ES2929118T3

ES2929118T3 - Hidrogeles de fosfato de magnesio

Info

Publication number: ES2929118T3
Application number: ES16871858T
Authority: ES
Inventors: Marino Faleh Tamimi; Ashwaq Ali Al-Hashedi; Marco Laurenti; Subaie Ahmed Ebraheem Al; Mohamed-Nur Abdallah; Marino Iskandar Tamimi
Original assignee: Invicare Inc
Current assignee: Invicare Inc
Priority date: 2015-12-10
Filing date: 2016-12-02
Publication date: 2022-11-24
Anticipated expiration: 2036-12-02
Also published as: EP3386547B1; US20190002282A1; EP4104864A1; US11629055B2; CA3007064A1; CA3007064C; US10875772B2; EP3386547A4; EP4104864B1; WO2017096469A1; US20210163290A1; EP3386547A1

Abstract

Un hidrogel que comprende una suspensión coloidal de nanocristales bidimensionales ΜI χΜII yPZ en agua, donde MI es Na+ y/o Li+, MII es Mg2+ o una mezcla de Mg2+ con uno o más Ni2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+ y/o Mn2+, P es una mezcla de iones de fosfato dibásico (HPO4 2-) e iones de fosfato tribásico (PO4 3-), X varía de aproximadamente 0,43 a aproximadamente 0,63, Y varía de aproximadamente 0,10 a aproximadamente 0,18, Z varía de aproximadamente 0,29 a aproximadamente 0,48, Siendo X, Y, Z fracciones molares, se proporciona. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Hidrogeles de fosfato de magnesio

Area de la invención

La presente invención se refiere a un hidrogel de fosfato de magnesio, un injerto óseo que comprende el hidrogel, un material de regeneración ósea que comprende el hidrogel y una jeringa que comprende el hidrogel. Antecedentes de la invención

Materiales en capas bidimensionales (2D)

Durante la última década, el campo de los materiales de capas bidimensionales (20) ha crecido mucho, especialmente después del descubrimiento y la caracterización del grafeno. Estos nanomateriales han suscitado un gran interés ya que presentan propiedades extraordinarias que suelen estar ausentes en su forma gruesa. Los avances recientes en tecnologías de nanomateriales también allanaron el camino para el desarrollo de biomateriales avanzados, y en la gran familia de nanomateriales, las arcillas sintéticas exfoliadas se han utilizado en muchas aplicaciones tecnológicas avanzadas.

El diseño de nanomateriales con una morfología bien definida y su fabricación a gran escala a bajo coste, siguen siendo desafíos cruciales para desplegar el muy prometedor futuro de la nanotecnología. De hecho, los procesos de síntesis de nanomateriales suele llevar mucho tiempo e implican procedimientos de varios pasos que pueden requerir el uso de productos químicos tóxicos y/o costosos para el proceso de exfoliación/deslaminación, o proceso hidrotermicos a altas temperaturas y presiones. En general, estos métodos pueden ser costosos, no ofrecen posibilidades de escalabilidad y son inapropiados para la síntesis de biomateriales. En los últimos años, las técnicas sonoquímicas se han utilizado ampliamente en la síntesis de materiales nanoestructurados.

Durante el proceso de cavitación acústica, se pueden alcancar altas temperaturas (>5000 K), presiones (>20 MPa) y velocidades de enfriamiento (>1010 K/s) tras el colapso de las burbujas. Sin embargo, la aplicación del proceso sonoquímico a gran escala es una tarea muy complicada.

Las arcillas son poliiones en forma de placas con una distribución de carga heterogénea que forma un gel físico en agua en concentraciones superiores a 40 mg/ml debido a la presencia simultánea de cargas positivas y negativas que dan lugar a interacciones electrostáticas y de van der Waals. Esto permite que el gel se comporte como un material tixotrópico debido a la formación de una red de partículas conocida como estructura de "castillo de naipes". Los materiales tixotrópicos se pueden licuar aplicando energía mecánica, lo que permite que el gel físico se comporte como un líquido; y luego, cuando se elimina la tensión mecánica, los movimientos brownianos hacen que las partículas entren en contacto para reformar la red y la dispersión licuada se vuelve gelatinosa nuevamente. Biomateriales Inorgánicos, Fosfatos, Magnesio

[Se han estudiado como materiales osteoinductores varios biomateriales inorgánicos, como los fosfatos de calcio, la hidroxiapatita, el fosfato tricálcico beta, la monetita, la brushita y ácido ortosilícico. Sin embargo, estos materiales presentan una degradación in vivo insuficiente que da como resultado una reabsorción lenta.

Estos materiales tienen También una baja inyectabilidad y capacidad para regenerar tejidos, haciendo necesario el desarrollo de una nueva generación de biomateriales que puedan facilitar la formación de tejidos funcionales.

El magnesio es el cuarto metal más común en el cuerpo humano, el 50 % del magnesio del cuerpo se almacena en los huesos y comparte muchas similitudes químicas con el calcio. El magnesio juega un papel importante en el metabolismo de los minerales , y promueve la calcificación, la formación de cristales de hidroxiapatita (HA), y aumenta la adhesión, proliferación y diferenciación de las células óseas. Entre los materiales a base de fosfato, los fosfatos de magnesio han demostrado ser biocompatibles y reabsorbibles in vivo.

Debido a sus interesantes propiedades industriales, los fosfatos de metales de transición binarios han recibido una atención considerable. La síntesis de una serie de fosfatos MIMIP04^H20 (M1=K, NH4; M11=Mg,10 Mn, Fe, Co, Ni) se describio por primera vez en 1933.

Limpieza de implantes dentales

La biopelícula oral se puede acumular en la superficie de los implantes dentales, causando infecciones y comprometiendo la supervivencia del implante. La acumulación de biofilm bacteriano en los implantes de titanio (Ti) altera la biocompatibilidad de la superficie e inicia enfermedades periimplantarias (mucositis periimplantaria y periimplantitis). Estos pueden causar pérdida de hueso marginal y, finalmente, fracaso del implante. Por lo tanto, la eliminación regular del biofilm oral de los implantes de Ti es fundamental para mantener la salud bucal y garantizar el éxito del implante a largo plazo.

Por lo tanto, las técnicas de higiene bucal profesional y de uso doméstico están altamente recomendadas para prevenir o controlar las infecciones periimplantarias y, por lo tanto, aumentar la supervivencia de los implantes. Cepillos, copas de pulido y pastas de uso personal o profesional se ha utilizado el control de la placa y eliminar las biopelículas que cubren las superficies de los implantes. Estas técnicas deberían ser capaces de eliminar biopelículas bacterianas sin afectar negativamente la biocompatibilidad del implante, pero actualmente no son capaces de conseguir estos resulatods. Además, a pesar de que estas técnicas disminuyen los síntomas de las infecciones periimplantarias, estas no son capaces de logran la eliminación completa del biofilm de los implantes. De hecho, las pastas profilácticas y las pastas dentales disponibles presentan una eficacia limitada en la limpieza de las superficies de los implantes porque todas fueron diseñadas originalmente para limpiar dientes, no implantes. En particular, están hechos de espesantes orgánicos y tensioactivos que pueden unirse al titanio y alterar sus propiedades.

Las pastas dentales convencionales fueron desarrolladas para promover la salud dental y ayudar a la eliminación mecánica de la biopelícula de los dientes con cepillos. La composición de la mayoría de los dentífricos incluye abrasivos (sílice hidratada, carbonato de calcio, alúmina), tensioactivos (glicerina, sorbitol), espesantes orgánicos (xantano, gomas de celulosa) y antimicrobianos (fluoruro, triclosán). Sin embargo, estos aditivos pueden tener un impacto negativo en la estabilidad y las propiedades químicas de las superficies de los implantes.

Los iones de fluoruro pueden iniciar la corrosión de la superficie del metal y las aleaciones de Ti, alterando la química, la topografía y la rugosidad de la superficie. El efecto del flúor no se limita al momento del procedimiento de higiene bucal, ya que el flúor puede quedar retenido y concentrado en la placa, y puede encontrarse en la saliva 24 horas después del uso de productos de higiene bucal fluorados.Además, se sabe que las macromoléculas orgánicas se adsorben espontáneamente en metales provocando una alteración en sus propiedades fisico-químicas asi como su carga superficial. Las arcillas inorgánicas naturales y sintéticas como la laponita (silicato de magnesio en capas) se utilizan en la profilaxis dental y en pastas dentales como aglutinantes o estabilizadores, pero se incorporan comúnmente con otros espesantes orgánicos (p. ej., goma xantana) para obtener la consistencia óptima de los dentífricos. Los compuestos orgánicos pueden adherirse fuertemente a la superficie del implante, lo que imposiblita poder limpiar su superficie sin dañarla en el proceso. Además, las arcillas son geles que contienen silicatos que pueden resultar demasiado abrasivos para las superficies de los implantes.

Además, los abrasivos incorporados en las pastas dentífricas o pastas de pulido convencionales pueden dañar las superficies de los implantes y aumentar su rugosidad. Estos abrazivos son necesarios para mejorar la acción de limpieza obtenida con el cepillo de dientes y frotar físicamente la superficie externa de los dientes/implantes, eliminando la película orgánica (proteínas salivales), la placa bacteriana y otras manchas extrínsecas. El carbonato de calcio, la sílice y la alúmina son los elementos abrasivos comunes utilizados en las pastas de dientes utilizadas actualmente.

Varios instrumentos de profilaxis como cepillos o copas de goma con o sin pastas de profilaxis son utilizados para descontaminar implantes y eliminar las biopelículas adheridas,

Estos metodos han demonstrado una eficacia moderada a la hora de eliminar biopelículas sin causar efectos negativos sobre las superficies de los implantes. Aunque, el uso de copas de goma y/o pasta de pulido altamente abrasivas puede causar daños en la superficie del implante.

En vista de lo descrito anteriormente, es recomendable utilizar pastas dentales e instrumentos de baja abrasividad para el mantenimiento de la higiene bucal diaria de los sujetos con implantes de Ti. De hecho, las pastas dentífricas deben seleccionarse cuidadosamente cuando hay restauraciones sobre implantes. Desafortunadamente, no existe una "pasta de implante" específica. La pasta dental Colgate™ Total es un ejemplo representativo de los dentífricos convencionales que se utilizan para el cuidado personal diario principalmente para reducir la placa y prevenir infecciones de las encías. Está compuesto por antimicrobianos (fluoruro de sodio, triclosán), espesantes orgánicos (goma de celulosa y copolímeros), abrasivos (sílice hidratada y dióxido de titanio) y humectantes (glicerina y sorbitol).

Regeneración Ósea

Se ha demostrado que las intervenciones quirúrgicas mínimamente invasivas reducen el tiempo de operación y anestesia, minimizan las complicaciones intraoperatorias y el dolor postoperatorio, y acortan la duración de la recuperación y la estancia hospitalaria, lo que a su vez reduce las tasas de morbilidad y mortalidad, y minimiza el coste de la intervención. Por lo tanto, tales intervenciones han ganado mucha popularidad.

Los procedimientos de regeneración ósea requieren intervenciones invasivas y dolorosas. La fijación ósea, por ejemplo, implica una incisión invasiva a través de la piel y el músculo para exponer el hueso con el fin de colocar las placas de fijación. Dichas intervenciones aumentan el riesgo de daño a las estructuras anatómicas adyacentes, y de lesiónes nerviosas.

El manejo del dolor en las intervenciones de regeneración ósea se limita al uso de fármacos tales como antiinflamatorios no esteroideos, opioides, paracetamol y anestésicos locales. Sin embargo, estos fármacos tienen varias limitaciones. Los antiinflamatorios no esteroideos retrasan la cicatrización ósea y aumentan el riesgo de enfermedades gastrointestinales. Los opioides son drogas controladas y tienen efectos secundarios importantes, como estreñimiento y adicción. Por lo general, el acetaminofén no es eficaz en el dolor óseo moderado o intenso. Los anestésicos locales son relativamente los más efectivos y los que tienen menos efectos secundarios, sin embargo, están limitados por su corta duración de acción.

El documento US 2015/0150973 A1 proporciona un gel de fosfato de magnesio que esta compuesto de agua como fase dispersante e iones de fosfato, un catión divalente e iones de sodio, en el que el catión divalente es magnesio o una mezcla de magnesio y calcio, comprendiendo la mezcla hasta un 30% en peso de calcio basado en el peso total de la mezcla. También se proporcionan métodos para preparar y fabricar este gel.

Junfeng Jia et. al, "Development of magnesium calcium phosphate biocement for bone regeneration", Journal of the Royal Society, Interface (2010) 7, 1171-1180, describe un biocemento de fosfato de calcio y magnesio (MCPB) con características de fraguado rápido que se fabricó utilizando una mezcla de polvos de óxido de magnesio y dihidrógeno fosfato de calcio. Los resultados revelaron que el MCPB se endureció después de mezclar los polvos con agua durante aproximadamente 7 min y la resistencia a la compresión alcanzó los 43 MPa después de fraguar durante 1 h, lo que indica que el MCPB tenía un tiempo de fraguado corto y una alta resistencia mecánica inicial. Después de la reacción ácido-base de MCPB que contenía MgO y Ca(H2P04)2 ■ H2O en una relación molar de 2:1, los productos hidratados finales fueron Mg3(P04)2 y 15 Ca3(P04)2. El MCPB fue degradable en solución Tris-HCl y la relación de degradación fue obviamente más alta que el biocemento de fosfato de calcio (CPB) debido a su rápida disolución. La unión y proliferación de las células MG53 en MCPB mejoraron significativamente en comparación con CPB, y la actividad de fosfatasa alcalina de las células MG53 en MCPb fue significativamente mayor que en CPB a los 7 y 14 días. Las células MG53 con fenotipo normal se extendieron bien en las superficies de MCPB y se unieron muy cerca del sustrato, como se ve por microscopía electrónica de barrido (SEM). Jia describio que el MCPB tenía una buena capacidad para apoyar la adhesion, proliferación y diferenciación celular, y exhibió una buena citocompatibilidad.

El documento US 6451 361 B1 describe la composición de un alimento para animales hecho de un mineral soluble en agua y biodisponible capaz de amortiguar los fluidos digestivos animales a un pH casi neutro que comprende un fosfato de magnesio de metal alcalino hidratado aportando un total de entre 1,5 y 4,7 pesos equivalentes de metal alcalino y magnesio por molécula de fósforo. Se requiere entre un 6 y un 12 por ciento de agua de hidratación para que sea efectivo. Se prepara una composición eficaz, Na2Mg(P04) 0,8 H2O, mediante la reacción paso a paso de carbonato de sodio y óxido de magnesio con ácido ortofosfórico en un recipiente giratorio equipado para una mezcla de alta intensidad.

RESUMEN DE LA INVENCION

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un hidrogel que comprende una suspensión coloidal de nanocristales bidimensionales de MlxMl1 yPz: en agua, en el que:

Ml es Na+ y/o Li+,

M11 es Mg2+ o una mezcla de Mg2+ con uno o mas Ni2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+ y/o Mn2+,

X esta en el rango entre 0.43 y 0.60,

Y esta en el rango entre 0.10 y 0.18,

Z esta en el rango entre 0.29 y 0.46,

Siendo X,Y y Z fracciones molars

También se proporciona el hidrogel anterior, en el que X varía de 0,45 a 0,56, de 0,45 a 0,55,

preferiblemente de 0,45 a 0,53, más preferiblemente de 0,50 a 0,58 y lo más preferiblemente es 0,52.

También se proporciona cualquiera y todos los hidrogeles anteriores, en los que Y oscila entre 0,13 y 0,18, preferentemente entre 0,14 y 0,18, más preferentemente entre 0,13 y 0,16 y lo más preferentemente es 0,15.

También se proporciona cualquiera y todos los hidrogeles anteriores, en los que Z oscila entre 0,30 y 0,39, preferentemente de 0,31 a 0,37, más preferentemente de 0,34 a 0,37, y lo más preferentemente es 0,33.

También se proporciona cualquiera y todos los hidrogeles anteriores, en los que M1 es Na+; donde Ml es Li+, o Ml es una mezcla de Na+ y Li+.

También se proporciona cualquiera y todos los hidrogeles anteriores, en los que M11 es Mg2+; M11 es una mezcla de Mg2+ y uno o más Ni2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+ y/o Mn2+; o donde M11 es una mezcla de Mg2+ y Fe2+.

También se proporciona cualquiera y todos los hidrogeles anteriores, que comprenden uno o más de Ni2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+ y/o Mn2+ en una fracción molar total de hasta aproximadamente 0,3 Y, más preferiblemente una fracción molar total de hasta alrededor de 0,2Y, y más preferiblemente una fracción molar total de alrededor de 0,16Y.

También se proporciona cualquiera y todos los hidrogeles anteriores, en los que M1 es Na+, M11 es Mg2+, X es 0,516, Y es 0,144 y Z es 0,34; donde Ml es Na+, M11 es Mg2+, Xi es 0,45, Y es 0,18 y Z es 0,37; donde M1 es Na+, M11 es Mg2+, X es 0,53, Y es 0,13 y Z es 0,34; donde M1 es Na+, M11 es una mezcla de Mg2+ y Fe2+, X es 0,55, Y es 0,14 y Z es 0,31; donde M1 es Na+, M11 es Mg2+, X es 0,52, Y es 0,13 y Z es 0,35; donde Ml es Na+, M11 es Mg2+, Xi es 0,55, Y es 0,14 y Z es 0,31, o donde M1 es Na+, M11 es Mg2+, Xi es 0,56, Y es 0,13 y Z es 0,31.

También se proporciona cualquiera y todos los hidrogeles anteriores, que tienen un pH entre 7 y 11, entre 7 y 10, preferentemente entre 7 y 9, más preferentemente pH entre 7,5 y 8,5, aún más preferentemente entre 7,5 y 8, y más preferentemente un pH de 7,8.

También se proporciona cualquiera y todos los hidrogeles anteriores, que comprenden entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 50 %, preferiblemente entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 25 %, más preferiblemente entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 15 %, y más preferiblemente aproximadamente el 10 % por peso de M1xM11yPz, basado en el peso total del gel.

También se proporciona cualquiera y todos los hidrogeles anteriores, que comprenden entre 50 % y 95 %, preferiblemente entre 75 % y 95 %, más preferiblemente entre 85 % y 95 %, lo más preferiblemente 90 % de agua en peso basado en el peso total del gel.También se proporciona cualquiera y todos los hidrogeles anteriores, que comprenden hasta el 15 %, preferiblemente hasta aproximadamente el 10 %, más preferiblemente entre aproximadamente el 4 y aproximadamente el 9 % de agua de hidratación en peso basado en el peso total del gel. . ]También se proporciona cualquiera y todos los hidrogeles anteriores, en los que el hidrogel comprende M1xM11yPz nanocristales bidimensionales aglomerados y formando planos interconectados con agua en espacios vacíos entre los nanocristales aglomerados.

También se proporcionan todos y cada uno de los hidrogeles anteriores, en los que el hidrogel comprende una red de paneles de agregados cara a cara en forma de láminas extendidas que están dobladas, retorcidas, ramificadas y entrelazadas con algunos contactos bordes a cara.

También se proporciona cualquiera y todos los hidrogeles anteriores, que además comprenden uno o más aditivos. También se proporciona cualquiera y todos los hidrogeles anteriores, que además comprenden uno o más agentes bioactivos.

También se proporciona cualquiera y todos los hidrogeles anteriores, para uso en ingeniería de tejido óseo.

También se proporcionan todos y cada uno de los hidrogeles anteriores, para su uso como andamiaje para la ingeniería de tejido óseo.

También se proporciona cualquiera y todos los hidrogeles anteriores, para promover la regeneración ósea y/o el crecimiento óseo periimplantario.

También se proporciona cualquiera y todos los hidrogeles anteriores, para su uso como un sistema de administración de fármacos.

Además, se describe un armazón para el crecimiento óseo, para la reparación ósea y/o para la regeneración ósea que comprende cualquiera de los hidrogeles anteriores.

En otro aspecto relacionado con la invención, se proporciona un injerto óseo y/o un material de regeneración ósea que comprende cualquiera de los hidrogeles anteriores.

En otro aspecto relacionado con la invención, se describe un método para:

• promover la regeneración ósea,

• promover el crecimiento óseo (por ejemplo, crecimiento óseo periimplantario),

• tratamiento de un defecto óseo, y/o

• tratamiento de una lesión ósea,

el método comprende el paso de administrar cualquiera de los hidrogeles anteriores en el lugar necesario.

También se describe el método anterior, en el que el paso de administración comprende implantar el hidrogel o inyectar el hidrogel. También se describe el método anterior, en el que el sitio de necesidad es un defecto óseo o En otro aspecto relacionado de la invención, se proporciona una jeringa que comprende cualquiera de los hidrogeles anteriores e instrucciones para usar el hidrogel para promover la regeneración ósea, promover el crecimiento óseo (por ejemplo, crecimiento óseo periimplantario), tratar un defecto óseo y/o tratar una lesión ósea.

En otro aspecto relacionado de la invención, se describe una composición farmacéutica que comprende uno o más agentes bioactivos y cualquiera de los hidrogeles anteriores como vehículo para el agente bioactivo. También se describe la composición farmacéutica anterior, en la que la composición farmacéutica es un implante o un inyectable. También se describe la composición farmacéutica anterior, en la que el agente bioactivo es un anestésico local.

En otro aspecto relacionado de la invención, se describe un método para administrar un agente bioactivo a un paciente, comprendiendo el método el paso de administrar cualquiera de las composiciones farmacéuticas al paciente. En otro aspecto relacionado de la invención, se describe un método para dirigir la administración de un agente bioactivo a un lugar necesitado en el paciente, comprendiendo el método las etapas de administrar cualquier composición farmacéutica al sitio de necesidad. También se describen los métodos anteriores, en los que el sitio de necesidad es un defecto óseo o una lesión ósea. También se describen los métodos anteriores, en los que dicho paso de administración comprende implantar el hidrogel o inyectar el hidrogel.

