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ES2916396A1 - Composicion farmaceutica para el tratamiento de la enfermedad de charcot-marie-tooth - Google Patents

Composicion farmaceutica para el tratamiento de la enfermedad de charcot-marie-tooth Download PDF

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ES2916396A1
ES2916396A1 ES202031320A ES202031320A ES2916396A1 ES 2916396 A1 ES2916396 A1 ES 2916396A1 ES 202031320 A ES202031320 A ES 202031320A ES 202031320 A ES202031320 A ES 202031320A ES 2916396 A1 ES2916396 A1 ES 2916396A1
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ES
Spain
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pharmaceutical composition
mice
mitoq
charcot
marie
Prior art date
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Withdrawn
Application number
ES202031320A
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English (en)
Inventor
Marcos José Manuel Cuezva
Tapioles Cristina Nuevo
Martínez Francesc Palau
Gil-Delgado Jorgina Satrústegui
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universidad Autonoma de Madrid
Hospital Sant Joan de Deu
Centro de Investigacion Biomedica en Red CIBER
Original Assignee
Universidad Autonoma de Madrid
Hospital Sant Joan de Deu
Centro de Investigacion Biomedica en Red CIBER
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Priority to ES202031320A priority Critical patent/ES2916396A1/es
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Abstract

Composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth. La presente invención divulga una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth que comprende MitoQ, siendo preferentemente la causa de dicha enfermedad alteraciones en GDAP1 y/o MFN2 y los síntomas de la enfermedad deficiencias motoras, pérdida sensorial, deficiencias ópticas, parálisis diafragmática y/o parálisis de las cuerdas vocales.

Description

DESCRIPCIÓN
COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA PARA EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD
DE CHARCOT-MARIE-TOOTH
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la biomedicina, más concretamente al tratamiento de enfermedades mitocondriales.
Antecedentes
La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) es una neuropatía para la que en la actualidad no hay tratamientos efectivos. Los pacientes con CMT presentan una degeneración de los nervios periféricos, lo que lleva a la debilidad muscular y a la pérdida de la propiocepción. La pérdida de proteínas de fosforilación oxidativa mitocondrial y de enzimas de la respuesta antioxidante acompañan a la degeneración de los nervios en las biopsias de piel de los pacientes con CMT.
La CMT es una enfermedad rara y la afección hereditaria más común del sistema nervioso periférico, con una prevalencia general estimada en la población de 10 a 28/100.000 habitantes en Europa. La CMT es una enfermedad genética heterogénea1 que suele aparecer en las dos primeras décadas de vida. Los pacientes presentan una degeneración de los nervios periféricos, lo que lleva a la debilidad muscular y a la pérdida de la propiocepción y de la sensación de pinchazo y se caracteriza por la debilidad muscular distal y la atrofia. A pesar de los esfuerzos por caracterizar la enfermedad, en la actualidad la CMT carece de tratamientos eficaces o de terapias.
Se han vinculado más de 90 genes a la enfermedad de CMT y a las neuropatías relacionadas. Uno de ellos codifica la proteína asociada a la diferenciación inducida por gangliósidos (GDAP1). Las mutaciones en el gen GDAP1 causan CMT axonal con herencia tanto recesiva (AR-CMT2K) como dominante (CMT2K), y desmielinización recesiva CMT4A. La GDAP1 es una proteína de la membrana mitocondrial externa (MOM) que también se encuentra tanto en las membranas mitocondriales asociadas (MAM) como en los sitios de contacto de la membrana mitocondrial-lisosoma. Las mutaciones en la GDAP1 se han asociado con cambios anormales en la morfología y la dinámica de las mitocondrias y con una disminución de la entrada de Ca2+ a través de la entrada de calcio operada por almacenamiento (SOCE), lo que lleva a un fallo en la estimulación de la respiración mitocondrial y a la inhibición de la producción de ATP mitocondrial. La falta de GDAP1 también induce una respuesta inflamatoria en la médula espinal y el nervio ciático. Además, la GDAP1 participa en la defensa contra el estrés oxidativo. En este contexto, se ha demostrado que los miembros de la familia de la GDAP1 responden y protegen contra el estrés asociado al aumento de los niveles de glutatión oxidado. Asimismo, las mutaciones de GDAP1 conducen a una actividad defectuosa del complejo mitocondrial I y al estrés oxidativo. En consonancia con estas observaciones, se ha informado de la pérdida de proteínas mitocondriales y antioxidantes en biopsias de piel de pacientes con CMT2 y en los nervios periféricos del ratón Gdapl knock-out (Gdapl-null). La pérdida de proteínas de fosforilación oxidativa mitocondrial y de enzimas de la respuesta antioxidante acompañan a la degeneración de los nervios en las biopsias de piel de los pacientes con CMT. lo que sugiere además que la función mitocondrial y el estrés oxidativo constituyen objetivos potenciales para tratar la enfermedad del CMT.
El artículo científico MitoQ protects dopaminergic neurons in a 6-OHDA induced PD model by enhancing Mfn2-dependent mitochondrial fusion via activation of PGC-1a divulga el tratamiento con el compuesto MitoQ en Parkinson, otra neuropatía, sin embargo, no hay experimentos en la enfermedad CMT.
La patente EP2624832B1 divulga uso médico de inhibidores específicos de la enzima HDAC6 para el tratamiento de CMT. Estos inhibidores tienen una estructura química diferente al MitoQ y además pueden presentar efectos secundarios.
El artículo científico MFN2 agonists reverse mitochondrial defects in preclinical models of Charcot-Marie-Tooth disease type 2A divulga el uso de pequeños péptidos para el tratamiento de un subtipo de CMT causada por alteraciones en MFN2, al igual que en el caso de la patente anterior, el uso de estos compuestos puede tener efectos secundarios además de ser un tratamiento más caro que el propuesto por la presente invención.
En la presente invención divulga una composición farmacéutica para el tratamiento de los síntomas de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth.
Descripción
En la presente memoria el término “tratamiento” ha de entenderse como uso preventivo, es decir, para el evitar la progresión de los síntomas de la enfermedad, o terapéutico, para revertir los síntomas.
