ES2926950T3 - Procesos para preparar 2-cetoácidos alargados y compuestos C6-C10 a partir de estos mediante modificaciones genéticas de rutas metabólicas microbianas - Google Patents
Procesos para preparar 2-cetoácidos alargados y compuestos C6-C10 a partir de estos mediante modificaciones genéticas de rutas metabólicas microbianas Download PDFInfo
- Publication number
- ES2926950T3 ES2926950T3 ES14824634T ES14824634T ES2926950T3 ES 2926950 T3 ES2926950 T3 ES 2926950T3 ES 14824634 T ES14824634 T ES 14824634T ES 14824634 T ES14824634 T ES 14824634T ES 2926950 T3 ES2926950 T3 ES 2926950T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- enzyme
- substitution
- native
- genetically modified
- leu
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 10
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 title abstract description 6
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 title description 4
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 title description 4
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 title description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 148
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 148
- WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N leubethanol Natural products C1=C(C)C=C2[C@H]([C@H](CCC=C(C)C)C)CC[C@@H](C)C2=C1O WQVJUBFKFCDYDQ-BBWFWOEESA-N 0.000 claims abstract description 84
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 35
- TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-M 2-oxobutanoate Chemical compound CCC(=O)C([O-])=O TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 33
- QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C(=O)C(O)=O QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 101710102786 ATP-dependent leucine adenylase Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 21
- KPULXFNPTWGJQH-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-4-oxo-4-propan-2-yloxybutanoic acid Chemical compound CC(C)OC(=O)C(O)CC(O)=O KPULXFNPTWGJQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 150000003544 thiamines Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 59
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 55
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 55
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 54
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 42
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 37
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 30
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 25
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- SHDOPXQMNJDYDK-UHFFFAOYSA-N 2-oxononanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(=O)C(O)=O SHDOPXQMNJDYDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 claims description 16
- OWJIAECDMCMDNK-UHFFFAOYSA-N 2-hexyl-3-hydroxybutanedioic acid Chemical compound C(CCCCC)C(C(C(=O)O)O)C(=O)O OWJIAECDMCMDNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 12
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 9
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 9
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- -1 3-butyl malate Chemical compound 0.000 claims description 8
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 claims description 8
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 claims description 7
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 claims description 6
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 claims description 6
- 108020004652 Aspartate-Semialdehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 6
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 6
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 claims description 6
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 6
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 claims description 6
- 108010028984 3-isopropylmalate dehydratase Proteins 0.000 claims description 5
- 108010006873 Threonine Dehydratase Proteins 0.000 claims description 5
- 102000006843 Threonine synthase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 claims description 5
- 102100033451 Thyroid hormone receptor beta Human genes 0.000 claims description 5
- 108010071598 homoserine kinase Proteins 0.000 claims description 5
- IDDYNNYMUPHFMO-UHFFFAOYSA-N 2-Keto-n-heptylic acid Chemical compound CCCCCC(=O)C(O)=O IDDYNNYMUPHFMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 claims description 4
- 108700016168 Dihydroxy-acid dehydratases Proteins 0.000 claims description 4
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 108010000200 Ketol-acid reductoisomerase Proteins 0.000 claims description 4
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000003588 threonines Chemical class 0.000 claims description 4
- QRXKEYMWUCJOKS-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3-pentylbutanedioic acid Chemical compound CCCCCC(C(O)=O)C(O)C(O)=O QRXKEYMWUCJOKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GPPUPQFYDYLTIY-UHFFFAOYSA-M 2-oxooctanoate Chemical compound CCCCCCC(=O)C([O-])=O GPPUPQFYDYLTIY-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 102000005369 Aldehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 3
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010082340 Arginine deiminase Proteins 0.000 claims description 3
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940049920 malate Drugs 0.000 claims description 3
- WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 2-acetyloxypropanoic acid Chemical class OC(=O)C(C)OC(C)=O WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- JGGLZQUGOKVDGS-VYTIMWRQSA-N aspartate semialdehyde Chemical class O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)CO[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(C)=O)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]3[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]4[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O4)O)[C@@H](O)[C@H](CO)O3)O)O2)O)[C@H](CO)O1 JGGLZQUGOKVDGS-VYTIMWRQSA-N 0.000 claims description 2
- 150000004728 pyruvic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 claims 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 13
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 13
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 13
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 abstract description 10
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 10
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 abstract description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 6
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 119
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 32
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 1-Octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- RNQHMTFBUSSBJQ-CRCLSJGQSA-N (2R,3S)-3-isopropylmalic acid Chemical compound CC(C)[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)C(O)=O RNQHMTFBUSSBJQ-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 26
- RNQHMTFBUSSBJQ-UHFFFAOYSA-N 3-isopropylmalate Natural products CC(C)C(C(O)=O)C(O)C(O)=O RNQHMTFBUSSBJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 20
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 18
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- NUJGJRNETVAIRJ-UHFFFAOYSA-N octanal Chemical compound CCCCCCCC=O NUJGJRNETVAIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- KWKAKUADMBZCLK-UHFFFAOYSA-N 1-octene Chemical compound CCCCCCC=C KWKAKUADMBZCLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 6
- MQVBPERQKIUJRM-UHFFFAOYSA-N 2-butyl-3-hydroxybutanedioic acid Chemical compound CCCCC(C(O)=O)C(O)C(O)=O MQVBPERQKIUJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000782236 Bothrops leucurus Thrombin-like enzyme leucurobin Proteins 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 4
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 4
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 4
- 238000005895 oxidative decarboxylation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 101150036810 eco gene Proteins 0.000 description 3
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 108010048295 2-isopropylmalate synthase Proteins 0.000 description 2
- XNIHZNNZJHYHLC-UHFFFAOYSA-N 2-oxohexanoic acid Chemical compound CCCCC(=O)C(O)=O XNIHZNNZJHYHLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDVFRMMRZOCFLS-UHFFFAOYSA-M 2-oxopentanoate Chemical compound CCCC(=O)C([O-])=O KDVFRMMRZOCFLS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010039636 3-isopropylmalate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102100026105 3-ketoacyl-CoA thiolase, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 102000009836 Aconitate hydratase Human genes 0.000 description 2
- 108010009924 Aconitate hydratase Proteins 0.000 description 2
- 241000193401 Clostridium acetobutylicum Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N intermediate I Chemical compound COC(=O)[C@@]1(C=O)[C@H]2CC=[N+](C\C2=C\C)CCc2c1[nH]c1ccccc21 QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N 0.000 description 2
- 150000004715 keto acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N n-Octanol Natural products CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 2
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- FMYBFLOWKQRBST-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(carboxymethyl)amino]acetic acid;nickel Chemical compound [Ni].OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O FMYBFLOWKQRBST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GIBJGNIQPMQQIY-UHFFFAOYSA-N 2-oxo-undecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC(=O)C(O)=O GIBJGNIQPMQQIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JUCRENBZZQKFGK-UHFFFAOYSA-N 3-ethylmalic acid Chemical compound CCC(C(O)=O)C(O)C(O)=O JUCRENBZZQKFGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010055682 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- LOLHYFQEDPGSHZ-UHFFFAOYSA-N 3-propylmalic acid Chemical compound CCCC(C(O)=O)C(O)C(O)=O LOLHYFQEDPGSHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(=O)C(O)=O BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CIBNXHHWVVKRDY-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-oxohexanoic acid Chemical compound CC(C)CCC(=O)C(O)=O CIBNXHHWVVKRDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010006229 Acetyl-CoA C-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010003902 Acetyl-CoA C-acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000605222 Acidithiobacillus ferrooxidans Species 0.000 description 1
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000589941 Azospirillum Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 101000742087 Bacillus subtilis (strain 168) ATP-dependent threonine adenylase Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102100037458 Dephospho-CoA kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010023922 Enoyl-CoA hydratase Proteins 0.000 description 1
- 102000011426 Enoyl-CoA hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102100039894 Hemoglobin subunit delta Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 101000774739 Thermus thermophilus Aspartokinase Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 108010031234 carbon monoxide dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000010779 crude oil Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 108010049285 dephospho-CoA kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009483 enzymatic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000002803 fossil fuel Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010528 free radical solution polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000003367 kinetic assay Methods 0.000 description 1
- 230000028744 lysogeny Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- CMFNMSMUKZHDEY-UHFFFAOYSA-N peroxynitrous acid Chemical compound OON=O CMFNMSMUKZHDEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 108040006686 pyruvate synthase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 101150072448 thrB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000004711 α-olefin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
- C12P7/26—Ketones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01085—3-Isopropylmalate dehydrogenase (1.1.1.85)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
- C12Y203/03013—2-Isopropylmalate synthase (2.3.3.13)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
- C12Y402/01033—3-Isopropylmalate dehydratase (4.2.1.33)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
La modificación de las rutas metabólicas incluye la ingeniería genética de al menos una enzima involucrada en la elongación de 2-cetoácidos durante la biosíntesis de leucina, y preferiblemente al menos la isopropilmalato deshidrogenasa o sintasa (LeuB o LeuA en E. coli), para incluir al menos dicha enzima no nativa, enzima complejo, o una combinación de los mismos para convertir 2-cetobutirato o 2-cetoisovalerato en un 2-cetoácido C7-C11, en el que la producción de los mismos tiene una mayor eficacia que si se sigue una ruta puramente nativa. El 2-cetoácido C7-C11 puede luego convertirse, a través de una descarboxilasa dependiente de tiamina nativa o modificada genéticamente, para formar un aldehído C6-C10 que tiene un carbono menos que el 2-cetoácido C7-C11 que se está convirtiendo. En algunas realizaciones, el aldehído C6-C10 puede convertirse luego a través de enzimas nativas o modificadas genéticamente adicionales para formar otros productos C6-C10, incluidos alcoholes, ácidos carboxílicos y alcanos. Esta ingeniería genética ofrece la oportunidad de una escala comercial de procesos biosintéticos in vivo que pueden ser más rentables que los enfoques no biobasados para producir los mismos productos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Procesos para preparar 2-cetoácidos alargados y compuestos C6-C10 a partir de estos mediante modificaciones genéticas de rutas metabólicas microbianas
La invención se refiere al campo del uso de enzimas biológicas para producir 2-cetoácidos C7-C11 y aldehídos C6-C10 adicionales y productos fabricados a partir de estos. Más particularmente, se refiere al el campo del uso de enzimas modificadas que se pueden expresar por un organismo microbiano genéticamente modificado para convertir un sustrato adecuado en un aldehído C6-C10 a través de una o más rutas metabólicas, o se pueden incubar in vitro para convertir 2-cetobutirato o 2-cetoisovalerato en un 2-cetoácido alargado y luego convertir el 2-cetoácido en un aldehído C6-C10.