En otro aspecto relacionado de la invención, se describe una pasta para limpiar implantes dentales, comprendiendo una pasta de cualquiera de los hidrogeles anteriores mezclados con un agente abrasivo.

También se describe la pasta anterior, en la que el gel tiene un pH entre aproximadamente 9 y aproximadamente 10. También se describe la pasta anterior, en la que, en el hidrogel, M1 es Na+, M11 es Mg2+, X es 0,56, Y es 0,13 y Z es 0,31.

También se describe la pasta anterior, en la que el agente abrasivo es un compuesto de sílice, tal como una sílice de fosfato de magnesio, un nanosilicato o carbonato de calcio.

También se describe la pasta anterior, en la que el agente abrasivo son nanopartículas de sílice hidratadas.

También se describe la pasta anterior, en la que las partículas de agente abrasivo tienen un tamaño de partículas de hasta alrededor de 500 nm, preferiblemente hasta alrededor de 400 nm, y más preferiblemente en el intervalo de alrededor de 200 a alrededor de 300 nm.

También se describe la pasta anterior, que el agente abrasivo comprende de 5 a 60%, preferiblemente de 20 a 40%, más preferiblemente 30% del peso total de la pasta.

También se describe la pasta anterior, que además comprende uno o más aditivos.

En otro aspecto relacionado de la invención, se describe un método para fabricar cualquiera de los hidrogeles anteriores, comprendiendo el método

proporcionar un primer depósito que contiene una primera solución acuosa que comprende iones Mg2+, iones de fosfato dibásico (HPO⁴2-) e iones de fosfato tribásico (PO⁴3-), y opcionalmente que comprende además uno o más Ni2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+ y/o Mn2+,

proporcionar un segundo depósito que contiene una segunda solución acuosa que comprende iones Na+ y/o Li+, proporcionar una cámara de mezcla de pequeño volumen conectada de forma fluida a dicho primer y segundo depósito y que tiene una salida,

alimentar simultáneamente dicha primera y segunda soluciones a la cámara de mezcla, fabricando así dicho hidrogel, y recoger el hidrogel a través de la salida de la cámara de mezcla.

DESCRIPCION RESUMIDA DE LOS DIBUJOS

En los dibujos adjuntos:

la Figura 1 muestra un aparato para fabricar el hidrogel descrito en este documento;

La Figura 2 muestra los puntos totales utilizados para determinar las diferentes fases cristalinas del diagrama ternario del sistema NaoH-Mg(OH)2-H3PO4;

La Figura 3 muestra el diagrama ternario del sistema Mg(OH)2-NaOH-H3PO4 con las diferentes fases obtenidas al mezclar los tres componentes en diferentes fracciones molares;

La Figura 4 muestra el patrón de difracción de rayos X de una nueva fase cristalina no identificada obtenida en el área etiquetada como "Nueva fase cristalina y fases mixtas de Mg/PO4 en la Figura 3;

La Figura 5 muestra el análisis termogravimétrico de las diferentes formulaciones: de "a" a "d" - Formulaciones A, B, C y D, respectivamente;

la Figura 6 muestra el pH de la suspensión coloidal en función del tiempo de reacción;

la Figura 7 es una imagen de la suspensión después de 30 segundos desde el comienzo de la reacción;

la Figura 8 muestra la suspensión coloidal de NMP después de 10 minutos;

Las Figuras 9 A y B muestran la evolución de los nanocristales de NMP durante la reacción;

La figura 10 muestra la evolución de G', G” y 6 del gel de la formulación A en función del incremento en el tension de cizalla a medida que avanza el tiempo;

La Figura 11 muestra la evolución de G', G” y 6 de diferentes formulaciones de gel en función del aumento de la tensión de cizallamiento con el tiempo - mediciones reológicas de la formulación A;

La Figura 12 muestra la evolución de G', G” y 6 de diferentes formulaciones de gel en función del aumento de la tensión de cizallamiento con el tiempo - mediciones reológicas de la formulación B;

La Figura 13 muestra la evolución de G', G” y 6 de diferentes formulaciones de gel en función del aumento con el tiempo de la tensión de cizallamiento - mediciones reológicas de la formulación C;

La Figura 14 muestra la evolución de G', G” y 6 de diferentes formulaciones de gel en función del aumento de la tensión de cizallamiento con el tiempo - mediciones reológicas de la formulación D;

La figura 15 muestra el aspecto físico de la suspensión de NMP (A) en una jeringa, (B) mientras se inyecta a través de una aguja de insulina (diámetro interno de 160 pm) y (C) después de la inyección;

la Figura 16 es una micrografía TEM representativa de una réplica de carbono-platino fracturada por congelación de una suspensión de NMP al 5% p/p;

la Figura 17 es una micrografía TEM de gran aumento de la rejilla réplica de carbono-platino que muestra la estructura laminar de los nanocristales ultrafinos de la formulación A con una disposición cara a cara y un espesor de 4-7 nm;

la Figura 18 es una micrografía TEM de las suspensiones coloidales de NMP de la Formulación A;

la Figura 19 es una micrografía TEM de las suspensiones coloidales de NMP de la Formulación B; la Figura 20 es una micrografía TEM de las suspensiones coloidales de NMP de la Formulación C; la Figura 21 es una micrografía TEM de las suspensiones coloidales de NMP de la Formulación D;

La Figura 22 muestra los patrones XRD de diferentes polvos que muestran la conversión parcial o total de NMP nanocristalina en Newberyita cristalina;

La figura 23 es una micrografía TEM de una dispersión coloidal de NMP de la formulación A con una concentración de 1 % v/v en agua (en el recuadro, la difracción de electrones de área seleccionada (SAED) muestra la nanocristalinidad de los nanocristales de NMP);

la Figura 24 es una micrografía de Titan Krios del gel NMP de formulación A que muestra la estructura muy delgada de la hoja de 20 nm;

La figura 25 muestra la estabilidad de la suspensión tixotrópica en el tiempo en función de la relación [Na]/([Na]+[K];

La Figura 26 muestra el aspecto físico después de una semana de suspensiones de NMP con diferentes proporciones de [Na]/([Na]+[K]);

la Figura 27 muestra el diagrama ternario del pH en función de la fracción molar de Mg(OH)2, NaOH y H3PO4; La Figura 28 muestra tubos viales con las dispersiones coloidales (a) después de la síntesis y (b) después de 3 días - el gel sintetizado usando LiOH (a la izquierda en ambas imágenes) se mantuvo estable mientras que el gel usando KOH (a la derecha) perdió su estabilidad y convertiendose en Newberyita (MgHPOdH20);

La figura 29 muestra el espectro FT-IR del polvo de NMP secado y lavado de la formulación A;

La Figura 30 muestra el espectro FT-IR del mismo polvo después de la calcinación a 700 °C durante 8 horas; la Figura 31 muestra los espectros de RMN de la formulación A, tomados usando un espectrómetro 14T; la Figura 32 muestra los espectros de RMN del biomaterial de la formulación A después de la inmersión en D²O; La Figura 33 muestra a) Experimento de perfil de profundidad XPS de la suspensión coloidal de NMP sintetizada en la formulación A, b) la desconvolución de los espectros XPS de alta resolución de P2p confirmó la presencia de PO⁴3" y HPO⁴", y c) la variación del % at. de Na+ y Mg2+ de la formulación A después de un grabado suave usando iones Ar;

Las Figuras 34 A y B muestran la deposición de NMP sobre una superficie de vidrio cargada negativamente; Las Figuras 35 A y B muestran polvo de NMP depositado sobre una superficie de vidrio cargada positivamente; La Figura 36 muestra los resultados de la actividad metabólica utilizando el ensayo Alamar-Blue y el ensayo vivo/muerto de células HF - número de células HF;

La figura 37 muestra los resultados de la actividad metabólica usando el ensayo Alamar-Blue y el ensayo vivo/muerto de células HF - porcentaje de células HF vivas;

La figura 38 muestra los resultados del ensayo vivo/muerto de la formulación A en el día 1. a-c, Imagen de microscopio de "canal dividido" para las diferentes tinciones utilizadas(Calceina AM/Etd-1/Hoechst 33258); d, Micrografía después de fusionar los tres canales. La longitud de la barra de escala es de 100 pm;

La Figura 39 muestra los resultados del ensayo vivo/muerto de la formulación B en el día 1. a-c, Imagen de microscopio de "canal dividido" para las diferentes tinciones utilizadas (Calcein AM/Etd-1/Hoechst 33258). d, Micrografía después de fusionar los tres canales. La longitud de la barra de escala es de 100 pm;

La figura 40 muestra los resultados del ensayo vivo/muerto de la formulación A en el día 4. a-c Imagen de microscopio de "canal dividido" para las diferentes tinciones utilizadas (Calcein AM/Etd-1/Hoechst 33258). d, Micrografía después de fusionar los tres canales. La longitud de la barra de escala es de 50 pm;

La Figura 41 muestra los resultados del ensayo vivo/muerto de la formulación Bat day 4. a-c, Imagen de microscopio de "canal dividido" para las diferentes tinciones utilizadas (Calcein AM/Etd-1/Hoechst 33258). d, Micrografía después de fusionar los tres canales. La longitud de la barra de escala es de 50 pm;

la Figura 42 es una micrografía SEM que muestra la adhesión y colonización de células de osteoblastos sobre nanocristales de NMP;

La figura 43 muestra la expresión cuantitativa de ARNm de ALP de células de médula ósea de ratón cultivadas durante 21 días, de izquierda a derecha, en newberyita (MgHPOdH20) (valores normalizados), formulación B de NMP y cattiita (Mg3(P04)222H20);

La figura 44 muestra la expresión cuantitativa de ARNm de OCN de células de médula ósea de ratón cultivadas durante 21 días, de izquierda a derecha, en newberyita (MgHPOdH20) (valores normalizados), formulación B de NMP y cattiita (Mg3(P04)222H20);

La figura 45 muestra la expresión cuantitativa de ARNm de OPN de células de médula ósea de ratón cultivadas durante 21 días, de izquierda a derecha, newberyita (MgHPOdH20) (valores normalizados), formulación B de NMP y cattiita (Mg3(PO4)2 ■ 22H2O);

La figura 46 muestra la expresión cuantitativa de ARNm de COL1A1 de células de médula ósea de ratón cultivadas durante 21 días, de izquierda a derecha, newberyita (MgHPOdH2O) (valores normalizados), formulación B de NMP y cattiita (Mg3(PO4)2 ■ 22H2O);

La figura 47 muestra la expresión cuantitativa de ARNm de RunX2 de células de médula ósea de ratón cultivadas durante 21 días, de izquierda a derecha, newberyita (MgHPOdH20) (valores normalizados), formulación B de NMP y cattiita (Mg3(P04)2 ■ 22H20);

la Figura 48 muestra modelos p-CT 30 de los defectos óseos en los días 3, 7 y 14;

La Figura 49 muestra el análisis de histología e histomorfometría (14 días después de la cirugía): tinción de tricrómico de maison (colágeno), tinción de ALP (osteoblastos) y tinción de TRAP (osteoclastos) en un defecto el control y otro tratado con NMP;

La figura 50 muestra el porcentaje de contacto hueso-implante (BIC) en los defectos controles y los defectos tratados con NMP;

La Figura 51 muestra el porcentaje de colágeno en el control y los defectos tratados con NMP (tinción tricrómica de Maison);

la Figura 52 muestra el número de osteoblastos (tinción ALP) en los defectos de control y los defectos tratados con NMP;

la Figura 53 muestra el número de osteoclastos (tinción TRAP) en los defectos controles y en los defectos tratados con NMP;

La Figura 54 muestra modelos 3D de |j-CT y secciones histológicas coronales de implantes de Ti que muestran más hueso (de color más claro en j-CT y más oscuro en histología) en contacto con el implante en implantes recubiertos con NMP;

la figura 55 es una imagen de FIB que muestra la matriz ósea que presenta mineralización por osteoblastos en un defecto tratado con NMP 7dias después de la implantación;

la Figura 56 es una imagen FIB que muestra fibras de colágeno que experimentan mineralización en un defecto tratado con NMP 7dias después de la implantación;

La Figura 57 muestra los resultados de qRT-PCR en los que se ve un aumento en la expresión de RunX2 en los defectos tratados con NMP, en el día 3 (a la izquierda), en comparación con el defecto control; sin embargo, no se observaron diferencias significativas en el día 14 (a la derecha);

La Figura 58 muestra los resultados de qRT-PCR en las que se ver que la expresión de COL1A1 aumentó en los defectos tratados con NMP, al día 3 (a la izquierda) en comparación con el control; sin embargo, no se observaron diferencias significativas en el día 14 (a la derecha). );

La Figura 59 muestra A) (a-c) fotografías de un cepillo giratorio cargado con el gel NMP, la pasta de implante desarrollada y la pasta de dientes Colgate y (fotografías d-D de los tubos Eppendorf que contienen el gel NMP, la pasta de implante y la pasta de dientes Colgate respectivamente y B) una micrografía TEM representativa de una réplica de carbono-platino de una superficie criofracturada fracturada de una suspensión de NMP al 10 % p/p que muestra la estructura 30 y las interacciones de los nanocristales que componen el gel de NMP;

La figura 60 muestra el analisis de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) (A), un gráfico de barras (B), imágenes de microscopio electrónico de barrido con un aumento de x10,000 (C) y fotografías (D) que ilustran el efecto de limpieza del cepillo de profilaxis giratorio. a diferentes tiempos de cepillado sobre la composición elemental y la topografía de las superficies de Ti contaminadas con biopelículas;

La Figura 61 muestra imágenes de microscopio electrónico de barrido (aumento x10,000, fila superior) y fotografías (fila inferior) que muestran la topografía de las superficies de Ti contaminadas con biopelículas después de cepillarse con el gel NMP, el gel que contiene diferentes concentraciones de sílice hidratado y pasta dental Colgate (el tiempo de cepillado fue de 1 minuto);

La Figura 62 muestra encuestas XPS (A) y un gráfico de barras (B) que comparan la eficiencia de limpieza del gel NMP y el gel que contiene diferentes concentraciones de sílice hidratada (el tiempo de cepillado fue de 1 minuto);

La Figura 63 muestra encuestas XPS (A) y un gráfico de barras (B) que muestra el cambio en la composición elemental de las superficies de Ti no contaminadas después de limpiarlas con el cepillo rotatorio y la pasta de implante optimizada (gel NMP que contiene un 30% de sílice hidratada) y un comercial. pasta de dientes (Colgate), el tiempo de cepillado fue de 1 minuto;

La Figura 64 muestra gráficos de barras (A) e imágenes de microscopio de barrido láser confocal (B), que comparan la rugosidad superficial de las superficies de Ti pulidas después de limpiarlas con el cepillo de profilaxis, la pasta de implante optimizada (gel NMP que contiene un 30 % de sílice hidratada) y la pasta de dientes comercial. (El tiempo de cepillado es de 1 minuto);

La Figura 65 muestra el analisis de XPS (A) y un gráfico de barras (B) que comparan la eficacia de limpieza del cepillo de profilaxis, la pasta de implantes optimizada y la pasta de dientes Colgate (el tiempo de cepillado fue de 1 minuto);

La Figura 66 muestra gráficos de barras (A) e imágenes de tinción viva/muerta (fluorescencia) (B) que comparan la eficiencia de eliminación de bacterias del cepillo de profilaxis, la pasta de implante optimizada y la pasta dental Colgate (el tiempo de cepillado fue de 1 minuto);

La figura 67 muestra la liberación del fármaco in vitro mostrando que el gel puede controlar la liberación del anestésico local (NMP con mepivacaína);

la figura 68 es el ajuste de Korsmeyer-Peppas para el fármaco acumulativo liberado a partir de muestras de gel+mepivacaína;

La Figura 69 muestra los espectros UV-Vis de la mepivacaína liberada del gel después de 24 horas;

y la Figura 70 muestra los resultados de la prueba de radiacion de calor para evaluar la tolerancia al calor de ratones in vivo utilizando el modelo de pata trasera de ratón; estos resultados mostraron que la NMP cargada con mepivacaína proporciona analgesia y la acción analgésica de la mepivacaína fue prolongada por la NMP; La figura 71 muestra A) los resultados de la prueba de soporte de peso y B) los resultados de la prueba de protección para el tratamiento con solución salina, mepivacaína, NMP y NMP+ mepivacaína;

la Figura 72 muestra secciones sagitales, coronales de micro-CT y reconstrucciones 3D que muestran la formación de hueso en el sitio de la fractura después del tratamiento con solución salina, mepivacaína, NMP y NMP+ mepivacaína;

y La Figura 73 muestra resultados de prueba pendientes de 3 puntos después del tratamiento con solución salina, mepivacaína, NMP y NMP+ mepivacaína.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION

Hidrogel

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un hidrogel que comprende una suspensión coloidal de nanocristales bidimensionales MlxMll y Pz en agua.

En la fórmula química anterior:

Ml es un catión monovalente y es Na+ y/o Li+,

M11 es un catión divalente y es Mg2+ o una mezcla de Mg2+ con uno o más Ni2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+ y/o Mn2+, P es una mezcla de iones de fosfato dibásico (HPO⁴-) e iones de fosfato tribásico (PO⁴3' ),

X varía de 0,43 a 0,60,

Y oscila entre 0,10 y 0,18, y

Z varía de 0,29 a 0,46,

X, Y, Z son fracciones molares.

Seria evidente para el experto en la materia que, dado que X, Y y Z son fracciones molares, su suma debe ser 1 (más o menos los errores de redondeo). De hecho, esta es la definición estándar de fracción molar en la técnica: "En química, la fracción molar se define como la cantidad de un constituyente dividida por la cantidad total de todos los constituyentes en una mezcla. La suma de todas las fracciones molares es igual a 1". Aquí, el cálculo de las fracciones molares solo tiene en cuenta los cationes divalentes (M11), los aniones de fosfato (P) y los cationes monovalentes (M1). No se consideran el agua y los aditivos opcionales que se pueden agregar al gel.

En la materialización de la invención, Xi es 0,43, 0,44, 0,45, 0,46, 0,47, 0,48, 0,49, 0,50, 0,51, 0,52, 0,53, 0,54, 0,55, 0,56, 0,57, 0,58, 0,59, 0,60, 0,61 o más de 0,62 En estas u otras materializaciones, Xi es 0,60, 0,59, 0,58, 0,57, 0,56, 0,55, 0,54, 0,53, 0,52, 0,51, 0,50, 0,49, 0,48, 0,47, 0,46, 0,45 o 0,44 o menos. En materializaciones, Xi esta alrededor de cualquiera de los valores anteriores.

En la materialización de la invención, Y es 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16 o 0,17 o más. En estas u otras materializaciones, Y es 0,18, 0,17, 0,16, 0,15, 0,14, 0,13, 0,12 o 0,11 o menos. En materialización es de la invención, Y es aproximadamente cualquiera de los valores anteriores.

En la materialización de la invención, Z es 0,29, 0,30, 0,31, 0,32, 0,33, 0,34, 0,35, 0,36, 0,37, 0,38, 0,39, 0,40, 0,41, 0,41, 0,42, 0,43, 0,44, 0,45, 0,46 o más de 0,47 En estas u otras materializaciónes, Z es 0,46, 0,45, 0,44, 0,43, 0,42, 0,41, 0,40, 0,39, 0,38, 0,37, 0,36, 0,35, 0,34, 0,33, 0,32, 0,31 o 0,30 o menos. En realizaciones, Z es aproximadamente cualquiera de los valores anteriores.

En materializaciones preferidas, X varía de 0,45 a 0,56, de 0,45 a 0,55, preferiblemente de 0,45 a 0,53, más preferiblemente de 0,50 a 0,58 y lo más preferiblemente es 0,52.

En materializaciones realizaciones preferidas, Y varía de 0,13 a 0,18, preferiblemente de 0,14 a 0,18, más preferiblemente de 0,13 a 0,16 y lo más preferiblemente es 0,15.

En materializaciones preferidas, Z varía de 0,30 a 0,39, preferiblemente de 0,31 a 0,37, más preferiblemente de 0,34 a 0,37 y lo más preferiblemente es 0,33.

En materializaciones preferidas, el catión monovalente (M1) es Na+.

En materializaciones de la invención, el catión monovalente (M1) es Li+.

En materializaciones de la invención, el catión monovalente (M1) es una mezcla de Li+ y Na+.

En materializaciones preferidas, el catión divalente (M11) es únicamente magnesio (Mg2+).

En otras materializaciónes, parte del magnesio se reemplaza por uno o más de los siguientes: Ni2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+ y/o Mn2+. En otras palabras, M11 es una mezcla de Mg2+ con uno o más de los siguientes: Ni2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+ y/o Mn2+, o cualquier combinación o subconjunto de los mismos. En las materializaciones de la invencion, uno o más de Ni2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+ y/o Mn2+ es Fe2+. En los geles que comprenden tales mezclas, uno o más de Ni2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+ y/o Mn2+ pueden estar presentes en una fracción molar total de hasta aproximadamente 0,3Y (lo que significa que Mg2+ está presente en una fracción molar de al menos alrededor de 0.7Y). En realizaciones preferidas, el gel comprende uno o más de Ni2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+ y/o Mn2+ en una fracción molar total de hasta aproximadamente 0,2Y. En las realizaciones, los geles comprenden uno o más de Ni2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+ y/o Mn2+ en una fracción molar total de aproximadamente 0,16 Y (y, por lo tanto, Mg2+ está presente en una fracción molar de aproximadamente 0,84 Y).

