ES3042097T3 - Antibodies specifically binding to human il-1r7 - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales que se unen específicamente al IL-1R7 humano, o a un fragmento o derivado del mismo, o a un polipéptido que contiene al menos una porción de dicho anticuerpo suficiente para conferirle una unión específica al IL-1R7. La invención también se refiere al uso de dichos anticuerpos en el tratamiento de una enfermedad mediada por IL-18 y a composiciones farmacéuticas que comprenden un excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo según la invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Anticuerpos que se unen específicamente a IL-1R7 humano

[0005] Campo de la invención

[0007] La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a IL-1R7 humano. La invención también se refiere a usos de dichos anticuerpos y a composiciones farmacéuticas que los comprenden.

[0009] Antecedentes

[0011] IL-1R7 es un correceptor para la señalización de IL-18, que también se conoce como cadena p del receptor de IL-18. La IL-18 está clasificada como uno de los miembros de la superfamilia de citocinas IL-1, que actúa como un importante regulador de las respuestas inmunitarias innatas y adquiridas (Garcíaet al.,2003; Dinarelloet al.,2013). Desempeña funciones efectoras y reguladoras en diversas respuestas inflamatorias tempranas y se conoce su expresión en los sitios de inflamación crónica, en enfermedades autoinmunitarias, en diversos tipos de cáncer y en el contexto de numerosas enfermedades infecciosas (Lebel-Binayet al.,2000; Diakowskaet al.,2006; Kinjoet al.,2002; Fabbiet al.,2015).

[0013] La familia de citocinas de IL-18 se sintetizan como moléculas precursoras y son escindidas por la enzima caspasa-1 antes o durante su liberación de la célula. Después de la liberación de la célula, la transducción de la señalización de IL-18 se produce a través de la unión al receptor. Uno de sus principales receptores es el IL-1R5, también conocido como cadena a del receptor de IL-18. De manera más específica, se conoce un complejo receptor que consiste en IL-1R5 e IL-1R7 que transduce la señalización de IL-18 (Debetset al.,2000).

[0015] Tras la unión del ligando, continúa la cascada de señalización proinflamatoria de IL-18, dando lugar a la activación y transcripción de numerosos genes diana que afectan a la activación de diversos tipos celulares, tales como macrófagos, células dendríticas, mastocitos, linfocitos B y T, fibroblastos y muchos otros tipos de células. La familia de citocinas de IL-1 e IL-18 tiene muchos paralelismos, por ejemplo, la estructura de sus receptores y las vías de transducción de señales utilizadas. Por ejemplo, IL-1R5 cumple la misma función para la vía de IL-18 que IL-1R3 para las vías de señalización de la familia de IL-1.

[0017] La señalización de la mayoría de los miembros de la familia de IL-1 se produce a través de receptores heterodiméricos de la membrana plasmática, y la mayoría de ellos utilizan una cadena de señalización común (IL-1R3) (Rivaet al.,2012). El bloqueo de IL-1R3 conduce a resultados problemáticos, ya que IL-1R3 es un receptor para varias interleucinas y, por tanto, cumple varias funciones (cascadas de señalización tanto proinflamatorias como antiinflamatorias). De manera similar a IL-1R3, es extremadamente difícil encontrar anticuerpos que inhiban de manera eficaz la vía de señalización mediante el bloqueo de IL-1R7 humano. Esto queda demostrado por el hecho de que en la bibliografía no se divulgan dichos anticuerpos eficaces.

[0019] Se han descrito muchos anticuerpos que inhiben los efectos de IL-18 mediante la unión directa a IL-18 (Documentos US 2014/0112915; US 2014/0004128; US 2013/0101595). No obstante, la experiencia previa con la inhibición directa de IL-18 produjo resultados contradictorios. Por lo tanto, se necesitaban otros métodos para inhibir la vía de señalización de IL-18, por ejemplo, mediante el bloqueo de su receptor IL-1R5. Para este fin, se conocen varios anticuerpos (Documento WO 2007/096396 o WO 2007/117577).

[0021] En estudios recientes de artritis reumatoide, el complejo receptor soluble de interleucina-18 se ha identificado como un nuevo biomarcador. Por otra parte, también se han divulgado anticuerpos que se unen a este complejo (S. Takeiet al.,2011,Arthritis Res Ther13, R52).

[0023] Se han divulgado anticuerpos y proteínas de unión a IL-18 (Wu Chengbinet al., J Immunol2003; Vol. 170 (11)), que inhiben tanto la unión de iL-18 al complejo receptor de IL-18 como, de manera más específica, su unión a IL-1R5.

[0024] Además, se identificó un anticuerpo monocatenario (scFv) antagonista humano, h18-108, que inhibe la producción de IFN-<y>en la estirpe celular mielomonocítica KG-1 mediante el bloqueo de la unión de IL-18 y su posterior señalización (T. Hamasakiet al.,2005,J. Biochemistry,vol. 138, 4).

[0026] Otros estudios exploran la estructura espacial de la unión del receptor de IL-18. En este contexto, se describe el anticuerpo monoclonal 125-2H neutralizante de IL-18, que se une específicamente a IL-18R5 e inhibe la unión de IL-18 a células que expresan el receptor IL-1R5in vitro(Wei Huiet al.,2014,FEBS Letters,588).

[0028] Al utilizar el mismo anticuerpo murino (125-2H) frente al anticuerpo humano ABT-325, el análisis de la estructura cristalina del respectivo complejo de unión revela la unión a diferentes epítopos de IL-18, y es probable que ABT-325 se una cerca del sitio de unión natural de IL-18IIL-1R7 (IL-18Rp) (A. M. Argiriadiet al.; J. Biol. Chem.Vol. 284, número 36).

[0029] El documento EP3241845 divulga un anticuerpo humanizado que se une específicamente a IL-1R3, o un fragmento o derivado del mismo, que contiene al menos una parte del anticuerpo suficiente para conferir especificidad de unión a IL-1R3. Aunque estos anticuerpos se dirigen a un receptor diferente, presentan una gran homología con los anticuerpos divulgados en el presente documento.

[0031] Sin embargo, IL-1R5 puede actuar como receptor no sólo de la IL-18, sino también de la citocina antiinflamatoria IL-37. La unión de IL-18 a IL-1R5 provoca acciones proinflamatorias, mientras que la unión de IL-37 a IL-1R5 conduce a acciones antiinflamatorias (Mologoraet al.,2016). Por tanto, el bloqueo del receptor IL-1R5 puede ser contraproducente en el tratamiento de pacientes con una modalidad anti-IL-18, ya que puede interferir con otros mecanismos que podrían ser beneficiosos para dichos pacientes. La inhibición de IL-1R7 sigue siendo, por lo tanto, la única intervención antiinflamatoria selectiva.

