ES2914648T3

ES2914648T3 - Receptores de células T

Info

Publication number: ES2914648T3
Application number: ES17717845T
Authority: ES
Inventors: Conor Hayes; Linda Hibbert; Nathaniel Liddy; Tara Mahon; Marine Raman
Original assignee: Immunocore Ltd
Current assignee: Immunocore Ltd
Priority date: 2016-04-08
Filing date: 2017-04-07
Publication date: 2022-06-15
Anticipated expiration: 2037-04-07
Also published as: US20190092834A1; EP3440105B1; UA129144C2; MX2018012318A; EP4023668A1; KR20180132844A; MD3440105T2; SG11201808797XA; PH12018502158B1; IL308831A; EP3440105A1; IL262144B2; AU2022256131A1; RU2018135248A3; IL262144B1; LT3440105T; JP2019516357A; CY1125331T1; CR20180531A; RU2018135248A

Abstract

Un receptor de células T (TCR) que tiene la propiedad de unirse al complejo de GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) y HLA-A*02 y que comprende un dominio variable de la cadena alfa del TCR y un dominio variable de la cadena beta del TCR, en el que: (a) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:17; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:28; (b) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:25; (c) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:28; (d) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:20; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:28; (e) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26; (f) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:27; (g) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29; (h) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:23; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29; (i) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:46; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29; (j) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:47; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29; (k) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:48; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29; (l) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:49; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29; (m) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:50; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29; (n) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29; (o) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:20; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:65; (p) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:66; (q) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:67; (r) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:68; (s) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:69; (t) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:70; (u) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:52; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26; (v) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26; (w) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:54; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26; (x) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:55; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26; (y) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:56; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26; (z) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:57; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26; (aa) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:58; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26; (bb) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:59; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26; (cc) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:60; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26; (dd) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:71; (ee) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:72; (ff) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:73; (gg) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:74; (hh) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:75; (ii) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:76; (jj) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:77; (kk) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:78; o (II) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:79.

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores de células T

La presente invención se refiere a receptores de células T (TCR) que se unen al péptido restringido HLA-A*02 GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) derivado del antígeno cancerígeno de la línea germinal MAGE A4. Dichos TCR comprenden mutaciones no naturales dentro de los dominios variables alfa y/o beta en relación con un TCR MAGE A4 nativo. Los TCR de la invención son particularmente adecuados para su uso como nuevos reactivos inmunoterapéuticos para el tratamiento de enfermedades malignas. Cualquier referencia a métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia debe interpretarse como una referencia a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento.

Antecedentes de la invención

Los receptores de células T (TCR) son expresados naturalmente por las células T CD4+ y CD8+. Los TCR están diseñados para reconocer antígenos peptídicos cortos que se muestran en la superficie de las células presentadoras de antígenos en complejo con las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad ("Major Histocompatibility Complex", MHC) (en los seres humanos, las moléculas del MHC también se conocen como antígenos leucocitarios humanos, "Human Leukocyte Antigens", o HLA) (Davis, et al. (1998), Annu. Rev. Immunol., 16: 523-544). Las células T CD8+, que también se denominan células T citotóxicas, reconocen específicamente los péptidos unidos al MHC de clase I y, por lo general, se encargan de encontrar y mediar en la destrucción de las células enfermas. Las células T CD8+ son capaces de destruir tanto las células cancerosas como las infectadas por virus; sin embargo, la afinidad de los TCR expresados por las células T específicas del cáncer en el repertorio natural suele ser baja como resultado de la selección tímica, lo que significa que las células cancerosas suelen escapar a la detección y destrucción. Los nuevos enfoques inmunoterapéuticos destinados a facilitar el reconocimiento del cáncer por parte de las células T ofrecen una estrategia muy prometedora para el desarrollo de tratamientos eficaces contra el cáncer.

MAGE A4 pertenece a la familia MAGE de antígenos cancerígenos codificados en la línea germinal (De Plaen, et al. (1994), Immunogenetics, 40(5): 360-369) y tiene el número de registro de Uniprot P43358. Se ha comprobado que estos antígenos se expresan con frecuencia en diversos tipos de cáncer, mientras que su expresión en los tejidos normales se limita a los testículos de los adultos y a otros lugares privilegiados desde el punto de vista inmunitario, incluida la placenta. La naturaleza específica del cáncer de estos genes los convierte en dianas ideales para las terapias anticancerígenas. La función precisa de MAGE A4 sigue siendo desconocida, pero se cree que desempeña un papel en el desarrollo embrionario. Se ha notificado un alto nivel de expresión de MAGE A4 en tumores de varios tipos, tales como el melanoma, los carcinomas de esófago, cabeza y cuello, pulmón, mama y vejiga (Bergeron (2009), Int. J. Cancer, 125(6): 1365-1371 Cabezón, et al. (2013), Mol. Cell. Proteomics, 12(2): 381-394; Cuffel, et al. (2011), Int. J. Cancer, 128(11): 2625-2634; Forghanifard, et al. (2011), Cancer Biol. Ther., 12(3): 191-197 Karimi, et al. (2012), Clin. Lung Cancer, 13(3): 214-219 Svobodova, et al. (2011), Eur. J. Cancer, 47(3): 460-469). El péptido 10-mero GVYDGREHTV (SEQ ID NO:1) corresponde a los aminoácidos 230-239 de la proteína MAGE A4 de longitud completa. Este péptido se une al HLA-A*02 y se ha demostrado que el complejo de péptido-HLA estimula a las células T citotóxicas, lo cual conduce a la lisis de las células tumorales MAGE A4 positivas, HLA-A*02 positivas (Duffour, et al. (1999), Eur. J. Immunol., 29(10): 3329-3337 y documento WO2000020445). Por lo tanto, el complejo de HLA-A*02 y GVYDGREHTV constituye un antígeno diana útil para la intervención inmunoterapéutica.

La identificación de secuencias particulares de TCR que se unen al complejo de GVYDGREHTV y HLA-A*02 con alta especificidad es ventajosa para el desarrollo de nuevas inmunoterapias. Los TCR terapéuticos pueden utilizarse, por ejemplo, como agentes solubles de transporte dirigido con el fin de administrar agentes citotóxicos o efectores inmunitarios al tumor (Lissin, et al. (2013), "High-Affinity Monoclonal T-cell receptor (mTCR) Fusions. Fusion Protein Technologies for Biophamaceuticals: Applications and Challenges", S. R. Schmidt, Wiley; Boulter, et al. (2003), Protein Eng., 16(9): 707-711; Liddy, et al. (2012), Nat. Med., 8: 980-987), o bien pueden utilizarse para modificar células T para la terapia adoptiva (June, et al. (2014), Cancer Immunol. Immunother., 63(9): 969-975). Sin embargo, no se conocen tales secuencias de TCR en la técnica, y los métodos para la identificación de TCR con características de especificidad susceptibles de uso terapéutico tienen una alta tasa de erosión y, por lo tanto, no proporcionan a los expertos una expectativa razonable de éxito.

En primer lugar, los expertos deben identificar una secuencia de partida o de andamiaje adecuada. Normalmente, estas secuencias se obtienen de fuentes naturales, por ejemplo, de células T que responden al antígeno extraídas de la sangre de un donante. Dada la rareza de las células T específicas para el cáncer en el repertorio natural, a menudo es necesario examinar a muchos donantes, por ejemplo 20 o más, antes de encontrar una célula T que responda. El proceso de selección puede durar varias semanas o meses, e incluso cuando se encuentra una célula T que responde, puede ser inadecuada para su uso inmunoterapéutico. Por ejemplo, la respuesta puede ser demasiado débil y/o puede no ser específica para el antígeno diana, o bien puede no ser posible generar una población clonal de células T, ni expandir o mantener una determinada línea de células T para producir suficiente material para identificar las secuencias de cadena TCR correctas. Además, como los TCR son degenerados y se ha predicho que pueden unirse a aproximadamente un millón de péptidos HLA diferentes (Wooldridge, et al. (2012), J. Biol. Chem., 287(2): 1168 1177)) es excepcionalmente difícil, incluso para los profesionales expertos, poder determinar si un TCR particular tiene un perfil de especificidad que lo haría elegible para la modificación para un uso terapéutico.

Las secuencias de TCR que son adecuadas como secuencias de partida o de andamiaje deben tener una buena afinidad por el complejo diana de péptido-HLA, por ejemplo 200 pM o más, demostrar un alto nivel de especificidad por la diana, por ejemplo, una unión relativamente débil o nula a complejos de péptido-HLA alternativos, ser modificables para su uso en bibliotecas de presentación, tal como la presentación por fagos, y poder ser replegadas y purificadas con un alto rendimiento.

Los TCR, tal y como existen en la naturaleza, tienen una afinidad débil por el antígeno diana (intervalo micromolar bajo) en comparación con los anticuerpos, y los TCR contra antígenos cancerígenos suelen tener un reconocimiento del antígeno más débil que los TCR específicos virales (Aleksic, et al. (2012), Eu. J. Immunol., 42(12), 3174-3179). Esta débil afinidad, unida a la regulación negativa del HLA en las células cancerosas, significa que los TCR terapéuticos para la inmunoterapia del cáncer requieren una modificación para aumentar su afinidad por el antígeno diana y generar así una respuesta más potente. Las afinidades de unión al antígeno del TCR en el intervalo de nanomolar a picomolar, con semividas de unión de varias horas, son deseables para los agentes de transporte dirigido solubles basados en el TCR. La mejora de la potencia generada por el reconocimiento de antígenos de alta afinidad con un número bajo de epítopos se ejemplifica en las figuras 1e y 1f de Liddy et al. (Liddy, et al. (2012), Nat. Med., 18(6), 980-987). La maduración por afinidad típicamente implica que los expertos en la materia tengan que identificar mutaciones específicas y/o combinaciones de mutaciones, incluyendo pero no limitándose a sustituciones, inserciones y/o deleciones, que pueden hacerse a la secuencia del TCR de partida para aumentar la fuerza de reconocimiento del antígeno. Los métodos para identificar las mutaciones de un determinado TCR que confieren una mejora de la afinidad son conocidos en la técnica, por ejemplo, el uso de bibliotecas de presentación (Li et al. (2005), Nat. Biotechnol., 23(3):349-354; Holler et al. (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(10):5387-5392). Sin embargo, para producir aumentos significativos en la afinidad de un TCR dado contra una diana determinada, se requiere que los expertos en la materia seleccionen mutaciones específicas y/o combinaciones de mutaciones de un gran conjunto de alternativas posibles. Las mutaciones específicas y/o las combinaciones de mutaciones que producen aumentos significativos en la afinidad no son predecibles y existe una alta tasa de erosión. En muchos casos puede que no sea posible conseguir un aumento significativo de la afinidad con una secuencia inicial de TCR determinada.

El proceso de maduración por afinidad también debe tener en cuenta la necesidad de mantener la especificidad de antígeno del TCR. El aumento de la afinidad de un TCR por su antígeno diana conlleva un riesgo sustancial de revelar una reactividad cruzada con otras dianas no previstas como resultado de la degeneración inherente al reconocimiento de antígenos por parte del TCR (Wooldridge, et al. (2012), J. Biol. Chem., 287(2): 1168-1177 Wilson, et al. (2004), Mol. Immunol., 40(14-15): 1047-1055 Zhao et al. (2007), J. Immunol., 179, 9, 5845-5854). En un nivel natural de afinidad, el reconocimiento del antígeno de reacción cruzada puede ser demasiado bajo para producir una respuesta. Si un antígeno de reacción cruzada se muestra en células sanas normales, existe una gran posibilidad de que se produzca una unión que no sea a la diana in vivo , lo que puede manifestarse en una toxicidad clínica. Por lo tanto, además de aumentar la fuerza de unión al antígeno, los expertos también deben seleccionar las mutaciones y/o combinaciones de mutaciones que permiten que el TCR mantenga una alta especificidad por el antígeno diana y demuestre un buen perfil de seguridad en las pruebas preclínicas. De nuevo, estas mutaciones y/o combinaciones de mutaciones no son predecibles. La tasa de erosión en esta etapa es aún mayor y en muchos casos puede no ser alcanzable en absoluto a partir de una determinada secuencia de partida de TCR.

Las mutaciones requeridas para una alta afinidad y una alta especificidad también deben producir un TCR que sea capaz de ser expresado, replegado y purificado con un rendimiento razonable y que sea altamente estable en una forma purificada.