Será evidente para el experto en la materia que la proporción de iones de fosfato dibásico (HPO⁴2-) a iones de fosfato tribásico (P043-) en el gel dependerá del pH exacto del gel.

materializaciones de la invención, el hidrogel tiene un pH entre 7 y 11, preferiblemente entre 7 y 10, entre 7 y 9, más preferiblemente entre 7,5 y 8,5, aún más preferiblemente entre 7,5 y 8, lo más preferiblemente un pH de 7,8. Los ejemplos no limitantes de hidrogeles con (más o la mayoría) pH preferido incluyen:

Así, en realizaciones preferidas,

• Ml es Na+, M11 es Mg2+, X es 0,516, Y es 0,144, y Z es 0,34;

• Ml es Na+, M11 es Mg2+, X es 0,45, Y es 0,18, y Z es 0,37;

• Ml es Na+, M11 es Mg2+, X es 0,53, Y es 0,43, y Z es 0,34;

• Ml es Na+, M11 es una mezcla de Mg2+ y Fe2+, Xes 0,55, Y es 0,14 (0,02 Fe 0,12 Mg), y Z es 0,31;

• Ml es Na+, M11 es Mg2+, Xes 0,52, Y es 0,13, y Z es 0,35;

• Ml es Na+, M11 es Mg2+, Xes 0,55, Y es 0,14, y Z es 0,31; y/o

• Ml es Na+, M11 es Mg2+, X es 0,56, Y es 0,13, y Z es 0,31.

En cualquiera y todos los hidrogeles anteriores, la cantidad de MlxMl1yPz en el gel oscila normalmente entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 50 % en peso en función del peso total del gel, por ejemplo, entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 25 %. , o entre alrededor del 5% y alrededor del 15%. En realizaciones preferidas, el gel comprende alrededor del 10 % de MlxM11yPz.

En todos y cada uno de los hidrogeles anteriores, la cantidad de agua (como fase de dispersión) en el gel oscila normalmente entre el 50 % y el 95 % en peso en función del peso total del gel, por ejemplo, entre el 75 % y el 95 %. o entre 85% y 95%. En realizaciones preferidas, el gel comprende 90% de agua. Debe distinguirse entre el agua como fase dispersante y el agua de hidratación. El agua como fase dispersante es el medio en el que se dispersan las nanoláminas. Esta agua se puede eliminar secando el gel a una temperatura relativamente baja, por ejemplo, una temperatura por debajo de la temperatura de ebullición del agua, como 80°C. Este proceso producirá un producto que se ve y se siente seco, pero que aún contiene agua de hidratación.

Por otro lado, el agua de hidratación consiste en moléculas de agua que están unidas o asociadas de alguna manera con un sólido (por ejemplo, atrapadas dentro de él). Estas moléculas normalmente solo se eliminan del sólido calentando el sólido por encima de la temperatura de ebullición del agua, a menudo muy por encima de esta temperatura, por ejemplo entre 100 y 250 °C. El hidrogel anterior normalmente contiene agua de hidratación. Por ejemplo, puede contener hasta aproximadamente un 15 % de agua de hidratación en peso basado en el peso total del gel, por ejemplo hasta aproximadamente un 10 %, o entre aproximadamente un 4 y aproximadamente un 9 %. Cuando se observa mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM), en realizaciones, la morfología del gel comprende nanoplacas o nanoláminas delgadas (nanocristales bidimensionales MlxMl1 yPz). Más específicamente, estas nanoláminas pueden tener alrededor de 200 nm de ancho, ser muy delgadas (por ejemplo, alrededor de 10 nm de grosor) y hasta 1 pm de largo. Como se ve por Micorsopia Electronica de Transmision, estas nanoláminas se aglomeran y forman planos interconectados (ver, por ejemplo, las Figuras 18 a 21).

En este documento, una "suspensión coloidal" se refiere a una mezcla que comprende partículas insolubles microscópicamente dispersas (en este documento, los nanocristales bidimensionales M1xM11yPz) suspendidas en un medio (en este documento, agua), en el que las partículas no sedimentan o tardan mucho tiempo en sedimentarse apreciablemente.

Aquí, los "nanocristales" son partículas cristalinas que tienen al menos unas dimensiónes por debajo de 100 nanómetros. Aquí, los "nanocristales bidimensionales" (20 nanocristales) son nanocristales delgados en forma de láminas. En otras palabras, el grosor de los 20 nanocristales es mucho menor que su ancho y largo. En realizaciones de la invención, los nanocristales M1xM11yPz que tienen un grosor de hasta aproximadamente 10 nm. Por ejemplo, su espesor puede oscilar entre aproximadamente 4 y aproximadamente 7 nm. La longitud de los nanocristales puede ser tan larga como aproximadamente 1 pm, por ejemplo 600 nm, y su anchura puede ser de hasta como aproximadamente 250 nm, por ejemplo 200 nm. (Ver por ejemplo la Figura 24).

El hidrogel de la invención se presenta en forma de suspensión coloidal de nanocristales bidimensionales. En realizaciones, los nanocristales forman paquetes o agregados que juntos producen una red, con el agua componiendo el medio del hidrogel en los espacios vacíos entre los nanocristales agrupados. Más específicamente, los nanocristales pueden superponerse parcialmente entre sí, lo que da como resultado una red de panal de agregados cara a cara en forma de láminas extendidas que están dobladas, torcidas, ramificadas y entrelazadas con generalmente pocos contactos de borde a cara.

Aquí, los términos "aglomerado", "agregado" y "paquete" se usan indistintamente.

En realizaciones de cualquiera y todos los hidrogeles anteriores, el gel también puede comprender uno o más aditivos, como nanopartículas (por ejemplo, de sílice), alginato, quitosano o polietilenglicol.

En realizaciones de cualquiera y todos los hidrogeles anteriores, el gel también puede comprender uno o más agentes bioactivos, dependiendo de las propiedades deseadas y su uso final. Dichos agentes se discutirán a continuación.

Métodos de fabricación del hidrogel

En otro aspecto, la presente invención describe métodos para fabricar el hydrogel descrito anteriormente.

En estos métodos, los diversos iones pueden ser incorporados utilizando cualquiera de sus sales, óxidos, ácidos o bases solubles en agua, que normalmente se proporcionarán como soluciones acuosas. Para la aplicación biológica, se prefieren los materiales farmacéuticamente aceptables. En particular, se pueden usar los materiales que se muestran en la siguiente tabla.

Tabla 1. Materiales de partida (los materiales de partida preferidos están en negrita)

Es de destacar que, en descrioto anteriormente, un material de partida dado puede proporcionar dos tipos de iones a la vez.

El hidrogel de la invención se puede preparar mezclando soluciones de los materiales de partida mencionados anteriormente. En realizaciones preferidas, se agrega una solución de los materiales de partida para los iones de sodio y/o litio a una solución que contiene los otros materiales de partida.

Una mezcla asi sencilla es adecuada para producir lotes de pequeño volumen (por ejemplo, 50 ml). Sin embargo, para lotes de mayor volumen, es posible que la solución no se homogeneice lo suficientemente rápido para producir el hidrogel y se obtendrán otras fases de forma bastante indeseable.

Para producir mayores volúmenes de gel, es ventajoso utilizar un método continuo (en lugar de un método por lotes). Más específicamente, se describe un método para fabricar el hidrogel anterior, en el que se mezclan pequeños volúmenes de las soluciones, preferiblemente de forma continua, para producir el hidrogel.

Esto se puede lograr mediante:

proporcionando un primer depósito que contiene una primera solución acuosa que comprende iones Mg2+ (solos o como una mezcla de Mg2+ con uno o más Ni2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+ y/o Mn2+), iones de fosfato dibásico (HPOi-) e iones de fosfato tribásico (P043-), proporcionando un segundo depósito que contiene una segunda solución acuosa que comprende iones Na+ y/o Li+, proporcionando una cámara de mezcla de pequeño volumen conectada de forma fluida a dicho primer y segundo depósito y que tiene una salida, y se

alimenta simultáneamente dicha primera y segunda soluciones a la cámara de mezcla, fabricando así dicho hidrogel, y recogiendo el hidrogel a la salida de la cámara de mezcla.

En este método, la cámara de mezcla de pequeño volumen tiene un volumen lo suficientemente pequeño como para permitir una mezcla rápida y homogénea de ambas soluciones. En realizaciones, la cámara de mezclado tiene un volumen de hasta aproximadamente 100 ml, por ejemplo, hasta aproximadamente 50 ml, hasta aproximadamente 25 ml.

Se deben mezclar pequeños volúmenes de ambas soluciones con suficiente turbulencia para formar el hidrogel. En realizaciones, un régimen turbulento con un número de Reynolds >4000 permitirá la mezcla adecuada de las soluciones y la producción continua del hidrogel. La turbulencia se puede controlar ajustando la velocidad de flujo de ambas soluciones y la morfología (volumen y forma) de la cámara de mezcla.

En realizaciones de la invención, la cámara de mezcla puede estar provista de un agitador.

La Figura 1 muestra la materializacion de un aparato que permite implementar el método anterior.

Propiedades del Hidrogel

En realizaciones de la invencion, el hidrogel puede presentar una o más de las siguientes propiedades/ventajas. Los hidrogeles tienen un pH controlado que los hace aptos para aplicaciones biológicas.

Los hidrogeles presentan estabilidad a largo plazo.

Los hidrogeles son tixotrópicos.

Los hidrogeles son inyectables (a través de agujas muy finas).

Los hidrogeles son biocompatibles.

Los hidrogeles son biorreabsorbibles.

Los hidrogeles controlan la liberación de agentes bioactivos.

Los hidrogeles pueden desencadenar actividades osteogénicas únicas. Los hidrogeles pueden acelerar la regeneracion ósea y/o la osteointegración al mejorar la formación de colágeno, la diferenciación de osteoblastos y/o la proliferación de osteoclastos a través de la regulación positiva de COL1A1, RunX2, ALP, OCN y/u OPN.

Uso como andamiaje para ingeniería de tejido óseo

Debido a que, en las realizaciones de la invencion, los presentes hidrogeles se pueden inyectar a través de agujas de alto caliber (muy finas) en defectos óseos, pueden acelerar la consolidación ósea y la osteointegración (los resultados descritos a continuación en los Ejemplos muestran una mejora significativa de la consolidación ósea y la osteointegración en comparación con un grupo de control, y una reabsorción total después de solo dos semanas) y son bioabsorbibles, podrían traer un cambio de paradigma en el campo de las intervenciones ortopédicas y craneofaciales mínimamente invasivas. De hecho, podrían minimizar la invasividad de tales intervenciones. Los hidrogeles podrían potencialmente reemplazar los cementos y (bio)cerámicas utilizados convencionalmente.

Los hidrogeles descritos anteriormente pueden utilizarse por tanto en la ingeniería de tejido óseo, especialmente para promover la regeneración ósea y el crecimiento óseo periimplantario. Proporcionan un medio de soporte temporal, así como un injerto reabsorbible, y los hidrogeles finalmente se reemplazan por hueso.

Por lo tanto, en un aspecto relacionado de la invención, se proporciona un armazón para el crecimiento óseo, para la reparación ósea y/o para la regeneración ósea que comprende el hidrogel anterior.

También se proporciona un injerto óseo o un material de regeneración ósea que comprende el hidrogel anterior. También se describen métodos para:

• promover la regeneración ósea,

• promover el crecimiento óseo (en realizaciones, crecimiento óseo periimplantario),

• tratamiento de un defecto óseo, y/o

• tratamiento de una lesión ósea,

comprendiendo estos métodos las etapas de administrar el hidrogel en un sitio de necesidad. En realizaciones, dicho paso de administración comprende implantar el hidrogel. En otras realizaciones, dicho paso de administración comprende inyectar el hidrogel. En realizaciones, el sitio de necesidad es un defecto óseo o una lesión ósea.

El término "defecto óseo", tal como se usa en este documento, incluye, entre otros, defectos o vacíos/huecos resultantes de fracturas por compresión, quistes óseos benignos, hueso enfermo, traumatismo de alta energía, fracturas periarticulares, fracturas cráneo-maxilofaciales, fracturas osteoporóticas refuerzo (es decir, aumento con tornillos), artrodesis articular, artroplastia articular y reconstrucción periodontal.

También se proporciona una jeringa que contiene el hidrogel e instrucciones para usar el hidrogel para promover la regeneración ósea, promover el crecimiento óseo (en realizaciones, crecimiento óseo periimplantario), tratar un defecto óseo y/o tratar una lesión ósea como se describe. En lo anterior, el hidrogel puede comprender opcionalmente uno o más aditivos y/o agentes bioactivos. Los aditivos pueden ser los discutidos anteriormente. Los agentes bioactivos se discutirán en la siguiente sección.

Uso como sistema de liberación de medicamentos

Los hidrogeles descritos anteriormente se pueden usar como sistemas de liberación de fármacos.

Por lo tanto, en un aspecto relacionado de la invención, se describe una composición farmacéutica que comprende uno o más agentes bioactivos y el hidrogel (como se describe anteriormente, que incluye, por ejemplo, varios aditivos) como vehículo para el agente bioactivo. La composición farmacéutica puede ser un implante o un inyectable.

También se describe un método para administrar un agente bioactivo a un paciente, comprendiendo el paso de administrar al paciente la composición farmacéutica mencionada anteriormente.

También se describe un método para dirigir la administración de un agente bioactivo a un sitio de necesidad de un paciente, comprendiendo el método las etapas de administrar la composición farmacéutica al sitio de necesidad. En materilaizciones de la invencion, el sitio de necesidad es un defecto óseo o una lesión ósea.

En realizaciones de los métodos anteriores, dicho paso de administración comprende implantar el hidrogel. En otras realizaciones de los métodos anteriores, dicho paso de administración comprende inyectar el hidrogel.

Los agentes bioactivos transportados por los hidrogeles anteriores pueden ser cualquier agente conocido en la técnica. Generalmente se prefieren los agentes bioactivos neutros y alcalinos. También se pueden usar agentes bioactivos ácidos. Sin embargo, algunos agentes bioactivos ácidos, si reducen demasiado el pH del gel, pueden desestabilizar el hidrogel. No obstante, en muchos casos, estos agentes pueden usarse ya que la desestabilización puede evitarse usando un gel más alcalino, lo que dará como resultado un producto con un pH final en el rango de estabilidad del hidrogel. En el Ejemplo 4 se proporciona un ejemplo de gel con un agente bioactivo.

Los ejemplos no limitativos de agentes bioactivos que pueden transportar los hidrogeles anteriores incluyen anestésicos locales como la mepivacaína, antibióticos como el imipenem y bloqueadores beta como el propranolol, así como los que se analizan en el siguiente párrafo.

En realizaciones preferidas, el hidrogel se usa para la ingeniería de tejido óseo como se describe anteriormente, y simultáneamente como un sistema de administración de fármacos. En otras palabras, tanto en el andamiaje para el crecimiento óseo, el material de injerto óseo, el material de regeneración ósea, los métodos y la jeringa descritos en la sección anterior, el hidrogel comprende un agente bioactivo para administrar al paciente. Los agentes bioactivos adecuados cuando el hidrogel se usa en la ingeniería de tejido óseo como se describe anteriormente incluyen anestésicos, antibióticos, hormonas y factores de crecimiento (por ejemplo, factores de crecimiento osteogénicos, vasogénicos o neurogénicos) y proteínas (por ejemplo, osteopontina). Los agentes bioactivos preferidos en tal caso incluyen anestésicos, más preferiblemente anestésicos locales, así como antibióticos y proteínas osteogénicas. Los ejemplos de anestésicos locales incluyen mepivacaína. Ejemplos de antibióticos incluyen imipenem. Los ejemplos de hormonas incluyen la melatonina. Los ejemplos de factores de crecimiento incluyen factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento transformantes (TGF-), factores de crecimiento similares a la insulina (IGF), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de células endoteliales humanas ( ECGF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEG^f), proteína morfogenética derivada del cartílago (COMP). Los ejemplos de proteínas osteogénicas incluyen OP-1, OP-2, BMP2, BMP3, BMP4, BMP9, OPP, Vg-1, 60 A y Vgr-1, incluidos los derivados recombinantes y de origen natural de los anteriores.

En tales realizaciones, los hidrogeles proporcionan ventajosamente alivio del dolor y una técnica mínimamente invasiva para la regenración ósea. De hecho, un material que pueda aliviar el dolor y administrarse a través de procedimientos mínimamente invasivos (por ejemplo, inyección) podría generar un cambio de paradigma en los campos de las intervenciones ortopédicas y craneofaciales. Esto minimizaría potencialmente la invasividad de los procedimientos de regeneración ósea, acortaría el período de cicatrización y el tiempo de movilización, al mismo tiempo que eliminaría o reduciría la necesidad de la administración de fármacos sistémicos para el tratamiento del dolor.

En materializaciones de la invencion, el hidrogel controla (por ejemplo, retrasa o extiende) la administración del agente bioactivo, mejorando así potencialmente su ventana terapéutica. Este es especialmente el caso con el anestésico local mepivacaína (ver el ejemplo a continuación).

Uso en una pasta para limpieza de implantes dentales

Los hidrogeles descritos anteriormente también se pueden usar para producir una pasta para limpiar implantes dentales.

En comparación con las pastas dentales convencionales comúnmente utilizadas para el cuidado personal diario, la pasta de la invención está diseñada específicamente para la limpieza de implantes dentales, que tienen requisitos de limpieza que difieren significativamente de los dientes naturales. Según el conocimiento del inventor, actualmente no existe en el mercado ningún producto especialmente diseñado y optimizado para la descontaminación de la superficie del implante.

La pasta puede eliminar la contaminación por biopelícula de las superficies de los implantes de titanio, al tiempo que minimiza los cambios topográficos en estas superficies (es decir, sin afectar la integridad de la superficie). Por el contrario, las pastas dentales comerciales habituales, que son de base orgánica, son menos eficaces en ese contexto e incluso pueden contaminar las superficies de los implantes de titanio; consulte los ejemplos a continuación.

La pasta podría permitir a los odontólogos y pacientes eliminar el biofilm de los implantes, controlar las infecciones periimplantarias y/o favorecer la reoseointegración en caso de pérdida ósea. También podría utilizarse para la descontaminación quirúrgica de las superficies de los implantes o la limpieza profesional de los implantes durante las visitas de mantenimiento. También podría usarse para el cuidado personal diario para limpiar pilares de titanio en caso de sobredentadura o incluso para limpiar superficies expuestas de implantes. De hecho, cuando se usan implantes dentales, las superficies de titanio justo debajo de la corona, es decir, el "cuello" del implante, suelen quedar expuestas.

Por lo tanto, se divulga una pasta para limpiar implantes dentales que comprende el hidrogel anterior mezclado con un agente abrasivo. En la pasta para limpieza de implantes dentales, el hidrogel actúa como espesante y portador del agente abrasivo.

En realizaciones preferidas, el pH del gel está entre alrededor de 9 y alrededor de 10, especialmente si los implantes a limpiar están hechos de titanio. Uno de esos geles es un gel en el que , M1 es Na+, M11 es Mg2+, X es 0.56, Y es 25 0.13, yZ es 0.31.

La pasta puede ser completamente inorgánica, es decir, libre de compuestos orgánicos.

Volviendo al agente abrasivo, es preferible evitar los materiales abrasivos duros con partículas de gran tamaño, ya que pueden provocar arañazos en las superficies del implante, lo que podría aumentar la acumulación de placa. Como tal, el agente abrasivo debe tener un tamaño de partícula promedio relativamente pequeño, por ejemplo, hasta alrededor de 500 nm, preferiblemente hasta alrededor de 400 nm, y más preferiblemente desde alrededor de 200 a alrededor de 300 nm. Los agentes abrasivos adecuados incluyen partículas de sílice, incluidos los fosfatos de magnesio, sílice, nanosilicatos (que muestran propiedades osteoconductoras que ayudan a inducir y acelerar la regeneración ósea) y/o carbonato de calcio. Más preferiblemente, el agente abrasivo son nanopartículas de sílice hidratadas, especialmente aquéllas con un tamaño medio de partículas de aproximadamente 200 a aproximadamente 300 nm.

El agente abrasivo puede estar presente en la pasta en una concentración que oscila entre un 5% y un 60%, preferiblemente entre un 20% y un 40% y más preferiblemente un 30% en peso basado en el peso total de la pasta. La pasta para limpiar implantes dentales puede comprender otros aditivos, en particular aquellos aditivos que se sabe que son útiles en las pastas de limpieza dental. Dichos aditivos incluyen potenciadores del sabor, agentes colorantes, destellos y otros ingredientes funcionales. Como se indicó anteriormente, estos aditivos deben seleccionarse cuidadosamente para evitar la contaminación de los implantes con compuestos orgánicos.

Definiciones

En este documento, "implantar" significa insertar algo en el cuerpo de una persona, por ejemplo (pero sin limitarse a) mediante cirugía. Un "implante" es un material que está destinado/diseñado para ser implantado en el cuerpo de una persona.

Aquí, "inyectar" significa introducir algo en el cuerpo de una persona usando una aguja. Un "inyectable" es un material destinado/diseñado para ser inyectado en el cuerpo de una persona.

El uso de los términos "un" y "un" y "el" y referencias similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que este indicado de otro modo o claramente contradicho por el contexto.

Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" deben interpretarse como términos abiertos (es decir, que significan "que incluye, pero no se limita a") a menos que se indique lo contrario.

Cualquiera y todas las combinaciones y subcombinaciones de las realizaciones y características descritas en este documento están abarcadas por la presente invención. Por ejemplo, todos los componentes, propiedades y usos del gel descritos pueden combinarse.

La enumeración de los rangos de valores en este documento tiene la intención meramente de servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del rango, a menos que se indique lo contrario en este documento, y cada valor separado se incorpora a la especificación como si se mencionara individualmente en este documento. Todos los subconjuntos de valores dentro de los rangos también se incorporan a la especificación como si se mencionaran individualmente en este documento.

De manera similar, aquí se pretende que una estructura química general con varios sustituyentes y varios radicales enumerados para estos sustituyentes sirva como un método abreviado para referirse individualmente a todas y cada una de las moléculas obtenidas mediante la combinación de cualquiera de los radicales para cualquiera de los sustituyentes. Cada molécula individual se incorpora a la especificación como si se mencionara individualmente en este documento. Además, todos los subconjuntos de moléculas dentro de las estructuras químicas generales también se incorporan a la especificación como si se mencionaran individualmente en este documento.

Todos los métodos descritos en este documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en este documento o que el contexto lo contradiga claramente.

El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ejemplar (p. ej., "tal como") que se proporciona en el presente documento, pretende simplemente iluminar mejor la invención y no supone una limitación en el alcance de la invención que está determinado por las reivindicaciones adjuntas.

