ES2926677T3

ES2926677T3 - Herramientas y métodos terapéuticos novedosos para tratar la ceguera mediante el direccionamiento a los fotorreceptores

Info

Publication number: ES2926677T3
Application number: ES16770708T
Authority: ES
Inventors: Josephine Juettner; Dasha Nelidova; Botond Roska
Original assignee: Novartis Forschungsstiftung Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research
Current assignee: Novartis Forschungsstiftung Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research
Priority date: 2015-09-15
Filing date: 2016-09-13
Publication date: 2022-10-27
Anticipated expiration: 2036-09-13
Also published as: EP3350330B1; JP6898920B2; US10857241B2; WO2017046084A1; EP3350330A1; US11931427B2; JP2018531004A; US20180256753A1; EP4119667A1; CN108350463A; CN108350463B; US20210085804A1

Abstract

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un canal iónico despolarizante activado por la luz unido funcionalmente a un promotor que conduce a la expresión específica de dicho canal despolarizante activado por la luz en un fotorreceptor retiniano, o la secuencia de nucleótidos complementaria a dicha secuencia de nucleótidos, para uso en el tratamiento o mejora de la ceguera. La presente invención también se refiere a métodos para usar dichas moléculas de ácido nucleico en el tratamiento de la ceguera. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Herramientas y métodos terapéuticos novedosos para tratar la ceguera mediante el direccionamiento a los fotorreceptores

Campo de la invención

La presente invención se refiere a construcciones para su uso en el tratamiento de la ceguera, así como a su uso en la fabricación de un medicamento para tratar la ceguera.

Antecedentes de la invención

La ceguera es un problema de salud muy importante que incapacita a millones de personas en todo el mundo. Una de las causas más comunes de ceguera es la disfunción de la retina. Las tres formas más comunes de ceguera retiniana son la retinitis pigmentosa (RP), la degeneración macular (DM) y el glaucoma (G). En la RP y la DM el problema principal es la degeneración de los fotorreceptores y la consiguiente pérdida de fotosensibilidad. Por lo tanto, es necesario poder obviar los problemas asociados a dicha degeneración de los fotorreceptores.

Uno de los enfoques ha sido el desarrollo de una prótesis de retina, un chip de "ojo vidente" con hasta 1.000 electrodos diminutos que se implantan en el ojo. Esto tendría el potencial de ayudar a las personas que han perdido la vista a recuperar la visión suficiente para funcionar de forma independiente, pero el número de electrodos es simplemente insuficiente para proporcionar un alto grado o nivel de vista. Además, existen problemas asociados a la inserción de cuerpos extraños en el ojo.

Recientemente se han aislado y/o manipulado una serie de genes que cuando se expresan pueden hacer que las células sean sensibles a la luz. En algunos casos, también se necesitan factores no genéticos adicionales para que las células sean sensibles a la luz.

Una de las propuestas de Eli en 2001 fue usar las proteínas que contienen clorofila de las espinacas para tratar la pérdida de visión. Estas proteínas emiten un pequeño voltaje eléctrico después de capturar la energía de los fotones de luz entrantes. Aunque la investigación ha demostrado que pueden incorporarse centros de reacción del fotosistema I a un liposoma y se ha demostrado que son funcionales, en el sentido de que producen el equivalente experimental de un voltaje cuando se proyecta luz sobre ellos, hasta ahora no se había demostrado que esto funcionara en una célula retiniana.

Otro trabajo del neurobiólogo Richard Kramer, de la Universidad de Berkeley, ha estudiado la posibilidad de rediseñar un canal de potasio para que responda a la luz en lugar de al voltaje, con el fin de permitir la inserción de un interruptor activado por la luz en células cerebrales normalmente insensibles a la luz. Sin embargo, hay que mutar el canal para que permanezca siempre abierto y es necesario un "tapón" químico, unido al canal, que sea sensible a la luz, de manera que cuando se ilumine con luz ultravioleta de longitud de onda larga, el tapón se libere del canal, dejando salir el potasio del canal. La luz de mayor longitud de onda hace que el tapón se inserte de nuevo en el canal y detenga la liberación de potasio. Sin embargo, se apreciará que un sistema de este tipo es extremadamente complejo y es probable que surjan problemas si el canal se suministra al tipo equivocado de células retinianas.

Bi et al., ("Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration", Neuron, 50, 2006, págs. 23-33) desvelan el uso de rodopsina de tipo microbiano para restablecer las respuestas visuales en ratones con degeneración de fotorreceptores. Sin embargo, es probable que la expresión del gen de la rodopsina se haya producido en diversos tipos de células del ojo, lo que es potencialmente no deseable y/o problemático. También parece que el umbral de intensidad lumínica necesario para producir respuestas es mucho mayor que para los fotorreceptores bastones y conos normales, pero no se ha enseñado cómo puede abordarse esto, por ejemplo, en entornos con poca luz.

Algunos de los presentes inventores han descrito un método alternativo en el documento WO-A-2008/022772, en donde, por ejemplo, la canalrrodopsina-2 se dirige, por ejemplo, a células ON ("encendido" en inglés). Sin embargo, este método tiene la desventaja de no ser óptimo con las células OFF ("apagado" en inglés).

Sumario de la invención

Durante investigaciones posteriores, los presentes inventores se dieron cuenta de que la expresión de moléculas sensibles a la luz despolarizantes en los fotorreceptores retinianos puede ser extremadamente útil, por ejemplo, para restablecer la visión. Aunque es contrario a la intuición expresar moléculas sensibles a la luz despolarizantes en los fotorreceptores retinianos, que normalmente requieren hiperpolarización para activarse, los presentes inventores descubrieron que esta expresión es sorprendentemente útil y no solo funciona sorprendentemente bien, sino que también podría permitir afinar la respuesta retiniana global durante los métodos de restablecimiento de la visión utilizando, por ejemplo, la expresión de moléculas sensibles a la luz exógenas en células retinianas individuales. Además, los inventores también descubrieron que en las patologías, la polarización de los fotorreceptores retiñíanos no siempre refleja el estado normal y, en algunos casos, puede incluso invertirse en comparación con los fotorreceptores retinianos sanos.

La presente invención abarca, por lo tanto, una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un canal iónico activado por la luz despolarizante unido funcionalmente a un promotor que conduce a la expresión específica de dicho canal iónico activado por la luz despolarizante en un fotorreceptor retiniano, o la secuencia de nucleótidos complementaria a dicha secuencia de nucleótidos, para su uso en el tratamiento o la mejoría de la ceguera, en donde dicho promotor que conduce a la expresión de dicho canal iónico activado por la luz despolarizante en una célula fotorreceptora retiniana se selecciona del grupo que consiste en Gnat2_500 (s Eq ID NO: 2), Gnat2_2kb (SEQ ID NO: 3) y TF GSH2 (SEQ ID NO: 6). Se definen aspectos adicionales de la invención en las reivindicaciones.

El canal iónico activado por la luz despolarizante puede ser una rodopsina de canal, por ejemplo, la canal rodopsina-2 o una variante de la misma.

La molécula de ácido nucleico aislada de la invención puede tener un promotor que conduzca a la expresión de dicho canal iónico activado por la luz despolarizante en un fotorreceptor retiniano seleccionado del grupo de Gnat2_500 (SEQ ID NO: 2), Gnat2_2kb (SEQ ID NO: 3) y TF_GSH2 (SEQ ID NO: 6).

En la presente invención, la célula fotorreceptora retiniana puede ser un bastón y/o un cono.

La presente divulgación también abarca una molécula de ácido nucleico aislada que comprende, o que consiste en, la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 o 6, o que consiste en una secuencia de ácido nucleico de al menos 200 pb que tiene al menos un 90 % de identidad con respecto a dicha secuencia de la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 o 6, respectivamente, en donde dicha molécula de ácido nucleico aislada conduce específicamente a la expresión de un gen en un fotorreceptor retiniano cuando una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho gen está unida operativamente a dicha molécula de ácido nucleico aislada.

La presente invención abarca además un vector recombinante que comprende el ácido nucleico de la invención anterior, para su uso en el tratamiento o la mejoría de la ceguera.

La presente invención también abarca una célula hospedadora que comprende el vector de la invención, para su uso en el tratamiento o la mejoría de la ceguera.

La presente invención abarca además un kit que comprende un ácido nucleico aislado, un vector recombinante o una célula hospedadora de la invención.

La presente invención también abarca un aislado, un vector recombinante o una célula de la invención para su uso en el tratamiento de la ceguera. En dicho uso para el tratamiento de la ceguera, la administración puede realizarse a través de inyección subrretiniana.

Descripción de la Figura

Figura 1:

CatCh induce respuestas ON. Registros de campo completo de la matriz de electrodos múltiples de luz blanca de RGC. Intensidad de la luz expresada en fotones eficaces por cm2 por segundo. n = 263 neuronas.

Descripción detallada de la invención

Los presentes inventores se dieron cuenta de que la expresión de moléculas sensibles a la luz despolarizantes en los fotorreceptores retinianos puede ser extremadamente útil, por ejemplo, para restablecer la visión. Aunque es contrario a la intuición expresar moléculas sensibles a la luz despolarizantes en los fotorreceptores retinianos, que normalmente requieren hiperpolarización para activarse, los presentes inventores descubrieron que esta expresión es sorprendentemente útil y no solo funciona sorprendentemente bien, sino que también podría permitir afinar la respuesta retiniana global durante los métodos de restablecimiento de la visión utilizando, por ejemplo, la expresión de moléculas sensibles a la luz exógenas en células retinianas individuales. Además, los inventores también descubrieron que en las patologías, la polarización de los fotorreceptores retinianos no siempre refleja el estado normal y, en algunos casos, puede incluso invertirse en comparación con los fotorreceptores retinianos sanos.

