ES3040783T3 - Tacrolimus for use for the treatment of lymphedema - Google Patents

Abstract

Se proporcionan composiciones farmacéuticas y métodos para el tratamiento o la prevención del edema, mediante el uso de un agente anti-células T, un agente anti-TGF-β1 o un agente antiangiotensina, preferiblemente una combinación de al menos dos de dichos agentes. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para administración sistémica o local, y se administran preferiblemente por vía tópica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tacrolimus para uso en el tratamiento de linfedema

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos No.

62/112,273, presentada el 5 de febrero de 2015.

Antecedentes

Linfedema es una enfermedad debilitante crónica que en los Estados Unidos y países occidentales se presenta con mayor frecuencia como una complicación del tratamiento de cáncer. En este entorno, linfedema se presenta como resultado de una lesión iatrogénica en el sistema linfático con mayor frecuencia después de la disección de ganglios linfáticos, pero también como resultado de escisiones cutáneas amplias y terapia adyuvante con radiación. Purushotham et al., J. Clin. Oncol. 23:4312-4321 (2005); Szuba et al., Cancer 95:2260-2267 (2002); Tsai et al., Ann. Surg. Oncol. 16:1959-72 (2009). Se estima que hasta 1 de cada 3 pacientes que se someten a una disección de ganglios linfáticos desarrollará linfedema y las estimaciones conservadoras sugieren que se diagnostican hasta 50.000 nuevos pacientes anualmente. DiSipio et al., Lancet Oncol. 14:500-515 (2013); Petrek et al., Cancer 83:2776-2781 (1998). Debido a que el linfedema es una enfermedad de por vida sin cura, el número de individuos afectados incrementa anualmente con estimaciones actuales que varían entre 5-6 millones de estadounidenses (Rockson et al., Ann. NY Acad. Sci. 1131:147-154 (2008)) y más de 200 millones de personas en todo el mundo. Es probable que este número continúe incrementando en el futuro puesto que el desarrollo de linfedema está casi linealmente relacionado con la supervivencia a cáncer, y debido a que la prevalencia de factores de riesgo conocidos para linfedema, tal como obesidad y radiación, está aumentando. Erickson et al., J. Natl. Cancer Inst. 93:96-111 (2001).

Linfedema es desfigurante y debilitante; los pacientes tienen hinchazón crónica de la extremidad afectada, infecciones recurrentes, movilidad limitada y calidad de vida disminuida. Hayes et al., Cancer 118:2237-2249 (2012) . Además, una vez que se desarrolla linfedema, usualmente es progresivo. A pesar de que el linfedema es común y altamente mórbido, actualmente no hay cura, y el tratamiento es paliativo con el objetivo de prevenir la progresión de enfermedad en lugar de la restauración de la función linfática. Velanovich et al., Am. J. Surg. 177:184-187 (1999); Beaulac et al., Arch. Surg. 137;1253-1257 (2002). Como resultado, se requiere que los pacientes usen prendas ajustadas e incómodas durante el resto de sus vidas, en un esfuerzo por prevenir la acumulación de líquido linfático en la extremidad afectada y para someterse a tratamientos de fisioterapia intensos y que consumen mucho tiempo. Koul et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 67:841-846 (2007). Además, a pesar de la atención crónica en curso, algunos pacientes todavía tienen una progresión grave de su enfermedad con hinchazón creciente e infecciones frecuentes en la extremidad linfedematosa. Actualmente no hay una terapia farmacológica conocida que pueda detener la progresión o promover la resolución de linfedema. Cormier et al., Ann. Surg. Oncol.

19:642-651 (2012). Por lo tanto, el desarrollo de tratamientos dirigidos para linfedema es un objetivo importante y es una necesidad biomédica insatisfecha.

Estudios recientes han demostrado que la fibrosis no solo es un sello clínico de linfedema, sino también un regulador patológico clave de la enfermedad. Cheville et al., Semin. Radiat. Oncol. 13:214-225 (2003); Mihara et al., PLoS One 7:e41126 (2012); Rasmussen et al., Curr. Opin. Biotechnol. 20:74-82 (2009). El factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-p1) es un regulador crítico de la fibrosis en una variedad de sistemas de órganos, que actúa mediante mecanismos directos para incrementar la producción de colágeno por fibroblastos y disminuir la rotación de los productos de matriz. Willis et al., Am. J. Pathol. 166:1321-1332 (2005); Sakai et al., Am. J. Pathol.

184:2611-2617 (2014); Qi et al., Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288:F800-F809 (2005); Bonniaud et al., J. Immunol.

173:2099-2108 (2004); Fujimoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 305:1002-1007 (2003); Stramer et al., J. Cell Physiol. 203:226-232 (2005); Kawakami et al., J. Invest. Dermatol. 110:47-51 (1998); Li et al., Circulation 96:874-881 (1997); Martinez et al., Hepatology 21:113-119 (1995); Peltonen et al., J. Invest. Dermatol. 97:240-248 (1991); Van Laethem et al., Gastroenterology 110:576-582 (1996). Además, TGF-p1 es un regulador clave de las respuestas inflamatorias y se cree que regula la fibrosis indirectamente al modular la inflamación crónica. Pesce et al., PLoS Pathog. 5:e1000371 (2009). Recientemente se mostrado que la expresión de TGF-p1 se incrementa notablemente en tejidos linfedematosos, tanto clínicamente como en modelos de ratón de linfedema. La inhibición de TGF-p1 usando inmunoterapia acelera significativamente la regeneración linfática, disminuye la fibrosis, disminuye la inflamación y mejora la función linfática en el modelo de cola de ratón. Avraham et al., Plast. Reconstr. Surg. 124:438-450 (2009); Clavin et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295:H2113-H2127 (2008); Avraham et al., Am. J. Pathol. 177:3202-3214 (2010).

La inhibición de las respuestas fibróticas preserva la capacidad del sistema linfático para transportar líquido intersticial y células inflamatorias. Estudios recientes de nuestro laboratorio han mostrado que las células CD4+juegan un papel crucial en la regulación de la fibrosis en modelos tanto clínicos como animales de linfedema. Avraham et al., Am. J. Pathol. 177:3202-3214 (2010); Avraham et al., FASEB J. 27:1114-1126 (2013) ; Zampell et al., Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302:C392-C404 (2012); Zampell et al., PLoS ONE 7:e49940 (2012). Por ejemplo, se ha encontrado que los especímenes de biopsia de linfedema clínico y los modelos animales de linfedema se infiltran por células CD4+, y que el número de estas células se correlaciona con el grado de fibrosis y la severidad clínica de la enfermedad. Avraham et al., FASEB J. 27:1114-1126 (2013). Los pacientes con linfedema en etapa tardía tuvieron significativamente más células T infiltrantes en general, específicamente más células CD4+, que aquellos con enfermedad en etapa temprana. Mejoras en los síntomas clínicos de linfedema después de la derivación linfovenosa, un procedimiento en el que los linfáticos obstruidos se derivan a la circulación venosa, se asocia con fibrosis tisular disminuida e infiltración disminuida de células CD4+. Torrisi, et al., Lymphat. Res. Biol. 13:46-53 (2015).

La respuesta de células CD4+ en linfedema, similar a otros trastornos fibroproliferativos, se caracteriza por una población mixta de células Th1/Th2. Avraham et al., FASEB J. 27:1114-1126 (2013). Las células T CD4+ sin tratamiento previo, también conocidas como células T auxiliares o Th, patrullan las estructuras linfoides secundarias y tras la activación, se diferencian a lo largo de numerosos tipos de células distintas/superpuestas (por ejemplo, Th1, Th2, Th17, T reguladora, etc.). El subconjunto Th2 de células juega un papel clave en la regulación de las respuestas a parásitos y algunas respuestas autoinmunes. Estas células también se han implicado en la patología de enfermedades fibroproliferativas en varios sistemas de órganos que incluyen el corazón, pulmón, riñones y piel. Estudios más recientes han mostrado que el número de Th2 se incrementa en biopsias de tejido obtenidas de pacientes con linfedema y que la inhibición de la diferenciación de Th2 disminuye la patología de linfedema en modelos de ratón.

El agotamiento de células CD4+ (pero no otros tipos de células inflamatorias que incluyen células CD8+ o macrófagos) o la inhibición de la diferenciación de Th2 (pero no inflamación generalizada o inhibición de interleucina-6) disminuye notablemente el grado de fibrosis, incrementa la linfangiogénesis y el transporte de líquido linfático, y trata de manera efectiva el linfedema establecido en modelos de ratón preclínicos. Avraham et al., FASEB J. 27:1114-1126 (2013); Zampell et al., PLoS ONE 7:e49940 (2012); Ghanta et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 308:H1065-1077 (2015). Estos descubrimientos están respaldados por estudios recientes que demuestran que las células T inhiben potentemente la linfangiogénesis al producir citocinas/factores de crecimiento antilinfangiogénicos, que incluyen interferón gamma (IFN-<y>), interleucina (IL)-4, IL-13 y TGF-p1. Kataru et al., Immunity 34:96-107 (2011); Shin et al., Nat. Commun. 6:6196 (2015); Shao et al., J. Interferon. Cytokine Res.

26:568-574 (2006); Oka et al., Blood 111:4571-4579 (2008). En conjunto, estos descubrimientos sugieren que infiltrar células CD4+ en tejidos linfedematosos disminuye la función linfática a través de múltiples mecanismos que incluyen inducción de cambios estructurales de vasos linfáticos secundarios a fibrosis tisular e inhibición de formación de vasos linfáticos colaterales.

Tratamientos experimentales previos para linfedema se han centrado en la administración de citocinas linfangiogénicas. Skobe et al., Nat. Med. 7:192-198 (2001). Por ejemplo, algunos estudios previos se han centrado en la reparación de linfáticos dañados usando citocinas linfangiogénicas tal como factor de crecimiento endotelial vascular-c (VEGF-C). Tammela et al., Nat. Med. 13:1458-1466 (2007); Baker et al., Breast Cancer Res. 12:R70 (2010). Aunque prometedora, la aplicación de este enfoque, particularmente a pacientes con cáncer, puede ser insostenible ya que estos mismos mecanismos regulan el crecimiento tumoral y la metástasis, lo que aumenta el riesgo de metástasis o recurrencia de cáncer. Zhang et al., Cancer Res. 70:2495-2503 (2010); Yu et al., J. Exp. Clin. Cancer Res. 28:98 (2009); Sugiura et al., Int. J. Oncol. 34:673-680 (2009); Gu et al., Clin. Exp. Metastasis 25:717-725 (2008); Kazama et al., Hepatogastroenterology 54:71-76 (2007); Hirakawa et al., Blood 109:1010-1017 (2007). Por el contrario, el agotamiento de las células T CD4+ localmente puede tratar la patología subyacente en lugar de solo promover la linfangiogénesis y por lo tanto, puede ser mucho más seguro para uso en pacientes con cáncer. Por lo tanto, este enfoque puede permitir el tratamiento de sobrevivientes de cáncer durante brotes/exacerbaciones de linfedema, adicionar a la terapia conservadora en pacientes no quirúrgicos, prevenir el desarrollo de enfermedad en pacientes de alto riesgo o mejorar los resultados de los tratamientos quirúrgicos para linfedema.

Tacrolimus es un agente anti-células T que está aprobado por la FDA como una formulación tópica y se usa para tratar enfermedades inflamatorias/fibróticas cutáneas que incluyen dermatitis atópica (Ruzicka et al., N. Engl. J. Med. 337:816-821 (1997)), psoriasis (Wang et al., J. Cutan. Med. Surg. 18:8-14 (2014)), y esclerodermia localizada (Mancuso et al., Br. J. Dermatol. 152:180-182 (2005)). Tacrolimus es un macrólido producido por la bacteria del sueloStreptomyces tsukubaensisque se tolera bien cuando se usa para la prevención de rechazo de trasplante y tratamiento de una variedad de enfermedades autoinmunitarias. Ejerce sus propiedades anti-células T al unirse a la proteína de unión a FK-506 12 (FKBP-12) inhibiendo de este modo la calcineurina y en última instancia, disminuyendo la expresión de IL-2. Clipstone et al., Nature 357:695-697 (1992). Debido a que IL-2 es esencial para la activación de células T y la diferenciación de células T CD4+, los inhibidores de calcineurina tienen profundos efectos inmunosupresores de células CD4+. Liao et al., Immunity 38:13-25 (2013); Rautajoki et al., Ann. Med.

40:322-335 (2008).

Teriflunomida es un agente inmunosupresor que disminuye las respuestas inflamatorias de células T. La administración oral de teriflunomida está aprobada por la FDA para el tratamiento de esclerosis múltiple. Williamson et al., J. Biol. Chem. 270:22467-22472 (1995); Davis et al., Biochem. 35:1270-1273 (1996); Iglesias-Bregna et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 347:203-211 (2013). Teriflunomida es el metabolito activo de leflunomida e inhibe la síntesis de pirimidinade novoal bloquear la enzima dihidroorotato deshidrogenasa. También se ha mostrado que teriflunomida inhibe la activación de transductor de señal y activador de transcripción-6 (STAT-6) un regulador clave de diferenciación de Th2. Olsan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 108:18067-18072 (2011). Como resultado de estos mecanismos, la teriflunomida inhibe la división activa de células Th2 y disminuye las respuestas inflamatorias.

La pirfenidona es un compuesto que tiene efectos antifibróticos y antiinflamatorios. Estudios recientes han sugerido que esta actividad se debe, al menos en parte, a la inhibición de la producción y actividad de TGF-p. lyer et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 291:367-373 (1999); Tada et al., Clin. Exper. Pharmacol. Physiol. 28:522-527 (2001); Oku et al., Eur. J. pharmacol. 590:400-408 (2008); Tian et al., Chin. Med. Sci. J. 21:145-151 (2006); Schaefer et al., Eur. Respir. Rev. 20:85-97 (2011). Actualmente está aprobada en los Estados Unidos por la FDA para administración oral en el tratamiento de fibrosis pulmonar idiopática (IPF) después de que se estableció su seguridad y eficacia en tres ensayos clínicos de 1.247 pacientes con IPF. Taniguchi et al., Eur. Respir. J. 35:821-829 (2010); Noble et al., Lancet 377:1760-1769 (2011); King et al., N. Engl. J. Med. 370:2083-2092 (2014). Además del tratamiento de la FPI, la pirfenidona se ha evaluado clínicamente por su seguridad y eficacia para el tratamiento de otros trastornos fibróticos crónicos, incluida fibrosis renal, fibrosis hepática y mielofibrosis. Tada et al., Clin. Exper. Pharmacol. Physiol. 28:522-527 (2001); Cho et al., Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 2:906-913 (2007); Nagai et al., Intern. Med.

41:1118-1123 (2002); Raghu et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 159:1061-1069 (1999); Gahl et al., Mol. Genet. Metab. 76:234-242 (2002); Armendariz-Borunda et al., Gut 55:1663-1665 (2006); Angulo et al., Dig. Dis. Sci.

47:157-161 (2002); Mesa et al., Brit. J. Haematol. 114:111-113 (2001).

El captopril es un inhibidor de enzima convertidora de angiotensina (ACE), aprobado por la FDA para administración oral en el tratamiento de hipertensión y ciertos tipos de insuficiencia cardíaca y nefropatía diabética. ACE convierte la angiotensina I (AngI) en angiotensina II (AnglI) y provoca la constricción de los vasos sanguíneos, inhibe la vasodilatación e indirectamente regula los volúmenes de líquido intravascular por efectos en el sistema renina-angiotensina (RAS). Por lo tanto, la inhibición de ACE ha sido una terapia principal para la hipertensión. Estudios más recientes han mostrado que AngII también es un regulador clave de la fibrosis en una variedad de sistemas de órganos, incluidos el riñón, hígado y pulmón. Langham et al., Diabetes Care 29:2670-2675 (2006); Alves de Albuquerque et al., Kidney Intl. 65:846-859 (2004); Osterreicher et al., Hepatology. 50:929-938 (2009); Mak et al., Mol. Ther. 23:1434-1443 (2015); Wang et al., Cell Physiol. Biochem. 36:697-711 (2015). Los efectos profibróticos de AngII se median por varios mecanismos, incluida la producción de especies reactivas a oxígeno, producción de quimiocinas y citocinas, expresión incrementada de moléculas de adhesión y regulación de expresión/actividad de TGF-p. En contraste, AngI tiene actividades antiproliferativas y antifibróticas al activar su receptor de superficie celular, Mas. Clarke et al., Int. J. Hypertens. 2012:307315 (2011). Como resultado, se han propuesto inhibidores de ACE y/o AngII, como captopril, losartán y otros medicamentos similares, como una opción terapéutica potencial para trastornos fibróticos del pulmón, riñón e hígado.

Actualmente no hay terapias farmacológicas disponibles para el tratamiento del linfedema. Estudios previos sobre linfedema se han centrado en el tratamiento con medicamentos sistémicos. Por ejemplo, la cumarina tomada por vía oral se ha usado en pacientes con linfedema con éxito modesto. Casley-Smith et al., BMJ 307:1037-1041 (1993); Casley-Smith et al., N. Engl. J. Med. 329:1158-1163 (1993); Casley-Smith et al., Australas J. Dermatol.

33:69-74 (1992); Loprinzi et al., N. Engl. J. Med. 340:346-350 (1999). Sin embargo, la aplicación clínica generalizada de este fármaco se ha obstaculizado por una toxicidad significativa que incluye insuficiencia hepática y muerte. Loprinzi et al., N. Engl. J. Med. 340:346-350 (1999). Las estrategias dirigidas a la fibrosis, en particular, la inhibición de las respuestas inflamatorias CD4+ generalizadas, diferenciación de Th2 y/o la vía de TGF-p, mantienen la promesa clínica para tratamiento de linfedema. Aunque es altamente efectivo, el agotamiento sistémico de células CD4+ no es clínicamente viable debido a una morbilidad inaceptable y complicaciones sistémicas tal como infecciones, recurrencia de cáncer y trastornos autoinmunitarios. En contraste, la administración local de agentes para tratar eventos patológicos relacionados con linfedema es un enfoque novedoso que puede limitar la toxicidad sistémica. Debido a que el linfedema es principalmente una enfermedad de la piel y los tejidos blandos subcutáneos de las extremidades, es posible usar enfoques tópicos, que se pueden tolerar mejor y proporcionar un enfoque más específico, evitando de este modo complicaciones sistémicas. Por consiguiente, existe la necesidad en la técnica de tratamientos novedosos para linfedema, especialmente tratamientos tópicos.

Sumario de la invención

La invención se define por el conjunto de reivindicaciones anexas. Cualquier realización que no caiga dentro del alcance de las reivindicaciones anexas no forma parte de la invención. Más adelante se resumen algunos de los aspectos principales de la presente invención. Se describen aspectos adicionales en las secciones de descripción detallada de la invención, ejemplos, dibujos y reivindicaciones de esta divulgación. Se propone que la descripción en cada sección de esta divulgación se lea en conjunto con las otras secciones. Además, las diferentes realizaciones descritas en cada sección de esta divulgación se pueden combinar de varias maneras diferentes, y se propone que todas estas combinaciones caigan dentro del alcance de la presente invención. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para usarse en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) por terapia (o para diagnóstico).

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de tacrolimus para usarse en el tratamiento o prevención de linfedema, en donde el linfedema se asocia con tratamiento de cáncer, es el resultado de lesión linfática, se provoca por una infección y/o se provoca por obesidad.

De acuerdo con la presente invención, también se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de: tacrolimus, y uno o más de pirfenidona, teriflunomida o captopril; o uno o más de pirfenidona, leflunomida o captopril, para usarse en el tratamiento o prevención de linfedema.

También se describe en la presente una composición farmacéutica que comprende una combinación de agentes anti-células T, anti-TGF-p1 y/o anti-angiotensina. Por ejemplo, en la presente se describe una composición farmacéutica que comprende: (i) una cantidad efectiva de uno o más agentes anti-células T y (ii) una cantidad efectiva de uno o más agentes anti-TGF-p1 y/o una cantidad efectiva de uno o más agentes anti-angiotensina. En particular, en la presente se describe una composición farmacéutica que comprende (i) una cantidad efectiva de uno o más agentes anti-células T y (ii) una cantidad efectiva de uno o más agentes anti-TGF-p1. También se describe en la presente una composición farmacéutica que comprende: (i) una cantidad efectiva de uno o más agentes anti-células T y (ii) una cantidad efectiva de uno o más agentes anti-angiotensina. También se describe en la presente una composición farmacéutica que comprende: (i) una cantidad efectiva de uno o más agentes anti células T y (ii) una cantidad efectiva de uno o más agentes anti-TGF-p1 y (iii) una cantidad efectiva de uno o más agentes anti-angiotensina.

El agente anti-células T descrito en la presente se puede seleccionar del grupo que consiste en tacrolimus, teriflunomida, leflunomida, ciclosporina, pimecrolimus, denileucina diftitox y basiliximab. El agente anti-TGF-p1 o agente antiangiotensina descrito en la presente se puede seleccionar del grupo que consiste en pirfenidona, captopril, zofenopril, enalapril, lisinopril, ramipril, quinapril, perindopril, benazepril, imidapril, trandolapril, cilazapril, fosinopril, losartán, irbesartán, olmesartán, candesartán, telmisartán, valsartán y fimasartán. El agente antiangiotensina descrito en la presente puede ser un agonista de ACE, por ejemplo, un agonista de ACE-2. La composición se puede formular para administración sistémica o para administración local. En una realización preferida, la composición se formula para administración tópica.