Ningún lenguaje en la especificación debe interpretarse como que indica cualquier elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la invención.

Aquí, el término "sobre" tiene su significado ordinario. En las materializaciones de la invencion, puede significar más o menos el 10% o más o menos el 5% del valor numérico calificado.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Otros objetos, ventajas y características de la presente invención se harán más evidentes con la lectura de la siguiente descripción no restrictiva de materializaciones específicas de la misma, dadas a modo de ejemplo únicamente con referencia a los dibujos adjuntos.

DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES ILUSTRATIVAS

La presente invención se ilustra con mayor detalle mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1: geles de fosfato de magnesio que regulan al alza la formación y regeneración óseas

Aquí, describimos un nuevo material nanocristalino con una nanoestructura 2D y propiedades relevantes para aplicaciones biomédicas. Pudimos sintetizar un biomaterial 2D con propiedades como biocompatibilidad, biorresorción, estabilidad a largo plazo, tixotropía y/o inyectabilidad utilizando un método simple y potencialmente escalable. Descubrimos que los iones de sodio pueden regular la precipitación de fosfato de magnesio al interactuar con la superficie de los cristales, lo que provoca un crecimiento cristalino preferencial que da como resultado una morfología 2D. El material 2D dio lugar a una base de hidrogel físico sobre un material nanocristalino. Este hidrogel se caracterizó in vitro e in vivo. Mostramos a continuación que tiene una combinación de actividades osteogénicas y acelera la consolidación ósea y la osteointegración al mejorar la formación de colágeno, la diferenciación de osteoblastos y la proliferación de osteoclastos a través de la regulación ascendente de COL1A1, RunX2, ALP, OCN y OPN.

Seccion Experimental

Estudio y caracterización del sistema NaOH-Mg(OH)rH3P04

El sistema ternario del título se investigó variando la fracción molar de NaOH, Mg(OH)2 y H3PO4 en diferentes soluciones. En todas las reacciones químicas se utilizó un volumen fijo de 7 ml y la concentración máxima de reactivos fue de 10,5 mmol, para evitar cualquier posible efecto de concentración. El diagrama ternario se construyó utilizando 141 puntos diferentes obtenidos al mezclar los tres componentes en diferentes fracciones molares (Figura 2). Los precipitados obtenidos durante la determinación del diagrama ternario se prepararon utilizando el siguiente procedimiento. Se disolvieron 85 mg de Mg(OH)2 en 2,2 ml de H3PO41,5 M y después de la disolución completa se añadieron 3,8 ml de NaOH 1,5 M bajo fuerte agitación. Después de mezclar las dos soluciones, se dejó reposar la suspensión coloidal resultante durante 2 horas, se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos y se descartó el sobrenadante. El precipitado sólido se secó al vacío a temperatura ambiente y se almacenó para su caracterización. Las diferentes fases cristalinas de los precipitados obtenidos durante el diagrama ternario se identificaron mediante difracción de rayos X (XRD). Los patrones de difracción de los precipitados secos se registraron con un Bruker 08 Discover (Bruker AAS GmbH, Karlsruhe, Alemania) de 5° a 58° 28 con fuente de cobre (lcu,Ka = 1.5406 A) a 40 kV y 40 mA y GADDS detector. Los patrones de difracción se procesaron con el software EVA (Bruker AAS GmbH, Karlsruhe, Alemania) y la composición de fase se determinó comparando los espectros adquiridos con las fases identificadas en la base de datos PDF-4 del Centro Internacional de Datos de Difracción (ICDD).

Composición de la suspensión estable de NMP (NaMgPhosphate)

La composición elemental de las suspensiones estables de NMP se determinó mediante espectroscopia de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES) con un ICP-OES Thermo Scientific iCAP 6000 Series (Thermo Fisher Scientific Inc, East Grinstead, Reino Unido). En un procedimiento típico, se digirieron 6 mg de polvo seco de NMP durante 2 horas a 95 °C en 5 ml de HNO³con un 67 % de metales traza y todas las muestras se prepararon por triplicado. Después de la digestión, las muestras se dejaron enfriar a temperatura ambiente y luego se diluyeron con agua desionizada hasta 50 ml. De esta solución se tomó 1 ml y se diluyó con agua desionizada a 10 ml y se midió por ICP-OES.

Las curvas de calibración se prepararon utilizando soluciones estándar recién preparadas de Mg2+, Na+ y PO⁴3" con una concentración de 10, 5, 2, 1 y 0,1 ppm en HNO³4%. Las soluciones estándar se prepararon a partir de la dilución de una solución estándar certificada de 1000 ppm en HNO³al 4% (SCP Science Inc, Baie D'Urfe, Canadá). La velocidad de la bomba de análisis se fijó en 50 rpm, la potencia de radiofrecuencia del plasma fue de 1150 W, el flujo de gas auxiliar y nebulizador se fijó en 0,5 l min-1. Todas las mediciones se realizaron en modo axial/radio. La espectroscopia infrarroja por transformacion de Fourier (FT-IR) de los precipitados de NMP secos y tratados térmicamente se registró usando un Perkin Elmer Spectrum Two (Perkin Elmer Inc, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) con diamante de rebote único para reflectancia total atenuada (ATR). Los espectros se registraron a temperatura ambiente de 450 a 4000 cm-1 con una resolución de 4 cm-1 y 64 barridos.

Se realizó un análisis termogravimétrico (TGA) para calcular la cantidad de agua de cristalización de los precipitados de NMP secos (SOT Q600 TA Instruments, TA Instruments-Waters l.L.C. New Castle, EE. UU.). La TGA se realizó en modo vertical en una bandeja de platino de 30 a 1100 °C utilizando una velocidad de calentamiento de 5 °C/min, y en atmósfera de aire con un flujo de purgacion de 100 ml min-1.

En una síntesis típica para producir NMP, en una solución de H3P04 (11H3P04 = 0,37), el valor del pH aumentó de 0,8 a 1,9 después de agregar y disolver Mg(OH)2 (11Mg(OH)2 = 0,18). La adición de la solución de NaOH (11NaOH = 0,45, pH 8,3) provocó la formación instantánea de una suspensión líquida blanca formada por nanocristales de tamaño uniforme de 50 nm. El pH de la suspensión permaneció constante durante 4 minutos antes de que comenzara a disminuir lentamente y la suspensión blanca se volviera gris y solidificara. Durante los siguientes 30 minutos, el pH de la suspensión se estabilizó en 7.8 y los pequeños nanocristales aumentaron su tamaño formando la suspensión final compuesta por nanocristales 2D con estructura ondulada (Figuras 7 a 9).

La acidificación del pH observada durante la reacción podría deberse a la desprotonación de restos de fosfato ácido durante la reacción como resultado de la formación de ortofosfato tribásico (PO^{4 3}-).

La reología, morfología de nanocristales y estructura tridimensional de la suspensión coloidal de NMP Las suspensiones coloidales de NMP se sometieron a mediciones reológicas para determinar el esfuerzo de cizalla requerido para la transición gel-líquido, el tiempo de transición líquido-gel (t-G) tras la eliminación del esfuerzo de cizalla y la viscosidad. Los experimentos reológicos se realizaron con un reómetro AR2000 de TA Instruments (TA Instruments-Waters L.L.C. New Castle, USA) utilizando platos paralelos de 40 mm de diámetro y una distancia entre platos de 0,1 mm. Las mediciones oscilatorias se realizaron a una frecuencia constante (f = 1 Hz), y los barridos de tensión oscilatoria oscilaron entre 1 y 700 Pa. El tiempo de equilibrio antes de ejecutar las mediciones se estableció en 10 minutos y todas las mediciones se realizaron a temperatura ambiente.

La fuerza requerida para inyectar los nanocristales de NMP a través de una aguja de insulina de 160 pm de diámetro interno se midió utilizando el instrumento Mach-1 V500cs y el software Mach-1 Motion versión 4.3.1 (Biomomentum Inc., Laval, Canadá). La fuerza se midió con una celda de carga multieje de 70 N (resolución de 0,007 N) y tasa de adquisición de 100 Hz. El gel se cargó en la jeringa evitando la presencia de burbujas y luego se insertó el émbolo en la celda de carga. El valor de la fuerza se midió aplicando una velocidad de etapa vertical constante de 1 mm s_1 (resolución de 0,1 pm). La jeringa cargada con agua desionizada requirió una fuerza de 0,14 ± 0,01 N, mientras que para los geles de NMP de formulación A-D estaban comprendidos en un rango de 0,22 ± 0,03 N y 0,77 ± 0,04 N. A menor velocidad de etapa (0,3 mm s1) la fuerza requerida para inyectar las muestras de NMP fue considerablemente mayor alcanzando un máximo de 18 ± 1 N y un mínimo de 9 ± 1,2 N.

Se utilizó una réplica de una crio-fractura para investigar la organización y la morfología de los nanocristales que forman el material tixotrópico. La suspensión coloidal de NMP estable se congeló rápidamente en nitrógeno líquido (tasa de enfriamiento >105 K s1) inmovilizando los nanocristales instantáneamente (Acharya et al., Journal of International Oral Health 2014, 6, 361). La suspensión congelada resultante se fracturó, el hielo se eliminó mediante grabado por congelación al vacío y se pulverizó una fina capa de carbono sobre la superficie para producir una réplica de carbono. La superficie de la muestra se sombreó con vapor de platino y la réplica de metal de carbono se colocó en una rejilla de malla 200 de cobre recubierta de carbono/Formvar (2SPI, Structure Probe Inc, West Chester, EE. UU.) y se examinó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) utilizando un Tecnai T12 trabajando a 120 kV (FEI Inc, Hillsboro, Oregon, USA). La difracción de electrones de área seleccionada y las imágenes TEM de la dispersión de agua de los nanocristales de NMP se realizaron en una rejilla TEM Formvar/rejilla de malla de cobre recubierta de carbono-200 (2SPI, Structure Probe Inc, West Chester, EE. UU.). La cuadrícula se preparó mediante el depósito de una gota de 5 pL de una dispersión de agua al 1 % v/v del gel de NMP, y la gota se secó con papel de filtro 90 segundos después. Se utilizó microscopía electrónica de barrido (SEM) para caracterizar los nanocristales en diferentes momentos durante la reacción para obtener la NMP y la adhesión de osteoblastos a la superficie de los nanocristales.

Para el análisis a distintos timepos, se extrajo una alícuota de 2 ml de la reacción y se vertió en un filtro Buchner, se lavó primero con agua (20 ml), etanol (20 ml) y luego se secó en un horno de vacío a 25 °C. Este proceso se realizó a los 0,5, 5, 10 y 30 minutos a partir de el inicio de la reacción. El SEM se llevó a cabo utilizando un FEI Inspect F-50 FE-SEM (FEI Inc, Hillsboro, Oregón, EE. UU.) operado a 10 kV. Para la adhesión de los osteoblastos, los cultivos se fijaron con una solución de glutaraldehído al 2,5 % durante 20 minutos y luego se deshidrataron con una serie de soluciones de etanol del 50 al 100 %. Posteriormente, las muestras se secaron con soluciones de etanol/triclorotrifluoroetano en las relaciones siguientes: 75/25, 50/50, 25/75 y 0/100 durante 15 minutos y 0/100 hasta su complete evaporación.

Se llevaron a cabo mediciones de potencial zeta para evaluar la carga superficial de los nanocristales utilizando un Malvern Nano ZS equipado con células capilares plegadas desechables (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Reino Unido). La concentración del gel utilizado en las mediciones fue de 20 mg mL-1 y la temperatura se mantuvo constante a 25 °C. Para evaluar la presencia simultánea de cargas negativas y positivas, se estudió la interacción de los nanocristales de NMP con superficies de vidrio cargadas positiva y negativamente (Figuras 34 y 35). Los nanocristales de NMP se sintieron atraídos por las superficies de vidrio con carga positiva y negativa. Sin embargo, solo el vidrio con carga negativa interactuó con el borde de los nanocristales, lo que indica la presencia de una carga positiva en el borde de los nanocristales de NMP. Al igual que las arcillas, la presencia simultánea de cargas positivas y negativas parece permitir que la nueva dispersión de NMP coloidal sintetizada forme un hidrogel físico con un comportamiento "similar a la arcilla".

Caracterización de superficies

Las mediciones de XPS se llevaron a cabo con un espectrómetro Thermo K-alfa (Thermo Fisher Scientific Inc, East Grinstead, Reino Unido) equipado con una fuente monocromática de rayos X Al Ka que funciona a 1486,6 eV. Debido a la naturaleza no conductora del polvo que compone el gel, el efecto de carga se minimizó utilizando una cañón de saturacion de baja energía para proporcionar una neutralización de carga eficiente. Para evitar los efectos de carga en los espectros resultantes, se calibró la escala de energía de enlace (BE) a partir de la contaminación por hidrocarburos utilizando el pico C1s a 285,0 eV.

Durante la medición, la presión residual dentro de la cámara de análisis fue de 1x10-8 mbar. Los espectros de la encuesta se registraron con un diámetro de haz de rayos X de 400 pm y una energía de paso de 200 eV, un tiempo de permanencia de 50 ms y un tamaño de paso de energía de 1 eV. Los espectros de alta resolución se registraron utilizando una energía de paso de 50 eV, un tiempo de permanencia de 50 ms y un tamaño de paso de energía de 0,1 eV. El experimento del perfil de profundidad de la superficie se realizó utilizando un cañón de iones de Ar que trabajaba a baja corriente y con una energía de iones de 500 eV que produciría una tasa de grabado de 0,05 nm s-1 en una superficie de TaO2. El tiempo de grabado fue de 5 segundos y el proceso se repitió 5 veces. Se usó el software Avantage (5.932v) para ajustar los espectros de fotoelectrones usando un algoritmo de mínimos cuadrados. La señal de fondo en espectros de rango estrecho se acomodó mediante una función de Shirley no lineal, y las curvas experimentales se ajustaron usando combinaciones de distribuciones gaussianas y lorentzianas (Aguzzi, C. et al., Appl .Clay Sci. 2007, 36 (1-3), 22-36.) La cuantificación se realizó sobre la base de los factores de sensibilidad relativa de Scofield (AIAbbas, F.M. et al., Journal of Pipeline Engineering, 2012. 11(1): p. 63).

Biocompatibilidad de las dispersiones coloidales de NMP

La viabilidad celular de las suspensiones coloidales de NMP se llevó a cabo utilizando células primarias de fibroblastos humanos (HF). Los Hf fueron proporcionados amablemente por el Dr. C.Doillon (Universidad Laval). Los HF se recogieron de prepucios después de un consentimiento informado por escrito que fue aprobado por el Comité de Ética del Centre Hospitalier Universitaire de Quebec (CHUQ). Los HF se sembraron en cubreobjetos circulares en una placa de 24 pocillos (0,8 x 105 pocillos), se cultivaron en medios de cultivo celular DMEM (10 % FBS, 1 % penicilina-estreptomicina) a 37 °C en una atmósfera húmeda con 5 % de CO2 y se cultivaron durante una noche. Se preparó una solución del reactivo Alamar-Blue al 10 % en un medio de cultivo celular DMEM y se usó para el ensayo. Se usaron células HF sin materiales como control positivo, NMP sin células HF se usó como blanco, y la suspensión coloidal de la formulación A y B se puso en contacto directo con células HF para la prueba de viabilidad celular. Después de 1 día, se retiró el medio de cultivo celular y se añadieron a cada pocillo 500 pL de una solución del reactivo Alamar-Blue al 10% y se incubó a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5% durante 3 horas. De cada muestra se recogieron 100 pL de medio de cultivo y se depositaron en una placa de 96 pozos. La intensidad de la fluorescencia se midió a 585 nm usando un Aexc de 550 nm usando un lector de microplacas SpectraMax M2 (Molecular Devices, L.L.C. Sunnyvale, California, EE. UU.). Se usó el mismo procedimiento para el punto final y los días 4 y 7.

Ensayo vivo/muerto.

Los HF se sembraron en cubreobjetos circulares en una placa de 24 pocillos (0,4 x 105 pocillos), se cultivaron en medios de cultivo celular DMEM (10 % FBS, 1 % penicilina-estreptomicina) a 37 °C en una atmósfera húmeda con 5 % de CO2 y se cultivaron durante una noche. La solución de tinción se preparó mezclando calceína (2 jmol L-1), Etd-1 (4 |jmol L-1) y Hoechst 33258 (4 |jg mL-1). Se usaron células HF sin materiales como control positivo, las formulaciones de suspensión coloidal A y B se pusieron en contacto directo con las células HF para el ensayo Live-Dead. Las células HF de control negativo se trataron con metanol al 70% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el medio de cultivo y las células se lavaron tres veces con 500 jL de solución tampón de fosfato (PBS). Se añadieron 400 jL de la solución de tinción a cada cubreobjetos y se incubaron durante 40 minutos a temperatura ambiente protegidos de la luz. Las células se lavaron nuevamente con PBS (500 jl) y los cubreobjetos se montaron en portaobjetos de vidrio. Se utilizó Zeiss Axio lmager M2 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Goettingen, Alemania) para tomar las fotografías del ensayo Live/Dead utilizando tres conjuntos diferentes de filtros; verde para calceína, rojo para Etd-1 y azul para Hoechst 33258. Se usó el mismo procedimiento para el punto final y los días 4 y 7. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Expresión de genes de diferenciación de osteoblastos.

Las células de médula ósea derivadas de ratón (mBMC) fueron proporcionadas amablemente por el Dr. S. Komarova (Universidad McGill). Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas establecidas por el Consejo Canadiense de Cuidado Animal de la Universidad McGill. Se recolectaron células de médula ósea derivadas de ratón (mBCM) de tibia y fémur de ratón usando un procedimiento descrito anteriormente (C57BL6/J, macho, 6 semanas de edad, comprado a Charles River) - ver Hussein et al., Bone 2011, 48, 202 Se cultivaron mBMC utilizando un procedimiento descrito previamente - véase Tamimi et al., Acta Biomater. 2011, 7, 2678. Brevemente, se cultivaron mBMC en frascos de cultivo de tejidos de 75 cm2 (2,5x106 células cm-2) en MEM (Wisent Inc., Canadá) con suero al 10 % (Fisher Scientific, Canadá), penicilina/estreptomicina al 1 %. antibióticos (Wisent Inc., Canadá), piruvato de sodio al 1% (Wisent Inc.) y 50 jg mL-1 L de ácido ascórbico (Sigma-Aldrich Co., EE. UU.). Después de 7 a 10 días, las células se separaron con tripsina/EDTA (Wisent Inc.) y se sembraron en placas a una densidad de 104 células cm-2 directamente sobre la superficie de los materiales o el poliestireno tratado con cultivo de tejidos (Corning Life Sciences, Lowell, MA , EE.^uU). Los mBMC se cultivaron durante 3, 5, 7, 14 y 21 días utilizando suero MEM al 10 %, antibióticos al 1 %, piruvato de sodio al 1 %, 50 jg mL-1 de ácido ascórbico, glicerol 2-fosfato hidrato de sal disódica 10 mM y dexametasona 1x10 -9 M. Los cultivos celulares se complementaron con medio fresco cada dos días. El ARN total se aisló de cultivos primarios de mBMC utilizando el reactivo TRl-zol® (lnvitrogen™, EE. UU.) siguiendo el protocolo del fabricante y se cuantificó en un espectrofotómetro mediante lecturas de absorbancia a 260 nm. Para la PCR en tiempo real, se transcribió inversamente 1 jg de ARN total de cada muestra utilizando un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ADNc resultantes se usaron para PC^ren tiempo real usando un Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems).

Las reacciones se llevaron a cabo en un sistema de PCR en tiempo real 7500 (Applied Biosystems) durante 40 ciclos (95 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 45 s) después de una incubación inicial de 10 minutos a 95 °C Se calculó un valor de umbral de ciclo para cada reacción utilizando el software de detecciones de secuencia de Applied Biosystems y se determinó la relación relativa de la expresión utilizando un algoritmo descrito previamente - véase M. W. Pfaffl, Nucleic Acids Res. 2001, 29. Los cebadores utilizados para amplificar objetivos específicos son los siguientes: RunX2 (factor 2 de transcripción relacionado con runt: sentido, 50-10 GGCTTGGGTTTCAGGTTAG-30; antisentido, 50-CGGTTTCTT AGGGTCTTGGA-30), TNALP (fosfatasa alcalina no específica tisular: sentido, 50-GGGGACATGCAGTATGAGTT -30; antisentido, 50- GGCCTGGTAGTTGTTGTGAG-30), COL1A1 (colágeno tipo I, alfa 1: sentido, 50- GAGGCAT AAAGGGTCATCGTGG-30; antisentido, 50-CATTAGGCGCAGGAAGGTCAGC-30), OCN (osteocalcina: sentido, 50-TGAACAGACTCCGGCG-30 ; antisentido, 50-GATACCGTAGATGCGTTTG-30) y OPN (osteopontina:sentido, 50-CTGCTAGTACACAAGCAGACA-30; antisentido, 50-CATGAGAAA TTCGGAATTTCAG-30).

Estudio in vivo de la regeneración ósea y la osteointegración de implantes

La parte in vivo de este estudio fue aprobada por el Comité de la Junta de Ética de McGill de acuerdo con el Consejo Canadiense de Animales. Esta parte se llevó a cabo en treinta y nueve ratas Sprague-Dawley de 10-12 semanas de edad (Charles River Laboratories, Montreal, QC). Las ratas se alojaron en las instalaciones de Genome Animal de la Universidad McGill y se enjaularon en un entorno controlado a 22 °C con ciclos de luz/oscuridad de 12 horas y una humedad del 50 %. Se proporcionó una dieta para la cría de roedores y agua ad libitum. Se permitió que todas las ratas se aclimataran a este entorno durante 2 semanas antes de la intervención quirúrgica.

