ES2909910T3

ES2909910T3 - Tratamiento contra el cáncer usando combinaciones de inhibidores de ERK y RAF

Info

Publication number: ES2909910T3
Application number: ES14872061T
Authority: ES
Inventors: Saurabh Saha; Dean Welsch; Gary Decrescenzo; Jeffrey James Roix
Original assignee: Biomed Valley Discoveries Inc
Current assignee: Biomed Valley Discoveries Inc
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2034-12-19
Also published as: MX2021008610A; EP3082800A4; AU2014368906B2; JP2017502017A; CA3240745A1; AU2014368906A1; CA3168002C; CA2934669C; CA3168002A1; CN106211755B; US20160310476A1; CN106211755A; WO2015095819A2; EP3082800A2; BR112016014481A2; US10668055B2; RU2722784C2; MX394252B; WO2015095819A3; EP3082800B1

Abstract

Un primer agente anticancerígeno (i), que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un segundo agente anticancerígeno (ii), para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto, en el que el segundo agente anticancerígeno es (ii-1) un inhibidor de RAF de tipo 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; o (ii-2) AZ628 (Axon Medchem BV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento contra el cáncer usando combinaciones de inhibidores de ERK y RAF

Campo de la invención

La presente invención proporciona, entre otros, métodos, kits y composiciones farmacéuticas para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto usando (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de RAF de tipo 1, tal como dabrafenib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para tratar o mejorar los efectos del cáncer.

Antecedentes de la invención

Los inhibidores de fármacos que se dirigen a componentes de la ruta de señalización de proteínas quinasas activadas por mitógeno (MAPK) muestran eficacia clínica en una variedad de cánceres, particularmente aquellos que portan mutaciones en la proteína quinasa BRAF. Tanto los inhibidores de quinasa RAF como MEK están aprobados para su como agente individual en melanoma mutante para BRAF metastásico avanzado, y la combinación de dabrafenib y trametinib se está sometiendo actualmente a una revisión por la Administración de Alimentos y Medicamentos (Food and Drug Administration, FDA) para esta indicación. Ya sea solos o en combinación, los inhibidores de BRAF y MEK muestran actividad variable en otros cánceres, con una eficacia prometedora en el cáncer de tiroides y pulmón mutantes para BRAF, así como una posible actividad marginal en el cáncer colorrectal mutante para BRAF.

Se observan patrones variables de eficacia clínica con inhibidores de BRAF y MEK. Tanto el grado como la penetración de la regresión tumoral inicial, así como la duración de la respuesta antes de la progresión de la enfermedad, varían de manera única según cada clase de fármaco cuando se administra solo, o cuando se administra en estrategias de combinación secuenciales o concurrentes. Hasta la fecha, la terapia de combinación concurrente de dabrafenib y trametinib parece ser la intervención preferida para el melanoma mutante para BRAF. Sin embargo, también se ha demostrado que ciertas combinaciones de un inhibidor de Hsp90 y un inhibidor de BRAF son eficaces contra ciertos cánceres (documento WO2013074594). Además, en estudios preclínicos, el inhibidor de quinasa ERK1/2 SCH772984 mostró cierta actividad antitumoral en modelos de resistencia requerida a inhibidores de BRAF y MEK (Morris (2013), Cancer Discov. 3(7)). Se han sintetizado y propuesto otros inhibidores de la proteína quinasa ERK, entre otros, como agentes anticancerígenos (documento WO2005113541).

Como con otras terapias dirigidas, los patrones de respuesta de la enfermedad a los inhibidores de RAF y MEK parecen estar influidos por la heterogeneidad genética intrínseca presente en los cánceres donde se usan los fármacos. Por ejemplo, se ha demostrado que ciertas alteraciones genéticas, incluyendo PTEN y otros cambios que activan las señales de crecimiento celular de PI3K, pueden predecir una respuesta inicial deficiente, y/o progresión relativamente rápida, en melanoma mutante para BRAf tratado con el inhibidor de RAF vemurafenib. Del mismo modo, parecen surgir mutaciones directas en los loci génicos de MEK en tumores que han progresado después de BRAF, MEK o tratamiento farmacológico combinado. Varios ejemplos adicionales, a partir de la amplificación génica de RAS y RAF y mutaciones de corte y empalme, sugieren que se produce resistencia farmacológica adquirida cuando la pleiotropía oncogénica encuentra la presión selectiva del tratamiento farmacológico dirigido.

Por lo tanto, agentes dirigidos novedosos inhibirían idealmente diversos nodos de las rutas oncogénicas, y también serían eficaces en combinaciones induciendo una carga de presión selectiva que excede la capacidad adaptativa de diversos genomas de cáncer. La presente solicitud está dirigida a satisfacer, entre otras, la necesidad de agentes dirigidos novedosos.

Sumario de la invención

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un primer agente anticancerígeno (i), que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un segundo agente anticancerígeno (ii), para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto, en donde el segundo agente anticancerígeno es

(ii-1) un inhibidor de RAF de tipo 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; o

(ii-2) AZ628 (Axon Medchem BV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

La invención también se refiere a una composición para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto, en donde la composición comprende BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en combinación con

(i) un inhibidor de RAF de tipo 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; o

(ii) AZ628 (Axon Medchem BV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Además, la invención se refiere a una composición para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto, en donde la composición comprende

(ii) AZ628 (Axon Medchem BV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en combinación con BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En el presente documento se da a conocer además un método de tratamiento o de mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. Este método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de RAF de tipo 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para tratar o mejorar los efectos del cáncer.

También se da a conocer en el presente documento un método de tratamiento o de mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. En una realización de la presente invención, una cantidad eficaz de (i) BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es dabrafenib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se administrará al sujeto para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos del cáncer.

Una realización adicional de la presente invención es un método in vitro para efectuar la muerte de células cancerosas. Este método comprende poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de RAF de tipo 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Una realización adicional de la presente invención es un kit para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. Este kit comprende una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de RAF de tipo 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, empaquetado junto con instrucciones para su uso.

Una realización adicional de la presente invención es una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. Esta composición farmacéutica comprende un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de RAF de tipo 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la administración de los agentes anticancerígenos primero y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier agente anticancerígeno solo.

También se da a conocer en el presente documento un método de tratamiento o de mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. En una realización, la presente invención se refiere a una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es AZ628 (Axon Medchem BV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos del cáncer en un sujeto.

Una realización adicional de la presente invención es un método in vitro para efectuar la muerte de células cancerosas. Este método comprende poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es AZ628 (Axon Medchem BV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Una realización adicional de la presente invención es un kit para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto. Este kit comprende una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es AZ628 (Axon Medchem BV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, empaquetado junto con instrucciones para su uso.

Otra realización de la presente invención es una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. Esta composición farmacéutica comprende un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es AZ628 (Axon Medchem BV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la administración de los agentes anticancerígenos primero y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier agente anticancerígeno solo.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-C muestran el progreso de un estudio de aumento de la dosis en una línea celular de melanoma maligno humano (células A375) para el mes 1. Diversos tratamientos (trametinib (un inhibidor de MEK de tipo 2), dabrafenib (un inhibidor de BRAF) y BVD-523 (un inhibidor de ERK1/2)) son como se marcan.

Las figuras 2A-H muestran los resultados de un ensayo de proliferación que rastrea los cambios en la sensibilidad al/a los agente(s) aumentado(s) en el mes 1. Diversos tratamientos (trametinib, dabrafenib, BVD-523 y paclitaxel) son como se marcan en la parte superior del gráfico. La leyenda a la derecha del gráfico muestra los diversos tipos de células generadas a partir del estudio de aumento de la dosis. Por ejemplo, “dabrafenib” se refiere a las células que se han tratado con la dosis más alta de dabrafenib desde el mes 1 del estudio de aumento de la dosis. Parental se refiere a las células de control que no se han tratado con fármacos. Las figuras 2A-2C y 2G se normalizan al control, mientras que las figuras 2D-2F y 2H muestran los datos sin procesar.

Las figuras 3A-3D muestran el progreso de un estudio de aumento de la dosis en células A375 para el mes 2. Diversos tratamientos (trametinib, dabrafenib y BVD-523) son como se marcan.

Las figuras 4A-H muestran los resultados de un ensayo de proliferación que rastrea los cambios en la sensibilidad al/a los agente(s) aumentado(s) en el mes 2. Diversos tratamientos (trametinib, dabrafenib, BVD-523 y paclitaxel) son como se marcan en la parte superior del gráfico. La leyenda a la derecha del gráfico muestra los diversos tipos de células generadas a partir del estudio de aumento de la dosis. Por ejemplo, “dabrafenib” se refiere a las células que se han tratado con la dosis más alta de dabrafenib desde el mes 2 del estudio de aumento de la dosis. Parental se refiere a las células de control que no se han tratado con fármacos. Las figuras 4A-4C y 4G se normalizan al control, mientras que las figuras 4D-4F y 4H muestran los datos sin procesar.

Las figuras 5A-H muestran solo los datos de la línea celular parental y BVD-523 de la figura 4. Diversos tratamientos (trametinib, dabrafenib, BVD-523 y paclitaxel) son como se marcan. Las figuras 5A-5C y 5G se normalizan al control, mientras que las figuras 5D-5F y 5h muestran los datos sin procesar.

Las figuras 6A-D muestran el progreso del estudio de aumento de la dosis en una línea celular maligna humana (células A375) para el mes 3. Diversos tratamientos (trametinib, dabrafenib y BVD-523) son como se marcan.

La figura 7 es un histograma que muestra los resultados de un ensayo de proliferación tal como se aplica a células cultivadas en los pocillos de control de DMSO a partir del ensayo de aumento de la dosis.

Las figuras 8A-D son un conjunto de gráficos de líneas que muestran ensayos de proliferación para el mes 3 del estudio. Diversos tratamientos (trametinib, dabrafenib, BVD-523 y paclitaxel) son como se marcan en la parte superior del gráfico. La leyenda a la derecha del gráfico muestra los diversos tipos de células generadas a partir del estudio de aumento de la dosis. Por ejemplo, “dabrafenib” se refiere a las células que se han tratado con la dosis más alta de dabrafenib desde el mes 3 del estudio de aumento de la dosis. Parental se refiere a las células de control que no se han tratado con fármacos.

