ES2924640T3 - Vacunas de flavivirus - Google Patents
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Abstract
La invención proporciona vacunas de flavivirus y métodos para preparar y usar estas vacunas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Vacunas de flavivirus
Campo de la invención
Esta invención se refiere a vacunas de flavivirus.
Antecedentes de la invención
Los flavivirus son virus de ARN de cadena positiva, pequeños y con envoltura, varios de los cuales suponen una amenaza actual o posible para la salud pública mundial. El virus de la fiebre amarilla, por ejemplo, ha sido la causa de epidemias en ciertas localidades selváticas del África subsahariana, así como en algunas partes de América del Sur. Aunque muchas infecciones por fiebre amarilla son leves, la enfermedad también puede causar dolencia grave, potencialmente mortal. El cuadro clínico tiene dos fases. La fase inicial o aguda se caracteriza normalmente por fiebre alta, escalofríos, cefalea, dolor de espalda, dolores musculares, pérdida de apetito, náuseas y vómitos. Después de tres a cuatro días, estos síntomas desaparecen. En algunos pacientes, los síntomas vuelven a aparecer, a medida que la enfermedad entra en su denominada fase tóxica. Durante esta fase, la fiebre alta reaparece y puede provocar choque, sangrado (p. ej., sangrado de la boca, nariz, ojos y/o estómago), insuficiencia renal e insuficiencia hepática. De hecho, la insuficiencia hepática causa ictericia, que es la coloración amarillenta de la piel y del blanco de los ojos, y de ahí el nombre de "fiebre amarilla". Aproximadamente la mitad de los pacientes que entran en la fase tóxica mueren al cabo de 10 a 14 días. Sin embargo, las personas que se recuperan de la fiebre amarilla tienen inmunidad de por vida contra la reinfección. El número de personas infectadas con el virus de la fiebre amarilla en las dos últimas décadas ha ido en aumento, y actualmente hay aproximadamente 200000 casos de fiebre amarilla, con 30000 muertes aproximadamente cada año. Por tanto, la reaparición del virus de la fiebre amarilla presenta un grave problema de salud pública.
El virus del dengue (DEN) es otro ejemplo de flavivirus. Los mosquitos (principalmente Aedes aegypti) transmiten el virus del dengue a los seres humanos y son la causa de un creciente problema de salud pública a nivel mundial. Entre cincuenta y cien millones de personas se infectan anualmente con el virus del dengue y se han observado tasas de infección de hasta el 6 % en algunas zonas (Gubler, "Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever", CABI Publ., Nueva York, Capítulo 1, págs. 1-22, 1997; Burke et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 38:172-180, 1988). Cuatro serotipos del virus del dengue (tipos 1-4 del dengue) circulan en el Caribe, Asia y las Américas. La forma grave y potencialmente letal de la infección por DEN [fiebre hemorrágica por dengue/síndrome de choque por dengue DH/s Cd (DHF/DSS, siglas del inglés)] es una enfermedad inmunopatológica que se produce en individuos que han sufrido infecciones secuenciales por diferentes serotipos de DEN. Entre 1980 y 1995 se notificaron más de 3,6 millones de casos de DHF y 58.000 muertes causadas por DHF (Halstead, "Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever", CABI Publ., Nueva York, Capítulo 2, págs. 23-44, 1997). Debido a la patogenia de DHF/DSS, en general, se piensa que una vacuna óptima contra el dengue debe inmunizar contra los cuatro serotipos del virus del dengue simultáneamente e inducir una inmunidad duradera. A pesar de los grandes esfuerzos que se han realizado para desarrollar una vacuna eficaz contra el dengue desde la Segunda Guerra Mundial, actualmente no hay una vacuna contra el dengue aprobada disponible.
Los flavivirus, incluyendo el virus de la fiebre amarilla y el virus del dengue, tienen dos propiedades biológicas principales responsables de la inducción del cuadro clínico en seres humanos y en animales. La primera de estas dos propiedades es el neurotropismo, que es la propensión del virus a invadir e infectar el tejido nervioso del hospedador. La infección por flavivirus neurotrópicos puede provocar inflamación y lesión del cerebro y la médula espinal (es decir, encefalitis), alteración de la percepción, parálisis y convulsiones. La segunda propiedad biológica de los flavivirus es el viscerotropismo, que es la propensión del virus a invadir e infectar órganos viscerales vitales, incluyendo el hígado, riñón y corazón La infección por flavivirus viscerotrópicos puede provocar inflamación y lesión del hígado (hepatitis), riñón (nefritis) y músculo cardíaco (miocarditis), que conduce a la insuficiencia o disfunción de estos órganos. El neurotropismo y el viscerotropismo parecen ser propiedades distintas e independientes de los flavivirus.
Algunos flavivirus son principalmente neurotrópicos (como el virus del Nilo Occidental), otros son principalmente viscerotrópicos (p. ej., el virus de la fiebre amarilla y el virus del dengue) y otros presentan ambas propiedades (como el virus de la enfermedad del bosque de Kyasanur). Sin embargo, tanto el neurotropismo como el viscerotropismo están presentes en algún grado en todos los flavivirus. Dentro del hospedador, es probable que se produzca una interacción entre el viscerotropismo y el neurotropismo, porque la infección de las vísceras se produce antes de la invasión del sistema nervioso central. Por tanto, el neurotropismo depende de la capacidad del virus para replicarse en órganos extraneuronales (vísceras). Esta replicación extraneuronal produce viremia, que a su vez es responsable de la invasión del cerebro y la médula espinal.
Un enfoque para desarrollar vacunas contra los flavivirus es modificar sus propiedades de virulencia, de modo que el virus de la vacuna haya perdido su neurotropismo y viscerotropismo para seres humanos o animales. En el caso del virus de la fiebre amarilla, se han desarrollado dos vacunas (la vacuna contra la cepa 17D del virus de la fiebre amarilla y la vacuna neurotrópica francesa) (Monath, "Yellow Fever", En Plotkin and Orenstein, Vaccines, 3a ed., 1999, Saunders, Filadelfia, págs. 815-879). La vacuna contra la cepa 17D de la fiebre amarilla se desarrolló mediante pase
seriado en tejido de embrión de pollo y dio como resultado un virus con neurotropismo y viscerotropismo significativamente reducidos. La vacuna neurotrópica francesa se desarrolló mediante pase seriado en tejido cerebral de ratón y dio como resultado la pérdida de viscerotropismo, pero conservó el neurotropismo. Una alta incidencia de accidentes neurológicos (encefalitis posvacunal) se asoció al uso de la vacuna francesa. Las vacunas aprobadas no están disponibles actualmente para muchos flavivirus médicamente importantes que tienen propiedades viscerotrópicas, tales como el virus del dengue, del Nilo Occidental y de la fiebre hemorrágica de Omsk, entre otros.
Completamente procesados, los viriones maduros de los flavivirus contienen tres proteínas estructurales, cápside (C), membrana (M) y envoltura (E) y siete proteínas no estructurales. Los flaviviriones inmaduros que se encuentran en las células infectadas contienen la proteína de la premembrana (prM), que es un precursor de la proteína M. Las proteínas de los flavivirus se producen mediante la traducción de un único y largo marco abierto de lectura que genera una poliproteína, seguido de una serie compleja de escisiones proteolíticas postraduccionales de la poliproteína, que generan proteínas víricas maduras (Amberg et al. J.Virol. 73:8083-8094, 1999; Rice, "Flaviviridae", En Virology, Fields (ed.), Raven-Lippincott, Nueva York, 1995, Volumen I, pág. 937). Las proteínas estructurales del virus están dispuestas en la poliproteína en el orden C-prM-E.
Dos Santos Claudia Nunes Duarte et al., Virology, vol. 274(2), 2000, págs. 292-308 describen una investigación de si los determinantes genéticos responsables de la adquisición por el virus DEN-1 de la neurovirulencia del ratón interfieren con la inducción de la apoptosis en respuesta a la infección por el virus DEN-1. Los datos sugieren que las sustituciones de aminoácidos identificadas en la proteína E de la envoltura y en la ARN helicasa NS3 vírica, pueden influir en la patogenia del virus DEN-1 al alterar el crecimiento vírico.
Lee et al., Virology, vol. 232, 1997, págs. 281-290 describen un análisis de los acontecimientos moleculares implicados en la adaptación del virus del dengue durante la realización de pase seriado in vivo y en células cultivadas. La realización de pases seleccionó cambios de aminoácidos en la proteína de la envoltura E y ocasionalmente en la de la prM, pero no en la proteína de la cápside. Bray et al, Journal of Virology, vol. 72(2), 1998, págs. 1647-1651 describen una investigación sobre los determinantes genéticos responsables de la adquisición de la neurovirulencia del virus del dengue tipo 2 en ratones.
En el documento WO 01/39802 se describe un virus quimérico, vivo, infeccioso y atenuado, que contiene un virus de la fiebre amarilla, en el que se elimina, se trunca o se muta la secuencia de nucleótidos de una proteína prM-E, para que la proteína prM-E funcional no se exprese, y se integre en el genoma del virus de la fiebre amarilla, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína prM-E de un segundo, flavivirus diferente, para que se exprese la proteína prM-E del segundo flavivirus.
Guirakhoo et al., Journal of Virology, vol. 75(16), 2001, págs. 7290-7304 describen la construcción, seguridad e inmunogenicidad en primates no humanos de una vacuna tetravalente quimérica del virus de la fiebre amarilla-dengue, incluida la construcción de tres quimeras YF/DEN usando genes de premembrana (prM) y envoltura (E) de aislados clínicos de tipo silvestre (TS).
Sumario de la invención
La invención proporciona flavivirus que incluyen una o más mutaciones en la región bisagra que reducen el viscerotropismo de los flavivirus para su uso según las reivindicaciones 1 a 6. Estos flavivirus pueden ser, por ejemplo, un virus del dengue o un flavivirus quimérico.
En un ejemplo de un flavivirus quimérico, la quimera incluye las proteínas de la cápside y las no estructurales de un primer flavivirus (p. ej., un virus de la fiebre amarilla) y las proteínas de la premembrana y de la envoltura de un virus del dengue (p. ej., virus del dengue 1, 2, 3 o 4), incluida una mutación de la proteína de la envoltura que disminuye el viscerotropismo del flavivirus quimérico.
En el caso del virus del dengue, la mutación está en la lisina en la posición de aminoácido 202 o 204 de la envoltura del dengue. Este aminoácido se sustituye por arginina.
La invención también proporciona composiciones de vacunas para su uso según las reivindicaciones 7 y 8 que incluyen cualquiera de los virus descritos en el presente documento y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, así como los flavivirus descritos en el presente documento para su uso en un paciente en la inducción de una respuesta inmunitaria contra dicho flavivirus. Los pacientes tratados con estos métodos puede que no tengan, pero que estén en riesgo de desarrollar, la infección por flavivirus, o puede que tengan la infección por flavivirus.
Adicionalmente se describe el uso de los flavivirus de la invención en el tratamiento o la prevención de una infección por flavivirus.
