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ES2927649T3 - Tratamiento del síndrome de Rett - Google Patents

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ES2927649T3
ES2927649T3 ES15843249T ES15843249T ES2927649T3 ES 2927649 T3 ES2927649 T3 ES 2927649T3 ES 15843249 T ES15843249 T ES 15843249T ES 15843249 T ES15843249 T ES 15843249T ES 2927649 T3 ES2927649 T3 ES 2927649T3
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ES
Spain
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aryl
ptp1b
acid
mecp2
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ES15843249T
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English (en)
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Nicholas Tonks
Navasona Krishnan
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Cold Spring Harbor Laboratory
Original Assignee
Cold Spring Harbor Laboratory
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Publication date
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Abstract

La presente invención se refiere a agentes y métodos para tratar trastornos del espectro autista, como el Síndrome de Rett. Esta invención aborda la necesidad mencionada anteriormente al proporcionar agentes y métodos para tratar o mejorar los síntomas de enfermedades neurológicas, tales como trastornos del espectro autista y síndrome de Rett. En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad neurológica asociada con una o más mutaciones en el gen MECP2. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Tratamiento del síndrome de Rett
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a composiciones, sistemas y agentes terapéuticos para utilizar en métodos para tratar o aliviar los síntomas del síndrome de Rett.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los trastornos del espectro autista o del espectro autístico son una gama de trastornos neurológicos que se caracterizan por déficits sociales y dificultades de comunicación, comportamientos e intereses estereotipados o repetitivos y, en algunos casos, retrasos cognitivos. Algunos ejemplos de estos trastornos son el autismo, el síndrome de Asperger, el trastorno general del desarrollo, no especificado de otra manera (PDD-NOS, por sus siglas en inglés), el trastorno desintegrativo infantil y el síndrome de Rett. Véase Manual Diagnóstico y Estadístico de Trastornos Mentales 5ta edición, American Psychiatric Association (Asociación Americana de Psiquiatría), 18 de mayo de 2013 y Lord et al, Autism Spectrum Disorders. Neuron. 2000;28(2):355-63.
El síndrome de Rett se caracteriza por un crecimiento y desarrollo tempranos normales, seguidos de una ralentización del desarrollo, pérdida del uso intencionado de las manos, movimientos distintivos de las manos, crecimiento lento del cerebro y la cabeza, problemas para caminar, convulsiones y discapacidad intelectual. Casi todos los casos del síndrome de Rett son causados por una mutación en la proteína 2 de unión a CpG metiladas o gen MECP2. El gen MECP2 se encuentra en el cromosoma X de una persona, uno de los dos cromosomas sexuales. Dado que los hombres tienen sólo un cromosoma X, aquellos con defectos en sus genes MECP2 con frecuencia no muestran características clínicas del síndrome de Rett, pero experimentan graves problemas cuando nacen y mueren poco después de nacer. Las mujeres tienen dos cromosomas X, pero sólo uno está activo en cualquier célula dada. Como resultado, los pacientes con síndrome de Rett son casi exclusivamente mujeres y se estima que el síndrome de Rett afecta a uno de cada 10.000 a 15.000 nacimientos de mujeres vivas y en todos los grupos raciales y étnicos en todo el mundo. Véase, por ejemplo, la Hoja Informativa sobre el Síndrome de Rett del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (Rett Syndrome Fact Sheet by National Institute of Neurological Disorders and Stroke) disponible en /www.ninds.nih.gov/disorders/rett/detail_rett.htm.
Actualmente no existe cura para el síndrome de Rett. El tratamiento para el trastorno es sintomático, es decir, centrado en el manejo de los síntomas, y de apoyo, que requiere un enfoque multidisciplinario. Por ejemplo, se pueden usar medicamentos para las irregularidades respiratorias y las dificultades motoras, y se pueden usar medicamentos anticonvulsivos para controlar las convulsiones. Además, se utiliza terapia ocupacional para ayudar a los niños a desarrollar las habilidades necesarias para realizar actividades autodirigidas (como vestirse, alimentarse y practicar artes y artesanías), mientras que la fisioterapia y la hidroterapia pueden prolongar la movilidad. Véase, por ejemplo, la Hoja Informativa sobre el Síndrome de Rett mencionada anteriormente. Se necesitan agentes y métodos para tratar el síndrome de Rett, así como otros trastornos del espectro autista.
US 2009/131374 A1 describe ciertos derivados de ácido fosfónico como inhibidores de PTP1B. US 2009/131374 A1 no revela que estos compuestos pueden ser utilizados para el tratamiento del síndrome de Rett.
US 6709 817 B1 describe un método de detección del síndrome de Rett mediante la detección de una mutación en MECP2. US 6 709 817 B1 no revela que pueden utilizarse inhibidores de moléculas pequeñas de PTP1B para el tratamiento del síndrome de Rett.
SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN
Las formas de realización de la presente invención se definen en las reivindicaciones. En particular, esta invención aborda la necesidad mencionada anteriormente proporcionando una composición según lo definido en la reivindicación 1, un sistema según lo definido en la reivindicación 2, y un agente terapéutico según lo definido en la reivindicación 8 para utilizar en un método para tratar o aliviar síntomas del síndrome de Rett.
El método incluye administrar a un sujeto (por ejemplo, un paciente humano) que lo necesite una cantidad eficaz de un agente terapéutico que es un inhibidor de molécula pequeña de la proteína-tirosina fosfatasa 1B (PTP1B). Algunos ejemplos del compuesto de molécula pequeña son CpT157633, un triterpeno como el ácido ursólico (UA001) o UA0713, y los derivados de cada uno de estos compuestos. En ciertas formas de realización, el agente terapéutico es administrado al sujeto sólo después del diagnóstico del síndrome de Rett como asociado con una o más mutaciones en el gen MECP2. Por ejemplo, el diagnóstico puede incluir la realización de pruebas al sujeto para detectar una mutación en un gen que codifica la proteína 2 de unión a CpG metiladas (MECP2).
En un aspecto, la invención proporciona un sistema para utilizar en un método para tratar el síndrome de Rett que contiene (i) una primera composición farmacéutica que tiene una cantidad eficaz de un primer agente terapéutico que es un inhibidor de molécula pequeña de PTP1B, y (ii) un kit o reactivo para diagnosticar el síndrome de Rett, en donde el kit comprende un reactivo de ácido nucleico o anticuerpo para detectar una mutación en un gen que codifica MECP2. A tal efecto, el kit puede incluir cebadores de PCR para obtener un amplicón del gen o un transcrito del mismo que abarque el locus de la mutación. El kit también puede incluir un oligonucleótido o una sonda capaz de hibridarse a (i) un mutante o una forma del tipo salvaje del gen o (ii) su complemento bajo una condición de alta rigurosidad. Para facilitar la detección, el oligonucleótido o la sonda se pueden marcar con una molécula indicadora. En una forma de realización preferida, el sistema puede además incluir una segunda composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un segundo agente terapéutico. Este segundo agente terapéutico puede ser un IGF1 o un análogo del mismo.
En un aspecto, la invención presenta una composición farmacéutica para utilizar en el tratamiento del síndrome de Rett que contiene (i) una cantidad eficaz de un primer agente terapéutico que es un inhibidor de molécula pequeña de PTP1B, (ii) una cantidad eficaz de un segundo agente terapéutico que es un IGF1 o un análogo del mismo, y (iii) un portador farmacéuticamente aceptable.
Los detalles de una o más formas de realización de la invención son expuestos en la descripción que aparece a continuación. Otras características, objetivos y ventajas de la invención se desprenden de la descripción y de las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 es un diagrama que muestra la vía de transducción de señales que involucra tirosina quinasas receptoras (RTK)-fosfoinositida-3-quinasa-proteína quinasa B/Akt (PI3K-PKB/Akt).
Las FIG. 2A y B muestran que los ratones machos Mecp2 y hembras Mecp2 _/+ exhiben (A) intolerancia a la glucosa y (B) síntomas de hiperinsulinemia.
Las FIG. 3A y B muestran una deficiencia en la señalización de la insulina observada en ratones machos Mecp2-'-. La FIG. 4 muestra que la pérdida de MECP2 estaba acompañada por un aumento de la expresión de PTP1B en la corteza.
Las FIG. 5A-F muestran que los ratones mutantes Mecp2 expresan niveles más altos de PTP1B y que el gen PTPN1, que codifica PTP1B, es un objetivo de MECP2.
Las FIG. 6 A-E muestran que la inhibición de PTP1B mejoró la homeostasis de la glucosa y la supervivencia en ratones mutantes Mecp2.
La FIG. 7 muestra los efectos combinatorios de IGF-1 y un inhibidor de PTP1B sobre la supervivencia.
La FIG. 8 muestra los efectos combinatorios de IGF-1 y un inhibidor de PTP1B sobre la tolerancia a la glucosa. La FIG. 9 muestra que un inhibidor estructural y mecanísticamente distinto de PTP1B, UA0713, también mejoró la supervivencia de los machos nulos para MECP2.
La FIG. 10 muestra que los inhibidores estructural y mecanísticamente distintos de PTP1B mejoraron la supervivencia de los ratones machos nulos para MECP2.
La FIG. 11 muestra que los ratones heterólogos Mecp2 hembras mostraron un mayor rendimiento en un ensayo de recogida de crías después del tratamiento con el inhibidor de PTP1B CPT157633.
Las FIG. 12A-C muestran que la inhibición de PTP1B llevó a un aumento de la fosforilación de TrkB y a un aumento de la señalización como respuesta a BDNF.
Las FIG. 13A-G muestran la caracterización bioquímica del inhibidor de PTP1B CPT157633.
Las FIG. 14A-D muestran que la inhibición de PTP1B mejora los fenotipos del síndrome de Rett en modelos hembra de ratón.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Esta invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la inhibición de la proteína-tirosina fosfatasa 1B (PTP1B), según lo descrito en la presente, mejoró un número de síntomas del síndrome de Rett. Por consiguiente, los inhibidores de PTP1B ofrecen una nueva estrategia para el tratamiento del síndrome de Rett caracterizado por mutaciones en el gen MECP2.
El síndrome de Rett, tal y como se utiliza en la presente, se refiere a un trastorno neurológico del neurodesarrollo que se caracteriza y es causado por defectos en el gen MECP2 en las células afectadas, por ejemplo, una o más mutaciones en el gen como se muestra a continuación. Como se señaló anteriormente, casi todos los casos del síndrome de Rett son causados por una mutación en el gen MECP2, tales como mutaciones de sentido erróneo, sin sentido y con cambio del marco que afectan la función de MECP2. Algunos ejemplos de las mutaciones incluyen las descritas en Guy et al., Nat Genet. Mar. 2001;27(3):322-6, Bienvenu et al., Hum Mol Genet. 22 de mayo de 2000;9(9): 1377-84, Wan et al., Am J Hum Genet. Dic. 1999;65(6):1520-9, y Amir et al., Nat Genet. Octubre de 1999;23(2):185-8. Por ejemplo, estas incluyen diferentes mutaciones puntuales o deleciones del gen MECP2 detectadas en pacientes con síndrome de Rett que constituyen mutaciones de sentido erróneo, sin sentido y de cambio del marco, según lo ejemplificado por Bienvenu et al. y en la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1. Mutaciones del gen MECP2 de ejemplo en el síndrome de Rett
Figure imgf000004_0001
PTP1B y la ruta de transducción de señales relacionada
La proteína tirosina fosfatasa PTP1B es una enzima que es el miembro fundador de la familia de la proteína tirosina fosfatasa (PTP). Las proteínas tirosina fosfatasas son un grupo de enzimas que eliminan grupos fosfato de los residuos de tirosina fosforilados en las proteínas. Véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente US 20130029366. Las secuencias de aminoácidos y las secuencias nucleicas relacionadas de PTP1B de ejemplo se describen, por ejemplo, bajo los números de acceso del GenBank NM_002827, NP_002818, BT006752, AAP35398, M31724, AAA60223, M33689, AAA60157, BC015660, AAH15660, BC018164, AAH18164, AK316563, BAG38152, o secuencias relacionadas con Unigene Cluster Hs. 417549 (UGID:223337) PTPN1 (humano) Homo sapiens).
La fosforilación de la proteína tirosina (pTyr) es una modificación postraduccional común que puede crear motivos de reconocimiento para las interacciones de proteínas y la localización celular y que puede afectar la estabilidad proteica y regular la actividad enzimática. Estas enzimas son componentes reguladores clave en las vías de transducción de señales (tal como la vía de MAP quinasa) y el control del ciclo celular, y son importantes en el control del crecimiento, proliferación, diferenciación y transformación celular. Véase, por ejemplo, Hemmings et al., Cold Spring Harb Perspect Biol 2012;4:a011189.
Métodos de tratamiento
Según lo descrito en la presente, PTP1B puede ser un objetivo para el tratamiento de enfermedades neurológicas asociadas con el aumento de la expresión o actividad de PTP1B, incluyendo trastornos del espectro autista asociados con mutaciones del gen MECP2, como el síndrome de Rett.
Pueden utilizarse diversos inhibidores de PTP1B para poner en práctica la presente invención. En la presente invención, los inhibidores son compuestos de moléculas pequeñas. Estos inhibidores pueden funcionar a un nivel de actividad enzimática, transcripción, estabilidad del ARNm, traducción, estabilidad/degradación proteica, modificación proteica, y la interacción proteína-proteína. Más específicamente, según lo descrito en la presente, se ha descubierto que los inhibidores de PTP1B se pueden utilizar solos o en combinación con otros agentes para mejorar los síntomas del síndrome de Rett. Por consiguiente, la invención proporciona una composición según lo definido en la reivindicación 1, un sistema según lo definido en la reivindicación 2, y un agente terapéutico según lo definido en la reivindicación 8 para utilizar en un método para tratar el síndrome de Rett.
Inhibidores de molécula pequeña
Muchos inhibidores de molécula pequeña de PTP1B son conocidos en la técnica y se pueden utilizar para poner en práctica los métodos de tratamiento descritos en la presente invención. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos con los números 7504389 y 7829737.
