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ES2920373T3 - Activación de fármaco bioortogonal - Google Patents

Activación de fármaco bioortogonal Download PDF

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ES2920373T3
ES2920373T3 ES12725515T ES12725515T ES2920373T3 ES 2920373 T3 ES2920373 T3 ES 2920373T3 ES 12725515 T ES12725515 T ES 12725515T ES 12725515 T ES12725515 T ES 12725515T ES 2920373 T3 ES2920373 T3 ES 2920373T3
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ES
Spain
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alkyl
aryl
independently
drug
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Active
Application number
ES12725515T
Other languages
English (en)
Inventor
Marc Robillard
Henricus Janssen
Hoeve Wolter Ten
Ronny Versteegen
Raffaella Rossin
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Tagworks Pharmaceuticals BV
Original Assignee
Tagworks Pharmaceuticals BV
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Publication date
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Abstract

La invención se refiere a un método de activación de profármaco, para la terapéutica, en la que el uso está hecho de grupos químicos reactivos abióticos que exhiben reactividad bio-ortogonal entre sí. La invención también se relaciona con un kit de profármaco que comprende al menos un profármaco y al menos un activador, en el que el profármaco comprende un fármaco y un primer grupo reactivo bio-ortogonal (el desencadenante), y en el que el activador comprende un segundo grupo reactivo bio-ortogonal. La invención también se relaciona con las terapias dirigidas utilizadas en el método y el kit mencionado anteriormente. La invención se refiere particularmente a los conjugados de anticuerpos y a los derivados de anticuerpos bi y trispecíficos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Activación de fármaco bioortogonal
Campo de la invención
La invención se refiere a métodos terapéuticos basados en fármacos inactivados, tales como profármacos, que se activan mediante una reacción química bioortogonal abiótica. La invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier tema que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con fines informativos.
Antecedentes de la invención
En el ámbito médico, es bien conocido el uso de compuestos inactivos tales como profármacos que se activan en un sitio específico del cuerpo humano o animal. También se ha estudiado ampliamente la administración dirigida de compuestos inactivos tales como profármacos. Se ha dedicado mucho esfuerzo a los sistemas de administración de fármacos que realizan la selectividad de liberación del fármaco en un sitio objetivo y/o en un momento deseado en el tiempo. Una forma es activar selectivamente un profármaco (sistémico) específicamente por actividad enzimática local y específica. Sin embargo, en muchos casos, un sitio objetivo de interés carece de una enzima sobreexpresada adecuada. Una alternativa es transportar una enzima al tejido objetivo a través de una técnica llamada terapia con profármacos enzimáticos dirigidos por anticuerpos (ADEPT). En este enfoque, una enzima se dirige al sitio del tumor por conjugación con un anticuerpo que se une a un antígeno asociado al tumor. Después de la administración sistémica del conjugado, su localización en el objetivo y la eliminación del conjugado no enlazado, se administra sistémicamente y se activa localmente un profármaco diseñado. Este método requiere la catálisis de una reacción que no debe ser realizada por una enzima endógena. Es probable que las enzimas de origen no mamífero que satisfacen estas necesidades sean altamente inmunogénicas, un hecho que hace imposible la administración repetida. Alternativamente, los profármacos pueden dirigirse a un sitio de la enfermedad seguido de procesos de activación endógena específicos o no específicos de la enfermedad (por ejemplo, pH, enzimas, compuestos que contienen tiol).
Los tratamientos anticancerígenos dirigidos están diseñados para reducir las toxicidades inespecíficas y aumentar la eficacia en relación con la quimioterapia convencional contra el cáncer. Este enfoque está representado por la poderosa capacidad de direccionamiento de los anticuerpos monoclonales (mAb) para administrar específicamente terapias de moléculas pequeñas conjugadas altamente potentes a una célula cancerosa. En un intento por abordar el problema de la toxicidad, los agentes quimioterapéuticos (fármacos) se han acoplado a moléculas de direccionamiento tales como anticuerpos o ligandos de receptores de proteínas que se unen con un alto grado de especificidad a la célula tumoral para formar compuestos denominados conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) o inmunoconjugados. En teoría, los inmunoconjugados deberían ser menos tóxicos porque dirigen el fármaco citotóxico a los tumores que expresan el antígeno o receptor de la superficie celular en particular. Esta estrategia ha tenido un éxito limitado en parte porque los fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con anticuerpos grandes o ligandos de receptores de proteínas. Los avances prometedores con inmunoconjugados han visto fármacos citotóxicos enlazados a anticuerpos a través de un enlazador que se escinde en el sitio del tumor o dentro de las células tumorales (Senter et al., Current Opinion in Chemical Biology 2010, 14: 529-537). Idealmente, el mAb se unirá específicamente a un antígeno con expresión sustancial en células tumorales pero expresión limitada en tejidos normales. La especificidad permite la utilización de fármacos que de otro modo serían demasiado tóxicos para su aplicación clínica. La mayor parte del trabajo reciente en este campo se ha centrado en el uso de agentes citotóxicos muy potentes. Esto requiere el desarrollo de tecnologías de enlace que proporcionen estabilidad condicional, de modo que la liberación del fármaco se produzca después de la unión al tumor, en lugar de en la circulación.
Como conjugado, el fármaco es inactivo, pero tras la localización del objetivo, el fármaco se libera, por ejemplo, por el pH o una enzima, que podría ser específica del objetivo, pero también puede ser más genérica. La liberación del fármaco puede lograrse mediante un mecanismo extracelular, tal como un pH bajo en el tejido tumoral, hipoxia, ciertas enzimas, pero en general, puede lograrse una liberación del fármaco más selectiva a través de mecanismos de liberación intracelulares, principalmente lisosomales (p. ej., glutatión, proteasas, catabolismo) que requieren el conjugado de anticuerpo que se internalizará primero. Los mecanismos de liberación intracelular específicos (p. ej., glutatión, catepsina) normalmente dan como resultado el fármaco original, que dependiendo de sus propiedades, puede escapar de la célula y atacar a las células vecinas. Esto se considera un mecanismo de acción importante para una variedad de conjugados de anticuerpo-fármaco, especialmente en tumores con expresión de receptor heterogénea o con poca penetración de mAb. Ejemplos de enlazadores escindibles son: hidrazonas (lábiles a los ácidos), enlazadores peptídicos (escindibles con catepsina B), fracciones impedidas por disulfuro (escindibles con tiol). También se pueden usar enlazadores no escindibles en conjugados de mAb-fármaco. Estas construcciones liberan su fármaco tras el catabolismo, lo que presumiblemente da como resultado una molécula de fármaco aún unida a un aminoácido. Solo un subconjunto de fármacos recuperará su actividad como tal conjugado. Además, estos fármacos ligados a aminoácidos no pueden escapar de las células. No obstante, dado que el enlazador es estable, estas construcciones generalmente se consideran las más seguras y, de acuerdo con el fármaco y el objetivo, pueden ser muy eficaces.
Las estrategias actuales de liberación de conjugados de anticuerpo-fármaco tienen sus limitaciones. Los mecanismos extracelulares de liberación del fármaco suelen ser demasiado inespecíficos (como ocurre con los enlazadores sensibles al pH), lo que da lugar a toxicidad. La liberación intracelular depende de la eficiencia (p. ej., la intemalización mediada por el receptor) del mAb-fármaco, mientras que varios cánceres carecen de objetivos de internalización eficientes y específicas del cáncer que estén presentes en un número de copias suficientemente alto. La liberación intracelular puede depender además de la presencia de una enzima desencadenadora (proteasas) o moléculas (tioles como el glutatión) en una cantidad suficientemente alta. Después de la liberación intracelular, el fármaco puede, en ciertos casos, escapar de la célula para dirigirse a las células vecinas. Este efecto se considera ventajoso en tumores heterogéneos donde no todas las células expresan cantidades suficientemente altas del receptor objetivo. Es de mayor importancia en tumores que son difíciles de penetrar debido, por ejemplo, a la presión intersticial elevada, que impide el flujo de convección. Esto es especialmente un problema para construcciones grandes como mAb (conjugados). Este mecanismo también es esencial en los casos donde se produce una barrera en el sitio de unión. Una vez que un agente de direccionamiento sale de la vasculatura y se une a un receptor, se restringirá su movimiento dentro del tumor. La probabilidad de que un conjugado de mAb esté restringido en el espacio perivascular escala con su afinidad por su objetivo. La penetración se puede mejorar aumentando la dosis de mAb, sin embargo, este enfoque está limitado por la toxicidad limitante de la dosis en, por ejemplo, el hígado. Además, los antígenos que se desprenden de las células moribundas pueden estar presentes en el espacio intersticial del tumor donde pueden evitar que los conjugados de mAb se unan a su célula objetivo. Además, muchos objetivos se ven obstaculizados por una internalización ineficaz y diferentes fármacos no pueden enlazarse a un mAb de la misma manera. Además, se ha demostrado que es engorroso diseñar enlazadores para que sean escindibles selectivamente por elementos endógenos en el objetivo mientras que son estables para los elementos endógenos en camino al objetivo (especialmente en el caso de la eliminación lenta de los mAb completos). Como resultado, la combinación óptima de fármaco, enlazador, mAb y objetivo debe seleccionarse y optimizarse caso por caso.
Otra área de aplicación que podría beneficiarse de un enfoque de profármaco eficaz es el campo de las construcciones de anticuerpos que se acoplan a las células T (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos biespecíficos o triespecíficos), que actúan sobre el cáncer mediante el acoplamiento al sistema inmunitario. Durante mucho tiempo se ha considerado que poner las células T activadas en contacto directo con las células cancerosas ofrece una forma potente de matarlas (Thompson et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 366 (2008) 526-531). De los muchos anticuerpos biespecíficos que se han creado para hacer esto, la mayoría se compone de dos sitios de unión de anticuerpos, un sitio se dirige al tumor y el otro se dirige a una célula T (Thakur et al., Current Opinion in Molecular Therapeutics 2010, 12 (3), 340-349). Sin embargo, con anticuerpos biespecíficos que contienen un sitio de unión activo a células T, se producirá unión a células T periféricas. Esto no solo evita que el conjugado llegue al tumor, sino que también puede provocar tormentas de citoquinas y agotamiento de las células T. Los anticuerpos anti-células T fotoactivables, donde la actividad anti-células T solo se restablece cuando y donde es necesario (es decir, después de la localización del tumor a través del brazo de unión al tumor), después de la irradiación con luz ultravioleta, se han utilizado para superar estos problemas. Los anticuerpos anti-CD3 humanos (dirigidos a células T) podrían inhibirse de forma reversible con un recubrimiento fotoescindible de 1-(2-nitrofenil)etanol (NPE) (Thompson et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 366 (2008) 526-531). Sin embargo, la activación basada en la luz se limita a las regiones del cuerpo donde la luz puede penetrar y no se puede modificar fácilmente para tratar enfermedades sistémicas como el cáncer metastásico. Construcciones estrechamente relacionadas que podrían beneficiarse de un enfoque de profármaco son construcciones de anticuerpos que se acoplan a células T triespecíficas con, por ejemplo, una fracción de unión a células T CD3 y CD28 además de un agente dirigido al cáncer. Tales construcciones son demasiado tóxicas para usar como tales y es necesario enmascarar el CD3 o el CD28 o ambos dominios de unión.
Es deseable poder activar fármacos dirigidos de forma selectiva y predecible en el sitio objetivo sin depender de una penetración y orientación homogéneas, y de parámetros endógenos que pueden variar en camino hacia y dentro del objetivo, y de un caso a otro y de un paciente a otro.
Para evitar los inconvenientes de la activación actual de profármacos, se ha propuesto en Bioconjugate Chem 2008, 19, 714-718, para hacer uso de una reacción química abiótica, bioortogonal, a saber, la reacción de Staudinger, para provocar la activación del profármaco. Brevemente, en el concepto presentado, el profármaco es un conjugado de un fármaco y un desencadenador, y este conjugado de fármaco-desencadenador no se activa endógenamente, por ejemplo, una enzima o un pH específico, sino por una administración controlada del desencadenador, es decir, una especie que reacciona con la fracción desencadenadora en el profármaco, para inducir la liberación del fármaco desde el desencadenador (o viceversa, la liberación del desencadenador desde el fármaco, sin embargo, se puede observar este proceso de liberación). Sin embargo, el enfoque de Staudinger presentado para este concepto ha resultado no funcionar bien, y su área de aplicación es limitada en vista de la naturaleza específica del mecanismo de liberación impuesto por la reacción de Staudinger. Otros inconvenientes del uso de las reacciones de Staudinger son sus velocidades de reacción limitadas y la inestabilidad oxidativa de los componentes de fosfina de estas reacciones. Por lo tanto, se desea proporcionar reactivos para una reacción bioortogonal abiótica que sean estables en condiciones fisiológicas, que sean más reactivos entre sí y que sean capaces de inducir la liberación de un fármaco enlazado por medio de una variedad de mecanismos ofreciendo así un método de liberación de fármacos activados muy versátil.
El uso de una reacción química biocompatible que no dependa de mecanismos de activación endógenos (p. ej., pH, enzimas) para la activación selectiva de profármacos representaría una herramienta nueva y poderosa en la terapia del cáncer. La activación selectiva de profármacos cuando y donde sea necesario permite el control de muchos procesos dentro del cuerpo, incluido el cáncer. Las terapias, como la terapia con anticuerpos antitumorales, pueden así hacerse más específicas, proporcionando un mayor contraste terapéutico entre las células normales y el tumor para reducir los efectos secundarios no deseados. En el contexto de los anticuerpos anticancerígenos que interactúan con las células T, la presente invención permite la administración sistémica y el direccionamiento del tumor de una construcción de anticuerpo inactivo (es decir, este es entonces el profármaco), disminuyendo la toxicidad fuera del objetivo. Tras una captación suficiente del tumor y eliminación de áreas no objetivo, el anticuerpo enlazado al tumor se activa mediante la administración del desencadenador, que reacciona con el desencadenador o desencadenadores en el anticuerpo o dominio de anticuerpo particular, lo que da como resultado la eliminación del desencadenador y la restauración de la función de unión a la célula T. Esto da como resultado la activación de las células T y la acción anticancerígena (es decir, esta es entonces la liberación del fármaco).
Sumario de la invención
Con el fin de abordar mejor uno o más de los deseos anteriores, la presente invención proporciona
Un kit para la administración y activación de un profármaco, comprendiendo el kit un fármaco DD enlazado, directa o indirectamente, a una fracción desencadenadora TR, y un desencadenador para la fracción desencadenadora, donde la fracción desencadenadora comprende un dienófilo y el desencadenador comprende un dieno, el dienófilo, incluido dicho fármaco enlazado al mismo, que satisface la siguiente fórmula (1 a):
Figure imgf000004_0001
tía)
donde T, G denotan, cada uno independientemente H, o un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en alquilo, F, Cl, Br o I;
A y P cada uno independientemente son CRa2 o CRaXD, siempre que al menos uno sea CRaXD; XD es (O-C(O))p-(LD)n-(DD), S-C(O)-(LD)n-(DD), O-C(S)-(LD)n-(DD), S-C(S)-(LD)n-(DD), o O-S(O)-(LD)n-(DD), donde p = 0 o 1; (LD)n es un enlazador opcional, con n = 0 o 1, enlazado a TR a través de S, N, NH u O, donde estos átomos son parte del enlazador, que puede consistir en múltiples unidades dispuestas linealmente y/o ramificadas;
Y, Z, Q, X juntos forman una fracción alifática o heteroalifática de cuatro miembros, opcionalmente fusionada con una fracción o fracciones aromáticas;
cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, OR', SR', S(=O)Rm, S(=O)2Rm, S(=O)2NR'R", Si-Rm, Si-O-Rm, OC(=O)Rm, SC(=O)Rm, OC(=S)Rm, SC(=S)Rm, F, Cl, Br, I, N3 , SO2H, SO3H, SO4H, PO3H, PO4H, NO, NO2 , CN, OCN, SCN, NCO, NCS, CF3 , CF2-R', NR'R", C(=O)R', C(=S)R', C(=O)O-R', C(=S)O-R', C(=O)S-R', C(=S)S-R', C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'C(=O)-Rm, NR'C(=S)-Rm, NR'C(=O)O-Rm, NR'C(=S)O-Rm, NR'C(=O)S-Rm, NR'C(=S)S-Rm, OC(=O)NR'-Rm, SC(=O)NR'-Rm, OC(=S)NR'-Rm, SC(=S)NR'-Rm, NR'C(=O)NR"-R", NR'C(=S)NR"-R", CR'NR", siendo cada R' y cada R'' independientemente H, arilo o alquilo y siendo R''' independientemente arilo o alquilo;
DD es uno o más fármacos, preferiblemente enlazados a través de S, N, NH u O, donde estos átomos son parte del fármaco, donde cuando tanto p como n son 0, DD está enlazado a TR a través de un O, N, NH o S, donde estos átomos son parte del fármaco;
donde opcionalmente uno o más agentes de direccionamiento TT o fracciones de enmascaramiento MM se unen al fármaco DD, al desencadenador TR, o al enlazador LD, opcionalmente a través de un espaciador o espaciadores SP; donde el desencadenador comprende un dieno seleccionado de los dienos, de acuerdo con las fórmulas (2)-(4):
Figure imgf000004_0002
(2)
donde R1 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, CF3, CF2-R', OR', SR', C(=O)R', C(=S)R', C(=O)O-R', C(=O)S-R', C(=S)O-R', C(=S)S-R", C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'R", NR'C(=O)R", NR'C(=S)R", NR'C(=O)OR", NR'C(=S)OR", NR'C(=O)SR", NR'C(=S)SR", NR'C(=O)NR"R", NR'C(=S)NR"R" siendo cada R' y cada R'' independientemente H, arilo o alquilo; A y B se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en carbono sustituido con alquilo, carbono sustituido con arilo, nitrógeno, N+O-, N+R siendo R alquilo, con la condición de que A y B no sean ambos carbono; X se selecciona del grupo que consiste en O, N-alquilo y C=O, e Y es CR con R seleccionado del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, C(=O)OR', C(=O)SR', C(=S)OR', C(=S)SR', C(=O)NR'R" siendo R' y R'' cada uno independientemente H, arilo o alquilo.
Figure imgf000005_0001
donde R1 y R2 cada uno independientemente se seleccionan del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, CF3, CF2-R', NO2 , OR', SR', C(=O)R', C(=S)R', OC(=O)Rm, SC(=O)Rm, OC(=S)Rm, SC(=S)Rm, S(=O)R', S(=O)2Rm, S(=O)2NR'R", C(=O)O-R', C(=O)S-R', C(=S)O-R', C(=S)S-R', C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'R", NR'C(=O)R", NR'C(=S)R", NR'C(=O)OR", NR'C(=S)OR", NR'C(=O)SR", NR'C(=S)SR", OC(=O)NR'R", SC(=O)NR'R", OC(=S)NR'R", SC(=S)NR'R", NR'C(=O)NR"R", NR'C(=S)NR"R" siendo cada R' y cada R'' independientemente H, arilo o alquilo, y siendo R''' independientemente arilo o alquilo; A se selecciona del grupo que consiste en N-alquilo, N-arilo, C=O y CN-alquilo; B es O o S; X se selecciona del grupo que consiste en N, CH, C-alquilo, C-arilo, CC(=O)R', CC(=S)R', CS(=O)R', CS(=O)2Rm, CC(=O)O-R', CC(=O)S-R', CC(=S)O-R', CC(=S)S-R', CC(=O)NR'R", CC(=S)NR'R", siendo cada R' y R'' independientemente H, arilo o alquilo y siendo R''' independientemente arilo o alquilo; Y se selecciona del grupo que consiste en CH, C-alquilo, C-arilo, N y N+O‘.
Figure imgf000005_0002
donde R1 y R2 cada uno independientemente se seleccionan del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, CF3, CF2-R', NO, NO2, OR', SR', CN, C(=O)R', C(=S)R', OC(=O)Rm, SC(=O)Rm, OC(=S)Rm, SC(=S)Rm, S(=O)R', S(=O)2Rm, S(=O)2OR', PO3R'R", S(=O)2NR'R", C(=O)O-R', C(=O)S-R', C(=S)O-R', C(=S)S-R', C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'R", NR'C(=O)R", NR'C(=S)R", NR'C(=O)OR", NR'C(=S)OR", NR'C(=O)SR", NR'C(=S)SR", OC(=O)NR'R", SC(=O)NR'R", OC(=S)NR'R", SC(=S)NR'R", NR'C(=O)NR"R", Nr 'C(=S)NR"R" siendo cada R' y cada R'' independientemente H, arilo o alquilo, y siendo R''' independientemente arilo o alquilo; A se selecciona del grupo que consiste en N, C-alquilo, C-arilo y N+O_; B es N; X se selecciona del grupo que consiste en N, CH, C-alquilo, C-arilo, CC(=O)R', CC(=S)R', CS(=O)R', CS(=O)2Rm, CC(=O)O-R', CC(=O)S-R', CC(=S)O-R', CC(=S)S-R', CC(=O)NR'R", CC(=S)NR'R", siendo R' y R'' cada uno independientemente H, arilo o alquilo y siendo R''' independientemente arilo o alquilo; Y se selecciona del grupo que consiste en CH, C-alquilo, C-arilo, N y N+O_;
donde el desencadenador está opcionalmente enlazado a un polietilenglicol, una proteína, un péptido, un carbohidrato, un polímero, una fracción colorante, una fracción fluorescente o una sonda de formación de imágenes.
En otro aspecto, la invención presenta un profármaco que satisface la fórmula anterior (1a).
En aún otro aspecto más, la invención proporciona un método para modificar un compuesto farmacológico en un profármaco que puede activarse mediante una reacción abiótica bioortogonal, comprendiendo el método proporcionar un fármaco y enlazar químicamente el fármaco a una fracción dienófila para formar un compuesto de fórmula (1 a) como se define en el presente documento.
En otro aspecto más, la invención es un compuesto que satisface la siguiente fórmula (1a):
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de acuerdo con las reivindicaciones, comprendiendo dicho compuesto un enlace a un fármaco, para su uso en la terapia con profármacos en un animal o un ser humano. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y fármacos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
La reacción retro de Diels-Alder
El dienófilo de fórmula (1a) y el dieno son capaces de reaccionar en una reacción de Diels-Alder de demanda electrónica inversa. La activación del profármaco por la reacción retro de Diels-Alder del desencadenador con el activador conduce a la liberación del fármaco.
A continuación se presenta un esquema de reacción para una reacción de Diels-Alder [4+2] entre el (3,6)-di-(2-piridil)-s-tetrazina dieno y un frans-cicloocteno dienófilo, seguido de una reacción retro de Diels-Alder donde se forma el producto y el dinitrógeno. El producto de reacción puede tautomerizarse, y esto también se muestra en el esquema. Dado que el derivado de trans-cicloocteno no contiene grupos aceptores de electrones como en la reacción clásica de Diels-Alder, este tipo de reacción de Diels-Alder se distingue de la clásica, y con frecuencia se la denomina "reacción de Diels-Alder de demanda inversa de electrones". En el siguiente texto, la secuencia de ambas etapas de reacción, es decir, la cicloadición inicial de Diels-Alder (típicamente una cicloadición inversa de Diels-Alder de demanda de electrones) y la posterior reacción retro de Diels-Alder se denominará abreviadamente como " reacción retro de Diels-Alder" o "retro-DA". A veces se abreviará como reacción "rDA". El producto de la reacción es entonces el aducto retro de Diels-Alder, o el aducto rDA.
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Descripción detallada de la invención
En un sentido general, la invención se basa en el reconocimiento de que un fármaco puede liberarse de derivados de frans-cicloocteno que satisface la fórmula (1 a) tras la cicloadición con dienos compatibles, tales como derivados de tetrazina. Los dienófilos de fórmula (1a) tienen la ventaja de que reaccionan (y efectúan la liberación del fármaco) sustancialmente con cualquier dieno.
Sin querer limitarse a la teoría, los inventores creen que la estructura molecular del aducto retro de Diels-Alder es tal que una reacción de eliminación espontánea dentro de este aducto rDA libera el fármaco. Particularmente, los inventores creen que los componentes de rDA apropiadamente modificados conducen a aductos de rDA donde el enlace con el fármaco en el dienófilo se desestabiliza por la presencia de un solo par de electrones en el dieno.
El concepto general de usar la reacción retro de Diels-Alder en la activación de profármacos se ilustra en el Esquema 1.
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En este esquema "TCO" significa frans-cicloocteno. El término frans-cicloocteno se usa en este documento como posiblemente incluyendo uno o más heteroátomos, y particularmente se refiere a una estructura que satisface la fórmula (1a). En un amplio sentido, los inventores han descubierto que, además de los intentos realizados sobre la base de la reacción de Staudinger, la selección de un TCO como la fracción desencadenadora de un profármaco proporciona una herramienta versátil para convertir las fracciones de fármaco (activas) en fracciones de profármaco (activables), donde la activación ocurre a través de una potente reacción bioortogonal abiótica del dienófilo (desencadenador) con el dieno (activador), a saber, la reacción retro de Diels-Alder antes mencionada, y donde el profármaco es un conjugado de fármaco-dienófilo.
Se entenderá que en el Esquema 1 en el aducto retro de Diels-Alder así como en el producto final, el grupo TCO indicado y el grupo dieno indicado son los residuos respectivamente de los grupos TCO y dieno después de que estos grupos se hayan convertido en la reacción retro de Diels-Alder.
Un requisito para la aplicación exitosa de una reacción química bioortogonal abiótica es que los dos grupos funcionales participantes tengan una reactividad finamente ajustada para evitar la interferencia con la función coexistente. Idealmente, los compañeros reactivos serían abióticos, reactivos en condiciones fisiológicas y reactivos solo entre sí ignorando su entorno celular/fisiológico (bioortogonal). Las demandas de selectividad impuestas por un entorno biológico impiden el uso de la mayoría de las reacciones convencionales.
La reacción de Diels-Alder de demanda inversa de electrones, sin embargo, ha demostrado utilidad en animales en bajas concentraciones y condiciones semiequimolares (R. Rossin et al., Angewandte Chemie Int Ed 2010, 49, 3375­ 3378). Los compañeros de reacción objeto de esta invención son derivados de trans-cicloocteno (TCO) tensionados y dienos adecuados, tales como derivados de tetrazina. La reacción de cicloadición entre un TCO y una tetrazina produce un compuesto intermedio, que luego se reorganiza mediante la expulsión de dinitrógeno en una cicloadición retro de Diels-Alder para formar un conjugado de dihidropiridazina. Este y sus tautómeros es el aducto retro de Diels-Alder.
Los presentes inventores han llegado a la conclusión no obvia de que la estructura del TCO de fórmula (1a), por excelencia, es adecuado para provocar la liberación de un fármaco ligado a él, como resultado de la reacción que involucra al doble enlace disponible en el dienófilo TCO y un dieno. Las características que se cree que permiten esto son (a) la naturaleza de la reacción rDA, que implica una reorganización de los dobles enlaces, que puede utilizarse para provocar una cascada de eliminación; (b) la naturaleza del aducto rDA que tiene un grupo dihidro piridazina que no es aromático (u otro grupo no aromático) y que puede reorganizarse mediante una reacción de eliminación para formar dobles enlaces conjugados o para formar un grupo aromático (por ejemplo, piridazina), (c) la naturaleza del aducto rDA que puede tener un grupo dihidropiridazina que es débilmente básico y que, por lo tanto, puede catalizar reacciones de eliminación.
En un sentido amplio, la invención utiliza el reconocimiento de que la reacción rDA, usando un dienófilo de fórmula (1a), así como el aducto rDA, incorporan una plataforma versátil para permitir la liberación provocada del fármaco en una reacción bioortogonal.
El hecho de que la reacción sea bioortogonal y que existan muchas opciones estructurales para los pares de reacción será evidente para el experto en la materia. Por ejemplo, la reacción rDA es conocida en la técnica de la medicina predirigida. Se hace referencia a, por ejemplo, los documentos WO 2010/119382, WO 2010/119389, y WO 2010/051530. Si bien la invención presenta un uso completamente diferente de la reacción, se entenderá que las diversas posibilidades estructurales disponibles para los pares de reacción rDA como se usan en el predireccionamiento también están disponibles en el campo de la presente invención.
