ES3042336T3 - Surfactant additives for digital microfluidic devices for high protein content droplets transport - Google Patents

Abstract

Aquí se describe un aditivo surfactante, el etilendiamino tetrakis(etoxilato-bloque-propoxilato) tetrol con 16 unidades repetitivas de óxido de etileno y 18 unidades repetitivas de óxido de propileno (conocido por su nombre comercial Tetronic 90R4), utilizado como aditivo para gotas o para recubrir las superficies de los electrodos de DMF, lo que mejora drásticamente la capacidad de trabajar con líquidos con alto contenido proteico (por ejemplo, sangre completa) en chips microfluídicos digitales. Este surfactante previene la adsorción de proteínas y la contaminación de las superficies de los electrodos de DMF en un grado que hasta ahora era imposible. Específicamente, este surfactante permite la manipulación de gotas de sangre completa sin diluir durante más de 1 hora por electrodo (más de 150 veces mejor que lo que es posible para cualquier aditivo conocido). Esta mejora en el manejo de medios con alto contenido proteico revolucionará los diagnósticos basados en sangre en plataformas microfluídicas digitales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Aditivos tensioactivos para dispositivos microfluídicos digitales para el transporte de gotas con alto contenido en proteínas

[0005] Campo

[0007] La presente invención se refiere al uso de estructuras moleculares anfifílicas que, cuando se incluyen como aditivo en gotas manipuladas mediante microfluídica digital, impiden la adsorción de proteínas en un grado que hasta ahora era imposible. Un tensioactivo particular, etilendiamina tetrakis(etoxilato-bloque-propoxilato) tetrol (conocido como Tetronic 90R4), permite la manipulación de gotas de sangre entera sin diluir durante más de 1 hora por electrodo (más de 150 veces mejor que lo que es posible con cualquier aditivo conocido).

[0009] Antecedentes

[0011] La sangre es la muestra clínica más importante que se recoge del cuerpo humano, y se extraen cientos de millones de tubos cada año para el diagnóstico de enfermedades y el monitorización terapéutica.1 Un problema que viene de largo en el diagnóstico clínico es la adsorción no específica de proteínas sanguíneas en la superficie de dispositivos analíticos, tales como sensores implantables o plataformas dediagnósticoin vitro.2 Incluso después de eliminar los componentes celulares de la sangre, el fluido restante (es decir, el plasma) tiene una gran concentración de proteínas (> 60 g L -1) que puede obstaculizar el rendimiento de estos dispositivos.3 En consecuencia, los químicos y los científicos de materiales han dedicado una enorme cantidad de esfuerzo al desarrollo de superficies resistentes a las proteínas.45 Estos materiales generalmente incluyen grupos funcionales hidrófilos, no cargados [por ejemplo, óxido de poli(etileno) (PEO) o sulfobetaína] de modo que se forma una capa fuertemente unida de moléculas de agua en la superficie, lo que dificulta la adsorción de proteínas.2 Sin embargo, estas superficies no son una panacea para todas las aplicaciones y, de hecho, la hidrofilicidad de estos materiales los hace incompatibles con la microfluídica digital (DMF), una técnica de manejo de fluidos que recientemente se ha vuelto popular en aplicaciones de diagnóstico clínico.6-8

[0013] En los dispositivos microfluídicos digitales (DMF), las muestras y los reactivos se manipulan en forma de gotas discretas de tamaño picolitral a microlitral mediante la aplicación de potenciales eléctricos en una matriz genérica (m * n) de electrodos de accionamiento aislados (Figura 1a).9 La geometría genérica y el sencillo esquema de accionamiento de los DMF permiten a los usuarios implementar protocolos de ensayo mediante un enfoque de "programación", que invoca una serie de "funciones" que comprenden diversas combinaciones de operaciones con gotas: dosificación desde depósitos, división, fusión y mezcla (Figura 1b). El formato de dispositivo más versátil y frecuente para DMF es la configuración de dos placas, en la que las gotas se intercalan entre dos sustratos paralelos con patrones de electrodos (Figura 1a).Normalmente, la placa inferior alberga el conjunto de electrodos de accionamiento (de cualquier material conductor) cubierto por una capa dieléctrica aislante (por ejemplo, parileno C, nitruro de silicio, PDMS o SU-8). Estos electrodos están referenciados a un electrodo de tierra continuo en la placa superior, a menudo fabricado con óxido de indio y estaño (ITO), un material conductor ópticamente transparente. Se utilizan espaciadores para separar las placas superior e inferior, creando una separación fija entre ellas.

[0015] Un requisito crítico del DMF es que las superficies en contacto con la gota deben estar recubiertas con un recubrimiento hidrófobo fluorado (por ejemplo, Teflon AF® de DuPont, Cytop® de Asahi Glass o FluoroPel® de Cytonix) para minimizar la fricción experimentada por las gotas acuosas durante el movimiento sobre el conjunto de electrodos. El requisito de esta capa hidrófoba hace que el dispositivo sea susceptible a la contaminación por proteínas. Cuando se coloca una gota de solución que contiene proteínas sobre el dispositivo, las proteínas comienzan a ensuciar o incrustarse en la superficie, volviéndola hidrófila y (después de que se adsorben suficientes moléculas de proteínas) no apta para el movimiento de gotas. Por ejemplo, la concentración máxima móvil de albúmina de suero bovino acuoso (BSA) en DMF es de apenas 0,005 g L -1; en concentraciones mayores que este nivel, la proteína se adsorbe tan rápidamente a la capa dieléctrica que recubre las superficies de los electrodos impulsores que las gotas se vuelven imposibles de mover.1011 Esta limitación hace que la DMF sea completamente inadecuada para aplicaciones de diagnóstico clínico basadas en sangre, en las que las muestras contienen al menos 60 g L -1 de proteína.

