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ES2929726T3 - Normalización de la respuesta de un instrumento de fluorescencia mediante el uso de la respuesta espectral - Google Patents

Normalización de la respuesta de un instrumento de fluorescencia mediante el uso de la respuesta espectral Download PDF

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ES2929726T3
ES2929726T3 ES15841304T ES15841304T ES2929726T3 ES 2929726 T3 ES2929726 T3 ES 2929726T3 ES 15841304 T ES15841304 T ES 15841304T ES 15841304 T ES15841304 T ES 15841304T ES 2929726 T3 ES2929726 T3 ES 2929726T3
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David A Heavner
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Ortho Clinical Diagnostics Inc
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Abstract

Un método para normalizar al menos uno de una población de analizadores de diagnóstico clínico subordinados a un analizador de diagnóstico clínico maestro, de modo que el resultado de un ensayo de un analizador de diagnóstico clínico subordinado se pueda convertir en el resultado equivalente del analizador de diagnóstico clínico maestro mediante el uso de un multiplicativo simple. cuando el ensayo ejecutado en cada analizador utiliza un tinte común marcado con fluorescencia. También es un método para volver a normalizar el resultado de un ensayo de un analizador de diagnóstico clínico subordinado a un resultado de ensayo de un analizador de diagnóstico clínico maestro mediante el uso de un factor multiplicativo simple cuando el ensayo ejecutado en el analizador de diagnóstico clínico subordinado utiliza un colorante marcado con fluorescencia diferente al del ensayo ejecutado en el analizador de diagnóstico clínico subordinado. analizador maestro de diagnóstico clínico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Normalización de la respuesta de un instrumento de fluorescencia mediante el uso de la respuesta espectral
Campo de la invención
La invención se refiere generalmente a un método para calibrar analizadores de diagnóstico mediante el uso de la fluorometría como mecanismo de medición.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a al menos un analizador de diagnóstico clínico que realiza un inmunoensayo que emplea un marcador de fluorescencia. Típicamente, un marcador de fluorescencia se une a anticuerpos o antígenos que tienen afinidad por el analito de interés. El analito desconocido en la muestra luego se une con los anticuerpos o antígenos marcados que generalmente están inmovilizados en un sustrato. Los anticuerpos o antígenos marcados no unidos se eliminan subsecuentemente por lavado y la concentración de anticuerpos o antígenos marcados unidos se mide mediante el uso de la fluorometría.
La fluorometría es la medida de la fluorescencia. La fluorescencia es la adsorción molecular de energía luminosa en una longitud de onda y su reemisión casi instantánea en otra longitud de onda, generalmente más larga. El instrumento usado para medir la fluorescencia se llama fluorómetro. Un fluorómetro genera la longitud de onda de la luz requerida para excitar el analito de interés y luego mide la intensidad de la luz emitida resultante. La cantidad o cuantía de luz emitida es frecuentemente proporcional a la concentración del analito que se mide. Cuando se emplea en analizadores de diagnóstico clínico, la fluorometría proporciona una extraordinaria sensibilidad, alta especificidad, simplicidad y bajo costo en comparación con otras técnicas analíticas.
Para asegurar el control de calidad de los resultados de los fluorómetros, se emplea alguna forma de estándar de referencia estable, como el vidrio de SRM (Material de Referencia Estándar) 2944 del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST). El SRM 2944 es un vidrio dopado con iones de bismuto en forma de cubeta, recomendado para su uso en la corrección espectral relativa de la emisión y la verificación diaria del rendimiento de los espectrómetros de fluorescencia de estado estacionario. Más información sobre el SRM 2944 se describe en Paul C. DeRose; Melodía V. Smith; Jeffrey R. Anderson; Gary W. Kramer en Journal of Luminescence, Volumen 141, págs. 9-14, titulado "Characterization of Standard Reference Material 2944, Bi-Ion-Doped Glass, Spectral Correction Standard for Red Fluorescence".
Un problema que presentan los fluorómetros es que las variaciones en la fabricación de analizadores de diagnóstico clínico son tales que para un marcador de fluorescencia dado; la población de analizadores de diagnóstico clínico no proporcionará el mismo resultado analítico para una cantidad específica de analito en una muestra. Estas variaciones de fabricación son el resultado de diferencias en los espectros de luz de excitación del diodo láser, variaciones en las características de transmisión de los filtros ópticos, etc. Por lo tanto, para tener en cuenta estas variaciones y proporcionar resultados precisos, debe calibrarse cada analizador de diagnóstico clínico individual.
Otro problema que presentan los fluorómetros es que la introducción de un nuevo marcador de fluorescencia que tenga diferentes espectros de absorción y emisión requerirá una recalibración total de toda la población de analizadores de diagnóstico clínico.
Un método para la calibración de la longitud de onda de un espectrómetro se describe en el documento US 2008/0297796 A1. Los métodos descritos en este documento se basan en el principio de un desplazamiento relativo gradual de los bloques de valores medidos correspondientes de un modelo y un espectro de calibración donde se calcula un valor de correlación para cada paso de desplazamiento. Para cada bloque de valores medidos se determina un valor de desplazamiento en el que el valor de correlación alcanza un valor óptimo. Para cada bloque de valores medidos se determina un par de valores compuesto por un marcador de posición del bloque de valores medidos y el correspondiente valor de desplazamiento. Estos pares de valores representan los puntos de diseño para ajustarse a una función de asignación adecuada. Los coeficientes obtenidos de esta manera pueden usarse directamente como coeficientes de una asignación de longitud de onda o combinarse con los coeficientes de una primera asignación de longitud de onda existente, al reemplazar, por ejemplo, estos coeficientes o compensados con los coeficientes de una primera asignación de longitud de onda existente.
