ES2930237T3 - Neurotoxinas botulínicas recombinantes nuevas con mayor duración de efectos - Google Patents
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Abstract
Esta invención se refiere a nuevas neurotoxinas botulínicas recombinantes de serotipo A que muestran (i) una mayor duración del efecto y (ii) una alta actividad biológica específica. Estas nuevas neurotoxinas botulínicas recombinantes comprenden al menos dos dominios adicionales que consisten en prolina, alanina y un residuo de aminoácido adicional y al menos una modificación de aminoácido que se encuentra en el exositio alfa o en el exositio beta de la cadena ligera de la neurotoxina. . La invención se refiere además a nuevas neurotoxinas botulínicas precursoras recombinantes monocatenarias y composiciones que comprenden la neurotoxina botulínica recombinante con una mayor duración del efecto y una alta actividad biológica específica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Neurotoxinas botulínicas recombinantes nuevas con mayor duración de efectos
Campo de la invención
Esta invención se refiere a neurotoxinas botulínicas recombinantes nuevas de serotipo A que presentan (i) una mayor duración de efectos y (ii) una elevada actividad biológica específica. La invención también se refiere a métodos para la fabricación de dichas neurotoxinas botulínicas recombinantes. Estas neurotoxinas botulínicas recombinantes nuevas comprenden al menos dos dominios adicionales y al menos una modificación de aminoácido situada en el exositio alfa y/o en el exositio beta de la cadena ligera de la neurotoxina. La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden dichas neurotoxinas recombinantes. La invención se refiere además a las neurotoxinas botulínicas nuevas precursoras monocatenarias recombinantes y a las secuencias de ácido nucleico que codifican dichas neurotoxinas botulínicas precursoras monocatenarias.
Antecedentes de la invención
Clostridium es un género de bacterias gram-positivas anaerobias, que pertenecen a los Firmicutes. Clostridium consiste en aproximadamente 100 especies que incluyen tanto bacterias libres comunes como patógenos importantes tales como Clostridium botulinum y Clostridium tetani. Ambas especies producen neurotoxinas, la toxina botulínica y la toxina tetánica, respectivamente. Estas neurotoxinas son potentes inhibidores de la secreción de neurotransmisores dependientes de calcio en las células neuronales y están entre las toxinas más potentes conocidas por el hombre. La dosis letal en seres humanos está entre 0,1 ng y 1 ng por kilogramo de peso corporal.
La ingestión oral de toxina botulínica a través de alimentos contaminados o la generación de toxina botulínica en heridas puede producir botulismo, que se caracteriza por la parálisis de diversos músculos. La parálisis de los músculos respiratorios puede causar la muerte del individuo afectado.
Aunque tanto la neurotoxina botulínica (BoNT) como la neurotoxina tetánica (TxNT) actúan a través de un mecanismo de acción fisiológica inicial similar, la inhibición de la liberación de neurotransmisores procedentes del axón de la neurona afectada a la sinapsis, difieren en su respuesta clínica. Mientras que la toxina botulínica actúa en la unión neuromuscular y otras sinapsis colinérgicas del sistema nervioso periférico, inhibiendo la liberación del neurotransmisor acetilcolina y provocando de este modo una parálisis flácida, la toxina tetánica actúa principalmente en el sistema nervioso central, impidiendo la liberación de los neurotransmisores inhibidores GABA (ácido gamma-aminobutírico) y glicina al degradar la proteína sinaptobrevina. La consiguiente sobreactividad en los músculos da lugar a contracciones generalizadas de la musculatura agonista y antagonista, denominadas espasmo tetánico (parálisis rígida).
Aun cuando la neurotoxina tetánica pertenece a un tipo inmunitariamente diferente, se sabe que las neurotoxinas botulínicas se producen en siete tipos inmunógenos distintos, denominados BoNT/A a BoNT/G. La mayoría de las cepas de Clostridium botulinum producen un tipo de neurotoxina, pero también se han descrito cepas que producen múltiples toxinas.
Las neurotoxinas botulínicas y tetánicas tienen secuencias de aminoácidos altamente homólogas y muestran una estructura de dominio similar. Su forma biológicamente activa comprende dos cadenas peptídicas, una cadena ligera de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada de aproximadamente 100 kDa, unidas por un enlace disulfuro. Hay una región enlazadora o bucle, cuya longitud varía entre diferentes toxinas clostrídicas, situada entre los dos restos de cisteína que forman el enlace disulfuro. Esta región de bucle es escindida proteolíticamente por una endoproteasa clostrídica desconocida para obtener la toxina biológicamente activa.
El mecanismo molecular de intoxicación por TeNT y BoNT también parece ser similar: la entrada en la neurona diana está mediada por la unión de la parte del extremo C-terminal de la cadena pesada a un receptor de superficie celular específico; a continuación, la toxina se absorbe mediante endocitosis mediada por receptores. El pH bajo en el endosoma así formado desencadena entonces un cambio conformacional en la toxina clostrídica que permite su incorporación a la membrana endosómica y translocarse a través de la membrana endosómica al citoplasma, donde se reduce el enlace disulfuro que une la cadena pesada y la cadena ligera. La cadena ligera puede entonces escindir selectivamente las denominadas proteínas SNARE, que son esenciales en diferentes etapas de la liberación de neurotransmisores en la hendidura sináptica, p. ej., reconocimiento, acoplamiento y fusión de vesículas que contienen neurotransmisores con la membrana plasmática. TeNT, BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G provocan la escisión proteolítica de la sinaptobrevina o VAMP (proteína de membrana asociada a vesículas), BoNT/A y BoNT/E escinden la proteína SNAP-25 asociada a la membrana plasmática y BoNT/C escinde la proteína de membrana plasmática integral, sintaxina, y la proteína SNAP-25.
Las neurotoxinas clostrídicas muestran duraciones de acción variables que son específicas del serotipo. El efecto terapéutico clínico de BoNT/A dura aproximadamente 3 meses para trastornos neuromusculares y de 6 a 12 meses para la hiperhidrosis. Por otra parte, el efecto de BoNT/E dura menos de 4 semanas. El efecto terapéutico más duradero de BoNT/A hace que sea preferible para cierto uso clínico en comparación con los otros serotipos, por ejemplo, los serotipos B, C1, D, E, F, G. Una explicación posible para las distintas duraciones de acción podría ser las distintas localizaciones
subcelulares de los serotipos de BoNT. El dominio de proteasa de la cadena ligera de BoNT/a se localiza de forma puntual hacia la membrana plasmática de células neuronales, localizándose junto a su sustrato SNAP-25. Por el contrario, el serotipo BoNT de duración corta es citoplasmático. La asociación con la membrana podría proteger a BoNT/A de los mecanismos de degradación citosólicos permitiendo la persistencia prolongada de BoNT/A en la neurona.
En Clostridium botulinum, la toxina botulínica se forma como un complejo proteico que comprende el componente neurotóxico y proteínas no tóxicas. Las proteínas auxiliares incorporan el componente neurotóxico, protegiéndolo de este modo de la degradación por las enzimas digestivas del tracto gastrointestinal. Por lo tanto, las neurotoxinas botulínicas de la mayoría de los serotipos son tóxicas por vía oral. Pueden obtenerse complejos con, por ejemplo, 450 kDa o con 900 kDa a partir de cultivos de Clostridium botulinum.
En los últimos años se han utilizado neurotoxinas botulínicas como agentes terapéuticos en el tratamiento de distonías y espasmos. Existen preparaciones comercializadas que comprenden complejos de toxina botulínica, p. ej. de Ipsen Ltd (Dysport ®) o Allergan Inc. (Botox®). Por ejemplo, Merz Pharmaceuticals GmbH, Frankfort (Xeomina ®) comercializa un componente neurotóxico de alta pureza, exento de proteínas complejantes.
Las neurotoxinas clostrídicas se inyectan normalmente en el tejido muscular afectado, llevando el agente cerca de la placa de la unión neuromuscular, es decir, cerca del receptor celular que media su captación en la célula nerviosa que controla dicho músculo afectado. Se han observado diversos grados de difusión de la neurotoxina. Se cree que la difusión de la neurotoxina depende de la cantidad inyectada y la preparación particular de neurotoxina. Puede dar lugar a efectos secundarios adversos tales como parálisis del tejido muscular cercano, que puede evitarse en gran medida reduciendo las dosis inyectadas al nivel terapéuticamente relevante. La sobredosis también puede hacer que el sistema inmunitario genere anticuerpos neutralizantes que inactiven la neurotoxina impidiendo que alivien la actividad muscular involuntaria. Se ha demostrado que la tolerancia inmunitaria a la toxina botulínica se correlaciona con dosis acumulativas.
Las neurotoxinas clostrídicas presentes todavía se producen predominantemente mediante procesos de fermentación utilizando cepas de Clostridium apropiadas. Sin embargo, la producción industrial de neurotoxina clostrídica a partir del cultivo anaeróbico de Clostridium es un proceso engorroso y lento. Debido a la alta toxicidad del producto final, el procedimiento debe realizarse en condiciones estrictas de confinamiento. Durante el proceso de fermentación, los precursores monocatenarios se escinden proteolíticamente mediante una proteasa clostrídica desconocida para obtener la neurotoxina clostrídica bicatenaria biológicamente activa. El grado de activación de la neurotoxina alcanzado mediante la escisión proteolítica varía entre diferentes cepas y serotipos de neurotoxina, lo que supone una consideración importante para la fabricación debido a la necesidad de preparaciones de neurotoxina con una actividad biológica bien definida. Además, durante los procesos de fermentación que utilizan cepas de Clostridium, las neurotoxinas clostrídicas se producen como complejos de proteínas, en los que el componente neurotóxico está integrado en proteínas auxiliares. Estas proteínas auxiliares no tienen ningún efecto ventajoso sobre la actividad biológica o la duración del efecto. Sin embargo, pueden desencadenar una reacción inmunitaria en el paciente, dando lugar a inmunidad contra la neurotoxina clostrídica. La fabricación de neurotoxinas clostrídicas recombinantes, no integradas en proteínas auxiliares podría, por lo tanto, ser ventajosa.
Los métodos para la expresión recombinante de neurotoxinas clostrídicas en E. coli son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, WO 00/12728, WO 01/14570 o WO 2006/076902). Además, las neurotoxinas clostrídicas se han expresado en sistemas de expresión eucarióticos, como en Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces cerevisiae, células de insecto y células de mamífero (véase WO 2006/017749).
Las neurotoxinas botulínicas recombinantes pueden expresarse como precursores monocatenarios, que posteriormente deben escindirse proteolíticamente para obtener la neurotoxina botulínica biológicamente activa final. Por lo tanto, las neurotoxinas botulínicas pueden expresarse con un alto rendimiento en bacterias de crecimiento rápido como polipéptidos monocatenarios relativamente no tóxicos.
Además, podría ser ventajoso modificar las características de la neurotoxina botulínica con respecto a la actividad biológica, la especificidad celular, el potencial antigénico y la duración del efecto mediante ingeniería genética para obtener neurotoxinas recombinantes con nuevas propiedades terapéuticas en áreas clínicas específicas. La modificación genética de las neurotoxinas botulínicas puede permitir alterar el modo de acción o ampliar la gama de dianas terapéuticas.
Las variantes de toxina botulínica que presentan una duración del efecto y una actividad biológica específica en el tejido neuromuscular superiores al de las toxinas botulínicas de origen natural serían muy ventajosas para reducir la frecuencia de administración y la incidencia de la generación de anticuerpos neutralizantes ya que la tolerancia inmunitaria a la toxina botulínica se correlaciona con dosis acumulativas.