[0033] Por otra parte, aunque IL-1R5 es un componente funcional del receptor de IL-18, su afinidad de unión a IL-18 es relativamente baja y, además, IL-1R7 es necesario para la unión de alta afinidad de la IL-18. Hasta ahora, los anticuerpos conocidos que bloquean IL-1R5 e IL-1R7 con el objetivo de inhibir la señalización mediada por IL-18, no actúan con una potencia que permita su uso como anticuerpos terapéuticos.

[0035] Se demostró la expresión de IL-1R7 en células Th1, lo que aclara el papel de IL-1R7 en las patologías mediadas por Th1 (Debetsel al.,2000). Debetset al.desarrollaron un anticuerpo anti-IL-1R7 de ratón (AcM anti-IL-1R7: TC30-28E3, AcM anti-IL18: C18.6)., que inhibió de manera eficaz las respuestas a IL-18in vitro,demostrando un papel fundamental de IL-1R7 en la acción de IL-18. Sin embargo, el anticuerpo desarrollado por Debets y sus colegas es un anticuerpo antimurino de rata y sólo se probóin vitro.El desarrollo de un anticuerpo potente con elevada especificidad contra IL-1R7 humano ha resultado difícil y no se ha conseguido hasta ahora.

[0037] Por lo tanto, se necesitan anticuerpos eficaces contra IL-1R7 humano. Esta necesidad se resuelve con los anticuerpos de la presente invención.

[0039] Sumario de la invención

[0041] Un primer aspecto de la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a IL-1R7 humano, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos o un polipéptido que contiene al menos una parte de dicho anticuerpo que es suficiente para conferir especificidad de unión a IL-1R7. La invención también se refiere a composiciones que comprenden dichos anticuerpos y métodos para tratar una enfermedad mediada por IL-18.

[0042] Definiciones

[0044] El término "conejo", de acuerdo con la invención, significa un animal de los miembros del orden taxonómico Lagomorpha, que incluye las familias (liebres y conejos) y Ochotonidae (picas), preferentemente del género Oryctolagus. El término "anticuerpo" abarca las diversas formas de estructuras de anticuerpos que incluyen, pero sin limitación, anticuerpos completos y fragmentos de anticuerpos siempre que muestren las propiedades de acuerdo con la invención.

[0046] La expresión "anticuerpo monoclonal de conejo", de acuerdo con la invención, significa un anticuerpo monoclonal producido mediante inmunización de un conejo y aislado de una célula productora de anticuerpos de dicho conejo, así como un anticuerpo que se modifica adicionalmente, preferentemente un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un fragmento de los mismos, o un anticuerpo adicional genomanipulado o producido de forma recombinante, siempre que se conserven las propiedades características de acuerdo con la invención. Preferentemente, el anticuerpo procede de un linfocito B o de una célula de hibridoma de conejo de dicho conejo.

[0047] La expresión "célula productora de anticuerpos", de acuerdo con la invención, significa un linfocito B de conejo que produce anticuerpos, preferentemente un linfocito B o una célula de hibridoma de conejo.

[0049] Los "anticuerpos nativos" suelen ser glucoproteínas heterotetraméricas compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, aunque el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro intracatenarios a espacios regulares. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VH) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que restos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada.

[0051] "Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia peptídica o polipeptídica se define como el porcentaje de restos de aminoácidos de una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos de la secuencia peptídica o polipeptídica específica, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de varias maneras que se encuentran dentro de la experiencia en la materia, por ejemplo, mediante programas informáticos disponibles de manera pública, tales como los programas BLAST, BlAs T-2, a L iGN o Megalign (DNASTAR).

[0053] Los "dominios constantes (partes constantes)" no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero también presentan, por ejemplo, funciones efectoras. El fragmento génico de la región constante de cadena pesada que corresponde a la IgG1 humana se denomina cadena y1. El fragmento génico de la región constante de cadena pesada que corresponde a la IgG3 humana se denomina cadena y3. Las cadenas pesadas constantes y humanas están descritas en detalle por Kabat, E. A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md . (1991) y por Brueggemann, M.,et al.,J. Exp. Med. 166 (1987) 1351 -1361; Love, T. W.,et al.,Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527.

[0055] Los dominios constantes de tipo IgG1 o IgG3 están glucosilados en Asn297. "Asn 297", de acuerdo con la invención, significa el aminoácido asparagina situado aproximadamente en la posición 297 en la región Fc; basada en pequeñas variaciones de secuencia de los anticuerpos, Asn297 también se puede ubicar algunos aminoácidos (normalmente no más de 3 aminoácidos) cadena arriba o cadena abajo.

[0057] La expresión "función(es) efectora(s) de anticuerpos" o "función efectora", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una función aportada por un dominio(s) efector Fc de una IgG (por ejemplo, la región Fc de una inmunoglobulina). Dicha función puede efectuarse mediante, por ejemplo, la unión de un dominio o dominios efectores Fc a un receptor Fc en una célula inmunitaria con actividad fagocítica o lítica o mediante la unión de un dominio o dominios efectores Fc a componentes del sistema del complemento. Las funciones efectoras normales son ADCC, ADCP y CDC.

[0059] Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo inalterado que comprende una parte de un anticuerpo inalterado que se une al antígeno al que se une el anticuerpo inalterado. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

[0061] Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más y, por el contrario, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un 50 % o más en un ensayo de competencia. En el presente documento se proporciona un ensayo de competencia ilustrativo.

[0063] La "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" y "ADCC" (del inglésantibody-dependent cellmediated cytotoxicity)se refiere a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan FcR (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente provocan la lisis de la célula diana. Las células primarias para mediar en la ADCC, las células NK, expresan FcyRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRIl y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457- 492. La expresión "fagocitosis celular dependiente de anticuerpos" y el término "ADCP" (del inglésantibody-dependent cellularphagocytosis)se refieren a un proceso mediante el cual se internalizan células recubiertas de anticuerpos, en su totalidad o en parte, mediante células inmunitarias fagocíticas (por ejemplo, macrófagos, neutrófilos y células dendríticas) que se unen a una región Fc de inmunoglobulina.

[0065] "C1q" es un polipéptido que incluye un sitio de unión para la región Fc de una inmunoglobulina. C1q junto con dos serina-proteasas, C1r y C1s, forma el complejo C1, el primer componente de la ruta de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). El C1q humano se puede adquirir comercialmente de, por ejemplo, Quidel, San Diego, California.

[0067] La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que tiene su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e Ig, y varias de éstas pueden subdividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG-i, IgG<2>, IgG<3>, IgG<4>, IgA<1>e IgA<2>. Los dominios constantes de cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 8, £,<y>y M, respectivamente. Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

[0069] La expresión "región Fc" en el presente documento se utiliza para definir una región carboxiterminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una parte de la región constante. La expresión incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes.