También se incluyen en la invención procesos para reducir el viscerotropismo de un flavivirus, que implican introducir en un flavivirus una mutación que da como resultado una disminución del viscerotropismo según las reivindicaciones 9 a 12.
Los flavivirus descritos en el presente documento son ventajosos porque, al haber disminuido el viscerotropismo, proporcionan un nivel adicional de seguridad, en comparación con sus homólogos no mutados, cuando se administran a los pacientes. Otras ventajas de estos virus se proporcionan por el hecho de que pueden incluir secuencias de la cepa YF17D del virus de la fiebre amarilla (p. ej., secuencias que codifican las proteínas de la cápside y las no estructurales), que (i) ha tenido su seguridad establecida durante > de 60 años, durante los cuales se han administrado más de 350 millones de dosis a los seres humanos, (ii) induce una inmunidad de larga duración después de una sola dosis, y (iii) induce inmunidad rápidamente, a los pocos días de la inoculación. Adicionalmente, los virus de la vacuna descritos en el presente documento provocan una infección activa en los pacientes tratados. Como el medio de citocinas y la respuesta inmunitaria innata de los individuos inmunizados son similares a los de la infección natural, la masa antigénica se expande en el hospedador, los epítopos conformacionales correctamente plegados se procesan de manera eficaz, la respuesta inmunitaria adaptativa es fuerte y se establece la memoria. Asimismo, en quimeras de la invención, las proteínas prM y E procedentes del virus diana contienen los antígenos críticos para la inmunidad humoral y celular protectora.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, los dibujos y las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra variantes de tamaño de placas producidas por ChimeriVax™-JE en FRhL3 (placa grande, Panel A) y FRhLs (placa pequeña, Panel B). Las placas se tiñeron usando antisuero de conejo anti-JE seguido de anti-IgG de conejo-peroxidasa de rábano picante.
La Fig. 2 es una serie de gráficos que muestran las distribuciones de supervivencia de las construcciones YF-VAX® y ChimeriVax™-JE, con y sin mutación en E279 (M^-K). Ratones lactantes de cuatro días de vida inoculados por vía intracerebral (Fig. 2A) con aproximadamente 0,7 log-io UFP; (Fig. 2B) aproximadamente 1,7 log-io UFP; y (Fig. 2C) ~2,7 log-o UFP.
La Fig. 3 es un gráfico de análisis de regresión, mortalidad frente a dosis de virus, que muestra pendientes y líneas paralelas similares de virus (con FRhLs y sin (FRhL3) con la inversión de Met por Lys, que permite establecer una comparación estadística. En FRhLs el virus era 18,52 veces más fuerte (virulento) que en FRhL3 (p<0,0001).
La Fig. 4 muestra los resultados de la transfección de ARN independiente y de la serie de pases del virus ChimeriVax™-JE en células FRhL y Vero. Se muestra la aparición de mutaciones en los genes prME por nivel de pases.
La Fig. 5 es un modelo tridimensional del ectodominio de la glicoproteína de la envoltura del flavivirus que muestra ubicaciones de mutaciones en la región bisagra que se producen con la adaptación en células FRhL o Vero. La secuencia de la glicoproteína de la envoltura JE (cepa JaOArS982; Sumiyoshi et al.,, Virology 161:497-510, 1987) se alineó con uno de los moldes estructurales TBE (Rey et al., Nature 375:291-298, 1995) como entrada para la construcción automatizada de modelado por homología mediante el método de SegMod (Modelado con segmentos coincidentes) utilizando el programa informático LOOK (Molecular Application Group, Palo Alto, CA).
Descripción detallada
La invención desvela flavivirus para su uso según las reivindicaciones 1 a 6 y composiciones de vacunas para su uso según las reivindicaciones 7 u 8. La mutación en los flavivirus, como se describe en el presente documento, se encuentra en la región bisagra de la proteína de la envoltura, que se ha demostrado que juega un papel en la determinación del viscerotropismo. A continuación, también se describe el uso de los virus y los métodos de la invención.
Un ejemplo de flavivirus es el virus de la fiebre amarilla. Se pueden realizar mutaciones en la región bisagra de la envoltura de un clon infeccioso de tipo silvestre, p.ej., del clon infeccioso de Asibi o de un clon infeccioso de otro virus virulento de tipo silvestre de la fiebre amarilla, y los mutantes pueden después probarse en un sistema de modelo animal (p. ej., en sistemas de modelo de hámster y/o mono) para identificar los sitios que afectan al viscerotropismo. La reducción del viscerotropismo se calcula, p. ej., detectando la disminución de la viremia y/o de la lesión hepática en el sistema de modelo (véase más adelante para más detalles). Una o más mutaciones que disminuyen el viscerotropismo del virus de tipo silvestre se introducen después en una cepa de vacuna (p. ej. YF17D), y estos mutantes se prueban en un sistema de modelo animal (p. ej. en un sistema de modelo de hámster y/o mono) para determinar si los mutantes resultantes han disminuido su viscerotropismo. Los mutantes que se descubre que tienen un viscerotropismo reducido pueden utilizarse como nuevas cepas de vacunas que tienen mayor seguridad, debido a la disminución de los niveles de viscerotropismo.
Como flavivirus adicionales se incluyen otros flavivirus transmitidos por mosquitos, tales como el virus de la encefalitis japonesa, el del dengue (serotipos 1-4), el de la encefalitis del valle del río Murray, el de la encefalitis de San Luis, el del virus del Nilo occidental, de Kunjin, de Rocío y de Ilhéus; flavivirus transmitidos por garrapatas, tales como el virus de la encefalitis centroeuropea, encefalitis siberiana, encefalitis rusa de primavera y verano, enfermedad de la selva de Kyasanur, fiebre hemorrágica de Omsk, de Louping-ill, Powasan, Negishi, Absettarov, Hansalova, Apoi y virus Hypr; así como virus del género Hepacivirus (p. ej. virus de la hepatitis C). Todos estos virus tienen cierta propensión a
infectar órganos viscerales. El viscerotropismo de estos virus puede no causar disfunción de órganos viscerales vitales, pero la replicación del virus en estos órganos puede causar viremia y contribuir así a la invasión del sistema nervioso central. La disminución del viscerotropismo de estos virus por mutagénesis puede reducir por tanto su capacidad para invadir el cerebro y causar encefalitis.
En la invención se incluyen flavivirus quiméricos que incluyen una o más mutaciones, como se define en las reivindicaciones 1 a 6, que disminuyen el viscerotropismo para su uso según las reivindicaciones 1 a 6. Las quimeras pueden consistir en un flavivirus de cadena principal (p. ej., un virus de la fiebre amarilla) en el que las proteínas prM y E del flavivirus se han reemplazado por las proteínas prM y E del virus del dengue (1-4), (cuya proteína E tiene una mutación en la región bisagra como se describe en el presente documento). El virus contra el que se busca la inmunidad es la fuente de la(s) proteína(s) estructural(es) insertada(s).
Un ejemplo específico de un virus quimérico que puede incluirse en las vacunas descritas en el presente documento, es el de la cepa de la vacuna humana contra la fiebre amarilla, YF17D, en la que las proteínas prM y E se han reemplazado por la proteínas prM y E (incluyendo una mutación en la bisagra como se reivindica en el presente documento) de un virus del dengue (serotipo 1,2, 3 o 4). Por ejemplo, el siguiente flavivirus quimérico, que se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) en Manassas, Virginia, EE. UU. según los términos del Tratado de Budapest y al que se le otorgó una fecha de depósito del 6 de enero de 1998, puede utilizarse para preparar los virus de la invención: el virus quimérico de la fiebre amarilla 17D/Dengue tipo 2 (YF/DEN-2; con el número de registro en la ATCC, ATCC VR-2593). Se proporcionan detalles sobre la preparación de virus quiméricos que pueden utilizarse en la invención, por ejemplo, en las solicitudes internacionales PCT/US98/03894 y PCT/US00/32821; y en Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999.
Como se ha indicado anteriormente, las mutaciones que están incluidas en los virus descritos en el presente documento, disminuyen el viscerotropismo. Estas mutaciones están presentes en la región bisagra de la proteína de la envoltura del flavivirus. La cadena polipeptídica de la proteína de la envoltura se pliega en tres dominios distintos: un dominio central (dominio I), un dominio de dimerización (dominio II) y un dominio de módulo de tipo inmunoglobulina (dominio III). La región bisagra está presente entre los dominios I y II y, tras la exposición a pH ácido, sufre un cambio conformacional (de ahí la designación "bisagra") implicado en la fusión de las membranas del virus y del endosoma, después de la captación del virus por endocitosis mediada por receptores. Numerosos aminoácidos de la envoltura están presentes en la región bisagra, incluidos, por ejemplo, los aminoácidos 48-61, 127-131 y 196-283 del virus de la fiebre amarilla (Rey et al., Nature 375:291-298, 1995). Cualquiera de estos aminoácidos, o los aminoácidos que los rodean (y los aminoácidos correspondientes en otras proteínas de la envoltura de los flavivirus), puede mutarse y probarse con respecto a una disminución que dé como resultado el viscerotropismo. Las mutaciones se pueden realizar en la región bisagra utilizando métodos estándar, tal como mutagénesis dirigida. El tipo de mutación presente en los virus, como se describe en el presente documento, es una sustitución. Adicionalmente, como se ha indicado anteriormente, las mutaciones pueden estar presentes individualmente o en el contexto de una o más mutaciones adicionales.
Los virus (incluidas las quimeras), como se describe en el presente documento, pueden prepararse utilizando métodos estándar de la técnica. Por ejemplo, una molécula de ARN correspondiente al genoma de un virus puede introducirse en células primarias, embriones de pollo, o líneas celulares diploides, a partir de los cuales (o los sobrenadantes de los cuales) puede purificarse el virus descendiente. Otro método que se puede utilizar para producir los virus emplea células heteroploides, tales como células Vero (Yasumura et al., Nihon Rinsho 21, 1201-1215, 1963). En este método, una molécula de ácido nucleico (p. ej., una molécula de ARN) correspondiente al genoma de un virus, se introduce en las células heteroploides, el virus se extrae del medio en el que se han cultivado las células, el virus extraído se trata con una nucleasa (p. ej., una endonucleasa que degrada tanto ADN como ARN, tal como Benzonase™; patente de EE. UU. n.° 5.173.418), el virus tratado con nucleasa se concentra (p. ej., utilizando ultrafiltración con un filtro que tenga un límite de peso molecular de, p. ej., 500 kDa), y el virus concentrado se formula con fines de vacunación. Los detalles de este método se proporcionan en la solicitud de patente de EE. UU. número de serie 60/348.565, presentada el 15 de enero de 2002.