[0017] En el pasado, se han desarrollado dos estrategias para superar el desafío de la adsorción de proteínas en dispositivos DMF: (1) encapsular gotas en un líquido no conductor e inmiscible, o (2) dopar aditivos en las propias gotas acuosas. En el método (1), los dispositivos se llenan con un fluido de baja viscosidad (normalmente aceite de silicona); en esta configuración (Izquierda, Figura 1c), las gotas (que deben ser inmiscibles con el relleno) están encapsuladas por una película, que evita que las gotas entren en contacto directo con la superficie hidrófoba. Por ejemplo, utilizando este enfoque, Srinivasan et al.12 demostraron la manipulación exitosa de sangre entera durante hasta 40 minutos, después de lo cual los autores observaron una degradación del rendimiento del dispositivo.

[0018] En otra variante de este enfoque, las gotas acuosas se encapsulan en una fina capa de aceite y se transportan en un dispositivo que está predominantemente lleno de aire (Medio, Figura 1c).13 Esta configuración de núcleocapa de aceite acuoso reduce la resistencia viscosa y elimina la fabricación y el empaquetado necesarios para confinar el 2 aceite de silicona en el dispositivo. Sin embargo, el uso de aceite puede conllevar varios inconvenientes para las aplicaciones analíticas. En primer lugar, el analito de interés (por ejemplo, una proteína o una molécula pequeña) puede pasar a la fase oleosa, lo que puede afectar negativamente al rendimiento del ensayo y provocar contaminación cruzada. En segundo lugar, las técnicas que requieren interacciones con las superficies del dispositivo, como la hibridación de nucleótidos o la detección electroquímica, pueden verse obstaculizadas por la barrera de aceite que rodea la gota.

[0020] En la segunda clase de técnicas utilizadas para limitar los efectos de la adsorción de proteínas en dispositivos DMF, se incluye un aditivo en la composición de las gotas para evitar que las proteínas interactúen con la superficie (Derecha, Figura 1c). El aditivo más establecido para prevenir la adsorción de proteínas en microfluídica digital es Pluronics. Esta familia de copolímeros tribloque lineales es anfifílica, es decir, están formados por una cadena de poli(óxido de propileno) (PPO) relativamente hidrófoba flanqueada por dos cadenas de poli(óxido de etileno) (PEO) relativamente hidrófilas (PEO-PPO-PEO). Se sabe que, cuando se disuelven en solución acuosa, las moléculas anfifílicas (que portan residuos hidrofóbicos e hidrofílicos) reducen la adsorción de proteínas y células a superficies hidrofóbicas; en las diferentes variedades de Pluronics, esta propiedad se ajusta variando las longitudes de los componentes PPO y PEO.14 Los aditivos Pluronic han demostrado ser invaluables como agentes antiincrustantes en el desarrollo de DMF. Por ejemplo, en un informe inicial, Luk et al.10 demostraron un movimiento sostenido de gotas que contenían hasta 50 g L -1 de BSA en dispositivos sin aceite para gotas que contenían bajas concentraciones (0,08 %) de Pluronic F127 (con una longitud de cadena promedio de PEO/PPO/PEO de 100/65/100). En un estudio más sistemático, Au et al. 15 probaron la idoneidad de una serie de ocho tensioactivos Pluronic para la reducción de incrustaciones en gotas de medios de cultivo celular (que contienen 10 % de suero bovino) en dispositivos DMF. En consonancia con observaciones anteriores,14 los autores observaron que los Pluronics con cadenas de PPO hidrofóbicas más largas son más eficaces para reducir la adsorción de proteínas durante el movimiento de las gotas. Específicamente, las moléculas de Pluronic que contenían menos de 30 unidades de PPO (F38, L35 y L44) no permitieron la traducción de gotas que contenían 10% de suero bovino fetal (debido a la suciedad superficial), mientras que las moléculas de Pluronic que contenían más de 30 unidades de PPO (F68, L64, L62, L92 y P105) resistieron la contaminación o incrustación y soportaron el movimiento durante cientos de operaciones de gotas.

[0021] Desde estos informes iniciales, la inclusión de aditivos Pluronic en formulaciones de reactivos para DMF se ha vuelto casi universal entre los cientos de científicos de todo el mundo que utilizan esta prometedora tecnología. Por ejemplo, Pluronic L64 se ha utilizado ampliamente como aditivo antiincrustante para inmunoensayos habilitados con DMF. Desafortunadamente, la técnica aditiva de Pluronic es imperfecta, particularmente para soluciones que contienen concentraciones muy altas de proteínas (como la sangre entera). De hecho, a pesar del gran interés en las aplicaciones de DMF que involucran sangre, no hay informes de ningún aditivo que pueda permitir de manera confiable la manipulación de gotas de sangre durante más de 1 minuto por electrodo.16 Esto sugiere que las propiedades convencionales de los aditivos de polímeros hidrófilos (ref.Patente de EE. UU. N.° 8,481,125) es insuficiente para la manipulación microfluídica digital de soluciones que contienen más de 50 g L -1 de proteínas (por ejemplo, sangre entera).

[0023] El documento US 2011/180571 A1 se refiere al campo de la realización de operaciones con gotas en un actuador de gotas. En particular, el documento US 2011/180571 A1 está dirigido a diseños de actuadores de gotas y composiciones de fluidos de actuadores de gotas para mejorar las operaciones de gotas.

[0025] Jaime Gonzalez-Lopez et al (2008) se refiere a las características estructurales del autoensamblaje de diferentes poloxaminas [(las secuenciales convencionales Tetronic 304, 901, 904, 908, 1107, 1301 y 1307; una contraparte secuencial inversa Tetronic 150R1; y un derivado modificado químicamente Tetronic 1107 N-metilado) en 10 mM HCl por medio de la isoterma n-A, tensión superficial y mediciones de fluorescencia de pireno.

[0027] El documento WO 2009/021173 A1 se refiere a un actuador de gotas con un sustrato que comprende electrodos dispuestos para realizar operaciones de gotas sobre una superficie de operaciones de gotas del sustrato; una fase de fluido de relleno en contacto con la superficie de operaciones de gotas que rodea al menos parcialmente una fase de gotas que comprende una gota dispuesta sobre uno o más de los electrodos, comprendiendo la gota: (i) una sustancia objetivo susceptible de pérdida de la fase de gota a la fase de fluido de relleno; y (ii) un aditivo que reduce la pérdida de la sustancia objetivo a la fase de fluido de relleno con respecto a una gota correspondiente que no comprende el aditivo.