La fracción desencadenadora del dienófilo utilizada en la presente divulgación comprende un anillo de transcicloocteno, incluyendo opcionalmente el anillo uno o más heteroátomos. En lo sucesivo, esta fracción de anillo de ocho miembros se definirá como un fracción de trans-cicloocteno, en aras de la legibilidad, o abreviada como fracción "TCO". Se entenderá que la esencia reside en la posibilidad de que el anillo de ocho miembros actúe como dienófilo y se libere de su fármaco conjugado tras la reacción. El experto en la materia está familiarizado con el hecho de que la actividad dienófila no depende necesariamente de la presencia de todos los átomos de carbono en el anillo, ya que también se sabe que los anillos de ocho miembros del monoalquenileno heterocíclico poseen actividad dienófila.
Por lo tanto, en general, la invención no se limita estrictamente a fármacos sustituidos con trans-cicloocteno. El experto en química orgánica sabrá que existen otros dienófilos basados en anillos de ocho miembros, que comprenden el mismo doble enlace endocíclico que el trans-cicloocteno, pero que puede tener uno o más heteroátomos en otra parte del anillo. Es decir, la invención generalmente se refiere a fracciones de alquenileno cíclicas no aromáticas de ocho miembros, preferiblemente una fracción de cicloocteno, y más preferiblemente una fracción de trans-cicloocteno, que comprende un fármaco conjugado.
Excepto en el caso de, por ejemplo, las sustancias medicinalmente activas, donde la acción in vivo a menudo cambia con cambios estructurales menores, la presente invención requiere primero y ante todo la reactividad química correcta combinada con un diseño apropiado del conjugado de fármaco. Así, las posibles estructuras se extienden a aquellas con las que el experto en la materia está familiarizado, ya que estas son reactivas como dienófilos.
Cabe señalar que, dependiendo de la elección de la nomenclatura, el dienófilo TCO también puede denominarse E-cicloocteno. Con referencia a la nomenclatura convencional, se entenderá que, como resultado de la sustitución en el anillo de cicloocteno, dependiendo de la ubicación y el peso molecular del sustituyente, el mismo isómero de cicloocteno puede denominarse formalmente isómero Z. En la presente invención, cualquier variante sustituida de la invención, sean o no isómeros formalmente "E" o "Z", o "cis" o "trans", se considerarán derivados de trans-cicloocteno no sustituido, o E-cicloocteno no sustituido. Los términos "trans-cicloocteno" (TCO) así como E-cicloocteno se usan indistintamente y se mantienen para todos los dienófilos de acuerdo con la presente invención, también en el caso de que los sustituyentes requieran formalmente la nomenclatura opuesta. Es decir, la invención se refiere al cicloocteno donde los átomos de carbono 1 y 6 , como se enumeran a continuación, están en la posición E (entgegen, opuesta) o trans.
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Fórmula 1
La presente invención se describirá adicionalmente con respecto a realizaciones particulares y con referencia a ciertos dibujos, pero la invención no se limita a ellos sino únicamente a las reivindicaciones. Cualquier signo de referencia en las reivindicaciones no se interpretará como una limitación del alcance. Los dibujos descritos son solo esquemáticos y no limitativos. En los dibujos, el tamaño de algunos de los elementos puede estar exagerado y no estar dibujado a escala con fines ilustrativos. Donde se usa un artículo definido o indefinido cuando se hace referencia a un sustantivo singular, por ejemplo, "un" o "uno, una", "el, la", este incluye un plural de ese sustantivo a menos que se indique específicamente algo más.
Además, debe notarse que el término "que comprende", utilizado en la descripción y en las reivindicaciones, no debe interpretarse como restringido a los medios enumerados a continuación; no excluye otros elementos o etapas.
En varias fórmulas químicas a continuación se hace referencia a "alquilo" y "arilo". A este respecto, "alquilo", cada uno independientemente, indica un grupo hidrocarbilo alifático, lineal, ramificado, saturado, insaturado y/o cíclico de hasta diez átomos de carbono, que posiblemente incluya de 1 a 10 heteroátomos tales como O, N o S, y "arilo", cada uno independientemente, indica un grupo aromático o heteroaromático de hasta veinte átomos de carbono, que posiblemente esté sustituido, y que posiblemente incluya de 1 a 10 heteroátomos tales como O, N, P o S. Los grupos "arilo" también incluyen grupos "alquilarilo" o "arilalquilo" (ejemplo simple: grupos bencilo). El número de átomos de carbono que contiene un "alquilo", "arilo", "alquilarilo" y "arilalquilo" se puede indicar mediante una designación que precede a dichos términos (es decir, alquilo C1-10 significa que dicho alquilo puede contener de 1 a 10 átomos de carbono). Ciertos compuestos de la invención poseen centros quirales y/o tautómeros, y todos los enantiómeros, diastereómeros y tautómeros, así como sus mezclas, están dentro del alcance de la invención. En varias fórmulas, los grupos o sustituyentes se indican con referencia a letras tales como "A", "B", "X", "Y" y varios grupos "R’’ (numerados). Las definiciones de estas letras deben leerse con referencia a cada fórmula, es decir, en diferentes fórmulas estas letras, cada una de forma independiente, pueden tener diferentes significados a menos que se indique lo contrario.
En todas las realizaciones de la invención como se describe en este documento, el alquilo es preferiblemente alquilo inferior (alquilo C1-4), y cada arilo es preferiblemente fenilo.
El trabajo anterior (R. Rossin et al., Angewandte Chemie Int Ed 2010, 49, 3375-3378) demostró la utilidad de la reacción de Diels-Alder de demanda inversa de electrones para la formación de imágenes de radioinmunología predireccionada. Este ejemplo particular de cicloadición se produjo entre un derivado de (3,6)-di-(2-piridil)-s-tetrazina y un E-cicloocteno, seguido de una reacción retro de Diels-Alder donde se forma el producto y el nitrógeno. Debido a que el derivado trans-cicloocteno no contiene grupos aceptores de electrones como en la reacción clásica de Diels-Alder, este tipo de reacción de Diels-Alder se distingue de la clásica, y con frecuencia se la denomina "reacción de Diels-Alder de demanda inversa de electrones". En el siguiente texto, la secuencia de ambas etapas de reacción, es decir, la cicloadición inicial de Diels-Alder (típicamente una cicloadición de Diels-Alder de demanda inversa de electrones) y la posterior reacción retro de Diels-Alder se denominarán abreviadamente " reacción retro de Diels-Alder".
Reacción retro de Diels-Alder
La química de acoplamiento retro de Diels-Alder generalmente involucra un par de reactivos que se acoplan para formar un compuesto intermedio inestable, cuyo compuesto intermedio elimina una molécula pequeña (dependiendo de los compuestos iniciales, esto puede ser, por ejemplo, N2 , CO2 , RCN), como único subproducto a través de una reacción retro de Diels-Alder para formar el aducto retro de Diels-Alder. Los reactivos emparejados comprenden, como un reactivo (es decir, un grupo reactivo bioortogonal), un dieno adecuado, tal como un derivado de tetrazina, por ejemplo, una tetrazina deficiente en electrones y, como el otro reactivo (es decir, el otro grupo reactivo bioortogonal), un dienófilo adecuado, tal como un cicloocteno tensionado (TCO).
La reacción excepcionalmente rápida de, por ejemplo, tetrazinas deficientes en electrones (sustituidas) con una fracción TCO da como resultado un compuesto intermedio de ligación que se reorganiza en un aducto retro de Diels-Alder de dihidropiridazina mediante la eliminación de N2 como el único subproducto en una cicloadición retro de DielsAlder [4+2]. En un entorno acuoso, el producto de 4,5-dihidropiridazina formado inicialmente puede tautomerizarse a un producto de 1,4-dihidropiridazina.
Las dos especies reactivas son abióticas y no experimentan un metabolismo rápido ni reacciones secundarias in vivo. Son bioortogonales, por ejemplo, reaccionan selectivamente entre sí en medios fisiológicos. Por lo tanto, los compuestos y el método de la invención se pueden usar en un organismo vivo. Además, los grupos reactivos son relativamente pequeños y se pueden introducir en muestras biológicas o en organismos vivos sin alterar significativamente el tamaño de las biomoléculas que contienen. Las referencias sobre la reacción de Diels-Alder de demanda inversa de electrones y el comportamiento del par de especies reactivas incluyen: Thalhammer, F; Wallfahrer, U; Sauer, J, Tetrahedron Letters, 1990, 31 (47), 6851-6854; Wijnen, JW; Zavarise, S; Engberts, JBFN, Journal Of Organic Chemistry, 1996, 61, 2001-2005; Blackman, ML; Royzen, M; Fox, JM, Journal Of The American Chemical Society, 2008, 130 (41), 13518-19), R. Rossin, P. Renart Verkerk, Sandra M. van den Bosch, R. C. M. Vulders, 1. Verel, J. Lub, M. S. Robillard, Angew Chem Int Ed 2010, 49, 3375, N. K. Devaraj, R. Upadhyay, J. B. Haun, S. A. Hilderbrand, R. Weissleder, Angew Chem Int Ed 2009, 48, 7013, y Devaraj et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2009, 48, 1-5.
Otras referencias de antecedentes incluyen Haun et al., Nature Nanotechnology, 2010, volumen 5, número 9, páginas 660-665; y el documento WO 2009/023916.
Se entenderá que, en un sentido amplio, de acuerdo con la invención, el acoplamiento retro de Diels-Alder mencionado anteriormente y la química de activación subsiguiente del fármaco se pueden aplicar básicamente a cualquier par de moléculas, grupos o fracciones que se puedan usar en la terapia con profármacos. Es decir, uno de ese par comprenderá un fármaco enlazado a un dienófilo (el desencadenador). El otro será un dieno complementario para usar en reacción con dicho dienófilo.
Desencadenador
El profármaco comprende un fármaco denominado DD enlazado, directa o indirectamente, a una fracción desencadenante denominada TR, donde la fracción desencadenadora es un dienófilo. El dienófilo, en un sentido amplio, es una fracción alquenileno cíclico no aromático de ocho miembros (preferiblemente una fracción cicloocteno, y más preferiblemente una fracción frans-cicloocteno). Opcionalmente, la fracción frans-cicloocteno (TCO) comprende al menos dos enlaces exocíclicos fijados sustancialmente en el mismo plano, y/o comprende opcionalmente al menos un sustituyente en la posición axial, y no en la posición ecuatorial. El experto en química orgánica entenderá que el término "fijado sustancialmente en el mismo plano" se refiere a la teoría de enlaces de acuerdo con la cual normalmente se considera que los enlaces están fijos en el mismo plano. Los ejemplos típicos de tales fijaciones en el mismo plano incluyen enlaces dobles y anillos condensados tensionados. Por ejemplo, al menos dos enlaces exocíclicos pueden ser los dos enlaces de un doble enlace a un oxígeno (es decir, C=O). Los al menos dos enlaces exocíclicos también pueden ser enlaces sencillos en dos átomos de carbono adyacentes, siempre que estos enlaces juntos sean parte de un anillo condensado (es decir, condensado con el anillo de TCO) que asume una estructura sustancialmente plana, fijando así dichos dos enlaces sencillos en sustancialmente uno y el mismo plano. Los ejemplos de estos últimos incluyen anillos tensionados tales como ciclopropilo y ciclobutilo. Sin desear limitarse a la teoría, los inventores creen que la presencia de al menos dos enlaces exocíclicos en el mismo plano dará como resultado un aplanamiento al menos parcial del anillo de TCO, lo que puede conducir a una mayor reactividad en la reacción retro de Diels-Alder.
En esta invención, el TCO satisface la siguiente fórmula (1a):
Figure imgf000009_0001
A y P cada uno independientemente son CRa2 o CRaXD, siempre que al menos uno sea CRaXD. XD is (O-C(O))p-(LD)n-(DD), S-C(O)-(LD)n-(DD), O-C(S)-(LD)n-(DD), S-C(S)-(LD)n-(DD), O-S(O)-(LD)n-(DD), donde p = 0 o 1, (LD)n es un enlazador opcional, con n = 0 o 1, enlazado a TR a través de S, N, NH u O, donde estos átomos son parte del enlazador, que puede consistir en múltiples unidades dispuestas linealmente y/o ramificadas. DD es uno o más fármacos, ligados a TR a través de S, N, NH u O, donde estos átomos son parte del fármaco. Preferiblemente, XD es (O-C(O))p-(LD)n-(DD), donde p = 0 o 1 , preferiblemente 1 , y n = 0 o 1.
Se prefiere que cuando DD está enlazado a TR o LD a través de NH, este NH es un residuo de amina primaria (-NH2) de DD, y cuando DD se une a través de N, este N es un residuo de amina secundaria (-NH-) de DD. De manera similar, se prefiere que cuando DD se une a través de O o S, dichos O o S son, respectivamente, un residuo de hidroxilo (-OH) o un residuo de sulfhidrilo (-SH) de DD.
Se prefiere además que dichas fracciones de S, N, NH u O comprendidas en DD estén unidas a un carbono alifático o aromático de DD.
Se prefiere que cuando LD está enlazado a TR a través de NH, este NH es una amina primaria (-NH2) residuo de LD, y cuando LD se une a través de N, este N es un residuo de amina secundaria (-NH-) de LD De manera similar, se prefiere que cuando LD se une a través de O o S, dichos O o S son, respectivamente, un residuo de hidroxilo (-OH) o un residuo de sulfhidrilo (-SH) de LD.
Se prefiere además que dichas fracciones de S, N, NH u O comprendidas en LD estén unidas a un carbono alifático o aromático de LD.
Donde se hace referencia en la invención a un enlazador LD éste puede ser autoinmolable o no, o una combinación de ambos, y que puede consistir en múltiples unidades autoinmolables.
A modo de aclaración adicional, si p = 0 y n = 0, la especie de fármaco DD constituye directamente el grupo saliente de la reacción de eliminación, y si p = 0 y n = 1 , el enlazador autoinmolable constituye el grupo saliente de la eliminación. La posición y formas de unión de los enlazadores LD y fármacos DD son conocidos por el experto (ver por ejemplo, Papot et al, Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 2008, 8 , 618-637). No obstante, ejemplos típicos pero no limitativos de enlazadores autoinmolables LD son derivados de bencilo, como los que se muestran a continuación. A la derecha, se muestra un ejemplo de un enlazador autoinmolable con múltiples unidades; este enlazador se degradará no solo en CO2 y una unidad de alcohol 4-aminobencílico, sino también en una unidad de 1,3-dimetilimidazolidin-2 -ona.
Figure imgf000010_0001
X = O o S o NH o NR con R = alquilo o arilo
En una realización interesante, Y, Z, X, Q se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en CRa2 , C=CRa2, C=O, C=S, C=NRb, S, SO, SO2, O, NRb, y SiRC2 , con un máximo de tres de Y, Z, X y Q seleccionados del grupo que consta de C=CRa2 , C=O, C=S y C=NRb, donde dos fracciones R juntas pueden formar un anillo, y con la condición de que no estén presentes pares de átomos adyacentes seleccionados del grupo que consiste en O-O, O-NRb, S-NRb, O-S, O-S(O), O-S(O)2, y S-S, y tal que Si solo es adyacente a CRa2 u O.
En una realización preferida, el TCO de fórmula (1a) es un anillo totalmente de carbono. En otra realización preferida, el TCO de fórmula (1a) es un anillo de carbono heterocíclico, que tiene de uno a tres átomos de oxígeno en el anillo, y preferiblemente un solo átomo de oxígeno.
En otra realización interesante, uno de los enlaces PQ, QX, XZ, ZY, YA es parte de un anillo condensado o consta de CRa=CRa, tal que dos enlaces exocíclicos estén fijados en el mismo plano, y siempre que PQ y YA no formen parte de un anillo aromático de 5 o 6 miembros, de un anillo conjugado de 7 miembros, o de CRa=CRa; cuando no forman parte de un anillo condensado, P y A son independientemente CRa2 o CRaXD, siempre que al menos uno sea CRaXD; cuando parte de un anillo condensado P y A son independientemente CRa o CXD, siempre que al menos uno sea CXD; siendo los grupos restantes (Y, Z, X, Q) independientemente entre sí CRa2 , C=CRa2 , C=O, C=S, C=NRb, S, SO, SO2, O, NRb, SiRc2, tal que como máximo 1 grupo es C=CRa2, C=O, C=S, C=NRb, y no hay pares de átomos adyacentes seleccionados del grupo que consiste en O-O, O-NRb, S-NRb, O-S, O-S(O), O-S(O)2 , y S-S, y tal que Si, si está presente, es adyacente a CRa2 u O, y la unión CRa2=CRa2, si está presente, es adyacente a grupos CRa2 o C=CRa2; T, G denotan cada uno independientemente H, o un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en alquilo, F, Cl, Br o I.
En algunas realizaciones, están presentes anillos condensados que dan como resultado que dos enlaces exocíclicos se fijen sustancialmente en el mismo plano. Estos se seleccionan de anillos condensados de 3 miembros, anillos condensados de 4 miembros, anillos condensados bicíclicos de 7 miembros, anillos condensados aromáticos de 5 miembros, anillos condensados aromáticos de 6 miembros y anillos condensados planos conjugados de 7 miembros como se define a continuación:
Los anillos condensados de 3 miembros son:
Figure imgf000010_0002
Allí, E, G son parte del anillo de 8 miembros mencionado anteriormente y pueden fusionarse con PQ, QP, QX, XQ, XZ, ZX, ZY, YZ, YA, AY, de modo que P, A son CRa o CXD, y tal que CXD solo puede estar presente en A y P.
E-G es CRa-CRa o CRa-CXD, y D es CRa2 ,C=O, C=S, C=NRb, NRb, O, S; o E-G es CRa-N o CXD-N, y D es CRa2 , C=O, C=S, C=NRb, NRbO, o S.
Los anillos condensados de 4 miembros son:
Figure imgf000011_0001
E-G es parte del anillo de 8 miembros mencionado anteriormente y se puede fusionar con PQ, QP, QX, XQ, XZ, ZX, ZY, YZ, YA, AY, de modo que P, A son C, CRa o CXD, y tal que CXD solo puede estar presente en A y P.
E, G son CRa, CXD o N, y D, M independientemente entre sí son CRa2, C=O, C=S, C= NRb, C=CRa2 , S, SO, SO2 , O, NRb pero sin grupos O-O o S-S adyacentes; o
E-D es C=CRa y G es N, CRa, CXD y M es CRa2, S, SO, SO2, O, NRb; o E-D es C=N y G es N, CRa, CXD y M es CRa2 , S, SO, SO2, O; o
D-M es CRa=CRa y E, G cada uno independientemente son CRa, CXD o N; o D-M es CRa=N y E es CRa, CXD, N y G es CRa o CXD; o
E es C, G es CRa, CXD o N, y D, M son CRa2 , S, SO, SO2, O, NRb, o como máximo uno de C=O, C=S, C=NRb, C=CRa2 , pero sin grupos O-O o S-S adyacentes; o E y G son C, y D y M independientemente entre sí son CRa2 , S, SO, SO2, O, NRb pero no hay grupos O-O o S-S adyacentes.
Los anillos bicíclicos condensados de 7 miembros son:
Figure imgf000011_0002
E-G es parte del anillo de 8 miembros mencionado anteriormente y se puede fusionar con PQ, QP, QX, XQ, XZ, ZX, ZY, YZ, YA, AY, de modo que P, A son C, CRa o CXD, y tal que CXD solo puede estar presente en A y P;
E, G son C, CRa, CXD o N; K, L son CRa; D, M forman un CRa=CRa o CRa=N, o D, M independientemente entre sí son CRa2 , C=O, C=S, C=NRb, C=CRa2, S, SO, SO2, O, NRb pero sin grupos O-O, S-S, N-S adyacentes; J es CRa2, C=O, C=S, C=NRb, C=CRa2, S, SO, SO2 , O, NRb; como máximo 2 grupos N; o
E, G son C, CRa, CXD; K es N y L es CRa; D, M forman un enlace CRa=CRa o D, M independientemente entre sí son CRa2 , C=O, C=S, C=NRb, C=CRa2 , NRb pero sin grupos O-O, S-S, N-S adyacentes; J es CRa2 , C=O, C=S, C=NRb, C=CRa2 , S, SO, SO2, O, NRb; como máximo 2 grupos N; o E, G son C, CRa, CXD; K y L son N; D, M, J independientemente entre sí son grupos CRa2, C=O, C=S, C=NRb, C=CRa2;
Los anillos aromáticos condensados de 5 miembros son
Figure imgf000011_0003
E, G son parte del anillo de 8 miembros mencionado anteriormente y pueden fusionarse con QX, XQ, XZ, ZX, ZY, YZ. E y G son C; uno de los grupos L, K o M son O, NRb, S y los dos grupos restantes son independientes entre sí CRa o N; o E es C y G es N; L, K, M son independientes entre sí CRa o n
Los anillos aromáticos condensados de 6 miembros son:
Figure imgf000011_0004
E, G son parte del anillo de 8 miembros mencionado anteriormente y pueden fusionarse con QX, XQ, XZ, ZX, ZY, YZ. E,G es C; L, K, D, M son independientes entre sí CRa o N.
Los anillos condensados planos conjugados de 7 miembros son
Figure imgf000011_0005
E, G son parte del anillo de 8 miembros mencionado anteriormente y se pueden fusionar con QX, XQ, XZ, ZX, ZY, YZ. E,G es C; L, K, D, M son CRa; J es S, O, CRa2, NRb
Cada Ra como se indicó anteriormente puede ser independientemente H, alquilo, arilo, OR', SR', S(=O)Rm, S(=O)2Rm, S(=O)2NR'R", Si-Rm, Si-O-Rm, OC(=O)Rm, SC(=O)Rm, OC(=S)R"', SC(=S)Rm, F, Cl, Br, I, N3, SO2H, SO3H, SO4H, PO3H, PO4H, NO, NO2 , CN, OCN, SCN, NCO, NCS, CF3 , CF2-R', NR'R", C(=O)R', C(=S)R', C(=O)O-R', C(=S)O-R', C(=O)S-R', C(=S)S-R', C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'C(=O)-Rm, NR'C(=S)-Rm, NR'C(=O)O-Rm, NR'C(=S)O-Rm, NR'C(=O)S-Rm, NR'C(=S)S-Rm, OC(=O)NR'-Rm, SC(=O)NR'-Rm, OC(=S)NR'-Rm, SC(=S)NR'-Rm, NR'C(=O)NR"-R", NR'C(=S)NR"-R", CR'NR", siendo cada R' y cada R'' independientemente H, arilo o alquilo y siendo R''' independientemente arilo o alquilo;
Cada Rb como se indicó anteriormente, se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, O-arilo, O-alquilo, OH, C(=O)NR'R'', siendo cada uno de R' y R'' independientemente H, arilo o alquilo, R'CO-alquilo, con R' siendo H, alquilo y arilo.
Cada RC como se indicó anteriormente, se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, O-alquilo, O-arilo, OH.
Donde dos o más fracciones Rabc juntas pueden formar un anillo.
Preferiblemente, cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, O-alquilo, O-arilo, OH, C(=O)NR'R'', NR'C(=O)-R''', con R' y R'' cada uno independientemente siendo H, arilo o alquilo, y siendo R''' independientemente alquilo o arilo.
En todas las realizaciones anteriores, opcionalmente uno de A, P, Q, Y, X y Z, o los sustituyentes o anillos condensados de los que forman parte, o el enlazador autoinmolable LD, o el fármaco DD, está enlazado, opcionalmente a través de un espaciador o espaciadores SP, a uno o más agentes de direccionamiento TT o fracciones de enmascaramiento MM.
La síntesis de TCO como se ha descrito anteriormente está bien disponible para el experto en la materia. Esto también es válido expresamente para los TCO que tienen uno o más heteroátomos en los anillos de cicloalqueno tensionados. Las referencias a este respecto incluyen Cere et al., Journal of Organic Chemistry 1980, 45, 261 y Prevost et al., Journal of the American Chemical Society 2009, 131.14182.
En una realización preferida, la fracción trans-cicloocteno satisface la fórmula (1b):
Figure imgf000012_0001
donde, además de la presencia opcional de como máximo dos enlaces exocíclicos fijados en el mismo plano, cada Ra denota independientemente H o, como máximo en cuatro casos, un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en alquilo, arilo, OR', SR', S(=O)Rm, S(=O)2Rm, S^O^NR'R", Si-Rm, Si-O-Rm, OC(=O)Rm, SC(=O)Rm, OC(=S)Rm, SC(=S)Rm, F, Cl, Br, I, N3 , SO2H, SO3H, SO4H, PO3H, PO4H, NO, NO2, CN, OCN, SCN, NCO, NCS, CF3, CF2-R', NR'R", C(=O)R', C(=S)R', C(=O)O-R', C(=S)O-R', C(=O)S-R', C(=S)S-R', C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'C(=O)-Rm, NR'C(=S)-Rm, NR'C(=O)O-Rm, NR'C(=S)O-Rm, NR'C(=O)S-Rm, NR'C(=S)S-Rm, OC(=O)NR'-Rm, SC(=O)NR'-Rm, OC(=S)NR'-Rm, SC(=S)NR'-Rm, NR'C(=O)NR"-R", NR'C(=S)NR"-R", CR'NR", siendo cada R' y cada R'' independientemente H, arilo o alquilo y siendo R''' independientemente arilo o alquilo;
cada Rd como se indicó anteriormente, se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, OR', SR', S(=O)Rm, S(=O)2Rm, Si-Rm, Si-O-Rm, OC(=O)Rm, SC(=O)Rm, OC(=S)Rm, SC(=S)Rm, F, Cl, Br, I, N3 , SO2H, SO3H, PO3H, NO, NO2, CN, CF3 , CF2-R', C(=O)R', C(=S)R', C(=O)O-R', C(=S)O-R', C(=O)S-R', C(=S)S-R', C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'C(=O)-Rm, NR'C(=S)-Rm, NR'C(=O)O-Rm, NR'C(=S)O-Rm, NR'C(=O)S-Rm, NR'C(=S)S-Rm, NR'c (=O)NR"-R", NR'C(=S)NR"-R", CR'NR", siendo cada R' y cada R'' independientemente H, arilo o alquilo y siendo R''' independientemente arilo o alquilo;
donde dos fracciones de Rad juntas pueden formar un anillo;
con opcionalmente un Rad comprendido en una fracción enlazadora, opcionalmente a través de un espaciador SP, a un agente de direccionamiento TT o una fracción de enmascaramiento MM, y donde T y G denotan cada uno independientemente H, o un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en alquilo, F, Cl, Br e I, y XD es como se definió anteriormente para la fórmula (1a).
Preferiblemente, cada Ray cada Rd se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, O-alquilo, O-arilo, OH, C(=O)NR'R'', NR'C(=O)-R''', con R' y R'' cada uno independientemente siendo H, arilo o alquilo, y siendo R''' independientemente alquilo o arilo.
En los dienófilos anteriores, se prefiere que al menos dos enlaces exocíclicos fijados en el mismo plano se seleccionen del grupo que consiste en (a) los enlaces sencillos de un anillo de ciclobutilo condensado, (b) los enlaces hibridados de un anillo aromático condensado, (c) un doble enlace exocíclico a un oxígeno, y (d) un doble enlace exocíclico a un carbono.
El TCO, que contiene una o dos fracciones XD, puede consistir en múltiples isómeros, que también comprenden el posicionamiento ecuatorial versus el axial de sustituyentes, tales como XD, en el TCO. En este sentido, se hace referencia a Whitham et al. J. Chem. Soc. (C), 1971,883-896, que describe la síntesis y caracterización de los isómeros ecuatoriales y axiales de trans-ciclo-oct-2-en-ol, identificados como (1RS, 2RS) y (1SR, 2RS), respectivamente. En estos isómeros, el sustituyente OH está en la posición ecuatorial o axial.
En una realización preferida, para estructuras de profármacos donde la XD puede estar en la posición axial o ecuatorial, la XD está en posición axial.