En la presente memoria la expresión “alteraciones genéticas” comprende mutaciones (sustituciones, deleciones, duplicaciones o inversiones) de al menos una base nucleotídica de la secuencia de un gen que dé como resultado un fenotipo característico de la enfermedad Charcot-Marie-Tooth. Las alteraciones genéticas pueden ser somáticas o espontáneas y hereditarias.
En la presente memoria los términos “Gdapl-null’, “Gdap1-/- “ratones deficientes en GdapT’, “Gdapl knockout’ y “Gdapl kd’ son sinónimos y se emplean de forma intercambiable.
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende MitoQ para su uso en el tratamiento de los síntomas de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth de un paciente.
La fórmula química del MitoQ es Metansulfonato de [10-(4,5-Dimetoxi-2-metil-3,6-dioxo-1,4-ciclohexadien-1-il)decilo](trifenil)fosfonio. Adicionalmente, MitoQ también engloba a una sal, solvato, y/o éster farmacéuticamente aceptable del mismo.
El MitoQ es un antioxidante mitocondrial dirigido que consiste en una fracción de quinona unida a un trifenilfosfonio por una cadena de alquilo de 10 carbonos. MitoQ no tiene efectos tóxicos en los tratamientos administrados en el agua potable y se comercializa como suplemento dietético para los seres humanos3.
En una realización particular, la causa de la enfermedad se debe a alteraciones genéticas en GDAP1 y/o MFN2.
La secuencia que codifica para GDAP1 y MFN2 humana, así como sus respectivos tránscritos se pueden encontrar en la base de datos de Ensembl (Human GRCh38.p13) GDAP1: ENSG00000104381 y MFN2: ENSG00000116688. Esta es la secuencia de un individuo particular en la población de seres humanos. Los seres humanos varían entre sí en sus secuencias génicas. Estas variaciones son muy mínimas, produciéndose algunas veces a una frecuencia de aproximadamente 1 a 10 nucleótidos por gen. Existen formas diferentes de cualquier gen particular dentro de la población humana. Estas formas diferentes se denominan variantes alélicas. Las variantes alélicas a menudo no cambian la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada; tales variantes se denominan sinónimas. Incluso si cambian el aminoácido codificado (no sinónimas), la función de la proteína no se ve afectada normalmente. Tales cambios son evolutiva o funcionalmente neutros. Cuando se hace referencia a GDAP1 humana o MFN2 humana en la presente solicitud, se pretende que todas las variantes alélicas se abarquen por el término.
Para los fines de determinar una alteración genética en cualquiera de estos genes, pueden compararse las secuencias de GDAP1 y/o MFN2 determinadas en una muestra de prueba de un primer ser humano con una secuencia determinada obtenida de una muestra de un segundo humano que sirva como control, este segundo ser humano puede ser un familiar. Una diferencia en la secuencia en los dos tejidos indica una mutación. Alternativamente, puede compararse la secuencia determinada en un gen de GDAP1 y/o MFN2 en una muestra de prueba con la secuencia indicada en el párrafo anterior en Ensembl. Puede identificarse una diferencia entre la secuencia de muestra de prueba y la secuencia en Ensembl como una mutación. Un experto en la materia sabría diferenciar aquellas alteraciones genéticas responsables de la enfermedad CMT de otras alteraciones silenciosas o inocuas. Las muestras corporales adecuadas para las pruebas incluyen sangre, suero, plasma, esputo, orina, heces, saliva y líquido cefalorraquídeo.
En una realización preferida la neuropatía de Charcot-Marie-Tooth (CMT) está causada por mutaciones en la secuencia del gen GDAP1.
En otra realización preferida adicional, los subtipos de la enfermedad CMT causadas por mutaciones en GDAP1 son: formas recesivas axonales (AR-CMT2K), dominantes axonales (CMT2K) y recesivas desmielinizantes (CMT4A).
En otra realización preferida la neuropatía de Charcot-Marie-Tooth (CMT) está causada por mutaciones en la secuencia del gen MFN2 es la forma recesiva axonal AR-CMT2A2
En otra realización preferida adicional, el subtipo de la enfermedad CMT causada por mutaciones en MFN2 son:
En una realización preferida la neuropatía de Charcot-Marie-Tooth 2 (CMT 2) está causada por mutaciones en el gen MFN2. Las mutaciones en MFN2 causan la forma AR-CMT2A2.
Otros subtipos de CMT causados por alteraciones genéticas en la secuencia de GDAP1 y/o MFN2 también se encuentran comprendidos en el ámbito de la presente invención.
En una realización particular la CMT puede ser al menos uno de los subtipos, AR-CMT2K, CMT2K y CMT4A y el modelo preclínico el ratón GDAPI-null y/o células derivadas del mismo.
Los síntomas de la enfermedad pueden ser la manifestación física de las alteraciones en las proteínas involucradas en el metabolismo energético y proteínas redox (reducción -oxidación) características de la enfermedad CMT.
En una realización particular los síntomas de la enfermedad CMT son deficiencias motoras, pérdida sensorial, deficiencias ópticas, parálisis diafragmática y/o parálisis de las cuerdas vocales
En otra realización particular las deficiencias motoras comprenden deficiencias motoras de las extremidades inferiores, pérdida de masa corporal en las piernas y los pies, arcos de los pies elevados, dedos de los pies doblados (dedos del pie en martillo) y/o dificultad para flexionar el talón (pie caído).
En otra realización particular la pérdida sensorial comprende una menor sensibilidad o pérdida de la sensibilidad en las piernas y los pies. Estos síntomas están ligados a las deficiencias motoras de las extremidades inferiores.
En otra realización particular las deficiencias ópticas pueden ser atrofia óptica, dando lugar a un deterioro visual.
La composición farmacéutica de la invención puede comprender adicionalmente, al menos uno o más de los siguientes:
- un excipiente farmacéuticamente aceptable, y
- un aditivo farmacéuticamente aceptable.
La composición farmacéutica de la invención se puede emplear como tratamiento subsiguiente o simultáneo con otras terapias.
La composición farmacéutica de la invención se puede administrar a un individuo por vía tópica, intranasal, rectal, intraperitoneal, oral, subcutánea o intramuscular, preferentemente por vía oral.