[0029] Pavey K.D. et al. (1999) se refiere a mezclas de copolímeros de cadena larga y corta que han demostrado adherirse a portaobjetos de resonancia plasmónica de superficie de sustrato de oro. Se ha demostrado que las mezclas reducen significativamente la unión de BSA a las superficies de oro, en comparación con los copolímeros de PEO de cadena larga más comúnmente utilizados. Se ha demostrado que estas mezclas son más eficaces que los copolímeros de cadena corta o larga utilizados individualmente, lo que complementa un tratado teórico publicado sobre el comportamiento del tensioactivo PEO frente a la interacción de proteínas con superficies.

[0031] El documento US 5075400 A se refiere a materiales y procesos para (1) tratar materiales para minimizar la deposición de proteínas y otras moléculas; y (2) eliminar proteínas y otras moléculas de los materiales.

[0033] Au et al. (2011) se refiere a una serie de ocho aditivos de gotas anfipílicos, polímeros de cobloque Pluronic de poli(óxido de propileno) (PPO) y poli(óxido de etileno) (PEO), como una solución a la bioincrustación en microfluídica digital utilizando medios de cultivo celular que contienen suero como fluido modelo.

[0035] Compendio

[0037] En esta memoria se describen en aditivos tensioactivos con una estructura molecular única que mejora drásticamente la capacidad de trabajar con líquidos con alto contenido de proteínas (por ejemplo, sangre entera) en chips microfluídicos digitales. Un tensioactivo altamente eficaz para este propósito descrito en esta memoria es etilendiamina tetrakis(etoxilato-Wogue-propoxilato) tetrol con 16 unidades repetidas de óxido de etileno y 18 unidades repetidas de óxido de propileno (conocido por su nombre comercial como Tetronic 90R4) y los estudios realizados por los inventores han demostrado que este tensioactivo previene la adsorción de proteínas en una medida que hasta ahora era imposible. En concreto, este tensioactivo permite la manipulación de gotas de sangre entera sin diluir durante más de 1 hora por electrodo (más de 150 veces mejor que lo que es posible con cualquier aditivo conocido). Esta mejora en el manejo de medios con alto contenido de proteínas revolucionará el diagnóstico basado en sangre en plataformas microfluídicas digitales. Otras realizaciones de tensioactivos con cuatro grupos R se derivan de este tensiactivo cambiando varios grupos. Además, en esta memoria se describen tensioactivos con más de cuatro grupos R.

[0039] Como se describe en las reivindicaciones, la presente invención se refiere a un método para prevenir la incrustación de electrodos microfluídicos digitales durante el procesamiento de fluidos que contienen proteínas, que comprende:

[0041] mezclar o disolver un compuesto en el fluido;

[0043] en donde el compuesto es

[0045] etilendiamina tetrakis(etoxilato-bloque-propoxilato) tetrol con 16 unidades repetidas de óxido de etileno y 18 unidades repetidas de óxido de propileno; o en donde el compuesto es

[0048]

[0051] en donde R es x unidades repetidas de óxido de etileno e y unidades repetidas de óxido de propileno, en donde x está en un rango de 8 a 24, y en donde y está en un rango de 8 a 30; o

[0053] en donde el compuesto es

[0056]

[0059] en donde n es un número entero de al menos 2, en donde R es x unidades repetidas de óxido de etileno e y unidades repetidas de óxido de propileno, y en donde x es un número entero en un rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 32, e y es un número entero en un rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 36, y en donde X e Y son cualquiera de los siguientes grupos

[0060]

[0063] o

[0064] en donde el compuesto es

[0067]

[0069] en donde R es x unidades repetidas de óxido de etileno e y unidades repetidas de óxido de propileno, y en donde x es un número entero en un rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 32, y es un número entero en un rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 36; o

[0070] en donde el compuesto es

[0073]

[0075] en donde R es x unidades repetidas de óxido de etileno e y unidades repetidas de óxido de propileno, y en donde x es un número entero en un rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 32, e y es un número entero en un rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 36; o

[0076] en donde el compuesto es

[0077]

[0080] en donde n es un numero entero de al menos 2, en donde R es x unidades repetidas de oxido de etileno e y unidades repetidas de óxido de propileno, en donde x es un nUmero entero en un rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 32, e y es un número entero en un rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 36; y en donde X es uno cualquiera de

[0083]

[0086] o

[0088] en donde el compuesto es

[0091]

[0094] en donde R es x unidades repetidas de óxido de etileno e y unidades repetidas de óxido de propileno, en donde x es un número entero en un rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 32, e y es un número entero en un rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 36; y en donde X, Y y Z son uno cualquiera de

[0095]

[0098] o

[0099] en donde el compuesto es

[0102]

[0104] en donde R es x unidades repetidas de óxido de etileno e y unidades repetidas de óxido de propileno, en donde x es un número entero en un rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 32, e y es un número entero en un rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 36.

[0105] Una mejor comprensión de los aspectos funcionales y ventajosos de la presente invención se puede lograr mediante referencia a la siguiente descripción detallada y a los dibujos.

[0106] Breve descripción de los dibujos

[0107] A continuación se describirán realizaciones, solo a modo de ejemplo con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

[0108] La Figura 1 muestra un dispositivo DMF estándar en el que (a) es una vista superior (lado izquierdo) y una vista lateral (lado derecho) que muestra esquemas de un dispositivo DMF de dos placas;

[0109] (b) es una representación gráfica de una secuencia de voltaje preprogramada (lado izquierdo) y los fotogramas correspondientes de un vídeo (lado derecho) que muestra la medición de gotas de los depósitos; y

[0110] (c) ilustra los métodos convencionales para prevenir la adsorción de proteínas en DMF, que incluyen la configuración llena de aceite (izquierda), la configuración núcleo-capa (medio) y la configuración sin aceite (derecha) con aditivo miscible.

