ES2927699T3 - Compuesto para la profilaxis o el tratamiento de nefropatía diabética o enfermedad renal diabética - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a compuestos para la profilaxis o el tratamiento del daño orgánico al restaurar la función endotelial y/o inhibir la producción de especies reactivas de oxígeno y especialmente a compuestos para la profilaxis o el tratamiento del daño renal diabético. Específicamente, la presente invención se refiere a 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-il)(piperazin-1-il)metanona o N,6-dihidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman- 2-carboxamida o una de sus sales o bases farmacéuticamente aceptables para su uso en la profilaxis o el tratamiento del daño orgánico mediante la restauración de la función endotelial y/o la inhibición de la producción de especies reactivas de oxígeno y especialmente el daño orgánico del riñón diabético. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Compuesto para la profilaxis o el tratamiento de nefropatía diabética o enfermedad renal diabética

La presente invención se refiere a compuestos para la profilaxis o el tratamiento de daño al órgano mediante el restablecimiento de la función endotelial y/o la inhibición de la producción de especies reactivas del oxígeno y, especialmente, a compuestos para la profilaxis o el tratamiento de daño renal diabético.

La nefropatía diabética (del latín nephropatia diabética), también conocida como glomeruloesclerosis diabética nodular o glomerulonefritis intercapilar, es una enfermedad renal progresiva provocada por la angiopatía de capilares en los glomérulos renales. Se caracteriza por síndrome nefrótico y glomeruloesclerosis difusa. La nefropatía diabética está provocada generalmente por diabetes mellitus duradera, y es la principal indicación para diálisis en muchos países desarrollados.

La insuficiencia renal provocada por la glomeruloesclerosis conduce a deficiencias en la filtración de líquidos y otros trastornos de la función renal. Se produce un aumento en la tensión arterial (hipertensión) y la retención de líquidos en el cuerpo, además de una presión oncótica reducida en plasma que provoca edema. Otras complicaciones pueden ser la arteriesclerosis de la arteria renal y proteína en la orina.

Generalmente, la primera anomalía de laboratorio es una prueba positiva para la microalbuminuria. El diagnóstico de nefropatía diabética se sospecha cuando un análisis de orina rutinario de una persona con diabetes muestra demasiada proteína en la orina (proteinuria). El análisis de orina también puede mostrar glucosa en la orina, especialmente si la glucemia se controla de manera deficiente. La creatinina y BUN séricas pueden aumentar a medida que avanza el daño renal. Generalmente, una biopsia renal confirma el diagnóstico, aunque no siempre es necesaria si el caso es sencillo con una progresión documentada de la proteinuria a lo largo del tiempo y la presencia de retinopatía diabética en el examen de la retina de los ojos.

La hiperfiltración glomerular es la fisiopatología básica en la nefropatía diabética que conduce a hipertensión intraglomerular. Los fármacos inhibidores de ACE ayudan a prevenir la nefropatía diabética previniendo esta etapa. La evolución de la hiperfiltración glomerular conduce a la etapa de engrosamiento de la membrana basal. Este es el cambio detectable más temprano en el trascurso de la nefropatía diabética. A esto le sigue la expansión del mesangio y finalmente la esclerosis nodular. En esta etapa, el riñón puede filtrar más albúmina sérica (proteína plasmática) de lo normal en la orina (albuminuria), y esto puede detectarse mediante pruebas médicas para detectar la albúmina. A medida que avanza la nefropatía diabética, cada vez se destruyen más glomérulos por la glomeruloesclerosis nodular progresiva. Generalmente, una biopsia renal muestra claramente la nefropatía diabética. A la nefropatía diabética le precede habitualmente la aparición de retinopatía diabética; las evidencias de nefropatía sin retinopatía hacen que se sospeche que la insuficiencia renal no está provocada por la propia diabetes, sino que es el resultado de la comorbilidad (por ejemplo, glomerulonefritis).