A pesar de las dificultades descritas anteriormente para identificar secuencias de TCR con características adecuadas para su uso terapéutico, los inventores han descubierto sorprendentemente una secuencia de TCR que proporciona un punto de partida ideal, o andamiaje, para producir TCR terapéuticos. Además, los inventores han identificado inesperadamente mutaciones adecuadas que pueden introducirse en los dominios variables alfa y beta del andamiaje para producir secuencias de TCR con características ideales para la inmunoterapia dirigida basada en TCR de los cánceres que expresan MAGE A4.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un receptor de células T (TCR) que tiene la propiedad de unirse a GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) en complejo con HLA-A*02 y que comprende un dominio variable de la cadena alfa del TCR y un dominio variable de la cadena beta del TCR,

(a) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:17; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:28;

(b) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:25;

(c) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:28;

(d) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:20; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:28;

(e) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26;

(f) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:27;

(g) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29;

(h) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:23; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29;

(i) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:46; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29;

(j) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:47; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29;

(k) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:48; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29;

(l) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:49; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29;

(m) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:50; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29;

(n) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:51; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29;

(o) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:20; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:65;

(p) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:66;

(q) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:67;

(r) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:68;

(s) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:69;

(t) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:70;

(u) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:52; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26;

(v) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26;

(w) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:54; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26;

(x) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:55; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26;

(y) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:56; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26;

(z) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:57; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26;

(aa) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:58; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26;

(bb) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:59; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26;

(cc) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:60; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26;

(dd) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:71;

(ee) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:72;

(ff) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:73;

(gg) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:74;

(hh) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:75;

(ii) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:76;

(jj) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:77;

(kk) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:78; o

(II) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:79.

Las características preferidas de los aspectos de la invención se exponen en las reivindicaciones dependientes del presente documento.

En el presente documento se divulga un TCR que se une a un complejo de GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) y HLA-A*02 con una afinidad superior a 200 j M, en el que: las CDR 1,2 y 3 de la cadena alfa comprenden las SEQ ID NO:6, 7 y 8, respectivamente y/o las CDR 1, 2 y 3 de la cadena beta comprenden las SEQ ID NO:11, 12 y 13, respectivamente y/o al menos una de las CDR contiene una o más sustituciones conservadoras con respecto a SEQ ID NO: 6 a 8 y 11 a 13; y/o al menos una de las CDR contiene hasta tres sustituciones toleradas con respecto a SEQ ID NO: 6 a 8 y 11 a 13.

La afinidad de los TCR de la invención por el complejo de GVYDGREHTV y HLA-A*02 puede estar en el intervalo de 200 j M a 1 pM. Preferiblemente, dichas sustituciones no cambian la afinidad de unión en más del /- 50 %, o más preferiblemente en no más del /- 20 %, en relación con el TCR no sustituido. Preferiblemente, dichas sustituciones no aumentan la afinidad de unión por complejos de péptido-HLA alternativos.

El andamiaje de TCR tiene el siguiente uso de las cadenas variables alfa y beta:

Cadena alfa: TRAV10*01/TRAJ6*01

Cadena beta: TRBV28*01/TRBD1*01/TRBJ2-7*01/

(Nota, el término "*01" indica la variante alélica para esta secuencia, tal como se designa en la nomenclatura IMGT) y las siguientes secuencias CDR3 de las cadenas alfa y beta:

Cadena alfa: WNHSGGSYIPTF (SEQ ID NO: 8)

Cadena beta: ASSFLMTSGDPYEQYF (SEQ ID NO: 13)

La expresión "TCR de andamiaje" o "TCR de partida" se utiliza como sinónimo en esta solicitud con los términos "TCR de tipo salvaje" o "TCR WT" o "TCR no mutado" o "TCR nativo", o "TCR parental" para indicar un TCR que tiene una cadena alfa variable que comprende los restos 1-113 de SEQ ID NO: 2 y un dominio variable de la cadena beta que comprende los restos 1-116 de SEQ ID NO: 3. El dominio constante del TCR WT puede ser de longitud completa, o puede estar truncado y/o mutado para producir un TCR soluble. En cualquier caso, se pueden introducir sustituciones de cisteína en las regiones TRAC y TRBC de forma que se pueda formar un enlace disulfuro intercatenario no nativo. Las posiciones adecuadas para la ubicación de dichas sustituciones de cisteína se describen en el documento WO03020763. La figura 2 de los dibujos adjuntos muestra las secuencias extracelulares de las cadenas alfa y beta de TCR de tipo salvaje, respectivamente, en formato soluble. SEQ ID NO: 4 es idéntica a la secuencia extracelular de la cadena alfa nativa SEQ ID NO: 2, excepto que la cisteína en la posición 48 del dominio constante ha sido sustituida por treonina. De forma similar, SEQ ID NO: 5 es idéntica a la secuencia extracelular de la cadena beta nativa SEQ ID NO: 3, excepto que la cisteína en la posición 57 del dominio constante ha sido sustituida por serina, la cisteína en la posición 75 del dominio constante ha sido sustituida por alanina, y la asparagina en la posición 89 del dominio constante ha sido sustituida por ácido aspártico. El TCR soluble de tipo salvaje puede utilizarse para proporcionar una referencia con la que se puede comparar el perfil de unión de los TCR mutados de la invención.

Las secuencias del TCR definidas en el presente documento se describen con referencia a la nomenclatura del IMGT, que es ampliamente conocida y accesible para quienes trabajan en el campo de los TCR. Por ejemplo, véase: LeFranc y LeFranc (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press; Lefranc (2011), Cold Spring Harb Protoc., 2011(6): 595-603; Lefranc (2001), Curr. Protoc. Immunol., apéndice 1: Apéndice 10O; y Lefranc (2003), Leukemia, 17(1): 260 266). Brevemente, las ap de TCR están formadas por dos cadenas unidas por disulfuro. Por lo general, se considera que cada cadena (alfa y beta) tiene dos dominios, a saber, uno variable y otro constante. Una región corta de unión conecta los dominios variable y constante y se considera normalmente parte de la región variable alfa. Además, la cadena beta suele contener una región corta de diversidad junto a la región de unión, que también suele considerarse parte de la región variable beta.

El dominio variable de cada cadena está situado N-terminalmente y comprende tres regiones determinantes de la complementariedad ("Complementarity Determining Regions", CDR) incrustadas en una secuencia marco. Las CDR comprenden el sitio de reconocimiento para la unión del péptido-MHC. Existen varios genes que codifican las regiones variables de la cadena alfa (Va) y varios genes que codifican las regiones variables de la cadena beta (Vp), que se distinguen por su marco, las secuencias CDR1 y CDR2, y por una secuencia CDR3 parcialmente definida. Los genes Va y Vp se denominan en la nomenclatura del IMGT con el prefijo TRAV y TRBV, respectivamente (Folch y Lefranc (2000), Exp. Clin. Immunogenet., 17(1): 42-54; Scaviner y Lefranc (2000), Exp. Clin. Immunogenet., 17(2): 83 96; LeFranc y LeFranc (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). Asimismo, existen varios genes de unión o J, denominados TRAJ o TRBJ, para la cadena alfa y beta, respectivamente, y para la cadena beta existe un gen de diversidad o D denominado TRBD (Folch y Lefranc (2000), Exp. Clin. Immunogenet., 17(2): 107-114; Scaviner y Lefranc (2000), Exp. Clin. Immunogenet., 17(2): 97-106; LeFranc y LeFranc (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press). La enorme diversidad de cadenas de receptores de células T es el resultado de redisposiciones combinatorias entre los diversos genes V, J y D, que incluyen variantes alélicas, y de la diversidad de uniones (Arstila, et al. (1999), Science, 286(5441): 958-961; Robins et al. (2009), Blood, 114(19): 4099-4107). Las regiones constantes, o C, de las cadenas TCR alfa y beta se denominan TRAC y TRBC, respectivamente (Lefranc (2001), Curr. Protoc. Immunol., apéndice 1: Apéndice 1O).

El dominio variable de la cadena alfa puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y el dominio variable de la cadena beta puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; el dominio variable de la cadena alfa puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y el dominio variable de la cadena beta puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; el dominio variable de la cadena alfa puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y el dominio variable de la cadena beta puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; el dominio variable de la cadena alfa puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 y el dominio variable de la cadena beta puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; el dominio variable de la cadena alfa puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y el dominio variable de la cadena beta puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.

El TCR de la invención puede ser un heterodímero alfa-beta, que tiene una secuencia de dominio constante TRAC de cadena alfa y una secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2 de cadena beta.

El TCR de la invención puede estar en formato monocatenario, incluyendo, pero sin limitarse a Va,-L-Vp, Vp-L-Va, Va-Ca-L-Vp, Va-L-Vp-Cp, Va-Ca-L-Vp-Cp, en los que Va y Vp son regiones variables de las a y p del TCR, respectivamente, Ca y Cp son regiones constantes de las a y p del TCR, respectivamente, y L es una secuencia conectora.

El TCR de la invención puede asociarse con un marcador detectable, un agente terapéutico o un resto modificador de PK.

El TCR de la invención puede comprender un anticuerpo anti-CD3 unido covalentemente al terminal C o N de la cadena alfa o beta del TCR. La cadena beta puede estar unida a la secuencia del anticuerpo anti-CD3 a través de una secuencia conectora; la secuencia conectora puede seleccionarse del grupo formado por GGGGS (SEQ ID NO: 30), GGGSG (SEQ ID NO: 31), GGSGG (SEQ ID NO: 32), GSGGG (SEQ ID NO: 33), GSGGGP (SEQ ID NO: 34), GGEPS (SEQ ID NO: 35), GGEGGGP (SEQ ID NO: 36), y GGEGGGSEGGGS (SEQ ID NO: 37).

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una molécula de fusión TCR-anti-CD3 en la que:

(II) el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22; y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:79, y

en el que el anticuerpo anti-CD3 está unido covalentemente al N-terminal o al C-terminal de la cadena beta del TCR a través de una secuencia conectora seleccionada de las SEQ ID NO: 30-37).

El TCR de la invención puede incluirse en una biblioteca de partículas. Para ello, el TCR puede presentarse en la superficie de un bacteriófago, una célula de levadura, una célula de mamífero o un ribosoma, por ejemplo. El TCR puede estar aislado, libre de células y/o ser soluble, es decir, puede no ser un TCR que se encuentre en su estado natural dentro de una célula T dentro de un cuerpo humano.

Los TCR de la invención pueden ser de origen no natural y/o purificados y/o diseñados.

En el presente documento se divulgan TCR que pueden tener más de una mutación presente en el dominio variable de la cadena alfa y/o en el dominio variable de la cadena beta en relación con el TCR nativo MAGE A4. El dominio variable de la cadena alfa puede tener una mutación en al menos una de las siguientes posiciones con referencia a la numeración de los restos 1-113 de la SEQ ID NO: 2: M50, T51, F52, S53, E54, H94, S95, G96, S98. Las mutaciones pueden seleccionarse entre los siguientes aminoácidos con referencia a la numeración de los restos 1-113 de SEQ ID NO: 2:

Tabla 1

Ademas, o como alternativa, el dominio variable de la cadena beta puede tener una mutación en al menos una de las siguientes posiciones con referencia a la numeración de los restos 1-116 de SEQ ID NO: 3: M27; D28; H29, E30, N31, Y50, D51, V52, K53, M54, F95, L96, M97, T98. Las mutaciones pueden seleccionarse entre los siguientes aminoácidos con referencia a la numeración de los restos 1-116 de SEQ ID NO: 3:

Tabla 2

El dominio variable de la cadena alfa puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 de las mutaciones mostradas en la tabla 1 y/o el dominio variable de la cadena beta puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de las mutaciones mostradas en la tabla 2

El dominio variable de la cadena alfa puede tener al menos uno de los siguientes grupos de mutaciones:

Grupo 1: M50L, T51D, F52Y, S53A, E54I

Grupo 2: H94S, S95A, G96N, S98L

Grupo 3: H94R S95A, G96D, S98L

Grupo 4: M50L, T51D, F52Y, S53A, E54I, H94R S95A, G96D, S98L

Grupo 5: M50L, H94S, S95A, G96S, S98L

Grupo 6: M50L, H94S, S95A, G96Q, S98L

y/o el dominio variable de la cadena beta puede tener al menos uno de los siguientes grupos de mutaciones:

Grupo 1: M27A, D28P, H29L, E30S, N31K F95S, L96D, M97Q, T98N

Grupo 2: Y50R, D51F, V52A, K53T, M54G, F95S, L96D, M97Q, T98N

Grupo 3: F95S, L96D, M97Q, T98N

Grupo 4: M27L, Y50R, D51F, V52A, K53T, M54G, F95S, L96D, M97Q, T98N

Grupo 5: M27A, D28P, H29L, E30S, N31K, M54L, F95S, L96D, M97Q, T98N

Por ejemplo, el dominio variable de la cadena alfa puede tener mutaciones del grupo 4 y el dominio variable de la cadena beta puede tener mutaciones del grupo 1; el dominio variable de la cadena alfa puede tener mutaciones del grupo 4 y el dominio variable de la cadena beta puede tener mutaciones del grupo 5; el dominio variable de la cadena alfa puede tener mutaciones del grupo 2 y el dominio variable de la cadena beta puede tener mutaciones del grupo 2; el dominio variable de la cadena alfa puede tener mutaciones del grupo 6 y el dominio variable de la cadena beta puede tener mutaciones del grupo 4; el dominio variable de la cadena alfa puede tener mutaciones del grupo 5 y el dominio variable de la cadena beta puede tener mutaciones del grupo 4.