Los dienófilos preferidos, que se seleccionan de manera óptima para la liberación del fármaco que se cree que procede a través de un mecanismo de eliminación en cascada, se seleccionan de las siguientes estructuras:
Figure imgf000013_0001
• = resto de TT o SP-TT o MM o SP-MM unidos
= resto de DD, Ld-Dd unidos, que comprende opcionalmente TT o SP-TT o MM o Sp-M1''
Figure imgf000013_0002
Figure imgf000014_0001
= resto de TT o SP-TT o MM o SP-MM unidos = resto de DD, Ld-Dd unidos, que opcionalmente
Figure imgf000014_0002
comprende TT o SP-TT o MM o Sp-Mm
Figure imgf000014_0003
Figure imgf000015_0001
-----= resto de TT o SP-TT o MM o SP-MM unidos
= resto de DD, Ld-Dd unidos, que comprende opcionalmente TT o SP-TT o MM o SP-MM
Uso de TCO como un portador
La invención también se refiere al uso de un frans-cicloocteno que satisface la fórmula (1a), en todas sus realizaciones, como vehículo para un compuesto terapéutico. El frans-cicloocteno debe leerse como un TCO en un sentido amplio, como se discutió anteriormente, preferiblemente un anillo solo de carbono o que incluye uno o dos heteroátomos. Un compuesto terapéutico es un fármaco u otro compuesto o fracción destinado a tener una aplicación terapéutica. El uso de TCO como vehículo de acuerdo con este aspecto de la invención no se relaciona con la actividad terapéutica del compuesto terapéutico. De hecho, también si el compuesto terapéutico es un fármaco destinado a ser desarrollado como fármaco, muchos de los cuales fallarán en la práctica, la aplicación de TCO como vehículo sigue siendo útil para probar el fármaco. En este sentido, el TCO en su capacidad de vehículo debe considerarse de la misma manera que un excipiente farmacéutico, sirviendo como vehículo cuando se introduce un fármaco en un sujeto.
El uso de un TCO como vehículo tiene la ventaja de que permite la administración, a un sujeto, de un fármaco transportado por una fracción que está abierta a una reacción bioortogonal, con un dieno, particularmente una tetrazina. Esto proporciona una poderosa herramienta no solo para afectar el destino del fármaco transportado al cuerpo, sino también para seguir su destino (p. ej., al permitir que un dieno marcado reaccione con él) o para cambiar su destino (p. ej., al permitir que los agentes modificadores de pK se unan con él). Todo esto se basa en la posibilidad de dejar que un dieno reaccione con el TCO en la reacción rDA discutida anteriormente. El vehículo preferiblemente se hace reaccionar con un activador como se describe a continuación, para provocar la liberación del compuesto terapéutico del TCO, como se analiza ampliamente en este documento.
Activador
El activador comprende un grupo reactivo bioortogonal, donde este grupo reactivo bioortogonal del activador es un dieno. Este dieno reacciona con el otro grupo reactivo bioortogonal, el desencadenador, y ese es un dienófilo (véase más arriba). El dieno del activador se selecciona de modo que sea capaz de reaccionar con el dienófilo del desencadenador experimentando una cicloadición de Diels-Alder seguida de una reacción retro de Diels-Alder, produciendo el aducto retro de Diels-Alder. Este aducto intermedio luego libera el fármaco o los fármacos, donde esta liberación del fármaco puede ser causada por diversas circunstancias o condiciones que se relacionan con la estructura molecular específica del aducto retro de Diels-Alder. Sin desear limitarse a ninguna teoría, los inventores creen que el activador se selecciona para provocar la liberación del fármaco a través de una eliminación o eliminación en cascada (a través de una reacción de eliminación intramolecular dentro del aducto retro de Diels-Alder). Esta reacción de eliminación puede ser una reacción simple de una sola etapa, o puede ser una reacción de múltiples etapas que involucra una o más estructuras intermedias. Estas estructuras intermedias pueden ser estables durante algún tiempo o pueden degradarse inmediatamente al producto final termodinámico o a la siguiente estructura intermedia. Cuando se trata de varias etapas, se puede hablar de una reacción en cascada. En cualquier caso, ya sea un proceso simple o en cascada, el resultado de la reacción de eliminación es que el fármaco se libera del aducto retro de Diels-Alder. Sin desear limitarse a la teoría, el diseño de ambos componentes (es decir, el activador del dieno y el desencadenador del dienófilo) es tal que la distribución de electrones dentro del aducto retro de Diels-Alder es desfavorable, por lo que debe ocurrir una reorganización de estos electrones. Esta situación inicia la reacción de eliminación intramolecular (cascada) y por lo tanto induce la liberación del fármaco o fármacos. La ocurrencia de la reacción de eliminación y la liberación del fármaco del profármaco no es eficaz o no puede tener lugar antes de la reacción retro de Diels-Alder, ya que el propio profármaco es relativamente estable como tal. La eliminación solo puede tener lugar después de que el activador y el profármaco hayan reaccionado y se hayan ensamblado en el aducto retro de Diels-Alder.
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Sin desear limitarse a la teoría, los dos ejemplos anteriores ilustran cómo la distribución desfavorable de electrones dentro del aducto retro de Diels-Alder puede mejorarse mediante una reacción de eliminación, liberando así el fármaco. En un escenario, el proceso de eliminación produce el producto final A, donde este producto tiene una conjugación de dobles enlaces que aún no estaba presente en el aducto retro de Diels-Alder. La especie A puede tautomerizarse hasta el producto final B, o puede reorganizarse para formar el producto final C. Luego, el anillo de dihidropiridazina no aromático en el aducto retro de Diels-Alder se ha convertido en el anillo de piridazina aromática en el producto final C. El experto comprenderá que la distribución de electrones en el aducto retro de Diels-Alder es generalmente desfavorable en relación con la distribución de los electrones en los productos finales, ya sea de especies A o B o C. Por lo tanto, la formación de una especie más estable que el aducto retro de Diels-Alder es la fuerza impulsora de la reacción de eliminación (en cascada). En cualquier caso, y sea cual sea la forma en que se considere el proceso, la especie de fármaco (aquí la amina 'fármaco-NH2') se expulsa efectivamente del aducto retro de Diels-Alder, mientras que no se expulsa del profármaco solo.
El siguiente esquema muestra un posible mecanismo de liberación alternativo para la eliminación en cascada, además de los dos discutidos anteriormente. Sin desear limitarse a la teoría, los siguientes ejemplos ilustran cómo la distribución desfavorable de electrones dentro del aducto retro de Diels-Alder puede mejorarse mediante una reacción de eliminación, liberando así el fármaco. Este proceso puede evolucionar a través de varias tautomerizaciones que están todas en equilibrio. En el presente documento, la reacción rDA produce los tautómeros A y B, que pueden intercambiarse entre sí. El tautómero B puede conducir a la eliminación en el producto C y luego en D.
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El activador es un dieno. El experto en la materia es consciente de la riqueza de dienos que son reactivos en la reacción retro de Diels-Alder. El dieno comprendido en el activador puede formar parte de una estructura de anillo que comprende un tercer doble enlace, tal como una tetrazina (que es un activador preferido de acuerdo con la invención). Generalmente, el activador es una molécula que comprende una fracción heterocíclica que comprende al menos 2 dobles enlaces conjugados.
Los dienos de acuerdo con las reivindicaciones se presentan a continuación, con referencia a las fórmulas (2)-(4).
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En la fórmula (2) R1 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, CF3, CF2-R', OR', SR', C(=O)R', C(=S)R', C(=O)O-R', C(=O)S-R', C(=S)O-R', C(=S)S-R", C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'R", NR'C(=O)R", NR'C(=S)R", NR'C(=O)OR", NR'C(=S)OR", NR'C(=O)SR", NR'C(=S)SR", NR'C(=O)NR"R", NR'C(=S)NR"R" siendo cada R' y cada R'' independientemente H, arilo o alquilo; A y B se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en carbono sustituido con alquilo, carbono sustituido con arilo, nitrógeno, N+O-, N+R siendo R alquilo, con la condición de que A y B no sean ambos carbono; X se selecciona del grupo que consiste en O, N-alquilo y C=O, e Y es CR con R seleccionado del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, C(=O)OR', C(=O)SR', C(=S)OR', C(=S)SR', C(=O)NR'R'' siendo R' y R'' cada uno independientemente H, arilo o alquilo.
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Un dieno particularmente adecuado como compañero de reacción para el cicloocteno se presenta en la fórmula (3), donde R1 y R2 cada uno independientemente se seleccionan del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, CF3 , CF2-R', NO2 , OR', SR', C(=O)R', C(=S)R', OC(=O)R''', SC(=O)R''', OC(=S)R''', SC(=S)R''', S(=O)R', S(=O)2R''', S(=O)2NR'R'', C(=O)OR', C(=O)SR', C(=S)OR', C(=S)S-R', C(=O)NR'R'', C(=S)NR'R'', NR'R'', NR'C(=O)R'', NR'C(=S)R'', NR'C(=O)OR'', NR'C(=S)OR'', NR'C(=O)SR'', NR'C(=S)SR'', OC(=O)NR'R'', SC(=O)NR'R'', OC(=S)NR'R'', SC(=S )NR'R'', NR'C(=O)NR''R'', NR'C(=S)NR''R'' siendo cada R' y cada R'' independientemente H, arilo o alquilo, y siendo R''' independientemente arilo o alquilo; A se selecciona del grupo que consiste en N-alquilo, N-arilo, C=O y CN-alquilo; B es O o S; X se selecciona del grupo que consiste en N, CH, C-alquilo, C-arilo, c C(=O)R', CC(=S)R', CS(=O)R', CS(=O)2R''', CC(=O)O-R', CC(=O)S-R', CC(=S)O-R', CC(=S)S-R', CC(=O)NR'R'', CC(=S)NR'R'', siendo R' y R'' cada uno independientemente H, arilo o alquilo y siendo R''' independientemente arilo o alquilo; Y se selecciona del grupo que consiste en CH, C-alquilo, C-arilo, N y N+O-.
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Otro dieno particularmente adecuado como compañero de reacción para el cicloocteno es el dieno (4), donde R1 y R2 cada uno independientemente se seleccionan del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, CF3 , CF2-R', NO, NO2 , OR', SR', CN, C(=O)R', C(=S)R', OC(=O)Rm, SC(=O)Rm, OC(=S)Rm, SC(=S)Rm, S(=O)R', S(=O)2Rm, S(=O)2OR', PO3R'R", S(=O)2NR'R", C(=O)O-R', C(=O)S-R', C(=S)O-R', C(=S)S-R', C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'R", NR'C(=O)R", NR'C(=S)R", NR'C(=O)OR", NR'C(=S)OR", NR'C(=O)SR", NR'C(=S)SR", OC(=O)NR'R", SC(=O)NR'R", OC(=S)NR'R", SC(=S)n R'R", NR'C(=O)NR"R", NR'C(=S)NR"R" siendo cada R' y cada R'' independientemente H, arilo o alquilo, y siendo R''' independientemente arilo o alquilo; A se selecciona del grupo que consiste en N, C-alquilo, C-arilo y N+O'; B es N; X se selecciona del grupo que consiste en N, CH, C-alquilo, C-arilo, CC(=O)R', CC(=S)R', CS(=O)R', CS(=O)2Rm, CC(=O)O-R', CC(=O)S-R', CC(=S)O-R', CC(=S)S-R', CC(=O)NR'R", CC(=S)NR'R", siendo R' y R'' cada uno independientemente H, arilo o alquilo y siendo R''' independientemente arilo o alquilo; Y se selecciona del grupo que consiste en CH, C-alquilo, C-arilo, N y N+O-.
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De acuerdo con la invención, los dienos particularmente útiles son los derivados de 1,2-diazina, 1,2,4-triazina y 1,2,4,5-tetrazina, como se indica en las fórmulas (5), (6) y (7), respectivamente.
La 1,2-diazina se presenta en (5), en donde R1 y R2 cada uno independientemente se seleccionan del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, CF3, CF2-R', NO2 , OR', SR', C(=O)R', C(=S)R', OC(=O)Rm, SC(=O)Rm, OC(=S)Rm, SC(=S)Rm, S(=O)R', S(=O)2Rm, S(=O)2NR'R", C(=O)O-R', C(=O)S-R', C(=S)O-R', C(=S)S-R', C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'R", NR'C(=O)R", NR'C(=S)R", NR'C(=O)OR", NR'C(=S)OR", NR'C(=O)SR", NR'C(=S)SR", OC(=O)NR'R", SC(=O)NR'R", OC(=S)NR'R", SC(=S)NR'R", NR'C(=O)NR"R", NR'C(=S)NR"R" siendo cada R' y cada R'' independientemente H, arilo o alquilo, y siendo R''' independientemente arilo o alquilo; X e Y se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en O, N-alquilo, N-arilo, C=O, CN-alkyl, CH, C-alkyl, C-aryl, CC(=O)R', CC(=S)R', CS(=O)R', CS(=O)2Rm, CC(=O)O-R', CC(=O)S-R', CC(=S)O-R', CC(=S)S-R', CC(=O)NR'R", CC(=S)NR'R", siendo R' y R'' cada uno independientemente H, arilo o alquilo y siendo R''' independientemente arilo o alquilo, donde X-Y puede ser un enlace sencillo o doble, y donde X e Y pueden estar conectados en una segunda estructura de anillo aparte de la diazina de 6 miembros. Preferiblemente, X-Y representa un grupo éster (X = O e Y = C=O; X-Y es un enlace sencillo) o X-Y representa un grupo cicloalcano (X = CR' e Y = CR''; X-Y es un enlace sencillo; R' y R'' están conectados), preferiblemente un anillo de ciclopropano, de modo que R' y R'' están conectados entre sí en el primer átomo de carbono fuera del anillo de 1,2-diazina.
La 1,2,4-triazina se presenta en (6), en donde R1 y R2 cada uno independientemente se seleccionan del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, CF3, CF2-R', NO2 , OR', SR', C(=O)R', C(=S)R', OC(=O)Rm, SC(=O)Rm, OC(=S)Rm, SC(=S)R", S(=O)R', S(=O)2Rm, S(=O)2NR'R", C(=O)O-R', C(=O)S-R', C(=S)O-R', C(=S)S-R', C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'R", NR'C(=O)R", NR'C(=S)R", NR'C(=O)OR", NR'C(=S)OR", NR'C(=O)SR", NR'C(=S)SR", OC(=O)NR'R", SC(=O)NR'R", OC(=S)NR'R", SC(=S)NR'R", NR'C(=O)NR"R", NR'C(=S)NR"R" siendo cada R' y cada R'' independientemente H, arilo o alquilo, y siendo R''' independientemente arilo o alquilo; X se selecciona del grupo que consiste en CH, C-alquilo, C-arilo, CC(=O)R', CC(=S)R', CS(=O)R', CS(=O)2R", CC(=O)O-R', CC(=O)S-R', Cc (=S)O-R', CC(=S)S-R', CC(=O)NR'R", CC(=S)Nr 'R", siendo R' y R'' cada uno independientemente H, arilo o alquilo y siendo R''' independientemente arilo o alquilo.
La 1,2,4,5-tetrazina se presenta en (7), en donde R1 y R2 cada uno independientemente se seleccionan del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, CF3 , CF2-R', NO, NO2 , OR', SR', CN, C(=O)R', C(=S)R', OC(=O)R", SC(=O)R", OC(=S)R", SC(=S)R", S(=O)R', S(=O)2R", S(=O)2OR', PO3R'R", S(=O)2NR'R", C(=O)O-R', C(=O)S-R', C(=S)O-R', C(=S)S-R', C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'R", NR'C(=O)R", NR'C(=S)R", NR'C(=O)OR", NR'C(=S)OR", NR'C(=O)SR", NR'C(=S)SR", OC(=O)NR'R", SC(=O)NR'R", OC(=S)NR'R", SC(=S)NR'R", NR'C(=O)NR"R", NR'C(=S)NR"R" siendo cada R' y cada R'' independientemente H, arilo o alquilo, y siendo R''' independientemente arilo o alquilo.
Las 1,2-diazinas (5), 1,2,4-triazinas (5) o 1,2,4,5-tetrazinas (7) deficientes en electrones son especialmente interesantes ya que tales dienos son generalmente más reactivos con los dienófilos. Las di-tri- o tetra-azinas son deficientes en electrones cuando están sustituidas con grupos o fracciones que generalmente no se mantienen como donantes de electrones, o con grupos que son aceptores de electrones. Por ejemplo, R1 y/o R2 puede denotar un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en H, alquilo, NO2 , F, Cl, CF3, CN, COOR, COn Hr , CONR2 , COR, SO2R, SO2OR, SO2NR2 , PO3R2, NO, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2,6-pirimidilo, 3,5-pirimidilo, 2,4-pirimidilo, 2,4-imidazilo, 2,5-imidazilo o fenilo, opcionalmente sustituido con uno o más grupos aceptores de electrones tales como NO2 , F, Cl, CF3, CN, COOR, CONHR, CONR, COR, SO2R, SO2OR, SO2NR2, PO3R2, NO, Ar, donde R es H o alquilo C1-C6 y Ar representa un grupo aromático, particularmente fenilo, piridilo o naftilo.
Las 1,2,4,5-tetrazinas de fórmula (7) son las más preferidas como dienos activadores, ya que estas moléculas son más reactivas en reacciones retro de Diels-Alder con dienófilos, tal como los dienófilos TCO preferidos, incluso cuando los grupos R1 y/o R2 no son necesariamente aceptores de electrones, e incluso cuando R1 y/o R2 son de hecho donantes de electrones. Los grupos donantes de electrones son, por ejemplo, OH, OR', SH, SR', NH2 , NHR', NR'R", NHC(=O)R", NR'C(=O)R", NHC(=S)R", NR'C(=S)R", NHSO2R", NRSO2R" siendo R' y R'' cada uno independientemente grupos alquilo o arilo. Ejemplos de otros grupos donantes de electrones son los grupos fenilo con uno o más de los grupos donantes de electrones unidos a ellos que se mencionan en la lista anterior, especialmente cuando se sustituyen en las posiciones 2, 4 y/o 6 del grupo fenilo.
De acuerdo con la invención, las 1,2,4,5-tetrazinas con dos residuos aceptores de electrones, o aquellas con un residuo aceptor de electrones y un residuo que no es ni aceptor ni donador de electrones, se denominan deficientes en electrones. De manera similar, las 1,2,4,5-tetrazinas con dos residuos donantes de electrones, o aquellas con un residuo donante de electrones y un residuo que no es ni aceptor ni donante de electrones, se denominan suficientes en electrones. Las 1,2,4,5-tetrazinas con dos residuos que no son ni aceptores ni donantes de electrones, o aquellas que tienen un residuo aceptor de electrones y un residuo donante de electrones, no son ni deficientes ni suficientes en electrones.
Las 1,2,4,5-tetrazinas pueden ser de naturaleza asimétrica o simétrica, es decir, los grupos R1 y R2 en la fórmula (7) pueden ser grupos diferentes o pueden ser grupos idénticos, respectivamente. Las 1,2,4,5-tetrazinas simétricas son más convenientes ya que estos activadores son más fácilmente accesibles a través de procedimientos de síntesis.
Se han probado varias 1,2,4,5-tetrazinas con respecto a su capacidad como activadores para liberar un compuesto farmacológico modelo (p. ej., bencilamina) a partir de un profármaco a través de un proceso de eliminación (cascada), y se ha descubierto que las tetrazinas que son deficientes en electrones, suficientes en electrones o ni deficientes en electrones ni suficientes en electrones son capaces de inducir la liberación del fármaco. Además, tanto las tetrazinas simétricas como las asimétricas fueron eficaces.
Las 1,2,4,5-tetrazinas deficientes en electrones y las 1,2,4,5-tetrazinas que no son ni deficientes en electrones ni suficientes en electrones son generalmente más reactivas en las reacciones retro de Diels-Alder con dienófilos (tales como los TCO), por lo que estas dos clases de 1,2,4,5-tetrazinas son preferibles a las 1,2,4,5-tetrazinas suficientes en electrones, aunque estas últimas también son capaces de inducir la liberación de fármacos en profármacos.
En los siguientes párrafos, se resaltarán ejemplos específicos de activadores de 1,2,4,5-tetrazina de acuerdo con la segunda realización de esta invención definiendo los residuos R1 y R2 en la fórmula (7).
Las 1,2,4,5-tetrazinas simétricas deficientes en electrones con residuos aceptores de electrones son, por ejemplo, aquellas con R1 = R2 = H, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2,4-pirimidilo, 2,6-pirimidilo, 3,5-pirimidilo, 2,3,4-triazilo o 2,3,5-triazilo. Otros ejemplos son aquellos con R1 = R2 = fenilo con COOH o carboxilato COOMe, o con nitrilo CN, o con CONH2 , CONHCH3 o amida CON(CH3)2 , o con SO3H o sulfonato SO3Na, o con SO2NH2, SO2NHCH3 , o sulfonamida SO2N(CH3)2 o con PO3H2 o sustituyentes de fosfonato PO3Na2 en la posición 2, 3 o 4 del grupo fenilo, o en las posiciones 3 y 5, o en las posiciones 2 y 4, o en las posiciones 2, y 6 del grupo fenilo. También son posibles otros patrones de sustitución, incluido el uso de diferentes sustituyentes, siempre que la tetrazina permanezca simétrica. Véase a continuación algunos ejemplos de estas estructuras.
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Las 1,2,4,5-tetrazinas simétricas suficientes en electrones con residuos donantes de electrones son, por ejemplo, aquellas con R1 = R2 = OH, OR', SH, SR', NH2, NHR', NR'2, NH-COR', NH-SO-R', NH-SO2-R', 2-pirrilo, 3-pirrilo, 2-tiofeno, 3-tiofeno, donde R' representa un grupo metilo, etilo, fenilo o tolilo. Otros ejemplos son aquellos con un sustituyente o sustituyentes R1 = R2 = fenilo con OH, OR', SH, SR', NH2 , NHR', NR'2 , NH-CO-R', NR''-CO-R', NH-SO-R' o NH-SO2-R', donde R' representa un grupo metilo, etilo, fenilo o tolilo, donde R'' representa un grupo metilo o etilo, y donde la sustitución se realiza sobre la o las posiciones 2 o 3 o 4 o 2 y 3 o 2 y 4 o 2 y 5 o 2 y 6 o 3 y 4 o 3 y 5 o 3, 4 y 5. Véase a continuación algunos ejemplos de estas estructuras.
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Las 1,2,4,5-tetrazinas simétricas sin residuos aceptores de electrones ni donantes de electrones son, por ejemplo, aquellas con R1 = R2 = fenilo, metilo, etilo, (iso)propilo, 2,4-imidazilo, 2,5-imidazilo, 2,3-pirazilo o 3,4-pirazilo. Otros ejemplos son aquellos donde R1 = R2 = a un ciclo hetero(aromático) tal como un ciclo de oxazol, isoxazol, tiazol u oxazolina. Otros ejemplos son aquellos donde R1 = R2 = un fenilo con un sustituyente aceptor de electrones seleccionado de COOH, COOMe, CN, CONH2 , CONHCH3 , CON(CHa)2 , SO3H, SOaNa, SO2NH2, SO2NHCH3, SO2N(CHa)2, PO3H2 o PO3Na2 y un sustituyente donador de electrones seleccionado del sustituyente o sustituyentes OH, OR', SH, SR', NH2 , NHR', NR'2 , NH-CO-R', NR''-CO-R', NH-SO-R' o NH-SO2-R', donde R' representa un grupo metilo, etilo, fenilo o tolilo y donde R'' representa un grupo metilo o etilo. Las sustituciones se pueden hacer en las posiciones 2 y 3, 2 y 4, 2 y 5, 2 y 6 , 3 y 4, y 3 y 5. Sin embargo, otros ejemplos son aquellos donde R1 = R2 = una fracción piridilo o pirimidilo con un sustituyente donador de electrones seleccionado entre los sustituyentes OH, OR', SH, SR', NH2 , NHR', NR'2 , NH-CO-R', NR''-CO-R', NH-SO-R' o NH-SO2-R', donde R' representa un grupo metilo, etilo, fenilo o tolilo y donde R'' representa un grupo metilo o etilo. Véase a continuación algunos ejemplos.
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En caso de que se consideren 1,2,4,5-tetrazinas asimétricas, se puede elegir cualquier combinación dada de residuos R 1 y R2 que se han resaltado y enumerado anteriormente para las tetrazinas simétricas de acuerdo con la fórmula (7), siempre que, por supuesto, R1 y R2 sean diferentes. Las 1,2,4,5-tetrazinas asimétricas preferidas son aquellas donde al menos uno de los residuos R1 o R2 es de naturaleza aceptora de electrones. A continuación se encuentran algunos ejemplos de estructuras dibujadas.
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Otras consideraciones sobre el activador
Los activadores preferidos son 1,2-diazinas, 1,2,4-triazinas y 1,2,4,5-tetrazinas, particularmente 1,2,4,5-tetrazinas, son los activadores de dieno preferidos. A continuación, se destacarán algunas características relevantes del activador, donde también se hará evidente que hay muchas opciones para diseñar la formulación correcta del activador para cada aplicación específica.
De acuerdo con la invención, el activador, por ejemplo, una 1,2,4,5-tetrazina, tiene propiedades farmacológicas y farmacocinéticas útiles y beneficiosas, lo que implica que el activador no es tóxico o al menos tiene una toxicidad suficientemente baja, produce metabolitos que también tienen una toxicidad suficientemente baja, es suficientemente soluble en soluciones fisiológicas, se puede aplicar en formulaciones acuosas o de otro tipo que se usan de forma rutinaria en productos farmacéuticos, y tienen el valor log D correcto donde este valor refleja el equilibrio hidrófilo/ hidrófobo de la molécula activadora a pH fisiológico. Como se sabe en la técnica, los valores de log D pueden ser negativos (moléculas hidrófilas) o positivos (moléculas hidrófobas), donde cuanto más bajos o más altos se vuelven los valores de log D, más hidrófilas o más hidrófobas son las moléculas, respectivamente. Los valores de log D se pueden predecir de manera bastante adecuada para la mayoría de las moléculas, y los valores de log D de los activadores se pueden ajustar agregando o eliminando grupos polares o apolares en sus diseños. A continuación se encuentran algunos diseños de activadores con sus correspondientes valores de log D calculados (a pH = 7,4). Téngase en cuenta que la adición de grupos metilo, cicloalquileno, piridina, amina, alcohol o sulfonato o la eliminación de grupos fenilo modifica el valor de log D, y que se puede acceder a una gama muy amplia de valores de log D.
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Los números de log D presentados se han calculado a partir de un método ponderado, con igual importancia de los métodos 'VG' (Viswanadhan, V. N.; Ghose, A. K.; Revankar, G. R.; Robins, R. K., J. Chem. Inf. Comput. Sci., 1989, 29, 163-172), 'KLOP' (de acuerdo con Klopman, G.; Li, Ju-Yun.; Wang, S.; Dimayuga, M.: J. Chem. Inf. Comput. Sci., 1994, 34, 752) y 'PHYS' (de acuerdo con la base de datos PHYSPROP©), con base en una solución acuosa en 0.1 M en Na+/K+ Cl-.
El activador de acuerdo con la invención tiene una reactividad apropiada hacia el profármaco, y esto puede regularse haciendo que el dieno, particularmente las 1,2,4,5-tetrazinas, sean suficientemente deficientes en electrones. Una reactividad suficiente asegurará una reacción retro de Diels-Alder rápida con el profármaco tan pronto como sea alcanzado por el activador.
El activador de acuerdo con la invención tiene una buena biodisponibilidad, lo que implica que está disponible dentro del cuerpo (humano) para ejecutar su propósito previsto: llegar efectivamente al profármaco en el objetivo principal. En consecuencia, el activador no se adhiere significativamente a los componentes sanguíneos o al tejido que no sea el objetivo. El activador puede estar diseñado para unirse a las proteínas de albúmina que están presentes en la sangre (para aumentar el tiempo de circulación en la sangre, como se sabe en la técnica), pero al mismo tiempo debe liberarse eficazmente del torrente sanguíneo para ser capaz de alcanzar el profármaco. Por consiguiente, la unión a la sangre y la liberación de la sangre deben equilibrarse adecuadamente. El tiempo de circulación en la sangre del activador también se puede aumentar incrementando el peso molecular del activador, por ejemplo, uniendo grupos de polietilenglicol (PEG) al activador ("pegilación"). Alternativamente, la PKPD del activador puede modularse conjugando el activador con otra fracción tal como un polímero, proteína, péptido (corto), carbohidrato.