[0071] Salvo que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de los restos de aminoácidos en la región Fc o en la región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también denominado índice EU, como se describe en Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

[0073] Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia "natural" o "de tipo silvestre" en virtud de al menos una "modificación de aminoácidos" como se define en el presente documento.

[0075] La expresión "variante de Fc", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polipéptido que comprende una modificación en el dominio Fc. La modificación puede ser una adición, eliminación o sustitución. Las sustituciones pueden incluir aminoácidos de origen natural y aminoácidos de origen no natural. Las variantes pueden comprender aminoácidos no naturales.

[0077] La expresión "polipéptido que contiene la región Fc" se refiere a un polipéptido, tal como un anticuerpo o una inmunoadhesina (véanse las definiciones a continuación), que comprende una región Fc.

[0079] La expresión "receptor de Fc" o el término "FcR" se utilizan para describir un receptor que se une con la región Fc de un anticuerpo. Un FcR que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRIl y FcyRIII, incluyendo las variantes alélicas y las formas de corte y empalme alternativas de estos receptores. Los receptores FcyRIl incluyen FcyRIIA (un "receptor activador") y FcyRlIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos. El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo de activación del inmunorreceptor a base de tirosina (ITA, del inglésimmunoreceptor tyrosine-based activation)en su dominio citoplasmático. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibición del inmunorreceptor a base de tirosina (ITIM, del inglésimmunoreceptor tyrosine-based inhibition)en su dominio citoplasmático, (véase la revisión en Daeron, M., Annu. Rev. Immunol. 15 (1997) 203-234). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492; Capelet al.,Immunomethods 4 (1994) 25-34; y de Haas,et al.,J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-41. Otros FcR, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, se incluyen en el término "FcR" del presente documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyeret al.J. Immunol. 1 17 (1976) 587 y Kim,et al.,J. Immunol. 24 (1994) 249).

[0081] Por "ligando Fc de IgG", como se utiliza en el presente documento, se entiende una molécula, preferentemente un polipéptido, de cualquier organismo que se une a la región Fc de un anticuerpo IgG para formar un complejo Fc/ligando Fc. Los ligandos Fc incluyen, pero sin limitación, FcyR, FcRn, C1q, C3, lectina de unión a manano, receptor de manosa, proteína A estafilocócica, proteína G estreptocócica y FcyR vírico. Los ligandos Fc también incluyen homólogos del receptor Fc (FcRH), que son una familia de receptores de Fc homólogos a los FcyR (Daviset al.,Immunological Reviews 190 (2002) 123-136, incorporado en su totalidad por referencia). Los ligandos Fc pueden incluir moléculas no descubiertas que se unen a Fc. Los ligandos Fc de IgG en particular son los receptores FcRn y Fc gamma. Por "ligando Fc", como se utiliza en el presente documento, se entiende una molécula, preferentemente un polipéptido, de cualquier organismo que se une a la región Fc de un anticuerpo para formar un complejo Fc/ligando Fc.

[0083] Por "receptor de Fc gamma", "FcyR" o "FcgammaR", como se utiliza en el presente documento, se entiende cualquier miembro de la familia de proteínas que se unen a la región Fc del anticuerpo IgG y está codificado por un genFcyR.En los seres humanos, esta familia incluye, pero sin limitación, FcyRI (CD64), incluidas las isoformas FcyRIa, FcyRIB y FcyRIC; FcyRII (CD32), incluidas las isoformas FcyRIlA (incluidos los alotipos H131 y R131), FcyRIIB (incluidos FcyRIIB-1 y FcyRIIB-2) y FcyRIIc; y FcyRIII (CD16), incluidas las isoformas FcyRIIIA (incluidos los alotipos V158 y F158) y FcyRIIIb (incluidos los alotipos FcyRIIB-NA1 y FcyRIIB-NA2) (Jefferiset al.,Immunol Lett 82(2002) 57-65, incorporados en su totalidad por referencia), así como cualquier FcyR humano o isoformas o alotipos de FcyR no descubiertos. Un FcyR puede ser de cualquier organismo, incluidos, pero sin limitación, seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos. Los FcyR de ratón incluyen, pero sin limitación, FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16) y FCYRIII-2 (CD 16-2), así como cualquier FcyR o isoformas o alotipos de FcyR de ratón no descubiertos.

[0085] Por "FcRn" o "receptor de Fc neonatal", como se utiliza en el presente documento, se entiende una proteína que se une a la región Fc del anticuerpo IgG y está codificada al menos en parte por un genFcRn.El FcRn puede ser de cualquier organismo, incluidos, pero sin limitación, seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos. Como se conoce en la materia, la proteína funcional FcRn comprende dos polipéptidos, a menudo denominados cadena pesada y cadena ligera. La cadena ligera es la beta-2-microglobulina y la cadena pesada está codificada por el genFcRn.A menos que se indique otra cosa en el presente documento, FcRn o una proteína FcRn se refiere al complejo de la cadena pesada de FcRn con beta-2-microglobulina.

[0087] Un "inmunoconjugado" significa un anticuerpo conjugado con uno o más agentes citotóxicos, tal como un agente quimioterápico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina, otro anticuerpo o un isótopo radiactivo.

[0088] Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpos monoclonales", como se utilizan en el presente documento, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una única composición de aminoácidos.

[0089] La expresión "anticuerpo humanizado" o "versión humanizada de un anticuerpo" se refiere a los anticuerpos cuyas cadenas pesadas y ligeras están humanizadas como resultado de la genomanipulación de los anticuerpos. Una cadena humanizada es normalmente una cadena en la que la secuencia de aminoácidos de la región V se ha modificado de forma que, analizada en su conjunto, es más parecida en homología a una secuencia de la línea germinal humana que a la secuencia de la estirpe germinal de la especie de origen. La evaluación de la humanización se basa en la secuencia de aminoácidos resultante y no en la metodología en sí.

[0091] Las expresiones "unión específica, contra la diana o anticuerpo antidiana", como se utilizan en el presente documento, se refieren a la unión del anticuerpo al antígeno (diana) respectivo o a la célula que expresa el antígeno, medida mediante ELISA, en donde dicho ELISA comprende preferentemente el recubrimiento del antígeno respectivo en un soporte sólido, la adición de dicho anticuerpo en condiciones que permitan la formación de un inmunocomplejo con el antígeno o proteína respectivo, la detección de dicho inmunocomplejo mediante la medición de los valores de densidad óptica (DO) utilizando un anticuerpo secundario que se une a un anticuerpo de acuerdo con la invención y utilizando un desarrollo de color mediado por peroxidasa.

[0093] El término "antígeno", de acuerdo con la invención, se refiere al antígeno utilizado para inmunización o a una proteína que comprende dicho antígeno como parte de su secuencia proteínica. Por ejemplo, para inmunización se puede utilizar un fragmento del dominio extracelular de una proteína (por ejemplo, los primeros 20 aminoácidos) y para detección/ensayo y similares se puede utilizar el dominio extracelular de la proteína o la proteína completa.