Las mutaciones pueden realizarse ademas, o como alternativa, fuera de las CDR; dichas mutaciones pueden mejorar la unión y/o la especificidad y/o la estabilidad y/o el rendimiento de una forma soluble purificada del TCR. Por ejemplo, el TCR puede comprender ademas, o como alternativa, un dominio variable de la cadena alfa que tenga las siguientes mutaciones con referencia a la numeración de los restos 1-113 de SEQ ID NO: 2:

Tabla 3

En el dominio variable de la cadena alfa, la secuencia de restos aminoácidos 27-32, 50-56 y 91-103 puede seleccionarse entre las siguientes:

Tabla 4

El dominio variable de la cadena alfa del TCR puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 90 % 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO: 16-24 o 46-64.

En el dominio variable de la cadena beta, la secuencia de restos aminoácidos 27-31, 49-54 y 92-107 puede seleccionarse entre las siguientes:

Tabla 5

El dominio variable de la cadena beta del TCR puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 90 % 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO: 25-29 o 65-81.

La secuencia del dominio variable de la cadena alfa de los restos aminoácidos 27-32, 50-56 y 91-103 y la secuencia del dominio variable de la cadena beta de los restos aminoácidos 27-31, 49-54 y 92-107 pueden seleccionarse entre las siguientes

Tabla 6

El dominio variable de la cadena alfa puede comprender la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 16 a 24 o 46-64 y/o el dominio variable de la cadena beta puede comprender la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 25 a 29 o 65-81.

El TCR puede comprender una región del marco de la cadena alfa 2 (FR2) y una región del marco de la cadena alfa 3 (FR3), en las que las regiones FR2 y FR3 comprenden SEQ ID NO: 9 y 10, respectivamente y/o contienen una o más, por ejemplo una, dos o tres, sustituciones conservadoras y/o hasta tres sustituciones toleradas. El TCR puede comprender una región FR2 de la cadena beta y una región f R3 de la cadena beta, en las que las regiones FR2 y FR3 comprenden las SEQ ID NO:14 y 15, respectivamente y/o contienen una o más, por ejemplo una, dos o tres, sustituciones conservadoras y/o hasta tres sustituciones toleradas. El TCR puede comprender los aminoácidos 1-113 de SEQ ID NO: 2 y/o los aminoácidos 1-116 de SEQ ID NO: 3, cada una de las cuales puede contener una o más sustituciones conservadoras y/o hasta tres mutaciones toleradas y/o una o más de las mutaciones establecidas en las tablas 1, 2 y 3.

"TCR modificado" y "TCR mutante" se utilizan como sinónimos en el presente documento para referirse a un TCR que tiene una o más mutaciones introducidas en relación con el TCR MAGE A4 nativo, en particular en el dominio variable de la cadena alfa y/o el dominio variable de la cadena beta del mismo. Las mutaciones suelen mejorar la afinidad de unión del TCR al complejo de GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) y HLA-A*02, pero pueden conferir además, o como alternativa, otras ventajas, tales como una mayor estabilidad en forma aislada y una mayor especificidad. Las mutaciones en una o más posiciones pueden afectar además, o como alternativa, a la interacción de una posición adyacente con el complejo pMHC cognado, por ejemplo permitiendo un ángulo más favorable para la interacción. Para mejorar la unión del Tc R al complejo de GVYDGREh Tv (SEQ ID NO: 1) y HLA-A*02, las mutaciones se realizan preferiblemente dentro de una o más de las regiones CDR.

Puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mutaciones en las CDR de la cadena alfa, por ejemplo 4, 5 o 9 mutaciones y/o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mutaciones en las CDR de la cadena beta, por ejemplo 4, 9 o 10 mutaciones.

El dominio variable de la cadena a de un TCR divulgado en el presente documento puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 90 %, al menos un 91%, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de restos aminoácidos 1-113 de SEQ ID NO: 2, siempre que el dominio variable de la cadena a tenga al menos una de las mutaciones señaladas anteriormente, por ejemplo en la tabla 1 o en la tabla 3. En algunas realizaciones, el dominio variable de la cadena p del TCR de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con la secuencia de restos aminoácidos 1-116 de SEQ ID NO: 3, siempre que el dominio variable de la cadena p tenga al menos una de las mutaciones señaladas anteriormente, por ejemplo en la tabla 2.

Las mutaciones de un TCR parental (o de tipo salvaje) pueden incluir aquellas que son capaces de aumentar la afinidad de unión (ko y/o semivida de unión) del TCR al Gv Yd GREHTV. Las mutaciones pueden incluir aquellas que son capaces de reducir la cantidad de unión no específica, es decir, reducir la unión a antígenos además de la unión a GVYDGREHTV. Las mutaciones pueden incluir las que aumentan la eficacia del plegado y/o fabricación. Algunas mutaciones pueden contribuir a cada una de estas características, otras pueden contribuir a la afinidad, pero no a la especificidad, por ejemplo, o a la especificidad, pero no a la afinidad, etc.

En el presente documento se divulgan variantes fenotípicamente silenciosas de cualquier TCR de la invención. Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "variantes fenotípicamente silenciosas" se entiende que se refiere a un TCR que incorpora uno o más cambios de aminoácidos, incluyendo sustituciones, inserciones y deleciones, además de los expuestos anteriormente, cuyo TCR tiene un fenotipo similar al correspondiente TCR sin dichos cambios. A los efectos de esta solicitud, el fenotipo del TCR comprende la afinidad de unión al antígeno (KD y/o semivida de unión) y la especificidad por el antígeno. Una variante fenotípicamente silenciosa puede tener una Kd y/o semivida de unión para el complejo de GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) y HLA-A*02 dentro del 50 %, o más preferiblemente dentro del 20 % de la Kd medida y/o la semivida de unión del TCR correspondiente sin dichos cambios, cuando se mide en condiciones idénticas (por ejemplo a 25 °C y/o en el mismo chip SPR). En el ejemplo 3 se proporcionan además las condiciones adecuadas. La especificidad por el antígeno se define más adelante. Como es sabido por los expertos en la materia, puede ser posible producir TCR que incorporen cambios en los dominios variables de los mismos en comparación con los detallados anteriormente sin alterar la afinidad de la interacción con el complejo de GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) y HLA-A*02. En particular, estas mutaciones silenciosas pueden incorporarse en partes de la secuencia que se sabe que no participan directamente en la unión al antígeno (por ejemplo, las CDR, o partes de las CDR que no entran en contacto con el antígeno peptídico).

Las variantes fenotípicamente silenciosas pueden contener una o más sustituciones conservadoras y/o una o más sustituciones toleradas. Las sustituciones toleradas y conservadoras pueden dar lugar a un cambio en la Kd y/o en la semivida de unión para el complejo de GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) y HLA-A*02 dentro del 50 %, o más preferiblemente dentro del 20 %, incluso más preferiblemente dentro del 10 % de la Kd medida y/o la semivida de unión del TCR correspondiente sin dichas sustituciones conservadoras y/o toleradas, cuando se mide en condiciones idénticas (por ejemplo a 25 °C y/o el mismo chip SPR), siempre que el cambio en la Kd no provoque que la afinidad sea inferior (es decir, más débil) a 200 pm. Por sustituciones toleradas se entienden aquellas sustituciones que no entran en la definición de conservadoras, tal y como se indica a continuación, pero que, sin embargo, son fenotípicamente silenciosas.

Los TCR pueden incluir una o más sustituciones conservadoras que tienen una secuencia de aminoácidos similar y/o que conservan la misma función (es decir, son fenotípicamente silenciosos como se ha definido anteriormente). Los expertos en la materia saben que diversos aminoácidos tienen propiedades similares y, por tanto, son "conservadores". Uno o más de estos aminoácidos de una proteína, polipéptido o péptido pueden ser sustituidos a menudo por uno o más de estos aminoácidos sin eliminar una actividad deseada de dicha proteína, polipéptido o péptido.

Así, los aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina pueden sustituirse a menudo entre sí (aminoácidos con cadenas laterales alifáticas). De estas posibles sustituciones, se prefiere que la glicina y la alanina se utilicen para sustituirse entre sí (ya que tienen cadenas laterales relativamente cortas) y que la valina, la leucina y la isoleucina se utilicen para sustituirse entre sí (ya que tienen cadenas laterales alifáticas más grandes que son hidrofóbicas). Otros aminoácidos que pueden sustituirse a menudo son: la fenilalanina, la tirosina y el triptófano (aminoácidos con cadenas laterales aromáticas); la lisina, la arginina y la histidina (aminoácidos con cadenas laterales básicas); el aspartato y el glutamato (aminoácidos con cadenas laterales ácidas); la asparagina y la glutamina (aminoácidos con cadenas laterales amidas); y la cisteína y la metionina (aminoácidos con cadenas laterales azufradas). Debe apreciarse que las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse utilizando aminoácidos naturales o no naturales. Por ejemplo, en el presente documento se contempla que el grupo metilo de una alanina pueda ser sustituido por un grupo etilo y/o que se realicen cambios menores en el esqueleto del péptido. Tanto si se utilizan aminoácidos naturales como sintéticos, se prefiere que solo estén presentes los aminoácidos L.

Las sustituciones de esta naturaleza suelen denominarse sustituciones de aminoácidos "conservadoras" o "semiconservadoras". Se divulga en el presente documento un TCR que comprende una secuencia de aminoácidos descrita anteriormente, pero con una o más sustituciones conservadoras y/o una o más sustituciones toleradas en la secuencia, de tal manera que la secuencia de aminoácidos del TCR tiene al menos un 90 % de identidad, tal como un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con el TCR que comprende los aminoácidos 1-113 de SEQ ID NO: 2, 16-24 o 46-64 y/o los aminoácidos 1-116 de las SEQ ID NO: 3, 25-29 o 65-81.

La "identidad", tal y como se conoce en la técnica, es la relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, determinada mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, la identidad también significa el grado de parentesco de la secuencia entre las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según sea el caso, como se determina por la coincidencia entre las cadenas de dichas secuencias. Aunque existen varios métodos para medir la identidad entre dos secuencias polipeptídicas o dos polinucleotídicas, los métodos comúnmente empleados para determinar la identidad están codificados en programas informáticos. Los programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, entre otros, el paquete de programas GCG (Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN y FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol.

215, 403 (1990)).

Se puede utilizar un programa, tal como el programa CLUSTAL, para comparar las secuencias de aminoácidos. Este programa compara las secuencias de aminoácidos y encuentra la alineación óptima insertando espacios en cualquiera de las secuencias según corresponda. Es posible calcular la identidad o la similitud de aminoácidos (la identidad más la conservación del tipo de aminoácido) para una alineación óptima. Un programa como BLASTx alineará el tramo más largo de secuencias similares y asignará un valor al ajuste. Así, es posible obtener una comparación en la que se encuentran varias regiones de similitud, cada una con una puntuación diferente. Ambos tipos de análisis de identidad se contemplan en la presente invención.

El porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos se determina alineando las secuencias para una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en la primera secuencia para una mejor alineación con la secuencia) y comparando los restos aminoácidos o nucleótidos en las posiciones correspondientes. El "mejor alineamiento" es un alineamiento de dos secuencias que da como resultado el mayor porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se determina por el número de restos aminoácidos o nucleótidos idénticos en las secuencias comparadas (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones * 100).