Los objetivos del tratamiento de la nefropatía diabética son ralentizar la evolución del daño renal y controlar las complicaciones relacionadas. El principal tratamiento, una vez establecida la proteinuria, es el uso de fármacos inhibidores de ACE, lo que habitualmente reduce los niveles de proteinuria y ralentiza la evolución de la nefropatía diabética. Varios efectos de los ACEI que pueden contribuir a la protección renal se han relacionado con la asociación del aumento en las cininas, que también es responsable de algunos de los efectos secundarios asociados con la terapia con ACEI, tales como la tos seca. El efecto de protección renal se refiere a los efectos antihipertensores en pacientes normales e hipertensos, la vasodilatación renal que da como resultado un aumento en el flujo sanguíneo renal y la dilatación de las arteriolas eferentes. Muchos estudios han demostrado que los fármacos relacionados, bloqueadores del receptor de angiotensina (ARB), tienen un efecto similar.

Varios compuestos están en desarrollo para la nefropatía diabética. Estos compuestos incluyen bardoxolona metilo, olmesartán medoxomilo, sulodexida, NOX-E36 y avosentán.

Sin embargo, a pesar de lo anterior, sigue existiendo la continua necesidad en la técnica de compuestos adicionales para la profilaxis o el tratamiento de nefropatía diabética o enfermedad renal diabética.

Un objeto de la presente invención, entre otros objetos, es satisfacer la necesidad anterior en la técnica.

Según la presente invención, el objeto anterior, entre otros objetos, se satisface proporcionando compuestos tal como se describen en las reivindicaciones adjuntas.

Específicamente, el objeto anterior, entre otros objetos, se satisface por la presente invención mediante un compuesto según la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable o una base del mismo, para su uso en la profilaxis o el tratamiento de daño al órgano mediante el restablecimiento de la función endotelial y/o la inhibición de la producción de especies reactivas del oxígeno, en el que dicho daño al órgano es daño al órgano diabético y/o dicho órgano es el riñón,

- en la que R1 representa un metilo o isopropilo;

- en la que R2 representa un metilo o isopropilo;

- en la que R3 representa un hidrógeno;

- n es 1;

- en la que R4 es CO-NH-R5, en el que el C=O está unido al resto de trolox,

- en el que el peso molecular de R4 es preferiblemente menor de 300 Da,

- y en el que R5 es un grupo alquilo, opcionalmente sustituido con nitrógeno y/u oxígeno, en el que el grupo alquilo comprende 1-12 átomos de carbono, y en el que el nitrógeno puede ser amina, amina cuaternaria, guanidina o imina, y el oxígeno puede ser hidroxilo, carbonilo o ácido carboxílico, y en el que el oxígeno y el nitrógeno, juntos, pueden formar grupos amida, urea o carbamato

- en el que R5 comprende una estructura cíclica

- en el que el compuesto según la fórmula (I) tiene un peso molecular inferior a 500 Da.

Tal como se reconocerá, el compuesto de fórmula (I) se deriva del trolox, un análogo soluble en agua de la vitamina E. En el trolox, R1 y R2 son metilo, R3 es hidrógeno y R4 es ácido carboxílico.

Específicamente, el objeto anterior se satisface por la presente invención mediante un compuesto según la fórmula (II)

(6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-il)(piperazin-1-il)metanona (II)

o una sal farmacéuticamente aceptable o una base del mismo para su uso en la profilaxis o el tratamiento de daño al órgano mediante el restablecimiento de la función endotelial y/o la inhibición de la producción de especies reactivas del oxígeno, en el que dicho daño al órgano es daño al órgano diabético y/o dicho órgano es el riñón.

Los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que los presentes compuestos según la fórmula (I), y lo más preferiblemente (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-il)(piperazin-1-il)metanona, tienen un efecto significativo sobre el restablecimiento de la función endotelial y/o la inhibición de las especies reactivas del oxígeno en un modelo de ratón de diabetes que los hace adecuados para la profilaxis o el tratamiento de daño al órgano mediante el restablecimiento de la función endotelial y/o la inhibición de la producción de especies reactivas del oxígeno en órganos y especialmente en nefropatía diabética o enfermedad renal diabética.

Según la presente invención, la presente profilaxis o el presente tratamiento comprende la administración de los presentes compuestos tales como los compuestos según la fórmula (I) o (II) en una dosis terapéuticamente eficaz. El compuesto según la fórmula (I),

tiene las siguientes características:

R1 y R2 son metilo o isopropilo, y lo más preferiblemente, R1 y R3 son iguales, y son metilo o isopropilo.

R3 representa un hidrógeno.

El peso molecular de R4 es preferiblemente menor de 300 Da.

El compuesto según la fórmula (I) tiene un peso molecular inferior a 500 Da.