El activador de acuerdo con la invención puede ser multimérico, de manera que se pueden unir múltiples fracciones de dieno a una estructura molecular, particularmente, por ejemplo, a moléculas multifuncionales, carbohidratos, polímeros, dendrímeros, proteínas o péptidos, donde estas estructuras son preferiblemente solubles en agua. Ejemplos de estructuras que se pueden usar son polietilenglicoles (multifuncionales), dendrímeros de poli(propilenimina) (PPI), dendrímeros PAMAM, dendrímeros basados en glicol, derivados de heparina, derivados de ácido hialurónico o proteínas de albúmina sérica tales como HSA.
Dependiendo de la posición del profármaco (p. ej., dentro o fuera de la célula, órgano específico al que se dirige), el activador está diseñado para poder llegar de forma eficaz a este profármaco. Por lo tanto, el activador se puede adaptar, por ejemplo, variando su valor de log D, su reactividad o su carga. El activador puede incluso diseñarse con un agente de direccionamiento (p. ej., una proteína, un péptido y/o una fracción de azúcar), de modo que se pueda alcanzar el objetivo principal de forma activa en lugar de pasiva. En caso de que se aplique un agente de direccionamiento, se prefiere que sea una fracción simple (es decir, un péptido corto o un azúcar simple).
De acuerdo con la invención, se puede aplicar una mezcla de diferentes activadores. Esto puede ser relevante para la regulación del perfil de liberación del fármaco.
El activador que de acuerdo con la invención provocará y regulará la liberación del fármaco en el objetivo principal puede modificarse adicionalmente con fracciones que proporcionen una función o funciones adicionales al activador, ya sea para estudios o aplicaciones in vitro y/o in vivo. Por ejemplo, el activador puede modificarse con fracciones colorantes o fracciones fluorescentes (véase, por ejemplo, S. Hilderbrand et al., Bioconjugate Chem., 2008, 19, 2297­ 2299 para 3-(4-bencilamino)-1,2,4,5-tetrazina que está amidada con el fluoróforo VT6 8 0 del infrarrojo cercano (NIR), o pueden funcionalizarse con sondas de formación de imágenes, donde estas sondas pueden ser útiles en modalidades de formación de imágenes, tales como las técnicas PET o SPECT de formación de imágenes nucleares. De esta forma, el activador no solo iniciará la liberación del fármaco, sino que también puede localizarse dentro del cuerpo (humano) y, por lo tanto, puede utilizarse para localizar el profármaco dentro del cuerpo (humano). En consecuencia, se puede controlar la posición y la cantidad de liberación del fármaco. Por ejemplo, el activador se puede modificar con ligandos DOTA (o DTPA), donde estos ligandos son ideales para formar complejos con iones 111In3+ para formación de imágenes nucleares. En otros ejemplos, el activador puede estar enlazado a fracciones de 123I o 18F, que están bien establecidas para su uso en formación de imágenes SPECT o PET, respectivamente. Además, cuando se usa en combinación, por ejemplo, con isótopos emisores de beta, tales como Lu-177 o Y-90, la activación del profármaco se puede combinar con radioterapia localizada en un formato predireccionado.
Los activadores preferidos son:
Figure imgf000023_0001
La 1,2,4,5-tetrazina dada en la fórmula (8 a) y (8 b), donde cada R1 y cada R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, CF3, CF2-R', NO2, OR', SR', C(=O)R', C(=S)R', OC(=O)Rm, SC(=O)Rm, OC(=S)Rm, SC(=S)Rm, S(=O)R', S(=O)2Rm, S^O^NR'R", C(=O)O-R', C(=O)S-R', C(=S)O-R', C(=S)S-R', C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'R", NR'C(=O)R", NR'C(=S)R", NR'C(=O)OR", NR'C(=S)OR", NR'C(=O)SR", NR'C(=S)SR", OC(=O)NR'R", SC(=O)NR'R", OC(=S)NR'R", SC(=S)NR'R", NR'C(=O)NR"R", NR'C(=S)NR"R" siendo cada R' y cada R'' independientemente H, arilo o alquilo, y siendo R''' independientemente arilo o alquilo.
Otros activadores preferidos son:
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Figure imgf000024_0001
El activador puede tener un enlace con una fracción deseado, tal como un péptido, una proteína, un carbohidrato, un PEG o un polímero. Preferiblemente, estos activadores satisfacen una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000024_0003
Profármaco
Un profármaco es un conjugado del fármaco DD y el desencadenador TR y por lo tanto comprende un fármaco que es capaz de una acción terapéutica después de su liberación del desencadenador. Dicho profármaco puede tener opcionalmente especificidad por objetivos de enfermedad.
La fórmula general del profármaco se muestra a continuación en las fórmulas (9a) y (9b).
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(9a) (9b)
La fracción YM puede ser un agente de direccionamiento TT o una fracción de enmascaramiento MM; SP es un espaciador; TR es un desencadenador, LD es un enlazador, y DD es un fármaco.
Para aplicaciones donde los fármacos se liberan de un agente de direccionamiento: YM es un agente de direccionamiento TT;
Fórmula (9a): k = 1; m, r > 1; t, n > 0.
Fórmula (9b): k = 1; m, n, r > 1; t > 0.
Para aplicaciones donde se desenmascaran los fármacos enmascarados: YM es una fracción de enmascaramiento MM;
Fórmula (9a) y (9b): r = 1; m > 1; k, n, t > 0.
Aunque se ha omitido en aras de la claridad en la fórmula anterior, DD puede comprender además TT y/o MM, opcionalmente a través de SP.
Los fármacos que se pueden usar en un profármaco relevante para esta invención incluyen, entre otros: anticuerpos, derivados de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, Fab2, Fab, scFV, diacuerpos, triacuerpos, fusiones de anticuerpos (fragmentos) (por ejemplo, fragmentos de mAb biespecíficos y triespecíficos), proteínas, aptámeros, oligopéptidos, oligonucleótidos, oligosacáridos, así como péptidos, peptoides, esteroides, compuestos de fármacos orgánicos, toxinas, hormonas, virus, células enteras, fagos. Los fármacos típicos para los que es adecuada la invención incluyen, pero no se limitan a: fragmentos de mAb biespecíficos y triespecíficos, inmunotoxinas, que comprenden, por ejemplo, ricina A, toxina de la difteria, toxina del cólera. Otras realizaciones utilizan auristatinas, maitansinas, caliqueamicina, duocarmicinas, maitansinoides DM1 y DM4, auristatina MMAE, CC1065 y sus análogos, camptotecina y sus análogos, SN-38 y sus análogos; agentes antiproliferativos/antitumorales, antibióticos, citoquinas, agentes antiinflamatorios, agentes antivirales, agentes antihipertensivos, agentes quimiosensibilizadores y radiosensibilizadores. En otras realizaciones, el fármaco DD liberado es en sí mismo un profármaco diseñado para liberar otro fármaco DD Los fármacos incluyen opcionalmente una fracción de translocación de membrana (adamantina, polilisina/arginina, TAT) y/o un agente de direccionamiento (contra, por ejemplo, un receptor de células tumorales) opcionalmente enlazado a través de un enlazador estable o lábil.
Los ejemplos de fármacos para usar como conjugados con el derivado de TCO y para ser liberados tras la reacción retro de Diels-Alder con el activador incluyen, pero no se limitan a: fármacos citotóxicos, particularmente aquellos que se usan para la terapia del cáncer. Dichos fármacos incluyen, en general, agentes que dañan el ADN, antimetabolitos, productos naturales y sus análogos. Los ejemplos de clases de agentes citotóxicos incluyen inhibidores de enzimas tales como inhibidores de la dihidrofolato reductasa e inhibidores de la timidilato sintasa, alquiladores de ADN, sensibilizadores de radiación, intercaladores de ADN, escindidores de ADN, agentes antitubulina, inhibidores de topoisomerasas, fármacos a base de platino, la familia de fármacos de antraciclinas, los fármacos de la vinca, las mitomicinas, las bleomicinas, los nucleósidos citotóxicos, los taxanos, las lexitropsinas, la familia de fármacos de las pteridinas, los diinenos, las podofilotoxinas, las dolastatinas, los maitansinoides, los inductores de la diferenciación y los taxoles. Miembros particularmente útiles de esas clases incluyen, por ejemplo, duocarmicina, metotrexato, metopterina, diclorometotrexato, aglutinantes del surco menor del ADN de 5-fluorouracilo, 6 -mercaptopurina, arabinósido de citosina, melfalán, leurosina, leurosideína, actinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, mitomicina C, mitomicina A, caminomicina, aminopterina, talisomicina, podofilotoxina y derivados de la podofilotoxina tales como etopósido o fosfato de etopósido, vinblastina, vincristina, vindesina, taxol, ácido taxotere retinoico, ácido butírico, N8 -acetil espermidina, camptotecina, caliqueamicina, esperamicina, enediinas, y sus análogos.
Los ejemplos de fármacos incluyen las dolastatinas y sus análogos, incluidos: dolastatina A (patente de los Estados Unidos n.° 4.486.414), dolastatina B (patente de los Estados Unidos n.° 4.486.414), dolastatina 10 (patentes de los Estados Unidos n.° 4,486,444, 5,410,024, 5,504,191, 5,521,284, 5,530,097, 5,599,902, 5,635,483, 5,663,149, 5,665,860, 5,780,588, 6,034,065, 6,323,315), dolastatina 13 (patente de los Estados Unidos n.° 4,986,988), dolastatina 14 (patente de los Estados Unidos n.° 5,138,036), dolastatina 15 (patente de los Estados Unidos n.° 4,879,278), dolastatina 16 (patente de los Estados Unidos n.° 6,239,104), dolastatina 17 (patente de los Estados Unidos n.° 6,239,104), y dolastatina 18 (patente de los Estados Unidos n.° 6,239 104).
En ejemplos de realizaciones de la invención, la fracción de fármaco es una mitomicina, un alcaloide de la vinca, un taxol, una antraciclina, una caliqueamicina, un maitansinoide o una auristatina.
Se entenderá que también se pueden realizar modificaciones químicas en el compuesto deseado para hacer que las reacciones de ese compuesto sean más convenientes para preparar los conjugados de la invención. Los fármacos que contienen un grupo funcional amina para acoplarse al TCO incluyen mitomicina C, mitomicina A, daunorrubicina, doxorrubicina, aminopterina, actinomicina, bleomicina, 9-amino camptotecina, N8 -acetil espermidina, 1-(2 cloroetil)1,2-dimetanosulfonilhidrazida, talisomicina, citarabina, dolastatinas (incluyendo auristatinas) y derivados de las mismas.
Los fármacos que contienen un grupo funcional hidroxilo para acoplarse al TCO incluyen etopósido, camptotecina, taxol, esperamicina, 1,8-dihidroxi-biciclo[7.3.1]trideca-4-9-dieno-2,6-diino-13-ona (patente de los Estados Unidos n.° 5,198,560), podofilotoxina, anguidina, vincristina, vinblastina, morfolino-doxorrubicina, n-(5,5-diacetoxipentil)doxorrubicina y derivados de las mismas.
Los fármacos que contienen un grupo funcional sulfhidrilo para acoplarse al TCO incluyen esperamicina y 6 -mecaptopurina, y derivados de las mismas.
Se entenderá que los fármacos pueden unirse opcionalmente al derivado de TCO a través de un enlazador LD o un enlazador autoinmolable LD, o una combinación de los mismos, y que puede consistir en múltiples unidades (autoinmolables o no inmolables).
Se entenderá además que uno o más agentes de direccionamiento TT o fracciones de enmascaramiento MM se pueden unir opcionalmente al fármaco DD, desencadenador TR, o enlazador LD, opcionalmente a través de un espaciador o espaciadores SP.
Varios fármacos pueden ser reemplazados por una etiqueta que puede formar imágenes para medir el direccionamiento y la liberación del fármaco.
De acuerdo con una realización particular adicional de la invención, el profármaco se selecciona para dirigirse o tratar una enfermedad, tal como el cáncer, una inflamación, una infección, una enfermedad cardiovascular, por ejemplo, un trombo, una lesión aterosclerótica, un sitio hipóxico, por ejemplo, un accidente cerebrovascular, tumor, trastorno cardiovascular, trastorno cerebral, apoptosis, angiogénesis, un órgano y un gen/enzima informador.
De acuerdo con una realización, el profármaco y/o el activador pueden ser compuestos multiméricos que comprenden una pluralidad de fármacos y/o fracciones reactivas bioortogonales. Estos compuestos multiméricos pueden ser polímeros, dendrímeros, liposomas, partículas poliméricas u otros constructos poliméricos.
En el profármaco, el fármaco DD y el desencadenador TR -el derivado de TCO- pueden enlazarse directamente entre sí. También se pueden unir entre sí a través de un enlazador o un enlazador autoinmolable LD Se entenderá que la invención abarca cualquier forma concebible donde el activador dienófilo se une al fármaco. Lo mismo se aplica para la fijación de un agente de direccionamiento opcional TT o fracción de enmascaramiento MM al profármaco. Métodos para afectar la conjugación de estos fármacos, por ejemplo, a través de aminoácidos reactivos tales como lisina o cisteína en el caso de proteínas, son conocidos por el experto en la materia.
Se entenderá que la fracción de fármaco está enlazada al TCO de tal manera que el fármaco eventualmente puede ser liberado después de la formación del aducto retro de Diels-Alder. En general, esto significa que el enlace entre el fármaco y el TCO, o en el caso de un enlazador, el enlace entre el TCO y el enlazador LD, o en el caso de un enlazador autoinmolable LD, el enlace entre el enlazador y el TCO y entre el fármaco y el enlazador debe ser escindible. Predominantemente, el fármaco y el enlazador opcional se unen a través de un heteroátomo, preferiblemente a través de O, N, NH o S. El enlace escindible se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en enlaces carbamato, tiocarbamato, carbonato, éter, éster, amina, amida, tioéter, tioéster, sulfóxido y sulfonamida.
Por lo tanto, en la invención, los conceptos de enlazadores se pueden aplicar de forma análoga a los conocidos por los expertos. La mayoría de los profármacos reportados constan de tres componentes: un desencadenador, un enlazador y un fármaco original, opcionalmente una molécula de direccionamiento se une ya sea al enlazador o al desencadenador. El desencadenador, que puede, por ejemplo, ser un sustrato para una enzima específica del sitio, o un grupo lábil al pH, a menudo está conectado al fármaco original a través de un enlazador de autoeliminación. Este enlazador se incorpora para facilitar la escisión enzimática del desencadenador, aumentando la accesibilidad al sitio activo y disminuyendo el impedimento estérico del fármaco adjunto. Además, el enlazador facilita el uso sencillo de una amplia gama de profármacos en combinación con el mismo desencadenador. Además, el enlazador modula la estabilidad del profármaco, la farmacocinética, la distribución en órganos, el reconocimiento de enzimas y la cinética de liberación. Después de la activación/eliminación del desencadenador, el enlazador debe eliminarse espontáneamente para liberar el fármaco original. Dependiendo del fármaco adjunto, el enlazador o partes del mismo pueden permanecer en el fármaco sin perjudicar su acción. El concepto general se representa en el Esquema 2.
Esquema 2:
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Se pueden distinguir dos tipos de enlazadores de autoeliminación: a) el enlazador electrónico en cascada, b) el enlazador de ciclación. El ejemplo más destacado de un enlazador en cascada es el espaciador de eliminación 1,6 que se muestra en el Esquema 3 en un profármaco p-glucurónido del agente anticanceroso 9-aminocamptotecina. Tras el desenmascaramiento de la función hidroxilo aromática por la enzima p-glucuronidasa (presente en ciertas áreas tumorales necróticas), este grupo se convierte en donador de electrones e inicia una cascada electrónica que conduce a la expulsión del grupo saliente, que libera el fármaco libre tras la eliminación de CO2. Esta cascada, basada en un reordenamiento de quinona-metida, también puede ser iniciada por el par solitario de una amina o tiol no enmascarado en lugar del hidroxilo. La especie de quinona-metida formada es atrapada por el agua para formar un derivado de fenol.
Esquema 3:
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Figure imgf000027_0001
En el Esquema 4 se representan algunos otros conceptos de desencadenador-enlazador. El desencadenador en A es activado por esterasas plasmáticas. La hidrólisis del éster terc-butílico produce el grupo hidroxilo aromático libre, que inicia la cascada de quinona-metida. Esta construcción ha sido objeto de conjugación con un anticuerpo (R). En B, la hidrólisis de las cefalosporinas por las enzimas betalactamasas se utiliza como desencadenador. La hidrólisis del anillo de lactama puede provocar la expulsión del sustituyente del fármaco dependiendo de su naturaleza de grupo saliente. Los fármacos se han conjugado a través de un enlace éster, amida, sulfuro, amina y carbamato. Dos ejemplos de enlazadores basados en ciclación aromática son C y D. En C, la escisión por la penicilina G-amidasa conduce al ataque intramolecular de la amina sobre el carbonilo, liberando el fármaco. D muestra un profármaco sensible a la fosfatasa. La escisión del fosfato por la fosfatasa alcalina humana produce un hidroxilo que reacciona con una lactama liberando el fármaco. En E se muestra un ejemplo de un profármaco que se desencadena por la reducción de un grupo nitro a una amina. Esta reducción puede ser realizada por nitroreductasa en presencia de NADPH. Además, se conocen varias construcciones nitro heterocíclicas (F) que se reducen en tejido hipóxico (tumor) y, por lo tanto, pueden iniciar una cascada sin la ayuda de una enzima. Otros desencadenantes utilizados en la terapia con profármacos son sensibles a la plasmina, la tirosina hidroxilasa (altamente expresada en el neuroblastoma), la tirosinasa o la catepsina B.
Esquema 4: X = O, N, S
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La combinación y reacción entre el TCP-desencadenadory el activador
El fármaco, ya sea a través de un enlazador o no, se une preferentemente a un átomo de carbono que es adyacente al doble enlace en el anillo de TCO.
A continuación, algunas combinaciones no limitativas de profármacos de TCO y activadores de tetrazina ilustran las posibilidades de liberación de fármaco inducida por eliminación en cascada a partir del aducto retro de Diels-Alder. Téngase en cuenta que en los casos de liberación de fármacos funcionales de amina, estos pueden ser, por ejemplo, tipos de fármacos de amina primaria o secundaria, anilina, imidazol o pirrol, de modo que el fármaco puede variar en el carácter de grupo saliente. También puede ser posible la liberación de fármacos con otras funciones (por ejemplo, fármacos funcionalizados con tiol), en caso de que se apliquen los correspondientes profármacos TCO hidrolíticamente estables. Los productos de anillos condensados ilustrados pueden o no tautomerizarse a otros tautómeros más favorables.
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El ejemplo anterior de TCO sustituidos con uretano (o carbamato) proporciona la liberación de un fármaco amino funcional del aducto. El activador de tetrazina es simétrico y deficiente en electrones.
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Los ejemplos anteriores de TCO sustituidos con uretano (o carbamato) proporcionan la liberación de un fármaco funcional de amina del aducto. El activador de tetrazina es asimétrico y deficiente en electrones. Obsérvese que el uso de una tetrazina asimétrica conduce a la formación de regioisómeros de aductos retro de Diels-Alder, además de los estereoisómeros que ya se forman cuando se emplea tetrazina simétrica.
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El ejemplo anterior de TCO de uretano (o carbamato) proporciona la liberación de un fármaco funcional de amina del aducto. El activador de tetrazina es simétrico y suficiente en electrones.
En una realización preferida, el fármaco se proporciona en forma de un conjugado de anticuerpo y toxina. El conjugado se proporciona con una fracción de TCO como se identificó anteriormente, para permitir la liberación de la toxina bioortogonal químicamente activada. En otra realización, el fármaco es un derivado de anticuerpo biespecífico o triespecífico que sirve para unirse a células tumorales y reclutar y activar células T, cuya función de unión a células T se inactiva al unirse a una fracción de TCO como se describió anteriormente. Este último, de nuevo, sirve para permitir la activación bioortogonal de fármacos activados químicamente.
Direccionamiento
Los kits y el método de la invención son muy adecuados para su uso en la administración dirigida de fármacos.
Un "objetivo principal" como se usa en la presente invención se refiere a un objetivo para un agente de direccionamiento para terapia. Por ejemplo, un objetivo principal puede ser cualquier molécula que esté presente en un organismo, tejido o célula. Los objetivos incluyen objetivos de superficie celular, por ejemplo, receptores, glicoproteínas; proteínas estructurales, por ejemplo, placas amiloides; abundantes objetivos extracelulares tales como estroma, objetivos de matriz extracelular tales como factores de crecimiento y proteasas; objetivos intracelulares, por ejemplo, superficies de cuerpos de Golgi, superficies de mitocondrias, ARN, ADn , enzimas, componentes de rutas de señalización celular; y/o cuerpos extraños, por ejemplo. patógenos tales como virus, bacterias, hongos, levaduras o partes de los mismos. Los ejemplos de objetivos principales incluyen compuestos tales como proteínas cuya presencia o nivel de expresión se correlaciona con un determinado tipo de tejido o célula o cuyo nivel de expresión está sobrerregulado o subregulado en un determinado trastorno. De acuerdo con una realización particular de la presente invención, el objetivo principal es una proteína tal como un receptor (internalizante o no internalizante).
De acuerdo con la presente invención, el objetivo principal puede seleccionarse entre cualquier objetivo adecuado dentro del cuerpo humano o animal o en un patógeno o parásito, por ejemplo, un grupo que comprende células tales como membranas celulares y paredes celulares, receptores tales como receptores de membrana celular, estructuras intracelulares, tales como cuerpos de Golgi o mitocondrias, enzimas, receptores, ADN, ARN, virus o partículas virales, anticuerpos, proteínas, carbohidratos, monosacáridos, polisacáridos, citocinas, hormonas, esteroides, receptor de somatostatina, monoamina oxidasa, receptores muscarínicos, sistema nervioso simpático miocárdico, receptores de leucotrieno, p. ej., en leucocitos, receptor del activador del plasminógeno de uroquinasa (uPAR), receptor de folato, marcador de apoptosis, marcador de (anti)angiogénesis, receptor de gastrina, sistema dopaminérgico, sistema serotoninérgico, sistema GABAérgico, sistema adrenérgico, sistema colinérgico, receptores opiáceos, receptor GPIIb/IIIa y otros receptores relacionados con trombos, fibrina, receptor de calcitonina, receptor de tuftsina, receptor de integrina, fibronectina, VEGF/EGF y receptores de VEGF/EGF, TAG72, CEA, CD19, CD20,CD22, CD40, CD45, CD74, CD79, CD105, CD138, CD174, CD227, CD326, CD340, MUC1, MUC16, GPNMB, PSMA, Cripto, tenascina C, receptor de melanocortina-1, CD44v6, G250, HLA DR, EDB, TMEFF2 , EphB2, EphA2, FAP, mesotelina, GD2, CAIX, 5T4, metaloproteinasa de matriz (MMP), receptor de selectina P/E/L, receptor de LDL, glicoproteína P, receptores de neurotensina, receptores de neuropéptidos, receptores de sustancia P, receptor de NK, receptores de CCK, receptores sigma, receptores de interleucina, tirosina quinasa del virus del herpes simple, tirosina quinasa humana. Para permitir el direccionamiento específico de los objetivos principales mencionados anteriormente, el agente de direccionamiento TT puede comprender compuestos que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, Fab2, Fab, scFV, diacuerpos, triacuerpos, VHH, fusiones (fragmentos) de anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de mAb biespecíficos y triespecíficos), proteínas, péptidos, por ejemplo, octreótido y derivados, VIP, MSH, LHRH, péptidos quimiotácticos, bombesina, elastina, miméticos de péptidos, carbohidratos, monosacáridos, polisacáridos, virus, células completas, fármacos, polímeros, liposomas, agentes quimioterapéuticos, agonistas y antagonistas de receptores, citoquinas, hormonas, esteroides. Ejemplos de compuestos orgánicos previstos dentro del contexto de la presente invención son, o se derivan de, estrógenos, por ejemplo, estradiol, andrógenos, progestinas, corticosteroides, metotrexato, ácido fólico y colesterol. En una realización preferida, el agente de direccionamiento TT es un anticuerpo. De acuerdo con una realización particular de la presente invención, el objetivo principal es un receptor y se emplea un agente de direccionamiento, que es capaz de unirse específicamente al objetivo principal. Los agentes de direccionamiento adecuados incluyen, pero no se limitan al, ligando de dicho receptor o una parte del mismo que aún se une al receptor, por ejemplo, un péptido de unión al receptor en el caso de ligandos de proteína de unión al receptor. Otros ejemplos de agentes dirigidos de naturaleza proteica incluyen interferones, por ejemplo, interferón alfa, beta y gamma, interleucinas y factor de crecimiento proteico, tal como el factor de crecimiento tumoral, por ejemplo, factor de crecimiento tumoral alfa, beta, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), proteína de direccionamiento a uPAR, apolipoproteína, LDL, anexina V, endostatina y angiostatina. Los ejemplos alternativos de agentes de direccionamiento incluyen ADN, ARN, PNA y LNA que son, por ejemplo, complementarios al objetivo principal.
De acuerdo con una realización particular adicional de la invención, el objetivo principal y el agente de direccionamiento se seleccionan para obtener como resultado el direccionamiento específico o aumentado de un tejido o enfermedad, tal como cáncer, una inflamación, una infección, una enfermedad cardiovascular, por ejemplo, trombo, lesión aterosclerótica, sitio hipóxico, por ejemplo, apoplejía, tumor, trastorno cardiovascular, trastorno cerebral, apoptosis, angiogénesis, un órgano y gen/enzima informador. Esto se puede lograr seleccionando objetivos primarios con expresión específica de tejido, célula o enfermedad. Por ejemplo, los receptores de ácido fólico de membrana median la acumulación intracelular de folato y sus análogos, tal como el metotrexato. La expresión está limitada en tejidos normales, pero los receptores están sobreexpresados en varios tipos de células tumorales.
Fracciones de enmascaramiento
Las fracciones de enmascaramiento MM pueden ser una proteína, un péptido, un polímero, un polietilenglicol, un carbohidrato o una construcción orgánica que protege aún más al fármaco enlazado DD o profármaco. Este blindaje puede basarse, por ejemplo, en un impedimento estérico, pero también puede basarse en una interacción no covalente con el fármaco Dd. Tal fracción de enmascaramiento también puede usarse para afectar las propiedades in vivo (por ejemplo, eliminación de la sangre, reconocimiento por parte del sistema inmunitario) del fármaco DD o profármaco.
Espaciadores
Los espaciadores SP incluyen pero no se limitan a cadenas de polietilenglicol (PEG) que varían de 2 a 200, particularmente de 3 a 113 y preferiblemente de 5 a 50 unidades repetitivas. Otros ejemplos son fragmentos de biopolímeros, tales como oligo o polipéptidos o polilactidas. En el Ejemplo 11 se muestran otros ejemplos preferidos.
Administración
En el contexto de la invención, el profármaco normalmente se administra primero, y llevará un cierto período de tiempo antes de que el profármaco alcance el objetivo principal. Este período de tiempo puede diferir de una aplicación a otra y puede ser de minutos, días o semanas. Una vez transcurrido el período de tiempo elegido, se administra el activador, y se encontrará y reaccionará con el profármaco y, por lo tanto, activará la liberación del fármaco en el objetivo principal.
Las composiciones de la invención se pueden administrar a través de diferentes rutas que incluyen inyección intravenosa, intraperitoneal, administración oral, administración rectal e inhalación. Las formulaciones adecuadas para estos diferentes tipos de administraciones son conocidas por el experto en la materia. Los profármacos o activadores de acuerdo con la invención se pueden administrar junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo farmacéutico adecuado, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un vehículo adecuado para fines médicos o veterinarios, que no es tóxico ni es inaceptable de otro modo. Dichos vehículos son bien conocidos en la técnica e incluyen solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debe adaptarse al modo de administración.