Se utilizaron veinticuatro animales para evaluar el efecto del gel de NMP en la cicatrización ósea y la osteointegración del implante. Estos animales se dividieron en dos grupos; primero control (12 ratas) y; segundo gel de NMP (12 ratas). Para proporcionar suficiente analgesia durante el procedimiento quirúrgico, se inyectó a las ratas carprofeno (5-10 mg/kg, subcutáneo, Pfizer Animal Health, Montreal, QC) treinta minutos antes de la intervención quirúrgica. Las ratas fueron anestesiadas con isoflurano (4% durante la inducción y 2,5% durante el procedimiento quirúrgico); las piernas fueron rasuradas, desinfectadas con solución de gluconato de clorhexidina (Omega Laboratories, Montreal, Canadá) y cubiertas con un paño estéril. Se realizó una incisión de espesor completo para exponer el tercio proximal de la tibia. Se creó un defecto unicortical (2,5 mm 0) en la tibia derecha usando una pieza de mano recta bajo irrigación salina constante. Se realizó el mismo procedimiento en el lado contralateral, pero se colocó en el defecto un implante de titanio (Ti) hecho a medida (1,5 mm 0 x 2,0 mm de profundidad). En el grupo NMP, los implantes de Ti se recubrieron con gel NMP antes de la inserción en el defecto y los defectos contralaterales se rellenaron con gel NMP (20 j L). En el grupo de control los implante y los defectos no fueron tratados. Las incisiones se suturaron con suturas monocryl 5-0. Para proporcionar suficiente analgesia a las ratas después de la cirugía, se les administró carprofeno cada 24 horas durante los primeros 3 días. Se permitió que las ratas sanaran durante dos semanas y luego se sacrificaron utilizando asfixia con CO2, y las tibias se extrajeron y conservaron en formalina tamponada neutra al 10% (Richard Allan Scientific, Kalamazoo, MI). Las muestras se etiquetaron con códigos y los códigos se cegaron a la persona que realizó los análisis.

Micro-CT

Desde la introducción de los implantes metálicos para uso médico por parte de Branamark en 1981 (ref), se ha considerado a la histología como el método más preciso para evaluar la osteointegración. Sin embargo, la histología tiene varias limitaciones: solo permite la evaluación bidimensional, es costosa, el procesamiento de varios pasos puede ser costoso y destruye la muestra. Por lo tanto, j-c t se introdujo como un método para el análisis volumétrico óseo. Sin embargo, también tenía desventajas, ya que no era posible evaluar el hueso que rodea a los implantes debido a la diferencia de densidades entre el hueso y el implante metálico. Aquí presentamos un nuevo método para evaluar la osteointegración utilizando j-ct. Las tibias derechas (muestras de defectos óseos) se escanearon usando un micro-CT (SkyScan1172; SkyScan; Kontich, Bélgica) ajustado a una resolución de 12,7 jm, voltaje de 50 kV, corriente de 200 jA, paso de rotación de 0,5 grados y filtro de aluminio de 0,5 mm. El defecto óseo original (2,5 mm 0, espesor total de la corteza) se identificó como una región de interés (ROI). Se analizó el ROI y se calculó el volumen del defecto restando el volumen óseo del volumen total del ROI.

Las muestras de tibias izquierdas con implantes de Ti también se escanearon con un micro-CT (SkyScan1172; SkyScan; Kontich, Bélgica), pero se configuraron con una resolución de 4,5 jm, un voltaje de 100 kV, una corriente de 100 jA, un paso de rotación de 0,4 grados y un filtro de aluminio/cobre. Las imágenes reconstruidas fueron segmentadas por diferentes umbrales para obtener dos ROls. La primera ROI incluyó el implante de titanio solo mediante el umbral de intensidad del color blanco en 80 bajo y 255 alto. La segunda ROI incluyó el implante y el hueso en el área periimplantaria mediante una dilatación exacta de la primera ROI y seguido por el umbral de intensidad de el color blanco en 10 bajo y 255 alto. El ROI final (el hueso periimplantario) se determinó restando la primera ROI de la segunda ROI y se analizó el área periimplantaria del hueso.

Expresión génica del estudio in vivo

Se usaron doce ratas para evaluar los efectos del gel NMP sobre la expresión de los genes RunX2 y COL1A1. Se crearon dos defectos uni-corticales (2,5 mm 0) en ambas tibias. El defecto tibial derecho se administró con gel NMP mientras que el lado contralateral se dejó vacío.

COL1A1

Los cebadores específicos utilizados para amplificar fueron los siguientes: RunX2 (factor 2 de transcripción relacionado con runt: sentido, 50-GGCTTGGGTTTCAGGTTAG-; antisentido, 50-CGGTTTCTTAGGGTCTTGGA-30), TNALP (factor de transcripción de tejido fosfatasa alcalina no específica: sentido, 50-GGGGACATGCAGTATGAGTT-30; antisentido, 50-30 GGCCTGGTAGTTGTTGTGAG-30), COL1A1 (colágeno tipo I, alfa 1: sentido, 50- GAGGCAT AAAGGGTCATCGTGG-30; antisentido, 50-CATTAGGCGCAGGAAGGTCAGC-30), OCN (osteocalcina: sentido, 50-TGAACAGACTCCGGCG-30; antisentido, 50-GATACCGTAGATGCGTTTG -30) y OPN (osteopontina: sentido, 50-CTGCTAGTACACAAGCAGACA-30; antisentido, 50-CATGAGAAA TTCGGAATTTCAG-30).

Cicatrización ósea y osteointegración

Las muestras con defectos óseos se deshidrataron en concentraciones ascendentes de etanol (70-95%). Se obtuvieron tres secciones y se tiñeron con fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) para evaluar el número de osteoclastos, fosfatasa alcalina (ALP) para evaluar los efectos sobre el número de osteoblastos y Von Kossa para evaluar la mineralización. Las secciones histológicas se registraron usando un microscopio óptico (Carl Zeiss Microscopy, Alemania). El número de osteoclastos y osteoclastos se cuantificó utilizando un software de imágenes (ZEN 2012 SP2, Alemania). Los datos de osteoclastos se presentaron como número de osteoclastos por milímetro cuadrado de tejido mineralizado (OC/mm2). De manera similar, los datos de osteoblastos se presentaron como número de osteoblastos por milímetro cuadrado de tejido mineralizado (OB/mm2). El porcentaje de tejido mineralizado en el defecto se analizó mediante el programa Image-J (Wayne Rasband; Instituto Nacional de Salud, Bethesda, Maryland) y los datos se presentaron como presencia de tejido mineralizado (% MT). Todos los datos se presentan como media y desviación estándar. Muestras de tibias izquierdas con implantes de Ti fueron deshidratadas en concentraciones ascendentes de etanol (70% - 100%) e infiltradas con resina histológica de poli(metil-metacrilato) (Technovit 9100, Heraeus Kulzer, Wehrheim, Alemania). Después de la polimerización, las muestras se seccionaron en portaobjetos histológicos de 30 jm de espesor con una sierra de diamante (SP1600, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania) y se tiñeron con fucsina básica y azul de metileno. Se tomaron imágenes de las secciones histológicas con un microscopio óptico (Cari Zeiss Microscopy, Alemania) y se analizaron con el software lmageJ (Wayne Rasband; Instituto Nacional de Salud, Bethesda, Maryland). El contacto huesoimplante se calculó dividiendo el perímetro del implante cubierto de hueso por el perímetro total del implante.

Análisis estadístico

El tamaño de la muestra para la parte in vivo del estudio se calculó para dar una potencia del 80 % con un nivel de confianza del 95 % para rechazar la hipótesis nula de que no hay diferencia entre los implantes con y sin recubrimiento de gel NMP. Se consideró que una diferencia del 10 % era clínicamente relevante, se asumió una desviación estándar potencial del 12 % según un estudio anterior y se esperaba una potencial perdidad de animals del 10 % (según nuestro experimento anterior con un modelo y una intervención similares). Se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para evaluar la normalidad de los datos y la prueba t de Student para comparar entre grupos. Se utilizó el software Origin 9 (Origin Lab Co., Northampton, MA) para el análisis de datos. La significación estadística se fijó en p < 0,05.

Resultados

Identificación, Caracterización, morfología de nanocristales y estructura de la fase NMP

El nuevo biomaterial de fosfato de magnesio nanocristalino (NMP) se identifica en el diagrama ternario del sistema NaOH-Mg(OH)2-H3PO4 (Figura 2).

Los geles de NMP se obtuvieron en una pequeña región del diagrama ternario (Figura 3, área etiquetada como "Suspensión coloidal estable"). Los símbolos en esta área del diagrama ternario se refieren a formulaciones específicas A= fl, B=t, C = y D=O descritos en la Tabla 2.

Dependiendo de las fracciones molares utilizadas, las fases cristalinas restantes identificadas oscilaron entre fosfato de magnesio tribásico y dibásico, como newberyita MgHPO43H20, farringtonita Mg³(PO⁴)², bobierrita Mg³(P⁰⁴)²'⁸H²O y brucita Mg(OH)². Además, se obtuvo una nueva fase cristalina no identificada (patrón de difracción de rayos X que se muestra en la Figura 4) y una suspensión coloidal similar a un gel inestable (Figura 3, área etiquetada como "Nueva fase cristalina y fases mixtas de Mg/P04" que rodea el área etiquetada como " Suspensión coloidal estable"). Las soluciones con una fracción molar de H³PO⁴superior a 0,8 eran demasiado ácidas y no se produjeron precipitados (consulte la Figura 3, área negra en el lado derecho del diagrama).

La composición del NMP estaba compuesta por una gama de [Mg+], [Na+], [P043 ], y [HPOi-J y se puede asumir que la formula seria MgxNay(HPOi -)Z"(P0 43)r nH20 con [5::,X:57], [1:5Y:52], [3:5Z:55], y [1:5T:53], donde [7:5X+Y:58] y [5:5Z+T:56].

El agua de cristalización se determinó por análisis termogravimétrico y estuvo comprendida entre [3:5n:54] (Cuadro 2 y Figura 5).

Tabla 2. Composición de las cuatro formulaciones diferentes obtenidas como suspensión coloidal estable medida con ICP-OES. La cantidad de agua del polvo seco se determinó usando TGA. Los símbolos se refieren a formulaciones específicas que se muestran en el área etiquetada como "Suspensión coloidal estable" en la Figura 3.

Formulacion Fracción molar Atomico Atomico Atomico pH H3PO4/NaOH/Mg(OH)2 %P %Na %Mg

A 0.35/0.52/0.13 16.26±1.3 6.5±0.2 17.5±0.4 8.3±0.1 B 0.37/0.45/0.18 19.5±2.3 3.3±0.4 19.5±2.2 7.8±0.1 fl

t 0.3/0.55/0.15 20.3±3.0 3.4±1.0 24.7±3.5 10.9±0.1

O C

D 0.3/0.52/0.18 20.4±1.5 3.2±1.5 22.2±1.8 10.8±0.1

La relación atómica Mg/P estuvo entre 1 y 1,15, lo que sugiere que el gel de NMP podría presentar similitud con el precipitado cristalino Newberyite MgHPO4dH20.

La evolución de varios aspectos físicos de la suspensión coloidal de NMP durante la síntesis fue la siguiente. La figura 6 muestra el pH de la suspensión coloidal en función del tiempo de reacción. La fracción molar de H3PO4/NaOH/Mg(OH)2 fue 0,37/0,45/0,18 y el volumen total fue 7 ml. La figura 7 es una imagen de la suspensión después de 30 segundos desde el comienzo de la reacción. La suspensión coloidal era blanca y líquida, y visible al inclinar el tubo. La Figura 8 muestra que después de 10 minutos, la suspensión coloidal de n Mp se transformó de líquido a sólido cambiando su color de blanco a gris. Finalmente, las Figuras 9 A y B muestran la evolución de los nanocristales de NMP durante la reacción. Las micrografías SEM muestran la evolución de la morfología de los nanocristales después de 30 s (d) y 30 minutos (e). La barra de escala representa 500 nm.

El potencial zeta de los nanocristales de NMP mostró una carga negativa global comprendida entre -10,1±4,3 y -18,1±6,7 mV.

Las mediciones reológicas confirmaron la tixotropía de la suspensión coloidal de NMP con un contenido sólido de 5-10% en peso (Figuras 10 a 14). Después de la licuefacción (G' :5 G"), t-G es el tiempo que tardan G', G" y g en volver a sus niveles originales cuando se elimina la fuerza de cizalla.

A baja tensión, el material permaneció en estado sólido, como lo indica G' > G" (6 < 45°), y al aumentar la tensión comenzó a licuarse (G' = G" y 8 = 45°). La fuerza de cizalla mínima requerida para que esto ocurra se define como el esfuerzo de licuefacción Ty y su valor osciló entre 22 y 127 Pa. El aumento de Ty y la viscosidad generalmente se atribuye al aumento del número y la extensión de las interacciones entre los nanocristales debido a su crecimiento y asociación. Después de la eliminación de la tensión, el material recuperó el estado de gel con un tiempo de recuperación (t-G) tan rápido como 12 s, que es más rápido que la dispersión en agua de la arcilla Laponite (20 minutos). TL-G varió según la viscosidad porque los movimientos brownianos son inversamente proporcionales a la viscosidad del medio; una mayor viscosidad disminuyó la movilidad de los nanocristales aumentando el t-G necesario para reformar la red tridimensional original.

Además, la viscosidad fue inversamente proporcional al tamaño de las nanopartículas, por lo que al variar la fracción molar de los tres componentes fue posible modificar las propiedades reológicas y físicas de las suspensiones de NMP (Tabla 3).

Tabla 3. Propiedades físicas de los hydrogeles NMP sintetizados con varias fracciones molares

Almacenado

Formulación ^{Fraccion molar}Tamaño de cristal Potencial Licuifacciontl-G _{H3PO4/Mg(OH)i}Lx A (nm) Zeta (mV) Modulo G' Stres TY (Pa) (Pa)

A 2.7 285±133X54±18 -10.7±0.5 1769 22 12 s

B 2.1 237±83 X 64±25 -10.1±4.3 4316 56 60 s

C 2 156±84 X 39±8 -17.4±5.5 5199 80 95s

0 1.6 141±82 X 39±12 -18.1±6.7 10540 127 ^>300s

El gel de NMP podría inyectarse fácilmente a través de una aguja de insulina y, después de la inyección manual, la suspensión coloidal recuperaría un comportamiento sólido (Figura 15). La fuerza requerida para inyectar el material de NMP a través de la aguja de insulina fue sólo 0,08-0,63 N mayor que la fuerza requerida para inyectar agua (0,14 ± 0,03 N Sección Experimental, arriba). Después de volcar el porta de vidrio, la suspensión se comportó como un material sólido.

La verdadera estructura 3D de la suspensión coloidal se reveló con la técnica de crio-fractura TEM gracias a la técnica de preparación de la muestra. Los nanocristales se mantienen en su lugar gracias a la matriz de hielo subyacente y, después de ser expuestos para su replicación, la réplica de carbono-metal muestra la red formada por los nanocristales. La micrografía TEM a pocos aumentos de la réplica de carbono-metal de una suspensión fracturada por congelación muestra nanocristales de NMP agrupados formando una red 3D, y el agua que compone el medio del hidrogel se encuentra en el espacio vacío entre los nanocristales agrupados (Figura 16). La superficie de la réplica mostró un patrón escalonado que revelaba el espesor de los nanocristales que se estimó en un rango de entre 4 y 7 nm (Figura 17).

Las micrografías TEM ilustraron una alta relación de aspecto de los nanocristales, y la difracción de electrones de área seleccionada mostró la naturaleza nanocristalina del biomaterial (Figuras 18 a 22).

Uno de los modelos utilizados para explicar la tixotropía es el "castillo de naipes" mencionado anteriormente, donde las partículas se mantienen unidas por contactos de borde a cara debido a la presencia simultánea de cargas positivas y negativas en el borde y la cara de las partículas. La micrografía TEM de gran aumento revela que el tipo de agregación de los nanocristales consiste principalmente en asociaciones cara a cara. Los nanocristales se superponen parcialmente entre sí, lo que da como resultado una red de panal de agregados cara a cara en forma de lámina extendida que se doblan, se retuercen, se ramifican y se entrelazan con pocos contactos de borde a cara (Figuras 17 y 23).

La estructura muy delgada de la hoja de 20 nm es visible en la micrografía Titan Krios del gel NMP (Figura 24). Los iones de sodio estabilizan los nanocristales de NMP

La síntesis del biomaterial tixotrópico NMP se logró utilizando diferentes bases alcalinas (NaOH, KOH y LiOH) y el material mostró una estabilidad a muy largo plazo (> 1500 días, 20 °C). Sin embargo, la estabilidad estuvo dramáticamente influenciada por el tipo de ion alcalino utilizado. Los iones más pequeños como Li+ y Na+ (radio iónico 76 y 102 pm, respectivamente) produjeron hidrogeles estables, mientras que los iones K+ más grandes (radio iónico 138 pm) dieron como resultado hidrogeles inestables que finalmente se convirtieron en newberyita MgHPOdH20 (Figura 28). El reemplazo de iones de Na+ con K+ afectó la estabilidad de la suspensión que disminuyó de > 4 años a < 1 día dando como resultado una rápida conversión de NMP a Newberyita (Figura 25); la velocidad de conversión se correlacionó directamente con la relación [Na]/([K]+[Na]). La suspensión estable de NMP hecha con sodio permaneció en estado de gel y no tuvo cambio de fase después de 4 años como se muestra por XRD (Figura 26). Tanto NMP como Newberyite tienen una relación Mg/P similar, se forman en un rango de pH similar de 6,4 a 9,4 (Figura 27, flechas).

NMP contiene tanto HPO⁴2- como PO⁴3-. Esto se demostró analizando el polvo lavado de NMP con FT-IR, RMN de giro de ángulo mágico (MAS) de estado sólido y XPS.

El espectro FT-IR de la formulación A (Figura 29) mostró una amplia banda de absorción de 3600 a 2600 cm-1, lo que indica una combinación de estiramiento O-H del agua de cristalización intermolecular y débilmente unida y estiramiento de (P)O-H. Como en otros fosfatos de hidrógeno (p. ej., Monetita CaHPO⁴), el estiramiento OH del anión HPO⁴- da lugar a al menos a dos bandas anchas alrededor de 2855 y 2385 cm-1. La banda alrededor de 2855 cm-1 estaba cubierta por la amplia absorción de las moléculas de agua, mientras que la banda de 2355 cirr1 era visible. El ancho la absorción a 1647 cirr1 también se atribuyó a una combinación de flexión y rotación de HOH de cristalización residual y agua libre. Las bandas de absorción en 1080 y 1005 cirr1 se asociaron con las vibraciones de estiramiento de P=O, la banda en 875 cirr1 se atribuyó a la flexión de P-O-H, mientras que la banda en 535 cirr1 fue atribuida a la flexión de P=O.

La Figura 30 muestra el espectro FT-IR del mismo polvo después de la calcinación a 700 °C durante 8 horas. Como se puede observar, las vibraciones de la fracción P-O-H desaparecieron y aparecieron nuevos modos vibracionales adicionales en el rango de frecuencia de 1250-450 cm-1 que fueron asignados a la presencia de P²O⁴-, demostrando la transformación de HPO⁴- a P²O⁴.

Los espectros de 31P (parte superior de la Figura 31) revelaron dos picos. El izquierdo sin bandas laterales visibles se asignó como PO⁴3', mientras que el derecho con bandas laterales presentó una señal más fuerte en el experimento CP y se asignó como HPO⁴. Los espectros de 23Na tomados con dos retrasos de reciclaje diferentes (50 ms y 1 s) se muestran en la Figura 31, abajo. Uno de los picos fue más evidente a RD = 50 ms. MAS NMR mostró que, HPO⁴2' presenta una intensa polarización cruzada debido a la corta distancia entre los iones de hidrógeno y fosfato en su estructura química molecular. Por lo tanto, HPOi- produce una señal más fuerte en los espectros C^pMAS, en comparación con PO⁴3'. Por otro lado, PO⁴3' produce una señal más fuerte y más estrecha en los espectros regulares de 31P MAS sin detección detectable de bandas laterales, indicando la naturaleza isotrópica de los cristales de este ion y la presencia de un menor efecto de acoplamiento espín-espín.

Después de sumergir el gel de NMP en D20, la señal de HPO⁴²se fue debilitando progresivamente, y tras 14 horas de exposición a D2O ya no se encontraba ninguna señal remanente, lo que indica el intercambio de protones entre esta molécula y D20. Por otro lado, todas las señales de PO⁴3' se vieron ampliadas, presentando bandas laterales cortas y anchas (más claramente perceptibles en los experimentos CP). Esto puede haber ocurrido debido a la alteración del ambiente químico debido a la presencia de D20, causando diferentes cambios químicos isotrópicos para P043- y conduciendo a una estructura cristalográfica menos organizada (Figura 32).

Los espectros XPS de alta resolución P2p confirmaron la presencia de dos tipos diferentes de aniones fosfato, y su deconvolución en dos picos a 133,7 y 134,9 eV se asignaron respectivamente a P043- y HPOi-(Figura 33 (a) y (b)). El perfil de profundidad XPS (Figura 33 (c)) también reveló que la concentración de sodio disminuyó ligeramente de 9,1 a 7,6 at. % después de un grabado suave utilizando iones de Ar en condiciones muy suaves. El exceso superficial de sodio en la superficie exterior de los nanocristales podría deberse a la presencia de cargas negativas en las caras de los nanocristales, y esos iones podrían ser los responsables de la estabilización de la fase nanocristalina metaestable.

También se estudió la deposición de polvo de NMP sobre diferentes superficies de vidrio tratadas. La Figura 34 muestra la deposición de NMP sobre una superficie de vidrio cargada negativamente. Los nanocristales pueden adoptar una dirección paralela o perpendicular a la superficie. La figura 35 muestra el polvo de NMP depositado sobre una superficie de vidrio cargada positivamente. Los nanocristales adoptan solo una configuración paralela a la superficie del vidrio. Además, la cantidad de nanocristales depositados sobre la superficie del sustrato con carga negativa fue considerablemente mayor que la superficie positiva. Hay que tener en cuenta que el contraste en las Figuras 34 y 35 se mejoró para la visibilidad en blanco y negro.