R4 es -CO-NH-R5, en el que el C=O está unido al resto de trolox, y en el que R5 es un grupo alquilo, opcionalmente sustituido con nitrógeno u oxígeno, en el que el grupo alquilo comprende 1-12 átomos de carbono, y en el que el nitrógeno puede ser amina, amina cuaternaria, guanidina o imina, y el oxígeno puede ser hidroxilo, carbonilo o ácido carboxílico. El oxígeno y el nitrógeno, juntos, pueden formar grupos amida, urea o carbamato.

El grupo alquilo en R5 puede ser lineal, ramificado o cíclico, y comprende al menos una estructura cíclica.

Los compuestos tal como se presentan mediante la fórmula (I) pueden prepararse según la síntesis química conocida.

Por ejemplo, los compuestos con un grupo guanidina o un grupo piperazina unido a un resto de trolox a través de un grupo alquilo se describen en el documento EP202580. Puede usarse una síntesis análoga, en la que el oxígeno en 6 está protegido, y se libera después de la síntesis, o protegido con un resto de profármaco.

Por ejemplo, los compuestos que tienen un grupo amonio cuaternario se describen en el documento WO2014/011047, que incluye una descripción de la síntesis en los ejemplos.

La presente invención se detallará adicionalmente en los ejemplos a continuación. En los ejemplos, se hace referencia a figuras, en las que:

la figura 1 muestra datos metabólicos de ratones diabéticos y no diabéticos tratados con SUL121. A) Peso corporal, B) ingesta de agua, C) diuresis, D) niveles plasmáticos de glucosa sin ayunas. E) Presión arterial. * p<0,05 SUL121 diabético frente a control diabético;

la figura 2 muestra pesos de órganos al final. *p<0,05 SUL121 diabético frente a control diabético. # p<0,05 control de tipo natural frente a diabético;

la figura 3 muestra la excreción de albúmina urinaria y las razones ACR para animales diabéticos. *,# p<0,05 SUL121 diabético frente a control diabético;

la figura 4 muestra que las puntuaciones de FGS en animales diabéticos se reducen significativamente mediante el tratamiento con SUL121;

la figura 5 muestra que el tratamiento con SUL121 restablece la relajación mediada por el endotelio;

la figura 6 muestra que el tratamiento con SUL121 normalizó los niveles de H2O2 en plasma en la diabetes;

la figura 7 muestra que el tratamiento con SUL121 normalizó la producción de ROS celulares inducida por alto contenido en glucosa; y

la figura 8 muestra correlaciones entre diferentes parámetros.

Ejemplos

Ejemplo 1: Síntesis de varios compuestos

Los compuestos pueden sintetizarse según métodos de síntesis convencionales que conoce bien un experto en la técnica. La tabla 1 a continuación proporciona un resumen de los presentes compuestos como una indicación (código) arbitraria intercambiable de los presentes compuestos usados en el presente documento.

Tabla 1: Varios compuestos según la presente invención

Síntesis de SUL-102 y SUL-121

Se logró la amidación de trolox mediante la reacción con la amina apropiada en presencia de reactivos de acoplamiento convencionales para la formación de amida, por ejemplo, HATu y CDI. Se prepararon las aminas correspondientes mediante la reducción de las amidas formadas con BH3. Se prepararon derivados del ácido hidroxámico mediante la reacción con hidroxilamina/CDI. Se logró la síntesis de análogos de carbohidrazida de trolox mediante la reacción con hidrazinas (sustituidas). Se prepararon compuestos enantioméricos/diastereoméricos partiendo de trolox (R) o (S) enantioméricamente puro o por medio de cromatografía quiral.

Ejemplo 2

Introducción

Se ha demostrado que (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-il)(piperazin-1-il)metanona o SUL121 es muy eficaz en reducir el daño por isquemia y reperfusión en el riñón de rata. En este modelo, se detuvo el flujo sanguíneo al riñón durante un periodo prolongado después del cual se restableció el flujo sanguíneo. Se sabe que este modelo induce fuertemente producción de ROS renal. Se cree que SUL121 es un inductor de H²S, un compuesto con diversas acciones incluyendo la inhibición de la cadena respiratoria, reduciendo por tanto la formación de ROS. Uno de los mecanismos subyacentes puede ser la inducción de la enzima productora de H²S, CBS, y una expresión aumentada de GDF15.