Otro método y sistema de calibración espectral para múltiples instrumentos se describe en el documento US 2006/0138344 A1. En este documento, se describe un aparato para generar factores de calibración para un instrumento de detección espectral. Los factores de calibración se derivan de una placa de calibración que contiene una o más especies espectrales en cada pocillo de la placa de calibración. A continuación, cada pocillo se expone a una fuente de excitación que provoca la fluorescencia de una o más especies espectrales en cada uno de los pocillos. La respuesta de la señal se mide y asocia con cada especie espectral en cada posición de pocillo diferente en la placa de calibración. Luego, la respuesta de la señal medida de cada especie espectral en cada posición del pocillo en la placa de calibración se compara con una respuesta de señal predeterminada para cada especie espectral. Los resultados de esta comparación pueden usarse para determinar un factor de calibración para cada pocilio y especie espectral para compensar la diferencia entre la respuesta de la señal medida y la respuesta de la señal predeterminada.
Finalmente, Paul C. DeRose: "Standard Guide to Fluorescence - Instrument Calibration and Validation", 2 de octubre de 2007, páginas 1 a 27, Gaithersburg, MD 20899-8312, enumera los materiales y métodos disponibles para cada tipo de calibración o corrección para instrumentos de fluorescencia (corrección de emisión espectral, precisión de longitud de onda, etc.) con una descripción general, el nivel de calidad, precisión y exactitud alcanzable, advertencias y referencias útiles proporcionadas para cada entrada.
Resumen de la invención
Un objeto de la presente invención es permitir que una población de analizadores o instrumentos de diagnóstico clínico se normalice a un analizador o instrumento de diagnóstico clínico principal específico de manera que la respuesta de cualquier analizador o instrumento de diagnóstico clínico subordinado en la población a una muestra que tenga un la cantidad de analito es sustancialmente la misma que la respuesta del analizador o instrumento de diagnóstico clínico principal a esa muestra después de una calibración inicial de fábrica. Otro objeto de la presente invención es permitir la introducción de un nuevo marcador de fluorescencia que tenga un espectro de emisión y adsorción diferente en comparación con un marcador de fluorescencia anterior, de manera que la recalibración y la renormalización de toda la población de analizadores de diagnóstico clínico al analizador de diagnóstico clínico principal depende únicamente de los espectros de absorción y emisión del nuevo marcador de fluorescencia. No se requiere una recalibración total de la población de analizadores de diagnóstico clínico.
Los objetos anteriores y adicionales de la invención se logran de acuerdo con un aspecto de la invención que proporciona un método de acuerdo con la reivindicación 1 para normalizar un primer resultado de diagnóstico de un analizador de diagnóstico clínico subordinado a un segundo resultado de diagnóstico de un analizador de diagnóstico clínico principal que comprende las etapas de obtener un espectro de intensidad de excitación normalizado del analizador de diagnóstico clínico principal, obtener un espectro de intensidad de excitación normalizado del analizador de diagnóstico clínico subordinado, obtener un espectro de intensidad de respuesta normalizado del analizador de diagnóstico clínico principal, obtener un espectro de intensidad de respuesta normalizado del analizador de diagnóstico clínico subordinado analizador de diagnóstico clínico, obtener un espectro de excitación/emisión normalizado de un objetivo de calibración de fluoróforo fotoestable inorgánico sólido, leer el objetivo de calibración de fluoróforo fotoestable inorgánico sólido en el analizador de diagnóstico clínico principal para obtener de esta manera un primer valor de respuesta, leer el objetivo de calibración de fluoróforo fotoestable inorgánico sólido en el analizador de diagnóstico clínico subordinado para obtener de esta manera un segundo valor de respuesta, determinar la relación de ganancia del analizador de diagnóstico clínico principal con respecto al analizador de diagnóstico clínico subordinado en función de los dos valores de respuesta obtenidos anteriormente, determinar un factor de normalización multiplicativo entre un analizador de diagnóstico clínico subordinado normalizado y el analizador de diagnóstico clínico principal, determinar el espectro relativo de adsorción/emisión de un primer colorante marcado con fluorescencia, mientras que el primer colorante marcado con fluorescencia es un componente de ensayo de diagnóstico, obtener un primer resultado de diagnóstico a partir de un espécimen o muestra de un paciente específico que incorpore el primer colorante marcado con fluorescencia mediante el uso del analizador de diagnóstico clínico subordinado normalizado, y multiplicar el primer resultado de diagnóstico por el factor de normalización multiplicativo para obtener un segundo resultado de diagnóstico mientras que el segundo resultado de diagnóstico es una aproximación normalizada a un resultado de diagnóstico que se obtendría mediante el análisis del espécimen o la muestra de un paciente específico en el analizador de diagnóstico clínico principal.
Otro aspecto más de la invención proporciona un método para volver a normalizar un resultado de ensayo de un analizador de diagnóstico clínico subordinado en comparación con un resultado de ensayo de un analizador de diagnóstico clínico principal que comprende las etapas de normalizar el analizador de diagnóstico clínico subordinado como se indicó anteriormente, obtener un espectro relativo de adsorción/intensidad de un segundo colorante marcado con fluorescencia, mientras que el segundo colorante marcado con fluorescencia es un componente de ensayo de diagnóstico, determinar un factor multiplicativo de renormalización entre un analizador de diagnóstico clínico subordinado y un analizador de diagnóstico clínico principal, obtener un primer resultado de diagnóstico de una muestra o espécimen de paciente específico que incorpore el segundo colorante marcado con fluorescencia mediante el uso del analizador de diagnóstico clínico subordinado normalizado, y multiplicar el primer resultado de diagnóstico por el factor de renormalización para obtener un segundo resultado de diagnóstico, mientras que el segundo resultado de diagnóstico es una aproximación normalizada a un resultado de diagnóstico que se obtendría mediante el análisis de la muestra o el espécimen específico del paciente en el analizador de diagnóstico clínico principal.
Objetos adicionales, características y ventajas de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la consideración detallada de las modalidades preferidas que siguen.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una vista de la química asociada con un inmunoensayo normalmente contenido en un portaobjetos analítico (no mostrado).
La Figura 2 es un diagrama esquemático de un sistema de detección óptica asociado con un analizador de detección de fluorescencia.
La Figura 3 es un gráfico del espectro relativo de adsorción y emisión de Alexa Fluor® 635, un colorante comúnmente usado como marcador de fluoróforo.