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede realizarse mediante un algoritmo matemático conocido por los expertos en la materia. Un ejemplo de algoritmo matemático para comparar dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877. Los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410 han incorporado dicho algoritmo. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácidos nucleicos. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteínas para su uso en la invención. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25:3389-3402. Como alternativa, puede utilizarse PSI-Blast para realizar una búsqueda iterada que detecte relaciones lejanas entre las moléculas (Id.). Al utilizar los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo de algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). El programa ALIGN (versión 2.0), que forma parte del paquete de software de alineación de secuencias del CGC, ha incorporado un algoritmo de este tipo. Otros algoritmos para el análisis de secuencias conocidos en la técnica son ADVANCE y ADAM, descritos en Torellis y Robotti (1994), Comput. Appl. Biosci., 10 :3-5y FASTA descritos en Pearson y Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448. Dentro de FASTA, ktup es una opción de control que establece la sensibilidad y la velocidad de la búsqueda.

Las mutaciones, incluidas las sustituciones conservadoras y toleradas, las inserciones y las deleciones, pueden introducirse en las secuencias proporcionadas utilizando cualquier método apropiado, incluidos, pero sin limitarse a ellos, los basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la clonación basada en enzimas de restricción o los procedimientos de clonación independiente del acoplamiento (LIC). Estos métodos se detallan en muchos de los textos convencionales de biología molecular. Para más detalles sobre la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la clonación basada en enzimas de restricción, véase Sambrook y Russell (2001), Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3a ed.), CSHL Press. Se puede encontrar más información sobre los procedimientos de clonación independiente del acoplamiento (LIC) en Rashtchian (1995), Curr. Opin. Biotechnol., 6(1): 30-6. Las secuencias de TCR proporcionadas por la invención pueden obtenerse a partir de la síntesis en estado sólido, o cualquier otro método apropiado conocido en la técnica.

Los TCR de la invención tienen la propiedad de unirse al complejo de GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) y HLA-A*02. Se ha descubierto que los TCR de la invención reconocen fuertemente este epítopo en relación con otros epítopos no pertinentes, y por lo tanto son particularmente adecuados como vectores de transporte dirigido para el transporte de agentes terapéuticos o marcadores detectables a las células y tejidos que muestran esos epítopos. La especificidad en el contexto de los TCR de la invención se refiere a su capacidad para reconocer las células diana HLA-A*02 que son positivas al antígeno, mientras que tienen una capacidad mínima para reconocer las células diana HLA-A*02 que son negativas al antígeno.

La especificidad puede medirse in vitro, por ejemplo, en ensayos celulares como los descritos en el ejemplo 6. Para analizar la especificidad, los TCR pueden estar en forma soluble y/o pueden fusionarse con un efector inmunológico y/o pueden expresarse en la superficie de las células, tales como las células T. El reconocimiento puede determinarse midiendo el nivel de activación de las células T en presencia de un TCR de la invención y de células diana. El reconocimiento mínimo de células diana negativas al antígeno se define como un nivel de activación de células T inferior al 20 %, preferiblemente inferior al 10 %, preferiblemente inferior al 5 %, y lo más preferiblemente inferior al 1 % del nivel producido en presencia de células diana positivas al antígeno, cuando se mide en las mismas condiciones y a una concentración de TCR terapéuticamente pertinente. Para los TCR solubles de la invención, una concentración terapéuticamente pertinente puede definirse como una concentración de TCR de 10'9 M o inferior y/o una concentración de hasta 100, preferiblemente hasta 1000 veces mayor que el valor de CE50 correspondiente. Las células positivas al antígeno pueden obtenerse por pulsión de péptidos utilizando una concentración de péptidos adecuada para obtener un nivel de presentación de antígenos comparable al de las células cancerosas (por ejemplo, 10'9 M de péptido, tal como se describe en Bossi et al. (2013), Oncoimmunol., 1, 2(11):e26840) o, pueden presentar naturalmente dicho péptido. Preferiblemente, tanto las células positivas al antígeno como las negativas al antígeno son células humanas. Preferiblemente, las células positivas al antígeno son células cancerosas humanas. Las células negativas al antígeno incluyen preferiblemente las derivadas de tejidos humanos sanos.

La especificidad puede referirse además, o como alternativa, a la capacidad de un TCR para unirse a un complejo de GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) y HLA-A*02 y no a un panel de complejos de péptido-HLA alternativos. Esto puede determinarse, por ejemplo, mediante el método Biacore del ejemplo 3. Dicho panel puede contener al menos 5, y preferiblemente al menos 10 complejos de péptido-HLA -A*02 alternativos. Los péptidos alternativos pueden compartir un bajo nivel de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y puede presentarse de forma natural. Los péptidos alternativos pueden derivarse de proteínas expresadas en tejidos humanos sanos. La unión al complejo de GVYDGREHTV-HLA-A*02 puede ser al menos 2 veces mayor que a otros complejos de HLA y péptidos presentados de forma natural, más preferiblemente al menos 10 veces, o al menos 50 veces o al menos 100 veces mayor, incluso más preferiblemente al menos 400 veces mayor.

Un enfoque alternativo o adicional para determinar la especificidad del TCR puede ser la identificación del motivo de reconocimiento del péptido del TCR mediante mutagénesis secuencial, por ejemplo, la exploración de alanina. Los restos que forman parte del motivo de unión son los que no se pueden sustituir. Las sustituciones no permitidas pueden definirse como aquellas posiciones del péptido en las que la afinidad de unión del TCR se reduce al menos en un 50 %, o preferiblemente al menos en un 80 % en relación con la afinidad de unión del péptido no mutado. Este enfoque se describe con más detalle en Cameron et al. (2013), Sci. Transl. Med., 7 de agosto de 2013, 5(197): 197ra103; y el documento WO2014096803. En este caso, la especificidad del TCR puede determinarse identificando péptidos con motivos alternativos, en particular péptidos con motivos alternativos en el proteoma humano, y analizando la unión de estos péptidos al TCR. La unión del TCR a uno o más péptidos alternativos puede indicar una falta de especificidad. En este caso, puede ser necesario realizar más pruebas de especificidad del TCR mediante ensayos celulares.

Como es sabido por los expertos en la materia, los péptidos derivados de miembros de la familia MAGE pueden compartir un alto nivel de identidad de secuencia con péptidos derivados de otros miembros de la familia MAGe . Por ejemplo, hay péptidos derivados de MAGE-A8 y MAGE-B2 que difieren solo en dos restos de SEQ ID NO 1 (GVYDGREHTV). Dichos péptidos y células que expresan dichos miembros de la familia MAGE pueden excluirse de la definición de especificidad proporcionada anteriormente, en particular si se sabe que dichos miembros de la familia MAGE son antígenos del cáncer, tales como MAGE-A8 y MAGE-B2. Por lo tanto, los TCR de la invención pueden reconocer péptidos con un alto porcentaje de identidad de secuencia que se derivan de otros miembros de la familia MAGE, incluyendo MAGE-A8 y MAGE-B2 y que se presentan en el contexto de HLA A*02. El reconocimiento de dichos péptidos por parte de los TCR de la invención puede ser de un nivel similar o inferior al reconocimiento del complejo de GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) y HLA-A*02.

Ciertos TCR de la invención pueden tener un perfil de seguridad ideal para su uso como reactivos terapéuticos. En este caso, los TCR pueden estar en forma soluble y pueden estar preferiblemente fusionados a un efector inmunológico. Un perfil de seguridad ideal significa que, además de demostrar una buena especificidad, los TCR de la invención pueden haber superado otras pruebas preclínicas de seguridad. Los ejemplos de estas pruebas incluyen ensayos de sangre total para confirmar la liberación mínima de citoquinas en presencia de sangre total y, por tanto, el bajo riesgo de causar un síndrome de liberación de citoquinas potencial in vivo, y las pruebas de alorreactividad para confirmar el bajo potencial de reconocimiento de tipos alternativos de HLA.

Ciertos TCR solubles de la invención pueden ser susceptibles de una purificación de alto rendimiento. Un alto rendimiento significa más del 1 %, o más preferiblemente más del 10 % o un rendimiento superior.

Los TCR de la invención pueden tener una Kd para el complejo de GVYDGREHTV-HLA-A*02 de más (es decir, más fuerte que) 200 pM, por ejemplo entre 1 pM y 200 pM. Algunos TCR de la invención pueden tener una Kd para el complejo de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 400 nM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 200 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 pM. Algunos TCR de la invención pueden tener una Kd para el complejo de aproximadamente 20-80 pM. Los TCR de la invención pueden tener una semivida de unión (T1^ ) para el complejo en el intervalo de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 60 h, de 1 minuto a aproximadamente 60 h, de aproximadamente 20 min a aproximadamente 50 h, o de aproximadamente 2 h a aproximadamente 35 h. Ciertos TCR de la invención pueden tener una T1^ para el complejo de aproximadamente 8 h a 35 h. Los TCR que son para su uso como productos terapéuticos y/o de diagnóstico solubles cuando están acoplados a un marcador detectable o agente terapéutico tienen preferiblemente una Kd para el complejo de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 pM, o de aproximadamente 20 pM a aproximadamente 80 pM y/o una semivida de unión para el complejo de aproximadamente 2 h a 60 h, o de aproximadamente 8 h a aproximadamente 35 h. Ciertos TCR de la invención pueden ser adecuados para aplicaciones de terapia adoptiva; dichos TCR pueden tener una Kd para el complejo de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 200 pM, o de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 pM y/o una semivida de unión para el complejo de aproximadamente 3 seg a aproximadamente 12 min.

Ciertos TCR preferidos son capaces de generar una respuesta de células T altamente potente in vitro contra células positivas al antígeno, en particular aquellas células que presentan bajos niveles de antígeno típicos de las células cancerosas (es decir, aproximadamente 50 antígenos por célula (Bossi et al. (2013), Oncoimmunol., 1, 2(11):e26840; Purbhoo et al. (2006). J. Immunol., 176(12): 7308-7316). Dichos TCR pueden estar en forma soluble y unidos a un efector inmunológico, tal como un anticuerpo anti-CD3. La respuesta de las células T que se mide puede ser la liberación de marcadores de activación de las células T, tales como el interferón y o la granzima B, o la eliminación de células u otra medida de activación de las células T. Preferiblemente, una respuesta altamente potente es aquella con un valor de CE⁵⁰en el intervalo de pM, por ejemplo 100 pM o inferior.

Ciertos TCR preferidos de la invención tienen una afinidad de unión y/o una semivida de unión para el complejo de GVYDGREHTV-HLA-A*02 sustancialmente mayor que la del TCR nativo. El aumento de la afinidad de unión de un TCR nativo suele reducir la especificidad del TCR por su ligando de péptido-MHC, y esto se demuestra en Zhao et al. (2007), J. Immunol., 179:9, 5845-5854. Sin embargo, estos TCR de la invención siguen siendo específicos para el complejo de GVYDGREHTV-HLA-A*02, a pesar de tener una afinidad de unión sustancialmente mayor que el TCR nativo.

La afinidad de unión (inversamente proporcional a la constante de equilibrio Kd) y la semivida de unión (expresada como T1^ ) pueden determinarse utilizando la resonancia de plasmón de superficie (BIAcore) y/o el método Octet del ejemplo 3 del presente documento. Se apreciará que al duplicar la afinidad de un TCR se reduce a la mitad la KD. La T1^ se calcula como In2 dividido por la constante de disociación (koff). Por lo tanto, la duplicación de T ^ resulta en una reducción a la mitad de la koff. Los valores de KD y koff para los TCR se miden normalmente para las formas solubles del TCR, es decir, aquellas formas que están truncadas para eliminar los restos del dominio citoplasmático y transmembrana. Preferiblemente, la afinidad de unión o la semivida de unión de un TCR dado se mide varias veces, por ejemplo 3 o más veces, utilizando el mismo protocolo de ensayo, y se toma una media de los resultados.

Para su uso como agente de transporte dirigido para el transporte de agentes terapéuticos a la célula presentadora de antígenos, el TCR puede estar en forma soluble (es decir, sin dominios transmembrana ni citoplásmicos). Para la estabilidad, los TCR de la invención, y preferiblemente los TCR ap heterodiméricos solubles, pueden tener un enlace disulfuro introducido entre los restos de los respectivos dominios constantes, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 03/020763. Uno o ambos dominios constantes extracelulares presentes en un heterodímero ap de la invención pueden estar truncados en el terminal C o en los terminales C, por ejemplo hasta 15, o hasta 10 o hasta 8 o menos aminoácidos. El extremo C terminal del dominio constante extracelular de la cadena alfa puede estar truncado en 8 aminoácidos. Uno o ambos dominios constantes extracelulares pueden contener una o más mutaciones. La constante extracelular de la cadena alfa puede tener un resto asparagina (N) o lisina (K) en la posición 4 debido a un polimorfismo natural. Para su uso en la terapia adoptiva, un TCR heterodimérico ap puede, por ejemplo, transfectarse como cadenas de longitud completa que tienen dominios citoplasmáticos y transmembrana. Los TCR para su uso en la terapia adoptiva pueden contener un enlace disulfuro correspondiente al que se encuentra en la naturaleza entre los respectivos dominios constantes alfa y beta, y además, o como alternativa, puede estar presente un enlace disulfuro no nativo.