Las figuras 9A-D muestran solo los datos de la línea celular parental, con dabrafenib y con BVD-523 de la figura 8.

La figura 10A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de trametinib/dabrafenib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 10B es una matriz de dosis que muestra un exceso con respecto a Bliss para la combinación de trametinib/dabrafenib. Las figuras 10C y 10D muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos con agente individual de dabrafenib y trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 10E muestra el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos de combinación de dabrafenib y trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue.

La figura 11A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de trametinib/dabrafenib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo. La figura 11B es una matriz de dosis que muestra un exceso con respecto a Bliss para la combinación de trametinib/dabrafenib. Las figuras 11C y 11D muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos con agente individual de dabrafenib y trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo. La figura 11E muestra el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos de combinación de dabrafenib y trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo.

La figura 12A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de BVD-523/dabrafenib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 12B es una matriz de dosis que muestra un exceso con respecto a Bliss para la combinación de BVD-523/dabrafenib. Las figuras 12C y 12D muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos con agente individual de dabrafenib y BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 12E muestra el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos de combinación de dabrafenib y BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue.

La figura 13A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de BVD-523/dabrafenib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo. La figura 13B es una matriz de dosis que muestra un exceso con respecto a Bliss para la combinación de BVD-523/dabrafenib. Las figuras 13C y 13D muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos con agente individual de dabrafenib y BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo. La figura 13E muestra el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos de combinación de dabrafenib y BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo.

La figura 14A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de trametinib/BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 14B es una matriz de dosis que muestra un exceso con respecto a Bliss para la combinación de trametinib/BVD-523. Las figuras 14C y 14D muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos con agente individual de BVD-523 y trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 14E muestra el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos de combinación de BVD-523 y trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue.

La figura 15A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de trametinib/BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo. La figura 15B es una matriz de dosis que muestra un exceso con respecto a Bliss para la combinación de trametinib/BVD-523. Las figuras 15C y 15D muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos con agente individual de BVD-523 y trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo. La figura 15E muestra el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos de combinación de BVD-523 y trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo.

Las figuras 16A-D son un conjunto de imágenes que muestran el análisis de inmunotransferencia de tipo Western de la señalización de MAPK en células A375 después de un tratamiento de 4 horas con diversas concentraciones (en nM) de BVD-523, dabrafenib (Dab) y trametinib (Tram). Se cargaron 40 |ig de proteína total en cada carril, excepto donde se indique lo contrario. En este experimento, se recogieron muestras por duplicado. Las figuras 16A y 16B muestran resultados de muestras por duplicado. De manera similar, las figuras 16C y 16D también muestran resultados de muestras por duplicado. En las figuras 16A y 16B, pRSK1 tenía una señal relativamente débil en células A375 en comparación con otros marcadores. Se sometió a prueba un anticuerpo frente a pRSK1-S380 diferente de Cell Signaling (n.° de cat. 11989) pero no dio una señal detectable (datos no mostrados). En las figuras 16C y 16D, pCRAF-338 dio una señal mínima.

Las figuras 17A-D son un conjunto de imágenes que muestran el análisis de inmunotransferencia de tipo Western de la señalización de MAPK en una línea celular de carcinoma colorrectal humano (células HCT116) después de un tratamiento de 4 horas con diversas concentraciones (en nM) de BVD-523, dabrafenib (Dab) y trametinib (Tram). Se cargaron 40 |ig de proteína total en cada carril, excepto donde se indique lo contrario. En este experimento, se recogieron muestras por duplicado. Las figuras 17A y 17B muestran resultados de muestras por duplicado. De manera similar, las figuras 17c y 17D también muestran resultados de muestras por duplicado. En las figuras 17A-17B, los niveles de pRSK1 parecen ser muy bajos en células HCT116, y en las figuras 17C y 17D, la señal de pCRAF-338 también fue muy débil.

Las figuras 18A-D son un conjunto de imágenes que muestran el análisis de inmunotransferencia de tipo Western de proteínas del ciclo celular y de apoptosis en células de melanoma A375 después de un tratamiento de 24 horas con diversas concentraciones (en nM) de BVD-523 (“BVD523”), trametinib (“tram”) y/o dabrafenib (“Dab”) como se marca. Se cargaron 50 |ig de proteína total en cada carril, excepto donde se indique lo contrario. En este experimento, se recogieron muestras por duplicado. Las figuras 18A y 18B muestran resultados de muestras por duplicado. De manera similar, figuras 18C y 18D también muestran resultados de muestras por duplicado. En las figuras 18A y 18B, no fue evidente ninguna banda de un tamaño correspondiente a PARP escindido (89 kDa).

La figura 19 es un histograma que muestra la viabilidad de células A375 después de 96 horas de incubación con diversas cantidades de BVD-523 o BVD-523 en combinación con AZ628 30 nM (un inhibidor de RAF) o dabrafenib 3 nM. Las puntuaciones de Bliss se muestran en los recuadros amarillos.

La figura 20 es un histograma que muestra actividad de caspasa en células A375 después de 24 horas de incubación con diversas cantidades de BVD-523 o BVD-523 en combinación con AZ62830 nM o dabrafenib 3 nM.

La figura 21 es un histograma que muestra actividad de caspasa en células A375 después de 48 horas de incubación con diversas cantidades de BVD-523 o BVD-523 en combinación con AZ62830 nM o dabrafenib 3 nM.

La figura 22 es un histograma que muestra la viabilidad de células HCT116 después de 96 horas de incubación con diversas cantidades de BVD-523 o BVD-523 en combinación con ABT-263 3 |iM. Las puntuaciones de Bliss se muestran en los recuadros amarillos.

La figura 23 es un histograma que muestra actividad de caspasa en células HCT116 después de 24 horas de incubación con diversas cantidades de BVD-523 o BVD-523 en combinación con ABT-2633 |iM.

La figura 24 es un histograma que muestra actividad de caspasa en células HCT116 después de 48 horas de incubación con diversas cantidades de BVD-523 o BVD-523 en combinación con ABT-2633 |iM.

La figura 25 es un diagrama de flujo que muestra el protocolo de aumento de la dosis utilizado en el presente documento.

La figura 26 muestra los tiempos individuales hasta el punto final para los ratones en el estudio.

La figura 27 muestra el crecimiento tumoral medio (figura 27A) y el diagrama de Kaplan-Meier (figura 27B) para el estudio.

Las figuras 28A-28D muestran el crecimiento tumoral medio para diversos grupos de ratones a los que se administraron combinaciones de dabrafenib/BVD-523 en comparación con monoterapias.

La figura 29 muestra el porcentaje de cambios en el peso corporal medio desde el día 1 en el estudio in vivo.

La figura 30 muestra un esquema de la ruta de las proteínas quinasas activadas por mitógeno (MAPK).

La figura 31A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de AZ628/trametinib en células HCT116 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 31B es una matriz de dosis que muestra un exceso con respecto a Bliss para la combinación de AZ628/trametinib. Las figuras 31C y 31D muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos de agente individual con AZ628 y trametinib en células HCT116 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 31E muestra el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos de combinación de AZ628/trametinib en células HCT116 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue.

La figura 32A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de AZ628/BVD-523 en células HCT116 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 32B es una matriz de dosis que muestra un exceso con respecto a Bliss para la combinación de AZ628/BVD-523. Las figuras 32C y 32D muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos con agente individual de AZ628 y BVD-523 en células HCT116 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 32E muestra el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos de combinación de AZ628/BVD-523 en células HCT116 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue.

La figura 33A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de sorafenib/trametinib en células HCT116 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 33B es una matriz de dosis que muestra un exceso con respecto a Bliss para la combinación de sorafenib/trametinib. Las figuras 33C y 33D muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos con agente individual de sorafenib y trametinib en células HCT116 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 33E muestra el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos de combinación de sorafenib/trametinib en células HCT116 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue.

La figura 34A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de sorafenib/BVD-523 en células HCT116 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 34B es una matriz de dosis que muestra un exceso con respecto a Bliss para la combinación de sorafenib/BVD-523. Las figuras 34C y 34D muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos con agente individual de sorafenib y BVD-523 en células HCT116 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 34E muestra el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos de combinación de sorafenib/BVD-523 en células HCT116 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue.

La figura 35A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de dabrafenib/trametinib en células HCT116 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 35B es una matriz de dosis que muestra un exceso con respecto a Bliss para la combinación de dabrafenib/trametinib. Las figuras 35C y 35D muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos con agente individual de dabrafenib y trametinib en células HCT116 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 35E muestra el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos de combinación de dabrafenib/trametinib en células HCT116 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue.

La figura 36A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de dabrafenib/BVD-523 en células HCT116 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 36B es una matriz de dosis que muestra un exceso con respecto a Bliss para la combinación de dabrafenib/BVD-523. Las figuras 36C y 36D muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos con agente individual de dabrafenib y BVD-523 en células HCT116 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 36E muestra el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos de combinación de dabrafenib/BVD-523 en células HCT116 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue.

La figura 37A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de AZ628/BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 37B es una matriz de dosis que muestra un exceso con respecto a Bliss para la combinación de AZ628/BVD-523. Las figuras 37C y 37D muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos con agente individual de AZ628 y BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 37E muestra el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos de combinación de AZ628/BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue.

La figura 38A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de sorafenib/trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 38B es una matriz de dosis que muestra un exceso con respecto a Bliss para la combinación de sorafenib/trametinib. Las figuras 38C y 38D muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos con agente individual de sorafenib y trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 38E muestra el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos de combinación de sorafenib/trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue.

La figura 39A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de sorafenib/BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 39B es una matriz de dosis que muestra un exceso con respecto a Bliss para la combinación de sorafenib/BVD-523. Las figuras 39C y 39D muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos con agente individual de sorafenib y BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 39E muestra el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos de combinación de sorafenib/BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue.

