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ES2911774T3 - Producción de partículas similares a enterovirus 71 en plantas - Google Patents

Producción de partículas similares a enterovirus 71 en plantas Download PDF

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ES2911774T3
ES2911774T3 ES13835101T ES13835101T ES2911774T3 ES 2911774 T3 ES2911774 T3 ES 2911774T3 ES 13835101 T ES13835101 T ES 13835101T ES 13835101 T ES13835101 T ES 13835101T ES 2911774 T3 ES2911774 T3 ES 2911774T3
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Marc-Andre D'aoust
Pierre-Olivier Lavoie
Manon Couture
Lucie Poulin
Louis-Philippe Vezina
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Medicago Inc
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Abstract

Un método para producir partículas similares a enterovirus (EVLP) en una planta, parte de la planta o célula vegetal que comprende: i-a) introducir por transformación en la planta, parte de la planta o célula vegetal un primer ácido nucleico que comprende una primera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una primera secuencia de nucleótidos que codifica una poliproteína de enterovirus, en donde la poliproteína de enterovirus consiste en la poliproteína P1 de Enterovirus 71, la primera región reguladora comprende un primer promotor unido operativamente a un primer potenciador; introducir por transformación en la planta, parte de la planta o célula vegetal un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta y unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteasa 3CD de Enterovirus 71, la segunda región reguladora comprende un segundo promotor unido operativamente a un segundo potenciador; o i-b) proporcionar la planta, parte de la planta o célula vegetal que comprende un primer ácido nucleico que comprende una primera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una primera secuencia de nucleótidos que codifica una poliproteína de enterovirus, en donde la poliproteína de enterovirus consiste en la poliproteína P1 de Enterovirus 71, la primera región reguladora comprende un primer promotor unido operativamente a un primer potenciador; y un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteasa 3CD de Enterovirus 71, la segunda región reguladora comprende un segundo promotor unido operativamente a un segundo potenciador; ii)incubar la planta, parte de la planta o célula vegetal en condiciones que permitan la expresión del primer y el segundo ácido nucleico, para producir de esta manera las VLP y opcionalmente iii) cosechar la planta, parte de la planta o célula vegetal, y purificar las VLP.

Description

DESCRIPCIÓN
Producción de partículas similares a enterovirus 71 en plantas
Campo de la invención
Esta invención se refiere a la producción de partículas similares a enterovirus (EVLP) en plantas.
Antecedentes de la invención
Los picornavirus son pequeños virus de ARN de cadena positiva sin envoltura que pueden causar una amplia variedad de manifestaciones clínicas en humanos y animales. En base a una serie de propiedades, incluidas las homologías de secuencia y la sensibilidad a los ácidos, los picornavirus se dividen en varios géneros, entre los que se encuentran muchos patógenos importantes de humanos y animales.
Los picornavirus tienen nucleocápside desnuda. La cápside es una disposición de 60 protómeros en una estructura icosaédrica estrechamente empaquetada. Cada protómero consta de 4 polipéptidos conocidos como VP (proteína viral) 1, 2, 3 y 4. Los polipéptidos VP2 y VP4 se originan a partir de un precursor conocido como VP0, que se escinde después de la internalización del ARN genómico viral en la célula. VP4 está ubicado en el lado interno de la cápside. En dependencia del tipo y grado de deshidratación, la partícula viral tiene un diámetro de alrededor de 27­ 30 nm.
Los picornavirus tienen un genoma monopartito, lineal, poliadenilado de ssRNA(+) de 7,1-8,9 kb, que está compuesto por un solo ORF que codifica una poliproteína. El ARN genómico viral tiene una proteína viral (VPg) en su extremo 5' en lugar de una estructura de caperuza de nucleótidos metilados. La UTR larga en el extremo 5' contiene un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES). La región P1 codifica los polipéptidos estructurales. Las regiones P2 y P3 codifican las proteínas no estructurales asociadas con la replicación. La UTR 3' más corta es importante en la síntesis de la cadena (-). L es una proteína líder N-terminal adicional presente en algunos géneros que puede ser una proteasa (aftovirus, erbovirus) o tener otra función (kobuvirus, cardiovirus).
El ARN del virión es infeccioso y sirve como ARN mensajero genómico y viral. El IRES permite la traducción directa de la poliproteína. La poliproteína es procesada inicialmente por la(s) proteasa(s) viral(es) en varias proteínas precursoras y maduras para producir las proteínas estructurales, replicasa, VPg y una serie de proteínas que modifican la célula hospedera, lo que finalmente conduce a la lisis celular.
El enterovirus 71 (EV71) es un miembro de la familia Picornaviridae de virus de ARN monocatenario. Es un virus sin envoltura y su cápside está constituida por múltiples proteínas de cubierta producidas como fragmentos de un solo producto de traducción viral. El procesamiento de la poliproteína viral en componentes estructurales y no estructurales se presenta en la Figura 1 (técnica anterior). La región P1 del gen de la poliproteína codifica las proteínas estructurales, mientras que las regiones P2 y P3 codifican los componentes no estructurales del virus. Después de la escisión del precursor de proteína estructural P1 (1ABCD en la Figura 1) de la poliproteína por la proteasa viral 2A, el precursor de P1 se procesa en las proteínas de la cápside VP0, VP1 (fragmento 1D en la Figura 1) y VP3 (fragmento 1C en la Figura 1). El componente 3C y su precursor 3CD, codificado por la región P3, son las proteasas virales responsables de procesar el precursor P1 en proteínas de la cápside. Los protómeros VP0, VP1 y VP3 se ensamblan espontáneamente en cápsides vacías y se cree que el ARN viral se empaqueta en las partículas después del ensamblaje de las partículas vacías. La asociación de la cápside vacía con el ARN genómico da como resultado un cambio estructural, la internalización del ARN, la escisión autocatalítica de VP0 en VP2 (fragmento 1B en la Figura 1) y VP4 (fragmento 1A en la Figura 1) y la maduración en un virión 150S estable. Las cápsides vacías, que contienen el precursor de VP0 no escindido, se encuentran comúnmente durante las infecciones por picornavirus.
La producción de VLP de EV71 en células de insecto se ha obtenido a partir de la coexpresión de la proteína precursora P1 con la proteasa 3CD (Hu y otros, 2003, Biotechnology Letters 25: 919-925). El uso de un solo vector de baculovirus para la producción de P1 y 3CD se describe por Chung y otros, (2008, Vaccine 26: 1855-1862). Los estudios de inmunogenicidad en ratones mostraron que las VLP de EV71 purificadas conferían protección frente a un reto con dosis letales del virus.
La proteína VP1 de EV71 se ha producido en frutos de tomates transgénicos, y la alimentación de ratones con frutos transgénicos que contenían VP1 resultó en el desarrollo de IgA fecal e IgG sérica específicas para VP1 (Chen y otros, 2006, Vaccine24: 2944-2951).
La proteína precursora P1 y la proteasa 3C del virus de la fiebre aftosa (FMDV) se coexpresaron en alfalfa transgénica (Dus Santos y otros 2005, Vaccine 23: 1838-1843). La alfalfa se transformó de forma estable con un solo vector que comprende la región genómica de FMDV P1 (1A, 1B, 1C, 1D), 2A, los primeros 16 residuos de aminoácidos del extremo N de 2B, la secuencia completa de 3B1, 3B2, 3B3, 3C y los primeros 16 residuos de aminoácidos del extremo N de 3D. La inmunogenicidad de los extractos de proteína cruda de las plantas transgénicas se demostró mediante la administración intraperitoneal en ratones Balb/c. Los ratones inmunizados también estaban protegidos contra un reto letal con el FMDV (virus de la fiebre aftosa). Los niveles de expresión del antígeno fueron bajos a efectos prácticos.
Solicitud Argentina AR078257 describe una planta transgénica que expresa un virus de cápside vacío, en donde la planta transgénica comprende en su genoma un constructo de ADN que codifica un polipéptido precursor de P1 unido a la proteasa 2A autocatalítica. El constructo de ADN puede contener además el fragmento de proteína 2B adjunto a la secuencia que codifica la proteasa 3C unida a un fragmento de la secuencia que codifica el fragmento de proteína 3D.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a métodos para producir partículas similares a enterovirus (EVLP) en una planta, parte de la planta o célula vegetal. También se describen métodos para producir proteínas estructurales de picornavirus en plantas y para producir partículas similares a virus que comprenden proteína estructural de picornavirus en plantas. La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Se describe un método (A) para producir una partícula similar a picornavirus (PVLP) en una planta que comprende:
a) introducir un primer ácido nucleico que comprende una primera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más poliproteínas de picornavirus, en la planta, o parte de la planta,
b) introducir un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta y unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteasas;
c) incubar la planta o parte de la planta en condiciones que permitan la expresión del primer y el segundo ácido nucleico, para producir de esta manera las PVLP
También se describe un método (B) para producir una partícula similar a picornavirus (PVLP) que comprende, a) proporcionar una planta, parte de una planta o célula vegetal que comprende un primer ácido nucleico que comprende una primera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una primera secuencia de nucleótidos que codifica una o más poliproteínas de picornavirus y un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteasas;
b) incubar la planta, parte de la planta, o célula vegetal en condiciones que permitan la expresión de los ácidos nucleicos, para producir de esta manera las PVLP.
La primera región reguladora activa en la planta y la segunda región reguladora activa en la planta pueden ser iguales o diferentes.
Además, en el método (A) o (B) la relación porcentual del primer ácido nucleico al segundo ácido nucleico introducido en la planta, parte de la planta o célula vegetal puede estar entre 95 %:5 % y 50 %:50 %, o entre aproximadamente 20:1 y aproximadamente 0,5:1.
En los métodos (A) o (B) descritos anteriormente, la primera secuencia de ácido nucleico puede comprender la primera región reguladora unida operativamente con uno o más potenciadores de comovirus, la secuencia de nucleótidos que codifica la poliproteína y uno o más de un elemento de amplificación de geminivirus, y un tercer ácido nucleico que codifica una replicasa de geminivirus se introduce en la planta o parte de la planta. El uno o más potenciadores de comovirus pueden ser un UTR de comovirus, por ejemplo, un UTR hipertraducible del virus del mosaico del caupí (CPMV-HT) tal como el CPMV-HT 5', 3'UTR, o una combinación de los mismos. El uno o más elementos de amplificación de geminivirus pueden seleccionarse de una región intergénica larga del virus del enanismo amarillo del frijol (BeYDV LIR) y una región intergénica corta de BeYDV (BeYDV SIR).
Los métodos descritos anteriormente (Método A) también pueden implicar la introducción de otra secuencia de ácido nucleico que codifique un supresor del silenciamiento, por ejemplo, HcPro o p19.
Los métodos descritos anteriormente (Método B) también pueden implicar proporcionar además la planta, parte de la planta o célula vegetal que comprende otra secuencia de ácido nucleico que codifica un supresor de silenciamiento, por ejemplo, HcPro o p19.
En el método (A) como se describe anteriormente, en la etapa de introducción (etapa a), el ácido nucleico puede expresarse transitoriamente en la planta. Alternativamente, en la etapa de introducción (etapa a), el ácido nucleico se expresa de forma estable en la planta.
Los métodos (A) y (B) descritos anteriormente pueden comprender además una etapa de recolección de la planta y purificación de los PVLP.
Se describe una composición que comprende una dosis eficaz de PVLP como se acaba de describir para inducir una respuesta inmunitaria y un portador farmacéuticamente aceptable.
Se describe un método para inducir inmunidad contra una infección por picornavirus en un sujeto, que comprende administrar el PVLP como se acaba de describir al sujeto. La PVLP puede administrarse a un sujeto por vía oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea.
Se describe materia vegetal que comprende un PVLP producido por el método (A) y/o (B) descrito anteriormente. La materia vegetal puede usarse para inducir inmunidad contra una infección por picornavirus en un sujeto. La materia vegetal también puede mezclarse como un complemento alimenticio.
Este resumen de la invención no describe necesariamente todas las características de la invención.