La Figura 4 es un gráfico del espectro relativo de adsorción y emisión de Alexa Fluor® 647, otro colorante comúnmente usado como marcador de fluoróforo.
La Figura 5 es un gráfico de una curva de calibración lineal de instrumento principal de ejemplo.
La Figura 6 es un gráfico de una curva de calibración no lineal de instrumento principal de ejemplo.
La Figura 7 es un histograma de las respuestas a un conjunto de muestras o especímenes de concentración fija de analitos mediante el uso de Alexa Fluor® 647 cuando se someten a variaciones del instrumento.
La Figura 8 es un histograma de la relación de respuestas a un conjunto de muestras de concentración fija de analito o especímenes que comparan vidrio de fósforo dopado con bismuto y Alexa Fluor® 647 cuando se someten a variaciones del instrumento.
La Figura 9 es un histograma de la relación de respuestas a un conjunto de muestras de concentración fija de analito o especímenes que comparan vidrio de fósforo dopado con bismuto y Alexa Fluor® 647 cuando se someten a variaciones del instrumento cuando se corrige mediante el uso de la normalización del instrumento.
Descripción detallada de las modalidades preferidas
Si bien la presente invención se describe con respecto a las modalidades preferidas como se detalla a continuación y se muestra en las figuras, la presente invención está limitada solo por los límites de las reivindicaciones que siguen.
La fluorometría se elige por su extraordinaria sensibilidad, alta especificidad, simplicidad y bajo costo en comparación con otras técnicas analíticas. La fluorometría es normalmente 1000 veces más sensible que las mediciones de absorbancia. Es una técnica poderosa y ampliamente aceptada que se usa para una variedad de aplicaciones ambientales, industriales y biotecnológicas. Es una valiosa herramienta analítica tanto para el análisis cuantitativo como cualitativo. Sin embargo, la fluorometría requiere un estándar de fluorescencia estable para garantizar que los analizadores de diagnóstico clínico permanezcan normalizados y calibrados. Los fluoróforos orgánicos, especialmente los que están en forma líquida, no son adecuados para su uso en analizadores de normalización en un entorno de fábrica porque fotoblanquean, tienen una vida útil limitada, son propensos a problemas de arrastre y son difíciles de dosificar. Un fluoróforo fotoestable inorgánico sólido no tendría los problemas anteriores, pero solo hay un número limitado de estos materiales disponibles.
Junto con una modalidad preferida del presente método inventivo, se ha diseñado un dispositivo mediante el uso de un material desarrollado por el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) que consiste en un vidrio de matriz de fosfato dopado con ion bismuto de manera que el vidrio tiene propiedades fluorescentes. Este material se conoce como el vidrio de material de referencia estándar (SRM) 2944 del NIST. La composición de dicho material se muestra en la Tabla A.
Tabla A: Composición del vidrio de SRM 2944 del NIST
Figure imgf000004_0001
Este dispositivo ha sido diseñado para superar las limitaciones enumeradas anteriormente y se usa en relación con este método inventivo; ver la solicitud de patente de Estados Unidos en tramitación junto con la presente de Freeman III, Heavner y Oenick titulada "Fluorescence Reference Standard Device" (Núm. de expediente del abogado CDS5170WOPCT) que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Para la fluorometría de diferentes longitudes de onda, se usaría un material diferente al SRM 2944 del NIST, como otros vidrios dopados con fosfato también disponibles del NIST, que incluye el SRM 2943, vidrio dopado con cobre, estándar de corrección espectral para fluorescencia azul.
El dispositivo de vidrio de SRM 2944 del NIST descrito anteriormente es un fluoróforo fotoestable inorgánico sólido preferido usado en el método inventivo descrito en la presente descripción para normalizar una población de analizadores de diagnóstico clínico subordinados a un analizador de diagnóstico clínico principal. Mediante el uso de los espectros de excitación y emisión del vidrio de SRM 2944 del NIST, los espectros de excitación y emisión del marcador de fluorescencia empleado en la combinación de reactivo de anticuerpo marcador marcado con fluorescencia y los espectros de excitación y respuesta medidos inherentes a los sistemas de detección óptica de los analizadores de diagnóstico clínico principales y subordinados, la normalización de los analizadores subordinados al analizador principal se realiza en la fábrica. Mediante el uso de muestras o especímenes de concentraciones conocidas de analitos, también puede realizarse una calibración estándar en la fábrica. Y, además, si fuera necesario o deseable cambiar el marcador en el reactivo de anticuerpo marcador de fluorescencia combinado, esto puede lograrse en el campo solo mediante el uso de los espectros de excitación y emisión del nuevo marcador de fluorescencia.
Una ventaja del método inventivo es que mediante el uso de un fluoróforo fotoestable inorgánico sólido, como el vidrio de SRM 2944 del NIST preferido, como material de referencia, una población de analizadores de diagnóstico clínico subordinados puede normalizarse a un analizador de diagnóstico clínico principal de manera que después de una normalización de la fábrica y la calibración de los analizadores de diagnóstico clínico subordinados tendrán sustancialmente la misma respuesta a una muestra o espécimen que contenga una cantidad fija de analito que tendría el analizador de diagnóstico clínico principal.
Además, si fuera necesario o deseable cambiar el marcador de fluorescencia en el reactivo de anticuerpo marcador de fluorescencia combinada, entonces la población de analizadores de diagnóstico clínico subordinados puede volverse a normalizar (y conservar la calibración original de fábrica) mediante un procedimiento simple que no requiere una recalibración total en el campo.
Para una comprensión general de los métodos descritos, se hace referencia a los dibujos. En los dibujos, se han usado números de referencia similares para designar elementos idénticos. Al describir los métodos descritos, se han usado el(los) siguiente(s) término(s) en la descripción.
El término "£' (la letra griega xi) o "emisión" se refiere a una o más longitudes de onda de luz generadas como resultado de la fluorescencia, específicamente cuando se usa "£' en una ecuación, significa longitud de onda de emisión.
El término "capacidad de respuesta" se refiere a la salida normalizada de un sistema de medición de intensidad óptica en función de una longitud de onda de luz específica que se introduce en ese sistema.