La figura 40A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de dabrafenib/trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 40B es una matriz de dosis que muestra un exceso con respecto a Bliss para la combinación de dabrafenib/trametinib. Las figuras 40C y 40D muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos con agente individual de dabrafenib y trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 40E muestra el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos de combinación de dabrafenib/trametinib en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue.

La figura 41A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de dabrafenib/BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 41B es una matriz de dosis que muestra un exceso con respecto a Bliss para la combinación de dabrafenib/BVD-523. Las figuras 41C y 41D muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos con agente individual de dabrafenib y BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue. La figura 41E muestra el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos de combinación de dabrafenib/BVD-523 en células A375 usando el ensayo de viabilidad celular Alamar Blue.

La figura 42 muestra los resultados de ensayos de proliferación de agente individual en A375 (figura 42A - figura 42F) y G-361 (figura 42G - figura 42L). Los resultados de la proliferenciación se muestran para el tratamiento con dabrafenib (figura 42a y figura 42G), vemurafenib (figura 42B y figura 42H), TAK-632 (figura 42C y figura 42I), BVD-523 (figura 42D y figura 42J), SCH772984 (figura 42E y figura 42K) y paclitaxel (figura 42F y figura 42L).

La figura 43A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de dabrafenib/BVD-523 en células A375. La figura 43B es una matriz de dosis que muestra el exceso de Loewe para la combinación de dabrafenib/BVD-523. La figura 43C es una matriz de dosis que muestra el exceso de Bliss para la combinación de dabrafenib/BVD-523. Las figuras 43D y 43E, respectivamente, muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos con agente individual de dabrafenib y BVD-523 en células A375.

La figura 44A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de dabrafenib/SCH772984 en células A375. La figura 43B es una matriz de dosis que muestra el exceso de Loewe para la combinación de dabrafenib/SCH772984. La figura 43C es una matriz de dosis que muestra el exceso de Bliss para la combinación de dabrafenib/SCH772984. Las figuras 43D y 43E, respectivamente, muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos con agente individual de dabrafenib y SCH772984 en células A375.

La figura 45A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de vemurafenib/BVD-523 en células A375. La figura 45B es una matriz de dosis que muestra el exceso de Loewe para la combinación de vemurafenib/BVD-523. La figura 45C es una matriz de dosis que muestra el exceso de Bliss para la combinación de vemurafenib/BVD-523. Las figuras 45D y 45E, respectivamente, muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos con agente individual de vemurafenib y BVD-523 en células La figura 46A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de vemurafenib/SCH772984 en células A375. La figura 46B es una matriz de dosis que muestra el exceso de Loewe para la combinación de vemurafenib/SCH772984. La figura 46C es una matriz de dosis que muestra el exceso de Bliss para la combinación de vemurafenib/SCH772984. Las figuras 46D y 46E, respectivamente, muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos con agente individual de vemurafenib y SCH772984 en células A375.

La figura 47A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de TAK-632/BVD-523 en células A375. La figura 47B es una matriz de dosis que muestra el exceso de Loewe para la combinación de TAK-632/BVD-523. La figura 47C es una matriz de dosis que muestra el exceso de Bliss para la combinación de TAK-632/BVD-523. Las figuras 47D y 47E, respectivamente, muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos con agente individual de TAK-632 y BVD-523 en células A375.

La figura 48A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de TAK-632/SCH772984 en células A375. La figura 48B es una matriz de dosis que muestra el exceso de Loewe para la combinación de TAK-632/SCH772984. La figura 48C es una matriz de dosis que muestra el exceso de Bliss para la combinación de TAK-632/SCH772984. Las figuras 48D y 48E, respectivamente, muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos con agente individual de TAK-632 y SCH772984 en células A375.

La figura 49A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de dabrafenib/BVD-523 en células G-361. La figura 49B es una matriz de dosis que muestra el exceso de Loewe para la combinación de dabrafenib/BVD-523. La figura 49C es una matriz de dosis que muestra el exceso de Bliss para la combinación de dabrafenib/BVD-523. Las figuras 49D y 49E, respectivamente, muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos con agente individual de dabrafenib y BVD-523 en células G-361.

La figura 50A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de dabrafenib/SCH772984 en células G-361. La figura 50B es una matriz de dosis que muestra el exceso de Loewe para la combinación de dabrafenib/SCH772984. La figura 50C es una matriz de dosis que muestra el exceso de Bliss para la combinación de dabrafenib/SCH772984. Las figuras 50D y 50E, respectivamente, muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para tratamientos con agente individual de dabrafenib y SCH772984 en células G-361.

La figura 51A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de vemurafenib/BVD-523 en células G-361. La figura 51B es una matriz de dosis que muestra el exceso de Loewe para la combinación de vemurafenib/BVD-523. La figura 51C es una matriz de dosis que muestra el exceso de Bliss para la combinación de vemurafenib/BVD-523. Las figuras 51D y 51E, respectivamente, muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos con agente individual de vemurafenib y BVD-523 en células G-361.

La figura 52A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de vemurafenib/SCH772984 en células G-361. La figura 52B es una matriz de dosis que muestra el exceso de Loewe para la combinación de vemurafenib/SCH772984. La figura 52C es una matriz de dosis que muestra el exceso de Bliss para la combinación de vemurafenib/SCH772984. Las figuras 52D y 52E, respectivamente, muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos con agente individual de vemurafenib y SCH772984 en células G-361.

La figura 53A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de TAK-632/BVD-523 en células G-361. La figura 53B es una matriz de dosis que muestra el exceso de Loewe para la combinación de TAK-632/BVD-523. La figura 53C es una matriz de dosis que muestra el exceso de Bliss para la combinación de TAK-632/BVD-523. Las figuras 53D y 53E, respectivamente, muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos con agente individual de TAK-632 y BVD-523 en células G-361.

La figura 54A es una matriz de dosis que muestra el % de inhibición de la combinación de TAK-632/SCH772984 en células G-361. La figura 54B es una matriz de dosis que muestra el exceso de Loewe para la combinación de TAK-632/SCH772984. La figura 54C es una matriz de dosis que muestra el exceso de Bliss para la combinación de TAK-632/SCH772984. Las figuras 54D y 54E, respectivamente, muestran el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO para los tratamientos con agente individual de TAK-632 y SCH772984 en células G-361.

La figura 55A muestra puntuaciones de sinergia para las combinaciones sometidas a prueba tanto en células A375 como G-361. La figura 55B muestra un gráfico de los valores presentados en la figura 55A.

La figura 56A muestra los volúmenes de Loewe para las combinaciones sometidas a prueba tanto en células A375 como G-361. La figura 56B muestra un gráfico de los valores presentados en la figura 56A.

La figura 57A muestra los volúmenes de Bliss para las combinaciones sometidas a prueba tanto en células A375 como G-361. La figura 57B muestra un gráfico de los valores presentados en la figura 57A.

La figura 58 muestra los resultados de la combinación de BVD-523 y SCH772984. La figura 58A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células A375. La figura 58B - figura 58C muestran los resultados de ensayos de proliferación de agente individual para la combinación en 58A. La figura 58D muestra el exceso de Loewe para la combinación en 58A y la figura 58E muestra el exceso de Bliss para la combinación en 58A.

Descripción detallada de la invención

En el presente documento se da a conocer un método de tratamiento o de mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. Este método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de RAF de tipo 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para tratar o mejorar los efectos del cáncer.

Como se usan en el presente documento, los términos “tratar”, “que trata”, “tratamiento” y variaciones gramaticales de los mismos significan someter a un individuo a un protocolo, régimen, proceso o remedio, en el que se desea obtener una respuesta fisiológica o un resultado en ese sujeto, por ejemplo, un paciente. En particular, los métodos y las composiciones de la presente invención pueden usarse para ralentizar el desarrollo de síntomas de la enfermedad o retrasar la aparición de la enfermedad o afección, o detener la progresión del desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, debido a que cada sujeto tratado puede no responder a un protocolo de tratamiento, régimen, proceso o remedio particular, el tratamiento no requiere que se logre el resultado o la respuesta fisiológica deseados en todos y cada uno de los sujetos o la población de sujetos, por ejemplo, población de pacientes. En consecuencia, un sujeto o población de sujetos dada, por ejemplo, la población de pacientes, puede no responder o responder inadecuadamente al tratamiento.

Como se usan en el presente documento, los términos “mejorar”, “que mejora” y variaciones gramaticales de los mismos significan disminuir la gravedad de los síntomas de una enfermedad en un sujeto.

Como se usa en el presente documento, un “sujeto” es un mamífero, preferiblemente, un ser humano. Además de los seres humanos, las categorías de mamíferos dentro del alcance de la presente invención incluyen, por ejemplo, animales de granja, animales domésticos, animales de laboratorio, etc. Algunos ejemplos de animales de granja incluyen vacas, cerdos, caballos, cabras, etc. Algunos ejemplos de animales domésticos incluyen perros, gatos, etc. Algunos ejemplos de animales de laboratorio incluyen primates, ratas, ratones, conejos, cobayas, etc.

En la presente invención, BVD-523 es un compuesto según la fórmula (I):

y sales farmacéuticamente aceptables del mismo. BVD-523 puede sintetizarse según los métodos dados a conocer en, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.354.939. También se contemplan enantiómeros y mezclas racémicas de ambos enantiómeros de BVD-523 dentro del alcance de la presente invención. BVD-523 es un inhibidor de ERK1/2 con un mecanismo de acción que se cree que es, por ejemplo, único y distinto de ciertos otros inhibidores de ERK1/2, tales como SCH772984. Por ejemplo, otros inhibidores de ERK1/2, tales como SCH772984, inhiben la autofosforilación de ERK (Morris et al., 2013), mientras que BVD-523 permite la autofosforilación de ERK al tiempo que todavía inhibe ERK (figura 18).