La composición farmacéutica descrita en la presente puede comprender una combinación de agentes anti-células T, anti- TGF-p1 y/o anti-angiotensina. En una realización de la invención, la composición para usarse en el tratamiento o prevención de linfedema comprende tacrolimus y pirfenidona. En otra realización, la composición comprende tacrolimus, pirfenidona y teriflunomida. En una realización adicional, la composición comprende tacrolimus, pirfenidona y leflunomida. En aspectos adicionales, la composición comprende tacrolimus y captopril; o tacrolimus, captopril y teriflunomida; o tacrolimus, captopril y leflunomida; o tacrolimus, captopril y pirfenidona.

En una realización en la que la composición farmacéutica se formula para administración tópica, la composición puede comprender aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 1 % de tacrolimus, de manera preferente aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,2 % de tacrolimus; aproximadamente 0,0 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml de pirfenidona, de manera preferente aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml de pirfenidona; aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml de teriflunomida, de manera preferente aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml de teriflunomida; aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 % de leflunomida, de manera preferente aproximadamente 5 % a aproximadamente 15 % de leflunomida; y/o aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 % de captopril. La composición farmacéutica está preferentemente en una forma seleccionada de un ungüento, una crema, una loción, una pasta, un gel, una mousse, una espuma, una laca, una suspensión, un líquido y una aspersión. En una realización preferida, la composición está en la forma de un ungüento.

En la presente también se describe un método para tratar o prevenir edema, el método que comprende administrar a un sujeto en necesidad de lo mismo una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de uno o más fármacos seleccionados del grupo que consiste en tacrolimus, teriflunomida, leflunomida, ciclosporina, pimecrolimus, denileucina diftitox, basiliximab, pirfenidona, captopril, zofenopril, enalapril, lisinopril, ramipril, quinapril, perindopril, benazepril, imidapril, trandolapril, cilazapril, fosinopril, losartán, irbesartán, olmesartán, candesartán, telmisartán, valsartán y fimasartán.

Está dentro de la habilidad del experto ordinario determinar un programa de dosificación y duración para administración sistémica o local. En una realización, la composición farmacéutica se administra de manera tópica al menos una vez al día. En otra realización, la composición farmacéutica se administra de manera tópica al menos dos veces al día. La composición se puede administrar dentro de aproximadamente seis semanas de una lesión linfática, preferentemente dentro de aproximadamente dos semanas de una lesión linfática.

Breve descripción de las figuras

Lafigura 1A-1Emuestra que tacrolimus tópico disminuye el linfedema de cola. Lafigura 1Amuestra fotografías representativas de colas de ratón después de la escisión quirúrgica de linfáticos colectores superficiales/profundos y tratamiento con o sin tacrolimus tópico comenzando 2 semanas (tratamiento temprano) o 6 semanas (tratamiento tardío) después de la cirugía. Las flechas indican el inicio de terapia. Lafigura 1Bes una representación gráfica de los cambios en el volumen de cola después del tratamiento temprano (*p = 0,021) o tardío (*p = 0,018) con tacrolimus en comparación con los controles. Lafigura 1C(panel superior) muestra imágenes histológicas representativas de sección transversal de colas de ratón tratados con control y con tacrolimus temprano cosechadas 6 semanas después de la ablación linfática. Los corchetes muestran el espesor de tejidos blandos. Lafigura 1C(panel inferior) muestra la cuantificación de los cambios en los tejidos blandos después del tratamiento temprano o tardío con tacrolimus (*p = <0,001). Lafigura 1Dmuestra la cuantificación de los niveles de tacrolimus en sangre completa que demuestran concentraciones inmunosupresoras en animales tratados sistémicamente (4 mg kg-1 IP diariamente) y niveles no inmunosupresores en el grupo tratado tópicamente (*p = 0,007). Lafigura 1Emuestra gráficas de citometría de flujo (panel superior) y cuantificación de células T sanguíneas (panel inferior) en animales tratados con control de vehículo, tacrolimus tópico o tacrolimus sistémico. Las gráficas de flujo representan el área de dispersión lateral (SSA) en el eje y y CD3+ que representa las células T en el eje x. Se señala una reducción significativa en las células T solo en animales tratados sistémicamente (*p = 0,012).

Lasfiguras 2A-2Dmuestran que tacrolimus tópico disminuye la inflamación después de una lesión linfática. Lasfiguras 2A-2Dmuestran imágenes representativas 40x de secciones de tejido de cola cosechadas de animales tratados con control y tacrolimus 6 semanas después de la cirugía con localización inmunofluorescente de CD45+ (figura 2Aiy 2Aii), células CD3+ (figura 2Biy 2Bii), células CD4+ (figura 2Ciy 2Cii) y células IFN-Y+ (figura 2Diy 2Dii). Las imágenes de mayor potencia (80x) se muestran en la esquina superior derecha de cada figura. Los vasos linfáticos se tiñen (LYVE-1) en cada figura. Las cuantificaciones de los conteos de células para tratamientos tempranos y tardíos se muestran a la derecha de cada figura (p < 0,001 para todos).

Lasfiguras 3A-3Dmuestran que tacrolimus tópico disminuye la fibrosis en linfedema. Lasfiguras 3Aiy 3Aii muestran imágenes representativas 40x de tejidos de cola cosechados del tratamiento con control o temprano con tacrolimus 6 semanas después de la cirugía con localización inmunofluorescente de colágeno tipo I y vasos linfáticos. Las cuantificaciones del área de tinción de colágeno I en el tratamiento temprano y tardío se muestran a la derecha (p<0,001 para ambos). Lasfiguras 3Biy 3Bii muestran imágenes representativas 40x de tinción con rojo picrosirius de tejidos de cola cosechados de animales tratados con control y con tacrolimus temprano (deposición de colágeno I y colágeno III). La cuantificación del índice de cicatriz (relación rojo:verde) se muestra a la derecha (p=0,036 temprano; p<0,001 tarde). Lasfiguras 3Ci/iiy 3Di/ii muestran una colocalización inmunofluorescente representativa 40x de TGF-p1 o pSMAD3 con vasos linfáticos en tejidos de cola cosechados de animales tratados con control o tratamiento temprano con tacrolimus 6 semanas después de la cirugía. La cuantificación del número de células positivas/área de 0,25 mm2 para ambas se muestra a la derecha de cada figura.

Lasfiguras 4A-4Gmuestran que tacrolimus mejora la función linfática después de una lesión linfática quirúrgica. Lafigura 4Amuestra imágenes representativas de ICG de colas de ratón 6 semanas después de la cirugía después del tratamiento temprano con o sin tacrolimus. Se señala el flujo de ICG proximalmente a través de la herida en animales tratados con tacrolimus. El recuadro muestra una fotografía de los mismos ratones para orientación. Lasfiguras 4Biy 4Bii muestran la captación ajustada por descomposición de 99mTc por ganglios linfáticos sacros 6 semanas después de la ligadura quirúrgica de linfáticos superficiales/profundos en animales tratados con control y con tacrolimus temprano (comenzando 2 semanas después de la cirugía) (*p=0,005). Las fotografías macroscópicas de las colas de ratón mostradas en el panel superior de lafigura 4Bii son para orientación y muestran el sitio de inyección de 99mTc y la ubicación de los ganglios linfáticos sacros; se muestran mapas de calor representativos en el panel inferior con la flecha blanca apuntando hacia los ganglios linfáticos sacros. Lafigura 4Cmuestra imágenes representativas de ICG de extremidades posteriores obtenidas 50 minutos después de la inyección en la pata distal en ratones tratados con o sin tacrolimus 4 semanas después de PLND. Las flechas blancas muestran el reflujo dérmico de ICG. La fotografía insertada muestra orientación. Lasfiguras 4Diy 4Dii son representaciones gráficas de pulsaciones de vasos linfáticos en vasos colectores de extremidades posteriores de ratones tratados con o sin tacrolimus 4 semanas después de PLND. La cuantificación de la frecuencia de pulsación se muestra a la derecha (*p=0,001). Lafigura 4emuestra imágenes representativas de colocalización fluorescente 40x de células inflamatorias (CD45+; panel superior), células iNOS+ (panel inferior) y vasos linfáticos (LYVE-1+) en tejidos cosechados de las extremidades posteriores distales de animales tratados con control o tacrolimus 4 semanas después de PLND. Se señala la acumulación perilinfática de células CD45+ e iNOS+. Lasfiguras 4F y 4Gmuestran la cuantificación de células CD45+ peril-linfáticas (figura 4F) y células iNOS+ (figura 4G) en tejidos de extremidades posteriores distales de animales tratados con control o con tacrolimus cosechados 4 semanas después de PLND.

Lasfiguras 5A-5Dmuestran que tacrolimus tópico incrementa la formación de vasos linfáticos colaterales después de una lesión linfática. Lafigura 5Ai muestra imágenes representativas 40x inmunofluorescentes longitudinales de vasos LYVE-1 que puentean las heridas de cola creadas quirúrgicamente de ratones tratados con control y con tacrolimus temprano cosechados 6 semanas después de la lesión linfática; el recuadro muestra el área donde se obtuvieron las secciones longitudinales. Lafigura 5Aii muestra la cuantificación de la densidad de vasos linfáticos de puente (LVD) en la porción con herida de la cola en ratones tratados con control versus ratones tratados con tacrolimus temprano o tardíamente (p<0,001 para ambos). Lafigura 5Aiii muestra qPCR de ARN cosechado de tejidos de cola de ratón tratado con control y tacrolimus temprano cosechados 6 semanas después de la lesión linfática, lo que demuestra la expresión relativa de VEGF-C (p = 0,264), TGF-p1 (p = 0,006) e IFN-y (p = 0,014). Lafigura 5Bes una fotografía de una extremidad posterior de ratón que muestra el sitio de formación de vasos colaterales que drena hacia los ganglios linfáticos inguinales antes y después de PLND. Lafigura 5Cmuestra imágenes representativas de ICG (paneles izquierdos) e inmunofluorescentes 40x de vasos LYVE-1 (panel derecho que muestra el área en el cuadro) en animales tratados con control y tacrolimus 4 semanas después de PLND. Lafigura 5Dmuestra la cuantificación de LVD linfática colateral en la región de muslo aterolateral de animales tratados con control o tacrolimus (p<0,001).

Lasfiguras 6A-6Fmuestran que tacrolimus incrementa la linfangiogénesis inflamatoria.(A)Imágenes representativas macroscópicas (paneles izquierdos) y de montaje completo 5x (paneles derechos) de córneas de ratón teñidas para vasos linfáticos (LYVE-1+/débilmente CD31+) y vasos sanguíneos (CD31+/LYVE-1-) cosechados 2 semanas después de la colocación de sutura y tratamiento con control de vehículo o tacrolimus sistémico. El cuadro denota el área mostrada en las imágenes de montaje completo. Lasfiguras 6B y 6Cmuestran la cuantificación de vasos linfáticos corneales (LYVE-1+) y sanguíneos (CD31+/LYVE-1-). Lafigura 6Dmuestra imágenes representativas 5x de montaje completo fluorescentes de heridas de oreja que localizan LYVE-1+en animales tratados con control o tacrolimus tópico cosechados 4 semanas después de la herida. La fotografía insertada muestra el área donde se obtuvieron las secciones. Lafigura 6Emuestra la cuantificación del área de tinción LYVE-1+ en la piel de oreja (dentro de 400 pm de la herida) que demuestra un incremento en la linfangiogénesis en animales tratados con tacrolimus (p<0,001). Lafigura 6Fmuestra la cuantificación de los puntos de ramificación de vasos linfáticos por unidad de área en heridas de oreja tratadas con o sin tacrolimus que demuestran ramificación incrementada en animales tratados con tacrolimus (p<0,001).

Lafigura 7muestra que el tacrolimus tópico no disminuye las células T CD4+ circulantes. Se muestran gráficas de flujo representativas de células CD4+ de sangre periférica (panel superior) con cuantificación de células T<c>D4+ (panel inferior) después de 2 semanas de tratamiento con tacrolimus tópico, tacrolimus sistémico o control de vehículo.

Lafigura 8muestra que tacrolimus tópico disminuye la infiltración de macrófagos en linfedema post-quirúrgico. En los paneles superiores se muestran imágenes representativas 40x de secciones de tejido de cola de animales tratados con control y tacrolimus tópico temprano cosechados 6 semanas después de la cirugía con localización inmunofluorescente de células F4/80+. La cuantificación para experimentos de tratamiento tanto temprano como tardío se muestra más adelante.

Lasfiguras 9A-9Cmuestran el modelo de disección de ganglios linfáticos poplíteos. Lafigura 9Amuestra el ganglio linfático poplíteo, lleno de contraste azul de Evan, visible en la almohadilla de grasa poplítea. Lafigura 9Bmuestra que el ganglio linfático poplíteo, junto con los colectores aferentes y eferentes, se aísla con su almohadilla de grasa circundante. Lafigura 9Cmuestra el contraste azul de Evan derramándose libremente en el sitio quirúrgico, después de la resección quirúrgica.

Lasfiguras 10A-10Bmuestran que PLND da por resultado ROS y DAMP en comparación con las extremidades de control simuladas. Lafigura 10Amuestra imágenes de ratón representativas (panel izquierdo) que muestran luminiscencia (que indica ROS) en la pata trasera inmediatamente después de PLND (6 horas) y 1 semana después. La cuantificación de los fotones luminiscentes (panel derecho) muestra niveles de ROS significativamente incrementados en áreas PLND pero no en simulación a 1 semana. Lafigura 10Bmuestra imágenes inmunofluorescentes representativas de secciones de piel de extremidades posteriores de ratones simulados y PLND teñidos para HSP-70 (panel superior) y HMGB1 (panel inferior).

Lafigura 11muestra que tacrolimus tópico disminuye la infiltración de células CD4+ perilinfáticas después de PLND. Los paneles superiores muestran imágenes representativas de la localización inmunofluorescente de células CD4+ y vasos linfáticos (LYVE-1+) en animales tratados con control o tacrolimus y cosechados 4 semanas después de PLND. La cuantificación se muestra más adelante.

Lasfiguras 12A-12Bmuestran que tacrolimus tópico disminuye la infiltración de células F4/80+ perilinfáticas después de PLND. Lafigura 12Amuestra imágenes inmunofluorescentes representativas de secciones de tejidos de piel de extremidades posteriores PLND tratadas con tacrolimus y vehículo teñidas para vasos linfáticos (LYVE-1) y macrófagos (F4/80). Lafigura 12Bmuestra la cuantificación de los macrófagos F4/80+ perilinfáticos.

Lafigura 13muestra que el tacrolimus tópico no altera la pulsación de vasos linfáticos colectores o linfangiogénesis en la ausencia de lesión linfática o inflamación. Los paneles superiores son imágenes representativas de imágenes linfáticas NIR de los linfáticos de extremidades posteriores en ratones operados de forma simulada (es decir, anestesia sin incisión o PLND) después del tratamiento con control o tacrolimus tópico durante 2 semanas. La cuantificación de la frecuencia de pulsación de vasos linfáticos colectores después de 3 o 14 días de tratamiento con tacrolimus se muestra más adelante.

Lasfiguras 14A-14Bmuestran que el tratamiento con tacrolimus tópico no altera la permeabilidad vascular después de una lesión linfática. Lafigura 14Amuestra imágenes macroscópicas representativas de extremidades posteriores de ratones PLND tratados con tacrolimus o vehículo después de inyecciones de azul de Evans en la vena de la cola para medir la permeabilidad vascular. Lafigura 14Bmuestra la cuantificación de la absorbancia de azul de Evans extraído con formamida de tejidos de extremidades posteriores PLND tratados con tacrolimus y vehículo.

Lasfiguras 15A-15Dmuestran que tacrolimus tópico después de PLND no altera la cobertura de a-SMA o diámetro luminal de los colectores linfáticos de extremidades posteriores. Lafigura 15Amuestra (de izquierda a derecha) una imagen de campo claro de la cara lateral de una extremidad posterior de ratón con el nivel de las secciones transversales mostradas por la elipse amarilla; imagen NIR de una extremidad posterior de ratón que muestra la anatomía de los vasos linfáticos de la extremidad posterior, con dos vasos de gran calibre en la cara lateral; imagen 5x IF de una extremidad posterior de ratón con un recuadro amarillo que indica la pata anterolateral, donde se ubican los dos vasos linfáticos colectores dominantes; imagen 20x de la región en la que se ubican los vasos colectores dominantes (mostrada con flechas blancas). Lafigura 15Bmuestra imágenes representativas 100x de secciones transversales de los vasos linfáticos colectores después de la tinción inmunofluorescente doble para podoplanina y a-SMA. Lafigura 15Cmuestra la cuantificación del área luminal. Lafigura 15Dmuestra la cuantificación del espesor de a-SMA.

Lafigura 16muestra que el tacrolimus tópico no incrementa la linfangiogénesis en ausencia de lesión/inflamación. Los paneles superiores muestran imágenes representativas 5x de tinción inmunofluorescente de vasos linfáticos en orejas de ratón no heridas después de 4 semanas de aplicación de tacrolimus tópico o control de vehículo. La cuantificación del área de tinción LYVE-1 se muestra más adelante.

Lasfiguras 17A-17Imuestran que la inhibición de TGF-p mejora la función linfática y disminuye la acumulación perilinfática de células inflamatorias después de la disección de ganglios linfáticos poplíteos. Lafigura 17Amuestra una fotografía representativa de imágenes de infrarrojo cercano de las extremidades posteriores distales de ratones tratados con control de isotipo o anticuerpos monoclonales (mAb) de TGF-p 4 semanas después de PLND (panel superior) y frecuencia de bombeo en la recolección de linfáticos (panel inferior). Se señala la frecuencia de bombeo incrementada de colectores de extremidades posteriores en ratones tratados con TGF-p mAb. También se señala el reflujo dérmico (flecha blanca) en ratones tratados con control pero no con mAb TGF-p. Lafigura 17Bmuestra la cuantificación de la frecuencia de bombeo linfático colector (pulso) en ratones de tratados con control y mAB de TGF-p. Lafigura 17Cmuestra la cuantificación del flujo de retorno dérmico en ratones tratados con control y mAB de TGF-p. Lafigura 17Dmuestra una gráfica de citometría de flujo representativa de tejidos de extremidades posteriores distales de ratones tratados con control y mAb de TGF-p 4 semanas después de PLND. Se señala el porcentaje disminuido de células CD3+CD4+ en ratones tratados con mAb de TGF-p. Lafigura 17Emuestra fotomicrografías representativas de potencia baja y alta (recuadro) de células inflamatorias perilinfáticas (LYVE-1+) (CD45+; superior) e iNOS+ (inferior) en ratones tratados con control y con mAb de TGF-p.La figura 17Fmuestra la cuantificación de la citometría de flujo para células CD4+ en tejidos de extremidades posteriores en ratones tratados con control y mAb de TGF-p. Lafigura 17Gmuestra la cuantificación de la cuantificación del número de vasos LYVE-1 en ratones tratados con control y mAb de TGF-p.La figura 17Hmuestra la cuantificación del número de células CD45+ perilinfáticas en ratones tratados con control y mAb de TGF-p.La figura 17Imuestra la cuantificación del número de células iNOS+ perilinfáticas en ratones tratados con control y mAb de TGF-p.

Lasfiguras 18A-18Gmuestran que la pirfenidona sistémica mejora la función linfática en la extremidad posterior después de una lesión linfática quirúrgica. Lafigura 18A(paneles superiores) muestra imágenes representativas NIR de extremidades posteriores obtenidas 50 minutos después de la inyección en pata distal de ICG en ratones tratados con o sin pirfenidona 4 semanas después de PLND. Las flechas blancas muestran el reflujo dérmico de ICG. La fotografía insertada es para orientación. Los paneles inferiores muestran representaciones gráficas de pulsaciones de vasos linfáticos en vasos colectores de extremidades posteriores de ratones tratados con o sin pirfenidona 4 semanas después de PLND. Lafigura 18Bmuestra la cuantificación de la frecuencia de pulsación (pulsos/minuto) a la derecha (n = 6 animales/grupo; *p<0,05). Lafigura 18Cmuestra la cuantificación del flujo de retorno dérmico en ratones tratados con control y pirfenidona. Lafigura 18Dmuestra la cuantificación de vasos LYVE-1+/área de 0,25 mm2 en tejidos de extremidades posteriores distales de animales tratados con control o con pirfenidona cosechados 4 semanas después de PLND (n = 6 animales/grupo; *p<0,001 para LYVE-1). Lafigura 18Emuestra imágenes representativas de colocalización fluorescente de potencia baja y alta (recuadro) de células inflamatorias (CD45+; paneles superiores), células iNOS+(paneles inferiores) y vasos linfáticos (LYVE-1+) en tejidos cosechados de las extremidades posteriores distales de animales tratados con o sin pirfenidona 4 semanas después de PLND, barra de escala =100 pm. Las imágenes de mayor potencia (80x) se muestran en la esquina inferior derecha de cada figura, barra de escala =20 pm. Se señala la acumulación perilinfática de células CD45+ e iNOS+. Lafigura 18Fmuestra la cuantificación de células CD45+ peril-linfáticas en ratones tratados con control y pirfenidona. Lafigura 18Gmuestra la cuantificación de células iNOS+ perilinfáticas/hpf en ratones tratados con control y pirfenidona.