Se entenderá que las entidades químicas administradas, a saber, el profármaco y el activador, pueden estar en una forma modificada que no altere la funcionalidad química de dicha entidad química, tales como sales, hidratos o solvatos de los mismos.
Después de la administración del profármaco, y antes de la administración del activador, se prefiere eliminar el exceso de profármaco por medio de un agente depurador en los casos en que no se desea la activación del profármaco en circulación y cuando la depuración natural del profármaco es insuficiente. Un agente depurador es un agente, compuesto o fracción que se administra a un sujeto con el fin de unirse o formar complejos con un agente administrado (en este caso, el profármaco) cuyo exceso se eliminará de la circulación. El agente depurador es susceptible de ser dirigido para su retiro de circulación. Esto último generalmente se logra a través de mecanismos basados en receptores hepáticos, aunque existen otras formas de secreción de la circulación, como es conocido por el experto en la materia. En la invención, el agente depurador para eliminar el profármaco circulante comprende preferiblemente una fracción dieno, por ejemplo, como se discutió anteriormente, capaz de reaccionar con la fracción de TCO del profármaco.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos demuestran la invención o aspectos de la invención y no sirven para definir o limitar el alcance de la invención o sus reivindicaciones.
Métodos. Los espectros de RMN 1H y RMN 13C se registraron en un espectrómetro Varian Mercury (400 MHz para RMN 1H y 100 MHz para RMN 13C) a 298 K. Los desplazamientos químicos se reportan en ppm campo abajo desde TMS a temperatura ambiente. Las abreviaturas utilizadas para dividir patrones son s = singlete, t = triplete, q = cuarteto, m = multiplete y br = ancho. Los espectros IR se registraron en un FT-IR Perkin Elmer 1600 (UATr ). La LC-MS se realizó utilizando un HPLC Shimadzu de la serie LC-10 AD VP acoplado a un detector de arreglo de diodos (detector Finnigan Surveyor PDA Plus, Thermo Electron Corporation) y una trampa de iones (LCQ Fleet, Thermo Scientific). Los análisis se realizaron utilizando una columna C18 de 3 p Alltech Alltima HP usando un volumen de inyección de 1-4 pL, un caudal de 0.2 mL min’1 y típicamente un gradiente (5% a 100% en 10 min, mantenido al 100% por 3 min más) de CH3CN en H2O (ambos con un contenido de ácido fórmico al 0.1%) a 25 °C. Se realizó RP-HPLC preparativa (CH3CN/H2O con ácido fórmico al 0.1%) usando un Shimadzu SCL-10A VP acoplado a dos bombas Shimadzu LC-8A y un detector UV-VIS Shimadzu SPD-10AV VP en una columna C1 8110A de 5 p, Phenomenex Gemini. La HPLC de exclusión por tamaño (SEC) se llevó a cabo en un sistema Agilent 1200 equipado con un detector radiactivo Gabi. Las muestras se cargaron en una columna Superdex-200 10/300 GL (GE Healthcare Life Sciences) y se eluyeron con tampón de fosfato 10 mM, pH 7.4, a 0.35 - 0.5 mL/min. La longitud de onda UV se preestableció a 260 y 280 nm. La concentración de las soluciones de anticuerpos se determinó con un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific) a partir de la absorbancia a 322 nm y 280 nm, respectivamente.
Materiales. Todos los reactivos, productos químicos, materiales y disolventes se obtuvieron de fuentes comerciales y se usaron tal como se recibieron: Biosolve, Merck y Cambridge Isotope Laboratories para disolventes (deuterados); y Aldrich, Acros, ABCR, Merck y Fluka para productos químicos, materiales y reactivos. Todos los disolventes eran de calidad AR. Se sintetizó 4-(f-butildimetilsililoximetil)-2,6-dimetilfenol de acuerdo con un procedimiento de la literatura (Y.H. Choe, C.D. Conover, D. Wu, M. Royzen, Y. Gervacio, V. Borowski, M. Mehlig, R.B. Greenwald, J. Controlled Release 2002, 79, 55-70). Se obtuvo clorhidrato de doxorrubicina a través de Avachem Scientific.
Ejemplo 1
Síntesis de activadores de tetrazina
Procedimientos generales
Aparte de las tetrazinas descritas con detalle a continuación, se han preparado una serie de otras tetrazinas. Se han usado reacciones de tipo Pinner, donde los nitrilos apropiados se han hecho reaccionar con hidracina para producir los compuestos intermedios de dihidro 1,2,4,5-tetrazina. En lugar de nitrilos, también se han utilizado amidinas como reactivos, como se conoce en la técnica. También se conoce el uso de azufre en esta reacción, ya que en algunos casos ayuda a la formación de la dihidro 1,2,4,5-tetrazina. La oxidación de este compuesto intermedio da como resultado los activadores del dieno tetrazina. Las siguientes reacciones describen algunas de las tetrazinas preparadas e ilustran algunas de las posibilidades (por ejemplo, uso de disolvente, concentraciones, temperatura, equivalentes de reactivos, opciones de oxidación, etc.) para fabricar y aislar tetrazinas. También se pueden usar otros métodos conocidos en la técnica para preparar tetrazinas u otros activadores.
Síntesis de 3,6-bis(2-piridil)-1,2,4,5-tetrazina (2)
Figure imgf000031_0001
Se agitaron 2-cianopiridina (10.00 g, 96.0 mmol) y el hidrato de hidracina (15.1 g; 300 mmol) durante la noche a 90 °C en una atmósfera inerte. La mezcla turbia se enfrió a temperatura ambiente, se filtró y el residuo se lavó posteriormente con agua (20 mL) y etanol (20 mL) y se secó al vacío para producir la dihidrotetrazina 1 sin purificación como un sólido de color anaranjado (7.35 g; 65 %).
La dihidrotetrazina (1, 100 mg; 0.419 mmol) se suspendió en ácido acético (3 mL) y se añadió nitrito de sodio (87 mg; 1.26 mmol). Se observó un cambio de color inmediato de anaranjado a rojo oscuro y el producto oxidado se aisló por filtración. El residuo se lavó con agua (10 mL) y se secó al vacío para producir el compuesto del título como un sólido de color púrpura (2, 92 mg; 93%).
RMN 1H (CDCla): 8 = 9.00 (d, 2H), 8.76 (d, 2H), 8.02 (t, 2H), 7.60 (dd, 2H) ppm. RMN 13C (CDCla): 8 = 163.9, 151.1, 150.1, 137.5, 126.6, 124.5 ppm. HPLC-MS/PDA: un pico en el cromatograma, m/z = 237.00 (M+H+), Xmáx. = 296 y 528 nm.
Síntesis de 3-(5-acetamido-2-piridil)-6-(2-piridil)-1,2,4,5-tetrazina (5)
Figure imgf000032_0001
Se agitaron 2-cianopiridina (5.00 g, 48.0 mmol), 5-amino-2-cianopiridina (5.72 g; 48.0 mmol) e hidrato de hidracina (15.1 g; 300 mmol) durante la noche a 90 °C en una atmósfera inerte. La mezcla turbia se enfrió a temperatura ambiente, se filtró y el residuo se lavó posteriormente con agua (20 mL) y etanol (20 mL) y se secó al vacío. El sólido de color anaranjado se suspendió en acetona (200 mL), se impregnó en gel de sílice (20 g) y se cromatografió usando un gradiente (0 % a 70 %) de acetona y heptano, para producir dihidrotetrazina 3 como un sólido de color anaranjado (1.46 g; 12% de rendimiento).
La dihidrotetrazina (3, 90 mg; 0.355 mmol) se disolvió en THF (1 mL) y se añadió anhídrido acético (54.4 mg; 0.533 mmol). La solución se calentó a reflujo en una atmósfera inerte durante 18 h. El precipitado de color anaranjado se aisló por filtración y se lavó con THF (3 mL) para obtener la acetamida de la dihidrotetrazina (4, 90 mg; 8 6 % de rendimiento).
La acetamida 4 (50 mg, 0.169 mmol) se suspendió en ácido acético (1 mL) y se añadió nitrito de sodio (35 mg, 0.508 mmol). Se observó un cambio de color inmediato de anaranjado a rojo oscuro y el producto oxidado se aisló por filtración. El residuo se lavó con agua (5 mL) y se secó al vacío para producir el compuesto del título como un sólido de color púrpura (5, 42 mg; 84%).
RMN 1H (DMSO-d6): 8 = 9.03 (d, 1H), 8.93 (d, 1H), 8.61 (dd, 2H), 8.42 (dd, 1H), 8.16 (dt, 1H), 7.73 (dd, 1H), 2.17 (s, 3H) ppm . RMN 13C (DMSO-d6): 8 = 169.5, 163.0, 162.8, 150.6, 150.2, 143.8, 141.2, 138.5, 137.8, 126.6, 126.1, 124.9, 124.2, 24.1 ppm. HPLC-MS/PDA: un pico en el cromatograma, m/z = 293.9 (M+H+), Xmáx. = 323 y 529 nm.
Síntesis de 3-(2-piridil)-6-metil-1,2,4,5-tetrazina (7)
Figure imgf000032_0002
Se agitaron 2-cianopiridina (500 mg, 4.8 mmol), clorhidrato de acetamidina (2.00 g, 21.2 mmol) y azufre (155 mg, 4.8 mmol) en etanol (5 mL) en una atmósfera inerte de argón. Se añadió hidrato de hidracina (2.76 g; 55.2 mmol) y la mezcla se agitó durante la noche a 20 °C. La mezcla turbia se filtró y el filtrado se evaporó a sequedad, para producir 2.9 g de producto 6 sin purificación de color anaranjado.
Posteriormente, se suspendió 6 (800 mg) en una mezcla de THF (3 mL) y ácido acético (4 mL). Se añadió una solución de NaNO2 (2.0 g; 29.0 mmol) en agua (3 mL) a 0 °C. Se observó una coloración instantánea hasta una suspensión roja/púrpura. Después de 5 minutos de agitación a 0 °C, se añadieron cloroformo y agua. La capa de cloroformo púrpura se lavó dos veces con agua y luego se concentró. El residuo sólido se agitó en una mezcla 1:1 de cloroformo y hexano y luego se filtró. El filtrado se concentró y el producto sin purificar se purificó por cromatografía en columna de sílice aplicando mezclas de cloroformo/acetona como eluyente, produciendo un producto puro (7.48 mg, 21 % de rendimiento total, calculado a partir de 2 -cianopiridina).
RMN 1H (CDCla): 8 = 8.96 (d, 1H), 8.65 (d, 1H), 7.99 (t, 1H), 7.56 (dd, 1H), 3.17 (s, 3H) ppm. RMN 13C (CDCI3): 8 = 168.1, 163.6, 150.9, 150.3, 137.4, 126.3, 123.9, 21.4 ppm. HPLC-MS/PDA: un pico en el cromatograma, m/z = 174.3 (M+H+), Xmáx. = 274 y 524 nm.
Síntesis de 3,6-bis(2-aminofenil)-1,2,4,5-tetrazina (9)
Figure imgf000033_0001
Se disolvió 2-aminobenzonitrilo (1.00 g; 8.46 mmol) en etanol (3 mL) y se añadió hidrato de hidracina (2.06 g; 41.2 mmol). La mezcla se enfrió a 0 ° C y se añadió azufre (0.17 g; 5.30 mmol). Se continuó agitando durante 15 min y posteriormente la mezcla se calentó a 90 °C. Después de 3 h, el precipitado amarillo se aisló por filtración, se lavó con etanol (10 mL) y posteriormente se trituró dos veces con cloroformo (2 veces, 10 mL), para producir el compuesto intermedio 8 amarillo (343 mg, 30%).
El compuesto intermedio 8 (105 mg; 0.394 mmol) se disolvió en etanol (15 mL) y se burbujeó oxígeno a través de esta solución a 50 °C. En cuestión de minutos, el color cambió de amarillo a anaranjado/rojo oscuro y se formó un precipitado. Después de 2 h, el precipitado se filtró, se lavó con etanol y se secó para obtener el producto 9 como cristales de color rojo oscuro (89 mg, 86%).
RMN 1H (DMSO-d6): 8 = 8.39 (d, 2H), 7.32 (t, 2H), 7.04 (s, 4H), 6.93 (d, 2H), 6.75 (t, 2H) ppm. RMN 13C (DMSO-d6): 8 = 162.7, 149.6, 133.0, 129.0, 117.1, 115.8, 111.6 ppm. HPLC-MS/PDA: un pico en el cromatograma, m/z = 265.4 (M+H+), W = 237, 293, 403 y 535 nm.
Síntesis de 3,6-bis(4-hidroxifenil)-1,2,4,5-tetrazina (11)
Figure imgf000033_0002
Se disolvió 4-hidroxibenzonitrilo (1.06 g; 8.90 mmol) en hidrato de hidracina (3.09 g; 61.7 mmol) y la mezcla se calentó a 90 °C durante 16 h. El precipitado amarillo se filtró y se lavó con agua (25 mL) y etanol (10 mL), para producir el compuesto intermedio 10 sin purificar como un polvo amarillo (870 mg; 62%).
El compuesto intermedio (10, 173 mg; 0.645 mmol) se suspendió en etanol (10 mL), y se burbujeó oxígeno a través de esta mezcla a 50 °C. En cuestión de minutos, el color cambió de amarillo a anaranjado/rojo oscuro. Después de 6 h, el precipitado se filtró, se lavó con etanol y se secó para obtener el producto 11 en forma de cristales de color rojo oscuro (136 mg, 80%).
RMN 1H (DMSO-d6): 8 = 10.35 (br. s, 2H), 8.36 (d, 4H), 7.02 (d, 4H) ppm. RMN 13C (DMSO-d6): 8 = 162.6, 161.5, 129.2, 122.6, 116.3 ppm. HPLC-MS/PDA: un pico en el cromatograma, m/z = 267.1 (M+H+), Xmáx. = 235, 330 y 535 nm.
Síntesis de 3,6-bis(4-aminofenil)-1,2,4,5-tetrazina (13)
Figure imgf000034_0001
Se disolvió 4-aminobenzonitrilo (1.00 g; 8.46 mmol) en etanol (3 mL) y posteriormente se añadieron hidrato de hidracina (2.12 g; 42.2 mmol) y azufre (0.176 g; 5.5 mmol). La mezcla se calentó a 90 °C durante 90 min y el precipitado amarillo se aisló por filtración, se lavó con etanol (10 mL) y posteriormente se trituró con acetona (12 mL) para producir el compuesto intermedio 12 amarillo (190 mg, 17%).
El compuesto intermedio 12 (50 mg; 0.188 mmol) se disolvió en DMSO (1 mL), y se burbujeó oxígeno a través de esta solución a 20 °C. Después de 5 h, la mezcla de reacción se vertió en salmuera (13 mL) y el precipitado rojo se filtró, se lavó con agua (10 mL) y se secó al vacío. El polvo rojo se purificó adicionalmente por trituración con acetona (15 mL), para producir el producto 13 como un sólido de color rojo (13.7 mg, 27%).
RMN 1H (DMSO-da): 8 = 8.17 (d, 2H), 7.75 (d, 2H), 6.02 (s, 4H) ppm. RMN 13C (DMSO-da): 8 = 162.3, 152.8, 128.5, 118.3, 113.8 ppm. HPLC-MS/PDA: un pico en el cromatograma, m/z = 265.2 (M+H+), Xmáx. = 241, 370 y 530 nm.
Síntesis de 3,6-bis(3-aminofenil)-1,2,4,5-tetrazina (15)
Figure imgf000034_0002
Se disolvió 3-aminobenzonitrilo (1.00 g; 8.460 mmol) en hidrato de hidracina (2.50 mL; 51.4 mmol) y la mezcla se calentó a 90 °C durante 3 días. Se añadió agua (5 mL), y el precipitado amarillo se filtró y se lavó con agua (15 mL) y etanol (10 mL), para producir el compuesto intermedio 14 sin purificar como un polvo de color anaranjado (910 mg; 81%). El compuesto intermedio 14 (50 mg; 0.188 mmol) se suspendió en etanol (4 mL) y se burbujeó oxígeno a través de esta mezcla a 50 °C. En cuestión de minutos, el color cambió de amarillo a rojo. Después de 16 h, el precipitado se filtró y se lavó con etanol para obtener el producto 15 como un polvo de color rojo (31 mg, 62%).
RMN 1H (DMSO-d6): 8 = 7.77 (s, 2H), 7.66 (d, 2H), 7.30 (t, 2H), 6.85 (d, 2H), 5.53 (s, 4H) ppm. HPLC-MS/PDA: un pico en el cromatograma, m/z = 265.2 (M+H+), Xmáx. = 240, 296 y 527 nm.
Síntesis de 3,6-bis(aminometil)-1,2,4,5-tetrazina (20)
Figure imgf000034_0003
Se disolvió boc-amino acetonitrilo (1.00 g; 6.40 mmol) en metanol (10 mL) y se añadió metóxido de sodio (0.145 mL al 25 % en MeOH; 0.64 mmol). La mezcla se agitó a 20 °C durante 18 h y posteriormente se añadió cloruro de amonio (0.34 g; 6.40 mmol) y la mezcla se agitó a 20 °C durante 3 días. La solución se precipitó en éter dietílico (40 mL) y el precipitado se recogió por filtración, se lavó y se secó para producir el clorhidrato de amidina 17.
El clorhidrato de amidina (17, 241 mg; 1.15 mmol) se disolvió en hidrato de hidracina (3 mL; 61.9 mmol) y la solución se agitó a 20 °C durante 16 h. Luego se diluyó con agua (10 mL) y el precipitado se recogió por centrifugación y se secó. El sólido incoloro se disolvió en ácido acético (1.5 mL) y se añadió nitrito de sodio (28 mg; 0.41 mmol). La mezcla de color rosado se agitó durante 15 min y posteriormente se añadieron cloroformo (15 mL) y bicarbonato de sodio saturado (30 mL). La capa orgánica se aisló y se lavó con agua (15 mL), se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó a sequedad para producir la tetrazina protegida con Boc como un sólido de color rosado (19, 70 mg; 35%). Este compuesto (12 mg; 0.035 mmol) se disolvió en cloroformo (1 mL) y se añadió TFA (1 mL). La mezcla se agitó durante 15 min y se precipitó en éter dietílico (15 mL). El precipitado de color rosado se filtró, se lavó y se secó para obtener el compuesto del título como su sal de TFA (20, 10 mg, 78%).
RMN 1H (D2O): 8 = 5.06 (s, 4H) ppm. RMN 13C (D2O): 8 = 164.5, 41.1 ppm. HPLC-MS/PDA: un pico en el cromatograma, m/z = 141 (M+H+), Amáx. = 267 y 517 nm.
Síntesis de ácido 2,2',2"-(10-(2-oxo-2-(6-oxo-6-(6-(6-(piridin-2-il)-1,2,4,5-tetrazin-3-il)piridin-3-ilamino)hexilamino)etil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triil)triacético (27) y ácido 2,2',2"-(10-(2-oxo-2-(11-oxo-11-(6-(6-(piridin-2-il)-1,2, 4,5-tetrazin-3-il)piridin-3-ilamino)undecilamino )etil)-1,4.7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triil)triacético (28)
Figure imgf000035_0001
Se suspendieron 5-amino-2-cianopiridina 21 (1.02 g; 8.60 mmol), ácido N-Boc-6-amino-hexanoico 22 (0.99 g; 4.30 mmol), DCC (1.77 g; 8.60 mmol), DMAP (1.05 g; 8.60 mmol) y PPTS (0.37 g; 1.47 mmol) en cloroformo (15 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 h y luego se evaporó hasta sequedad y se agitó en acetonitrilo (20 mL). El precipitado se eliminó por filtración y el filtrado se evaporó hasta sequedad, se disolvió en cloroformo (20 mL) y se lavó con ácido cítrico acuoso (15 mL, 0.5 M), hidrogenocarbonato de potasio acuoso (15 mL, 1 M) y agua (15 mL) respectivamente. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó a sequedad. El producto sin purificar se purificó por cromatografía en columna (sílice, hexano/acetato de etilo = 1:1) para producir el producto 23 como un sólido de color blanco (0.95 g; 61%).
MS (ESI, m/z): calculado para C17H25N4O3+ ([M+H]+): 333.19, encontrado: 333.17.
Se disolvieron 6-(6-cianopiridin-3-ilamino)-6-oxohexilcarbamato de tert-butilo 23 (0.70 g; 2.1 mmol), 2-cianopiridina (0.87 g; 8.4 mmol), hidrato de hidracina (1.25 g; 20 mmol) en etanol (2 mL) y se añadió azufre (0.22 g; 7 mmol). La mezcla se agitó a 70 °C bajo una atmósfera inerte de argón durante 2 h, y luego a 50 °C durante 16 h. La suspensión anaranjada se diluyó con cloroformo (10 mL) y la solución resultante se lavó con agua (2 veces con 15 mL). La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó a sequedad. El producto sin purificarse purificó por cromatografía en columna (sílice, cloroformo/acetona = 4:1) para producir el producto 24 como un sólido de color anaranjado (0.65 g; 66%). MS (ESI, m/z): calculado para C23H31NsO3+ ([M+H]+): 467.25, encontrado: 467.33.
Se disolvió 6-oxo-6-(6-(6-(piridin-2-il)-1.2-dihidro-1,2,4,5-tetrazin-3-il)piridin-3-ilamino)hexilcarbamato de tert-butilo 24 (0.30 g; 0.64 mmol) en THF (1.5 mL) y se añadió ácido acético (2 mL). Se disolvió nitrito de sodio (0.25 g; 3.62 mmol) en agua (1 mL) y se añadió gota a gota. La solución roja se vertió en hidrogenocarbonato de potasio acuoso (50 mL; 1 M) y el producto se extrajo con cloroformo (50 mL). La capa orgánica se lavó con agua (50 mL) y se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó a sequedad para producir el producto 25 como un sólido de color púrpura (0.25 g; 83%).
MS (ESI, m/z): calculado para C23H29N8O3+ ([M+H]+): 465.23, encontrado: 465.42.
Se disolvió 6-oxo-6-(6-(6-(piridin-2-il)-1,2,4,5-tetrazin-3-il)piridin-3-ilamino)hexilcarbamato de tert-butilo 25 (66 mg; 0.14 mmol) en cloroformo (6 mL) y se añadió TFA (6 mL). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 h y posteriormente se evaporó hasta sequedad para producir el producto 26 como su sal de TFA (52 mg; 100%). MS (ESI, m/z): calculado para C18H21N8O+ ([M+H]+): 365.19, encontrado: 365.33.
Se disolvió 6-amino-N-(6-(6-(piridin-2-il)-1,2,4,5-tetrazin-3-il)piridin-3-il)hexanamida 26 (52 mg; 0.14 mmol) en DMF (2.5 mL) y se añadió DIPEA (320 mg; 2.0 mmol). Se añadió DOTA activado con N-hidroxisuccinimida (161 mg; 0.2 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 h. La solución se evaporó hasta sequedad y el producto sin purificar se disolvió en una mezcla de acetonitrilo y agua y se purificó mediante RP-HPLC preparativa. Después de la liofilización el producto puro 27 se obtuvo como un sólido esponjoso de color rosado (80 mg, 76% de rendimiento).
1H-RMN (acetonitrilo al 30% ds en D2O): 8 = 8.90 (m, 2H, ArH), 8.68 (d, 1H, ArH), 8.60 (dd, 1H, ArH), 8.31 (m, 1H, ArH), 8.24 (t, 1H, ArH), 7.82 (t, 1H, ArH), 3.80 (br s, 6H, NCH2COOH), 3.72 (br s, 2H, NCH2CONH), 3.34-3.23 (br m, 18H, NCH2CH2N, CH2NHCO), 2.49 (t, 2H, NHCOCH2), 1.70 (m, 2H, NHCOCH2CH2), 1.59 (m, 2H, CH2CH2NHCO), 1.41 (m, 2H, CH2CH2CH2NHCO) ppm. RMN 13C (acetonitrilo al 30%-d3 en D2O): 8 = 175.5, 171.5 (br), 162.6, 162.5, 150.1, 148.1, 142.9, 141.6, 139.6, 138.4, 128.0, 127.9, 125.4, 124.8, 55.4, 54.3 (br), 49.4, 36.2 (br), 39.4 25.9, 24.6 ppm. ESI-MS: m/z para C34H47N12O8+ ([M+H]+): 751.37; Obs. [M+H]+ 751.58, [M+Na]+ 773.50, [M+2H]2+ 376.42, [M+ 3H]3+251.33. FT-IR (ATR): u = 3263, 3094, 2941, 2862, 1667, 1637, 1582, 1540, 1460, 1431, 1395, 1324, 1296, 1272, 1251, 1226, 1198, 1128, 1087, 1060, 7.890, 9, 60, 831, 798, 782, 742, 718, 679, 663 cm'1.
Para 28, se utilizó un procedimiento comparable a la síntesis descrita de ácido 2,2',2''-(10-(2-oxo-2-(6-oxo-6-(6-(6-(piridin-2-il)-1,2,4,5-tetrazin-3-il)piridin-3-ilamino)hexilamino)etil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1 4.7-triil)triacético (27). Después de la liofilización el producto puro 28 se obtuvo como un sólido esponjoso de color rosado (90 mg, 78% de rendimiento).
RMN 1H (DMSO-d6): 8 = 10.65 (s, 1H, NH), 9.06 (d, 1H, ArH), 8.93 (d, 1H, ArH), 8.61 (t, 2H, ArH), 8.44 (dd, 1H, ArH), 8.16 (t, 2H, ArH, NH), 7.73 (dd, 1H, ArH), 3.51 (br s, 6H, NCH2COOH), 3.28 (br s, 2H, NCH2CONH), 3.06 (q, 2H, CH2NHCO), 3.34-3.23 (br m, 16H, NCH2CH2N), 2.43 (t, 2H, NHCOCH2), 1.64 (m, 2H, NHCOCH2CH2), 1.42 (m, 2H, CH2CH2NHCO), 1.38-1.22 (m, 12H, CH2) ppm. RMN 13C (DMSO-d6): 8 = 173.0, 171.0 (br), 169.1 (br), 163.5, 163.2, 151.0, 150.6, 144.2, 141.7, 139.1, 138.2, 127.0, 126.5, 125.3, 124.6, 57.3 (br), 55.2 (br), 50.7, 39.0, 36.8, 29.5, 29.4, 29.3, 29.19, 29.17, 29.1, 26.9, 25.3 ppm. ESI-MS: m/z calculado para C39H57N12O8+ ([M+H]+): 821.44; Obs. [M+Na]+ 843.58, [M+H]+ 821.58, [M 2H]2+ 411.42, [M+3H]3+ 274.67. FT-IR (ATR): u = 3261, 3067, 2925, 2851, 1633, 1583, 1541, 1458, 1433, 1394, 1324, 1298, 1270, 1249, 1228, 1200, 1165, 1128, 1088, 1059, 1016, 991, 920, 885, 860, 832, 798, 782, 764, 742, 719, 687, 661 cm’1.
Activador de DOTA-tetrazina 29
Figure imgf000036_0001
La tetrazina 29 anterior ha sido descrita en detalle en Robillard et al., Angew. Chem., 2010, 122, 3447-3450. También sirve como ejemplo una estructura que puede ser utilizada como activador de acuerdo con esta invención. La función amida en uno de los grupos 2-piridilo de la fracción 1,2,4,5-tetrazina es un grupo donador de electrones, mientras que ambos grupos piridina pueden verse como aceptores de electrones. Por lo tanto, la tetrazina puede verse como ligeramente deficiente en electrones.