Breve descripción de las figuras
Estas y otras características de la invención serán más evidentes a partir de la siguiente descripción en la que se hace referencia a las Figuras adjuntas en donde:
La Figura 1 muestra una representación de la técnica anterior de un genoma de picornavirus (enterovirus 71) e intermedios de procesamiento de poliproteínas. (de la página web de ViralZone)
La Figura 2 muestra un análisis de transferencia Western de la expresión y procesamiento de P1 por 3CD. Diez microgramos de extractos de proteínas de plantas transformadas con los vectores de expresión identificados anteriormente se cargaron y sometieron a electroforesis en condiciones no reductoras. Se usaron anticuerpos monoclonales anti-VP1 de ratón para la inmunodetección. Las relaciones indican la proporción de cepas de Agrobacterium P1 (constructo 1300 o 1301 ver Tabla 1) a las 3CD (constructo 1310, 1311 o 1315 ver Tabla 1) en la suspensión bacteriana usada para la transformación. Se indica la posición esperada de P1 y VP1.
La Figura 3 muestra el cribado de estrategias de expresión de 3CD para la acumulación máxima de VP1. Cinco microgramos de extractos de proteínas de plantas transformadas con los vectores de expresión identificados anteriormente se cargaron y sometieron a electroforesis en condiciones no reductoras. Se usaron anticuerpos monoclonales anti-VP1 de ratón para la inmunodetección. Las relaciones indican la proporción de cepas de Agrobacterium P1 (1301) a las 3CD (1310, 1311, 1312 y 1313) en la suspensión bacteriana usada para la transformación.
La Figura 4 muestra la evaluación del ensamblaje de la cápside del EV71. (A) La SDS-PAGE teñida con Coomassie y el análisis de transferencia Western de fracciones de elución de la separación por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de extractos de proteínas de plantas que coexpresan P1 y 3CD (constructos 1301+1310 (4:0,5)). Se indica la banda que supuestamente corresponde a VP1 en el gel teñido con Coomassie. (B) Examen con microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa de la fracción de elución SEC 12. La barra representa 100 nm.
La Figura 5 muestra la caracterización de los PVLP de EV71 purificados. (A) La SDS-PAGE teñida con Coomassie y los análisis de transferencia Western de las PVLP de EV71 purificadas. Se indica la banda correspondiente a VP1 en el gel teñido con Coomassie. También se identifican otras bandas, correspondientes en peso molecular a otras proteínas de la cápside de EV71. (B) Examen con microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa de las PVLP de EV71 purificadas. La muestra se diluyó 1/100 antes del examen. La barra representa 100 nm.
La Figura 6 muestra la caracterización del lote 479-23-018 por microscopía electrónica.
La Figura 7 muestra el análisis de criomicroscopía electrónica de las PVLP de EV71 extraídas mediante procesos y métodos asistidos por enzimas y seleccionados por HIC (número de lote 479-31-020).
La Figura 8 muestra el análisis de criomicroscopía electrónica de las PVLP de EV71 extraídas mediante el método de extracción mecánica (pH 8,0) con tratamiento térmico (número de lote 479-32-020).
La Figura 9A muestra el 3CD de la cepa HK08 de EV71 que comprende los aminoácidos 1549-2193 (SEQ ID NO: 1), como se establece en GenBank ID ADG57603. La Figura 9B muestra 3CD de la cepa HK08 de EV71 que comprende los nucleótidos 5387 -7321 (SEQ ID NO: 2) como se establece en GenBank ID GQ279369. La Figura 9C muestra 3CD de la cepa GDFS08 de EV71 que comprende los aminoácidos 1549-2193 (SEQ ID NO: 3) como se establece en GenBank ID ACI25378. La Figura 9D muestra 3CD de la cepa GDFS08 de EV71 que comprende los nucleótidos 5387 -7321 (SEQ ID NO: 4) como se establece en GenBank ID FJ194964. La Figura 9E muestra la secuencia de aminoácidos de P1 GenBank ID ADG57603 (aminoácidos 1-862) (SEQ ID NO: 5). La Figura 9F muestra la secuencia de nucleótidos de P1 GenBank ID GQ279369 (nucleótidos 743­ 3328) (SEQ ID NO: 6). La Figura 9G muestra la secuencia de nucleótidos de la poliproteína PVgp1 del serotipo PV-1 del enterovirus C humano (GenBank ID NC_002058 para el genoma y NP_041277 para la poliproteína: nt 5438-7369) (SEQ ID NO: 7). La Figura 9H muestra la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de Poliovirus (aa 1566-2209 de GenBank ID NP_041277) (SEQ ID NO: 8). La Figura 9I muestra la secuencia de nucleótidos de la poliproteína PVgp1 [enterovirus C humano] (nt 743-3385 de GenBank ID NC_002058) (SEQ ID NO: 9). La Figura 9J muestra la secuencia de aminoácidos de la poliproteína [Enterovirus C humano] GenBank ID NP_041277 (aa 1-881 de GenBank ID NP_041277) (SEQ ID NO: 10).
Descripción detallada
La siguiente descripción es de una modalidad preferida.
Se describen partículas similares a virus (VLP) que comprenden una o más proteínas estructurales de picornavirus (es decir, una proteína similar a picornavirus, o PVLP), y métodos para producir PVLP en plantas o en partes de la planta. Por lo tanto, la PVLP puede comprender una o más de una proteína estructural de picornavirus. Por ejemplo, la PVLP puede comprender una o más de una proteína estructural de enterovirus.
El picornavirus puede seleccionarse del grupo de Aphthovirus, Avihepatovirus, Cardiovirus, Enterovirus, Erbovirus, Hepatovirus, Kobuvirus, Parechovirus, Sapelovirus, Senecavirus, Teschovirus y Tremovirus. En un ejemplo no limitativo, el picornavirus puede ser un enterovirus, por ejemplo, el enterovirus 71 (EV71) o el enterovirus humano C (también conocido como poliovirus).
Se describe un método para producir una VLP, por ejemplo, una PVLP o una partícula similar a un enterovirus en una planta. El método puede comprender introducir un primer ácido nucleico que comprende una primera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una primera secuencia de nucleótidos que codifica una o más poliproteínas de picornavirus en la planta, o parte de la planta, e introducir un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteasa. Seguido por incubar la planta o parte de la planta en condiciones que permitan la expresión de los ácidos nucleicos, para producir de esta manera las PVLP.
"partícula similar a virus" (VLP), o "partículas similares a virus" o "VLP" se refiere a estructuras que se autoensamblan y comprenden una o más de una proteína estructural, por ejemplo, una o más de una proteína estructural de picornavirus, o una o más de una proteína estructural de enterovirus, o una combinación de las mismas, por ejemplo, pero no se limitan a, la proteína estructural VP0, VP1, VP2, VP3, VP4, o una combinación de las mismas. Generalmente las VLP son morfológica y antigénicamente similares a los viriones producidos en una infección, pero carecen de información genética suficiente para replicarse y, por lo tanto, no son infecciosas. Las VLP pueden producirse en células hospederas adecuadas incluidas las células hospederas vegetales. Después de la extracción de la célula hospedera y tras el aislamiento y posterior purificación en condiciones adecuadas, las VLP pueden purificarse como estructuras intactas.
La expresión "partícula similar a picornavirus" (PVLP), se refiere a una VPL o más VLP que comprenden una o más de una proteína estructural de picornavirus. La expresión o "partícula similar a enterovirus" se refiere a una VLP o más VLP que comprenden una o más de una proteína estructural de enterovirus. Los ejemplos de proteínas estructurales de picornavirus pueden incluir, pero no se limitan a, VP0, VP1, VP2, VP3, VP4, o una combinación de las mismas proteínas estructurales. Los ejemplos de proteínas estructurales de enterovirus pueden incluir, pero no se limitan a, VP0, VP1, VP2, VP3, VP4, o una combinación de las mismas proteínas estructurales.
Por poliproteína se entiende una proteína que comprende una o más de una proteína o precursor de proteína, que cuando se procesa proteolíticamente proporciona una o más proteínas. Por ejemplo, la poliproteína puede comprender una o más de una proteína estructural. La una o más proteínas, por ejemplo, proteína estructural, en el polipéptido pueden, por ejemplo, estar separadas por sitios de escisión, como por ejemplo sitios de escisión de proteasa. Un ejemplo no limitante de una "poliproteína" es el precursor de la proteína estructural P1, también denominado "región P1". La región P1 se define como la parte de la poliproteína de picornavirus que genera "proteínas estructurales" o "proteínas de cubierta", por ejemplo, VP0, VP1, VP2, VP3, VP4 o una combinación de las mismas. Los ejemplos no limitantes de picornavirus P1, o fragmentos de P1 que pueden usarse de acuerdo con la presente invención incluyen aquellos P1 de enterovirus, por ejemplo, enterovirus 71.
Un ejemplo de una región P1, que no debe considerarse limitante, es la secuencia de aminoácidos como se establece en GenBank ID ADG57603 que comprende los aminoácidos 1-862 (SEQ ID NO: 5) o una secuencia que tiene al menos aproximadamente 90-100 % de similitud de secuencia con la misma, que incluye cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % de similitud de secuencia con los mismos. Además, se establece un ejemplo no limitante de una secuencia de nucleótidos que codifica una región P1 en GenBank ID GQ279369 que comprende los nucleótidos 743-3328 (SEQ ID NO: 6) o una secuencia que tiene al menos aproximadamente 90-100 % de similitud de secuencia con la misma, que incluye cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % de similitud de secuencia con los mismos.
Otro ejemplo de una región P1, que no debe considerarse limitante, es la secuencia de aminoácidos como se establece en GenBank ID NP_041277 que comprende los aminoácidos 1566-2209 (SEQ ID NO: 8) o una secuencia que tiene al menos aproximadamente 90-100 % de similitud de secuencia con la misma, que incluye cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % de similitud de secuencia con los mismos. Además, se establece un ejemplo no limitante de una secuencia de nucleótidos que codifica una región P1 en GenBank ID NC_002058 que comprende los nucleótidos 5438-7369 (SEQ ID NO: 7) o una secuencia que tiene al menos aproximadamente 90-100 % de similitud de secuencia con la misma, que incluye cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % de similitud de secuencia con los mismos. En otro ejemplo que no debe considerarse como limitante de la región P1, la secuencia de aminoácidos como se establece en GenBank ID NP_041277 que comprende los aminoácidos 1-881 (SEQ ID NO: 10) o una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 90-100 % de similitud de secuencia con la misma, que incluye cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % de similitud de secuencia con los mismos. Además, se establece un ejemplo no limitante de una secuencia de nucleótidos que codifica una región P1 en GenBank ID NC_002058 que comprende los nucleótidos 743-3385 (SEQ ID NO: 9) o una secuencia que tiene al menos aproximadamente 90-100% de similitud de secuencia con la misma, que incluye cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % de similitud de secuencia con los mismos.
Una "poliproteína de picornavirus" se refiere a la totalidad o una parte de una poliproteína de picornavirus aislada de picornavirus, presente en cualquier cepa o aislado de picornavirus de origen natural o variante, por ejemplo, una poliproteína de enterovirus. De manera similar, la "proteína estructural de picornavirus" puede referirse a la totalidad o una parte de una proteína estructural de picornavirus aislada de picornavirus, presente en cualquier cepa o aislado de picornavirus natural o variante, por ejemplo, una proteína estructural de enterovirus, por ejemplo, obtenida de un poliovirus o enterovirus 71. Por lo tanto, la expresión "poliproteína de picornavirus" y "proteína estructural de picornavirus" y similares incluyen variantes naturales de poliproteína de picornavirus, proteína estructural de picornavirus o una combinación de las mismas, producidas por mutación durante el ciclo de vida del virus o producidas en respuesta a la presión selectiva (por ejemplo, terapia farmacológica, expansión del tropismo o infectividad de la célula hospedera, etc.). La expresión "poliproteína de picornavirus" incluye además "poliproteína de enterovirus" y "proteína estructural de enterovirus" y similares incluyen variantes naturales de poliproteína de enterovirus, proteína estructural de enterovirus o una combinación de las mismas, producidas por mutación durante el ciclo de vida del virus o producidas en respuesta a la presión selectiva (por ejemplo, terapia farmacológica, expansión del tropismo o infectividad de la célula hospedera, etc.). La expresión "poliproteína de picornavirus" también puede incluir "poliproteína de poliovirus" y "proteína estructural de poliovirus" y similares incluyen variantes naturales de poliproteína de poliovirus, proteína estructural de poliovirus o una combinación de las mismas, producidas por mutación durante el ciclo de vida del virus o producidas en respuesta a la presión selectiva (por ejemplo, terapia farmacológica, expansión del tropismo o infectividad de la célula hospedera, etc.). Como apreciará un experto en la técnica, las poliproteínas nativas y variantes de picornavirus, enterovirus o poliovirus, o la proteína estructural de picornavirus, enterovirus o poliovirus también pueden producirse mediante el uso de técnicas recombinantes.