La presente invención abarca, por lo tanto, una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un canal iónico activado por la luz despolarizante unido funcionalmente a un promotor que conduce a la expresión específica de dicho canal iónico activado por la luz despolarizante en un fotorreceptor retiniano, o la secuencia de nucleótidos complementaria a dicha secuencia de nucleótidos, para su uso en el tratamiento o la mejoría de la ceguera, en donde dicho promotor que conduce a la expresión de dicho canal iónico activado por la luz despolarizante en una célula fotorreceptora retiniana se selecciona del grupo que consiste en Gnat2_500 (SEQ ID NO: 2), Gnat2_2kb (SEQ ID NO: 3) y TF GSH2 (SEQ ID NO: 6). El canal iónico activado por la luz despolarizante puede ser una rodopsina de canal, por ejemplo, la canal rodopsina-2 o una variante de la misma.

La molécula de ácido nucleico aislada de la divulgación puede tener un promotor que conduzca a la expresión de dicho canal iónico activado por la luz despolarizante en el fotorreceptor retiniano seleccionado del grupo del promotor de la rodopsina humana, el promotor de la opsina roja humana, el promotor de la opsina de cono rojo, el promotor arr3 (mCAR), el promotor Grm6, Fabp7(trunc) (SEQ ID NO: 1), Gnat2_500 (SEQ ID NO: 2), Gnat2_2kb (SEQ ID NO: 3), Arr3_2kb (SEQ ID NO: 4), TF_ZFHX3 (SEQ ID NO: 5) y TF_GSH2 (SEQ ID NO: 6).

La presente invención también abarca una célula hospedadora que comprende el vector de la invención. La presente invención abarca además un kit que comprende un ácido nucleico aislado, un vector recombinante o una célula hospedadora de la invención, para su uso en el tratamiento o la mejoría de la ceguera.

La presente invención también abarca una molécula de ácido nucleico aislada, un vector recombinante o una célula de la invención para su uso en el tratamiento de la ceguera. En dicho uso para el tratamiento de la ceguera, la administración puede realizarse a través de inyección subrretiniana.

La presente invención también abarca composiciones que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención. Dichas composiciones pueden ser composiciones farmacéuticamente aceptables. Los "fotorreceptores retinianos" comprenden los bastones y los conos. La retina puede verse como un procesador de imágenes paralelo que obtiene imágenes a través de un mosaico de fotorreceptores y que extrae diversas características visuales de las imágenes obtenidas. Los fotorreceptores bastones responden directamente a la luz a intensidades más bajas y los fotorreceptores conos a intensidades más altas. La infraestructura celular que subyace al procesamiento paralelo consiste en mosaicos de circuitos neuronales locales. La retina tiene ~20 mosaicos de circuitos de este tipo, construidos a partir de más de 60 tipos celulares, que extraen independientemente diferentes características del mundo visual. Cada mosaico tiene un mosaico asociado de células de salida, las células ganglionares, que transmiten la característica calculada a centros cerebrales superiores. Cada cono de la retina está conectado a aproximadamente 10 tipos de células bipolares de cono, y cada una de estas células bipolares está conectada a varios tipos de células ganglionares. Los conos, las células bipolares y las células ganglionares usan el neurotransmisor excitador glutamato para comunicarse. La comunicación entre los conos y las células bipolares está modificada por las células horizontales inhibidoras, y la comunicación entre las células bipolares y las células ganglionares está modificada por una gran diversidad de células amacrinas inhibidoras. Los conos responden a la luz disminuyendo el voltaje de su membrana, es decir, se hiperpolarizan. La mitad de las células bipolares de cono también se hiperpolarizan (células OFF), mientras que la otra mitad aumenta su voltaje de membrana, despolarizándose cuando aumenta la intensidad de la luz (células ON). La polaridad de las respuestas de las células ganglionares está determinada por la polaridad de las células bipolares de las que reciben entrada. Cada bastón está conectado a un tipo celular bipolar especial llamado célula bipolar de bastón. Las células bipolares de bastón "hablan" con las llamadas células amacrinas All, que a su vez proporcionan una entrada excitadora a los extremos axónicos de las células bipolares de los conos ON y una entrada inhibidora a los extremos de las células bipolares de los conos OFF. Los bastones (fotorreceptores) se hiperpolarizan por la luz, mientras que las células bipolares de los bastones y las células amacrinas All se despolarizan: Éstas son, por lo tanto, células ON. Las células retinianas se disponen en mosaicos, cubriendo toda la retina. La única excepción a la disposición en mosaico es una zona especial de la retina en algunos primates y en unas pocas aves y reptiles depredadores. Esta zona se llama fóvea y es el lugar con mayor densidad de conos. La fóvea humana, también llamada mácula, no tiene bastones en su centro, y el único compartimento celular que se organiza en forma de mosaico es el segmento externo del cono. Los cuerpos celulares de los conos foveales se apilan unos sobre otros, mientras que los cuerpos celulares de todos los demás tipos celulares se desplazan hacia un lado, formando un anillo concéntrico de cuerpos celulares.

Por "ceguera" se entiende la pérdida total o parcial de la visión. Normalmente, el medicamento puede usarse para tratar la ceguera asociada a la degeneración macular, el glaucoma y/o la retinitis pigmentosa. Sin embargo, debe apreciarse que cualquier enfermedad o afección que conduzca a la degeneración o al no funcionamiento de los fotorreceptores en el ojo puede tratarse utilizando el medicamento. Además, sin desear estar limitado por la teoría, se cree que la presente invención será particularmente eficaz para curar la ceguera en las primeras etapas de la degeneración retiniana (dr), cuando se pierde la función de los fotorreceptores pero la sinapsis fotorreceptor-a-bipolar puede estar todavía intacta.

Un "fragmento activo de un canal iónico activado por la luz despolarizante" es un fragmento que cuando se expresa genera un polipéptido que sigue siendo capaz de actuar como una molécula captadora de luz que provoca un flujo posterior de iones fuera de la célula en la que se encuentra el canal y un consiguiente cambio de voltaje.

Por "hiperpolarización" se entiende la disminución del potencial de membrana de una célula (se hace más negativo). Por "despolarización" se entiende el aumento del potencial de membrana de una célula (se hace más positivo).

Se apreciará que la presente invención también se extiende a una construcción de ADN de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento terapéutico de la ceguera mediante la administración a un paciente que padece ceguera de la construcción de ADN de acuerdo con la invención que comprende una secuencia génica de canal iónico activado por la luz despolarizante o un fragmento activo de la misma, secuencia génica o fragmento de la misma que es capaz de expresar una o más copias de la proteína del canal iónico activado por la luz despolarizante en una célula retiniana, por lo que la expresión de dicha una o más copias de la proteína del canal iónico activado por la luz despolarizante hace que la célula sea fotosensible para permitir el tratamiento o la mejoría de la ceguera.

Normalmente, la secuencia génica del canal iónico activado por la luz despolarizante de la invención o un fragmento de la misma puede administrarse a un sujeto en forma de una molécula recombinante que comprende dicha secuencia génica del canal iónico activado por la luz o un fragmento activo bajo los controles transcripcionales/traduccionales apropiados para permitir la expresión de dicha proteína del canal iónico activado por la luz despolarizante cuando se administra a las células retinianas de un sujeto. Se apreciará que la secuencia o fragmento del canal iónico activado por la luz despolarizante puede estar bajo el control de un promotor adecuado, tal como un promotor constitutivo y/o controlable.

La presente invención también proporciona una molécula recombinante de la invención que comprende una secuencia génica del canal iónico activado por la luz despolarizante o un fragmento activo de la misma para su uso en terapia. La molécula recombinante puede estar en forma de plásmido, fagémido o vector vírico. Además, la proteína del canal iónico activado por la luz despolarizante, expresada de forma recombinante o sintetizada químicamente, o fragmentos funcionalmente importantes de la misma, pueden producirse y aplicarse al ojo a través de una pomada adecuada u otro vehículo farmacéutico, como tratamiento o medida profiláctica para tratar dichas enfermedades mencionadas anteriormente.

Se conocen muchos vectores víricos y no víricos y métodos de su suministro, para su uso en terapia génica, tales como los vectores adenovíricos, los vectores de virus adenoasociados, los vectores retrovíricos, los vectores lentivíricos, los vectores de virus del herpes, los liposomas, la administración de ADN desnudo y similares. Se enseña una revisión detallada de posibles técnicas para transformar genes en las células deseadas del ojo en Wright (Br J Ophthalmol, 1997; 81: 620-622). Además, también puede ser posible usar la tecnología de células encapsuladas, tal como la desarrollada por Neurotech, por ejemplo.