Dada su eficacia en el modelo de isquemia y reperfusión renales, se planteó la hipótesis de que el compuesto SUL121 también protegerá al riñón en un modelo experimental de diabetes de tipo 2 inducida por obesidad (T2DM). Por tanto, se estudiaron los efectos de SUL121 sobre el desarrollo de albuminuria y daño renal en el modelo de ratón de diabetes de tipo 2. Para el estudio, se empleó el modelo de ratón db/db. El ratón db/db no tiene ningún receptor de leptina funcional y, por tanto, se desarrolla diabetes inducida por obesidad. La diabetes comienza a la edad de 6-8 semanas y pueden observarse niveles adecuados de daño renal y albuminuria a la edad de 18 semanas.

Para estudiar los efectos de SUL121 sobre el desarrollo de diabetes, el tratamiento con SUL121 comenzó desde la edad de 10 semanas hasta la edad de 18 semanas. Además, para estudiar los efectos de SUL121 sobre animales sanos, se trataron de manera similar ratones de control. Se incluyó un grupo de control no tratado en el estudio que servía como control no tratado sano. Se administraron fármaco y vehículo mediante la implantación de minibombas osmóticas a la edad de 10 y 14 semanas.

Materiales y métodos

Productos químicos y formulación

Se obtuvo DMSO de calidad para cultivo celular de Sigma-Aldrich (Zwijndrecht, Países Bajos). Las soluciones salinas estériles al 0,9% eran de Baxter (Utrecht, Países Bajos). La (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-il)(piperazin-1-il)metanona (SUL121) la suministró Sulfateq BV, Groningen, Países Bajos, suministrada en una formulación de 500 mM en DMSO al 100% correspondiente a 177 g/l. Las minibombas osmóticas (Alzet, EE.UU.) son resistentes a concentraciones de DMSO < 50%. Por tanto, se sometió a prueba la solubilidad de SUL121 en DMSO al 50% en solución salina. SUL121 era completamente soluble en DMSO al 50% hasta una concentración de 12,6 g/l. Se cargaron las bombas modelo 2004 de Alzet con 200 pl de disolución 12,6 g/l de SUL121 o con 200 ul de disolución de DMSO al 50% (vehículo). Según las especificaciones de la bomba, se administraron 6 pl de SUL121 al día, dando como resultado una dosis diaria de 2,2 mg/kg/día para un ratón de 35 gramos.

Animales de experimentación

Se adquirieron ratones db/db macho (n=16) y animales de control heterocigóticos delgados (n=16) de Harlan UK (raza JAX000642). Todos los ratones se alojaron individualmente. Se proporcionaron agua y alimento a voluntad. Se investigaron cuatro grupos de ratones:

1) db/db vehículo (control diabético)

2) db/db Sul121 (grupo diabético tratado)

3) wt vehículo (control no diabético)

4) wt Sul121 (para estudiar el efecto del fármaco sólo)

Se administraron fármaco y vehículo mediante la implantación de minibombas osmóticas a la edad de 10 (t=0) y 14 semanas (t=4). Se realizaron jaulas metabólicas y mediciones de presión arterial cada dos semanas. No pudieron obtenerse muestras de sangre mediante punción malar, por lo que se extrajo sangre del plexo retroorbital a la edad de 10 (t=0) y 12 semanas (t=2). A la edad de 18 semanas (t=8), se sacrificaron todos los animales y se extrajo sangre mediante punción cardiaca.

Mediciones urinarias

Se midieron las concentraciones de glucosa urinaria mediante el método de la glucosa oxidasa con un electrodo específico de recogidas de orina de 24 h después de que se almacenaran las muestras a -20°C. Se midió la concentración de creatinina urinaria mediante métodos de laboratorio convencionales (método de Jaffe sin desproteinización, DiaSys Diagnostic Systems, Holzheim, Alemania). Se calcularon los valores de la mediana de las recogidas de orina de 24 h y de la razón de albúmina con respecto a creatinina. Además, se determinaron manualmente los niveles de albúmina de ratón en orina usando un kit de Elisa de albúmina de ratón (Abcam, Cambridge, R.U.). Se determinaron los niveles de peróxido de hidrógeno urinario usando un kit de ensayo de H²O² Amplex Red (Life Technologies, Leusden, Países Bajos).