El término "x" (la letra griega chi) o "excitación" se refiere a una o más longitudes de onda de luz generadas para usarse como fuente para irradiar un complejo de fluorescencia, específicamente cuando "x" se usa en una ecuación significa excitación de longitud de onda.
El término "absorbancia" se refiere al coeficiente de extinción normalizado de un colorante fluorescente.
El término "distribución espectral" o "función de forma" se refiere a la intensidad relativa de un haz de luz de excitación o emisión en función de la longitud de onda.
El término "analizador de diagnóstico clínico", "analizador de diagnóstico" e "instrumento" significan dispositivos que aceptan una muestra o espécimen de un paciente, analizan la muestra o espécimen en busca de un analito específico e informan el resultado de ese análisis. Estos términos pretenden abarcar analizadores de química clínica, analizadores de inmunohematología, lectores de dispositivos de flujo lateral y similares.
El término "normalizar" se refiere al método inventivo aplicado a dos analizadores o instrumentos de diagnóstico clínico, un instrumento principal "A" y un instrumento subordinado "B", de manera que la respuesta de "B" a una muestra o espécimen específico que contiene una concentración determinada de analito puede convertirse en la respuesta de "A" a la misma muestra o espécimen mediante el uso de un factor multiplicativo cuando el método de ensayo empleado por los analizadores usa colorantes comunes marcados con fluorescencia.
El término "renormalizar" se refiere al método inventivo aplicado a dos analizadores o instrumentos de diagnóstico clínico, un instrumento principal "A" y un instrumento subordinado "B", de manera que la respuesta de "B" a una muestra o espécimen específico que contiene una concentración determinada de analito puede convertirse en la respuesta de "A" a la misma muestra o espécimen mediante el uso de un factor multiplicativo cuando el método de ensayo empleado por los analizadores usa diferentes colorantes marcados con fluorescencia.
Los términos "Alexa Fluor® 635" y "Alexa Fluor® 647" se refieren a los fluoróforos orgánicos preferidos que pueden usarse como etiquetas fluorescentes. Estos materiales están hechos por INVITRO-GEN™. Por ejemplo, el espectro de adsorción/emisión de "Alexa Fluor® 635" se muestra en la Figura 3 y "Alexa Fluor® 647" tiene un máximo de absorción a 650 nm y un máximo de emisión a 671 nm como se muestra en la Figura 4. "Alexa Fluor® 635" a veces se abrevia como "AF 635" y "Alexa Fluor® 647" a veces se abrevia como "AF 647"
En la Figura 1, se agrega una combinación de reactivo de anticuerpo marcado con fluorescencia 101 a un analito objetivo 102 (un antígeno en este ejemplo específico) en la muestra o espécimen en donde la combinación de reactivo de anticuerpo marcado con fluorescencia 101 se une al analito formando un complejo anticuerpo-analito 103. El reactivo 101 de anticuerpo marcador de fluorescencia de combinación no unido se elimina posteriormente. El complejo de anticuerpo-analito unido 103 se expone luego a una luz de excitación de longitud de onda específica que genera una emisión de fluorescencia proporcional a la cantidad de analito presente que se generará poco después.
En la Figura 2, el complejo de anticuerpo-analito unido 103 se captura en un volumen muy delgado y bien definido (normalmente algún tipo de portaobjetos de análisis, no mostrado) y se presenta en el plano de muestra 201. La luz de excitación es generada por la fuente de diodo emisor de luz (LED) 208, luego colimada por lentes del sistema condensador 210, filtrada por el filtro de excitación 207, formada por la apertura de excitación 206 y la lente de proyección 211, redirigida por un espejo dicroico 203, y luego pasado a través de una lente objetivo 202 que actúa para hacer converger los rayos de luz de excitación hacia abajo a un área apropiada para el volumen muy delgado y bien definido. Los componentes del sistema de excitación contenidos en el rectángulo discontinuo se denominan brazo de excitación 209 del sistema de detección óptica. Cualquier analito capturado y etiquetado en ese volumen emite fluorescencia, y una parte de esa emisión es interceptada por la lente objetivo 202, pasa a través del espejo dicroico 203, luego pasa a través de al menos un filtro de paso de banda 204, a través de una lente detectora 212 y finalmente a través de una abertura de detección 213. La luz de emisión que atraviesa la abertura de detección 213 golpea el fotodetector 205 y genera una corriente eléctrica que se amplifica en una señal utilizable. En el fotodetector 205, el brazo de excitación 209 del sistema de detección óptica entrega un flujo de fotones (algún número de fotones por segundo) con alguna distribución espectral (es decir, alguna mezcla de longitudes de onda). Esto puede ser descrito por
donde $ es un escalar (unidades = fotones/segundo) y S(x) es una función de forma sin unidades donde el valor máximo de S(x) es la unidad. La magnitud de $ está determinada por la salida de la fuente LED 208, las propiedades de atenuación de los filtros 207 y las propiedades de atenuación de las lentes 210, 211 y 202, las propiedades reflectantes del espejo dicroico 203 y las tolerancias de posición de los elementos ópticos. Las características de S(x) están determinadas por las propiedades espectrales de la fuente LED 208 y el espectro de transmisión del filtro 207 y las características reflectantes del espejo dicroico 203.
Si el vidrio de SRM 2944 del NIST se expone al flujo de fotones O(x) de la ecuación (1), se obtendrá una curva de emisión compuesta que puede aproximarse mediante la suma de pequeños incrementos de Ax, es decir, el valor de S(x) a un x particular multiplicado por la curva de emisión normalizada ECvidrio a esa longitud de onda. Eso es,
( 2 ) El fotoflujo de fluorescencia O(^) emitido por el vidrio puede escribirse como
donde ^ es un escalar que es característico de la salida del vidrio de SRM 2944 del NIST.