La preocupación sobre la futura escasez, el coste y el impacto ambiental de la obtención y el uso de combustibles fósiles han estimulado el interés en la explotación de biomasa renovable y barata como fuentes alternativas tanto para combustibles como para los productos químicos elaborados a partir de ellas. A medida que han aumentado los precios del petróleo crudo, los productos químicos e industriales de base biológica se han convertido en alternativas atractivas a sus equivalentes derivados del petróleo. Los procesos de fermentación que usan organismos microbianos anaeróbicos ofrecen un camino prometedor para convertir la biomasa y los desechos agrícolas en productos útiles, mientras que al mismo tiempo solucionan los problemas que pueden surgir en la eliminación de productos básicos agrícolas de bajo coste y subproductos/desechos del procesamiento de alimentos. Algunos de los productos útiles que se pueden preparar a partir de materias primas de biomasa de bajo coste son los ácidos orgánicos y los alcoholes, que incluyen en particular los alcoholes C6-C10 como el octanol. El octanol encuentra un uso particular como material de partida de bajo coste para preparar octeno, que es una materia prima química muy deseable en varias industrias. Estas industrias incluyen la industria del polietileno, que usa octeno como un co-monómero para polimerizaciones en solución, y la industria de detergentes, que lo usa para alquilar fenoles para producir precursores de detergentes. El octeno se ha preparado típicamente mediante la tecnología de alfa olefina lineal (LAO) que se basa en la tetramerización de uso intensivo de energía y, como resultado, los suministros de octeno son a menudo insuficientes, lo que contribuye a fluctuaciones indeseables en su precio. Por lo tanto, se esperaría que la identificación de métodos mejores y menos costosos para producir octanol de lugar a una producción de octeno menos costosa. En general, el uso de procesos de fermentación para producir octanol podría proporcionar dicha reducción de costes, lo que a su vez aumentaría la oferta y estabilizaría el precio del octeno.
En general, los métodos para la mejora de organismos microbianos industriales van desde el enfoque aleatorio de la mejora clásica de cepas (CSI) hasta los métodos altamente racionales de la ingeniería metabólica. La CSI suele ser eficaz para aliviar la inhibición del producto o mejorar la productividad, pero es un enfoque mucho menos eficaz para generar cepas capaces de producir productos completamente nuevos. Además, la CSI requiere mucho tiempo y recursos. Esto se debe a que, para obtener cepas con alta tolerancia a los productos inhibidores de la fermentación, es necesario cribar y seleccionar mutantes continuamente cultivando sucesivamente la cepa en el medio en presencia de concentraciones crecientes de inhibidor. Esto generalmente se lleva a cabo junto con mutagénesis inducida usando mutágenos químicos y/o radiación ultravioleta (UV). Sin embargo, el proceso de selección del cultivo convencional es generalmente tedioso, requiere mucho tiempo y, a menudo, es infructuoso.
Las modificaciones metabólicas son con frecuencia más eficaces a la hora de crear cepas que produzcan nuevos productos. Esto se debe a que los genes, y en algunos casos incluso rutas completas, se pueden transferir entre organismos (métodos recombinantes) y/o se pueden modificar las enzimas (métodos de ingeniería). Estos métodos evitan algunas de las desventajas de la CSI. La ingeniería metabólica, un término que comprende tanto los métodos recombinantes como los de ingeniería, es un enfoque dirigido y, a menudo más rápido, que se usa ampliamente para diseñar cepas para lograr una mayor eficacia en la sobreproducción de metabolitos, a través de alteraciones en la distribución del flujo metabólico. La mayor parte de este trabajo hasta la fecha está relacionada con la producción de metabolitos secundarios (como antibióticos), aminoácidos (p. ej., lisina) y proteínas heterólogas, usando organismos con genética y fisiología bien estudiadas (p. ej., E. coli, levaduras y células de hibridoma). El análisis estequiométrico de las distribuciones de flujo metabólico proporciona una guía para la modificación metabólica adecuada, la formulación del medio y las estrategias de alimentación óptimas, y la optimización de bioprocesos. Sin embargo, este enfoque aún requiere un conocimiento profundo de las redes metabólicas y reguladoras en las células de fermentación. Aunque estos enfoques racionales han tenido éxito en casos que implican un solo gen o algunos genes dentro de un solo grupo de genes, han sido a menudo ineficaces en casos que implican rutas metabólicas más complejas o en gran parte desconocidas. Esto se debe a que dichos enfoques generalmente se dirigen a un gen a la vez y, por lo tanto, no pueden predecir interacciones complejas entre múltiples genes en una ruta determinada.
La modificación enzimática se realiza modificando esa porción del código genético, es decir, el ADN del organismo que corresponde a la expresión de esa enzima. La modificación de enzimas puede dar lugar a una funcionalidad completamente nueva o se puede usar para mejorar la especificidad o la eficacia de los productos o productos intermedios deseados. Además, se sabe que ciertas enzimas son promiscuas y, a menudo, realizan tareas que van más allá de sus roles naturales conocidos. Estas enzimas también se pueden modificar para realizar conversiones novedosas, pero hasta la fecha, el éxito de este enfoque se ha limitado con frecuencia a rendimientos de productos que no son comercialmente viables. Véase, p. ej., Zhang, K.; Sawaya, M.R.; Eisenberg, D.S.; Liao, J.C. "Expanding metabolism for biosynthesis of nonnatural alcohols”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105: 20653-20658. En teoría,
se puede usar la modificación de múltiples enzimas en una ruta como una técnica para maximizar la especificidad y/o la eficacia catalítica.
Un ejemplo de un organismo conocido por producir octanol bajo ciertas condiciones es Clostridium. Se han empleado varias especies de Clostridium (p. ej., C. acetobutylicum, difficile y kluyveri) en el documento WO2012135731. Esa publicación atribuye la producción poco selectiva de una especie de Clostridium, que incluye una pequeña cantidad de n-octanol, entre otros productos, a la capacidad del organismo microbiano modificado para expresar o sobreexpresar beta-cetotiolasa (p. ej., BktB), acetil CoA acetiltransferasa (p. ej., AtoB), 3- hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (p. ej., Hbd, de Clostridium, o PaaHI), crotonasa (p. ej., Crt) y trans-enoil-CoA reductasa (p. ej., Ter). Estas modificaciones son generalmente en la ruta CoA del organismo para la producción de alcoholes superiores. Esta ruta evita la ruta de producción de butanol que se encuentra en muchas especies de Clostridium, que implica enzimas e intermediarios sensibles al oxígeno. Sin embargo, la cantidad de n-octanol producido mediante esta invención es demasiado pequeña para ser comercialmente viable. Véase también, p. ej., Lee, J.Y.; Jang, Y.S.; Lee, J.; Papoutsakis, E.T.; Lee, S.Y. "Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum M5 for highly selective butanol production'', Biotechnol., 2009, 4: 1432-1440; y Wang, Y.; Blaschek, H.P. "Optimization of butanol production from tropical maize stalk juice by fermentation with Clostridium beijerinckií', Bioresour. Technol., 2011, 102, 9985-9990.
El documento WO2010045629 describe la misma ruta enzimática con LeuABCD para el alargamiento de la cadena de carbono y la producción de cetoácidos en donde se describieron mutaciones en LeuA para incrementar la especificidad de sustrato o para reducir la resistencia a la retroalimentación mediante el intercambio de aminoácidos en el sitio activo para el proceso de un ciclo catalítico para alargar los cetoácidos.
En la presente memoria se describe un proceso para preparar un 2-cetoácido C7-C11 que comprende poner en contacto un sustrato, seleccionado de 2-cetobutirato y 2-cetoisovalerato, y (1) una enzima LeuA nativa o genéticamente modificada; (2) una enzima LeuB’ genéticamente modificada, en donde la enzima (a) se obtiene a partir de Escherichia coli y tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente al Listado de Secuencias, SEQ ID 1; habiéndose modificado la enzima en el sentido en que alanina, glicina, valina o leucina se sustituyen de forma independiente por Leu-96, Val-198, o una combinación estas; o (b) la enzima tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 60 por ciento homóloga a la secuencia de aminoácidos del Listado de Secuencias, SEQ ID 1; habiéndose modificado la enzima como en (a); y (3) un complejo enzimático LeuCD’ nativo o genéticamente modificado; en condiciones tales que el 2-cetobutirato o el 2-cetoisovalerato se convierte, mediante una o más etapas, en un 2-cetoácido C7-C11.
La invención proporciona un proceso para preparar un 2-cetoácido C7-C11 que comprende poner en contacto un sustrato, seleccionado de 2-cetobutirato y 2-cetoisovalerato, y
(1) una enzima LeuA nativa o genéticamente modificada que tiene actividad de isopropilmalato sintasa;
(2) una enzima LeuB' genéticamente modificada, en donde:
a) la enzima se obtiene a partir de Escherichia coli y tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente al Listado de Secuencias, SEQ ID 1; habiéndose modificado la enzima (1) en la Leu-96 por sustitución a glicina; (2) en la Val-198 por sustitución a alanina; (3) en la Leu-96 por sustitución a alanina y en la Val-198 por sustitución a alanina; (4) en la Leu-96 por sustitución a glicina y en la Val-198 por sustitución a alanina; (5) en la Leu-96 por sustitución a glicina y en la Val-198 por sustitución a glicina; o (6) en la Leu-96 por sustitución a alanina;
o (b) la enzima tiene actividad de isopropilmalato deshidrogenasa y cataliza la conversión de 3-hexilmalato para formar 2-cetononanoato con una eficacia catalítica mayor que la de una enzima LeuB nativa, en donde la enzima tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 60 por ciento homóloga a la secuencia de aminoácidos del Listado de Secuencias, SEQ ID 1; habiéndose modificado la enzima como en (a);
y (3) un complejo enzimático LeuCD' nativo o genéticamente modificado que tiene actividad de isopropilmalato isomerasa; en condiciones tales que el 2-cetobutirato o el 2-cetoisovalerato se convierte, a través de una o más etapas, en un 2-cetoácido C7-C11.
En otra realización, el 2-cetoácido C7-C11 producido como se describe en el párrafo anterior se pone en contacto con una descarboxilasa dependiente de tiamina nativa o genéticamente modificada, en condiciones tales que el 2-cetoácido C7-C11 se convierte en un aldehido C6-C10 que tiene un átomo de carbono menos que el 2-cetoácido C7-C11 que se está convirtiendo.