La poliproteína puede comprender una o más proteínas estructurales, por ejemplo, proteínas de la cápside. Los ejemplos no limitantes de proteína estructural o proteínas de la cápside de picornavirus son las proteínas de picornavirus VP0, VP1, VP2, VP3 y VP4, y un fragmento de VP0, VP1, VP2, VP3 y VP4. Los ejemplos no limitantes de proteínas VP0, VP1, VP2, VP3 y VP4, o fragmentos de proteínas VP0, VP1, VP2, VP3 y VP4 que pueden usarse incluyen aquellas proteínas VP0, VP1, VP2, VP3 y VP4 de enterovirus, por ejemplo, poliovirus o enterovirus 71. Además, la proteína estructural de poliproteína, o una combinación de las mismas, puede ser, por ejemplo, de la cepa HK08 o la cepa GDFS08 del enterovirus 71. En otro ejemplo no limitante, la proteína estructural de poliproteína o una combinación de las mismas puede ser del enterovirus C humano, también conocido como poliovirus.
La similitud o identidad de la secuencia de aminoácidos puede calcularse mediante el uso de los programas BLASTP y TBLASTN que emplean el algoritmo BLAST 2,0 (herramienta básica de búsqueda de alineación local). Las técnicas para calcular la similitud o identidad de secuencias de aminoácidos son bien conocidas por los expertos en la técnica, y el uso del algoritmo BLAST se describe en ALTSCHUL y otros (1990, J Mol. Biol. 215: 403- 410) y ALTSCHUL y otros (1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402).
Las VLP de picornavirus, enterovirus (incluido el poliovirus) se producen en una planta, parte de una planta o célula vegetal, mediante la coexpresión de un ácido nucleico (un primer ácido nucleico) que codifica una poliproteína de picornavirus, enterovirus o poliovirus, por ejemplo, pero no se limitan a P1, con un segundo ácido nucleico que codifica una proteasa, por ejemplo, una proteasa de picornavirus, enterovirus o poliovirus tal como, por ejemplo, pero no se limitan a, 3CD, y de esta manera produce VLP.
Un ejemplo de una proteasa, que no debe considerarse limitante, es una secuencia de aminoácidos de la cepa HK08 de EV71 que comprende los aminoácidos 1549-2193, como se establece en GenBank ID ADG57603 (SEQ ID NO: 1). La secuencia de nucleótidos como se establece en GenBank ID GQ279369 (SEQ ID NO: 2) desde el nucleótido 5387 hasta el nucleótido 7321 o una secuencia que tiene al menos aproximadamente 90-100 % de similitud de secuencia con SEQ ID NO: 2, que incluye cualquier porcentaje de similitud dentro de este rango, tales como 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % de similitud de secuencia con los mismos. Otro ejemplo no limitante es la secuencia de aminoácidos de la cepa GDFS08 de EV71 que comprende los aminoácidos 1549-2193 como se establece en GenBank ID ACI25378 (s Eq ID NO:3). La secuencia de nucleótidos como se establece en GenBank ID FJ194964 (SEQ ID NO: 4), desde el nucleótido 5387 hasta el nucleótido 7321 puede usarse para producir la secuencia de aminoácidos. Además, una secuencia que tenga entre aproximadamente un 90-100 % de similitud de secuencia con SEQ ID NO: 4, que incluye cualquier porcentaje de similitud dentro de este rango, tal como 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 % de similitud de secuencia con los mismos.
El primer ácido nucleico, y el segundo ácido nucleico, pueden introducirse en la planta en la misma etapa, o pueden introducirse en la planta secuencialmente.
Secuencias
Los ejemplos no limitantes de secuencias que pueden usarse incluyen:
La secuencia P1 de Aphthovirus, Avihepatovirus, Cardiovirus, Enterovirus, Erbovirus, Hepatovirus, Kobuvirus, Parechovirus, Sapelovirus, Senecavirus, Teschovirus y Tremovirus puede usarse para producir una poliproteína P1. En un ejemplo no limitante, la secuencia que codifica la poliproteína P1 puede ser de enterovirus, por ejemplo, enterovirus 71 o enterovirus humano C (también conocido como poliovirus).
Además, los ejemplos no limitantes de secuencias que pueden usarse para codificar una proteasa para su uso como se describe en la presente descripción incluyen la secuencia de la proteasa 3CD, por ejemplo, obtenida de Aphthovirus, Avihepatovirus, Cardiovirus, Enterovirus, Erbovirus, Hepatovirus, Kobuvirus, Parechovirus, Sapelovirus, Senecavirus, Teschovirus y Tremovirus. En un ejemplo no limitante, la secuencia que codifica la proteasa 3CD puede ser de enterovirus, por ejemplo, enterovirus 71 o poliovirus (también conocido como enterovirus humano C). Se ha encontrado que al introducir y coexpresar la poliproteína y la proteasa en la planta o parte de la planta puede modularse el rendimiento de las VLP producidas. La poliproteína y la proteasa pueden proporcionarse en constructos de ácido nucleico separados y coexpresarse, o pueden proporcionarse en el mismo constructo pero cada secuencia se expresa de manera diferencial, según se requiera, para optimizar la producción de VLP como se describe más abajo.
Por "coexpresado" se entiende que dos, o más de dos, secuencias de nucleótidos se expresan aproximadamente al mismo tiempo dentro de la planta, dentro del mismo tejido de la planta y dentro de las mismas células de la planta. Así mismo, las dos o más de dos secuencias de nucleótidos pueden necesitar expresarse dentro del mismo compartimento celular tal como, por ejemplo, el retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, el apoplasto, el citosol, la mitocondria, el cloroplasto, el peroxisoma. No es necesario que las secuencias de nucleótidos se expresen exactamente al mismo tiempo. Más bien, las dos o más secuencias de nucleótidos se expresan de tal manera que los productos codificados tengan la posibilidad de interactuar. Por ejemplo, la proteasa puede expresarse ya sea antes o durante el período en el que se expresa la poliproteína, de modo que pueda tener lugar la escisión de la poliproteína en proteínas estructurales. Las dos o más de dos secuencias de nucleótidos pueden coexpresarse mediante el uso de un sistema de expresión transitoria, donde las dos o más secuencias se introducen dentro de la planta aproximadamente al mismo tiempo, bajo condiciones en las que se expresan las dos secuencias. Las dos o más de dos secuencias pueden estar presentes en diferentes constructos, y la coexpresión requiere la introducción de cada uno de los constructos en la planta, parte de la planta o célula vegetal, o las dos o más de dos secuencias pueden estar presentes en un constructo y el constructo introducido en la planta, parte de la planta o célula vegetal. Alternativamente, una planta que comprende una de las secuencias de nucleótidos, por ejemplo, la secuencia que codifica la proteasa, puede transformarse, ya sea de manera transitoria o estable, con una secuencia adicional que codifica la poliproteína. En este caso, la secuencia que codifica la proteasa puede expresarse dentro de un tejido deseado, durante una etapa de desarrollo deseada, o su expresión puede inducirse mediante el uso de un promotor inducible, y la secuencia adicional que codifica la poliproteína puede expresarse en condiciones similares y en el mismo tejido, para asegurar que las secuencias de nucleótidos se coexpresen. Adicionalmente, la secuencia que codifica la poliproteína puede transformarse, ya sea de manera transitoria o estable, con una secuencia adicional que codifica la proteasa. En este caso, la secuencia que codifica la poliproteína puede expresarse dentro de un tejido deseado, durante una etapa de desarrollo deseada, o su expresión puede inducirse mediante el uso de un promotor inducible, y la secuencia adicional que codifica la proteasa puede expresarse en condiciones similares y en el mismo tejido, para asegurar que las secuencias de nucleótidos se coexpresen.
Como puede verse en las Figuras 2 y 3, el nivel de acumulación de VLP en la planta, parte de la planta o célula vegetal, está influenciado por la relación de Agrobacterium que contiene poliproteínas a Agrobacterium que contiene proteasa infiltrado en la planta, parte de planta o célula vegetal. La relación entre el Agrobacterium que contiene poliproteína y el que contiene proteasa puede oscilar, por ejemplo, entre aproximadamente 20:1 y aproximadamente 0,5:1 (poliproteína:proteasa), o cualquier cantidad intermedia, por ejemplo, entre aproximadamente 20:1, 18:1, 16:1, 14:1, 12:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 0,5:1 (poliproteína:proteasa), o cualquier cantidad intermedia.
La relación de poliproteína a proteasa puede variarse, por ejemplo, mediante la introducción de diferentes relaciones de Agrobacterium que contiene el primer ácido nucleico a Agrobacterium que contiene el segundo ácido nucleico en la planta, parte de la planta o célula vegetal. Alternativamente, si la poliproteína y la proteasa están presentes en el mismo constructo, y por lo tanto se introducen en el mismo Agrobacterium, pueden expresarse de forma diferencial dentro de la planta, parte de la planta o célula vegetal mediante el uso de promotores adecuados de manera que se obtenga la relación deseada de poliproteína a proteasa.
Por lo tanto, se describe un método para aumentar el rendimiento de producción de PVLP mediante la modulación de la relación entre el primer y el segundo ácido nucleico.
En una modalidad, el porcentaje del Agrobacterium que contiene proteasa puede estar entre el 0,5 % y el 50 % del total de Agrobacterium infiltrado o cualquier cantidad intermedia. Por ejemplo, la relación porcentual de Agrobacterium que contiene proteasa puede ser 0, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 % 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 % o 50 % o cualquier cantidad intermedia.
La relación porcentual de Agrobacterium que contiene poliproteína a Agrobacterium que contiene proteasa puede ser de 95 %:5 % a 40 %:60 % del total de Agrobacterium infiltrado, o cualquier cantidad intermedia. Por ejemplo el porcentaje de Agrobacterium que contiene poliproteína dentro de la cantidad total de Agrobacterium infiltrado puede ser 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 %, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 89 %, 88 %, 87 %, 86 %, 85 %, 84 %, 83 %, 82 %, 81 %, 80 %, 79 %, 78 %, 77 %, 76 %, 75 %, 74 %, 73 %, 72 %, 71 %, 70 %, 69 %, 68 %, 67 %, 66 %, 65 %, 64 %, 63 %, 62 %, 61 %, 60 %, 59 %, 58 %, 57 %, 56 %, 55 %, 54 %, 53 %, 52 % o 51 %. Por ejemplo, la relación porcentual de Agrobacterium que contiene poliproteína a Agrobacterium que contiene proteasa puede estar entre 50 %:50 % y 95 %:5 %, o cualquier relación porcentual intermedia, o la relación porcentual entre Agrobacterium que contiene la poliproteína y Agrobacterium que contiene la proteasa puede ser 50 %:50 %, 55 %:45 %, 60 %:40 %, 65 %:35 %, 70 %:30 %, 75 %:25 %, 80 %:20 %, 85 %:15 %, 90 %:10 %, 95 %:5 %, o cualquier relación porcentual intermedia.
La expresión de la primera y segunda secuencia de nucleótidos dentro de una célula vegetal forma una VLP, y la VLP puede usarse, por ejemplo, para producir un anticuerpo que es capaz de unirse a una proteína viral, tal como por ejemplo la proteína estructural de picornavirus, que incluye, pero no se limitan a, VP0, VP1, VP2, VP3 y/o VP4. La VLP, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmunitaria.
Como se describe en detalle más abajo, la relación de poliproteína a proteasa puede variarse adicionalmente, por ejemplo, al expresar diferencialmente la poliproteína y la proteasa. La expresión puede variarse al modular, por ejemplo, la replicación, transcripción, traducción, o una combinación de las mismas, de la poliproteína, la proteasa, o tanto la proteína como la proteasa. Por ejemplo, diferentes elementos reguladores, que incluyen promotores, elementos de amplificación, potenciadores o una combinación de los mismos, puede usarse además de la variación de la relación del Agrobacterium que contiene proteína con respecto al Agrobacterium que contiene proteasa infiltrados como se describió anteriormente. Puede usarse un primer conjunto o combinación de elementos reguladores para regular la replicación, la transcripción o una combinación de las mismas, del primer ácido nucleico y puede usarse un segundo conjunto o combinación de elementos reguladores para regular la replicación, transcripción o una combinación de las mismas, del segundo ácido nucleico. El primer conjunto o combinación de elementos reguladores es diferente del segundo conjunto o combinación de elementos reguladores y permite la expresión diferencial del primer y segundo ácidos nucleicos para permitir modular la relación de poliproteína: proteasa in vivo. Por ejemplo, que no debe considerarse limitante, un conjunto o combinación de elementos reguladores, por ejemplo, el primer conjunto, puede incluir un elemento de amplificación, por ejemplo, elementos obtenidos de BeYDV, mientras que el elemento de amplificación, por ejemplo, los obtenidos de BeYDV, puede estar ausente en el otro conjunto o combinación de elementos reguladores, por ejemplo, el segundo conjunto. Alternativamente, el segundo conjunto puede incluir un elemento de amplificación (por ejemplo, elementos obtenidos de BeYDV), mientras que el elemento de amplificación (por ejemplo, elementos obtenidos de BeYDV) puede estar ausente en el primer conjunto o combinación de elementos reguladores. De manera similar, la fuerza de un promotor puede diferir entre el primer y el segundo conjunto o combinación de elementos reguladores, o uno de los promotores puede ser inducible y el otro constitutivo, de manera que la expresión diferencial entre la poliproteína con respecto a la proteasa se logra in vivo.