Mediciones de la presión arterial

Se midió la presión arterial en ratones anestesiados (isoflurano al 2%) por medio del método que usa manguito de la cola (PS-200A; Riken-Kaihatsu; Tokio, Japón). Para cada animal, los valores de presión arterial representan la media de tres a diez registros obtenidos en una única sesión.

Histología

Se usaron riñones fijados en paraformaldehído para la tinción con actina de músculo liso a (a-SMA). Se realizaron cortes de cuatro micrómetros, se desparafinizaron, se hidrataron y se procesaron con 1 mmol/EDTA (pH 9,0) para la recuperación del antígeno. Todas las etapas fueron según el protocolo del kit Vector MOM. Para evaluar la prefibrosis después de la lesión diabética, se tiñeron los cortes para detectar a-SMA (anticuerpo monoclonal de ratón anti-actina de músculo liso a; Sigma Chemical, St. Louis, MO) en dilución 1:100, certificando el diluyente MOM una tinción negativa.

Se desarrolló actividad peroxidasa mediante la incubación con AEC (Dako). Se midió la expresión de a-SMA usando morfometría asistida por ordenador. Se evaluó la tinción total a un aumento de *200. Se excluyeron los glomérulos y las arterias de las mediciones. Se dividió la tinción con a-SMA entre el área medida y se expresó como porcentaje. Se midieron al menos 10 campos corticales para obtener una puntuación promedio por animal.

Para evaluar el daño renal después de la lesión diabética, se tiñeron los cortes para detectar KIM-1, un marcador de daño tubular (anticuerpo policlonal de conejo, Dr. H. van Goor, Centro Médico Universitario de Groningen). Los cortes en parafina se desparafinizaron y se sometieron a recuperación del antígeno en tampón TrisHCl 0,1 M, pH 9, mediante incubación durante la noche a 80°C. Se usó una técnica de inmunoperoxidasa de dos etapas. Los portaobjetos de control, en los que el anticuerpo primario se reemplazó por PBS, fueron sistemáticamente negativos. Se realizó la evaluación del análisis de las tinciones y morfométrico con enmascaramiento.

Experimentos de baño de órganos con la aorta aislada

Se montaron anillos aórticos torácicos recién aislados (1,5-2 mm de longitud) en alambres de acero inoxidable de 200 pm en baños miográficos individuales (Danish Myo Technology, Aarhus, Dinamarca). En resumen, se calentaron baños que contenían 6 ml de disolución de Krebs hasta 37°C y se equilibraron previamente y se airearon continuamente con el 95% de O²-el 5% de CO² para mantener el pH a 7,4. Se evaluó la longitud de las tiras aórticas mediante microscopía. Se equilibraron los anillos aórticos durante 40 min hasta que tuvieron un nivel inicial estable. Luego se sensibilizaron los anillos y se comprobó la viabilidad mediante dos estimulaciones consecutivas con KCl (60 mM) seguidas de lavados y una nueva estabilización para obtener respuestas contráctiles reproducibles.

Protocolo vascular

Se midieron las respuestas a la contracción como curvas de concentración acumulada-respuesta para la fenilefrina (PE; 10 nM-100 pM) seguido de una única concentración de KCl (90 mM). Se evaluó la relajación dependiente del endotelio obteniendo curvas de concentración-respuesta para ACh (10 nM-300 pM) en anillos contraídos previamente con PE (1 pM) seguido de la estimulación con una alta concentración del donante de NO nitroprusiato de sodio (SNP; 0,1 mM) para evaluar la dilatación dependiente del endotelio máxima.

Para estudiar el papel del endotelio en los efectos vasoconstrictores, se desollaron los anillos retirando la capa celular endotelial frotando el lado luminal del vaso con un alambre humedecido. Para examinar la contribución de diferentes EDRF en la modulación de las respuestas vasoconstrictoras y en la mediación de la relajación dependiente del endotelio, se usaron inhibidores de la síntesis de PG y NO. Para este fin, se evaluaron los componentes de PG incubando previamente los anillos (20 min) con el inhibidor de ciclooxigenasa inespecífico, la indometacina (10 pM). Se examinó el componente de NO mediante la incubación posterior tanto con el inhibidor de la síntesis de NO, la NG-monometil-L-arginina (L-NMMA; 1 pM), como con indometacina. La relajación mediada por ACh restante se atribuyó a un EDHF no identificado.