Los TCR de la invención pueden ser heterodímeros ap. Los TCR de la invención pueden estar en formato monocatenario. Los formatos monocatenarios única incluyen, entre otros, los polipéptidos de TCR ap de los tipos Va-L-Vp, Vp-L-Va, Va-Ca-L-Vp, Va-L-Vp-Cp o Va-Va-L-Vp-Cp, en los que Va y Vp son regiones variables de a y p del TCR, respectivamente, Ca y Cp son regiones constantes de a y p del TCR, respectivamente, y L es una secuencia conectora (Weidanz et al. (1998), J. Immunol. Methods., 1 de diciembre, 221(1-2):59-76; Epel et al. (2002), Cancer Immunol. Immunother., noviembre, 51(10):565-573; documento WO 2004/033685; documento WO9918129). Uno o ambos dominios constantes pueden ser de longitud completa, o pueden estar truncados como se ha descrito anteriormente y/o contener mutaciones. La constante extracelular de la cadena alfa puede tener un resto asparagina (N) o lisina (K) en la posición 4 debido a un polimorfismo natural. En ciertas realizaciones, los TCR monocatenarios de la invención pueden tener un enlace disulfuro introducido entre los restos de los respectivos dominios constantes, como se describe en el documento WO 2004/033685. Los TCR monocatenarios se describen además en el documento WO2004/033685; documento WO98/39482; documento WO01/62908; Weidanz et al. (1998), J. Immunol. Methods, 221(1-2): 59-76; Hoo et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(10): 4759-4763; Schodin (1996), Mol. Immunol., 33(9): 819-829).

Como será obvio para los expertos en la materia, puede ser posible truncar las secuencias proporcionadas en el C-terminal y/o N-terminal de las mismas en 1, 2, 3, 4, 5 o más restos, sin afectar sustancialmente a las características de unión del TCR.

Los TCR heterodiméricos alfa-beta de la invención suelen comprender una secuencia de dominio constante TRAC de cadena alfa y/o una secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2 de cadena beta. Las secuencias del dominio constante de las cadenas alfa y beta pueden modificarse por truncamiento o sustitución para delecionar el enlace disulfuro nativo entre Cys4 del exón 2 de TRAC y Cys2 del exón 2 de TRBC1 o TRBC2. Las secuencias del dominio constante de la cadena alfa y/o beta pueden ser modificadas mediante la sustitución de restos cisteína por Thr 48 de TRAC y Ser 57 de TRBC1 o TRBC2, formando dichas cisteínas un enlace disulfuro entre los dominios constantes alfa y beta del TCR. TRBC1 o TRBC2 pueden incluir además una mutación de cisteína a alanina en la posición 75 del dominio constante y una mutación de asparagina a ácido aspártico en la posición 89 del dominio constante. El dominio constante puede contener además, o como alternativa, otras mutaciones, sustituciones o deleciones en relación con las secuencias nativas TRAC y/o TRBC1/2. El término TRAC y TRBC1/2 engloba las variantes polimorfas naturales, por ejemplo N a K en la posición 4 de TRAC (Bragado et al., Int. Immunol., febrero de 1994, 6(2):223-230).

También se divulgan en el presente documentos variantes, fragmentos y derivados de los TCR proporcionados por la invención.

Se divulgan en el presente documento partículas que presentan los TCR de la invención y la inclusión de dichas partículas dentro de una biblioteca de partículas. Dichas partículas incluyen, pero no se limitan a fagos, ribosomas de levadura o células de mamíferos. Los métodos de producción de tales partículas y bibliotecas son conocidos en la técnica (por ejemplo, véase el documento WO2004/044004; documento WO01/48145; Chervin et al. (2008), J. Immuno. Methods, 339.2: 175-184).

En otro aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica una cadena alfa de TCR y una cadena beta de TCR del TCR de la invención y/o la molécula de fusión de TCR-anti-CD3 de la invención.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ADNc. El ácido nucleico puede ser de origen no natural y/o estar purificado y/o diseñado. La secuencia del ácido nucleico puede estar optimizada en cuanto a codones, según el sistema de expresión utilizado.

En otro aspecto, la invención proporciona un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de la invención.

La invención también proporciona una célula que porta (a) un vector de expresión de la invención, que codifica las cadenas alfa y beta en un único marco de lectura abierto, o dos marcos de lectura abiertos distintos, o (b) un primer vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena alfa de un TCR de la invención, y un segundo vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena beta de un TCR de la invención. Estas células son especialmente útiles en la terapia adoptiva. Las células de la invención pueden ser aisladas y/o recombinantes y/o de origen no natural y/o estar modificadas.

Dado que los TCR de la invención tienen utilidad en la terapia adoptiva, la invención incluye una célula no natural y/o purificada y/o modificada, especialmente una célula T, que presenta un TCR de la invención. La invención también proporciona una población expandida de células T que presentan un TCR de la invención. Existen varios métodos adecuados para la transfección de células T con un ácido nucleico (tal como ADN, ADNc o ARN) que codifica los TCR de la invención (véase, por ejemplo, Robbins et al. (2008), J. Immunol., 180: 6116-6131). Las células T que expresan los TCR de la invención serán adecuadas para su uso en el tratamiento del cáncer basado en la terapia adoptiva. Como sabrán los expertos en la materia, existen varios métodos adecuados para llevar a cabo la terapia adoptiva (véase, por ejemplo, Rosenberg et al. (2008), Nat. Rev. Cancer, 8(4): 299-308).

Los TCR solubles de la invención son útiles para transportar marcadores detectables o agentes terapéuticos a las células presentadoras de antígenos y a los tejidos que contienen células presentadoras de antígenos. Por lo tanto, pueden estar asociados (covalentemente o de otra manera) con un marcador detectable (para fines de diagnóstico en el que el TCR se utiliza para detectar la presencia de células que presentan el complejo de GVYDGREHTV-HLA-A*02); un agente terapéutico; o un resto modificador de PK.

Entre los ejemplos de restos modificadores de PK se encuentran, entre otros, el PEG (Dozier et al. (2015), Int. J. Mol. Sci., 28 de octubre, 16(10):25831-25864; y Jevsevar et al. (2010), Biotechnol J., enero, 5(1):113-128), la PASilación (Schlapschy et al. (2013), Protein Eng. Des. Sel., agosto, 26(8):489-501), la albúmina (Dennis et al. (2002), J. Biol. Chem., 20 de septiembre, 277(38):35035-35043) y/o polipéptidos no estructurados (Schellenberger et al. (2009), Nat. Biotechnol., diciembre, 27(12):1186-1190).

Los marcadores detectables con fines de diagnóstico incluyen, por ejemplo, marcadores fluorescentes, radiomarcadores, enzimas, sondas de ácido nucleico y reactivos de contraste.

Los agentes terapéuticos que pueden asociarse a los TCR de la invención incluyen inmunomoduladores, compuestos radiactivos, enzimas (perforina, por ejemplo) o agentes quimioterapéuticos (cisplatino, por ejemplo). Para asegurar que los efectos tóxicos se ejercen en el lugar deseado, la toxina podría estar dentro de un liposoma unido al TCR para que el compuesto se libere lentamente. Esto evitará los efectos perjudiciales durante el transporte en el cuerpo y garantizará que la toxina tenga el máximo efecto después de la unión del TCR a las células presentadoras de antígenos pertinentes.

Otros agentes terapéuticos adecuados son:

• agentes citotóxicos de molécula pequeña, es decir, compuestos con capacidad para matar células de mamíferos que tienen un peso molecular inferior a 700 daltons. Estos compuestos también podrían contener metales tóxicos capaces de tener un efecto citotóxico. Además, debe entenderse que estos agentes citotóxicos de molécula pequeña también incluyen profármacos, es decir, compuestos que se descomponen o se convierten en condiciones fisiológicas para liberar agentes citotóxicos. Los ejemplos de estos agentes son cisplatino, derivados de la maytansina, raquelmicina, caliqueamicina, docetaxel, etopósido, gemcitabina, ifosfamida, irinotecán, melfalán, mitoxantrona, sorfimer sódico-fotofrina II, temozolomida, topotecán, trimetreato 27arbur27ato, auristatina E, vincristina y doxorubicina;

• citotoxinas peptídicas, es decir, proteínas o fragmentos de las mismas con capacidad para matar células de mamíferos. Por ejemplo, la ricina, la toxina diftérica, la exotoxina bacteriana A de pseudomonas, la Dnasa y la Rnasa;

• radionúclidos, es decir, los isótopos inestables de los elementos que se descomponen con la emisión simultánea de una o varias partículas a o p, o de rayos y. Por ejemplo, yodo 131, renio 186, indio 111, itrio 90, bismuto 210 y 213, actinio 225 y astatina 213; pueden utilizarse agentes quelantes para facilitar la asociación de estos radionúclidos a los TCR de alta afinidad, o a sus multímeros;

• inmunoestimulantes, es decir, moléculas efectoras inmunitarias que estimulan la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, citoquinas, tales como IL-2 y IFN-y,

• superantígenos y sus mutantes;

• fusiones de TCR-HLA, por ejemplo, fusión a un complejo de péptido-HLA, en el que dicho péptido se deriva de un patógeno humano común, tal como el virus de Epstein Barr (VEB);

• quimioquinas, tales como IL-8, factor 4 plaquetario, proteína estimuladora del crecimiento del melanoma, etc.;

• anticuerpos o fragmentos de los mismos, incluyendo anticuerpos determinantes anticélulas T o células NK (por ejemplo, anti-CD3, anti-CD28 o anti-CD16);

• andamiajes proteicos alternativos con características de unión similares a las de los anticuerpos;

• activadores del complemento;

• dominios de proteína xenogénicos, dominios de proteína alogénicos, dominios de proteína virales/bacterianos, péptidos virales/bacterianos.

Una realización preferida es la proporcionada por un TCR de la invención asociado (normalmente por fusión a un extremo terminal N o C de la cadena alfa o beta) con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento funcional o variante de dicho anticuerpo anti-CD3 (tales fusiones de TCR-anti-CD3 pueden denominarse moléculas ImmTAC™). Tal y como se utiliza aquí, el término "anticuerpo" engloba dichos fragmentos y variantes. Los ejemplos de anticuerpos anti-CD3 incluyen, entre otros, OKT3, UCHT-1, BMA-031 y 12F6. Los fragmentos y variantes/análogos de anticuerpos que son adecuados para su uso en las composiciones y métodos aquí descritos incluyen minicuerpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')², fragmentos dsFv y scFv, Nanobodies™ (estas construcciones, comercializadas por Ablynx (Bélgica), comprenden un dominio pesado variable de inmunoglobulina sintética derivado de un camélido (por ejemplo camélido (por ejemplo, camello o llama) y Domain Antibodies (Domantis (Bélgica), que comprenden un dominio pesado variable de inmunoglobulina o un dominio ligero variable de inmunoglobulina madurado por afinidad) o andamiajes proteicos alternativos que presentan características de unión similares a las de los anticuerpos, como Affibodies (Affibody (Suecia), que comprende un andamiaje de proteína A diseñado) o Anticalins (Pieris (Alemania)), que comprende anticalinas diseñadas), por nombrar solo algunos.

La unión del TCR y el anticuerpo anti-CD3 puede ser mediante una unión covalente o no covalente. La unión covalente puede ser directa o indirecta a través de una secuencia conectora. Las secuencias conectoras suelen ser flexibles, ya que están formadas principalmente por aminoácidos como la glicina, la alanina y la serina, que no tienen cadenas laterales voluminosas que puedan restringir la flexibilidad. Las longitudes utilizables u óptimas de las secuencias conectoras se determinan fácilmente. A menudo, la secuencia conectora será inferior a aproximadamente 12, por ejemplo menos de 10, o de 2 a 10 aminoácidos de longitud. Los conectores adecuados que pueden utilizarse en los TCR de la invención incluyen, pero no se limitan a: GGGGS (SEQ ID NO: 30), GGGSG (SEQ ID NO: 31), GGSGG (SEQ ID NO: 32), GSGGG (SEQ ID NO: 33), GSGGGP (SEQ ID NO: 34), GGEPS (SEQ ID NO: 35), GGEGGGP (SEQ ID NO: 36), y GGEGGGSEGGGS (SEQ ID NO: 37) (como se describe en el documento WO2010/133828).