La composición farmacéutica indicados para la administración por vía oral puede presentarse en unidades separadas, como cápsulas, píldoras o comprimidos, cada uno de ellos con una cantidad predeterminada de MitoQ; en granulados o en gránulos; en disolución, como una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite o en polvo; El MitoQ puede también administrarse vía intravenosa, como un preparado o un puré.
La composición farmacéutica puede tener cualquier formulación seleccionada del grupo que consiste en un comprimido, una pastilla, un polvo, un granulado, una cápsula, una suspensión, una solución, una emulsión, un jarabe, una solución acuosa, una solución no acuosa, una suspensión, una emulsión, un secante por congelación, un supositorio y una inyección.
Cuando se emplean de forma oral, se pueden elaborar, por ejemplo, comprimidos, pastillas, píldoras, suspensiones oleosas o acuosas, gránulos en polvo dispersos, emulsiones, pastillas duras o blandas, siropes o elixires.
Las composiciones farmacéuticas se pueden fabrican por un procedimiento conocido, por ejemplo, un procedimiento general de mezclado, granulación, disolución o liofilización. Por ejemplo, la composición farmacéutica para su administración oral se puede preparar mezclando el fármaco con un vehículo sólido, granulando la mezcla, añadiendo un aditivo apropiado si fuera necesario, y, a continuación, formulando la mezcla o el granulado en forma de un comprimido o una gragea.
Un comprimido se puede elaborar por compresión o por moldeado, o de forma opcional, con uno o más excipientes y/o aditivos adicionales. Los comprimidos compactos pueden elaborarse por compresión, en un dispositivo adecuado del MitoQ en libre flotación como los sobres o gránulos, opcionalmente mezclados con un ligante, un lubricante, un diluyente inerte, un profiláctico, una superficie activa o un agente dispersante. Los comprimidos que han sido transformados, moldeándolos en un dispositivo adecuado, en una mezcla de MitoQ en polvo humedecidos con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos pueden ir opcionalmente revestidos, marcados o elaborados a fin de proporcionar una liberación lenta o controlada del MitoQ.
Las composiciones farmacéuticas administradas por vía oral se pueden elaborar por cualquiera de las técnicas conocidas en cuanto a la preparación de composiciones farmacéuticas y tales composiciones pueden contener uno o más excipientes y/o aditivos que contienen agentes edulcorantes, de condimentación, colorantes y conservantes, a fin de conseguir un preparado agradable al paladar. Serán aptos los comprimidos que contienen el MitoQ en mezclas con excipientes farmacéuticos permitidos no tóxicos y que son admitidos en la elaboración de comprimidos.
El excipiente farmacéuticamente aceptable puede incluir, en particular, un relleno, por ejemplo, azúcar, tal como lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol, un agente de celulosa y/o fosfato de calcio, tal como fosfato tricálcico o hidrogenofosfato de calcio, y un agente de acoplamiento, por ejemplo, pastas de almidón que usan almidones de maíz, trigo, arroz o patata, gelatina, tragacanto, metilcelulosa y/o polivinilpirrolidona, y si fuera necesario, un agente disgregante, por ejemplo, los almidones mencionados anteriormente, carboximetilalmidón, polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo, por ejemplo, alginato de sodio.
Los aditivos farmacéuticamente aceptables incluyen, en particular, un agente de control de flujo y un lubricante, por ejemplo, ácido silícico, talco, ácido esteárico o su sal, por ejemplo, estearato de magnesio, o calcio y/o polietilenglicol. Se proporciona un recubrimiento gastrorresistente apropiado a un núcleo de gragea, y, en particular, una solución de azúcar concentrada que incluye goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, polietilenglicol y/o dióxido de titanio en un disolvente orgánico apropiado o una mezcla de disolventes, o se usa una solución agitada, o, para formar el recubrimiento gastrorresistente, se puede usar una solución con agente de celulosa apropiado, tal como ftalato de acetilcelulosa o ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa.
Otros excipientes farmacéuticamente aceptables para administración por vía oral incluyen agentes encapsulantes y cápsulas rellenadas en seco fabricadas de gelatina, y cápsulas selladas blandas fabricadas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. La cápsula rellenada en seco puede incluir un ingrediente activo en forma particulada, por ejemplo, un relleno, tal como lactosa, un agente de acoplamiento, tal como almidones, y/o un modificador, como talco o estearato de magnesio, y una mezcla con un estabilizante si fuera apropiado. En la cápsula blanda, el MitoQ se disuelve o suspende en un líquido apropiado, por ejemplo, aceite fijo, aceite de vaselina o polietilenglicol líquido, y se puede añadir un estabilizante en el mismo. Los comprimidos pueden estar con o sin revestir mediante técnicas conocidas que incluyen la microencapsulación para retrasar la desintegración y la absorción en el tracto gastrointestinal y de ese modo proporcionar una acción prolongada durante un período de tiempo mayor. Por ejemplo, se pueden emplear materiales retardantes como el monoestereato de glicerol o el diestearato de glicerol por si solos o con una cera.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden presentarse como suspensiones acuosas que contienen MitoQ en mezclas con excipientes y/o aditivos apropiados para la elaboración de las suspensiones acuosas. Por ejemplo, incorporan un agente en suspensión, como la carboximetilcelulosa de sodio, la metilcelulosa, metilcelulosa de hidroxipropilo, alginato sódico, el polivinilpirrolidona, la goma tragacanto, la goma arábiga y agentes dispersantes o humidificantes como la fosfatida natural (por ejemplo la lecitina), un producto de condensación de óxido de alquileno con un ácido graso (por ejemplo, el estearato de polioxietileno), un producto de condensación de óxido de etileno con un alcohol alifático de cadena larga, (por ejemplo, el heptadecaetileneoxicetanol), un producto de condensación del óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un anhídrido de hexitol (por ejemplo, el monooleato sorbitán polioxietileno). La suspensión acuosa puede contener también uno o más conservantes como el etil o el n-propil p-hidroxi-benzoato, uno o más agentes colorantes, uno o mas agentes saborizantes y uno o más agentes edulcorantes, como la sacarosa o la sacarina.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden presentarse como polvos o gránulos dispersables permitidos en la preparación de una suspensión acuosa mediante la adicción de agua, proporcionan el MitoQ en una mezcla con un excipiente y/o aditivo dispersante o humidificante, un agente de suspensión o uno o más conservantes.