Tamaño
La aparición de VLP puede detectarse mediante el uso de cualquier método adecuado, por ejemplo, gradientes de sacarosa o cromatografía de exclusión por tamaño. Puede evaluarse la estructura y el tamaño de las VLP mediante, por ejemplo, microscopía electrónica o mediante cromatografía de exclusión por tamaño.
Para la cromatografía de exclusión por tamaño, las proteínas solubles totales pueden extraerse del tejido vegetal al homogeneizar (Polytron) una muestra de material vegetal congelado triturado en tampón de extracción, y el material insoluble se elimina por centrifugación. La concentración por precipitación asistida por PEG también puede ser beneficiosa. La VLP también puede producirse por preparación de protoplastos o una fracción de protoplastos mediante el uso de los métodos descritos en el documento WO 2011/035422. Se cuantifica la proteína soluble y el extracto se pasa a través de una columna Sephacryl™, por ejemplo, una columna Sephacryl™ S500. Puede usarse azul dextrano 2000 como estándar de calibración.
Los restos celulares pueden eliminarse mediante centrifugación. A continuación, el extracto centrifugado puede filtrarse. Sin pretender estar ligado a la teoría, se cree que dicha etapa o etapas de filtración pueden eliminar los sólidos en suspensión, reducir la biocarga y estabilizar y acondicionar el extracto antes de la purificación adicional. Debido a su tamaño, el PVLP puede purificarse aún más mediante el uso de filtración de flujo tangencial (TFF). Sin pretender estar ligado a la teoría, la TFF elimina de forma eficaz y selectiva las proteínas solubles de menor peso molecular que se encuentran en el extracto clarificado, incluidas las enzimas usadas para la despolimerización de la pared celular. Además, la etapa de TFF también concentra las VLP y permite un intercambio de tampón en preparación para la cromatografía. La etapa de TFF puede ir seguida de varias etapas cromatográficas, por ejemplo, intercambio aniónico, intercambio catiónico, cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y/o pseudoafinidad. Pueden añadirse etapas de TFF adicionales después de las etapas del cromatógrafo. Después de la cromatografía y/o la TFF, las fracciones pueden analizarse adicionalmente por inmunotransferencia para determinar el complemento proteico de la fracción.
La fracción separada puede ser, por ejemplo, un sobrenadante (si se centrifuga, sedimenta o precipita), o un filtrado (si se filtra), y está enriquecida en proteínas o proteínas de superestructura, tales como, por ejemplo, partículas de mayor peso molecular, de orden superior o VPL completas. La fracción separada puede procesarse adicionalmente para aislar, purificar, concentrar o una combinación de los mismos, las proteínas, proteínas de supraestructura o partículas de orden superior, por ejemplo, mediante etapas adicionales de centrifugación, precipitación, etapas cromatográficas (por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño, de intercambio iónico, de afinidad), filtración de flujo tangencial o una combinación de las mismas. La presencia de proteínas purificadas, proteínas de supraestructura o partículas de orden superior, tales como las v Pl , puede confirmarse, por ejemplo, por SDS-PAGE nativa o, análisis Western mediante el uso de un anticuerpo de detección apropiado, electroforesis capilar, microscopía electrónica o cualquier otro método como sería evidente para un experto en la técnica.
La Figura 4A muestra un ejemplo de un perfil de elución de un análisis de cromatografía de exclusión por tamaños de un extracto vegetal que comprende PVLP. En este caso, las VLP que comprenden la cápside del enterovirus EV71, eluyen en fracciones de 9 a aproximadamente 14, con un pico en la fracción 12.
Las VLP pueden purificarse o extraerse mediante el uso de cualquier método adecuado, por ejemplo, extracción química o bioquímica. Las VLP pueden ser relativamente sensibles a la desecación, el calor, el pH, los tensioactivos y los detergentes. Por lo tanto, puede ser útil usar métodos que maximicen los rendimientos, minimicen la contaminación de la fracción de VLP con proteínas celulares, mantengan la integridad de las proteínas, o VLP, y métodos de aflojamiento de la pared celular para liberar las proteínas o VLP. Por ejemplo, pueden usarse métodos que producen protoplastos y/o esferoplastos (ver por ejemplo el documento WO 2011/035422) para obtener VLP como se describe en la presente descripción. Minimizar o eliminar el uso de detergentes o tensioactivos como, por ejemplo, SDS o Triton X-100 puede ser beneficioso para mejorar el rendimiento de la extracción de VLP. A continuación, puede evaluarse la estructura y el tamaño de las VLP mediante, por ejemplo, microscopía electrónica o mediante cromatografía de exclusión por tamaño, como se mencionó anteriormente, y someterse a ultracentrifugación analítica.
El tamaño (es decir, el diámetro) de las PVLP definidas anteriormente, puede medirse, por ejemplo, por técnicas de dispersión dinámica de luz (DLS) o de microscopía electrónica (EM), suele estar entre 20 y 50 nm, o cualquier tamaño intermedio. Por ejemplo, el tamaño de la estructura PVLP intacta puede oscilar de aproximadamente 25 nm a aproximadamente 35 nm, o cualquier tamaño intermedio, o de 20 nm, 21 nm, 22 nm, 23 nm, 24 nm, 25 nm, 26 nm, 27 nm, 28 nm, 29 nm, 30 nm, 31 nm, 32 nm, 33 nm, 34 nm, 35 nm, 36 nm, 37 nm, 38 nm, 39 nm, 40 nm, 41 nm, 42 nm, 43 nm, 44 nm, 45 nm, 46 nm, 47 nm, 48 nm, 49 nm, 50 nm, o cualquier tamaño intermedio.
El PVLP puede sintetizarse en una cantidad de hasta 2 g por kilogramo de peso fresco de la planta, lo que corresponde a aproximadamente el 40 % del contenido proteico total de la planta. Por ejemplo, como se describe en el presente documento, la cantidad de VLP sintetizada puede estar entre 10 mg y 2,0 g por kilogramo de peso fresco, o cualquier cantidad entre ellas, tales como 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 o 2000 mg por kilogramo de peso fresco o cualquier cantidad intermedia.
Hospedero
El uno o más de los constructos genéticos de la presente invención pueden expresarse en cualquier planta hospedera adecuada o parte de la planta, por ejemplo, una o más hojas, el tallo más una o más hojas, o las raíces, que se transforma por la secuencia de nucleótidos, constructos o vectores de la presente invención. Los ejemplos de hospederos adecuados incluyen, pero no se limitan a, cultivos agrícolas que incluyen alfalfa, canola, Brassica spp., maíz, Nicotiana spp., patata, ginseng, guisante, avena, arroz, soja, trigo, cebada, girasol, algodón y similares.
El uno o más constructos genéticos de la presente invención pueden comprender además una región 3' no traducida. Una región 3' no traducida se refiere la porción de un gen que comprende un segmento de ADN que contiene una señal de poliadenilación y cualquier otra señal reguladora capaz de efectuar el procesamiento del ARNm o la expresión génica. La señal de poliadenilación se caracteriza generalmente por efectuar la adición de colas de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de ARNm. Las señales de poliadenilación se reconocen comúnmente por la presencia de homología con la forma canónica 5' AATAAA-3', aunque las variaciones no son infrecuentes. Ejemplos no limitantes de regiones 3' adecuadas son las regiones no traducidas transcritas en 3' que contienen una señal de poliadenilación de genes del plásmido inductor de tumores (Ti) de Agrobacterium, tal como el gen de la nopalina sintasa (NOS) y genes vegetales tales como los genes de la proteína de almacenamiento de la soja, la subunidad pequeña del gen de la ribulosa-I, 5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO; documento US 4,962,028)), el promotor usado para regular la expresión de plastocianina, descrito en US 7,125,978.
Uno o más de los constructos genéticos de la presente invención también pueden incluir potenciadores adicionales, potenciadores de la traducción o de la transcripción, según sea necesario. Los potenciadores pueden ubicarse 5' o 3' con respecto a la secuencia que se está transcribiendo. Las regiones potenciadoras son bien conocidas por los expertos en la técnica y pueden incluir un codón de iniciación ATG, secuencias adyacentes o similares. El codón de iniciación, si está presente, puede estar en fase con el marco de lectura ("en marco") de la secuencia de codificación para proporcionar la traducción correcta de la secuencia transcrita.
Los constructos de la presente invención pueden introducirse en células vegetales mediante el uso de plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores de virus de plantas, transformación directa de ADN, microinyección, electroporación, etc. Para revisiones de tales técnicas véase, por ejemplo, Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, Nueva York VIII, págs. 421-463 (1988); Geierson y Corey, Plant Molecular Biology, 2da Ed. (1988); y Miki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. En Plant Metabolism, 2da Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (editores), Addison Wesly, Langmans Ltd. Londres, págs. 561-579 (1997). Otros métodos incluyen la captación directa de ADN, el uso de liposomas, la electroporación, por ejemplo, mediante el uso de protoplastos, microinyección, microproyectiles o fibras e infiltración al vacío. Véase, por ejemplo, Bilang, y otros (Gene 100: 247-250 (1991), Scheid y otros (Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991), Guerche y otros (Plant Science 52: 111-116, 1987), Neuhause y otros (Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987), Klein y otros, Nature 327: 70-73 (1987); Howell y otros (Science 208: 1265, 1980), Horsch y otros (Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlock y otros, Plant Physiology 91: 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach y Weissbach, editores, Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler y Zielinski, editores., Academic Press Inc., 1989), Liu y Lomonossoff (J Virol Meth, 105:343-348, 2002,), patentes de EE. UU. números 4,945,050; 5,036,006; y 5,100,792, solicitudes de patente de EE. UU. números de serie 08/438,666, presentada 10 de Mayo, 1995, y 07/951,715, presentada 25 septiembre, 1992.
Expresión transitoria
Sin pretender estar ligado a la teoría, la concentración de proteína y la relación de las diferentes proteínas estructurales de picornavirus, las poliproteínas de picornavirus y/o la proteasa pueden ser importantes para la eficiencia de ensamblaje de las PVLP. Por lo tanto, la multiplicidad y el tiempo de infección pueden ser importantes para manipular la concentración de proteínas y la eficiencia general de ensamblaje de las VLP en las plantas.
El constructo de la presente invención puede expresarse transitoriamente en una planta, parte de una planta o una célula vegetal. Puede usarse un sistema de expresión transitoria que se basa en la expresión epicromosómica de la poliproteína recombinante introducida, a través de la infiltración de Agrobacterium tumefaciens en una planta, parte de una planta o célula vegetal para expresar la proteína estructural de picornavirus, la poliproteína de picornavirus y/o la proteasa, dirigida a varios compartimentos o subcompartimentos celulares. Un sistema de expresión transitoria permite una alta velocidad de producción. Además, pueden obtenerse grandes cantidades de proteína en unos pocos días después de la infiltración de Agrobacterium recombinante en plantas (Rybicki, 2010; Fischer y otros, 1999). También es posible expresar secuencias genéticas largas y tener más de un gen expresado simultáneamente en la misma célula, lo que permite un ensamblaje eficaz de proteínas multiméricas (Lombardi y otros, 2009).