Lasfiguras 19A-19Imuestran que la pirfenidona sistémica y tópica disminuye linfedema e inflamación de cola de ratón. Lafigura 19Amuestra fotografías representativas de colas de ratón después del tratamiento sistémico y tópico con pirfenidona o control de vehículo. El tratamiento se inició 7 semanas después de la lesión linfática de la cola. Se señala mejora notable en los ratones tratados con pirfenidona. Lafigura 19Bmuestra la cuantificación de los volúmenes de cola de ratón en ratones tratados con control, pirfenidona tópica y pirfenidona sistémica. Se señalan reducciones significativas en los ratones tratados con pirfenidona (la flecha muestra cuándo se inició el tratamiento con pirfenidona). Lafigura 19Cmuestra la cuantificación de la deposición de tejido fibroadiposo en ratones tratados con control y pirfenidona. Lafigura 19Dmuestra la cuantificación de la deposición de colágeno tipo I en ratones tratados con control y pirfenidona. Lafigura 19Emuestra fotomicrografías representativas de sección transversal de colas de ratón tratados con control o pirfenidona (sistémica o tópica). Lafigura 19Fmuestra fotomicrografías representativas de alta potencia de secciones transversales de cola teñidas para colágeno tipo I y vasos linfáticos (LYVE-1). Se señala deposición disminución disminuida de colágeno tipo I en los ratones tratados con pirfenidona. Lafigura 19Gmuestra la captación nodal pico de 99Tc después de la inyección de cola distal de 99Tc conjugado con coloide de azufre. Se señala captación incrementada en los ganglios linfáticos sacros en ratones tratados con pirfenidona. Lafigura 19Hmuestra la tasa de captación de ganglios linfáticos de 99Tc después de la inyección de cola distal. Se señala captación más rápida en los ratones tratados con pirfenidona. Lafigura 19Imuestra fotomicrografías representativas de alta potencia de secciones transversales de cola teñidas para leucocitos (CD45+) y vasos linfáticos (LYVE-1). Se señala acumulación disminuida de células CD45+ perilinfáticas en los ratones tratados con pirfenidona.

Lasfiguras 20A-20Kmuestran que pirfenidona disminuye la inflamación perilinfática y la expresión de TGF-p. Lafigura 20Amuestra fotomicrografías representativas de secciones de extremidades posteriores que demuestran acumulación perilinfática de células CD4+ en animales tratados con control y pirfenidona (tratamiento sistémico mostrado en paneles izquierdos; tratamiento tópico mostrado en paneles derechos). Las imágenes de alta potencia se muestran en el recuadro. Lafigura 20Bmuestra fotomicrografías representativas de secciones de extremidades posteriores que demuestran la acumulación perilinfática de células TGF-p1 en animales tratados con control y pirfenidona (tratamiento sistémico mostrado en los paneles izquierdos; tratamiento tópico mostrado en los paneles derechos). Lafigura 20Cmuestra fotomicrografías representativas de secciones de extremidades posteriores que demuestran acumulación perilinfática de células SMAD3+ en animales tratados con control y pirfenidona (tratamiento sistémico mostrado en paneles izquierdos; tratamiento tópico mostrado en paneles derechos). Lafigura 20Dmuestra la cuantificación de células CD4+ perilinfáticas en ratones tratados con control y pirfenidona. Lafigura 20Emuestra la cuantificación de células TGF-p1+ perilinfáticas en ratones tratados con control y pirfenidona. Lafigura 20Fmuestra la cuantificación de células SMAD3+ perilinfáticas en ratones tratados con control y pirfenidona. Lafigura 20Gmuestra una fotomicrografía de alta potencia de un vaso colextor de extremidades posteriores de ratones tratados con control y pirfenidona teñidos para podoplanina, a-SMA y colágeno tipo I. Se señala el engrosamiento y proliferación de células a-SMA+ en ratones de control. Lafigura 20Hmuestra la cuantificación de la deposición de colágeno tipo I alrededor de los linfáticos colectores de ratones tratados con control y pirfenidona. Lafigura 20Imuestra la expresión de TGF-p1 en suero en ratones tratados con control y pirfenidona sistémica. Lafigura 20Jmuestra la expresión de IFN-<y>en suero en ratones tratados con control y pirfenidona sistémica. Lafigura 20Kmuestra la expresión de VEGF-C en suero en ratones tratados con control y pirfenidona sistémica.

Lasfiguras 21A-21Fmuestran que la pérdida de expresión de células T pero no de células mieloides TGF-p previene el desarrollo de linfedema después de una lesión linfática. Lafigura 21Amuestra la expresión relativa de ARNm de TGF-p1 en tejidos de cola cosechados de animales con control, con célulascre T y mieloidecre 6 semanas después de la lesión linfática de cola. Lafigura 21Bmuestra fotomicrografías representativas de ratones de control, con mieloide-TGF-p1cre y células T-TGF-p1cre. Se señala la falta de hinchazón en ratones con célulascre T Lafigura 21Cmuestra la cuantificación de los volúmenes de cola de ratón en diferentes grupos. Se señalan los volúmenes disminuidos de cola en ratones con célulascre T en comparación con los controles tipo silvestre. Lafigura 21Dmuestra fotomicrografías representativas de secciones transversales de cola teñidas para H&E (parte superior), colágeno tipo I/LYVE-1 (centro) y cuantificación de deposición de tejido fibroadiposo y expresión de colágeno tipo I (inferior) en diferentes grupos. Se señala la deposición disminuida de tejido fibroadiposo en ratones con célulascre T Lafigura 21Emuestra la captación nodal pico de 99Tc inyectado en la cola distal. Se señala la captación incrementada en ratones con célulascre T Lafigura 21Fmuestra la tasa de captación nodal sacra de 99Tc en diferentes grupos. Se señala captación más rápida en ratones con célulascre T

Lasfiguras 22A-22Gmuestran que los ratones que carecen de células T que expresan TGF-p1 tienen inflamación disminuida perilinfática y la expresión de TGF-p1. Lafigura 22Amuestra fotomicrografías representativas de extremidades posteriores de ratón de diferentes grupos teñidos para células CD4+ (parte superior), células IL13+ (centro), células pSMAD3+ (parte inferior) y vasos linfáticos (LYVE-1+). Se señala la acumulación disminuida de células CD4+, número disminuido de células IL13+ y número disminuido de células pSMAD3+ en ratones con célulascre T. Lafigura 22Bmuestra la cuantificación de células CD4+ en tejidos de extremidades posteriores de animales en diferentes grupos. Lafigura 22Cmuestra la cuantificación de células Th2 (CD4+/IL13+) en tejidos de extremidades posteriores de animales en diferentes grupos. Lafigura 22Dmuestra la cuantificación de células pSMAD3+ en tejidos de extremidades posteriores de animales en diferentes grupos. Lasfiguras 22E-22Gmuestran los niveles en suero de concentración de proteína IFN-<y>(figura 22E), TGF-p1 (figura 22F) y VEGF-C (figura 22G) de ratones de control, mieloideCre y célulascre T

Lasfiguras 23A-23Hmuestran que la capacidad de respuesta de LEC TGF-p1 alterada no tiene cambios en el linfedema, inflamación o fibrosis de la cola, pero ha mejorado la linfangiogénesis. Lafigura 23Amuestra imágenes representativas de alta potencia (80x) de secciones de ganglios linfáticos cosechadas de ratones de control y FLT4cre con colocalización inmunofluorescente de pSMAD+ y LYVE-1, barra de escala =10 pm. Las flechas indican la colocalización de pSMAD3 en vasos LYVE-1+. Lafigura 23Bmuestra la cuantificación de la concentración de proteína TGF-p1 de cola en ratones de control y FLT4cre 6 semanas después de la cirugía (n = 5 animales/grupo; p = NS para ambos). Lafigura 23Cmuestra fotografías representativas de colas de ratón de control y FLT4cre después de la escisión quirúrgica de linfáticos colectores superficiales/profundos 6 semanas después de la cirugía. Lafigura 23Dmuestra una representación gráfica de los cambios de volumen de cola de las colas de ratón FLT4cre en comparación con los controles (n = 5 animales/grupo; p = NS). Lafigura 23Emuestra la cuantificación de los cambios de tejidos blandos de ratones de control y FLT4cre (n = 5 animales/grupo; p = NS). Lafigura 23Fmuestra la cuantificación del área de tinción de colágeno I (n = 5 animales/grupo; p = NS). Lafigura 23G(paneles superiores) muestra imágenes histológicas representativas de sección transversal de colas de ratón de control y FLT4cre cosechadas 6 semanas después de la ablación linfática. Los corchetes ilustran el espesor de tejidos blandos. Barra de escala= 500 pm. Lafigura 23G(paneles centrales) muestra imágenes representativas 40x de tejidos de cola cosechados de animales de control y FLT4cre6 semanas después de la cirugía con localización inmunofluorescente de colágeno tipo I y vasos linfáticos. Lafigura 23G(paneles inferiores) muestra localización de pSMAD3 y vasos linfáticos. Barra de escala= 100 pm. Lafigura 23Hmuestra imágenes representativas de mayor potencia (60x) de secciones de tejido de cola longitudinal cosechadas de heridas de cola de ratones de control y FLT4cre6 semanas después de la cirugía con localización inmunofluorescente de LYVE-1, barra de escala = 50 pm. Cuantificaciones de densidad de vasos LYVE-1+ de puente (LVD) (n/área de 0,25 mm2) para ratones de control y FLT4cre (n = 5 animales/grupo; *p<0,01).

Lasfiguras 24A-24Dmuestran que teriflunomida disminuye linfedema. Lafigura 24Amuestra una fotomicrografía macroscópica de colas de ratón tratados con vehículo (control) o teriflunomida tópica 6 semanas después de la ablación linfática. Lafigura 24Bmuestra un cambio en el volumen de cola 6 semanas después de la ablación linfática en animales tratados con vehículo o teriflunomida tópica ((*p<0,0002). Lafigura 24Cmuestra secciones transversales histológicas de colas de ratón cosechadas a 1 cm distales de la zona de lesión linfática en ratones tratados con control y teriflunomida. Los corchetes muestran el área de deposición de tejido fibroadiposo. Lafigura 24Dmuestra la cuantificación de la deposición de tejido fibroadiposo en secciones transversales de cola de ratones tratados con control de vehículo o teriflunomida tópica (*p<0,0001).

Lasfiguras 25A-25Dmuestran que teriflunomida disminuyó la fibrosis. Lafigura 25Amuestra una fotomicrografía representativa de secciones transversales de cola de ratón de ratones tratados con control y teriflunomida que localizan fibras de colágeno tipo I y linfáticos dérmicos. Se observa una disminución marcada de la fibrosis en animales tratados con teriflunomida. Lafigura 25Bmuestra la cuantificación de la deposición de colágeno tipo I en colas de ratones tratadas con control de vehículo o teriflunomida tópica (*p<0,001). Lafigura 25Cmuestra una fotomicrografía representativa de un vaso colector de extremidad posterior principal en animales tratados con control o teriflunomida que localiza a-SMA y podoplanina. Se señala proliferación disminuida de células positivas para a-SMA y lumen más ancho de linfáticos colectores en ratones tratados con teriflunomida. Lafigura 25Dmuestra la cuantificación del espesor de músculo liso perilinfático en ratones tratados con control y teriflunomida después de PLND (*p<0,05).

Lasfiguras 26A-26Bmuestran que teriflunomida disminuye la inflamación. Lafigura 26Amuestra una fotomicrografía representativa de secciones transversales de cola de ratón de ratones tratados con control y teriflunomida, que localizan células CD4+ y linfáticos dérmicos. Hay una disminución marcada en la infiltración de células CD4+ en animales tratados con teriflunomida. La inserción de caja muestra una vista de alta potencia (80x). Lafigura 26Bmuestra la cuantificación de células CD4+ en colas de ratones tratadas con control de vehículo o teriflunomida tópica (*p<0,0001).

Lasfiguras 27A-27Dmuestran que teriflunomida incrementa la linfangiogénesis. Lafigura 27Amuestra una fotomicrografía representativa de imagenología de infrarrojo cercano de linfáticos de extremidades posteriores de ratón y formación de vasos colaterales (círculos blancos) en animales tratados con control de vehículo o teriflunomida. Los linfáticos colaterales recién formados evitan el ganglio linfático poplíteo en ratones tratados con teriflunomida. Lafigura 27Bmuestra la cuantificación de la formación linfática colateral en animales después de PLND y tratados con control de vehículo o teriflunomida (*p<0,001). Lafigura 27Cmuestra una fotomicrografía representativa de la herida de cola en ratones tratados con control de vehículo o teriflunomida tópica que localiza vasos linfáticos cruzados recién formados. Hay un incremento marcado en la linfangiogénesis en ratones tratados con teriflunomida. Lafigura 27Dmuestra la cuantificación de linfáticos colaterales en heridas de cola de ratón de animales tratados con control y teriflunomida 6 semanas después de la ablación linfática (*p<0,001).

Lafigura 28muestra que la teriflunomida tópica disminuye la fuga linfática. Imagen infrarroja cercana representativa de vasos linfáticos en la extremidad posterior de ratones tratados con control de vehículo o teriflunomida después de PLND. Se señala la fuga disminuida de vasos linfáticos (flechas) en ratones tratados con teriflunomida.

Lasfiguras 29A-29Bmuestran que teriflunomida tópica incrementa la función linfática. Lafigura 29Amuestra una gráfica de citometría de flujo representativa de células dendríticas (DC) traficadas en ganglios linfáticos inguinales de ratones tratados con control de vehículo o teriflunomida después de PLND. Los ratones se trataron con una formulación tópica de FITC en la extremidad posterior distal para etiquetar las DC residentes en tejido y 24 horas después se cosecharon los ganglios linfáticos inguinales y se analizaron usando citometría de flujo para cuantificar la cantidad de DC que se habían traficado desde la periferia. El incremento marcado en el tráfico de DC indica una función linfática mejorada en animales tratados con teriflunomida. Lafigura 29Bmuestra la cuantificación del tráfico de DC en animales tratados con control y teriflunomida (n = 6; *p<0,0001).

Lasfiguras 30A-30Bmuestran que teriflunomida tópica incrementa el bombeo linfático. Lafigura 30Amuestra una gráfica de bombeo linfático colector de extremidades posteriores en ratones tratados con control y teriflunomida después de PLND. Lafigura 30Bmuestra la cuantificación de la frecuencia de bombeo linfático colector de extremidades posteriores en ratones tratados con control y teriflunomida después de PLND. Se señala un incremento significativo en el bombeo en animales tratados con teriflunomida (*p<0,002).

Lasfiguras 31A-31Bmuestran que el tratamiento con captopril incrementa el tráfico de células dendríticas después de una lesión linfática. Lafigura 31Amuestra citometría de flujo representativa de ganglios linfáticos inguinales que demuestran células FITC+ CD11c en ratones tratados con control y captopril después de PLND. Lafigura 31Bmuestra el porcentaje (izquierda) y número absoluto (derecha) de células FITC+ CD11c en ganglios linfáticos inguinales de ratones tratados con control y captopril después de PLND.

Lasfiguras 32A-32Bmuestran que el tratamiento con captopril incrementa el bombeo linfático colector de extremidades posteriores. Lafigura 32Amuestra una gráfica representativa de bombeo linfático colector como se valora por linfangiografía ICG en ratones tratados con control y captopril después de PLND. Lafigura 32Bmuestra la cuantificación de la frecuencia de paquetes (bombeo) de linfáticos colectores de extremidades posteriores.

Lasfiguras 33A-33Cmuestran que el tratamiento con captopril disminuye la infiltración de células T después de PLND. Se muestran fotomicrografías representativas de alta potencia de secciones de extremidades posteriores de ratón tratado con control (figura 33A) y con captopril (figura 33B)teñidas para CD3+ (marcador de células T) y LYVE-1 (marcador linfático). La contratinción nuclear se muestra con DAPI. Lafigura 33Cmuestra la cuantificación de células CD3+ en tejidos de extremidades posteriores de ratones tratados con control y captopril.

Lasfiguras 34A-34Cmuestran que el tratamiento con captopril disminuye la infiltración de macrófagos después de PLND. Se muestran fotomicrografías representativas de alta potencia de secciones de extremidades posteriores de ratón tratado con control (figura 34A) y con captopril (figura 34B)teñidas para F4/80+ (marcador de macrófagos) y LYVE-1 (marcador linfático). La contratinción nuclear se muestra con DAPI. Lafigura 34Cmuestra la cuantificación de células f4/80+ en tejidos de extremidades posteriores de ratones tratados con control y captopril.

Lasfiguras 35A-35Dmuestran que el tratamiento con captopril incrementa la linfangiogénesis después de PLND. Se muestran fotomicrografías representativas de alta potencia de secciones de extremidades posteriores de ratón tratado con control (figura 35A) y con captopril (figura 35B) teñidas para LYVE-1 (marcador linfático). La contratinción nuclear se muestra con DAPI. Lafigura 35Cmuestra la cuantificación de vasos LYVE-1+ en ratones tratados con control y captopril (*p<0,05).

Lafigura 36muestra que el tratamiento con captopril disminuye la hinchazón de pata después de la ablación linfática de extremidades posteriores con DT. Fotografías representativas de patas de ratón en grupos tratados con control (superior) y captopril (inferior) en diferentes momentos después de la ablación linfática DT Se señala una disminución obvia en la hinchazón de patas en los ratones tratados con captopril.

Lasfiguras 37A-37Cmuestran que el tratamiento con captopril disminuye la infiltración de células T después de la ablación linfática de extremidades posteriores con DT Fotomicrografías representativas de alta potencia de secciones de extremidades posteriores de ratón tratado con control (figura 37A) y con captopril (figura 37B)teñidas para CD3+ (marcador de células T) y LYVE-1 (marcador linfático). Los tejidos ipsilaterales se cosechan de la extremidad tratada con DT, en tanto que los tejidos contralaterales son de la extremidad opuesta no tratada. La contratinción nuclear se muestra con DAPI. Lafigura 37Cmuestra la cuantificación de células CD3+ en tejidos de extremidades posteriores de ratones tratados con control y captopril. Se señala la diferencia significativa (*p<0,05) entre el control ipsilateral y las extremidades de captopril ipsilaterales.

Lasfiguras 38A-38Cmuestran que el tratamiento con captopril disminuye la infiltración de macrófagos de extremidades posteriores después de la ablación linfática con DT Se muestran fotomicrografías representativas de alta potencia de secciones de extremidades posteriores de ratón tratado con control (figura 38A) y con captopril (figura 38B)teñidas para F4/80 (marcador de macrófagos) y LYVE-1 (marcador linfático). La contratinción nuclear se muestra con DAP<i>. Lafigura 38Cmuestra la cuantificación de células F4/80+ en tejidos de extremidades posteriores de ratones tratados con control y captopril. Se señala la diferencia significativa (*p<0,005) entre el control ipsilateral y las extremidades de captopril ipsilaterales.

Lasfiguras 39A-39Cmuestran que el tratamiento con captopril disminuye la deposición de músculo liso de vasos colectores de extremidades posteriores después de la ablación linfática con DT. Fotomicrografías representativas de alta potencia de secciones de extremidades posteriores de ratón tratado con control (figura 39A) y con captopril (figura 39B) teñidas para alfa actina de músculo liso (a-SMA) (marcador de músculo liso) y podoplanina (marcador linfático). La contratinción nuclear se muestra con DAPI. Lafigura 39Cmuestra la cuantificación de células a-SMA+ en tejidos de extremidades posteriores de ratones tratados con control y captopril. Se señala la diferencia significativa (*p<0,05) entre el control ipsilateral y las extremidades de captopril ipsilaterales.

Lasfiguras 40A-40Cmuestran que el tratamiento con captopril disminuye la deposición de colágeno tipo I de extremidades posteriores después de la ablación linfática con DT Se muestran fotomicrografías representativas de alta potencia de secciones de extremidades posteriores de ratón tratado con control (figura 40A) y con captopril (figura 40B) teñidas para colágeno tipo I (marcador de fibrosis) y LYVE-1 (marcador linfático). La contratinción nuclear se muestra con DAPI. Lafigura 40Cmuestra la cuantificación de colágeno tipo I en tejidos de extremidades posteriores de ratones tratados con control y captopril. Se señala la diferencia significativa (*p<0,0001) entre el control ipsilateral y las extremidades de captopril ipsilaterales.

Lasfiguras 41A-41Cmuestran que el tratamiento con captopril disminuye la expresión de enzima convertidora de angiotensina (ACE) de extremidades posteriores después de la ablación linfática con DT. Fotomicrografías representativas de alta potencia de secciones de extremidades posteriores de ratón tratado con control (figura 41A) y con captopril (figura 41B) teñidas para ACE y LYVE-1 (marcador linfático). La contratinción nuclear se muestra con DAPI. Lafigura 41Cmuestra la cuantificación de ACE en tejidos de extremidades posteriores de ratones tratados con control y captopril. Se señala la diferencia significativa (*p<0,0001) entre el control ipsilateral y las extremidades de captopril ipsilaterales.

Lafigura 42muestra que el tratamiento con captopril incrementa la formación de linfáticos colaterales después de la ablación linfática de extremidades posteriores con DT Se muestran fotografías representativas de ICG de las extremidades posteriores de control (panel izquierdo), captopril (centro) y arquitectura linfática normal (es decir, sin tratamiento<d>T). El círculo punteado representa el área en la que se forman los linfáticos colaterales para drenar hacia los ganglios linfáticos inguinales.

Lasfiguras 43A-43Dmuestran que el tratamiento con captopril disminuye la linfangiogénesis de extremidades posteriores después de la ablación linfática con DT Fotomicrografía representativa de alta potencia de secciones de extremidades posteriores de ratón tratado con control (figura 43A) y con captopril (figura 43B) teñidas para LYVE-1 (marcador linfático). La contratinción nuclear se muestra con DApI. Lafigura 43Cmuestra la cuantificación de vasos linfáticos LYVE-1+ en tejidos de extremidades posteriores de ratones tratados con control y captopril. Se señala la diferencia significativa (*p<0,0001) entre el control ipsilateral y las extremidades de captopril ipsilaterales. Lafigura 43Dmuestra la cuantificación del área de vasos linfáticos LYVE-1+ en tejidos de extremidades posteriores de ratones tratados con control y captopril. Se señala la disminución significativa (*p<0,005) entre el control ipsilateral y las extremidades de captopril ipsilaterales.