Los inhibidores de molécula pequeña de PTP1B incluyen los compuestos de las Fórmulas I y IIa-e descritas en la Patente de los Estados Unidos con número 7504389 y que se muestra a continuación:
Fórmula I: (I)
Figure imgf000005_0001
en donde:
X1 es un grupo ligante o está ausente;
X2 es H, está ausente o es un grupo ligante, preferentemente seleccionado de un compuesto alifático de cadena recta o ramificado opcionalmente sustituido, preferentemente que comprende de 1 a 8 carbonos, que contiene opcionalmente 1 o más enlaces dobles o triples, en donde uno o más de los carbonos son opcionalmente sustituidos con R* en donde R* es cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; -C(O)-, -C(O)C(O)-, -C(O)NR11-, -C(O)NR11NR12-, -C(O)O-, - OC(O)-, -NR11CO2-, -O-, -NR11C(O)NR12-, -OC(O)NR11-, -NR11NR12-, -NR11c (o )-, -S-, -So -, -SO2-, -NR11-, -SO2NR11- o -NR11SO2-, en donde R11 y R12 se seleccionan independientemente entre H y un compuesto alifático, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; o X2 es cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; -C(O)-, -C(O)C(O)-, -C(O)NR11-, -C(O)NR11NR12-, -C(O)O-, -OC(O)-, -NR11CO2-, -O-, -NR11C(O)NR12-, -OC(O)NR11-, -NR11NR12-, - NR11C(O)-, -S-, -SO-, -SO2-, -NR11-, -SO2NR11- o -NR11SO2-; siempre y cuando X1 sea -NH-, X2 no sea -CH2C(O)- o -CH2C(O)-sustituido;
R1 es H o un compuesto alifático C1-8, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; R2 es H o un compuesto alifático C1-8, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; o R2 está ausente cuando X2 es H;
R3 y R4 son independientemente H, alquilo o arilo C5-6;
R5 y R6 son independientemente H o halo;
R7 y R8 son independientemente H, -OR23 o -NHR23; o un compuesto alifático, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; o juntos forman un anillo opcionalmente sustituido que comprende de 3 a 7 átomos de carbono o heteroátomos;
R9 es H o alquilo C1-3;
R10 es H o alquilo C1-3; o R8 y R10 juntos forman un anillo opcionalmente sustituido que comprende de 3 a 7 átomos de carbono o heteroátomos; y
cada Rm es independientemente H, halo, -OH, -NO2, -CN; alquilo C1-3 opcionalmente sustituido; -OR23, -C(O)R23, -C(O)OR23, -C(O)N(R23)(R24), -OC(O)R23, -OC(O)OR23, - OC(O)N(R23)(R24), -N(R23)(R24), -S(O)2R23, -S(O)R23, -SR23, -S(O)2N(R23)(R24); NR23C(O)R24, -NR23C(O)OR24, -NR23SOOR24, -NR3C(O)N(R24)(R25) o - NR23SO2N(R24)(R25); donde cada uno de R23, R24 y R25 es independientemente H, alquilo C1-4 o cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo de 3 a 8 miembros opcionalmente sustituido; o dos grupos Rm adyacentes juntos forman un anillo aromático o no aromático opcionalmente sustituido que comprende de 5 a 7 átomos de carbono o heteroátomos; donde n es 0, 1, 2, 3 o 4; o Rm y R7 juntos forman un anillo aromático o no aromático opcionalmente sustituido; y
en donde cada uno de los átomos de carbono 2-6 del anillo de fenilo A es opcionalmente sustituido con N; o cualquier par de átomos de carbono 2-6 adyacentes del anillo de fenilo A es opcionalmente sustituido con S, N u O; siempre que en ningún caso se sustituya el átomo de carbono del anillo de fenilo A que está sustituido con el grupo fosfonato;
Fórmula Ila:
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0002
en donde:
Ra y Rb son independientemente H o halógeno;
cada uno de R26, R27, R29 y R30 es independientemente H, halo, -OH, -NO2, -CN, -CF3, - CHF2, -CH2CH3, -CH2CF3, -CF2CF3, -CH2Cl, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2NH2, - CH2CH2NH2, -CH2SO2CH3, -OR23, -C(O)R23, -C(O)OR23, -C(O)N(R23)(R24), - OC(O)R23, -OC(O)OR23, -OC(O)N(R23)(R24), -N(R23)(R24), -S(O)2R23, -S(O)R23, - SR23, -S(O)2N(R23)(R24), -NR23C(O)R24, -NR23C(O)OR24, -NR23SOOR24, - NR23C(O)N(R24)(R25), -NR23SO2R24 o -NR23SO2N(R24)(R25); o alquilo C1-6, alcoxi C1-6 o arilo opcionalmente sustituido; donde cada uno de R23, R24 y R25 es independientemente H, alquilo C1-4 o cicloalquilo C3-8, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo;
cada uno de R31 y R32 es independientemente H, alquilo o arilo C5-6;
R28 es H, halógeno, -CN, -[CH2]n-[C(H)3-p] x(R33)p, -C(O)OH, -C(O)(CH2)nNH2, - C(O)NH(CH2)nR33, -C=N-N-S(O)2R33, -(CH2)n-CH(R34)(R35) o -Ch n R 34 -; o R28 tomado junto con R27 o R29 forman un anillo opcionalmente sustituido que comprende de 3 a 8 átomos de carbono o heteroátomos;
cada R33 es independientemente H, halógeno, -C(O)OR39, -OH, -CN, -N=N-N, - N(R37)(R38), -C(O)NH(CH2)nR39, -C(R 39 )(NH2)C(O)Or 39 , -CH2R35 o - CH(R35)NHS(O)2R39; o un cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido;
R34 es H o -N(R37)(R38);
R35 es H, -C(O)R34, -C(O)OR39 o -N(NH2)C(O)NH(CH2)nPh;
cada uno de R17 y R38 es independientemente H, -C(O)OR39, -C(O)cycloalkyl-Ph, -S(O)2R39, -C(O)R39, -OC(O)R39, -C(O)(CH2)qR39, -S(O)2, -S(O)2NHR39, -S(O)2N(R44)(R39), N(R39)(R44), -C(O)N(R44)(R39) o -NHC(O)N(R44)(R39), o alquilo C1-6, cicloalquilo C3-8, arilo C5-8, heterocicloalquilo de 3 a 8 miembros o heteroarilo de 5 a 8 miembros opcionalmente sustituido; y
cada uno de R39 y R44 es independientemente H o alquilo C1-6, cicloalquilo C3-8, arilo C5-8, heterocicloalquilo de 3 a 8 miembros o heteroarilo de 5 a 8 miembros opcionalmente sustituido;
en donde cada uno de los átomos de carbono 2-6 del anillo de fenilo A incluyendo sus respectivos sustituyentes está opcionalmente sustituido con N; o cualquier par de átomos de carbono 2-6 adyacentes del anillo de fenilo A y sus respectivos sustituyentes está opcionalmente sustituido con S, N u O; y
en donde n es un entero de 0 a 4; m es 0, 1 o 2; p es un entero de 1 a 3; q es un entero de 0 a 6; y x es 0 o 1, siempre y cuando x es 0, p es 1;
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en donde R26, R27, R28, R29, R31 y R32 son según lo definido anteriormente; cada uno de los átomos de carbono 3-6 del anillo de fenilo A incluyendo sus respectivos sustituyentes es opcionalmente sustituido con N; o cualquier par de átomos de carbono 3-6 adyacentes del anillo de fenilo A y sus respectivos sustituyentes están opcionalmente sustituidos con S, N u O;
Figure imgf000007_0002
en donde R26, R27, R29, R31 y R32 son según lo definido anteriormente para la Fórmula IIa;
R40 es H, alquilo, alquileno, -C(O)OR39, -C(O)N(R37)(R38) o - N(NH)C(O)NH(CH2)nPh;
R41 es -N(R37)(R38); en donde R37 y R38 son según lo descrito anteriormente para la Fórmula IIa; y
cada uno de los átomos de carbono 3, 5 o 6 del anillo de fenilo A incluyendo sus respectivos sustituyentes está opcionalmente sustituido con N; o los átomos de carbono 5 y 6 del anillo de fenilo A juntos y sus respectivos sustituyentes es opcionalmente sustituido con un S, N u O
Fórmula lid:
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en donde R26, R27 y R29 son según lo definido anteriormente para la Fórmula lia;
cada uno de R31 y R32 es independientemente H, alquilo o arilo C5-6;
R40 es según lo definido anteriormente para la Fórmula IIc; R42 es H, alquilo C1-3 opcionalmente sustituido, - C(O)OR39, -OC(O)R39, -C(O)N(R44)(R39), -C(O)ciclopropil-Ph, -S(O)2R39 , - S(O)2NHR39 o -C(O)(CH2)qR39; y cada uno de los átomos de carbono 3, 5 o 6 del anillo de fenilo A incluyendo sus respectivos sustituyentes es opcionalmente sustituido con N; o los átomos de carbono 5 y 6 del anillo de fenilo A juntos y sus respectivos sustituyentes son opcionalmente sustituidos con un S, N u O; y
en donde R39 es según lo definido anteriormente para la Fórmula lia; y
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en donde R26, R27, R29 y R40 son según lo definido anteriormente para la Fórmula lid; y
cada uno de R31 y R32 es independientemente H, alquilo o arilo C5-6; R43 es H, -NHR39 o es R39; en donde R39 es H o alquilo C1-6, cicloalquilo C3-8, heterocicloalquilo de 3-8 miembros, arilo C3-8 o heteroarilo de 3 a 8 miembros opcionalmente sustituido; y cada uno de los átomos de carbono 3, 5 o 6 del anillo de fenilo A incluyendo sus respectivos sustituyentes es opcionalmente sustituido con N; o los átomos de carbono 5 y 6 del anillo de fenilo A juntos y sus sustituyentes son opcionalmente sustituidos con S, N u O.
En algunos ejemplos, el inhibidor puede ser uno seleccionado del respectivo grupo que consiste en ácido {[2-bromo-4-(2-carbamoil- 2-metansulfonilaminoetil)fenil] difluorometil} -fosfónico (CPT157633, Ceptyr, Inc), o un derivado y análogo de CPT157633. En algunos ejemplos, el inhibidor puede ser uno seleccionado de ácido ursólico (UA001) o UA0713, u otro derivado o análogo de triterpeno. Véase Zhang et al, Biochimica Biophys. Acta, (2006), 1760:1505-1512. El término "derivado" se refiere a un compuesto químico que es similar a otro compuesto en estructura y función. El derivado puede diferir estructuralmente por un solo elemento o grupo, o por la modificación de más de un grupo (por ejemplo, 2, 3 o 4 grupos) si conserva la misma función que el compuesto parental. Estas modificaciones son rutinarias para los expertos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, restos químicos adicionales o sustituidos, tales como ésteres o amidas de un ácido, grupos protectores tales como un grupo bencílico para un alcohol o tiol, y grupos tercbutoxilcarbonilo para una amina. También se incluyen las modificaciones a las cadenas laterales de alquilo, tales como las sustituciones de alquilo (por ejemplo, metilo, dimetilo, etilo, etc.), las modificaciones al nivel de saturación o insaturación de las cadenas laterales, y la adición de grupos modificados tales como fenilo y fenoxi sustituidos. Asimismo, se pueden añadir restos a los agentes descritos en la presente para alterar sus propiedades farmacocinéticas, tal como aumentar la semivida in vivo o ex vivo, o aumentar las propiedades de penetración celular o la biodisponibilidad. También se incluyen los profármacos, que se sabe que aumentan numerosas cualidades deseables de los productos farmacéuticos (por ejemplo, solubilidad, biodisponibilidad, fabricación, etc.). El término "análogo" se refiere a un compuesto que es un derivado estructural de un compuesto parental que difiere con respecto a la composición elemental, tal como por el reemplazo de un átomo con otro, o un grupo funcional con otro. Los derivados, análogos y profármacos de los compuestos de acuerdo con las reivindicaciones no forman parte de la invención a menos que se reivindique explícitamente.
A continuación se muestra la estructura de CPT157633:
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Los derivados y análogos de CPT157633 incluyen compuestos que tienen las fórmulas de Fórmulas I y ll(a)-(e).
A continuación se muestra la estructura del ácido ursólico (UA001)
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A continuación se muestra la estructura de UA0713:
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Los inhibidores de triterpenos de PTP1B incluyen los que se muestran en la Tabla 2 a continuación.
Tabla 2. Inhibidores de triterpenos de PTP1B
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Inhibidores de Ácido Nucleico
Otros inhibidores de PTP1B descritos incluyen un inhibidor basado en ácido nucleico que disminuye la expresión o el nivel de actividad de PTP1B endógeno en un sujeto. Algunos ejemplos de tales inhibidores incluyen los que utilizan ARNi (ARN de interferencia) para degradar específicamente las moléculas de ARNm objetivo dentro de una célula, por ejemplo, ARN bicatenario corto de interferencia (siRNA, por sus siglas en ingles), ARN en horquilla corto (shRNA, por sus siglas en inglés) o micro-ARN monocatenario (miRNA, por sus siglas en inglés), y también inhibidores tales como moléculas de ADN o ARN antisentido, tales como oligonucleótidos antisentido (ASO, por sus siglas en inglés). Véase, por ejemplo, US 7560438, US 8202980, US 8420391, y US 8445237.
Un inhibidor de ácido nucleico puede codificar un ARN pequeño de interferencia (por ejemplo, un agente de ARNi) que se dirige al PTP1B e inhibe su expresión o actividad. La expresión "agente de ARNi" se refiere a un ARN, o análogo del mismo, que tiene suficiente complementariedad de secuencia con un ARN objetivo para dirigir la interferencia de ARN. Los ejemplos también incluyen un ADN que se puede utilizar para producir el ARN. La interferencia de ARN (ARNi) se refiere a un proceso selectivo o específico de una secuencia por el cual una molécula objetivo (por ejemplo, un gen objetivo, proteína o ARN) es regulada a la baja. Generalmente, un ARN interferente ("ARNi") es un ARN de interferencia corto bicatenario (siRNA), un ARN en horquilla corto (shRNA) o un micro-ARN monocatenario (miRNA) que da como resultado la degradación catalítica de ARNm específicos, y también puede ser utilizado para disminuir o inhibir la expresión génica. Véase, por ejemplo, US 7560438, US 8202980, US 8420391, y US 8445237, Pillai et al., Trends in Cell Biology 17 (3): 118-126, véase, por ejemplo, Paddison, et al., Genes & Development 16:948-958.
Pueden diseñarse moléculas de siRNA, miRNA y asRNA (ARN antisentido) mediante métodos bien conocidos en la técnica. Las moléculas de siRNA, miRNA y asRNA con homología suficiente para proporcionar la especificidad de la secuencia necesaria para degradar de forma única cualquier ARN se pueden diseñar utilizando programas conocidos en la técnica, incluyendo, entre otros, los que se mantienen en los sitios web para AMBION, Inc. y DHARMACON, Inc. El análisis sistemático de diversas especies diseñadas para la optimización del siRNA, miRNA, y secuencia del asRNA puede ser llevado a cabo rutinariamente por los expertos en la técnica. Las consideraciones al diseñar moléculas cortas de ácido nucleico interferente incluyen, entre otras, consideraciones biofísicas, termodinámicas y estructurales, preferencias de base en posiciones específicas en la cadena de sentido, y homología. Estas consideraciones son bien conocidas en la técnica y proporcionan las pautas para diseñar las moléculas de ARN antes mencionadas. Véase, por ejemplo, US 7560438, US 8202980, US 8420391, y US 8445237.
Un polinucleótido antisentido (preferentemente ADN) puede ser cualquier oligonucleótido antisentido siempre y cuando posea una secuencia de bases complementaria o sustancialmente complementaria a la del gen o ARN que codifica PTP1B. La secuencia de bases puede tener al menos un 80%, 90% o 95% de identidad de secuencia con el complemento del gen que codifica el polipéptido. Estos ADN antisentido se pueden sintetizar mediante un sintetizador de ADN. Véase, por ejemplo, US 8685368, US 8153777, y US 8034376.