El gen del canal iónico activado por la luz puede ser un gen de rodopsina, tal como una rodopsina de un microorganismo, tal como un alga unicelular, normalmente de la especie Chlamydononas, especialmente Chlamydomonas reinhardtii. Una rodopsina preferida es la Canalrrodopsina-2 (ChR2), que es un canal catiónico activado por la luz de C. reinhardtii; véase, por ejemplo, Boyden et al 2005 (Nature Neuroscience, 8, 9; 1263-1268) y el documento W o -A-2003/084994. Las variantes de Canalrrodopsina-2 también son muy adecuadas para la presente invención. Un ejemplo de dichas variantes es CatCh, un mutante L132C de ChR2 (Nat Neurosci. Abril de 2011;14(4):513-8. doi: 10.1038/nn.2776. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Kleinlogel S1, Feldbauer K, Dempski RE, Fotis H, Wood PG, Bamann C, Bamberg E.).

Los fotorreceptores retinianos a los que se ha de administrar el medicamento o el vector pueden haber perdido su fotosensibilidad, pero por lo general no están "muertos" y pueden usarse para expresar el gen del canal iónico activado por la luz despolarizante. Además, la expresión del gen del canal iónico activado por la luz despolarizante en los fotorreceptores puede prevenir o ralentizar la degeneración.

Se entiende que la expresión del gen del canal iónico activado por la luz de la invención está controlada por medio de un promotor específico de la célula. Por lo tanto, puede usarse un promotor específico de la célula para garantizar que el gen del canal iónico activado por la luz solo se exprese en un tipo celular específico.

Una vez expresada en una célula retiniana apropiada, la proteína del canal iónico activado por la luz despolarizante se inserta en la membrana plasmática de la célula, haciéndola fotosensible y capaz de provocar el transporte iónico, de cationes o aniones, en respuesta a la luz. Sin embargo, aunque se sabe que la retina es sensible a intervalos muy amplios de intensidades de luz debido a la naturaleza adaptativa de los fotorreceptores, las bombas o los canales iónicos activados por la luz pueden no ser capaces de adaptarse y, por lo tanto, pueden responder solo a un intervalo estrecho de intensidades de luz. Si este es el caso, una limitación de este tipo puede mitigarse mediante el uso de intensificadores de imágenes y/o convertidores de imágenes conocidos en la técnica. Por ejemplo, un paciente que ha sido tratado mediante el método descrito anteriormente, puede llevar, intensificadores/potenciadores de imágenes montados, por ejemplo, en gafas o similares.

A modo de ejemplo, un dispositivo intensificador de imágenes, tal como los proporcionados por Telesensory (http://www.telesensory.com), puede combinarse con un dispositivo de barrido de la retina (RSD, por sus siglas en inglés), como el desarrollado por Microvision (http://www.microvision.com/milprod.html), para proporcionar un aparato que se lleva en la cabeza, capaz de proporcionar una imagen brillante e intensificada directamente a la retina de un paciente con la visión alterada (http://www.telesensory.com/home8.html). En pocas palabras, un RSD proyecta imágenes en la retina de manera que una persona puede ver una imagen grande y de movimiento completo sin necesidad de pantallas o monitores adicionales. Por lo tanto, al proyectar una imagen intensificada directamente en la retina de un individuo con la visión alterada, puede ser posible mejorar la visión de quienes se consideran ciegos.

En caso de expresar el canal iónico activado por la luz despolarizante en las células bipolares o ganglionares retiniana, pueden perderse algunos aspectos de la capacidad de procesamiento de red de la retina. Por ejemplo, la inhibición lateral mediada por células horizontales puede perderse si la luz activa las células bipolares o ganglionares. En estos casos, un procesador similar a la retina (D. Balya y B. Roska: "Retina model with real time implementation", International Symposium on Circuits and Systems ISCAS 2005, Kobe, Japón, mayo, págs. 5222-5225., véase también http://www.anafocus.com/ y http://www.eutecus.com/) puede combinarse con el sistema Microvision.

Estos y otros aspectos de la presente invención deberían ser evidentes para los expertos en la técnica, a partir de las enseñanzas de la presente.

Por comodidad, a continuación se indica el significado de determinados términos y expresiones empleados en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas.

Las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen la referencia al plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

La "halorrodopsina" es una bomba iónica activada por la luz, específica para los iones cloruro, y se encuentra en las "bacterias" antiguas desde un punto de vista filogenético (arqueas), conocidas como halobacterias. Es una proteína con siete dominios transmembrana de la familia de proteínas de retinilideno, homóloga a la bomba de protones activada por la luz, bacteriorrodopsina, y similar en su estructura terciaria (pero no en la estructura de la secuencia primaria) a las rodopsinas de vertebrados, los pigmentos que detectan la luz en la retina. La halorrodopsina también comparte similitud de secuencia con la canalrrodopsina, un canal iónico activado por la luz. La halorrodopsina contiene el derivado todo-trans retiniano de la vitamina A isomerizable por la luz esencial. La halorrodopsina es una de las pocas proteínas de membrana cuya estructura cristalina se conoce. Las isoformas de la halorrodopsina se encuentran en múltiples especies de halobacterias, incluyendo H. salinarum y N. pharaonis (NphR). Una gran cantidad de investigaciones en curso explora estas diferencias y las utiliza para discernir las propiedades de fotociclo y de bomba. Después de la bacteriorrodopsina, la halorrodopsina puede ser la mejor opsina de tipo I (microbiana) estudiada. La absorbancia máxima del complejo retiniano de halorrodopsina es de aproximadamente 570 nm. Recientemente, la halorrodopsina se ha convertido en una herramienta en optogenética. Al igual que el canal iónico activado por la luz azul canalrrodopsina-2 permite activar células excitables (tales como neuronas, células musculares, células pancreáticas y células inmunitarias) con pulsos breves de luz azul, la halorrodopsina permite silenciar las células excitables con pulsos breves de luz amarilla. Por lo tanto, la halorrodopsina y la canalrrodopsina posibilitan juntas la activación, el silenciamiento y la desincronización ópticos con múltiples colores de la actividad neuronal, lo que crea un poderoso grupo de herramientas de neuroingeniería. Se han desarrollado otras variantes de la halorrodopsina, por ejemplo, la NphR mejorada (eNphR). Para el fin de la presente invención, dichas variantes también se incluyen en la definición de "Halorrodopsina".

"Polinucleótido" y "ácido nucleico", utilizados indistintamente en la presente, se refieren a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Por lo tanto, estos términos incluyen, pero sin limitación, ADN o ARN monocatenario, bicatenario o multicatenario, ADN genómico, ADNc, híbridos de ADN-ARN o un polímero que comprenda bases púricas y pirimidínicas u otras bases nucleotídicas naturales, modificadas química o bioquímicamente, no naturales o derivatizadas. Estos términos incluyen además, pero sin limitación, ARNm o ADNc que comprenden secuencias intrónicas. La cadena principal del polinucleótido puede comprender azúcares y grupos fosfato (como pueden encontrarse normalmente en el ARN o el ADN), o grupos de azúcar o fosfato modificados o sustituidos. Como alternativa, la cadena principal del polinucleótido puede comprender un polímero de subunidades sintéticas tales como fosforamiditas y, por lo tanto, puede ser un fosforamidato de oligodesoxinucleósido o un oligómero mixto fosforamidato-fosfodiéster. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos de unión tales como la fluorribosa y el tioato, y ramas de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos se puede interrumpir con componentes que no sean nucleótidos. Un polinucleótido se puede modificar adicionalmente después de su polimerización tal como mediante conjugación con un componente marcador. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definición son las protecciones, la sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural por un análogo y la introducción de medios para unir el polinucleótido a proteínas, iones metálicos, componentes de marcaje, otros polinucleótidos o un soporte sólido. El término "polinucleótido" también abarca ácidos nucleicos peptídicos, PNA y LNA. Los polinucleótidos pueden comprender además ADN genómico, ADNc o híbridos de ADN-ARN.

"Identidad de secuencia" se refiere a un grado de similitud o complementariedad. Puede haber identidad parcial o completa. Una secuencia parcialmente complementaria es una que inhibe, al menos parcialmente, la hibridación de una secuencia idéntica con un polinucleótido diana; se hace referencia a ella utilizando la expresión funcional "sustancialmente idéntica". La inhibición de la hibridación de la secuencia totalmente complementaria a la secuencia diana puede examinarse utilizando un ensayo de hibridación (transsferencia Southern o Northern, hibridación en solución y similares) en condiciones de baja rigurosidad. Una secuencia o sonda sustancialmente idéntica competirá e inhibirá la unión (es decir, la hibridación) de una secuencia o sonda totalmente idéntica a la secuencia diana en condiciones de baja rigurosidad. Esto no quiere decir que las condiciones de baja rigurosidad sean de manera que se permita la unión no específica; las condiciones de baja rigurosidad requieren que la unión de dos secuencias entre sí sea una interacción específica (es decir, selectiva). La ausencia de unión inespecífica puede someterse a ensayo mediante el uso de una segunda secuencia diana que carezca incluso de un grado parcial de complementariedad (por ejemplo, menos de aproximadamente el 30 % de identidad); en ausencia de unión inespecífica, la sonda no se hibridará con la segunda secuencia diana no complementaria.

Otra forma de ver la identidad de secuencias en el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos incluye la referencia a restos de las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para obtener la máxima correspondencia en una región específica. Como se usa en la presente, el porcentaje de identidad de secuencia significa el valor determinado mediante la comparación de dos secuencias alineadas de forma óptima en una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede incluir adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no incluye adiciones ni deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico idéntica en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

"Gen" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que comprende secuencias de control y codificantes necesarias para la producción de un polipéptido o precursor. El polipéptido puede estar codificado por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia codificante. Un gen puede constituir una secuencia codificante ininterrumpida o puede incluir uno o más intrones, unidos por las uniones de corte y empalme apropiadas. Además, un gen puede contener una o más modificaciones en las regiones codificantes o no traducidas que podrían afectar a la actividad biológica o a la estructura química del producto de expresión, a la tasa de expresión o a la forma de control de la expresión. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, mutaciones, inserciones, deleciones y sustituciones de uno o más nucleótidos. A este respecto, estos genes modificados pueden denominarse "variantes" del gen "nativo".