Sin embargo, durante la expresión transitoria, el silenciamiento génico postranscripcional puede limitar la expresión de las proteínas heterólogas en las plantas. La coexpresión de un supresor del silenciamiento, por ejemplo, pero no se limitan a, Nss del virus de la marchitez manchada del tomate, puede usarse para contrarrestar la degradación específica de los ARNm transgénicos (Brigneti y otros, 1998). Los supresores de silenciamiento alternativos son bien conocidos en la técnica y pueden usarse como se describe en la presente descripción (Chiba y otros, 2006, Virology 346:7-14), por ejemplo, pero no se limitan a, HcPro, TEV -p1/HC-Pro (virus del grabado del tabaco-pl/HCPro), BYV -p21, p19 del virus del enanismo ramificado del tomate (TBSV p19), proteína de cápside del virus del arrugamiento del tomate (TCV -CP), 2b del virus del mosaico del pepino; CMV-2b), p25 del virus X de la patata (PVX-p25), p11 del virus M de la patata (PVM-p11), p11 del virus S de la patata (PVS-p11), p16 del virus de la quemazón del arándano (BScV -p16), p23 del virus de la tristeza de los cítricos (CTV-p23), p24 del virus-2 asociado al enrollamiento de la hoja de vid, (GLRaV-2 p24), p10 del virus de la vid A, (GVA-p10), p14 del virus de la vid B (GVB-p14), p10 del virus latente de Heracleum (HLV-p10) o p16 del virus latente común del ajo (GCLV-p16). Por lo tanto, un supresor de silenciamiento, por ejemplo HcPro, TEV -p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSVp19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 o GVA-p10, puede coexpresarse junto con una o más proteínas estructurales de picornavirus, poliproteínas de picornavirus y/o proteasas para asegurar además altos niveles de producción de proteínas dentro de una planta o parte de una planta o una célula vegetal.
También se describe un método como se describe anteriormente, en donde una (tercera) secuencia de nucleótidos adicional se expresa dentro de la planta, la secuencia de nucleótidos adicional (tercera) que codifica un supresor de silenciamiento se une operativamente con una (tercera) región reguladora adicional que está activa en la planta. La secuencia de nucleótidos que codifica un supresor de silenciamiento puede ser, por ejemplo, Nss, HcPro, TEV -p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSV p19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 o GVA-p10.
Como se describe más abajo, pueden usarse métodos de expresión transitoria para expresar los constructos de la presente invención (véase Liu y Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348). Alternativamente, puede usarse un método de expresión transitorio basado en vacío, como se describe por Kapila y otros, 1997). Estos métodos pueden incluir, por ejemplo, pero no se limitan a, un método de agroinoculación o agroinfiltración, infiltración con jeringa, sin embargo, también pueden usarse otros métodos transitorios como se indicó anteriormente. Con agroinoculación, agroinfiltración o infiltración con jeringa, una mezcla de Agrobacteria que comprende el ácido nucleico deseado se introduce en los espacios intercelulares de un tejido, por ejemplo, las hojas, la parte aérea de la planta (que incluye el tallo, las hojas y la flor), otra parte de la planta (tallo, raíz, flor) o la planta completa. Después de cruzar la epidermis, las agrobacterias infectan y transfieren
ADN-t se transcribe de manera episomal y el ARNm se traduce, lo que conduce a la producción de la proteína de interés en las células infectadas, sin embargo, el paso del ADN-t dentro del núcleo es transitorio.
También se describen plantas, células vegetales o semillas transgénicas que contienen los ácidos nucleicos o uno o más constructos génicos de la presente invención. También se conocen en la técnica los métodos para regenerar plantas enteras a partir de células vegetales. En general, las células vegetales transformadas se cultivan en un medio apropiado, que puede contener agentes de selección tales como antibióticos, donde se usan marcadores de selección para facilitar la identificación de las células vegetales transformadas de forma estable. Para ayudar en la identificación de células vegetales transformadas de forma estable, los constructos de esta invención pueden manipularse adicionalmente para incluir marcadores seleccionables de plantas. Los marcadores seleccionables útiles incluyen enzimas que proporcionan resistencia a productos químicos tales como antibióticos, por ejemplo, gentamicina, higromicina, kanamicina, o herbicidas tales como fosfinotricina, glifosato, clorosulfurón y similares. De manera similar, pueden usarse enzimas que proporcionan la producción de un compuesto identificable por cambio de color, tal como GUS (beta-glucuronidasa), o luminiscencia, tal como luciferasa o GFP. Una vez que se forma el callo, puede fomentarse la formación de brotes con el empleo de las hormonas vegetales apropiadas de acuerdo con métodos conocidos y los brotes se transfieren a un medio de enraizamiento para la regeneración de las plantas. Las plantas pueden usarse después para establecer generaciones repetitivas, ya sea a partir de semillas o mediante el uso de técnicas de propagación vegetativa. Las plantas transgénicas también pueden generarse sin usar cultivos de tejidos.
Elementos de amplificación
La relación de poliproteína a proteasa puede variarse, por ejemplo, mediante el uso de diferentes elementos reguladores, o una combinación de elementos reguladores, en las secuencias de ácido nucleico usadas para impulsar la expresión de la poliproteína y la proteasa. Por ejemplo, puede usarse un primer conjunto o combinación de elementos reguladores para regular la replicación, la transcripción o una combinación de las mismas del primer ácido nucleico y puede usarse un segundo conjunto o combinación de elementos reguladores para regular la replicación, la transcripción o una combinación de las mismas, del segundo ácido nucleico de modo que se logre una diferencia en la expresión del primer y segundo ácidos nucleicos al modular de esta manera la relación de poliproteína:proteasa in vivo. Por ejemplo, lo que no debe considerarse limitante del primer conjunto o combinación de elementos reguladores puede incluir un elemento de amplificación, por ejemplo, elementos obtenidos de BeYDV, mientras que el elemento de amplificación puede estar ausente en el segundo conjunto o combinación de elementos reguladores. Alternativamente, el segundo conjunto puede incluir un elemento de amplificación, por ejemplo, elementos obtenidos de BeYDV, mientras que el elemento de amplificación puede estar ausente en el primer conjunto o combinación de elementos reguladores.
"Casete de expresión" se refiere a una secuencia de nucleótidos que comprende un ácido nucleico de interés bajo el control de, y unido operativamente (u operativamente) a, un promotor apropiado u otros elementos reguladores para la transcripción del ácido nucleico de interés en una célula hospedera.
El sistema de expresión como se describe en la presente descripción puede comprender un casete de expresión en base a un virus bipartito, o un virus con un genoma bipartito. Por ejemplo, los virus bipartitos pueden ser de la familia Comoviridae. Los géneros de la familia Comoviridae incluyen Comovirus, Nepovirus, Fabavirus, Cheravirus y Sadwavirus. Los comovirus incluyen el virus del mosaico del caupí (CPMV), el virus del mosaico grave del caupí (CPSMV), el virus del mosaico de la calabaza (SqMV), el virus del moteado del trébol rojo (RCMV), el virus del moteado de la vaina del frijol (BPMV), el virus de la mancha anular del nabo (TuRSV), el virus del mosaico verdadero de la haba (BBtMV), virus de la mancha de haba (BBSV), virus del mosaico del rábano (RaMV). Los ejemplos de secuencias de ARN-2 de comovirus que comprenden elementos potenciadores que pueden ser útiles para varios aspectos de la invención incluyen, pero no se limitan a: CPMV RNA-2 (número. de acceso de GenBank nC_003550), RCMV RNA-2 (número de acceso de GenBank NC_003738), b PmV RNA-2 (número de acceso de GenBank NC_003495), CPs Mv RNA-2 (número de acceso de GenBank Nc_003544), SqMV RNA-2 (número de acceso de GenBank Nc_003800), TuRSV RNA-2 (número de acceso de GenBank nC_013219.1). BBtMV RNA-2 (número de acceso de GenBank GU810904), BbSv RNA2 (número de acceso de GenBank FJ028650), RaMV (número de acceso de GenBank NC_003800)
Los segmentos del genoma del ARN comoviral bipartito se denominan como ARN-1 y ARN-2. El ARN-1 codifica las proteínas involucradas en la replicación, mientras que el ARN-2 codifica las proteínas necesarias para el movimiento de célula a célula y las dos proteínas de la cápside. Puede usarse cualquier casete basado en comovirus adecuado, incluidos CPMV, CPSMV, SqMV, RCMV o BPMV, por ejemplo, el casete de expresión puede estar en base a CPMV. Los sistemas de expresión también pueden comprender elementos de amplificación de un geminivirus, por ejemplo, un elemento de amplificación del virus del enanismo amarillo del frijol (BeYDV). BeYDV pertenece al género Mastrevirus adaptado a plantas dicotiledóneas. BeYDV es monopartita con un genoma de ADN circular monocatenario y puede replicarse a números de copia muy altos mediante un mecanismo de círculo rodante. Los sistemas de vectores replicones de ADN derivados de BeYDV se han usado para la producción rápida de proteínas con alto rendimiento en plantas.
Como se usa en la presente, la frase "elementos de amplificación" se refiere a un segmento de ácido nucleico que comprende al menos una parte de una o más regiones intergénicas largas (LIR) de un genoma de geminivirus. Como se usa en la presente, "región intergénica larga" se refiere a una región de una región intergénica larga que contiene un sitio de unión a rep capaz de mediar la escisión y replicación por una proteína Rep de geminivirus. En algunos aspectos, el segmento de ácido nucleico que comprende una o más LIR, puede comprender además una región intergénica corta (SIR) de un genoma de geminivirus. Como se usa en la presente, "región intergénica corta" se refiere a la cadena complementaria (la IR corta (SIR) de un Mastrevirus). En la presente descripción puede usarse cualquier elemento de amplificación derivado de geminivirus adecuado. Véase, por ejemplo, los documentos WO2000/20557; WO2010/025285; Zhang X. y otros (2005, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 93, 271-279), Huang Z. y otros (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, 706-714), Huang Z. y otros (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 106, 9-17)).
Elemento regulador
También se describe un constructo génico que comprende un ácido nucleico que codifica una poliproteína, tal como una o más proteínas de picornavirus, o una proteasa, por ejemplo, pero no se limitan a, la proteasa de picornavirus, como se describió anteriormente, unido operativamente a un elemento regulador que es operativo en una planta. El uso de las expresiones "región reguladora", "elemento regulador" o "promotor" en la presente solicitud pretende reflejar una porción de ácido nucleico típicamente, pero no siempre, aguas arriba de la región codificante de proteínas de un gen, que puede estar compuesto por ADN o ARN, o tanto ADN como ARN. Cuando una región reguladora está activa, y en asociación operativa, o unida operativamente, con un gen de interés, esta puede dar como resultado la expresión del gen de interés. Un elemento regulador puede ser capaz de mediar la especificidad en un órgano o controlar la activación de genes por el desarrollo o temporal. Una "región reguladora" puede incluir elementos promotores, elementos promotores centrales que exhiben una actividad promotora basal, elementos que son inducibles en respuesta a un estímulo externo, elementos que median la actividad promotora tales como elementos reguladores negativos o potenciadores de la transcripción. "Región reguladora", como se usa en la presente descripción, también incluye elementos que son activos después de la transcripción, por ejemplo, elementos reguladores que modulan la expresión génica tales como potenciadores de la transcripción y la traducción, represores de la transcripción y la traducción, secuencias de activación aguas arriba y determinantes de inestabilidad del ARNm. Varios de estos últimos elementos pueden ubicarse próximos a la región codificante.
Los ejemplos de elementos reguladores operativos en una célula vegetal y que pueden usarse de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, una región reguladora de plastocianina documento de (US 7 125978), o una región reguladora de ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO; documento de Estados Unidos 4962028), proteína de unión a clorofila a/b (CAB; Leutwiler y otros; 1986), ST-LS 1 (asociada con el complejo generador de oxígeno del fotosistema II y descrita por Stockhaus y otros 1987, 1989).
En el contexto de esta descripción, la expresión "elemento regulador" o "región reguladora" típicamente se refiere a una secuencia de ADN, generalmente, pero no siempre, corriente arriba (5') a la secuencia codificante de un gen estructural, que controla la expresión de la región codificante al proporcionar el reconocimiento para la ARN polimerasa y/u otros factores necesarios para que la transcripción comience en un sitio particular. Sin embargo, debe entenderse que otras secuencias de nucleótidos, ubicadas dentro de los intrones o 3' de la secuencia también pueden contribuir a la regulación de la expresión de una región codificante de interés. Un ejemplo de un elemento regulador que proporciona el reconocimiento de la ARN polimerasa u otros factores de transcripción para garantizar el inicio en un sitio particular es un elemento promotor. La mayoría, pero no todos, los elementos promotores eucariotas contienen una caja TATA, una secuencia de ácidos nucleicos conservada compuesta por pares de bases de nucleótidos de adenosina y timidina, generalmente situados aproximadamente a 25 pares de bases aguas arriba de un sitio de inicio de la transcripción. Un elemento promotor comprende un elemento promotor basal, responsable del inicio de la transcripción, así como también otros elementos reguladores (como se enumeró anteriormente) que modifican la expresión génica.