El ADN antisentido puede contener azúcares, bases o ligaciones modificados o cambiados. El ADN antisentido, así como el agente de ARNi mencionado anteriormente, también puede ser proporcionado en una forma especializada como liposomas, microesferas, o puede ser aplicado a la terapia génica, o puede ser proporcionado en combinación con los restos unidos. Véase, por ejemplo, US 8685368, US 8153777, y US 8034376.
Los ácidos nucleicos mencionados anteriormente codifican uno o más de los agentes de ARNi mencionados anteriormente o pueden clonarse en un vector para su administración a las células in vitro o in vivo. Para los usos in vivo, la administración puede dirigirse a un tejido u órgano específico (por ejemplo, cerebro). Véase, por ejemplo, US 8685368, US 8153777, y US 8034376.
La administración de las secuencias de ácidos nucleicos también se puede lograr utilizando un vector de expresión recombinante, como un virus quimérico o un sistema de dispersión coloidal. El uso de liposomas dirigidos es preferible para la administración terapéutica de las secuencias de ácidos nucleicos.
Diversos vectores virales que pueden ser utilizados para la terapia génica incluyen, adenovirus, virus adeno-asociado (AAV), virus del herpes, vaccinia, o, preferentemente, un virus ARN como un retrovirus y un lentivirus. Preferentemente, el vector retroviral es un lentivirus o un derivado de un retrovirus murino o aviario. Entre los ejemplos de vectores retrovirales en los que se puede insertar un solo gen extraño se incluyen, entre otros: Virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV) y virus del sarcoma de Rous (RSV). Diversos vectores retrovirales adicionales pueden incorporar múltiples genes. Véase, por ejemplo, US 7732129, US 7572906, US 6498033, y US 6165990.
Composiciones
Una composición para utilizar de acuerdo con la invención puede contener un portador adecuado y uno o más de los agentes terapéuticos descritos anteriormente. La composición puede ser una composición farmacéutica que contiene un portador farmacéuticamente aceptable.
La expresión "composición farmacéutica" se refiere a la combinación de un agente activo con un portador, inerte o activo, lo que hace que la composición sea especialmente adecuada para uso diagnóstico o terapéutico in vivo o ex vivo. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptable incluyen todos y cada uno de los solventes, diluyentes, u otro vehículo líquido, auxiliares de la dispersión o de la suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsificantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según se adapte a la forma particular de dosificación deseada. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18va Edición, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990). Un portador farmacéuticamente aceptable, después de ser administrado a un sujeto, no causa efectos fisiológicos indeseables. El portador en la composición farmacéutica debe ser "aceptable" también en el sentido de que sea compatible con el ingrediente activo y pueda ser capaz de estabilizarlo. Se pueden utilizar uno o más agentes solubilizantes como portadores farmacéuticos para la administración de un compuesto activo. Los ejemplos de un portador farmacéuticamente aceptable incluyen, entre otros, vehículos biocompatibles, adyuvantes, aditivos y diluyentes para lograr una composición utilizable como forma de dosificación. Los ejemplos de otros portadores incluyen óxido de silicio coloidal, estearato de magnesio, celulosa, laurilsulfato de sodio y amarillo D&C # 10.
La composición descrita anteriormente, en cualquiera de las formas descritas anteriormente, puede ser utilizada para tratar el síndrome de Rett que se caracteriza y es causado por defectos en el gen MECP2 en las células afectadas, por ejemplo, una o más mutaciones en el gen según lo descrito en la presente invención. Una cantidad eficaz se refiere a la cantidad de un compuesto/agente activo que se requiere para conferir un efecto terapéutico a un sujeto tratado. Las dosis eficaces variarán, según lo reconocen los expertos en la técnica, dependiendo de los tipos de enfermedades tratadas, la vía de administración, el uso de excipientes, y de la posibilidad del uso conjunto con otro tratamiento terapéutico.
Una composición farmacéutica para utilizar de acuerdo con la presente invención puede ser administrada por vía parenteral, oral, nasal, rectal, tópica, o bucal. El término "parenteral", tal y como se utiliza en la presente, se refiere a la inyección subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional o intracraneal, así como cualquier técnica de infusión adecuada. Una composición inyectable estéril puede ser una solución o suspensión en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico. Tales soluciones incluyen, entre otras, 1,3-butanodiol, manitol, agua, solución de Ringer, y solución isotónica de cloruro sódico. Una composición para la administración oral puede ser cualquier forma de dosificación oral aceptable incluyendo cápsulas, tabletas, emulsiones y suspensiones acuosas, dispersiones, y soluciones.
Un "sujeto" se refiere a un animal humano y no humano. Algunos ejemplos de animales no humanos son los mamíferos, como los primates no humanos (particularmente los primates superiores), perro, roedor (por ejemplo, ratón o rata), cobaya y gato. En una forma de realización preferida, el sujeto es un ser humano. En otra forma de realización, el sujeto es un animal experimental o animal adecuado como modelo de enfermedad (tal como un modelo de ratón del síndrome de Rett). Un sujeto que va ser tratado puede ser identificado por técnicas de diagnóstico estándar para el trastorno.
Los términos "tratar" o "tratamiento" se utilizan indistintamente y se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas; en donde el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) la afección patológica o trastorno objetivo. En particular, se refiere a la administración de un compuesto o agente a un sujeto, que tiene un trastorno (síndrome de Rett), con el propósito de curar, aliviar, mitigar, remediar, retrasar la aparición, prevenir o mejorar el trastorno, el síntoma del trastorno, el estado de la enfermedad secundaria al trastorno, o la predisposición hacia el trastorno.
Una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad del compuesto o agente que es capaz de producir un resultado médicamente deseable en un sujeto tratado. El método de tratamiento puede realizarse in vivo o ex vivo, solo o en combinación con otros fármacos o terapia. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede administrarse en una o más administraciones, aplicaciones o dosificaciones y no pretender estar limitada a una formulación o vía de administración particular. La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, el agente terapéutico en particular y similares.
Los compuestos utilizados en la invención son preferentemente formulados en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de dosificación. La expresión "forma unitaria de dosificación", tal y como se utiliza en la presente, se refiere a una unidad físicamente discreta de agente terapéutico apropiada para el paciente que se va a tratar. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de los compuestos y composiciones utilizadas en la presente invención será decidido por el médico responsable dentro del alcance de un buen criterio médico. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente u organismo en particular dependerá de diversos factores, incluyendo el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el momento de la administración, la vía de administración y la tasa de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; los medicamentos utilizados en combinación o coincidiendo con el compuesto específico empleado; y factores similares bien conocidos en las artes médicas.
Se puede administrar un agente terapéutico in vivo o ex vivo, solo o en combinación con otros fármacos o terapia, es decir, un cóctel terapéutico. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "coadministración" o "coadministrado" se refiere a la administración de al menos dos agentes o terapias a un sujeto. En otras formas de realización, un primer agente/terapia se administra antes de un segundo agente/terapia. Los expertos en la técnica entienden que las formulaciones y/o las vías de administración de los diversos agentes/terapias utilizadas pueden variar.
En una forma de realización, se coadministra un primer inhibidor de molécula pequeña de PTP1B con un segundo inhibidor de molécula pequeña de PTP1B que tiene un mecanismo de acción diferente que el primer inhibidor de molécula pequeña. Por ejemplo, CPT157333 y sus derivados y análogos son inhibidores competitivos de PTP1B, y UA0713 y otros inhibidores de triterpeno son inhibidores no competitivos de PTP1B. Por lo tanto, en una forma de realización, se coadministra un inhibidor competitivo de molécula pequeña de PTP1B con un inhibidor no competitivo de molécula pequeña de PTP1B.
En un enfoque in vivo, se administra un compuesto o agente a un sujeto. Por lo general, el compuesto se suspende en un portador farmacéuticamente aceptable (tal como, por ejemplo, entre otros, solución salina fisiológica) y se administra por vía oral o por infusión intravenosa, o se inyecta o se implanta por vía subcutánea, intramuscular, intratecal, intraperitoneal o intranasal. La dosis requerida depende de la elección de la vía de administración; la naturaleza de la formulación; la naturaleza de la enfermedad del paciente; el tamaño, peso, superficie, edad, y sexo del sujeto; otros fármacos que se administran; y el criterio del médico responsable. Las dosis adecuadas están comprendidas entre 0,01-100 mg/kg. Cabe esperar variaciones en la dosis necesaria en vista de la variedad de compuestos disponibles y las diferentes eficacias de las distintas vías de administración. Por ejemplo, se espera que la administración oral requiera dosis más altas que la administración por inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajustar usando rutinas empíricas estándar para la optimización como se entiende bien en la técnica. La encapsulación del compuesto en un vehículo de administración adecuado (por ejemplo, micropartículas poliméricas o dispositivos implantables) puede aumentar la eficacia de la administración, particularmente para la administración oral.
La presente invención también proporciona una composición que comprende un inhibidor de molécula pequeña de PTP1B para utilizar en el tratamiento del síndrome de Rett. Un inhibidor de molécula pequeña de PTP1B incluye los inhibidores descritos anteriormente, tales como CPT157633 y derivados o análogos de acuerdo con las fórmulas reivindicadas.
Ensayos diagnósticos complementarios
La invención proporciona composiciones, sistemas y agentes terapéuticos para utilizar en métodos para tratar el síndrome de Rett. El método utilizado en la invención puede incluir además un ensayo diagnóstico para determinar si un sujeto tiene una mutación en un gen MECP2. Tal ensayo proporciona información diagnóstica y terapéuticamente importante acerca de los niveles de la expresión génica o proteica en un tejido enfermo u otra muestra de paciente y también se conoce como un ensayo diagnóstico complementario. Véase, por ejemplo, US 20130034847, US 20090176312, y la guía de la FDA (Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos) relacionada (disponible en www.fda.gov/medicaldevices/deviceregulationandguidance/guidancedocuments/ucm262292.htm #).
La proteína MECP2 es una proteína de unión al ADN expresada abundantemente, localizada en el núcleo y asociada con la heterocromatina rica en 5-metilcitosina (5-mC). Sus 486 aminoácidos (aa) contienen dos dominios funcionales conocidos: un dominio de unión a CpG metiladas de 84 aa (MBD) y un dominio de represión transcripcional de 104 aa (TRD). El MBD se une a dinucleótidos CpG simétricamente metilados; el TRD interactúa con el correpresor Sin3A, y juntos reclutan histona desacetilasas. La desacetilación resultante de las histonas centrales H3 y H4 comprime la cromatina, haciéndola inaccesible a la maquinaria transcripcional. La represión dependiente de la metilación del ADN es importante para la inactivación del cromosoma X y la impronta genómica. MECP2 se expresa en todos los tejidos y se cree que actúa como un represor transcripcional global. MECP2 es esencial para el funcionamiento normal de las células nerviosas y particularmente importante para las células nerviosas maduras, donde está presente en niveles altos. El gen MECP2 está localizado en el brazo largo (q) del cromosoma X en la banda 28 (“Xq28”), desde el par de bases 152.808.110 hasta el par de bases 152.878.611. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos con los números 7994127 y 6709817.
Actualmente, casi todos los casos del síndrome de Rett son causados por una mutación en el gen MECP2. Véase, por ejemplo, Amir et al., 1999, Nat. Genet. 23 (2): 185-8; Carney et al., 2003, Schanen et al., 2004, Pediatr Neurol 28 (3): 205-11; Am J Med Genet A 126 (2): 129-40; Van den Veyver et al., 2001, Brain Dev 23 (Supl 1): S147-51; y Miltenberger-Miltenyi G, Laccone F, 2004, Hum. Mutat.22 (2): 107-15. Como el gen MECP2 no funciona correctamente en individuos con síndrome de Rett, se producen cantidades insuficientes o formas estructuralmente anormales de la proteína y pueden causar que otros genes se expresen anormalmente. Por lo tanto, el ensayo diagnóstico complementario descrito en la presente puede ser diseñado para diagnosticar la etapa o el grado del síndrome de Rett y determinar un agente terapéutico al cual un paciente es más probable que responda. Más específicamente, los resultados de dicho ensayo pueden utilizarse para correlacionar niveles de expresión exactos y precisos del gen o proteína MECP2 dentro de muestras de tejido específicas del paciente o sujeto del que se recogió y preservó la muestra de tejido. Esto no sólo proporciona información de diagnóstico sobre el trastorno, sino que también permite que un médico u otro profesional médico determine la terapia apropiada para el paciente.
Se han identificado varias mutaciones en el gen MECP2. Por consiguiente, un experto en la técnica puede analizar si un sujeto tiene una o más de estas mutaciones utilizando métodos clínicos estándar de diagnóstico bien conocidos en la técnica. Normalmente, estos métodos incluyen la obtención de una muestra del sujeto, que puede ser, entre otras, una muestra de tejido, una biopsia, una muestra de fluido (por ejemplo, sangre, orina, saliva, y líquido cefalorraquídeo), etc., y luego someter la muestra al procedimiento de diagnóstico. El médico dispone de muchas metodologías bien conocidas para analizar la muestra, como diversos métodos de detección y amplificación de ácidos nucleicos, incluidos los métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa, y diversos métodos de detección de proteínas, incluidos los métodos de detección basados en anticuerpos. En otros casos, puede ser posible utilizar técnicas de toma de imágenes para el diagnóstico no invasivo. Además de las mutaciones de MECP2, las mutaciones en varios otros genes (por ejemplo, los genes CDKL5 y FOXG1) también contribuyen al síndrome de Rett. Véase, por ejemplo, la Hoja Informativa sobre el Síndrome de Rett del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (Rett Syndrome Fact Sheet by National Institute of Neurological Disorders and Stroke) disponible en /www.ninds.nih.gov/disorders/rett/detail_rett.htm. Por consiguiente, el ensayo diagnóstico complementario de esta invención puede opcionalmente incluir pruebas de detección para uno o más de estos genes.
En un aspecto, el ensayo diagnóstico complementario que puede ser utilizado en la invención proporciona información cualitativa y cuantitativa para determinar si un sujeto tiene o está predispuesto a padecer el síndrome de Rett. Un sujeto con síndrome de Rett o propenso a padecerlo puede determinarse en función de los niveles de expresión, patrones o perfiles del gen MECP2 descrito anteriormente o de sus productos de expresión (ARN o polipéptidos) en una muestra de prueba del sujeto. En otras palabras, los productos se pueden utilizar como marcadores para indicar la presencia o ausencia del trastorno. Los aspectos diagnósticos y pronósticos de los ensayos complementarios que pueden ser utilizados en la invención incluyen métodos para evaluar el nivel de expresión de los productos. Los métodos y kits permiten detectar el síndrome de Rett. Por ejemplo, la falta de expresión del gen MECP2 del tipo salvaje normal en la muestra indica la presencia o el alto riesgo de padecer el trastorno. Por el contrario, un nivel de expresión normal es indicativo de la ausencia del trastorno.
Pueden utilizarse los métodos y marcadores descritos anteriormente para evaluar el riesgo de un sujeto de desarrollar el síndrome de Rett. En particular, los ensayos diagnósticos complementarios que pueden utilizarse en la invención pueden aplicarse a aquellos en cohorte de alto riesgo que ya tienen ciertos riesgos para obtener una visión crítica de la detección temprana.