El documento US 2002/0127247 describe neurotoxinas clostrídicas que comprenden modificaciones en sitios de modificación secundaria y que muestran persistencia biológica alterada.
Existe una gran demanda de producir nuevas neurotoxinas botulínicas serotipo A con una mayor duración de efecto y con propiedades mejoradas, para permitir el aprovechamiento del potencial terapéutico del serotipo A de la BoNT, que hasta ahora se ha considerado poco práctico para cierta aplicación clínica. De forma ideal, el aumento en la duración
del efecto de una neurotoxina botulínica con serotipo A concreta podría ajustarse de forma personalizada para abordar cualesquiera características y demandas particulares de una indicación dada, tal como la cantidad de neurotoxina que se administra, frecuencia de administración, etc. Además, sería deseable producir neurotoxinas botulínicas con serotipo A que presenten una mayor duración de efecto que las toxinas botulínicas con serotipo A de aparición natural con una elevada actividad biológica específica. Hasta la fecha, tales aspectos no se han resuelto satisfactoriamente.
Objetos de la invención
Un objeto de la invención era superar los inconvenientes ilustrados anteriormente. En particular, era un objeto de la invención proporcionar neurotoxinas botulínicas de serotipo A recombinantes que presenten una duración de efecto superior al de las toxinas botulínicas de aparición natural con una elevada actividad biológica específica en el tejido neuromuscular y establecer un método fiable y preciso para fabricar y obtener dichas neurotoxinas botulínicas recombinantes. Dicho método y las neurotoxinas botulínicas nuevas precursoras utilizadas en dichos métodos servirían para satisfacer la gran necesidad de neurotoxinas botulínicas recombinantes que muestren una mayor duración del efecto con una elevada actividad biológica específica.
Resumen de la invención
Los serotipos de toxina botulínica de aparición natural muestran duraciones de efecto muy divergentes, probablemente debido a su distinta localización subcelular. BoNT/A presenta la persistencia más larga y se ha demostrado su localización en las proximidades de la membrana plasmática de las células neuronales. Sin embargo, factores adicionales tales como degradación, propagación o difusión y/o las velocidades de translocación podrían tener un impacto decisivo en las diferencias en la duración de los serotipos individuales de toxina botulínica.
Hasta ahora, excepto para el enfoque descrito y reivindicado en WO 2015/132004, no hay disponible ningún método generalmente aplicable para modificar las neurotoxinas clostrídicas para aumentar la duración de su efecto. Según WO 2015/132004, una neurotoxina botulínica recombinante que comprende un dominio que consiste en restos de prolina (P), alanina (A) y serina (S) (a continuación en la memoria neurotoxinas botulínicas “ PASiladas” ) presenta una mayor duración del efecto en comparación con una neurotoxina botulínica de tipo salvaje correspondiente, pero se ha demostrado que dicha “ neurotoxina botulínica” “ PASilada” también presenta una menor potencia específica, es decir, una actividad biológica específica menor en comparación con la neurotoxina botulínica de tipo salvaje correspondiente. Esto significa, en un entorno clínico, que debe inyectarse una mayor cantidad de tal neurotoxina botulínica modificada a un sujeto/paciente para lograr el mismo efecto paralizante en comparación con una neurotoxina botulínica de tipo salvaje, lo que a su vez aumenta el riesgo de generar anticuerpos neutralizantes que inactiven la neurotoxina.
Sorprendentemente, se ha descubierto que pueden obtenerse mediante una modificación doble neurotoxinas botulínicas recombinantes de serotipo A con una mayor duración de efecto en comparación con una neurotoxina botulínica de tipo salvaje correspondiente y con una alta potencia específica, es decir, una elevada actividad biológica específica. Por una parte, estas neurotoxinas comprenden al menos dos dominios adicionales que consisten en restos de prolina, alanina y serina. En segundo lugar, estas neurotoxinas según la invención comprenden al menos una modificación de aminoácido situada en el exositio alfa y/o en el exositio beta de la cadena ligera de la neurotoxina.
Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere a una neurotoxina botulínica recombinante de serotipo A que comprende al menos dos dominios, en donde cada dominio comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en entre 70 y 260 restos aminoácidos, especialmente 100 restos aminoácidos, 150 restos aminoácidos o 200 restos aminoácidos, en donde dicha secuencia de aminoácidos consiste en restos de prolina, alanina y serina y en donde la neurotoxina comprende además seis modificaciones de aminoácido en el exositio alfa de la cadena ligera de la neurotoxina en las posiciones D102, T109, K340, I348, N353, K356, en donde estos aminoácidos se sustituyen como sigue D102F, T109R, K340M, I348L, N353M, K356R y cuatro modificaciones de aminoácido en el exositio beta de la cadena ligera de la neurotoxina en las posiciones G169, T220, P239, S254, en donde estos restos aminoácidos se sustituyen como sigue G169I, T220R, P239M, S254T, en donde la neurotoxina botulínica de serotipo A recombinante tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 95 % con la parte correspondiente de la neurotoxina botulínica de serotipo A parental, y en donde la neurotoxina botulínica de serotipo A recombinante produce tanto (i) un aumento en la duración del efecto respecto a una neurotoxina botulínica de serotipo A de tipo salvaje como (ii) un aumento en la actividad biológica específica con respecto a una neurotoxina botulínica de serotipo A que comprende dos dominios que consisten en restos de prolina, alanina y serina sin dichas modificaciones en el exositio alfa y/o en el exositio beta de la cadena ligera de la neurotoxina.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición, en particular a una composición farmacéutica que comprende la neurotoxina botulínica recombinante de la presente invención.
En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de la composición de la presente invención para el tratamiento cosmético.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para generar la neurotoxina botulínica recombinante de la presente invención que comprende la etapa de obtener una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una neurotoxina botulínica monocatenaria recombinante precursora de serotipo A modificando la secuencia la secuencia de ácido nucleico de la neurotoxina botulínica de serotipo A como corresponda.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a una neurotoxina botulínica monocatenaria recombinante de serotipo A que comprende al menos dos dominios adicionales en donde cada dominio comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos 50 restos aminoácidos, en donde dicha secuencia de aminoácidos consiste en al menos una prolina, al menos una alanina y al menos un resto de aminoácido adicional, seleccionado del grupo que consiste en serina, treonina, tirosina y glutamina, y un exositio alfa y/o exositio beta modificado de la cadena ligera.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica la neurotoxina botulínica monocatenaria recombinante de serotipo A precursora de la presente invención.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un método para obtener la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, que comprende la etapa de añadir secuencias de ácido nucleico a la cadena pesada y la cadena ligera y además modificar una secuencia de ácido nucleico que codifica el exositio alfa y/o el exositio beta de la cadena ligera de la neurotoxina botulínica de serotipo A parental.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, o la secuencia de ácido nucleico que puede obtenerse mediante el método de la presente invención.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a una célula huésped recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, pudiendo obtenerse la secuencia de ácido nucleico mediante el método de la presente invención o mediante el vector de la presente invención.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir la neurotoxina botulínica monocatenaria recombinante precursora de la presente invención, que comprende la etapa de expresar la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, o la secuencia de ácido nucleico que puede obtenerse mediante el método de la presente invención, o el vector de la presente descripción en una célula huésped recombinante, o cultivando la célula huésped recombinante de la presente invención en condiciones que dan lugar a la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico.
Figuras
Figura 1: Presentación esquemática de una toxina botulínica A modificada (MaJ007 = PAS100-BoNT/A (D102F T109R K340M I348L N353M K356R) -PAS100 = PAS100-BoNT/A - ISA2- PAS100), en donde tanto la cadena ligera (LC) como la cadena pesada (HC) comprenden, cada una, una secuencia de aminoácidos adicional que consiste en 100 restos aminoácidos, en donde dicha secuencia de aminoácidos consiste en restos de prolina (P), alanina (A) y serina (S) (PAS) y en donde la cadena ligera (LC) comprende seis modificaciones de aminoácido situadas en el exositio alfa en las posiciones D102, T109, K340, I348, N353, K356, en donde estos aminoácidos están sustituidos como sigue D102F, T109R, K340M, I348L, N353M, K356R.
Figura 2: SDS PAGE de BoNT/A MaJ007 purificado (PAS100-BoNT/A - ISA2- PAS100). Carril 1: Marcador de peso molecular. Antes de aplicar las muestras al gel, se añadió p-mercaptoetanol. El carril “v.A.” (antes de la activación): PAS100-BoNT/A - ISA2- PAS100 monocatenaria, purificada no activada. Los carriles “ n.A.” (después de la activación) y “ n.R.” (después de la purificación) muestran la cadena ligera (LC) y la cadena pesada (HC) obtenidas después de la activación por trombina en condiciones reductoras.
Figura 3: Presentación esquemática de una toxina botulínica PAS100-BoNT modificada (G169I, T220R, P239M, S254T) -PAS(100) = PAS100-BoNT/A - ISA5- PAS100), en donde tanto la cadena ligera (LC) como la cadena pesada (HC) comprenden, cada una de ellas, una secuencia de aminoácidos adicional que consiste en 100 restos aminoácidos, en donde dicha secuencia de aminoácidos consiste en restos de prolina, alanina y serina (PAS) y en donde la cadena ligera (LC) comprende cuatro modificaciones de aminoácidos situadas en el exositio beta en las posiciones G169, T220, P239, S254, en donde estos aminoácidos se sustituyen como sigue G169I, T220R, P239M, S254T.
Figura 4: SDS PAGE de BoNT/A MaJ024 purificada (PAS100-BoNT/A - ISA5- PAS(100). Carril 1: Marcador de peso molecular. Antes de aplicar las muestras al gel, se añadió p-mercaptoetanol. Carril “v.A.” (antes de la activación): PAS100-BoNT/A - ISA5- PAS(100) monocatenaria, purificada no activada. Los carriles “ n.A.” (después de la activación) y “ n.R.” (después de la purificación) muestran la cadena ligera (LC) y la cadena pesada (HC) obtenidas después de la activación por trombina en condiciones reductoras.
Figura 5: Ensayo de carrera en ratones con BoNT/A PAS100-BoNT/A-ISA5-PAS100 (MaJ024)
Descripción detallada de la invención
La presente invención puede entenderse más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada de la invención y los ejemplos incluidos en la misma.
En un aspecto, la presente invención se refiere a una neurotoxina botulínica recombinante de serotipo A que comprende al menos dos dominios, en donde cada dominio comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en entre 70 y 260 restos aminoácidos, especialmente 100 restos aminoácidos, 150 restos aminoácidos o 200 restos aminoácidos, en donde dicha secuencia de aminoácidos consiste en restos de prolina, alanina y serina, en donde la neurotoxina comprende además seis modificaciones de aminoácido en el exositio alfa de la cadena ligera de la neurotoxina en las posiciones D102, T109, K340, I348, N353, K356, en donde estos aminoácidos se sustituyen como sigue D102F, T109R, K340M, I348L, N353M, K356R y cuatro modificaciones de aminoácidos en el exositio beta de la cadena ligera de la neurotoxina en las posiciones G169, T220, P239, S254, en donde estos restos aminoácidos se sustituyen como sigue G169I, T220R, P239M, S254T, en donde la neurotoxina botulínica de serotipo A tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 95 % con la parte correspondiente de la neurotoxina botulínica de serotipo A parental, y en donde la neurotoxina botulínica de serotipo A produce tanto (i) un aumento en la duración del efecto respecto a una neurotoxina botulínica de serotipo A de tipo salvaje como (ii) un aumento en la actividad biológica específica con respecto a una neurotoxina botulínica de serotipo A que comprende dos dominios que consisten en restos de prolina, alanina y serina sin dichas modificaciones en el exositio alfa y/o en el exositio beta de la cadena ligera de la neurotoxina.