En otra realización más, la invención proporciona un organismo microbiano que expresa una enzima LeuB' genéticamente modificada que:
(1) se obtiene de Escherichia coli y tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente al Listado de Secuencias, SEQ ID 1; habiéndose modificado la enzima (i) en la Leu-96 por sustitución a glicina; (ii) en la
Val-198 por sustitución a alanina; (iii) en la Leu-96 por sustitución a alanina y en la Val-198 por sustitución a alanina; (iv) en la Leu-96 por sustitución a glicina y en la Val-198 por sustitución a alanina; (v) en la Leu-96 por sustitución a glicina y en la Val-198 por sustitución a glicina; o (vi) en la Leu-96 por sustitución a alanina;
o (2) tiene actividad de isopropilmalato deshidrogenasa y cataliza la conversión de 3-hexilmalato para formar 2-cetononanoato con una eficacia catalítica mayor que la de una enzima LeuB nativa, y en donde la enzima tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 60 por ciento homóloga a la secuencia de aminoácidos del Listado de Secuencias, SEQ ID 1, habiéndose modificado la enzima como en (1).
También se describe en la presente memoria un organismo microbiano que expresa o sobreexpresa una enzima que (1) se obtiene de Escherichia coli y tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente al Listado de Secuencias, SEQ ID 1; habiéndose modificado la enzima en el sentido de que alanina, glicina, valina o leucina se sustituyen independientemente por Leu-96, Val-198, o una combinación estas; o (2) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 60 por ciento homóloga a la secuencia de aminoácidos del Listado de Secuencias, SEQ ID 1; habiéndose modificado la enzima como en (1).
En otra realización más, la invención proporciona un proceso para preparar un aldehído C6-C10 que comprende
(la ) poner en contacto un sustrato que contiene carbono y: piruvato carboxilasa nativa o genéticamente modificada con actividad de piruvato carboxilasa, aspartato aminotransferasa nativa o genéticamente modificada con actividad de aspartato aminotransferasa, aspartoquinasa/homoserina deshidrogenasa bifuncional nativa o genéticamente modificada con actividad aspartoquinasa/homoserina deshidrogenasa bifuncional, homoserina quinasa nativa o genéticamente modificada con actividad de homoserina quinasa, treonina sintasa nativa o genéticamente modificada con actividad de treonina sintasa, aspartato semialdehído deshidrogenasa nativa o genéticamente modificada con actividad de aspartato semialdehído deshidrogenasa y treonina deshidratasa nativa o genéticamente modificada con actividad de treonina deshidratasa, en condiciones para formar 2 -cetobutirato, o
(lb ) poner en contacto un sustrato que contiene carbono y: isozima acetolactato sintasa nativa o genéticamente modificada con actividad de isozima acetolactato sintasa, cetol-ácido reductoisomerasa que tiene actividad cetol-ácido reductoisomerasa, y dihidroxiácido deshidratasa que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa, en condiciones para formar 2 -cetoisovalerato;
(2) poner en contacto el 2-cetobutirato o el 2-cetoisovalerato y
(a) una enzima LeuA nativa o genéticamente modificada que tiene actividad de isopropilmalato sintasa;
(b) una enzima LeuB' genéticamente modificada, en donde la enzima LeuB'
(i) se obtiene de Escherichia coli y tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente al Listado de Secuencias, SEQ ID 1; habiéndose modificado la enzima (a) en la Leu-96 por sustitución a glicina; (b) en la Val-198 por sustitución a alanina; (c) en la Leu-96 por sustitución a alanina y en la Val-198 por sustitución a alanina; (d) en la Leu-96 por sustitución a glicina y en la Val-198 por sustitución a alanina; (e) en la Leu-96 por sustitución a glicina y en la Val-198 por sustitución a glicina; o (f) en la Leu-96 por sustitución a alanina;
o (ii) tiene actividad de isopropilmalato deshidrogenasa y cataliza la conversión de 3-hexilmalato para formar 2-cetononanoato con una eficacia catalítica superior a la de una enzima LeuB nativa, y en donde la enzima tiene una secuencia de aminoácidos de al menos un 60 por ciento homóloga a la secuencia de aminoácidos del Listado de Secuencias, SEQ ID 1; habiéndose modificado la enzima como en (i); y
(c) un complejo enzimático LeuCD' nativo o genéticamente modificado que tiene actividad de isopropilmalato isomerasa; en condiciones tales que el 2-cetobutirato o el 2-cetoisovalerato se convierte, a través de una o más etapas, en un 2-cetoácido C7-C11; y
(3) poner en contacto el 2-cetoácido C7-C11 y una descarboxilasa dependiente de tiamina nativa o genéticamente modificada que tiene actividad descarboxilasa dependiente de tiamina en condiciones tales que el 2-cetoácido C7-C11 se convierte en un aldehído C6-C10 que tiene un átomo de carbono menos que el C7- C11 2-cetoácido que se está convirtiendo;
cada uno de (1), (2) y (3) ocurre en una o más etapas;
en donde (1), (2) y (3) ocurren de manera independiente dentro o fuera de un organismo microbiano genéticamente modificado.
También se describe en la presente memoria un proceso para preparar un aldehído C6-C10 que comprende (1) poner en contacto un sustrato que contiene carbono y una o más enzimas nativas o genéticamente modificadas en
condiciones para formar 2-cetobutirato o 2-cetoisovalerato; (2) poner en contacto el 2-ceto-butirato o el 2-cetoisovalerato y (a) una enzima LeuA nativa o genéticamente modificada; (b) una enzima LeuB' genéticamente modificada, en donde la enzima (i) se obtiene a partir de Escherichia coli y tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente al Listado de Secuencias, SEQ ID 1; habiéndose modificado la enzima en el sentido de que alanina, glicina, valina o leucina se sustituyen de manera independiente por Leu-96, Val-198, o una combinación de estas; o (ii) la enzima tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 60 por ciento homóloga a la secuencia de aminoácidos del Listado de Secuencias, SEQ ID 1; habiéndose modificado la enzima como en (a); y (c) un complejo enzimático LeuCD' nativo o genéticamente modificado; en condiciones tales que el 2-cetobutirato o el 2-cetoisovalerato se convierte, a través de una o más etapas, en un 2-cetoácido C7-C11; y (3) poner en contacto el 2-cetoácido C7-C11 y una descarboxilasa dependiente de tiamina nativa o genéticamente modificada en condiciones tales que el 2-cetoácido C7-C11 se convierte en un aldehído C6-C10 que tiene un átomo de carbono menos que el 2-cetoácido C7-C11 que se está convirtiendo; cada uno de (1), (2) y (3) ocurre en una o más etapas; en donde (1), (2) y (3) ocurren de manera independiente dentro o fuera de un organismo microbiano genéticamente modificado.
La FIGURA 1 muestra el alargamiento de un 2-cetoácido por medio de las actividades repetitivas de LeuABCD, en las etapas 1 a 3. Después del alargamiento, el 2-cetoácido alargado (IV) resultante se convierte en un aldehído (V), a través de la actividad de una descarboxilasa (dependiente de tiamina) en la etapa 4, y finalmente a un alcohol (VI), a través de la actividad de una alcohol deshidrogenasa en la etapa 5.
La FIGURA 2 muestra dos rutas relacionadas pero diferentes para producir 1-octanol. En una, una ruta de Wood-Ljungdahl convierte el gas de síntesis en acetil CoA, y otra ruta convierte luego el acetil CoA en piruvato. A continuación, el piruvato se convierte en 2-cetobutirato y, finalmente, se inicia una ruta LeuABCD, en donde el 2-cetobutirato se convierte (en esta realización) en 2-cetononanoato. Una vez que se ha formado el 2-cetoácido alargado (el 2-cetononanoato), una descarboxilasa (dependiente de tiamina) lo convierte en un aldehído C6-C10 (en esta realización, octanal), y una alcohol deshidrogenasa convierte el octanal en un alcohol C6-C10 (en esta realización, 1 -octanol).
En la otra ruta, también ilustrada en la FIGURA 2, una de las posibles rutas de catabolismo del azúcar, que en esta realización es una ruta de glucólisis o de pentosa fosfato, convierte un azúcar C5 o C6 en piruvato, y luego se sigue la misma secuencia de ruta que en la primera ruta para llegar al 1-octanol.
En el LISTADO DE SECUENCIAS, SEQ ID 1, muestra una secuencia del gen LeuB de E. coli nativo (tipo salvaje), con ambos pares de bases y los aminoácidos correspondientes. El texto libre del listado de secuencias establece lo siguiente: " LeuB de E. coli de tipo salvaje".
En el LISTADO DE SECUENCIAS, SEQ ID 2, muestra los aminoácidos para el LeuB de E. coli nativo (de tipo salvaje), pero sin los pares de bases correspondientes.
En los LISTADOS DE SECUENCIAS, las SEQ ID 3-20, muestran enzimas variantes LeuB' con modificaciones específicas de pares de bases (mostrada en secuencias impares) y modificaciones de aminoácidos (sin los pares de bases correspondientes) (mostrada en secuencias pares), como se describe. El texto libre del listado de secuencias (<223>) para cada uno indica la designación de la variante particular. Las designaciones se definen y describen en la presente memoria a continuación.
En general, la presente invención incluye un proceso para convertir 2-cetobutirato o 2-cetoisovalerato en un 2-cetoácido C7-C11; una enzima o una combinación de enzimas genéticamente modificadas para llevar a cabo esa conversión; y un proceso para preparar un producto C6-C10, que puede ser un aldehído, un alcohol, un ácido carboxílico o un alcano, a través del contacto entre un sustrato que contiene carbono, como, por ejemplo, gas de síntesis (syngas) o un azúcar C5 o C6, como sacarosa, glucosa o pentosa, y una serie de enzimas que convierten el sustrato que contiene carbono en el producto C6-C10 a través de una o más etapas, y en ciertas realizaciones a través de tres o más etapas, y preferiblemente cinco o más etapas. Cualquiera de los procesos se puede llevar a cabo biosintéticamente, en una de las realizaciones descritas de una célula que no se produce de forma natural, es decir, genéticamente modificada, es decir, en un organismo microbiano que no se produce de forma natural; o a través de metodología in vitro.
En el proceso para preparar un aldehído C6-C10, un sustrato que contiene carbono seleccionado se convierte primero en piruvato y de piruvato en 2-cetobutirato o, alternativamente, en 2-cetoisovalerato, mediante la acción de una o más enzimas y en una o más etapas. El 2-cetobutirato o el 2-cetoisovalerato se convierte luego, mediante el alargamiento de la cadena, en un 2-cetoácido C7-C11, mediante la acción de al menos una de tres enzimas o complejos enzimáticos no nativos, es decir, genéticamente modificados, o una combinación de estos en la ruta de LeuABCD (como se denomina con respecto al organismo microbiano de E. coli), que es una parte de la ruta no natural de la leucina (FIGURA 1). El primer grupo de enzimas modificadas potencialmente empleadas que logran este alargamiento de la cadena se identifican en la presente memoria como Leu A' (2-isopropilmalato sintasa), Leu B' (isopropilmalato deshidrogenasa) y Leu CD' (dos enzimas que, juntas, se denominan complejo isopropilmalato isomerasa). El 2-cetoácido C7-C11 se puede luego convertir en un aldehído C6-C10 por la acción de al menos una enzima más, que incluye una descarboxilasa dependiente de tiamina nativa o genéticamente modificada, que convierte el 2-cetoácido C7-C11 en un aldehído C6-C10 que tiene un átomo de carbono menos que el 2-cetoácido C7-C11 que se está
convirtiendo.