Citocompatibilidad de la suspensión coloidal de NMP

Investigamos más a fondo la citotoxicidad de los nanocristales de NMP mediante el ensayo vivo-muerto y el ensayo Alamar-Blue para medir la actividad metabólica. El ensayo Alamar-Blue en células de fibroblastos humanos sembradas en contacto directo con el gel de NMP reveló que la actividad metabólica de la formulación A y B aumentó desde el día uno hasta el día siete (Figura 36). La formulación B mostró una actividad metabólica más alta que la formulación A durante los siete días del experimento, y en el día siete no se observó ninguna diferencia significativa entre el control y la formulación B. El valor más alto de la formulación B podría deberse a su pH más fisiológico (7,8) que la formulación A (8.3) Los resultados del ensayo vivo-muerto sugirieron una buena viabilidad celular para las formulaciones A y B (Figuras 37 a 41).

Hay que tener en cuenta que el orden de las barras en las Figuras 36 y 37 de izquierda a derecha es el orden que se muestra en la leyenda de las Figuras 36 de arriba a abajo. En las Figuras 38 a 41, se mejoró el contraste para la visibilidad en blanco y negro.

La micrografía SEM muestra la morfología, la adhesión y la colonización de osteoblastos diferenciados de células de médula ósea de ratón (mBMC) cultivadas sobre el biomaterial NMP. Después de ocho días de cultivo, la imagen muestra interacciones célula-célula y célula-sustrato que permitieron la formación de una construcción de tejido a macroescala (Figura 42). Además, comparando la estructura de los nanocristales de NMP antes y después del cultivo celular, se puede observar un aumento de la porosidad de los nanocristales probablemente debido a la disolución de los nanocristales de NMP.

El gel de NMP sintetizado en la formulación B (pH 7,8) se estudió para su uso en regeneración ósea. El factor de transcripción relacionado con Runt 2 (RunX2) se considera un factor clave de la osteogénesis debido a la estimulación de genes relacionados con los osteoblastos, como la fosfatasa alcalina (ALP), la osteocalcina (OCN), la osteopontina (OPN) y el colágeno tipo I, alfa1. COL1A1). La actividad de regulación de ALP es un evento clave que ocurre durante el tiempo temprano de la osteogénesis. Nuestro resultado muestra un aumento temprano y una regulación al alza de ALP durante los primeros cinco días con respecto a MgHPOdH20 y Mg3(P04)222H20, lo que indica que NMP tuvo un efecto positivo en la expresión de ALP y promovió la diferenciación osteogénica (Figura 43). La síntesis de OCN y OPN también es un indicador clave de la mineralización ósea. La OCN es secretada únicamente por los osteoblastos y regula el metabolismo corporal y el proceso de formación de los huesos, siendo el marcador más específico para la diferenciación y mineralización de los osteoblastos. La PCR en tiempo real de OCN mostró que durante los primeros 14 días, las mBMC cultivadas en NMP expresaron niveles significativamente más altos del gen que las células cultivadas en MgHPOdH20 y Mg3(P04)222H20 (Figura 44).

La OPN o sialoproteína ósea es una proteína estructural que representa el -8% de todas las proteínas no colágenas que se encuentran en el hueso, y es sintetizada principalmente por pre-osteoblastos, osteoblastos y osteocitos. Nuestros resultados mostraron que NMP regulaba al alza la expresión de OPN hasta 21 días (Figura 45).

También seguimos la expresión del ARNm de COL1A1, un gen responsable de codificar la producción de la cadena pro-alfa1 (I) de colágeno tipo I que es un constituyente de la MEC en tejidos conectivo como el hueso, la piel, el tendón, el ligamento y la dentina. COL1A1 expresado por mBMC fue regulado al alza por NMP alcanzando un máximo en el día 7 en comparación con MgHPOdH20 y Mg3(P04)222H20 (Figura 46). Los mBMC cultivados en NMP expresaron niveles más altos de RunX2 que los mBMC cultivados en Cattiite (Mg3(P04)222H20) y Newberyita después de cinco días de incubación (Figura 47).

En las Figuras 43 a 47, las diferencias se evaluaron mediante análisis de varianza unidireccional y se aceptaron como estadísticamente significativas a p < 0,05*.

El nuevo material NMP tiene propiedades osteogénicas y puede desencadenar una serie de eventos como la proliferación de células osteoblásticas, la síntesis de colágeno, la maduración de la MEC y la mineralización que siguen el patrón temporal de la diferenciación osteogénica. El material 2D regula al alza la expresión de ARNm de RunX2/ALP y también los genes responsables de la formación de la matriz extracelular con proteínas relacionadas con el hueso como OCN, OPN y colágeno tipo I.

La NPM acelera la cicatrización ósea y la osteointegración del implante

Los efectos de la NMP en la formación ósea (cicatrización y osteointegración) también se investigaron in vivo utilizando un modelo de tibia de rata. Se realizaron exploraciones de microtomografía computarizada (|J-CT) en muestras de hueso que se recuperaron en diferentes puntos de tiempo 3, 7 y 14 días después de la cirugía para defectos tratados y no tratados con NMP. En el día 3, no hay una diferencia visible en la exploración de j -CT entre el grupo de control y el de NMP. Por otro lado, en el día 7 la tomografía computarizada ^jindica claramente que el defecto tibial tratado con NMP mostró más formación ósea en el defecto en comparación con los controles (Figura 48). Después de 14 días, el defecto tibial tratado con NMP se rellena casi por completo con hueso nuevo mientras que el control todavía está parcialmente curado.

El análisis de histología e histomorfometría mostró que NMP aceleró la regeneración ósea y mejoró la osteointegración (Figuras 49 a 53 y Tabla 4) a través de la regulación positiva de la proliferación de osteoclastos (Figuras 49 y 53), diferenciación de osteoblastos (Figuras 49 y 54), síntesis de colágeno (Figuras 49 y 51) y mineralización (Figuras 48 y 49). La j -CT y la histología del implante muestran más hueso en contacto con el implante (Figuras 54 y 50). La histología y la histomorfometría indican que NMP mejoró claramente las células formadoras de hueso; osteoblastos y osteoclastos, así como colágeno.

Tabla 4. Los análisis de j -CT muestran un volumen de defecto más pequeño, menos separación trabecular (Tb.Sp), más grosor trabecular (Tb.Th) y número trabecular (Tb.N) en defectos tratados con NMP.

Grupo NMP Control

Vol. Defecto(mm3) 1.51±0.20 2.19±0.32

Tb.Th (mm) 0.30±0.04 0.25±0.04

Tb.Sp (mm) 0.11±0.02 0.15±0.05

Tb.N (mm-1) 2.52±0.25 1.98±0.61

Focus Ion Beam SEM (FIB-SEM) se realizó en muestras de defectos que se recuperaron en los días 3 y 7. En el día 3, no había mineralización presente en ambos grupos, sin embargo, en el día 7, las imágenes FIB-SEm muestran matriz ósea de colágeno en proceso de mineralización por osteoblastos en defectos tratados con NMP (Figuras 55 y 56).

Los efectos de NMP en la expresión de genes (COL1A1 y RunX2) se evaluaron más in vivo mediante el tratamiento del defecto tibial de ratas con NMP. Las muestras de hueso se recogieron y evaluaron mediante qRT-PCR en diferentes momentos; 3, 7 y 14 días y se mostró que la expresión de COL1A1 y RunX2 ya estaba significativamente regulada al día 3 después de la cirugía (Figuras 57 y 58).

La diferenciación de osteoblastos se reguló (Figura 52) debido a los efectos de NMP en el gen osteoblástico marcadores ALP, OPN y RunX2 (Figuras 43, 45, 47 y 57). La presencia de iones de magnesio y calcio aumenta la expresión de los genes del fenotipo osteoblástico. El magnesio aumenta la expresión de ALP, OPN y RunX2. Por otro lado, el calcio aumenta la expresión de Col1.

La NMP también mejoró la proliferación de osteoclastos (Figuras 49 y 53). NMP, que es rico en magnesio y calcio, mejoró la proliferación de osteoclastos y la mineralización de los defectos de regeneración.

La síntesis de colágeno también se reguló positivamente en los defectos tratados con NMP (Figuras 49 y 51) porque NMP mejoró la expresión de COL1A1 (Figuras 46 y 58).

Conclusiones

En resumen, sintetizamos un biomaterial nanocristalino 2D hecho de Mg-Na-(HP04)-(P04). Las dispersiones en agua de los nanocristales de NMP dieron como resultado la constitución de un hidrogel físico que tenía un comportamiento tixotrópico que era fácil de inyectar.

Las propiedades físicas de este nuevo material se pueden adaptar variando la fracción molar de NaOH-Mg(OH)2-H3PO4.

Los ensayos de viabilidad celular con células de fibroblastos humanos en contacto directo con el hidrogel NMP mostraron su biocompatibilidad. La expresión de ARNm in vitro de mBMC cultivadas en NMP mostró la regulación positiva de genes (RunX2, ALP, OPN, OCN y COL1A1). Además, mejoró la regeneración ósea y la osteointegración al estimular la diferenciación y la actividad de las células óseas; osteoblastos, osteoclastos y el colágeno.

Ejemplo 2 - Síntesis de otros geles

Aquí, describimos la síntesis de materiales nanocristalinos con morfología plaquetaria. Los nanocristales 2D se caracterizaron utilizando una variedad de métodos analíticos. Los nanomateriales se basan en una nueva familia de materiales con la siguiente composición MIM11(HP0 4)2-(P0 4)3- donde Ml= Na+ y M11 = Mg2+ solo o en combinación con Fe2+.

Los nanocristales sintetizados formaron suspensiones coloidales que se comportaron como hidrogeles físicos que presentaron estabilidad a largo plazo, tixotropía, inyectabilidad y alta área superficial. Aquí, mostramos además un método fácil y escalable para sintetizar nanomateriales 2D obtenidos por una ruta de precipitación simple. La facilidad de síntesis y las interesantes propiedades fisicoquímicas de estos materiales abren la puerta a aplicaciones prometedoras en catálisis, deposición capa a capa y electrodos para baterías.

Sección experimental

Materiales y métodos

Sintetizamos diferentes formulaciones M1M11(HP04)2-(P0 4)3- donde Ml= Na+ y M11 = Mg2+ solo o en combinación con Fe2+ .

FeCl4H20 y Mg(OH)2 fueron comprados a Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI, USA).

N anocristales 2D de MgNa(HP04)2 (P04)3- Se realizó una suspensión coloidal estable de nanocristales 2D utilizando las siguientes condiciones. Se disolvieron 85 mg de Mg(OH)2 (1,45 mmol, fracción molar 0,14) en 2,2 ml de H3PO4 1,5 M (3,30 mmol, fracción molar 0,31). Tras la disolución completa de Mg(OH)2, se añadieron 3,8 ml de NaOH 1,5 M (5,7 mmol, fracción molar 0,55) bajo agitación vigorosa. La adición de NaOH provocó la formación instantánea de una suspensión coloidal blanca que después de 6 minutos cambió a un estado sólido de color gris. El pH final de la suspensión coloidal fue de 8,46. Después de 2 horas, la suspensión coloidal se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos y se descartó el sobrenadante. El precipitado sólido se lavó con etanol para eliminar el exceso de agua, se secó al vacío a temperatura ambiente y se almacenó para su caracterización.

Combinación de FeCl4H20 y Mg(OH)2

Se disolvieron 60 mg de FeCl4H2O (0,3 mmol, fracción molar 0,02) y 90 mg de Mg(OH)2 (1,54 mmol, fracción molar 0,12) en 2,6 ml de H3P041,5 M (3,9 mmol, fracción molar 0,31) y se añadió a esta solución se añadieron 4,5 ml de NaOH 1,5 M (6,75 mmol, fracción molar 0,55) para producir una suspensión coloidal de color verde pálido. El pH final fue de 8.10. La mezcla se procesó como se describe para Mg.

Síntesis de MgNa(HP04)2(P04)3Dispersión coloidal usando diferentes fuentes de Mg

La dispersión coloidal con Mg también se obtuvo utilizando cloruro de magnesio (MgCl26H2O) en lugar de hidróxido de magnesio (Mg(OH)2). La reacción se llevó a cabo disolviendo 667,5 mg de MgCl26H2O (3,275 mmol) en 2,5 ml de agua desionizada y 935 mg de Na2HP04 (6,525 mmol) en 10 ml de agua desionizada. Después de disolver los sólidos, el Na2HP04 se vertió en la solución de MgCb6H2O con agitación. La resultante dispersión coloidal tuvo un color blanco y 20 minutos después del comienzo de la reacción se obtuvo un gel tixotrópico gris. También se obtuvo NaMg(HPO 4)2-(P04)3- reemplazando Mg(OH)2 con óxido de magnesio (MgO). Brevemente, se disolvieron 160 mg de MgO en 11,2 ml de H3P04 1,5 M y se añadieron 16,8 ml de NaOH 1,5 M bajo una agitación vigorosa. La suspensión coloidal tenía un color blanco y después de 10 minutos se obtuvo un gel tixotrópico gris.

También se obtuvo NaMg(HP04)2-(P0 4)3 reemplazando el Mg(OH)2 por óxido de magnesio (MgO). En resumen, se disolvieron 160 mg de MgO en 11,2 ml de H3P04 1,5 M y se añadieron 16,8 ml de NaOH 1,5 M bajo fuerte agitación. La suspensión coloidal tenía un color blanco y después de 10 minutos se obtuvo un gel tixotrópico gris. La sustitución de NaOH por tripolifosfato de sodio (Na3P3O10) también permitió la producción del gel M1M11(HP04)2-(P0 4)3-. Brevemente, se disolvieron 110 mg de MgCl26H2O (0,545 mmol) en 2,5 ml de agua desionizada y se añadieron 12,5 ml de solución de NaOH 0,2 M y Na3P3O10 al 15% con agitación.

Mezclas a gran escala

La mayor parte de la suspensión coloidal descrita anteriormente se puede preparar en lotes de pequeño volumen de 50 ml. Usando las condiciones reportadas, estudiamos la escalabilidad de la síntesis utilizando un sistema simple "2 en 1" con un tubo conectado a un reservorio de una solución de NaOH (1.5 M) y el otro tubo conectado a un reservorio que contiene una solución de H3P04 (1.5 M) y Mg(OH)2 (0,6 M). Para obtener la suspensión coloidal de NaMg(HP0 4)2-(P0 4)3-, la velocidad mínima de flujo de las dos soluciones dentro del tubo para provocar un régimen turbulento fue con un número de Reynolds de >4000. Bajo estas condiciones, el flujo turbulento en el punto de intersección proporciona una buena mezcla de las dos soluciones y un método para la producción continua de la suspensión coloidal.

Caracterización

Los patrones de difracción de rayos X de los precipitados secos se registraron con un Bruker D8 Advance (Bruker AXS GmbH, Karlsruhe, Alemania) de 5° a 58° 2theta con fuente de cobre (lcu,Ka = 1,54 A) a 40 kV y 40 mA y detector GADDS. Los patrones de difracción de los precipitados secos que contenían Fe se registraron con un Bruker D8 Discover de 5° a 58° 2theta con fuente de cobalto (lca,Ka = 1.79 A) a 35 kV y 45 mA y detector GADDS. Los patrones de difracción se procesaron con el software EVA (Bruker AXS GmbH, Karlsruhe, Alemania) y la composición de fases se determinó comparando los espectros adquiridos con las fases identificadas en la base de datos PDF-4 del Centro Internacional de Datos de Difracción (ICDD).

La espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR) de los precipitados secos se registró utilizando un Perkin Elmer Spectrum Two (Perkin Elmer Inc, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) con un solo diamante de rebote para la reflectancia total atenuada (ATR). Los espectros se registraron a temperatura ambiente de 450 a 4000 cm-1 con una resolución de 4 cm-1 y 64 barridos.

Se realizó análisis termogravimétrico (TGA) para calcular la cantidad de agua de cristalización de los precipitados secos (SOT Q600 TA Instruments, TA Instruments-Waters l.l.C. New Castle, EE. UU.). La TGA se realizó en modo vertical en una bandeja de platino de 30 a 800 °C utilizando una velocidad de calentamiento de 5 °C/min, y en atmósfera de aire con un flujo de purgación de 100 ml min-1.

Se llevaron a cabo mediciones de potencial zeta para evaluar la carga superficial de los nanocristales utilizando un Malvern Nano ZS equipado con células capilares plegadas desechables (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Reino Unido). La concentración de nanocristales utilizada para las mediciones se fijó en 20 mg mL-1 y la temperatura se mantuvo constante a 25 °C.

La morfología de los diferentes nanocristales obtenidos fue revelada por Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) usando un FEI Inspect F-50 FE-SEM (FEI Inc, Hillsboro, Oregon, USA) operado a 10 kV. Previo análisis, las muestras se pulverizaron logrando una capa de recubrimiento homogénea de 2 nm Pt (Leica EM ACE600, Leica Microsystems Inc, Concord, Ontario, Canadá). La composición elemental de la suspensión coloidal se determinó mediante espectroscopía de análisis de rayos X de dispersión de energía (EDS) realizada con un EDAX Octane Super Detector de deriva de silicio y analizado con el software TEAM™ versión 4.0.2 (AMETEK, Inc. Berwyn, PA, EE. UU.). El dispositivo se instaló en un F-50 FE-SEM (FEI Inc, Hillsboro, Oregón, EE. UU.) operado en modo de electrones secundarios a 10 kV. Se llevó a cabo un análisis sin estándar ZAF (número atómico (Z), absorción (A) y fluorescencia (F)) en cada uno de los espectros de EDS utilizando eZAF Smart Quant Results Acquisition (software TEAM™ versión 4.0.2) para determinar la porcentaje atómico (at. %) de los nanocristales lavados. Los espectros EDS se adquirieron a 10 kV durante 2 min con una tasa de recuento de 3000 recuentos/s.

El área de superficie específica de los productos se midió mediante el método Brunauer-Emmett-Teller (BET) utilizando isotermas de adsorción y desorción de nitrógeno en un analizador de adsorción de gas automatizado Tristar 3000 (Micromeritics Instrument Corporation Norcross, Georgia, EE. UU.).

La fuerza requerida para inyectar las suspensiones coloidales tixotrópicas a través de una aguja de insulina de 160 |jm de diámetro interno se midió utilizando un software Mach-1 V500cs y Mach-1 Motion versión 4.3.1 (Biomomentum Inc., Laval, Canadá). La fuerza se midió con una celda de carga multieje de 70 N (resolución de 0,007 N) y tasa de adquisición de 100 Hz. Se cargó el gel en la jeringa evitando la presencia de burbujas y luego se insertó el émbolo en la celda de carga. El valor de la fuerza se midió aplicando una velocidad vertical constante de 1 mm s-1 (resolución de 0,1 jm).

Resultados y discusiones

Las suspensiones coloidales formaron geles físicos.

Las dispersiones coloidales mostraron un comportamiento tixotrópico formando un gel físico. Los nanocristales sintetizados presentaron una morfología bidimensional para formar un hidrogel físico con un comportamiento tixotrópico similar al de la arcilla. Las arcillas son poli-iones en forma de placa con una distribución de carga heterogénea que forma un gel físico en agua a concentraciones superiores a 40 mg/ml debido a la presencia simultánea de cargas positivas y negativas que dan lugar a interacciones electrostáticas y de Van der Waals. Esto permite que el gel se comporte como un material tixotrópico debido a la formación de una red tridimensional de partículas conocida como estructura de "castillo de naipes". Los materiales tixotrópicos se pueden licuar aplicando energía mecánica, lo que permite que el gel físico se comporte como un líquido; luego, cuando se elimina la tensión mecánica, los movimientos brownianos hacen que las partículas entren en contacto para reformar la red 3D y la dispersión licuada se vuelve gelatinosa nuevamente. Al igual que en las arcillas, la presencia simultánea de cargas positivas y negativas permitió que la nueva dispersión de nanocristales sintetizados formara un hidrogel físico con un comportamiento "similar a la arcilla". Como resultado de sus propiedad reológicas únicas, el gel NMP podría inyectarse fácilmente a través de una aguja de insulina y, después de la inyección manual, la suspensión coloidal recuperaría un comportamiento similar al de un sólido. Después de la inyección, el material recupera rápidamente su estado sólido y se comporta nuevamente como sólido, esta es una característica importante para el procedimiento de aplicación de recubrimientos.

Los datos de FT-IR, el patrón de difracción de rayos X de los polvos secos y lavados demostraron la naturaleza nanocristalina de los nanocristales debido a la presencia de amplios picos de difracción.

Ejemplo 3- De la pasta de dientes a la "pasta de implantes": un nuevo producto para la limpieza de implantes dentales

Resumen

Este estudio tuvo como objetivo desarrollar una pasta profiláctica libre de compuestos orgánicos optimizada para la limpieza de implantes dentales (en lo sucesivo denominada "pasta de implante"), y que al mismo tiempo es capaz de preservar la integridad de la superficie de los implantes dentales.

La pasta de implantes se desarrolló combinando un agente espesante inorgánico hecho de una suspensión coloidal nanocristalina (fosfato de magnesio nanocristalino) y nanopartículas de pulido de sílice coloidal hidratada. La formulación de pasta de implante se optimizó para descontaminar superficies de titanio recubiertas con una biopelícula oral y se comparó con una pasta de dientes comercial (Colgate Total; Colgate-Palmoliven, EE. UU.). Se analizo la morfología de la superficie, la carga y adherencia bacterianas y las propiedades químicas de las superficies de titanio y se realizaron comparaciones entre diferentes productos mediante el test de ANOVA unidireccional y el test t de Student para muestras independientes.

El uso de la pasta profiláctica inorgánica hecha de gel de fosfato de magnesio nanocristalino (10 % p/p) y sílice hidratada (30 % p/p) fue superior al cepillado solo y al dentífrico Colgate para eliminar los contaminantes de las superficies de titanio y no provocó alteraciones en la superficie. La naturaleza tixotrópica e inorgánica de la pasta de implante de fosfato de magnesio nanocristalino es ideal para limpiar las superficies de los implantes porque, a diferencia de Colgate y otras pastas dentales comerciales, no contiene espesantes de base orgánica que puedan adherirse fuertemente a las superficies de titanio y, por lo tanto, cambiar la química de la superficie. Y además, no desgasta el titanio.