Los excipientes y/o aditivos dispersantes o humidificantes permitidos así como los agentes en suspensión son por ejemplo los expuestos anteriormente. También pueden encontrarse excipientes adicionales, por ejemplo, edulcorantes, saborizantes o colorantes.
La cantidad de MitoQ que puede mezclarse con los excipientes y/o aditivos para generar una forma de dosificación sencilla variará en función del agente empleado y la forma específica de administración. Por ejemplo, una composición farmacéutica con un tiempo de liberación concebido para la administración vía oral en seres humanos puede contener aproximadamente de 1 a 1000 mg de MitoQ intensificada con una correcta y adecuada cantidad de sustancia portadora que puede oscilar entre un 1 y 95% de las composiciones totales (peso/peso). Se puede preparar la composición farmacéutica para proporcionar fácilmente cantidades medibles para su administración. Por ejemplo, una solución acuosa concebida para la infusión (inyección) intravenosa puede contener desde aproximadamente 3 hasta 500 pg (picogramos) de MitoQ por mililitro de solución a fin de que la inyección de un volumen adecuado a una velocidad de 30 mL/hr pueda producirse.
Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar en envases de dosis unitarias o múltiples, por ejemplo, ampollas precintadas y los viales, y pueden ser almacenarse en condiciones de liofilización que precisen únicamente la adición de un portador líquido estéril, por ejemplo, el agua para la inyección, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones por inyección improvisadas, son elaboradas a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos de la misma clase que los que se citaron anteriormente. Los preparados preferentes de dosis unitarias son aquellos que contienen una dosis diaria o una subdosis diaria unitaria, o una fracción adecuada de este tipo, de MitoQ.
El término “paciente” se refiere a cualquier mamífero que es el receptor del diagnóstico, preferiblemente un ser humano. El paciente puede ser una persona que se presenta para una evaluación de rutina de la enfermedad o puede presentar síntomas sugestivos de CMT. El paciente también puede ser un individuo considerado de alto riesgo de esta enfermedad, debido a los antecedentes familiares con esta enfermedad hereditaria.
El diagnóstico se puede realizar por cualquier método conocido del estado de la técnica que se emplee de forma corriente en la práctica médica por un facultativo o un especialista en esta enfermedad.
La composición farmacéutica puede administrarse al paciente antes de la aparición de los síntomas de la CMT, lográndose así la prevención o el retraso en la aparición de los síntomas característicos de esta neuropatía.
En una realización la composición farmacéutica se puede administrar durante toda la vida del paciente contando desde la primera administración lográndose así la prevención o el retraso en la aparición de los síntomas característicos de esta neuropatía.
En otra realización particular, la composición farmacéutica se puede administrar con un intervalo de administración variable, a modo de ejemplo de 1 a 7 veces por semana, preferentemente, de 2 a 6 veces por semana, más preferentemente de 3 a 5 veces por semana.
La dosis eficaz del MitoQ y de la composición farmacéutica que lo comprenda depende de la naturaleza de las condiciones la forma de ejecución y la formulación farmacéutica, y estará definida por la experiencia de un médico mediante la aplicación de las investigaciones habituales para un aumento de la dosis. Se puede considerar que la dosis eficaz se encuentra desde 0,0001 hasta aproximadamente 1000 mg/kg peso corporal por día, o desde 0,01 hasta aproximadamente 500 mg/kg peso corporal por día, o desde 0,01 hasta 100 mg/kg peso corporal por día, o desde 0,05 hasta aproximadamente 10 mg/ kg de peso corporal por día. Por ejemplo, la dosis diaria que se postula para una persona adulta de aproximadamente 70 kg de peso corporal estará en el rango de 1 mg a 1000 mg, o entre 5 mg y 500 mg, y puede hacerse mediante dosis individuales o múltiples, diarias o no.
En una realización particular, se puede usar la composición farmacéutica para la indicación reivindicada administrando a un individuo una dosis de 0,1 mg/kg/día a 1000 mg/kg/día, específicamente una dosis de 1 mg/kg/día a 500 mg/kg/día, o una dosis de 3 mg/kg/día a 100 mg/kg/día.
En la dosis y el intervalo de administración de la composición farmacéutica pueden variar dependiendo de diversos factores, por ejemplo, condiciones individuales, tales como disponibilidad y duración del fármaco un procedimiento de administración, sexo, edad y peso de los individuos, gravedad de las enfermedades y similares. La vía de administración específica y la dosis se pueden seleccionar por un experto en la materia según condiciones tales como la edad, el peso, el grado de actividad de la enfermedad y el estado físico. Las condiciones particulares de la dosis e intervalo de administración pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la materia.
Por lo tanto, la administración de MitoQ a partir de una etapa temprana del diagnóstico a los pacientes con CMT podría contribuirá a prevenir la pérdida de las proteínas mitocondriales y antioxidantes observadas en los nervios periféricos de los pacientes con CMT levemente afectados, resultando en un menor deterioro de las funciones motoras.
Cabe destacar que el tratamiento con MitoQ previene el deterioro molecular y el daño oxidativo observado en los nervios ciáticos de los ratones Gdapl-null así como el desarrollo de síntomas de CMT en dichos ratones, lo que apoya firmemente el daño oxidativo como un factor importante que contribuye a la etiología de la enfermedad.
La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos que describen de forma detallada los objetos de la invención. Estos ejemplos no deben ser considerados como limitativos del alcance de la invención sino como ilustrativos de la misma.
Breve descripción de las figuras
Figura 1 El MitoQ previene el desarro llo del fenotipo asociado a la enfermedad CMT en los ratones Gdapl-/-.
A. Esquema gráfico que muestra el tratamiento de los ratones. Después del destete (1 mes) se administró MitoQ (0,14 mg/ml) en el agua potable de los ratones. Las pruebas de función motora se realizaron a los 7 y 10 meses de edad.