[0095] Las expresiones "unión específica" o "reconocido específicamente" en el presente documento significan que un anticuerpo presenta una afinidad apreciable por un antígeno, y, preferentemente, no presenta una reactividad cruzada significativa.

[0097] Un anticuerpo que "no presenta reactividad cruzada significativa" es aquel que no se une de forma apreciable a otra proteína no deseable. La unión específica se puede determinar de acuerdo con cualquiera de los medios reconocidos en la materia para determinar dicha unión, por ejemplo, mediante ensayos de unión competitiva tales como ELISA.

[0098] La "región (o dominio) variable de un anticuerpo de acuerdo con la invención" (región variable de una cadena ligera (VL), región variable de una cadena pesada (VH)), como se utiliza en el presente documento, indica cada uno de los pares de regiones de cadenas ligera y pesada que participan directamente en la unión del anticuerpo a al antígeno. Las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas tienen la misma estructura general y cada región comprende cuatro regiones marco (FR) cuyas secuencias están ampliamente conservadas, conectadas por tres regiones determinantes de la complementariedad, CDR.

[0100] La expresión "parte de unión a antígeno de un anticuerpo", cuando se utiliza en el presente documento, se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La parte de unión a antígeno de un anticuerpo comprende preferentemente restos de aminoácidos de las "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". Las secuencias CDR se definen de acuerdo con Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Mediante este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento de, o inserción en, una FR o CDR de la región variable. Por ejemplo, una región variable de cadena pesada puede incluir una única inserción de aminoácido (resto 52a de acuerdo con Kabat) después del resto 52 de H2 y restos insertados (por ejemplo, restos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del resto 82 de la FR de cadena pesada. La numeración de los restos según Kabat puede determinarse para un anticuerpo dado por alineación en las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "patrón".

[0102] El término "cáncer", como se utiliza en el presente documento, puede ser, por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de pulmón de células broncoalveolares, cáncer de huesos, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello del útero, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer de pene, cáncer de la próstata, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o del uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), tumores del eje espinal, glioma del tronco encefálico, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas epidermoides, adenoma hipofisario, linfoma, leucemia linfocítica, incluyendo versiones refractarias de cualquiera de los cánceres anteriores o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores. Preferentemente, dicho cáncer es un cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón o cáncer de páncreas.

[0104] La expresión "enfermedades relacionadas con IL-18", como se utiliza en el presente documento, incluye, pero sin limitación, artritis reumatoide, artrosis, artritis juvenil crónica, artritis de Lyme, artritis psoriásica, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico y nefritis lúpica), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria intestinal, diabetesmellitusinsulinodependiente, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, psoriasis de tipo 1, psoriasis de tipo 2, esclerodermia, enfermedad del injerto frente al hospedador, rechazo de trasplante de órganos, enfermedad inmunitaria aguda o crónica asociada al trasplante de órganos, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los riñones, hepatitis activa crónica, uveítis, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome séptico, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, mielitis transversal aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, ictus, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, neoplasias malignas, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedad de Addison, deficiencia poliglandular de tipo I y deficiencia poliglandular de tipo II esporádicas, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, alopecia, alopecia grande, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriásica, artropatía colítica ulcerosa, sinovitis enteropática, clamidia, artropatía asociada aYersiniaySalmonella,espondiloartropatías, enfermedad ateromatosa, arteriesclerosis, alergia atópica, enfermedad ampollosa autoinmunitaria, pénfigo vulgar, pénfigo filiar, penfigoide, enfermedad por IgA lineal, anemia hemolítica autoinmunitaria, anemia hemolítica positiva para Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/enfermedad de Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de células gigantes, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmunitaria criptogénica, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, enfermedades relacionadas con la inmunodeficiencia adquirida, hepatitis C, inmunodeficiencia común variada, hipogammaglobulinemia variable común, miocardiopatía dilatada, infertilidad femenina, fallo ovárico, insuficiencia ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial postinflamatoria, pneumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada a la enfermedad del tejido conjuntivo, enfermedad pulmonar asociada a la enfermedad mixta del tejido conectivo, enfermedad pulmonar intersticial asociada a esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar intersticial asociada a artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada al lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada a dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada a la enfermedad de Sjogren, enfermedad pulmonar asociada a la espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada a hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármacos, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterante, neumonía eosinófila crónica, enfermedad pulmonar infiltrativa linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial postinfecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria de tipo 1, hepatitis autoinmunitaria clásica o lupoide, hepatitis autoinmunitaria de tipo 2, hepatitis por anticuerpos anti-LKM, hipoglucemia mediada por autoinmunidad, resistencia a la insulina de tipo B con acantosis pigmentaria, hipoparatiroidismo, enfermedad inmunitaria aguda asociada al trasplante de órganos, enfermedad inmunitaria crónica asociada al trasplante de órganos, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, leucocitopenia idiopática, neutrocitopenia autoinmunitaria, enfermedad renal NOS, glomerulonefritis, vasulitis microscópica de los riñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad del esperma, todos los subtipos de esclerosis múltiple, oftalmia simpática, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad del tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de la poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, arteritis/enfermedad de Takayasu, trombocitopenia autoinmunitaria, trombocitopenia idiopática, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmunitario bocioso o enfermedad de Hashimoto, hipotiroidismo atrófico autoinmunitario, mixoedema primario, uveítis facogénica, vasculitis primaria, vitíligo, hepatopatía aguda, hepatopatía crónica, alergia y asma, trastornos mentales, depresión, esquizofrenia, enfermedades mediadas por el tipo Th2 y el tipo Th1, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedades inflamatorias, autoinmunitarias y óseas. La expresión "enfermedades relacionadas con IL-18" comprende además modalidades inducidas por el cáncer, tal como la inflamación crónica inducida por tumores.

[0106] Descripción detallada de la invención

[0108] En el presente documento se divulgan anticuerpos monoclonales, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, capaces de unirse a IL-1R7 humano. Como se ha expuesto anteriormente, el desarrollo de dichos anticuerpos había resultado muy difícil. Menos aún existían anticuerpos que se unieran a IL-1R7 humano con una especificidad y eficacia suficientes para permitir su uso como agentes terapéuticos. No se esperaba la posibilidad de desarrollar y obtener dichos anticuerpos, debido a las dificultades experimentadas anteriormente en la generación de dichos anticuerpos.

[0109] Por tanto, fue muy sorprendente para los inventores encontrar que los anticuerpos de la presente invención muestran las características ventajosas y beneficiosas como se describen y detallan adicionalmente a continuación.