Lafigura 44muestra que el tratamiento con captopril disminuye los volúmenes de extremidades después de la ablación linfática de extremidades posteriores con Dt Cuantificación de volúmenes de extremidades posteriores en ratones tratados con control y captopril después de la ablación linfática con DT Se señala una disminución marcada en los ratones tratados con captopril (*p<0,007).

Lasfiguras 45A-45Bmuestran que el tratamiento con captopril disminuye el linfedema de cola de ratón 6 semanas después de la ablación linfática. Lafigura 45Amuestra fotografías representativas de colas de ratón antes de la operación y semanalmente, después de la ablación linfática y el tratamiento con control de vehículo o captopril. Las flechas indican sincronización de inicio de tratamiento. Lafigura 45Bmuestra la cuantificación del cambio en los volúmenes de cola de ratón en ratones tratados con control y captopril.

Lasfiguras 46A-46Bmuestran que el tratamiento con captopril disminuye la deposición de tejido fibroadiposo en el modelo de cola de ratón de linfedema 6 semanas después de la ablación linfática. Lafigura 46Amuestra secciones transversales representativas de cola de ratón teñidas con H&E 6 semanas después de la ablación linfática y tratadas con control (izquierda) o captopril de manera tópica. Los corchetes representan la deposición de tejido fibroadiposo. Lafigura 46Bmuestra la cuantificación de la deposición fibroadiposa subcutánea en ratones tratados con control o captopril de manera tópica 6 semanas después de la ablación linfática de la cola. Se señala una disminución significativa en los ratones tratados con captopril (*p<0,0001).

Lasfiguras 47A-47Cmuestran que el tratamiento con captopril incrementa la frecuencia de bombeo de vasos colectores de cola de ratón 6 semanas después de la ablación linfática. Se muestran fotografías representativas del análisis de verde de indocianina (parte superior) de colas de ratón tratadas con control (figura 47A) o ungüento de captopril (figura 47B) de manera tópica durante 6 semanas. Las gráficas de líneas que representan la recolección de contracciones linfáticas se muestran debajo de las fotografías. Se señala el número incrementado de contracciones en animales tratados con captopril. Lafigura 47Cmuestra la cuantificación de la frecuencia de contracción o linfáticos colectores de cola de ratón en animales tratados con control y captopril. Se señala la frecuencia incrementada en los ratones tratados con captopril (*p<0,01).

Lasfiguras 48A-48Cmuestran que el tratamiento con captopril incrementa el número de vasos linfáticos que cruzan la región de la herida de cola en el modelo de cola de ratón de linfedema 6 semanas después de la ablación linfática. Se muestran secciones longitudinales representativas de las colas de ratón en animales tratados con control (figura 48A) y con captopril (figura 48B) teñidos para LYVE-1 (un marcador linfático). Lafigura 48Cmuestra la cuantificación de la densidad de vasos LYVE-1 en ratones tratados con control y captopril 6 semanas después de la ablación linfática de la cola.

Lasfiguras 49A-49Cmuestran que el tratamiento con captopril disminuye el área de vasos linfáticos y se correlaciona con estasis linfática disminuida en el modelo de cola de ratón de linfedema 6 semanas después de la ablación linfática. Se muestran secciones transversales representativas de las colas de ratón en animales tratados con control (figura 49A) y con captopril (figura 49B) teñidos para LYVE-1 (un marcador linfático). Se señala el diámetro disminuido de los vasos linfáticos en los ratones tratados con captopril. Lafigura 49Cmuestra la cuantificación del área de vasos LYVE-1+ en ratones de control y captopril. Se señala una disminución significativa en el área de los vasos linfáticos que corresponde a la estasis linfática disminuida.

Lasfiguras 50A-50Cmuestran que el tratamiento con captopril disminuye la fibrosis dérmica y la deposición de colágeno tipo I en el modelo de cola de ratón de linfedema 6 semanas después de la ablación linfática. Se muestran secciones transversales representativas de las colas de ratón en animales tratados con control (figura 50A) y con captopril (figura 50B) teñidos para colágeno tipo I, LYVE-1 y DAPI. Se señala la fibrosis disminuida en animales tratados con captopril. Lafigura 50Cmuestra la cuantificación del área de tinción de colágeno tipo I dérmico de cola de ratón en ratones tratados con control y captopril. Se señala una disminución significativa en los animales tratados con captopril (*p<0,0001).

Lasfiguras 51A-51Cmuestran que el tratamiento con captopril disminuye la expresión de enzima convertidora de angiotensina (ACE) en el modelo de cola de ratón de linfedema 6 semanas después de la ablación linfática. Se muestran secciones transversales representativas de las colas de ratón en animales tratados con control (figura 51A) y con captopril (figura 51B) teñidos para ACE, LYVE-1 y DAPI. Se señala la expresión de ACE disminuida en animales tratados con captopril. Lafigura 51Cmuestra la cuantificación del área de tinción ACE de cola de ratón en ratones tratados con control y captopril. Se señala una disminución significativa en los animales tratados con captopril (*p<0,0001).

Lasfiguras 52A-52Cmuestran que el tratamiento con captopril disminuye la acumulación perilinfática de células T (CD3+) en el modelo de cola de ratón de linfedema 6 semanas después de la ablación linfática. Se muestran secciones transversales representativas de las colas de ratón en animales tratados con control (figura 52A) y con captopril(figura 52B) teñidos para CD3, LYVE-1 y DAPI. Se señala la expresión de ACE disminuida en animales tratados con captopril. Lafigura 52Cmuestra la cuantificación de células CD3+ perilinfáticas de cola de ratón/vaso en ratones tratados con control y captopril. Se señala una disminución significativa en los animales tratados con captopril (*p<0,0001).

Lasfiguras 53A-53Cmuestran que el tratamiento con captopril disminuye la acumulación perilinfática de macrófagos (células F4/80+) en el modelo de cola de ratón de linfedema 6 semanas después de la ablación linfática. Se muestran secciones transversales representativas de las colas de ratón en animales tratados con control (figura 53A) y con captopril (figura 53B) teñidos para F4/80, LYVE-1 y DAPI. Se señala la expresión de ACE disminuida en animales tratados con captopril. Lafigura 53Cmuestra la cuantificación de células F4/80 perilinfáticas de cola de ratón/vaso en ratones tratados con control y captopril. Se señala una disminución significativa en los animales tratados con captopril (*p<0,0001).

Descripción detallada de la invención

La presente divulgación se refiere, en parte, al uso de agentes anti-células T y/o agentes anti-TGF-p1 y/o agentes anti-angiotensina como tratamientos novedosos, seguros y efectivos para edema, especialmente linfedema. La presente divulgación se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que la administración sistémica o local de agentes anti-células T, anti-TGF-p1 y/o anti-angiotensina, por ejemplo, tacrolimus, pirfenidona, teriflunomida, leflunomida y/o captopril, mejora dramáticamente el linfedema y función linfática, y tiene una variedad de otros efectos biológicos beneficiosos, incluido estimular la linfangiogénesis, cuando se administra a sujetos mamíferos. Además, debido a que estos agentes actúan en diferentes pasos de la vía de fibrosis, las combinaciones de agentes anti-células T, anti-TGF-p1 y/o anti-angiotensina pueden ser más efectivas que la administración de un agente individual, exhibiendo potencialmente efectos sinérgicos.

En la presente se describen composiciones y métodos para tratar o prevenir edema, tal como linfedema, y/o para producir una variedad de otros efectos biológicos beneficiosos que incluyen, pero no se limitan a: hinchazón de tejido reducida, estasis de fluido linfático reducida o “agrupación”, fibrosis de tejido reducida, inflamación de tejido reducida, infiltración reducida de leucocitos, infiltración reducida de macrófagos, infiltración reducida de células T sin tratamiento previo y diferenciadas, expresión reducida de TGF-p1 y expresión reducida y/o activación de mediadores en la dirección 3' (por ejemplo, pSmad3), niveles reducidos de angiotensinas y/o ACE, deposición de colágeno reducida y/o formación de cicatriz, función linfática mejorada o incrementada, transporte de fluido linfático mejorado o incrementado, linfangiogénesis mejorada o incrementada, y/o frecuencia de pulsación linfática mejorada o incrementada.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona experta en la materia con la cual se relaciona esta invención. Por ejemplo, The Dictionary of Cell and Molecular Biology (5th ed. J.M. Lackie ed., 2013), el Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (2d ed. R. Cammack et al. eds., 2008), y The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology (2d ed. P-S. Juo, 2002) pueden proporcionar a un experto definiciones generales de algunos términos usados en la presente.

Como se usa en esta especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Los términos “un” (o “una”) así como los términos “uno o más” y “al menos uno” se pueden usar indistintamente.

Además, “y/o” se va a tomar como divulgación específica de cada uno de los dos componentes o características especificadas con o sin la otra. Por lo tanto, el término “y/o” como se usa en una frase tal como “A y/o B” se propone que incluya “A y B”, “A o B”, “A” (solo) y “B” (solo). Del mismo modo, el término “y/o” como se usa en una frase tal como “A, B y/o C” se propone que incluya A, B y C; A, B o C; A o B; A o C; B o C; A y B; A y C; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

Las unidades, prefijos y símbolos se denotan en su forma aceptada del sistema internacional de unidades (SI). Los intervalos numéricos son inclusivos de los números que definen el intervalo. Cuando un término numérico está precedido por “aproximadamente”, el término incluye el número y los valores indicados ±10 % del número indicado. Los encabezados proporcionados en la presente no son limitaciones de los diferentes aspectos o realizaciones de la invención, que se pueden tener por referencia a la especificación en conjunto. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente más adelante se definen más completamente por referencia a la especificación en su totalidad.

Siempre que se describen realizaciones con el lenguaje “que comprende”, se incluyen realizaciones de otro modo análogas descritas en términos de “que consiste en” y/o “que consiste esencialmente en”.

El término “edema”, como se usa en la presente, incluye linfedema, disfunción linfática, fibrosis de tejido linfático, edema idiopático, edema periférico y edema ocular. Como se usa en la presente, “edema” no incluye edema pulmonar o edema cerebral. El edema puede incluir edema agudo, edema crónico, edema postoperatorio y edema de inicio gradual. Los síntomas de edema pueden incluir hinchazón, plenitud o tumefacción de tejidos, inflamación, fibrosis, pesadez, dolor, intervalo disminuido de movimiento, dolor, infecciones recurrentes, engrosamiento de la piel o incomodidad.

Un “agente activo” es un agente que en sí mismo tiene actividad biológica, o que es un precursor o profármaco que se convierte en el cuerpo en un agente que tiene actividad biológica. Los agentes activos para tratar o prevenir el edema pueden incluir agentes inmunosupresores, agentes antifibróticos, agentes anti-células T, agentes anti-TGF-p1 y agentes anti-angiotensina. En algunas realizaciones, los agentes son compuestos de moléculas pequeñas. En otras realizaciones, los agentes son macromoléculas, tal como polinucleótidos (por ejemplo, ARN inhibidor) o polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos).

Un “agente anti-células T” es una molécula que reduce la inflamación mediada por células T, activación de células T, diferenciación de células T y/o proliferación de células T. Las clases de agentes anti-células T incluyen inhibidores de calcineurina e inhibidores de IL-2. Los ejemplos de agentes anti-células T de molécula pequeña incluyen tacrolimus, teriflunomida, leflunomida, ciclosporina y pimecrolimus. Los ejemplos de agentes anti-células T de macromoléculas incluyen denileucina diftitox y basiliximab.

Un “agente anti-TGF-p1” es una molécula que inhibe la expresión, secreción, activación, señalización o actividad del factor de crecimiento transformante beta 1. La pirfenidona es un ejemplo de un agente anti-TGF-p1 de molécula pequeña.

Un “agente anti-angiotensina” es una molécula que inhibe la actividad de AngI o AnglI, o una molécula que inhibe la conversión de AngI en AnglI (por ejemplo, inhibidores de ACE o agonistas de ACE). Los ejemplos de agentes anti-angiotensina incluyen captopril, zofenopril, enalapril, lisinopril, ramipril, quinapril, perindopril, benazepril, imidapril, trandolapril, cilazapril, fosinopril, losartán, irbesartán, olmesartán, candesartán, telmisartán, valsartán, fimasartán, aceturato de diminazeno, xantenona y AVE 099.

Los términos “inhibir”, “bloquear” y “suprimir” se usan indistintamente y se refieren a cualquier disminución estadísticamente significativa en la actividad biológica, incluido el bloqueo completo de la actividad.

El método descrito en la presente puede comprender administrar una combinación de agentes anti-células T, anti-TGF-p1 y/o anti-angiotensina. El método descrito en la presente puede comprender administrar una composición farmacéutica que comprende: (i) una cantidad efectiva de uno o más agentes anti-células T seleccionados del grupo que consiste en tacrolimus, teriflunomida, leflunomida, ciclosporina, pimecrolimus, denileucina diftitox y basiliximab; y (ii) una cantidad efectiva de uno o más agentes anti-TGF-p1 y/o uno o más agentes anti-angiotensina seleccionados del grupo que consiste en pirfenidona, captopril, zofenopril, enalapril, lisinopril, ramipril, quinapril, perindopril, benazepril, imidapril, trandolapril, cilazapril y fosinopril, losartán, irbesartán, olmesartán, candesartán, telmisartán, valsartán y fimasartán. El método descrito en la presente puede comprender administrar un compuesto farmacéutico que comprende cualquier combinación de agentes anti-células T, anti-TGF-p1 y/o anti-angiotensina. Por ejemplo, en una realización, el método comprende administrar una composición farmacéutica que comprende tacrolimus y pirfenidona. En otra realización, el método comprende administrar una composición farmacéutica que comprende tacrolimus, pirfenidona y teriflunomida. En una realización adicional, el método comprende administrar una composición farmacéutica que comprende tacrolimus, pirfenidona y leflunomida. En aspectos adicionales, el método comprende administrar una composición farmacéutica que comprende tacrolimus y captopril; o tacrolimus, captopril y teriflunomida; o tacrolimus, captopril y leflunomida; o tacrolimus, captopril y pirfenidona.

Por “sujeto” o “ individuo” o “paciente” se refiere a cualquier sujeto, preferentemente un sujeto mamífero, para quien se desea diagnóstico, pronóstico o terapia. Los sujetos mamíferos incluyen humanos, animales domésticos, animales de granja, animales de deportes y animales de zoológico que incluyen, por ejemplo, humanos, primates no humanos, perros, gatos, conejillos de indias, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, etc.

En algunas realizaciones, el sujeto puede tener o puede haber tenido cáncer, por ejemplo, un cáncer que comprende un tumor sólido. En algunas realizaciones, el sujeto puede tener o puede haber tenido cáncer de mama o un cáncer que afecta los órganos reproductores femeninos, sistema cutáneo, sistema musculoesquelético, tejidos blandos de las extremidades o tronco, sistema reproductor masculino, sistema urinario o la cabeza y cuello. En algunas realizaciones, el sujeto se puede haber sometido a disección de ganglios linfáticos axilares. En algunas realizaciones, el sujeto ha recibido tratamiento para cáncer, y el linfedema, se asocia con el tratamiento de cáncer. Por ejemplo, el sujeto puede estar recibiendo o puede haber recibido quimioterapia o radioterapia para el tratamiento de cáncer u otras indicaciones, o puede haber tenido uno o más ganglios linfáticos removidos quirúrgicamente en el curso del tratamiento de cáncer.

En algunas realizaciones, el sujeto puede haber sufrido una lesión linfática (por ejemplo, como resultado de la remoción, ligadura u obstrucción de ganglios linfáticos o vasos linfáticos, o fibrosis de tejido linfático), o el sujeto puede ser obeso o tener o tuvo una infección que conduce a linfedema. En algunas realizaciones, la infección puede ser una infección de piel o una historia de infección o infecciones de la piel que se relacionan con linfedema o lesión linfática. En algunas realizaciones, la infección puede ser una infección parasitaria que obstruye el flujo linfático o lesiona el sistema linfático. En algunas realizaciones, el sujeto puede tener una lesión linfática sostenida por reemplazo de articulaciones, trauma, quemaduras, radiación o quimioterapia.

Los términos tal como “que trata” o “tratamiento” o “para tratar” o “que alivia” o “para aliviar” se refieren a medidas terapéuticas que curan, desaceleran, disminuyen los síntomas y/o detienen la progresión de una condición o trastorno patológico diagnosticado. Por lo tanto, aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con el trastorno. En ciertas realizaciones, un sujeto se “trata” de manera exitosa para una enfermedad o trastorno de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente si el paciente muestra, por ejemplo, alivio o eliminación total, parcial o transitorio de los síntomas asociados con la enfermedad o trastorno. Por ejemplo, “tratar el edema” puede incluir, pero no se limita a, disminuir la hinchazón, disminuir la inflamación, disminuir la fibrosis, disminuir el dolor, incrementar el intervalo de movimiento, disminuir la pesadez, disminuir la tensión, disminuir el engrosamiento de piel y/o mejorar la función linfática.

“Prevenir” o “prevención” se refiere a medidas profilácticas o preventivas que previenen y/o desaceleran el desarrollo de una condición o trastorno patológico dirigido. Por lo tanto, aquellos en necesidad de prevención incluyen aquellos en riesgo o susceptibles de desarrollar el trastorno. Los sujetos que están en riesgo o son susceptibles de desarrollar linfedema incluyen, pero no se limitan a, pacientes con cáncer que se someten a radioterapia, quimioterapia y/o disección quirúrgica de ganglios linfáticos. En ciertas realizaciones, una enfermedad o trastorno se previene de manera exitosa de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente si el paciente desarrolla, de manera transitoria o permanentemente, por ejemplo, menos o menos síntomas severos asociados con la enfermedad o trastorno, o un inicio posterior de síntomas asociados con la enfermedad o trastorno, que un paciente que no ha estado sujeto a los métodos de la invención.

En un contexto profiláctico, la composición farmacéutica de la invención se puede administrar en cualquier momento antes o después de un evento, por ejemplo, radioterapia, quimioterapia o disección quirúrgica de ganglios linfáticos, que coloca a un sujeto en riesgo o susceptible a lesión linfática y/o edema en desarrollo. En algunos aspectos, la composición farmacéutica se administra profilácticamente hasta aproximadamente una semana antes del evento, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días antes del evento. En algunos casos, la composición farmacéutica se administra profilácticamente el mismo día que el evento. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra profilácticamente dentro de las seis semanas del evento, por ejemplo, dentro de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o 6 días, o dentro de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o 6 semanas del evento. En una realización, la composición farmacéutica se administra profilácticamente durante aproximadamente 2-4 semanas o durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o 6 semanas.

En algunas realizaciones, los métodos de tratamiento y/o prevención descritos en la presente se pueden realizar en combinación con uno o más métodos de tratamiento y/o prevención de edema o linfedema adicionales conocidos en la técnica, por ejemplo, métodos de tratamiento que implican la administración de otros agentes terapéuticos y/o métodos de tratamiento que implican cirugía, masaje, terapia de compresión, terapia de drenaje de fluidos, acupuntura, láser o cualquier otro método de tratamiento adecuado.

El término “composición farmacéutica” se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica del principio activo sea efectiva, y que no contiene componentes adicionales que son inaceptablemente tóxicos para un sujeto al cual se administraría la composición. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en numerosas formas de dosis, por ejemplo, tableta, cápsula, líquido, solución, gel blando, suspensión, emulsión, jarabe, elixir, tintura, película, polvo, hidrogel, ungüento, pasta, crema, loción, gel, mousse, espuma, laca, aspersión, aerosol, inhalador, nebulizador, gotas oftálmicas, parche, supositorio y/o enema. Las composiciones farmacéuticas habitualmente comprenden un portador farmacéuticamente aceptable, y pueden comprender uno o más de un amortiguador (por ejemplo, amortiguador de acetato, fosfato o citrato), un agente tensioactivo (por ejemplo, polisorbato), un agente estabilizador (por ejemplo, albúmina humana), un conservador (por ejemplo, alcohol bencílico), un intensificador de penetración, un promotor de absorción para mejorar la biodisponibilidad y/u otros agentes solubilizantes o de dispersión convencionales. La elección de la forma de dosis y excipientes depende del agente activo que se va a administrar y la enfermedad o trastorno que se va a tratar o prevenir, y es rutinario para un experto en la técnica.

“Administración sistémica” significa que una composición farmacéutica se administra de modo que el agente activo ingrese al sistema circulatorio, por ejemplo, mediante vía enteral, parenteral, inhalatoria o transdérmica. Las vías de administración enterales implican el tracto gastrointestinal e incluyen, sin limitación, administración oral, sublingual, bucal y rectal. Las vías de administración parenteral implican vías distintas del tracto gastrointestinal e incluyen, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratecal y subcutánea. “Administración local” significa que una composición farmacéutica se administra directamente donde se desea su acción (por ejemplo, en o cerca del sitio de la lesión o síntomas). Las vías de administración locales incluyen, sin limitación, tópica, inhalación, subcutánea, oftálmica y ótica. Está dentro del alcance de un experto en la técnica formular composiciones farmacéuticas que son adecuadas para su vía de administración propuesta.

Una “cantidad efectiva” de una composición como se divulga en la presente es una cantidad suficiente para llevar a cabo un propósito específicamente establecido. Una “cantidad efectiva” se puede determinar empíricamente y de manera rutinaria, en relación con el propósito señalado, la vía de administración y forma de dosis.