Puede detectarse un cambio en los niveles de los productos genéticos asociados con el síndrome de Rett en las células de un sujeto antes, o en las primeras etapas, del desarrollo de fenotipos de la enfermedad. Por lo tanto, el método de tratamiento también puede incluir el examen de un sujeto con riesgo de desarrollar el síndrome de Rett, que comprende la evaluación del nivel de expresión del gen MECP2 o de la mutación o mutaciones genéticas en una muestra de prueba adecuada y, opcionalmente, los niveles de uno o más de los otros marcadores. Por consiguiente, una diferencia o alteración del nivel del producto genético, o de la combinación de productos genéticos, en la muestra biológica en comparación con el nivel de un producto genético correspondiente en una muestra de control, indica que el sujeto está en riesgo de desarrollar el síndrome de Rett. La muestra biológica utilizada para tal detección sistemática puede incluir una población de células de la sangre del sujeto que es normal o se sospecha que tiene el trastorno. Los sujetos con un cambio en el nivel de uno o más productos genéticos asociados con el síndrome de Rett o con una o más mutaciones en el gen MECP2 son candidatos para un seguimiento y pruebas adicionales. Tales pruebas adicionales pueden incluir exámenes histológicos, neurológicos o conductuales utilizando técnicas conocidas en la técnica.
Para una mayor precisión del ensayo diagnóstico complementario, se puede evaluar a un sujeto o paciente en función del estado físico y neurológico pertinente. Por ejemplo, se puede diagnosticar clínicamente el síndrome de Rett observando los signos y síntomas durante el crecimiento y desarrollo tempranos de un paciente, y realizando evaluaciones continuas del estado físico y neurológico del paciente. Con ese fin, se puede consultar a un neurólogo pediátrico, genetista clínico o pediatra del desarrollo para confirmar el diagnóstico clínico del síndrome de Rett. El médico puede utilizar un conjunto de directrices muy específicas que se dividen en tres tipos de criterios clínicos: principal, de apoyo y de exclusión, que se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, el Manual de Diagnóstico y Estadística de los Trastornos Mentales (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders) 5ta edición, American Psychiatric Association, 18 de mayo de 2013, y la Hoja Informativa sobre el Síndrome de Rett del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (Rett Syndrome Fact Sheet by National Institute of Neurological Disorders and Stroke) disponible en www.ninds.nih.gov/disorders/rett/detail_rett.htm.
El síndrome de Rett se ha clasificado en cuatro etapas según la edad y los síntomas de los pacientes. Supra. Mientras que los de las etapas II (edades 1-4), III (edades 2-10), y IV (edades 11 y más) muestran el estado físico y neurológico particular característico del síndrome de Rett, los síntomas de los pacientes de la etapa I (típicamente comienzan entre 6 y 18 meses de edad) pueden ser confusos y a menudo se pasan por alto. Supra. Por consiguiente, el ensayo diagnóstico complementario descrito anteriormente es especialmente deseable para estos pacientes jóvenes en etapa
Como se mencionó anteriormente, el síndrome de Rett y las mutaciones del gen MECP2 afectan a los niños más gravemente, ya que un niño tiene sólo un cromosoma X y aquellos con defectos mueren poco después del nacimiento. Por consiguiente, el ensayo diagnóstico complementario de la presente invención debe realizarse mucho antes en varones sospechados de tener síndrome de Rett. Por ejemplo, puede realizarse un diagnóstico prenatal o detección sistemática prenatal en un feto o embrión masculino antes de que nazca. Los procedimientos comunes de prueba incluyen amniocentesis, ecografía incluyendo ecografía de translucencia nucal, prueba de marcador sérico, o cribado genético. Supra.
Por "diagnóstico" o "evaluación" se refiere al diagnóstico de un síndrome de Rett, al diagnóstico de una etapa del síndrome de Rett, al diagnóstico de un tipo o clasificación de un síndrome de Rett, al diagnóstico o detección de una recurrencia de un síndrome de Rett, diagnóstico o detección de una regresión de un síndrome de Rett, pronóstico de un síndrome de Rett o evaluación de la respuesta de un sujeto tratado a una terapia. Por lo general, el diagnóstico de una enfermedad o trastorno se basa en la evaluación de uno o más factores y/o síntomas que son indicativos de la enfermedad. Es decir, se puede realizar un diagnóstico basado en la presencia, ausencia o cantidad de un factor, que es indicativo de la presencia, o ausencia de la enfermedad o afección. Cada factor o síntoma que se considera indicativo para el diagnóstico de una enfermedad en particular no necesita estar relacionado exclusivamente con la enfermedad en particular; es decir, puede haber diagnósticos diferenciales que se pueden inferir de un factor o síntoma diagnóstico. Asimismo, puede haber casos en los que un factor o síntoma que es indicativo de una enfermedad en particular esté presente en un individuo que no tiene la enfermedad en particular. Los métodos de diagnóstico se pueden utilizar independientemente, o en combinación con otros métodos de diagnóstico y/o estadificación conocidos en la técnica médica para una enfermedad o trastorno particular, por ejemplo, el síndrome de Rett.
Sistemas y kits
En algunas formas de realización de esta invención, la terapéutica descrita anteriormente puede ser combinada con pruebas genéticas o genómicas que determinan si ese individuo es un portador de un gen mutante que se sabe que está relacionado con un desorden del espectro autista, tal como el síndrome de Rett. Puede utilizarse este enfoque de medicina personalizada para descubrir la predisposición de un sujeto a la enfermedad o trastorno y su susceptibilidad a la terapia, y tratar al sujeto en consecuencia.
Por consiguiente, otro aspecto de la invención proporciona un sistema según lo definido en la reivindicación 2 para utilizar en el tratamiento del síndrome de Rett que contiene una cantidad eficaz de cualquiera del agente terapéutico descrito anteriormente (o una combinación de los mismos) y un kit para diagnosticar el síndrome de Rett. El kit puede comprender un recipiente para recoger una muestra que contenga ácido nucleico, por ejemplo, un tubo para recoger sangre. Los kits de acuerdo con la presente invención pueden comprender reactivos para realizar el diagnóstico, incluyendo métodos para amplificación de ácido nucleico, copiado, extensión de cebadores, detección, identificación, y/o cuantificación. A tal efecto, puede suministrarse uno o más de los componentes de reacción para los métodos descritos en la presente, en forma de kit para utilizar en la detección de un ácido nucleico objetivo. En tal kit, se proporciona una cantidad apropiada de uno o más componentes de la reacción en uno o más recipientes o se mantiene en un sustrato (por ejemplo, por interacciones electrostáticas o unión covalente).
El kit descrito en la presente comprende preferentemente reactivos para la secuenciación basada en PCR de una o más de las regiones codificantes y límites entre exones e intrones del gen MECP2. Los kits pueden incluir uno o más de los cebadores específicos para el ADN o ARN genómico del gen MECP2 descrito anteriormente. El kit puede incluir uno o más recipientes que contengan uno o más cebadores. Un kit puede contener un solo cebador en un solo recipiente, múltiples recipientes que contienen el mismo cebador, un solo recipiente que contiene dos o más cebadores cebadores de la invención, o múltiples recipientes que contienen diferentes cebadores o mezclas de dos o más cebadores. Los kits abarcan cualquier combinación y permutación de cebadores y recipientes.
El kit también puede contener materiales adicionales para practicar los métodos descritos anteriormente. Por lo tanto, el kit puede comprender algunos o todos los reactivos para realizar una reacción de PCR utilizando el cebador de la invención. Algunos o todos los componentes de los kits pueden ser proporcionados en los recipientes separados del recipiente o recipientes que contiene(n) el cebador de la invención. Entre los ejemplos de componentes adicionales de los kits se incluyen, entre otros, una o más polimerasas diferentes, uno o más cebadores específicos para un ácido nucleico de control o para un ácido nucleico objetivo, una o más sondas específicas para un ácido nucleico de control o para un ácido nucleico objetivo, amortiguadores para reacciones de polimerización (en formas IX o concentradas) y uno o más colorantes o moléculas fluorescentes para detectar productos de polimerización. El kit también puede incluir uno o más de los siguientes componentes: soportes, reactivos de terminación, modificación o digestión, osmolitos y un aparato para detectar una sonda de detección.
Los componentes de la reacción utilizados en un proceso de amplificación y/o detección pueden proporcionarse de diversas formas. Por ejemplo, los componentes (por ejemplo, enzimas, trifosfatos de nucleótidos, sondas y/o cebadores) pueden suspenderse en una solución acuosa o como polvo liofilizado o secado por congelación, miniesfera (pellet) o perla. En este último caso, los componentes, una vez reconstituidos, forman una mezcla completa de componentes para su uso en un ensayo.
Un kit o sistema puede contener, en una cantidad suficiente para al menos un ensayo, cualquier combinación de los componentes descritos en la presente invención, y puede incluir además instrucciones registradas de forma tangible para el uso de los componentes. En algunas aplicaciones, puede proporcionarse uno o más componentes de la reacción en cantidades de un solo uso pre-medidas en tubos individuales, normalmente desechables, o recipientes equivalentes. Con esta disposición, la muestra que se va a analizar para detectar la presencia de un ácido nucleico objetivo se puede añadir a los tubos individuales y puede llevarse a cabo la amplificación directamente. La cantidad de un componente suministrado en el kit puede ser cualquier cantidad apropiada, y puede depender del mercado objetivo al que se dirige el producto. Las pautas generales para determinar las cantidades apropiadas pueden encontrarse, por ejemplo, en Joseph Sambrook y David W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; y Frederick M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 2003.
Los sistemas de la invención o los kits pueden comprender cualquier número de reactivos adicionales o sustancias que son útiles para practicar un método de la invención. Estas sustancias incluyen, entre otras: reactivos (incluidos los amortiguadores) para aislar células, reactivo para la lisis de células, agentes quelantes de cationes divalentes u otros agentes que inhiben nucleasas no deseadas, ADN/ARN control para utilizar con el fin de garantizar que los cebadores, la polimerasa y otros componentes de las reacciones funcionen correctamente, reactivos de aislamiento de ARN (incluidos los amortiguadores), reactivos de reacción de amplificación (incluidos los amortiguadores), y soluciones de lavado. Pueden suministrarse kits a cualquier temperatura. Por ejemplo, para el almacenamiento de los kits que contienen componentes proteicos o complejos de los mismos en un líquido, se prefiere que se proporcionen y mantengan por debajo de 0 °C, preferentemente a -20 °C o por debajo de dicha temperatura, o de otro modo en estado congelado.
El o los recipientes en los que se suministran los componentes pueden ser cualquier recipiente convencional capaz de contener la forma suministrada, por ejemplo, tubos de microcentrífuga, ampollas, botellas, o dispositivos de prueba integrales, como dispositivos fluídicos, cartuchos, flujo lateral u otros dispositivos similares. Los kits pueden incluir sondas de ácido nucleico etiquetadas o sin etiquetar para su uso en la amplificación o detección de ácidos nucleicos objetivo. En algunas formas de realización, los kits pueden incluir además instrucciones para utilizar los componentes en cualquiera de los métodos descritos en la presente, por ejemplo, un método que utiliza una matriz cruda sin extracción y/o purificación de ácido nucleico.
Los kits o sistema también pueden incluir materiales de embalaje para contener el recipiente o una combinación de recipientes. Los materiales de embalaje típicos para estos kits y sistemas incluyen matrices sólidas (por ejemplo, vidrio, plástico, papel, lámina, micropartículas y similares) que mantienen los componentes de reacción o las sondas de detección en una variedad de configuraciones (por ejemplo, en un vial, pocillo de placa de microtitulación, micromatriz, etc.).
Las instrucciones en el uso de una prueba de diagnóstico complementaria pueden proporcionarse en material escrito empaquetado con un compuesto, composición, o kit de la invención. El material escrito puede ser, por ejemplo, una etiqueta. El material escrito puede sugerir condiciones o características genéticas relevantes para el síndrome de Rett o los compuestos terapéuticos. Las instrucciones proporcionan al sujeto y al médico supervisor la mejor orientación para lograr un resultado clínico óptimo de la administración de la terapia. Por ejemplo, un sistema de esta invención, además de contener los componentes del kit, puede incluir además la instrumentación para conducir un ensayo, por ejemplo, un luminómetro para detectar una señal de una sonda etiquetada y/o un dispositivo magnético para separar ácido nucleico hibridado a una sonda de captura.
Las instrucciones, tales como indicaciones escritas o demostraciones grabadas en vídeo que detallan el uso del sistema de la presente invención o el kit, se proporcionan opcionalmente con el kit o los sistemas.
Opcionalmente, los sistemas de la invención o el kit incluyen además programas informáticos para acelerar la generación, análisis y/o almacenamiento de datos, y para facilitar el acceso a las bases de datos. El kit puede comprender un paquete de programas informáticos para el análisis de datos del estado fisiológico de un sujeto que se va a tratar, que puede incluir perfiles de referencia para compararlos con el perfil de prueba relevante. El programa informático incluye instrucciones lógicas, conjuntos de instrucciones o programas informáticos adecuados que pueden utilizarse en la recopilación, almacenamiento y/o análisis de los datos. El análisis comparativo y relacional de los datos es posible utilizando el programa informático proporcionado.
Dichos kits también pueden incluir información, como referencias a la literatura científica, materiales de prospecto, resultados de ensayos clínicos y/o resúmenes de éstos y similares, que indiquen o establezcan las actividades y/o ventajas de la composición, y/o que describan la dosificación, la administración, los efectos secundarios, las interacciones de medicamentos, u otra información útil para el proveedor de servicios sanitarios. Esta información puede basarse en los resultados de diversos estudios, por ejemplo, estudios en los que se utilizan animales de experimentación con modelos in vivo y estudios basados en ensayos clínicos en humanos. Los kits descritos en la presente se pueden proporcionar, comercializar y/o promover a los proveedores de servicios sanitarios, incluyendo médicos, enfermeras, farmacéuticos, funcionarios del vademécum nacional de especialidades farmacéuticas, y similares. Los kits pueden también, en algunas formas de realización, ser comercializados directamente al consumidor.
Definiciones adicionales
Un "ácido nucleico" se refiere a una molécula de ADN (por ejemplo, un ADNc o ADN genómico), una molécula de ARN (por ejemplo, un ARNm o ARNc), o un análogo de ADN o ARN. Un análogo de ADN o ARN puede ser sintetizado a partir de análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria.
Tal y como se utiliza en la presente, la expresión "ácido nucleico objetivo" o "secuencia objetivo" se refiere a un ácido nucleico que contiene una secuencia de ácido nucleico objetivo. Un ácido nucleico objetivo puede ser monocatenario o bicatenario, y a menudo es ADN, ARN, un derivado de ADN o ARN, o una combinación de los mismos. Una "secuencia de ácidos nucleicos objetivo", una "secuencia objetivo" o una "región objetivo" significa una secuencia específica que comprende toda o parte de la secuencia de un ácido nucleico monocatenario. Una secuencia objetivo puede estar dentro de una plantilla de ácido nucleico, que puede ser cualquier forma de ácido nucleico monocatenario o bicatenario.