[0111] En un aspecto de la invención, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una región VH de SEQ ID NO: 1189 que comprende una región CDRlH de SEQ ID NO: 309, una región<c>D<r>2H de SEQ ID NO: 457 y una región CDR3H de SEQ ID NO: 605, y una región VL de SEQ ID NO: 1198 o 1203 que comprende una región CDR1L de SEQ ID NO: 753, una región CDR2L de SEQ ID NO: 901 y una región CDR3L de SEQ ID NO: 1045 o 1205.

[0112] Se consiguieron efectos particularmente buenos cuando dicha región VH es la SEQ ID NO: 1189 y la región VL es la SEQ ID NO: 1198 o 1203.

[0113] Se divulgan además anticuerpos que incluyen una de las siguientes combinaciones de seis CDR de las secuencias de cadena pesada y ligera como se muestra en una sola fila de la siguiente tabla que representa las SEQ ID NO:

[0116]

[0119] Los efectos de dichos anticuerpos son, por ejemplo, su unión selectiva a IL-1R7 (y no a IL-1R5) como se muestra en la figura 2 y la figura 3 y su eficacia en la inhibición de la señalización de IL-18 como se muestra en la figura 1.

[0120] De acuerdo con la invención, un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, es capaz de unirse a IL-1R7 humano y presenta una inhibición de la señalización de IL-18 de al menos un 30%, en un ensayo funcional con IL-18 como se describe en el ejemplo 1.

[0122] Preferentemente, dicha inhibición de la señalización de IL-18 es al menos de un 35 %, preferentemente de un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % y lo más preferentemente de un 90 %, en un ensayo funcional con IL-18.

[0124] Se divulga un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que es capaz de unirse a IL-1R7 humano y presenta una especificidad de unión a células que expresan el receptor IL-1R7 humano de más de 10.000 UFR (Unidades de fluorescencia relativa) en un ensayo de unión a células con hulL-1R7 como se ha descrito en el ejemplo 2. Preferentemente, dicha especificidad de unión es superior a 20.000 UFR, más preferentemente superior a 30.000 UFR, 40.000 UFR, 50.000 UFR, 60.000 UFR, 70.000 UFR, 80.000 UFR, 90.000 UFR y lo más preferentemente superior a 100.000 UFR.

[0126] Estos valores ilustran la elevada eficacia particular de los anticuerpos de acuerdo con la invención en la unión al receptor IL-1R7 y la inhibición de la señalización de IL-18. Además, destaca su potencia para usar en el tratamiento de enfermedades, en donde se reducirá la señalización de IL-18.

[0128] Como se detalla en la introducción, la vía de la IL-18 está muy regulada y la experiencia previa con la inhibición a través de la IL-18 directa produjo resultados contradictorios: Se han descrito efectos proinflamatorios que se refieren a la actividad de IL-18 con señalización a través de IL-1R5 e IL-1R7. También se describieron fuertes efectos antiinflamatorios que están relacionados con la actividad de IL-37 con señalización a través de IL-1R5 y otro receptor IL-1R8 (TIR8/SIGIRR). Esto significa que IL-1R5 puede actuar como receptor no sólo de IL-18, sino también de la citocina antiinflamatoria IL-37, y que el bloqueo del receptor IL-1R5 puede constituir un riesgo para los pacientes con respuesta inmunitaria reducida.

[0130] Por lo tanto, la inhibición de IL-1R7 es la única intervención antiinflamatoria selectiva sin riesgo de interferir con otros mecanismos que pueden no ser beneficiosos para los pacientes tratados con una modalidad anti-IL-18.

[0132] Por lo tanto, se apreciará particularmente en el campo que los anticuerpos de acuerdo con la invención muestran una unión muy fuerte al receptor IL-1R7 y una unión muy débil al receptor IL-1R5.

[0134] Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden presentar una especificidad de unión a células que expresan el receptor IL-1R5 humano de menos de 1.000 UFR en un ensayo de unión a células con hulL-1R5 como se describe en el ejemplo 2.

[0136] Preferentemente, dicha especificidad de unión a células que expresan el receptor IL-1R5 humano es inferior a 1.000 UFR, 800 UFR, más preferentemente inferior a 700 UFR, 600 UFR, 500 UFR, 400 UFR, 300 UFR, 200 UFR, 100 UFR.

[0138] En una realización preferida, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo quimérico humano y de conejo. En otra versión preferida, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

[0139] Las secuencias de aminoácidos de varios anticuerpos humanizados se muestran en la figura 10. Los efectos más favorables se encontraron para los anticuerpos humanizados que tienen una región variable de cadena pesada (VH) como se muestra en las SEQ ID NO: 1185 a 1193 y una región variable de cadena ligera (VL) como se muestra en las SEQ ID NO: 1194 a 1204. Se divulgan los anticuerpos humanizados que incluyen una de las siguientes combinaciones de regiones variables de cadena pesada y cadena ligera: VH de Se Q ID NO: 1185 y VL de SEQ ID NO: 1194; VH de SEQ ID NO: 1186 y VL de SEQ ID NO: 1195; VH de SEQ ID NO: 1187 y VL de SEQ ID NO: 1196; VH de SEQ ID NO: 1188 y VL de SEQ ID NO: 1197; VH de SEQ ID NO: 1189 y VL de SEQ ID NO: 1198; VH de SEQ ID NO: 1190 y VL de SEQ ID NO: 1199; VH de SEQ ID NO: 1191 y VL de SEQ ID NO: 1200; VH de SEQ ID NO: 1192 y VL de SEQ ID NO: 1201; VH de SEQ ID NO: 1193 y VL de SEQ ID NO: 1202; VH de SEQ ID NO: 1189 y VL de SEQ ID NO: 1203, y VH de SEQ ID NO: 1192 y VL de SEQ ID NO: 1204.

[0141] De acuerdo con la aplicación terapéutica preferida de los anticuerpos de acuerdo con la invención, las funciones efectoras (tales como ADCC, CDC y ADCP) de los anticuerpos de la invención son reducidas o inexistentes. Por lo tanto, los anticuerpos de la invención evitan el agotamiento no deseado de las células inmunitarias y reducen el riesgo de efectos adversos, por ejemplo, infecciones oportunistas.

[0143] En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la invención comprende una o más mutaciones que reducen las interacciones con el receptor FcR.

[0145] Se prefiere que un anticuerpo de acuerdo con la invención presente una afinidad reducida por los receptores de F<cy>humanos en comparación con el F<cy>de IgG de tipo silvestre. Esto puede conducir a una señalización reducida a través del receptor de F<cy>humano en comparación con la señalización del receptor de F<cy>de IgG de tipo silvestre.

[0146] En una realización específica, el anticuerpo de acuerdo con la invención comprende al menos sustituciones de aminoácidos en L234A y L235A de la región Fc de IgG1 humana. En otra realización, el anticuerpo puede comprender al menos sustituciones de aminoácidos en S228P y L235E de la región Fc de la IgG4 humana.