"Expresión" se refiere generalmente al proceso por el cual una secuencia de polinucleótidos se somete a una transcripción y una traducción exitosas, de manera que se expresan niveles detectables de la secuencia de aminoácidos o de la proteína. En determinados contextos, la expresión se refiere a la producción de ARNm. En otros contextos, la expresión se refiere a la producción de proteína.

"Tipo celular" se refiere a una célula procedente de una fuente dada (por ejemplo, un tejido u órgano) o a una célula en un estado de diferenciación dado, o a una célula asociada a una patología o una composición genética dada.

"Polipéptido" y "proteína", utilizados indistintamente en la presente, se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos traducidos, sin traducir, modificados químicamente, modificados bioquímicamente y derivatizados. Un polipéptido o una proteína pueden ser de origen natural, recombinante o sintético, o cualquier combinación de éstos. Además, un polipéptido o una proteína pueden comprender un fragmento de una proteína o un péptido de origen natural. Un polipéptido o una proteína pueden ser una molécula única o un complejo multimolecular. Además, dichos polipéptidos o proteínas pueden tener cadenas principales peptídicas modificadas. Los términos incluyen proteínas de fusión, incluyendo proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga, fusiones con secuencias líderes heterólogas y homólogas, con o sin restos de metionina N-terminales, proteínas marcadas inmunológicamente y similares.

Un "fragmento de una proteína" se refiere a una proteína que es una porción de otra proteína. Por ejemplo, los fragmentos de proteínas pueden comprender polipéptidos obtenidos mediante la digestión de proteínas de longitud completa aisladas de células cultivadas. En una realización, un fragmento de proteína comprende al menos aproximadamente 6 aminoácidos. En otra realización, el fragmento comprende al menos aproximadamente 10 aminoácidos. En otra realización, el fragmento de proteína comprende al menos aproximadamente 16 aminoácidos.

Un "producto de expresión" o "producto génico" es una biomolécula, tal como una proteína o ARNm, que se produce cuando un gen de un organismo se transcribe o traduce o se modifica postraduccionalmente.

"Célula hospedadora" se refiere a un microorganismo, una célula procariota, una célula eucariota o una estirpe celular cultivada como entidad unicelular que puede ser, o ha sido, utilizada como receptor de un vector recombinante u otra transferencia de polinucleótidos, e incluye la progenie de la célula original que se ha transfectado. La progenie de una sola célula puede no ser necesariamente totalmente idéntica en morfología o en complemento genómico o de ADN total que el progenitor parental debido a una mutación natural, accidental o deliberada.

La expresión "equivalente funcional" pretende incluir los "fragmentos", "mutantes", "derivados", "alelos", "híbridos", "variantes", "análogos" o "derivados químicos" del gen o virus nativo.

"Aislado" se refiere a un polinucleótido, un polipéptido, una inmunoglobulina, un virus o una célula hospedadora que se encuentra en un entorno diferente de aquel en el que el polinucleótido, el polipéptido, la inmunoglobulina, el virus o la célula hospedadora se encuentran de forma natural.

"Sustancialmente purificado" se refiere a un compuesto que se ha extraído de su entorno natural y que está al menos aproximadamente un 60 % libre, al menos aproximadamente un 65 % libre, al menos aproximadamente un 70 % libre, al menos aproximadamente un 75 % libre, al menos aproximadamente un 80 % libre, al menos aproximadamente un 83 % libre, al menos aproximadamente un 85 % libre, al menos aproximadamente un 88 % libre, al menos aproximadamente un 90 % libre, al menos aproximadamente un 91 % libre, al menos aproximadamente un 92 % libre, al menos aproximadamente un 93 % libre, al menos aproximadamente un 94 % libre, al menos aproximadamente un 95 % libre, al menos aproximadamente un 96 % libre, al menos aproximadamente un 97 % libre, al menos aproximadamente un 98 % libre, al menos aproximadamente un 99 % libre, al menos aproximadamente un 99,9% libre o al menos aproximadamente un 99,99 % o más libre de otros componentes con los que está asociado naturalmente.

"Diagnóstico" y "diagnosticar" incluyen generalmente la determinación de la susceptibilidad de un sujeto a una enfermedad o trastorno, la determinación de si un sujeto está actualmente afectado por una enfermedad o trastorno, el pronóstico de un sujeto afectado por una enfermedad o trastorno (por ejemplo, la identificación de estados cancerosos premetastásicos o metastásicos, estadios del cáncer o la capacidad de respuesta del cáncer a la terapia) y la terametría (por ejemplo, el control del estado de un sujeto para proporcionar información sobre el efecto o la eficacia de la terapia).

"Muestra biológica" abarca una diversidad de tipos de muestras obtenidas de un organismo que pueden usarse en un ensayo de diagnóstico o de control. La expresión abarca la sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, las muestras de tejidos sólidos, tales como una muestra de biopsia, o los cultivos de tejidos o las células derivadas de los mismos y la progenie de los mismos. La expresión abarca específicamente una muestra clínica y además incluye células en cultivo celular, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, orina, líquido amniótico, fluidos biológicos y muestras de tejido. La expresión también abarca muestras que se han manipulado de alguna manera después de su obtención, tal como el tratamiento con reactivos, la solubilización o el enriquecimiento para determinados componentes.

"Individuo", "sujeto", "hospedador" y "paciente", utilizados indistintamente en la presente, se refieren a cualquier sujeto mamífero para el que se desea un diagnóstico, tratamiento o terapia. En una realización preferida, el individuo, sujeto, hospedador o paciente es un ser humano. Otros sujetos pueden ser, pero sin limitación, vacas, caballos, perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, primates y ratones.

"Hibridación" se refiere a cualquier proceso por el que una secuencia de polinucleótidos se une a una secuencia complementaria a través de emparejamiento de bases. Las condiciones de hibridación pueden definirse, por ejemplo, por las concentraciones de sal o formamida en las soluciones de prehibridación e hibridación, o por la temperatura de hibridación, y son bien conocidas en la técnica. La hibridación puede producirse en condiciones de diversa rigurosidad.

"Condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones en las que una sonda puede hibridarse con su secuencia polinucleotídica diana, pero no con otras secuencias. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia (por ejemplo, las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas). Por lo general, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C más bajas que el punto de fusión térmica (Tf) para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. La Tf es la temperatura (con una fuerza iónica, un pH y una concentración de polinucleótidos definidos) a la que el 50 % de las sondas complementarias a la secuencia diana se hibridan con la secuencia diana en equilibrio. Normalmente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal es una concentración de iones de sodio (u otras sales) de al menos aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 M a aproximadamente pH 7,0 a aproximadamente pH 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos).

Las condiciones rigurosas también pueden conseguirse con la adición de agentes desestabilizantes, tales como la formamida.

"Biomolécula" incluye polinucleótidos y polipéptidos.

"Actividad biológica" se refiere al comportamiento y los efectos biológicos de una proteína o péptido. La actividad biológica de una proteína puede verse afectada a nivel celular y a nivel molecular. Por ejemplo, la actividad biológica de una proteína puede verse afectada por cambios a nivel molecular. Por ejemplo, un oligonucleótido antisentido puede impedir la traducción de un ARNm particular, inhibiendo de este modo la actividad biológica de la proteína codificada por el ARNm. Además, una inmunoglobulina puede unirse a una proteína particular e inhibir la actividad biológica de esa proteína.

"Oligonudeótido" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que comprende, por ejemplo, de aproximadamente 10 nucleótidos (nt) a aproximadamente 1000 nt. Los oligonucleótidos para su uso en la invención tienen, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 150 nt, por ejemplo, de aproximadamente 150 nt a aproximadamente 1000 nt. El oligonucleótido puede ser un oligonucleótido natural o un oligonucleótido sintético.

"Oligonucleótido modificado" y "Polinucleótido modificado" se refieren a oligonucleótidos o polinucleótidos con una o más modificaciones químicas a nivel molecular de las estructuras moleculares naturales de todas o alguna de las bases, restos de azúcares, uniones fosfato internucleosídicas, así como a moléculas que tienen sustituciones añadidas o una combinación de modificaciones en estos sitios. Las uniones fosfato internucleosídicas pueden ser uniones internucleotídicas de fosfodiéster, fosfotriéster, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetiléster, acetamidato, carbamato, tioéter, fosforamidato en puente, fosfonato de metileno en puente, fosforotioato, metilfosfonato, fosforoditioato, fosforotioato en puente o sulfona, o uniones 3'-3', 5'-3' o 5'-5', y combinaciones de dichas uniones similares. La unión fosfodiéster puede reemplazarse por una unión sustituta, tal como el fosforotioato, el metilamino, el metilfosfonato, el fosforamidato y la guanidina, y la subunidad de ribosa de los polinucleótidos también puede sustituirse (por ejemplo, fosfodiéster de hexosa; ácidos nucleicos peptídicos). Las modificaciones pueden ser internas (únicas o repetidas) o en el extremo o extremos de la molécula de oligonucleótido, y pueden incluir adiciones a la molécula de las uniones fosfato internucleosídicas, tales como modificaciones de desoxirribosa y fosfato que se escinden o reticulan a las cadenas opuestas o a las enzimas u otras proteínas asociadas. Las expresiones "oligonucleótidos modificados" y "polinucleótidos modificados" también incluyen oligonucleótidos o polinucleótidos que comprenden modificaciones en los restos de azúcar (por ejemplo, monómeros de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos sustituidos en 3'), cualquiera de los cuales está unido a través de uniones 5' a 3'.