En algunas realizaciones, la administración del agente anti-célula T y/o el agente anti-TGF-p1 y/o el agente antiangiotensina puede comprender la administración sistémica, en cualquier dosis adecuada y/o de acuerdo con cualquier régimen de dosificación adecuado, como se determina por un experto en la técnica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el tacrolimus o un análogo, variante o derivado del mismo se administra sistémicamente al sujeto a una dosis diaria de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg. Más en particular, tacrolimus o un análogo, variante, o derivado del mismo se puede administrar al sujeto a una dosis diaria de aproximadamente 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,0, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,0, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2.5, 2,75, 3,0, 3,25, 3,5, 3,75, 4,0, 4,25, 4,5, 4,75 o 5,0 mg/kg.

En algunas realizaciones, teriflunomida o un análogo, variante o derivado de la misma se administra sistémicamente al sujeto a una dosis diaria de aproximadamente 0,0 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg. Más en particular, teriflunomida o un análogo, variante o derivado de la misma se puede administrar al sujeto a una dosis diaria de aproximadamente 0,0, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,0, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,25, 3,5, 3,75, 4,0, 4,25, 4,5, 4,75 o 5,0 mg/kg.

En algunas realizaciones, leflunomida o un análogo, variante o derivado de la misma se administra sistémicamente al sujeto a una dosis diaria de aproximadamente 0,0 mg/kg. a aproximadamente 5 mg/kg. Más en particular, leflunomida o un análogo, variante, o derivado de la misma se puede administrar al sujeto a una dosis diaria de aproximadamente 0,0, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,0, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2.5, 2,75, 3,0, 3,25, 3,5, 3,75, 4,0, 4,25, 4,5, 4,75 o 5,0 mg/kg.

En algunas realizaciones, pirfenidona o un análogo, variante o derivado de la misma se administra sistémicamente al sujeto a una dosis diaria de aproximadamente 50 mg/kg a aproximadamente 2500 mg/kg. Más en particular, pirfenidona o un análogo, variante, o derivado de la misma se puede administrar al sujeto a una dosis diaria de aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 325, 350, 375, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400 o 2500 mg/kg.

En algunas realizaciones, captopril o un análogo, variante o derivado del mismo se administra sistémicamente al sujeto a una dosis diaria de aproximadamente 0,0 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Más en particular, captopril o un análogo, variante, o derivado del mismo se puede administrar al sujeto a una dosis diaria de aproximadamente 0,0, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,0, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,25, 3.5, 3,75, 4,0, 4,25, 4,5, 4,75, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 o 10 mg/kg.

En algunas realizaciones, la administración del agente anti-célula T y/o el agente anti-TGF-p1 y/o el agente antiangiotensina puede comprender la administración local, en cualquier dosis adecuada y/o de acuerdo con cualquier régimen de dosificación adecuado, como se determina por un experto en la técnica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, tacrolimus o un análogo, variante, o derivado del mismo se administra al sujeto en la forma de una composición tópica que comprende de aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, o de aproximadamente 0,0 mg/ml a 2 mg/ml, o aproximadamente 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,0, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,0, 1,2, 1.3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,25, 3,5, 3,75, 4,0, 4,25, 4,5, 4,75 o 5,0mg/ml de tacrolimus o un análogo, variante, o derivado del mismo. En algunas realizaciones, tacrolimus o un análogo, variante, o derivado del mismo se administra al sujeto en la forma de una composición tópica que comprende de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 1 %, o de aproximadamente 0,03 % a aproximadamente 0,5 %, o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,2 %, o aproximadamente 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,0, 0,05, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 o 1,0 % de tacrolimus o un análogo, variante, o derivado del mismo.

En algunas realizaciones, teriflunomida o un análogo, variante, o derivado de la misma se administra al sujeto en la forma de una composición tópica que comprende de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, o de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, o aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 mg/ml de teriflunomida o un análogo, variante, o derivado de la misma. En algunas realizaciones, teriflunomida o un análogo, variante, o derivado de la misma se administra al sujeto en la forma de una composición tópica que comprende de aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 %, o de aproximadamente 5 % a aproximadamente 15 %, o aproximadamente 1,0, 1,0, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3.25, 3,5, 3,75, 4,0, 4,25, 4,5, 4,75, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 15, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5 o 20 % de teriflunomida o un análogo, variante, o derivado de la misma.

En algunas realizaciones, leflunomida o un análogo, variante, o derivado de la misma se administra al sujeto en la forma de una composición tópica que comprende de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, o de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, o aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 mg/ml de leflunomida o un análogo, variante, o derivado de la misma. En algunas realizaciones, leflunomida o un análogo, variante, o derivado de la misma se administra al sujeto en la forma de una composición tópica que comprende de aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 %, o de aproximadamente 5 % a aproximadamente 15 %, o aproximadamente 1,0, 1,0, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3.25, 3,5, 3,75, 4,0, 4,25, 4,5, 4,75, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 15, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5 o 20 % de leflunomida o un análogo, variante, o derivado de la misma.

En algunas realizaciones, pirfenidona o un análogo, variante, o derivado de la misma se administra al sujeto en la forma de una composición tópica que comprende de aproximadamente 0,0 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, o de aproximadamente 0,5 mg/ml a 2 mg/ml, o aproximadamente 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,0, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,0, 1,2, 1.3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,25, 3,5, 3,75, 4,0, 4,25, 4,5, 4,75 o 5,0mg/ml de pirfenidona o un análogo, variante, o derivado de la misma. En algunas realizaciones, pirfenidona o un análogo, variante, o derivado de la misma se administra al sujeto en la forma de una composición tópica que comprende de aproximadamente 0,0 % a aproximadamente 20 %, o de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 %, o aproximadamente 0,0, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,0, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2.5, 2,75, 3,0, 3,25, 3,5, 3,75, 4,0, 4,25, 4,5, 4,75, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 15, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5 o 20 % de pirfenidona o análogo, variante, o derivado de la misma.

En algunas realizaciones, pirfenidona captopril un análogo, variante, o derivado del mismo se administra al sujeto en la forma de una composición tópica que comprende de aproximadamente 0,0 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, o de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, o aproximadamente 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,0, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,0, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,25, 3,5, 3,75, 4,0, 4,25, 4.5, 4,75 o 5,0 mg/ml de captopril o un análogo, variante, o derivado del mismo. En algunas realizaciones, captopril o un análogo, variante, o derivado del mismo se administra al sujeto en la forma de una composición tópica que comprende de aproximadamente 1% aaproximadamente 20 %, o de aproximadamente 5% aaproximadamente 15 %, o aproximadamente 1,0, 1,0, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75, 3,0, 3,25, 3,5, 3,75, 4,0, 4,25, 4,5, 4,75, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 15, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5 o 20 % de captopril o un análogo, variante, o derivado del mismo.

El agente anti-células T y/o agente anti-TGF-p1 y/o agente anti-angiotensina se puede administrar de acuerdo con cualquier régimen de dosificación adecuado, por ejemplo, donde la dosis diaria se divide en dos o más dosis separadas. Está dentro de la habilidad del experto ordinario determinar un programa de dosificación y duración para administración sistémica o local. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra de manera oral al menos una vez al día o al menos dos veces al día. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra de manera intravenosa al menos una vez al día o al menos dos veces al día. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra de manera tópica al menos una vez al día o al menos dos veces al día. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra de manera subcutánea al menos una vez al día o al menos dos veces al día.

En realizaciones en las cuales se administra más de un agente activo, los agentes se pueden administrar juntos (por ejemplo, en la misma formulación y/o al mismo tiempo), o por separado (por ejemplo, en diferentes formulaciones y/o en diferentes momentos). En algunas de estas realizaciones, los agentes se administran de manera sistémica. En algunas de estas realizaciones, los agentes se administran de manera local. En algunas de estas realizaciones, un (o más) agente se administra de manera sistémica y un (o más) agente se administra de manera local, por ejemplo, de manera tópica. Cuando se usan dos de estos agentes, es posible usar dosis o cantidades más bajas de cada agente, en comparación con las dosis necesarias cuando cada agente se usa solo.

Las realizaciones de la presente divulgación se pueden definir adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. Será evidente para aquellos expertos en la técnica que se pueden practicar muchas modificaciones, tanto a materiales como a métodos, sin apartarse del alcance de la presente divulgación.

Ejemplos

Ejemplo 1.Tratamiento y prevención de linfedema usando tacrolimus

Tacrolimus disminuye linfedema la cola sin inmunosupresión sistémica

Para estudiar el efecto del tacrolimus tópico sobre linfedema, se usó un modelo de cola de ratón de linfedema descrito anteriormente. Goldman et al., Circ. Res. 96:1193-1199 (2005); Shimizu et al., J. Am. Heart Assoc.

2:e000438 (2013); Choi et al., Circulation 125:872-882 (2012); Tabibiazar et al., PLoS Med. 3:e254 (2006); Yoon et al., J. Clin. Invest. 111:717-725 (2003). La interrupción de los linfáticos superficiales y profundos de la cola del ratón dio por resultado un incremento mayor de 100 % en los volúmenes de cola 2 semanas después de la cirugía (figura 1A,1B). Se ha mostrado previamente que la hinchazón en este punto de tiempo se debe principalmente a la acumulación de líquido intersticial. Avraham et al., FASEB J. 27:1114-1126 (2013). La obstrucción linfática crónica en la cola da por resultado el reemplazo gradual de líquido intersticial por tejido fibroadiposo, así como la acumulación de células inflamatorias se presenta durante las siguientes 4 semanas. Avraham et al., FASEB J.

27:1114-1126 (2013). Estos cambios patológicos reflejan estrechamente el linfedema clínico y persisten durante al menos 6-9 semanas adicionales una vez que se establece el linfedema. Goldman et al., Circ. Res. 96:1193-1199 (2005); Shimizu et al., J. Am. Heart Assoc. 2:e000438 (2013); Choi et al., Circulation 125:872-882 (2012); Tabibiazar et al., PLoS Med. 3:e254 (2006); Yoon et al., J. Clin. Invest. 111:717-725 (2003).

Con base en este conocimiento, se usaron dos enfoques de tratamiento con tacrolimus diferentes. Un grupo de animales se trataron con tacrolimus comenzando 2 semanas después de la cirugía durante 4 semanas (total de 6 semanas después de la cirugía de cola), en un esfuerzo por prevenir el desarrollo de linfedema (es decir, tratamiento temprano). En otro grupo, se esperaron 6 semanas después de la ablación linfática para que se estableciera el linfedema y entonces se trató con tacrolimus hasta 9 semanas, con la intención de tratar los cambios de tejidos blandos establecidos (es decir, tratamiento tardío). En todos los estudios, se trataron a los animales dos veces al día con tacrolimus al 0,1 % (0,05 g/aplicación) o control de vehículo (petrolato). Se aplicaron tacrolimus o control de vehículo como una capa delgada a toda la cola distal a (es decir, sin incluir) el sitio quirúrgico.

El tratamiento temprano con tacrolimus tópico disminuyó notablemente la hinchazón de cola y evitó el desarrollo de hinchazón permanente (figura 1A,1B). El examen macroscópico de las colas de animales de experimentación demostró una resolución casi completa del linfedema y este cambio correspondió a una disminución de 95 % en el volumen de cola y disminución de casi 50 % en el espesor de tejidos blandos (figura 1B,1C). El tratamiento tardío también fue altamente efectivo para disminuir la hinchazón macroscópica de cola, volumen de cola y espesor los tejidos blandos, en comparación con los controles, aunque en estos animales los volúmenes de la cola no regresaron a los niveles preoperatorios (figura 1B,1C).

También se analizaron los niveles sistémicos de tacrolimus y los conteos de células T periféricas para determinar si el tacrolimus aplicado tópicamente se absorbe de manera apreciable. Este análisis demostró que la absorción sistémica de tacrolimus tópico (valor medio de 1,06 ng mL-1) se mantuvo significativamente por debajo de los niveles inmunosupresores terapéuticos conocidos logrados con la administración sistémica (5-15 ng mL-1;figura 1D). Además, los animales tratados con tacrolimus tópico no mostraron cambios en las células T sanguíneas circulantes o células CD4+ (figura 1E,figura 7), en comparación con los controles tratados con vehículo.

Tacrolimus disminuye la inflamación y fibrosis después de una lesión linfática

La inflamación crónica es un sello histológico del linfedema clínico y se caracteriza por acumulación incrementada de células T auxiliares, células T reguladoras y macrófagos. Avraham et al., FASEB J. 27:1114-1126 (2013); Zampell et al., PLoS ONE 7:e49940 (2012); Ghanta et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 308:H1065-1077 (2015); Olszewski et al., Lymphology 23:23-33 (1990). De acuerdo con esto, se encontró que los animales tratados con tacrolimus habían disminuido notablemente el número de leucocitos que se infiltraron en la dermis y la grasa subcutánea en comparación con los controles (células CD45+; 56 % de tratamiento de reducción temprana; 49 % de tratamiento tardío; figura 2A). Las células inflamatorias en tejidos linfedematosos cosechados de animales de control se ubicaron en proximidad cercana a los linfáticos colectores y capilares, pero estaban virtualmente ausentes en ratones tratados con tacrolimus. De manera similar, se observaron disminuciones marcadas en los números de células CD3+ infiltrantes (53 % de reducción temprana; 49 % de tratamiento tardío;figura 2B), células CD4+ (78 % de reducción-tratamiento temprano, 71 % de tratamiento tardío;figura 2C) y células productoras de IFN-<y>(54 % de reducción-tratamiento temprano, 57 % de tratamiento tardío;figura 2D). Adicionalmente, se señaló una disminución en la infiltración de macrófagos en tejidos blandos (células F4/80+; 86 % de reducción-tratamiento temprano; 73 % de tratamiento tardío;figura 8). En conjunto, estos descubrimientos muestran que después de una lesión linfática, las células inflamatorias se acumulan en grandes números en estrecha proximidad a la piel/vasos linfáticos subcutáneos y que esta respuesta se mitiga por aplicación tópica de tacrolimus.

Los pacientes con linfedema tienen fibrosis progresiva de tejidos blandos y el grado de fibrosis se correlaciona con la severidad de enfermedad. Tassenoy et al., Lymphat. Res. Biol. 7:145-151 (2009). Por lo tanto, se analizaron varios marcadores de fibrosis en los tejidos de cola para comprender los efectos del tratamiento con tacrolimus en este aspecto de la enfermedad. Se encontró que el tratamiento tópico con tacrolimus disminuyó notablemente la deposición de colágeno tipo I dérmico y subcutáneo y el índice de cicatriz (birrefringencia roja picrosirius que mide la relación de colágeno I/III), en comparación con los ratones de control (figura 3A, 3B). Los vasos linfáticos de los ratones de control estaban rodeados por capas espesas de colágeno tipo I; en contraste, los animales tratados con tacrolimus tenían vasos linfáticos esencialmente normales. De acuerdo con esta observación y los reportes previos (Clavin et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295:H2113-2127 (2008)), también se encontró que el tratamiento con tacrolimus disminuyó notablemente la expresión del factor de crecimiento profibrótico TGF-p1 y la expresión celular de su molécula de señalización en la dirección 3' activada, SMAD3 fosforilada (pSMAD-3;figura 3C, 3D).El grado de esta respuesta fue similar para los tratamientos con tacrolimus tanto temprano como tardío.

Tacrolimus incrementa la función linfática

Para valorar la función linfática, se realizó una linfangiografía de infrarrojo cercano (NIR) con verde de indocianina (ICG), que se ha descrito como un medio efectivo para cuantificar la función linfática en humanos, cerdos y ratones al permitir la imagenología en tiempo real de vasos linfáticos, cálculo de la frecuencia de paquetes (o flujo pulsátil de líquido linfático) y análisis de reflujo dérmico y depuración de tinte. Kwon et al., Lymphat. Res. Biol. 5:219-231 (2007); Sharma et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292:H3109-3118 (2007); Unno et al., J. Vasc. Surg.

52:946-952 (2010). Usando imágenes NIR 6 semanas después de la ligadura linfática, se señaló un transporte rápido de líquido intersticial proximalmente a través de la herida de cola en animales en los que el tratamiento se inició 2 semanas después de la lesión linfática (tratamiento temprano;figura 4A).En contraste, los animales de control demostraron agrupamiento de ICG distal al sitio de escisión linfática sin transporte a través de la zona de lesión. Este descubrimiento se confirmó usando linfocintigrafía con tecnecio-99m (99mTc), una técnica en la que se inyecta un radiotrazador en la cola distal y se mide la captación por los ganglios linfáticos sacros con el paso del tiempo. La captación ajustada por descomposición de los ganglios linfáticos sacros en los animales de tratamiento temprano demostró un incremento de más de 6 veces en la captación de 99mTc en animales tratados con tacrolimus en comparación con los controles (figura 4B). El tratamiento tardío con tacrolimus incrementó de manera similar la captación ganglionar (2 veces); sin embargo, esta diferencia no alcanzó significación estadística.

Dada la eficacia de tacrolimus en la prevención y tratamiento del linfedema en el modelo de cola, a continuación se buscó estudiar cómo tacrolimus modula la función linfática después de la lesión linfática usando un modelo previamente descrito de disección de ganglios linfáticos poplíteos (PLND) (figura 9). Blum et al., Breast Cancer Res. Treat. 139:81-86 (2013). Este modelo es clínicamente relevante puesto que la disección de ganglios linfáticos en el curso del tratamiento de cáncer es la causa más común de linfedema en los países desarrollados. Primero se utilizó el modelo de ratón PLND para comprender mejor los mecanismos por los cuales se activan las reacciones inflamatorias crónicas después de una lesión linfática.

Estudios previos han demostrado que las células endoteliales linfáticas (LEC) son altamente sensibles a las especies reactivas de oxígeno (ROS) (Kasuya et al., Sci. Rep. 4:4173 (2014)) y que ROS pueden activar la inflamación crónica. Gorlach et al., Redox Biol. 6:372-385 (2015). Para determinar si las ROS están presentes después de PLND, se analizó la acumulación de ROS en tejidos distales a la zona de lesión 1 semana después de la lesión con base en el papel conocido de los vasos linfáticos en la remoción de productos metabólicos celulares. De hecho, este análisis demostró una acumulación significativa de ROS en los tejidos de extremidades posteriores inmediatamente distales a la región poplítea en animales tratados con PLN<d>(figura 10). Por el contrario, los animales de control que se habían tratado con incisión en la piel sin linfadenectomía prácticamente no tenían acumulación de ROS. Las ROS pueden activar respuestas inmunitarias innatas que incluyen moléculas de patrón molecular asociado a daño (DAMP). Yin et al., J. Immunol. 194:429-437 (2015). De acuerdo con estos estudios y nuestro descubrimiento de ROS incrementadas después de PLND, así como con los estudios previos usando un modelo de cola de linfedema en el que se demostró expresión incrementada de HMGB1 en una variedad de tipos de células en tejidos linfomatosos (Zampell et al., Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300:C1107-1121 (2011)), se señaló un incremento marcado en la expresión de SAMP tal como proteína de choque térmico-70 (HSP70) y secuencia 1 de grupo de alta movilidad (HMGB-1)(figura 10).Estos descubrimientos indican que la lesión linfática da por resultado la generación de ROS, que a su vez, da por resultado lesión celular, expresión de DAMP e inicio de respuestas inflamatorias.

Estudios clínicos y de laboratorio anteriores han descrito el reflujo dérmico como la agrupación de ICG en el espacio intersticial como resultado de linfáticos disfuncionales con fugas. Blum et al., Breast Cancer Res. Treat. 139:81-86 (2013); Tashiro et al., Ann. Plast. Surg. doi: 10.1097/SAP599 (2015); Yamamoto et al., Plast. Reconstr. Surg.

128:314e-321e (2011). De acuerdo con estos reportes, se encontró que los animales de control tratados tópicamente con petrolato solo durante 4 semanas tuvieron fugas marcadas de los linfáticos iniciales de la almohadilla de pata (áreas punteadas de acumulación de ICG brillante indicadas por flechas blancas;figura 4C) y reflujo dérmico (retención generalizada de ICG en la dermis;figura 4C). Esta respuesta patológica disminuyó notablemente en animales tratados con tacrolimus tópico, dando por resultado fuga linfática disminuida y depuración mejorada de ICG inyectado.

El análisis de fluctuaciones en la intensidad de fluorescencia ICG en los vasos recolectores usando fotografía de lapso de tiempo es una técnica que se ha usado previamente para medir la tasa de bombeo linfático. Sevick-Muraca et al., J. Clin. Invest. 124:905-914 (2014). Este análisis permite el cálculo de la “frecuencia de paquetes de ICG” y se ha usado para analizar la función linfática colectora después de PLND. Blum et al., Breast Cancer Res. Treat. 139:81-86 (2013). Usando esta técnica, se encontró que la terapia tópica con tacrolimus incrementó notablemente la frecuencia de paquetes linfáticos colectores en comparación con los controles (incremento >2 veces), lo que indica que este tratamiento incrementa la función linfática colectora (figura 4D).

Además, de manera similar a los descubrimientos con el modelo de cola, se encontró que el tratamiento con tacrolimus tópico después de PLND disminuyó notablemente la infiltración perilinfática de células inflamatorias (39 % de reducción en células CD45+ (figura 4Epanel superior,figura 4F) 56 % de reducción en células CD4+ (figura 11) y 36 % de reducción en células F4/80+ (figura 12) en comparación con los controles tratados con vehículo. El tratamiento con tacrolimus tópico también dio por resultado una disminución significativa en la expresión perilinfática de óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) por células inflamatorias (42 % de reducción en el número de células que expresan iNOS) (figura 4Epanel inferior,figura 4G). Esto es importante puesto que estudios previos han mostrado que la expresión de iNOS perilinfática es un regulador importante de la capacidad de bombeo linfático colector. Liao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 108:18784-18789 (2011). Es importante destacar que los cambios en la contractilidad linfática en respuesta al tratamiento tópico con tacrolimus solo se observaron en el contexto de la lesión linfática, puesto que el tratamiento de animales no operados (es decir, solo anestesia pero sin cirugía) con tacrolimus no incrementó la frecuencia de contracción linfática o la acumulación perilinfática de células inflamatorias (figura 13).