El activador 29 muestra propiedades farmacológicas adecuadas y favorables: 29 es bastante estable en solución de PBS con poca degradación dentro de las 2 h y la mayor parte del material sigue intacto después de la incubación durante la noche; tiene una semivida de eliminación de la sangre de 10 min en ratones; su volumen parcial de distribución (Vd) en ratones corresponde al compartimiento de agua extracelular total, ya que no ingresa significativamente a las células. El activador 29 contiene un ligando DOTA, y tales ligandos son fundamentales en una variedad de modalidades de formación de imágenes (p. ej., IRM, SPECT). En consecuencia, el activador 29 no solo es adecuado para la liberación de fármacos, sino que también se puede utilizar simultáneamente con fines de obtención de imágenes. De hecho, el activador 29 se ha empleado como sonda para formación de imágenes de SPECT/CT después de la complejación con 111In3+. Véase Robillard et al., Angew. Chem., 2010, 122, 3447-3450 para mas detalles.
Téngase en cuenta que las fracciones amino-1,2,4,5-tetrazina comprendidas en los activadores 27 - 29 se pueden usar para la conjugación con una variedad de grupos funcionales adicionales, tales como azúcares, PEG, polímeros, péptidos (tales como RGD o c-RGD), proteínas, moléculas fluorescentes o moléculas de colorante.
Ejemplo 2
Síntesis de profármacos modelo de (E)-cicloocteno y profármacos
Síntesis de (E)-ciclooct-2-enol (31), bencilcarbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (32), y (3,5-dimetilfenil)carbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (33).
Figure imgf000037_0001
Síntesis de (E)-ciclooct-2-enol (31)
Una solución de (Z)-ciclooct-2-enol 30 (2.36 g, 14.0 mmol) y benzoato de metilo (1.8 mL, 1.94 g, 14.3 mmol, 1.0 eq.) en éter dietílico/heptanos 1:2 (500 mL) se irradió durante 32 h, mientras se conducía continuamente a través de una columna llena de sílice/nitrato de plata 10:1 (41 g), sílice (0.5 cm) y arena (0.5 cm). La columna se colocó en la oscuridad durante la irradiación. La columna se eluyó con diclorometano (250 mL) para obtener el material de partida sin reaccionar. La sílice se agitó con diclorometano/amoníaco acuoso al 12.5 % 1 :1 (3 x 100 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron al vacío para obtener un producto 31 sin purificar como un aceite de color gris. El aceite se purificó por cromatografía en columna (sílice, eluyentes pentano/éter dietílico del 10 % al 50 %) para obtener (E)-ciclooct-2-enol 31 (isómero mayor, segunda fracción, 440 mg, 3.49 mmol, 24.9 %) como un aceite incoloro y (E)-ciclooct-2-enol 31 (isómero menor, primera fracción, 325 mg, 2.58 mmol, 18.4 %) como un aceite incoloro. El diastereoisómero mayoritario es idéntico al (1ES.2ES)-trans-ciclooct-2-en-1-ol preparado a través de una ruta diferente por G.H. Whitham, M. Wright, J. Chem. Soc. (C) 1971, 883. El diastereoisómero menor es idéntico al (1ES.2ES)-trans-ciclooct-2-en-1-ol preparado a través de una ruta diferente por G.H. Whitham, M. Wright, J. Chem. Soc. (C) 1971, 886. Isómero menor: RMN 1H (CDCla, 300 MHz) 8 = 0.71-0.82 (m, 1H), 1.05-1.17 (m, 1H), 1.43-1.72 (m, 4H), 1.80-2.09 (m, 4H), 2.45-2.52 (m, 1H), 4.61 (s, 1H), 5.54-5.61 (m, 1H), 5.90­ 6.00 (m, 1H) ppm. RMN 13C (CDCla, 75 MHz) 8 = 23.35, 29.42, 36.08, 36.27, 43.40, 71.40, 130.78, 135.39 ppm. Isómero mayor: RMN 1H (CDCh, 300 MHz) 8 = 0.64-0.90 (m, 2H), 1.31-1.51 (m, 2H), 1.66-1.95 (m, 4H), 2.06-2.14 (m, 1H), 2.22-2.37 (m, 1H), 2.78 (br, 1H), 4.15-4.23 (m, 1H), 5.45-5.65 (m, 2H) ppm. RMN 13C (CDCh, 75 MHz) 8 = 27.83, 29.28, 30.52, 35.58, 36.05, 44.48, 131.86, 136.00 ppm.
Nota: Se hace referencia a Whitham et al., J. Chem. Soc. (C), 1971, 883-896, que describe la síntesis y caracterización de los isómeros ecuatoriales y axiales de trans-ciclo-oct-2-en-ol, identificado como (1RS, 2RS) y (1SR, 2RS), respectivamente. En estos isómeros, el sustituyente OH está en la posición ecuatorial o axial. Los isómeros mayor y menor mencionados anteriormente se refieren respectivamente al isómero ecuatorial y axial. A lo largo de los siguientes ejemplos, mayor/ecuatorial y menor/axial se utilizan indistintamente para derivados de trans-ciclo-oct-2-enol, y esta caracterización se basa en la caracterización antes mencionada del compuesto original trans-ciclo-oct-2-enol.
Síntesis de bencilcarbamato de (£)-ciclooct-2-en-1-ilo (isómero mayor) (32)
A una solución de (£)-ciclooct-2-enol 31 (isómero mayor 100 mg, 0.792 mmol) en diclorometano (6 mL) se añadieron isocianato de bencilo (101 j L, 110 mg, 0.826 mmol, 1.04 eq.) y una gota de trietilamina. El matraz se cubrió con papel de aluminio y la solución se agitó en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente durante la noche. La evaporación de la mezcla de reacción proporcionó principalmente material de partida. Se añadieron isocianato de bencilo (200 j L, 220 mg, 1.65 mmol, 2.08 eq.) y una gota de trietilamina en diclorometano (6 mL) y la solución se agitó durante la noche a temperatura ambiente, a 50 °C durante 1 hora y a 25 - 30 °C durante el fin de semana. Los volátiles se eliminaron mediante destilación bulbo a bulbo (50 °C, 2 h). El residuo se purificó por cromatografía en columna para obtener carbamato 32 (101 mg, 0.389 mmol, 49.2 %) como un sólido de color blanco.
RMN 1H (CDCla, 300 MHz) 8 = 0.81-0.86 (m, 2H), 1.35-1.55 (m, 2H), 1.82-1.99 (m, 4H), 2.21-2.30 (m, 1H), 2.38-2.47 (m, 1H), 4.36 (d, 5.8 Hz, 2H), 4.96 (br, 1H), 5.08-5.20 (m, 1H), 5.48-5.57 (m, 1H), 5.71-5.82 (m, 1H), 7.26-7.36 (M, 5H) ppm. RMN 13C (CDCla, 75 MHz) 8 = 27.69, 29.25, 35.68, 35.76, 35.83, 41.32, 44.53, 78.33, 100.02, 127.65, 127.78, 128.86, 132.03, 133.31, 138.88 ppm.
Síntesis de bencilcarbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (isómero menor) (32).
A una solución de (E)-ciclooct-2-enol 31 (isómero menor 100 mg, 0.792 mmol) en diclorometano (6 mL) se añadieron isocianato de bencilo (101 j L, 110 mg, 0.826 mmol, 1.04 eq.) y una gota de trietilamina. El matraz se cubrió con papel de aluminio y la solución se agitó en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente durante la noche. La evaporación de la mezcla de reacción proporcionó principalmente material de partida. Se añadieron isocianato de bencilo (200 j L, 220 mg, 1.65 mmol, 2.08 eq.) y una gota de trietilamina en diclorometano (6 mL) y la solución se agitó durante la noche a temperatura ambiente, a 50 °C durante 1 hora y a 25 - 30 °C durante el fin de semana. Los volátiles se eliminaron mediante destilación bulbo a bulbo (50 °C, 2 h). El residuo se purificó por cromatografía en columna para obtener carbamato 32 (43 mg, 0.166 mmol, 20.9 %) como un sólido de color blanco.
RMN 1H (CDCls, 300 MHz) 8 = 0.74-0.93 (m, 2H), 1.01-1.14 (m, 1H), 1.41-1.57 (m, 1H), 1.62-1.76, 2H), 1.84-2.12 (m, 3H), 2.46-2.49 (m, 1H), 4.40 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 5.05 (br, 1H), 5.40 (s, 1H), 5.52-5.59 (m, 1H), 5.79-5.89 (m, 1H), 7.31­ 7.36 (m, 5H) ppm. RMN 13C (CDCls, 75 MHz) 8 = 24.34, 29.33, 36.13, 36.20, 40.97, 45.30, 74.33, 127.67, 127.85, 128.87, 131.72, 131.99, 138.87, 156.11 ppm.
Síntesis de (3,5-dimetilfenil)carbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (isómero mayor) (33).
A una solución de (E)-ciclooct-2-enol 31 (isómero mayor 260 mg, 2.06 mmol) en diclorometano (12 mL) se añadieron isocianato de 3,5-dimetilfenilo (305 j L, 318 mg, 2.16 mmol, 1.05 eq.) en diclorometano (3 mL) y unas pocas gotas de trietilamina. El matraz se cubrió con papel de aluminio y la solución se agitó en atmósfera de nitrógeno a 29 °C durante 4 noches. La evaporación de la mezcla de reacción produjo 0.57 g de un sólido blanquecino. El residuo se purificó por cromatografía en columna (sílice, 30 mL eluyentes acetato de etilo/heptanos 5 a 10 %) para obtener carbamato 33 parcialmente purificado (94 mg). El producto se purificó más mediante cromatografía en columna (sílice, 30 mL de eluyentes acetato de etilo/heptanos al 5 %) para obtener carbamato 33 (72 mg, 0.263 mmol, 12.8 % de rendimiento, contiene aproximadamente 10 % de isómero Z) como un sólido de color blanco. RMN 1H (CDCh, 300 MHz) 8 = 0.79­ 0.98 (m, 2H), 1.28-2.02 (m, 4H), 1.80-2.07 (m, 3H), 2.30 (s, 6H), 2.42-2.50 (m, 1H), 5.13-5.22 (m, 1H), 5.55-5.87 (m, 2H), 6.49 (br, 1H), 6.71 (s, 1H), 7.04 (s, 2H) ppm. RMN 13C (CDCls, 75 MHz) 8 = 21.61, 27.67, 29.24, 35.70, 35.84, 41.21, 79.34, 116.59, 125.22, 131.83, 133.51, 138.11, 138.50, 153.43 ppm.
Síntesis de (3,5-dimetilfenil)carbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (isómero menor) (33)
A una solución de (E)-ciclooct-2-enol 31 (isómero menor, contiene también isómero Z, 260 mg, 2.06 mmol) en diclorometano (12 mL) se añadieron isocianato de 3,5-dimetilfenilo (305 j L, 318 mg, 2.16 mmol, 1.05 eq.) en diclorometano (3 mL) y unas gotas de trietilamina. El matraz se cubrió con papel de aluminio y la solución se agitó en atmósfera de nitrógeno a 30 °C durante 2 noches y a 50 °C durante la noche. La evaporación de la mezcla de reacción produjo 0.54 g de un sólido de color amarillo. El residuo se purificó por cromatografía en columna (sílice, 40 mL eluyentes acetato de etilo/heptanos al 5 %) para obtener carbamato 33 parcialmente purificado (20 mg). El producto se purificó adicionalmente al vacío (0.08 mbar) a 40 °C durante 3 h y a temperatura ambiente durante la noche para obtener carbamato 33 (11 mg, 0.040 mmol, 2.0 %) como un semisólido de color amarillo claro.
RMN 1H (CDCls, 300 MHz) 8 = 0.78-0.90 (m, 1H), 1.07-2.18 (m, 8H), 2.30 (s, 6H), 2.45-2.53 (m, 1H), 5.42 (s, 1H), 5.56­ 5.62 (m, 1H) , 5.83-5.94 (m, 1H), 6.60 (s, 1H), 6.71 (s, 1H), 7.03 (s, 2H) ppm. RMN 13C (CDCh, 75 MHz) 8 = 21.64, 24.42, 29.43, 36.77, 40.19, 74.46, 116.47, 118.77, 125.35, 131.34, 132.31, 138.00, 138.91 ppm.
Síntesis de (4-nitrofenil)carbonato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (34)
Figure imgf000038_0001
Una solución de (£)-ciclooct-2-enol 31 menor (304 mg, 2.41 mmol) en 15 mL de diclorometano se enfrió en hielo. Se añadió 4-(N,N-dimetilamino)piridina (1.16 g, 9.50 mmol), seguido de cloroformiato de 4-nitrofenilo (0.90 g, 4.46 mmol). La solución se agitó durante la noche y luego se vertió en una columna de sílice de 20 g. La elución se realizó con diclorometano, luego con diclorometano que contenía TBME al 5%. Las fracciones del producto se combinaron y se sometieron a evaporación rotatoria para producir el producto menor 34 como un aceite que se solidifica (338 mg, 1.16 mmol, 48%).
De manera similar, a partir del producto mayor (E)-ciclooct-2-enol 31 (259 mg, 2.06 mmol) en 10 mL de diclorometano, con 4-(N,N-dimetilamino)piridina (1.11 g, 9.09 mmol) y cloroformiato de 4-nitrofenilo (0.85 g, 4.22 mmol), se obtuvo el producto mayor 34 como un aceite que se solidifica (234 mg, 0.80 mmol, 39%).
1H-RMN del producto menor 34 (CDCh): 8 = 0.9 (m, 1H), 1.25 (m, 1H), 1.5 -2.2 (m, 6H), 2.25 (dd, 1H), 2.6 (m, 1H), 5.45 (s, 1H), 5.6 (dd, 1H) ), 6.0 (m, 1H), 7.4 (d, 2H), 8.3 (d, 2H) ppm. RMN 13C (CDCla): 8 = 24.0, 29.0, 36.0, 36.0, 40.6 (todo CH2), 79.0, 122.0, 125.8, 129.8, 133.2 (todo CH), 145.4, 151.8, 156.0 (C y C=O) ppm.
RMN 1H del producto mayor 34 (CDCh): 8 = 0.8 - 1.0 (m, 2H), 1.4 - 2.1 (m, 6H), 2.35 (m, 1H), 2.45 (m, 1H), 5.2 (m, 1H), 5.65 (m, 1H), 5.85 (m , 1H), 7.4 (día, 2H), 8.3 (día, 2H) ppm. RMN 13C (CDCh): 8 = 27.8, 29.0, 35.8, 36.0, 40.4 (todo CH2), 83.0, 121.8, 125.0, 130.4, 134.4 (todo CH), 145.8, 152.0, 156.0 (C y C=O) ppm.
Síntesis de (4-(hidroximetil)fenil)carbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (35)
Figure imgf000039_0001
El derivado de PNP 34 del alcohol 31 menor (136 mg, 0.467 mmol) se disolvió en 7.5 g de THF. Se añadió diisopropiletilamina (182 mg, 1.41 mmol), seguido de 1-hidroxibenzotriazol (24 mg, 0.178 mmol) y alcohol 4-aminobencílico (94 mg, 0.76 mmol). La mezcla se agitó en la oscuridad a aproximadamente 30 °C durante 6 días. El disolvente se eliminó por evaporación rotatoria y el residuo se cromatografió sobre 20 g de sílice, usando diclorometano con cantidades gradualmente crecientes de TBME como eluyente. El producto eluyó con aproximadamente 5 % de TBME. La evaporación rotatoria de las fracciones del producto dejó el producto menor 35 como un aceite viscoso (112 mg, 0.407 mmol, 87 %).
De manera similar, el derivado de PNP 34 derivado del alcohol 31 mayor (145 mg, 0.498 mmol) en 6.0 g de THF, se hizo reaccionar con diisopropiletilamina (210 mg, 1.63 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (34 mg, 0.251 mmol) y alcohol 4-aminobencílico (128 mg, 1.04 mmol ) durante 3 días a aproximadamente 30 °C. La evaporación rotatoria y la cromatografía produjeron el producto mayor 35 como un aceite viscoso (110 mg, 0.40 mmol, 80%).
RMN 1H del producto menor 35 (CDCh): 8 = 0.8 (m, 1H), 1.1 (m, 1H), 1.45 (m, 1H), 1.6-2.2 (m, 6H), 2.4 (m, 1H), 4.6 (s, 2H), 5.4 (s, 1H) ), 5.55 (dd, 1H), 5.85 (m, 1H), 7.15 (bs, 1H), 7.2 -7.4 (AB, 4H) ppm. RMN 13C (CDCh): 8 = 24.2, 29.0, 36.0, 36.0, 41.0, 65.0 (todo CH2), 75.0, 119.0, 128.0, 131.0, 132.6 (todo CH), 136.0, 138.0, 153.6 (C y C=O) ppm. RMN 1H del producto mayor 35 (CDCh): 8 = 0.8 -1.0 (m, 2H), 1.4 - 2.1 (m, 6H), 2.3 (m, 1H), 2.45 (m, 1H), 4.65 (s, 2H), 5.2 (m, 1H), 5.6 (m , 1H), 5.8 (m, 1H), 6.6 (bs, 1H), 7.45 - 7.65 (AB, 4H) ppm. RMN 13C (CDCh): 8 = 27.4, 29.2, 35.8, 36.0, 41.2, 65.0 (todo CH2), 79.8, 119.0, 128.2, 132.0, 134.0 (todo CH), 136.0, 137.8, 153.6 (C y C=O) ppm.
Síntesis del producto menor 2-(4-(((ciclooct-2-en-1-iloxi)carbonil)amino)fenil)-2-((((2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi)carbonil) oxi)acetato de (E)-etilo (37)
Figure imgf000039_0002
El derivado de PNP 34 derivado del alcohol menor 31 (300 mg, 1.03 mmol) se disolvió en 10.3 g de THF. Se añadió diisopropiletilamina (362 mg, 2.80 mmol), seguido de 1-hidroxibenzotriazol (75 mg, 0.556 mmol) y 2-(4-aminofenil)-2-hidroxiacetato de etilo (325 mg, 1.67 mmol), preparado como se describe en el documento WO 2009109998). La mezcla se agitó en la oscuridad a aproximadamente 30 °C durante 6 días. El disolvente se eliminó por evaporación rotatoria y el residuo se cromatografió sobre 21 g de sílice, usando diclorometano con cantidades gradualmente crecientes de TBME como eluyente. El producto eluyó con aproximadamente 5 % de TBME. La evaporación rotatoria de las fracciones del producto proporcionó el producto menor 2-(4-(((ciclooct-2-en-1-iloxi)carbonil)amino)fenil)-2-hidroxiacetato de (E)-etilo (36) como un aceite viscoso (350 mg, 1.01 mmol, 99 %).
RMN 1H (CDCla): 8 = 0.8 (m, 1H), 1.1 (m, 1H), 1.2 (t, 3H), 1.4-2.2 (m, 7H), 2.5 (m, 1H), 4.1 -4.3 (2q, 2H), 5.1 (s , 1H), 5.45 (s, 1H), 5.55 (dd, 1H), 5.85 (m, 1H), 6.7 (bs, 1H), 7.3 -7.45 (AB, 4H) ppm.
El producto 36 obtenido anteriormente (80 mg, 0.23 mmol) se disolvió en 4.1 g de acetonitrilo. Se añadió diisopropiletilamina (215 mg, 1.67 mmol), seguido de carbonato de N,N'-disuccinimidilo (217 mg, 0.85 mmol). La solución se agitó durante 2 días a aproximadamente 30 °C. El disolvente se eliminó por evaporación rotatoria y el residuo se cromatografió sobre 16 g de sílice, usando diclorometano con cantidades gradualmente crecientes de TBME como eluyente. El producto eluyó con aproximadamente 20 % de TBME. La evaporación rotatoria de las fracciones del producto proporcionó el producto menor 2-(4-(((ciclooct-2-en-1-iloxi)carbonil)amino)fenil)-2-((((2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi) carbonil)oxi)acetato de (E)-etilo (37) como un aceite viscoso (60 mg, 0.123 mmol, 53 %).
RMN 1H (CDCla): 8 = 0.8(m, 1H), 1.1 (m, 1H), 1.2 (t, 3H), 1.4-2.2 (m, 7H), 2.5 (m, 1H), 2.6 (s, 4H), 4.15 -4.3(2q, 2H), 5.4 (s, 1H), 5.55 (dd, 1H), 5.8 (s) y 5.85 (m) (2H), 6.7 (bs, 1H), 7.35 - 7.5 (AB, 4H) ppm.
Síntesis del profármaco (E)-cicloocteno doxorrubicina (38)
Figure imgf000040_0001
El derivado de PNP 34 derivado del alcohol menor 31 (20 mg, 0.0687 mmol) se disolvió en 3.0 g de DMF. Se añadió diisopropiletilamina (80 mg, 0.62 mmol), seguido de clorhidrato de doxorrubicina (45 mg, 0.0776 mmol). La mezcla se agitó en la oscuridad a aproximadamente 30 °C durante 3 días. El disolvente se eliminó a alto vacío y el residuo se cromatografió sobre 17 g de sílice, usando diclorometano con cantidades gradualmente crecientes de metanol como eluyente. La evaporación rotatoria de las fracciones del producto dejó un residuo que se agitó con 5 mL de TBME. Después de la adición de 15 mL de heptano y filtración se obtuvo el producto menor 38 (27 mg, 0.039 mmol, 50%). El filtrado contenía una cantidad adicional de producto. De manera similar, a partir del derivado de PNP 34 derivado del alcohol principal 31 (22 mg, 0.0756 mmol) en 7.2 g de DMF, tras reacción con diisopropiletilamina (80 mg, 0.62 mmol) y clorhidrato de doxorrubicina (47.7 mg, 0.0822 mmol), seguido de eliminación del disolvente a alto vacío, cromatografía y tratamiento con TBME/heptano se obtuvo el producto mayor 38 (21 mg, 0.030 mmol, 30%). El filtrado contenía una cantidad adicional de producto.
RMN 1H del producto menor 38 (CDCls): 8 = 0.7 -2.0 (m) y 1.35 (d) (18H), 2.2 (m, 2H), 2.4 (m, 2H), 3.0- 3.4 (dd, 2H), 3.65 (s, 1H), 3.9 (m, 1H), 4.1 (s m, 4H), 4.8 (s, 1H), 5.05 (m, 1H), 5.2 - 5.85 (m, 2H), 7.4 (d, 1H), 7.8 (t, 1H), 8.05 (d, 1H) ppm.
RMN 1H del producto mayor 38 (CDCls): 8 = 0.7-2.0 (m) y 1.35 (d) (18H), 2.2 (m, 2H), 2.4 (m, 2H), 3.0 -3.4 (dd, 2H), 3.65 (s, 1H), 3.9 (m, 1H), 4.1 (s m, 4H), 4.8 (s, 1H), 5.0 (m, 1H), 5.3 - 5.8 (m, 2H), 7.4 (d, 1H), 7.8 (t, 1H), 8.05 (d, 1H) ppm. MS: 694.3 (M-1).
Síntesis del profármaco (E)-cicloocteno-doxorrubicina 46
Figure imgf000040_0002
Se añadió n-butil-litio (97 mL, 2.5 N en hexanos, 0.242 mol) a diisopropilamina (23.66 g, 0.234 mol) en 100 mL de THF a temperaturas inferiores a -20 °C. La solución se enfrió y se añadió ciclooct-2-enona (39, 23.07 g, 0.185 mol), disuelto en 60 mL de THF, durante un período de 20 min de -65 a -80 °C. A continuación, la solución se agitó durante 1 hora de -67 a -72 °C. Se añadió bromoacetato de etilo (45.4 g, 0.272 mol), disuelto en 40 mL de THF, durante un período de 25 min de -63 a -75 °C. La mezcla resultante se agitó durante 3 h de -55 a -70 °C. Se añadió heptano (50 mL) a -60 °C, seguido de la adición de una solución de 40 g de cloruro de amonio en 100 mL de agua (con enfriamiento), permitiendo que la temperatura subiera de -70 °C a -30 °C. Se eliminó el baño de enfriamiento y se agitó la mezcla durante 30 min más, con lo que la temperatura se elevó a -15 °C. La mezcla se vertió en 200 mL de TBME y 50 mL de agua, las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con 50 mL de agua. Las capas acuosas sucesivas se extrajeron con 250 mL de TBME. Las capas orgánicas se secaron y se sometieron a evaporación rotatoria. El exceso de bromoacetato de etilo se eliminó a alto vacío calentando en un aparato Kugelrohr. El residuo que comprende 2-(2-oxociclooct-3-en-1-il)acetato de (Z)-etilo (40) se utilizó como tal en la etapa siguiente.
RMN 1H (CDCla): 8 = 1.25 (t, 3H), 1.4-2.6 (m, 9H), 2.9 (2d, 1H), 3.55 (m, 1H), 4.15 (q, 2H), 6.05 -6.5 (m, 2H) ppm.
Una solución del éster 40 sin purificación en una mezcla de 180 mL de THF y 20 mL de metanol se enfrió en hielo. Se añadió ácido fosfotúngstico (250 mg), seguido de la adición en porciones de borohidruro de sodio (4.0 g, 0.105 mol) durante un período de 30 min, a temperaturas por debajo de 7 °C. La mezcla se agitó durante 90 min en hielo, luego se añadieron 250 mL de agua y 250 mL de tolueno. Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con 50 mL de agua. Las capas acuosas sucesivas se extrajeron con 250 mL de tolueno. Las capas orgánicas se secaron y se sometieron a evaporación rotatoria. El producto 41 sin purificar no produjo fracciones bien definidas, por lo que todo el material se combinó e hidrolizó a reflujo durante 2 h con 25 mL de solución de hidróxido de sodio al 50 % en 200 mL de etanol (se añadieron otros 25 mL de agua durante el proceso). La mayor parte del etanol se eliminó por evaporación rotatoria. Se añadió algo de agua al residuo. La mezcla se extrajo con 2 x 200 mL de tolueno. Las capas orgánicas se lavaron con 50 mL de agua. Se añadió tolueno (200 mL) a las capas acuosas combinadas, que se acidificaron con ácido clorhídrico concentrado. Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con 20 mL de agua. Las capas acuosas sucesivas se extrajeron con 200 mL de tolueno. Las 2 capas orgánicas se secaron y se sometieron a evaporación rotatoria. La destilación de Kugelrohr produjo la lactona 42 como una mezcla de 2 isómeros en una relación aproximadamente de 2:1 (7.33 g, 44.1 mmol, 24 % basado en ciclooct-2-enona).
RMN 1H (CDCla): 8 = 1.2 - 2.6 (m, 10H), 2.6-2.8 (m, 1H), 4.95 (m, 0.35 H), 5.35 (m, 0.65H), 5.6 (m, 1H), 5.85 (m, 1H) ppm. RMN 13C (CDCh): 8 = 24.1, 25.2, 27.0, 28.0, 29.2, 29.6, 34.4, 36.8 (todo CH2), 43.5, 47.2, 80.8, 81.9 (todo CH), 126.4, 129.6, 130.2, 134.2 (todo CH), 176.4 (C=O), 177.0 (C=O) ppm.
La lactona 42 obtenida anteriormente (7.33 g, 44.1 mmol) se mezcló con 10.0 g de benzoato de metilo y aproximadamente 500 mL de heptano/éter (aproximadamente 4:1). La mezcla se irradió durante 36 h mientras la solución se lavaba continuamente a través de una columna de sílice de 69 g impregnada con nitrato de plata (que contenía aproximadamente 6.9 g de nitrato de plata). A continuación, el material de la columna se lavó con porciones de 250 mL de heptano/TBME en las proporciones 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 y luego con 400 mL de TBME. Las dos primeras fracciones contenían solo benzoato de metilo. Las últimas 3 fracciones se lavaron con 200 mL de amoníaco al 10 %, se secaron y se sometieron a evaporación rotatoria. Después de eliminar la mayor parte del benzoato de metilo a alto vacío, el residuo combinado pesó 800 mg (una mezcla del isómero Z y E, así como benzoato de metilo). El material restante de la columna se agitó con TBME y amoníaco, luego se filtró y las capas se separaron. El sólido se trató dos veces más con la capa acuosa y TBME, luego se filtró y las capas se separaron. Las capas orgánicas se secaron y se sometieron a evaporación rotatoria para producir 3.70 g de 43 como una mezcla aproximadamente 4:1 de isómeros, cada isómero probablemente consistiendo en 2 isómeros E (22.29 mmol, 51%).