Los virus descritos en el presente documento pueden administrarse como agentes profilácticos primarios en adultos o niños con riesgo de infección, o pueden utilizarse como agentes secundarios para tratar pacientes infectados. Por ejemplo, en el caso de las quimeras de fiebre amarilla/dengue, las vacunas pueden utilizarse en adultos o niños con riesgo de infección por dengue, o se pueden utilizarse como agentes secundarios para el tratamiento de pacientes infectados por dengue. Los ejemplos de pacientes que pueden tratarse utilizando las vacunas y los métodos relacionados con el dengue incluyen (i) niños en zonas en las que el dengue es endémico, tal como Asia, América Latina y el Caribe, (ii) viajeros extranjeros, (iii) personal militar, y (iv) pacientes en zonas de epidemia de dengue. Asimismo, se puede tratar a habitantes de regiones en las que se ha observado que la expansión de la enfermedad (p. ej. Argentina, Chile, Australia, partes de África, el sur de Europa, Oriente Medio y el sur de los Estados Unidos), o regiones en las que se puede observar su expansión en el futuro (p. ej., regiones infestadas con Aedes aegypti).
La formulación de los virus como los descritos en el presente documento, se puede llevar a cabo utilizando métodos que son estándar en la técnica. Numerosas soluciones farmacéuticamente aceptables para su uso en la preparación de vacunas son bien conocidas y los expertos en esta técnica pueden adaptarlas fácilmente para su uso en la presente
invención. (Véase, p.ej., Remington's Pharmaceutical Sciences (18a edición), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA.) En dos ejemplos específicos, los virus se formulan en sal de Earle en medio mínimo esencial (MEME, Mínimum Essential Médium Earle’s) que contiene lactosa al 7,5 % y seroalbúmina humana al 2,5 % o en MEME que contiene sorbitol al 10%. Sin embargo, los virus pueden simplemente diluirse en una solución fisiológicamente aceptable, tal como solución salina estéril o solución salina tamponada estéril. En otro ejemplo, los virus pueden administrarse y formularse, por ejemplo, de la misma manera que la vacuna contra la fiebre amarilla 17D, p.ej., como una suspensión purificada de tejido de embrión de pollo infectado, o un líquido extraído de cultivos celulares infectados con el virus quimérico de la fiebre amarilla.
Las vacunas descritas en el presente documento pueden administrarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica, y los expertos en la materia pueden determinar fácilmente las cantidades adecuadas de las vacunas administradas. Por ejemplo, los virus de la invención pueden formularse como soluciones acuosas estériles que contengan entre 102 y 107 unidades infecciosas (p. ej., unidades formadoras de placa o dosis infecciosas de cultivo tisular) en un volumen de dosis de 0,1 a 1,0 ml, para administrarse, por ejemplo, por vía intramuscular, vía subcutánea o intradérmica. Adicionalmente, dado que los flavivirus pueden ser capaces de infectar al hospedador humano a través de las vías mucosas, tal como la vía oral (Gresikova et al., "Tick-bome Encephalitis", En The Arboviruses, Ecology and Epidemiology, Monath (ed.), CRC Press, Boca Ratón, Florida, 1988, volumen IV, 177-203), los virus también pueden administrarse por vía mucosa. Además, las vacunas descritas en el presente documento pueden administrarse en una sola dosis u, opcionalmente, la administración puede implicar el uso de una dosis de primovacunación seguida de una dosis de refuerzo que se administra, p.ej., 2-6 meses después, como se determina que es apropiado por los expertos en la técnica.
Opcionalmente, los adyuvantes que conocen los expertos en la técnica pueden utilizarse en la administración de los virus descritos en el presente documento.
Los adyuvantes que pueden utilizarse para mejorar la inmunogenicidad de los virus incluyen, por ejemplo, formulaciones de liposomas, adyuvantes sintéticos, tales como (p. ej., QS21), dipéptido de muramilo, monofosforil lípido A o polifosfazina. Aunque estos adyuvantes se utilizan normalmente para mejorar las respuestas inmunitarias a las vacunas inactivadas, también pueden utilizarse con vacunas vivas. En el caso de un virus suministrado a través de una vía mucosa, por ejemplo, por vía oral, como adyuvantes pueden utilizarse adyuvantes de la mucosa, tales como la toxina termolábil (Tl ) de E. coli o derivados mutantes de la TL. Adicionalmente, en los virus pueden insertarse genes que codifiquen citocinas que tengan actividades adyuvantes. Por tanto, genes que codifican citocinas, tales como GM-CSF, iL-2, IL-12, IL-13 o IL-5, pueden insertarse junto con genes de antígenos extraños para producir una vacuna que dé lugar a respuestas inmunitarias mejoradas, o para modular la inmunidad dirigida más específicamente a respuestas celulares, humorales o de las mucosas.
En el caso del virus del dengue, contra el cual la vacunación óptima puede implicar la inducción de inmunidad contra los cuatro serotipos del dengue, los virus quiméricos de la presente invención pueden utilizarse en la formulación de vacunas tetravalentes. Cualquiera o todas las quimeras utilizadas en dichas formulaciones tetravalentes pueden incluir una mutación, como se describe en las reivindicaciones, que disminuya el viscerotropismo. Las quimeras pueden mezclarse para formar preparaciones tetravalentes en cualquier momento durante la formulación o pueden administrarse en serie. En el caso de una vacuna tetravalente, para reducir la posibilidad de interferencia vírica y así lograr una respuesta inmunitaria equilibrada, las cantidades de cada una de las diferentes quimeras presentes en las vacunas administradas pueden variar. Resumiendo, en un ejemplo de una formulación de este tipo, se utiliza al menos 5 veces menos de la quimera del dengue-2 (p. ej., 10, 50, 100, 200 o 500 veces menos) en relación con las otras quimeras. En este ejemplo, las cantidades de las quimeras del dengue-1, dengue-3 y dengue-4, pueden ser equivalentes o pueden variar. En otro ejemplo, las cantidades de virus del dengue-4 y/o dengue 1 también pueden reducirse. Por ejemplo, además de utilizar menos quimera del dengue-2, puede utilizarse al menos 5 veces menos de la quimera del dengue-4 (p. ej., 10, 50, 100, 200 o 500 veces menos) en relación con las quimeras del dengue-1 y dengue-3; puede utilizarse al menos 5 veces menos de la quimera del dengue-1 (p. ej., 10, 50, 100, 200 o 500 veces menos) en relación con las quimeras del dengue-3 y dengue-4; o puede utilizarse al menos 5 veces menos de las quimeras del dengue-1 y dengue-4 en relación con la quimera del dengue-3. Puede ser particularmente deseable, por ejemplo, disminuir la cantidad de quimera del dengue-1 en relación con las cantidades de las quimeras del dengue-3 y/o dengue-4 cuando la mutación E204/E202 descrita en el presente documento no está incluida en la quimera.
A continuación se proporcionan detalles de la caracterización de un ejemplo de una mutación que se produce en la posición 279 de la proteína de la envoltura de una quimera del virus de la fiebre amarilla/encefalitis japonesa. También se proporcionan a continuación detalles sobre las quimeras del virus de la fiebre amarilla/dengue, en las que las proteínas de la envoltura del virus del dengue incluyen una o más mutaciones que disminuyen el viscerotropismo.
En un ejemplo de dicha mutación, la lisina en la posición 204 de la proteína de la envoltura del virus del dengue-1, dengue-2 o dengue-4, o la lisina en la posición 202 de la proteína de la envoltura del virus del dengue-3, que es dos aminoácidos más corta que la de las proteínas de la envoltura de los otros serotipos del virus de dengue, se sustituye por arginina. Otros restos cercanos al aminoácido 204 de la envoltura (202 para el virus del dengue-3) también pueden mutarse para lograr una disminución del viscerotropismo. Por ejemplo, cualquiera de los aminoácidos 200-208, o combinaciones de estos aminoácidos, pueden mutarse. Como ejemplos específicos se incluyen los siguientes: la
posición 202 (K) del virus del dengue-1; la posición 202 (E) del virus del dengue-2; la posición 200 (K) del virus del Dengue-3; y las posiciones 200 (K), 202 (K) y 203 (K) del virus del dengue-4. Estos restos pueden sustituirse, por ejemplo, por arginina.
Resultados experimentales
1. Quimera del virus de la fiebre amarilla/encefalitis japonesa que incluye una región bisagra
Mutación (el siguiente Ejemplo 1 no forma parte de la invención y se proporciona únicamente con fines informativos)
Sumario
Se construyó una vacuna quimérica contra el virus de la fiebre amarilla (YF, yellow fever) y de la encefalitis japonesa (JE, Japanese encephalitis) (ChimeriVax™-JE) insertando los genes prM-E de la cepa SA14-14-2 de la vacuna atenuada del virus de la JE en un clon de ADNc de longitud completa de la cepa 17D de virus de la YF. La realización de pases en células de pulmón de feto de Macacus rhesus (FRhL, fetal rhesus lung) condujo a la aparición de un virus de placa pequeña que contenía una sola mutación de aminoácido Met a Lys en E279, revirtiendo este resto de la cepa SA14-14-2 al aminoácido de tipo silvestre. También se construyó un virus similar mediante mutagénesis dirigida. La mutación en E279 se encuentra en una lámina beta en la región bisagra de la proteína E, que es responsable de un cambio conformacional dependiente del pH durante la entrada del virus desde el endosoma al citoplasma de una célula infectada. En estudios de pases de transfección independientes en células FRhL o Vero, las mutaciones aparecieron con mayor frecuencia en la bisagra 4 (limitada por los aminoácidos de las posiciones E266 a E284), lo que refleja inestabilidad genómica en esta región funcionalmente importante. La inversión en E279 provocó un aumento significativo de la neurovirulencia, según lo determinado por la DL50 (dosis letal media) y la distribución de la supervivencia en ratones lactantes y por histopatología en Macacus rhesus ("actualmente Macaca mulatta o macaco de la India). En función de la sensibilidad y la comparabilidad de los resultados con monos, el ratón lactante es un hospedador apropiado para las pruebas de seguridad de las vacunas candidatas de flavivirus para el neurotropismo. El resto Lys en E279 del virus estaba restringido con respecto a la replicación extraneuronal en monos, ya que los niveles de viremia y anticuerpos (marcadores de viscerotropismo) se redujeron significativamente en comparación con el resto Met en E279 del virus.
Antecedentes
El estudio de los virus quiméricos ha aportado nuevos conocimientos sobre las bases moleculares de la virulencia y nuevas perspectivas para el desarrollo de vacunas. Por ejemplo, clones moleculares de alfavirus de cadena positiva (Morris-Downes et al., Vaccine 19:3877-3884, 2001; Xiong et al., Science 243:1188-1191, 1991) y flavivirus (Bray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:10342-10346, 1991; Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999; Guirakhoo et al., J. Virol. 75:7290-7304, 2001; Huang et al., J. Virol. 74:3020-3028, 2000) se han modificado mediante la inserción de genes estructurales que codifican la envoltura del virus y los determinantes implicados en la neutralización, adhesión, fusión e interiorización celular. La replicación de estos virus quiméricos está controlada por proteínas no estructurales y los extremos no codificantes expresados por la cepa precursora, mientras que las proteínas estructurales de los genes donantes proporcionan inmunidad específica. Las características biológicas de los virus quiméricos están determinadas por los genes del virus donante y del receptor. Comparando construcciones con diferencias de secuencias de nucleótidos entre los genes donantes, es posible analizar los papeles funcionales de los restos de aminoácido individuales en la virulencia y la atenuación.