Tal y como se utiliza en la presente, el término "amplificación" y sus variantes incluye cualquier proceso para producir múltiples copias o complementos de al menos alguna porción de un polinucleótido, dicho polinucleótido suele denominarse "plantilla". El polinucleótido plantilla puede ser monocatenario o bicatenario. Una plantilla puede ser un ácido nucleico purificado o aislado, o puede ser no purificado o no aislado. La amplificación de una plantilla determinada puede dar como resultado la generación de una población de productos de amplificación de polinucleótidos, denominados colectivamente "amplicón". Los polinucleótidos del amplicón pueden ser de monocatenarios o bicatenarios, o una mezcla de ambos. Típicamente, la plantilla incluirá una secuencia objetivo, y el amplicón resultante incluirá polinucleótidos que tengan una secuencia que sea sustancialmente idéntica o sustancialmente complementaria a la secuencia objetivo. En algunas formas de realización, los polinucleótidos de un amplicón particular son sustancialmente idénticos, o sustancialmente complementarios, entre sí; alternativamente, en algunas formas de realización, los polinucleótidos dentro de un amplicón dado pueden tener secuencias de nucleótidos que varían entre sí. La amplificación puede proceder de manera lineal o exponencial, y puede implicar replicaciones repetidas y consecutivas de una plantilla dada para formar dos o más productos de amplificación. Algunas reacciones de amplificación típicas implican ciclos sucesivos y repetidos de síntesis de ácidos nucleicos basada en plantillas, dando como resultado la formación de una pluralidad de polinucleótidos hijas que contienen al menos alguna porción de la secuencia de nucleótidos de la plantilla y comparten al menos algún grado de identidad de secuencia de nucleótidos (o complementariedad) con la plantilla. En algunas formas de realización, cada instancia de síntesis de ácidos nucleicos, que puede denominarse "ciclo" de amplificación, incluye la creación de un extremo 3' libre (por ejemplo, mediante el corte de una hebra de un ADNbc), generando así un cebador y etapas de extensión del cebador; opcionalmente, también se puede incluir una etapa de desnaturalización adicional en la que la plantilla es parcial o totalmente desnaturalizada. En algunas formas de realización, una ronda de amplificación incluye un número dado de repeticiones de un solo ciclo de amplificación. Por ejemplo, una ronda de amplificación puede incluir 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 o más repeticiones de un ciclo en particular. En una forma de realización de ejemplo, la amplificación incluye cualquier reacción en donde una plantilla particular de polinucleótido es sometida a dos ciclos consecutivos de síntesis de ácidos nucleicos. La síntesis puede incluir la síntesis de ácidos nucleicos dependiente de plantilla.
El término "cebador" u "oligonucleótido cebador" se refiere a una hebra de ácido nucleico o un oligonucleótido capaz de hibridarse a un ácido nucleico plantilla y actuar como punto de inicio para la incorporación de nucleótidos de extensión de acuerdo con la composición del ácido nucleico plantilla para la síntesis de ácidos nucleicos. Los "nucleótidos de extensión" se refieren a cualquier nucleótido (por ejemplo, dNTP) capaz de incorporarse a un producto de extensión durante la amplificación, es decir, ADN, ARN o un derivado de ADN o ARN, que puede incluir una etiqueta.
Tal y como se utiliza en la presente, el término "oligonucleótido" se refiere a un polinucleótido corto, típicamente menor o igual a 300 nucleótidos de largo (por ejemplo, en el rango de 5 y 150, preferentemente en el rango de 10 a 100, más preferentemente en el rango de 15 a 50 nucleótidos de longitud). Sin embargo, tal y como se utiliza en la presente, el término también pretende abarcar cadenas polinucleótidas más largas o más cortas. Un "oligonucleótido" puede hibridarse a otros polinucleótidos, por lo que sirve como sonda para la detección de polinucleótidos o como cebador para la extensión de la cadena de polinucleótidos.
El término "sonda" tal y como se utiliza en la presente se refiere a un oligonucleótido capaz de unirse a un ácido nucleico objetivo de secuencia complementaria a través de uno o más tipos de enlaces químicos, generalmente a través de pares de bases complementarias, generalmente a través de la formación de enlaces de hidrógeno. Las sondas pueden unirse a las secuencias objetivo sin una completa complementariedad con la secuencia de la sonda, dependiendo de la severidad de las condiciones de hibridación. Puede haber cualquier número de errores de apareamiento de pares de bases que interferirán con la hibridación entre la secuencia objetivo y los ácidos nucleicos monocatenarios descritos en la presente. Sin embargo, si el número de mutaciones es tan grande que no se puede producir hibridación ni siquiera bajo las condiciones de hibridación menos severas, la secuencia no es una secuencia objetivo complementaria. Una sonda puede ser monocatenaria o parcialmente monocatenaria y parcialmente bicatenaria. La estructura, la composición y las propiedades de la secuencia objetivo determinan el número de hebras (strandedness) de la sonda. Las sondas pueden etiquetarse directamente o indirectamente con una etiqueta, como la biotina, a la que un complejo de estreptavidina puede unirse posteriormente.
Una "etiqueta" o "molécula indicadora" es un resto químico o bioquímico útil para marcar un ácido nucleico (incluido un nucleótido único), polinucleótido, oligonucleótido o ligando proteico, por ejemplo, aminoácido o anticuerpo. Los ejemplos incluyen agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, agentes cromogénicos, agentes de extinción, radionucleótidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y otros restos conocidos en la técnica. Las etiquetas o las moléculas indicadoras son capaces de generar una señal medible y pueden estar unidas covalente o no covalentemente a un oligonucleótido o nucleótido (por ejemplo, un nucleótido no natural) o ligando.
"Complemento" o "complementario", tal y como se utiliza en la presente, para hacer referencia a un ácido nucleico puede significar apareamiento de bases de Watson-Crick (por ejemplo, A-T/U y C-G) o Hoogsteen entre nucleótidos o análogos de nucleótidos de moléculas de ácido nucleico. Un complemento completo o totalmente complementario puede significar un apareamiento de bases del 100% complementario entre nucleótidos o análogos de nucleótidos de moléculas de ácido nucleico.
"Hibridación" o "hibridar" o "aparear" se refiere a la capacidad de las hebras de ácidos nucleicos, completa o parcialmente complementarias, de reunirse en condiciones específicas de hibridación (por ejemplo, condiciones severas de hibridación) en una orientación paralela o preferentemente antiparalela para formar una estructura o región estable de doble cadena (a veces denominada "híbrido") en la que las dos hebras constitutivas están unidas por enlaces de hidrógeno. Aunque los enlaces de hidrógeno típicamente se forman entre adenina y timina o uracilo (A y T o U) o citosina y guanina (C y G), pueden formarse otros pares de bases (por ejemplo, Adams et al., The Biochemistry of the nucleic acids, edición Nro. 11, 1992).
La expresión "condiciones rigurosas de hibridación" o "condiciones rigurosas" significa las condiciones en las que una sonda o un oligómero se hibrida específicamente a su secuencia de ácidos nucleicos objetivo prevista y no a otra secuencia. Las condiciones rigurosas pueden variar dependiendo de factores bien conocidos, por ejemplo, contenido de GC y longitud de secuencia, y pueden predecirse o determinarse empíricamente utilizando métodos bien conocidos por un experto en biología molecular (por ejemplo, Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2da ed., Cap. 11, pp. 11.47-11.57, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)).
Las "condiciones rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad" típicamente: (1) emplean una baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecilsulfato sódico al 0,1% a 50 °C.; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, 50% (v/v) formamida con seroalbúmina bovina al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/amortiguador de fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42 °C.; o (3) emplean 50% formamida, 5x SSC (cloruro sódico/citrato sódico, NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, solución de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 mg/ml), SDS al 0,1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42 °C, con lavados a 42 °C en 0,2x SSC y 50% de formamida a 55 °C, seguido de un lavado de alta rigurosidad que consiste en 0,1x SSC que contiene EDTA a 55 °C.
Las "condiciones moderadamente rigurosas" pueden identificarse convencionalmente e incluir el uso de condiciones de solución de lavado y de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante la noche a 37 °C en una solución que comprende: formamida al 20%, 5x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5x, sulfato de dextrano al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cizallado desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 1x SSC a aproximadamente 37-50 °C. El experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc. según sea necesario para adaptarse a factores como la longitud de la sonda y similares, mediante el uso de las instrucciones del fabricante (véase, por ejemplo, las instrucciones del sistema Illumina).
El término "muestra" se refiere a una muestra obtenida de un organismo (por ejemplo, paciente) o de componentes (por ejemplo, células) de un organismo. La muestra puede ser de cualquier tejido biológico, célula o fluido. La muestra puede ser una "muestra clínica", que es una muestra derivada de un sujeto, como un paciente humano o un animal. Estas muestras incluyen, entre otras, saliva, esputo, sangre, glóbulos sanguíneos (por ejemplo, glóbulos blancos), líquido amniótico, plasma, semen, médula ósea, y muestras de tejido o biopsia con aguja fina, orina, líquido peritoneal y líquido pleural, o células de los mismos. Las muestras biológicas también pueden incluir secciones de tejidos, como secciones congeladas tomadas con fines histológicos. Una muestra biológica también puede denominarse "muestra de paciente". Una muestra biológica también puede incluir un ácido nucleico sustancialmente purificado o aislado, proteína, preparación de membranas o cultivo celular.
Los términos "determinar", "medir", "evaluar", "analizar" y "ensayar" se utilizan indistintamente e incluyen la medición cuantitativa y cualitativa, e incluyen la determinación de si una característica, rasgo o distintivo está presente o no. La evaluación puede ser relativa o absoluta. La evaluación de la presencia de un objetivo incluye determinar la cantidad del objetivo presente, así como determinar si está presente o ausente.
Tal y como se describe en la presente invención, se proporcionan diversos rangos de valores. Se entiende que cada valor intermedio, a la décima de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de ese rango también se describe específicamente. Cada rango más pequeño entre cualquier valor indicado o valor intermedio en un rango indicado y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese rango indicado está abarcado dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos rangos más pequeños pueden incluirse o excluirse de forma independiente en el rango, y cada rango en el que uno, ninguno o ambos límites se incluyan en los rangos más pequeños también está embarcado dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el rango indicado. Cuando el rango indicado incluye uno o ambos límites, los rangos excluyendo uno o ambos de los límites incluidos también se incluyen en la invención.
El término "aproximadamente" generalmente se refiere a más o menos el 10% del número indicado. Por ejemplo, “aproximadamente el 10%” puede indicar un rango de 9% a 11%, y “aproximadamente 1” puede significar de 0,9 a 1,1. Otros significados de "aproximadamente" pueden ser evidentes del contexto, como redondeo, por lo que, por ejemplo, "aproximadamente 1" también puede significar de 0,5 a 1,4.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
En los ejemplos siguientes se utilizaron los siguientes materiales y métodos.
Ratones. Todos los experimentos con animales se realizaron utilizando protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de CSHL (siglas en inglés correspondientes a Cold Spring Harbor Laboratory). En este estudio se utilizaron ratones B6.129-MeCP2tm11Bird/J adquiridos en Jackson Labs (003890). Se utilizaron ratones CBA/CaJ en los ensayos de recuperación de crías.
Administración de fármacos. Se disolvieron CPT157633 (CEPTYR Inc, Bothell, WA) y UA0713 (TCRS LLC, Bristol, PA) en solución salina estéril y se administraron por vía intraperitoneal o subcutánea. CPT157633 se administró a una dosis única de 5 mg/kg de peso corporal todos los días y UA0713 se administró a una dosis de 5 mg/kg cada dos días. Con ratones machos WT (siglas en inglés correspondientes a tipo salvaje) y Mecp2rly, se inició la administración de compuestos a P2 y con ratones hembras WT y Mecp2r/+ se inició la administración de compuestos a las 10 semanas de edad.
Anticuerpos y reactivos. Todos los reactivos se compraron a Sigma-Aldrich a menos que se indique lo contrario. Los anticuerpos utilizados en el estudio fueron contra los siguientes: PTP1B (Cat # 04-1140, EP1841Y (clon), Millipore), 4G10 (Cat # 05-321,4G10 (clon), Upstate Biotechnology), pY1162/1163-IRp (Cat # 700393, 97H9L7 (clon), Invitrogen), IR-B (Cat # sc-711, C711 (clon), Santa Cruz biotechnology), flag (Cat # F3040, M1 (clon)) y Actina (Cat # A2228, AC-74 (clon) (Sigma), IRS1 (Cat # 2382, 59G8 (clon)), pT308AKT (Cat # 13038, D25E6 (clon)), pS473AKT (Cat # 4051, 587F11 (clon)), AKT (Cat # 4691, C67E7 (clon)), pTFOXO1 (Cat # 2599, 4G6 (clon)), FOXO1 (Cat # 2880, C29H4 (clon)), p-GSK3B (Cat # 8452, D1G2 (clon)), GSK3B (Cat # 12456, D5C5Z (clon)), pY705/706TRKB (Cat # 4621, C50F3 (clon)) , pY515TRKB (Cat # 4619, C53G9 (clon)), TRKB (Cat # 4603, 80E3 (clon) y MECP2 (Cat # 3456, D4F3 (clon) (Señalización celular). Los fibroblastos de control y derivados de pacientes con RETT se obtuvieron del repositorio de Corriell. Los constructos de expresión TRKA y TRKC fueron un generoso regalo del Dr. Moses Chao, NYU Medical Center, NY.
Mediciones metabólicas. La glucosa en la sangre de la cola se midió con un glucómetro (One-Touch Basic; Lifescan, CA). Para las pruebas de tolerancia a la glucosa (PTG), los ratones fueron sometidos a ayuno durante 10 horas y luego se les inyectó D-glucosa al 20% (2 mg/g de peso corporal) y se controló la glucosa en sangre inmediatamente antes y a los 15, 30, 60 y 120 minutos después de la inyección. Para las pruebas de tolerancia a la insulina (PTI), se administró insulina (0.75 mU/g) a los animales en ayunas de 4 h y se midió la glucosa en sangre inmediatamente antes y a los 30, 60 y 120 minutos después de la inyección. Se determinaron la insulina sérica, colesterol, triglicéridos (Stanbio Labs, TX), BDNF (Abnova), IGF1 e IGFBP (R&D Systems) mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima.