"Secuencia biomolecular" o "secuencia" se refiere a la totalidad o a una porción de una secuencia polinucleotídica o polipeptídica.

El término "detectable" se refiere a un patrón de expresión de polinucleótidos que es detectable a través de técnicas convencionales de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), transcriptasa inversa (RT) PCR, visualización diferencial y análisis Northern, que son bien conocidas por los expertos en la técnica. Del mismo modo, los patrones de expresión de los polipéptidos pueden "detectarse" a través de técnicas convencionales, incluyendo inmunoensayos tales como transferencias Western.

Un "gen diana" se refiere a un polinucleótido, con frecuencia derivado de una muestra biológica, para el que se diseña una sonda oligonucleotídica para que se hibride específicamente. Es la presencia o la ausencia del polinucleótido diana lo que ha de detectarse, o es la cantidad del polinucleótido diana lo que ha de cuantificarse. El polinucleótido diana tiene una secuencia complementaria a la secuencia polinucleotídica de la sonda correspondiente dirigida a la diana. El polinucleótido diana también puede referirse a la subsecuencia específica de un polinucleótido más grande al que se dirige la sonda o a la secuencia global (por ejemplo, gen o ARNm) cuyo nivel de expresión se desea detectar.

Una "proteína diana" se refiere a un polipéptido, con frecuencia derivado de una muestra biológica, con el que se hibrida o se une específicamente un agente de captura de proteínas. Es la presencia o la ausencia de la proteína diana lo que ha de detectarse, o es la cantidad de la proteína diana lo que ha de cuantificarse. La proteína diana tiene una estructura que es reconocida por el correspondiente agente de captura de proteína dirigido a la diana. La proteína o aminoácido diana también puede referirse a la subestructura específica de una proteína mayor a la que se dirige el agente de captura de proteína o a la estructura global (por ejemplo, un gen o ARNm) cuyo nivel de expresión se desea detectar.

"Complementario" se refiere a la compatibilidad topológica o la coincidencia de las superficies de interacción de una molécula de sonda y su diana. La diana y su sonda pueden describirse como complementarias y, además, las características de la superficie de contacto son complementarias entre sí. La hibridación o el emparejamiento de bases entre nucleótidos o ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, entre las dos cadenas de una molécula de ADN bicatenario o entre una sonda oligonucleotídica y una diana son complementarios.

El término "marcador" se refiere a agentes que son capaces de proporcionar una señal detectable, ya sea directamente o mediante interacción con uno o más miembros adicionales de un sistema productor de señales. Los marcadores que se pueden detectar directamente y pueden resultar útiles en la invención incluyen los marcadores fluorescentes. Los fluoróforos específicos incluyen colorantes de fluoresceína, rodamina, BODIPY, cianina y similares.

La expresión "proteína de fusión" se refiere a una proteína compuesta por dos o más polipéptidos que, aunque normalmente no están unidos en su estado nativo, están unidos por sus respectivos extremos amino y carboxilo a través de una unión peptídica para formar un único polipéptido continuo. Se entiende que los dos o más componentes polipeptídicos pueden unirse directamente o indirectamente a través de un enlazador/espaciador peptídico.

La expresión "condiciones fisiológicas normales" se refiere a las condiciones que son típicas dentro de un organismo vivo o una célula. Aunque algunos órganos u organismos proporcionan condiciones extremas, el entorno intraorganismo e intracelular varía normalmente en torno al pH 7 (es decir, de pH 6,5 a pH 7,5), contiene agua como disolvente predominante y existe a una temperatura superior a 0 °C e inferior a 50 °C. La concentración de las diversas sales depende del órgano, organismo, célula o compartimento celular que se utilice como referencia.

"BLAST" se refiere a la Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básico, una técnica para detectar subsecuencias no alineadas que coincidan con una secuencia de consulta dada.

"BLASTP" es un programa de BLAST que compara una secuencia de consulta de aminoácidos con una base de datos de secuencias de proteínas. "BLASTX" es un programa de BLAST que compara los productos de traducción conceptual de seis marcos de una secuencia de consulta de nucleótidos (ambas cadenas) con una base de datos de secuencias de proteínas.

Se usa "cds" en una entrada de secuencia de ADN de GenBank para referirse a la secuencia codificante. Una secuencia codificante es una subsecuencia de una secuencia de ADN que se supone que codifica un gen.

Una "secuencia de consenso" o "contig", como se entiende en la presente, es un grupo de secuencias ensambladas que se solapan, en particular entre secuencias de una o más de las bases de datos de la invención.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser producidas por un virus que albergue un ácido nucleico que codifica la secuencia génica pertinente. El virus puede comprender elementos capaces de controlar y/o potenciar la expresión del ácido nucleico. El virus puede ser un virus recombinante. El virus recombinante también puede incluir otros elementos funcionales. Por ejemplo, los virus recombinantes pueden diseñarse de manera que los virus se repliquen de forma autónoma en la célula diana. En este caso, en un virus recombinante pueden ser necesarios elementos que induzcan la replicación del ácido nucleico. El virus recombinante también puede comprender un promotor o regulador o potenciador para controlar la expresión del ácido nucleico según sea necesario. Se usan elementos promotores/potenciadores específicos de tejido para regular la expresión del ácido nucleico en tipos celulares específicos. El promotor puede ser constitutivo o inducible.

Un "promotor" es una región de ADN que generalmente se encuentra corriente arriba (hacia la región 5') del gen que se necesita transcribir. El promotor permite la activación o represión adecuada del gen que controla. En el contexto de la presente invención, los promotores conducen a la expresión específica de los canales iónicos activados por la luz en los fotorreceptores.

"Expresión específica" significa que al menos más del 75 % de las células que expresan el gen de interés son del tipo especificado, es decir, fotorreceptores en el presente caso. Son ejemplos de promotores adecuados para la expresión de construcciones en los fotorreceptores retinianos el promotor de la rodopsina humana (Allocca et al., Novel AAV serotypes efficiently transduce murine photoreceptors, J Virol. (2007)), el promotor de la opsina roja humana (Nathan et al., Science.

11 de abril de 1986; 232(4747): 193-202), el promotor GRM6, el promotor de la opsina del cono rojo o el promotor arr3 (mCAR) (Zhu, X. et al. Mouse cone arrestin gene characterization: promoter targets expression to cone photoreceptors. FEBS Letters 524, 116-122 (2002)). Además, se ha comprobado que los siguientes promotores son adecuados para la expresión específica y casi exclusiva (más del 75 %) de los genes en los fotorreceptores retinianos y que también son muy adecuados para la presente invención:

Fabp7(trunc) (SEQ ID NO: 1: (ejemplo de referencia)

AGCTAGCACAGCACTAGGCTAAAGCGTACTGAGCCCTTGTCTTCCGTGGGAGCTGCAG AGTGGGATGCATGCGTTGTGAGCTGAGGCTCAAGCTGCGCTGGCAGAAGAGCAGGGG TTGCCTTGTCAGACTCCAGGGTCTCTTTCTCTCTGAGCCTGGGAAAGTGCCACTTTATT GGATCTATAAAGCCGGGGGGGGGGGGGGGGGAGGAATCTCAAGGTGAAGAGGAAGTT CACAGACCCCTCTAACGCCTCTATTAGAACCTTCCAGCTATTCTCTCATACTTGTACACT GAGCTGGCACACAGTATAGGCAAGTTCTATTCGCATCACCCCTCTAGTTCCTGTCTCCC TGGTT ATGCAAGCCT CAT ATTT AGGT AGAT GT GACCTT AGGAAACCAAAAT ATCCTTT AA G AT CTT ACT AACTGGTTGCCT GTT CAGCTTTT CCACATT GATCCT GT AGCCCCCT CGAGG AGGT G AAGG AAAAAAAT CTCCT CTTT GTTT CT CT AACT C ATT AAT G AATTTT AAGGGCACT CTGT AAGGTTCCTTTCCCATT CTGGT CTGGTTCGT ACATT CT GAG AAACACACT GT GTTT GT GTT GAGAGTT GGCTCCCTAGCTACACTGTCT GTCACATT G AT GCT CT G AGT AGGGAC AGGGTT CAT CT AGG AAAT AT ATTTT CACT C ACACT CTGTAT CTTTTCCT AGTTT GGCAT AT T CT AGTCT GCATTT GGCTCT CT GTTT AAAT AT AAAAGAAAACT AAAACACACCCTT CAG AC GCCTATGTCTGAAAAATCTGGCATTTCCGTGGGTTTTTCTTTAAGGAGGCCTTCATTTGT AACCAAC ACCAT GCTCTCCTT AAGG AAAT CAAT CT CAAT GCCCT ATT ATCCTTCCCTTTT C TTTCCTCCCAGTTT GAGGCTGCAGTTGCCTTTTTTTTT CTT ATCCCCTG CT G AACCT GAA AAACCCTCTCTTTTCTACAGTTTTCTGTTCCCAGGCCCCGCTGACTTCCTTTAGAGCATG GGGGGGGGGGGGATCAGGATTGTGATGTGTGAACTGGGAGGATCTTGACCTACTCCG CT AACCCAGT GGCCT GAGCAAATCACAAGGAGGATTGGAGCCATCTGCCCAGCCCCTC CCCCACGGCAGCCT GCT GGAAAGAGACAAGTT AGT CATTCAAAT GATT GGCTTTTTGCC CGCTTCTTCTCTAAATAAGAAGGCAGCAGCTTCTGCTGAGGT),