B-D Ratones de tipo salvaje (WT, n=9, barra de línea negra y puntos), ratones Gdap1-/-sin tratar (KO, n=10, barra de línea negra y cuadrados), y ratones Gdap1-/- tratados con MitoQ (MITOQ, n=9, barra de línea gris y triángulos).
B. Imágenes representativas de ratones a los 10 meses de edad. Los histogramas muestran la cuantificación del cambio en el peso de los ratones durante los tratamientos a los 7 meses de edad (panel superior) y 10 meses de edad (panel inferior)
C. Imágenes representativas de 3 ratones de 10 meses de edad suspendidos por la cola. Los ratones de tipo salvaje (WT) y los ratones Gdap1-/- tratados con MitoQ muestran la respuesta característica de intentar escapar extendiendo las extremidades posteriores del tronco de su cuerpo. Por el contrario, las extremidades posteriores de los ratones Gdap1-/- no tratados se mantienen pegadas al tronco en una postura distónica anormal. Los histogramas muestran la cuantificación del ángulo entre la extremidad trasera derecha y el eje del cuerpo.
D. Imagen representativa de la prueba de colgado con dos extremidades. Los histogramas muestran la cuantificación del tiempo más largo durante el cual los ratones mostraron tensión sostenida en las extremidades.
Las barras indican la media ± SEM de la n indicada en la parte superior. **p < 0.01 cuando se compara con Ratones WT y ##p < 0.01 cuando se comparan con los ratones Gdapl-' por la prueba t de Student.
Figura 2 El M itoQ previenen las defic iencias m otoras en los ratones Gdapl-/-.
A-D Ratones de tipo salvaje (WT, n=9, barra de línea negra y puntos), ratones Gdapl-' sin tratar (KO, n=10, barra de línea negra y cuadrados), y ratones Gdapl- 'tratados con MitoQ (MITOQ, n=9, barra de línea gris y triángulos).
A. Imagen representativa de la prueba de colgado de dos extremidades. Los histogramas muestran la cuantificación del máximo tiempo durante el cual los ratones mostraron tensión sostenida en las extremidades, (panel izquierdo) y el impulso de sujeción mínimo en la prueba de colgado de dos extremidades a los 10 meses de edad (panel derecho).
B. Imagen representativa de la prueba de fuerza de agarre. Los histogramas muestran la cuantificación de la fuerza de los ratones (g) sobre el peso corporal (g).
C. Imagen representativa de la prueba de colgado de cuatro extremidades. Los histogramas muestran la cuantificación del máximo tiempo durante el cual los ratones mostraron tensión sostenida en las extremidades. (panel izquierdo) y el impulso de sujeción mínimo en la prueba de colgado de extremidades a los 10 meses de edad (panel derecho).
D. Imagen representativa de la prueba del rotarod. El gráfico muestra la cuantificación de la latencia de los ratones al caer (en segundos) a una velocidad de 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 y 32 r.p.m.
Las barras indican la media ± SEM de la n indicada en la parte superior. **p < 0.01 cuando se compara con Ratones WT y ##p < 0.01 cuando se comparan con los ratones Gdapl-' por la prueba t de Student.
Figura 3. El MitoQ previene las defic iencias m etabólicas y redox observadas en los nervios c iá ticos de los ratones GDAP1--.
Los extractos del nervio ciático obtenidos a partir de ratones salvajes (WT, caja negra, izquierda) (n=9), ratones Gdapl-' no tratados (KO, caja negra, centro) (n=10) y MitoQ (MITOQ, caja gris, derecha) (n=9) se depositaron en forma de gotas sobre las láminas y procesados. Los arrays se desarrollaron con los anticuerpos primarios indicados y la cantidad de proteína de los extractos expresada en unidades arbitrarias/ng de proteína utilizando como estándar el diagrama lineal de la línea celular C2C12. Los gráficos de cajas representan los percentiles 25 a 75 con el valor mediano en la línea media, y con todos los datos representados desde los valores mínimos hasta los máximos del nivel de expresión de las proteínas, los niveles de expresión se muestran como unidades arbitrarias, (u.a.). Se presentan las enzimas del metabolismo de la glucosa (ENO1, LDHA, PDH), el ciclo del TCA (IDH1, MDH2), oxidación de los ácidos grasos (HADHA), OXPHOS (Fosforilación Oxidativa) (CORE2, p-F1-ATPase), dinámica mitocondrial (MFN2, OPA1), homeostasis redox (G6PDH, GR, SOD1, Catalasa, SOD2) y estrés oxidativo (MDA, 4HNE). * y **, indica una p < 0,05 y p < 0,001 cuando comparados con los ratones WT, respectivamente; # y ##, p < 0,05 y p < 0,001 cuando se comparan con ratones Gdap1-/- , respectivamente.
Figura 4. El nervio ciá tico de los ratones GDAP1 -/- muestra un efecto marginal en el contenido de proteínas del m etabolism o.
Los extractos del nervio ciático derivados de ratones salvajes (WT, caja negra) (n=9), ratones Gdapl-/- no tratados (KO, caja roja) (n=10) y ratones Gdap1-/- tratados con MitoQ (MITOQ, caja amarilla) (n=9) se depositaron en forma de gotas sobre las láminas y procesados. Los arrays se desarrollaron con los anticuerpos primarios indicados y la cantidad de proteína de los extractos expresada en unidades arbitrarias/ng de proteína utilizando como estándar el diagrama lineal de la línea celular C2C12 (figura S3). Los gráficos de caja representan los percentiles 25 a 75 con el valor mediano en la línea media, y con todos los datos representados desde los valores mínimos hasta los máximos del nivel de expresión de las proteínas.
Se muestran proteínas mitocondriales adicionales de la fosforilación oxidativa (NADH9, COXIV), la dinámica mitocondrial (MFN1) y la estructura mitocondrial (HSP60). *p < 0.05 cuando se compara con el WT ratones; #p < 0,05 cuando se compara con los ratones Gdapl--.
Referencias
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Ejem plos de realización.