ChIP y PCR cuantitativa. Para ChIP, se utilizaron tres cerebros de ratón enteros de ratones machos WT. Brevemente, se molieron los cerebros congelados rápidamente y se agregó al formaldehído al 1% en polvo. La fijación se continuó durante 15 minutos a temperatura ambiente y se terminó con una solución de glicina 0,125 M. Las células se peletizaron y homogeneizaron en un homogeneizador Dounce. Después de la centrifugación, se resuspendieron las células en 5 ml de amortiguador de lisis (Tris 10 mM pH 8,0, NP-40 al 0,2%, NaCl 10 mM, inhibidores completos de proteasa (Roche)). Se hizo pasar el lisado a través de una aguja de calibre 25 para eliminar los grumos y se incubó durante 15 minutos adicionales en 5 ml de amortiguador de lisis. Se recolectaron los núcleos por centrifugación (4.000 x g) durante 5 minutos y se resuspendió el sedimento en 2 ml de amortiguador de lisis de núcleos (Tris-HCl 50 mM, EDTA 10 mM, dodecilsulfato de sodio [SDS] 1%, inhibidores de proteasa). Se lisaron los núcleos durante 5 minutos a temperatura ambiente y se diluyeron en 1 ml de amortiguador de dilución ChIP (Tris 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, Triton al 1%, inhibidores de proteasa). Se sonicó la cromatina (5 min, ciclo de trabajo 50, salida 8). Tras la sonicación, se eliminó la cromatina por centrifugación, se eliminó previamente con proteína A-Sefarosa (Sata Cruz Biotechnology) y se sometió a inmunoprecipitación durante la noche con anticuerpo anti-MeCP2. Se unieron los precipitados de anticuerpos a proteína A-Sefarosa durante 1 h y se lavaron una vez (SDS al 0,1%, Triton X-100 al 1%, EDTA 2 mM, NaCl 150 mM, Tris-HCl 20 mM [pH 8]), tres veces con amortiguador de lavado I ChIP (SDS al 0,1%, Triton X-100 al 1%, EDTA 2 mM, NaCl 500 mM, Tris-HCl 20 mM [pH 8]), una vez con amortiguador de lavado III ChIP (LiCl 0,25 M, NP-40 1%, desoxicolato al 1%, EDTA 1 mM, Tris-HCl 10 mM [pH 8]), y tres veces con Tris-EDTA.
Los precipitados de ADN-anticuerpo se eluyeron dos veces con SDS al 1 %, bicarbonato de sodio 0,1M y se invirtieron los entrecruzamientos a 65°C durante 6 horas. El ADN se purificó con QIAGEN según el kit de purificación. Del eluido final se utilizaron 2 ml para las PCR. Para los estudios de expresión génica se extrajo ARN total de ratones machos WT y nulos para Mecp2. Se utilizó el ARN extraído para sintetizar el ADNc mediante el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad, 170-8890). Se utilizó el ADNc sintetizado de muestras de cerebro de ratones WT y nulos para Mecp2 para PCR cuantitativa utilizando un instrumento 7900HT de Applied Biosystems. Se utilizaron arreglos de PCR de perfilador en tiempo real (RT profiler) (Qiagen, Cat. Nro. 330231-006ZA y 330231-0030ZA) para observar los cambios en la expresión génica en la vía de señalización de la insulina y el metabolismo de la glucosa.
Identificación de TrkB como sustrato de PTP1B. Se incubaron lisados de cerebro (1 mg/ml) obtenidos de ratones hembra WT y Mecp2r/+ tratados con inhibidor de PTP1B y/o solución salina con 20 ml de proteína de fusión PTP1B y D181A PTP1B tipo salvaje marcada con His acoplada a perlas (10 mg/ml) en presencia y ausencia de pervanadato 1 mM. Después de varios lavados, se analizaron los complejos mediante inmunotransferencia.
Ensayo de recogida de crías. Se realizó un test de recogida de crías del modo descrito por Lau et al. Neuroscience 2013, Presentación de la 43a Reunión Anual de la Sociedad de Neurociencia disponible en http://sfn2013.conferencespot.org/55321-sn6-1.225941/t-010-1.227112/335-12-1.227119/335-12-1.227120).
Ensayo del promotor PTP1B. Se transfectaron células HEK 293T utilizando Reactivo Lipofectamina (Life Technologies, Inc.) de acuerdo con los protocolos del proveedor. Típicamente, se utilizó 1 mg del plásmido indicador que contenía diferentes longitudes del promotor junto con 1 mg de pRL-TK (Promega), un vector de expresión que contenía ADNc que codifica Renilla luciferasa como control interno de la eficacia de transfección. Se utilizaron aproximadamente 1,0 3 105 células para cada transfección con Reactivo Lipofectamina (Life Technologies, Inc.) en una placa de 24 pocillos. Se utilizó un mg del plásmido indicador para la expresión de luciferasa de luciferasa de luciérnaga. Se cotransfectaron plásmidos de expresión para MECP2-E1 humano (0,1 mg/ml), MECP2-E2 (0,1 mg/ml), o plásmido control sin inserto (0,1 mg/ml). Se incubaron las células con complejo ADN-lípido durante 24 h y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato, y se ensayó la actividad de la luciferasa utilizando el sistema de ensayo indicador de luciferasa dual (Promega).
Ensayo de sujeción de patas. Para el ensayo de sujeción de patas, los ratones fueron suspendidos por sus colas y observados durante 30 segundos. La duración durante la cual los animales sujetaron sus patas se utilizó para calcular el porcentaje (sujeción de las patas (%) = (tiempo dedicado a sujetar las patas (s)/30(s))x 100). Se utilizaron ratones de la misma edad (vehículo Mecp2r/+, n= 18; tratados con CPT157633 n = 18). Las barras de error representan SEM. Se realizó un análisis estadístico utilizando la prueba t pareada, P=0,001.
Rendimiento de varilla giratoria aceleradora (Rotarod). Se utilizó un sistema de varilla giratoria aceleradora de velocidad angular en aumento (instrumentos AccuScan) en ratones hembra de 12 a 14 semanas de edad. Tanto los ratones WT como Mecp2rl+ fueron aclimatados al aparato de prueba con tres ensayos de 90 segundos de velocidad en constante aumento (4-6 rpm). Después de esta aclimatación, se realizaron cuatro ensayos. Estos ensayos se repitieron al día siguiente sin un período de aclimatación. Se registró la latencia hasta la caída de cada ensayo. Las barras de error representan SEM. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA, P=0,01.
Expresión y purificación de proteínas para estudios de RMN. Se expresó el dominio catalítico PTPT1B (residuos 1­ 301; PTP1B1-301) en E. coli y se purificó según lo descrito anteriormente por Krishnan et al. (2014) Nature Chemical Biology 10:558-66. Brevemente, se expresó PTP1B1-301 etiquetado con isótopo en cultivos de E. coli cultivados en medio mínimo M9 que contenía 1 g/L de 15N NHUCl, 100% D2O y ya sea 4 g/L de 13C-D-glucosa o 12C-D-glucosa. Se cultivaron los cultivos a 37°C hasta una DO600 de ~0,6 bajo agitación vigorosa (250 rpm). Se indujo la expresión proteica con la adición de IPTG 1 mM y se incubaron los cultivos durante ~20 horas a 18°C, 250 rpm. Los rendimientos de proteínas fueron ~46 mg/L en caldo Luria, ~34 mg/L en 2H, 15N medio M9 y ~17 mg/L en 2H, 15N, 13C medio M9. Se purificó PTP1B1-301 mediante cromatografía de afinidad a Ni2+ y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, Superdex 7526/60), con HEPES 50 mM pH 6,8, NaCl 150 mM, TCEP 0,5 mM como el amortiguador de RMN final.
Espectroscopia de RMN. Se recopilaron los datos de RMN en un espectrómetro Bruker AvancelIIHD 850 MHz equipado con una criosonda de gradiente Z TCI HCN a 298 K. Se registraron las mediciones de RMN de PTP1B1-301 utilizando ya sea proteína etiquetada con 2H, 15N- o 2H, 15N, 13C a una concentración final de 0,2 mM en HEPES 50 mM pH 6,8, NaCl 150 mM, t Ce P 0,5 mM y 90% de H2O/10% de D2O. La asignación del esqueleto específico de la secuencia de PTP1B1-301 en el estado unido a CPT157633 se logró utilizando los siguientes experimentos a una frecuencia de 850 MHz 1H Larmor: 2D [1H,15N] TROSY, 3D TROSY- HNCA, y 3D TROSY-HN(CO)CA. Los espectros de asignación y titulación se procesaron con Topspin 3.1 (Bruker, Billerica, MA) y se evaluaron los datos utilizando SPARKY (http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/).
Análisis de RMN de unión de inhibidor. Se tituló CPT157633 en [2H,15N]-PTP1B 200 mM en relaciones molares de 0,1:1, 0,2:1, 0,4:1, 0,5:1, 1:1, 1,5:1, 3:1 y 5:1 CPT157633:PTP1B1-301 y se registraron los espectros TROSY 2D [1H,15N] para cada punto de titulación. Se solubilizó CPT157633 en agua a 100 mM. Se calcularon las diferencias de desplazamiento químico (Dd) entre los espectros de PTP1B1-301 y PTP1B1-301 unido a CPT157633 (relación molar 1,5:1) utilizando la siguiente ecuación:
Figure imgf000024_0001
Todos los desplazamientos químicos para PTP1B unido a CPT157633 se depositaron en el BioMagResBank (http://www.bmrb.wisc.edu) bajo el número de acceso 25375.
Cristalización y determinación de estructuras. Se purificó PTP1B1-301 según lo descrito anteriormente (Id.) con la excepción de que el amortiguador de proteína final fue Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 25 mM, EDTA 0,2 mM, TCEP 0,5 mM. Se agregó CPT157633 (relación molar 10:1) a PTP1B para formar PTP1B1-301:CPT157633 y se concentró el complejo proteína:ligando hasta 50 mg/mL para la cristalización. Se obtuvieron los cristales de PTP1B1-301:CPT157633 utilizando difusión de vapor de la gota sentada en Tris 0,1 M, pH 7,4, 20% de PEG8000, MgCb 0,2 M. Se utilizaron los pequeños cristales iniciales como semillas para posteriores ensayos de cristalización en el mismo licor madre. Se crioprotegieron los cristales mediante una inmersión de 10 segundos en licor madre suplementado con glicerol al 30% y CPT157633 10% (100 mM) y se congelaron de inmediato en nitrógeno líquido. Se recopilaron los datos de rayos X en un cristal simple a 112 K utilizando un generador de rayos X con ánodo de cobre giratorio Rigaku FR-E+ Superbright con un detector CCD Saturn 944 HG (Brown University Structural Biology Facility) y se procesaron los datos a 1,9 A. Los datos de PTP1B1-301:CPT157633 se sincronizaron utilizando reemplazo molecular (Phaser como se implementó en PHENIX (Adams et al. (2010) Acta crystallographica Section D, Biological crystallography. 66(Pt 2):213-21)) utilizando PTP1B (PDBID:1C88, (Iverson et al. (2000) The Journal of Biological Chemistry 275:10300-7)) como el modelo de búsqueda. La clara densidad de electrones para CPT157633 unido fue visible en los mapas iniciales. El modelo inicial de PTP1B1-301:CPT157633 se construyó utilizando Phenix.AutoBuild (Adams et al.), seguido por rondas iterativas de refinamiento en PHENIX y construcción manual utilizando Coot (Emsley et al. (2004) Acta crystallographica Section D, Biological crystallography. 60(Pt 12): 2126-32). Se generó el archivo Restraint para el ligando CPT157633 utilizando Phenix.eLBOW (Adams et al.) utilizando la cadena SMILES de CPT157633 CNC(=O)[C@H](Cc1ccc(C(F)(F)P(=O)(O)O)c(Br)c1)NS(C)(=O)=O. Las estadísticas de recopilación y refinamiento de datos se presentan en la Tabla Suplementaria 2. Todas las coordenadas para PTP1B unido a CPT157633 se depositaron en el PDB bajo el número de acceso 4Y14.
Estadísticas. Todos los resultados se expresan como media 6 SEM. Se utilizaron ANOVA y la prueba t de Student (de dos colas) para determinar la significación estadística; se consideró significativo el valor P de 0,05 e inferior. Todos los análisis estadísticos y la generación de gráficos se realizaron utilizando GraphPad Prism (versión 7; programa informático GraphPad).
Ejemplo 2
Se realizaron pruebas de tolerancia a la glucosa y a la insulina (PTG and PTI) tanto en ratones machos Mecp2-Iy como en ratones hembras Mecp2-/+. Los ratones machos hemicigotos MeCP2-/y mostraron intolerancia a la glucosa y eliminaron la glucosa a un ritmo muy lento en comparación con los ratones de tipo salvaje de control. También se encontró que los ratones hembras heterocigotos MeCP2-/+ eran intolerantes a la glucosa (Figura 2A). Se realizaron estudios para determinar si los ratones con desactivación de Mecp2 responden a la insulina como los ratones WT. Se descubrió que tanto en Mecp2r/y como en Mecp2r/+ los niveles de glucosa en sangre no respondieron a la insulina administrada (Figura 2B). Se observó intolerancia a la glucosa y a la insulina tanto en ratones Mecp2-/y como en Mecp2-/+, sin embargo fue más pronunciada en ratones macho Mecp2-/y, lo que se puede explicar por la diferencia en los niveles de expresión de Mecp2. Se descubrió además que los niveles de insulina eran más altos tanto en los ratones Mecp2-/y como en los ratones Mecp2-/+ en comparación con sus homólogos WT. Para caracterizar más esto, se estudió la vía de señalización de la insulina tanto en ratones Mecp2-/y como en ratones Mecp2-/+. Se descubrió que los ratones con desactivación de Mecp2 mostraron una reducción en la señalización de la insulina caracterizada por una reducción en la fosforilación de tirosina del receptor de insulina (IR-p) y del sustrato del receptor de la insulina-1 (IRS1) El reclutamiento del IRS1 fosforilado al receptor desencadena la activación de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y la estimulación de moléculas de señalización corriente abajo tal como PKB/AKT, lo que da como resultado la translocación del transportador de glucosa y la absorción de glucosa e inactivación de la glicógeno sintasa quinasa (GSK3p). Por lo tanto, se estudió la fosforilación de la quinasa AKT y la señalización corriente abajo. A diferencia del caso de los ratones WT, los ratones Mecp2-/y mostraron una disminución de la fosforilación de AKT y sus sustratos FOXO y GSK-3p. Los ratones mutantes Mecp2 tienen niveles más altos de niveles circulantes de insulina, sin embargo la señalización inducida por hormonas es inhibida. En ratones Mecp2-/+ se observó una tendencia similar de reducción de la fosforilación de tirosina del receptor de insulina (IR-p), IRS1 y disminución de la activación de AKT.
Para examinar adicionalmente la señalización de insulina en los ratones, se lisó corteza de cada ratón control o nulo para Mecp2 en un amortiguador RIPA y cantidades iguales de lisado se sometieron a inmunotransferencia utilizando anticuerpos que reconocen diversos componentes de la vía de señalización de insulina. Como se muestra en las FIG.
3A y B, se alteró la señalización de la insulina en ratones macho Mecp2-/-. Por ejemplo, mientras que las cantidades totales de proteína AKT en los ratones control y en los ratones nulos para Mecp2 eran casi iguales, la fosforilación de la proteína AKT en los ratones nulos para Mecp2 fue significativamente reducida o abolida.
También se realizaron ensayos de inmunotransferencia similares utilizando anticuerpo anti-PTP1B. Se descubrió que la pérdida de MECP2 estaba acompañada por un aumento de la expresión de PTP1B en la corteza. Véase la FIG. 4.