Introducción

El gel de fosfato de magnesio nanocristalino (NMP) es una nueva suspensión coloidal inorgánica. Es estable, biocompatible y tixotrópico. A diferencia de otros materiales inorgánicos tixotrópicos, como las arcillas de silicato, el gel NMP no contiene silicatos, que pueden ser más abrasivos en las superficies de los implantes. Este nuevo gel también es rico en cationes Na+ que tienen un efecto tóxico sobre las bacterias y pueden alterar la estructura del biofilm al desplazar los cationes divalentes (Ca++). Las pastas dentales convencionales contienen fluoruro que puede corroer el Ti, compuestos orgánicos que pueden alterar la química de su superficie y abrasivos que pueden dañar la microtextura de su superficie. Por estos motivos, planteamos la hipótesis de que las pastas profilácticas libres de flúor y compuestos orgánicos serían más eficientes para la limpieza de los implantes dentales. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo desarrollar y optimizar una nueva "pasta de implantes" diseñada específicamente para la descontaminación de implantes dentales.

Materiales y métodos

El diseño del estudio fue revisado y aprobado por el Comité de la Junta de Ética en Investigación de la Universidad McGill (solicitud 14-464 GEN). Todos los sujetos que participaron en este estudio han firmado consentimientos informados por escrito antes de su participación.

Síntesis de materiales

La pasta de implantes se desarrolló combinando un agente espesante hecho de un gel inorgánico de fosfato de magnesio nanocristalino (NMP) con diferentes concentraciones de un agente abrasivo de nanopartículas de sílice hidratadas. En un procedimiento típico para sintetizar el gel de NMP, se disolvieron 300 mg de Mg(OH)2 (5,14 mmol; fracción molar = 0,144) en 8,1 ml de H3PO4 1,5 M (12,15 mmol; fracción molar = 0,34), seguido de la adición de 12,3 ml de solución de NaOH 1,5 M (18,45 mmol; fracción molar 0,516) En otro procedimiento típico, se disolvieron 270 mg de Mg(OH)2 (4,62 mmol; fracción molar = 0,13) en 7,5 ml de H3P04 1,5 M (11,25 mmol; fracción molar = 0,31), seguida de la adición de 13,5 ml de solución de NaOH 1,5 M (20,25 mmol; fracción molar = 0,56). La adición de la solución de NaOH provocó la formación instantánea de una suspensión líquida blanca compuesta por nanocristales con un tamaño uniforme de 50 nm. El pH de la suspensión permaneció constante durante 4 minutos (8,3), luego disminuyó lentamente y se estabilizó en 7,8 después de 30 minutos para el primer procedimiento, mientras que permaneció constante durante 4 minutos en un pH 10,1 y luego disminuyó lentamente y se estabilizó en pH 9,6 después de 30 minutos. Para el segundo procedimiento la suspensión líquida cambió su color de blanco a gris y poseía un comportamiento sólido y tixotrópico con la suspensión final compuesta por nanocristales 2D con estructura ondulada. Luego se modificó el contenido de sólidos de la pasta agregando 20, 30, 50 o 60 % de nanopartículas de sílice hidratada con un tamaño promedio de partículas agregadas de 0,2-0,3 pm. La adición de nanopartículas de sílice hidratada aumentó la viscosidad del gel dependiendo de la concentración utilizada, sin embargo, el comportamiento tixotrópico y el pH del gel inicial no se vieron afectados (ver Figura 59A).

Las fotografías de un cepillo giratorio cargado con el gel NMP, la pasta de implantes desarrollada y la pasta de dientes Colgate (a-c, respectivamente) y las fotografías de los tubos Eppendorf que contienen el gel NMP, la pasta de implantes y la pasta de dientes Colgate (d-f, respectivamente) claramente ilustran que el gel y la pasta de implante desarrollada son más tixotrópicos que la pasta de dientes Colgate. La pasta de dientes Colgate fluye sin aplicar cizallamiento mecánico mientras que las otras pastas no fluían.

Preparación de muestras

En este estudio se utilizaron discos de titanio mecanizados y pulidos (grado 2, 0,5 de diametro y 1,0 mm de espesor; McMaster-Carr, Cleveland, OH, Estados Unidos). Los discos se ultra-sonicaron secuencialmente en agua desionizada, acetona y etanol durante 15 minutos cada uno, antes de secarlos por una noche en un horno de vacío (lsotemp, Fisher Scientific, EE. UU.).

Contaminación por biopelícula

La biopelícula se desarrolló en las superficies de titanio siguiendo un protocolo estándar descrito previamente; consulte Gosau, M., et al., Effect of six different peri-implantitis disinfection methods on in vivo human oral biofilm. Clinical Oral Implants Research, 2010. 21(8): p. 866-872; ldlibi, AN., et al., Destruction of oral biofilms formed in situ on machined titanium (Ti) surfaces by cold atmospheric plasma. Biofouling, 2013. 29(4): p. 369- 379; Rupf, S., et al., Removing biofilms from microstructured titanium ex vivo: a novel approach using atmospheric plasma technology. PloS one, 2011. 6(10): p. e25893; y Schreiber, B., et al., Modified implant surfaces show different biofilm compositions under in vivo conditions. Clinical oral implants research, 2009. 20(8): p. 817-826.

Se tomaron impresiones de alginato para producir modelos de estudio para la mandíbula superior de cada participante. Se produjeron férulas de copoliéster termoplástico de 1 mm de espesor que cubrían todos los dientes maxilares. Las férulas se utilizaron para fijar discos de Ti en la cara bucal en la región de los premolares y molares, cada férula albergaba 12 discos de Ti. Se pidió a los participantes que usaran las férulas durante 24 horas para permitir que se acumulara una biopelícula blanda en las superficies de Ti. Se instruyó a los participantes para que quitaran y guardaran las férulas mientras bebían o comían en solución salina tamponada con fosfato. Después de 24 horas, se recolectaron las férulas, los discos se lavaron con una solución salina estéril (9%) y se almacenaron para su posterior análisis.

Limpieza de muestras

Se usó un cepillo giratorio para limpiar las muestras contaminadas con biopelículas con enfriamiento intensivo en agua a una velocidad de -2500 rpm. El cepillo se mantuvo perpendicularmente en suave contacto con las superficies de las muestras contaminadas mientras se movía en un movimiento circular.

Las muestras se cepillaron inicialmente sin pasta durante 1, 2 y 5 minutos con el fin de optimizar el tiempo de cepillado para que causara el menor daño posible a las superficies (n=6 para cada grupo). Las formulaciones de pasta de implantes; Luego se evaluaron geles que contenían 10 % (p/p) de NMP y 20, 30, 50 ó 60 % (p/p) de sílice hidratada en agua con los parámetros de cepillado optimizados (n=3 para cada grupo). Después de eso, las muestras se cepillaron con la pasta de implante optimizada y se compararon con superficies limpiadas solo con cepillos rotatorios y otras cepilladas con una pasta dental comercial (Colgate Total; Colgate-Palmoliven, Nueva York, Estados Unidos; n=6 para cada grupo) .

Métodos de análisis

Las superficies de Ti se analizaron antes y después de la contaminación por biopelícula y el cepillado posterior utilizando los siguientes métodos:

Espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS)

XPS es la técnica de análisis de superficies más utilizada que mide la composición elemental, el estado químico y el estado electrónico de los elementos dentro de un material. La composición química de las superficies de Ti se analizó utilizando un espectrómetro de fotoelectrones de rayos X (Thermo Fischer Scientific Inc, East Grinstead, Reino Unido). El instrumento estaba equipado con una fuente de radiación monocromática de rayos X Al Ka (1486,6 eV, (l) 0,834 nm) y una cámara de ultra alto vacío (10-9 torr). Para todos los discos, se hicieron análisis en el rango de 0-1350 eV con una energía de paso de 200 eV y una resolución de 1,0 eV. Se usó una pistola de inundación para neutralizar la carga superficial en todas las muestras. Las energías de unión, las áreas de los picos y las relaciones de concentración atómica se obtuvieron utilizando la función de ajuste de curvas del software de análisis Avantage (5.932v) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.).

Ensayos de bacterias vivas/muertas y microscopía de fluorescencia (FM)

Se utilizó el kit de tinción vivo/muerto (Baclight Bacterial Viability Kit L7012, Molecular Probes, Carlsbad, EE. UU.) y microscopía de fluorescencia para evaluar la viabilidad y la unión de bacterias sobre los discos de Ti contaminados y limpios (n = 6 para cada grupo). La tinción viva/muerta se preparó diluyendo 1 pL de SYTO 9 (excitación(l) = 485 nm, emisión = 498 nm) y 1 pL de yoduro de propidio (excitación = 535 nm, emisión = 617 nm) en 1 ml de agua destilada. Los discos se colocaron en una placa de 48 pocillos y se añadieron 500 pL de la mezcla de reactivos a cada pocillo seguido de incubación a temperatura ambiente y en la oscuridad durante 15 min.

A continuación, cada disco se colocó cuidadosamente en un portaobjetos de vidrio, se cubrió con aceite de montaje y se almacenó en un espacio oscuro a 4 °C hasta su posterior procesamiento. Los discos se evaluaron usando un microscopio de fluorescencia vertical (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Gottingen, Alemania) equipado con una cámara digital (AxioCam MRm Rev. 3, Carl Zeiss Microscopy, Gottingen, Alemania) y operado con un software de procesamiento de imágenes (ZEN; Carl Zeiss Microscopy GmbH, Gotinga, Alemania). Para cada disco, se capturaron imágenes de cinco ubicaciones seleccionadas al azar; una en el centro y las otras cuatro desde los cuartos de la superficie de Ti usando un objetivo de 20x. Se calcularon las medias de las áreas fluorescentes rojas (células muertas), las áreas fluorescentes verdes (células viables) y la fluorescencia total (bacterias totales) por área de campo microscópico estándar (448x335 = 0,15 mm2) (expresadas como AU) utilizando el software de análisis de imágenes Cell Profiler. (Broad Institute of MIT y Harvard, Massachusetts, EE. UU.).

Microscopio electrónico de barrido (SEM)

Las superficies de Ti se escanearon antes y después de la contaminación por biopelícula y después de cada procedimiento de limpieza para visualizar los contaminantes de la superficie o cualquier cambio topográfico. Los discos de Ti limpios se escanearon con SEM (FE-SEM S-4700, Hitachi, Japón) sin más preparación, mientras que los discos contaminados se prepararon de la siguiente manera: los discos se fijaron en glutaraldehído (2,5 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS); PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria) durante 2 horas y se lavaron 5 veces durante 10 minutos en PBS, antes de deshidratarlos en concentraciones ascendentes de etanol (30 -100 % v/v, 15 min cada uno). A continuación, los discos se secaron usando CO2 en punto crítico (Ladd Research Critical Point Dryer). Todos los discos se montaron en montas de muestra SEM y se cubrieron con oro. Se seleccionó el modo SE con un voltaje de aceleración de 20 kV y la presión de vacío se mantuvo por debajo de 1x10-5 torr. Para la comparación directa de la topografía de la superficie, se seleccionó el mismo aumento de x10.000 para todas las muestras.

Microscopio de barrido láser confocal

Se utilizó un microscopio confocal LEXT 30 (Olympus America Inc., PA) para evaluar la rugosidad de la superficie de los discos de Ti pulidos antes y después de la descontaminación. La rugosidad superficial se caracterizó con parámetros de perfil de rugosidad [rugosidad media (Ra) y rugosidad cuadrática media (Rq)]; un método ampliamente utilizado para evaluar la rugosidad de la superficie de los implantes. Todos los valores se determinaron a una longitud de corte de 0,08 mm en 50 secciones (longitud de evaluación de 4 mm) y se evaluaron utilizando el software LEXT OLS4000 (Olympus, America Inc., PA). Se usaron cuatro discos para cada grupo y se tomaron medidas en cinco áreas aleatorias de cada disco.

Análisis estadístico

Las variables de resultado primarias fueron la composición química de la superficie, la rugosidad de la superficie y la adhesión y viabilidad bacteriana. Para cada técnica de limpieza, los datos de las variables primarias se analizaron estadísticamente con base en un diseño pareado para comparar las mediciones antes y después de la contaminación y descontaminación. También se analizaron y compararon los resultados de diferentes métodos de descontaminación.

Se utilizo el de ANOVA de medidas repetidas y el test t de Student de muestras pareadas para comparar los resultados de los mismos grupos en diferentes puntos de tiempo de tratamiento, mientras que el test de ANOVA unidireccional y el test t de student de muestras independientes se realizaron para comparar los resultados de diferentes grupos y técnicas. Los análisis de datos se llevaron a cabo utilizando el software SPSS versión 22 (SPSS Inc., IBM Corporation, Somers, NY, EE. UU.) y Origin 9.0 (Origin lab, Northampton, MA, EE. UU.). Se estableció un valor de p < 0,05 para representar una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos.

Resultados

Química superficial de superficies limpias y contaminadas con biopelículas

Los espectros XPS de superficies limpias mostraron la presencia de los siguientes picos principales: O1s (Oxígeno), C1s (Carbono), Ti2p (Titanio) y N1s (Nitrógeno) (consulte la Figura 60A y 8). Las señales C1s y N1s indican la contaminación de la superficie, mientras que las señales Ti2p demuestran la presencia de la capa de óxido de TiO2. La contaminación por biopelícula de las superficies de Ti aumentó significativamente los niveles de C y N a expensas de O y Ti, lo que indica que los contaminantes eran principalmente de naturaleza orgánica (Figura 60A y 8). La señal de Ti2p casi desapareció de los estudios espectrales de las superficies contaminadas con biopelícula, lo que indica que la biopelícula cubre por completo las superficies de Ti con los contaminantes orgánicos (Figura 60A). Nótese que el orden de las columnas en el gráfico de barras de la Figura 608 corresponde al establecido en la leyenda presentada entre (B) y (C). Además, en el gráfico de barras, a: significativamente diferente del grupo de control (Ti limpio), b: significativamente diferente del grupo contaminado con biopelícula, c: significativamente diferente de las superficies de Ti cepilladas durante 1 minuto, y d: significativamente diferente de las superficies de Ti cepilladas durante 2 minutos (p < 0,05).

Optimización del tiempo de cepillado

Cepillar las superficies de Ti durante 1 minuto redujo significativamente los niveles de C y N y aumentó las concentraciones de O y Ti (Figura 608). Aumentar el tiempo de cepillado a 2 y 5 minutos no logró más beneficios de limpieza pero indujo rayones en la superficie como se ve en las imágenes SEM (Figura 60C). Así, el tiempo de cepillado se fijó en 1 minuto.

Optimización de la formulación de pasta de implantes

La composición del gel de NMP se optimizó como se mencionó anteriormente para obtener un pH alcalino de 9,6. al 10% p/p.

Las superficies contaminadas con biofilm se cepillaron con gel NMP optimizado (10% con respecto al contenido de agua) con y sin sílice hidratada. Las imágenes SEM mostraron que las superficies limpiadas con el gel MNP y el gel con sílice hidratada al 30 % estaban limpias sin cambios notables en su topografía (ver Figura 61). Las muestras limpiadas con el gel que contenía un 30% de sílice hidratada fueron significativamente diferentes de las muestras contaminadas en términos de composición elemental, como lo muestra la XPS, mostraron niveles más altos de Ti, O y niveles más bajos de C, N, sílice (Si) y magnesio (magnesio). El gel de MNP con menos sílice también disminuyó los niveles de C y N, pero fueron menos eficientes que el gel que contenía un 30 % de sílice hidratada. Por otro lado, las concentraciones más altas de sílice (> 30 %) no mejoraron el rendimiento de la limpieza, pero provocaron la contaminación de la superficie con residuos de pasta de implante, incluido el silicio. Las flechas pequeñas en la Figura 61 indican las áreas donde se acumula el sílice remanente en las superficies de Ti.

Esto también es visible en la Figura 62. Hay que tener en cuenta que el orden de las columnas en el gráfico de barras de la Figura 62 (de izquierda a derecha) corresponde al establecido de arriba a abajo en la leyenda. Además, en el gráfico de barras, a: significativamente diferente del grupo de control, b: significativamente diferente del grupo contaminado con biopelícula, c: significativamente diferente del grupo de gel NMP, d: significativamente diferente de las superficies de Ti cepilladas con el gel que contiene 20 % de sílice hidratada, e: significativamente diferente de las superficies de Ti cepilladas con el gel que contiene 30 % de sílice hidratada, y f: significativamente diferente de las superficies de Ti cepilladas con el gel que contiene 50 % de sílice hidratada (p < 0,05).

En base a estos resultados, la formulación de pasta de implante optimizada fue la que contenía 10 % de gel de NMP y 30 % de sílice hidratada. Limpieza de muestras no contaminadas (control) con la pasta de implante optimizada. El cepillado de Ti no contaminado con la pasta de implante optimizada aumentó los niveles superficiales de Ti y disminuyó los de C (consulte la Figura 63). En esta figura, a: significativamente diferente del grupo de control.

La pasta dental comercial no mostró un cambio en los niveles de Ti o C. Esto indica que la pasta de implante optimizada también puede eliminar los compuestos que contienen carbono que se adsorben de la atmósfera y generalmente se detectan en superficies limpias de Ti sin inducir un aumento significativo en su rugosidad, como se muestra con microscopía confocal (consulte la Figura 64). En esta figura: *: significativamente diferente de las superficies de Ti limpias, a: significativamente diferente de las superficies de Ti limpiadas con el cepillo de profilaxis, b: significativamente diferente de las superficies de Ti cepilladas con pasta de implante optimizada (p < 0,05).

La pasta de implantes optimizada frente a la pasta de dientes Colgate

La pasta de implante optimizada redujo significativamente la concentración atómica de los contaminantes de las superficies (C y N) y aumentó los niveles de O y Ti. Sin embargo, no indujo ningún cambio significativo en la rugosidad de la superficie de Ti (ver Figura 64). Ambos resultados contrastan con los obtenidos para superficies limpiadas con el cepillo solo o el cepillo con pasta dental Colgate (Figura 65A y B). La pasta de dientes aumentó significativamente los niveles de C y la rugosidad de la superficie de Ti.

Nótese que el orden de las columnas en el gráfico de barras (de izquierda a derecha) de la Figura 65 corresponde al establecido en la leyenda (de arriba a abajo). Además, en el gráfico de barras, a: significativamente diferente del grupo de control, b: significativamente diferente del grupo contaminado con biopelícula, c: significativamente diferente de las superficies de Ti limpiadas con el cepillo de profilaxis, d: significativamente diferente de las superficies de Ti cepilladas con el implante optimizado -pegar (p < 0,05).

La pasta de implante optimizada y la pasta dental Colgate fueron capaces de eliminar las bacterias de las superficies de Ti contaminadas con biopelículas, alcanzando niveles de bacterias comparables a los encontrados antes de la contaminación por biopelículas (Figura 66A y B).

Hay que tener en cuenta que el orden de las columnas en el gráfico de barras (de izquierda a derecha) de la Figura 66 corresponde al establecido en la leyenda (primera línea y luego segunda línea de izquierda a derecha) presentada entre (A) y (B). Además, en el gráfico de barras, a: significativamente diferente del grupo de control, b: significativamente diferente del grupo contaminado con biopelícula, c: significativamente diferente de las superficies de Ti limpiadas con el cepillo de profilaxis, d: significativamente diferente de las superficies de Ti cepilladas con el gel que contiene Sílice hidratada al 30% (p < 0,05).

Las imágenes SEM mostraron rasguños en las superficies y residuos de pasta de dientes en las superficies limpiadas con pasta de dientes Colgate, pero no se pudieron ver rasguños ni residuos con la pasta de implante optimizada (Figura 61).

Discusión

Aquí presentamos una nueva pasta para implantes especialmente diseñada y optimizada para la descontaminación de la superficie del implante. Desinfecta eficazmente los implantes de titanio contaminados sin impactos negativos aparentes en la integridad de su superficie.

En este estudio, utilizamos un modelo de biopelícula in vivo porque ofrece la oportunidad de evaluar superficies de implantes en condiciones clínicas realistas; formación de placa compuesta, coadherencia de microorganismos y película salival bajo las fuerzas de eliminación del flujo salival y las actividades de masticación. Se han probado y validado varios modelos de biopelículas in vitro para estudiar las interacciones bacterianas en la superficie del implante. Esto incluye, por ejemplo, los sistemas basados en placas de microtitulación comúnmente utilizados. Sin embargo, no consiguen simular con precisión la compleja estructura del biofilm, la dinámica de su patogenicidad y los determinantes ecológicos.

Los instrumentos de profilaxis, como cepillos y copas de goma, se utilizan para eliminar las biopelículas adheridas a las superficies de los implantes con o sin pastas de profilaxis. En este estudio, usamos cepillos rotatorios para limpiar superficies de titanio porque son económicos y accesibles en comparación con los cepillos de titanio y sus cerdas de plástico deben ser delicadas con el titanio. Se descubrió que las copas giratorias dejaban restos de partículas de goma en las superficies de los implantes después de la limpieza. Además, algunos materiales de copa son demasiado abrasivos y pueden dañar la superficie de Ti.

En el presente estudio, inicialmente se utilizaron casquillos de profilaxis para descontaminar las superficies de los implantes sin pasta. El propósito de este procedimiento fue optimizar el tiempo de cepillado y excluir el posible efecto dañino de la técnica de cepillado. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que optimizó el tiempo requerido para la descontaminación de Ti usando el cepillo de profilaxis. Los resultados mostraron que el cepillado de la superficie del implante contaminada con biopelícula durante 1 minuto fue capaz de eliminar los contaminantes de la superficie de Ti de manera eficiente (Figura 60 A y B), sin inducir arañazos o cambios en la superficie (Figura 60 C y D).