A continuación, se explican los materiales, métodos y protocolos concretos empleados en los 3 ejemplos de la invención. Salvo que se indique lo contrario, las condiciones y materiales empleadas en los ejemplos de realización serán las que figuren en la siguiente sección.
A. Materiales y Métodos
Líneas celulares. Las células se cultivaron en un incubador a 37°C con una atmósfera controlada con un 10% de CO2. Las células de carcinoma colorrectal humano HCT116 y C2C12 se cultivaron en el medio McCoy’s 5A complementado con un 10 % de suero bovino fetal (FBS). Para preservar las líneas celulares, se congelaron gradualmente alícuotas de 5 millones de células en un 1 ml del medio de cultivo con 10% de DMSO, dimetil sulfóxido (14 h a -20°C, 24 h a -70°C y luego se mantuvieron en nitrógeno líquido). El descongelamiento se realizó a 37°C diluyéndolos inmediatamente en el medio de cultivo.
Animales. Los ratones se alojaron en el Animalario con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad y temperaturas de 18-23 °C con 40-60% de humedad. Los ratones deficientes en Gdapl o Gdapl knockout (Gdapl--) fueron previamente generados y caracterizados y se emplean como modelos de estudio de la enfermedad CMT4. El MitoQ (0,14 mg/ml) se administró a los ratones en el agua potable.
Evaluación de la función m otora del ratón
Prueba de Rotarod. El rendimiento motor y el equilibrio se midieron usando un rotarod acelerante. Cada ratón fue sometido al mismo procedimiento durante 2 días. El primer día se utilizó para entrenar a los ratones en una sesión de 2 min, caminando a 4 revoluciones por minuto (r.p.m). Los ratones que se cayeron después de completar 2 min caminando en un plazo de 10 min se descartaron del experimento. Las sesiones de prueba se realizaron el segundo día. Durante la prueba, la velocidad del rotarod fue acelerándose de 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 a 32 r.p.m. Los ratones pasaron 1 min corriendo a cada velocidad. Se midió su latencia. Los ratones que se cayeron 6 veces en 60 segundos se descartaron del experimento.
Prueba de fuerza de agarre/resistencia. La prueba de fuerza de agarre se utilizó para medir la máxima fuerza que podría realizar un ratón con sus patas delanteras aprovechando la tendencia del animal a agarrarse a las superficies. Empleando cada vez un ratón, se dejó que se agarrara las barras metálicas y luego se le retiró suavemente hasta que el agarre se rompiera. El tirón se hacía a una velocidad constante y lo suficientemente lento para permitir que el ratón ejercer una resistencia contra él. La prueba se repitió 5 veces por ratón, con un mínimo de 1 minuto entre cada una de las 5 determinaciones por animal.
Prueba de colgado o suspensión: dos extremidades. La fuerza muscular de las extremidades delanteras se midió controlando la capacidad de los ratones de ejercer una tensión sostenida en las extremidades para oponerse a su peso. Los ratones se colocaron en una barra de metal de 2 mm de espesor a 35 cm de una superficie acolchada y se registró el tiempo hasta la caída. La prueba terminó después de que se lograra un tiempo de suspensión de 2 min o de otra manera después de tres sesiones. Se calculó el máximo tiempo de suspensión y el impulso de sujeción mínimo (masa corporal, gramos x tiempo de suspensión, suspensión)5.
Prueba de colgado o suspensión: cuatro extremidades. La fuerza muscular de las cuatro extremidades se midió controlando la capacidad de los ratones de ejercer una tensión sostenida en las extremidades para oponerse a su peso. Se colocaron ratones en una rejilla de alambre a 35 cm de una superficie acolchada y se registró el tiempo hasta la caída. La prueba terminó después de que se lograra un tiempo de suspensión de 2 minutos o, de lo contrario, después de tres sesiones. Se calculó el tiempo máximo de suspensión y el impulso de sujeción mínimo (masa corporal x tiempo de suspensión)5.
Extracción de proteína de los te jidos de los ratones. Para la extracción de proteínas, se homogeneizaron secciones de tejido mediante un homogeneizador de molino de perlas OMNI Bead Ruptor 24 (Fisher Scientific, 15515799), previamente suspendido la sección de tejido en el reactivo de extracción de proteínas de tejido T-PER (Cat. No.
78510, Thermo Scientific, Ins. Madrid, España,) en una proporción de 1:8 (peso/volumen), y se congelaron tres veces más en nitrógeno líquido. La concentración de proteínas se determinó con el reactivo Bradford (Cat. No. 5000001, Bio-Rad, Inc. Madrid, España) usando Albúmina de Suero Bovino (BSA) como estándar.
C u ltivos neuronales del ganglio de la raíz dorsal. Los ganglios de la raíz dorsal (DRG) se obtuvieron a partir de ratones recién nacidos (día postnatal 0-2) de tipo salvaje (WT) y Gdapl knockout (Gdapl-/-) según6. Los ganglios se digirieron en colagenasa (Worthington, EE.UU.) y tripsina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.), se disociaron por trituración y se aplicaron en DMEM-F12 que contenía 50 ng/mL de NGF (Tebu-Bio, Le-Perray-en-Yvelines, Francia), 10% de suero bovino fetal y 5 ng/mL de afidicolina (A.G. Scientific, San Diego, CA, EE.UU.). Las neuronas DRG fueron sembradas en polilisina y recubiertas de laminina (1 pg/mL) (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) y usado para la experimentación entre 2-4 DIV, (Días in vitro).
Impresión y procesam iento de los reverse phase protein arrays (RPPAs). Los extractos de proteínas de las biopsias de tejidos se diluyeron con T-PER (Tissue Protein Extraction Reagent) hasta una concentración final de proteínas de 2 pg/pl (p/v). Antes de la impresión, las muestras se diluyeron con PBS (Tampón fosfato salino) hasta una concentración final de proteínas de 0,5 pg/pl (p/v). También se prepararon extractos de proteínas diluidas en serie (0-1,5 pg/pl (p/v)) derivadas del mioblasto de ratón C2C12 y de las células de carcinoma colorrectal humano HCT116 para evaluar la calidad de la impresión y la respuesta lineal del reconocimiento de proteínas por los anticuerpos utilizados7. También se prepararon curvas estándar de BSA (0-2 pg/pl) e IgG (inmunoglobulina G) de ratón (1-30 ng/pl) como controles internos negativos y positivos, respectivamente.