En el contexto de la presente invención, la expresión “ neurotoxina botulínica de serotipo A” se refiere a una neurotoxina de serotipo A natural que puede obtenerse a partir de bacterias Clostridium botulinum, o a una neurotoxina que puede obtenerse de fuentes alternativas, incluido de tecnologías recombinantes o de modificación genética o química. Especialmente, las neurotoxinas botulínicas tienen una actividad biológica específica, es decir, actividad endopeptidasa.
Las neurotoxinas botulínicas se producen como precursores monocatenarios que son escindidos proteolíticamente por una endoproteasa clostrídica desconocida dentro de la región de bucle para obtener la forma bicatenaria unida por puente disulfuro biológicamente activa de la neurotoxina, que comprende dos elementos de cadena, una cadena ligera funcionalmente activa y una cadena pesada funcionalmente activa, donde un extremo de la cadena ligera está unido a un extremo de la cadena pesada sin enlace peptídico, sino mediante un enlace disulfuro.
En el contexto de la presente invención, la expresión “cadena ligera de neurotoxina botulínica” se refiere a aquella parte de una neurotoxina botulínica de serotipo A que comprende una actividad endopeptidasa responsable de escindir una o más proteínas que forman parte del denominado complejo SNARE implicado en el proceso que da lugar a la liberación de neurotransmisores en la hendidura sináptica: En neurotoxinas botulínicas naturales, la cadena ligera tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kDa.
En el contexto de la presente invención, la expresión “exositio alfa de la cadena ligera” se refiere a cuatro alfa-hélices de la LC (102-113, 310-321, 335-348 y 351-358) que intersecan un motivo helicoidal de SNAP-25 que está aproximadamente a 30-50 aminoácidos de distancia del sitio de escisión de SNAP-25 que interactúa con el sustrato SNAP25 (véase Xue S, Javor S, Hixon MS, Janda KD, Probing BoNT/A protease exosites: implications for inhibitor design and light chain longevity. Biochemistry. 2014; 53(43):6820-4).
En el contexto de la presente invención, el término “exositio beta de la cadena ligera” se refiere a una región de lámina beta situada en una lámina beta cercana al sitio activo que interactúa con el sustrato SNAP25 que comprende AS 162-254 (véase Breidenbach MA1, Brunger AT. Substrate recognition strategy for botulinum neurotoxin serotype A, Nature. 2004, 432(7019):925-9).
En el contexto de la presente invención, la expresión “cadena pesada de neurotoxina botulínica” se refiere a la parte de una neurotoxina botulínica de serotipo A responsable de la entrada de la neurotoxina en la neurona: En neurotoxinas botulínicas de aparición natural, la cadena pesada tiene un peso molecular de aproximadamente 100 kDa.
En el contexto de la presente invención, la expresión “cadena de neurotoxina botulínica funcionalmente activa” se refiere a una cadena de neurotoxina botulínica de serotipo A recombinante capaz de realizar las funciones biológicas de una cadena de neurotoxina botulínica del serotipo A de aparición natural en al menos aproximadamente un 50 %, especialmente en al menos aproximadamente un 60 %, en al menos aproximadamente un 70 %, en al menos aproximadamente un 80 %, y lo más especialmente en al menos aproximadamente un 90 %, donde las funciones biológicas de las cadenas de neurotoxina botulínica incluyen, aunque no de forma limitativa, la unión de la cadena pesada a la neurona, la entrada de la neurotoxina en una neurona, la liberación de la cadena ligera de la neurotoxina bicatenaria y la actividad endopeptidasa de la cadena ligera. Pueden encontrarse métodos para determinar la actividad neurotóxica, por ejemplo, en WO 95/32738, que describe la reconstitución de cadenas ligeras y pesadas obtenidas por separado de la toxina tetánica y la toxina botulínica. También los métodos de ensayo celulares que se describen, por ejemplo, en WO2009/114748, WO 2013/049508 y WO2014/207109.
En el contexto de la presente invención, el término “ alrededor de” o “ aproximadamente” significan dentro del 20 %, de forma alternativa dentro del 10 %, incluyendo dentro del 5 %, de un valor o intervalo dado. De forma alternativa, especialmente en sistemas biológicos, el término “aproximadamente” significa dentro de una unidad logarítmica (es decir, un orden de magnitud), incluyendo dentro de un factor de dos de un valor dado.
En el contexto de la presente invención, la expresión “ neurotoxina botulínica recombinante” se refiere a una composición que comprende una neurotoxina botulínica de serotipo A que se obtiene mediante la expresión de la neurotoxina en una célula heteróloga tal como E. coliy que incluye, aunque no de forma limitativa, la materia prima obtenida de un proceso de fermentación (sobrenadante, composición después de la lisis celular), una fracción que comprende una neurotoxina botulínica de serotipo A obtenida a partir de la separación de los ingredientes de dicha materia prima en un proceso de purificación, una proteína aislada y esencialmente pura y una formulación para uso farmacéutico y/o estético que comprende una neurotoxina botulínica de serotipo A y adicionalmente disolventes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
En el contexto de la presente invención, el término “comprende” o “que comprende” significa “que incluye, aunque no de forma limitativa” . El término pretende ser abierto, para especificar la presencia de cualesquiera características, elementos, números enteros, etapas o componentes citados, pero no para excluir la presencia o adición de una o más características, elementos, números enteros, etapas, componentes o grupos de los mismos. El término “que comprende” incluye por lo tanto los términos más restrictivos “que consiste en” y “que consiste esencialmente en” .
La neurotoxina botulínica de serotipo A recombinante según la invención comprende las siguientes seis modificaciones en el exositio alfa de la cadena ligera:
(i) La modificación D102F (el ácido aspártico en la posición 102 de la cadena ligera es sustituido por una fenilalanina),
(ii) La modificación T109R (la treonina en la posición 109 es sustituida por una arginina),
(iii) La modificación K340M (la lisina en la posición 340 es sustituida por una metionina),
(iv) La modificación I348L (la isoleucina en la posición 348 de la cadena ligera es sustituida por una leucina),
(v) La modificación N353M (la asparagina en la posición 353 de la cadena ligera es sustituida por una metionina),
(vi) La modificación K356R (la lisina en la posición 356 de la cadena ligera es sustituida por una arginina).
La neurotoxina botulínica de serotipo A recombinante según la invención comprende las siguientes cuatro modificaciones en el exositio beta de la cadena ligera:
(i) modificación G169I (la glicina en la posición 169 de la cadena ligera es sustituida por una isoleucina),
(ii) modificación T220R (la treonina en la posición 220 es sustituida por una arginina),
(iii) modificación P239M (la prolina en la posición 239 es sustituida por una metionina),
(iv) modificación S254T (la serina en la posición 254 de la cadena ligera es sustituida por una treonina).
La neurotoxina botulínica de serotipo A recombinante según la invención comprende dos dominios, en donde cada dominio comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de entre 70 y 260 restos aminoácidos, especialmente 100 restos aminoácidos, 150 restos aminoácidos o 200 restos aminoácidos, en donde dicha secuencia de aminoácidos consiste en restos de al menos una prolina, al menos una alanina y al menos una serina.
En realizaciones particulares, la neurotoxina botulínica de serotipo A recombinante según la invención comprende dos dominios en donde cada dominio comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de entre 70 y 150 restos aminoácidos o entre 80 y 120 restos aminoácidos o entre 90 y 110 restos aminoácidos, en donde dicha secuencia de aminoácidos consiste en restos de al menos una prolina, al menos una alanina y al menos una serina.
En el contexto de la presente invención, la expresión “variante funcional de una neurotoxina botulínica” se refiere a una neurotoxina botulínica de serotipo A que difiere en la secuencia de aminoácidos y/o en la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una neurotoxina botulínica de serotipo A, pero aún funcionalmente activa. En el contexto de la presente invención, la expresión “funcionalmente activa” se refiere a la propiedad de una neurotoxina botulínica de serotipo A recombinante de presentar una actividad biológica de al menos aproximadamente un 20 %, especialmente de al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 % y más especialmente al menos aproximadamente un 90 % de la actividad biológica de una neurotoxina botulínica de origen natural precursora, es decir, una neurotoxina botulínica de serotipo A precursora sin modificaciones en el extremo C de la cadena ligera, donde las funciones biológicas incluyen, aunque no de forma limitativa, la unión al receptor de la neurotoxina, la entrada de la neurotoxina en una neurona, la liberación de la cadena ligera de la neurotoxina bicatenaria y la actividad endopeptidasa de la cadena ligera y, por lo tanto, la inhibición de la liberación del neurotransmisor procedente de la célula nerviosa afectada. Los ensayos in vivo para evaluar la actividad biológica incluyen el ensayo DL50 en ratones y el ensayo de hemidiafragma ex vivo en ratones, como se describe en Pearce y col. (Pearce 1994, Toxicol. Appl. Pharmacol. 128: 69-77) y Dressier y col. (Dressier 2005, Mov. Disord. 20:1617
1619, Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637) o en un ensayo celular como se describe en WO2009/114748, WO2014/207109 o WO 2013/049508. La actividad biológica se expresa habitualmente en Unidades de ratón (MU). Como se utiliza en la presente memoria, 1 MU es la cantidad de componente neurotóxico que mata al 50 % de una población de ratón especificada después de la inyección intraperitoneal, es decir, la DL50 i.p. en ratones.
Para la proteína, una variante funcional mantendrá características clave de la neurotoxina botulínica de serotipo A correspondiente, tales como restos clave para la actividad endopeptidasa en la cadena ligera, o restos clave para la unión a los receptores de neurotoxina o para la translocación a través de la membrana endosómica en la cadena pesada, pero puede contener modificaciones que comprenden una sustitución de uno o más aminoácidos de la neurotoxina botulínica correspondiente.
En otra realización, la variante funcional de una neurotoxina botulínica de serotipo A comprende adicionalmente un péptido señal. Normalmente, dicho péptido señal estará situado en el extremo N-terminal de la neurotoxina. Muchos de dichos péptidos señal son conocidos en la técnica y están comprendidos por la presente invención. En particular, el péptido señal da lugar al transporte de la neurotoxina a través de una membrana biológica, tal como la membrana del retículo endoplásmico, la membrana del Golgi o la membrana plasmática de una célula eucariota o procariota. Se ha descubierto que los péptidos señal, cuando se unen a la neurotoxina, median la secreción de la neurotoxina en el sobrenadante de las células. En determinadas realizaciones, el péptido señal se escindirá en el transcurso de, o después de, la secreción, de modo que la proteína secretada carece del péptido señal N-terminal, se compone de cadenas ligeras y pesadas separadas, que están unidas covalentemente por puentes disulfuro, y es activa proteolíticamente.