La señal eléctrica (corriente) que se genera en el detector a una longitud de onda de emisión particular x puede describirse mediante
donde G es una constante y Sr(^) es una función de manera que el valor máximo de Sr(^) es la unidad. La magnitud de G está determinada por la eficiencia de recolección de las ópticas 202 y 212, la eficiencia de transmisión del espejo dicroico 203 y los filtros de emisión 204. Las características de Sr(^) están determinadas por las características espectrales del espejo dicroico 203, los filtros de emisión 204 y las características espectrales del detector (fotodiodo) 205. La señal eléctrica total generada es
Figure imgf000006_0001
o,
E = G- l | i S R© [2* S(X) • ECvidfiolx,?)] ( 6 )
Supongamos que hay un instrumento principal "A" y un instrumento subordinado "B" donde el Instrumento "B" debe normalizarse al instrumento "A". Mediante el uso de la ecuación (6), la relación de las señales (Ea y Eb) proporcionadas por los dos instrumentos en respuesta a la presentación de un objetivo de vidrio de SRM 2944 del NIST idéntico puede escribirse como
Figure imgf000006_0002
o,
Figure imgf000007_0001
donde Gr se denomina relación de ganancia. Las respuestas tanto del instrumento A como del instrumento B (Sra(^) y Srb(^), respectivamente) pueden medirse al presentar una fuente de luz de longitud de onda variable de intensidad constante a cada instrumento, barrer la fuente a través del intervalo de longitudes de onda en la banda de transmisión de los filtros de emisión 204 y el espejo dicroico 203 mientras monitorea la señal generada por el respectivo instrumento, luego mediante la normalización de esa señal por el valor máximo obtenido durante ese barrido. Los espectros de emisión de ambos instrumentos, Sa(x) y Sb(x), se miden fácilmente con un espectrómetro.
Consideremos ahora el caso de un marcador fluorescente, específicamente Alexa Fluor® 647, donde en la Figura 3, la curva de excitación sólida 301 está designada por Scolorante(x). Los valores digitales equivalentes para Scolorante(x) se presentan en la Tabla 4. También para Alexa Fluor® 647, en la Figura 3, la curva de emisión discontinua 302 está designada por Scolorante(^). Los valores digitales equivalentes para Scolorante(^) se presentan en la Tabla 5.
El flujo de fotones Ocolorante(^) (O dye) emitido por el marcador fluorescente (colorante) puede escribirse como
donde ^ colorante es un escalar que es característico de la salida del marcador de fluorescencia (colorante).
Al reescribir la ecuación (6) en términos del marcador de fluorescencia (colorante) da
E = G <p COLORANTE' í > { I ( í « ( O l V M ^COLORANTE Oí) | ' -^COLORANTE C X ) ] (10)
y,
Figure imgf000007_0002
o,
í Ex
Figure imgf000007_0003
COLORARTE Of) J'S COLORANTE ( ( } 1
e a = e b ■ r> fí ( !,')■ S Í S í f H E f t f S Í ü r J l S COLORANTE (í.Tj!'S~COLORANTE ( ( } j (12J
Por lo tanto, podemos transformar la respuesta Eb del analizador "B" a la respuesta Ea que sería vista por el analizador principal "A" mediante el uso de la ecuación. (12).
Esto permite la introducción de nuevos marcadores de fluorescencia (colorantes) a los instrumentos de campo subordinados y permite que esos instrumentos de campo subordinados vuelvan a normalizarse a un analizador principal "A" simplemente al proporcionar el espectro de absorción y emisión del nuevo marcador de fluorescencia (colorante) y mediante el uso de la ecuación (12).
En resumen, en la fábrica se realiza lo siguiente para cada instrumento subordinado "Z":
• Medición de Sz(x) y almacenamiento de esta información en el instrumento.
• Medición de Srz(^) y almacenamiento de esta información en el instrumento.
• La relación de ganancia de cada instrumento se determina al escanear el portaobjetos de calibración de SRM 2944 del NIST como objetivo y luego al aplicar la ecuación (8).
Ejemplo ilustrativo de normalización de fábrica
En este ejemplo, el Analizador AP106 se selecciona como instrumento principal y el Analizador AP115 se selecciona como instrumento subordinado. El objetivo de esta normalización de fábrica es determinar la relación entre los dos analizadores con respecto a sus respuestas individuales a la misma muestra. Esto significa que una respuesta a una muestra particular para el instrumento subordinado puede convertirse en la respuesta del instrumento principal al multiplicar la respuesta del instrumento subordinado por la relación de ganancia y el resto de la ecuación (12) a la derecha de Gr (como se derivó anteriormente y se determinará para este ejemplo a continuación). Las etapas iniciales de recopilación de datos pueden enumerarse de la siguiente manera:
1. Obtener el espectro de intensidad de excitación normalizado de AP106 (ver la Tabla 1 para obtener los datos espectrofotométricos digitales).
2. Obtener el espectro de intensidad de excitación normalizado de AP115 (ver la Tabla 1 para obtener los datos espectrofotométricos digitales).
3. Obtener el espectro de intensidad de respuesta normalizada de AP106 (ver Tabla 2 para los datos espectrofotométricos digitales).
4. Obtener el espectro de intensidad de respuesta normalizado de API 15 (ver la Tabla 2 para obtener los datos espectrofotométricos digitales).
5. Obtener el espectro de excitación/emisión normalizado del vidrio de SRM 2944 del NIST (ver las Tablas 3A, 3B y 3C para obtener los datos espectrofotométricos digitales).
6. Leer el vidrio de SRM 2944 del NIST como objetivo en AP106 para obtener el valor de respuesta para Ea de 2181,705 unidades relativas de fluorescencia (RFU).
7. Leer el vidrio de SRM 2944 del NIST como objetivo en AP115 para obtener el valor de respuesta para Eb de 2035,274 RFU.
8. Calcular la relación de ganancia de AP106 a AP115 mediante el uso de la ecuación (8), donde el numerador entre paréntesis tiene el valor 123,9541 y el denominador entre paréntesis tiene el valor 126,4753 con el siguiente resultado:
Figure imgf000008_0001
Tener en cuenta que la relación (123,9541/126,4763) expresa la diferencia de señal entre los dos instrumentos en función de las diferencias espectrales. Mientras que la relación de ganancia Gr expresa diferencias debidas a diferencias no espectrales (por ejemplo, un instrumento puede tener un LED de iluminación ligeramente más brillante o una óptica de receptor algo más eficiente).