Además, para asegurar que los efectos observados de tacrolimus en la función linfática no fueran el resultado de la permeabilidad vascular disminuida y la fuga de vasos sanguíneos, se realizó un ensayo Miles para medir la permeabilidad de vasos sanguíneos después de cirugías PLND con y sin tacrolimus. No se observaron diferencias en la permeabilidad de vasos sanguíneos entre el tratado con tacrolimus y el control con vehículo, lo que sugiere que los efectos del tacrolimus en el incremento de la función linfática se deben de hecho al incremento de la función linfática en lugar de a la fuga vascular disminuida (figura 14).

Después se examinó el diámetro luminal y cobertura de células de músculo liso alfa de los linfáticos colectores de extremidades posteriores después de PLND en animales tratados con control y tacrolimus con base en el hecho de que reportes clínicos previos han mostrado que pacientes con linfedema grave de larga duración constriñeron linfáticos con hipertrofia de células de músculo liso. Mihara et al., PLoS One 7:e41126 (2012). No sorprendentemente, en este período de tiempo relativamente temprano después de la lesión linfática (es decir, 4 semanas), no se encontraron diferencias en el número de músculos lisos alfa que rodean los vasos o en el área luminal de colectores de extremidades posteriores cuando se compararon ratones tratados con tacrolimus y control. Este descubrimiento indica que los incrementos en la frecuencia de paquetes linfáticos colectores después del tratamiento con tacrolimus no están regulados por cambios estructurales linfáticos sino más bien debido a cambios en el microambiente linfático (por ejemplo, inflamación perilinfática o expresión de iNOS;figura 15).

Tacrolimus incrementa la formación de vasos linfáticos colaterales

Debido a que se conoce que las células T inhiben potentemente la linfangiogénesis de ganglios linfáticos (Kataru et al., Immunity 34:96-107 (2011)) y linfangiogénesis inflamatoria durante la reparación de heridas (Zampell et al., Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302:C392-C404 (2012)), después se buscó determinar si el tratamiento con tacrolimus incrementa la formación de linfáticos colaterales. De hecho, el análisis histológico de heridas de cola e identificación de linfáticos usando tinción inmunofluorescente (IF) de LYVE-1 demostró un incremento marcado en vasos linfáticos recién formados que puentean la zona de lesión linfática (189 % de incremento después de tratamiento temprano; 106 % de incremento después de tratamiento tardío;figura 5A). Esta respuesta linfangiogénica pareció ser independiente de la expresión de VEGF-C, puesto que no se observaron diferencias en la expresión de ARNm de VEGF-C entre los animales tratados con control y con tacrolimus (figura 5A). Sin embargo, de acuerdo con el análisis de tinción IF, se señaló una disminución significativa en la expresión de dos factores de crecimiento potencialmente antilinfangiogénicos y citocinas, TGF-p1 (Oka et al., Blood 111:4571-4579 (2008); Clavin et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295:H2113-2127 (2008)) y IFN-<y>(Kataru et al., Immunity 34:96-107 (2011); Shao et al., J. Interferon Cytokine Res. 26:568-574 (2006))(Fig. 5A).El análisis linfangiográfico por imagenología NIR y tinción IF para vasos linfáticos en extremidades posteriores 4 semanas después de PLND, confirmó los descubrimientos del modelo de cola que demuestran que los animales tratados con tacrolimus tenían consistentemente significativamente más vasos linfáticos colaterales que drenaban hacia el ganglio linfático inguinal, evitando de este modo la zona de lesión (figura 5B-5D).

Para determinar los efectos linfangiogénicos de tacrolimus en otros modelos inflamatorios y de heridas en los que el drenaje de fluido linfático no se obstruye quirúrgicamente, después se usaron otros dos modelos de linfangiogénesis inflamatoria. La córnea es un tejido útil para estudiar la linfangiogénesis debido a que normalmente está desprovista de vasos sanguíneos y linfáticos, pero se desarrolla en el contexto de la inflamación. Cursiefen et al., J. Clin. Invest. 113:1040-1050 (2004). Se colocaron suturas en las córneas de ratones y se trataron con tacrolimus sistémico o control de vehículo diariamente durante 2 semanas y se encontró que el tratamiento con tacrolimus dio por resultado un incremento significativo en la proliferación de vasos linfáticos (incremento de 48 %) pero no sanguíneos (figura 6A-6C).

También se estudió la linfangiogénesis durante la cicatrización de heridas usando un modelo de herida con punzón de oído y aplicando tacrolimus tópico o ungüento de control durante 4 semanas. De manera similar al modelo corneal, se encontró que el tacrolimus tópico incrementó significativamente la densidad de vasos linfáticos y la ramificación en la piel de oreja adyacente a la herida en comparación con los controles (figura 6D-6F). Para probar la posibilidad de efectos linfangiogénicos directos de tacrolimus, se aplicó tacrolimus a orejas de ratón no heridas durante 4 semanas, y entonces se realizó imagenología confocal de montaje completo de vasos linfáticos. No se observó ningún incremento en la linfangiogénesis en este entorno no lesionado, no inflamado (figura 16). En conjunto, estos resultados indican que el tacrolimus facilita la formación de nuevos vasos linfáticos en el contexto de la inflamación en general y en el contexto de linfedema/lesión linfática específicamente.

Métodos

Diseño de estudio

El objetivo de este estudio fue probar la hipótesis de que la inhibición local de las células T puede prevenir el desarrollo de linfedema después de una lesión linfática y tratar el linfedema establecido después de que se ha desarrollado. Usando dos modelos de ratón diferentes de lesión linfática y linfedema, se analizó la eficacia de Tacrolimus, un medicamento tópico anti-células T aprobado por la FDA en estos resultados. Después de haber encontrado que Tacrolimus fue de hecho efectivo en la prevención y tratamiento del linfedema, se buscó analizar los mecanismos celulares y moleculares que regulan esta respuesta. En estos estudios posteriores, se probó la hipótesis de que la inhibición de las respuestas inflamatorias CD4+ mejoró la función linfática al incrementar la formación de linfáticos colaterales, disminuir la deposición de colágeno en la matriz extracelular que rodea los linfáticos iniciales e incrementar la frecuencia de bombeo de linfáticos colectores. Los estudios se realizaron todos usando ratones C57BL/6J hembra adultos (10-14 semanas de edad) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) que se mantuvieron en ambientes libres de patógenos controlados por luz y temperatura y se alimentaronad libitum.Todos los estudios fueron aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Cada experimento se realizó usando un mínimo de 6-8 animales y los ensayos se realizaron por triplicado. Todos los conteos de células se realizaron por revisores ciegos a la intervención.

Modelos y tratamientos animales

La cirugía de cola y ablación linfática se realizó como se publicó anteriormente. Clavin et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295:H2113-H2127 (2008). En resumen, se extirparon los linfáticos colectores superficiales y profundos de la porción media de la cola usando una extirpación circunferencial de 2 mm. Tacrolimus 0,1 % (Astellas, Tokio, Japón)/control de vehículo (petrolato) se trató tópicamente comenzando a las 2 semanas después de la cirugía (tratamiento temprano) y comenzando a las 6 semanas después de la cirugía (tratamiento tardío) en diferentes grupos de animales. Para ambos enfoques, se trataron los animales con tacrolimus al 0,1 % o control de vehículo, dos veces al día durante un período de 4 semanas (para tratamiento temprano) y un período de 3 semanas (tratamiento tardío). Se aplicó tacrolimus (aprox. 0,05 g) como una capa delgada a toda el área de cola. Para permitir el análisis de la capacidad de bombeo del vaso colector linfático se utilizó un modelo de linfadenectomía poplítea de ratón descrito anteriormente. Blum et al., Breast Cancer Res Treat 139:81-86 (2013); Sharma et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292:H3109-H3118 (2007). En resumen, se identificaron los vasos colectores de extremidades posteriores y los ganglios linfáticos poplíteos y se extirparon los ganglios linfáticos con la almohadilla de grasa poplítea. Comenzando 2 semanas después de la cirugía, los animales se asignaron al azar al tratamiento con tacrolimus tópico al 0,1 % o control de vehículo (petrolato) dos veces al día durante 2 semanas.

Se realizó un ensayo de linfangiogénesis corneal como se reportó previamente. Cursiefen et al., Cornea 25:443-447 (2006). En resumen, se colocaron suturas de nylon 10-0 (Ethicon, Cincinnati, OH) en la córnea en ángulos de 120°. Comenzando inmediatamente después de la colocación de la sutura, los animales se trataron con tacrolimus sistémico o control de vehículo diariamente durante dos semanas, seguido de análisis usando microscopía confocal (Leica Microsystems, Weitziar, Alemania). El tacrolimus sistémico (Biotang Inc., Lexington, MA) se disolvió en etanol al 10 % con Tween 80 al 1 % en PBS (Rozkalne et al., Neurobiol. Dis. 41:650-654 (2011); Butcher et al., J. Neurosci. 17:6939-6946 (1997)) y se dosificaron a 4 mg kg_1 IP diariamente. El control del vehículo para el tacrolimus sistémico fue el volumen equivalente de etanol al 10 %, Tween 80 al 1 % en PBS. La linfangiogénesis cutánea se valoró usando un modelo de herida con punzón de oído como se reportó previamente. Cho et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 103:4946-4951 (2006). Después de la herida, la piel de oreja se trató con tacrolimus tópico o control de vehículo durante 4 semanas. Entonces, las orejas se cosecharon y se fijaron en PFA al 1 % durante la noche. Las porciones anterior y posterior de la piel de la oreja se dividieron entonces removiendo el cartílago y se realizó la tinción de montaje completo para LYVE-1 y CD31. Las imágenes de escaneo de pieza se obtuvieron usando un microscopio confocal (Leica Microsystems, Weitziar, Alemania) y la piel dentro de 400 pm del borde de la herida se analizó usando software Metamorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los campos estandarizados (200 pm x 200 pm) se analizaron para el número de puntos de ramificación presentes por unidad de área por dos revisores ciegos.

Citometría de flujo

La citometría de flujo se realizó en muestras de sangre periférica como se reportó previamente. Zampell et al., PLoS ONE 7:e49940 (2012). En resumen, los eritrocitos se lisaron con amortiguador de lisis RBC (Ebioscience, San Diego, CA) seguido de tinción con anticuerpos conjugados con fluoróforo (CD45, CD3 y CD4; todos de Biolegend, San Diego, CA) y análisis con un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) usando el software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).

Nivel en sangre de tacrolimus por espectrometría de masas

Los niveles en sangre de tacrolimus se midieron usando espectrometría de masas en una modificación de un método previamente reportado. Donaldson et al., Meth. Mol. Biol. 603:479-487 (2010). En resumen, se recolectó sangre entera en tubos recubiertos con EDTAde sodio (Terumo, Shibuya, Japón) y entonces se analizó usando un cromatógrafo de flujo turbulento (TFc) Thermo Scientific Aria TLX-2 acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo<t>S<q>Quantum Ultra (Thermo Scientific, Franklin, MA). La columna TurboFlow usada fue una Cyclone P- 50 X 0,5 mm, en tanto que la columna analítica fue una columna Hypersil Gold C-18, 3 X 50 mm. A la sangre entera (50 pL) se adicionaron 200 pL de ZnSO4 0,2 mM que contenía ascomicina como estándar interno. Después de una incubación y centrifugación de 30 minutos, se inyectaron 50 pl del sobrenadante en el sistema TFC. Los analitos se eluyeron a través de la columna (0,75mL min'1) con un gradiente de soluciones de agua y metanol que contenían formiato de amonio 10 mM y ácido fórmico al 0,1 %. El tiempo de corrida analítica fue 4,5 minutos. La imprecisión entre días del ensayo se determinó a tres concentraciones durante un período de 10 días. A concentraciones de 3,3, 12,6 y 31,9 ng mL’1 los coeficientes de variación fueron de 9,8, 7,0 y 7,8 %, respectivamente. El ensayo tiene un intervalo lineal de 0 a 40 ng mL-1.

Análisis de función linfática

Los volúmenes de cola se calcularon usando la fórmula de cono truncado como se reportó previamente (Clavin et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295:H2113-H2127 (2008)) y se confirmó usando mediciones histológicas del espesor de tejido blando de la piel/tejidos subcutáneos de una manera estandarizada usando el software de imágenes Mirax (Carl Zeiss, Munich, Alemania).

La linfoescintigrafía se realizó usando los métodos publicados previamente. Avraham et al., Am. J. Pathol.

177:3202-3214 (2010). En resumen, se inyectaron 50 pl de coloide de azufre de tecnecio-99m (99mTc) filtrado (Nuclear Diagnostic Products, Rockaway, NJ) en la cola distal. Las imágenes se tomaron usando una cámara X-SPECT (Gamma Medica, Northridge, CA) y se realizó análisis de región de interés para derivar conteis ajustados por descomposición en los ganglios linfáticos sacros y para calcular el pico y la tasa de captación nodal usando software ASIPro (CTI Molecular Imaging, Knoxville,<t>N).

La imagenología en infrarrojo cercano (NIR) se realizó usando una modificación de los resultados publicados previamente. Tassenoy et al., Lymphat. Res. Biol. 7:145-151 (2009). En resumen, se inyectaron 15 |jl (0,15 mg mL-1) de verde de indocianina (ICG, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) de manera intradérmica en el espacio web de la extremidad posterior dorsal y se visualizaron usando una cámara EVOS EMCCD (Life Technologies, Carlsbad, CA) con una fuente de luz LED (CoolLED, Andover, Reino Unido). Las imágenes estáticas/de video se obtuvieron usando un microscopio Zeiss V12 Stereolumar (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) y la función de bombeo linfático se analizó usando software Fiji (NIH, Bethesda, MD) al identificar una región de interés sobre el recipiente colector dominante de la pierna y restando la intensidad fluorescente de fondo representada con el paso del tiempo.

Histología e inmunotinción

La tinción inmunohistoquímica se realizó usando los métodos publicados. Clavin et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295:H2113-H2127 (2008). En resumen, los tejidos se fijaron en paraformaldehído al 4 % a 4 °C, se descalcificaron en EDTA de sodio al 5 % (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), se incrustaron en parafina y se seccionaron a 5 micrómetros. Las secciones cortadas se rehidrataron y el desenmascaramiento de antígeno mediado por calor se realizó usando citrato de sodio a 90 °C (Sigma-Aldrich). La unión no específica se bloqueó con BSA al 2 %/suero animal al 20 %. Los tejidos se incubaron durante la noche con anticuerpo primario a 4 °C. Los anticuerpos primarios usados para tinciones inmunohistoquímicas incluyeron LYVE-1 anti-ratón de cabra, CD45 anti-ratón de rata, CD4 anti-ratón de conejo y F4/80 anti-ratón de rata (todos de R&D, Minneapolis, MN), CD3 anti-ratón de conejo (de Dako, Carpinteria, CA), anti-aSMA de ratón conjugado con Cy3 (de Sigma-Aldrich), IFN-<y>anti-humano de conejo, TGF-p1 anti-ratón de conejo, p-SMAD3 anti-ratón de conejo, colágeno I anti-ratón de conejo, iNOS anti-ratón de conejo y podoplanina anti-ratón de hámster, HMGB-1 y HSP-70 anti-ratón de conejo (todos de ABCAM, Cambridge, MA).

La tinción de inmunofluorescencia se realizó usando anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo AlexaFluor (Life Technologies, Norwalk, CT). Las imágenes se escanearon usando el software de imagenología Mirax (Carl Zeiss). Los conteos de células CD45+ y CD4+ perilinfáticas se valoraron por conteo de células teñidas positivamente dentro de 50 jm del vaso linfático más inflamado en cada cuadrante de la pierna. Las células teñidas positivamente se contaron por dos revisores ciegos en cuatro campos de alta potencia 40x seleccionados aleatoriamente en un mínimo de 4 campos por animal. La deposición de colágeno I se cuantificó usando software Metamorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) en áreas dérmicas de secciones transversales de 5 jm . Este análisis se confirmó usando tinción con rojo picrosirius y cálculo del índice de cicatriz como se reportó previamente. Flanders et al., Am. J. Pathol. 163:2247-2257 (2003). Los vasos linfáticos puente en colas de ratón se contaron en el sitio quirúrgico reepitelializado en 4 campos de alta potencia diferentes por cola.

Tinción con rojo sirio

Las secciones de parafina de los tejidos de la cola se tiñeron con el kit de tinción de rojo picrosirius (Polysciences, Warrington, PA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las imágenes se obtuvieron a través de luz polarizada en un microscopio Axiocam 2 (Carl Zeiss) y el índice de cicatriz se cuantificó con el software Metamorph al calcular la relación de fibras rojo-naranja: verde-amarillo con números más altos que representan mayor cicatrización.

PCR en tiempo real

La extracción de ARN se realizó en la piel de la cola usando TRIZOL (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La calidad y cantidad de ARN se valoraron usando un bioanalizador Agilent (Agilent Technologies, Inc; Santa Clara, CA). El ARN aislado se convirtió en ADNc usando un kit de transcriptasa inversa TaqMan (Roche, Branchburg, NJ) y la expresión relativa de la expresión génica entre grupos se realizó usando análisis de PCR CT delta-delta y normalizando la expresión génica usando amplificación de ARN de GAPDH como se describió previamente. Schmittgen et al., Nat. Protoc. 3:1101-1108 (2008). La expresión relativa se calculó usando la fórmula: 2[-(gen Ct de interés - control endógeno Ct) muestra A - (gen Ct de interés - control endógeno Ct) muestra B)]. Todas las muestras se realizaron por triplicado. Los cebadores usados para las dianas de PCR de interés fueron para VEGF-C, TGF-p1 e IFN-<y>(Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA).

Detección in vivo de ROS y ensayo Miles para permeabilidad vascular

La detección in vivo de ROS se realizó por imagenología bioluminiscente de NADPH oxidasa como se describe por Han et al. (J. Vis. Exp. doi: 10.3791/3925 (2012)). En resumen, los ratones se inyectaron sistémicamente con L-012 (un análogo de luminol) (20 jg /g) disuelto en PBS en diferentes puntos de tiempo después de que se tomaron imágenes de las señales luminiscentes y de PLND que representan ROS en el sitio de cirugía de PLND y se cuantificaron usando espectro IVIS 200 (Xenogen Corporation). El ensayo Miles para la permeabilidad vascular se realizó como se describe. Radu et al., J. Vis. Exp. doi: 10.3791/50062 (2013). En resumen, se inyectaron 200 j l de azul de Evans estéril al 0,5 % mediante la vena de la cola a ratones PLND tratados con tacrolimus de 2 semanas. Después de 30 min, se tomaron imágenes de las extremidades posteriores de PLND para observar la fuga de azul de Evans. Las extremidades posteriores se extirparon y se incubaron en formamida durante 48 h a 55 °C para extraer el azul de Evans. El azul de Evans extraído se cuantificó al medir la absorbancia a 610 nm.

Análisis estadístico

Los datos se analizaron y se mostraron usando el software GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA). Los valores se presentan como media ± desviación estándar a menos que se señale de otro modo. La significancia estadística se estableció en p<0,05, y las diferencias entre 2 grupos se valoraron con la prueba t de Student en tanto que se realizaron múltiples análisis usando ANOVA con pruebas post hoc para comparar dentro de los grupos.

Conclusiones

Debido a que las células T CD4+juegan un papel crítico en la patología de linfedema, el propósito de este estudio fue evaluar la eficacia de tacrolimus tópico para la prevención y tratamiento del linfedema. Se usó bien un modelo de cola de ratón descrito de linfedema, así como un modelo previamente descrito de lesión linfática resultante de la disección de ganglios linfáticos poplíteos (PLND) para mostrar que el tacrolimus tópico previene potentemente el desarrollo de linfedema después de la lesión linfática al disminuir las respuestas inflamatorias crónicas, disminuir la fibrosis tisular y linfática, incrementar el bombeo linfático colector e incrementar la formación de vasos linfáticos colaterales. Estos descubrimientos tienen implicaciones importantes para el tratamiento del linfedema, puesto que los intentos experimentales anteriores se han centrado principalmente en incrementar la regeneración linfática usando factores de crecimiento linfangiogénicos exógenos.

También se encontró que tacrolimus disminuye potentemente la infiltración de células T dérmicas y subcutáneas y la fibrosis tisular después de una lesión linfática. Estos cambios previenen el desarrollo de linfedema y pueden revertir los cambios patológicos una vez que se establece el linfedema. El tratamiento con tacrolimus incrementa la función linfática al incrementar la formación de linfáticos colaterales y al incrementar la frecuencia de bombeo linfático colector. Hasta donde se sabe, este es el primer medio farmacológico tópico dirigido para prevenir y tratar el linfedema posquirúrgico.

Se encontró que el tacrolimus fue más efectivo cuando se aplicó antes, inmediatamente después de la cirugía, lo que probablemente refleja el hecho de que este tratamiento no requirió la reversión de la patología establecida. Este descubrimiento es consistente con estudios previos en otros trastornos fibroproliferativos tal como fibrosis hepática en los que la prevención es mucho más efectiva que la reversión de cambios histológicos. Friedman et al., Hepatology 43:S82-S88 (2006).