Finalmente, el aldehido C6-C10 se puede usar tal cual, en una variedad de aplicaciones industriales, o se puede emplear como material intermedio o de partida para la producción de otras sustancias químicas. Por ejemplo, el aldehído C6-C10 se puede poner en contacto con una alcohol deshidrogenasa, que convierte el aldehído C6-C10 en el alcohol C6-C10 correspondiente. Alternativamente, se puede poner en contacto con una aldehído deshidrogenasa, que lo convierte en el ácido carboxílico C6-C10 correspondiente. Finalmente, se puede poner en contacto con una aldehído graso decarbonilasa, que lo convierte en el alcano C5-C9 correspondiente. Cada una de las descarboxilasas dependientes de tiamina y la alcohol deshidrogenasa, la aldehído deshidrogenasa o la aldehído graso descarbonilasa pueden ser independientemente nativas o genéticamente modificadas.
Los términos "genéticamente modificado" o "modificado", tal como se usan en la presente memoria, se refieren a una enzima (ya sea una enzima con un nombre general o específico, p. ej., alcohol deshidrogenasa, etc.) que tiene una secuencia de aminoácidos intencionalmente alterada, o un organismo microbiano (dependiendo de la colocación de cualquiera de los términos como un adjetivo) que tiene un genoma intencionalmente alterado. Tal alteración se puede haber logrado a través de tecnología recombinante, donde se transfieren uno o más genes de un segundo organismo microbiano diferente a un organismo microbiano diana; tecnología de ingeniería, en donde se alteran los aminoácidos dentro del organismo microbiano diana, generalmente mediante mutagénesis de sitio dirigido, lo que da como resultado la conversión de al menos un aminoácido (y con frecuencia más de uno) en un aminoácido diferente; o ambos.
En realizaciones preferidas, el producto C6-C10, por ejemplo, un alcohol C6-C10 tal como 1-octanol, se produce con una especificidad deseablemente alta, es decir, preferiblemente al menos del 25 por ciento (%), más preferiblemente al menos del 40 %, aún más preferiblemente al menos del 50 %, y lo más preferiblemente al menos del 70 %, basado en el peso (peso) del producto total (es decir, % en peso), es el producto diana. Otra forma de afirmar esto es que el rendimiento del producto deseado (p. ej., 1-octanol) sea preferiblemente de al menos 0,25 gramos de producto por gramo de materia prima (g/g), más preferiblemente de al menos 0,4 g/g, aún más preferiblemente de al menos 0,5 g/g y lo más preferiblemente de al menos 0,7 g/g.
Como se indicó anteriormente, la invención se puede llevar a cabo ya sea in vivo o in vitro. Se puede preferir un enfoque in vivo para la producción a escala comercial, mientras que un enfoque in vitro puede ser más conveniente para fines de investigación general y de laboratorio, como para llevar a cabo ensayos enzimáticos. En general, el enfoque in vivo emplea la(s) vía(s) metabólica(s) nativa(s) de un organismo microbiano, primero para convertir un sustrato que contiene carbono adecuado en piruvato y luego para convertir el piruvato en 2-cetobutirato o, alternativamente, en 2-cetoisovalerato, en un número variable de etapas.
En una realización, el organismo microbiano seleccionado puede poseer una ruta de Wood-Ljungdahl, también conocida como "ruta de síntesis de fijación (syngas)", en donde el syngas se convierte en acetil CoA. Esto se puede realizar de manera eficaz por ciertas especies de bacterias productoras de acetato, como las del género Clostridium, que incluyen, pero no se limitan a, en particular, Clostridium Ijungdahlii (C. Ijungdahlií). En esta ruta, la conversión del gas de síntesis en acetil CoA generalmente incluye la reducción de dióxido de carbono a monóxido de carbono y luego a acetil CoA a través de la acción de dos enzimas, es decir, la monóxido de carbono deshidrogenasa, que cataliza la reducción del dióxido de carbono, y la acetil CoA sintasa, que combina el monóxido de carbono resultante con un grupo metilo para formar acetil CoA. A partir de este punto, la acetil CoA continúa por otra ruta en donde se convierte en piruvato, mediante la reducción por PFOR (ferrodoxina oxidorreductasa). Tales rutas pueden estar presentes en organismos que incluyen, por ejemplo, Clostridium, Escherichia coli (E. c o l) Azospirillum, Bacillus, Saccharomyces y Corynebacterium.
En una realización alternativa, un sustrato adecuado que contiene carbono (que no sea gas de síntesis), como un azúcar C5 o C6 (glucosa, sacarosa, pentosa o una combinación de estos), se puede convertir directamente en piruvato a través de una de las rutas de catabolismo de azúcar, como una ruta de la glucólisis o de las pentosas fosfato.
Posteriormente, el piruvato se puede convertir primero en L-treonina, a través de PC (piruvato carboxilasa); AAT (aspartato aminotransferasa); ThrABC (ThrA, que es una aspartoquinasa/homoserina deshidrogenasa bifuncional); ThrB, que es homoserina quinasa; y ThrC, que es treonina sintasa); y ASD (aspartato semialdehído deshidrogenasa). La L-treonina luego se convierte en 2-cetobutirato a través de ILva (treonina deshidratasa). En una realización alternativa, el piruvato se puede convertir en 2-cetoisovalerato a través de las actividades de IlvBN/IlvGM, IlvC e IlvD. Véase también, Zhang, K.; Sawaya, M.R.; y cols., ibídem.
Después de la producción de 2-cetobutirato o 2-cetoisovalerato, la modificación genética de la porción de LeuABCD nativa de la ruta de biosíntesis de leucina no natural opera para efectuar la conversión a un 2-cetoácido C7-C11 a través de una o más etapas. En ciertas realizaciones, están implicadas varias etapas y emplean, en un enfoque in vivo, al menos una enzima modificada (endógena o exógena), un complejo enzimático o una combinación de estos (denominados colectivamente en la presente memoria como "LeuA'B'CD’ “), para convertir el 2-cetobutirato o el 2-cetoisovalerato en un 2-cetoácido C7-C11 deseado. Por ejemplo, el 2-cetobutirato se convierte primero en 2-cetovalerato, luego en 2-cetocaproato, luego en 2-cetoheptanoato o hasta 2-ceto-undecanoato, dependiendo del producto final deseado, a medida que se produce el alargamiento de la cadena. Alternativamente, el 2-cetoisovalerato
se convierte primero en 2-cetoisocaproato, luego en 2-cetoisoheptanoato, etc. Sin embargo, opcionalmente es posible modificar solo una enzima, un complejo enzimático o una combinación de estos, por ejemplo, LeuA', LeuB', o LeuCD', para obtener una producción aceptable o deseable de un 2-cetoácido C7-C11 comenzando con 2-cetobutirato o 2-cetoisovalerato.
Una vez que se forma un 2-cetoácido C7-C11 alargado, se puede usar tal cual o convertirse en un aldehído C6-C10. Para dicha conversión, se emplea una descarboxilasa dependiente de tiamina nativa o genéticamente modificada (DC'), lo que da como resultado un aldehído C6-C10 que tiene un átomo de carbono menos que el 2-cetoácido C7-C11 que se convierte. Los aldehídos C6-C10 disfrutan de una amplia aplicabilidad tanto por sí mismos como por productos de partida o intermedios en la producción de alcoholes C6-C10, ácidos carboxílicos, alcanos y combinaciones de estos, como se ha descrito anteriormente. La producción de un alcohol C6-C10, en una realización, octanol, se ilustra en la FIGURA 1.
Para permitir que un organismo no nativo lleve a cabo una parte de las conversiones in vivo como se define anteriormente, por ejemplo, para producir los aldehídos C6-C10 y/o los alcoholes C6-C10, es deseable realizar protocolos similares al descrito a continuación. En general, los Ejemplos incluidos con la presente memoria implican ingeniería enzimática para alterar los aminoácidos con el fin de modificar la funcionalidad de la enzima, particularmente en términos de actividad y/o especificidad. Esta alteración en los aminoácidos se puede usar para producir enzimas modificadas para propósitos de pequeña escala, por ejemplo, para ensayos in vitro; o puede ser la base para la modificación del genoma con el fin de producir una cepa de organismos microbianos adecuada para la producción a mayor escala.
La metodología se puede llevar a cabo como bien entienden los expertos en la técnica. En general, se usa una base de datos adecuada, como GenBank, para obtener los códigos genéticos de las enzimas nativas, seguido de la identificación de los codones adecuados para la modificación. Esta identificación se puede usar como base para los métodos de ingeniería de proteínas conocidos en la técnica, en donde el modelado molecular por ordenador identifica y también permite la diferenciación de ubicaciones estructurales en las que se pueden emplear eficazmente las modificaciones de las interfaces enzima/sustrato. A continuación, se realiza una modificación deseada determinada, usando una técnica de biología molecular llamada mutagénesis de sitio dirigido. Luego, el gen modificado se clona en un vector de plásmido replicativo que, cuando se transforma en un organismo microbiano huésped como E. coli, permite la producción de enzimas que tienen una eficacia catalítica superior a la nativa. Las células de E. coli que contienen la enzima variante diana también producen otras proteínas nativas y, por lo tanto, las enzimas de tipo variante se deben someter a purificación para separar las proteínas que no son diana y las estructuras celulares generales, lo que deja una enzima purificada que exhibirá un mayor eficacia catalítica que la nativa, es decir, más alta que la de tipo salvaje. Esto se puede evaluar apropiadamente in vitro, de acuerdo con la metodología más adecuada para la enzima particular dada. Se confirma que una enzima ensayada que muestra tener un nivel deseable de eficacia catalítica es el producto de una modificación genética deseable y se puede usar para métodos de producción in vitro, como para la producción in vitro de un 2-cetoácido C7-C11 dado, como 2-cetononanoato, y/o un aldehído C6-C10, como octanal, y/o un producto elaborado a partir del aldehído C6-C10, como un alcohol C6-C10, ácido carboxílico o alcano.