Se añadió una gota de 1,5 nl aproximadamente de cada muestra en láminas de vidrio revestidas de nitrocelulosa (almohadilla ONCYTE® SuperNOVA 8 - Grace Bio-Labs, 705118). Cada muestra se analizó por triplicado o quintuplicado. Las gotas se añadieron utilizando una impresora de sistema pico iTWO-300P (M2-Automation, Inc.) equipada con un microdispensador impulsado por un piezoeléctrico (PDMD) de 30-150 pL a una humedad constante de la cámara (HR 52%) y temperatura (16 °C), y una temperatura de la placa (10 °C).
Después de la impresión, las láminas se dejaron secar y posteriormente se bloquearon con el tampón de bloqueo Super G (Cat. No. 10501, Grace Biolabs, Madrid, España). Después, las láminas se incubaron durante la noche a 4 °C con las diluciones indicadas de los anticuerpos primarios listados en la Tabla 1.
Tabla 1: Listado de anticuerpos primarios empleados
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Tras la incubación, las láminas se lavaron con la solución de tampón fosfato salinotween, PBS-T y se incubaron más tarde con anticuerpos de cabra anti-ratón o cabra anti-conejo altamente cruzados conjugados con CF™ 647 (Sigma Aldrich, SAB4600183 - SAB4600185; 1:500, Madrid, España). Se utilizaron láminas incubadas directamente con anticuerpos secundarios y con 0,0001% Fast Green FCF (Cat. No. F7252, Sigma Aldrich, Madrid, España) para evaluar posibles uniones inespecíficas a los IgG de ratón no enmascarados y la cantidad total de proteína presente en las gotas de las muestras, respectivamente.
Los microarrays fueron escaneados usando el escáner Typhoon 9410 (GE Healthcare, Inc. Madrid, España). La intensidad media de fluorescencia de las manchas se midió utilizando GenePix® Pro 7 (EE.UU.) y se normalizó en relación con la cantidad de proteína contenida en la muestra obtenida de la almohadilla de tinción FCF. Después de la cuantificación, la intensidad fluorescente relativa se convirtió en unidades arbitrarias de proteína expresada/ng de proteína en el extracto utilizando como estándar el gráfico lineal de la línea celular C2C128,9.
Aná lis is estadístico. Los resultados que se muestran en las figuras son medias ± SEM (error estándar de la media). El análisis estadístico fue realizado por la prueba t de Student. Las pruebas estadísticas fueron de dos colas en el nivel del 5% de significación. Los análisis estadísticos se realizaron usando Excel Microsoft 365 y GraphPad Prism 7.
B. E jem plos de realización
Ejemplo 1: Efectividad del MitoQ en la prevención de la aparición y desarro llo de los síntom as de la CMT en ratones defic ientes en Gdapl
Se administró MitoQ a ratones Gdapl-null desde el momento del destete y hasta los 10 meses de edad (Figura 1A). También se incluyó un grupo de ratones salvajes y Gdap1-null no tratados.
A los siete meses de edad, observamos que los ratones Gdapl-null mostraban un aumento significativo de peso corporal en comparación con los de tipo salvaje. Por el contrario, el MitoQ evitó el aumento de peso corporal de los ratones Gdapl-null (Figura 1B, histograma superior). El aumento de peso es un problema serio en los pacientes con CMT porque los músculos debilitados les dificultan mantenerse activos. De acuerdo con esto, el aumento progresivo de peso observado en los ratones Gdapl-null debido a la acumulación de grasa visceral se evitó al tratar dichos ratones con MitoQ presumiblemente porque al evitar la debilidad muscular permitieron a los ratones tener la misma actividad que los ratones control, o WT.
Sin embargo, la coordinación motora de los grupos de ratones estudiados, evaluada con el rotarod en ratones de las 3 condiciones a 7 meses de edad, no reveló diferencias significativas entre ellos (Figura 1D).
A los 10 meses de edad, los ratones Gdapl-null no tratados seguían mostrando un aumento relevante del peso corporal en comparación con los ratones de tipo salvaje (Figura 1B, fotografías de los ratones). El tratamiento con MitoQ disminuyó significativamente el aumento de peso corporal de los ratones Gdapl-null (Figura 1B histograma inferior).
La CMT relacionada con alteraciones genéticas en GDAP1 promueve la debilidad y el desgaste de pies y manos, dando lugar a deficiencias motoras y pérdidas de sensibilidad, lo que lleva a una pronunciada discapacidad de los pacientes. De forma similar a lo descrito para los pacientes, a los 10 meses de edad observamos un reflejo anormal de cierre de la extremidad posterior en ratones Gdapl-null no tratados con Mitoq, evaluado por la forma del ángulo entre la extremidad posterior derecha y el eje del cuerpo, cuando se comparan con los ratones de tipo salvaje (Figura 1C). Notablemente, el tratamiento de los ratones con MitoQ mejoró significativamente el reflejo de cierre de las extremidades traseras de los animales (Figura 1C, histograma), por lo tanto, el tratamiento de la presente invención mejoró la prevención de la aparición de los síntomas de la CMT.
La determinación de la fuerza muscular de las extremidades delanteras y la fuerza máxima realizada por dichas extremidades se evaluaron mediante las pruebas de colgado de dos y cuatro extremidades (Figuras 2A y 2C imágenes de los ratones) y fuerza de agarre (Figura 2B). Tanto el máximo tiempo de suspensión (Figura 2A, histograma izquierdo) como el impulso de sujeción mínimo (Figura 2A, histograma derecho) se redujeron significativamente en los ratones Gdapl-null no tratados cuando se compararon con los ratones salvajes o WT en la prueba de colgado con 2 extremidades. El tratamiento de los ratones con MitoQ mejoró significativamente la fuerza muscular de las extremidades delanteras (Figura 2A). Se obtuvieron resultados similares en la prueba de fuerza de agarre (Figura 2B) lo que apoya la conclusión de que tanto el tratamiento con MitoQ previene el desgaste de los músculos de las extremidades delanteras de los ratones Gdapl-null.