Ejemplo 2.Tratamiento y prevención de linfedema usando pirfenidona

Pirfenidona disminuye linfedema de la cola

La interrupción de los linfáticos superficiales y profundos de la cola de ratón dio por resultado un incremento de casi 80 % en los volúmenes de cola 2 semanas después de la cirugía (figura 19A, 19B). Se ha mostrado previamente que la hinchazón en este punto de tiempo se debe principalmente a la acumulación de líquido intersticial. Avraham et al., FASEB J. 27:1114-1126 (2013). La obstrucción linfática crónica en la cola da por resultado el reemplazo gradual de líquido intersticial por tejidos fibroadiposos y la acumulación de células inflamatorias durante las siguientes 4 semanas. Avraham et al., FASEB J. 27:1114-1126 (2013). Estos cambios patológicos reflejan estrechamente el linfedema clínico y persisten durante al menos 8-10 semanas adicionales una vez que se establece el linfedema. Con base en este conocimiento, se esperaron 7 semanas después de la cirugía para que se estableciera el linfedema y entonces se inició el tratamiento con pirfenidona con la intención de tratar estos cambios de tejidos blandos establecidos. Inicialmente se comenzó con el tratamiento sistémico, ya que la mayoría de los estudios previos sobre pirfenidona usan esta vía de administración para el tratamiento de enfermedades fibróticas. Sin embargo, una vez que se estableció la pirfenidona como un tratamiento efectivo, se desarrolló una formulación tópica, ya que se preferiría la administración local para reducir al mínimo cualquier efecto secundario potencial debido a la terapia sistémica. El tratamiento con pirfenidona tanto sistémica como tópica disminuyó notablemente la hinchazón macroscópica de cola, volumen de cola y espesor de tejidos blandos en comparación con los controles (figura 19A-19C,19E;p<0,01 para volumen de cola y p<0,05 para espesor para ambos grupos de tratamiento).

Pirfenidona incrementa la función linfática en la cola

Dada la eficacia de pirfenidona en el tratamiento del linfedema en el modelo de cola, después se buscó estudiar si pirfenidona regula la función linfática después de la lesión linfática. Usando linfocintigrafía con 99Tc, una técnica en la que se inyecta un radiotrazador en la cola distal, se midió su captación por los ganglios linfáticos sacros durante 90 minutos. La captación ajustada por descomposición de los ganglios linfáticos sacros en animales tratados con pirfenidona tanto sistémica como tópica demostró un incremento de casi 4 veces en la captación de 99Tc en animales tratados con pirfenidona en comparación con los controles. Además, tanto los animales tratados sistémicamente como los tratados tópicamente demostraron un incremento de casi 4 veces en la captación ganglionar máxima (figura 19G; p<0,01 para ambos). De manera similar, hubo un incremento en la tasa de captación en animales tratados tanto de manera sistémica como de manera tópica como se indica por la pendiente incrementada de la curva ajustada por decaimiento (figura 19H; p<0,01 y p<0,05, respectivamente).

Pirfenidona disminuye la inflamación y fibrosis en la cola después de una lesión linfática

La inflamación crónica es un sello histológico del linfedema clínico y se caracteriza por acumulación incrementada de células inflamatorias, específicamente células T auxiliares. Avraham et al., FASEB J. 27:1114-1126 (2013); Zampell et al., PLoS ONE 7:e49940 (2012); Ghanta et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 308:H1065-1077 (2015); Olszewski et al., Lymphology 23:23-33 (1990). De acuerdo con esto, se encontró que tanto los animales tratados de manera sistémica como los tratados de manera tópica habían disminuido notablemente el número de leucocitos que se infiltraron en la dermis y la grasa subcutánea en comparación con los controles. Las células inflamatorias en tejidos linfedematosos cosechados de animales de control se ubicaron en proximidad cercana a los linfáticos colectores y capilares, pero estaban virtualmente ausentes en ratones tratados con pirfenidona. De manera similar, se observaron disminuciones marcadas en los números de células CD3+ infiltrantes y células CD4+ (figura 20A, 20D; p<0,001 para ambos). Además, se observó una disminución significativa en la acumulación de proteína IFN-<y>, una citocina producida por células T auxiliares (Th) 1 que se ha encontrado previamente que es potencialmente antilinfangiogénica (figura 20J; p<0,01). Kataru et al., Immunity 34:96-107 (2011); Shao et al., J. Interferon Cytokine Res. 26:568-574 (2006).

Además, se demostró previamente que los macrófagos se acumulan en tejidos distales a la lesión linfática. Zampell et al., PLoS ONE 7:e49940 (2012). Se analizó el efecto de la pirfenidona en la infiltración de macrófagos, puesto que regulan tanto la fibrosis (principalmente a través de TGF-p1) como la linfangiogénesis (mediante VEGF-C). No se encontraron diferencias en la infiltración de células F4/80+ en tejidos de cola linfedematosos con tratamiento con pirfenidona, tanto sistémico como tópico, en comparación con los controles. De acuerdo con esto, no se encontraron diferencias en la acumulación de proteína VEGF-C después del tratamiento con pirfenidona (figura 20K; p = NS). En conjunto, estos descubrimientos muestran que después de la lesión linfática, las células inflamatorias, específicamente las células T, se acumulan en grandes números en estrecha proximidad a la piel/vasos linfáticos subcutáneos y que esta respuesta se mitiga por tratamiento sistémico y tópico con pirfenidona.

Los pacientes con linfedema tienen fibrosis progresiva de tejidos blandos y el grado de fibrosis se correlaciona con la severidad de enfermedad clínicamente. Tassenoy et al., Lymphat. Res. Biol. 7:145-151 (2009). De manera consistente con otros trastornos fibróticos, se ha mostrado previamente que TGF-p1 es un factor de crecimiento profibrótico crítico en el linfedema. Avraham et al., Am. J. Pathol. 177:3202-3214 (2010). Además, se ha mostrado que TGF-p1 tiene un efecto antilinfangiogénico directo sobre las LEC. Clavin et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295:H2113-H2127 (2008). Por lo tanto, se analizó la infiltración de células TGF-p1+ y la expresión celular de su molécula de señalización en la dirección 3' activada, pSMAD3. En los grupos de tratamiento con pirfenidona tanto sistémica como tópica, se encontró una acumulación notablemente disminuida de células TGF-p1 y células pSMAD3+ en comparación con los controles (figura 20B, 20C, 20E,20F; p<0,001 para todos). De acuerdo con esto, se encontró una acumulación disminuida de la acumulación de proteína TGF-p1 después del tratamiento con pirfenidona (figura 20I; p<0,05). Esto se correlacionó con una deposición de colágeno tipo I dérmico y subcutáneo significativamente disminuida en ambos grupos de tratamiento en comparación con los ratones de control (figura 19D, 19F; p<0,001 para sistémico y p<0,05 para tópico).

Puesto que se han descrito cambios estructurales en los vasos linfáticos colectores (hipertrofia del músculo liso, capas espesas de colágeno tipo I, constricción de la luz) en pacientes humanos con linfedema, se examinaron los vasos linfáticos colectores de nuestros animales para detectar cambios similares. Mihara et al., PLoS One 7:e41126 (2012). De acuerdo con estos estudios en humanos, los linfáticos colectores (a-SMA+/podoplanina+) de los ratones de control estaban rodeados por capas espesas de colágeno tipo I, en tanto que los animales tratados con pirfenidona tenían vasos linfáticos esencialmente normales (figura 20H).

Pirfenidona incrementa la función linfática en la extremidad posterior

A fin de comprender los mecanismos por los cuales la pirfenidona incrementa la función linfática, se analizó el reflujo dérmico en los linfáticos iniciales y la capacidad de bombeo linfático recolector usando un modelo de PLND de extremidad posterior de ratón. Blum et al., Breast Cancer Res. Treat. 139:81-86 (2013). Usando linfangiografía NIR 4 semanas después de PLND, se encontró que los animales tratados con 2 semanas de pirfenidona sistémica tenían notablemente menos reflujo dérmico y fuga de vasos capilares en comparación con los controles tratados con vehículo (figura 18A, flecha blanca). Además, los animales tratados con pirfenidona tuvieron una tasa significativamente mayor de contracción de vasos linfáticos colectores en comparación con los controles (incremento de 2 veces;figura 18A,18B; p<0,0015). Esta respuesta, similar a los descubrimientos con el modelo de cola, se correlacionó con una disminución significativa en la infiltración perilinfática de células inflamatorias en ratones tratados con pirfenidona (figura 18E(paneles superiores),figura 18F; p<0,01). Además, el tratamiento con pirfenidona dio por resultado una disminución significativa en la expresión perilinfática de iNOS por células inflamatorias (figura 18E(paneles inferiores),figura 18G; p<0,01). Este es un descubrimiento crítico, ya que se ha mostrado que la acumulación incrementada de iNOS perilinfática, en el contexto de inflamación, altera los gradientes normales de óxido nítrico que son críticos para la contractilidad normal y coordinada de los vasos linfáticos. Liao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 108:18784-18789 (2011). Esto proporciona un mecanismo importante en cuanto a cómo la pirfenidona mejora la contractilidad de los vasos linfáticos.

Pirfenidona incrementa la formación de vasos linfáticos colaterales

Puesto que se conoce que las células T, específicamente las citocinas Th1 y Th2, inhiben potentemente la linfangiogénesis de ganglios linfáticos y linfangiogénesis inflamatoria durante la reparación de heridas, después se buscó determinar si el tratamiento con pirfenidona incrementa la formación de linfáticos colaterales. Kataru et al., Immunity 34:96-107 (2011); Clavin et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295:H2113-H2127 (2008); Zampell et al., Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302:C392-C404 (2012); Savetsky et al., PLoS One 10:e0126908 (2015). De hecho, el análisis histológico e identificación de linfáticos usando tinción inmunofluorescente de LYVE-1 demostró un incremento marcado en la densidad de vasos linfáticos tanto en la cola como en la extremidad posterior (figura 18D,18E; p<0,001). Esta respuesta linfangiogénica pareció ser independiente de la expresión de VEGF-C, puesto que no se observaron diferencias en el análisis de la proteína VEGF-C en las colas linfedematosas tratadas con pirfenidona en comparación con los controles, mientras que hubo una disminución profunda en las citocinas de células T antilinfangiogénicas,tal como IFN-y y TGF-p1 (figura 20E, 20I, 20K;p<0,05 para TGF-p1, p<0,01 para IFN-y y p = NS para VEGF-C).

La inmunoterapia de TGF-p1 con pirfenidona no mejora aún más la función linfática

Dado que el principal mecanismo de acción de la pirfenidona es el bloqueo de la actividad de TGF-p1, se comparó el efecto del tratamiento con pirfenidona con la inmunoterapia con TGF-p1 después de PLND en estudios separados. Schaefer et al., Eur. Respir. Rev. 20:85-97 (2011). Usando imagenología NIR, en comparación con los controles de isotipo, se encontró que la inmunoterapia con TGF-p1 sola, así como la combinación de inmunoterapia con TGF-p1 y pirfenidona, había disminuido el reflujo dérmico e incrementado significativamente la tasa de contracción de vasos linfáticos colectores. Más importante aún, no hubo beneficio adicional con la terapia de combinación en comparación con la inmunoterapia sola, lo que indica que estábamos inhibiendo al máximo TGF-p1 a las dosis que se usaron (figura 21A-21C; p = NS). De manera similar, usando citometría de flujo, en comparación con los controles de isotipo, se encontró que la inmunoterapia con TGF-p1 sola, así como la combinación de inmunoterapia con TGF-p1 y pirfenidona, había disminuido significativamente la acumulación tisular de células T auxiliares distales a la lesión linfática, mientras que no hubo terapia adicional con combinación en comparación con la inmunoterapia sola.

TGF-p1 KO de las células T disminuye el linfedema de cola, mejora la función linfática y disminuye la inflamación y fibrosis en la cola después de una lesión linfática

Para determinar la fuente celular de TGF-p1 en el contexto del linfedema, se desarrollaron ratones transgénicos con KO selectivo de producción de TGF-p1 a partir de células T y mielocitos. La confirmación fenotípica de estos ratones transgénicos se confirmó usando reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que mostró una disminución significativa de la expresión de TGF-p1 de células T y mieloides aisladas de ratones con célulascre T y mieloidecre, respectivamente, en comparación con los ratones de control (figura 21A; p<0,05 para ambos). Se realizaron cirugías de cola y el análisis se realizó 6 semanas después de la cirugía. Los ratones con célulascreT habían disminuido notablemente la hinchazón macroscópica de cola, volumen de cola y espesor fibroadiposo en comparación con los ratones mieloidescre y de control (figura 21B-21D; p<0,01 para volumen de la cola y p<0,05 para espesor). El análisis de linfoescintigrafía con 99Tc demostró un incremento de casi 4 veces en la captación ajustada por descomposición del trazador en los ganglios linfáticos sacros de ratones con célulascre T en comparación con ratones mieloidescre y de control. De manera similar, hubo un incremento en la captación nodal máxima, así como en la tasa de captación de trazador en los ratones con célulascre T en comparación con los ratones mieloidescre y de control (figura 21E-21F; p<0,05 y p<0,01, respectivamente).

Anteriormente, se ha mostrado que la inmunoterapia con TGF-p1 en el modelo de cola de linfedema dio como resultado inflamación disminuida, específicamente la infiltración de tejido de células T auxiliares, además de fibrosis disminuida. Avraham et al., Am. J. Pathol. 177:3202-3214 (2010). De manera interesante, los ratones con célulascre T habían disminuido notablemente el número de células T auxiliares que se infiltraron en la dermis y la grasa subcutánea en comparación con los ratones mieloidescre y de control (figura 22A, 22B; p<0,01). Además, de manera similar a los descubrimientos en los animales tratados con pirfenidona, se observó una disminución significativa en la acumulación de proteína IFN-y (figura 22D; p<0,01). Se encontró que el análisis de las células TGF-p1+ y la acumulación de proteínas, así como la expresión celular de su molécula de señalización en la dirección 3' activada, pSMAD3, disminuyó notablemente en los ratones con célulascre T en comparación con los ratones mieloidescre y de control (figura 22A, 22C,22E; p<0,01 para pSMAD3 y p<0,05 para la proteína TGF-p1). No se encontraron diferencias en las células F4/80+ o la acumulación de proteína VEGF-C entre todos los grupos (figura 22F; p = NS). Esto se correlacionó con una deposición de colágeno tipo I dérmico y subcutáneo significativamente disminuida en ratones con célulascre T en comparación con ratones mieloidescre y de control (figura 21D; p<0,05). En tanto que pareció haber una tendencia en la inflamación disminuida, fibrosis y expresión de citocinas antilinfangiogénicas en ratones mieloidescre, no alcanzó importancia. Estos descubrimientos son importantes debido a que indican que la principal fuente celular de TGF-p1 en el linfedema son las células T.

La capacidad de respuesta alterada de LEC TGF-p1 no tuvo cambios en el linfedema, inflamación o fibrosis de cola en la cola después de una lesión linfática

Para analizar los efectos directos de TGF-p1 en LEC en el contexto de linfedema y aplicar los descubrimientos previosin vitroa un modeloin vivo,se realizaron cirugías de cola en ratones FLT4Crey el análisis se realizó 6 semanas después de la cirugía. Avraham et al., Plast. Reconstr. Surg. 124:438-450 (2009). La confirmación fenotípica de estos ratones transgénicos se confirmó con tinción en ganglios linfáticos para LYVE-1 y pSMAD3. Los ratones FLT4Cre no tuvieron tinción de pSMAD3 detectable en LEC, lo que indica que LEC no responde a TGF-p1 (figura 23A, las flechas blancas indican pSMAD3+ LEC). Los ratones FLT4cre no tuvieron diferencias en la hinchazón macroscópica de cola, volumen de cola y espesor fibroadiposo en comparación con los ratones de control (figura 23C-23E,23G; p = NS). De manera interesante y similar a los descubrimientosin vitroanteriores, se encontró una mayor densidad de vasos linfáticos en la porción de puente de las heridas (figura 23H; p<0,01). Clavin et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295:H2113-H2127 (2008). La porción de puente de la herida es el área donde se removieron todos los vasos linfáticos dérmicos con cirugía. Por lo tanto, esto indica una linfangiogénesis mejorada como resultado de la falta de respuesta de LEC a TGF-p1 en el contexto de linfedema.

El análisis de las células infiltrantes inflamatorias y la acumulación de citocinas entre ratones FLT4cre y de control no reveló diferencias en las células CD4+ y la acumulación de proteína IFN-y (p = NS para ambos), células F4/80+ o acumulación de proteína VEGF-C (p=NS), células TGF-p1+y acumulación de proteína (figura 23B; p = NS), así como la expresión celular de su molécula de señalización en la dirección 3 'activada, pSMAD3 (figura 23G; p = NS). De manera similar, la deposición de colágeno I no fue significativamente diferente entre los ratones FLT4cre y de control (figura 23F, 23G;p = NS). Estos descubrimientos sugieren que el efecto principal de TGF-p1 en la promoción de la inflamación, fibrosis y en última instancia, disfunción linfática está en la matriz extracelular, en tanto que su función antilinfangiogénica directa desempeña un papel relativamente menor en el contexto del linfedema.

Métodos

Diseño de estudio

La hipótesis fue que el linfedema se puede tratar por inhibición de TGF-p1, disminuyendo de este modo tanto la inflamación como la fibrosis. Se exploraron diferentes aspectos de esta hipótesis en varios modelos animales diferentes para permitir valorar a fondo la hinchazón, inflamación, fibrosis, función de los vasos linfáticos y linfangiogénesis después de la lesión. Los ratones C57BL/6J hembra adultos (10-14 semanas de edad) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) se mantuvieron en ambientes libres de patógenos controlados por luz y temperatura, y se alimentaronad libitum.Todos los estudios fueron aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Después de someterse a cirugía de cola, los animales se excluyeron del experimento si experimentaban necrosis de cola distal. Esta valoración se realizó antes de que los animales se asignaran al azar a los grupos de tratamiento o control. Cada experimento se realizó usando un mínimo de 6-8 animales y los ensayos se realizaron por triplicado. Todos los conteos se realizaron por revisores ciegos a la intervención.

Modelos y tratamientos animales

Los animales se sometieron a ablación linfática usando un modelo de cola de ratón bien descrito de linfedema en el que los sistemas linfáticos superficiales y profundos de la cola se extirpan a través de una extirpación de piel circunferencial de 2 mm en la porción media de la cola. Clavin et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295:H2113-H2127 (2008); Avraham et al., Am. J. Pathol. 177:3202-3214 (2010); Rutkowski et al., Microvasc. Res. 72:161-271 (2006); Tabibiazar et al., PLoS Med. 3:e254 (2006). El grupo y otros han demostrado previamente que este modelo da por resultado linfedema sostenido de la cola distal, deterioro severo en la función linfática y características histológicas de linfedema clínico (por ejemplo, inflamación crónica, deposición adiposa, fibrosis) durante al menos 10 semanas después de la operación. Clavin et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295:H2113-H2127 (2008); Avraham et al., Am. J. Pathol. 177:3202-3214 (2010); Rutkowski et al., Microvasc. Res. 72:161-271 (2006); Tabibiazar et al., PLoS Med. 3:e254 (2006). Siete semanas después de la cirugía, cuando se estableció el linfedema, los animales se asignaron al azar a grupos experimentales (pirfenidona) o de control y se trataron una vez al día durante 3 semanas, seguido de análisis como se describe más adelante.

El modelo de cola es útil para analizar cambios histológicos en el tejido (es decir, fibrosis y deposición adiposa); sin embargo, debido al pequeño calibre de los vasos colectores, este modelo no es ideal para analizar la función de bombeo linfático. Por lo tanto, para determinar la eficacia de pirfenidona en la restauración de la capacidad de bombeo linfático de la recolección de linfáticos y para analizar el efecto de este tratamiento sobre la proliferación linfática en los tejidos distales a la zona de lesión linfática, se realizaron disecciones de ganglios linfáticos poplíteos (PLND) como se describió previamente. Blum et al., Breast Cancer Res. Treat. 139:81-86 (2013). En resumen, los linfáticos se visualizaron después de la inyección de 50 pl de azul de Evans al 3 % en la pata trasera. Se extirparon los linfáticos colectores en la región poplítea, junto con los ganglios linfáticos poplíteos. Dos semanas después de la cirugía, los animales se asignaron al azar al tratamiento con pirfenidona sistémica o control una vez al día durante 2 semanas, seguido de análisis.

En experimentos sistémicos, los ratones se trataron oralmente diariamente con pirfenidona (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) a una dosis de 400 mg/kg disueltos en DMSO al 10 %/carboximetilcelulosa (CMC) al 0,5 % en PBS o con vehículo (DMSO al 10 %/CMC al 0,5 % en PBS). Esta dosis se determinó con base en estudios previos que mostraron un régimen de tratamiento efectivo en diferentes modelos de fibrosis. Oku et al., Eur. J. Pharmacol.

590:400-408 (2008); Kakugawa et al., Eur. Respir. J. 24:57-65 (2004); Tanaka et al., Chest 142:1011-1019 (2012). Se desarrolló una formulación tópica de pirfenidona en colaboración con el Research Pharmacy Core Facility en Memorial Sloan Kettering Cancer Center. En estos experimentos, los ratones se trataron diariamente con pirfenidona tópica (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) 1 mg/ml en petrolato al 41 %, en tanto que los animales de control recibieron vehículo solo (petrolato al 41 %).