Una aplicación particular para la metodología descrita anteriormente es producir un organismo deseable para la producción fermentativa a gran escala o comercial de un producto facilitado por enzimas, como un aldehído C6-C10 o uno de los productos C6-C10 que se pueden preparar a partir de este. Dicha preparación se puede llevar a cabo insertando el ADN, o fragmentos de ADN, que codifican la enzima mejorada deseada en el genoma de un segundo organismo microbiano que se sabe o se cree que posee otras características deseables, como, por ejemplo, la capacidad de resistir a los inhibidores durante la fermentación, la capacidad de producir piruvato (o acetil CoA) a partir de un sustrato particular que contiene carbono, o alguna(s) otra(s) característica(s) ventajosa(s). Por lo tanto, el segundo organismo microbiano ahora está genéticamente modificado, ya que produce una enzima genéticamente modificada.
En otra realización, también es posible identificar simplemente un organismo microbiano que tiene enzimas nativas que son útiles en una ruta general deseada, y usar ese organismo microbiano en sí mismo como un organismo microbiano inicial, o transferir la(s) parte(s) del genoma(s) que codifica(n) la enzima apropiada de tales organismos microbianos en el genoma del organismo que ya ha sido identificado como útil para la producción de fermentación a gran escala. Un ejemplo de esto sería seleccionar un organismo microbiano que ya produce una descarboxilasa dependiente de tiamina nativa (DC) y una alcohol deshidrogenasa nativa (ADH) adecuadas, y usar ese organismo microbiano ya sea como organismo de partida o como organismo transformante para preparar genéticamente un organismo microbiano modificado para producir un alcohol C6-C10 con mayores rendimientos o especificidad que los organismos microbianos de tipo salvaje.
Ejemplo 1
Preparación de la enzima LeuA modificada (es decir, "LeuA’ “).
Este ejemplo representa una realización en donde se prepara una enzima LeuA' manipulada. Esto se logra comenzando con un organismo de Escherichia coli que se ha transformado con un plásmido que contiene un gen
LeuA modificado para producir una variante de 2-isopropilmalato sintasa (LeuA') que tiene una eficacia catalítica superior a la media (kcat/kM) para la captura de 2-cetoácidos de interés para la catálisis. Para esto, se ha identificado un gen particular como adecuado que es LeuA; N.° de acceso de GenBank NC_000913.3 ID del gen: 947465.
En la expresión kcat/KM, kcat es el "número de recambio", de unidad = seg-1; Km es la constante de Michaelis-Menten; y el número de recambio es igual a VMax./[E], en donde VMax. es la velocidad máxima, y [E] es la concentración de enzima. La ecuación se aplica a las reacciones que obedecen a la cinética de Michaelis-Menten y generalmente proporciona la cantidad de sustrato, en moles, que se convierte en producto en un segundo. Por lo tanto, el valor kcat/KM indica una capacidad de catálisis eficaz y se obtiene experimentalmente. Las variantes que tienen una kcat/KM relativamente más alta son por lo tanto aquellas que son más eficaces en la condensación de 2-cetoácidos (n = 1-5 en el intermedio I en la FIGURA 1), que pueden (en este ejemplo de la FIGURA 1) incluir 2-cetobutirato, 2-cetovalerato, 2-cetocaproato, 2-cetoheptanoato y/o 2-cetooctanoato, con acetil CoA, generando así los correspondientes productos de 2-alquilmalato (intermedio II en la FIGURA 1).
Para preparar las variantes LeuA', se realizan sustituciones en los sitios de residuos de aminoácidos designados como Phe-47, Leu-73, His-97, Phe-99, Ser-139 y Asn-167. Uno o más de estos aminoácidos diana se convierten en los aminoácidos glicina, alanina, leucina o valina mediante la realización de mutagénesis de sitio dirigido del gen LeuA conocido de un organismo seleccionado, como E. coli (GenBank: N.° de acceso NC_000913.3 ID del Gen: 947465). Véase también, Patente de EE.UU. 8.298.798 B2. Se puede unir una "etiqueta" de histidina (etiqueta de histidina) a cualquier proteína dada como una ayuda en la purificación de la proteína. Después de este "marcaje", que puede comprender una secuencia de longitud variable insertada en cualquiera de los extremos de una secuencia seleccionada y puede incluir seis (6) histidinas y aminoácidos adicionales seleccionados, la enzima marcada con histidina, que constituye una variante de la enzima (es decir, una enzima modificada) (Leu A') que se expresa en las células DE3 de E. coli se purifica mediante cromatografía de ácido nitrilotriacético-níquel (Ni-NTA). La eficacia de la enzima variante purificada en la condensación de los diversos 2-cetoácidos (n = 1-5 en el intermedio I en la FIGURA 1) se determina mediante ensayos enzimáticos in vitro. Para obtener más información sobre un ensayo que puede ser adecuado para esta determinación, véase, p. ej., Marcheschi, R. J.; Li, H.; Zhang, K.; Noey, E.L.; Kim, S.; Chaubey, A.; Houk, K.N.; Liao, J.C. "Sythetic recursive "+1" pathway for carbon chain elongation", ACS Chem. Biol., 2012, 7: 689-697. Se identifican y seleccionan las variantes que muestran niveles más altos de eficacia catalítica (kcat/kM) para la producción de uno o más alcoholes C6-C10 deseados. También se pueden identificar las combinaciones de variantes LeuA' que trabajan juntas para catalizar la condensación de cualquiera o todos los 2-cetoácidos identificados implicados en la biosíntesis del alcohol C6-C10 de acuerdo con ensayos in vitro.
La FIGURA 2 muestra dos itinerarios para formar 2-cetobutirato a partir de un sustrato que contiene carbono. El primero es a través de una combinación de una ruta de fijación de gas de síntesis de Wood-Ljungdahl para formar piruvato, seguido de una ruta de piruvato a 2-cetobutirato, y el segundo es a través de una combinación de una ruta de glucólisis o de pentosa fosfato para formar piruvato, seguido de una ruta de piruvato a 2-cetobutirato. En cualquier caso, una vez que se forma el 2-cetobutirato, la ruta LeuABCD inicia el alargamiento de la cadena para producir el 2-cetoácido C7-C11 deseado (en esta realización, 2-cetononanoato), y este 2-cetoácido C7-C11 luego se descarboxila a través de una descarboxilasa (dependiente de tiamina) para formar el aldehído C6-C10 que tiene un carbono menos que el 2-cetoácido C7-C11 que se está descarboxilando (en esta realización, octanal). Finalmente, una alcohol deshidrogenasa actúa sobre el aldehído C6-C10 para producir el alcohol C6-C10 correspondiente (en esta realización, 1-octanol).
Ejemplo 2
I. Preparación de variantes LeuB' (isopropilmalato deshidrogenasa) de E. coli que tienen actividad aumentada frente al 3-hexilmalato (3-HM).
Durante la biosíntesis de 2-cetononanoato por la actividad repetitiva de la ruta LeuABCD, se forman ácidos 3-alquilmálicos de diferentes longitudes como sustratos de LeuB. Para una biosíntesis eficaz de 2-cetononanoato, se desea que la LeuB capture de manera eficaz el 3-etilmalato (intermedio III, n=2; FIGURA 1), 3-propilmalato (Intermedio III, n=3; FIGURA 1), 3-butilmalato (3 -BM; Intermedio III, n=4; FIGURA 1), 3-pentilmalato (Intermedio III, n=5; FIGURA 1) y 3-hexilmalato (3-HM; Intermedio III, n=6; FIGURA 1) para la catálisis. La LeuB nativa es relativamente ineficaz para capturar sustratos de 3-alquilmalato no naturales más largos. Para mejorar la eficacia de la LeuB nativa en la captura de 3-hexilmalato para la catálisis, se modifica el sitio activo de la LeuB nativa usando técnicas de ingeniería de proteínas como se describe en la presente memoria a continuación.
Se identificaron residuos que recubren el sitio de unión de 3-isopropilmalato de la LeuB de E. coli a partir de un modelo estructural de LeuB que se construye a través de modelos de homología y que usan como plantilla el modelo de estructura cristalina de la isopropilmalato deshidrogenasa de Thiobacillus ferrooxidans (Protein Data Bank (PDB) código 1A05), según lo descrito por Imada, K.; Inagaki, K.; Matsunami, H.; Kawaguchi, H.; Tanaka, H.; Tanaka, N.; Namba, K. "Structure of 3-isopropylmalate dehydrogenase in complex with 3-isopropylmalate at 2.0 Á resolution: the role of Glu88 in the unique substrate-recognition mechanism", Structure, 1998, 6: 971-982. Se seleccionan Leu-96 y Val-198 para su modificación y se preparan variantes en donde se reemplazan uno o ambos, de diversas formas, con valina, alanina y/o glicina, como se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1
•Las enzimas se identifican por las modificaciones realizadas en la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje. El nombre de cada uno incluye una primera letra que es la abreviatura del aminoácido de la enzima de tipo salvaje; el número es su posición dentro de la secuencia de aminoácidos; y la última letra, que es la abreviatura del aminoácido sustituido en esa ubicación. L = leucina; A = alanina; G = glicina; y V = valina.
Por ejemplo, la enzima L96A se prepara reemplazando la Leu-96 en la isopropilmalato deshidrogenasa de E. coli con alanina; la enzima L96G se prepara reemplazando la Leu-96 con glicina; y la enzima L96G/V198A se prepara reemplazando la Leu-96 con glicina y la Val-198 con alanina. Las restantes variantes de LeuB en la Tabla 1 se nombran de acuerdo con el aminoácido reemplazado.
Cada una de las variantes de LeuB modificadas se expresa, se purifica y luego se evalúa su actividad frente a tres sustratos, que son 3-isopropilmalato (3-IPM), 3-butilmalato (3-BM) y 3-hexilmalato (3-HM). 3-IPM es el sustrato natural de LeuB y se forma en los organismos microbianos durante la biosíntesis de leucina. El 3-BM y el 3-HM son sustratos no naturales de LeuB que se formarían dentro de las células durante la biosíntesis de 2-cetoácidos C7-C11, por ejemplo, 2-cetononanoato.
La evaluación de las variantes de LeuB se realiza en dos etapas usando el ensayo enzimático de alto rendimiento que se describe a continuación. Inicialmente, se analiza la actividad de todas las variantes frente a una sola concentración alta de 3-IPM, 3-BM y 3-HM. Después de la evaluación inicial, se realiza un análisis cinético detallado en un número selecto de variantes para determinar la tasa máxima (kcat), constante de Michaelis-Menten (kM), y la eficacia catalítica de la enzima (kcat/kM).
Las variantes LeuB' que son más eficaces (kcat/kM mayores) que la enzima de tipo salvaje en la conversión de todos o algunos de los sustratos de 3-alquilmalato, tales como 3-HM, en el 2-cetoácido C7-C11 correspondiente, son deseables porque mejoran la eficacia global de la ruta "+1" relevante.