9. Obtener el espectro de absorción relativo del marcador fluorescente (colorante) usado en el análisis. En este caso, se usa Alexa Fluor® 647 y los datos espectrofotométricos digitales asociados se presentan en la Tabla 4.
10. Obtener la intensidad de emisión relativa del marcador fluorescente (colorante) usado en el análisis. En este caso se usa Alexa Fluor® 647 y los datos espectrofotométricos digitales asociados se presentan en la Tabla 5.
11. Mediante el uso de la ecuación (12), el factor de normalización entre las respuestas AP115 y las respuestas AP106 puede determinarse de la siguiente manera, donde el numerador en la ecuación (12) es 122,1005 y el denominador en la ecuación (12) es 117,6860:
La /117,6fí60\
^ = (1,0506) . ( ^ ¡ 5 ; ) = M t tM
Es decir, para convertir una respuesta de AP115 a una respuesta normalizada a AP106 al realizar medidas con Alexa Fluor® 647, debemos multiplicar las respuestas de AP115 por 1,0126.
Ejemplo ilustrativo de renormalización de campo
En este ejemplo, el instrumento subordinado AP115 se ha normalizado previamente al instrumento principal AP106 y se desea introducir un nuevo marcador fluorescente (colorante). El análisis previo permite la introducción de nuevos marcadores fluorescentes (colorantes) a los instrumentos de campo subordinados y permite que esos instrumentos de campo subordinados se normalicen al analizador principal simplemente al proporcionar el espectro de absorción y emisión del nuevo colorante y mediante el uso de la ecuación. (12) arriba. El método se describe a continuación:
1. Obtener el espectro de absorción relativo del marcador fluorescente (colorante) usado en el análisis. En este caso se usa Alexa Fluor® 635 y los datos espectrofotométricos digitales asociados se presentan en la Tabla 6. 2. Obtener la intensidad de emisión relativa del marcador fluorescente (colorante) usado en el análisis. En este caso se usa Alexa Fluor® 635 y los datos espectrofotométricos digitales asociados se presentan en la Tabla 7.
3. Mediante el uso de la ecuación (12), el factor de normalización entre las respuestas AP115 y las respuestas AP106 puede determinarse de la siguiente manera, donde el numerador en la ecuación (12) es 44,02245 y el denominador en la ecuación (12) es 45,2193:
Figure imgf000008_0002
Es decir, para convertir una señal de AP115 a una señal normalizada a AP106 al realizar medidas con Alexa Fluor® 635 en contraposición a Alexa Fluor® 647, debemos multiplicar las señales AP115 por 1,01274. Tener en cuenta que la relación de ganancia no depende del marcador fluorescente (colorante) y permanece constante.
En la práctica, cuando se introduce un nuevo marcador de fluorescencia (colorante (DYE)) en un instrumento de campo subordinado, la cantidad
£ * $Rb ( 0 [ Z f j f S í t o ) ' SCOLORANTE 0 t ) ] ' ^ COLORANTE £ 0
se proporcionará a ese instrumento junto con
Scolorante(^) y Scolorante(x)
de manera que sea capaz de ejecutar ensayos que hagan uso de ese nuevo marcador de fluorescencia (colorante).
Ejemplo ilustrativo de calibración lineal de fábrica
En este ejemplo, se llevará a cabo un procedimiento de calibración estándar con muestras o especímenes de concentración de analito conocida. El procedimiento utilizará 10 muestras con concentraciones conocidas de analito de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 ng/ml. Se observó que las respuestas del instrumento principal fueron 1,15, 1,90, 3,10, 3,90, 5,05, 5,95, 7,30, 7,90, 8,90 y 10,20. Para la fluorometría, la cantidad de luz emitida es frecuentemente proporcional a la cantidad de analito presente en la muestra o espécimen; por lo tanto, generalmente se emplea una curva de calibración lineal. En este caso, los valores de concentración conocidos, que se conocen sin errores, se usan como variable de predicción y las respuestas del instrumento principal, que contienen errores de medición, se usan como variable de respuesta. Se sabe que esta situación satisface el requisito para usar la regresión de mínimos cuadrados ordinarios (OLS). Los datos y la línea de regresión ajustada se muestran en la Figura 5. Los puntos de datos 501 y la línea de regresión OLS ajustada (mostrada como una línea negra continua) 502 indican una estrecha correlación para el instrumento principal.
Para el instrumento principal, la respuesta del instrumento a una muestra o espécimen (como lo indica un valor en el eje Y) se rastrea hacia la derecha horizontalmente hasta la línea de calibración lineal ajustada y luego se rastrea verticalmente hasta el eje X para obtener la estimación de la concentración del analito en la muestra o espécimen. Por ejemplo, en la Figura 5, si la respuesta del instrumento principal a una muestra o espécimen es 5, entonces, al trazar hacia la derecha, la línea horizontal intercepta la línea de calibración lineal y se obtiene un valor de aproximadamente 5 en el eje X.
Para los instrumentos subordinados, la respuesta del instrumento subordinado a una muestra o espécimen se multiplica por la Relación de Ganancia y todo a la derecha de Eb en la ecuación (12) de manera que la respuesta resultante pueda usarse como si se hubiera obtenido del instrumento principal para obtener una estimación de la concentración del analito en la muestra o espécimen. Para este caso específico, el instrumento subordinado produciría una respuesta de 4 y, subsecuentemente, esa respuesta se multiplicaría por el factor de ganancia de 1,25 para producir una respuesta de instrumento principal equivalente de 5. Además, mediante el uso de la curva de calibración maestra produce una concentración de analito estimada de aproximadamente 5.