La fuerza muscular de las cuatro extremidades se determinó por la habilidad de los ratones para oponerse a su peso haciendo uso de las mismas, mediante una prueba similar a la de colgado de dos extremidades (Figura 2C). Tanto el máximo tiempo de suspensión (Figura 2C, histograma izquierdo) como el impulso de sujeción mínimo (Figura 2C, histograma derecho) se redujeron significativamente en los ratones Gdaplnull no tratados cuando se compararon con los ratones salvajes. El tratamiento de los ratones con MitoQ mejoró significativamente la fuerza muscular de las cuatro extremidades (Figura 2C), lo que demuestra que el tratamiento con este compuesto previene el desgaste muscular de las extremidades en los ratones Gdapl-null.
Finalmente, el comportamiento de coordinación motora se evaluó mediante la prueba del rotarod (Figura 2D). Aunque no se observaron diferencias significativas entre los ratones de las 3 condiciones con 7 meses de edad, cuando se repitió el experimento con ratones de las 3 condiciones con 10 meses de edad, se observó que la latencia de caída se redujo significativamente en los ratones Gdapl-null (Figura 2D), reforzando aún más la conclusión de que el MitoQ actúa como “colector” de especies reactivas de oxígeno (ROS) mitocondriales desde la vida temprana previniendo la aparición del fenotipo de pérdida de músculo deletéreo del modelo de ratón Gdapl-null.
Ejemplo 2: Efectividad del MitoQ en la prevención de la degradación del proteoma m itocondria l redox en ratones defic ientes de Gdapl
Se ha publicado que pacientes de la enfermedad CMT sufren una pérdida parcial de enzimas implicadas en el metabolismo energético y en la manipulación de ROS como resultado de la lesión de terminales nerviosas epidérmicas1. De manera similar, los nervios periféricos del modelo de ratón de la enfermedad CMT, Gdapl-null también muestran una reducción de las enzimas del metabolismo energético y de la respuesta antioxidante4. Por lo tanto, a continuación, exploramos el efecto del MitoQ en la expresión de determinadas proteínas del metabolismo energético y de la respuesta al estrés oxidativo en extractos de tejido derivados de los nervios ciáticos, de ratones Gdapl-null (Figura 3), utilizando una aproximación cuantitativa de alto rendimiento denominada reverse phase protein arrays (RPPAs)7,8. Los nervios periféricos de los ratones Gdapl-null mostraron una pérdida significativa de las enzimas implicadas en la oxidación de la glucosa y la respiración mitocondrial (LDHA, PDH, IDH1 y CORE2) y de la respuesta antioxidante (GR, SOD1, catalasa y SOD2) en comparación con los ratones de tipo salvaje (Figura 4). De acuerdo con esta última observación, la modificación oxidativa de las proteínas celulares por la MDA y la 4HNE aumentó significativamente en los ratones Gdapl-null (Figura 3). Otras proteínas no mostraron cambios significativos (Figura 3), aunque en la mayoría de ellos se observa una tendencia decreciente (ENO1, MDH2, HADHA, |3F1 y OPA1).
Notablemente, el tratamiento con MitoQ previno y/o aumentó significativamente la expresión de un gran número de proteínas del metabolismo energético (ENO1, LDHA, PDH, IDH, CORE2, |3F1), en la respuesta antioxidante (GR, catalasa y SOD2) y la proteína 4HNE, involucrada en estrés oxidativo, en los nervios ciáticos de los ratones Gdapl-null (Figura 3) Otras proteínas no mostraron cambios significativos, aunque en la mayoría de ellos se observa una tendencia a recuperar los niveles similares de los ratones WT, o control (MDH2, CORE2, OPA1 y SOD1) (Figura 3). Estos resultados apoyan firmemente a nivel molecular que las alteraciones en el metabolismo energético y redox que se produce en los ratones Gdapl-null durante el desarrollo pueden prevenirse mediante el tratamiento con el antioxidante MitoQ.
La cuantificación de proteínas mitocondriales en los nervios ciáticos, como NADH9 y COXIV de la cadena respiratoria, confirmó aún más el efecto deletéreo específico de la ablación del gen Gdapl en las proteínas implicadas en la producción de energía mitocondrial cuando se comparan con las proteínas implicadas en otras funciones mitocondriales (Figura 4). Además, se confirmó el efecto positivo del tratamiento en la prevención de la pérdida de las enzimas del metabolismo de la energía en ratones Gdapl-null (Figura 4), concretamente en NADH9 y cierta tendencia en COX IV. Estos resultados confirman aún más que el MitoQ previene el desarrollo de los síntomas de la CMT al mejorar la disfunción del metabolismo energético y la homeostasis redox en los nervios periféricos.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende MitoQ para su uso en el tratamiento de los síntomas de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth de un paciente.
2. La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, en la que la causa de la enfermedad se debe a alteraciones genéticas en GDAP1 y/o MFN2.
3. La composición farmacéutica según una de las reivindicaciones anteriores, en la que la enfermedad Charcot-Marie-Tooth se selecciona entre AR-CMT2K, CMT2K y CMT4A.
4. La composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 o 2, en la que la enfermedad Charcot-Marie-Tooth es AR-CMT2A2.
5. La composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 4, en la que los síntomas de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth son deficiencias motoras, pérdida sensorial, deficiencias ópticas, parálisis diafragmática y/o parálisis de las cuerdas vocales.
6. La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, en la que las deficiencias motoras comprenden deficiencias motoras de las extremidades inferiores, pérdida de masa corporal en las piernas y los pies, arcos de los pies elevados, dedos de los pies doblados y/o dificultad para flexionar el talón.
7. La composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende al menos uno o más de los siguientes:
- un excipiente farmacéuticamente aceptable, y
- un aditivo farmacéuticamente aceptable.
8. La composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el tratamiento del paciente se realiza antes de la aparición de los síntomas de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth.
9. La composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el tratamiento del paciente se realiza de 1 a 7 veces por semana.
10. La composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la dosis administrada es de 0,0001 hasta aproximadamente 1000 mg/kg peso corporal por día.
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