Para investigar la fuente celular de TGF-p1 en el linfedema, se desarrollaron ratones transgénicos no inducibles con inactivación selectiva de la producción de TGF-p1 a partir de células T y mielocitos. De Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME), se compraron B6.Cg-Tg(Lck-cre) 548Jxm/J que expresan Cre bajo el control del promotor Lck (proteína tirosina cinasa de linfocitos), lo que permite la escisión específica de timocitos de secuencias flanqueadas por loxP de interés. El gen Lck se expresa principalmente por linfocitos T donde fosforila residuos de tirosina de proteínas implicadas con vías de señalización intracelular. Además, se compraron de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) una cepa transgénica B6,129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/Jcon el alelo de activación LysMcre que tiene una recombinasa Cre localizada en el núcleo insertada en el primer ATG codificador del gen de lisozima 2 (Lyz2); tanto aboliendo la función del gen Lyz2 endógeno como colocando la expresión de NLS-Cre bajo el control de los elementos promotores/potenciadores de Lyz2 endógenos. Cada uno de estos ratones transgénicos se cruzó con ratones mutantesTgfb1tm21Doe/J(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) que albergan sitiosloxPque flanquean el exón 6 del gen TGF-p1. Como resultado, la recombinación mediada por Cre da por resultado la deleción del gen diana (TGF-p1) en linfocitos T y linaje de células mieloides (incluidos monocitos, macrófagos maduros y granulocitos).

Para investigar los efectos directos de TGF-p1 en LEC, se desarrolló un ratón transgénico inducible con un receptor de TGF-p no funcional en LEC. Se usó un ratón FLT4cre (un regalo del Dr. Sagrario Ortega) donde el promotor Flt4 de VEGFR-3 en estos ratones está bajo el control del receptor de estrógeno tipo 2 (ER2) y se expresa altamente por todas las LEC en ratones adultos. Martinez-Corral et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 109:6223-6228 (2012). Se cruzaron ratones FLT4cre con ratones mutantesB6;129-Tgfbr2tm1Karl/J(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) que poseen sitiosloxPque flanquean el exón 4 del factor de crecimiento transformante, receptor beta II. Se indujo la expresión de Cre en ratones FLT4cre hembra adultos usando tamoxifeno (300 mg/kg/día de manera subcutánea durante 5 días).

Para todos los ratones transgénicos, la expresión génica de ambos transgenes se confirmó por genotipificación (Transnetyx, Memphis, TN) y se retrocruzaron ratones homocigotos dobles durante 6 generaciones para asegurar la consistencia. Además, el laboratorio realizó estudios fenotípicos confirmatorios para todos los modelos transgénicos recientemente desarrollados con expresión génica usando PCR, cuantificación de proteínas usando ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) y tinción histológica (ver más adelante).

Volúmenes de cola, linfoescintigrafía y análisis histológico

Los volúmenes de cola se analizaron usando múltiples mediciones digitales de circunferencia de cola de calibre distal a la zona de lesión linfática y se calcularon usando la fórmula de cono truncado como se describió previamente. Clavin et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295:H2113-H2127 (2008). La linfocintigrafía también se realizó como se describió previamente para cuantificar el flujo linfático a los ganglios linfáticos sacros al inyectar 50 |jl de coloide de azufre de tecnecio (Tc99 m) filtrado en la cola distal. Avraham et al., FASEB J. 27:1114-1126 (2013). La captación ajustada por descomposición se registró en los ganglios linfáticos sacros usando una cámara X-SPECT (Gamma Medica, Northridge, CA) y el análisis de región de interés se realizó usando software ASIPro (CTI Molecular Imaging, Knoxville, TN). Clavin et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295:H2113-H2127 (2008).

Para el análisis histológico e inmunohistoquímico, las secciones de cola se cosecharon, se fijaron brevemente en paraformaldehído enfriado con hielo al 4 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), se descalcificaron usando ácido etilendiaminotetraacético al 5 % (EDTA; Santa Cruz, Santa Cruz, CA) y se incrustaron en parafina. Las secciones de hematoxilina y eosina se prepararon usando técnicas estándar y el espesor del tejido subcutáneo se cuantificó en secciones transversales histológicas estandarizadas al medir el espesor de la piel y los tejidos blandos en cuatro cuadrantes de la cola por dos revisores ciegos en un mínimo de 6 animales por grupo.

La tinción inmunohistoquímica se realizó de acuerdo con las técnicas establecidas. Avraham et al., Am. J. Pathol.

177:3202-3214 (2010). Los tejidos incrustados en parafina se rehidrataron y el desenmascaramiento de antígeno se realizó usando citrato de sodio hirviendo (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) seguido de la inactivación de la actividad de peroxidasa endógena con BSA al 2 %/suero animal al 20 %. Los tejidos se incubaron con anticuerpo primario durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos primarios usados para tinciones inmunohistoquímicas incluyeron LYVE-1, CD45 y CD4 (todos de R&D, Minneapolis, MN), F4/80, TGF-p1, pSMAD3, Podoplanina (todos de Abcam, Cambridge, MA), alfa-SMA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), iNOS (BD biosciences, San Jose, CA) y CD3 (Dako North America, Inc. Carpintería, CA). Todos los anticuerpos secundarios se obtuvieron de Vector Laboratories. Los portaobjetos se analizaron después de escanearse usando un escáner de portaobjetos Mirax (Zeiss, Munich, Alemania). La inmunohistoquímica de colágeno tipo I se realizó usando un anticuerpo para colágeno tipo I de ratón (Abcam, Cambridge, MA) y se cuantificó como una relación del área de dermis teñida positivamente dentro de un umbral fijo al área de tejido total usando software Metamorph Offline (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los conteos de células se realizaron en secciones de alta potencia, con un mínimo de 4-6 animales por grupo y 4-5 HPF/animal por dos revisores ciegos.

Análisis de proteínas

Los tejidos de cola para el análisis de proteínas se recolectaron a 1,5 cm de distancia de la lesión linfática, se congelaron rápidamente, se trituraron y se extrajeron con reactivo de proteína de extracción de tejido (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) mezclado con inhibidor de fosfatasa y proteasa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Se analizaron 20-30 mg de proteína de muestras (n = 3-5 animales/grupo) por ELISA para cuantificar TGF-p1, interferón-gamma (IFN-<y>) y factor de crecimiento endotelial vascular C (VEGF-C) de acuerdo con el protocolo del fabricante (eBioscience, San Diego, CA). Todos los experimentos se realizaron por duplicado.

Imagenología in vivo de función de vasos linfáticos

Para valorar la contractilidad de los vasos linfáticos colectores de extremidades posteriores, se grabaron videos con imagenología de infrarrojo cercano (NIR) después de 15 pl de 0. Se inyectaron 15 mg/ml de verde de indocianina (ICG) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) de manera intradérmica en la cara dorsal de la pata trasera. Se dejaron veinte minutos después de la inyección para permitir la captación en los vasos colectores. Entonces se tomaron imágenes de los animales usando una cámara EVOS EMCCD hecha a medida (Life Technologies, Carlsbad, CA) y una fuente de luz LED (CoolLED, Andover, Reino Unido). Las imágenes de video se obtuvieron usando un microscopio Zeiss V12 Stereolumar (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Las imágenes se obtuvieron cada ocho segundos durante 30 minutos. La función de bombeo linfático se analizó utilizando el software Fiji (una herramienta gratuita de análisis de datos de código abierto desarrollada por los National Institutes of Health, Bethesda, MD). Se seleccionó una región de interés sobre el vaso colector dominante y se graficó la intensidad fluorescente restada por ruido a lo largo del tiempo. A fin de evaluar la función de bombeo intrínseca, se excluyeron los diez minutos iniciales de cada video debido a la estimulación linfática del posicionamiento, y solo se analizaron los 20 minutos finales de cada video. La función de bombeo se cuantificó en pulsaciones por minuto.

PCR de expresión génica

Para confirmar el fenotipo de inactivación de TGF-p 1 de células T y mielocitos, se cosecharon bazos de estos ratones. Las células T se aislaron de bazos de ratones transgénicos con célulascre T usando perlas magnéticas CD3 de selección positiva (Miltenyi Biotec, Cambridge, MA) según las recomendaciones del fabricante. De manera similar, las células mieloides se aislaron de bazos de ratones transgénicos mieloidescre usando perlas magnéticas CD11b de selección positiva (Miltenyi Biotec, Cambridge, MA) según las recomendaciones del fabricante. Entonces, las células aisladas se colocaron en TRIzol. El ARN se aisló usando un procedimiento de extracción de TRIzol estándar. Chomczynski et al. Anal. Biochem. 162:156-159 (1987); Ribaudo et al., Curr. Protocols Immunol., (Coligan et al. eds.) Capítulo 10, Unidad 10 11 (2001). La transcripción inversa se realizó usando reactivos de transcripción inversa TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA) seguido de reacción en cadena de polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR) usando TaqMan Universal Mastermix (Applied Biosystems) y termociclador LightCycler (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN). Los niveles de expresión de TGF-p1 se normalizaron a GAPDH. Los experimentos se realizaron por triplicado.

Modulación de actividad de TGF-p1

Debido a que estudios previos han sugerido que un mecanismo de acción principal de la pirfenidona es el bloqueo de la actividad de TGF-p1, se comparó el efecto del tratamiento con pirfenidona con la inmunoterapia con TGF-p1 después de PLND en estudios separados. Schaefer et al., Eur. Respir. Rev. 20:85-97 (2011). Es importante destacar que se ha mostrado previamente que los anticuerpos monoclonales dirigidos contra TGF-p1 no solo son efectivos para neutralizar la actividad biológica de TGF-p1, sino que este tratamiento disminuye notablemente el linfedema y mejora la función linfática. Avraham et al., Am. J. Pathol. 177:3202-3214 (2010). Los animales se sometieron a PLND como se describió anteriormente y dos semanas después de la cirugía se asignaron al azar al tratamiento con anticuerpo neutralizante monoclonal de ratón TGF-p (TGFmab; clon 1D11; Bio-x-cell, West Lebanon, NH) solo o pirfenidona más TGFmab a una dosis de 5 mg/kg diluido en 150 pl de PBS administrado de manera intraperitoneal tres veces por semana. Ruzek et al., Immunopharmacol. Immunotoxicol. 25:235-257 (2003). Los animales de control se trataron con control de vehículo para pirfenidona o anticuerpos de isotipo no específicos administrados de manera intraperitoneal en el mismo programa que TGFmab.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó usando el software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Se usó la prueba T de Student para comparar diferencias entre dos grupos. El análisis entre múltiples puntos de tiempo (linfocintigrafía) se realizó usando un ANOVA bidireccional con pruebas post hoc para comparar grupos individuales. El análisis descriptivo y los métodos gráficos se usaron para analizar y resumir los resultados. Los datos se presentan como media ± desviación estándar a menos que se señale de otro modo, con p<0,05 considerado significativo.

Conclusiones

Un propósito de este estudio fue analizar la eficacia de pirfenidona en el tratamiento de linfedema en modelos de ratón preclínicos de linfedema y lesión linfática. Usando dos modelos de ratón diferentes, se muestra que tanto la pirfenidona sistémica como la tópica tratan el linfedema establecido, disminuyendo notablemente la fibrosis y mejorando la función linfática. El tratamiento con pirfenidona disminuye las reacciones inflamatorias crónicas e incrementa notablemente la capacidad de bombeo de vasos colectores linfáticos después de la linfadenectomía. Además, la pirfenidona fue altamente efectiva para prevenir la fibrosis después de una lesión linfática, y es probable que esta respuesta sea secundaria a la inhibición de TGF-p1. Usando inmunoterapia con TGF-p1 en el modelo PLND, se demostró que el efecto principal de pirfenidona es la inhibición de TGF-p1 y que la inhibición máxima de TGF-p1 se logró a las dosis que se utilizaron. Además, usando el modelo de cola de linfedema en los ratones, se mostró que las células T, específicamente las células CD4+, son la fuente predominante de TGF-p1 en el contexto del linfedema. Además, se demostró que la falta de TGF-p1 de células T redujo la inflamación crónica inducida por linfedema tal como células CD4+ junto con citocinas Th1 y Th2.

Ejemplo 3.Tratamiento y prevención de linfedema usando teriflunomida

Para probar la eficacia de la teriflunomida en la prevención de la disfunción linfática después de la lesión linfática, se usó un modelo de ratón bien descrito de disección de ganglios linfáticos poplíteos (PLND) en el que se extirpan los ganglios linfáticos poplíteos usando una pequeña incisión en la piel. A fin de probar la eficacia de este tratamiento en el tratamiento de linfedema establecido, se usó un modelo de cola de ratón de linfedema en el que el sistema linfático superficial y profundo de la cola se interrumpe y los animales desarrollan cambios histológicos que son consistentes con la enfermedad clínica.

Los animales se asignaron al azar a los grupos de PLND o linfedema de cola y 2 semanas después de la cirugía se trataron con una formulación tópica de teriflunomida (27 mg/ml; Tocris Bioscience, Minneapolis, MN) o control de vehículo (pomada de Aquaphor/glicerina) una vez al día durante 2-4 semanas (2 semanas después de PLND; 4 semanas después de linfedema de cola). La formulación tópica se desarrolló en colaboración con Research Pharmacy Core Facility en Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Entonces se sacrificaron los ratones y se valoraron la función linfática, fibrosis, linfangiogénesis usando ensayos convencionales.

El tratamiento de ratones con teriflunomida tópica después de la ablación linfática de la cola disminuyó notablemente el linfedema y la deposición fibroadiposa, el sello histológico de la enfermedad (figura 24). En tanto que los ratones de control tenían hinchazón y fibrosis obvias de la cola (fijas, “configuración J” resultantes de la deposición asimétrica de colágeno), los ratones tratados con teriflunomida tenían colas de apariencia esencialmente normal 6 semanas después de la lesión linfática (figura 24A). Estos cambios macroscópicos correspondieron a una disminución de casi 6 veces en el volumen de cola en ratones tratados con teriflunomida (figura 24B). Las secciones transversales histológicas de las colas de los ratones de control mostraron una acumulación significativa de tejidos fibroadiposos; en contraste, los ratones tratados con teriflunomida tuvieron una deposición mínima de tejido adiposo (figura 24C, 24D). Este descubrimiento se confirmó con tinción inmunoflorescente de colágeno tipo I que demuestra el encastramiento de linfáticos superficiales por fibras de colágeno en animales de control y disminuciones marcadas en la deposición de colágeno en animales tratados con teriflunomida 6 semanas después de la lesión (figura 25A, 25B). Además, la teriflunomida disminuyó la proliferación de células alfa de músculo liso que rodean los linfáticos colectores, manteniendo de este modo una configuración anatómica más normal de estos vasos (figura 25C, 25D).

Para determinar si la terapia con teriflunomida disminuyó la infiltración de células CD4+, después se analizaron secciones de tejido de ratones de control y tratados usando anticuerpos inmunoflorescentes dirigidos a CD4 (figura 26A, 26B). Este análisis demostró una disminución marcada en los tejidos de cola de infiltración de células CD4+ cosechados de animales tratados con teriflunomida en comparación con los controles. De hecho, la terapia con teriflunomida disminuyó el número de células CD4+ infiltrantes en más de 8 veces (P<0,001).

Estudios recientes han mostrado que las células CD4+ producen citocinas antilinfangiogénicas potentes que incluyen interferón gamma, interluecina-4 (IL4) e IL13. De acuerdo con esto, se encontró que el tratamiento de animales que se sometieron a PLND con teriflunomida incrementó notablemente (4,5 veces; p<0,001) la formación de vasos linfáticos colaterales que evitan la zona de lesión como se valora usando imagenología de infrarrojo cercano de verde de indocianina (ICG) (figura 27A). De manera similar, el tratamiento de ratones con teriflunomida después de la ablación linfática de la cola dio por resultado un incremento significativo en los linfáticos recién formados que cruzaron la zona de lesión en comparación con los controles (figura 27B). La regeneración de linfáticos colaterales en animales con teriflunomida disminuyó significativamente la fuga de vasos linfáticos en la dermis, lo que permitió que se propagaran mayores cantidades de líquido intersticial proximalmente (figura 28).

Los linfáticos recién formados y la disminución de los cambios patológicos en los linfáticos existentes de los ratones tratados con teriflunomida se tradujeron en una función linfática notablemente mejorada como se analizó por migración de células dendríticas (DC). Las DC migran de los tejidos periféricos mediante vasos linfáticos a ganglios linfáticos regionales para presentar antígenos y promover respuestas inmunitarias adaptativas. El análisis del tráfico de DC en animales de teriflunomida después de PLND usando un ensayo estándar (pintura FITC) demostró un incremento de más de 5 veces en el número de DC que habían traficado al ganglio linfático inguinal (el siguiente ganglio linfático en la cadena después del ganglio linfático poplíteo) en comparación con los controles (figura 29A, 29B). Debido a que las DC solo circulan mediante los vasos linfáticos, este descubrimiento proporciona evidencia sustancial de que la teriflunomida incrementa la función linfática.

Los vasos linfáticos colectores propagan la linfa proximalmente usando la contracción activa por células de músculo liso circundantes y válvulas unidireccionales para evitar el reflujo. De acuerdo con el descubrimiento de que la teriflunomida incrementa la función de transporte linfático y disminuye la fibrosis/proliferación de células alfa de músculo liso que rodean los vasos linfáticos, se encontró que este tratamiento también incrementa notablemente el bombeo linfático colector (figura 30). El tratamiento con teriflunomida después de PLND casi duplicó la frecuencia de los linfáticos colectores de extremidad posterior principal, incrementando de este modo la propagación proximal del líquido linfático.

Se descubrió por primera vez el uso de teriflunomida para la prevención y tratamiento de linfedema. Los descubrimientos muestran que el tratamiento con teriflunomida después de una lesión linfática disminuye sustancialmente el linfedema y la deposición de tejido fibroadiposo. Además, se muestra que este efecto se correlaciona con una infiltración disminuida de células T CD4+, formación incrementada de linfáticos colaterales, permeabilidad disminuida linfática y función linfática mejorada. Estos descubrimientos son novedosos puesto que proporcionan una terapia dirigida para el linfedema, una enfermedad que anteriormente se había tratado solo con intervenciones paliativas.

Ejemplo 4.Tratamiento y prevención de linfedema usando captopril

Como se describió anteriormente, se probó la eficacia de captopril en la prevención de la disfunción linfática después de la lesión linfática usando el modelo PLND, y en el tratamiento del linfedema establecido usando el modelo de cola de ratón. Los animales se trataron con una formulación tópica de captopril (5 %) o control de vehículo (petrolato o pomada de Aquaphor/glicerina) una vez al día durante 2-4 semanas (2 semanas después de PLND; 4 semanas después de linfedema de cola). Entonces se sacrificaron los ratones y se valoraron la función linfática, fibrosis, y linfangiogénesis usando ensayos convencionales. El tratamiento con captopril tópico dio por resultado función linfática mejorada en el modelo PLND y linfedema disminuido en el modelo de cola. Los resultados se muestran en lasfiguras 31-53.

Ejemplo 5.Tratamiento y prevención de linfedema usando combinaciones de fármacos

Usando los modelos de PLND y cola de ratón, como se describe en los ejemplos 1-4, a los animales se les administra una formulación tópica que comprende una combinación de fármacos antifibrosis o un control de vehículo. Las composiciones de tratamiento se muestran en latabla 1.

Tabla 1.Combinaciones de fármacos para tratamiento prevención de linfedema

Los ratones se tratan una vez al día durante 2-4 semanas (2 semanas después de PLND; 4 semanas después de linfedema de cola). Entonces se sacrifican los ratones y se valoran la función linfática, fibrosis, linfangiogénesis usando ensayos convencionales. En el modelo PLND, el tratamiento con una combinación de fármacos antifibrosis tópicos da por resultado una función linfática mejorada en comparación con el tratamiento con un fármaco antifibrosis individual. Del mismo modo, en el modelo de cola, el tratamiento con una combinación de fármacos antifibrosis tópicos da por resultado linfedema disminuido en comparación con el tratamiento con un fármaco antifibrosis individual. Además de ser más efectiva, la combinación produce efectos sinérgicos, de modo que la dosis efectiva de cada fármaco administrado en la combinación es menor que la dosis efectiva de cada fármaco administrado solo.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de tacrolimus para uso en el tratamiento o prevención de linfedema, en donde el linfedema se asocia con tratamiento de cáncer, es el resultado de una lesión linfática, se provoca por una infección y/o se provoca por obesidad.

2. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición farmacéutica comprende pirfenidona.

3. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde la composición farmacéutica comprende teriflunomida.

4. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la composición farmacéutica comprende leflunomida.

5. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la composición farmacéutica comprende captopril.

6. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la composición farmacéutica se formula para administración tópica.

7. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la composición farmacéutica comprende 0,01 % a 1 % de tacrolimus, preferentemente 0,05 a 0,2 % de tacrolimus.

8. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 6 o reivindicación 7, en donde la composición farmacéutica comprende 0,1 mg/ml a 5 mg/ml de pirfenidona, preferentemente 0,5 mg/ml a 2 mg/ml de pirfenidona.

9. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde la composición farmacéutica comprende 10 mg/ml a 50 mg/ml de teriflunomida, preferentemente 20 mg/ml a 30 mg/ml de teriflunomida.

10. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde la composición farmacéutica comprende 1 % a 20 % de leflunomida, preferentemente 5 % a 15 % de leflunomida.

11. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en donde la composición farmacéutica está en una forma seleccionada de un ungüento, una crema, una loción, una pasta, un gel, una mousse, una espuma, una laca, una suspensión, un líquido y una aspersión.

12. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la composición farmacéutica está en la forma de un ungüento.

13. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la composición farmacéutica se administra de manera tópica al menos una vez al día.

14. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la composición farmacéutica se administra de manera tópica al menos dos veces al día.

15. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la composición farmacéutica se administra profilácticamente dentro de aproximadamente dos semanas de una lesión linfática.

16. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de:

(i) tacrolimus, y

(ii) uno o más de pirfenidona, teriflunomida o captopril;

o uno o más de pirfenidona, leflunomida o captopril, para uso en el tratamiento o prevención de linfedema.