[0111] La Figura 2 muestra la estructura química y el peso molecular (PM) de un Tetronic "estándar", Tetronic 1107 (arriba) y un Tetronic "inverso", Tetronic 90R4 (abajo), su nombre químico es etilendiamina tetrakis(etoxilatobloque-propoxilato) tetrol.

[0112] La Figura 3A muestra la fórmula molecular del etilendiaminotetrakis(etoxilato-bloque-propoxilato) tetrol en el lado izquierdo y el grupo R que se muestra en el lado derecho son x unidades repetidas de óxido de etileno e y unidades repetidas de óxido de propileno, en donde x es un número entero en un rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 32, e y es un número entero en un rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 36; La Figura 3B1 muestra una fórmula molecular de otra molécula en el lado izquierdo que se puede utilizar en lugar de la fórmula molecular de la Figura 3A, en la que los cuatro grupos R son los mismos que en la fórmula de la Figura 3A y X e Y pueden ser cualquiera de los grupos que se muestran en el lado derecho etiquetados del I al IX;

[0114] La Figura 3B2 muestra una fórmula molecular de otra molécula en el lado izquierdo que se puede utilizar en lugar de la fórmula molecular de la Figura 3A, en la que los cuatro grupos R son los mismos que en la fórmula de la Figura 3A y X pueden ser cualquiera de los grupos que se muestran en el lado derecho etiquetados del i al v;

[0116] La Figura 3B3 muestra una fórmula molecular de otra molécula que se puede utilizar en lugar de la fórmula molecular de la Figura 3A, en la que los cuatro grupos R son los mismos que en la fórmula de la Figura 3A en la que los cuatro grupos R son los mismos que en la Figura 3A;

[0118] La Figura 3B4 muestra una fórmula molecular de otra molécula que se puede utilizar en lugar de la fórmula molecular de la Figura 3A , en la que los cuatro grupos R son los mismos que en la la Figura 3A;

[0120] La Figura 3C1 muestra una fórmula molecular de otra molécula que se puede utilizar en lugar de la fórmula molecular de la Figura 3A, en la que los seis grupos R son los mismos que en la Figura 3A y X, Y y Z pueden ser cualquiera de los grupos que se muestran en el lado derecho etiquetados del I al IX en la Figura 3B1 ;

[0121] La Figura 3C2 muestra una fórmula molecular de otra molécula que se puede utilizar en lugar de la fórmula molecular de la Figura 3A, en la que los seis grupos R son los mismos que en la Figura 3A;

[0123] La Figura 4 muestra un perfil de velocidad representativo del movimiento de gotas de sangre entera suplementada con 0,1 % de Tetronic 90R4 (a) o 0,1 % de Pluronic L64 (b). Los datos experimentales se representan como puntos grises; los ajustes exponenciales a los datos se muestran como líneas discontinuas.

[0124] La Figura 5 muestra datos de espectros de dicroísmo circular (CD) de 0,1 mg/ml de BSA en un tampón de pH 8,0 con varias concentraciones de dodecil sulfato de sodio (SDS) (a) o Tetronic 90R4 (b). La resolución del C<d>es de ±0,1 grados.

[0126] La Figura 6 muestra un gráfico de barras de la absorbancia del plasma extraído de sangre entera suplementada con varias concentraciones de Tetronic 90R4 (n = 3; las barras de error representan /- 1 DE). La línea discontinua indica la absorbancia de la sangre diluida solo con vehículo (sin hemólisis) y la línea continua indica la absorbancia de la sangre diluida con 1 % de SDS (hemólisis).

[0128] Descripción detallada

[0130] Las figuras no están a escala. Se describen numerosos detalles específicos para proporcionar una comprensión profunda de la invención. Sin embargo, en ciertos casos, no se describen detalles bien conocidos o convencionales para proporcionar un tratamiento conciso de la invención.

[0132] Tal como se utilizan en esta memoria, los términos "comprende" y "que comprende" deben interpretarse como inclusivos y abiertos, y no exclusivos. Específicamente, cuando se utilizan en la descripción y las reivindicaciones, los términos "comprende" y "que comprende" y variaciones de los mismos significan que las características, pasos o componentes especificados están incluidos. Estos términos no deben interpretarse como excluyentes de la presencia de otras características, pasos o componentes.

[0134] Como se utiliza en esta memoria, el término "ejemplar" significa "que sirve como ejemplo, instancia o ilustración" y no debe interpretarse como preferido o ventajoso sobre otras configuraciones divulgadas en esta memoria.

[0135] Tal como se utilizan en esta memoria, los términos "alrededor" y "aproximadamente" pretenden cubrir las variaciones que puedan existir en los límites superior e inferior de los rangos de valores, tales como variaciones en propiedades, parámetros y dimensiones. En un ejemplo no limitativo, los términos "alrededor" y "aproximadamente" significan más o menos el 10 por ciento o menos.

[0137] A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos empleados en esta memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica.

[0139] Se ha descubierto que el tensioactivo, etilendiamina tetrakis(etoxilato-bloque-propoxilato) tetrol con 16 unidades repetidas de óxido de etileno y 18 unidades repetidas de óxido de propileno (conocido como Tetronic 90R4), permite la manipulación de gotas de sangre entera sin diluir durante más de 1 hora por electrodo (más de 150 veces mejor que lo que es posible con cualquier aditivo conocido). Este sorprendente descubrimiento del efecto de Tetronic 90R4 en la actuación de las gotas de DMF surgió de la búsqueda de los inventores de una alternativa a la familia Pluronics (copolímeros tribloque lineales) como aditivos para prevenir la bioincrustación (motivados por el deseo de trabajar con gotas de sangre entera). Esta búsqueda llevó a los

[0140] inventores a estudiar una familia de tensioactivos anfifílicos con una estructura molecular diferente, llamados

[0141] Tetronics. Los tetronics se utilizan ampliamente como agentes antiespumantes, agentes humectantes, dispersantes, espesantes y demulsificantes en aplicaciones industriales.17 La mayoría de los tetronics son copolímeros de bloque ramificados en forma de "X" que tienen cuatro "brazos" de PPO-PEO que están unidos

[0142] a un enlace central de etilendiamina (la Figura 2, arriba es un ejemplo de un miembro típico de esta familia,

[0143] Tetronic 1107). Así, de forma similar a Pluronics, los Tetronics tienen un núcleo relativamente hidrófobo

[0144] flanqueado por cadenas relativamente hidrófilas.