Usando un virus quimérico de fiebre amarilla (YF) que incorporó los genes prM-E de una cepa atenuada (SA14-14-2) de encefalitis japonesa (JE), se realizó un examen detallado del papel de 10 mutaciones de aminoácidos que distinguían el virus de la JE atenuado del virus virulento de la JE de Nakayama de tipo silvestre (Arroyo et al., J. Virol.
75:934-942, 2001). Los factores de virulencia se definieron revirtiendo cada mutación individualmente o como grupos en la secuencia de tipo silvestre y determinando los efectos sobre la neurovirulencia en ratones adultos jóvenes inoculados por vía intracerebral (i.c.) con 104 unidades formadoras de placas (UFP). Todos los virus retromutantes de un solo sitio permanecieron muy atenuados, y para restaurar un fenotipo neurovirulento se requirieron inversiones en 3 o 4 restos. Únicamente un retromutante de un solo sitio (E279 Met^Lys) mostró alguna prueba de un cambio en la virulencia, sucumbiendo 1 de 8 animales después de la inoculación por vía i.c..
Con el fin de explorar más a fondo el papel funcional del determinante E279, se compararon virus quiméricos YF/JE que diferían en este resto de aminoácido por su capacidad para causar encefalitis en ratones y monos lactantes. La inoculación i.c. de monos se utiliza habitualmente como prueba de seguridad de flavivirus y otras vacunas vivas, y el examen patológico cuantitativo del tejido cerebral y de la médula espinal proporciona un método sensible para distinguir cepas del mismo virus con diferencias sutiles en cuanto a la neurovirulencia (Levenbook et al., J. Biol. Stand.
15: 305-313, 1987). Los ratones lactantes proporcionan un modelo más sensible que los animales de mayor edad, ya que la susceptibilidad a los flavivirus neurotrópicos depende de la edad (Monath et al., J. Virol. 74:1742-1751, 2000). Los resultados confirmaron que la única mutación del aminoácido Met^-Lys en E279 confirió un aumento en la neurovirulencia. Esta mutación se encuentra en la región 'bisagra' de la proteína E, que es responsable de un cambio conformacional dependiente del pH durante la entrada del virus desde el endosoma al citoplasma de una célula
infectada (Reed et al., Am. J. Hyg. 27:493-497, 1938). Es importante destacar que, se demostró que el ratón lactante predecía el perfil de virulencia en Macacus rhesus. Basándose en la detección de un cambio en la neurovirulencia conferida por una mutación puntual, se propone que el ratón lactante es un hospedador apropiado para las pruebas de seguridad de los candidatos a vacunas de flavivirus para el neurotropismo.
Aunque aumentaba la neurovirulencia, la mutación en E279 parecía tener el efecto contrario sobre el viscerotropismo, según lo medido por la disminución de la viremia y la respuesta de los anticuerpos en los monos, marcadores aceptados de este rasgo vírico (Wang et al., J. Gen. Virol. 76:2749-2755, 1995).
Materiales y métodos
Virus
El desarrollo de la vacuna ChimeriVax™-JE comenzó con la clonación de una copia de ADNc del genoma completo de 11 kilobases del virus YF 17D (Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999). Para realizar esto, las secuencias genómicas de YF 17D se propagaron en dos plásmidos, que codifican las secuencias de YF de 1-2276 y 8279-10.861 (plásmido YF5'3'IV) y de 1373-8704 nucleótidos (nt) (plásmido YFM5.2), respectivamente. Se generaron moldes de ADNc de longitud completa mediante ligamiento de fragmentos de restricción apropiados derivados de estos plásmidos. Las secuencias de YF dentro de los plásmidos YF 5'3'IV e YFM5.2 se reemplazaron por las correspondientes secuencias de JE (SA14-14-2) pr-ME, dando como resultado la generación de los plásmidos YF5'3'IV/JE (prM-E') e YFM5.2/JE (E'-E). Estos plásmidos se sometieron secuencialmente a digestión con las endonucleasas de restricción Nhel y BspEI. Los fragmentos apropiados se ligaron con ADN ligasa de T4, el ADNc se sometió a digestión con la enzima Xhol para permitir la transcripción, y el ARN se produjo a partir de un promotor de Sp6. La transfección de células diploides de pulmón de feto de Macacus rhesus (FRhL) con a Rn de longitud completa, se realizó mediante electroporación. El virus que contenía sobrenadante se extrajo cuando se observó un efecto citopático (generalmente el día 3), se purificó mediante centrifugación a baja velocidad y se filtró en condiciones estériles a 0,22 pm. Como estabilizador se añadió una concentración final de suero bovino fetal (FBS, fetal bovine serum) al 50 % v/v. El virus se tituló mediante ensayo de placa en células Vero, como se ha descrito anteriormente (Lupberger et al., Vaccine 17:1869-1882, 1999). Se realizaron pases secuenciales del virus quimérico en células FRhL o Vero (Vero-PM, Aventis Pasteur, Marcy l'Etoile, Francia) a una multiplicidad de infección de aproximadamente 0,001. La vacuna comercial contra la fiebre amarilla 17D (YF-VAX®) se obtuvo en Aventis-Pasteur (anteriormente Pasteur-Merieux-Connaught), Swiftwater, PA.
Mutagénesis dirigida
El virus que contenía una inversión M et^Lys de un solo sitio en E279 se generó mediante mutagénesis dirigida por oligo como se describe (Arroyo et al., J. ViroL 75:934-942,2001). Resumiendo, como molde para la mutagénesis dirigida se utilizó un plásmido (pBS/JE SA14-14-2) que contenía la región del gen E de JE SA-14-14-2 de los nucleótidos 1108 a 2472 (Cecilia et al., Virology 181:70-77, 1991). La mutagénesis se realizó utilizando el kit de mutagénesis dirigida Transformer (Clontech, Palo Alto, CA) y los cebadores de oligonucleótidos sintetizados en Life Technologies (Grand Island, NY). Los plásmidos se secuenciaron en la región E para verificar que el único cambio fuera la mutación diseñada. A continuación, se subclonó una región que abarcaba la mutación en E279 del plásmido pBS/JE en pYFM5.2/JE SA14-14-2 (Cecilia et al., Virology 181:70-77, 1991) utilizando los sitios de restricción Nhel y EheI (Kas l). El ensamblaje del ADN de longitud completa y la transcripción de SP6 se realizaron como se ha descrito anteriormente; sin embargo, la transfección de ARN de células Vero se realizó utilizando Lipofectin (Gibco/BRL).
Secuenciación
Se aisló ARN de monocapas infectadas con Trizol® (Life Technologies). La retrotranscripción (transcripción inversa) se realizó con la retrotranscriptasa (RT) Superscript II y con un protocolo de RT largo (Life Technologies), seguido de tratamiento con RNasaH (Promega) y Pc R larga (XL PCR, Perkin-Elmer/ABI). La RT, la PCR y los cebadores de secuenciación se diseñaron utilizando la secuencia de la cepa YF17D (número de registro del GeneBank K02749) y la secuencia de la cepa JE-SA14-14-2 (número de registro del GeneBank D90195) como referencias. Los productos de la PCR se purificaron en gel (kit de extracción en gel Qiaquick de Qiagen) y se secuenciaron utilizando la mezcla de reacción de secuenciación Dye-Terminator dRhodamine (Perkin-Elmer/ABI). Las reacciones de secuenciación se analizaron en un analizador genético modelo 310 (Perkin-Elmer/ABI) y las secuencias de ADN se evaluaron utilizando el programa informático Sequencher 3.0 (Gene-Codes).
Ensayos en placa y pruebas de neutralización
Los ensayos en placa se realizaron en placas de 6 pocillos de cultivos en monocapa de células Vero. Después de la adsorción del virus durante 1 hora de incubación a 37 °C, las células se cubrieron con agarosa en medio nutritivo. El día 4, se añadió una segunda capa que contenía rojo neutro al 3 %. Las pruebas de neutralización por dilución de suero y reducción en placa se realizaron como se ha descrito anteriormente (Monath et al., Vaccine 17:1869-1882, 1999).
Modelo de ratón destetado
Grupos de 8 a 10 ratones hembra ICR de 4 semanas de vida (Taconic Farms, Inc. Germantown, N.Y.) se inocularon por vía i.c. con 30 |jl de las construcciones quiméricas YF/JE SA14-14-2 (ChimeriVax™-JE) con (dosis de 4,0 log-io UFP) o sin (3,1 log-io UFP) la mutación en E279. Se inoculó un mismo número de ratones con YF-VAX® o diluyente. Durante 21 días, se realizó un seguimiento de la dolencia y muerte de los ratones.
Modelo de ratón lactante
Se estudiaron ratonas ICR preñadas (Taconic Farms) hasta el parto para obtener camadas de ratones lactantes de edad precisa. Los ratones lactantes de varias camadas nacidos en un intervalo de 48 horas se agruparon y redistribuyeron aleatoriamente a las madres en grupos de hasta 121 ratones. Las camadas se inocularon por vía i.c. con 20 j l de diluciones en serie de factor 10 del virus y durante 21 días se realizó un seguimiento de los síntomas de la dolencia y muerte. Los inóculos de virus se retrotitularon. Los valores de dosis letal al 50 % (DL50) se calcularon mediante el método de Reed y Muench (Morris-Downes et al., Vaccine 19:3877-3884, 2001). Se representaron gráficamente las distribuciones de supervivencia univariantes y se compararon mediante la prueba de rango logarítmico.
Modelo en monos
La prueba de neurovirulencia en monos se realizó según lo descrito por Levenbook et al. (Levenbook et al., J. Biol. Stand. 15: 305-313, 1987) y lo proscrito por la normativa de la OMS para pruebas de seguridad de los virus de inóculo YF 17D (Wang et al., J. Gen. Virol. 76:2749-2755, 1995). Esta prueba se ha aplicado anteriormente a la evaluación de las vacunas ChimeriVax™-JE y se describieron los resultados de las pruebas con el virus en FRhL3 (Monath et al., Curr. Drugs-Infect Dis., 1:37-50; 2001; Monath et al., Vaccine 17:1869-1882,1999). Las pruebas se realizaron en Sierra Biomedical Inc. (Sparks, NV), de acuerdo con las normas de prácticas correctas de laboratorio (GLP, Good Laboratory Practice) de la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. (21 C.F.R., Parte 58). El día 1, diez Macacus rhesus (5 machos, 5 hembras) que pesaban entre 3,0 y 6,5 kg recibieron una sola inoculación de 0,25 ml de virus ChimeriVax™-JE sin diluir con o sin la mutación Met^-Lys en E279 o YF-VAX® en el lóbulo frontal del cerebro. Los signos clínicos de los monos se evaluaron diariamente y se puntuaron como 0 (sin signos), 1 (pelaje áspero, inapetente), 2 (voz aguda, inactivo, movimiento lento, 3 (movimientos temblorosos, temblores, falta de coordinación, debilidad de las extremidades) y 4 (incapacidad para mantenerse en pie, parálisis de las extremidades, muerte). La puntuación clínica de cada mono es la media de las puntuaciones diarias del animal, y la puntuación clínica del grupo de tratamiento es la media aritmética de las puntuaciones clínicas individuales. Los niveles de viremia se midieron mediante ensayo en placa en células Vero utilizando sueros recogidos los días 2-10. El día 31, los animales se sacrificaron, se perfundieron con solución salina isotónica y ácido ético al 5 % seguido de formol neutro y tamponado al 10 % y se realizaron necropsias. Los cerebros y las médulas espinales se fijaron, se seccionaron y se tiñeron con galocianina. La neurovirulencia se evaluó con respecto a la presencia y gravedad de lesiones en diversas formaciones anatómicas del sistema nervioso central. La gravedad se puntuó dentro de cada bloque de tejido utilizando la escala especificada por la OMS (Wang et al., J. Gen. Virol. 76:2749-2755, 1995):
Grado 1: Mínimo: 1-3 pequeños infiltrados inflamatorios focales. Algunas neuronas pueden cambiar o perderse. Grado 2: Moderado: infiltrados inflamatorios focales más extensos. Los cambios o pérdidas neuronales no afectan a más de un tercio de las neuronas.