Como se usa en el presente documento, un “ inhibidor de RAF” significa aquellas sustancias que (i) interaccionan directamente con RAF, por ejemplo, mediante la unión a RAF y (ii) disminuyen la expresión o la actividad de RAF. Los inhibidores de RAF pueden clasificarse en dos tipos por sus respectivos modos de unión. Como se usan en el presente documento, los inhibidores de RAF de “tipo 1” son aquellos inhibidores que se dirigen a los sitios de unión a ATP de la quinasa en su conformación activa. Los inhibidores de RAF de “tipo 2” son aquellos inhibidores que se unen preferentemente a una conformación inactiva de la quinasa. Los ejemplos no limitantes de inhibidores de RAF de tipo 1 incluyen:

Compuesto

Compuesto

Compuesto 1

Compuesto

Compuesto

dabrafenib (GlaxoSmithKIine), GDC-0879 (Genentech), L-779450 B-Raf (Merck), PLX3202 (Plexxikon), PLX4720 (Plexxikon), SB-590885 (GlaxoSmithKIine), SB-699393 (GlaxoSmithKIine), vemurafenib (Plexxikon), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos. Preferiblemente, el inhibidor de RAF de tipo 1 es dabrafenib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En un aspecto de esta realización, el sujeto con cáncer tiene una mutación de BRAF somática o es resistente al tratamiento con un inhibidor de la ruta de MAPK. Preferiblemente, el sujeto es resistente al tratamiento con un inhibidor de la ruta de MAPK distinto de ERK.

Como se usa en el presente documento, “mutación somática” significa un cambio que se produce en cualquier célula que no está destinada a convertirse en una célula germinal. La mutación puede ser, por ejemplo, una sustitución, deleción, inserción o una fusión. La tabla 1 a continuación muestra una visión general de la distribución de mutaciones de BRAF, como se muestra en la base de datos de Sanger.

Tabla 1 - Visión general de la distribución de mutaciones de BRAF

Las mutaciones de BRAF se encuentran en aproximadamente el 66 % del melanoma (Davies et al, 2002; Brose et al, 2002; Hocket et al, 2007), y un porcentaje relativamente menor en otros cánceres, un 36 % de tumores de tiroides y un 10 % de cánceres de colon (Xu et al, 2003; Fransen et al, 2004). La mutación de BRAF más prevalente se produce en el aminoácido 600 de la proteína quinasa de tipo silvestre (SEQ ID NO:2) por sustitución de valina por ácido glutámico dando como resultado el mutante B-RafV600E, que representa aproximadamente el 80 % de las mutaciones de BRAF (Davies et al, 2002; Hocker et al, 2007). El dominio quinasa de B-RafV600E tiene una actividad quinasa 500 veces mayor en comparación con la actividad basal de B-Raf de tipo silvestre (Wan et al, 2004). De las otras mutaciones de BRAF identificadas en melanoma, V600K y V600D/R también son comunes y representan el 16 % y el 3 % de todas las mutaciones de BRAF, respectivamente (Long et al, 2011). Además del melanoma, las mutaciones de BRAF también son comunes en muchos otros cánceres, incluido el carcinoma papilar de tiroides, carcinoma de ovario y carcinoma colorrectal. (Wellbrock et al, 2004). En un estudio, se encontraron variantes de corte y empalme de BRAF (corte y empalme de los exones 14 y 15) en 5/24 (21 %) líneas celulares de cáncer colorrectal (Seth et al, 2009).

La tabla 2 a continuación de la base de datos de Sanger muestra la distribución y frecuencia de mutaciones de BRAF en tumores humanos.

Tabla 2

La tabla 3 a continuación muestra secuencias de ácido nucleico y aminoácidos seleccionadas de BRAF. Estas secuencias pueden usarse en métodos para identificar sujetos con un genotipo de BRAF mutante (tal como en los métodos expuestos a continuación).

Tabla 3

En la técnica se conocen métodos para identificar mutaciones en ácidos nucleicos, tales como los genes de BRAF identificados anteriormente. Los ácidos nucleicos pueden obtenerse de muestras biológicas. En la presente invención, las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, sangre, plasma, orina, piel, saliva y biopsias. Las muestras biológicas se obtienen de un sujeto mediante procedimientos y métodos rutinarios que se conocen en la técnica.

Los ejemplos no limitantes de métodos para identificar mutaciones incluyen PCR, secuenciación, captura de híbridos, captura en solución, sondas de inversión molecular, ensayos de hibridación fluorescente in situ (FISH), y combinaciones de los mismos.

En la técnica se conocen diversos métodos de secuenciación. Estos incluyen, pero no se limitan a, secuenciación de Sanger (también denominada secuenciación didesoxi) y diversos métodos de secuenciación por síntesis (SBS) como se da a conocer en, por ejemplo, Metzker 2005, secuenciación por hibridación, por ligadura (por ejemplo, documento WO 2005021786), por degradación (por ejemplo, patentes estadounidenses n.os 5.622.824 y 6.140.053) y secuenciación de nanoporos (que está disponible comercialmente de Oxford Nanopore Technologies, Reino Unido). En técnicas de secuenciación profunda, un nucleótido dado en la secuencia se lee más de una vez durante el proceso de secuenciación. Las técnicas de secuenciación profunda se dan a conocer en, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 20120264632 y la publicación de patente internacional n.° WO2012125848.

Los métodos basados en PCR para detectar mutaciones se conocen en la técnica y emplean amplificación por PCR, donde cada secuencia diana en la muestra tiene un par correspondiente de cebadores específicos de secuencia únicos. Por ejemplo, el método de reacción en cadena de la polimerasa-polimorfismos de longitud de fragmentos de (PCR-RFLP) permite la detección rápida de mutaciones después de que las secuencias genómicas se amplifiquen por PCR. La mutación se discrimina por digestión con endonucleasas de restricción específicas y se identifica por electroforesis. Véase, por ejemplo, Ota et al, 2007. Las mutaciones también pueden detectarse usando PCR en tiempo real. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud internacional n.° WO2012046981.

En la técnica se conocen métodos de captura híbridos y se describen en, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 20130203632 y las patentes estadounidenses n.os 8.389.219 y 8.288.520. Estos métodos se basan en la hibridación selectiva de las regiones genómicas diana con oligonucleótidos diseñados por el usuario. La hibridación puede ser con oligonucleótidos inmovilizados en microalineamientos de alta o baja densidad (captura en alineamiento), o hibridación en fase de disolución con oligonucleótidos modificados con un ligando (por ejemplo, biotina) que posteriormente pueden inmovilizarse en una superficie sólida, tal como una perla (captura en disolución).

En la técnica se conocen métodos de sonda de inversión molecular (MIP) y se describen en, por ejemplo, Absalan et al, 2008. Tales métodos usan moléculas de MIP, que son sondas de “candado” especiales (Nilsson et al, 1994) para genotipado. Una molécula de MIP es un oligonucleótido lineal que contiene regiones específicas, secuencias universales, sitios de restricción y una secuencia de etiqueta (índice) (16-22 pb). En tales métodos, una MIP se hibrida directamente alrededor del marcador genético/SNP de interés. El método de MIP también puede usar varios conjuntos de sondas “de candado” que se hibridan con el ADN genómico en paralelo (Hardenbol et al, 2003). En caso de una coincidencia perfecta, las regiones de homología genómica se ligan experimentando una inversión en la configuración (como se sugiere por el nombre de la técnica) y creando una molécula circular. Después de la primera restricción, todas las moléculas se amplifican con cebadores universales. Los amplicones se restringen nuevamente para garantizar fragmentos cortos para la hibridación en un microalineamiento. Los fragmentos cortos generados se marcan y, a través de una secuencia de etiqueta, se hibridan con una etiqueta c (cadena complementaria para el índice) en un alineamiento. Después de la formación de un dúplex de etiqueta-etiqueta c, se detecta una señal.

Como se usa en el presente documento, ser “resistente” al tratamiento con inhibidores de la ruta de MAPK significa que uno o más inhibidores de la ruta de MAPK tienen una eficacia reducida en el tratamiento del cáncer.

Como se usa en el presente documento, un “inhibidor de la ruta de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK)” es cualquier sustancia que reduzca la actividad, expresión o fosforilación de proteínas en la ruta de MAPK que da como resultado una reducción del crecimiento celular o un aumento de la muerte celular.

En la figura 30 se muestra una visión general de las cascadas de MAPK de mamíferos. Los detalles de las rutas de MAPK se revisan en, por ejemplo, Akinleye et al, 2013. Brevemente, con respecto al módulo de ERK1/2 en la figura 30 (recuadro púrpura claro), la cascada de señalización MAPK 1/2 se activa mediante la unión del ligando a las tirosina quinasas receptoras (RTK). Los receptores activados reclutan y fosforilan las proteínas adaptadoras Grb2 y SOS, que luego interaccionan con la GTPasa Ras unida a la membrana y causan su activación. En su forma unida a GTP activada, Ras recluta y activa las quinasas Raf (A-Raf, B-Raf y C-Raf/RaF-1). Las quinasas Raf activadas activan MAPK 1/2 (MKK1/2), que a su vez cataliza la fosforilación de residuos de treonina y tirosina en la secuencia de activación Thr-Glu-Tyr de ERK1/2. Con respecto al módulo de JNK/p38 (recuadro amarillo en la figura 30), quinasas aguas arriba, MAP3K, tales como MEKK1/4, ASK1/2 y MLK1/2/3, activan MAP2K3/6 (MKK3/6), MAP2K4 (MKK4) y MAP2K7 (MKK7). Estas MAP2K activan luego las proteínas quinasas JNK, incluyendo JNK1, JNK2 y JNK3, así como p38 a/p/y/8. Para ejecutar sus funciones, las JNK activan varios factores de transcripción, incluyendo c-Jun, ATF-2, NF-ATc1, HSF-1 y STAT3. Con respecto al módulo de ERK5 (recuadro azul en la figura 30), las quinasas aguas arriba de MAP2K5 (MkK5) son MEKK2 y MEKK3. La diana aguas abajo mejor caracterizada de MeK5 es ERK5, también conocida como MAP cinasa 1 grande (BMK1) porque tiene el doble del tamaño de otras MAPK.