Ejemplo ilustrativo de recalibración lineal de campo
En este ejemplo, se ha introducido un nuevo marcador fluorescente (colorante) en la química de análisis y se han vuelto a normalizar los instrumentos subordinados en el campo. Para esta situación, existen dos métodos que pueden usarse para obtener estimaciones adecuadas de la concentración del analito en la muestra o espécimen de la siguiente manera:
1. La respuesta del instrumento subordinado puede multiplicarse por el factor de normalización y puede usarse la antigua curva de calibración de fábrica. En la Figura 5, para una respuesta de instrumento subordinado de 4 y un factor de normalización de 1,25, esto se representa mediante la flecha hacia arriba que indica que 4 * 1,25 = 5 es la respuesta del instrumento principal equivalente. Comenzar con un 5 en el eje Y y trazar hasta la línea de calibración lineal principal 502 y luego descender hasta el eje X produce una estimación de 5.
2. Alternativamente, puede construirse una nueva curva de calibración lineal 503 al multiplicar la pendiente de la antigua curva de calibración lineal 502 por el inverso del factor de normalización. La nueva curva de calibración 503 entonces, como en la Figura 5, tiene una pendiente de 1,005 * (1/1,25) = 0,804. La estimación de la concentración del analito en la muestra o el espécimen se obtendría entonces al comenzar en el eje Y en la respuesta del instrumento subordinado (4), luego trazarlo hacia la derecha hasta que se encuentre la nueva curva de calibración lineal y luego moverlo hacia abajo hasta el eje X. Está claro a partir de la Figura 5 que tanto este procedimiento
como el procedimiento 1 anterior dan como resultado las mismas estimaciones de concentración de analito.
Ejemplo ilustrativo de calibración no lineal de fábrica
En este ejemplo, la cantidad de luz emitida no es proporcional a la cantidad de analito presente en la muestra o espécimen; por lo tanto, no puede usarse una curva de calibración lineal. De manera similar al ejemplo de calibración lineal, se prepara una serie de 10 muestras o especímenes de concentraciones de analito conocidas y se ajusta una función sigmoidal no lineal 601 a los puntos de datos 602. Por lo tanto, para el instrumento principal, una respuesta del eje Y se convierte en una estimación de la concentración del analito, al comenzar en el valor del eje Y, trazar hacia la derecha hasta encontrar la curva de calibración y luego trazar hacia abajo hasta el eje X para obtener la estimación de la concentración del analito.
Ejemplo ilustrativo de recalibración no lineal de campo
En este ejemplo, la Figura 6 muestra una curva de calibración no lineal (en forma de s) 601. Al suponer que el factor de normalización es 1,25 entre el instrumento principal y el subordinado, una respuesta del instrumento subordinado de 4 generaría una respuesta equivalente del instrumento principal de (4 * 1,25) = 5 lo que produciría una concentración de analito estimada de aproximadamente 51. A diferencia del caso de calibración lineal, la pendiente de la curva de calibración no lineal no puede ajustarse fácilmente de manera que pueda usarse la respuesta del instrumento subordinado sin procesar. Aquí es necesario multiplicar la respuesta del instrumento subordinado por el factor de normalización para obtener la respuesta del instrumento principal equivalente y luego usar la curva de calibración del instrumento principal.
Prueba de simulación de la efectividad del factor de normalización
Para probar la eficacia del proceso de normalización, se llevó a cabo una simulación Monte Carlo inicial en la que se presentaron 10 000 analizadores de fluorescencia simulados con una cantidad fija de marcador de fluorescencia (colorante) Alexa Fluor® 647 (AF 647) o una cantidad fija de vidrio dopado con bismuto como se usa en el estándar SRM 2944 del NIST. Las fuentes de variación fueron las siguientes:
1. Se permitió que la temperatura de incubación variara entre 36 °C y 38 °C.
2. Se permitió que variaran las características de paso de banda de 3 filtros ópticos en el brazo de detección del sistema de detección óptica (según las especificaciones del fabricante)
3. Se permitió que la longitud de onda de excitación variara entre 630 nm y 636 nm.
Después de configurar 10000 analizadores simulados de acuerdo con lo anterior, el modelo generó las estadísticas de una variedad de respuestas. La Figura 7 muestra el histograma resultante 701 de respuestas a muestras simuladas mediante el uso del colorante AF 647. Hay un intervalo de /- 25 % en la respuesta de la población. La Figura 8 muestra la población de proporciones de la respuesta de cada analizador individual al estándar AF 647 y SRM 2944 del NIST. El histograma resultante de respuestas 801 muestra una dispersión de aproximadamente /- 20 %. Claramente, la respuesta sin procesar del SRM 2944 del NIST hace un mal trabajo al predecir la respuesta del instrumento a las muestras que usan AF 647. Sin embargo, si se repite el mismo análisis donde se emplea un factor de normalización y se permite el ruido de medición (error) en lo siguiente:
1. Ruido asociado con el analizador que alinea y lee la diapositiva de calibración. Se usó un valor de CV del 0,5 % que debería poder alcanzarse con 4 eventos de carga y alineación, cada uno con 4 lecturas del marcador fluorescente (colorante). El proceso de alineación fue en realidad una fuente de variabilidad bastante significativa.
2. Ruido asociado con la caracterización de los espectros de excitación y respuesta del analizador por instrumentación de calibración de fábrica. Se estimó que cada punto de datos tenía una imprecisión de CV del 0,25 %.
3. Ruido asociado a la caracterización de la temperatura de incubación del analizador. El ruido de una desviación estándar se tomó como 0,067 °C. Esto crea un error debido a las diferencias de sensibilidad de temperatura entre el vidrio de SRM 2944 del NIST (~-0,25 % por °C) y el marcador fluorescente AF 647 (colorante) (— 1,2 % por °C).
La Figura 9 contiene el histograma resultante de errores 901 que indica que el error de estimación global del analito se ha reducido a aproximadamente un intervalo de /-1 %.
Será evidente para los expertos en la técnica que pueden realizarse varias modificaciones y variaciones al método descrito en la presente descripción. Por tanto, se pretende que la presente invención cubra tales modificaciones y variaciones, siempre que entren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.