[0148] Adicionalmente, un anticuerpo de acuerdo con la invención puede utilizarse en el tratamiento de una enfermedad mediada por IL-18.

[0150] Las preparaciones purificadas de anticuerpos de la invención pueden incorporarse a composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de enfermedades y trastornos humanos como los que se describen a continuación. Normalmente, dichas composiciones comprenden además un portador farmacéuticamente aceptable (es decir, inerte), tal como se conoce y exige la práctica farmacéutica aceptable. Ejemplos de dichos portadores incluyen portadores esterilizados, tales como solución salina Ringers o solución de dextrosa, tamponadas con tampones adecuados hasta un pH dentro del intervalo de 5 a 8. Las composiciones farmacéuticas para inyección o infusión continua están convenientemente exentas de partículas visibles y pueden comprender entre 0,1 ng y 100 mg de anticuerpo, normalmente entre 5 mg y 35 mg de anticuerpo. En cualquier caso, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de acuerdo con la invención. Los métodos para la preparación de dichas composiciones farmacéuticas son bien conocidos por los expertos en la materia.

[0152] Las dosis eficaces y la pauta terapéutica para administrar el anticuerpo de la invención se determinan generalmente de forma empírica y dependen de factores tales como la edad, peso y estado de salud del paciente y de la enfermedad a tratar. Dichos factores están dentro de la competencia del médico tratante. En general, estarán entre 1 mg y 1000 mg. En una realización, la pauta posológica para tratar a un paciente humano se administra i.v. o s.c. 1 vez por semana o 1 vez cada 4 semanas o 1 vez cada 3 meses. Las composiciones de la presente invención también pueden utilizarse una vez o incluso de forma profiláctica.

[0154] Dependiendo de la enfermedad o trastorno a tratar, la composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente activa del anticuerpo de la invención puede utilizarse simultáneamente, por separado o secuencialmente con una cantidad eficaz de otro medicamento tal como otros agentes antiinflamatorios o antitumorales.

[0156] La enfermedad tratada con un anticuerpo o composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede ser una enfermedad inmunitaria o autoinmunitaria o una enfermedad inflamatoria o autoinflamatoria o una enfermedad cardiovascular. La enfermedad puede ser también una enfermedad mediada por el inflamosoma.

[0158] Una enfermedad tratada con un anticuerpo o composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede ser una enfermedad seleccionada del grupo de enfermedades que comprende diabetes de tipo 1 o 2, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn (EC); colitis ulcerosa (CU), esclerosis múltiple, sarcoidosis, arteritis de células gigantes (ACG), degeneración macular asociada a la edad (DMAE), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad de Still de inicio en la edad adulta (ESA), artritis idiopática juvenil sistémica (AIJS), asma grave, uvenitis, atrofia geográfica, aterosclerosis e inflamación crónica inducida por tumores.

[0159] La presente invención también comprende un método para tratar una enfermedad mediada por IL-18 en un paciente. Dicho método comprende la administración a un paciente de una cantidad farmacéuticamente eficaz del anticuerpo o de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención.

[0160] El método puede aplicarse en casos en los que el paciente no haya respondido al tratamiento anti-TNF.

[0161] El método también puede utilizarse en el tratamiento de una enfermedad inmunitaria o autoinmunitaria o una enfermedad inflamatoria o autoinflamatoria o una enfermedad cardiovascular. Una enfermedad mediada por el inflamosoma también puede tratarse con el método de acuerdo con la invención.

[0162] En otro aspecto de la invención, la enfermedad que se trata con el presente método es una seleccionada del grupo de enfermedades que comprende diabetes de tipo 1 o 2, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn (EC); colitis ulcerosa (CU), esclerosis múltiple, sarcoidosis, arteritis de células gigantes (ACG), degeneración macular asociada a la edad (DMAE), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad de Still de inicio en la edad adulta (ESA), artritis idiopática juvenil sistémica (AIJS), asma grave, uvenitis, atrofia geográfica, aterosclerosis e inflamación crónica inducida por tumores.

[0163] Ejemplos

[0164] Los siguientes ejemplos se utilizan junto con las figuras y tablas para ilustrar la invención.

[0165] Ejemplo 1: Ensayos funcionales con IL-18

[0166] 1. Cultivar células HEK-Blue™ (InvivoGen; N.° de cat.: hkb-hmil18) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

[0167] 2. Sembrar 12,5 k células HEK-Blue™ en 15 pl de medio por pocillo en una placa de 384 pocillos de fondo plano tratada con cultivo celular transparente.

[0168] 3. Añadir 5 pl de sobrenadante de linfocitos B o de series de dilución de anticuerpos convencionales a cada pocillo.

[0169] 4. Incubar durante 1 hora a 37 °C/CO<2>al 5 %.

[0170] 5. Añadir 5 pl de una solución de hulL-18 de 0,1 mg/ml a cada pocillo.

[0171] 6. Incubar toda la noche a 37 °C/CO<2>a 5 %.

[0172] 7. Añadir 20 pl de QUANTI-Blue™ (1 bolsa disuelta en 50 ml) en una nueva placa transparente no aglutinante. 8. Añadir 5 pl de sobrenadante de células HEK-Blue™ e incubar a 37 °C/CO<2>al 5 % durante 45 min.

[0173] 9. Determinar los niveles de SEAP utilizando un espectrofotómetro a 620-655 nm.

[0174] Ejemplo 2: Ensayo de unión a células con hulL-1R7 y hulL-1R5

[0175] 1. Sembrar una cantidad adecuada de células HEK293 transfectadas con hulL-1R7 o hulL-1R5 (1000 a 2000 células/pocillo) en 20 pl de medio en una placa negra de 384 pocillos con fondo transparente.

[0176] 2. Incubar las placas durante 4 h a 37 °C y CO<2>al 5 %

[0177] 3. Añadir 5 pl de sobrenadantes de linfocitos B o series de dilución de anticuerpos convencionales a las células. 4. Incubar las placas durante la noche a 37 °C y CO<2>al 5 %.

[0178] 5. Lavar la placa 3 veces con 25 pl de PBS y añadir 20 pl de un anticuerpo de detección adecuado (concentración de ensayo 0,8 pg/ml).

[0179] 6. Incubar la placa 4 h a 37 °C y CO<2>al 5 % en oscuridad.

[0180] 7. Añadir 5 pl de una solución de Hoechst de 25 pg/ml y cubrir con papel de aluminio. Mientras se incuban las células durante 10 minutos a TA, centrifugar brevemente las placas durante 10 segundos a 300 x g.

[0181] 8. Analizar la unión de anticuerpos a las células con una plataforma de detección de alto contenido Cell Insight ™.