Ejemplos no limitativos de inhibidores de la ruta de MAPK incluyen inhibidores de RAS, inhibidores de RAF, inhibidores de MEK, inhibidores de ERK1/2, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

Como se usa en el presente documento, un “inhibidor de RAS” significa aquellas sustancias que (i) interaccionan directamente con RAS, por ejemplo, mediante la unión a RAS y (ii) disminuyen la expresión o la actividad de RAS. Los inhibidores de RAS a modo de ejemplo no limitativos incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de farnesil transferasa (tales como, por ejemplo, tipifarnib y lonafarnib), moléculas pequeñas que contienen grupos farnesilo (tales como, por ejemplo, salirasib y TLN-4601), d Ca I, como se describe por Maurer (Maurer et al., 2012), Kobe0065 y Kobe2602, como se describe por Shima (Shima et al, 2013), HBS 3 (Patgiri et al, 2011) y AIK-4 (Allinky).

Como se usa en el presente documento, un “inhibidor de RAF” significa aquellas sustancias que (i) interaccionan directamente con RAF, por ejemplo, mediante la unión a RAF y (ii) disminuyen la expresión o la actividad de RAF, tales como, por ejemplo, A-RAF, B-RAF y C-RAF (Raf-1). Los inhibidores de RAF a modo de ejemplo no limitativos incluyen:

Compuesto

Compuesto

Compuesto

Compuesto

Compuesto

Compuesto

Compuesto

Compuesto

Compuesto

Compuesto

Compuesto

Compuesto

Compuesto

Compuesto

Compuesto 2

Compuesto

Compuesta 2

Compuesto

Compuesto

Compuesto

Compuesto

(Id.), AAL881 (Novartis); AB-024 (Ambit Biosciences), ARQ-736 (ArQuIe), ARQ-761 (ArQuIe), AZ628 (Axon Medchem BV), BeiGene-283 (BeiGene), BIIB-024 (MLN 2480) (Sunesis & Takeda), inhibidor de b-raf (Sareum), inhibidor de quinasa BRAF (Selexagen Therapeutics), ARNip de BRAF 313 (tacacagcaagctagatgca) y 523 (cctatcgttagagtctttcctg) (Liu et al, 2007), CTT239065 (Institute of Cancer Research), dabrafenib (GSK2118436), DP-4978 (Deciphera Pharmaceuticals), HM-95573 (Hanmi), GDC-0879 (Genentech), GW-5074 (Sigma Aldrich), ISIS 5132 (Novartis), L779450 (Merck), LBT613 (Novartis), LErafON (NeoPharm, Inc.), LGX-818 (Novartis), pazopanib (GlaxoSmithKline), PLX3202 (Plexxikon), PLX4720 (Plexxikon), PLX5568 (Plexxikon), RAF-265 (Novartis), rAf-365 (Novartis), regorafenib (Bayer Healthcare Pharmaceuticals, Inc.), RO 5126766 (Hoffmann-La Roche), SB-590885 (GlaxoSmithKline), SB699393 (GlaxoSmithKline), sorafenib (Onyx Pharmaceuticals), TAK 632 (Takeda), TL-241 (Teligene), vemurafenib (RG7204 o PLX4032) (Daiichi Sankyo), XL-281 (Exelixis), ZM-336372 (AstraZeneca), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

Como se usa en el presente documento, un “inhibidor de MEK” significa aquellas sustancias que (i) interaccionan directamente con MEK, por ejemplo, mediante la unión a MEK y (ii) disminuyen la expresión o actividad de MEK. Por lo tanto, inhibidores que actúan aguas arriba de MEK, tales como inhibidores de RAS e inhibidores de RAF, no son inhibidores de MEF según la presente invención. Los ejemplos no limitativos de inhibidores de MEK incluyen toxina del carbunco, antroquinonol (Golden Biotechnology), ARRY-142886 (2-hidroxi-etoxi)-amida) del ácido 2-(4-bromo-2-cloro-fenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico (Array BioPharma), ARRY-438162 (Array BioPharma), AS-1940477 (Astellas), AS-703988 (Merck KGaA), bentamapimod (Merck KGaA), BI-847325 (Boehringer Ingelheim), E-6201 (Eisai), GDC-0623 (Hoffmann-La Roche), GdC-0973 (cobimetinib) (Hoffmann-La Roche), L783277 (Merck), porción del factor letal de la toxina del carbunco, MEK162 (Array BioPharma), PD 098059 (2-(2'-amino-3'-metoxifenil)-oxanaftalen-4-ona) (Pfizer), PD 184352 (CI-1040) (Pfizer), PD-0325901 (Pfizer), pimasertib (Santhera Pharmaceuticals), RDEA119 (Ardea Biosciences/Bayer), refametinib (AstraZeneca), RG422 (Chugai Pharmaceutical Co.), RO092210 (Roche), RO4987655 (Hoffmann-La Roche), RO5126766 (Hoffmann-La Roche), selumetinib (AZD6244) (AstraZeneca), SL327 (Sigma), TAK-733 (Takeda), trametinib (Japan Tobacco), U0126 (1,4-diamino-2,3-diciano-1,4-bis(2-aminofeniltio)butadieno) (Sigma), Wx-554 (Wilex), polipéptido YopJ (Mittal et al, 2010), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

Como se usa en el presente documento, un “inhibidor de ERK1/2” significa aquellas sustancias que (i) interaccionan directamente con eRK1 y/o ERK2, por ejemplo, mediante la unión a ERK1/2 y (ii) disminuyen la expresión o la actividad de las proteínas quinasas ERK1 y/o ERK2. Por lo tanto, inhibidores que actúan aguas arriba de ERK1/2, tales como inhibidores de MEK e inhibidores de RAF, no son inhibidores de ERK1/2 según la presente invención. Los ejemplos no limitativos de un inhibidor de ERK1/2 incluyen AEZS-131 (Aeterna Zentaris), AEZS-136 (Aeterna Zentaris), BVD-523, SCH-722984 (Merck & amp; Co.), SCH-772984 (Merck & amp; Co.), SCH-900353 (MK-8353) (Merck & amp; Co.), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

En otro aspecto de esta realización, el método comprende además administrar al sujeto al menos un agente terapéutico adicional eficaz para tratar o mejorar los efectos del cáncer. El agente terapéutico adicional puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo o fragmento del mismo, una toxina, un radionúclido, un inmunomodulador, un agente terapéutico fotoactivo, un agente radiosensibilizante, una hormona, un agente antiangiogénico, y combinaciones de los mismos.

Como se usa en el presente documento, un “anticuerpo” abarca inmunoglobulinas de origen natural, así como inmunoglobulinas de origen no natural, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados) y anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos). Los fragmentos de anticuerpos incluyen aquellos que se unen al antígeno (por ejemplo, Fab', F(ab')2, Fab, Fv y rlgG). Véase también, por ejemplo, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, III.); Kuby, J., Immunology, 3a ed., W.H. Freeman & Co., Nueva York (1998). El término anticuerpo también incluye moléculas, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos bivalentes o biespecíficos. El término “anticuerpo” incluye además anticuerpos tanto policlonales como monoclonales.

Ejemplos de anticuerpos terapéuticos que pueden usarse en la presente invención incluyen rituximab (Rituxan), cetuximab (Erbitux), bevacizumab (Avastin) e ibritumomab (Zevalin).

Los agentes citotóxicos incluyen agentes que dañan el ADN, antimetabolitos, agentes antimicrotúbulos, agentes antibióticos, etc. Los agentes que dañan el ADN incluyen agentes alquilantes, agentes a base de platino, agentes intercalantes, e inhibidores de la replicación del ADN. Los ejemplos no limitativos de agentes alquilantes de ADN incluyen ciclofosfamida, mecloretamina, uramustina, melfalán, clorambucilo, ifosfamida, carmustina, lomustina, estreptozocina, busulfano, temozolomida, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitativos de agentes a base de platino incluyen cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, nedaplatino, satraplatino, tetranitrato de triplatino, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitativos de agentes intercalantes incluyen doxorrubicina, daunorrubicina, idarubicina, mitoxantrona, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitativos de inhibidores de la replicación del ADN incluyen irinotecán, topotecán, amsacrina, etopósido, fosfato de etopósido, tenipósido, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos y combinaciones de los mismos. Los antimetabolitos incluyen antagonistas de folato tales como metotrexato y premetrexed, antagonistas de purina tales como 6-mercaptopurina, dacarbazina y fludarabina, y antagonistas de pirimidina tales como 5-fluorouracilo, arabinosilcitosina, capecitabina, gemcitabina, decitabina, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos y combinaciones de los mismos. Los agentes antimicrotúbulos incluyen, sin limitación, alcaloides de la vinca, paclitaxel (Taxol®), docetaxel (Taxotere®) e ixabepilona (Ixempra®). Los agentes antibióticos incluyen, sin limitación, actinomicina, antraciclinas, valrubicina, epirubicina, bleomicina, plicamicina, mitomicina, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos y combinaciones de los mismos.