La variante funcional tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 95 % con la parte correspondiente de la neurotoxina botulínica de serotipo A. Los métodos y algoritmos para determinar la identidad y/u homología de secuencia, incluyendo la comparación de variantes que tienen deleciones, adiciones y/o sustituciones relativas a una secuencia precursora, son bien conocidas por el experto en la técnica. El término “ identidad” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la identidad de secuencia caracterizada por determinar el número de aminoácidos idénticos entre dos secuencias de ácido nucleico o dos secuencias de aminoácidos en donde las secuencias están alineadas de modo que se obtiene la coincidencia de orden más alto. Puede calcularse utilizando técnicas publicadas o métodos codificados en programas informáticos como, por ejemplo, BLASTP, BLASTN o FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403). Los valores de porcentaje de identidad, en un aspecto, se calculan en toda la secuencia de aminoácidos. El experto en la técnica dispone de una serie de programas basados en una variedad de algoritmos para comparar diferentes secuencias. En este contexto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman dan resultados especialmente fiables. Para llevar a cabo las alineaciones de secuencia, puede utilizarse el programa PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5, 151) o los programas Gap y BestFit (Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482), que forman parte del paquete de software GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE.UU. 53711). Los valores de identidad de secuencia indicados anteriormente en porcentaje (%) deben determinarse, en otro aspecto de la invención, utilizando el programa GAP a lo largo de la totalidad de la región de secuencia con la siguiente configuración: Ponderación de hueco: 50, Ponderación de longitud: 3, Promedio de emparejamiento correcto: 10,000 y Promedio de emparejamiento incorrecto: 0,000, que, salvo que se indique lo contrario, siempre se utilizarán como configuraciones estándar para alineamientos de secuencia. En cuanto al ADN, las secuencias de ácido nucleico que codifican el homólogo funcional y la neurotoxina botulínica precursora pueden diferir en mayor medida debido a la degeneración del código genético. Se sabe que el uso de codones es diferente entre organismos procarióticos y eucarióticos. Por lo tanto, cuando se expresa una proteína procariota, como una neurotoxina botulínica, en un sistema de expresión eucariota, puede ser necesario, o al menos útil, adaptar la secuencia de ácido nucleico al uso de codones de la célula huésped de expresión, lo que significa que la identidad de secuencia o la homología puede ser bastante baja para el ácido nucleico.
En el contexto de la presente invención, el término “variante” se refiere a una neurotoxina botulínica de serotipo A que es un derivado química, enzimática o genéticamente modificado de una neurotoxina correspondiente de la neurotoxina botulínica de serotipo A de C. botulinum. Un derivado químicamente modificado puede ser uno que se modifica mediante piruvación, fosforilación, sulfatación, lipidación, pegilación, glucosilación y/o la adición química de un aminoácido o un polipéptido que comprende entre 2 y aproximadamente 100 aminoácidos, incluyendo la modificación que se produce en la célula huésped eucariota utilizada para expresar el derivado. Un derivado modificado enzimáticamente es aquel que es modificado por la actividad de enzimas, tales como enzimas endoproteolíticas o exoproteolíticas, incluida la modificación por enzimas de la célula huésped eucariota utilizada para expresar el derivado. Como se ha señalado anteriormente, un derivado genéticamente modificado es uno que se ha modificado por deleción o sustitución de uno o más aminoácidos contenidos en, o mediante la adición de uno o más aminoácidos (incluyendo polipéptidos que comprenden entre 2 y aproximadamente 100 aminoácidos) a, la secuencia de aminoácidos de dicha neurotoxina botulínica. Los métodos para diseñar y construir tales derivados modificados química o genéticamente y para ensayar dichas variantes para determinar la funcionalidad son bien conocidos por el experto en la técnica.
La neurotoxina botulínica de serotipo A recombinante según la invención se utiliza en el tratamiento de una enfermedad que requiere una mejora de la quimiodenervación, en donde la neurotoxina recombinante provoca (i) una mayor duración de efecto con respecto a una neurotoxina botulínica de serotipo A de tipo salvaje y (ii) una mayor actividad biológica específica en relación con una neurotoxina botulínica de serotipo A que comprende dos dominios que consisten en restos de prolina, alanina y serina sin dichas modificaciones en el exositio alfa y/o en el exositio beta de la cadena ligera de la neurotoxina.
En el contexto de la presente invención, el término “ mayor duración de efecto” o “ mayor duración de acción” se refiere a una denervación duradera mediada por una neurotoxina botulínica de serotipo A de la presente invención. Por ejemplo, como se describe en la presente memoria, la administración de una neurotoxina botulínica de serotipo A bicatenaria unida por disulfuro que comprende dos dominios según la invención da lugar a una parálisis localizada durante un período de tiempo más largo en relación con la administración de una neurotoxina botulínica de serotipo A bicatenaria unida por disulfuro sin los al menos dos dominios según la presente invención.
En el contexto de la presente invención, la expresión “aumento en la duración de efecto/acción” se define como más de aproximadamente 20 %, especialmente más de aproximadamente 50 %, más especialmente más de aproximadamente 90 % de aumento en la duración del efecto de la neurotoxina recombinante de la presente invención con respecto a la neurotoxina idéntica sin los dos dominios según la invención. Por ejemplo, una “aumento en la duración de efecto” puede determinarse utilizando el “ensayo de carrera en ratones” . El “ensayo de carrera en ratones” es bien conocido por el experto en la técnica y mide la distancia de recorrida diariamente por un ratón en una cinta de correr después de inyectar una neurotoxina botulínica en el gastrocnemio (véase Keller JE. Recovery from botulinum neurotoxin poisoning in vivo. Neuroscience. 12 de mayo de 200612;139(2):629-37). La distancia que puede recorrer un ratón en la cinta de correr el día antes de inyectar la neurotoxina botulínica se toma como comparación y se establece como 100 %. Una distancia recorrida no superior al 80 % de la distancia recorrida inicial se considera parálisis del músculo. La duración del efecto está determinada por el período de tiempo entre el momento en que se alcanza la mitad de la parálisis máxima, es decir, aproximadamente 40 % de la distancia inicial de carrera y el momento en que la parálisis alcanza la recuperación, es decir, el 40 % de la distancia inicial de carrera. Si este período de tiempo es superior a 2 días en comparación con la norma (BoNT natural), se considera que la neurotoxina botulínica presenta un “aumento en la duración de efecto/acción” siempre que la BoNT mutada presente una potencia similar, es decir, una parálisis máxima similar (reducción de la distancia recorrida) de aproximadamente 80-90 %.
En el contexto de la presente invención, la “ actividad endoproteasa específica” se mide en un ensayo que se describe en Jones y col. (J Immunol Methods. 1 Ene 2008;329(1 -2):92-101) y Hallis y col. (J Clin Microbiol. 1996 (8):1934-8; 1996) y se describe adicionalmente más adelante en el ejemplo 2.
En el contexto de la presente invención, el término “ actividad endoproteasa específica disminuida” se define como una cantidad de producto de escisión al menos un 20 % menor producida por un mutante de BoNT/A en el ensayo de endoproteasa en comparación con de BoNT/A de tipo salvaje aplicando la misma cantidad de proteína.
En el contexto de la presente invención, la expresión “actividad biológica específica” se refiere a la “ actividad endoproteasa específica” mencionada anteriormente y puede obtenerse también de la parálisis máxima mostrada en el “ Ensayo de carrera en ratones” descrito anteriormente.
En el contexto de la presente invención, el término “denervación” se refiere a la denervación resultante de la administración de un agente de quimiodenervación, por ejemplo, una neurotoxina.
En el contexto de la presente invención, el término “denervación localizada” o “parálisis localizada” se refiere a la denervación de una región anatómica concreta, generalmente un músculo o un grupo de músculos anatómica y/o fisiológicamente relacionados, resultado de la administración de un agente quimiododenervante, por ejemplo, una neurotoxina, a la región anatómica concreta.
Sin pretender imponer ninguna teoría, las neurotoxinas botulínicas recombinantes de la presente invención pueden mostrar una semivida biológica aumentada, tasas de degradación reducidas, tasas de difusión disminuidas, captación aumentada en neuronas y/o tasas de translocación intracelular modificadas, en cada caso vinculadas a una neurotoxina clostrídica precursora idéntica sin los al menos dos dominios según la invención.
En el contexto de la presente invención, la expresión “semivida biológica” especifica la vida útil de una proteína, por ejemplo de una neurotoxina botulínica de serotipo A, in vivo. En el contexto de la presente invención, el término “semivida biológica” se refiere al período de tiempo durante el cual la mitad de un conjunto de proteínas se degrada in vivo. Por ejemplo, se refiere al período de tiempo en el cual se degrada la mitad de la cantidad de neurotoxina botulínica de una dosis administrada.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición, en particular una composición farmacéutica o cosmética que comprende la neurotoxina botulínica recombinante de la presente invención. Para preparar una preparación que comprende una neurotoxina botulínica de serotipo A, la toxina puede formularse mediante diversas técnicas dependiendo de los propósitos de aplicación deseados que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido de neurotoxina botulínica (biológicamente activo) puede utilizarse junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables como una composición farmacéutica. El uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con el resto de ingredientes de la formulación y no ser perjudiciales para el receptor de los mismos. El vehículo farmacéutico empleado puede incluir un sólido, un gel o un líquido. Ejemplos de vehículos sólidos son lactosa, terra alba, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, goma arábiga, estearato de magnesio, ácido esteárico y similares. Ejemplos de vehículos líquidos son glicerol, solución
salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones, diversos tipos de agentes humectantes y similares. Los vehículos adecuados comprenden los mencionados anteriormente y otros bien conocidos en la técnica, véanse, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. En un aspecto, la composición farmacéutica puede disolverse en un diluyente, antes de la administración. El diluyente también se selecciona para que no afecte a la actividad biológica del producto de neurotoxina. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada o solución salina fisiológica. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros vehículos o estabilizantes no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares. Por lo tanto, el producto de neurotoxina formulado puede estar presente, en un aspecto, en forma líquida o liofilizada. En un aspecto, puede estar presente junto con glicerol, estabilizantes proteínicos (HSA) o estabilizantes no proteínicos como polivinilpirrolidona (PVP), ácido hialurónico o aminoácidos libres. En un aspecto, en WO 2005/007185 o WO 2006/020208 se describen estabilizantes no proteínicos adecuados. El producto de neurotoxina formulado puede utilizarse para terapia humana o animal de diversas enfermedades o trastornos en una dosis terapéuticamente eficaz o con fines cosméticos.
En realizaciones particulares, la neurotoxina botulínica recombinante de la presente invención o la composición farmacéutica de la presente invención es para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección entre la lista de: distonía cervical (tortícolis espasmódica), blefaroespasmo, hiperhidrosis axilar primaria grave, acalasia, dolor lumbar, hipertrofia benigna de próstata, neuropatías focales crónicas, migraña y otros trastornos de cefalea.
Indicaciones adicionales en las que el tratamiento con neurotoxinas botulínicas está actualmente en investigación y donde puede utilizarse la composición farmacéutica de la presente invención incluyen incontinencia pediátrica, incontinencia debido a vejiga sobreactiva, e incontinencia debido a vejiga neurogénica, fisura anal, trastornos espásticos asociados con lesión o enfermedad del sistema nervioso central incluyendo traumatismos, ictus, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson o parálisis cerebral, distonías localizadas que afectan a las extremidades, rostro, mandíbula o cuerdas vocales, trastornos de dolor en la articulación temporomandibular (TMJ), neuropatía diabética, cicatrización de heridas, salivación excesiva, disfunción de las cuerdas vocales, reducción del masetero para disminuir el tamaño de la mandíbula inferior, tratamiento y prevención del dolor de cabeza crónico y del dolor musculoesquelético crónico, tratamiento del ronquido, ayuda para la pérdida de peso aumentando el tiempo de vaciado gástrico.