Grado 3: Grave: los cambios o pérdidas neuronales afectan al 33-90 % de las neuronas; cambios inflamatorios focales o difusos moderados
Grado 4: Fulminante; más del 90 % de las neuronas se modifican o se pierden, con infiltración inflamatoria variable pero frecuentemente grave
Las estructuras involucradas en el proceso patológico con mayor frecuencia y con mayor gravedad se designaron como 'áreas diana', mientras que aquellas estructuras que discriminaban entre el virus JE de tipo silvestre y ChimeriVax™-JE se designaron como 'áreas discriminadoras'. La sustancia negra constituía el 'área diana' y el núcleo caudado, globo pálido, putamen, núcleo talámico anterior/medial, el núcleo talámico lateral y la médula espinal (agrandamientos cervicales y lumbares) constituyeron las 'áreas discriminadoras' (Monath et al., Curr. Drugs Infect Dis., 1:37-50, 2001), como se mostró anteriormente para YF 17D (Levenbook et al., J. Biol. Stand. 15:305-313, 1987). Todas las evaluaciones neuropatológicas fueron realizadas por un solo investigador experimentado que desconocía el código de tratamiento. Se determinaron las distintas puntuaciones para el área diana, las áreas discriminadoras y las áreas diana discriminadoras de cada mono, y se compararon los grupos de prueba con respecto a las puntuaciones promedio. También se examinaron otras áreas del tronco encefálico (núcleos del mesencéfalo además de la sustancia negra; la protuberancia, bulbo raquídeo y cerebelo) y la leptomeninge. Se realizaron comparaciones estadísticas de las puntuaciones neuropatológicas medias (para el área diana, las áreas discriminadoras y las áreas diana discriminadoras) con la prueba bilateral de la t de Student. Además del examen neuropatológico, el hígado, el bazo, las glándulas suprarrenales, el corazón y los riñones, se examinaron en busca de cambios patológicos mediante microscopía óptica.
Estabilidad del genoma
Para determinar la estabilidad genética del virus quimérico YF/JE y buscar 'puntos calientes' en el genoma de la vacuna que sean susceptibles a la mutación, se realizaron varios experimentos en los que se utilizó ARN para transfectar células y se realizaron pases seriados in vitro del virus descendiente, realizándose la secuenciación genómica parcial o completa a niveles de pases bajos y altos. Se realizaron pases seriados comenzando con la etapa de transfección en células FRhL o Vero-PM. Se realizaron pases seriados del virus a una MOI (multiplicidad de infección) baja en cultivos celulares cultivados en matraces T25 o T75. En los niveles de pases seleccionados, se extrajeron muestras por duplicado de ARN genómico vírico, se retrotranscribió, se amplificó por PCR y se determinó la región prM-E o la secuencia genómica completa.
Resultados
Generación de virus mutantes de sitio único mediante pases empíricos
El virus quimérico YF/JESA14-14-2 (ChimeriVax™-JE) recuperado de células FRhL transfectadas (FRhL-i), se pasó secuencialmente en cultivos líquidos de estas células a una MOI de aproximadamente 0,001. Como se describe a continuación, en el pase 4 se apreció un cambio en la morfología de la placa, que posteriormente se demostró que estaba asociado a una transversión T^-G en el nucleótido 1818 que resultaba en un cambio de aminoácido (Met^-Lys) en la posición 279 de la proteína E.
Las placas se caracterizaron a cada nivel de pase y se clasificaron en 3 categorías en función de sus tamaños medidos el día 6 (grande, G ~ > 1,0 mm, medio, M ~ 0,5-1 mm, y pequeño, P ~ <0,5 mm). La distribución del tamaño de las placas se determinó contando 100 placas. El virus en FRhL3 (3er pase) contenía un 80-94 % de placas G y un 6-20 % de placas P. En FRhLs (5.° pase), se detectó un cambio en el tamaño de la placa, comprendiendo la aparición de placas P >85 % de la población total de placas (Fig. 1). El virus en FRhL4 era intermedio, con un 40 % de placas grandes y un 60 % de placas pequeñas. La secuenciación genómica completa del virus en FRhLs demostró una sola mutación en E279. La secuencia consenso del genoma completo de la quimera FRhLs, con una inspección cuidadosa de la heterogeneidad de codones, confirmó que esta era la única mutación detectable presente en el virus. La secuencia consenso del genoma completo del virus en FRhL3 no reveló mutaciones detectables en comparación con el virus quimérico precursor YF/JESA14-14-2 (Arroyo et al., J. Virol. 75:934-942,2001) (Tabla 1).
Se escogieron diez placas grandes, medianas y pequeñas de FRhL3, -4 y -5, y se amplificaron a través de pases en cultivos líquidos de células FRhL. Tras la amplificación, al líquido sobrenadante se colocó en placas sobre células Vero. Los intentos de aislar el fenotipo de placa P de FRhL3 fracasaron y todas las placas aisladas de tamaño G o P produjeron una mayoría de placas G después de una ronda de amplificación en células FRhL. En el siguiente pase (FRhL4), donde el 60 % de las placas eran de tamaño pequeño, fue posible aislar estas placas por amplificación en células FRhL. En FRhLs, la mayoría de las placas (85-99 %) eran de tamaño pequeño, y la amplificación de las placas individuales G y P dio lugar a la mayoría de tamaño P. La secuenciación de los genes prM-E de los fenotipos de placa P y G de FRhL3 reveló secuencias idénticas a las de los genes precursores SA14-14-2 utilizados para la construcción de ChimeriVax™-JE, mientras que las placas P aisladas del virus en FRhL4 o en FRhLs reveló la mutación (Met^Lys) en E279.
Protocoles con animales
Todos los estudios en los que intervinieron ratones y primates no humanos se realizaron de acuerdo con la Ley de Bienestar Animal del USDA (9 C.F.R, Partes 1-3) como se describe en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
Virulencia de ratones destetados
Diez ratones hembra ICR de 4 semanas de vida se inocularon por vía i.c. con aproximadamente 3,0 log-10 UFP de virus en FRhL3, .4, o .5 en experimentos distintos; en cada estudio, 10 ratones recibieron una dosis equivalente (aproximadamente 3,3 log-10 UFP) de la vacuna comercial contra la fiebre amarilla (YF-VAX®, Aventis Pasteur, Swiftwater PA). Ninguno de los ratones inoculados con los virus quiméricos mostró síntomas de dolencia ni murió, mientras que el 70-100% de los ratones de control inoculados con YF-VAX® desarrollaron parálisis o murieron. En otro experimento, se inoculó a 8 ratones por vía i.c. con FRhLs (3,1 log-10 UFP) o con el retromutante E279 de un solo sitio y F/JE (4,0 log-10 UFP) y 9 ratones recibieron YF-VAX® (2,3 log-10 UFP). Ninguno de los ratones inoculados con las construcciones quiméricas enfermó, mientras que murieron 6/9 (67 %) de los ratones inoculados con YF-VAX®.
Virulencia en ratones lactantes
Se realizaron dos experimentos distintos en los que se inocularon por vía i.c. virus quiméricos YF/JESA14-14-2 con y sin la mutación E279 a dosis graduadas en ratones lactantes (Tabla 2). YF-VAX® se utilizó como control de referencia en estos experimentos. Se determinaron los valores de DL50 y el promedio de tiempos de supervivencia (PTS) de cada virus.
En el primer experimento, utilizando ratones de 8 , 6 días de vida, el virus en FRhL5, que contenía la inversión de un solo sitio (Met^-Lys) en E279, era neurovirulento, con un una DL50 logio de 1,64, mientras que el virus de FRhL3 que carecía de esta mutación, era casi avirulento, muriendo tan solo 1 de 10 ratones en los grupos que recibieron las dosis más altas (Tabla 2). A la dosis más alta (aproximadamente 3 logio UFP), el PTS del virus en FRhL5 fue más corto (10,3 días) que el del virus en FRhL3 (15 días).
Posteriormente se realizó un segundo experimento para verificar estadísticamente que una mutación en un solo sitio en el gen E era detectable mediante una prueba de neurovirulencia en ratones lactantes. En este experimento, ratones exogámicos de 4 días de vida, se inocularon por vía i.c. con dosis graduadas de ChimeriVax™-JE en FRhL3 (sin mutación), ChimeriVax™-JE en FRhL5(E279 Met^-Lys), o una quimera YF/JE en la que se introdujo una sola mutación (Met^-Lys) en E279 mediante mutagénesis dirigida (Arroyo et al, J. Virol. 75:934-942, 2001). Los valores de DL50 de los dos virus que contenían la mutación E279, fueron >de 10 veces más bajos que los de la construcción FRhL3 sin la mutación (Tabla 2), lo que indicaba que la mutación M et^Lys en E279 aumentaba la neurovirulencia del virus quimérico. Hubo diferencias estadísticamente significativas entre los virus en las distribuciones de supervivencia (Fig. 2) . A la dosis más baja (~ 0,7 log10 UFP), los virus quiméricos YF/JE fueron significativamente menos virulentos que YF-VAX® (rango logarítmico p<0.0001). Los virus con la mutación M et^Lys en E279 tenían curvas de supervivencia similares que diferían de las del virus en FRhL3 sin mutación, pero la diferencia no alcanzó significación estadística (rango logarítmico p=0.1216). Sin embargo, a dosis más altas (~1.7 y ~2.7 log10 UFC), las distribuciones de supervivencia de los virus mutantes en E279 fueron significativamente diferentes de las de los virus en FRhL3.
El análisis de la tasa de mortalidad por dosis de virus reveló pendientes y líneas de regresión paralelas similares (Fig. 3) . El virus en FRhL5 era 18.52 veces más potente (virulento) que en FRhL3 (intervalos de confianza del 95 % de 3.65 y 124.44, p<0.0001).