Los agentes citotóxicos también incluyen un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt. Los ejemplos no limitativos de un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt incluyen A-674563 (n.° CAS 552325-73-2), AGL 2263, AMG-319 (Amgen, Thousand Oaks, CA), AS-041164 (5-benzo[1,3]dioxol-5-ilmetilen-tiazolidin-2,4-diona), AS-604850 (5-(2,2-difluoro-benzo[1,3]dioxol-5-ilmetilen)-tiazolidin-2,4-diona), AS-605240 (5-quinoxilin-6-metilen-1,3-tiazolidin-2,4-diona), AT7867 (n.° Cas 857531 00-1), serie de bencimidazol, Genentech (Roche Holdings Inc., South San Francisco, CA), BML-257 (n.° CAS 32387 96-5), CAL-120 (Gilead Sciences, Foster City, CA), CAL-129 (Gilead Sciences), CAL-130 (Gilead Sciences), CAL-253 (Gilead Sciences), CAL-263 (Gilead Sciences), n.° CAS 612847-09-3, n.° CAS 681281-88-9, n.° CAS 75747-14-7, n.° CAS 925681-41-0, n.° CAS 98510-80-6, CCT128930 (n.° CAS 885499-61-6), CH5132799 (n.° CAS 1007207-67-1), CHR-4432 (Chroma Therapeutics, Ltd., Abingdon, Reino Unido), FPA 124 (n.° CAS 902779-59-3), GS-1101 (CAL-101) (Gilead Sciences), GSK 690693 (n.° CAS 937174-76-0), H-89 (n.° CAS 127243-85-0), Honokiol, IC87114 (Gilead Science), IPI-145 (Intellikine Inc.), KAR-4139 (Karus Therapeutics, Chilworth, Reino Unido), KAR-4141 (Karus Therapeutics), KIN-1 (Karus Therapeutics), KT 5720 (n.° CAS 108068-98-0), miltefosina, diclorhidrato de MK-2206 (n.° CAS 1032350-13-2), ML-9 (n.° CAS 105637-50-1), clorhidrato de naltindol, OXY-111A (NormOxys Inc., Brighton, MA), perifosina, PHT-427 (n.° Cas 1191951-57-1), inhibidor de PI3 quinasa delta, Merck KGaA (Merck & Amp; Co., Whitehouse Station, NJ), inhibidores de PI3 quinasa delta, Genentech (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 quinasa, Incozen (Incozen Therapeutics, Pvt. Ltd., Hydrabad, India), inhibidores de PI3 quinasa delta-2, Incozen (Incozen Therapeutics), inhibidor de PI3 quinasa, Roche-4 (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 quinasa, Roche (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 quinasa, Roche-5 (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3-alfa/delta, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd., South San Francisco, CA), Inhibidores de PI3-delta, Cellzome (Cellzome AG, Heidelberg, Alemania), inhibidores de PI3-delta, Intellikine (Intellikine Inc., La Jolla, CA), inhibidores de PI3-delta, Pathway Therapeutics-1 (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta, Pathway Therapeutics-2 (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-delta/gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-delta/gamma, Intellikine (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Intellikine (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidor de PI3-gamma Evotec (Evotec), inhibidor de PI3-gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3K delta/gamma, Intellikine-1 (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3K delta/gamma, Intellikine-1 (Intellikine Inc.), pictilisib (Roche Holdings Inc.), PIK-90 (n.° CAS 677338-12-4), SC-103980 (Pfizer, Nueva York, Ny), SF-1126 (Semafore Pharmaceuticals, Indianápolis, IN), SH-5, SH-6, tetrahidrocurcumina, TG100-115 (Targegen Inc., San Diego, CA), triciribina, X-339 (Xcovery, West Palm Beach, FL), XL-499 (Evotech, Hamburgo, Alemania), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y combinaciones de los mismos.

En la presente invención, el término “toxina” significa un veneno o veneno antigénico de origen vegetal o animal. Un ejemplo es la toxina diftérica o porciones de la misma.

En la presente invención, el término “radionúclido” significa una sustancia radiactiva administrada al paciente, por ejemplo, por vía intravenosa u oral, después de lo cual penetra a través del metabolismo normal del paciente en el órgano o tejido diana, donde suministra radiación local durante un corto tiempo. Los ejemplos de radionúclidos incluyen, pero no se limitan a, I-125, At-211, Lu-177, Cu-67, I-131, Sm-153, Re-186, P-32, Re-188, In-114m e Y-90.

En la presente invención, el término “ inmunomodulador” significa una sustancia que altera la respuesta inmunitaria aumentando o reduciendo la capacidad del sistema inmunitario para producir anticuerpos o células sensibilizadas que reconocen y reaccionan con el antígeno que inició su producción. Los inmunomoduladores pueden ser recombinantes, sintéticos o preparaciones naturales e incluyen citocinas, corticosteroides, agentes citotóxicos, timosina e inmunoglobulinas. Algunos inmunomoduladores están presentes de manera natural en el cuerpo, y algunos de estos están disponibles en preparaciones farmacológicas. Los ejemplos de inmunomoduladores incluyen, pero no se limitan a, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), interferones, imiquimod y fracciones de membrana celular ^{de bacterias, IL-2, IL-7, IL-12, CCL3, CCL26,}CxCl7 y fosfato de citosina-guanosina sintético (CpG).

En la presente invención, el término “agente terapéutico fotoactivo” significa compuestos y composiciones que se vuelven activos tras la exposición a la luz. Se dan a conocer ciertos ejemplos de agentes terapéuticos fotoactivos, por ejemplo, en la solicitud de patente estadounidense n.° 2011/0152230 A1, “Photoactive Metal Nitrosyls For Blood Pressure Regulation And Cancer Therapy”.

En la presente invención, el término “agente radiosensibilizante” significa un compuesto que hace que las células tumorales sean más sensibles a la radioterapia. Los ejemplos de agentes radiosensibilizantes incluyen misonidazol, metronidazol, tirapazamina y crocetinato trans sódico.

En la presente invención, el término “hormona” significa una sustancia liberada por células en una parte de un cuerpo que afecta a células en otra parte del cuerpo. Los ejemplos de hormonas incluyen, pero no se limitan a, prostaglandinas, leucotrienos, prostaciclina, tromboxano, amilina, hormona antimulleriana, adiponectina, hormona adrenocorticotropa, angiotensinógeno, angiotensina, vasopresina, atriopeptina, péptido natriurético cerebral, calcitonina, colecistoquinina, hormona liberadora de corticotropina, encefalina, endotelina, eritropoyetina, hormona foliculoestimulante, galanina, gastrina, grelina, glucagón, hormona liberadora de gonadotropina, hormona liberadora de hormona del crecimiento, gonadotropina coriónica humana, lactógeno placentario humano, hormona del crecimiento, inhibina, insulina, somatomedina, leptina, lipotropina, hormona luteinizante, hormona estimulante de melanocitos, motilina, orexina, oxitocina, polipéptido pancreático, hormona paratiroidea, prolactina, hormona liberadora de prolactina, relaxina, renina, secretina, somatostina, trombopoyetina, hormona estimulante de tiroides, testosterona, deshidroepiandrosterona, androstenediona, dihidrotestosterona, aldosterona, estradiol, estrona, estriol, cortisol, progesterona, calcitriol y calcidiol.

Algunos compuestos interfieren con la actividad de ciertas hormonas o detienen la producción de ciertas hormonas. Estos compuestos que interfieren con hormonas incluyen, pero no se limitan a, tamoxifeno (Nolvadex®), anastrozol (Arimidex®), letrozol (Femara®) y fulvestrant (Faslodex®). Tales compuestos también están dentro del significado de hormona en la presente invención.

Como se usa en el presente documento, un agente “antiangiogénico” significa una sustancia que reduce o inhibe el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, tales como, por ejemplo, un inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y un inhibidor de la migración de células endoteliales. Los agentes antiangiogénicos incluyen, sin limitación, 2-metoxiestradiol, angiostatina, bevacizumab, factor inhibidor de la angiogénesis derivado del cartílago, endostatina, IFN-a, IL-12, itraconazol, linomida, factor 4 de plaquetas, prolactina, SU5416, suramina, tasquinimod, tecogalán, tetratiomolibdato, talidomida, trombospondina, trombospondina, TNP-470, ziv-aflibercept, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos y combinaciones de los mismos.

En un aspecto adicional de esta realización, la administración de los agentes anticancerígenos primero y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier agente anticancerígeno solo. Como se usa en el presente documento, “sinérgico” significa más que aditivo. Los efectos sinérgicos pueden medirse mediante diversos ensayos conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, los dados a conocer en el presente documento, tal como el ensayo de exceso con respecto a Bliss.

También se da a conocer en el presente documento un método de tratamiento o de mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. En una realización de la presente invención, se usa una cantidad eficaz de (i) BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es dabrafenib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para tratar o mejorar los efectos del cáncer en el sujeto.

Los sujetos adecuados y preferidos son como se dan a conocer en el presente documento. En esta realización, los agentes pueden usarse para tratar los cánceres dados a conocer anteriormente, incluyendo aquellos cánceres con los antecedentes mutacionales identificados anteriormente. Los métodos para identificar tales mutaciones también son como se han expuesto anteriormente.

En un aspecto de esta realización, el BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra en forma de una composición farmacéutica que comprende además un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto adicional de esta realización, el dabrafenib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra en forma de una composición farmacéutica que comprende además un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto adicional de esta realización, al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, va a administrarse como se da a conocer en el presente documento.

En un aspecto adicional de esta realización, la administración de los agentes anticancerígenos primero y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier agente anticancerígeno solo.

Otra realización de la presente invención es un método in vitro para efectuar la muerte de células cancerosas. Este método comprende poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de RAF de tipo 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Los inhibidores de RAF tipo 1 adecuados y preferidos son como se dan a conocer en el presente documento. En esta realización, efectuar la muerte de células cancerosas puede lograrse en células cancerosas que tienen diversos antecedentes mutacionales y/o que se caracterizan como se dio a conocer anteriormente. Los métodos para identificar tales mutaciones también son como se han expuesto anteriormente.

En un aspecto de esta realización, los métodos pueden llevarse a cabo in vitro, y pueden usarse para efectuar la muerte de células cancerosas, por ejemplo, destruyendo células cancerosas, en células de los tipos de cáncer dados a conocer en el presente documento.

En otro aspecto de esta realización, la célula cancerosa es una célula cancerosa de mamífero. Preferiblemente, la célula cancerosa de mamífero se obtiene de un mamífero seleccionado del grupo que consiste en seres humanos, primates, animales de granja y animales domésticos. Más preferiblemente, la célula cancerosa de mamífero es una célula cancerosa humana.

En un aspecto adicional de esta realización, poner en contacto la célula cancerosa con los agentes anticancerígenos primero y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con poner en contacto la célula cancerosa con cualquier agente anticancerígeno solo.

En otro aspecto de esta realización, el método comprende además poner en contacto la célula cancerosa con al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, como se da a conocer en el presente documento.

En un aspecto adicional de esta realización, poner en contacto la célula cancerosa con los agentes anticancerígenos primero y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con poner en contacto la célula cancerosa con cualquier agente anticancerígeno solo. En esta realización, “poner en contacto” significa llevar BVD-523 y los inhibidores de RAF tipo 1, y opcionalmente uno o más agentes terapéuticos adicionales, a proximidad estrecha con las células cancerosas. Esto se puede lograr usando técnicas convencionales de administración de fármacos a mamíferos o en la situación in vitro, por ejemplo, proporcionando BVD-523 y los inhibidores de RAF tipo 1, y opcionalmente otros agentes terapéuticos, a un medio de cultivo en el que se encuentran las células cancerosas.