Análisis morfológico

Se desparafinizaron cortes fijados en formalina de cuatro micrómetros de grosor y se tiñeron para detectar ácido peryódico de Schiff (PAS) para la cuantificación de la glomeruloesclerosis focal (FGS) y la lesión tubular. La FGS se puntuó de manera semicuantitativa con enmascaramiento determinando el nivel de expansión mesangial y adhesión focal en cada cuadrante en un glomérulo y se expresó en una escala de desde 0 hasta 4. Si se vio afectado el 25% del glomérulo, se puntuó como 1, el 50% como 2, el 75% como 3 y el 100% como 4. En total, se analizaron 50 glomérulos por riñón, y se calculó la puntuación total de FGS multiplicando la puntuación por el porcentaje de glomérulos con la misma puntuación de FGS. Por tanto, la puntuación total de FGS osciló entre 0 y 200.

Se evaluaron los cambios histológicos de la morfología tubular mediante la evaluación de cuatro marcadores de daño: necrosis tubular, pérdida de borde en cepillo, desollamiento de la membrana basal y cilindros intraluminales. Cada parámetro se clasificó en una escala de desde 0 hasta 3, según el grado de la lesión (0: <5%; 1: 5-25%; 2: 25-75%; y 3: >75%). En total, se analizaron 30 túbulos por riñón, y se calculó la puntuación histológica. Por tanto, la puntuación histológica total osciló entre 0 y 90.

Procesamiento de datos

Las contracciones debidas a KCl y a PE se proporcionan en miliNewton. Las respuestas de relajación para ACh y SNP se expresan como porcentajes de la constricción previa con PE. Además de eso, se determinó el área bajo cada curva individual (AUC; en unidades arbitrarias) para la relajación inducida por ACh (SigmaPlot versión 10.0, Systat Software, San José, CA). Se usó el AUC para presentar la relajación dependiente del endotelio total y para el posterior análisis de las diferencias en la relajación mediada por ACh con y sin inhibidores presentes para estimar la contribución de los diferentes EDRF, es decir, PG para la parte sensible a la inhibición de ciclooxigenasa con indometacina, NO para la parte sensible a la inhibición de NOS con L-NMMA, y EDHF por medio de exclusión de PG y NO (34).

Evaluación estadística

Los datos se presentan como medias ± DE, y n se refiere al número de animales en cada grupo. El análisis estadístico se realizó con SPSS 16.0.2 para Windows (SPSS, Chicago, IL). Se sometieron a prueba las diferencias entre las curvas de concentración-respuesta completas con ANOVA repetitivo; se sometieron a prueba las diferencias entre los puntos con ANOV^a unilaterial. Los valores de P <0,05 (bilateral) se consideraron como estadísticamente significativos.

Resultados

Datos metabólicos

Los datos metabólicos se muestran en la figura 1. Tal como se esperaba, los ratones diabéticos tenían un peso corporal significativamente mayor en comparación con sus controles delgados (figura 1, panel A). Los ratones diabéticos adelgazaron gradualmente a partir de la semana 4 y posteriores. El tratamiento con SUL121 no afectó al peso corporal en ningún punto de tiempo.

La ingesta de agua y la diuresis (figura 1, paneles B y C) estaban íntimamente relacionadas y fueron significativamente mayores en los ratones diabéticos. En la semana 8, los ratones diabéticos tratados con SUL121 tenían una producción de orina y una ingesta de agua significativamente menores que los controles diabéticos (orina 23,1±2,5 y 11,2±3,8 g, ingesta de agua 22,5±2,5 y 10,9±3,9 g para control diabético y SUL121 diabético, respectivamente). En todos los demás puntos de tiempo, SUL121 no afectó significativamente a la diuresis ni a la ingesta de agua.

Los niveles de glucemia sin ayunas fueron significativamente mayores en los ratones db/db diabéticos en comparación con los ratones de control de tipo natural (figura 1, panel D). Durante el transcurso del experimento, los niveles de glucemia sin ayunas en los animales diabéticos aumentaron desde 27,5±2,5 y 27,2±1,3 (control diabético y diabético tratado con SUL121, respectivamente) hasta 35,8±2,4 y 35,3±1,1 mM, lo que indica un estado diabético grave y progresivo. El tratamiento con SUL121 no afectó a los niveles de glucemia.