Prueba de neurovirulencia en monos
Ninguno de los 20 monos inoculados con el virus ChimeriVax™-JE FRhL3 o FRhL5 desarrollaron signos de encefalitis, mientras que 4/10 monos inoculados con YF-VAX® desarrollaron signos de grado 3 (temblores) entre los días 15 y 29, que se resolvió a los 6 días de aparecer. Las puntuaciones clínicas medias y máximas fueron significativamente más altas en el grupo de YF-VAX® que en los dos grupos de ChimeriVax™-JE. No hubo diferencias en la puntuación clínica entre los grupos que recibieron los virus ChimeriVax™-JE con y sin la mutación E279 (Tabla 3).
No hubo diferencias en los cambios de peso durante el experimento entre los grupos de tratamiento. El examen anatomopatológico no reveló alteraciones del hígado, bazo, riñón, corazón o glándulas suprarrenales atribuibles a los virus, y no hubo diferencias entre los grupos de tratamiento.
El examen histopatológico del cerebro y la médula espinal reveló puntuaciones de lesiones significativamente más altas en los monos inoculados con YF-VAX® en comparación con el virus ChimeriVax™-JE en FRhL3 y FRhL5 (Tabla 3). Las puntuaciones de área diana áreas discriminadoras combinadas (± DE) de YF-VAX® fueron 1.17 (± 0.47). Las puntuaciones de ChimeriVax™-JE en FRhL3 (E279 Met) y FRhL5 (E279 Lys) fueron de 0.29 (± 0.20), (p= 0.00014 frente a YF-VAX®) y de 0.54 (± 0.28), (p=0,00248 frente a YF-VAX®), respectivamente.
La puntuación de las áreas discriminatorias y la del área diana áreas discriminadoras combinadas de ChimeriVax™-JE en FRhLs que contenían la inversión M et^Lys en E279 fueron significativamente más altas que las puntuaciones correspondientes de ChimeriVax™-JE en FRhL3 (Tabla 3).
El síntoma principal en monos inoculados con YF-VAX® fue temblor, lo que puede reflejar lesiones de los núcleos cerebelosos, o globo pálido. No se encontraron lesiones histológicas claras en la corteza cerebelosa, en el núcleo dentado ni en otros núcleos cerebelosos, mientras que en todos los monos positivos, había lesiones inflamatorias en los núcleos talámicos y en el globo pálido.
Curiosamente, hubo una relación inversa entre la neurovirulencia y el viscerotropismo del retromutante E279, como lo refleja la viremia. La prueba de neurovirulencia en monos según la normativa de la OMS incluye la cuantificación de la viremia como una medida de viscerotropismo (World Health Organization, "Requirements for yellow fever vaccine", Requirements for Biological Substances N.° 3, revisado en 1995, WHO Tech. Rep. Ser. 872, Anexo 2, Ginebra: OMS, 31-68, 1998). Esto es razonable, basándose en observaciones de que la inoculación intracerebral da como resultado la diseminación inmediata de tejidos extraneuronales (Theiler, "The Virus", En Strode (ed.), Yellow Fever, McGraw Hill, Nueva York, Nueva York, 46-136, 1951). Después de la inoculación por vía i.c., 9 (90 %) de 10 monos inoculados con YF-VAX® y 8 (80%) de 10 monos inoculados con ChimeriVax™-JE en FRhL3 se volvieron virémicos. El nivel de viremia tendió a ser mayor en el grupo que recibió YF-VAX® en comparación con el grupo que recibió ChimeriVax™-JE en FRhL3, alcanzando significación el día 4. Por el contrario, solo 2 (20 %) de los animales que recibieron el virus en FRhLs (M et^Lys en E279) tuvieron viremias detectables de bajo nivel (Tabla 4), y la viremia media fue significativamente menor que la del virus en FRhL3 los días 3 y 4 (y casi significativa el día 5). Por tanto, el virus retromutante en FRhL5 mostró mayor neurovirulencia, pero disminuyó el viscerotropismo en comparación con el virus en FRhL3. Se examinaron sueros de monos inoculados con ChimeriVax™-JE en FRhL3 y FRhL5 para detectar la presencia de variantes de tamaño de placa. Solo se observaron placas G en sueros de monos inoculados con FRhL3,
mientras que el virus en sangre de monos inoculados con FRhLs tenía la morfología de una placa P apropiada.
Inmunogenicidad
Todos los monos de los tres grupos desarrollaron anticuerpos neutralizantes homólogos 31 días después de la inoculación contra la fiebre amarilla (grupo YF-VAX®) o ChimeriVax™-JE (grupos ChimeriVax™), con la excepción de 1 animal (FRhLs, RAK22F), que no se analizó debido a la pérdida de la muestra. Sin embargo, la media geométrica del título (GMT) de anticuerpos fue significativamente mayor en los monos inoculados con FRhL3 (GMT 501) que con FRhLs (GMT 169, p=0.0386, prueba de la t).
Estabilidad del genoma
Se realizaron dos transfecciones distintas del ARN de ChimeriVax™-JE en cada una de las dos cepas celulares, FRhL y Vero, y se realizaron pases del virus descendiente, como se muestra en la Fig. 4. El pase de serie B de FRhL dio lugar a la aparición de la inversión E279 en FRhL4, como se ha descrito anteriormente. Curiosamente, una serie de pases distintos (A) en células FRhL también dio lugar a la aparición de una mutación (Thr^-Lys) en un restosa adyacente en E281, y una de las series de pases en células Vero dio lugar a una mutación Val^-Lys en E271. Otras mutaciones seleccionadas en células Vero estaban en el dominio III o dentro del dominio transmembrana. Todos los virus que contenían las mutaciones mostradas en la Fig. 2 se evaluaron en la prueba de neurovirulencia en ratones adultos y se descubrió que no eran virulentos
II. Quimera de fiebre amarilla/dengue, incluida la mutación de la región bisagra
Sumario
El virus ChimeriVax™-DEN1 se produjo utilizando los genes prME de una cepa de tipo silvestre del virus del dengue 1 [(Puo359) aislada en 1980 en Tailandia] insertada en la cadena principal del virus de la fiebre amarilla (cepa 17D) (Guirakhoo et al., J. Virol. 75:7290-7304, 2001). Durante la producción de un virus de inóculo pre-maestro de ChimeriVax™-DEN1 en células Vero, un clon (clon E) que contenía un cambio mononucleotídico de A a G en la posición 1590, que dio lugar a una sustitución de aminoácidos de K a R en la posición 204 de la proteína de la envoltura E, se aisló y se purificó en placas. El virus presentó atenuación en ratones lactantes de 4 días de vida y produjo una viremia más baja (viscerotropismo) que la de su virus precursor (no mutante) cuando se inoculó por vía subcutánea en monos. Se seleccionó otro clon (clon J-2) sin mutación, se purificó en placas y se utilizó para producir una reserva de virus PMS en el pase 7 (P7). Este virus no sufrió ninguna mutación cuando se efectuaron pases, hasta el P10 en células Vero, en condiciones de laboratorio. Sin embargo, después de un pase en condiciones con GMPc para producir un virus de inóculo maestro (P8) a partir de la reserva de PMS, surgió la misma mutación en la posición 1590 (A a G). Similar al clon E, el virus P8 produjo placas más grandes que el virus P7 y se atenuó en ratones lactantes. La posición E204, que se conserva en todos los virus del dengue, puede por tanto manipularse en los virus ChimeriVax™-DEN (serotipos 1-4) para lograr un equilibrio entre la atenuación y la inmunogenicidad de las vacunas candidatas para humanos.
Resultados y análisis
Producción de inóculos pre-maestro de virus ChimeriVax-DENI
La producción de virus de inóculo pre-maestro (PMS, Pre-Master Seed) purificados en placas de DEN1 se llevó a cabo de la siguiente manera. La purificación en placas comenzó con el virus en el pasaje 2 (P2) posterior a la transfección de ARN. Se produjeron dos virus PMS (no clonados en P2 y clonados en P7) en células Aventis Vero LS10 en el pase 142 utilizando un banco de células cualificado obtenido de Aventis en el pase 140. Los virus clonados se obtuvieron después de 3 rondas de purificación en placas y se secuenciaron en todo el genoma para garantizar la ausencia de mutaciones. En general, si un clon contenía una sustitución de aminoácido, no se utilizaba como candidato al virus PMS. Se prepararon y secuenciaron otros clones hasta identificar un clon sin mutación, que después se sometió a purificación en placas y secuenciación.
Secuenciación
Para la secuenciación, el ARN vírico se extrajo de cada muestra de virus individual (generalmente 0,25 ml) utilizando TRIReagent LS (Molecular Research Center) o Trizol LS (un reactivo similar de Gibco) y se disolvió en 0,20 ml de agua sin RNasa. Después, el ARN extraído se utilizó como molde para la RT-PCR (PCR en tiempo real) El genoma completo se amplificó en cinco amplicones superpuestos de una longitud de ~ 2-3 kb (fragmentos I a V) con el kit Titan One-Tube de r T-PCR (Roche). Los fragmentos de RT-PCR se purificaron con el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) o se purificaron en gel de agarosa con el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen). Las reacciones de secuenciación se realizaron utilizando el kit de secuenciación de ciclos CEQ Dye Terminator (Beckman) y un conjunto de cebadores de oligonucleótidos específicos de YF de orientación tanto positiva como negativa para leer ambas cadenas de los amplicones. Los productos de la reacción de secuenciación se purificaron con el kit DyeEx Spin (Qiagen) y se resolvieron con un secuenciador automático CEQ2000 (Beckman Coulter). Los datos de secuenciación
generados se alinearon y analizaron con el programa informático Sequencher 3.0 (GeneCodes). Las heterogeneidades de los nucleótidos solo se registraron cuando se observaba una señal heterogénea en todos los cromatogramas que representaban las reacciones de secuenciación de la cadena positiva y negativa.
Como se muestra en la Tabla 5, el virus de P2 no clonado no tenía ninguna mutación, pero adquirió 5 mutaciones de aminoácidos (heterogeneidad) dentro de la proteína de la envoltura E de P5. Curiosamente, la única mutación que era estable (seleccionada adicionalmente) en P15 era la mutación 204. Un experimento de pases repetidos a partir del virus de P2 no clonado (hasta P15) reveló que la misma mutación (K a R) en la posición E204 que se seleccionó en células Vero.