Una realización adicional de la presente invención es un kit para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. Este kit comprende una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de RAF de tipo 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, empaquetado junto con instrucciones para su uso.

Los kits también pueden incluir recipientes de almacenamiento adecuados, por ejemplo, ampollas, viales, tubos, etc., para cada agente anticancerígeno de la presente invención (que puede estar, por ejemplo, en forma de composiciones farmacéuticas) y otros reactivos, por ejemplo, tampones, soluciones salinas equilibradas, etc., para su uso en la administración de los agentes anticancerígenos a sujetos. Los agentes anticancerígenos de la invención y otros reactivos pueden estar presentes en los kits en cualquier forma conveniente, tal como, por ejemplo, en una disolución o en forma de polvo. Los kits pueden incluir además un recipiente de envasado, que tiene opcionalmente una o más particiones para alojar la composición farmacéutica y otros reactivos opcionales.

Los sujetos adecuados y preferidos y los inhibidores de RAF tipo 1 son como se dan a conocer en el presente documento. En esta realización, el kit puede usarse para tratar los cánceres dados a conocer anteriormente, incluyendo aquellos cánceres con los antecedentes mutacionales identificados en el presente documento. Los métodos para identificar tales mutaciones son como se han expuesto anteriormente.

En un aspecto adicional de esta realización, el kit comprende además al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, como se da a conocer en el presente documento.

Otra realización de la presente invención es una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. Esta composición farmacéutica comprende un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es bVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es un inhibidor de RAF de tipo 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la administración de los agentes anticancerígenos primero y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier agente anticancerígeno solo. Esta composición farmacéutica puede comprender además un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.

Los sujetos adecuados y preferidos y los inhibidores de RAF tipo 1 son como se dan a conocer en el presente documento. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse para tratar los cánceres dados a conocer anteriormente, incluyendo aquellos cánceres con los antecedentes mutacionales identificados en el presente documento. Los métodos para identificar tales mutaciones también son como se han expuesto anteriormente.

En un aspecto adicional de esta realización, la composición farmacéutica comprende además al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, como se da a conocer en el presente documento.

Además, se da a conocer un método de tratamiento o de mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. En una realización de la presente invención, una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es AZ628 (Axon Medchem BV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administrará al sujeto para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos del cáncer.

En esta realización, los sujetos adecuados y preferidos son como se dan a conocer en el presente documento. En esta realización, los agentes pueden usarse para tratar los cánceres dados a conocer anteriormente, incluyendo aquellos cánceres con los antecedentes mutacionales identificados anteriormente. Los métodos para identificar tales mutaciones también son como se han expuesto anteriormente.

En un aspecto adicional de esta realización, al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, se administrará además como se da a conocer en el presente documento.

En otro aspecto de esta realización, la administración de los agentes anticancerígenos primero y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier agente anticancerígeno solo.

Las células cancerosas adecuadas y preferidas son como se dan a conocer en el presente documento. En esta realización, efectuar la muerte de células cancerosas puede lograrse en células cancerosas que tienen diversos antecedentes mutacionales y/o que se caracterizan como se dio a conocer anteriormente. Los métodos para identificar tales mutaciones también son como se han expuesto anteriormente.

Los métodos de esta realización, que puede llevarse a cabo in vitro, pueden usarse para efectuar la muerte de células cancerosas, por ejemplo, destruyendo células cancerosas, en células de los tipos de cáncer dados a conocer en el presente documento.

En un aspecto de esta realización, la célula cancerosa es una célula cancerosa de mamífero. Preferiblemente, la célula cancerosa de mamífero se obtiene de un mamífero seleccionado del grupo que consiste en seres humanos, primates, animales de granja y animales domésticos. Más preferiblemente, la célula cancerosa de mamífero es una célula cancerosa humana.

En otro aspecto de esta realización, el método comprende además administrar al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, como se da a conocer en el presente documento.

En esta realización, “poner en contacto” significa llevar BVD-523 y los inhibidores de RAF, y opcionalmente uno o más agentes terapéuticos adicionales, a proximidad estrecha con las células cancerosas. Esto se puede lograr usando técnicas convencionales de administración de fármacos a mamíferos o en la situación in vitro, por ejemplo, proporcionando BVD-523 y los inhibidores de RAF, y opcionalmente otros agentes terapéuticos, a un medio de cultivo en el que se encuentran las células cancerosas.

Una realización adicional de la presente invención es un kit para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. Este kit comprende una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticancerígeno, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo agente anticancerígeno, que es AZ628 (Axon Medchem BV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, empaquetado junto con instrucciones para su uso.

En esta realización, los sujetos adecuados y preferidos son como se dan a conocer en el presente documento. En esta realización, el kit puede usarse para tratar los cánceres dados a conocer anteriormente, incluyendo aquellos cánceres con los antecedentes mutacionales identificados en el presente documento. Los métodos para identificar tales mutaciones son como se han expuesto anteriormente.

En esta realización, los sujetos adecuados y preferidos son como se dan a conocer en el presente documento. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden usarse para tratar los cánceres dados a conocer anteriormente, incluyendo aquellos cánceres con los antecedentes mutacionales identificados en el presente documento. Los métodos para identificar tales mutaciones también son como se han expuesto anteriormente.

Las composiciones farmacéuticas según la presente invención pueden estar en una forma farmacéutica unitaria que comprende ambos agentes anticancerígenos. En otro aspecto de esta realización, el primer agente anticancerígeno está en una primera forma farmacéutica unitaria y el segundo agente anticancerígeno está en una segunda forma farmacéutica unitaria, separado del primero.

Los agentes anticancerígenos primero y segundo pueden coadministrarse al sujeto, o bien simultáneamente o bien en momentos diferentes, según lo considere más apropiado un médico. Si los agentes anticancerígenos primer y segundo se administran en momentos diferentes, por ejemplo, mediante administración en serie, el primer agente anticancerígeno puede administrarse al sujeto antes del segundo agente anticancerígeno. Alternativamente, el segundo agente anticancerígeno puede administrarse al sujeto antes del primer agente anticancerígeno.

En la presente invención, una “cantidad eficaz” o una “cantidad terapéuticamente eficaz” de un agente anticancerígeno de la invención que incluye composiciones farmacéuticas que contienen el mismo que se dan a conocer en el presente documento es una cantidad de tal agente o composición que es suficiente para efectuar resultados beneficiosos o deseados como se describe en el presente documento cuando se administra a un sujeto. Formas farmacéuticas, modos de administración y cantidades de dosificación eficaces pueden determinarse empíricamente, y hacer tales determinaciones está dentro de la habilidad de la técnica. Los expertos en la técnica entenderán que la cantidad de dosificación variará con la vía de administración, la tasa de excreción, la duración del tratamiento, la identidad de cualquier otro fármaco que se administre, la edad, el tamaño y la especie de mamífero, por ejemplo, paciente humano, y factores similares bien conocidos en las técnicas de medicina y medicina veterinaria. En general, una dosis adecuada de un agente o composición según la invención será la cantidad del agente o la composición que es la dosis más baja eficaz para producir el efecto deseado. La dosis eficaz de un agente o composición de la presente invención puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis, administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del día.

Un ejemplo adecuado no limitativo de una dosificación de BVD-523, un inhibidor de RAF u otro agente anticancerígeno dado a conocer en el presente documento es de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 2400 mg/kg al día, tal como de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 1200 mg/kg al día, de 75 mg/kg al día a aproximadamente 300 mg/kg al día, incluyendo de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg al día. Otras dosis representativas de tales agentes incluyen aproximadamente 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg, 400 mg/kg, 500 mg/kg, 600 mg/kg, 700 mg/kg, 800 mg/kg, 900 mg/kg, 1000 mg/kg, 1100 mg/kg, 1200 mg/kg, 1300 mg/kg, 1400 mg/kg, 1500 mg/kg, 1600 mg/kg, 1700 mg/kg, 1800 mg/kg, 1900 mg/kg, 2000 mg/kg, 2100 mg/kg, 2200 mg/kg y 2300 mg/kg al día. La dosis eficaz de BVD-523, los inhibidores de RAF u otros agentes anticancerígenos dados a conocer en el presente documento pueden administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis, administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del día.

El BVD-523, los inhibidores de RAF u otros agentes anticancerígenos o composiciones farmacéuticas que los contienen de la presente invención pueden administrarse de cualquier manera deseada y eficaz: para ingestión oral, o como una pomada o gota para administración local a los ojos, o para administración parenteral u otra administración de cualquier manera apropiada tal como intraperitoneal, subcutánea, tópica, intradérmica, inhalación, intrapulmonar, rectal, vaginal, sublingual, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intratecal o intralinfática. Además, el BVD-523, los inhibidores de RAF u otros agentes anticancerígenos o composiciones farmacéuticas que los contienen de la presente invención pueden administrarse junto con otros tratamientos. El BVD-523, los inhibidores de RAF u otros agentes anticancerígenos o composiciones farmacéuticas que los contienen pueden encapsularse o protegerse de otro modo contra secreciones gástricas u otras secreciones, si se desea.

Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden uno o más principios activos, por ejemplo agentes anticancerígenos, en mezcla con uno o más diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, uno o más de otros compuestos, fármacos, componentes y/o materiales. Independientemente de la vía de administración seleccionada, los agentes/compuestos de la presente invención se formulan en formas farmacéuticas farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21a edición, Lippincott Williams y Wilkins, Filadelfia, PA.).