II. Expresión heteróloga de LeuB (isopropilmalato deshidrogenasa) y sus variantes modificadas en E. coli.
Para evaluar la especificidad de sustrato de la LeuB de tipo salvaje y de las variantes LeuB' manipuladas enumeradas en la Tabla 1, se expresan los genes de todas las proteínas en células de E. coli por separado y se aíslan los productos proteicos a partir de las células. Para obtener los productos proteicos, se descarga la secuencia del gen LeuB (N.° de Acceso EcoGene EG11577 (Listado de secuencias, SEQ ID 1) del sitio web de EcoGene (http://ecogene.org). Se añaden los codones de 11 aminoácidos adicionales después el codón del último aminoácido en el marco de lectura abierto del gen LeuB. Estos aminoácidos adicionales incluyen 6 histidinas más 5 aminoácidos adicionales, y se anclan como una etiqueta de histidina, para ayudar a purificar la proteína en una sola etapa usando cromatografía Ni-NTA. Se sintetiza químicamente la secuencia del gen de la secuencia completa de LeuB con los 11 aminoácidos adicionales,
se clona en el vector pETDuet-1 (EMD Biosciences), corriente abajo del promotor de la polimerasa T7, y se secuencia mediante Synthetic Genomics Inc. (San Diego, CA). Se observa que ninguno de los listados de secuencias incluidos en la presente memoria muestra la etiqueta de histidina que se usa, que en este caso es Gly-Ser-Ser-His-His-His-His-His-His-Ser-Ser.
Los genes de las variantes LeuB' enumeradas en la Tabla 1 también se sintetizan químicamente tras la sustitución del codón del aminoácido seleccionado (Leu-96 y/o V-198) por el de alanina, valina y/o glicina (Listado de secuencias, SEQ ID 2 a SEQ ID 10) y se clonan en el vector pETDuet-1. El vector pETDuet-1 que contiene el gen LeuB o su variante se transforma en E. coli, y se expresa la LeuB o su variante y finalmente se purifica como se describe a continuación.
A. Transformación de E.coli: los estudios de expresión en E.coli se llevan a cabo usando células BL21 (DE3) competentes adquiridas de Merck Biosciences. Las transformaciones se realizan según las instrucciones del kit e implican mezclar una alícuota de 50 microlitros (pl) de células competentes con 1 pl del vector. Las células que albergan el vector de expresión de LeuB se seleccionan usando ampicilina como marcador.
B. Expresión de LeuB y sus variantes en E.coli: los transformantes de E.coli que albergan el vector de expresión de LeuB o su variante se seleccionan en placas de agar LB que contienen 100 microgramos por mililitro (pg/ml) de ampicilina. Las placas se incuban a 37 grados Celsius (°C) durante 16 horas (h). Se inicia un cultivo iniciador con la transferencia de una sola colonia de transformante en 50 mililitros (ml) de medio Lysogeny Broth (LB) que contiene 100 pg/ml de ampicilina y se incuba a 37 °C con agitación a 220 revoluciones por minuto (rpm) durante toda la noche. Al día siguiente, se inoculan 7 ml de cultivo iniciador en 800 ml de Terrific Broth (TB) y el cultivo se incuba a 37 °C hasta que el cultivo alcanza una densidad óptica a 600 nanómetros (nm) (OD600nm) de 0,5. Se añade isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 milimolar (mM) para inducir la expresión de los genes LeuB o de las variantes de LeuB (LeuB'), y el cultivo se transfiere a una incubadora a 15 °C durante 16 h. Al final de las 16 h, el cultivo se centrifuga a 8.000 rpm para sedimentar las células. El sedimento celular se divide en dos alícuotas y se almacena a -80 °C durante toda la noche antes de la purificación.
C. Purificación de LeuB y sus variantes: Se suspende un sedimento celular de E. coli de 400 ml de cultivo de expresión en reactivo B-PER (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL) que contiene 1 pg/ml de ADNasa (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL), 1 pg/ ml de lisozima (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL), ditiotreitol (DTT) 1 mM y cóctel de inhibidores de proteasas (RPI Corp., Mount Prospect, IL). La suspensión se agita suavemente durante 30 minutos (min) a temperatura ambiente y se centrifuga a 15.000 veces la gravedad (x g) durante 20 min para sedimentar los restos celulares. Se separa el sobrenadante y se incuba con 5 ml de resina Co-NTA (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL) que se ha equilibrado previamente con un tampón de equilibrado (fosfato de sodio 50 mM, pH 8,0, que contiene cloruro de sodio 300 mM, imidazol 20 mM, 50 pl de cóctel inhibidor de proteasas y 15 por ciento en volumen (% en volumen) de glicerol). Después de un período de incubación de 1 h a 4 °C, la resina unida a LeuB se lava con 5 volúmenes de tampón de equilibrado. A continuación, se eluyen LeuB y sus variantes de la resina Co-NTA con un tampón de equilibrado que contiene imidazol 200 mM. Las proteínas eluidas finalmente se dializan frente a solución salina tamponada con fosfato y se almacenan como una solución de glicerol al 20% en volumen a -20 °C.
III. Determinación de la especificidad de sustrato de LeuB de tipo salvaje y de las variantes modificadas.
La evaluación de las variantes de LeuB se realiza en dos etapas usando el ensayo enzimático de alto rendimiento que se describe a continuación. Inicialmente, se analiza la actividad de todas las variantes frente a una sola concentración alta de 3-IPM, 3-BM y 3-HM. Después de la evaluación inicial, se realiza un análisis cinético detallado en un número selecto de variantes para determinar la tasa máxima (kcat), constante de Michaelis-Menten (kM), y la eficacia catalítica de las enzimas variantes (kcat/kM).
Se adapta un ensayo enzimático espectrofotométrico de LeuB adecuado a un formato de alto rendimiento en placas de 96 pocillos para la evaluación cinética de LeuB y sus variantes (mostradas en la Tabla 1) frente a 3-isopropilmalato (3-IPM), 3-butilmalato (3-BM) y 3-hexilmalato (3-HM). Véase, por ejemplo, Hsu, Y.; Kohlhaw, G.B. "Leucine biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization of beta-isopropylmalate dehydrogenase", J. Biol. Chem., 1980, 255 :7255-7260. Se determinan en estos experimentos los parámetros cinéticos de estado estacionario (kcat, kM y kcat/kM) para la descarboxilación oxidativa de los tres sustratos por las variantes.
A. Ensayo de detección de HTP para la identificación de variantes funcionales de LeuB:
El ensayo de detección de HTP implica la incubación de 750 micromoles (pM) de 3-IPM, 3-BM 1 mM o 3-HM 1 mM, con dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD+) 2 mM en tampón de ensayo de LeuB (ácido 4-(2-hidroxietil) piperazina-1-etanosulfónico (HEPES) 50 mM, pH 8,0, que contiene cloruro de potasio (KCI) 30 mM y cloruro de magnesio (MgCb) 5 mM) a 25 °C. La reacción se inicia por la adición a 25 °C de un stock de enzima de trabajo que contiene de 0,3 microgramos (pg) a 1,1 pg de la variante de LeuB diluida en tampón de ensayo que contiene 1 mM de DTT y 1 miligramo por mililitro (mg/ml) de albúmina de suero bovino (BSA). La placa que contiene los 200 pl de la mezcla de reacción se centrifuga a 2.500 x g durante 15 segundos (s) y el cambio de absorbancia de la mezcla de reacción se rastrea espectrofotométricamente a 340 nm en un lector de placas BioTek™, preequilibrado a 25 °C. La velocidad inicial de la reacción enzimática se calcula a partir de la tasa de producción de NADH a 340 nm y usando el
coeficiente de extinción de NADH (6,22 por milimolar por centímetro (mM-1cm-1)). La actividad de todas las variantes se normaliza con la cantidad de enzima presente en la mezcla de reacción y se expresa en nanomoles por minuto por microgramo (nmol.min-1.gg-1) (Tabla 2). Las concentraciones de proteína para normalizar las actividades se determinan usando el kit de ensayo de proteína total de 660 nm adquirido de Pierce Biotechnology Inc™, disponible de Thermo Fisher Scientific, Inc., y usando BSA como estándar.
B. Ensayo HTP de la enzima LeuB para la determinación de los parámetros cinéticos de descarboxilación oxidativa de 3-Ip M, 3-BM y 3-HM por variantes de LeuB:
El ensayo cinético de HTP implica la incubación de ocho concentraciones variadas, de 3-IPM (de 0 a 1,2 mM) o 3-BM (de 0 a 2 mM) o 3-HM (de 0 a 2 mM), con 2 mM de NAD+ en tampón de ensayo de LeuB (HEPES 50 mM, pH 8,0, que contiene KCl 30 mM y MgCl25 mM) a 25 °C. La reacción se inicia añadiendo de 0,008 gg a 0,5 gg de la variante de LeuB que se ha diluido previamente en tampón de ensayo que contiene 1 mM de DTT y 1 mg/ml de BSA. La placa que contiene los 200 gl de la mezcla de reacción se centrifuga a 2.500 x g durante 15 segundos y se registra espectrofotométricamente el cambio de absorbancia a 340 nm en un lector de placas BioTek.™ mantenido a 25 °C. La velocidad inicial de la reacción enzimática se calcula a partir de la tasa de producción de NADH a 340 nm y usando el coeficiente de extinción de NADH (6,22 mM-1cm-1). Los parámetros cinéticos (kcat, kM y kcat/kM) de descarboxilación oxidativa de 3-alquilmalato se determinan ajustando los datos a la ecuación de Michaelis-Menten que usa regresión no lineal realizada usando el software GraphPad Prism™. La Tabla 3 enumera los parámetros cinéticos de las variantes de tipo salvaje y modificadas frente a los tres sustratos. La cantidad de enzima en la mezcla de reacción se determina usando el kit de ensayo de proteína total de 660 nm adquirido de Pierce Biotechnology Inc.™, que usa BSA como estándar.
C. Resultados y Discusión
Para mejorar la eficacia de la ruta "+1" en la producción de 2-cetononanoato, la isopropilmalato deshidrogenasa catalizaría de forma deseable y eficaz la descarboxilación oxidativa de todos los 3-alquilmalatos intermedios. Los tres sustratos usados para la evaluación de las variantes de LeuB son representativos de estos 3-alquilmalatos intermedios, es decir, el 3-isopropilmalato (3-IPM) es representativo de los sustratos de 3-alquilmalato más cortos que se espera que se formen durante los primeros ciclos de la ruta "+1" reiterativa; el 3-butilmalato (3-BM) es representativo de los 3-alquilmalatos de longitud intermedia; y formación; y el 3-hexilmalato (3-HM) sería descarboxilado oxidativamente por LeuB para formar 2-cetononanoato.