[0146] En el trabajo inicial, los inventores examinaron toda la familia de Tetronics disponibles comercialmente (es decir,

[0147] Tetronics 1107, 1301, 1304, 1307, 150R1, 304, 701, 901, 904, 908, 90R4) por su capacidad para reducir la

[0148] adsorción de proteínas en gotas manipuladas mediante microfluídica digital. Sorprendentemente, en estas

[0149] pruebas iniciales, la última molécula, Tetronic 90R4 (T90R4), fue el único miembro de la familia Tetronics que

[0150] se observó que tenía un mejor rendimiento que el aditivo Pluronic (mucho más estándar). Curiosamente, T90R4

[0151] es una variante "inversa" de Tetronics, en la que los bloques PPO hidrófobos están en el flanco y los bloques

[0152] PEO están en el núcleo (Figura 2, parte inferior).17

[0154] Una amplia gama de variantes de Pluronic han demostrado ser eficaces para reducir la tasa de adsorción de

[0155] proteínas a superficies hidrófobas, facilitando así la manipulación de soluciones ricas en proteínas en dispositivos DMF. Estas moléculas comparten una estructura similar, pero difieren en la longitud de sus cadenas

[0156] de PEO y/o PPO. De manera similar, los inventores esperan que otras variantes de Tetronic (especialmente

[0157] variantes inversas con longitudes de cadena PEO/PPO similares a T90R4) también sean agentes antiincrustantes eficaces.

[0159] La fórmula molecular general para el etilendiaminotetrakis(etoxilato-bloque-propoxilato) tetrol se muestra en la

[0160] Figura 3a y, si bien T90R4 tiene x = 16 e y = 18, se contempla que las variaciones de esta estructura exhibirá

[0161] n cierta eficacia similar a T90R4. Por ejemplo, x es un número entero y puede estar en un rango de aproximad

[0162] amente 4 a aproximadamente 32, e y es un número entero y puede estar en un rango de aproximadamente 2

[0163] a aproximadamente 36 (Figura 3a). Además, x puede estar en un rango de aproximadamente 8 a aproximada

[0164] mente 24, e y puede estar en un rango de aproximadamente 8 a aproximadamente 30. Además, x puede esta

[0165] r en un rango de aproximadamente 12 a aproximadamente 20, e y puede estar en un rango de aproximadame

[0166] nte 12 a aproximadamente 24. Además, x puede estar en un rango de aproximadamente 14 a aproximadamen

[0167] te 18, e y puede estar en un rango de aproximadamente 16 a aproximadamente 20.

[0169] También se apreciará que el enlazador de etilendiamina central puede ser reemplazado o sustituido por otros enlazadores adecuados, mostrándose ejemplos no limitantes en la Figura 3B1. Aunque el enlazador en T90R4

[0170] es pequeño (corto) en relación con las largas cadenas laterales anfifílicas de PEO/PPO, su rigidez puede determinar la flexibilidad de las cadenas laterales y, por lo tanto, afectar la eficacia de las propiedades antiincrustantes. Algunos posibles enlaces sustitutivos incluyen, pero no se limitan a: (1) cadenas de carbonohidrógeno lineales saturadas (es decir, sin dobles enlaces) de longitud variable (Figura 3B1 (estructura I), por

[0171] ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo), en este caso, los carbonos en cada extremo se unen a las cuatro

[0172] patas de la molécula, (2) cualquiera de los anteriores con uno o más grupos amino en serie Figura

[0173] 3B1 estructura II), (3) cualquiera de los anteriores con uno o más grupos éter (-C-O-C-) en serie (Figura

[0174] 3B1 estructura III), (4) cualquiera de los anteriores con uno o más grupos cetona (-CO-C-) en serie (Figur 3B1 estructura IV), (5) cualquiera de los anteriores con uno o más grupos éster (-CO-O-C-) en serie (Figur 3B1 estructura V), (6) cualquiera de los anteriores con uno o más grupos amida(-CO-NH-) en serie (Figura

[0175] 3B1 estructura VI), (7) cualquiera de los anteriores con uno o más grupos disulfuro (-S-S-) en serie (Figur 3B1 estructura VII), (8) cualquiera de los anteriores con uno o más grupos anhídrido de ácido (-CO-O-CO-) en

[0176] serie (Figura 3B1 estructura VIII), (9) cualquiera de los anteriores con uno o más dobles enlaces en serie (-C=C-, Figura 3B1 estructura IX), (10) cualquiera de los anteriores donde los hidrógenos se reemplazan con

[0177] otros grupos laterales, como flúor, cloro, sulfato y fosfato (Figura 3B2 estructura i-v), (11) 1,2,4,5-bencenotetrametanol (Figura 3C1) (12) 2,2-bis(hidroximetil)1,3-propanodiol (Figura 3C2).

[0179] Si bien se utilizan cuatro (4) brazos alargados (PEO y PPO) anteriormente en las Figuras 3A, 3B1, 3B2,

[0180] 3B3 y 3B4, también se apreciará que se pueden utilizar más de cuatro (4) brazos con un enlazador central apropiado. Por ejemplo, una amina central que se conecta a cualquiera de los tres (3) enlaces que se muestran

[0181] en la Figura 3B1, en este caso los carbonos en los tres extremos se unen a un total de seis (6) brazos, con un

[0182] ejemplo no limitante que se muestra en la Figura 3C1. Otras variantes pueden incluir brazos PEO/PPO con hidrógenos reemplazados por otros grupos laterales que se muestran en la Figura 3B2, y un núcleo de siloxano

[0183] que une hasta seis (6) brazos que se muestran en la Figura 3C2.