RMN 1H (CDCh): 8 = 0.8 - 2.75 (m, 10.6H), 3.0 (m, 0.4H), 4.45 (t, 0.2H), 5.0 (m, 0.8H), 5.6 (dd, 0.5H), 5.65 (m, 0.5H) , 5.8 (m, 0.5 H), 6.05 (m, 0.5 H) ppm.
El isómero mayor recuperado (véase el experimento a continuación) tiene los siguientes datos:
RMN 1H (CDCh): 8 = 0.8 - 2.75 (m, 10.6H), 3.0 (m, 0.4H), t, 0.2H), 4.95 (m, 1H), 5.6 (dd, 0.8H), 5.65 (m, 0.3H), 5.8 (m, 0.3 H), 6.05 (m, 0.6 H) ppm.
RMN 13C (CDCh): 8 = 21.6, 25.8, 30.0, 30.4, 33.0, 34.8, 35.4, 36.0, 38.0 (todo CH2), 46.0, 47.0, 80.8, 84.0 (todo CH), 128.2, 131.4, 133.0, 134.0 (todo CH), 177.2 (C=O), 177.4 (C=O) ppm. La relación de las señales indica una relación de isómeros de aproximadamente 2:1.
Se añadió diisopropiletilamina (5.91 g, 45.8 mmol) a una solución de la lactona 43 (865 mg, 5.21 mmol) en 15 mL de diclorometano, seguido de la adición de clorhidrato de éster etílico de beta-alanina (1.38 g, 8.98 mmol). La mezcla se agitó durante 16 días a temperatura ambiente, luego se evaporó por rotación a 55 °C. El residuo se cromatografió sobre 50 g de sílice utilizando diclorometano como eluyente. Esto produjo la lactona 43 de partida (el isómero E mayor, que por RMN 13C parecía ser una mezcla de 2 isómeros). La elución adicional con diclorometano que contenía cantidades crecientes de metanol produjo la amida 44. El producto se recogió en 75 mL de TBME y se lavó con 5 g de ácido cítrico en 25 mL de agua y con 2 x 10 mL de agua. Las capas acuosas sucesivas se extrajeron con 50 mL de TBME. Las capas orgánicas combinadas se secaron y se sometieron a evaporación rotatoria para producir la amida 44 (360 mg, 1.27 mmol, 24 %), que consiste en una mezcla de isómeros.
RMN 1H (CDCl3): 8 = 0.8 - 2.7 (m), 1.25 (t), 2.45 (t) (16H), 3.5 (q, 2H), 3.9 (t, 0.5H), 4.15 (q, 2H), 4.35 (m, 0.5H), 5.5 -5.9 (m, 2H), 6.2 - 6.5 (2 bt, 1H) ppm.
RMN 13C (CDCl3) (señales de una fracción que estaba muy enriquecida en 1 conjunto de isómeros): 8 = 14.3 (CH3), 22.4, 27.8, 29.9, 33.0, 34.0, 34.1, 34.2, 34.5, 35.3, 35.3, 35.5, 35.7, 36.1, 36.2, 41.7 (todo CH2), 46.2 (CH), 51.6 (CH), 60.9 (CH2), 77.1, 80.2, 131.2, 131.7, 134.2, 135.6 (todo CH), 172.7, 173.9, 175.1 (todo C=O) ppm.
La amida 44 (115 mg, 0.406 mmol, principalmente 1 conjunto de isómeros) se disolvió en 4.4 g de acetonitrilo. Se añadió diisopropiletilamina (370 mg, 2.87 mmol), seguido de carbonato de N,N'-disuccinimidilo (355 mg, 1.38 mmol). La solución se agitó durante 2 días a aproximadamente 30 °C. El disolvente se eliminó por evaporación rotatoria y el residuo se cromatografió sobre 16 g de sílice, usando diclorometano con cantidades gradualmente crecientes de TBME como eluyente. El producto eluyó con aproximadamente 20 % de TBME. La evaporación rotatoria de las fracciones del producto proporcionó el carbonato de NHS 45 como un aceite viscoso (150 mg, 0.353 mmol, 87 %).
RMN 1H (CDCla): 8 = 0.8 - 2.6 (m), 1.25 (t), 2.55 (t) (16H), 2.85 (q, 4H), 3.5 (q, 2H), 4.15 (q, 2H), 4.95 (t, 0.8H), 5.2 (dd, 0.2H), 5.55 - 6.0 (m, 2H), 6.4 (bt, 1H) ppm.
El carbonato de NHS 45 obtenido anteriormente (150 mg, 0.353 mmol) se disolvió en 7.56 g de DMF. Se añadió diisopropiletilamina (132 mg, 1.02 mmol), seguido de clorhidrato de doxorrubicina (66 mg, 0.114 mmol). La mezcla se agitó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 3 días. El disolvente se eliminó a alto vacío y el residuo se cromatografió sobre 13 g de sílice, usando diclorometano con cantidades gradualmente crecientes de metanol como eluyente. La evaporación rotatoria de las fracciones del producto proporcionó 112 mg del profármaco 46.
RMN 1H (CDCl3, solo se presentan señales relevantes): 8 = 1.25 (t), 3.2 (m), 3.5 (m), 4.05 (s), 4.15 (q), 4.8 (s), 5.2 -5.8 (m), 6.15 (m), 6.25 (m), 7.4 ( d), 7.8 (t), 8.0 (d) ppm.
Opcionalmente el profármaco 46 puede conjugarse con un anticuerpo convirtiendo la funcionalidad éster en un ácido carboxílico, que luego puede convertirse en un éster de NHS para la conjugación con lisina.
Síntesis del producto menor (2,5-dioxopirrolidin-1-il)carbonato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (47)
Figure imgf000042_0001
Se añade carbonato de N,N'-disuccinimidilo (372 mg, 1.45 mmol) a una mezcla agitada de alcohol 31 minoritario (77 mg, 0.61 mmol), 3.33 g de acetonitrilo y diisopropiletilamina (410 mg, 3.18 mmol). La mezcla se agitó a 25 °C durante 3 días, añadiendo 120 mg adicionales de carbonato de N,N'-disuccinimidilo después de 2 días. La solución se cromatografió sobre 15 g de sílice usando diclorometano y luego diclorometano que contenía una pequeña cantidad de TBME como eluyente. Las fracciones del producto se sometieron a evaporación rotatoria para producir el producto 47 como un sólido (62 mg, 0.23 mmol, 38 %).
RMN 1H(CDCla): 8 = 0.8 (m, 1H), 1.15 (m, 1H), 1.45 -2.15 (m, 6H), 2.2 (dd, 1H), 2.55 (m, 1H), 2.8 (s, 4H), 5.4 ( s, 1H), 5.5 (d, 1H), 6.0 (m, 1H) ppm.
Ejemplo 3
Estabilidad y reactividad de los activadores de tetrazina
Pruebas de estabilidad hidrolítica de tetrazinas
Se diluyeron 10 pL de una solución de tetrazina específica en DMSO (25 mM) con tampón de PBS (3 mL) (o una mezcla de PBS y acetonitrilo en caso de que la solubilidad acuosa fuera demasiado baja). Esta solución se filtró y se controló la disminución de la banda de absorción a 525 nm mediante espectroscopia UV. La tasa de hidrólisis y el tiempo de vida media se determinaron a partir de estos datos.
Reactividad de tetrazinas hacia frans-ciclooct-4-en-1-ol (isómero axial)
Se realizó un experimento de competencia para determinar la relación de reactividad de una tetrazina específica y 3-(5-acetamido-2-piridil)-6-(2-piridil)-1,2,4,5-tetrazina (5) (que se eligió como la tetrazina de referencia), en la reacción inversa de Diels-Alder de demanda de electrones con frans-ciclooct-4-en-1-ol (isómero "menor" con OH en posición axial, véase: Whitham et al. J. Chem. Soc. (C), 1971, 883-896).
Se añadieron al acetonitrilo (0.100 mL) 5 pL de una solución de tetrazina específica en DMSO (25 mM) y 5 pL de una solución de tetrazina de referencia en DMSO (25 mM). Esta mezcla se diluyó con agua (0.9 mL) y las cantidades absolutas de ambas tetrazinas se determinaron mediante análisis por HPLC-MS/PDA. Posteriormente, se añadió lentamente una solución de frans-ciclooct-4-en-1-ol (isómero axial) en DMSO (25 pL 2.5 mM) y la mezcla se agitó durante 5 min. De nuevo, las cantidades absolutas de ambas tetrazinas se determinaron mediante análisis por HPLC-MS/PDA y se calcularon las conversiones para ambas tetrazinas. A partir de estas conversiones, la relación de reactividad (R=k2 Tco/k2 Ref) de ambas tetrazinas se calculó usando el procedimiento matemático de Ingold y Shaw (J. Chem. Soc., 1927, 2918-2926).
La siguiente tabla demuestra cómo el perfil de reactividad y estabilidad de las tetrazinas se puede adaptar a ciertas especificaciones variando los sustituyentes.
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000044_0001
Ejemplo 4
Estabilidad y reactividad de profármacos del modelo de frans-cicloocteno y profármacos
Estabilidad
Se diluyeron 10 pL de una solución del derivado específico de frans-cicloocteno en dioxano (25 mM) con tampón de PBS (3 mL), y esta solución se almacenó a 20 °C en la oscuridad. El destino del compuesto TCO se controló mediante análisis por HPLC-MS y se hizo una estimación del tiempo de vida media.
Reactividad de derivados de trans-cicloocteno frente a bis(2-piridil)-1,2,4,5-tetrazina: determinación de la constante de velocidad de segundo orden
La cinética de la reacción inversa de Diels-Alder de demanda de electrones de un derivado de frans-cicloocteno con 3-(5-acetamido-2-piridil)-6-(2-piridil)-1,2,4,5-tetrazina (5), realizada en acetonitrilo a 20 °C, se determinó mediante espectroscopia UV-visible. Se llenó una cubeta con acetonitrilo (3 mL) y se equilibró a 20 °C. Se añadió 3-(5-acetamido-2-piridil)-6-(2-piridil)-1,2,4,5-tetrazina (5, 2.50x10'7 mol), seguido por el derivado de frans-cicloocteno (2.50x10-7 mol). Se controló el decaimiento de la absorción a A=540 nm y, a partir de esta curva, se determinó la constante de velocidad de segundo orden, k2, asumiendo una cinética de velocidad de segundo orden.
Reactividad de los derivados de trans-cicloocteno hacia bis(2-piridil)-1,2,4,5-tetrazina: experimento de competencia
Se realizó un experimento de competencia para determinar la relación de reactividad de un derivado específico de frans-cicloocteno y frans-ciclooct-4-en-1-ol (isómero axial) (que se eligió como el frans-cicloocteno de referencia), en la reacción inversa de Diels-Alder de demanda de electrones con bis(2-piridil)-1,2,4,5-tetrazina (2).
Se le añadió a acetonitrilo (0.05 mL) una solución del derivado específico de frans-cicloocteno en dioxano (5 pL 25 mM; 1.25x10'7 mol) y una solución del frans-cicloocteno de referencia en dioxano (5 pL 25 mM; 1.25x10'7 mol). Esta mezcla se diluyó con agua (0.45 mL). Posteriormente, se añadió lentamente una solución de bis(2-piridil)-1,2,4,5-tetrazina (2, 6.25x10'8 mol) en una mezcla de acetonitrilo (0.05 mL) y agua (0.45 mL) mientras se agitaba vigorosamente. Después de la adición, la mezcla se agitó durante 5 min más. La conversión de ambos derivados de frans-cicloocteno se determinó mediante análisis por HPLC-MS/PDA y, a partir de estas conversiones, se calculó la relación de reactividad (R=k2,Tco/k2,Ref) del derivado específico de trans-cicloocteno usando el procedimiento matemático de Ingold y Shaw (J. Chem. Soc., 1927, 2918-2926).
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000046_0003
Ejemplo 5
Activación de profármacos modelo
El ejemplo demuestra la reacción inversa de Diels-Alder de demanda de electrones de 1,2,4,5-tetrazinas y un profármaco de trans-cicloocteno modelo, y la subsiguiente eliminación del fármaco modelo (por ejemplo, bencilamina). Procedimiento general:
3,6-bis(2-piridinil)-1,2,4,5-tetrazina (2) y bencilcarbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (32) producto menor
Figure imgf000046_0001
Se disolvió 3,6-bis(2-piridinil)-1,2,4,5-tetrazina (2, 5.91x10-5 g; 2.5x10-7 mol) en 0.2 mL de acetonitrilo y se añadió bencilcarbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo menor (32, el isómero con el carbamato en posición axial; 6.48x10-5 g; 2.50x10-7 mol). Después de 5 min, la mezcla de reacción se diluyó con agua (0.8 mL) y se agitó a 20 °C durante 24 h. El análisis por HPLC-MS de la mezcla demostró la formación del producto de eliminación (el aducto rDA sin el carbamato de aminobencilo) con m/z = 317 Da (M+H+), y la liberación de bencilamina (m/z = 108 Da: M+H+). 6-metil-3-(4-butanamido-2-piridinil)-1,2,4,5-tetrazina y bencilcarbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (32) producto menor
Figure imgf000046_0002
De acuerdo con el procedimiento general anterior, se hicieron reaccionar ambos compuestos del título y el análisis por HPLC-MS demostró la formación del producto de eliminación con m/z = 339 Da (M+H+), y liberación de bencilamina (m/z = 108 Da: M+H+).
6-fenil-3-(4-aminofenil)-1,2,4,5-tetrazina y bencilcarbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (32) producto menor
Figure imgf000047_0001
De acuerdo con el procedimiento general anterior, se hicieron reaccionar ambos compuestos del título y el análisis por HPLC-MS demostró la formación del producto de eliminación con m/z = 330 Da (M+H+), y liberación de bencilamina (m/z = 108 Da: M+H+).
6-Fenil-3-(3-aminofenil)-1,2,4,5-tetrazina y bencilcarbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (32) producto menor
Figure imgf000047_0002
De acuerdo con el procedimiento general anterior, se hicieron reaccionar ambos compuestos del título y el análisis por HPLC-MS demostró la formación del producto de eliminación con m/z = 330 Da (M+H+), y liberación de bencilamina (m/z = 108 Da: M+H+).
6-H-3-(4-aminometilfenil)-1,2,4,5-tetrazina y bencilcarbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (32) producto menor
Figure imgf000047_0003
De acuerdo con el procedimiento general anterior, se hicieron reaccionar ambos compuestos del título y el análisis por HPLC-MS demostró la formación del producto de eliminación con m/z = 268 Da (M+H+), y liberación de bencilamina (m/z = 108 Da: M+H+).
3,6-difenil-1,2,4,5-tetrazina y bencilcarbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (32) producto menor
Figure imgf000047_0004
De acuerdo con el procedimiento general anterior, se hicieron reaccionar ambos compuestos del título y el análisis por HPLC-MS demostró la formación del producto de eliminación con m/z = 315 Da (M+H+), y liberación de bencilamina (m/z = 108 Da: M+H+).
3,6-Bis(2-aminofenil)-1,2,4,5-tetrazina (9) y bencilcarbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (32) producto menor
Figure imgf000048_0001
Se disolvió 3,6-bis(2-aminofenil)-1,2,4,5-tetrazina (3.34 mg; 1.26 x 10-5 mol) en 0.5 mL de DMSO-d6, y se añadió bencilcarbamato de (£)-ciclooct-2-en-1-ilo producto menor (32; 3.28 mg; 1.26 x 10-5 mol). Después de 5 min, la mezcla de reacción se diluyó con D2O (0.2 mL) y se agitó a 20 °C durante 24 h. La RMN 1H de la mezcla de reacción indicó la formación de bencilamina: 8 = 3.86 ppm (s, 2H, PhCH2NH2). El análisis por HPLC-MS de esta mezcla demostró la formación del producto de eliminación (tr = 5.45 min: m/z = 345 Da (M+H+), y liberación de bencilamina: (tr = 0.88 min: m/z = 108 Da: (M+H+)).
3,6-Bis(4-hidroxifenil)-1,2,4,5-tetrazina (11) y bencilcarbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (32) producto menor
Figure imgf000048_0002
Se disolvió 3,6-bis(4-hidroxifenil)-1,2,4,5-tetrazina (11, 6.65 x 10-5 g; 2.50 x 10-7 mol) en 0.5 mL de acetonitrilo y se añadió bencilcarbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo producto menor (32; 6.48 x 10-5 g; 2.50 x 10-7 mol). Después de 2 min, la mezcla de reacción se diluyó con agua (0.5 mL) y se agitó a 20 °C durante 5 h. El análisis por HPLC-MS de la mezcla demostró la formación del producto de eliminación con m/z = 347 Da (M+H+), y liberación de bencilamina: m/z = 108 Da (M+H+).
3,6-Bis(2-aminofenil)-1,2,4,5-tetrazina (9) y (3,5-dimetilfenil)carbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (33) producto menor
Figure imgf000048_0003
Se disolvió 3,6-bis(2-aminofenil)-1,2,4,5-tetrazina (9, 6.60 x 10-5 g; 2.50 x 10-7 mol) se disolvió en acetonitrilo (0.3 mL) y esta mezcla se diluyó con tampón de PBS (0.7 mL). A continuación, se añadió (3,5-dimetilfenil)carbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (33, el isómero con el carbamato en la posición axial; 6.84 x 10-5 g; 2.50 x 10-7 mol). La solución se agitó a 20 °C durante 20 h. El análisis por HPLC-MS de la mezcla demostró la formación del producto de eliminación con m/z = 345 Da (M+H+), y liberación de 3,5-dimetilanilina: m/z = 122 Da (M+H+).
3,6-bis(4-hidroxifenil)-1,2,4,5-tetrazina (11) y (3,5-dimetilfenil)carbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (33) producto menor
Figure imgf000048_0004
Se disolvió 3,6-bis(4-hidroxifenil)-1,2,4,5-tetrazina (11, 6.65 x 10-5 g; 2.50 x 10-7 mol) en acetonitrilo (0.2 mL) y esta mezcla se diluyó con tampón de PBS (0.8 mL). A continuación, se añadió (3,5-dimetilfenil)carbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo producto menor (33; 6.84 x 10-5 g; 2.50 x 10-7 mol). La solución se agitó a 20 °C durante 20 h. El análisis por HPLC-MS de la mezcla demostró la formación del producto de eliminación con m/z = 347 Da (M+H+), y liberación de 3,5-dimetilanilina: m/z = 122 Da (M+H+).
3,6-difenil-1,2,4,5-tetrazina y (3,5-dimetilfenil)carbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (33) producto menor
Figure imgf000049_0001
Se disolvió 3,6-Difenil-1,2,4,5-tetrazina (5.85 x 10-5 g; 2.50 x 10-7 mol) se disolvió en acetonitrilo (0.3 mL) y esta mezcla se diluyó con tampón de PBS (0.7 mL). A continuación, se añadió (3,5-dimetilfenil)carbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (33; 6.84 x 10'5 g ; 2.50 x 10'7 mol). La solución se agitó a 20 °C durante 20 h. El análisis por HPLC-MS de la mezcla demostró la formación del producto de eliminación con m/z = 315 Da (M+H+), y liberación de 3,5-dimetilanilina: m/z = 122 Da (M+H+).
3-(2-piridil)-6-metil-1,2,4,5-tetrazina (7) y (3,5-dimetilfenil)carbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (33) producto menor
Figure imgf000049_0002
Se disolvió 3-(2-piridil)-6-metil-1,2,4,5-tetrazina (7, 4.33 x 10'5 g; 2.50 x 10'7 mol) en tampón de PBS (1 mL). A continuación, se añadió (3,5-dimetilfenil)carbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo (33; 6.84 x 10'5 g; 2.50 x 10'7 mol). La solución se agitó a 20 °C durante 20 h. El análisis por HPLC-MS de la mezcla demostró la formación del producto de eliminación con m/z = 254 Da (M+H+), y liberación de 3,5-dimetilanilina: m/z = 122 Da (M+H+).
Ejemplo 6
Activación de profármacos de doxorrubicina
3-(2-piridil)-6-metil-1,2,4,5-tetrazina (7) y carbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo doxorrubicina (38) producto menor
Figure imgf000049_0003
Se disolvió 3-(2-piridil)-6-metil-1,2,4,5-tetrazina (7, 4.33 x 10'6 g; 2.50 x 10'8 mol) en tampón de PBS (1 mL) (c = 25 |jM). A continuación, se añadió carbamato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo doxorrubicina producto menor (38, el isómero con el carbamato en la posición axial; 1.74 x 10'5 g; 2.50 x 10'8 mol). La solución se agitó a 20 °C durante 4 h. El análisis por HPLC-MS de la mezcla demostró la formación del producto de eliminación con m/z = 254 Da (M+H+) y liberación de doxorrubicina (69% de rendimiento): m/z = 544 Da (M+H+) y Xmáx. = 478 nm. Se obtuvieron resultados comparables a concentraciones de 2.5 y 1.0 jM .
3-(2-piridil)-6-metil-1,2,4,5-tetrazina (7) y carbamato de (£)-ciclooct-2-en-1-ilo doxorrubicina (38) producto mayor
Se disolvió 3-(2-piridil)-6-metil-1,2,4,5-tetrazina (7, 4.33 x 10-6 g; 2.50 x 10-8 mol) en tampón de PBS (1 mL) (c = 25 |jM). A continuación, se añadió carbamato de (£)-ciclooct-2-en-1-ilo doxorrubicina (38, el isómero con el carbamato en la posición ecuatorial; 1.74 x 10-5 g; 2.50 x 10-8 mol). La solución se agitó a 20 °C durante 16 h. El análisis por HPLC-MS de la mezcla mostró una conversión de la reacción de DA del 40 % y demostró la formación del producto de eliminación con m/z = 254 Da (M+H+), y liberación de doxorrubicina (20% de rendimiento): m/z = 544 Da (M+H+) y ^máx. = 478 nm.
3,6-Bis(2-aminofenil)-1,2,4,5-tetrazina (9) y carbamato de (£)-ciclooct-2-en-1-ilo doxorrubicina (38) producto menor
Figure imgf000050_0001
Se disolvió 3,6-bis(2-aminofenil)-1,2,4,5-tetrazina (9, 2.64 x 10-6 g; 1.00 x 10-8 mol) en acetonitrilo (0.1 mL). Esta mezcla se diluyó con tampón de PBS (0.9 mL). A continuación, se añadió carbamato de (£)-ciclooct-2-en-1-ilo doxorrubicina (38; 6.96 x 10-6 g; 1.00 x 10-8 mol). La solución se agitó a 20 °C durante 18 h. El análisis por HPLC-MS de la mezcla demostró la formación del producto de eliminación con m/z = 345 Da (M+H+) y liberación de doxorrubicina (90% de rendimiento): m/z = 544 Da (M+H+) y Xmáx. = 478 nm.
Ejemplo 7
Ensayo de proliferación celular con profármaco doxorrubicina producto minor 38 y tetrazina 7
Las células de carcinoma escamoso A431 se mantuvieron en una incubadora humidificada con CO2 (5%) a 37 °C en DMEM (Invitrogen) complementado con suero bovino fetal al 10% inactivado con calor y glutamax al 0.05% (Invitrogen) en presencia de penicilina y estreptomicina. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Nunc) a una densidad de 2500 células/pocillo 24 h antes del experimento. Se diluyeron en forma serial doxorrubicina (Dox) y el profármaco menor 38 (1 mM en DMSO) y la tetrazina 7 (10 mM en PBS) en medio de cultivo precalentado inmediatamente antes del experimento y se añadieron a los pocillos (200 jL de volumen final por pocillo). El profármaco se añadió solo o en combinación con tetrazina 7 10 jM o 1.5 eq. mol (con respecto al profármaco). Después de 72 h de incubación a 37 °C, se evaluó la proliferación celular mediante un ensayo MTT. Brevemente, se disolvió bromuro de metiltiazolildifeniltetrazolio (MTT) en PBS a razón de 5 mg/mL, se filtró a través de 0.22 jm y se añadieron 25 jL a cada pocillo. Después de 120 min de incubación a 37 °C, se aspiró suavemente el medio. Los cristales de formazán formados se disolvieron en 100 jL de DMSO y se midió la absorbancia con un lector de placas (BMG Labtech) a 560 nm. Los valores de CI50 (± error estándar; véase la Tabla) se derivaron de las curvas de crecimiento celular normalizadas (véase la Figura) generadas con GraphPad Prism (versión 5.01). El ensayo de proliferación celular muestra que, mientras que la tetrazina 7 no es tóxica (CI50 > 100 jM ) y el profármaco 38 es ligeramente tóxico (CI50 = 3.017 ± 0.486 jM), la combinación de estos dos componentes da como resultado una mayor toxicidad sobre las células A431 (CI500.137 ± 0.012 jM y 0.278 ± 0.022 jM cuando se utilizan diluciones seriadas o una cantidad constante de tetrazina 7, respectivamente). Esto confirma que la doxorrubicina se libera tras la reacción retro de Diels-Alder entre el frans-cicloocteno del profármaco y la tetrazina.
Valores de CI50 para doxorrubicina (Dox), profármaco 38 con y sin activación por tetrazina 7 y tetrazina 7 sola, determinados en la línea celular A431
Figure imgf000050_0002
Figure imgf000051_0001
Ensayo de proliferación celular realizado en células tumorales A431 en presencia de doxorrubicina (Dox), profármaco 38 con y sin activación por tetrazina 7 y tetrazina 7 solamente.
Ejemplo 8
Enmascaramiento de anticuerpos mediante modificación con carbonato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo NHS 47 y posterior activación de anticuerpos mediante reacción con activador de tetrazina
Conjugación de anticuerpos con carbonato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo NHS 47 producto menor
Se añadió una solución de CC49 (8 mg/mL, 62.5 j L) en PBS con 6.2 jL de DMF y se ajustó el pH a 9 con tampón de carbonato de sodio 1 M. Posteriormente, se disolvió carbonato de (E)-ciclooct-2-en-1-ilo NHS 47 producto menor recién disuelto en DMF seco (5 jg / jL , 40 eq. mol con respecto a CC49) y la solución resultante se incubó durante 3 h a temperatura ambiente, con agitación suave y en la oscuridad. Después de la incubación, la mezcla de reacción se diluyó a 500 jL con PBS y se eliminó el producto 47 sin reaccionar por medio de una columna de centrifugación de desalinización Zeba (corte de PM de 40 kDa, Pierce) equilibrada previamente con PBS. La concentración de la solución de mAb obtenida se midió mediante UV-Vis (Nanodrop) y la pureza e integridad del producto se evaluaron mediante SDS-PAGE. El rendimiento de la conjugación se determinó con una titulación con tetrazina. El derivado DOTA-tetrazina 29 fue radiomarcado con 177Lu con adición de vehículo como se describió anteriormente (Rossin et al., Angew Chem Int Ed, 2010, 49, 3375-3378). El mAb modificado con TCO (25 jg ) se hizo reaccionar con un exceso conocido de 177Lu-DOTA-tetrazina en PBS (50 j L). Después de 10 min de incubación a 37 °C, se añadió a la mezcla de reacción un tampón de muestra no reductor y se analizó mediante SDS-PAGE. Después de la electroforesis en gel, se evaluó la distribución de radiactividad en cada carril con un generador de imágenes de fósforo. Los rendimientos de la reacción entre 177Lu-DOTA-tetrazina y la construcción CC49-TCO se estimaron a partir de la intensidad de la banda de mAb radiactiva con respecto a la radiactividad total en el carril. Con este procedimiento se encontró un promedio de 20 fracciones de TCO por molécula de CC49 (rendimiento de conjugación del 50%).