En las semanas 0, 2 y 6, se midió la presión arterial (figura 1, panel E). En la semana 0, la presión arterial media en los animales diabéticos fue mayor que en los ratones de tipo natural no diabéticos. El tratamiento con SUL121 disminuyó la presión arterial en la semana 2 en los ratones de tipo natural no diabéticos en la semana 2. El tratamiento con SUL121 no afectó a la presión arterial en la semana 6. En los ratones diabéticos, el tratamiento con SUL121 no afectó a la presión arterial.

Efectos del tratamiento con SUL121 sobre el peso de los órganos

Después de 8 semanas de tratamiento, se sacrificaron los ratones y se midieron los pesos de los órganos (figura 2). En los ratones diabéticos de control, los pesos de los riñones tanto izquierdo como derecho aumentaron significativamente, lo que indica hipertrofia renal. El tratamiento con SUL121 normalizó los pesos de los riñones a los valores del control no diabético.

Efectos de SUL121 sobre la función renal

Para someter a prueba si el tratamiento con SUL121 podía reducir el daño renal, se midió la filtración de albúmina a la orina en todos los puntos de tiempo para los animales diabéticos. Se calculó la excreción de albúmina total al día (AER) multiplicando la concentración de albúmina urinaria por la diuresis diaria (figura 3A). El tratamiento con SUL121 impidió la progresión de la AER en animales diabéticos en las semanas 6 y 8. La AER en controles no diabéticos sólo se midió en la semana 8 y fue significativamente menor que para los animales diabéticos (control no diabético: 33,8±5,1 mg/día, no diabético tratado con SUL121: 31,3±4,6 mg/día). El tratamiento con SUL121 no afectó a la AER en animales no diabéticos.

Además, se determinó la razón de albúmina/creatinina (ACR) en las semanas 6 y 8 (figura 3B). En la semana 6, la ACR en ratones diabéticos tratados con SUL121 fue significativamente menor que en ratones de control diabéticos (1107±130 y 534±79 pg/mg para control diabético y diabético tratado con SUL121, respectivamente). En la semana 8, la ACR en animales tratados con SUL121 también fue menor que en ratones de control diabéticos, pero ésta no alcanzó significación estadística (1084±156 y 866±91 pg/mg para control diabético y diabético tratado con SUL121, respectivamente).

La ACR en animales de tipo natural en la semana 8 fue significativamente menor que para los animales diabéticos y no se vio afectada por el tratamiento con SUL121 (71±9 y 55±6 pg/mg para control de tipo natural y tipo natural tratados con SUL121, respectivamente).

Efectos de SUL121 sobre la histología renal

Dado que SUL121 tenía un efecto profundo sobre la albuminuria, se realizó una tinción con PAS para investigar los efectos de SUL121 sobre la esclerosis glomerular focal (FGS) en todos los animales (figura 4). Tal como se esperaba, las puntuaciones de FGS aumentaron en los ratones db/db diabéticos. El tratamiento con SUL121 redujo significativamente las puntuaciones de FGS en los ratones diabéticos.

Función vascular en la diabetes

La liberación alterada de factores de relajación a partir del endotelio (disfunción endotelial) es un fenómeno establecido en el modelo db/db de diabetes. Para establecer los efectos del tratamiento con SUL121 sobre la función endotelial, se contrajeron previamente los anillos aórticos de ratón con fenilefrina (PE) y posteriormente se relajaron con concentraciones crecientes de acetilcolina (ACh). Se construyeron curvas de dosis-efecto (figura 5A), demostrando una relajación alterada para la ACh en ratones db/db en comparación con los controles (relajación máx. del 39,2±6,5 y 9,2±1,6% de PE para db/db y control, respectivamente). En el grupo diabético tratado con SUL121, se restablecieron las relajaciones a los niveles de control (11,3±2,3%). En controles no diabéticos, el tratamiento con SUL121 no afectó a las relajaciones vasculares (9,2±1,6%). En conjunto, estos datos demuestran que el tratamiento con SUL121 pudo prevenir el desarrollo de disfunción endotelial en el modelo db/db de diabetes. Para investigar adicionalmente los componentes endoteliales implicados en la relajación vascular, se construyeron curvas de dosis-respuesta usando inhibidores específicos para eNOS (L-NMMA) y ciclooxigenasa (indometacina) y se calculó la contribución relativa de cada componente (figura 5B). En los animales diabéticos, SUL121 mejoró la relajación total aumentando significativamente EDHF. Además, SUL121 provocó un aumento no significativo (p=0,06) en los componentes NO y prostaglandina.