Sin embargo, el cepillado durante más de un minuto introdujo rayones visibles en las superficies de Ti sin mejorar los resultados de limpieza. De hecho, aumentar el tiempo de cepillado a 2 y 5 minutos afecta negativamente a la topografía de la superficie de Ti y a los arañazos superficiales inducidos (Figura 60). Este hallazgo podría atribuirse a la suavidad del metal de Ti y su poca resistencia al desgaste físico. Por lo tanto, los cepillos indujeron arañazos en la superficie de Ti cuando las revoluciones del cepillado mecanico aumentaron más de 2500 rpm. Para confirmar estos resultados, la rugosidad de la superficie de las superficies de Ti pulidas se midió antes y después del cepillado de un minuto, lo que mostró un aumento significativo en su rugosidad. Sin embargo, la rugosidad media de la superficie (Ra) después del cepillado fue de solo 0,018 ± 0,004 jm, lo que se encuentra dentro del umbral Ra (-0,2 |jm) que no provoca una mayor alteración en la carga microbiológica de la superficie.

En consecuencia, el cepillado durante 1 minuto (2500 rpm) de las superficies de los implantes de Ti contaminados pudo descontaminarlos sin causar abrasión mecánica, aunque no se logró la eliminación completa de los contaminantes y ni el restablecimiento de la química original de Ti. Esto indica la eficacia limitada de los cepillos para descontaminar las superficies de Ti, lo que exige el uso de un dentífrico o una pasta profiláctica.

Un dentífrico generalmente se usa en combincion con cepillos para complementar la eliminación física de la placa y las manchas a través de sus aditivos químicos y físicos, o para aplicar agentes terapéuticos y preventivos a las superficies dentales. El dentífrico necesita dos ingredientes principales para lograr la limpieza mecánica; un agente abrasivo y otro espesante para mantener los abrasivos en suspensión durante el cepillado. En este estudio, desarrollamos y optimizamos la pasta de profilaxis para descontaminar las superficies de los implantes "pasta de implantes" y mejorar la eficiencia de limpieza del cepillo. Para el desarrollo de esta pasta de implante, el único espesante estaba compuesto por un gel de fosfato de magnesio nanocristalino (NMP) inorgánico, libre de silicatos. La composición del gel se optimizó para obtener un pH alcalino de 9,6 debido a que la resistencia a la corrosión del Ti es alta a este pH. Además, la pasta para implantes puede estar en contacto con las estructuras intraorales y los dientes durante varias horas cuando se utiliza para la limpieza diaria de los implantes de Ti. En consecuencia, idealmente, esta pasta de implante optimizada debe tener un pH relativamente alcalino para minimizar el daño potencial al diente o al implante.

El gel NMP optimizado tiene una biocompatibilidad y propiedades tixotrópicas similares a las de la Laponita (arcillas de silicato); el espesante inorgánico más utilizado en pastas dentales. Sin embargo, el gel de NMP optimizado tiene una consistencia estable sin necesidad de espesantes orgánicos adicionales. Esta es una ventaja de nuestro novedoso gel sobre las pastas dentales a base de arcillas que requieren espesantes orgánicos (es decir, goma xantana) para brindar una consistencia óptima. Los compuestos orgánicos incorporados podrían adherirse a las superficies de los implantes complicando su descontaminación.

El otro componente clave de la pasta de implante que contribuye a la eliminación física del biofilm es el agente abrasivo. Para nuestra pasta de implante, se eligieron nanopartículas de sílice hidratadas como abrasivos. Es un ingrediente relativamente seguro, no tóxico y en su mayoría compatible con otros ingredientes, como la glicerina y el fluoruro. Además, la baja concentración de silicatos muestra propiedades osteoconductoras que ayudan a inducir y acelerar la regeneración ósea.

Utilizamos nanopartículas de sílice hidratadas (-200-300 nm) como agente de pulido y optimizamos su contenido para obtener una abrasividad leve que elimina la placa sin rayar las superficies de los implantes. También se utilizaron para aumentar la viscosidad del gel y beneficiarse de sus propiedades de osteoconductividad. Los resultados del estudio mostraron que los mejores resultados de descontaminación se obtuvieron con el gel de NMP al 10 % que contenía un 30 % de sílice hidratada. Esta fórmula mostró una eliminación eficiente de los contaminantes orgánicos de las superficies de Ti y los cambios morfológicos/topográficos mínimos (Figuras 61 y 62). La eficacia de limpieza de la pasta de profilaxis optimizada se confirmó aún más por su capacidad para eliminar el compuesto que contiene carbono de las superficies de Ti limpias (controles), usando el tiempo de cepillado optimizado, sin alterar su aspereza (Figura 64). La caída significativa en el nivel de carbono (Figura 63) después de la limpieza confirma la eficacia de la pasta de implante en la eliminación de los compuestos que contienen carbono que normalmente se adsorben en la superficie de Ti de la atmósfera.

También se observó la eficacia de descontaminación superior de la pasta de implante en superficies contaminadas con biopelícula en comparación con el cepillo de profilaxis rotatorio y el cepillo con una pasta de dientes comercial (Figura 65). Esto confirma que la formulación optimizada de pasta de implante es capaz de eliminar los contaminantes orgánicos superficiales independientemente de la acción mecánica del cepillo rotatorio. Por otro lado, el aumento significativo en los niveles de carbono después de limpiar estas superficies con pasta de dientes Colgate indica que las pastas de dientes regulares contaminan aún más la superficie de Ti. Este resultado podría deberse al contenido orgánico de las pastas dentales que generalmente se incorporan para obtener beneficios espesantes, aglutinantes o saborizantes. Esto confirma la superioridad de la pasta de implante desarrollada en este estudio, debido a su naturaleza inorgánica, sobre las pastas disponibles actualmente.

Se observo que las bacterias adheridas a las superficies cepilladas con la pasta de implantes optimizada y la pasta dental Colgate eran comparables a las que se encuentran en las superficies de Ti no contaminadas (Figura 66). Este resultado está de acuerdo con un estudio anterior que indicó la superioridad de un cepillo de dientes y dentífricos sobre diferentes raspadores ultrasónicos para reducir la carga bacteriana de las superficies contaminadas de los implantes.

Conclusiones

La pasta de implantes inorgánica optimizada muestra una eficiencia superior en la descontaminación de implantes que la pasta de dientes Colgate de base orgánica sin dañar la integridad de sus superficies. La nueva pasta inorgánica para implantes desarrollada en este estudio puede eliminar la biopelícula de los implantes de titanio contaminados sin afectar la integridad de su superficie. La limpieza de los implantes dentales con las pastas dentales de base orgánica actuales contamina las superficies de los implantes, cambiando su carga superficial, rugosidad y química, lo que podría tener un impacto negativo en la reosteointegración.

Según el conocimiento del inventor, esta es la primera pasta especialmente diseñada y optimizada para la descontaminación de la superficie del implante. La pasta de implantes inorgánica optimizada muestra 2 veces más eficacia en la descontaminación de Ti, 3 veces menos abrasividad que una pasta de dientes normal y 2 veces menos bacterias que el cepillado solo. Por lo tanto, muestra una eficacia superior en la descontaminación de los implantes de Ti que la pasta de dientes de base orgánica sin dañar sus superficies.

Ejemplo 4 - Liberación controlada de medicamentos

Anteriormente, mostramos que los nanocristales (gel) de fosfato de sodio y magnesio son una suspensión coloidal tixotrópica osteoinductiva y se pueden inyectar a través de agujas de alto calibre y, por lo tanto, se pueden usar para intervenciones mínimamente invasivas. Aquí, investigamos cómo este gel puede también controlar la liberación de anestésico local (mepivacaína) in vitro e in vivo. También investigamos si el NMP cargado con mepivacaína podría acortar el tiempo de movilización posterior a la fractura, reducir el dolor posoperatorio y acelerar la cicatrización ósea con el objetivo final de desarrollar un biomaterial de regeneración ósea inyectable con propiedades analgésicas. Materiales y métodos

El gel (NMP) para la liberación in vitro se preparó disolviendo 54 mg de Mg(OH)2 (0,93 mmol, fracción molar 0,13) en 1,65 ml de H3P041,5 M (2,47 mmol, fracción molar 0,34), y posteriormente 2,32 ml de NaOH 1,5 M (3,78 mmol, fracción molar 0,53) bajo agitación vigorosa.

Para la liberación in vitro del fármaco se disolvió clorhidrato de mepivacaína en 1 ml de gel previamente preparado para alcanzar diferentes concentraciones de mepivacaína. El pH de la suspensión coloidal tixotrópica resultante antes de la adición de mepivacaína era de 7,95, mientras que después de la adición del fármaco cambió a 7,1. El gel mepivacaína se colocó en un tubo de diálisis Pur-l-lyzer™ con un peso molecular de corte de 12000 Da, mientras que el grupo control lo representa la mepivacaína disuelta en PBS (2% p/v) y se colocó en un tubos de diálisis con el mismo corte de peso molecular. Los tubos se incubaron en 30 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 °C, y la solución se cambió en diferentes tiempos comprendidos entre 0 y 168 horas. Para calcular la cantidad de fármaco liberado, las soluciones extraídas se analizaron con espectroscopia UV-Vis tras la absorción de mepivacaína a 263 nm. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

La acción analgésica de la mepivacaína con gel se evaluó in vivo utilizando el modelo de pata trasera de ratón. Doce ratones fueron asignados a cuatro grupos (n=3, cada uno); solución salina, mepivacaína, gel y gel mepivacaína. Cada ratón recibió una única inyección del tratamiento asignado (5 pl por vía subcutánea) en la superficie plantadora de la pata trasera. Debido al pequeño volumen inyectable dentro de la pata trasera, la cantidad de mepivacaína disuelta dentro del gel aumentó del 2 al 8% p/v. Este aumento de fármaco cambió drásticamente el pH de la dispersión coloidal gel mepivacaína final de 7,5 a 4,1, siendo demasiado ácido y posteriormente desestabilizando la estructura del gel provocando la precipitación del mismo. Para abordar este problema, se sintetizó el gel para el experimento in vivo disolviendo 69 mg de Mg(OH)2 (1,18 mmol, fracción molar 0,16) en 1,65 ml de H3PO4 1,5 M (2,47 mmol, fracción molar 0,31), y posteriormente 2,9 ml de NaOH 1,5 M (4,35 mmol, fracción molar 0,53) se añadió bajo agitación vigorosa. Para la liberación in vivo del fármaco se disolvieron 80 mg de clorhidrato de mepivacaína en 1 ml de gel preparado previamente (8% p/v). El pH de la suspensión coloidal tixotrópica resultante antes de la adición de mepivacaína fue de 9,6, mientras que después de su adición el pH disminuyó a 7,6, siendo más compatible con el pH fisiológico. La sensibilidad a los estímulos térmicos se probó utilizando calor radiante en diferentes puntos de tiempo comprendidos entre 0 y 120 minutos.

Los efectos de NMP solo, NMP combinado con mepivacaína y mepivacaína sola, sobre la movilización posterior a la fractura, el dolor posoperatorio y la cicatrización ósea se evaluaron in vivo utilizando un modelo estandarizado de fractura tibial en ratones (St-Arnaud, The Journal of steroid biochemistry and molecular biology 121, 254-256 (2010)). Treinta y dos ratones fueron asignados aleatoriamente a cuatro grupos (n=8, cada uno); solución salina, mepivacaína, NMP y NMP mepivacaína. Treinta minutos antes de la intervención quirúrgica, a cada ratón se le inyectó carprofeno (20 mg/kg; SC).

A continuación, se anestesió al animal con isoflurano (3-5 % en el momento de la inducción y 2-2,5 % durante el periodo de mantenimiento). Después de que el animal mostrara signos de estar totalmente anestesiado, se afeitó la pata derecha y se desinfectó con clorohexidina, luego, se cubrió al animal con un paño estéril. Se realizó una incisión cutánea longitudinal para exponer el tendón rotuliano derecho. El tendón fue disecado y elevado para exponer la tuberosidad tibial proximal. Se introdujo una aguja espinal de calibre 27 en el canal intramedular de la tibia. Se realizó una fractura de tibia de manera estandarizada usando una tijera (Hiltunen et al., Journal of orthopaedic research 11, 305-312 (1993)). Después de la creación de la fractura, se realizó una sola inyección posoperatoria del tratamiento asignado (20 pL) en el sitio de la fractura y se cerró el sitio quirúrgico con Vicryl 5-0. Discusión y conclusión

Se evaluó la percepción del dolor y la locomoción de los animales postoperatorios, a diferentes tiempo; 24 horas, 3 días, una semana y dos semanas después de la fractura, evaluando el reflejo protección de los ratones (Yasuda et al., Journal of pain research 6, 161 (2013)) y la carga de peso en cada pierna, respectivamente. Se permitió que los animales se habituaran a la sala de pruebas durante al menos una hora antes de manipularlos. El comportamiento de protección se evaluó de la siguiente manera; cada ratón se colocó individualmente en una caja de plástico transparente sobre una malla elevada de acero inoxidable. Ambas patas (fracturadas y no fracturadas) se observaron de cerca durante períodos de 1 minuto cada cinco minutos durante 60 minutos. Se otorgó una puntuación de 0, 1 o 2 según la posición postural de cada pata en períodos de puntuación de 1 minuto. Si el lado lesionado está blanqueado o distorsionado por la malla, se le da una puntuación de 0. Si la pata está completamente fuera del piso, se le dio 2 puntos. Si la pata toca el suelo sin palidecer ni distorsionarse, se otorga 1 puntuación. La suma de las 12 puntuaciones (una puntuación cada cinco minutos durante 60 minutos) (0-24) se obtenia durante la sesión de 1 hora para cada pata. La puntuación de vigilancia final se obtuvo restando la puntuación del lado lesionado de la de la pata trasera no lesionada (Yasada, supra).

La prueba de soporte de peso se realizó de la siguiente manera; Se usó un medidor de incapacitancia (ITC.inc, CA, EE. UU.) para determinar la distribución del peso de las patas traseras. El ratón se colocó en una cámara de plexiglás en ángulo colocada de modo que cada pata trasera descansara sobre una placa de peso separada. Se midió el peso ejercido por cada miembro posterior y se promedió durante un período de 5 segundos. El cambio en la distribución del peso de la pata trasera se calculó determinando la diferencia en la cantidad de peso (g) entre las extremidades izquierda y derecha. El cambio en la distribución del peso de la pata trasera entre las extremidades izquierda (pata fracturada) y derecha (control) se usó como índice de dolor en la pata fracturada (Bove et al., Osteoarthritis and cartilage 11, 821-830 (2003)). Dos semanas después de la fractura, se sacrificó a los ratones y se evaluó la regeneración ósea y la resistencia a la fractura de los explantes tibiales mediante micro-CT y prueba de fractura de tres puntos, respectivamente.

Resultados y discusión

El experimento de liberación in vitro de mepivacaína demuestra que, en comparación con la formulación de control, el gel controló la liberación de mepivacaína.

Como se puede observar en la Figura 67, a las 8 horas, la liberación de mepivacaína en el grupo control fue casi completa con una liberación total de 90±5% de fármaco, mientras que el grupo de gel mepivacaína liberó 50±4% de fármaco. Los anestésicos locales, como la mepivacaína y la bupivacaína, tienen un efecto de corta duración, por ejemplo, 2 horas. El perfil de liberación fue más lento para el gel mepivacaína que para el grupo de control, lo que indica un efecto de liberación prolongado y, por lo tanto, una posible prolongación de la duración del efecto terapéutico de la mepivacaína.

Se usó el modelo de Korsmeyer-Peppa para el ajuste de la liberación acumulada de fármaco, como se muestra en la Figura 68. La ecuación de este modelo es M/Mt = ktn, donde M/Mt son las cantidades acumuladas de fármaco liberadas en el tiempo t, k es una constante que incorpora características estructurales y geométricas de la forma de dosificación del fármaco, y n es el exponente de liberación que identifica el mecanismo de liberación. El ajuste lineal dio un exponente n = 0,58 (R = 0,99) y según el modelo de Korsmeyer-Peppa cuando n es 0,5<n<1 el transporte de masa está regulado por difusión no fickiana. Este resultado podría indicar alguna interacción fisicoquímica entre el fármaco y el gel responsable de la liberación controlada.

La estabilidad de la mepivacaína en contacto con el gel se comprobó a las 24 horas del inicio del experimento de liberación del fármaco. Los espectros UV-Vis muestran la integridad molecular del fármaco, lo que indica que la mepivacaína es compatible con el gel (Figura 69).

La prueba de calor radiante mostró que el gel cargado con mepivacaína proporciona un efecto analgésico a los ratones y que el efecto de la acción analgésica del fármaco puede prolongarse utilizando el gel (Figura 70).

La NMP combinada con mepivacaína mejoró la carga de peso en la pierna fracturada y redujo el dolor posoperatorio (Figura 71).

NMP y NMP mepivacaína aceleraron la curación de fracturas. De hecho, las secciones coronales y sagitales de Micro-CT y las reconstrucciones en 3D mostraron que la formación de hueso en el lugar de la fractura fue mayor en NMP solo y en NMP combinado con mepivacaína (Figura 72).

La fuerza de fractura fue significativamente diferente entre la tibia fracturada y la no fracturada, entre los grupos de solución salina, mepivacaína y NMP (Figura 73). Sin embargo, no hubo diferencias significativas entre las piernas fracturadas y no fracturadas en el grupo de NMP mepivacaína.

Discusión y conclusión

El resultado del experimento in vitro mostró que el gel puede controlar la liberación de mepivacaína mejor que el control.

El biomaterial descrito aquí se inyectó a través de una aguja de alto calibre en la pata trasera de ratones y proporcionó una analgesia eficaz a los ratones tratados con gel mepivacaína.

De hecho, el NMP pudo controlar la liberación de mepivacaína hasta por 24 horas. Los modelos de Higuchi y Korsmeyer-Peppas indicaron que la mepivacaína se liberaba por difusión. La mepivacaína liberada por NMP no presentó cambios en su estructura molecular como lo muestran los espectros UV-Vis (Figura 69), lo que indica que el fármaco era compatible con NMP. La prueba de calor radiante mostró que la NMP cargada con mepivacaína proporciona analgesia y la NMP prolongó la acción analgésica de la mepivacaína (Figura 70). Las pruebas de protección y carga de peso revelaron que la NMP cargada con mepivacaína acorta el tiempo de movilización y reduce el dolor posoperatorio (Figura 71). Los datos de micro-CT mostraron que la NMP cargada con mepivacaína aceleraba la cicatrización ósea (Figura 72). La prueba de fractura en tres puntos indicó que la NMP cargada con mepivacaína mejoró la resistencia a la fractura (Figura 73).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un hidrogel que comprende una suspensión coloidal de nanocristales bidimensionales de MlxMl1 yPz en agua, donde: Ml es Na+ y/o Li+,

M11 es Mg2+ o una mezcla de Mg2+ con uno o mas de los siguientes:Ni2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+ y/o Mn2+, P is a mixture of dibasic phosphate ions (HPOi-) and tribasic phosphate ions (POi-), X tiene un rango entre 0.43 y 0.60,

Y tiene un rango entre 0.10 y 0.18,

y Z tiene un rango entre 0.29 y 0.46,

siendo X, Y, Z fracciones molares.

2. El hidrogel de la reivindicación 1, en el que X oscila entre 0,45 y 0,56, entre 0,45 y 0,55, preferentemente entre 0,45 y 0,53, más preferentemente entre 0,50 y 0,58, y lo más preferentemente es 0,52; donde Y oscila entre 0,13 y 0,18, preferentemente entre 0,14 y 0,18, más preferentemente entre 0,13 y 0,16 y lo más preferentemente es 0,15; y donde Z oscila entre 0,30 y 0,39, preferentemente entre 0,31 y 0,37, más preferentemente entre 0,34 y 0,37 y lo más preferentemente es 0,33.

3. El hidrogel de la reivindicación 1 o 2, donde M1 es Na+, M11 es Mg2+, X es 0.516, Y es 0.144, y Z es 0.34; o donde Ml es Na+, M11 es Mg2+, Xes 0.45, Y es 0.18, y Z es 0.37; o donde Ml es Na+, M11 es Mg2+, X es 0.53, Y es 0.13, y Z es 0.34; o donde M1 es Na+, M11 es una mezcla de Mg2+ y Fe2+, X es 0.55, Y es 0.14, y Z es 0.31; o donde Ml es Na+, M11 es Mg2+, X es 0.52, Y es 0.13, y Z es 0.35; o donde Ml es Na+, M11 es Mg2+, X es 0.55, Y es 0.14, y Z es 0.31 o donde Ml es Na+, M11 es Mg2+, X es 0.56, Y es 0.13, y Z es 0.31.

4. El hidrogel de la reivindicaciones 1 o 2, donde Ml es Na+, M11 es Mg2+, X es 0.53, Y es 0.13, y Z es 0.34. 5. El hidrogel de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que tiene un pH entre 7 y 11, entre 7 y 10, preferiblemente entre 7 y 9, más preferiblemente pH entre 7.5 y 8.5, aún más preferiblemente entre 7.

5 y 8, y más preferiblemente un pH de 7,8.

6. El hidrogel de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende entre 50% y 95%, preferiblemente entre 75% y 95%, más preferiblemente entre 85% y 95%, más preferiblemente 90% de agua en peso basado en el total peso del gel.

7. El hidrogel de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el hidrogel comprende nanocristales bidimensionales MlxM11yPz aglomerados y formando planos interconectados con agua en espacios vacíos entre los nanocristales aglomerados.

8. El hidrogel en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el hidrogel comprende una red de nanocrystales en forma de paneles de agregados cara a cara en forma de láminas extendidas que están dobladas, torcidas, ramificadas y entrelazadas con contactos de borde a cara.

9. El hidrogel en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que además comprende uno o más aditivos y/o uno o más agentes bioactivos.

10. El hidrogel en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además un agente abrasivo seleccionado del grupo que consiste en fosfato de magnesio, sílice, nano-silicato y carbonato de calcio.

11. El hidrogel en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para uso en ingeniería de tejido óseo y/o para uso en la promoción de la regeneración ósea y/o el crecimiento óseo periimplantario.

12. El hidrogel en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para uso como sistema de administración de fármacos.

13. Un injerto óseo y/o un material de regeneración ósea que comprende el hidrogel de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

14. Una jeringa que comprende el hidrogel de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.