Gnat2_500 (SEQ ID NO: 2:

CATCCT GAGAGAT GAGCCAGGACAAAGAACCAGT AAT AGCTCCTGGAGCAGCACATCT GTTTT GCCAGG ATT ATCCCTT GG ATCTCTT AAAACCG AG ACCTT GT AAT CT G AAG ACT CA ACTTGGGCT GT ACCCTT AACCTTCAGCTCT AT GATGCAAGT GAGTCCACAGGACCGGAG GCTTTGAGATGAGCTTTTCAGAAGGGAGGAGTTGGCCGCTTGCTCCCAGAGCTCCAGC ACCT GCATT CTT CTG GCT AT GT CAG AAGCCAGAT CATTTCCCT CGTT AAAAACAAAAACA AAAAAACAAACAAACAAAAT GTT AGTCTTTGCCCTTT AT CTGCCT GG CAAAGCTTTT AATT GGCTTGATCTGTCATTCCGCTAGACATAAAGGGGACAATCCCCGGATTAGGAAGGAGCT CTCCAGCTCGGGTAAGGAGTCTCAAGGCAAGGTAGGCAAGCACCACCGGTCCGCACTC TCGCCCAGCTTTTACGGGAAGAAGAGA),

Gnat2_2kb (SEQ ID NO: 3:

AGAGGCAGGCCGAGTTTGAGGCCAGCCTGGTCTACACAGGCGTTCTAGGAGAACCTGT CTCATATGCACATGGGCCTGGGATTACACATACAACTGCAATGGCAGCACTTGGAAAGC GGAAGCAGG AGAATCGG AATTT CACACT CATCCTT CATT AT AGAAGTCCAAACCT GTGC T AAGCT ACTTGGACAT CGCT AAAAAACAGCAAAAATCTTT CT AGGAATT GCCAAT GT AT A CACACCAAGTT GT ATTTTTGTAGGGCAG ACTTTTCC AACTTGCCAG AT G ATAAT AAT CAT TT ATATT AGCT ACATTT CAGGCT CCAG AATT AACACT GTT ACTGAAAT GT AT AGGTT CT AA AACAT ACCATTTCCAAAT ATTTT AA AGGATT AACATTTTT G AAAAGCAT GT GAT CTTCCAA CCAT ATTTT AGGGAA CAGA CAT AAGAAGT AGGCAAGTTT GGGAAGAAACAGTTCCT GAG GGCATTT CTTCCCAACCTT G AAT G CCCTGTGGGTTAACT GAGGT CTT G GT AAAAT GTAG ATT ATTT ACT GG ACTTTTT GAACT GAGAGT GCATTT CT AACAAAACTCC AGGGT ATGTGG TCCTTGCATT ACAT ATGGGGT AGCAACATTCT AAAGCAGT GTTTTTCAACCT GTGGATCA AGACCCACAG AAGTCACAT AGCAGAT ATCCTGCCT ATT AGAT ATTT ACATT AAG ATT CAG AGCAGTAGCAGAATAGGAGTCATCCCAACCTGAGGAACTGCATCAGAGTCCCAGCATC AGGAAGGGTGAGAGCCACTGAGCTAAAGTCCTCTAGGTGAGGGGGCTGCCCCGGAAA G ACT CATTT AAAT GAAACCACT GACACAG AGAGCT GACAGAT G AGGTGGGTTCCGT GTC TGTGAGGCTCTGCTGGTCGTCTCCTCACTCCCATGGAAGAACCACCGAGATGAGGGCG AGGGGCAGAGCTAACCCAGCCTCTAAGTAGGCAGAGTCTAGTGTCCAGCTGCCCAAGG AAGAAGTTT GCT GT GT GAGGTGGCCCT GAT GTCCGCACACACAAAAT GCCAGT GAAGTC T ACTT GACCAAGT GAAGCTGGT GT GG AATGGG AAG AAGCACAC ACAGT CAGTCT CT CT G CACACACT CT GTCCTT CACTT CTT CACTT ACCAG AG ATTT GAT GAGAACCT ACT AGCAG A TCAGATTT GATCCCT GAGTGGAAAAAACGT ACAGTGGGAGAT AAAAGAGGAAAACAACG GATCT GAGTTT GAGGTT AGCCT AGTCT GAGCAAGCCGGAT ACACAGT AAGACCCT GTCT CACATACATCCACTCGCACGCGCGCGCACACAAACACACACACACACACACACACACA CACACACACACACACACATCGT GCT AAGGACAAGAT AGGCATCCT GAGAGAT GAGCCA GGACAAAGAACCAGT AAT AGCTCCTGGAGCAGCACATCT GTTTT GCCAGGATT ATCCCT TGGAT CT CTT AAAACCGAGACCTT GT AAT CT GAAGACTCAACTT GGGCT GT ACCCTT AAC CTT CAGCTCTAT G ATGCAAGT GAGTCCACAGGACCGG AGGCTTT G AG AT GAGCTTTT CA GAAGGGAGGAGTTGGCCGCTTGCTCCCAGAGCTCCAGCACCTGCATTCTTCTGGCTAT GTCAG AAGCCAG AT CATTTCCCTCGTT AAAAACAAAAACAAAAAAACAAACAAAC AAAAT GTTAGTCTTTGCCCTTTATCTGCCTGGCAAAGCTTTTAATTGGCTTGATCTGTCATTCCG CT AGACAT AAAGGGGACAATCCCCGGATT AGGAAGGAGCT CTCCAGCT CGGGT AAGGA GTCTCAAGGCAAGGTAGGCAAGCACCACCGGTCCGCACTCTCGCCCAGCTTTTACGGG AAG AA GAG AAT GTT ACT CT ATCCT AACAT ATTTTTCCTTTTCCT CT AT CT CACA GAT AGG A AAAATTTAAGAGCCAGAGGGAACGTCCCTTCTCAGAGGAGACAGCAGAA),

Arr3_2kb (SEQ ID NO: 4: (ejemplo de referencia)

CT CTCCT CCCATT G AT G ACT GACT AGGCCAT CCTCTGCT AC AT AG GT GGCTGGAGCCT G AGTCCCT CCTT GT GT ACTCTTTGGTTGGT GGTTT ACTCTGGGGGT ACTGGTT AGTTCGT A TTGTTGTTCCTCCTAGGGGACTGCAAACCCCTTCAGCTCCTTGGGTCCTTTCTCTAGTTC CTTCTTTGGGGACCCTGTGCTCAGTTCAATGGATGGCCAATTTCCTTCTTAAATGCCCCT AGCAGT AACT GTT AGGTCT CAAT CCCAAG ACAAAT GTCT G AGGT GCCT ATTT AACAG AT C AAAGCGGACCTGGCCTCAGGTTATCCCAGTCCCTCCCTGTACCTCAGTCCCTACCCATC ACCAACTCTCCAGCCCAGAGCTTGGGCTGCACTTCCCCCACGGTTCTTCCCATTTTGGC TACATGGTCTTTTTTTTTACCTTTTTGGTTCCTTTGGCCTTTTGGCTTTTGGCTTCCAGGG CTTCTGGATCCCCCCCAACCCCTCCCATACACATACACATGTGCACTCGTGCACTCAAC CCAGCACAGGAT AAT GTT CATT CTT G ACCTTTCCACAT ACAT CTGGCT AT GTT CT CT CT C TTATCT ACAAT AAAT CTCCTCCACT ATACTT AGG AGCAGTT AT GTT CTT CTT CTTT CTTT CT TTTTTTTTTTTTT CATT CAGT AACAT CAT CAG AATCCCCT AGCTCTGGCCTACCTCCTCAG T AACAAT CAGCT GAT CCCTGGCCACT AATCT GT ACT CACT AAT CT GTTTTCCAAACT CTT GGCCCCT GAGCTAATT AT AGCAGTGCTTCATGCCACCCACCCCAACCCT ATT CTT GTTC TCT GACT CCCACT AATCT ACACATTCAGAGGATT GT GGAT AT AAGAGGCT GGGAGGCCA GCTTAGCAACCAGAGCTGGAGGCTGATGCGAGCTTCATCTCTTCCCTCAGGTAATATTC T AAAT CT CT CTGCTT CT AGCCCAT ACT AAGTCCACCTCCTTTGCCTTT AGCAT CTT CTTT A GGAGGAGAGGGGCATCTTTTCTGATGCAAGCAATGGATTTTTCAGGCTGATGTAAGAGA CTT CT AGAACT CAGCACCCCCCCCCAACT CATCCCT CT GACCAAGCCT ACT AT GTTTT G A AGGAAAGCACCAGAAAGACATTTCCCTCTCTATGCTTCCCTAGCACCTTAAGCGTGGGG ACAGGATGGAAAT GTTT GGGGAAAGT GACAAGAGAGAT GAT GAGT AAGGGCAAAGAGG GCTTTCGGCCTCCACAGAGGCTTCTACTGCCACCCCCCAAGAAAGTATGAGCGCAACC