Efectos de SUL121 sobre la producción de ROS en la diabetes

La producción mejorada de especies reactivas del oxígeno (ROS) es un fenómeno bien establecido en la diabetes. Para estudiar los efectos del tratamiento con SUL121 sobre la producción ROS, se midió el peróxido de hidrógeno, un metabolito estable de ROS, en plasma (figura 6). El tratamiento con SUL121 normalizó los niveles de H²O² en plasma.

Evaluación in vitro de la protección mediada por SUL121 en la diabetes

Para explorar adicionalmente los mecanismos a través de los cuales SUL121 media la protección renal en la diabetes, se empleó un modelo in vitro de diabetes. Para ello, se expusieron células mesangiales renales de ratón a condiciones que simulan la diabetes de tipo 2 (alto contenido en glucosa e insulina). La exposición a alto contenido en glucosa/insulina aumentó los niveles de ROS intracelulares en aproximadamente el 70% (figura 7). Curiosamente, este aumento podía inhibirse sustancialmente si las células se trataban previamente con SUL121 (p<0,05). SUL121 solo no afectó a la producción de ROS intracelular.

Correlaciones

Para determinar si la hipertrofia renal estaba relacionada con los cambios funcionales en el riñón, se realizó un análisis de correlación entre el peso del riñón y la excreción de albúmina en todos los animales diabéticos combinados (figura 8, panel A). Se halló una correlación positiva significativa entre ambos marcadores (p<0,05). Dado que SUL121 normalizó la función endotelial en animales diabéticos, los niveles de relajación máxima con la acetilcolina se correlacionaron con el peso del riñón (figura 8, panel B) y con la excreción de albúmina (figura 8, panel C). Ambas correlaciones fueron significativas (p<0,05).

Dado que SUL121 inhibió los niveles de H²O² en plasma, el H²O² también se correlacionó con la excreción de albúmina (figura 8, panel D) y con el peso del riñón (figura 8, panel E). Ambas correlaciones fueron significativas (p<0,05). Los niveles de H²O² en plasma no se correlacionaron con los niveles de relajación máxima con la acetilcolina (datos no mostrados).

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   Compuesto según la fórmula (II)

   

   (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-il)(piperazin-1-il)metanona

   o sal farmacéuticamente aceptable o base del mismo para su uso en la profilaxis o el tratamiento de daño al órgano mediante el restablecimiento de la función endotelial y/o la inhibición de la producción de especies reactivas del oxígeno, en el que dicho daño al órgano es nefropatía diabética o enfermedad renal diabética.

   6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-il)(piperazin-1-il)metanona para su uso según la reivindicación 1, en la que dicho daño al órgano es enfermedad renal diabética.

   Compuesto según la fórmula (I) o sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en la profilaxis o el tratamiento de daño al órgano mediante el restablecimiento de la función endotelial y/o la inhibición de la producción de especies reactivas del oxígeno, en el que dicho daño al órgano es nefropatía diabética o enfermedad renal diabética;

   

   - en la que R1 representa un metilo o isopropilo;

   - en la que R2 representa un metilo o isopropilo;

   - en la que R3 representa un hidrógeno;

   - n es 1;

   - en la que R4 es CO-NH-R5, en el que el C=O está unido al resto de trolox,

   - en el que el peso molecular de R4 es preferiblemente menor de 300 Da,

   - y en el que R5 es un grupo alquilo, opcionalmente sustituido con nitrógeno y/u oxígeno, en el que el grupo alquilo comprende 1-12 átomos de carbono, y en el que el nitrógeno puede ser amina, amina cuaternaria, guanidina o imina, y el oxígeno puede ser hidroxilo, carbonilo o ácido carboxílico, y en el que el oxígeno y el nitrógeno, juntos, pueden formar grupos amida, urea o carbamato

   - en el que R5 comprende una estructura cíclica

   - en el que el compuesto según la fórmula (I) tiene un peso molecular inferior a 500 Da.

   Compuesto para su uso según la reivindicación 3, en el que dicho daño al órgano es enfermedad renal diabética.