Tabla 1 - Intensidad de Excitación Normalizada de los Analizadores AP106 y AP115
Figure imgf000011_0001
Tabla 2 - Capacidad de Respuesta Normalizada de los Analizadores AP106 y AP115
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001

Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001
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Tabla 4 - Absorción Relativa de Alexa Fluor® 647 frente a Longitud de Onda de Excitación
Figure imgf000019_0001
Tabla 5 - Intensidad de Emisión Relativa de Alexa Fluor® 647 frente a Longitud de Onda
Figure imgf000020_0001
Tabla 6 - Absorción Relativa de Alexa Fluor® 635 frente a Longitud de Onda de Excitación
Figure imgf000021_0001
Continuación
Figure imgf000022_0001
(Continuación)
Figure imgf000023_0001
Continuación
Figure imgf000024_0001
(Continuación)
Figure imgf000025_0001
(Continuación)
Figure imgf000026_0001
Continuación
Figure imgf000027_0001
Continuación
Figure imgf000028_0001
Relativa de Alexa Fluor® 635 frente a Longitud de Onda de Excitación
Figure imgf000029_0001
Continuación
Figure imgf000030_0001
Continuación
Figure imgf000031_0001
Continuación
Figure imgf000032_0001

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método para normalizar un primer resultado de diagnóstico de un analizador de diagnóstico clínico subordinado (B) a un segundo resultado de diagnóstico de un analizador de diagnóstico clínico principal (A) que comprende las etapas de
obtener un espectro de intensidad de excitación normalizado del analizador de diagnóstico clínico principal (A),
obtener un espectro de intensidad de excitación normalizado del analizador de diagnóstico clínico subordinado (B),
obtener un espectro de intensidad de respuesta normalizado del analizador de diagnóstico clínico principal (A),
obtener un espectro de intensidad de respuesta normalizado del analizador de diagnóstico clínico subordinado (B),
obtener un espectro de excitación/emisión normalizado de un objetivo de calibración de fluoróforo fotoestable inorgánico sólido,
leer el objetivo de calibración de fluoróforo fotoestable inorgánico sólido en el analizador de diagnóstico clínico principal (A) para obtener de esta manera un primer valor de respuesta,
leer el objetivo de calibración de fluoróforo fotoestable inorgánico sólido en el analizador de diagnóstico clínico subordinado (B) para obtener de esta manera un segundo valor de respuesta,
determinar la relación de ganancia (Gr) del analizador de diagnóstico clínico principal (A) al analizador de diagnóstico clínico subordinado (B) en base a los valores de respuesta primero y segundo, en base a la ecuación
Figure imgf000033_0001
mediante el uso de la relación de ganancia determinada (GR), determinar un factor de normalización multiplicativo entre un analizador de diagnóstico clínico subordinado normalizado (B) y el analizador de diagnóstico clínico principal (A),
determinar el espectro relativo de adsorción/emisión de un primer colorante marcado con fluorescencia mientras que el primer colorante marcado con fluorescencia es un componente de ensayo de diagnóstico, obtener un primer resultado de diagnóstico de un espécimen o muestra de un paciente específico que incorpore el primer colorante marcado con fluorescencia mediante el uso del analizador de diagnóstico clínico subordinado normalizado (B), y
modificar el primer resultado de diagnóstico por el factor de normalización multiplicativo para obtener un segundo resultado de diagnóstico en donde el segundo resultado de diagnóstico es una aproximación normalizada a un resultado de diagnóstico que se obtendría mediante el análisis del espécimen o muestra de un paciente específico en el analizador de diagnóstico clínico principal (A).
2. Un método para renormalizar un resultado de ensayo de analizador de diagnóstico clínico subordinado en comparación con un resultado de ensayo de analizador de diagnóstico clínico principal que comprende las etapas de
normalizar el analizador de diagnóstico clínico subordinado (B) como se reivindica en la reivindicación 1, determinar un espectro relativo de adsorción/intensidad de un segundo colorante marcado con fluorescencia, mientras que el segundo colorante marcado con fluorescencia es un componente de ensayo de diagnóstico,
determinar un factor multiplicativo de renormalización entre un analizador de diagnóstico clínico subordinado (B) y un analizador de diagnóstico clínico principal (A),
obtener un primer resultado de diagnóstico de un espécimen o muestra de un paciente específico que incorpore el segundo colorante marcado con fluorescencia mediante el uso del analizador de diagnóstico clínico subordinado normalizado (B), y
modificar el primer resultado de diagnóstico por el factor de renormalización para obtener un segundo resultado de diagnóstico en donde el segundo resultado de diagnóstico es una aproximación normalizada a un resultado de diagnóstico que se obtendría mediante el análisis del espécimen o muestra de un paciente específico en el analizador de diagnóstico clínico principal (A).
3. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en donde el fluoróforo fotoestable inorgánico sólido es un vidrio de matriz de fosfato.
4. Un método como se reivindica en la reivindicación 2, en donde el vidrio de matriz de fosfato es un vidrio de fosfato dopado con bismuto.
5. Un método como se reivindica en la reivindicación 2, en donde el vidrio de matriz de fosfato es un vidrio de fosfato dopado con cobre.
6. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la modificación del primer resultado de diagnóstico por el factor de normalización multiplicativo para obtener el segundo resultado de diagnóstico se logra mediante multiplicación numérica.
7. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la modificación del primer resultado de diagnóstico por el factor de normalización multiplicativo para obtener el segundo resultado de diagnóstico se logra mediante el uso de una curva de calibración lineal (503) que tiene una pendiente diferente.
8. Un método como se reivindica en la reivindicación 2, en donde la modificación del primer resultado de diagnóstico por el factor de renormalización multiplicativo para obtener el segundo resultado de diagnóstico se logra mediante multiplicación numérica.
9. Un método como se reivindica en la reivindicación 2, en donde la modificación del primer resultado de diagnóstico por el factor de renormalización multiplicativo para obtener el segundo resultado de diagnóstico se logra mediante el uso de una curva de calibración lineal (503) que tiene una pendiente diferente.
10. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la modificación del primer resultado de diagnóstico por el factor de normalización multiplicativo para obtener el segundo resultado de diagnóstico en el caso de una curva de calibración no lineal (601) se logra mediante multiplicación numérica.
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