Inicialmente, las variantes LeuB' se analizan en cuanto a actividad frente a una sola concentración alta de cada uno de 3-IPM, 3-BM y 3-HM (Tabla 2).
Tabla 2. Evaluación de las variantes LeuB’ y LeuB de tipo salvaje.
•La actividad específica de las variantes de LeuB frente a los tres sustratos, 3-isopropilmalato (3-IPM), 3-butilmalato (3-BM) y 3-hexilmalato (3-HM) se determina como se describe en el ensayo de detección de HTP. Las actividades específicas que se muestran son las medias de experimentos duplicados del ensayo de detección.
El intervalo entre los dos valores es inferior al 20 %.
ND=no detectado en condiciones experimentales.
Sin desear limitarse a ninguna teoría, los resultados ilustrados en la Tabla 2 se pueden interpretar como sugestivos que reemplazar Leu-96 y/o Val-198 con aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrofóbicas más pequeñas, p. ej., valina, alanina o glicina, puede en algunos casos disminuir simultáneamente la actividad enzimática frente a 3-IPM y aumentar la actividad enzimática frente a 3-HM.
Las variantes L96A, L96G, V198A, L96A/V198A, L96G/V198A y L96G/V198G exhiben mayor actividad que la enzima de tipo salvaje frente a 3-HMe y se someten a análisis cinético adicional. Este análisis sugiere que la LeuB de tipo salvaje es muy eficaz en la captura de su sustrato nativo, 3-IPM para la catálisis. Como se ilustra en la Tabla 3, se encuentra que la eficacia catalítica de la enzima de tipo salvaje es 1.000 veces mayor que la del 3-HM, y la eficacia de captura de 3-BM es intermedia entre los dos sustratos. La enzima LeuB de tipo salvaje se convierte así en un catalizador progresivamente más pobre a medida que la ruta "+1" repite para alargar el 2-cetobutirato a un 2-cetoácido C7-C11, tal como, en este caso, 2-cetononanoato.
La sustitución de la Leu-96 en la LeuB de E. co licon residuos progresivamente más pequeños, p. ej., alanina (L96A) o glicina (L96G), mejora la eficacia de capturar sustratos con cadenas alquílicas más largas, con una reducción simultánea en la captura de sustratos con cadenas alquílicas más cortas. La variante L96A es aproximadamente 4 veces más ineficaz para capturar 3-IPM que la enzima de tipo salvaje, mientras que es modestamente pobre para capturar 3-BM (véase la Tabla 3). La variante L96G es 100 veces menos eficaz que la enzima de tipo salvaje en la captura de 3-IPM, mientras que es 80 veces más eficaz en la captura de 3-HM que la enzima de tipo salvaje. Esto sugiere que la Leu-96 está bloqueando la captura de alquilmalatos más largos, como el 3-HM.
La sustitución de la Val-198 en la LeuB de E. coli con un residuo de aminoácido más pequeño, p. ej., alanina, mejora la eficacia catalítica de la enzima para capturar 3-alquilmalatos más largos, como 3-HM, al tiempo que disminuye la eficacia de captura de alquilmalatos más cortos, como 3-IPM. Esto es evidente a partir de las eficacias comparativas de la variante V198A al catalizar la conversión de 3-HM, que es 5 veces mayor, y de 3-IPM, que es 1.000 veces menor, en comparación con las eficacias del la LeuB de tipo salvaje (véase la Tabla 3).
Tabla 3. Especificidad de sustrato de las enzimas LeuB modificadas
3-IPM = 3-isopropilmalato; 3-BM = butilmalato; y 3-HM = 3-hexilmalato. Para variantes LeuB' que tienen una constante de Michaelis-Menten alta (Km ) frente a uno de los sustratos, sólo se indica la eficacia catalítica (kcat/kM).
Se muestra la media ± desviación estándar (S.D.) de un mínimo de tres experimentos independientes.
Indica que la actividad es baja y, por tanto, no se puede calcular el parámetro.
También se observa que la sustitución tanto de la Leu-96 como de la Val-98 con residuos hidrofóbicos más pequeños aumenta simultáneamente la eficacia de captura del 3-HM y disminuye la eficacia de captura del 3-IPM. Las variantes L96A/V198A y L96G/V198A exhiben una eficacia 12 y 102 veces mayor, respectivamente, en la captura de 3-HM en comparación con la enzima de tipo salvaje (Tabla 3), mientras que al mismo tiempo estas variantes son catalizadores muy pobres para 3-IPM, como es evidente a partir de una bajada de más de 3.000 veces en comparación con la enzima LeuB de tipo salvaje.
Los datos muestran que la enzima LeuB' genéticamente modificada generalmente opera con una eficacia catalítica más alta que la de la enzima de tipo salvaje para catalizar, como se muestra, el 3-butilmalato para formar 2-cetoheptanoato, o el 3-hexilmalato para formar 2-cetononanoato. También se puede inferir que catalizará con mayor eficacia el 3-pentilmalato para formar 2-cetooctanoato. Finalmente, también realizará combinaciones de estas conversiones a una mayor eficacia catalítica.
Los datos cinéticos sobre las variantes LeuB' sugieren que un medio de formación eficaz de un 2-cetoácido C7-C11, tal como, entre otros, 2-cetononanoato, mediante la repetición de la ruta "+1" se realizaría mediante la coexpresión de la enzima salvaje LeuB y una o más de las variantes enumeradas en la Tabla 3.
Ejemplo 3
Preparación de las enzimas LeuCD modificadas (es decir, "LeuCD' ").
En esta realización del Ejemplo 3, se describe un enfoque similar al usado para la enzima LeuA' en el Ejemplo 1. El proceso comienza con un organismo de E. co lique se ha transformado con un plásmido que contiene los genes LeuC y LeuD para que produzca un complejo de 2-isopropilmalato isomerasa modificado con mayor eficacia catalítica (kcat/kM) en la isomerización de 2-alquilmalatos (n = 1-5 en el Intermedio II, FIGURA 1) generados por la LeuA' a sus correspondientes 3-alquilmalatos (n = 1-5 en el Intermedio III, FIGURA 1). Los genes LeuC y LeuD modificados se generan sintéticamente alterando algunos de los códigos genéticos, es decir, la sustitución de uno o más de los aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de los genes LeuC y LeuD obtenidos de GenBank (LeuC: N°. Acceso GenBank NC 000913.3 ID del Gen: 945076 y LeuD: N2. Acceso GenBank NC 000913.3, ID del Gen: 945642). Cada variante modificada se genera reemplazando uno o más residuos dentro y/o cerca de los sitios activos de LeuC y/o LeuD usando mutagénesis de sitio dirigido. Cada enzima modificada se expresa como una proteína etiquetada con histidina en células DE3 de E. coli y luego purificadas usando cromatografía Ni-NTA. La eficacia de la enzima variante purificada en la isomerización de varios 2-alquilmalatos se determina mediante un ensayo in vitro de enzimas acopladas tal como el que se puede usar para el ensayo de la aconitasa. Véase, p. ej., Han, D.; Canali, R.; García, J.; Aguilera, R.; Gallaher, T.K.; Cadenas, E. "Sites and mechanisms of aconitase inactivation by peroxynitrite: Modulation by citrate and glutathione", Biochemistry, 2005, 44: 11986-11996. Se identifican y seleccionan las variantes que muestran una mayor eficacia catalítica (kcat/kM) que el complejo enzimático nativo para la producción de un alcohol
Claims (6)
1. Un proceso para preparar un 2-cetoácido C7-C11 que comprende poner en contacto un sustrato, seleccionado de 2-cetobutirato y 2-cetoisovalerato, y
(1) una enzima LeuA nativa o genéticamente modificada que tiene actividad de isopropilmalato sintasa;
(2) una enzima LeuB' genéticamente modificada, en donde:
a) la enzima se obtiene a partir de Escherichia coli y tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente al Listado de Secuencias, SEQ ID 1; habiendo sido la enzima modificada
(1) en Leu-96 por sustitución a glicina;
(2) en Val-198 por sustitución a alanina;
(3) en Leu-96 por sustitución a alanina y en Val-198 por sustitución a alanina;
(4) en Leu-96 por sustitución a glicina y en Val-198 por sustitución a alanina;
(5) en Leu-96 por sustitución a glicina y en Val-198 por sustitución a glicina; o
(6) en Leu-96 por sustitución a alanina;
o
(b) la enzima tiene actividad de isopropilmalato deshidrogenasa y cataliza la conversión de 3-hexilmalato para formar 2-cetononanoato con una eficacia catalítica que es superior a la de una enzima LeuB nativa, en donde la enzima tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 60 por ciento homóloga a la secuencia de aminoácidos del Listado de Secuencias, SEQ ID 1; habiéndose modificado la enzima como en (a);
y
(3) un complejo enzimático nativo o genéticamente modificado LeuCD' que tiene actividad de isopropilmalato isomerasa;
en condiciones tales que el 2-cetobutirato o el 2-cetoisovalerato se convierte, a través de una o más etapas, en un 2-cetoácido C7-C11.
2. El proceso de la reivindicación 1 que comprende además poner en contacto el 2-cetoácido C7-C11 y una descarboxilasa dependiente de tiamina en condiciones tales que el 2-cetoácido C7-C11 se convierte en un aldehído C6-C10 que tiene un átomo de carbono menos que el 2-cetoácido C7-C11 que se está convirtiendo.
3. El proceso de la reivindicación 2 que además comprende poner en contacto el aldehído C6-C10 y al menos una enzima seleccionada de
(1) una alcohol deshidrogenasa, en condiciones tales que el aldehído C6-C10 se convierte en el alcohol C6-C10 correspondiente;
(2) una aldehído deshidrogenasa, en condiciones tales que el aldehído C6-C10 se convierte en el correspondiente ácido carboxílico C6-C10;
(3) una aldehído graso descarbonilasa, en condiciones tales que el aldehído C6-C10 se convierte en el alcano C5-C9 correspondiente; y
(4) combinaciones de estas.
4. Un organismo microbiano que expresa una enzima LeuB' genéticamente modificada que:
(1) se obtiene de Escherichia coli y tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente al Listado de Secuencias, SEQ ID 1; habiéndose modificado la enzima
(i) en Leu-96 por sustitución a glicina;
(ii) en Val-198 por sustitución a alanina;
(iii) en Leu-96 por sustitución a alanina y en Val-198 por sustitución a alanina;
(iv) en Leu-96 por sustitución a glicina y en Val-198 por sustitución a alanina;
(v) en Leu-96 por sustitución a glicina y en Val-198 por sustitución a glicina; o
(vi) en Leu-96 por sustitución a alanina;
o
(2) tiene actividad de isopropilmalato deshidrogenasa y cataliza la conversión de 3-hexilmalato para formar 2-cetononanoato con una eficacia catalítica que es mayor que la de una enzima LeuB nativa, y en donde la enzima tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 60 por ciento homóloga a la secuencia de aminoácidos del Listado de Secuencias, SEQ ID 1, habiéndose modificado la enzima como en (1).