Hay varios tipos de regiones reguladoras, incluidas aquellas que son reguladas por el desarrollo, inducibles o constitutivas. Una región reguladora que es regulada por el desarrollo, o controla la expresión diferencial de un gen bajo su control, se activa dentro de ciertos órganos o tejidos de un órgano en momentos específicos durante el desarrollo de ese órgano o tejido. Sin embargo, algunas regiones reguladoras que son reguladas por el desarrollo pueden estar activas preferentemente dentro de ciertos órganos o tejidos en etapas específicas del desarrollo, también pueden ser activas de una manera regulada por el desarrollo, o también a un nivel basal en otros órganos o tejidos dentro de la planta. Los ejemplos de regiones reguladoras específicas de tejido, por ejemplo, una región reguladora específica, incluyen el promotor de napina y el promotor de cruciferina (Rask y otros, 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau y otros, 1994, Plant Cell 14: 125-130). Un ejemplo de un promotor específico de la hoja incluye el promotor de plastocianina (véase el documento Estados unidos 7125978).
Una región reguladora inducible es una que es capaz de activar directamente o indirectamente la transcripción de una o más secuencias de ADN o genes en respuesta a un inductor. En ausencia de un inductor, las secuencias de ADN o los genes no se transcribirán. Típicamente, el factor proteico que se une específicamente a una región reguladora inducible para activar la transcripción puede estar presente en una forma inactiva, que después se convierte directamente o indirectamente en la forma activa por el inductor. Sin embargo, el factor proteico también puede estar ausente. El inductor puede ser un agente químico tal como una proteína, metabolito, regulador del crecimiento, herbicida o compuesto fenólico o un estrés fisiológico impuesto directamente por calor, frío, sal o elementos tóxicos o indirectamente a través de la acción de un patógeno o agente patógeno tal como un virus. Una célula vegetal que contiene una región reguladora inducible puede exponerse a un inductor al aplicar externamente el inductor a la célula o planta tal como por pulverización, riego, calentamiento o métodos similares. Los elementos reguladores inducibles pueden derivarse de genes ya sea vegetales o no vegetales (por ejemplo, Gatz, C. y Lenk, LR.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358). Los ejemplos de promotores inducibles potenciales incluyen, pero no se limitan a, promotor inducible por tetraciclina (Gatz, C.,1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. BioI. 48,89-108), promotor inducible por esteroide (Aoyama. T. y Chua, N.H., 1997, Plant 1. 2, 397-404) y promotor inducible por etanol (Salter, M.G., y otros, 1998, Plant 10urnal 16, 127-132; Caddick, M.X., y otros,1998, Nature Biotech. 16, 177­ 180) genes IB6 y CKI 1 inducibles por citoquinina (Brandstatter, I. y K.ieber, 1.1.,1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274,982-985) y el elemento inducible de auxina, DR5 (Ulmasov, T., y otros, 1997, Plant Cell 9, 1963-1971;).
Una región reguladora constitutiva dirige la expresión de un gen a través de las diversas partes de una planta y de manera continua a lo largo del desarrollo de la planta. Los ejemplos de elementos reguladores constitutivos incluyen promotores asociados con el transcrito CaMV 35S (Odell y otros, 1985, Nature, 313: 810-812), los genes de actina de arroz 1 (Zhang y otros, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), actina 2 (An y otros, 1996, Plant J., 10: 107-121), o tms 2 (documento (US 5,428,147), y triosafosfato isomerasa 1 (Xu y otros, 1994, Plant Physiol. 106: 459-467), el gen de ubiquitina del maíz 1 (Cornejo y otros, 1993, Plant Mol. BioI. 29: 637-646), los genes de ubiquitina 1 y 6 de Arabidopsis (Holtorf y otros, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), y el gen del factor de iniciación de la traducción 4A del tabaco (Mandel y otros, 1995, Plant Mol. Biol. 29, 995-1004).
La expresión "constitutivo", como se usa en la presente, no indica necesariamente que un gen bajo el control de la región reguladora constitutiva se expresa al mismo nivel en todos los tipos de células, sino que el gen se expresa en una amplia variedad de tipos de células aun cuando a menudo se observa variación en la abundancia. Los elementos reguladores constitutivos pueden acoplarse con otras secuencias para potenciar aún más la transcripción y/o la traducción de la secuencia de nucleótidos a la que están unidos operativamente. Por ejemplo, el sistema CPMV-HT se deriva de las regiones no traducidas del virus del mosaico del caupí (CPMV) y demuestra una traducción potenciada de la secuencia codificante asociada. Por "nativo" se entiende que el ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos es de origen natural o "de tipo salvaje". Por "unido operativamente" se entiende que las secuencias particulares, por ejemplo, un elemento regulador y una región codificante de interés, interactúan directamente o indirectamente para llevar a cabo una función prevista, tal como la mediación o la modulación de la expresión génica. La interacción de secuencias unidas operativamente puede, por ejemplo, estar mediada por proteínas que interactúan con las secuencias unidas operativamente.
La relación de poliproteína a proteasa puede variarse, además, por ejemplo, mediante el uso de elementos reguladores, elementos de amplificación y/o potenciadores. Por ejemplo, el primer ácido nucleico puede comprender elementos reguladores, elementos de amplificación y/o potenciadores. El segundo ácido nucleico puede comprender o no la misma combinación de elementos reguladores, elementos de amplificación y/o potenciadores.
Por ejemplo, pueden usarse diferentes promotores para impulsar la expresión diferencial entre la poliproteína con respecto a la proteasa in vivo. Por ejemplo, el primer conjunto o combinación de elementos reguladores puede incluir un promotor inducible, mientras que el promotor del segundo conjunto o combinación de elementos reguladores puede ser constitutivo, o el segundo conjunto o combinación de elementos reguladores puede comprender un promotor inducible, mientras que el promotor en el primer conjunto o combinación de elementos reguladores puede ser constitutivo. La fuerza del promotor también puede diferir entre el primer y el segundo conjunto o combinación de elementos reguladores, de modo que se logra la expresión diferencial entre la poliproteína con respecto a la proteasa in vivo.
La presente invención se ilustrará adicionalmente en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1 Expresión de EV71
Síntesis de genes
Se usaron segmentos de ADN que codifican la proteína estructural P1 de EV71 y la proteasa 3CD. Las secuencias candidatas para P1 y 3CD están disponibles en el GenBank. Ejemplos no limitantes de estas secuencias son:
• Para la secuencia de P1 aa: la secuencia de aminoácidos: GenBank ID ADG57603 (aminoácidos 1-862) (SEQ ID NO: 5); secuencia de nucleótidos: GenBank ID GQ279369 (nucleótidos 743-3328) (SEQ ID NO: 6);
• Para 3CD (cepa HK08): secuencia de aminoácidos: GenBank ID ADG57603 (aminoácidos 1549-2193) (SEQ ID NO: 1); secuencia de nucleótidos: GenBank ID GQ279369 (nucleótidos 5386-7321) (SEQ ID NO: 2);
• Para 3CD (cepa GDFS08): secuencia de aminoácidos: GenBank ID ACI25378 (aminoácidos 1549-2193) (SEQ ID NO: 3); secuencia de nucleótidos: GenBank ID FJ194964 (nucleótidos 5387-7321) (SEQ ID NO: 4).
Se sintetizaron dos genes P1. El primero se produjo mediante el uso de la secuencia de tipo salvaje, mientras que el segundo se basó en una secuencia optimizada (uso de codones humanos) determinada mediante el uso de métodos estándar conocidos en la técnica. Los dos genes 3CD se sintetizaron en base a sus secuencias de tipo salvaje. Los 3 genes de tipo salvaje fueron sintetizados por Invitrogen ™ (anteriormente GeneArt®) y el gen P1 optimizado fue optimizado y sintetizado por DNA2.0.
Clonación molecular
Los genes sintetizados se clonaron en vectores de expresión de plantas. Los componentes seleccionados del vector incluyen elementos reguladores de la transcripción y traducción de un casete basado en el virus del mosaico del caupí (CPMV) o un gen de plastocianina de alfalfa. Ambos elementos reguladores se han usado con éxito en nuestra plataforma de alta expresión de proteínas recombinantes. Los elementos de amplificación de ADN del geminivirus del enanismo amarillo del frijol (BeYDV) son otra característica que puede integrarse en nuestros vectores de expresión de plantas. Ha llevado a un gran aumento en la expresión de proteínas para algunos candidatos. Por lo tanto, hemos clonado cada constructo génico en vectores de expresión con o sin elementos de amplificación de ADN. La Tabla 1 presenta los casetes de expresión de plantas ensamblados para el proyecto.
Tabla 1 Casetes de expresión vegetal ensamblados para la expresión de la poliproteína estructural P1 y la proteasa 3CD de EV71 en N. benthamiana.
Región codificante Elemento regulador Elementos de amplificación de ADN Número de vector P1 (Wt HK08) CPMV HT 1300
P1 (Wt HK08) CPMV HT BeYDV+rep 1301
P1 (Wt HK08) Plastocianina 1302
P1 (Wt HK08) Plastocianina BeYDV+rep 1303
P1 (Opt HK08) CPMV HT - 1305
P1 (Opt HK08) CPMV HT BeYDV+rep 1306
P1 (Opt HK08) Plastocianina - 1307
P1 (Opt HK08) Plastocianina BeYDV+rep 1308
3CD (WT HK08) CPMV HT - 1310
3CD (WT HK08) CPMV HT BeYDV+rep 1311
3CD (WT HK08) Plastocianina - 1312
3CD (WT HK08) Plastocianina BeYDV+rep 1313
3CD (peso GDFS08) CPMV HT - 1315
3CD (peso GDFS08) CPMV HT BeYDV+rep 1316 (continuación)
Región codificante Elemento regulador Elementos de amplificación de ADN Número de vector 3CD (peso GDFS08) Plastocianina - 1317 3CD (peso GDFS08)______ Plastocianina________________ BeYDV+rep__________________ 1318_______ Análisis de expresión - selección de los mejores constructos de genes recombinantes
Cada casete de expresión se clonó en un vector de plásmido que luego se transfirió a Agrobacterium tumefaciens. La expresión transitoria se inició mediante la infiltración al vacío del inóculo transgénico de Agrobacterium que conduce a la transferencia de copias móviles de ADN de los constructos de ADN a las células vegetales. La expresión transitoria de múltiples componentes (coexpresión) se realizó mediante infiltración de mezclas de inóculos de Agrobacterium (coinfiltración). Como un componente que se introdujo en la planta era estructural (P1), y el sustrato del segundo componente, la proteasa 3CD, se moduló el nivel de expresión de los dos componentes. Esto se realizó mediante el uso de diferentes promotores, sistemas de amplificación de ADN de fuerza variable, por variación de la abundancia relativa de cada inóculo (P1 y 3CD) en el momento de la infiltración, o una combinación de los mismos.
Los vectores de expresión 1300 a 1308 se cribaron en cuanto a su capacidad para expresar P1 solo y, cuando se combinaron con los vectores 1310 a 1318, en cuanto a su capacidad para producir niveles elevados de los fragmentos proteolíticos VP1-4. Como solo estaba disponible un anticuerpo anti-VP1 (Abnova, MAB1255-M05), la acumulación de fragmentos proteolíticos se controló mediante la acumulación de VP1 y la desaparición de P1 sin procesar. Como se muestra en la Figura 2, la expresión de P1 solo (vector número 1300) condujo a la acumulación de un producto que contenía VP1 que tenía un peso molecular aparente correspondiente al de la proteína estructural sin procesar (98 kDa), lo que indica que las proteasas vegetales no pueden escindir P1 para generar las proteínas de la cápside viral. Sin embargo, cuando P1 se coexpresa con 3CD (vectores números 1300 1310 y 1300 1315), la señal de 98 kDa desaparece por completo y se detecta un nuevo producto que corresponde en peso molecular a VP1 (33,5 kDa). Este resultado muestra que la proteasa viral se produce y es altamente activa en la planta y que reconoce y escinde su sustrato coproducido en las células vegetales para generar proteínas de la cápside EV71. Los resultados obtenidos indicaron que el nivel de acumulación de VP1 en la planta está influenciado por la relación de Agrobacterium que contiene la proteína P1 a Agrobacterium que contiene la proteasa 3CD, obteniéndose una mayor acumulación con una menor proporción de Agrobacterium que contiene la proteasa 3CD (Figura 2: comparar 1300 1315 (4:2), 1300+1315 (4:1) y 1300+1315 (4:0,5)). El origen de 3CD, ya sea HK08 vs GDFS08, también impacta en el nivel de acumulación de VP1 en la planta (Figura 2: 1300+1310 (4:0,5) vs 1300+1315 (4:0,5)). Finalmente, se observó que el mayor nivel de acumulación de VP1 se obtuvo a partir de vectores de expresión que comprenden elementos de amplificación de ADN (Figura 2: 1301+1311 (4:2)).