Más recientemente, se han evaluado neurotoxinas clostrídicas para el tratamiento de otras indicaciones nuevas, por ejemplo, queloides dolorosos, dolor neuropático diabético, dolor de rodilla refractario, aplicación en la zona desencadenante de neuralgia del trigémino para controlar el dolor, cicatrización después de la cirugía con labio de hendidura, cáncer y depresión.
En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de la composición de la presente invención para tratamiento cosmético.
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para tratar cosméticamente a un paciente, que comprende la etapa de administrar una composición que comprende una neurotoxina clostrídica recombinante según la presente invención a un paciente que desea dicho tratamiento cosmético
En el contexto de la presente invención, el término “tratamiento cosmético” se refiere a usos en aplicaciones cosméticas o estéticas, tales como el tratamiento de arrugas, patas de gallo, líneas de entrecejo glabelares, reducción del músculo masetero, reducción de las pantorrillas, eliminación de asimetrías faciales, etc.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para generar la neurotoxina botulínica recombinante de la presente invención, que comprende la etapa de obtener una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una neurotoxina botulínica monocatenaria recombinante precursora mediante la inserción de una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos dos dominios que consisten en prolina, alanina y restos aminoácidos adicionales, seleccionados del grupo que consiste en restos de serina, treonina, tirosina y glutamina en una secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina clostrídica precursora y modificando la secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina botulínica precursora en el exositio alfa y I o en el exositio beta de la cadena ligera.
En el contexto de la presente invención, el término “ secuencia de ácido nucleico recombinante” se refiere a un ácido nucleico que se ha generado uniendo material genético de dos fuentes diferentes.
En el contexto de la presente descripción, la expresión “ neurotoxina botulínica monocatenaria precursora” se refiere a un precursor monocatenario de una neurotoxina botulínica bicatenaria unida por disulfuro que comprende una cadena ligera de neurotoxina botulínica funcionalmente activa, una cadena pesada de neurotoxina funcionalmente activa y una región de bucle que une el extremo C-terminal de la cadena ligera con el extremo N-terminal de la cadena pesada.
En el contexto de la presente descripción, la expresión “ neurotoxina botulínica monocatenaria recombinante precursora” se refiere a una neurotoxina botulínica precursora monocatenaria que comprende al menos dos dominios que consisten en prolina, alanina y restos aminoácidos adicionales, seleccionados del grupo que consiste en restos de serina, treonina, tirosina y glutamina, y un exositio alfa y I o exositio beta modificado de la cadena ligera de la neurotoxina.
En realizaciones particulares, la neurotoxina botulínica monocatenaria recombinante precursora comprende un sitio de escisión de proteasa en dicha región de bucle.
Las neurotoxinas botulínicas precursoras monocatenerias deben escindirse proteolíticamente para obtener las neurotoxinas botulínicas biológicamente activas finales. La escisión proteolítica puede ocurrir durante la expresión heteróloga por enzimas de la célula huésped, o mediante la adición de enzimas proteolíticas al material proteico en bruto aislado después de la expresión heteróloga. Las neurotoxinas botulínicas de origen natural contienen habitualmente una o más señales de escisión para proteasas que escinden postraduccionalmente la molécula precursora monocatenaria, de modo que puede formarse el complejo dimérico o multimérico final. Las neurotoxinas botulínicas presentes se siguen produciendo predominantemente mediante procesos de fermentación utilizando cepas de Clostridium apropiadas. Durante el proceso de fermentación, los precursores monocatenarios se escinden proteolíticamente mediante una proteasa clostrídica desconocida para obtener la neurotoxina clostrídica bicatenaria biológicamente activa. En los casos en los que la molécula precursora monocatenaria es precursora de una proteasa, puede producirse una escisión autocatalítica. De forma alternativa, la proteasa puede ser una enzima no clostrídica separada expresada en la misma célula. WO 2006/076902 describe la escisión proteolítica de un precursor monocatenario de una neurotoxina clostrídica recombinante en un sitio de reconocimiento y escisión heterólogos mediante incubación de un lisado de células hospedadoras E. coli. La escisión proteolítica es llevada a cabo por una proteasa de E. coli desconocida. En ciertas aplicaciones de expresión recombinante, los sitios de escisión de proteasa modificados se han introducido de forma recombinante en la región intercatenaria entre la cadena ligera y pesada de las toxinas clostrídicas, por ejemplo, sitios de escisión de proteasas para la trombina humana o proteasas no humanas (véase WO 01/14570).
En realizaciones particulares de la presente descripción, el sitio de escisión de la proteasa es un sitio escindido por una proteasa seleccionada de la lista de: trombina, tripsina, enteroquinasa, factor Xa, papaína vegetal, papaína de insecto, papaína de crustáceo, enteroquinasa, proteasa de rinovirus humano 3C, proteasa de enterovirus humano 3C, proteasa del virus del grabado del tabaco, proteasa del virus del moteado de las venas del tabaco, subtilisina y caspasa 3.
En una realización particular de la presente descripción, la neurotoxina botulínica monocatenaria recombinante de serotipo A comprende además una etiqueta de unión especialmente seleccionada del grupo que comprende: glutatión-S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa (MBP), una etiqueta de His, una estreptavidina, o una etiqueta FLAG.
En el contexto de la presente invención, la expresión “ neurotoxina botulínica precursora” se refiere a una neurotoxina botulínica inicial sin modificaciones seleccionada de una neurotoxina botulínica natural, una variante funcional de una neurotoxina botulínica natural o una neurotoxina botulínica quimérica.
En realizaciones particulares, el método para generar la neurotoxina botulínica recombinante de la presente invención comprende además la etapa de expresar de forma heteróloga dicha secuencia de ácido nucleico recombinante en una célula huésped, especialmente en una célula huésped bacteriana, más especialmente en una célula huésped de E. coli.
En determinadas realizaciones, las células de E. coli se seleccionan de E. coli XL1-Blue, Nova Blue, TOP10, XL10-Gold, BL21 y K12.
En realizaciones particulares, el método para generar la neurotoxina botulínica recombinante de la presente invención comprende adicionalmente al menos una de las etapas de (i) generar una neurotoxina botulínica recombinante bicatenaria unida por disulfuro según la invención haciendo o permitiendo el contacto de dicha neurotoxina botulínica monocatenaria recombinante precursora con una endoproteasa y (ii) purificación de dicha neurotoxina botulínica monocatenaria recombinante precursora o de dicha neurotoxina botulínica recombinante bicatenaria unida por disulfuro mediante cromatografía.
En realizaciones particulares, la neurotoxina botulínica monocatenaria recombinante precursora de la presente invención, o la neurotoxina botulínica bicatenaria unida por disulfuro recombinante de la presente invención, se purifica después de la expresión, o en el caso de la neurotoxina botulínica bicatenaria unida por disulfuro recombinante, después de la reacción de escisión. En dichas realizaciones particulares, la proteína se purifica por cromatografía, especialmente mediante cromatografía de inmunoafinidad, o por cromatografía en una matriz de intercambio iónico, matriz de interacción hidrófoba o matriz de cromatografía multimodal, especialmente una matriz de intercambio iónico fuerte, más especialmente una matriz de intercambio catiónico fuerte.
En el contexto de la presente invención, la expresión “ producir ... poniendo en contacto de dicha neurotoxina botulínica monocatenaria recombinante precursora ... con una endoproteasa” se refiere a un paso activo y/o directo de poner dicha neurotoxina y dicha endoproteasa en contacto, mientras que el término “que permite poner en contacto una neurotoxina botulínica monocatenaria recombinante precursora ... con una endoproteasa” se refiere a una etapa indirecta de establecer condiciones de modo que dicha neurotoxina y dicha endoproteasa estén en contacto entre sí.
En el contexto de la presente invención, el término “endoproteasa” se refiere a una proteasa que escinde enlaces peptídicos de aminoácidos no terminales (es decir, dentro de la cadena polipeptídica). Como no atacan los aminoácidos terminales, las endoproteasas no pueden descomponer los péptidos en monómeros.
En realizaciones particulares, la escisión de la neurotoxina botulínica monocatenaria recombinante precursora está casi completa.
En el contexto de la presente invención, la expresión “casi completa” se define como una escisión superior a aproximadamente 95 %, especialmente más de aproximadamente el 97,5 %, más especialmente más de aproximadamente el 99 % como se determina por SDS-PAGE y posterior Western Blot o cromatografía de fase invertida.
En realizaciones particulares, la escisión de la neurotoxina botulínica monocatenaria recombinante precursora de la presente invención se produce en una señal de escisión heteróloga localizada en la región de bucle de la neurotoxina botulínica precursora recombinante.
En realizaciones particulares, la reacción de escisión se realiza con lisados de células huésped brutos que contienen dicha proteína precursora monocatenaria.
En otras realizaciones particulares, la proteína precursora monocatenaria se purifica o se purifica parcialmente, especialmente en una primera etapa de enriquecimiento cromatográfico, antes de la reacción de escisión.
En el contexto de la presente invención, el término “ purificado” se refiere a más de aproximadamente 90 % de pureza. En el contexto de la presente invención, la expresión “ parcialmente purificado” se refiere a una pureza inferior a aproximadamente 90 % y un enriquecimiento de más de aproximadamente dos veces.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a una neurotoxina botulínica monocatenaria recombinante de serotipo A que es un precursora de la neurotoxina botulínica recombinante de la presente invención. Por lo tanto, en dicho aspecto, la presente invención se refiere a una neurotoxina botulínica monocatenaria recombinante precursora de serotipo A que comprende dos dominios que consisten en restos de prolina, alanina y aminoácidos adicionales, seleccionados del grupo que consiste en restos de serina, treonina, tirosina y glutamina, y un exositio alfa modificado y/o exositio beta de la cadena ligera de la neurotoxina.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para obtener la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, que comprende la etapa de modificar una secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina botulínica de serotipo A.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, o la secuencia de ácido nucleico que puede obtenerse mediante el método de la presente invención.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a una célula huésped recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico que puede obtenerse mediante el método de la presente invención o el vector de la presente invención.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir la neurotoxina botulínica monocatenaria recombinante precursora de la presente invención, que comprende la etapa de expresar la secuencia de ácido nucleico de la presente invención, o la secuencia de ácido nucleico que puede obtenerse mediante el método de la presente invención, o el vector de la presente invención en una célula huésped recombinante, o bien cultivar la célula huésped recombinante de la presente invención en condiciones que dan lugar a la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico.
Ejemplos
Ejemplo 1: Generación y purificación de una toxina botulínica PASilada de tipo A (PAS100-BoNT/A (D102F T109R K340M I348L N353M K356R) -PAS100)
La construcción de ácido nucleico que codifica un módulo “ PAS” que comprende 100 restos aminoácidos construida a partir de los aminoácidos prolina (P), alanina (A) y serina (s) se produjo sintéticamente, en donde se utilizó el siguiente patrón (ASPAAPAPASPAAPAPSAPA). Utilizando enzimas de restricción Ndel y Swal, se insertó primero el módulo génico correspondiente en el extremo N de BoNT/A recombinante (rBoNT/A). En una segunda etapa, el módulo PAS se insertó en el extremo C de la cadena pesada utilizando las enzimas de restricción BgllI y Aatl. Se verificó mediante secuenciación que la clonación era correcta. Para la expresión de BoNT/A en E. coli, las construcciones génicas se clonaron en pET29c. Las variantes contienen etiquetas de afinidad His6 y Strep fusionadas que pueden escindirse después de la purificación de proteínas mediante trombina. Para construir un plásmido para la expresión de BoNT/a, se utilizó un gen sintético con las mutaciones correspondientes de D102F T109R K340M I348L N353M K356R en la secuencia de BoNT/A1 natural y se utilizaron los sitios de restricción Swal y Seal.