Marcación radiactiva de CC49 y CC49-TCO(47)
El CC49 no modificado fue radiomarcado con 125I con el procedimiento de Bolton-Hunter de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se diluyó yoduro [I125] de sodio de aproximadamente 40 MBq con 50 jL de PBS y se le añadió 1 jL de solución de reactivo de Bolton-Hunter (SHPP, Pierce) en DMSO (0.1 jg / jL ) y 25 jL de solución de cloramina-T (Sigma-Aldrich) en PBS (4 mg/jL). La solución se mezcló durante 10-20 segundos, luego se añadieron 5 jL de DMF y 100 jL de tolueno. Después de someter a agitación tipo vórtice, la fase orgánica que contenía 125I-SHPP se transfirió a un vial de vidrio y se secó a temperatura ambiente bajo una corriente suave de N2. Luego se añadieron 30 jg de CC49 en PBS (50 j L) al vial de vidrio recubierto con 125I-SHPP y el pH se ajustó a 9 con tampón de carbonato de sodio 1 M, pH 9.6. El vial se incubó a temperatura ambiente con agitación suave durante aproximadamente 60 min, luego se evaluó el rendimiento de marcación de 125I-mAb con radio-ITLC (47%). El 125I-mAb sin purificar se purificó a través de columnas de centrifugación de desalinización Zeba (corte de PM de 40 kDa, Pierce) equilibradas previamente con solución salina y la pureza radioquímica del CC49 obtenido marcado con 125I fue superior al 98%, de acuerdo con lo determinado por radio-ITLC y radio-HPLC.
El CC49 con 20 fracciones de TCO (47) por molécula se hizo reaccionar con DOTA-tetrazina 29 (1 eq. mol con respecto a mAb) que fue previamente radiomarcado con 177Lu no añadido al vehículo como se describe (Rossin et al., Angew Chem Int Ed, 2010, 49, 3375-3378). Después de 10 min de incubación se usó la mezcla de reacción con una pureza radioquímica del 91% el CC49-TCO(47) marcado con 177Lu por radio-HPLC y se usó la mezcla de reacción sin purificación adicional.
Experimentos de activación de anticuerpos
En este ejemplo, se demostró que al modificar en exceso CC49 con TCO 47 se puede reducir significativamente la capacidad del mAb para unirse a su objetivo y que al hacer reaccionar la construcción CC49-TCO modificada en exceso con tetrazina 7, se restaura la capacidad de unión al objetivo. La reactivación del mAb tras la reacción con la tetrazina indica la liberación de TCO siguiendo el mecanismo de eliminación mediado por la cascada electrónica. La capacidad de las construcciones CC49 para unirse a su objetivo se evaluó mediante el uso de un ensayo de inmunorreactividad modificado a partir de un método descrito anteriormente (Lewis et al., Bioconjug Chem, 2006, 17, 485-492). Brevemente, las construcciones de mAb radiomarcadas (1 pg) se hicieron reaccionar con un exceso molar de 20 veces de mucina submaxilar bovina tipo I-S (BSM; Sigma-Aldrich) en solución de BSA al 1% (100 pL). Después de 10 min de incubación a 37 °C, las mezclas se analizaron por radio-HPLC utilizando una columna Superdex-200 (GE Healthcare Biosciences) eluida con PBS a 0.35 mL/min. En estas condiciones 125I-CC49 no modificado por TCO eluyó de la columna en un pico ancho con un tiempo de retención de 39 min (Figura 1-A). Como era de esperar, después de la incubación con BSM la actividad de 125I eluyó de la columna en un pico correspondiente a una especie de PM más alto (tiempo de retención de 25 min), lo que confirma la unión de 125I-CC49 a BSM (100 % de inmunorreactividad; Figura 1-B).
Cuando el CC49 marcado con 177Lu con 20 fracciones de TCO 47 por molécula se analizó mediante radio-HPLC, el mAb eluyó de la columna en dos picos amplios sin resolver con tiempos de retención de 31 min y 36 min, lo que representa el 43 % y el 57 % de la actividad total relacionada con mAb, respectivamente (Figura 2- A). Este comportamiento sugiere una modificación excesiva de CC49 con grupos TCO. De hecho, el cambio de PM después de la conjugación es relativamente pequeño y no es probable que provoque un cambio de 3 min en el tiempo de retención (de 39 a 36 min) entre CC49 y CC49-TCO. Por lo tanto, es más probable que la retención más corta en la columna se deba a cambios conformacionales causados por las 20 fracciones de TCO unidas al mAb. Además, el pico ancho que eluye de la columna a los 31 min es un signo de agregación de mAb. En consecuencia, después de incubar el CC49-TCO marcado con 177Lu con BSM, solo una pequeña cantidad (aproximadamente 20 % del total) de la actividad de 177Lu se asoció con una especie de alto PM en el cromatograma marcado radioactivamente (Figura 2-B). La inmunorreactividad residual de aproximadamente 20 % confirma que el CC49-TCO(47) modificado en exceso ha perdido su capacidad de unión al objetivo.
Posteriormente, el CC49-TCO(47) marcado con 177Lu se hizo reaccionar con un gran exceso de tetrazina 7 (exceso molar de 500 veces con respecto a TCO) en PBS a 37 °C. En varios puntos de tiempo (1 hora, 4 h y 24 h) se extrajo una parte alícuota de la mezcla de reacción (que contenía 1 pg de mAb), se incubó con BSM y se analizó por radio-HPLC. Tan solo 1 hora después de la adición de tetrazina 7, el cromatograma marcado radioactivamente mostró la desaparición del pico radiactivo atribuido a los agregados CC49-TCO, una reducción significativa del pico a los 36 min y la formación de un pico intenso debido a la formación de un aducto de 177Lu-CC49-TCO-BSM (Rt = 24 minutos; 72% de la actividad total relacionada con mAb; Figura 2-C).
Se observó un ligero aumento adicional en el área del pico con el tiempo (76 % después de 24 h de incubación de CC49-TCO con tetrazina 7). El rápido aumento de la inmunorreactividad de CC49 después de la cicloadición retro de Diels-Alder entre TCO 47 y tetrazina 7 es indicativo de liberación de TCO como resultado del mecanismo de eliminación mediado por cascada electrónica.
Figure imgf000052_0001
2 , 00 B
0,00
Figure imgf000052_0002
0,00 10,00 20 , 00 30 , 00 40 , 00 50 , 00 m i n
Figura 1: Cromatogramas marcados radioactivamente de exclusión por tamaño de (A) 125I-CC49 y (B) 125I-CC49 unido a mucina submaxilar bovina tipo I-S (BSM)
Figure imgf000053_0001
Figura 2: Cromatogramas marcados radioactivamente de exclusión por tamaño de (A) 177Lu-CC49-TCO y 177Lu-CC49-TCO en presencia de mucina submaxilar bovina tipo I-S (BSM) (B) antes y (C) después de 1 h de reacción con tetrazina 7
Ejemplo 9
Ejemplos de rutas generales de síntesis e intermediarios clave para la preparación de desencadenadores basados en TCO.
Los corchetes alrededor de LD y Sp significa que son opcionales. La TT presentada en este ejemplo puede ser reemplazada opcionalmente por
Figure imgf000053_0002
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000056_0001
Ejemplo 10
Estructuras de ejemplos de fracciones LD
Figure imgf000056_0002
Los enlazadores LD son los llamados enlazadores autoinmolables, lo que significa que tras la reacción del desencadenador con el activador, el enlazador se degradará a través de reacciones intramoleculares liberando así el fármaco DD Algunos de los anteriores también contienen una SP
Ejemplo 11.
Estructuras de ejemplos de fracciones SP
Figure imgf000057_0001
íVW = resto del profármaco unido
Téngase en cuenta que los grupos maleimida, éster activo y bromoacetamida son grupos activos a los que se dirigen los fracciones TT y fracciones de enmascaramiento MM, opcionalmente se pueden acoplar a través de otros espaciadores SP Los grupos maleimida y bromoacetamida suelen reaccionar con tioles, mientras que los ésteres activos suelen ser adecuados para acoplarse a aminas primarias o secundarias.
Ejemplo 12.
Estructuras de desencadenadores de TCO con los ejemplos de fracciones LD descritas y que funcionan a través del mecanismo de eliminación en cascada.
La TT presentada en este ejemplo puede ser reemplazada opcionalmente por MM
Figure imgf000057_0002
Figure imgf000058_0001
— = resto de TT o SP-TT unidos
Ejemplo 13.
Estructuras de desencadenadores de TCO con ejemplos de fracciones LD y/o SP descritas y que funcionan a través del mecanismo de eliminación en cascada.
Desencadenador conjugado con TT a través de amina o tiol de TT. La TT presentada en este ejemplo puede ser reemplazada opcionalmente por MM.
Figure imgf000058_0002
Ejemplo 14.
Estructuras de desencadenadores de TCO con ejemplos de fracciones LD y/o SP descritas y que funcionan a través del mecanismo de eliminación en cascada.
Desencadenador conjugado con TT a través de amina o tiol de TT. La TT presentada en este ejemplo puede ser reemplazada opcionalmente por MM.
Figure imgf000059_0001
Ejemplo 15.
Estructuras de conjugados anticuerpo-fármaco, que funcionan a través del mecanismo de eliminación en cascada. La toxina auristatina E (MMAE) se une a través de un enlazador LD autoinmolable a un desencadenador de TCO y, en los casos a través de SP, a un anticuerpo o fragmento de direccionamiento (conjugado a través de un residuo de cisteína o lisina). Ab = anticuerpo o fragmento de anticuerpo; q = # de modificación de Ab y normalmente está entre 1 y 10.
Figure imgf000060_0001
Figure imgf000061_0001
Estructuras de conjugados anticuerpo-fármaco, que funcionan a través del mecanismo de eliminación en cascada. La toxina auristatina E (MMAE) se une a un desencadenador de TCO y a través de SP, a un anticuerpo o fragmento de direccionamiento (conjugado a través de un residuo de cisteína o lisina). Ab = anticuerpo o fragmento de anticuerpo; q = # de modificación de Ab y normalmente está entre 1 y 10.
Figure imgf000062_0001
Ejemplo 17.
Estructuras de conjugados anticuerpo-fármaco, que funcionan a través del mecanismo de eliminación en cascada.
La toxina de maitansina se une a través de un enlazador LD autoinmolable a un desencadenador de TCO y, en algunos casos a través de SP, a un anticuerpo o fragmento de direccionamiento (conjugado a través de un residuo de cisteína o lisina). Ab = anticuerpo o fragmento de anticuerpo; q = relación de modificación de Ab y normalmente está entre 1 y 10.
Figure imgf000063_0001
Figure imgf000064_0001
Figure imgf000065_0001
Figure imgf000066_0001
Figure imgf000067_0001
Ejemplo 18.
Estructuras de construcciones de desencadenador-fármaco que se pueden conjugar con un agente de direccionamiento TT por ejemplo, a través de una fracción amina o tiol, y que funcionan a través del mecanismo de eliminación en cascada.
La toxina auristatina E (MMAE) se une a través de un enlazador LD autoinmolable a un desencadenador de TCO y, en algunos casos a través de SP, a una fracción reactiva para conjugación de TT
Figure imgf000068_0001
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Ejemplo 19.
Estructuras de construcciones de desencadenador-fármaco que se pueden conjugar con un agente de direccionamiento TT por ejemplo, a través de una fracción amina o tiol, y que funcionan a través del mecanismo de eliminación en cascada.
La toxina auristatina E (MMAE) se une a un desencadenador de TCO y a través de SP a una fracción reactiva para conjugación de TT
Figure imgf000069_0002
Ejemplo 20.
Estructuras de construcciones de desencadenador-fármaco que se pueden conjugar con un agente de direccionamiento TT por ejemplo, a través de una fracción amina o tiol, y que funcionan a través del mecanismo de eliminación en cascada.
La toxina de maitansina se une a través de un enlazador LD autoinmolable a un desencadenador de TCO TR y, en algunos casos a través de SP, a una fracción reactiva para conjugación de TT
Figure imgf000070_0001
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Ejemplo 21.
Activación del conjugado CC49-auristatina E unido al tumor.
CC49 como mAb o fragmento de mAb se une al marcador tumoral pan-sólido no internalizante TAG72. Después de la administración del profármaco, la unión al tumor y la eliminación de la sangre, se inyecta el activador. La reacción del activador con el desencadenador de TCO en el profármaco da como resultado la liberación de auristatina E de CC49 (anticuerpo o fragmento de anticuerpo), lo que le permite penetrar en la célula cancerosa dentro de la cual tiene su acción anticancerígena.
Figure imgf000074_0001
Ejemplo 22.
Activación del triacuerpo que se acopla a las células T unidas al tumor.
El triacuerpo comprende una fracción de unión al tumor, una fracción de unión a células T CD3 y una fracción coestimuladora de células T CD28. Como el CD3 y el CD28 combinados en una molécula darán como resultado un efecto tóxico inaceptable fuera del objetivo, el dominio anti-CD28 está bloqueado por unafracción de enmascaramiento MM, un péptido que se parece al dominio de unión a CD28 y que tiene afinidad por la fracción anti-CD28. Este péptido está enlazado a través de otro péptido o una SP con cadena PEG al desencadenador de TCO que a su vez está conjugado con una cisteína modificada específicamente en el sitio. Después de la administración del profármaco, la unión al tumor y la eliminación de la sangre, se inyecta el activador. La reacción del activador con el desencadenador de TCO en el profármaco da como resultado la liberación de la fracción de enmascaramiento del dominio anti-CD28 que permite la coestimulación de las células T con CD28, lo que refuerza el efecto anticancerígeno mediado por las células T y evita la toxicidad fuera del objetivo.
Figure imgf000075_0001

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un kit para la administración y activación de un profármaco, comprendiendo el kit un fármaco DD enlazado, directa o indirectamente, a una fracción desencadenadora TR, y un activador para la fracción desencadenadora, donde la fracción desencadenadora comprende un dienófilo y el activador comprende un dieno, el dienófilo, que incluye dicho fármaco enlazado al mismo, que satisface la siguiente fórmula (1a):
Figure imgf000076_0001
donde T, G denota cada uno independientemente H, o un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en alquilo, F, Cl, Br o I;
A y P cada uno independientemente son CRa2 o CRaXD siempre que al menos uno sea CRaXD; XD es (O-C(O))p-(LD)n-(DD), S-C(O)-(LD)n-(DD), O-C(S)-(LD)n-(DD), S-C(S)-(LD)n-(DD), o O-S(O)-(LD)n-(DD), donde p = 0 o 1; (LD)n es un enlazador opcional, con n = 0 o 1, enlazado a TR a través de S, N, NH u O, donde estos átomos son parte del enlazador, que puede consistir en múltiples unidades dispuestas linealmente y/o en forma ramificada;
Y, Z, Q, X juntos forman una fracción alifática o heteroalifática de cuatro miembros, opcionalmente fusionada con una fracción o fracciones aromáticas;
cada Ra se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, OR', SR', S(=O)R"', S(=O)2R'" S(=O)2NR'R", Si-R"', Si-O-R"', OC(=O)R"', SC(=O)R"', OC(=S)R"', SC(=S)Rm, F, Cl, Br, I, N3, SO2H, SO3H, SO4H PO3H, PO4H, NO, NO2, CN, OCN, SCN, NCO, NCS, CF3, CF2-R', NR'R", C(=O)R', C(=S)R', C(=O)O-R', C(=S)O-R' C(=O)S-R', C(=S)S-R', C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'C(=O)-R"', NR'C(=S)-R"', NR'C(=O)O-R"', NR'C(=S)O-R"' NR'C(=O)S-Rm, NR'C(=S)S-R"', OC(=O)NR'-R"', SC(=O)NR'-R'", OC(=S)NR'-R"', SC(=S)NR'-R"', NR'C(=O)NR"-R" NR'C(=S)NR"-R", CR'NR", siendo cada R' y cada R'' independientemente H, arilo o alquilo y R''' siendo independientemente arilo o alquilo;
DD es uno o más fármacos, preferiblemente enlazados a través de S, N, NH u O, donde estos átomos son parte del fármaco, donde cuando tanto p como n son 0, DD está enlazado a TR a través de un O, N, NH o S, donde estos átomos son parte del fármaco;
donde opcionalmente uno o más agentes de direccionamiento TT o fracciones de enmascaramiento MM se unen al fármaco DD, desencadenador TR, o enlazador LD, opcionalmente a través de un espaciador o espaciadores SP; donde el activador comprende un dieno seleccionado de los dienos, de acuerdo con las fórmulas (2)-(4):
Figure imgf000076_0002
(2)
donde R1 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, CF3 , CF2-R', OR', SR', C(=O)R', C(=S)R', C(=O)O-R', C(=O)S-R', C(=S)O-R', C(=S)S-R", C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'R", NR'C(=O)R", NR'C(=S)R", NR'C(=O)OR", NR'C(=S)OR", NR'C(=O)SR", NR'C(=S)SR", NR'C(=O)NR"R", NR'C(=S)NR"R" siendo cada R' y cada R'' independientemente H, arilo o alquilo; A y B se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consta de carbono sustituido con alquilo, carbono sustituido con arilo, nitrógeno, N+O', N+R siendo R alquilo, con la condición de que A y B no sean ambos carbono; X se selecciona del grupo que consiste en O, N-alquilo y C=O, y Y es CR con R seleccionado del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, C(=O)OR', C(=O)SR', C(=S)OR', C(=S)SR', C(=O)NR'R" siendo R' y R'' cada uno independientemente H, arilo o alquilo.
Figure imgf000076_0003
Figure imgf000076_0004
donde R1 y R2 cada uno independientemente se seleccionan del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, CF3, CF2-R', NO2 , OR', SR', C(=O)R', C(=S)R', OC(=O)R"', SC(=O)R"', OC(=S)Rm, SC(=S)R"', S(=O)R', S(=O)2R''', S(=O)2NR'R", C(=O)O-R', C(=O)S-R', C(=S)O-R', C(=S)S-R', C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'R", NR'C(=O)R", NR'C(=S)R", NR'C(=O)OR", NR'C(=S)OR", NR'C(=O)SR", NR'C(=S)SR", OC(=O)NR'R", SC(=O)NR'R", OC(=S)NR'R", SC(=S)NR'R", NR'C(=O)NR"R", NR'C(=S)NR"R" con cada R’ y cada R’’ siendo independientemente H, arilo o alquilo, y siendo R’’’ independientemente arilo o alquilo; A se selecciona del grupo que consiste en N-alquilo, N-arilo, C=O y CN-alquilo;
B es O o S; X se selecciona del grupo que consiste en N, CH, C-alquilo, C-arilo, CC(=O)R', CC(=S)R', CS(=O)R', CS(=O)2Rm CC(=O)O-R', CC(=O)S-R', CC(=S)O-R', CC(=S)S-R', CC(=O)NR'R", CC(=S)NR'R", siendo cada uno de R’ y R’’ independientemente H, arilo o alquilo y siendo R’’’ independientemente arilo o alquilo; Y se selecciona del grupo que consiste en CH, C-alquilo, C-arilo, N y N+O-.
Figure imgf000077_0001
donde R1 y R2 cada uno independientemente se seleccionan del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, CF3, CF2-R', NO, NO2, OR', SR', CN, C(=O)R', C(=S)R', OC(=O)R"', SC(=O)R"', OC(=S)R"', SC(=S)R"', S(=O)R', S(=O)2R''', S(=O)2OR', PO3R'R", S(=O)2NR'R", C(=O)O-R', C(=O)S-R', C(=S)O-R', C(=S)S-R', C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'R", NR'C(=O)R", NR'C(=S)R", NR'C(=O)OR", NR'C(=S)OR", NR'C(=O)SR", NR'C(=S)SR", OC(=O)NR'R", SC(=O)NR'R", OC(=S)NR'R", SC(=S)NR'R", NR'C(=O)NR"R", NR'C(=s )n R"R" con cada R’ y cada R’’ siendo independientemente H, arilo o alquilo, y siendo R’’’ independientemente arilo o alquilo; A se selecciona del grupo que consiste en N, C-alquilo, C-arilo y N+O-; B es N; X se selecciona del grupo que consiste en N, CH, C-alquilo, C-arilo, CC(=O)R', CC(=S)R', CS(=O)R', CS(=O)2Rm, CC(=O)O-R', CC(=O)S-R', CC(=S)O-R', CC(=S)S-R', CC(=O)NR'R", CC(=S)NR'R", R’ y R’’ siendo cada uno independientemente H, arilo o alquilo y siendo R’’’ independientemente arilo o alquilo; Y se selecciona del grupo que consiste en CH, C-alquilo, C-arilo, N y N+O-;
donde el activador está opcionalmente unido a un polietilenglicol, una proteína, un péptido, un carbohidrato, un polímero, una fracción colorante, una fracción fluorescente o una sonda de formación de imágenes.
2. Un kit de acuerdo con la reivindicación 1, donde XD es (O-C(O))p-(LD)n-(DD), donde p = 0 o 1, y n = 0 o 1.
3. Un kit de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde el dienófilo satisface la fórmula (1b):
Figure imgf000077_0002
donde cada Ra denota independientemente H, o, como máximo en cuatro casos, un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en alquilo, arilo, OR', SR', S(=O)R"', S(=O)2R"', S(=O)2NR'R", SiR"', Si-O-R'", OC(=O)R"', SC(=O)R"', OC(=S)R"', SC(=S)R"', F, Cl, Br, I, N3 , SO2H, SO3H, SO4H, PO3H, PO4H, NO, NO2, CN, OCN, SCN, NCO, NCS, CF3 , CF2-R', NR'R", C(=O)R', C(=S)R', C(=O)O-R', C(=S)O-R', C(=O)S-R', C(=S)S-R', C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'C(=O)-R''', NR'C(=S)-R'", NR'C(=O)O-R''', NR'C(=S)O-R''', NR'C(=O)S-R"', NR'C(=S)S-R"', OC(=O)NR'-R"', SC(=O)NR'-R"', OC(=S)NR'-Rm, SC(=S)NR'-R"', NR'C(=O)NR"-R", NR'C(=S)NR"-R", CR'NR", siendo cada R’ y cada R’’ independientemente H, arilo o alquilo y siendo R’’’ independientemente arilo o alquilo;
cada Rd como se indicó anteriormente, se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, OR', SR', S(=O)R"', S(=O)2R''', Si-R"', Si-O-Rm, OC(=O)R"', SC(=O)R"', OC(=S)R"', SC(=S)R"', F, Cl, Br, I, N3 , SO2H, SO3H, PO3H, NO, NO2, CN, CF3, CF2-R', C(=O)R', C(=S)R', C(=O)O-R', C(=S)O-R', C(=O)S-R', C(=S)S-R', C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'C(=O)-R''', NR'C(=S)-R'", NR'C(=O)O-R''', NR'C(=S)O-Rm, NR'C(=O)S-R"', NR'C(=S)S-R"', NR'C(=O)NR"-R", NR'C(=S)NR"-R", CR'NR", siendo cada R’ y cada R’’ independientemente H, arilo o alquilo y siendo R’’’ independientemente arilo o alquilo; donde dos fracciones Rad juntas pueden formar un anillo; donde, además, están opcionalmente presentes como máximo dos enlaces exocíclicos fijados en el mismo plano; con opcionalmente un Ra d comprendido en una fracción enlazadora, opcionalmente a través de un espaciador SP, a un agente de direccionamiento TT o una fracción de enmascaramiento MM, y donde T y G denotan cada uno independientemente H, o un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en alquilo, F, Cl, Br e I, y XD es como se define para la fórmula (1a) en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
4. Un kit de acuerdo con la reivindicación 1, donde el dienófilo es un compuesto seleccionado de las siguientes estructuras:
estructuras:
Figure imgf000078_0001
= resto de TT o SP-TT o MM o SP-MM unido
= resto de DD, Ld-Dd, que comprende opcionalmente TT o SP-TT o MM o SP-MM unido
Figure imgf000078_0002
Figure imgf000079_0001
- - - = resto de TT o SP-TT o MM o SP-MM unido
= resto de DD, Ld-Dd, que comprende opcionalmente TT o SP-TT o MM o SP-MM unido
Figure imgf000079_0002
Figure imgf000080_0001
.....= resto de TT o SP-TT o MM o SP-MM unido
= resto de DD, Ld-Dd, que comprende opcionalmente TT o SP-TT o MM o SP-MM unido,
donde TT denota un agente de direccionamiento, SP denota un espaciador o espaciadores, y MM denota una fracción de enmascaramiento.
5. Un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el dieno satisface la fórmula (7)
N X ^ , N
N y N
r 2
(7),
siendo una tetrazina sustituida en para con R1 y R2, donde R1 y R2 cada uno independientemente denota un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en H, alquilo, NO2 , F, Cl, CF3, CN, Co Or , CONHR, CONR2 , COR, SO2R, SO2OR, SO2NR2 , PO3R2, NO, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2,6-pirimidilo, 3,5-pirimidilo, 2,4-pirimidilo, 2,4-imidazilo, 2,5-imidazilo y fenilo, opcionalmente sustituido con uno o más grupos aceptores de electrones seleccionados del grupo que consiste en NO2 , F, Cl, CF3, CN, COOR, CONHR, CONR, COR, SO2R, SO2OR, SO2NR2 , PO3R2, NO, y Ar, donde R es H o alquilo C1-C6 y Ar representa fenilo, piridilo o naftilo.
6. Un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el dieno satisface cualquiera de las siguientes fórmulas (8a) u (8b):
Figure imgf000080_0002
donde R1 y cada R2 cada uno independientemente se seleccionan del grupo que consiste en H, alquilo, arilo, CF3 , CF2-R', NO2 , OR', SR', C(=O)R', C(=S)R', OC(=O)R"', SC(=O)R"', OC(=S)R"', SC(=S)R"', S(=O)R', S(=O)2Rm, S(=O)2NR'R", C(=O)O-R', C(=O)S-R', C(=S)O-R', C(=S)S-R', C(=O)NR'R", C(=S)NR'R", NR'R", NR'C(=O)R", NR'C(=S)R", NR'C(=O)OR", NR'C(=S)OR", NR'C(=O)SR", NR'C(=S)SR", OC(=O)NR'R", SC(=O)NR'R", OC(=S)NR'R", SC(=S)NR'R", NR'C(=O)NR"R", y
NR'C(=S)NR"R", siendo cada R' y cada R'' independientemente H, arilo o alquilo, y siendo R''' independientemente arilo o alquilo.
7. Un kit de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el dieno se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000081_0001
8. Un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde uno o más agentes de direccionamiento TT se une al fármaco DD, el enlazador LD, o la fracción desencadenadora TR, opcionalmente a través de un espaciador o espaciadores SP, donde TT es preferiblemente un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína, un péptido o un compuesto orgánico.
9. Un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde una o más fracciones de enmascaramiento MM, preferiblemente un péptido o un polietilenglicol, se une al fármaco DD, el enlazador LD, o la fracción desencadenadora TR, opcionalmente a través de un espaciador o espaciadores SP.
10. Un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el fármaco es una construcción de anticuerpo que se acopla a células T.
11. Un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el profármaco es un conjugado anticuerpo-toxina o anticuerpo-fármaco.
12. Un profármaco que satisface la fórmula (1a), como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
13. Un método para modificar un compuesto farmacológico en un profármaco que puede desencadenarse mediante una reacción bioortogonal abiótica, que comprende proporcionar un fármaco y enlazar químicamente el fármaco a una fracción dienófila, para formar un compuesto de fórmula (1a) como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 8 a 11.
14. Un compuesto que satisface la siguiente fórmula (1a):
Figure imgf000081_0002
( la )
como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo dicho compuesto un enlace a un fármaco, para uso en terapia con profármacos en un animal o un ser humano.
15. Un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde el compuesto de acuerdo con la fórmula (1a) satisface una cualquiera de las fórmulas (9a) y (9b)
Figure imgf000082_0001
fórm ula (9a); fórm ula (9b);
donde la fracción YM puede ser un agente de direccionamiento TT o una fracción de enmascaramiento MM; donde SP es un espaciador; TR es el desencadenador, LD es un enlazador, y DD es un fármaco;
donde cuando YM es un agente de direccionamiento TT, entonces
en la
fórmula (9a): k = 1; m, r > 1; t, n > 0; y
en la
fórmula (9b): k = 1; m, n, r > 1; t > 0;
en donde cuando YM es una fracción de enmascaramiento MM, entonces en las fórmulas (9a) y (9b): r = 1; m > 1; k, n, t > 0;
donde opcionalmente DD comprende además TT y/o MM, opcionalmente a través de SP
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