En el siguiente experimento, P1 se mantuvo bajo el control de CPMV-HT+BeYDV (1301) mientras se cotransformaban diferentes casetes de expresión de 3Cd a diferentes diluciones en el momento de la infiltración. El análisis de transferencia Western mediante el uso de el anticuerpo monoclonal anti-VP1 en extractos de proteína cruda de las plantas transformadas indicó que se observó acumulación de VP1 en un intervalo de proporciones de P1 a proteasa y componentes del constructo. La combinación de vectores que resultó en el nivel más alto de acumulación de VP1 fue 1301 1310, con una relación de concentración de cepas de Agrobacterium de 4:0,5 (proteína estructural: proteasa) en la suspensión bacteriana (Figura 3).
Análisis de la formación de VLP
La incorporación de VP1 en las VLP se evaluó con el uso de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de extractos concentrados. Las partículas coloidales se concentraron a partir de extractos crudos clarificados mediante centrifugación de alta velocidad (75000 x g durante 20 minutos.). El sedimento se lavó y se resuspendió en 1/6 del volumen de tampón de resuspensión (PBS 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM) y se cargó en una columna de filtración en gel Sephacryl S-500. La columna se eluyó con tampón de resuspensión y las fracciones de elución se caracterizaron mediante s DS-PAGE y transferencia Western.
Un extracto de proteína de plantas transformadas transitoriamente con 1301 1310 (4:0,5) se sometió a separación SEC y las fracciones de elución se analizaron mediante SDS-PAGE teñida con Coomassie y transferencia Western anti-VP1. Los resultados presentados en la Figura 4A muestran que la mayoría de las proteínas hospederas eluyeron de la columna en las fracciones tardías, con un pico en la fracción 16, mientras que la señal específica de VP1 se encontró en fracciones anteriores, con un pico en la fracción 12, donde se encuentra muy poca proteína hospedera. Al ser VP1 una proteína relativamente pequeña, se esperaría que eluyera de la columna con la mayoría de las proteínas hospederas si no se incorpora en estructuras de alto peso molecular. Por tanto, el perfil de elución observado para VP1 era fuertemente indicativo de que VP1 se había integrado en una estructura de alto peso molecular. Una combinación de la transferencia Western y el gel teñido con Coomassie también sugirió que la proteína abundante identificada por una flecha en la SDS-PAGE teñida con Coomassie en la Figura 4A podría ser VP1.
Se envió una muestra de la fracción de elución 12 de este experimento al Institut Armand-Frappier (IAF, Laval, Québec) para su análisis mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). La muestra se examinó después de una tinción negativa con ácido fosfotúngstico al 3 %. La Figura 4B muestra que en la fracción de elución 12 se observan partículas esféricas de 30 nm de tamaño y aspecto idénticos a las partículas vacías de EV71 encontradas en cultivos de células Vero infectadas con EV71 (Liu y otros, PLoS ONE 6, e20005). Este resultado indica que las estructuras de alto peso molecular en las que se incorpora VP1 son VLP de EV71 genuinas.
Purificación parcial
El método de purificación de VLP de la plataforma de cribado VLPExpress se desarrolló para la purificación de VLP envueltas (140 nm de diámetro) a partir de biomasa vegetal transformada. El método usa una digestión enzimática de las paredes celulares para la liberación del contenido extracelular y citosólico y el extracto obtenido se somete a una filtración profunda y a una microfiltración antes de ser centrifugado a 16000 g durante 6 horas para sedimentar las VLP. El sedimento se resuspende en 1/60 de volumen de solución de resuspensión (Na/KPO4 100 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Tween-80 al 0,01 %) y se filtra de forma estéril (0,2 |jm).
Se probó la capacidad del método de purificación VLPExpress para concentrar las VLP EV71 sin envoltura de 30 nm. El método de purificación se aplicó a plantas transformadas con los vectores de expresión 1301 1310 (4:0,5). El producto resultante se analizó mediante SDS-PAGE teñida con Coomassie y transferencia Western anti-VP1 (Figura 5A). El análisis SDS-PAGE teñido con Coomassie del producto de purificación mostró la presencia de proteínas correspondientes en peso molecular a las proteínas de cubierta de EV71 (indicadas por flechas, Figura 5A, panel derecho). La identidad de VP1 fue confirmada por transferencia Western (Figura 5A, panel izquierdo). Para otras proteínas de la cápside, la identificación se basó en el peso molecular estimado; 37,5 kDa para v P0 y 26,5 kDa para VP3. Se esperaba que VP4 y VP2 se encontraran en forma de VP0 no escindida ya que en la formación de partículas virales la escisión entre VP4 y VP2 solo ocurre después de la internalización del ARN viral. El análisis por microscopía electrónica de transmisión del producto purificado reveló abundantes estructuras esféricas de 30 nm, correspondientes en tamaño y forma a las v Lp de EV71 (Figura 5B).
Conclusiones sobre la expresión
El trabajo realizado para demostrar la capacidad de la plataforma de expresión transitoria basada en plantas para producir VLP de EV71 ha llevado a las siguientes conclusiones:
• Las proteínas P1 y 3CD de EV71se producen de manera eficiente en el sistema
• La 3CD es activa en la planta y procesa correctamente a P1 en proteínas de la cápside
• Las proteínas de la cápside de EV71 se ensamblan en VLP
• Las VLP de EV71 son extraíbles y pueden purificarse intactas a partir de biomasa vegetal.
Ejemplo de referencia 2- Expresión de poliovirus
Síntesis de genes
Pueden usarse segmentos de ADN que codifican la proteína estructural P1 del poliovirus (PV) y la proteasa 3CD del serotipo PV-1 del enterovirus C humano. Las secuencias candidatas para P1 y 3CD están disponibles en el GenBank. Ejemplos no limitantes de estas secuencias son:
Para P1: secuencia de aminoácidos GenBank ID NP_041277 (aminoácidos 1-881) (SEQ ID NO: 10); secuencia de nucleótidos: GenBank ID NC_002058 (nucleótidos 743-3385) (SEQ ID NO: 9);
Para 3CD: secuencia de aminoácidos GenBank ID NP_041277 (aminoácidos 1566-2209) (SEQ ID NO: 8); secuencia de nucleótidos: GenBank ID NC_002058 (nucleótidos 5438-7369) (SEQ ID NO:7).
Pueden sintetizarse dos genes P1. El primero puede producirse mediante el uso de la secuencia de tipo salvaje mientras que el segundo puede basarse en una secuencia optimizada (uso de codones humanos) determinada mediante el uso de métodos estándar como se conoce en la técnica. El gen 3CD puede sintetizarse en base a su secuencia de tipo salvaje. Ambos genes de tipo salvaje (P1 y 3CD) pueden sintetizarse mediante Invitrogen™ (anteriormente GeneArt®) y el gen P1 optimizado se optimiza y sintetiza mediante DNA2.0.
Clonación molecular
Los genes sintetizados pueden clonarse en vectores de expresión de plantas. Los componentes seleccionados del vector incluyen elementos reguladores de la transcripción y traducción de un casete basado en el virus del mosaico del caupí (CPMV) o un gen de plastocianina de alfalfa, ya que ambos elementos reguladores se han usado previamente con éxito para una alta expresión de proteínas recombinantes. Los elementos de amplificación de ADN del geminivirus del enanismo amarillo del frijol (BeYDV) también pueden integrarse en los vectores de expresión de plantas. Por lo tanto, cada constructo génico puede clonarse en vectores de expresión con o sin elementos de amplificación de ADN. La Tabla 2 presenta los casetes de expresión de plantas que pueden ensamblarse.
Tabla 2. Casetes de expresión vegetal para la expresión de poliproteína estructural P1 y proteasa 3CD de PV en N.
benthamiana.
Región codificante Elemento regulador Elementos de amplificación de ADN P1 (WT) CPMV HT
P1 (WT) CPMV HT BeYDV+rep
P1 (WT) Plastocianina
P1 (WT) Plastocianina BeYDV+rep
P1 (Opt) CPMV HT -P1 (Opt) CPMV HT BeYDV+rep
P1 (Opt) Plastocianina -P1 (Opt) Plastocianina BeYDV+rep
3CD CPMV HT -
3CD CPMV HT BeYDV+rep
3CD Plastocianina -3CD Plastocianina BeYDV+rep
Análisis de expresión - selección de los mejores constructos de genes recombinantes
Cada casete de expresión puede clonarse en un vector de plásmido que luego puede transferirse a Agrobacterium tumefaciens. La expresión transitoria puede iniciarse mediante la infiltración al vacío del inóculo de Agrobacterium transgénico que conduce a la transferencia de copias de ADN móviles de los constructos de ADN a las células vegetales. La expresión transitoria de múltiples componentes (coexpresión) puede realizarse por infiltración de mezclas de inóculos de Agrobacterium (coinfiltración). Como un componente que se introduce en la planta es estructural (P1) y el sustrato del segundo componente, la proteasa 3CD, el nivel de expresión de los dos componentes puede modularse. Esto puede realizarse mediante el uso de diferentes promotores, sistemas de amplificación de ADN de fuerza variable, por variación de la abundancia relativa de cada inóculo (P1 y 3CD) en el momento de la infiltración, o una combinación de los mismos.
Los vectores de expresión con P1 pueden cribarse primero en cuanto a su capacidad para expresar P1 solo, y cuando se combinan con vectores 3CD, en cuanto a su capacidad para producir altos niveles de fragmentos proteolíticos. La acumulación de fragmentos proteolíticos puede controlarse mediante la desaparición de P1 sin procesar. Se muestra que la proteasa viral se produce y es altamente activa en la planta, así como también es capaz de reconocer y escindir su sustrato coproducido en las células de la planta para generar proteínas de la cápside PV.
El nivel de acumulación de fragmentos proteolíticos en la planta puede estar influenciado por la relación de Agrobacterium que contiene la proteína P1 a Agrobacterium que contiene la proteasa 3CD, obteniéndose una mayor acumulación con una menor proporción de Agrobacterium que contiene la proteasa 3CD. Se observa con respecto a la presencia de elementos de amplificación de ADN y el uso de los diferentes elementos reguladores sobre el procesamiento de P1 y la acumulación de fragmentos proteolíticos.
Análisis de la formación de VLP
La incorporación de VP1 en VLP puede evaluarse con el uso de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de extractos concentrados. Las partículas coloidales pueden concentrarse a partir de extractos crudos clarificados mediante centrifugación de alta velocidad. El sedimento puede lavarse y resuspenderse en 1/6 del volumen de tampón de resuspensión y cargarse en una columna de filtración de gel. La columna puede eluirse con tampón de resuspensión y las fracciones de elución se caracterizan por SDS-PAGE y transferencia Western.
Un extracto de proteína de plantas transformadas transitoriamente puede someterse a separación SEC y las fracciones de elución se analizan mediante SDS-PAGE teñida con Coomassie. Los resultados pueden mostrar que la mayoría de las proteínas hospederas eluyeron de la columna en las últimas fracciones, mientras que la señal específica de VP1 puede encontrarse en las primeras fracciones. Al ser VP1 una proteína relativamente pequeña, se esperaría que eluyera de la columna con la mayoría de las proteínas hospederas si no se incorpora en estructuras de alto peso molecular. Por tanto, el perfil de elución observado para VP1 puede ser un fuerte indicativo de que VP1 se había integrado en una estructura de alto peso molecular. Una combinación de transferencia Western y el gel teñido con Coomassie también puede sugerir que la abundante proteína observada en el SDS-PAGE teñido con Coomassie podría ser VP1.
Puede enviarse una muestra de este experimento al Institut Armand-Frappier (IAF, Laval, Québec) para su análisis por microscopía electrónica de transmisión (TEM). El resultado indica que las estructuras de alto peso molecular en las que se incorpora VP1 son VLP de PV genuinas.