[0185] Si bien el método más común para agregar tensioactivos a soluciones que contienen proteínas implica simplemente mezclar los reactivos (o disolver los aditivos tensioactivos) antes de cargarlos en el chip DMF, se

[0186] pueden utilizar varios procedimientos alternativos en su lugar. Estos incluyen, pero no se limitan a, el presecado

[0187] de los tensioactivos aquí descritos sobre la superficie del dispositivo DMF, ya sea en puntos predeterminados

[0188] o recubiertos a lo largo de toda la superficie del dispositivo, de modo que cuando los líquidos entran en contacto con el tensioactivo seco, este se solubiliza. Estos métodos pueden ser especialmente atractivos para producir chips DMF que admitan la adición de muestras biológicas directamente (por ejemplo, a partir de una punción en el dedo), sin ningún tratamiento adicional de la muestra.

[0190] En una comparación directa de Tetronic 90R4 y Pluronic L64, un tensioactivo que se usa comúnmente en inmunoensayos microfluídicos digitales, 18 los inventores probaron su capacidad para manipular gotas de sangre entera ovina-EDTA (complementada con 0,1 % de T90R4 o L64) en un dispositivo microfluídico digital recubierto de teflón-parileno C (Figura 4). En cada experimento, se aplicó una fuerza de 20 pN m irr1 para mover una gota de 1 pL entre un par de electrodos durante hasta 40 minutos (equivalente a 20 minutos por electrodo). Durante cada experimento, se controló la velocidad de las gotas mediante seguimiento de impedancia.19 Como se esperaba (según la experiencia previa), las gotas de sangre suplementadas con L64 solo fueron capaces de moverse durante un corto período de tiempo antes de que el dispositivo se contaminara irreversiblemente. Por el contrario, las gotas suplementadas con T90R4 pudieron completar todo el experimento. Al extrapolar el perfil de velocidad con una función exponencial decreciente y definir tL (vida útil del dispositivo) como el tiempo en el cual la velocidad de la gota (dx/dt) cae a 1 m m s-1, los inventores observaron que la vida útil del dispositivo T90R4 es ~150 veces más larga que la del L64 (60,4 frente a 0,4 min). Este es un resultado extraordinario, que representa la diferencia entre poder implementar inmunoensayos en sangre entera (para gotas suplementadas con Tetronic 90R4) o no (para gotas suplementadas con Pluronic L64), lo que supone un salto significativo respecto a las enseñanzas de la Patente de Estados Unidos N.° 8,481,125.

[0192] En experimentos en curso, la tendencia mostrada en la Figura 4, en la que las gotas que contienen soluciones acuosas de altas concentraciones de proteínas son móviles durante largos períodos de tiempo cuando se suplementan con Tetronic 90R4, pero no son móviles (o solo son móviles durante un período muy corto de tiempo) cuando se suplementan con varios Pluronics u otros Tetronics (no "inversos" o "estándar"), se ha reproducido muchas veces (datos no mostrados). Los inventores proponen que este método será invaluable para aumentar la vida útil del dispositivo para cualquier solución rica en proteínas, incluyendo (pero no limitado a) sangre entera, suero, plasma, medios de cultivo celular, extracto de tejido, saliva, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, sudor, lágrimas, sebo, orina y más.

[0194] Por lo tanto, sin estar limitados por ninguna teoría, los inventores plantean la hipótesis de que dos fenómenos generales pueden estar involucrados en la reducción de la bioincrustación. En primer lugar (1), se cree que los unímeros T90R4 reducen la adsorción de proteínas a las superficies del dispositivo mediante la formación de complejos con moléculas de proteína (ya sea como micelas o simplemente mediante la interacción de una o más moléculas tensioactivas con una molécula de proteína) de modo que la molécula de proteína queda "recubierta" y, por lo tanto, no puede adsorberse en la superficie. En segundo lugar (2), se cree que los unímeros T90R4 reducen la adsorción de proteínas a la superficie de los dispositivos al formar una capa contigua adsorbida en la interfaz, "protegiendo" así la superficie de las moléculas de proteínas en solución. Los inventores recopilaron dos conjuntos de datos (que se describen en los párrafos siguientes), lo que sugiere que el fenómeno 2 (es decir, el blindaje en la interfaz) es probablemente el principal contribuyente a la reducción de la bioincrustación.

[0196] En el primer conjunto de datos, los inventores observaron que la disposición molecular de una proteína no cambia con la presencia de T90R4, lo que sugiere que el fenómeno 1 (es decir, la formación de complejos tensioactivos-proteína) es poco probable. La formación de complejos tensioactivos-proteína suele estar asociada con un reordenamiento molecular de la proteína (es decir, un cambio en la conformación de la proteína). Por ejemplo, cuando la proteína albúmina de suero bovino (BSA) se mezcla con el tensioactivo dodecil sulfato de sodio (SDS), se sabe que las dos especies forman un complejo molecular, lo que produce un cambio en la conformación de la BSA. Los cambios en la conformación de proteínas se pueden investigar mediante experimentos de dicroísmo circular (CD), como se ilustra en la Figura 5. En la Figura 5a, el espectro de 0,1 g L -1 de BSA (sin SDS) tiene un espectro CD claramente diferente de los espectros de 0,1 g L -1 de BSA mezclado con 1, 2, 2,5, 4 o 6 mM de SDS [tenga en cuenta que este rango de concentración se seleccionó para extenderse por encima y por debajo de la concentración de agregación crítica (CAC) y la concentración micelar crítica (CMC) para SDS en PBS con BSA, respectivamente]. Por el contrario, en la Figura 5b, el espectro de 0,1 mg/ml de BSA (sin T90R4) tiene un espectro de CD casi idéntico al generado a partir de 0,1 mg/ml de BSA mezclado con 0,0005 %, 0,001 %, 0,01 %, 0,1 % o 1 % de T90R4 (p/vol) (téngase en cuenta que este rango de concentración se seleccionó para extenderse por encima y por debajo del CAC y el CMC para T90R4 en PBS con BSA, respectivamente). Estos datos sugieren que no existe formación de complejos entre BSA y T90R4 o, si la hay, que la confirmación de la proteína no se ve afectada.