[0182] Ejemplo 3: ELISA bioquímico de IL1R7 humano

[0183] La unión de los anticuerpos monoclonales humanizados anti-IL1R7-IgG1-LALA a la proteína IL1R7 humana se probó en un ELISA bioquímico. La proteína recombinante Fc-IL1R7 humana (MAB Discovery) se incubó en una placa Nunc™ MaxiSorp™ de 384 pocillos a una concentración de 0,5 g/ml en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con tampón de lavado (PBS, Tween al 0,1 %), las placas se bloquearon con PBS, BSA al 2 %, Tween al 0,05 % durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo tres veces con tampón de lavado y anticuerpos a concentraciones que iban de 10 pg/ml a 6 pg/ml en PBS, BSA al 0,5 %, Tween al 0,05 % y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después de 3 lavados en tampón de lavado, los pocillos se incubaron con 12,5 pl de una dilución 1:5000 de fragmento F(ab)<2>específico de especie conjugado con peroxidasa antihumano, procedente de cabra (AbD Serotec) en tampón ELISA durante una hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron seis veces con tampón de lavado y se añadieron 15 pl/pocillo de solución de sustrato TMB (Invitrogen). Después de 30 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 15 pl de solución de parada (HCI 1 M) por pocillo y se midió la absorbancia a 450 y 620 nm de longitud de onda con un lector de microplacas Tecan M1000. Las curvas de ajuste y el cálculo de la CE<50>se obtuvieron utilizandoExcel(Microsoft) yXLfit(IDB<s>). Como se muestra en la figura 5, los valores de unión CE<50>variaron entre 2,1 ng/ml y 4,5 ng/ml.

[0185] Ejemplo 4: Unión a células que expresan hlL1R7

[0187] Para determinar la potencia de los anticuerpos monoclonales humanizados anti-IL1R7 IgG1-LALA en la unión a IL1R7 humano expresado en células, se transfectaron células HEK-293 con ADN que codifica el IL1R7 humano. 48 h después de la transfección, se sembraron 2000 células en 20 pl de DMEM que contenía FBS al 10 %, 1* Pen/Strep en una placa de 384 pocillos con fondo transparente y tratada con cultivo celular tratado. Los anticuerpos se añadieron a concentraciones finales que iban de 10 pg/ml a 2 pg/ml en 5 pl de medio. Después de 24 h, las células se lavaron tres veces con 25 pl de tampón de lavado (PBS, Tween al 0,05%) antes de añadir anti-IgG humana de cabra conjugado con Alexa-Fluor-488 (Jackson Laboratories) a una concentración de 0,8 pg/ml en 20 pl de medio. Cuatro horas más tarde, se añadieron 5 pl de colorante Hoechst en el medio hasta una concentración final de 5 pg/ml. Las señales fluorescentes de unión celular se midieron con un generador de imágenes automatizado de alto contenido Cell Insight (Thermo Fisher Scientific). Las curvas de ajuste y el cálculo de la CE<50>se obtuvieron utilizandoExcel(Microsoft) yXLfit(IDBS). En la figura 6 se resumen los valores de unión CE<50>que van de 1,7 a 8,3 ng/ml.

[0189] Ejemplo 5: Neutralización de la señalización de NF-kB inducida por IL-18

[0191] Se evaluó la capacidad de los anticuerpos monoclonales humanizados a-IL1R7 IgG1-LALA para interferir con la señalización de NF-kB inducida por IL-18 utilizando células reporteras HEK-Blue-IL18™ (InvivoGen). Las células se sembraron en 15 pl de DMEM, FCS al 10 %, Pen/Strep al 1 % a una densidad celular de 12500 células/pocillo en una placa de cultivo tisular de 384 pocillos. Se añadieron anticuerpos para concentraciones finales de anticuerpos que variaban de 50 a 0,024 pg/ml y se incubaron durante 1 h. Se añadió IL-18 humana a una concentración final de 100 pg/ml y se incubaron las células durante 24 h. Se transfirieron 5 pl del sobrenadante del medio de cada pocillo a una placa de 384 pocillos de fondo blanco transparente que contenía 20 pl de reactivo 2x QUANTI- Blue™ (InvivoGen). Después de 45 minutos de incubación a 37 °C y CO<2>al 5 %, se midió la densidad óptica a una longitud de onda de 655 nm, lo que refleja la activación dependiente de NF-kB de la secreción de fosfatasas. Las curvas de ajuste y el cálculo de la CE<50>se obtuvieron utilizandoExcel(Microsoft) yXLfit(IDBS). Los valores de CE<50>de la figura 7 indican la potencia de los anticuerpos anti-lL1R7 para inducir la señalización de NF-kB en las células reporteras HEK- Blue-IL18™.

[0193] Ejemplo 6: Neutralización de la liberación de citocinas IL-6 inducida por IL-18

[0195] Las células A-549_IL18Rb_IL1R9 se estimularon con hlL-18 para comprobar la capacidad de los anticuerpos monoclonales humanizados anti-IL1R7 IgG1-LALA para inhibir la liberación de citocinas IL-6 inducida por IL-18. Las células se sembraron en una mezcla de nutrientes F-12K modificada por Kaighn FCS al 10 % en placas de cultivo celular de 384 pocillos a una densidad de 12500 células/pocillo. Después de 24 h, las células se lavaron 3 veces con tampón de lavado celular (PBS, Tween al 0,05 %) y se añadieron 15 pl de medio y 10 pl de anticuerpos para obtener concentraciones finales de anticuerpos que variaban de 33,3 a 0,016 pg/ml. 1 h más tarde, se añadió IL18 humana a una concentración final de 10 ng/ml y se incubaron las células durante 6 h. Las concentraciones de IL-6 en sobrenadantes de cultivos celulares se cuantificaron utilizando un kit ELISA DuoSet de IL6 humana de R&D Systems. Las curvas de ajuste y el cálculo de la CE<50>se obtuvieron utilizandoExcel(Microsoft) yXLfit(IDBS). En la figura 8 se resumen los valores de CE<50>que van de 133 a 6350 ng/ml.

[0197] Ejemplo 7: Neutralización de la liberación de IFN-y inducida por IL-18

[0199] La capacidad de los anticuerpos monoclonales humanizados anti-IL1R7 IgG1-LALA para inhibir la liberación de IFN-y inducida por IL-18 se probó con células de mieloblastos KG-1. Las células KG-1 se sembraron a una densidad de 6750 células/pocillo en 15 pl de medio RPMI 1640 que contenía FBS al 20 % y L-Glutamina 2 mM en una placa de cultivo celular de 384 pocillos. Los anticuerpos se añadieron a una concentración final de 1,4 pg/ml o para experimentos de valoración de dosis en un intervalo de 5000 a 0,03 ng/ml. Después de 1 hora de incubación, se añadieron IL-18 humana (concentración final 5 ng/ml) y TNF-a (concentración final 10 ng/ml) y se incubaron las células durante 48 h a 37 °C y CO<2>al 5 %. Las concentraciones de IFN-y en el sobrenadante del medio se cuantificaron con un kit ELISA de IFN-y humano de R&D Systems. En la figura 9A se resumen las concentraciones de IFN-y medidas tras el tratamiento de las células KG-1 con 1,4 |jg/ml de anticuerpo. En la figura 9B se muestran los valores de CE<50>de la inhibición de la liberación de IFN-y determinados en experimentos de valoración de la dosis. Las curvas de ajuste y el cálculo de la CE<50>se obtuvieron utilizandoExcel(Microsoft) yXLfit(IDBS).