Se seleccionaron diferentes clones de ChimeriVax-DEN1 (A-J) mediante purificación directa placa a placa y se secuenciaron en varias fases para identificar mutaciones. La mutación más frecuente fue la sustitución E251 (V>F), que se produjo en los clones A, B, D y G seguida de E204 (K>R), que se encontró en los clones E y F, así como en virus no clonados. La mutación en E311 (E>D) solo se encontró en los clones C y D. Curiosamente, el clon J estaba exento de mutaciones hasta el P10. Sin embargo, cuando se produjo un inóculo maestro (MS, Master Seed) de este virus producido a partir de P7 (PMS) fabricado con GMPc, reapareció la misma sustitución en E204 (solo después de 1 pase). Esta mutación fue estable cuando se secuenció el virus en P20 (Tabla 5). Los clones que contenían la mutación E204 produjeron placas más grandes (~2 mm de diámetro) que los virus no mutantes (~1 mm de diámetro) (Tabla 9). La construcción original de este virus en Vero P4 (anteriormente demostrado que produce un bajo nivel de viremia en monos) también contenía la misma mutación E204 (Guirakhoo et al., J. Virol. 75:7290-7304, 2001). El papel de esta mutación en la biología del virus no podía entenderse anteriormente porque: a) la construcción original contenía una mutación adicional (nucleótido A a G que causaba un cambio de aminoácido de H a R) en M39 además de la mutación E204; b) la neurovirulencia de la construcción original se evaluó solo en ratones de 3-4 semanas de vida, que no son lo suficientemente sensibles para revelar la atenuación del virus ChimeriVax-DEN1 o cualquier otro virus ChimeriVax™-DEN (Guirakhoo et al., J. Virol. 75:7290-7304, 2001); y c) no se disponía de ningún virus ChimeriVax™-DEN1 (sin mutación) para comparar y determinar los cambios en el fenotipo de neurovirulencia o viscerotropismo del virus.
Dado que los virus quiméricos se atenuaban en ratones de 3 a 4 semanas de vida, se desarrolló una prueba más sensible (utilizando ratones lactantes de 4 a 8 días de vida) para probar diferencias sutiles en la neurovirulencia de diferentes clones.
Neurovirulencia en ratón
La prueba de neurovirulencia en ratones, utilizando ratones de 3-4 semanas de vida, se realiza como una prueba de liberación para garantizar que la neurovirulencia de las quimeras no exceda la del vector del virus (YF-VAX®) utilizado para construir los virus ChimeriVax™. Dado que todas las quimeras construidas hasta ahora (con o sin mutaciones) no son virulentas para ratones adultos (3-4 semanas de vida), estos animales no pueden utilizarse para identificar cambios sutiles en la neurovirulencia de quimeras asociadas a sustituciones de un solo aminoácido. Por el contrario, los ratones lactantes de 4 a 10 días de vida son más sensibles a pequeños cambios en el genoma de las quimeras, que intervienen en la virulencia. Durante el desarrollo de los virus ChimeriVax™-DEN, se observaron varias mutaciones en el genoma de las 4 quimeras (Guirakhoo et al., J. Virol. 75:7290-7304, 2001). Estas mutaciones se corrigieron en todas las quimeras, y los virus reconstruidos (excepto las quimeras DEN1) se evaluaron con éxito en cuanto a seguridad e inmunogenicidad en monos. Debido a la inestabilidad de los plásmidos DEN1, la reconstrucción de esta quimera (sin mutación) no se logró a tiempo y, por lo tanto, no pudo probarse en monos. Durante la purificación en placas para producir un PMS para la quimera DEN1, se secuenciaron 10 clones diferentes (A-J) para identificar un clon sin mutaciones (Tabla 5). Todos menos un clon (J) contenían 1 o 2 mutaciones dentro de la proteína de la envoltura E. Se evaluó la neurovirulencia de clones representativos de quimeras DEN1 utilizando ratones lactantes de 4 días (Tabla 6). Los animales se inocularon por vía i.c. con dos diluciones de 0,02 ml sin diluir, 1:10 o 1:100, de cada virus DEN1 quimérico y se observaron durante 21 días. Las dosis reales se determinaron mediante retrotitulación (titulación por retroceso) de los inóculos en un ensayo en placas. Como se muestra en la Tabla 6, todos los clones, excepto el clon E, presentaron una neurovirulencia similar en ratones de 4 días de vida con un promedio de tiempos de supervivencia (PTS) significativamente más bajos que los de YF-VAX® (p<0,001 utilizando el programa informático JMP, Versión 4.0.2). El clon E (E204K>R) fue significativamente menos virulento en comparación con todos los otros clones DEN1 (p<0,0001). Curiosamente, una de las 2 mutaciones identificadas en la quimera DEN1 original fue la sustitución E204 K>R. Este virus indujo un bajo nivel de viremia (título máximo medio 0,7 log-10 UFP/ml) durante 1,3 días cuando se inoculó en monos (Girakhoo et al., J. Virol. 75:7290-7304,2001). El clon J, que no contenía ninguna mutación y demostró ser significativamente menos virulento que YF-VAX® en ratones de 4 días de vida, P=0,001, se seleccionó para la producción del virus MS con GMPc.
Seguridad e inmunogenicidad (viremia y respuestas de anticuerpos neutralizantes) de virus quiméricos DEN1 en monos
El efecto de la mutación E204 sobre el viscerotropismo (viremia) del virus se evaluó mediante la inoculación de monos con virus ChimeriVax-DEN1 con (clon E, P6) o sin (clon J, P7) la mutación E204. Como control se seleccionó la quimera DEN1 original (ChimeriVax-DEN-1, P4 no clonado,1999, Grupo 1), porque sus perfiles de viremia e
inmunogenicidad ya se habían evaluado en monos como una vacuna monovalente o tetravalente (combinada con otras 3 quimeras) (Guirakhoo et al., J. Virol. 75:7290-7304,2001).
Se inocularon grupos de 4 Macacus rhesus con 5 log-iü UFP/0,5 ml de quimeras DEN1 (Tabla 7). Se midió la viremia (mediante ensayo en placas en células Vero) en sueros obtenidos del día 2 al día 11 después de la infección. Todos los monos inoculados con el virus DEN1 PMS (Grupo 3) se volvieron virémicos, mientras que 3/4 y 2/4 monos inoculados con el clon E o con virus no clonados, respectivamente, se volvieron virémicos (Tabla 8). El título máximo medio del virus (2,5 logi0 UFP/ml) y la duración (8,5 días) de la viremia en los monos del Grupo 3 (DEN1 PMS) fue significativamente mayor (p= 0,024 y 0,0002 para el título máximo del virus y la duración, respectivamente) en comparación con los Grupos 1 y 2. A pesar de la ausencia de viremia en algunos monos, todos los animales desarrollaron títulos de anticuerpos neutralizantes contra virus homólogos. Para ensayos de neutralización, los sueros de cada grupo de monos se termoinactivaron y se mezclaron con el virus homólogo (el mismo virus que se había utilizado para la inoculación de los animales en cada grupo). En consonancia con el nivel de viremia, los títulos neutralizantes en monos inmunizados con el virus PMS (sin mutación) fueron superiores en comparación con los otros 2 grupos (p= 0,0002). Los sueros de los monos del Grupo 1 (inmunizados con una quimera DEN1 con 2 mutaciones en las proteínas de la envoltura, prM y E) revelaron los títulos neutralizantes más bajos (Tabla 9), lo que indica que la mutación M39 puede haber atenuado aún más el virus (p=0,0045). Estos experimentos demostraron que podría haber una correlación directa para los virus ChimeriVax™-DEN entre 1) la magnitud de la viremia y el nivel de anticuerpos neutralizantes en monos, y 2) la neurovirulencia de la quimera para el ratón y la viremia/inmunogenicidad en monos (el clon E se atenuó en ratones de 4 días de vida e indujo un nivel más bajo de viremia y de anticuerpos neutralizantes en comparación con el virus PMS, que era neurovirulento en ratones de edad similar).
Resumiendo, la mutación en el resto E204 de ChimeriVax™-DEN1 controla la replicación de la quimera DEN1 en hospedadores vertebrados, como lo muestran las respuestas de viremia y neutralizantes. La mutación de este resto, que se conserva en todos los serotipos del dengue (Tabla 10), puede utilizarse por tanto en la construcción de quimeras con los fenotipos deseados apropiados para la vacuna contra el dengue humano.
Tabla 1. Comparación de las diferencias de aminoácidos en la proteína E del virus ChimeriVax™-JE en FRhL3 y ChimeriVax™-JE en FRhLs con secuencias publicadas de la vacuna JE SA14-14-2, cepas JE de tipo silvestre, sA 14 precursor y virus Nakayama. Los genomas completos de los virus de ChimeriVax™-JE en FRhL3 y FRhLs se ___________________ secuenciaron y la mutación en E279 fue la única diferencia encontrada.___________________ Virus E E E E E E E E E E
107 138 176 177 227 244 264 279 315 439 ChimeriVax™-JE
FRhL3 E279 Met F K V A S G H M V R ChimeriVax™-JE
FRhLs E279 Lys F K V A S G H K V R JE SA14-14-2
PDK1 F K V T S G Q M V R 107 138 176 177 227 244 264 279 315 439
1Nitayaphan S. et al. 1990. Virology 177:541-552
2Ni H. et al. 1994. J. Gen. Virol. 75:1505-1510; PDK=células primarias de riñón de perro 3 Aihara S. et al. 1991. Virus Genes 5: 95-109; PHK= células primarias del riñón de hámster
4 McAda P. et al. 1987. Virology 158:348-360
Tabla 2. Neurovirulencia en ratones lactantes de virus ChimeriVax™-JE con y sin mutación en E279 y vacuna YF
17D
continuación
Tabla 3. Evaluación neuropatológica, monos inoculados por vía i.c. con ChimeriVax™-JE en FRhL3, FRhL5 o con la _______vacuna contra la fiebre amarilla 17D (YF-VAX®) y con necropsia 30 días después de la inoculación.______ Virus de Mono Sexo Dosis1 Puntuación Puntuación histopatológica media individual prueba log10 clínica2 y grupal
UFP Puntuación
/0,25 máxima/ Área Áreas Áreas Diana ml ntuación diana3 discriminadoras Discriminadoras ria me 4
YF-VAX® RT702M M 4,05 1/0 2,00 0,51 1,26
Connaught RT758M M 4,28 1/0 0,25 0,01 0,13 Lote n.° 0986400 RT653M M 4,07 1/0 2,00 0,39 1,20
RT776M M 4,25 3/1 2,00 1,29 1,65 RT621M M 4,34 3/2 1,00 0,46 0,73 RAH80F H 4,14 3/1 1,50 0,71 1,10 RAL02F H 4,13 1/1 2,00 0,80 1,40 RT698F H 3,78 3/1 1,50 0,64 1,07 RAI12F H 4,11 1/1 2,00 1,45 1,73 RP942F H 4,05 1/0 2,00 0,81 1,41 Media 4,12 1 1,63 0,71 1,17 DT 0,16 1 0,59 0,42 0,47
ChimeriVax™ RT452M M 3,55 1/0 0,50 0,08 0,29 -JE, FRhLa RR257M M 3,52 1/0 1,00 0,14 0,57 Lote n.° I031299A RT834M M 3,71 1/0 0,50 0,38 0,44
RT620M M 3,71 1/0 1,00 0,14 0,57 RT288M 
M 
3,76 
1/0 
0,50 
0,19 
0,35
(continuación)
Virus de Mono Sexo Dosis1 Puntuación Puntuación histopatológica media individual prueba logio clínica2 y grupal
UFP Puntuaci
/0,25 áxim Área Áreas Áreas Diana ml ntuaci diana3 discriminadoras Discriminadoras 
ia me 4
RAJ9BF H 3,79 1/1 0,00 0,11 0,05 RAR08F H 3,52 1/0 0,00 0,13 0,07 RV481F H 3,52 1/0 0,00 0,06 0,03 RT841F H 3,71 1/0 0,50 0,05 0,28 RT392F H 3,76 1/0 0,50 0,07 0,29 Media 
3,66 0 0,45 0,14 0,29 DT 0,11 0 0,37 0,10 0,20
Valor de p (prueba de la t5) frente a YF-VAX® 37/0,0 0,00008 0,00191 0,00014
ChimeriVax™ RT62BM M 4,20 1/0 0,50 0,57 0,54 -JE, FRhLs RT678M M 4,19 1/0 1,00 0,12 0,60 Lote n ° 99801 RT581M M 4,17 1/0 1,00 0,46 0,73
RR726M M 4,32 1/0 1,00 0,66 0,83 RR725M M NR5 1/0 1,00 0,33 0,67 RAJ55F H 4,27 0/0 1,00 0,14 0,57 RT769F H 4,44 1/0 1,00 0,58 0,79 RAK22F H 4,24 1/0 0,00 0,12 0,06 RT207F H 4,49 1/1 1,00 0,22 0,61 RT490F H 4,34 1/0 0,00 0,04 0,02 Media 4,30 0 0,75 0,32 0,54 DT 0,11 0 0,42 0,23 0,28
Valor de p (prueba de la t) frente a YF-VAX® 24/0,0 0,00154 0,02436 0,00248
Valor de p (prueba de la t) frente a 43/1, 0,10942 0,03223 0,03656 ChimeriVax™-JE en FRhL3 
1 Retrotitulación
2 Puntuación clínica: 0= sin signos; 1=pelaje áspero, inapetente; 2= voz aguda, Inactivo, movimiento lento; 3= temblor, falta de coordinación,
movimientos temblorosos, debilidad de las extremidades; 4= incapacidad para mantenerse en pie, parálisis, moribundo, o muerto. Se muestra la puntuación máxima en cualquier día y la puntuación media durante el período de observación de 30 días.