[0198] En el segundo conjunto de datos, los inventores observaron que una relación molar baja de tensioactivo a proteína (menos de 1:10) es suficiente para el antiincrustante y que mantener una relación constante no produce el mismo rendimiento de movimiento de gotas en la microfluídica digital, lo que nuevamente sugiere que el fenómeno 1 (combinación tensioactivo-proteína) es poco probable. Si se evita que las moléculas de proteína se adsorban a las superficies del dispositivo formando complejos con moléculas de tensioactivo, primero se esperaría que la relación molar de las dos especies fuera al menos 1:1 (tensioactivo: proteína). En este caso, se podría suponer además que si se determina una proporción dada para reducir las incrustaciones, esta proporción tendría efectos similares incluso si las concentraciones absolutas de especies cambian (por ejemplo, 10 mM de tensioactivo y 1 mM de proteína deberían comportarse de la misma manera que 100 mM de tensioactivo y 10 mM de proteína). Los experimentos preliminares con manipulación de gotas en dispositivos DMF no respaldan esta idea. [En este estudio, el "movimiento" es un indicador de una reducción de la incrustación, ya que se sabe que las gotas se mueven fácilmente sobre una superficie de teflón AF impecable. De la misma manera, la "falta de movimiento" es un indicador de mayor incrustación, ya que se sabe que las gotas quedan "atascadas" en superficies que han sido incrustadas con proteína adsorbida. Además, para garantizar que se observe al menos un resultado de "sin movimiento", se eligió que la concentración de T90R4 fuera al menos 10 veces menor que la concentración requerida para mover sangre entera (0,1 % peso/vol).] Como se muestra en la Tabla 1, las gotas formadas a partir de cinco combinaciones diferentes de T90R4 y BSA (en concentraciones variables) se evaluaron por su capacidad de moverse a 1 mm/s en un dispositivo DMF. Curiosamente, las tres condiciones con la misma relación molar de 1:22,4 produjeron resultados diferentes. Lo más importante es que, aunque todas estas condiciones tienen proporciones molares muy inferiores a 1:1 (tensioactivo: proteína), dos de las condiciones dan lugar a un movimiento robusto de las gotas.

[0200] Tabla 1: Resultados de los experimentos de movimiento de gotas en dispositivos DMF.

[0203]

[0206] Con base en los datos anteriores, los inventores plantean la hipótesis de que el T90R4 reduce principalmente la incrustación superficial al formar una capa protectora contigua en la interfaz y que dos características (descritas en el siguiente párrafo) son necesarias para el rendimiento superior de la variante T90R4. Parece probable que la combinación de estas dos características produzca una organización 3D de estructura única de cadenas de copolímeros de bloque PEO/PPO en la interfaz líquido/superficie y que esta estructura sea particularmente eficaz para prevenir la interacción de las proteínas con la superficie hidrofóbica.

[0208] Por lo tanto, sin estar limitados por ninguna teoría, los inventores plantean la hipótesis de que las propiedades únicas observadas para Tetronic 90R4 están relacionadas con su estructura molecular: (1) su estructura X (T90R4 es superior a todas las variantes conocidas de Pluronic, que tienen una estructura lineal de tribloque), y (2) la posición relativa de los bloques PEO y PPO (la variante inversa T90R4, en la que los bloques PPO flanquean los bloques PEO, tiene un rendimiento muy superior a la variante normal T904). Se cree que esta orientación "inversa" de T90R4 probablemente permite que las moléculas formen una capa altamente ordenada en la interfaz sólido-líquido. La organización estructural de estas moléculas tensioactivas en la interfaz líquido/superficie parece ser particularmente efectiva para evitar que las proteínas interactúen con la superficie hidrofóbica. Parece probable que la combinación de estas dos características produzca una organización 3D de estructura única de cadenas de copolímeros de bloque PEO/PPO en la interfaz líquido/superficie y que esta estructura sea particularmente eficaz para prevenir la interacción de las proteínas con la superficie hidrofóbica.

[0209] Debido a que solo hay dos variantes "inversas" disponibles comercialmente (Tetronic 90R4 y 150R1), es difícil predecir si T90R4 representa o no un óptimo global para la prevención de la adsorción de proteínas; sin embargo, se contempla que si uno sintetizara variantes 70R4, 110R4, 90R3 o 90R5, podrían lograr un rendimiento similar o mejor.

[0211] Aunque normalmente se agregó entre 0,01 y 0,2 % p/v de T90R4 a líquidos que contenían proteínas antes de cargar líquidos en un dispositivo DMF, se apreciará que, en general, concentraciones más altas de tensioactivo reducirán aún más la tasa de adsorción de proteínas (extendiendo así la vida útil del dispositivo), pero si la concentración es demasiado alta, puede provocar hemólisis (lisis de células sanguíneas) en el caso de sangre entera, o toxicidad celular, en el caso de medios de crecimiento celular. El tensioactivo también se puede secar previamente en un chip DMF para mayor comodidad, de modo que el tensioactivo se reconstituya automáticamente en la muestra tan pronto como se cargue en el chip.

[0213] Se observa que una preocupación importante para los diagnósticos basados en la sangre es la hemólisis de muestras de sangre entera. La hemólisis suele ser indeseable, ya que libera componentes intracelulares que de otro modo estarían contenidos y que pueden interferir con los ensayos clínicos. Así, los inventores probaron este efecto mezclando solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía Tetronic 90R4 con sangre entera ovina (PBS que contenía T90R4: sangre 1:8) en varias concentraciones finales de T90R4. Después de incubar estas mezclas a temperatura ambiente durante 1 hora, se extrajo el plasma mediante centrifugación (500 g/5 min) y se determinó la metahemoglobina liberada midiendo la absorbancia del plasma a 630 nm. Como se muestra en la Figura 6, no se observó hemólisis apreciable para las muestras suplementadas con < 0,4%de Tetronic 90R4. Esto confirma la idoneidad de Tetronic 90R4 para ser compatible con ensayos no hemolíticos en sangre entera.