5. Un proceso para preparar un aldehído C6-C10 que comprende
(1 a) poner en contacto un sustrato que contiene carbono y:
piruvato carboxilasa nativa o genéticamente modificada que tiene actividad de piruvato carboxilasa, aspartato aminotransferasa nativa o genéticamente modificada que tiene actividad de aspartato aminotransferasa,
aspartoquinasa/homoserina deshidrogenasa bifuncional nativa o genéticamente modificada que tiene actividad bifuncional de aspartoquinasa/homoserina deshidrogenasa,
homoserina quinasa nativa o genéticamente modificada que tiene actividad de homoserina quinasa, treonina sintasa nativa o genéticamente modificada que tiene actividad de treonina sintasa, aspartato semialdehído deshidrogenasa nativa o genéticamente modificada que tiene actividad de aspartato semialdehído deshidrogenasa y
treonina deshidratasa nativa o genéticamente modificada que tiene actividad de treonina deshidratasa, en condiciones para formar 2-cetobutirato, o
(1 b) poner en contacto un sustrato que contiene carbono y:
isozima acetolactato sintasa nativa o genéticamente modificada con actividad de isozima acetolactato sintasa,
cetol-ácido reductoisomerasa que tiene actividad cetol-ácido reductoisomerasa, y
dihidroxiácido deshidratasa que tiene actividad dihidroxiácido deshidratasa,
en condiciones para formar 2-cetoisovalerato;
(2) poner en contacto el 2-cetobutirato o el 2-cetoisovalerato y
(a) una enzima LeuA nativa o genéticamente modificada que tiene actividad de isopropilmalato sintasa; (b) una enzima LeuB' genéticamente modificada, en donde la enzima LeuB'
(i) se obtiene de Escherichia coli y tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente al Listado de Secuencias, SEQ ID 1; habiéndose modificado la enzima
(a) en Leu-96 por sustitución a glicina;
(b) en Val-198 por sustitución a alanina;
(c) en Leu-96 por sustitución a alanina y en Val-198 por sustitución a alanina;
(d) en Leu-96 por sustitución a glicina y en Val-198 por sustitución a alanina;
(e) en Leu-96 por sustitución a glicina y en Val-198 por sustitución a glicina; o
(f) en Leu-96 por sustitución a alanina;
o
(ii) tiene actividad de isopropilmalato deshidrogenasa y cataliza la conversión de 3-hexilmalato para formar 2-cetononanoato con una eficacia catalítica que es mayor que la de una enzima LeuB nativa, y en donde la enzima tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 60
por ciento homologa a la secuencia de aminoácidos del Listado de Secuencias, SEQ ID 1; habiéndose modificado la enzima como en (i); y
(c) un complejo enzimático nativo o genéticamente modificado LeuCD' que tiene actividad de isopropilmalato isomerasa;
en condiciones tales que el 2-cetobutirato o el 2-cetoisovalerato se convierte, a través de una o más etapas, en un 2-cetoácido C7-C11; y
(3) poner en contacto el 2-cetoácido C7-C11 y una descarboxilasa dependiente de tiamina genéticamente modificada que tiene actividad descarboxilasa dependiente de tiamina en condiciones tales que el 2-cetoácido C7-C11 se convierte en un aldehído C6-C10 que tiene un átomo de carbono menos que el 2-cetoácido C7- C11 que se está convirtiendo;
cada uno de (1), (2) y (3) ocurren en una o más etapas;
en donde (1), (2) y (3) ocurren independientemente dentro o fuera de un organismo microbiano genéticamente modificado.
6. El proceso de la reivindicación 5, en donde la enzima genéticamente modificada LeuB' cataliza la conversión de:
(1) 3-butilmalato para formar 2-cetoheptanoato; y/o
(2) 3-pentilmalato para formar 2-cetooctanoato;
con una eficacia catalítica superior a la de una enzima LeuB nativa.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201361915040P | 2013-12-12 | 2013-12-12 | |
| PCT/US2014/069438 WO2015089127A1 (en) | 2013-12-12 | 2014-12-10 | Processes to prepare elongated 2-ketoacids and c6-c10 compounds therefrom via genetic modifications to microbial metabolic pathways |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2926950T3 true ES2926950T3 (es) | 2022-10-31 |
Family
ID=52293198
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES14824634T Active ES2926950T3 (es) | 2013-12-12 | 2014-12-10 | Procesos para preparar 2-cetoácidos alargados y compuestos C6-C10 a partir de estos mediante modificaciones genéticas de rutas metabólicas microbianas |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9951356B2 (es) |
| EP (1) | EP3080285B1 (es) |
| CN (1) | CN105793431A (es) |
| BR (1) | BR112016012712B1 (es) |
| CA (1) | CA2933470C (es) |
| ES (1) | ES2926950T3 (es) |
| SA (1) | SA516371281B1 (es) |
| WO (1) | WO2015089127A1 (es) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107231807B (zh) | 2014-12-10 | 2021-03-16 | 陶氏环球技术有限责任公司 | 基因修饰苯丙酮酸脱羧酶、其制备方法和用途 |
| CA3038660A1 (en) * | 2016-09-30 | 2018-04-05 | Dow Global Technologies Llc | Processes to prepare elongated 2-ketoacids and c5-c10 compounds therefrom via genetic modifications to microbial metabolic pathways |
| ES2984622T3 (es) * | 2017-09-29 | 2024-10-30 | Dow Global Technologies Llc | Complejos de enzima isopropilmalato isomerasa modificados genéticamente y procesos para preparar 2-cetoácidos alargados y compuestos C5-C10 con los mismos |
| CN116376989B (zh) * | 2022-04-11 | 2023-10-24 | 元素驱动(杭州)生物科技有限公司 | 一种制备酮酸的方法及该方法在制备氨基酸或氨基酸衍生物中的应用 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CL2008002961A1 (es) | 2007-10-04 | 2009-05-08 | Bio Arch Lab Inc | Metodo para convertir un monosacarido u oligosacarido apropiado en un quimico generico que comprende contactar dichos moleculas con un sistema microbiano que comprende uno o mas genes que codifican y expresan una via de biosintesis. |
| JP5578767B2 (ja) | 2008-01-28 | 2014-08-27 | 克己 飯田 | 蒸発装置 |
| BRPI0919696A2 (pt) * | 2008-10-18 | 2015-08-04 | Univ California | Polipeptídeo substancialmente purificado, microorganismo recombinante, e, polinucleotídeo isolado. |
| EP2464736A4 (en) | 2009-08-12 | 2013-07-31 | Gevo Inc | PATIENT LOCALIZATION OF CYTOSOLIC ISOBUTANOL FOR THE MANUFACTURE OF ISOBUTANOL |
| US8372610B2 (en) * | 2010-09-15 | 2013-02-12 | Ls9, Inc. | Production of odd chain fatty acid derivatives in recombinant microbial cells |
| WO2012135731A2 (en) | 2011-04-01 | 2012-10-04 | The Regents Of The University Of California | Alcohol production from recombinant microorganisms |
| US20140377857A1 (en) * | 2012-02-15 | 2014-12-25 | The Regents Of The University Of California | Integrated electro-bioreactor |
| CN107231807B (zh) | 2014-12-10 | 2021-03-16 | 陶氏环球技术有限责任公司 | 基因修饰苯丙酮酸脱羧酶、其制备方法和用途 |
-
2014
- 2014-12-10 WO PCT/US2014/069438 patent/WO2015089127A1/en not_active Ceased
- 2014-12-10 CA CA2933470A patent/CA2933470C/en active Active
- 2014-12-10 BR BR112016012712-9A patent/BR112016012712B1/pt active IP Right Grant
- 2014-12-10 ES ES14824634T patent/ES2926950T3/es active Active
- 2014-12-10 US US15/030,616 patent/US9951356B2/en active Active
- 2014-12-10 CN CN201480065279.XA patent/CN105793431A/zh active Pending
- 2014-12-10 EP EP14824634.1A patent/EP3080285B1/en active Active
-
2016
- 2016-06-09 SA SA516371281A patent/SA516371281B1/ar unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2015089127A1 (en) | 2015-06-18 |
| BR112016012712A2 (pt) | 2017-09-26 |
| US9951356B2 (en) | 2018-04-24 |
| CA2933470C (en) | 2023-10-03 |
| US20160355850A1 (en) | 2016-12-08 |
| CN105793431A (zh) | 2016-07-20 |
| SA516371281B1 (ar) | 2018-09-20 |
| EP3080285A1 (en) | 2016-10-19 |
| BR112016012712B1 (pt) | 2023-10-03 |
| CA2933470A1 (en) | 2015-06-18 |
| EP3080285B1 (en) | 2022-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11142761B2 (en) | Compositions and methods for rapid and dynamic flux control using synthetic metabolic valves | |
| Lin et al. | Extending shikimate pathway for the production of muconic acid and its precursor salicylic acid in Escherichia coli | |
| ES2792853T3 (es) | Fenilpiruvato descarboxilasa modificada genéticamente, procedimientos de preparación y usos de la misma | |
| US20140065697A1 (en) | Cells and methods for producing isobutyric acid | |
| JP2015517824A (ja) | 生合成経路、組み換え細胞、及び方法 | |
| ES2926950T3 (es) | Procesos para preparar 2-cetoácidos alargados y compuestos C6-C10 a partir de estos mediante modificaciones genéticas de rutas metabólicas microbianas | |
| CN107429271A (zh) | 从一碳化合物生物合成产物 | |
| CN102808002B (zh) | 一种生物法合成甲基乙偶姻及其衍生物的重组细胞和方法 | |
| US20220348935A1 (en) | Novel genetically engineered microorganism capable of growing on formate, methanol, methane or co2 | |
| US20140296571A1 (en) | Microorganisms And Methods For Producing Propionic Acid | |
| US10995322B2 (en) | Processes to prepare elongated 2-ketoacids and C5-C10 compounds therefrom via genetic modifications to microbial metabolic pathways | |
| US20140329275A1 (en) | Biocatalysis cells and methods | |
| Li et al. | Revealing the endogenous homoserine cycle for the effective methanol conversion in Pichia pastoris | |
| Belkhelfa | Genetic adaptation of methylotrophic bacteria for industrial production of chemical compounds | |
| BR112019006315B1 (pt) | Processo para preparar um c7-c11 2-cetoácido, microorganismo microbiano transgênico e polipeptídeo de isopropilmalato sintase geneticamente modificado tendo atividade de isopropilmalato | |
| Xie | Metabolic engineering for optimizing isobutanol production in Synechocystis PCC 6803 |