CTTTCTGTTCTACAGCTTTCCCTCTTCTTTCCCCCACCTCCCCCCTGTTCTTCCTTCTGA GCTGGAGGTCAAAAGCATCCCAATTCAGGGTCAAGTCCAGTACAGGGACAAAAAGAAAT TT CATCCATT CATTT ATTT ATT CAT AT AGTT AACT GACT GTGTGCCTGTT G AAGTT CAGT A TCAATGCAGCCCAAGGAACGTATTT AAGAGAT GGAGT AT GAGCAAGT AGGAT AAAT AGA AGGGGTTAAAAAATAAGATGAGGAGCAATCAAGAAAGACACTGGACATTCCTCTAGCTT TCACACACATGCACCT GTGCAT GCAT GGAT ACAT GCACAGGCATTCGCTCATGCACAT A CACAT G AG AG AGAG AG AG AAT GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG AGAGA GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAAGAGAGAAAGAGAGAAAGAGAGAAAGAGAA TGTAGTGCAATGGTTGGGTAAGTGTGTAACTGAAGAGTTGCCCTAAGAAGAGGAAAAAA AAAAAGGAAGCATT GAGT GTT GGT GT GGT ATCTCAGGCAGTT AATTT AT ATT ACACT AGG TGTAT CATT ATGGAAT ATT AT AGT GCACT AAAAAAAAAAGGATT AAAT AACT GAGT GTTCC T CTTCCCCT CAT CT CAGG AAAG ATT CAACTGGCCAGC),

TF_ZFHX3 (SEQ ID NO: 5: (ejemplo de referencia)

AGAT CT ATT AGT AAAATT AACT ACACCTGGT CCTTT AT GTCATT AACT ACACGT CAGTCGT

TCT ATT ATT AACT ACACAGAACTT ACT AT AT AATT AACT ACACCGCGCATTT GGAT AT ATT

AACT ACACAACTTT GCTT AAT AAATT AACTACACCCGT AACGG ATT CT CATT AACT ACACG

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CCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCC

GAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCC

T AGG CTTTTGCAAA),

y TF_GSH2 (SEQ ID NO: 6:

GT ACTGCGGACAT CCGCT AATT AGCAT AACCCGCAAGGAT GT AGCT AATT AGCAT ATCA

CGGGAGACTGGGGCT AATT AGCAT AAAAAGTCTCCCGCCT GCT AATT AGCAT ACGAGAC

TCTAGAATCGCTAATTAGCATATCAGTCAAACCACTTGCTAATTAGCATAAGCATCGCGC

T ATTTGCT AATT AGCAT AAAT GTT ACAT ACATCGCT AATT AGCAT AT GAT AGCACT GTCAA

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TTCTCCGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGG

CCTCT GAGCT ATTCCAGAAGT AGT GAGGAGGCTTTTTT GGAGGCCT AGG CTTTTGCAAA)

Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con los métodos y composiciones de la invención, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. Normalmente, un agente aislado se prepara mediante al menos una etapa de purificación. En una realización, el agente se purifica hasta al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 88 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, al menos aproximadamente el 99,9 % o al menos aproximadamente el 99,99 % en peso.

"Expresar" una proteína en una célula significa garantizar que la proteína esté presente en la célula, por ejemplo, para los fines de un procedimiento de interés. En numerosas realizaciones, "expresar" una proteína comprenderá introducir un transgén en una célula que comprenda un polinucleótido que codifique la proteína, unido operativamente a un promotor, en donde el promotor es un promotor constitutivo o un promotor inducible en el que se crean las condiciones suficientes para la inducción, así como una secuencia de localización. Sin embargo, una célula que, por ejemplo, exprese naturalmente una proteína de interés, puede usarse sin manipulación y se considera que "expresa" la proteína. Para la presente invención, "expresión específica de un canal iónico activado por la luz despolarizante en un fotorreceptor retiniano" significa que el canal iónico activado por la luz despolarizante se expresa exclusivamente (más del 75 %) en un fotorreceptor retiniano. Es importante señalar que una expresión en muchas células diferentes podría conducir a señales contradictorias, que se anulan entre sí.

Una "sonda fluorescente" se refiere a cualquier compuesto con la capacidad de emitir luz de una determinada longitud de onda cuando se activa con luz de otra longitud de onda.

El término "fluorescencia" se refiere a cualquier característica detectable de una señal fluorescente, que incluye intensidad, espectro, longitud de onda, distribución intracelular, etc.

El término "detectar" fluorescencia se refiere a evaluar la fluorescencia de una célula utilizando métodos cualitativos o cuantitativos. Por ejemplo, la fluorescencia se determina utilizando medios cuantitativos, por ejemplo, midiendo la intensidad de la fluorescencia, el espectro o la distribución intracelular, permitiendo la comparación estadística de los valores obtenidos en diferentes condiciones. El nivel también puede determinarse mediante métodos cualitativos, tales como el análisis visual y la comparación por parte de un ser humano de múltiples muestras, por ejemplo, muestras detectadas utilizando un microscopio fluorescente u otro detector óptico (por ejemplo, sistema de análisis de imágenes, etc.). Una "alteración" o "modulación" en la fluorescencia se refiere a cualquier diferencia detectable en la intensidad, la distribución intracelular, el espectro, la longitud de onda u otro aspecto de la fluorescencia con una condición particular en comparación con otra condición. Por ejemplo, se detecta cuantitativamente una "alteración" o "modulación", y la diferencia es estadísticamente significativa. Cualesquiera "alteraciones" o "modulaciones" en la fluorescencia se pueden detectar utilizando instrumentación convencional tal como microscopio fluorescente, CCD o cualquier otro detector fluorescente, y se pueden detectar utilizando un sistema automático tal como los sistemas integrados, o pueden reflejar una detección subjetiva de una alteración por parte de un observador humano.

Un ensayo realizado en un "formato homogéneo" significa que el ensayo puede realizarse en un solo recipiente, sin que sea necesario manipular o purificar ningún componente para determinar el resultado del ensayo, por ejemplo, puede añadirse un agente de ensayo a un sistema de ensayo y medir directamente sus efectos. Con frecuencia, estos ensayos de "formato homogéneo" comprenderán al menos un componente que se "inactiva" o se modifica de otro modo en presencia o ausencia de un agente de ensayo.

Los métodos para expresar proteínas heterólogas en células son bien conocidos por los expertos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Ausubel (1999), Guthrie y Fink (1991), Sherman, et al. (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratories, Freshney, y otros. Normalmente, en dichas realizaciones, un polinucleótido que codifica una proteína heteróloga de interés estará unida operativamente a una secuencia de control de expresión apropiada para la célula hospedadora particular en la que ha de expresarse la proteína heteróloga. En este método puede usarse cualquiera de un gran número de promotores bien conocidos. La elección del promotor dependerá de los niveles de expresión que se quieran alcanzar y de la especificidad celular deseada. También se describen elementos adicionales, tales como las señales de poliadenilación, las secuencias no traducidas en 5' y 3', etc., en libros de referencia bien conocidos.

En células de metazoos (animales que tienen el cuerpo compuesto por células diferenciadas en tejidos y órganos) se usan habitualmente promotores y otros elementos para expresar proteínas heterólogas y son bien conocidos por los expertos. Véase, por ejemplo, Cruz y Patterson (1973) Tissue Culture, Academic Press; Meth. Enzymology 68 (1979), Academic Press; Freshney, 3a edición (1994) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, Wiley-Liss. Los promotores y las secuencias de control para dichas células incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos y tardíos habitualmente utilizados del virus 40 de simio (SV40) u otros promotores víricos tales como los del polioma, el adenovirus 2, el virus del papiloma bovino o los virus del sarcoma aviar, la familia de los virus del herpes (por ejemplo, citomegalovirus, virus del herpes simple o virus de Epstein-Barr) o los promotores de inmunoglobulinas y los promotores de choque térmico (véase, por ejemplo, Sambrook, Ausubel, Meth. Enzymology Pouwells, et al., citado anteriormente (1987)). Además, pueden usarse promotores regulados, tales como metalotioneína, (es decir, MT-1 y MT- 2), glucocorticoide o "interruptores" génicos antibióticos. También pueden usarse regiones potenciadoras de dichos promotores.

Los casetes de expresión se introducen habitualmente en un vector que facilita la entrada del casete de expresión en una célula hospedadora y el mantenimiento del casete de expresión en la célula hospedadora. Dichos vectores se utilizan normalmente y son muy conocidos por los expertos en la técnica. Numerosos vectores de este tipo se comercializan, por ejemplo, en Invitrogen, Stratagene, Clontech, etc., y se describen en numerosas guías tales como Ausubel, Guthrie, Strathem, o Berger, todas mencionadas anteriormente. Dichos vectores habitualmente incluyen promotores, señales de poliadenilación, etc., junto con múltiples sitios de clonación, así como también elementos adicionales tales como orígenes de replicación, genes marcadores seleccionables (por ejemplo, LEU2, URA3, TRP 1, HIS3, GFP), secuencias centroméricas, etc.

Para la expresión en células de mamíferos, puede usarse cualquiera de un número de vectores, tales como pSV2, pBC12BI y p91023, así como vectores de virus líticos (por ejemplo, virus vaccinia, adenovirus, baculovirus), vectores de virus episómicos (por ejemplo, virus del papiloma bovino) y vectores retrovíricos (por ejemplo, retrovirus murinos).