Con el fin de identificar genes específicamente regulados por Mecp2 en la vía de la insulina, se realizó un análisis de expresión génica en la región del cerebro anterior. Se aisló ARN total del cerebro obtenido de ratones con desactivación (KO) de Mecp2-/y y sus miembros de la camada WT. Se realizó PCR cuantitativa de genes cruciales implicados en la señalización de la insulina y el metabolismo de la glucosa (Figuras 5A y 5B). Se seleccionaron genes cuya expresión cambió más de 1,5 veces en Mecp2-/y en comparación con WT. La atención se centró en la vía de señalización de la insulina, ya que se encontró que 4 genes fueron significativamente regulados a la alza en los ratones KO y 5 genes fueron regulados a la baja. Para analizar si Ptpnl es un objetivo directo de Mecp2, se utilizó una serie de plásmidos indicadores en los que la expresión de la luciferasa es impulsada por elementos promotores de Ptpn1. Se expresaron los plásmidos indicadores que contenían diferentes longitudes de secuencia del promotor Ptpnl junto con cualquier isoforma de Mecp2 (Mecp2-E1 y Mecp2-E2). Se observó que ambas isoformas de Mecp2 fueron capaces de suprimir la actividad del promotor Ptpnl en contraste con las células que expresaban sólo los constructos promotores sin Mecp2 (Figura 5C). Además, a diferencia de MECP2 tipo salvaje, la expresión de una forma mutante de pérdida de función clínicamente relevante de la proteína, MECP2-R168X, no suprimió la actividad del promotor PTPN1 (Figura 5C).
Los datos indican que Ptpnl es un objetivo directo de Mecp2. Para confirmar aún más que Mecp2 interactúa con el promotor génico Ptpnl, se llevó a cabo la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Se examinaron diversos genes que han demostrado estar involucrados en la señalización de la insulina para analizar si Mecp2 se dirige específicamente a Ptpnl. De los genes analizados por el análisis de ChIP, se descubrió que Mecp2 se unía fuertemente a la región promotora de dos proteínas, es decir, Ptpnl y Eya 2. A continuación se determinó si el aumento en los niveles de ARNm observado por qPCR se correlaciona con el nivel de proteína en ratones mutantes Mecp2. Se realizó una inmunotransferencia de cantidades iguales de lisado de secciones cerebrales de WT y Mecp2-/y para PtplB. Se descubrió que en ratones machos que carecían de Mecp2, la expresión de PtplB era aproximadamente 1.5-2 veces mayor en comparación con el homólogo WT (Figura 5D). De manera similar, la expresión de PtplB también fue mayor en ratones hembras que carecían de Mecp2 (Figura 5E). El nivel de expresión de Mecp2 se correlacionó con los niveles de PtplB en ratones Mecp2-/+. Se examinaron los niveles de PtplB en fibroblastos derivados de pacientes con RTT. De acuerdo con la observación en ratones mutantes MECP2, se observó una proteína PTP1B elevada en fibroblastos derivados de pacientes con síndrome de Rett (Figura 5F).
Ejemplo 3
Para analizar si la señalización mediada por fosforilación de tirosina aberrante debido a la actividad aumentada de PTP1B podía contribuir a RTT, se utilizaron inhibidores farmacológicos de la fosfatasa. Se trataron ratones WT y mutantes Mecp2-/y con CPT157633 (5 mg/Kg), un inhibidor dirigido al sitio activo de PTP1B, o un inhibidor alostérico, UA0713 (5 mg/Kg). Dos semanas después del tratamiento, se evaluaron los niveles de glucosa sérica y se descubrió que la intolerancia a la glucosa observada previamente se redujo marcadamente (Figura 6B). Se observó un pequeño aumento del peso corporal en los ratones Mecp2r/y que recibieron CPT157633 en comparación con los ratones tratados con solución salina (Figura 6E). Hubo una mejora significativa en los niveles circulantes de insulina y colesterol. Los datos indican que la inhibición de PTP1B causó una mejora general del metabolismo. Además, el tratamiento aumentó la supervivencia 2 veces con una duración media de vida de 75 días para CPT157633 y 95 días para los ratones tratados con UA0713, en comparación con 40 días para los ratones tratados con solución salina (Figura 6A). Para analizar si los inhibidores de moléculas pequeñas se dirigían selectivamente a PTP1B, se examinó la fosforilación de tirosina de IR-B e IRS1, dos sustratos bona fide de la fosfatasa. El tratamiento con inhibidores dio como resultado una mayor fosforilación de la tirosina tanto de IR-B como de IRS1 en comparación con las muestras obtenidas de ratones que no recibieron CPT157633 (Figura 6C). Para comprender el papel del metabolismo de la glucosa en la corrección de los síntomas de RTT, se analizaron otros tres inhibidores de moléculas pequeñas que han demostrado tener propiedades antidiabéticas, es decir, metformina, rosiglitazona y AICAR. Se observó que ninguno de los tres inhibidores era tan eficaz como los inhibidores de PTP1B (Figura 6d ). Los datos indican que la inhibición de PTP1B no sólo regula la señalización de la insulina y el metabolismo de la glucosa, sino también una vía de señalización diferente, lo que es fundamental para revertir el fenotipo observado. Además, se determinó si los inhibidores tendrían un impacto sobre los ratones hembras Mecp2-/+. Se estudió el efecto de la administración de inhibidores sobre la homeostasis de la glucosa establecida. En las tres semanas posteriores a la administración de CPT157633, se encontró que la intolerancia a la glucosa observada con ratones hembras no tratados con solución salina fue corregida y Mecp2-/+ mostró un aclaramiento de glucosa más normal en PTG. Consistentemente, se observó una mejora en la señalización de la insulina.
Ejemplo 4
En este ejemplo, para determinar la importancia de los niveles elevados de PTP1B en modelos animales del síndrome de Rett, se analizaron los efectos de los inhibidores de moléculas pequeñas de la fosfatasa. Utilizando paranitrofenilfosfato (pNPP) como sustrato, se estudió la inhibición de PTP1B por CPT157633 (FIG. 13A). Se descubrió que el compuesto era un inhibidor competitivo de alta afinidad de la fosfatasa (FIG. 13B), con una constante de inhibición (ki) de 40 nM. Se obtuvo un resultado similar utilizando RCML marcado con 32P como sustrato proteico (FIG.
13C). En comparación con PTP1B, CPT157633 fue notablemente menos eficaz contra un panel de seis PTP y dos fosfatasas de doble especificidad (FIG. 13D), ilustrando la especificidad en los efectos del inhibidor. Para obtener información estructural sobre la interacción PTP1B-CPT157633, se utilizaron tanto la espectroscopia de RMN biomolecular como la cristalografía de rayos X. Los residuos 1-301 del dominio catalítico de PTP1B se expresaron en medio basado en D2O y se registraron los espectros TROSY 2D [1H,15N] en ausencia y presencia de CPT157633. El mapeo de perturbación de desplazamientos químicos de RMN (c Sp , por sus siglas en inglés) mostró que los residuos que rodean el sitio activo fueron los más afectados por la unión de CPT157633 a la proteína (Figuras 13E, F). Esto fue confirmado por la estructura cristalina del complejo PTP1 B:CTP157633, que ilustraba una interacción no covalente. Las interacciones electrostáticas realizadas por el compuesto a los residuos del sitio activo crucial se resaltan en la FIG. 13G. En conjunto, estos datos demuestran que CPT157633 es un inhibidor selectivo, reversible, dirigido al sitio activo de FTP1B.
Se caracterizó un segundo inhibidor de PTP1B que ejerce su efecto sobre la enzima por un mecanismo diferente. Se identificaron compuestos con estructura triterpeno, varios de los cuales resultaron ser inhibidores no competitivos de PTP1B. De esos compuestos analizados, se descubrió que UA0713 es el inhibidor más potente de PTP1B. Se observó que UA0713 era un inhibidor no competitivo de PTP1B que inhibía la enzima con una Ki de 150 nM. Inhibió PTP1B con selectividad en comparación con un panel de ocho fosfatasas investigadas. Este ejemplo demuestra que dos inhibidores de alta afinidad de PTP1B son estructuralmente distintos e inhiben la enzima mediante dos mecanismos distintos.
Ejemplo 5
En este ejemplo, se realizaron ensayos para examinar los efectos sinérgicos entre los inhibidores CPT157633 e IGF 1. Brevemente, se llevaron a cabo pruebas de supervivencia y tolerancia a la glucosa en ratones machos Mecp2 '/_y ratones control de la misma manera descrita anteriormente excepto que los ratones se dividieron en cuatro grupos y recibieron CPT157633 (5 mg/Kg), IGF1 (1 mg/Kg), combinación de CPT157633 (5 mg/Kg) e IGF1 (1 mg/Kg), y solución salina. Los resultados se muestran en las Figuras 7 y 8. Se descubrió que IGF-1 y el inhibidor de PTP1B cuando en combinación mejoraron la supervivencia y el metabolismo de la glucosa de una manera sinérgica.
Los resultados anteriores indican que CPT157633 e IGF1 mejoraron la supervivencia y la señalización de la insulina de una manera sinérgica.
Ejemplo 6
En este ejemplo, se examinaron otros inhibidores de PTP1B para determinar sus efectos sobre la supervivencia y el metabolismo de la glucosa en ratones machos Mecp2-/-. Los ensayos se llevaron a cabo de la misma manera descrita anteriormente utilizando un inhibidor estructural y mecanísticamente distinto de PTP1B, UA0713 o UA001 (5mg/kg para cada uno). Como se muestra en las FIG. 9 y 10, tanto UA0713 como UA001 mejoraron la supervivencia en ratones machos Mecp2 -/- más que CPT157633. Los resultados indican que los inhibidores de PTP1B UA001 y UA 0713 también se pueden utilizar en el tratamiento del síndrome de Rett.
Ejemplo 7
Como los ratones hembras heterocigotos Mecp2r/+ son un reflejo más cercano del síndrome de Rett en humanos que los ratones machos nulos para mecp2, los inhibidores de PTP1B fueron analizados en estos animales. Como primera etapa, se analizaron los efectos de la administración de CPT157633 sobre la homeostasis de la glucosa. De acuerdo con la observación en ratones machos, se observó que la intolerancia a la glucosa encontrada en los ratones hembras Mecp2rl+ tratados con solución salina fue mejorada en las tres semanas siguientes al tratamiento con el inhibidor (FIG.
14A). Consistentemente, se observó una mejora en la señalización de la insulina (Figura 14B). Por lo tanto, se determinó si el tratamiento con CPT157633 también tuvo un impacto en los síntomas neurales y conductuales de ratones Mecp2~/+.
El agarre de la pata es un fenotipo clásico observado regularmente en ratones Mecp2r/+ y es similar al retorcimiento característico de manos que se observa comúnmente en pacientes con Rett. Véase, Chahrour et al. (2007) Neuron 56: 422-37. Cuando se levantaban por la cola, los ratones del tipo salvaje extendían sus extremidades mientras que, en contraste, los ratones Mecp2r/+ juntaban sus patas delanteras espontáneamente durante todo el tiempo que fueron monitoreados, sin ningún movimiento significativo de las patas. Los ratones Mecp2rl+ que recibieron CPT157633 mostraron una marcada reducción en el agarre de las patas, y extendieron sus patas de manera similar a los animales de tipo salvaje (FIG. 14C).
La regresión de las habilidades motoras es también uno de los síntomas comunes asociados con el síndrome de Rett en pacientes, que también se observa en ratones Mecp2'l+. Para analizar si la inhibición de PTP1B daba como resultado habilidades motoras mejoradas, los ratones WT y Mecp2r/+ tratados con solución salina y con CPT157633 fueron sometidos a una prueba de rendimiento de varilla giratoria aceleradora (rotarod). En comparación con los ratones WT, los ratones Mecp2r/+ mostraron niveles más bajos de actividad en la varilla giratoria aceleradora. En cuatro ensayos sucesivos de ratones WT, se observó una mejora espectacular en el tiempo que se pasaba en la varilla giratoria, mientras que no se observó ninguna mejora con los ratones Mecp2r/+ tratados con solución salina. Sin embargo, los ratones Mecp2r/+ tratados con CPT157633 mostraron una mejora significativa en el rendimiento, aunque se trataba de una restauración parcial y no lograron niveles de rendimiento del tipo salvaje (FIG 14D). Además, cuando se interrumpió el tratamiento con CPT157633 durante una semana y se volvió a analizar la capacidad motora, se observó que se había perdido la mejora de la capacidad motora que acompañaba al tratamiento. Esto ilustra que los efectos de CPT157633 son reversibles y que el tratamiento prolongado con el compuesto parece no tener efectos adversos en estos ratones.
Ejemplo 8
En este ejemplo, se realizó un análisis conductual para examinar los efectos del inhibidor de PTP1B CPT157633 sobre el comportamiento mediante el ensayo de recogida de crías.
Los ratones WT cuando están alojados con madres embarazadas durante un período de tres semanas exhiben un comportamiento materno completo cuando se exponen a las crías de ratón de acogida, un comportamiento que se cree que es activado por el olor de las crías y las llamadas de socorro vocal. A diferencia de los ratones WT, los ratones Mecp2-/+ no aprenden el comportamiento materno de las madres, lo que sugiere que la expresión de Mecp2 es necesaria para el aprendizaje y la ejecución eficaz del comportamiento materno. Por lo tanto, se estudió el comportamiento en ratones Mecp2~l+ tratados con solución salina y con CPT157633 para comprender el efecto de la inhibición de PTP1B sobre el comportamiento. Uno de los comportamientos maternos de las hembras de ratones hacia las crías es la recogida de las crías, que es la capacidad de los ratones para traer las crías de vuelta al nido. En el día de la prueba se colocaron cuatro crías en las cuatro esquinas de la jaula y se midió la capacidad de recoger las cuatro crías por latencia y errores. Sólo las crías traídas completamente al nido fueron contadas como recogidas. El ensayo se realizó con la madre (cuyas crías se utilizan en el estudio) como control positivo. La puntuación se realizó para la latencia de 0 a 1, siendo 0 una recogida rápida y 1 una recogida lenta. Los ratones WT recogieron a las crías con una puntuación de latencia promedio de 0,3, mientras que los ratones Mecp2r/+ recogidos a una latencia promedio de 0,7, en comparación con las madres, que recogieron a las crías con una puntuación de 0,15 (Figura 3E). El mismo ensayo se realizó con ratones WT y Mecp2-+ que habían sido tratados con CPT157633 durante dos semanas. El tratamiento con CPT157633 causó una ligera mejora en la tasa a la que los ratones WT recogieron a las crías, y hubo una mejora significativa en la capacidad de los ratones Mecp2r/+ para recoger a las crías con una latencia reducida de 0,3 (tratados con CPT157633) en comparación con la latencia más larga de 0,7 que se observó con ratones Mecp2-I+ tratados con solución salina (Figura 13). Los datos indican que la inhibición de PTP1B puede rescatar el comportamiento de recogida de las crías en ratones Mecp2-/+. Por lo tanto, los inhibidores de PTP1B pueden ser utilizados para mejorar la capacidad de aprendizaje y las funciones neurológicas de los pacientes con síndrome de Rett.