Expresión y purificación de proteínas.
La expresión de variantes de rBoNT/A se realizó en medios Riesenberg con 50 pg/ml de kanamicina {Riesenberg, 1991, n.° 1}. Las células se cultivaron en matraces agitados (37 qC, 175 rpm) hasta que se alcanzó una DO600 de 1,5-2. Para la inducción de la expresión de proteínas se añadió IPTG 1 mM (Fermentas) al cultivo de E. coli. La síntesis de proteínas se llevó a cabo durante 24 h (150C, 175 rpm). Las células se recogieron por centrifugación (5000 rpm, 20 min, 40C) y se resuspendieron en tampón de unión a His pH 8,0 (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, imidazol 5 mM) que contenía inhibidor de proteasa exento de EDTA completo (Roche Diagnostics). Para la determinación de la actividad endopeptidasa y caracterización in vivo, se extrajeron y purificaron las diferentes variantes de la toxina. Se rompieron los sedimentos resuspendidos en 2-3 ciclos mediante un French Press Cell Disrupte (Thermo Electron Corporation) a 4 °C. Los extractos brutos resultantes se centrifugaron (20.000 rpm, 30 min, 4 °C) y se recuperaron los sobrenadantes con las proteínas solubles. La purificación de proteínas se llevó a cabo mediante cromatografía líquida rápida de proteínas (GE Healthcare) utilizando los protocolos de purificación de tres etapas. La primera etapa de captura se realizó mediante IMAC utilizando una columna HisTrap HP de 1 ml (GE Healthcare). La columna se lavó (1 ml-min-1 de flujo de trabajo) utilizando un protocolo de dos etapas con tampón de elución His (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, imidazol 400 mM pH 8,0). La elución de las proteínas de la toxina se produjo en imidazol 400 mM. En una etapa adicional, se realizó una cromatografía de afinidad de Strep-Tactina como se ha descrito anteriormente (IBA GmbH). Como alternativa, en vez de una segunda cromatografía de afinidad se utilizó una cromatografía de intercambio catiónico en una columna HiTrap SP HP 1 ml (GE Healthcare, Freiburg, Alemania). Las muestras correspondientes se diluyeron con tampón de unión SP (Tris 50 mM, pH 8) y se eluyeron con tampón de elución SP (Tris 50 mM, NaCl 1 M, pH 8). Este procedimiento fue seguido por una SEC utilizando una columna Superdex 20010/300 (GE Healthcare). También se utilizó el tampón de migración SEC (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, CaCI22,5 mM pH 7,7) para almacenar las soluciones de proteína purificadas en alícuotas a -20 qC. Cada proteína se analizó aplicando 0,5-1 pg en gradiente de SDS- PAGE al 4-12 % (Novex Life Technologies) y se tiñó con tinción segura de SimplyBlue de Coomassie G-250 (Pierce). Cada proteína se consideró pura >98 % antes de aplicar los experimentos in vitro oin vivo.
Escisión de la trombina
Las preparaciones de BoNT/A se activaron con trombina (Merck Millipore; 8 U/1 mg de BoNT) durante 24 h a 20 0C produciendo >99 % de toxina bicatenaria. Posteriormente, la proteasa de escisión se eliminó con el kit Strep-Tactin descrito anteriormente (IBA GmbH).
La expresión se realizó en la cepa de expresión E. coli BI21. La purificación se hizo utilizando una combinación de cromatografía de afinidad, intercambio iónico y de exclusión molecular, seguida de activación utilizando trombina. La Figura 2 resume los resultados de la purificación y activación.
Ejemplo 2: Determinación de la actividad endoproteinasa de BoNT/A de tipo salvaje y BoNT/A PASilada
La actividad de endoproteinasa específica de las variantes de BoNT/A de tipo salvaje y BoNT/A modificada se determinó mediante un ensayo que se describe en Jones RG, Ochiai M, Liu Y, Ekong T, Sesardic D. Development of improved SNAP25 endopeptidase immuno-assays for botulinum type A and E toxins. J Immunol Methods. 1 Ene 2008;329(1-2):92-101 y Hallis B, James BA, Shone CC Development of novel assays for botulinum type A and B neurotoxins based on their endopeptidase activities. J Clin Microbiol. 1996 (8): 1934-8. Se utilizó la solución TMB Ultra, de 1 etapa, de Perbio Science para la tinción y cuantificación. Se utilizó un fragmento C-terminal de 70 aminoácidos de SNAP25 procedente de IBA GmBH en la reacción como sustrato. El anticuerpo primario de ratón de R&D Systems reconoce específicamente los fragmentos de SNAP25 escindidos únicamente por BoNT/A. El anticuerpo secundario era un conjugado de anticuerpo contra IgG de ratón con HPR de Dianova. El ensayo se realizó en una placa de microtitulación de 96 pocillos, y la cantidad de material escindido se determinó después de 120 minutos midiendo la absorción a 450 nm (Molecular Devices, FilterMax F5). Para el ensayo se utilizaron cantidades iguales de proteínas.
Los resultados de las actividades endopeptidasa medidas se muestran en la siguiente Tabla 1:
Tabla 1
Actividades exoproteinasa de mutantes
ISA2= (D102F T109R K340M I348L N353M K356R); N.° patrón
La Tabla 1 muestra que la actividad endoproteinasa específica de la toxina botulínica A PASilada aumentó por las mutaciones introducidas.
Ejemplo 3: Generación y purificación de una toxina botulínica de tipo A (PAS100-BoNT/A G169I, T220R, P239M, S254 -PAS100)
Se produjo sintéticamente la construcción de ácido nucleico que codifica un módulo “ PAS” que comprende 100 restos aminoácidos construidos a partir de los aminoácidos prolina (P), alanina (A) y serina (S), en donde se utilizó el siguiente patrón (ASPAAPAPASPAAPAPSAPA)5. Utilizando enzimas de restricción Nel y Swal, el módulo génico correspondiente se insertó primero en el extremo N de BoNT/A recombinante (rBoNT/A). En una segunda etapa, el módulo PAS se insertó en el extremo C de la cadena pesada utilizando las enzimas de restricción BgllI y Aatl. Se verificó mediante secuenciación que la clonación era correcta. Para la expresión de BoNT/A en E. coli, las construcciones génicas se clonaron en pET29c. Las variantes contienen etiquetas de afinidad His6 y Strep fusionadas que pueden escindirse después de la purificación de proteínas mediante trombina. Para construir un plásmido para la expresión de BoNT/a, se utilizó un gen sintético con las mutaciones correspondientes de G169I, T220R, P239M, S254 en la secuencia de BoNT/A1 de tipo salvaje y se utilizaron los sitios de restricción Swal y Seal.
La expresión de proteínas se realizó como se ha descrito anteriormente (véase el Ejemplo 1) en la cepa de expresión E. coli BL21. La purificación se hizo utilizando una combinación de cromatografía de afinidad, intercambio iónico y de exclusión molecular, seguida de activación utilizando trombina. La Figura 3 resume los resultados de la purificación y activación.
Ejemplo 4: Duración del efecto de PAS100-BoNT/A (G169I, T220R, P239M, S254T) -PAS100 en el “ Ensayo de carrera en ratones”
Se inyectaron dos dosis distintas de PAS100-BoNT/A (G169I, T220R, P239M, S254T) -PAS100 (=MaJ024), es decir, 6,0 pg y 9,0 pg en el gastrocnemio de cada ratón en comparación con el patrón Xeomin® (3 pg; 0,6 U) y toxina botulínica de tipo A PASilada sin las mutaciones introducidas (=Dasch021). Los ratones habían sido entrenados en una cinta de correr. La distancia recorrida diaria en la cinta de correr se midió durante 21 días. La parálisis causada por las toxinas se representó como porcentaje de la distancia recorrida en el día anterior a la inyección, que se estableció como 100 %, frente al tiempo (véase la Figura 5).
Como se muestra en la Figura 5, solo fueron necesarios 6 pg de PAS100-BoNT/A (G169I, T220R, P239M, S254T) -PAS (100) (=MaJ024) para lograr la misma parálisis en comparación con 9 pg de Dasch021 (BoNT/A PASilada sin las mutaciones introducidas), lo que indica que la potencia específica de MaJ024 había aumentado claramente en comparación con Dasch021.