A continuación se proporcionan ciertas realizaciones preferidas de construcciones de fusión de anti-CD3-TCR de la invención:

Tabla 7

Cada conector de las SEQ ID NO: 30-37 pueden utilizarse con cada una o cualquiera de las realizaciones preferidas de las construcciones de fusión de CD3-TCR. Por ejemplo, una fusión de TCR-CD3 que comprende la cadena alfa de SEQ ID NO: 24 y la cadena beta de SEQ ID NO: 29, en el que la cadena beta se fusiona con un scFv anti-CD3 a través de un conector de cualquiera de las SEQ ID NO: 31-37 se incluye en la invención.

Para algunos propósitos, los TCR de la invención pueden ser agregados en un complejo que comprende varios TCR para formar un complejo de TCR multivalente. Hay una serie de proteínas humanas que contienen un dominio de multimerización que puede utilizarse en la producción de complejos de TCR multivalentes. Por ejemplo, el dominio de tetramerización de p53, que se ha utilizado para producir tetrámeros de fragmentos de anticuerpos scFv que mostraron una mayor persistencia en el suero y una constante de disociación significativamente menor en comparación con el fragmento scFv monomérico (Willuda et al. (2001), J. Biol. Chem. 276(17):14385-14392. La hemoglobina también tiene un dominio de tetramerización que podría utilizarse para este tipo de aplicaciones. Un complejo de TCR multivalente de la invención puede tener una capacidad de unión mejorada para el complejo de GVYd Gr EHTV-HLA-A*02 en comparación con un heterodímero no multimérico de tipo salvaje o de receptor de células T de la invención. Dichos complejos de TCR multivalentes según la invención son particularmente útiles para rastrear o dirigirse a células que presentan antígenos particulares in vitro o in vivo, y también son útiles como intermedios para la producción de otros complejos de TCR multivalentes que tienen tales usos.

Como es bien conocido en la técnica, los TCR pueden estar sujetos a modificaciones postraduccionales. La glicosilación es una de estas modificaciones, que comprende la unión covalente de restos oligosacáridos a aminoácidos definidos en la cadena del TCR. Por ejemplo, los restos asparagina o serina/treonina son ubicaciones bien conocidas para la unión de oligosacáridos. El estado de glicosilación de una proteína concreta depende de varios factores, como la secuencia de la proteína, su conformación y la disponibilidad de determinadas enzimas. Además, el estado de glicosilación (es decir, el tipo de oligosacárido, la unión covalente y el número total de uniones) puede influir en la función de las proteínas. Por lo tanto, cuando se producen proteínas recombinantes, a menudo es conveniente controlar la glicosilación. La glicosilación controlada se ha utilizado para mejorar las terapias basadas en anticuerpos (Jefferis et al. (2009), Nat. Rev. Drug Discov., marzo 8(3):226-234). Para los TCR solubles de la invención, la glicosilación puede ser controlada in vivo, utilizando líneas celulares concretas, por ejemplo, o in vitro, por modificación química. Dichas modificaciones son deseables, ya que la glicosilación puede mejorar la farmacocinética, reducir la inmunogenicidad y asemejarse más a una proteína humana nativa (Sinclair y Elliott (2005), Pharm. Sci., agosto, 94(8):1626-1635).

Para su administración a los pacientes, los TCR de la invención (preferiblemente asociados a un marcador detectable o a un agente terapéutico o expresados en una célula T transfectada), las moléculas de fusión de TCR-anti CD3, los ácidos nucleicos, los vectores de expresión o las células de la invención pueden proporcionarse en una composición farmacéutica junto con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. Los TCR terapéuticos o de formación de imágenes, o las células, según la invención, se suministrarán normalmente como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluirá un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición farmacéutica puede estar en cualquier forma adecuada (dependiendo del método deseado para administrarla a un paciente). Puede suministrarse en una forma de dosificación unitaria, generalmente se suministrará en un recipiente sellado y puede ser suministrada como parte de un kit. Normalmente (aunque no necesariamente) un kit de este tipo incluye instrucciones de uso. Puede incluir una pluralidad de dichas formas de dosificación unitarias.

La composición farmacéutica puede adaptarse para su administración por cualquier vía apropiada, tal como la vía parenteral (incluida subcutánea, intramuscular o intravenosa), enteral (incluida oral o rectal), inhalatoria o intranasal. Dichas composiciones pueden prepararse por cualquier método conocido en el arte de la farmacia, por ejemplo, mezclando el ingrediente activo con los vehículos o excipientes en condiciones estériles.

Las dosificaciones de las sustancias de la presente invención pueden variar entre amplios límites, dependiendo de la enfermedad o el trastorno a tratar, la edad y condición del individuo a tratar, etc., y un intervalo de dosis adecuado para un TCR soluble de la invención asociado a un anticuerpo anti-CD3 puede estar entre 25 ng/kg y 50 pg/kg. Un médico determinará en última instancia las dosis adecuadas que se deben utilizar.

Los TCR, las composiciones farmacéuticas, los vectores, los ácidos nucleicos y las células de la invención pueden proporcionarse en forma sustancialmente pura, por ejemplo, con al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de pureza.

La invención también proporciona un TCR, una molécula de fusión de TCR-anti-CD3, un ácido nucleico, una composición farmacéutica y/o una célula de la invención para su uso en un medicamento, preferiblemente para su uso en un método de tratamiento del cáncer o de un tumor. Se divulga en el presente documento una formulación inyectable para administrar a un sujeto humano que comprende un TCR, una molécula de fusión de TCR-anti-CD3, un ácido nucleico, una composición farmacéutica o una célula de la invención.

El cáncer puede ser de mama, esófago, cabeza y cuello, pulmón, ovario o vejiga. El tumor puede expresar MAGE A4 y/o puede ser un tumor sólido. El TCR, la molécula de fusión de TCR-anti-CD3, el ácido nucleico, la composición farmacéutica o la célula de la invención pueden administrarse por inyección, tal como una inyección intravenosa o una inyección intratumoral directa. El sujeto humano puede ser del subtipo HLA-A*02.

La invención también proporciona un método para producir un TCR o una molécula de fusión de TCR-anti-CD3 de la invención, que comprende a) mantener una célula de la invención en condiciones óptimas para la expresión del ácido de las cadenas TCR y b) aislar las cadenas TCR.

Las características preferidas de cada aspecto de la invención son las mismas que para cada uno de los otros aspectos mutatis mutandis.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 - proporciona la secuencia de aminoácidos de las regiones extracelulares de una cadena alfa y beta del TCR MAGE A4 nativo.

Figura 2 - proporciona la secuencia de aminoácidos de las regiones extracelulares de una cadena alfa y beta del TCR MAGE A4 soluble nativo.

Figura 3 - proporciona ejemplos de secuencias de aminoácidos de regiones variables de la cadena alfa del TCR MAGE A4 mutadas.

Figura 4 - proporciona ejemplos de secuencias de aminoácidos de regiones variables de la cadena beta del TCR MAGE A4 mutado.

Figura 5 - proporciona ejemplos de secuencias de aminoácidos de la cadena alfa de las moléculas de fusión del TCR MAGE A4-anti-CD3.

Figura 6 - proporciona ejemplos de secuencias de aminoácidos de la cadena beta de las moléculas de fusión del TCR MAGE A4-anti-CD3.

Figura 7 - proporciona datos celulares que demuestran la potencia y especificidad de las moléculas de fusión del TCR MAGE A4-anti-CD3.

Figura 8 - proporciona datos celulares que demuestran la potencia y especificidad de otras moléculas de fusión del TCR MAGE A4-anti-CD3.

Figura 9 - proporciona más pruebas de la especificidad de las moléculas de fusión del TCR MAGE A4-anti-CD3.

Figura 10 - proporciona más datos sobre la especificidad de las moléculas de fusión del TCR MAGE A4-anti-CD3.

Figura 11 - proporciona pruebas de que las moléculas de fusión del TCR MAGE A4-anti-CD3 conducen a la eliminación de las células cancerosas

La invención se describe además en los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Expresión, replegamiento y purificación de TCR solubles

Método

Las secuencias de ADN que codifican las regiones extracelulares alfa y beta de los TCR solubles de la invención se clonaron por separado en plásmidos de expresión basados en pGMT7 utilizando métodos convencionales (como se describe en Sambrook, et al., Molecular cloning, vol. 2 (1989), Nueva York, Cold Spring Harbour Laboratory Press). Los plásmidos de expresión se transformaron por separado en la cepa de E. coli Rosetta (BL21pLysS), y se cultivaron colonias individuales resistentes a la ampicilina a 37 °C en medio TYP (+ ampicilina 100 pg/ml) hasta alcanzar una DO⁶⁰⁰de aproximadamente 0,6-0,8 antes de inducir la expresión de la proteína con 0,5 mM de IPTG. Las células se recolectaron tres horas después de la inducción mediante centrifugación. Los sedimentos celulares se lisaron con el reactivo de extracción de proteínas BugBuster (Merck Millipore) según las instrucciones del fabricante. Los sedimentos de los cuerpos de inclusión se recuperaron por centrifugación. Los sedimentos se lavaron dos veces en tampón Tritón (Tris-HCl 50 mM, pH 8,1, Triton-X100 al 0,5 %, NaCl 100 mM, NaEDTA 10 mM) y finalmente se resuspendieron en tampón sin detergente (Tris-HCl 50 mM, pH 8,1, NaCI 100 mM, NaEDTA 10 mM). El rendimiento de la proteína de los cuerpos de inclusión se cuantificó solubilizando con guanidina-HCl 6 M y midiendo la DO²⁸⁰. A continuación se calculó la concentración de proteínas mediante el coeficiente de extinción. La pureza de los cuerpos de inclusión se midió solubilizándolos con urea 8 M y cargando aproximadamente 2|jg en SDS al 4-20 %-PAGE en condiciones reductoras. A continuación se estimó o calculó la pureza mediante un programa informático de densitometría (Chemidoc, Biorad). Los cuerpos de inclusión se almacenaron a 4 °C para el almacenamiento a corto plazo y a -20 °C o -70 °C para el almacenamiento a largo plazo.

Para el replegamiento del TCR soluble, los cuerpos de inclusión que contenían cadenas a y p se mezclaron primero y se diluyeron en 10 ml de tampón de solubilización/desnaturalización (clorhidrato de guanidina 6 M, Tris HCI 50 mM, pH 8,1, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, DTT 20 mM), seguido de una incubación durante 30 minutos a 37 °C. A continuación, se inició el replegamiento mediante una nueva dilución en 1 L de tampón de replegamiento (Tris 100 mM, pH 8,1, L-arginina Hcl 400 mM, EDTA 2 mM, urea 4 M, clorhidrato de cisteamina 10 mM y dihidrocloruro de cistamina 2,5 mM) y se mezcló bien la disolución. La mezcla replegada se dializó contra 10 L de H²O durante 18-20 horas a 5 °C ± 3 °C. Transcurrido este tiempo, el tampón de diálisis se sustituyó dos veces por Tris 10 mM de pH 8,1 (10 L) y la diálisis continuó durante otras 15 horas. A continuación, la mezcla replegada se filtró a través de filtros de celulosa de 0,45 jm .

La purificación de los TCR solubles se inició aplicando el replegamiento dializado a una columna de intercambio aniónico POROS® 50HQ y eluyendo la proteína unida con un gradiente de NaCl 0-500 mM en Tris 20 mM, pH 8,1, a lo largo de 50 volúmenes de columna utilizando un purificador Akta® (GE Healthcare). Los picos de las fracciones de TCR se identificaron mediante SDS PAGE antes de ser agrupados y concentrados. A continuación, la muestra concentrada se aplicó a una columna de filtración en gel Superdex® 75HR (GE Healthcare) preequilibrada en tampón PBS de Dulbecco. Las fracciones del pico TCR se agruparon y concentraron y se calculó el rendimiento final del material purificado.