Ejemplo 9
Se cuantificó la cantidad de factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF, por sus siglas en inglés) en el cerebro en ratones WT y con desactivación de Mecp2. Tanto en los ratones Mecp2-/y como en los ratones Mecp2-/+, se redujo el nivel de BDNF sólo en aproximadamente 30% en comparación con los ratones WT control (Figura 12A). Se examinaron la fosforilación de la tirosina y la activación del receptor de BDNF quinasa B relacionada con Tropomiosina (T rkB). Se descubrió que los ratones Mecp2r/+ tratados con solución salina tenían una reducción de la fosforilación de TrkB en comparación con los ratones WT. Por el contrario, el tratamiento con CPT157633 dio como resultado un aumento de la fosforilación de TrkB tanto en ratones WT como en los Mecp2r/+ (Figura 12B). Se utilizó la forma mutante D181A de atrapamiento del sustrato de PTP1B recombinante de PTP1B para investigar la posibilidad de que TrkB sea un sustrato directo de PTP1B. Se generaron lisados cerebrales de ratones tratados con solución salina o con inhibidor de PTP1B y se incubó la misma cantidad de lisado con la forma mutante WT y D181A de PTP1B (Figura 12C). Se observó que el mutante D181A de atrapamiento del sustrato de PTP1B, pero no la enzima WT, fue capaz de inmunoprecipitar PTP1B (Figura 12C). Además, el tratamiento de la proteína PTP con pervanadato, que promueve la oxidación del sitio activo cisteína y bloquea su actividad, fue incapaz de unirse a TrkB.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un inhibidor de molécula pequeña de PTP1B para utilizar en el tratamiento del síndrome de Rett.
2. Un sistema para utilizar en un método para tratar el síndrome de Rett que comprende (i) una primera composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un primer agente terapéutico que es un inhibidor de molécula pequeña de PTP1B, y (ii) un kit para diagnosticar el síndrome de Rett,
en donde el kit comprende un reactivo para detectar una mutación en un gen que codifica la proteína 2 de unión a CpG metiladas (MECP2).
3. El sistema para utilizar de acuerdo con la reivindicación 2 en donde el reactivo comprende cebadores de PCR para la secuenciación basada en PCR de una o más de las regiones codificantes y límites entre exones e intrones del gen MECP2.
4. La composición para utilizar de acuerdo con la reivindicación 1 o el sistema para utilizar de acuerdo con la reivindicación 2 o reivindicación 3, en donde el inhibidor de molécula pequeña de PTP1B es seleccionado entre: ácido
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(UA0713), Ácido 18p-glicirretínico, Celastrol, Pristimerina, Ácido maslínico, Limonina, Ácido arjunólico, Hederagenina, Betulina, Lupeol, Uveol, Ácido betulínico, Ácido corosólico, Ácido oleanólico, Ácido boswélico, Friedelina, Momordicina, Momordicinina, Ácido morónico, amirina, bevirimat, hopano, Oleanano, Carbenoxolona, Panaxatriol, Taraxerol, Momordicilina, Yamogenina, o un compuesto de la Fórmula I o de las Fórmulas IIa-I Ie:
Fórmula I
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en donde:
X1 es un grupo ligante o está ausente;
X2 es H, está ausente o es un grupo ligante, preferentemente seleccionado de un compuesto alifático de cadena recta o ramificado opcionalmente sustituido, preferentemente que comprende de 1 a 8 carbonos, que contiene opcionalmente 1 o más enlaces dobles o triples, en donde uno o más de los carbonos son opcionalmente sustituidos con R* en donde R* es cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; -C(O)-, -C(O)C(O)-, -C(O)NR11-, -C(O)NR11NR12-, -C(O)O-, - OC(O)-, -NR11CO2-, -O-, -NR11C(O)NR12-, -OC(O)NR11-, -NR11NR12-, -NR11c (o )-, -S-, -So -, -SO2-, -NR11-, -SO2NR11- o -NR11SO2-, en donde R11 y R12 se seleccionan independientemente entre H y un compuesto alifático, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; o X2 es cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; -C(O)-, -C(O)C(O)-, -C(O)NR11-, -C(O)NR11NR12-, -C(O)O-, -OC(O)-, -NR11CO2-, -O-, -NR11C(O)NR12-, -OC(O)NR11-, -NR11NR12-, - NR11C(O)-, -S-, SO-, -SO2-, -NR11-, -SO2NR11- o -NR11SO2-; siempre y cuando X i sea -NH-, X2 no sea -CH2C(O)- o -CH2C(O)-sustituido;
R1 es H o un compuesto alifático C1-8, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; R2 es H o un compuesto alifático C1-8, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; o R2 está ausente cuando X2 es H;
R3 y R4 son independientemente H, alquilo o arilo C5-6;
R5 y R6 son independientemente H o halo;
R7 y R8 son independientemente H, -OR23 o -NHR23; o un compuesto alifático, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; o juntos forman un anillo opcionalmente sustituido que comprende de 3 a 7 átomos de carbono o heteroátomos;
R9 es H o alquilo C1-3;
R10 es H o alquilo C1-3; o R8 y R10 juntos forman un anillo opcionalmente sustituido que comprende de 3 a 7 átomos de carbono o heteroátomos; y
cada Rm es independientemente H, halo, -OH, -NO2, -CN; alquilo C1-3 opcionalmente sustituido; -OR23, -C(O)R23, -C(O)OR23, -C(O)N(R23)(R24), -OC(O)R23, -OC(O)OR23, - OC(O)N(R23)(R24), -N(R23)(R24), -S(O)2R23, -S(O)R23, -SR23, -S(O)2N(R23)(R24); NR23C(O)R24, -NR23C(O)OR24, -NR23SOOR24, -NR23C(O)N(R24)(R25) o - NR23SO2N(R24)(R25); donde cada uno de R23, R24 y R25 es independientemente H, alquilo C1-4 o cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo de 3 a 8 miembros opcionalmente sustituido; o dos grupos Rm adyacentes juntos forman un anillo aromático o no aromático opcionalmente sustituido que comprende de 5 a 7 átomos de carbono o heteroátomos; donde n es 0, 1, 2, 3 o 4; o Rm y R7 juntos forman un anillo aromático o no aromático opcionalmente sustituido; y
en donde cada uno de los átomos de carbono 2-6 del anillo de fenilo A es opcionalmente sustituido con N; o cualquier par de átomos de carbono 2-6 adyacentes del anillo de fenilo A es opcionalmente sustituido con S, N u O; siempre que en ningún caso se sustituya el átomo de carbono del anillo de fenilo A que está sustituido con el grupo fosfonato; o Fórmula IIa:
Figure imgf000030_0001
en donde:
Ra y Rb son independientemente H o halógeno;
cada uno de R26, R27, R29 y R30 es independientemente H, halo, -OH, -NO2, -CN, -CF3, - CHF2, -CH2CH3, -CH2CF3, -CF2CF3, -CH2Cl, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2NH2, - CH2CH2NH2, -CH2SO2CH3, -OR23, -C(O)R23, -C(O)OR23, -C(O)N(R23)(R24), - OC(O)R23, -OC(O)OR23, -OC(O)N(R23)(R24), -N(R23)(R24), -S(O)2R23, -S(O)R23, - SR23, -S(O)2N(R23)(R24), -NR23C(O)R24, -NR23C(O)OR24, -NR23SOOR24, - NR23C(O)N(R24)(R25), -NR23SO2R24 o -NR23SO2N(R24)(R25); o alquilo C1-6, alcoxi C1-6 o arilo opcionalmente sustituido; donde cada uno de R23, R24 y R25 es independientemente H, alquilo C1-4 o cicloalquilo C3-8, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo;
cada uno de R31 y R32 es independientemente H, alquilo o arilo C5-6;
R28 es H, halógeno, -CN, -[CH2]n-[C(H)3-p] x(R33)p, -C(O)OH, - C(O)(CH2)nNH2, -C(O)NH(CH2)nR33, -C=N-N- S(O)2R33, -(CH2)n-CH(R34)(R35) o -c Hn R34-; o R28 tomado junto con R27 o R29 forman un anillo opcionalmente sustituido que comprende de 3 a 8 átomos de carbono o heteroátomos;
cada R33 es independientemente H, halógeno, -C(O)OR39, -OH, -CN, -N=N-N, - N(R37)(R38), -C(O)NH(CH2)nR39, -C(R39)(NH2)C(O)Or39, -CH2R35 o - CH(R35)NHS(O)2R39; o un cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido;
R34 es H o -N(R37)(R38);
R35 es H, -C(O)R34, -C(O)OR39 o -N(NH2)C(O)NH(CH2)nPh;
cada uno de R37 y R38 es independientemente H, -C(O)OR39, -C(O)cicloalquil-Ph, - S(O)2R39, -C(O)R39, -OC(O)R39, -C(O)(CH2)qR39, -S(O)2, -S(O)2NHR39, - S(O)2N(R44)(R39), -N(R39)(R44), -C(O)N(R44)(R39) o -NHC(O)N(R44)(R39); o alquilo C1-6, cicloalquilo C3-8, arilo C5-8, heterocicloalquilo de 3 a 8 miembros o heteroarilo de 5 a 8 miembros opcionalmente sustituido; y
cada uno de R39 y R44 es independientemente H o alquilo C1-6, cicloalquilo C3-8, arilo C5-8, heterocicloalquilo de 3 a 8 miembros o heteroarilo de 5 a 8 miembros opcionalmente sustituido;
en donde cada uno de los átomos de carbono 2-6 del anillo de fenilo A incluyendo sus respectivos sustituyentes está opcionalmente sustituido con N; o cualquier par de átomos de carbono 2-6 adyacentes del anillo de fenilo A y sus respectivos sustituyentes está opcionalmente sustituido con S, N u O; y
en donde n es un entero de 0 a 4; m es 0, 1 o 2; p es un entero de 1 a 3; q es un entero de 0 a 6; y x es 0 o 1, siempre y cuando x es 0, p es 1;
o Fórmula Ilb:
(lIb)
Figure imgf000031_0001
en donde R26, R27, R28, R29, R31 y R32 son según lo definido anteriormente;
cada uno de los átomos de carbono 3-6 del anillo de fenilo A incluyendo sus respectivos sustituyentes está opcionalmente sustituido con N; o cualquier par de átomos de carbono 3-6 adyacentes del anillo de fenilo A y sus respectivos sustituyentes están opcionalmente sustituidos con S, N u O;
o Fórmula IIc:
Figure imgf000031_0002
en donde R26, R27, R29, R31 y R32 son según lo definido anteriormente para la Fórmula IIa;
R40 es H, alquilo, alquileno, -C(O)OR39, -C(O)N(R37)(R38) o - N(NH)C(O)NH(CH2)nPh;
R41 es -N(R37)(R38); en donde R37 y R38 son según lo descrito anteriormente para la Fórmula IIa; y
cada uno de los átomos de carbono 3, 5 o 6 del anillo de fenilo A incluyendo sus respectivos sustituyentes está opcionalmente sustituido con N; o los átomos de carbono 5 y 6 del anillo de fenilo A juntos y sus respectivos sustituyentes es opcionalmente sustituido con un S, N u O;
o Fórmula IId:
Figure imgf000031_0003
en donde R26, R27 y R29 son según lo definido anteriormente para la Fórmula lia;
cada uno de R31 y R32 es independientemente H, alquilo o arilo C5-6;
R40 es según lo definido anteriormente para la Fórmula IIc;
R42 es H, alquilo C1-3 opcionalmente sustituido, -C(O)OR39, -OC(O)R39, - C(O)N(R44)(R39), -C(O)ciclopropil-Ph, -S(O)2R39, -S(O)2NHR39 o -C(O)(CH2)qR39;
y cada uno de los átomos de carbono 3, 5 o 6 del anillo de fenilo A incluyendo sus respectivos sustituyentes están opcionalmente sustituidos con N; o los átomos de carbono 5 y 6 del anillo de fenilo A juntos y sus respectivos sustituyentes están opcionalmente sustituido con un S, N u O; y
en donde R39 es según lo definido anteriormente para la Fórmula IIa;
o la Fórmula IIe:
Figure imgf000032_0001
en donde R26, R27, R29 y R40 son según lo definido anteriormente para la Fórmula IId; y
cada uno de R31 y R32 es independientemente H, alquilo o arilo C5-6;
R43 es H, -NHR39 o es R39;
en donde R39 es H o alquilo C1-6, cicloalquilo C3-8, heterocicloalquilo de 3 a 8 miembros, arilo C3-8 o heteroarilo de 3 a 8 miembros opcionalmente sustituido; y
cada uno de los átomos de carbono 3, 5 o 6 del anillo de fenilo A incluyendo sus respectivos sustituyentes está opcionalmente sustituido con N; o los átomos de carbono 5 y 6 del anillo de fenilo A juntos y sus respectivos sustituyentes están opcionalmente sustituido con S, N u O.
5. La composición para utilizar de acuerdo con la reivindicación 1 o el sistema para utilizar de acuerdo con la reivindicación 2 o reivindicación 3, en donde el inhibidor de molécula pequeña de PTP1B es seleccionado entre CPT157633, ácido ursólico, UA0713, Ácido 18p-glicirretínico, Celastrol, Pristimerina, Ácido maslínico, Limonina, Ácido arjunólico, Hederagenina, Betulina, Lupeol, Uveol, Ácido betulínico, Ácido corosólico, Ácido oleanólico, Ácido boswélico, Friedelina, Momordicina, Momordicinina, Ácido morónico, amirina, bevirimat, hopano, Oleanano, Carbenoxolona, Panaxatriol, Taraxerol, Momordicilina o Yamogenina.
6. La composición para utilizar de acuerdo con la reivindicación 1 o el sistema para utilizar de acuerdo con la reivindicación 2 o reivindicación 3, en donde el inhibidor de molécula pequeña de PTP1B es seleccionado entre CPT157633, ácido ursólico o UA0713.
7. La composición para utilizar de acuerdo con la reivindicación 1 o el sistema para utilizar de acuerdo con la reivindicación 2 o reivindicación 3, en donde el inhibidor de molécula pequeña de PTP1B es CPT157633.
8. Un agente terapéutico que es CPT157633 para utilizar en un método para tratar el síndrome de Rett, comprendiendo el método la administración a un sujeto humano que lo necesite de una cantidad eficaz del agente terapéutico.
9. El agente terapéutico para utilizar de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el agente terapéutico es administrado al sujeto después del diagnóstico del síndrome de Rett.
10. El agente terapéutico para utilizar de acuerdo con la reivindicación 8 o con la reivindicación 9, en donde el método comprende además examinar al sujeto para detectar una mutación en un gen que codifica la proteína 2 de unión a CpG metiladas (MECP2).
11. El agente terapéutico para utilizar de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el examen comprende la detección de ácido nucleico y la detección de ácido nucleico es un ensayo seleccionado del grupo que consiste en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), PCR cuantitativa, secuenciación de ácido nucleico, análisis de micromatrices de ácidos nucleicos, e hibridación fluorescente in situ.
12. El agente terapéutico para utilizar de acuerdo con la reivindicación 10 en donde el examen comprende la secuenciación de ácidos nucleicos de una o más de las regiones codificantes y límites entre exones e intrones del gen MECP2.
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