Tabla 1: Secuencias
Id. de sec. n.° 1: BoNT recombinante A, incluida la etiqueta His
Id. de sec. n.° 2: PAS100-BoNT/A recombinante (D102F T109R K340M I348L N353M K356R) -PAS100 incluida la etiqueta His
Id. de sec. n.° 3: PAS100-BoNT recombinante (G169I, T220R, P239M, S254)-PAS100 incluida la etiqueta His)
Id. de sec. n.° 4: PAS100-BoNT/A recombinante (D102F T109R K340M I348L N353M K356R) -PAS100 incluida la etiqueta His (secuencia de ácido nucleico)
Id. de sec. n.° 5: PAS100-BoNT/A recombinante (G169I, T220R, P239M, S254T)-PAS100 incluida la etiqueta His) (secuencia de ácido nucleico)
Id. de sec. n.° 1:
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTY LSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPS ADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGI AINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYM KNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNL RNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKAGAGKSLVPRGSAGAGALNDLCIKVNNWDLF FSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKY ELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETS EVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRN EKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMI NINKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQ RLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFST SFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNR LNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWG DYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDR VYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQWVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNN IAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPLGDLVPRGSANSSSVDKLWSHPQFEKLEHHHHHH
Id. de sec. n.° 2: PAS100-BoNT/A recombinante (D102F T109R K340M I348L N353M K356R) - PAS100 incluida la etiqueta His
MGSSHHHHHHGSLVPRSSSASPAAPAPASPAAPAPSAPAASPAAPAPASPAAPAPSAPAASPAAPAPASPAAPAP SAPAASPAAPAPASPAAPAPSAPAASPAAPAPASPAAPAPSAPAAPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQP VKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTFLGRMLLRS IVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSP DFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGG HDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDMLYKMLT ELYTEDMFVRFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFE FYKLLCVRGIITSKAGAGKSLVPRGSAGAGALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISL DLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEA LLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVG ALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEAL ENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASL KDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYAS KINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVS LNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLD GCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYM YLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPD VGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDD GWGERPLASPAAPAPASPAAPAPSAPAASPAAPAPASPAAPAPSAPAASPAAPAPASPAAPAPSAPAASPAAPAP ASPAAPAPSAPAASPAAPAPASPAAPAPSAPAGDLVPRGSANSSSVDKLWSHPQFEK
Id. de sec. n.° 3: PAS100-BoNT recombinante (G169I, T220R, P239M, S254T) -PAS100 incluida la etiqueta His)
MGSSHHHHHHGSLVPRSSSASPAAPAPASPAAPAPSAPAASPAAPAPASPAAPAPSAPAASPAAPAPASPAAPAPSAPA ASPAAPAPASPAAPAPSAPAASPAAPAPASPAAPAPSAPAAPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKI WVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTID TELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFIHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLG AGKFATDPAVRLAHELIHAGHRLYGIAINMNRVFKVNTNAYYEMTGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKF KDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAV FKINIVPKVNYTIYDGFNLSNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKAGAGKSLVPRGSAGAGAL NDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIE RFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFT DETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNE KWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFL NQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYI KNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISL NNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISN LGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVD VNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKIL SALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPV DDGWGERPLASPAAPAPASPAAPAPSAPAASPAAPAPASPAAPAPSAPAASPAAPAPASPAAPAPSAPAASPAAPAPAS PAAPAPSAPAASPAAPAPASPAAPAPSAPAGDLVPRGSANSSSVDKLWSHPQFEK
Id. de sec. n .°4: PAS100-BoNT/A recombinante (D102F T109R K340M I348L N353M K356R) - PAS100 incluida la etiqueta His (secuencia de ácido nucleico)
ATGGGTAGCAGCCATCATCATCACCATCATGGTAGCCTGGTTCCGCGTAGCTCTTCTGCAAGTCCGGCAGCACC GGCACCGGCTTCACCAGCTGCACCAGCACCTAGCGCACCGGCAGCATCTCCAGCAGCCCCTGCACCGGCAAG CCCTGCAGCTCCAGCACCGTCAGCACCAGCAGCAAGCCCAGCTGCTCCTGCTCCAGCGAGCCCAGCAGCGCC AGCTCCTAGTGCCCCTGCTGCCTCTCCTGCTGCTCCGGCACCAGCAAGTCCTGCTGCGCCTGCACCGAGTGCT CCGGCTGCTAGTCCTGCCGCACCAGCTCCGGCTAGTCCAGCTGCTCCAGCCCCTTCAGCCCCTGCAGCACCAT TTGTGAACAAGCAGTTTAACTATAAGGACCCGGTGAACGGTGTGGATATCGCGTATATCAAAATCCCGAATGCG GGCCAGATGCAACCAGTCAAGGCGTTCAAGATTCATAACAAGATTTGGGTTATTCCGGAACGTGATACCTTCACC AATCCGGAAGAAGGCGATTTAAATCCGCCGCCAGAAGCCAAACAAGTGCCGGTGAGCTACTATGATAGCACGTA TCTTAGCACCGATAATGAAAAAGACAATTACCTGAAGGGCGTGACCAAGTTGTTCGAGCGCATCTACAGTACCTT CTTAGGCCGCATGTTGTTGCGTAGCATCGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGCGGCTCGACCATTGATACCGAGT TGAAAGTCATTGACACGAACTGTATCAATGTTATCCAACCGGACGGCAGTTATCGCAGCGAGGAGTTAAATTTGG TCATCATCGGTCCAAGCGCAGATATTATTCAGTTCGAATGCAAGAGCTTCGGCCATGAGGTCTTGAATTTGACGC GCAACGGTTACGGCAGCACCCAATACATCCGCTTTAGCCCGGATTTCACCTTTGGCTTCGAGGAGAGCTTGGAG GTGGACACCAACCCGCTGTTAGGTGCCGGCAAATTCGCAACCGACCCGGCAGTGACGTTGGCGCACGAATTGA TTCATGCGGGTCACCGCTTATACGGTATCGCGATCAATCCGAATCGCGTCTTTAAAGTCAATACCAACGCGTACT ACGAAATGAGCGGCTTAGAGGTTAGCTTTGAAGAATTACGCACCTTCGGTGGCCACGACGCCAAGTTCATCGAC AGCCTGCAGGAAAATGAGTTCCGCTTGTACTATTACAATAAATTCAAGGACATCGCGAGCACCTTAAATAAAGCA
AAGAGCATT GT GGGCACCACCGCAAGCTT GCAGTACAT GAAGAACGT ATTT AAGGAAAAAT ATTT GTT GTCGGAG GATACCAGCGGGAAATTCAGCGTCGATAAGCTGAAATTCGACATGTTGTATAAAATGCTGACCGAGCTGTACAC CGAGGAT AT GTTCGTCCGTTTTTTT AAGGT GTT AAATCGTAAGACCT ATTT AAACTTTGAT AAAGCGGT GTTT AAA ATT AAT ATCGTGCCGAAGGT GAATT ACACCAT CT ACGAT GGTTTCAATTT ACGCAACACGAAT CT GGCGGCGAAT TTT AAT GGCCAAAACACCGAAATT AACAACAT GAACTTT ACGAAGTTAAAGAATTTCACGGGCTT ATTCGAATTCT ACAAGTTATTATGCGTGCGCGGCATCATTACCAGCAAGGCAGGTGCGGGCAAGTCCTTGGTTCCGCGTGGCAG CGCCGGCGCCGGCGCGCTCAATGATCTGTGTATTAAAGTCAATAACTGGGACCTGTTCTTCAGCCCGAGCGAG GATAACTTTACCAACGACTTAAACAAAGGCGAGGAGATCACGAGCGATACGAACATCGAGGCGGCGGAGGAAA ATATTAGCCTGGACCTCATTCAGCAGTACTATCTGACGTTCAATTTTGACAATGAGCCGGAGAACATCAGCATTG AAAATCTCAGCAGCGACATCATCGGTCAGTTGGAACTGATGCCGAACATTGAACGCTTTCCGAACGGCAAAAAA TATGAACTGGACAAGTATACCATGTTCCATTACTTACGCGCACAGGAATTTGAGCACGGCAAGAGCCGCATTGC GCTGACCAATAGCGTTAACGAGGCCTTGTTAAATCCGAGCCGTGTCTACACGTTCTTCAGCAGCGATTATGTCAA AAAAGTGAACAAGGCGACCGAAGCCGCGATGTTTTTGGGCTGGGTCGAGCAATTGGTTTACGATTTTACCGACG AAACCAGCGAGGTGAGCACGACCGACAAAATTGCAGATATCACCATCATCATTCCGTACATCGGTCCGGCGCTC AATATCGGCAATATGTTATACAAGGACGACTTTGTGGGCGCGCTGATCTTTAGCGGCGCGGTTATCTTATTAGAA TTCATCCCGGAGATCGCAATCCCGGTCTTGGGCACCTTTGCGTTGGTGAGCTATATCGCGAATAAAGTGCTCAC GGTCCAAACCATCGATAACGCGCTCAGCAAGCGTAATGAGAAATGGGACGAGGTTTATAAGTATATCGTGACCA ACTGGTTAGCAAAAGTCAATACGCAGATCGATCTCATCCGCAAAAAAATGAAAGAAGCCTTGGAAAATCAAGCGG AGGCAACCAAAGCCATCATTAATTACCAGTATAACCAATATACCGAAGAAGAAAAAAACAATATCAACTTCAATAT CGATGATTTGAGCAGCAAACTGAACGAGAGCATTAACAAAGCGATGATTAACATCAACAAGTTCTTGAATCAATG CAGCGTGAGCTATCTCATGAACAGCATGATCCCGTATGGCGTCAAACGCTTGGAAGATTTTGACGCCAGCCTGA AAGATGCGCTCCTCAAGTATATTTATGACAACCGCGGCACCCTCATTGGCCAGGTGGACCGCTTGAAGGATAAA GTGAACAATACGCTCAGCACGGATATCCCGTTCCAGCTGAGCAAGTACGTCGACAACCAGCGCTTACTGAGCAC CTTTACCGAGTATATCAAGAACATCATTAATACCAGCATCCTCAACTTGCGCTATGAGAGCAATCACCTGATCGA CCTCAGCCGCTACGCCAGCAAGATCAACATCGGCAGCAAGGTCAATTTCGACCCGATCGATAAGAATCAGATCC AATTGTTTAACCTGGAAAGCAGCAAGATCGAGGTTATCTTGAAGAACGCGATTGTGTACAACAGCATGTACGAGA ACTTTAGCACGAGCTTCTGGATTCGTATCCCGAAGTATTTCAATAGCATTAGCCTGAATAACGAATATACCATTAT CAACTGCATGGAAAATAATAGCGGCTGGAAGGTGAGCTTAAATTACGGCGAGATCATTTGGACCTTACAGGATA CCCAAGAAATCAAACAGCGCGTCGTCTTTAAGTATAGCCAGATGATCAACATCAGCGATTACATCAACCGCTGGA TCTTCGTGACCATCACCAATAATCGCTTGAATAATAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATTGATCAAAAACC GATCAGCAATCTCGGTAATATCCATGCCAGCAATAACATCATGTTTAAGTTAGACGGTTGCCGCGATACCCACCG CTATATCTGGATCAAGTATTTTAACTTATTTGATAAGGAACTCAACGAAAAGGAAATTAAAGACTTATATGACAATC AGAGCAATAGCGGCATCCTGAAGGATTTCTGGGGCGACTACCTGCAGTACGATAAGCCGTACTATATGTTGAAC TTGTATGACCCGAACAAATATGTCGATGTGAACAATGTGGGTATTCGTGGCTATATGTACTTAAAGGGCCCGCGT GGTAGCGTGATGACCACGAATATTTACTTAAACAGCAGCTTATACCGCGGCACGAAGTTTATTATCAAGAAGTAT GCCAGCGGCAACAAGGACAATATCGTCCGCAACAACGACCGTGTGTATATTAACGTGGTGGTGAAGAATAAAGA GTACCGCTTGGCCACGAATGCGAGCCAGGCGGGCGTGGAAAAAATCTTGAGCGCGTTGGAGATCCCGGACGT CGGCAACCTCAGCCAGGTTGTGGTGATGAAGTCTAAAAACGACCAGGGCATCACGAACAAGTGCAAAATGAATT TGCAAGATAACAACGGCAACGACATCGGCTTTATTGGTTTTCACCAGTTCAATAACATCGCCAAACTCGTGGCCA GCAATTGGTATAACCGCCAAATTGAACGCAGCAGCCGCACGCTCGGCTGTAGCTGGGAGTTCATCCCGGTGGA CGATGGCTGGGGCGAGCGCCCGCTCGCAAGTCCGGCAGCACCGGCACCGGCTTCACCAGCTGCACCAGCACC TAGCGCACCGGCAGCATCTCCAGCAGCCCCTGCACCGGCAAGCCCTGCAGCTCCAGCACCGTCAGCACCAGC AGCAAGCCCAGCTGCTCCTGCTCCAGCGAGCCCAGCAGCGCCAGCTCCTAGTGCCCCTGCTGCCTCTCCTGCT GCTCCGGCACCAGCAAGTCCTGCTGCGCCTGCACCGAGTGCTCCGGCTGCTAGTCCTGCCGCACCAGCTCCG GCTAGTCCAGCTGCTCCAGCCCCTTCAGCCCCTGCAGGAGATCTGGTGCCACGCGGTTCCGCGAATTCGAGCT CCGTCGACAAGCTTTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAATAA
Id. de sec. n.° 5: PAS100-BoNT/A recombinante (G169I, T220R, P239M, S254T) -PAS100 incluida la etiqueta His) (secuencia de ácido nucleico)
ATGGGTAGCAGCCATCATCATCACCATCATGGTAGCCTGGTTCCGCGTAGCTCTTCTGCAAGTCCGGCAGCACC GGCACCGGCTTCACCAGCTGCACCAGCACCTAGCGCACCGGCAGCATCTCCAGCAGCCCCTGCACCGGCAAG CCCTGCAGCTCCAGCACCGTCAGCACCAGCAGCAAGCCCAGCTGCTCCTGCTCCAGCGAGCCCAGCAGCGCC AGCTCCTAGTGCCCCTGCTGCCTCTCCTGCTGCTCCGGCACCAGCAAGTCCTGCTGCGCCTGCACCGAGTGCT CCGGCTGCTAGTCCTGCCGCACCAGCTCCGGCTAGTCCAGCTGCTCCAGCCCCTTCAGCCCCTGCAGCACCAT TTGTGAACAAGCAGTTTAACTATAAGGACCCGGTGAACGGTGTGGATATCGCGTATATCAAAATCCCGAATGCG GGCCAGATGCAACCAGTCAAGGCGTTCAAGATTCATAACAAGATTTGGGTTATTCCGGAACGTGATACCTTCACC AATCCGGAAGAAGGCGATTTAAATCCGCCGCCAGAAGCCAAACAAGTGCCGGTGAGCTACTATGATAGCACGTA TCTTAGCACCGATAATGAAAAAGACAATTACCTGAAGGGCGTGACCAAGTTGTTCGAGCGCATCTACAGTACCG ACTTAGGCCGCATGTTGTTGACGAGCATCGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGCGGCTCGACCATTGATACCGA GTTGAAAGTCATTGACACGAACTGTATCAATGTTATCCAACCGGACGGCAGTTATCGCAGCGAGGAGTTAAATTT GGTCATCATCGGTCCAAGCGCAGATATTATTCAGTTCGAATGCAAGAGCTTCATCCATGAGGTCTTGAATTTGAC GCGCAACGGTTACGGCAGCACCCAATACATCCGCTTTAGCCCGGATTTCACCTTTGGCTTCGAGGAGAGCTTGG AGGTGGACACCAACCCGCTGTTAGGTGCCGGCAAATTCGCAACCGACCCGGCAGTGCGCTTGGCGCACGAATT GATTCATGCGGGTCACCGCTTATACGGTATCGCGATCAATATGAATCGCGTCTTTAAAGTCAATACCAACGCGTA CTACGAAATGACCGGCTTAGAGGTTAGCTTTGAAGAATTACGCACCTTCGGTGGCCACGACGCCAAGTTCATCG
ACAGCCT GCAGGAAAATGAGTTCCGCTT GT ACT ATTACAAT AAATTCAAGGACATCGCGAGCACCTT AAAT AAAG CAAAGAGCATT GT GGGCACCACCGCAAGCTT GCAGTACAT GAAGAACGT ATTT AAGGAAAAAT ATTT GTT GTCGG AGGAT ACCAGCGGGAAATT CAGCGTCGAT AAGCTGAAATTCGACAAATTGTAT AAAAT GCT GACCGAGATTT ACA CCGAGGAT AACTTCGT CAAGTTTTTT AAGGTGTT AAATCGT AAGACCT ATTT AAACTTT GAT AAAGCGGT GTTT AA AATTAATATCGTGCCGAAGGTGAATTACACCATCTACGATGGTTTCAACTTAAGCAACACGAATCTGGCGGCGAA TTTTAATGGCCAAAACACCGAAATTAACAACATGAACTTTACGAAGTTAAAGAATTTCACGGGCTTATTCGAATTC TACAAGTTATTATGCGTGCGCGGCATCATTACCAGCAAGGCAGGTGCGGGCAAGTCCTTGGTTCCGCGTGGCA GCGCCGGCGCCGGCGCGCTCAATGATCTGTGTATTAAAGTCAATAACTGGGACCTGTTCTTCAGCCCGAGCGA GGATAACTTTACCAACGACTTAAACAAAGGCGAGGAGATCACGAGCGATACGAACATCGAGGCGGCGGAGGAA AATATTAGCCTGGACCTCATTCAGCAGTACTATCTGACGTTCAATTTTGACAATGAGCCGGAGAACATCAGCATT GAAAATCTCAGCAGCGACATCATCGGTCAGTTGGAACTGATGCCGAACATTGAACGCTTTCCGAACGGCAAAAA ATATGAACTGGACAAGTATACCATGTTCCATTACTTACGCGCACAGGAATTTGAGCACGGCAAGAGCCGCATTG CGCTGACCAATAGCGTTAACGAGGCCTTGTTAAATCCGAGCCGTGTCTACACGTTCTTCAGCAGCGATTATGTCA AAAAAGTGAACAAGGCGACCGAAGCCGCGATGTTTTTGGGCTGGGTCGAGCAATTGGTTTACGATTTTACCGAC GAAACCAGCGAGGTGAGCACGACCGACAAAATTGCAGATATCACCATCATCATTCCGTACATCGGTCCGGCGCT CAATATCGGCAATATGTTATACAAGGACGACTTTGTGGGCGCGCTGATCTTTAGCGGCGCGGTTATCTTATTAGA ATTCATCCCGGAGATCGCAATCCCGGTCTTGGGCACCTTTGCGTTGGTGAGCTATATCGCGAATAAAGTGCTCA CGGTCCAAACCATCGATAACGCGCTCAGCAAGCGTAATGAGAAATGGGACGAGGTTTATAAGTATATCGTGACC AACTGGTTAGCAAAAGTCAATACGCAGATCGATCTCATCCGCAAAAAAATGAAAGAAGCCTTGGAAAATCAAGCG GAGGCAACCAAAGCCATCATTAATTACCAGTATAACCAATATACCGAAGAAGAAAAAAACAATATCAACTTCAATA TCGATGATTTGAGCAGCAAACTGAACGAGAGCATTAACAAAGCGATGATTAACATCAACAAGTTCTTGAATCAAT GCAGCGTGAGCTATCTCATGAACAGCATGATCCCGTATGGCGTCAAACGCTTGGAAGATTTTGACGCCAGCCTG AAAGATGCGCTCCTCAAGTATATTTATGACAACCGCGGCACCCTCATTGGCCAGGTGGACCGCTTGAAGGATAA AGTGAACAATACGCTCAGCACGGATATCCCGTTCCAGCTGAGCAAGTACGTCGACAACCAGCGCTTACTGAGCA CCTTTACCGAGTATATCAAGAACATCATTAATACCAGCATCCTCAACTTGCGCTATGAGAGCAATCACCTGATCG ACCTCAGCCGCTACGCCAGCAAGATCAACATCGGCAGCAAGGTCAATTTCGACCCGATCGATAAGAATCAGATC CAATTGTTTAACCTGGAAAGCAGCAAGATCGAGGTTATCTTGAAGAACGCGATTGTGTACAACAGCATGTACGAG AACTTTAGCACGAGCTTCTGGATTCGTATCCCGAAGTATTTCAATAGCATTAGCCTGAATAACGAATATACCATTA TCAACTGCATGGAAAATAATAGCGGCTGGAAGGTGAGCTTAAATTACGGCGAGATCATTTGGACCTTACAGGATA CCCAAGAAATCAAACAGCGCGTCGTCTTTAAGTATAGCCAGATGATCAACATCAGCGATTACATCAACCGCTGGA TCTTCGTGACCATCACCAATAATCGCTTGAATAATAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATTGATCAAAAACC GATCAGCAATCTCGGTAATATCCATGCCAGCAATAACATCATGTTTAAGTTAGACGGTTGCCGCGATACCCACCG CTATATCTGGATCAAGTATTTTAACTTATTTGATAAGGAACTCAACGAAAAGGAAATTAAAGACTTATATGACAATC AGAGCAATAGCGGCATCCTGAAGGATTTCTGGGGCGACTACCTGCAGTACGATAAGCCGTACTATATGTTGAAC TTGTATGACCCGAACAAATATGTCGATGTGAACAATGTGGGTATTCGTGGCTATATGTACTTAAAGGGCCCGCGT GGTAGCGTGATGACCACGAATATTTACTTAAACAGCAGCTTATACCGCGGCACGAAGTTTATTATCAAGAAGTAT GCCAGCGGCAACAAGGACAATATCGTCCGCAACAACGACCGTGTGTATATTAACGTGGTGGTGAAGAATAAAGA GTACCGCTTGGCCACGAATGCGAGCCAGGCGGGCGTGGAAAAAATCTTGAGCGCGTTGGAGATCCCGGACGT CGGCAACCTCAGCCAGGTTGTGGTGATGAAGTCTAAAAACGACCAGGGCATCACGAACAAGTGCAAAATGAATT TGCAAGATAACAACGGCAACGACATCGGCTTTATTGGTTTTCACCAGTTCAATAACATCGCCAAACTCGTGGCCA GCAATTGGTATAACCGCCAAATTGAACGCAGCAGCCGCACGCTCGGCTGTAGCTGGGAGTTCATCCCGGTGGA CGATGGCTGGGGCGAGCGCCCGCTCGCAAGTCCGGCAGCACCGGCACCGGCTTCACCAGCTGCACCAGCACC TAGCGCACCGGCAGCATCTCCAGCAGCCCCTGCACCGGCAAGCCCTGCAGCTCCAGCACCGTCAGCACCAGC AGCAAGCCCAGCTGCTCCTGCTCCAGCGAGCCCAGCAGCGCCAGCTCCTAGTGCCCCTGCTGCCTCTCCTGCT GCTCCGGCACCAGCAAGTCCTGCTGCGCCTGCACCGAGTGCTCCGGCTGCTAGTCCTGCCGCACCAGCTCCG GCTAGTCCAGCTGCTCCAGCCCCTTCAGCCCCTGCAGGAGATCTGGTGCCACGCGGTTCCGCGAATTCGAGCT CCGTCGACAAGCTTTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAATAA
Claims (1)
- REIVINDICACIONESUna neurotoxina botulínica recombinante con serotipo A que comprende al menos dos dominios, en donde cada dominio comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de entre 70 y 260 restos de aminoácidos, particularmente 100 restos de aminoácidos, 150 restos de aminoácidos o 200 restos de aminoácidos, en donde dicha secuencia de aminoácidos consiste en restos de prolina, alanina y serina, en donde la neurotoxina comprende además seis modificaciones de aminoácidos en el exositio alfa de la cadena ligera de la neurotoxina en las posiciones D102, T109, K340, I348, N353, K356, en donde estos aminoácidos se sustituyen como sigue D102F, T109R, K340M, I348L, N353M, K356R y cuatro modificaciones de aminoácidos en el exositio beta de la cadena ligera de la neurotoxina en las posiciones G169, T220, P239, S254, en donde estos restos de aminoácidos se sustituyen como sigue G169I, T220R, P239M, S254T, en donde la neurotoxina botulínica de serotipo A tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 95 % con la parte correspondiente de la neurotoxina botulínica de serotipo A precursora, y en donde la neurotoxina botulínica de serotipo A produce tanto (i) un aumento en la duración del efecto respecto a una neurotoxina botulínica de serotipo A parental como (ii) un aumento en la actividad biológica específica con respecto a una neurotoxina botulínica de serotipo A que comprende dos dominios que consisten en restos de prolina, alanina y serina sin dichas modificaciones en el exositio alfa y/o en el exositio beta de la cadena ligera de la neurotoxina.Una composición que comprende la neurotoxina recombinante de la reivindicación 1.Una composición farmacéutica que comprende la neurotoxina recombinante de la reivindicación 1.Uso de la neurotoxina recombinante de la reivindicación 1 para tratamiento cosmético.Un método para generar una neurotoxina recombinante según las reivindicaciones 1, que comprende la etapa de obtener una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una neurotoxina botulínica monocatenaria recombinante precursora mediante la inserción de una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos dos dominios que consisten en prolina, alanina y restos de aminoácidos adicionales, seleccionados del grupo que consiste en restos de serina, treonina, tirosina y glutamina en una secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina clostrídica precursora y modificando la secuencia de ácido nucleico que codifica una neurotoxina botulínica precursora en el exositio alfa y/o en el exositio beta de la cadena ligera.
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