Ejemplo 2: Expresión, replegamiento y purificación de moléculas ImmTAC (moléculas de fusión de TCR-anti CD3 solubles)

Método

La preparación de ImmTAC se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 1, excepto que la cadena beta del TCR se fusionó mediante un conector con un anticuerpo monocatenario anti-CD3. Además, se realizó una etapa de intercambio catiónico durante la purificación tras el intercambio aniónico. En este caso, las fracciones de pico del intercambio aniónico se diluyeron 20 veces en MES 20 mM (pH 6,5), y se aplicaron a una columna de intercambio catiónico POROS® 50HS. La proteína unida se eluyó con un gradiente de NaCl 0-500 mM en MES 20 mM. Las fracciones de ImmTAC de los picos se agruparon y se ajustaron a Tris 50 mM, pH 8,1, antes de ser concentradas y aplicadas directamente a la matriz de filtración en gel como se describe en el ejemplo 1.

Ejemplo 3: Caracterización de la unión

El análisis de la unión de los TCR solubles purificados y de las moléculas ImmTAC al complejo de péptido-HLA correspondiente se llevó a cabo mediante resonancia de plasmón de superficie, utilizando un instrumento BIAcore 3000 o BIAcore T200, o mediante interferometría de biocapa, utilizando un instrumento ForteBio Octet. Las moléculas de HLA-A*02 de clase I biotiniladas se volvieron a plegar con el péptido de interés y se purificaron utilizando métodos conocidos por los expertos en la materia (O'Callaghan et al. (1999), Anal. Biochem., 266(1): 9-15; Garboczi, et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89(8): 3429-3433). Todas las mediciones se realizaron a 25 °C en tampón PBS de Dulbecco, complementado con P20 al 0,005 %.

Método BIAcore

Los monómeros de péptidos-HLA biotinilados se inmovilizaron en chips sensores CM-5 acoplados a estreptavidina. Las constantes de unión en el equilibrio se determinaron utilizando diluciones seriadas de TCR soluble/ImmTAC inyectadas a un caudal constante de 30 j l min'1 sobre una celda de flujo recubierta con aproximadamente 200 unidades de respuesta (RU) del complejo de péptido-HLA-A*02. Las respuestas en el equilibrio se normalizaron para cada concentración de TCR restando la respuesta del tampón en masa en una celda de flujo de control que contenía un péptido-HLA pertinente. El valor de Kd se obtuvo mediante un ajuste de la curva no lineal utilizando el software Prism y la isoterma de unión de Langmuir, unido = C*Max/(C KD), en la que "unido" es la unión en el equilibrio en RU a la concentración de TCR inyectada C, y Max es la unión máxima.

Para las interacciones de alta afinidad, los parámetros de unión se determinaron mediante un análisis cinético de ciclo único. Se inyectaron cinco concentraciones diferentes de TCR/ImmTAC soluble sobre una celda de flujo recubierta con aproximadamente 100 -200 RU de complejo de péptido-HLA utilizando un caudal de 50-60 j l min-1. Normalmente, se inyectaron 60-120 j l de TCR/ImmTAC soluble a una concentración máxima de 100-200 nM, y se utilizaron diluciones sucesivas en 2 veces para las otras cuatro inyecciones. Se inyectó primero la concentración más baja. Para medir la fase de disociación se inyectó entonces tampón hasta que se produjo una disociación del >10 %, normalmente después de 1 a 3 horas. Los parámetros cinéticos se calcularon con el software BIAevaluation®. La fase de disociación se ajustó a una ecuación de descomposición exponencial única que permite calcular la semivida. La constante de equilibrio Kd se calculó a partir de koff/kon.

Método Octet

Se capturaron monómeros de péptido-HLA biotinilados sobre 1 nm en biosensores de estreptavidina (SA) (Pall ForteBio) preinmovilizados con estreptavidina. Los sensores se bloquearon con biotina libre (2 j M) durante 2 minutos. Las constantes de unión en el equilibrio se determinaron sumergiendo los biosensores cargados en TCR/ImmTAC soluble diluido en serie en una placa de muestras de 96 o 384 pocillos. La agitación de la placa se ajustó a 1000 rpm. Para las interacciones de baja afinidad (intervalo de j M) se utilizó una asociación corta (aproximadamente 2 minutos) y un tiempo de disociación corto (aproximadamente 2 minutos). Las curvas de unión se procesaron mediante la sustracción de doble referencia de los biosensores de referencia cargados con pHLA no pertinente utilizando el software de análisis de datos Octet (Pall ForteBio). Se usaron las respuestas (nm) en equilibrio para calcular el valor de Kd a partir de gráficos de estado estacionario ajustados a la ecuación Respuesta = Rmax*conc/(KD conc), en la que "respuesta" es la unión en equilibrio en nm a cada concentración de TCR (conc) y Rmax es la respuesta de unión máxima a la saturación de pHLA.

Para las interacciones de alta afinidad (intervalo de nM-pM), los parámetros cinéticos se determinaron a partir de curvas de unión a concentraciones > 3 de TCR/ImmTAC típicamente 10 nM, 5 nM y 2,5 nM. El tiempo de asociación fue de 30 minutos y el tiempo de disociación de 1 a 2 horas. Las curvas de unión se procesaron mediante la sustracción de doble referencia de biosensores de referencia cargados con pHLA pertinente y bloqueados con biotina. Los parámetros cinéticos kon y k f se calcularon mediante un ajuste global directo a las curvas de unión utilizando el software de análisis de datos Octet (Pall ForteBio). La Kd se calculó a partir de koff/kon y la semivida de disociación se calculó a partir de t-i^/2= 0,693/koff.

Ejemplo 4: Caracterización de la unión del TCR nativo

Se preparó un TCR nativo soluble según los métodos descritos en el ejemplo 1 y se analizó la unión a pHLA según el ejemplo 3. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas alfa y beta correspondían a las mostradas en la figura 2. Se preparó HLA-A*02 biotinilado soluble con el péptido MAGE A4 GVYDGREh TV y se inmovilizó en un chip sensor BIAcore.

Resultados

Se determinó la unión a varias concentraciones y se determinó que el valor Kd para la interacción era de 142 j M. La reactividad cruzada (especificidad) se evaluó frente a un panel de 15 complejos de péptidos HLA-A*02 no pertinentes utilizando el método de equilibrio BIAcore del ejemplo 3. Los 15 pHLA no pertinentes se agruparon en tres grupos y se cargaron en una de las tres celdas de flujo, para obtener aproximadamente 1000 RU de cada pHLA por celda de flujo. Se inyectaron 20 j l de TCR soluble de tipo salvaje a concentraciones de 73 j M en todas las celdas de flujo a una velocidad de 20 jl/min. No se detectó ninguna unión significativa en ninguna de las dos concentraciones, lo que indica que el TCR nativo es específico para el complejo de GVYDGREHTV-HLA-A*02.

Estos datos indican que este TCR se une a la diana con una afinidad y especificidad adecuadas y, por tanto, proporciona una secuencia de partida útil para los TCR terapéuticos.

Ejemplo 5: Caracterización de la unión de TCR mutados solubles y moléculas ImmTAC de la invención

Se produjeron TCR mutados solubles y moléculas ImmTAC basadas en las secuencias proporcionadas en la figura 2. Las muestras se prepararon como se describe en los ejemplos 1 y 2, y las características de unión se determinaron según el ejemplo 3.

Resultados

Se descubrió que una única mutación puntual de cisteína a valina en la posición 19 de la cadena alfa (SEQ ID NO: 6) mejoraba el replegamiento y el rendimiento de la purificación sin afectar a la afinidad o la especificidad (la Kd se registró como 145 j M y no se observó ninguna reacción cruzada con el mismo panel de 15 complejos de péptido-HLA alternativos que se analizaron con el WT).

Se identificaron cadenas alfa y/o beta de TCR que contenían mutaciones en al menos una región CDR en relación con las secuencias CDR mostradas en la figura 2 (SEQ ID NO: 4 y 5). Estas secuencias de TCR reconocieron el complejo de GVYDGREHTV y HLA-A*02 con una afinidad y/o una semivida especialmente adecuadas. En algunos casos, se identificaron otras mutaciones que mejoraban la estabilidad y/o el rendimiento del TCR, incluida la mutación de la cadena alfa K1A (con referencia a la numeración de SEQ ID NO: 4). Las secuencias de aminoácidos de ciertas regiones variables mutadas de la cadena alfa y beta de TCR de la invención se proporcionan en las figuras 4 y 5 respectivamente. La siguiente tabla proporciona las características de unión de los TCR solubles o de las moléculas ImmTAC (moléculas de fusión de Tc R y anti-CD3 solubles) que comprenden las regiones variables alfa y beta indicadas.

Tabla 9

Se analizaron otras combinaciones de regiones variables alfa y beta que contenían mutaciones de la invención para la unión al complejo de GVYDGREHTV y HLA-A*02. Los datos que se presentan en la tabla siguiente se obtuvieron utilizando Biacore, como se ha descrito anteriormente. Las secuencias de dominio variable alfa y beta indicadas se prepararon como moléculas ImmTAC. Las siguientes combinaciones de los respectivos dominios variables de las cadenas alfa y beta no están dentro del alcance de la invención: (i) SEQ ID NO:62; y SEQ ID NO:5; (ii) SEQ ID NO:63; y SEQ ID NO:5; (iii) SEQ ID NO:64; y SEQ ID NO:5; (iv) SEQ ID NO:61; y SEQ ID NO:80; y (v) SEQ ID NO:61; y SEQ ID NO:81.

Tabla 10

Los datos presentados en las tablas 9 y 10 indican que ciertas secuencias variables de TCR de la invención tienen una alta afinidad de unión y una larga semivida para el complejo de GVYDGREHTV y HLA-A*02, y por lo tanto son particularmente adecuadas para su uso como reactivos terapéuticos solubles.

Además de la unión al complejo de GVYDGREHTV y HLA-A*02 cognado, también se evaluó la unión de los TCR de la invención a péptidos similares derivados de MAGE A8 y MAGE B2 y presentados por HLA-A*02. Los números de la tabla siguiente proporcionan los datos de unión de Biacore para tres moléculas ImmTAC que comprenden las secuencias de dominio variable alfa y beta indicadas. Las tres moléculas ImmTAC reconocen el péptido MAGE-A8 a un nivel similar al del péptido cognado y el péptido MAGE-B2 a un nivel más débil.

Tabla 11

Ejemplo 6: Redirección potente y específica de células T mediante moléculas ImmTAC

Las moléculas ImmTAC que contienen secuencias de cadena variable alfa y beta mutadas con una afinidad particularmente alta por el antígeno diana se analizaron para comprobar su capacidad de mediar en la redirección potente y específica de las células T CD3+ mediante el ensayo ELISPOT, utilizando la secreción de interferón-Y (IFN-Y) como lectura de la activación de las células T.

En este ejemplo, la secuencia de la región variable de la cadena alfa se seleccionó entre las SEQ ID NO: 20-24, y la secuencia de la región variable de la cadena beta se seleccionó entre las SEQ ID NO: 26-29. Las secuencias del dominio variable se fusionaron con las respectivas secuencias del dominio constante extracelular alfa o beta y contenían un enlace disulfuro no nativo. En cada caso, la cadena beta se fusionó a través de un conector con un scFv anti-CD3; el conector se seleccionó entre las SEQ ID NO: 30-37. Las secuencias completas de las moléculas ImmTAC ensayadas vienen dadas por las SEQ ID NO establecidas en la siguiente tabla:

Tabla 12

Métodos

Los ensayos se realizaron utilizando un kit ELISPOT de IFN-y humano (BD Biosciences). Las células diana se prepararon a una densidad de 1*106/ml en un medio de ensayo (RPMI 1640 que contenía FBS inactivado por calor al 10 % y penicilina-estreptomicina-L-glutamina al 1 %) y se cultivaron a 50.000 células por pocillo en un volumen de 50 |jl. Se utilizaron células mononucleares de sangre periférica ("peripheral blood mononuclear cells", PBMC), aisladas de sangre fresca de donantes, como células efectoras y se cultivaron entre 10.000 y 50.000 células por pocillo en un volumen de 50 j l (el número exacto de células utilizadas para cada experimento depende del donante y puede ajustarse para producir una respuesta dentro de un intervalo adecuado para el ensayo). Se utilizaron distintas concentraciones de ImmTAC, que abarcaban el intervalo clínicamente pertinente previsto, y se añadieron al pocillo en un volumen de 50 jl.