3 Sustancia negra
4 Cuerpo estriado y tálamo, lado derecho e izquierdo (N. caudado, globo pálido, putamen, N. ant/lat. tálamo, N. lat. tálamo; agrandamientos cervical y lumbar de la médula espinal (6 niveles) 5 Prueba de la t de Student, bilateral, heteroscedástica, que compara los virus YF-VAX® y ChimeriVax™-JE.
6 No realizado
Tabla 4. Viremia, Macacus rhesus inoculados por vía i.c. con virus FRHL3 y FRHL5 YF-VAX® o con ChimeriVax™-JE ara la dosis inoculada véase la Tabla 3
continuación
Tabla 5. Secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de clones no clonados y de varios clones de virus ChimeriVax-DEN1 ili n i in vir n V r .
(continuación)
Tabla 6. Neurovirulencia de diferentes clones de virus DEN1 uiméricos en ratones lactantes de 4 días de vida.
Tabla 7. Estudio de inmunogenicidad en Macacus rhesus, Virus ChimeriVax™-DEN1, Estudio Sierra Biomedical, no cumple con las GLP (prácticas correctas de laboratorio)
T l . Vir mi n m n inm niz n l i F .. if r n l n vir him riV x-DEN1
Tabla 9. Viremia y títulos de anticuerpos neutralizantes (50 %) en monos inmunizados con 5 log10 UFC (s.c.) de diferentes clones de virus ChimeriVax-DEN1
T l 1. P i i n 24 r n r ín E him riV x™-DEN1-4
___
Claims (12)
1. Un flavivirus que es:
un virus del dengue-1, un virus del dengue-2 o un virus del dengue-4; o
un virus quimérico del dengue-1, del dengue-2 o del dengue-4, que comprende un primer flavivirus en el que las proteínas de la membrana y de la envoltura del primer flavivirus se han reemplazado por las proteínas de la membrana y de la envoltura de un virus del dengue-1, un virus del dengue-2 o un virus del dengue-4 respectivamente;
en donde el flavivirus comprende una sustitución de lisina por arginina en la posición 204 de la proteína de la envoltura del virus del dengue, para su uso en un ser humano en la inducción de una respuesta inmunitaria contra dicho flavivirus.
2. Un flavivirus que es:
un virus del dengue-1, un virus del dengue-2 o un virus del dengue-4; o
un virus quimérico del dengue-1, del dengue-2 o del dengue-4, que comprende un primer flavivirus en el que las proteínas de la membrana y de la envoltura del primer flavivirus se han reemplazado por las proteínas de la membrana y de la envoltura de un virus del dengue-1, un virus del dengue-2 o un virus del dengue-4 respectivamente;
en donde el flavivirus comprende una sustitución de lisina por arginina en la posición 204 de la proteína de la envoltura del virus del dengue, para su uso en el tratamiento o la prevención de infección por flavivirus en un ser humano en riesgo de infección.
3. Un flavivirus para su uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que es un virus del dengue-1 o un virus quimérico del dengue-1 que comprende un primer flavivirus en el que las proteínas de la membrana y de la envoltura del primer flavivirus se han reemplazado por las proteínas de la membrana y de la envoltura de un virus del dengue-1.
4. Un flavivirus que es:
un virus del dengue-3; o
un virus quimérico del dengue-3 que comprende un primer flavivirus en el que las proteínas de la membrana y de la envoltura del primer flavivirus se han reemplazado por las proteínas de la membrana y de la envoltura de un virus del dengue-3;
en donde el flavivirus comprende una sustitución de lisina por arginina en la posición 202 de la proteína de la envoltura del virus del dengue, para su uso en un ser humano en la inducción de una respuesta inmunitaria contra dicho flavivirus.
5. Un flavivirus que es:
un virus del dengue-3; o
un virus quimérico del dengue-3 que comprende un primer flavivirus en el que las proteínas de la membrana y de la envoltura del primer flavivirus se han reemplazado por las proteínas de la membrana y de la envoltura de un virus del dengue-3;
en donde el flavivirus comprende una sustitución de lisina por arginina en la posición 202 de la proteína de la envoltura del virus del dengue, para su uso en el tratamiento o la prevención de infección por flavivirus en un ser humano en riesgo de infección.
6. Un flavivirus para su uso según en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde en el contexto de dicho uso, dicho flavivirus tiene un viscerotropismo disminuido en relación con un flavivirus correspondiente que carece de la mutación.
7. Una composición de vacuna que comprende:
i) un flavivirus que es:
a) un virus del dengue-1, un virus del dengue-2 o un virus del dengue-4; o
b) un virus quimérico del dengue-1, del dengue-2 o del dengue-4, que comprende un primer flavivirus en el que las proteínas de la membrana y de la envoltura del primer flavivirus se han reemplazado por las proteínas de la membrana y de la envoltura de un virus del dengue-1, un virus del dengue-2 o un virus del dengue-4 respectivamente;
en donde el flavivirus comprende una sustitución de lisina por arginina en la posición 204 de la proteína de la envoltura del virus del dengue;
o
ii) un flavivirus que es:
a) un virus del dengue-3; o
b) un virus quimérico del dengue-3 que comprende un primer flavivirus en el que las proteínas de la membrana y de la envoltura del primer flavivirus se han reemplazado por las proteínas de la membrana y de la envoltura de un virus del dengue-3;
en donde el flavivirus comprende una sustitución de lisina por arginina en la posición 202 de la proteína de la envoltura del virus del dengue;
y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable;
para su uso en un ser humano en la inducción de una respuesta inmunitaria contra dicho flavivirus.
8. Una composición de vacuna que comprende:
i) un flavivirus que es:
a) un virus del dengue-1, un virus del dengue-2 o un virus del dengue-4; o
b) un virus quimérico del dengue-1, del dengue-2 o del dengue-4, que comprende un primer flavivirus en el que las proteínas de la membrana y de la envoltura del primer flavivirus se han reemplazado por las proteínas de la membrana y de la envoltura de un virus del dengue-1, un virus del dengue-2 o un virus del dengue-4 respectivamente;
en donde el flavivirus comprende una sustitución de lisina por arginina en la posición 204 de la proteína de la envoltura del virus del dengue;
o
ii) un flavivirus que es:
a) un virus del dengue-3; o
b) un virus quimérico del dengue-3 que comprende un primer flavivirus en el que las proteínas de la membrana y de la envoltura del primer flavivirus se han reemplazado por las proteínas de la membrana y de la envoltura de un virus del dengue-3; en donde el flavivirus comprende una sustitución de lisina por arginina en la posición 202 de la proteína de la envoltura del virus del dengue;
y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable;
para su uso en el tratamiento o la prevención de infección por flavivirus en un ser humano en riesgo de infección.
9. Un proceso para reducir el viscerotropismo de un flavivirus que es un virus del dengue o un virus quimérico que comprende un primer flavivirus en el que las proteínas de la membrana y de la envoltura del primer flavivirus se han reemplazado por las proteínas de la membrana y de la envoltura de un virus del dengue; comprendiendo el proceso la sustitución de lisina por arginina
(i) en la posición 204 de una proteína de la envoltura del virus del dengue-1, de una proteína de la envoltura del virus del dengue-2 o de una proteína de la envoltura del virus del dengue-4, o
(ii) en la posición 202 de una proteína de la envoltura del virus del dengue-3.
10. El proceso según la reivindicación 9, en donde el flavivirus es un virus del dengue-1 o un virus quimérico que comprende un primer flavivirus en el que las proteínas de la membrana y de la envoltura del primer flavivirus se han reemplazado por las proteínas de la membrana y de la envoltura de un virus del dengue-1 y en donde el proceso comprende la sustitución de lisina por arginina en la posición 204 de la proteína de la envoltura del virus del dengue-1.
11. El proceso según la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en donde el proceso comprende además formular el flavivirus en una composición de vacuna que comprende dicho flavivirus y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
12. El proceso de la reivindicación 11, en donde dicha composición de vacuna es una composición de vacuna tetravalente que comprende un virus del dengue-1 o un virus quimérico del mismo, un virus del dengue-2 o un virus quimérico del mismo, un virus del dengue-3 o un virus quimérico del mismo y un virus del dengue-4 o un virus quimérico del mismo,
en donde dicho virus quimérico del dengue-1 comprende un primer flavivirus en el que las proteínas de la membrana y de la envoltura del primer flavivirus se han reemplazado por las proteínas de la membrana y de la envoltura de un virus del dengue-1;
en donde dicho virus quimérico del dengue-2 comprende un primer flavivirus en el que las proteínas de la membrana y de la envoltura del primer flavivirus se han reemplazado por las proteínas de la membrana y de la envoltura de un virus del dengue-2
en donde dicho virus quimérico del dengue-3 comprende un primer flavivirus en el que las proteínas de la membrana y de la envoltura del primer flavivirus se han reemplazado por las proteínas de la membrana y de la
envoltura de un virus del dengue-3;
en donde dicho virus quimérico del dengue-4 comprende un primer flavivirus en el que las proteínas de la membrana y de la envoltura del primer flavivirus se han reemplazado por las proteínas de la membrana y de la envoltura de un virus del dengue-4 y en donde cualquiera o todos de dichos virus dentro de la composición de la vacuna tetravalente pueden incluir una sustitución como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 4.
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