Como se utiliza en la presente, el término "trastorno" se refiere a una dolencia, enfermedad, patología, afección clínica o afección patológica.

Como se utiliza en la presente, la expresión "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un medio portador que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del principio activo, es químicamente inerte y no es tóxico para el paciente al que se administra.

Como se utiliza en la presente, la expresión "derivado farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier homólogo, análogo o fragmento de un agente, por ejemplo, identificado utilizando un método de cribado de la invención, que es relativamente atóxico para el sujeto.

La expresión "agente terapéutico" se refiere a cualquier molécula, compuesto o tratamiento, que contribuye a la prevención o el tratamiento de trastornos, o complicaciones de trastornos.

Se pueden preparar, envasar y etiquetar para el tratamiento composiciones que comprendan un agente de este tipo formulado en un portador farmacéutico compatible.

Si el complejo es hidrosoluble, entonces se puede formular en un tampón apropiado, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato u otras soluciones fisiológicamente compatibles.

Como alternativa, si el complejo resultante tiene una solubilidad deficiente en disolventes acuosos, entonces se puede formular con un tensioactivo no iónico tal como Tween o polietilenglicol. Por lo tanto, los compuestos y sus solvatos fisiológicamente aceptables se pueden formular para la administración mediante inhalación o insuflación (a través de la boca o la nariz) o administración oral, bucal, parenteral, rectal o, en el caso de tumores, inyectarse directamente en un tumor sólido.

Para la administración oral, la preparación farmacéutica puede estar en forma líquida, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o se puede presentar como un producto farmacológico para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Dichas preparaciones líquidas se pueden preparar mediante métodos convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas), agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las composiciones farmacéuticas pueden adoptar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparados por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato de almidón sódico); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato sódico). Los comprimidos se pueden recubrir mediante métodos muy conocidos en la técnica.

Los compuestos se pueden formular para la administración parenteral por inyección, por ejemplo, mediante inyección en embolada o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en una forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis, donde se ha añadido un conservante.

Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos acuosos u oleosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, el principio activo se puede encontrar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril exenta de pirógenos, antes del uso.

Los compuestos también se pueden formular para una aplicación tópica tal como una crema o loción.

Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos también se pueden formular como una preparación de liberación lenta. Dichas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse por implante (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular.

Por lo tanto, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados moderadamente solubles, por ejemplo, como una sal moderadamente soluble. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos muy conocidos de vehículos o portadores de suministro para fármacos hidrófilos.

Las composiciones se pueden presentar, si se desea, en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas farmacéuticas unitarias que contengan el principio activo. El envase puede comprender, por ejemplo, una lámina metálica o de plástico tal como un envase de tipo blíster. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones para la administración.

La invención también proporciona kits para realizar las pautas posológicas terapéuticas de la invención. Dichos kits comprenden cantidades terapéutica o profilácticamente eficaces de las composiciones en forma farmacéuticamente aceptable en uno o más recipientes.

La composición en un vial de un kit puede estar en forma de una solución farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, combinada con solución salina estéril, solución de dextrosa o solución tamponada, u otro fluido estéril farmacéuticamente aceptable. Como alternativa, el complejo se puede liofilizar o desecar, en este caso, el kit comprende además opcionalmente en un recipiente una solución farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, solución de dextrosa, salina, etc.), preferentemente estéril, para reconstituir el complejo con el fin de formar una solución para su inyección.

En otra realización, un kit comprende además una aguja o jeringuilla, preferentemente envasada en forma estéril, para inyectar el complejo y/o una toallita con alcohol envasada. Opcionalmente, se incluyen instrucciones para la administración de las composiciones por parte de un facultativo o por parte del paciente.

A menos que se defina lo contrario, todas las expresiones y los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque en la práctica o en los ensayos de la presente invención pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente, como se define en las reivindicaciones, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

Ejemplos

La expresión dirigida de CatCh en conos de ratones rd1 (ratones homocigotos para la mutación rd1 tienen una degeneración retiniana grave de inicio temprano) se logró mediante el uso del promotor específico de célula arrestina 3 de cono de ratón (mCar) (Busskamp, 2010). Anteriormente se demostró que impulsa selectivamente la expresión en un alto porcentaje de conos rd1 (Busskamp, 2010). CatCh, fusionado con proteína verde fluorescente potenciada, EGFP, se empaquetó dentro de AAV y se inyectó en el espacio subrretiniano de ratones rd1. Todas las inyecciones en ratones se realizaron entre P28 y P39. Se usaron AAV que solo expresaban EGFP como controles durante todo el estudio. La capacidad de los conos de rd1 transfectados con CatCh para transmitir información a células ganglionares retinianas (RGC, por sus siglas en inglés), las neuronas de salida de la retina, se midió en matrices de electrodos múltiples (MEA, por sus siglas en inglés). Se realizaron registros de MEA de CatCh de luz blanca de campo completo entre P79-P114. En las retinas transducidas con CatCh se observaron respuestas ON robustas de las RGC, tanto transitorias como sostenidas, a partir de 10(15) fotones eficaces por cm2 por segundo. Las respuestas persistieron a lo largo de cuatro unidades logarítmicas de intensidades de luz. En ratones rd1 inyectados con el virus de EGFP de control solamente, no se obtuvieron respuestas a la luz.

Por lo tanto, no solo puede hacerse que el cono se hiperpolarice en respuesta a la luz a través de, por ejemplo, la halorrodopsina, imitando la respuesta hiperpolarizante nativa de la opsina. También puede hacerse que se despolarice en respuesta a la luz si CatCh se dirige al cono de rd1.

En la parte inferior de los fotorreceptores, la retina se divide en dos canales de información paralelos. Las células bipolares ON y las ganglionares ON se activan por aumentos de luz y se conectan a los conos mediante sinapsis de inversión de signo. Las células bipolares OFF y las ganglionares OFF se activan por disminuciones de luz y se conectan a los conos con sinapsis de conservación de signo. 7 Puesto que los fotorreceptores transducidos por CatCh se despolarizan ahora en respuesta a la luz, la vía ON se hiperpolarizará en respuesta a la luz y será silenciosa, mientras que la vía OFF se despolarizará y dará lugar a respuestas ON.

Para demostrar que los fotorreceptores despolarizantes son capaces de transmitir información a las células ganglionares a través de la inversión de los circuitos ON y OFF, los inventores indujeron la degeneración de la retina en ratones de tipo silvestre introduciendo en su retina transgenes con un promotor de p-actina de pollo constitutivo (CBA). Diez días después de la inyección subrretiniana de un casete AAV2/8-CBA-DIO-InhA-2A-EGFP, la retina de los ratones de tipo silvestre mostró una opsina casi completa. El marcaje de la arrestina de conos mostró una alteración de la morfología de los conos. Los segmentos internos parecían acortados, llegando a desaparecer por completo; los conos ya no se encontraban en el mismo plano de la capa de fotorreceptores y con el tiempo se produjo un aumento aparente del tamaño del cuerpo de las células de los conos. Los inventores pasaron a coinyectar este casete tóxico de ^cB^acon CatCh cuando los ratones de tipo silvestre eran P36. Se realizaron registros de m Ea de luz blanca de campo completo entre P61-P73. Las respuestas de las células ganglionares, tanto ON como OFF, fueron visibles durante los registros de MEA.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un canal iónico activado por la luz despolarizante unido funcionalmente a un promotor que conduce a la expresión específica de dicho canal iónico activado por la luz despolarizante en una célula fotorreceptora retiniana, para su uso en el tratamiento o la mejoría de la ceguera, en donde dicho promotor que conduce a la expresión de dicho canal iónico activado por la luz despolarizante en una célula fotorreceptora retiniana se selecciona del grupo que consiste en Gnat2_500 (SEQ ID NO: 2), Gnat2_2kb (SEQ ID NO: 3) y TF GSH2 (SEQ ID NO: 6).

2. La molécula de ácido nucleico aislada para el uso de la reivindicación 1, en donde el canal iónico activado por la luz despolarizante es una rodopsina de canal, por ejemplo, la canalrodopsina-2.

3. La molécula de ácido nucleico aislada para el uso de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho promotor que conduce a la expresión de dicho canal iónico activado por la luz despolarizante es Gnat2_500 (SEQ ID NO: 2).

4. La molécula de ácido nucleico aislada para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha célula fotorreceptora retiniana es un bastón y/o un cono.

5. Un vector recombinante para su uso en el tratamiento o la mejoría de la ceguera, en donde dicho vector recombinante comprende la molécula de ácido nucleico aislada como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. El vector recombinante para el uso de la reivindicación 5, en donde el vector es un vector vírico.

7. El vector recombinante para el uso de la reivindicación 6, en donde el vector vírico es un vector de virus adenoasociado.

8. Una célula hospedadora para su uso en el tratamiento o la mejoría de la ceguera, en donde dicha célula hospedadora comprende el vector recombinante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

9. Un kit que comprende la molécula de ácido nucleico aislada como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el vector recombinante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 o la célula hospedadora como se define en la reivindicación 8.

10. La molécula de ácido nucleico aislada para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el vector recombinante para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 o la célula hospedadora para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicho tratamiento o mejoría de la ceguera comprende una inyección subrretiniana de dicha molécula de ácido nucleico aislada, dicho vector recombinante o dicha célula hospedadora.