Las placas se prepararon según las instrucciones del fabricante. Las células diana, las células efectoras y las moléculas ImmTAC se añadieron a los pocillos correspondientes y se completaron hasta un volumen final de 200 j l con medio de ensayo. Todas las reacciones se realizaron por triplicado. También se prepararon pocilios de control con la omisión de ImmTAC, células efectoras o células diana. A continuación, las placas se incubaron durante la noche (37 °C/5% de CO²). Al día siguiente, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado (1xsobre de PBS, que contiene P20 al 0,05 %, preparado en agua desionizada). A continuación, se añadió el anticuerpo primario de detección a cada pocillo en un volumen de 50 pl. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas antes de ser lavadas de nuevo tres veces. La detección secundaria se realizó añadiendo 50 pl de estreptavidina-HRP diluida a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora y se repitió la etapa de lavado. No más de 15 minutos antes de su uso, se añadió una gota (20 pl) de cromógeno AEC a cada 1 ml de sustrato AEC, se mezcló y se añadieron 50 pl a cada pocillo. El desarrollo de las manchas se controló regularmente y las placas se lavaron con agua del grifo para terminar la reacción de desarrollo. A continuación, se dejaron secar las placas a temperatura ambiente durante al menos 2 horas antes de realizar el recuento de las manchas mediante un analizador CTL con el software Immunospot (Cellular Technology Limited).

Resultados

Los datos presentados en las figuras 7 y 8, paneles superiores, demuestran que las moléculas ImmTAC 1-2 y 3-5, respectivamente, son capaces de mediar una potente (es decir, una CE⁵⁰inferior a 100 pM) redirección de células T contra las células cancerosas que expresan el antígeno diana (NCI-H1703, línea celular de cáncer de pulmón humano). No se detectó activación de células T contra células cancerosas negativa al antígeno (línea celular de adenocarcinoma papilar humano NCI-H441 para las moléculas ImmTAC 1-2, y línea celular de cáncer de mama humano CAMA-1 para las moléculas ImmTAC 3-5), dentro del intervalo de concentración clínica pertinente (<1 nM), lo que demuestra que la respuesta es específica.

Se probó la especificidad de las moléculas ImmTAC utilizando células derivadas de tejidos humanos normales y sanos como células diana. El panel inferior de la figura 7 demuestra que las moléculas ImmTAC 1-2 tienen una reactividad mínima a una concentración clínica pertinente contra las células de la vasculatura de la piel humana. Del mismo modo, los paneles inferiores de la figura 8 demuestran que las moléculas ImmTAC 3-5 tienen una reactividad mínima a una concentración clínica pertinente contra las células de la vasculatura de la piel humana y las células renales humanas.

Las moléculas ImmTAC 1 y 3 se sometieron a pruebas adicionales de especificidad contra un panel de células humanas derivadas de tejidos sanos normales utilizando la misma metodología ELISPOT descrita anteriormente. Los datos presentados en la figura 9 muestran una activación limitada de las células T, dentro de un intervalo de concentración clínicamente pertinente (<1 nM), para los tejidos sanos, incluyendo la vasculatura de la piel, tejido cardíaco, esquelético, hepático y pulmonar.

Las moléculas ImmTAC 1 y 4 fueron analizadas también para la reactividad contra un panel extendido de >10 tipos de células normales, usando la misma metodología ELISpOT descrita anteriormente y con un intervalo más fino de concentraciones de ImmTAC (0,01 nM, 0,1 nM, 0,2 nM, 0,3 nM, 0,5 nM y 1 nM). La figura 10 muestra datos representativos obtenidos de células esqueléticas, cardíacas y renales. En cada caso, se incluyeron como controles células positivas al antígeno (NCI-H1703) y células negativas al antígeno (NCI-H441). Los datos demuestran una reactividad insignificante contra las células normales, en relación con las células positivas al antígeno, dentro de un intervalo de concentración clínicamente pertinente (<1 nM).

Estos datos indican que estas moléculas ImmTAC demuestran un alto nivel de potencia y especificidad y, por tanto, son especialmente adecuadas para su uso terapéutico.

Ejemplo 7: Destrucción potente de células tumorales por las células T redirigidas por ImmTAC

Se investigó la capacidad de las moléculas ImmTAC de la invención para mediar en la destrucción potente de células T redirigidas de células tumorales positivas al antígeno utilizando la plataforma IncuCyte (Essen BioScience). Este ensayo permite detectar en tiempo real por microscopía la liberación de caspasa-3/7, un marcador de la apoptosis.

Método

Los ensayos se realizaron con el kit de ensayo de la apoptosis de 96 pocillos CellPlayer Caspase-3/7 (Essen BioScience, n.° de catálogo 4440) y se llevó a cabo según el protocolo del fabricante. Brevemente, las células diana (NCI-H1703 - antígeno ve HLA A*02+ve y NCI-H441 - antígeno_ve HLA A*02+ve) se cultivaron a 5000 células por pocillo y se incubaron durante la noche para permitir que se adhirieran. Se prepararon disoluciones de ImmTAC a concentraciones entre 0,5 nM y 0,01 nM, y se añadieron 25 pl de cada concentración al pocillo correspondiente. Las células efectoras se utilizaron en una proporción de células efectoras a células diana de 10:1 (50 000 células por pocillo). También se preparó una muestra de control sin ImmTAC. El reactivo de ensayo NucView se preparó a 30 pM y se añadieron 25 pl a cada pocillo y el volumen final se llevó a 150 pl (dando una concentración final de 5 pM). La placa se colocó en el instrumento IncuCyte y se tomaron imágenes cada 2 horas (1 imagen por pocillo) durante 3 días. Se determinó el número de células apoptóticas en cada imagen y se registró como células apoptóticas por mm2. Los ensayos se realizaron por triplicado.

Resultados

Los datos presentados en la figura 11 muestran la destrucción en tiempo real de células tumorales por parte de las células T redirigidas por ImmTAC. Los resultados se presentan para ImmTACI e ImmTAC4. Ambas moléculas ImmTAC muestran una destrucción redirigida por células T de células tumorales positivas al antígeno a una concentración de 0,01 nM. No se observa la muerte de células negativas al antígeno ni siquiera a la concentración más alta (0,5 nM).

Estos datos confirman que ImmTAC1 e immTAC4 median en la eliminación potente por células T redirigidas de células tumorales positivas al antígeno.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un receptor de células T (TCR) que tiene la propiedad de unirse al complejo de GVYDGREHTV (SEQ ID NO: 1) y HLA-A*02 y que comprende un dominio variable de la cadena alfa del TCR y un dominio variable de la cadena beta del TCR, en el que:

2. - Un TCR según la reivindicación 1, en el que el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:24, y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29.

3. - Un TCR según la reivindicación 1, en el que el dominio variable de la cadena alfa del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:22, y el dominio variable de la cadena beta del TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26.

4. - Un TCR según la reivindicación 1, que:

(a) es un heterodímero alfa-beta, con una secuencia de dominio constante TRAC de la cadena alfa y una secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2 de la cadena beta, o

(b) está en formato monocatenario del tipo Va-L-Vp, Vp-L-Va, Va-Ca-L-Vp, Va-L-Vp-Cp,

en las que Va y Vp son regiones variables a y p del TCR, respectivamente, Ca y Cp son regiones constantes a y p del TCR, respectivamente, y L es una secuencia conectora.

5. - Un TCR según la reivindicación 4, que es un heterodímero alfa-beta, en el que las secuencias del dominio constante de la cadena alfa y beta se modifican por truncamiento o sustitución para eliminar un enlace disulfuro nativo entre Cys4 del exón 2 de TRAC y Cys2 del exón 2 de TRBC1 o TRBC2 y/o opcionalmente las secuencias del dominio constante de la cadena alfa y/o beta se modifican mediante la sustitución de restos cisteína por Thr 48 de TRAC y Ser 57 de TRBC1 o TRBC2, formando dichas cisteínas un enlace disulfuro no nativo entre los dominios constantes alfa y beta del TCR.

6. - Un TCR según cualquier reivindicación anterior asociado con un marcador detectable, un agente terapéutico o un resto modificador de PK, opcionalmente en el que un anticuerpo anti-CD3 está unido covalentemente al C- o N-terminal de la cadena alfa o beta del TCR, opcionalmente en el que el anticuerpo anti-CD3 está unido covalentemente al C- o N-terminal de la cadena beta del TCR a través de una secuencia conectora, opcionalmente en el que la secuencia conectora se selecciona del grupo que consiste en GGGGS (SEQ ID NO: 30), GGGSG (SEQ ID NO: 31), GGSGG (SEQ ID NO: 32), GSGGG (SEQ ID NO: 33), GSGGGP (SEQ ID NO: 34), GGEPS (SEQ ID NO: 35), GGEGGGP (SEQ ID NO: 36), y GGEGGGSEGGGS (SEQ ID NO: 37).

7. - Una molécula de fusión de TCR-anti-CD3, en la que:

en el que el anticuerpo anti-CD3 está unido covalentemente al N-terminal o al C-terminal de la cadena beta del TCR a través de una secuencia conectora seleccionada de las SEQ ID NO: 30-37.

8. - Una molécula de fusión de TCR-anti CD3 según la reivindicación 7, que comprende:

(a) una secuencia de aminoácidos de la cadena alfa correspondiente a SEQ ID NO: 38 y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta correspondiente a SEQ ID NO: 42;

(b) una secuencia de aminoácidos de la cadena alfa correspondiente a SEQ ID NO: 38 y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta correspondiente a SEQ ID NO: 43;

(c) una secuencia de aminoácidos de la cadena alfa correspondiente a SEQ ID NO: 39 y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta correspondiente a SEQ ID NO: 44;

(d) una secuencia de aminoácidos de la cadena alfa correspondiente a SEQ ID NO: 40 y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta correspondiente a SEQ ID NO: 45; o

(e) una secuencia de aminoácidos de la cadena alfa correspondiente a SEQ ID NO: 41 y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta correspondiente a SEQ ID NO: 45.

9. - Una molécula de fusión TCR-anti CD3 según la reivindicación 7, que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena alfa correspondiente a SEQ ID NO: 40 y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta correspondiente a SEQ ID NO: 45.

10. - Una molécula de fusión TCR-anti CD3 según la reivindicación 7, que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena alfa correspondiente a SEQ ID NO: 38 y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta correspondiente a SEQ ID NO: 42.

11. - Un ácido nucleico que codifica una cadena alfa de TCR y una cadena beta de TCR según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

12. - Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 11.

13. - Un vector de expresión según la reivindicación 12, en el que el vector comprende un primer marco de lectura abierto que codifica la cadena alfa de TCR y un segundo marco de lectura abierto que codifica la cadena beta de TCR.

14. - Una célula que porta:

(a) un vector de expresión según la reivindicación 12 o 13 que codifica las cadenas alfa y beta de TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en un único marco de lectura abierto, o dos marcos de lectura abiertos distintos; o

(b) un primer vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena alfa de un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y un segundo vector de expresión que comprende ácido nucleico que codifica la cadena beta de un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

15. - Una célula no natural, en especial, una célula T, que presenta un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

16. - Una composición farmacéutica que comprende un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, una molécula de fusión de TCR-anti CD3 según las reivindicaciones 7-10, un ácido nucleico según la reivindicación 11 y/o una célula según la reivindicación 14 o en la reivindicación 15, junto con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.

17. - El TCR de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, la molécula de fusión de TCR-anti-CD3 de las reivindicaciones 7 a 10, el ácido nucleico de la reivindicación 11, la composición farmacéutica de la reivindicación 16 y/o la célula de la reivindicación 14 o la reivindicación 15, para su uso en un medicamento.

18. - El TCR, la molécula de fusión de TCR-anti-CD3, el ácido nucleico, la composición farmacéutica y/o la célula para el uso de la reivindicación 17, en los que el TCR, la molécula de fusión de TCR-anti-CD3, el ácido nucleico, la composición farmacéutica o la célula es para su uso en un método de tratamiento del cáncer o de un tumor, preferiblemente en un sujeto humano.

19. - El TCR, la molécula de fusión de TCR-anti-CD3, el ácido nucleico, la composición farmacéutica y/o la célula para el uso de la reivindicación 18, en los que (i) el sujeto humano tiene un tumor que expresa MAGE A4, (ii) el tumor es un tumor sólido, (iii) el sujeto humano es del subtipo HLA-A*02 y/o (iv) el TCR, la molécula de fusión de TCR-anti-CD3, el ácido nucleico, la composición farmacéutica o la célula se administran por inyección, tal como una inyección intravenosa o una inyección intratumoral directa.

20. - Un método para producir un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1a 6, o una molécula de fusión de TCR-anti-CD3 según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, que comprende a) mantener una célula según la reivindicación 14 en condiciones óptimas para la expresión de las cadenas de TCR y b) aislar las cadenas de TCR.