[0200] Leyendas de las figuras

[0201] Figura 1: Ensayos funcionales con IL-18

[0202] Se muestran los resultados de los experimentos realizados según se detalla en el ejemplo 1.

[0203] Figura 2: Ensayo de unión a células con hulL-1R7

[0204] Se muestran los resultados de los experimentos realizados de acuerdo con el ejemplo 2.

[0205] Figura 3: Ensayo de unión a células con hulL-1R5

[0206] Se muestran los resultados de los experimentos realizados según se detalla en el ejemplo 2.

[0207] Figura 4: Secuencias (aminoácidos en código de una letra)

[0208] Secuencias completas de regiones variables (VR):

[0209] Cadena pesada: VH completa: SEQ ID NO: 1 a 148

[0210] Cadena ligera: VL completa: SEQ ID NO: 149 a 296

[0211] Regiones determinantes de la complementariedad (CDR):

[0212] Cadena pesada: CDR-H1: SEQ ID NO: 297 a 444

[0213] CDR-H2: SEQ ID NO: 445 a 592

[0214] CDR-H3: SEQ ID NO: 593 a 740

[0215] Cadena ligera: CDR-L1: SEQ ID NO: 741 a 888

[0216] CDR-L2: SEQ ID NO: 889 a 1036

[0217] CDR-L3: SEQ ID NO: 1037 a 1184, 1205, 1206

[0218] Figura 5: Unión de anticuerpos a-IL1R7 humanizados a IL-1R7 humana en un ELISA bioquímico

[0219] Se muestran los resultados de los experimentos realizados según se detalla en el ejemplo 3. La unión de los anticuerpos humanizados anti-IL-1R7 IgG1-LALA a la proteína humana recombinante IL-1R7 se probó en ELISA bioquímico. Los valores de unión de CE<50>variaron de 2,1 ng/ml a 4,5 ng/ml.

[0220] Figura 6: Unión de anticuerpos a-IL1R7 humanizados a células HEK-293-hlL1R7

[0221] Se muestran los resultados de los experimentos realizados según se detalla en el ejemplo 4. La unión de los anticuerpos humanizados anti-IL-1R7 IgG1-LALA al IL1R7 humano expresado en la superficie celular se probó con células HEK-293 transfectadas con ADN que codifica el IL1R7 humano. Los valores de unión de CE<50>variaron de 1,7 y 8,3 ng/ml.

[0222] Figura 7: Neutralización de la señalización de NF-kB inducida por IL-18 en una estirpe celular reportera HEK-Blue-IL18™

[0223] Se muestran los resultados de los experimentos realizados según se detalla en el ejemplo 5. Las células reporteras HEK-Blue-IL18™, estimuladas con 100pg/ml de IL-18 humana, se trataron con concentraciones crecientes de anticuerpos monoclonales humanizados a-IL1R7 IgG1-LALA para interferir en la señalización de NF-<k>B inducida por IL-18. Los valores de inhibición de CE<50>cariaron entre 3,2 y >50 jg/ml.

[0224] Figura 8: Neutralización de la liberación de IL-6 inducida por IL18 por células A-549_IL18Rb_IL1R9

[0225] Se muestran los resultados de los experimentos realizados según se detalla en el ejemplo 6. Se ha probado la neutralización de la secreción de IL-6 inducida por IL-18 con células A-549_IL18Rb_IL1R9. Las células se incubaron con concentraciones crecientes de anticuerpos monoclonales humanizados a-IL1R7 IgG1-LALA o un anticuerpo de referencia a-hlL1R7 murino de R&D Systems (MAB1181) junto con 10 ng/ml de IL-18 durante<6>h. La liberación de IL-<6>en el sobrenadante del cultivo se cuantificó mediante ELISA.

[0226] Figura 9: Neutralización de la liberación de IFN-g inducida por IL-18 en mieloblastos KG-1

[0227] Se muestran los resultados de los experimentos realizados según se detalla en el ejemplo 7. Los mieloblastos KG-1 se trataron con anticuerpos monoclonales humanizados a-IL1R7 IgG1-LALA o un anticuerpo de referencia a-hlL1R7 murino de R&D Systems (MAB1181) para comprobar su capacidad de bloquear la liberación de IFN-<y>inducida por hIL-18. En la figura 9A se muestra la inhibición de la liberación de IFN-y a una concentración de anticuerpo de 1,4 |jg/ml. En la figura 9B se muestran los valores de CE<50>de la inhibición de los experimentos de valoración de la dosis de los anticuerpos (5000 a 0,03 ng/ml).

[0228] Figura 10: Secuencias de anticuerpos humanizados

[0229] Secuencias completas de las regiones variables y de las CDR respectivas

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse a IL-1R7 humano, en donde el anticuerpo comprende

a) una región VH de SEQ ID NO: 1189 y comprende una región CDR1H de SEQ ID NO: 309, una región CDR2H de SEQ ID NO: 457 y una región CDR3H de SEQ ID NO: 605, y

b) una región VL de SEQ ID NO: 1198 o 1203 y comprende una región CDR1L de SEQ ID NO: 753, una región CDR2L de SEQ ID NO: 901 y una región CDR3L de SEQ ID NO: 1049 o 1205.

2. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico de conejo/humano.

3. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que presenta una afinidad reducida por los receptores de Fcy humanos en comparación con Fcy de IgG de tipo silvestre.

4. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la señalización a través del receptor de Fcy humano se reduce en comparación con la señalización del receptor de Fcy de IgG de tipo silvestre.

5. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por IL-18, que es una enfermedad inmunitaria o una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad inflamatoria o autoinflamatoria o una enfermedad cardiovascular.

6. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en diabetes de tipo 1 o 2, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn (EC); colitis ulcerosa (CU), esclerosis múltiple, sarcoidosis, arteritis de células gigantes (ACG), degeneración macular asociada a la edad (DMAE), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad de Still de inicio en la edad adulta (ESA), artritis idiopática juvenil sistémica (AIJS), asma grave, uvenitis, atrofia geográfica, aterosclerosis e inflamación crónica inducida por tumores.

7. Una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.