Purificación parcial
El método de purificación de VLP de la plataforma de cribado VLPExpress se desarrolló para la purificación de VLP envueltas (140 nm de diámetro) a partir de biomasa vegetal transformada. El método usa una digestión enzimática de las paredes celulares para la liberación del contenido extracelular y citosólico y el extracto obtenido se somete a una filtración profunda y a una microfiltración antes de ser centrifugado para sedimentar las VLP. El sedimento se resuspende en solución de resuspensión y se filtra de forma estéril.
El método de purificación VLPExpress puede probarse para determinar su capacidad para concentrar las PV VLP sin envoltura. El análisis SDS-PAGE teñido con Coomassie del producto de purificación puede mostrar la presencia de proteínas correspondientes en peso molecular a las proteínas de cubierta PV. La identificación de las proteínas de la cápside puede basarse en su peso molecular estimado.
Ejemplo 3- Purificación
La extracción de proteínas se realizó mediante el uso de la técnica de extracción mecánica o la degradación enzimática de la pared celular como se describe en los documentos WO 2011/035422 y PCT/CA2012/050180. La extracción enzimática es ventajosa sobre la extracción mecánica, ya que da como resultado una mayor liberación de producto con una liberación mínima de proteínas vegetales contaminantes, siendo los principales contaminantes en el extracto resultante las enzimas usadas para la ruptura de la pared celular, que pueden eliminarse mediante el uso de etapas posteriores adecuadas aguas abajo.
Los extractos mecánicos o enzimáticos se sometieron a centrifugación para eliminar restos celulares, Agrobacterias, ADN y partículas de mayor tamaño. Luego, los extractos centrifugados se pasaron a través de etapas de filtración realizadas para eliminar los sólidos en suspensión, reducir la carga biológica y estabilizar y acondicionar el extracto antes del procesamiento aguas abajo. Aunque no se pudo evaluar la recuperación de VLP de EV71 en el filtrado en ausencia de un ensayo de cuantificación, los análisis de transferencia Western indicaron que la pérdida de VLP durante las etapas de filtración fue mínima. El extracto clarificado resultante se procesó adicionalmente mediante filtración de flujo tangencial (TFF) o se cargó directamente en medios cromatográficos, según fuera adecuado. El tamaño de las VLP permite el uso de TFF para la eliminación eficaz y selectiva de las proteínas solubles que se encuentran en el extracto clarificado, incluidas las enzimas usadas para la despolimerización de la pared celular. La etapa TFF también concentra VLP y permite un intercambio de tampón en preparación para la cromatografía.
Se evaluaron varios enfoques de cromatografía (intercambio de aniones, intercambio de cationes, cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) y pseudoafinidad), modos (unión o flujo continuo) y condiciones tampón (pH de 5 a 8, conductividad de 10 a 80 mS/cm) para su capacidad para aumentar la pureza y reducir el ADN y las endotoxinas contaminantes, mientras que conserva las características deseadas de una VLP. Hemos descubierto que, en determinadas condiciones, POROS® D (una resina de intercambio aniónico débil) usada en modo de flujo continuo podría proporcionar la eliminación más eficaz de ADN y endotoxinas de las VLP de EV71 concentradas.
Se añadió una segunda etapa de TFF después de la cromatografía en el proceso de purificación de VLP de EV71. El papel de esta etapa de TFF fue concentrar y formular el producto en el tampón deseado. El tamaño de poro y las condiciones operativas para esta segunda etapa de TFF se determinaron en base a los parámetros identificados para el primer TFF. Finalmente, se obtuvo una sustancia farmacológica con partículas de EV71 aparentemente puras concentradas después de una filtración de 0,22 pm. El producto se formuló en PBS que contenía polisorbato 80 al 0,01 %.
Caracterización de VLP
Se produjo un primer lote de VLP de EV71 con el proceso adaptado descrito anteriormente (lote número 479-23­ 018) y el producto se caracterizó por completo (Tabla 3, lote número 479-23-018). La pureza se determinó mediante densitometría a partir de exploraciones de geles teñidos con Coomassie, donde solo las bandas que mostraban señales positivas en transferencias Western (anti VP1-VP2) y que podían confirmarse aún más mediante espectrometría de masas, se consideraban como parte del producto. El análisis del perfil de calidad del producto indicó que la preparación contenía VLP de EV71 de alta pureza.
Tabla 3 Atributos de calidad de VLP de EV71, lote número 479-23-018.
Atributo Proceso inicial de VLP de EV71
Número de lote 479-23-018
Pureza 96,4 %
(continuación)
Atributo Proceso inicial de VLP de EV71
Concentración de proteína (BCA, |jg/ml) 1192,4
SEC-HPLC (% en volumen vacío 100 %
(estructuras de alto peso molecular)
Dispersión de la luz
48,3
Microscopio de electrones Partículas redondas Aprox. 30 nm Bien disperso Mapeo tríptico/MS 2
Número de impurezas detectadas Ubiquitina (4 pep)
(p<0,05 y >2 péptidos) Peroxidasa (2 pep)
3 primeras impurezas
Carga biológica (UFC//mL) <10
■Estimaciones preliminares calculadas a partir de una sola corrida.
Un análisis adicional del producto por microscopía electrónica confirmó que las VLP de EV71 purificadas estaban intactas (Figura 6A) y el mapeo tríptico por espectrometría de masas confirmó la pureza del producto.
Ejemplo 4 - Modificaciones del proceso
Purificación de VLP con VP1 intacto por HIC
Durante el cribado inicial de los enfoques cromatográficos para purificar las VLP de EV71, se observó que las resinas HIC podían separar las VLP que contenían VP1 intacta de las partículas que contenían VP1 fragmentada. Bajo ciertas condiciones, mientras que las partículas que contenían fragmentos de VP1 LMW (bajo peso molecular) estaban fuertemente unidas a las resinas, las partículas intactas fluían a través de la columna. Por lo tanto, esta etapa HIC se insertó como una etapa de pulido después de la cromatografía POROS® D. Las partículas de EV71 purificadas a través de este proceso eran de tamaño homogéneo (dispersión de la luz), con una pureza cercana al 100 %, sin contaminantes proteicos detectables por espectrometría de masas. Los atributos de calidad del producto de este producto (lote número 479-31-020) se presentan en la Tabla 3, columna central. Procedimiento de extracción modificado.
El extracto vegetal puede clarificarse por acidificación a un pH de alrededor de 5,2 o por tratamiento térmico y eliminar el coágulo por centrifugación. El tratamiento térmico se insertó entre las etapas de extracción mecánica y centrifugación. El uso de un tratamiento térmico de 10 minutos a 60 °C (pH 8,0) eliminó más del 90 % de las proteínas solubles sin afectar la solubilidad de las VLP de EV71 a un nivel detectable. El VP1 permaneció intacto cuando se extrajo y clarificó en estas condiciones.
La extracción mecánica a pH 8,0, combinada con clarificación basada en tratamiento térmico, se implementó para el proceso de purificación de VLP de EV71en reemplazo de la extracción enzimática. Se ha producido un lote de VLP con este proceso (lote número 479-32-020). Las características del producto se presentan en la tabla 4 (tercera columna). Los resultados obtenidos mostraron que la extracción mecánica, usada junto con la clarificación de proteínas basada en el calor, representa una etapa de recuperación primaria eficaz que es totalmente compatible con las etapas aguas abajo definidas anteriormente. El proceso resultante es de alto rendimiento y genera un producto VLP de EV71que tiene una pureza del 98 %. Los perfiles de dispersión de luz de las VLP de EV71 preparadas a partir de este proceso mostraron una alta homogeneidad. El análisis Cryo TEM de este producto confirmó que las partículas tienen el tamaño y la forma de las VLP de EV71 (Figura 8).
Tabla 4. Comparación de las características de VLP de EV71 para lotes producidos con procesos que comprenden extracción enzimática con y sin HIC o extracción mecánica.
Atributo Extracción enzimática Extracción enzimática Extracción mecánica (pH (pH 5,1) sin HIC (pH 5,1) con HIC 8,0) con tratamiento térmico
Número de lote 479-35-020 479-31-020 479-32-020
Pureza 95,5 % 100 % 98,2 %
Concentración de proteína 352,8 297,8 715,3
(BCA, jg/ml)
SEC-HPLC (% en volumen 100 % 98,9 % 100 %
vacío (estructuras de alto
peso molecular)
Microscopio de electrones Estar determinado Partículas redondas 25- Partículas redondas 25-30
30 nm Bien dispersas nm Bien dispersas ■Estimaciones preliminares calculadas a partir de una sola corrida para cada proceso.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir partículas similares a enterovirus (EVLP) en una planta, parte de la planta o célula vegetal que comprende:
i-a) introducir por transformación en la planta, parte de la planta o célula vegetal un primer ácido nucleico que comprende una primera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una primera secuencia de nucleótidos que codifica una poliproteína de enterovirus, en donde la poliproteína de enterovirus consiste en la poliproteína P1 de Enterovirus 71, la primera región reguladora comprende un primer promotor unido operativamente a un primer potenciador;
introducir por transformación en la planta, parte de la planta o célula vegetal un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta y unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteasa 3CD de Enterovirus 71, la segunda región reguladora comprende un segundo promotor unido operativamente a un segundo potenciador; o
i-b)proporcionar la planta, parte de la planta o célula vegetal que comprende un primer ácido nucleico que comprende una primera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una primera secuencia de nucleótidos que codifica una poliproteína de enterovirus, en donde la poliproteína de enterovirus consiste en la poliproteína P1 de Enterovirus 71, la primera región reguladora comprende un primer promotor unido operativamente a un primer potenciador; y un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteasa 3CD de Enterovirus 71, la segunda región reguladora comprende un segundo promotor unido operativamente a un segundo potenciador;
ii) incubar la planta, parte de la planta o célula vegetal en condiciones que permitan la expresión del primer y el segundo ácido nucleico, para producir de esta manera las VLP y opcionalmente
iii) cosechar la planta, parte de la planta o célula vegetal, y purificar las VLP.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico se introducen en la planta, parte de la planta o célula vegetal mediante infiltración con un primer Agrobacterium que comprende el primer ácido nucleico y un segundo Agrobacterium que comprende el segundo ácido nucleico, en donde el primer Agrobacterium y el segundo Agrobacterium se infiltran en una relación de aproximadamente 20:1 a 0,5:1.
3. El método de la reivindicación 1, en donde la poliproteína P1 de Enterovirus comprende las proteínas estructurales VP1, VP2, VP3 y VP4.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico están en constructos de ácido nucleico separados.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico están en el mismo constructo de ácido nucleico.
6. El método de la reivindicación 1, en donde en la etapa de introducción (etapa i-a), el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico se expresan transitoriamente en la planta o donde en la etapa de introducción (etapa ia), el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico se expresan de forma estable en la planta.
7. Un extracto vegetal que comprende partículas similares a enterovirus (EVLP) producidas mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
8. Una composición que comprende el extracto vegetal de la reivindicación 7 para el uso en la inducción de una respuesta inmunitaria contra Enterovirus 71 en un sujeto y un portador farmacéuticamente aceptable.
9. El extracto vegetal de la reivindicación 7 para el uso en la inducción de inmunidad contra una infección por Enterovirus en un sujeto.
10. Una composición para el uso de la reivindicación 8, en donde el extracto vegetal se administra a un sujeto por vía oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea.
11. El método de la reivindicación 1, en donde el primer y el segundo potenciador comprenden uno o más de un potenciador de comovirus.
12. Una célula vegetal que comprende partículas similares a enterovirus (EVLP) que comprenden las proteínas estructurales VP1, v P2, VP3 y VP4 de Enterovirus 71.
13. Una célula vegetal que comprende un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico, el primer ácido nucleico comprende una primera región reguladora activa en la célula vegetal unida operativamente a una primera secuencia de nucleótidos que codifica una poliproteína de enterovirus, en donde la poliproteína de enterovirus consiste en la poliproteína P1 de Enterovirus 71, la primera región reguladora comprende un primer promotor unido operativamente a un primer potenciador y el segundo ácido nucleico comprende una segunda región reguladora activa en la célula vegetal unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una proteasa 3CD de Enterovirus 71, la segunda región reguladora comprende un segundo promotor unido operativamente a un segundo potenciador.
14. Una célula vegetal que comprende partículas similares a enterovirus (EVLP), la célula vegetal puede obtenerse mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
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