[0215] Por lo tanto, en conclusión, se ha demostrado que incluir etilendiamina tetrakis(etoxilato-bloque-propoxilato) tetrol (Tetronic 90R4) como aditivo (o pre-recubrirlo sobre las superficies) es muy ventajoso, ya que permite la manipulación de soluciones de alto contenido proteico (por ejemplo, sangre entera), que de otro modo son imposibles de mover durante más de unos pocos segundos. El uso de este tensioactivo actúa para extender la vida útil del dispositivo DMF para todas las soluciones que contienen proteínas y se contempla que este tensioactivo puede usarse para reducir la bioincrustación en otros sistemas (por ejemplo, microfluidos de canales y/o de 2 fases).

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

1. Un método para prevenir la incrustación de electrodos microfluídicos digitales durante el procesamiento de fluidos que contienen proteínas, que comprende:

mezclar o disolver un compuesto en el fluido;

en donde el compuesto es

etilendiamina tetrakis(etoxilato-bloque-propoxilato) tetrol con 16 unidades repetidas de óxido de etileno y 18 unidades repetidas de óxido de propileno; o

en donde el compuesto es

en donde R son x unidades repetidas de óxido de etileno y unidades repetidas de óxido de propileno, en donde x está en un rango de 8 a 24, y en donde y está en un rango de 8 a 30; o

en donde el compuesto es

en donde n es un numero entero de al menos 2, en donde R son x unidades repetidas de óxido de etileno e y unidades repetidas de óxido de propileno, y en donde x es un número entero en un rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 32, e y es un número entero en un rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 36; y en donde X y Y son uno cualquiera de los siguiente grupos

o

en donde el compuesto es

en donde R es x unidades repetidas de óxido de etileno e y unidades repetidas de óxido de propileno, y en donde x es un número entero en un rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 32, e y es un número entero en un rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 36; o

en donde el compuesto es

en donde R es x unidades repetidas de óxido de etileno e y unidades repetidas de óxido de propileno, y en donde x es un número entero en un rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 32, e y es un número entero en un rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 36; o

en donde el compuesto es

en donde n es un número entero de al menos 2, en donde R es x unidades repetidas de óxido de etileno e y unidades repetidas de óxido de propileno, en donde x es un número entero en un rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 32, e y es un número entero en un rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 36; y en donde X es uno cualquiera de

- H ------ F ------Cl

i i i i i i

o

en donde el compuesto es

en donde R es x unidades repetidas de óxido de etileno e y unidades repetidas de óxido de propileno, en donde x es un número entero en un rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 32, e y es un número entero en un rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 36; y en donde X, Y y Z son uno cualquiera de

o

en donde el compuesto es

en donde R es x unidades repetidas de óxido de etileno e y unidades repetidas de óxido de propileno, en donde x es un número entero en un rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 32, e y es un número entero en un rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 36.

2. El método según la reivindicación 1, en el que el compuesto es etilendiamina tetrakis(etoxilato-bloquepropoxilato) tetrol con 16 unidades repetidas de óxido de etileno y 18 unidades repetidas de óxido de propileno, y en el que el etilendiamina tetrakis(etoxilato-bloque-propoxilato) tetrol está presente en una cantidad de al menos 0,02 % p:p.

3. El método según la reivindicación 1 o 2, en el que el compuesto es etilendiamina tetrakis(etoxilato-bloquepropoxilato) tetrol con 16 unidades repetidas de óxido de etileno y 18 unidades repetidas de óxido de propileno, y en el que el fluido es sangre, y en el que el etilendiamina tetrakis(etoxilato-bloque-propoxilato) tetrol está presente en un intervalo de aproximadamente 0,02 % a aproximadamente 0,4 % peso:peso, por encima del cual se produce la hemólisis.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el compuesto es etilendiamina tetrakis(etoxilato-bloque-propoxilato) tetrol con 16 unidades repetidas de óxido de etileno y 18 unidades repetidas de óxido de propileno;

en el que el método comprende recubrir uno o más electrodos de accionamiento con etilendiamina tetrakis(etoxilato-bloque-propoxilato) tetrol presecado con 16 unidades repetidas de óxido de etileno y 18 unidades repetidas de óxido de propileno, ya sea en puntos predeterminados o cubriendo toda la superficie del dispositivo, de modo que al entrar en contacto las gotas de líquido con el tensioactivo seco, este se solubilice, de modo que el etilendiamina tetrakis(etoxilato-bloque-propoxilato) tetrol esté presente en una cantidad de al menos el 0,02 % p/p en las gotas de líquido.

5. El método según la reivindicación 4, en el que el fluido es sangre, en el que el compuesto es etilendiamina tetrakis(etoxilato-bloque-propoxilato) tetrol con 16 unidades repetidas de óxido de etileno y 18 unidades repetidas de óxido de propileno, y en el que el etilendiamina tetrakis(etoxilato-bloque-propoxilato) tetrol está presente en un intervalo de desde aproximadamente 0,02% hasta aproximadamente 0,4% peso:peso, por encima del cual se produce la hemólisis.

6. El método según la reivindicación 1, en el que el compuesto es

en donde R es x unidades repetidas de óxido de etileno e y unidades repetidas de óxido de propileno, en el que x está en un rango de 8 a aproximadamente 24, y en el que y está en un rango de 8 a 30.

7. El método según la reivindicación 6, en el que x está en un intervalo de aproximadamente 12 a aproximadamente 20, y en el que y está en un intervalo de aproximadamente 12 a aproximadamente 24.

8. El método según la reivindicación 6, en el que x está en un intervalo de aproximadamente 14 a aproximadamente 18, y en el que y está en un intervalo de aproximadamente 16 a aproximadamente 20.

9. El método según la reivindicación 6, en el que n es un número entero en un rango de 2 a 40.

10. El método según la reivindicación 1, en el que el compuesto es

en donde n es un número entero de al menos 2, en donde R es x unidades repetidas de óxido de etileno e y unidades repetidas de óxido de propileno, en donde x es un número entero en un rango de aproximadamente 4 a aproximadamente 32, e y es un número entero en un rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 36; y en donde X es uno cualquiera de

iv<V>

en donde n es un número entero en un rango de 2 a 40.