Los diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21a edición, Lippincott Williams y Wilkins, Filadelfia, PA.) y The National Formulary (American Pharmaceutical Association, Washington, D.C.) e incluyen azúcares (por ejemplo, lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol), almidones, preparaciones de celulosa, fosfatos de calcio (por ejemplo, fosfato dicálcico, fosfato tricálcico e hidrogenofosfato cálcico), citrato de sodio, agua, disoluciones acuosas (por ejemplo, solución salina, inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de sodio, inyección de Ringer con lactato), alcoholes (por ejemplo, alcohol etílico, alcohol propílico y alcohol bencílico), polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol), ésteres orgánicos (por ejemplo, oleato de etilo y triglicéridos), polímeros biodegradables (por ejemplo, polilactida-poliglicolida, poli(ortoésteres) y poli(anhídridos)), matrices elastoméricas, liposomas, microesferas, aceites (por ejemplo, maíz, germen, oliva, ricino, sésamo, semilla de algodón y cacahuete), manteca de cacao, ceras (por ejemplo, ceras para supositorios), parafinas, siliconas, talco, silicilato, etc. Cada diluyente o portador farmacéuticamente aceptable usado en una composición farmacéutica de la invención debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros componentes de la formulación y no perjudicial para el sujeto. Los diluyentes o portadores adecuados para una forma farmacéutica seleccionada y vía de administración prevista se conocen bien en la técnica, y pueden determinarse diluyentes o portadores aceptables para una forma farmacéutica y método de administración elegidos usando la habilidad habitual en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener, opcionalmente, componentes y/o materiales adicionales comúnmente usados en composiciones farmacéuticas. Estos componentes y materiales se conocen bien en la técnica e incluyen (1) cargas o extensores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico; (2) aglutinantes, tales como carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa, sacarosa y goma arábiga; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes disgregantes, tal como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos, glicolato sódico de almidón, carboximetilcelulosa de sodio reticulada y carbonato de sodio; (5) agentes retardantes de la disolución, tales como parafina; (6) aceleradores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tales como alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, tales como caolín y arcilla de bentonita; (9) lubricantes, tal como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos y laurilsulfato de sodio; (10) agentes de suspensión, tales como alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto; (11) agentes tamponantes; (12) excipientes, tal como lactosa, azúcares de la leche, polietilenglicoles, grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, manteca de cacao, almidones, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicol, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco, salicilato, óxido de zinc, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida; (13) diluyentes inertes, tales como agua u otros disolventes; (14) conservantes; (15) agentes tensioactivos; (16) agentes dispersantes; (17) agentes de control de la liberación o retardantes de la absorción, tales como hidroxipropilmetilcelulosa, otras matrices poliméricas, polímeros biodegradables, liposomas, microesferas, monoestearato de aluminio, gelatina y ceras; (18) agentes opacificantes; (19) adyuvantes; (20) agentes humectantes; (21) agentes emulsionantes y de suspensión; (22), agentes solubilizantes y emulsionantes, tal como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácido graso de sorbitano; (23) propelentes, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volátiles no sustituidos, tales como butano y propano; (24) antioxidantes; (25) agentes que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, tales como azúcares y cloruro de sodio; (26) agentes espesantes; (27) materiales de recubrimiento, tales como lecitina; (28) agentes edulcorantes, saborizantes, colorantes, perfumantes y conservantes. Cada uno de tales componentes o materiales debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros componentes de la formulación y no ser perjudicial para el sujeto. Los componentes y materiales adecuados para una forma farmacéutica seleccionada y la vía de administración prevista se conocen bien en la técnica, y los componentes y materiales aceptables para una forma farmacéutica y método de administración elegidos pueden determinarse usando la habilidad habitual en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención adecuadas para administración oral pueden estar en forma de cápsulas, sellos, píldoras, comprimidos, polvos, gránulos, una disolución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, una emulsión líquida de aceite en agua o de agua en aceite, un elixir o jarabe, una pastilla, un bolo, un electuario o una pasta. Estas formulaciones pueden prepararse por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos de recubrimiento en bandeja, mezclado, granulación o liofilización convencionales.

Pueden prepararse formas farmacéuticas sólidas para administración oral (cápsulas, comprimidos, píldoras, comprimidos recubiertos de azúcar, polvos, gránulos y similares), por ejemplo, mezclando el/los principio(s) activo(s) con uno o más diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, una o más cargas, extensores, aglutinantes, humectantes, agentes disgregantes, agentes retardantes de la disolución, aceleradores de absorción, agentes humectantes, absorbentes, lubricantes y/o agentes colorantes. Pueden emplearse composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando un excipiente adecuado. Puede prepararse un comprimido por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más componentes auxiliares. Pueden prepararse comprimidos sometidos a compresión usando un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante, disgregante, agente tensioactivo o dispersante adecuado. Pueden prepararse comprimidos moldeados moldeando en una máquina adecuada. Los comprimidos, y otras formas farmacéuticas sólidas, tales como comprimidos recubiertos de azúcar, cápsulas, píldoras y gránulos, opcionalmente pueden ranurarse o prepararse con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. También pueden formularse para proporcionar una liberación lenta o controlada del principio activo en los mismos. Pueden esterilizarse mediante, por ejemplo, filtración a través de un filtro de retención de bacterias. Estas composiciones también pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composición tal que liberen solo el principio activo, o preferentemente, en una cierta porción del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de manera retardada. El principio activo también puede estar en forma microencapsulada.

Las formas farmacéuticas líquidas para administración oral incluyen emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Las formas farmacéuticas líquidas pueden contener diluyentes inertes adecuados comúnmente usados en la técnica. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes, colorantes, perfumantes y conservantes. Las suspensiones pueden contener agentes de suspensión.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención para administración rectal o vaginal pueden presentarse como un supositorio, que puede prepararse mezclando uno o más principios activos con uno o más diluyentes o portadores no irritantes adecuados que son sólidos a temperatura ambiente, pero líquidos a temperatura corporal y, por lo tanto, se fundirán en el recto o la cavidad vaginal y liberarán el compuesto activo. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención que son adecuadas para administración vaginal también incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de pulverización que contienen tales diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables como se sabe en la técnica que son apropiados.

Las formas farmacéuticas para la administración tópica o transdérmica incluyen polvos, aerosoles, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, disoluciones, parches, gotas e inhalantes. El/los agente(s)/compuesto(s) activo(s) puede(n) mezclarse en condiciones estériles con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable adecuado. Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener excipientes. Los polvos y aerosoles pueden contener excipientes y propelentes.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención adecuadas para administraciones parenterales pueden comprender uno o más agentes/compuestos en combinación con una o más disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que pueden reconstituirse en disoluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, solutos adecuados que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, o agentes de suspensión o espesantes. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. Estas composiciones farmacéuticas también pueden contener adyuvantes adecuados, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede lograr mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción.

En algunos casos, con el fin de prolongar el efecto de un fármaco (por ejemplo, formulación farmacéutica), es deseable ralentizar su absorción de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tiene poca solubilidad en agua.

La velocidad de absorción del principio activo/fármaco depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de un agente/fármaco administrado por vía parenteral se puede lograr disolviendo o suspendiendo el agente/fármaco activo en un vehículo oleoso. Pueden prepararse formas de depósito inyectables formando matrices microencapsuladas del principio activo en polímeros biodegradables. Dependiendo de la razón del principio activo con respecto al polímero, y la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del principio activo. También se preparan formulaciones inyectables de depósito atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal. Los materiales inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, por filtración a través de un filtro de retención de bacterias.

Las formulaciones pueden presentarse en recipientes sellados de una sola dosis o múltiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales, y pueden almacenarse en una condición liofilizada que requiere solo la adición del diluyente o portador líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes de su uso. Pueden prepararse disoluciones y suspensiones para inyección extemporánea a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente.

La presente invención proporciona combinaciones que se muestra que potencian los efectos de los inhibidores de ERK. En el presente documento, los solicitantes también han demostrado que la combinación de diferentes inhibidores de ERK es igualmente sinérgica. Por lo tanto, se contempla que los efectos de las combinaciones descritas en el presente documento pueden mejorarse adicionalmente mediante el uso de uno o más inhibidores de ERK adicionales. En consecuencia, algunas realizaciones de la presente invención incluyen uno o más inhibidores de ERK adicionales.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente los métodos de la presente invención. Estos ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención de ninguna manera.

Ejemplos

Ejemplo 1

Materiales y métodos

Las líneas celulares de cáncer se mantuvieron en cultivo celular en condiciones de medios y suero convencionales. Para estudios de aumento de la dosis, se dividieron las células A375, se cultivaron hasta aproximadamente el 40-60 % de confluencia y luego se trataron con la dosis inicial del fármaco especificado. La tabla 4 muestra un resumen de los tratamientos farmacológicos que se aumentaron.

Tabla 4 - Resumen de tratamientos que se aumentan

Se realizaron aumentos de dosis de agente individual basándose en Little et al, 2011 y se explican resumidamente en la figura 25. Entonces se permitió que las células crecieran hasta el 70-90 % de confluencia y se dividieron. Las razones de división se mantuvieron lo más “normales” posible y razonablemente constantes entre tratamientos (por ejemplo, un mínimo del 50% de la razón de división normal de las parentales). El medio se renovó cada 3-4 días. Cuando las células alcanzaron nuevamente el 40-60 % de confluencia de nuevo, la dosis se aumentó. En el caso de que faltase la ventana del 40-60 %, las células se dividieron de nuevo y se dosificaron una vez que alcanzaron el 40 60 % de confluencia. De nuevo, el medio se renovó cada 3-4 días. El proceso se repitió según se requirió (figura 25).

Para tratamientos con agente individual, las concentraciones iniciales y los aumentos de dosis se realizaron comenzando con la CI⁵⁰aproximada, aumentando en pequeños incrementos o, suavemente, para las 4-5 dosis iniciales, duplicando la dosis, aumentando en el mismo incremento para las siguientes 4 dosis, pasando entonces a aumentos de 1,5 veces en la concentración para las dosis posteriores.

Para tratamientos de combinación, las concentraciones iniciales y los aumentos de dosis se realizaron comenzando con la mitad de la CI⁵⁰aproximada de cada compuesto (el ensayo de combinación sugiere que esto dará como resultado un intervalo de inhibición de aproximadamente el 40-70 %), aumentando según los agentes individuales (es decir, haciendo una duplicación inicial y luego aumentando en el mismo incremento para las siguientes 4 dosis, pasando entonces a incrementos de 1,5 veces en la concentración). La tabla 5 muestra los aumentos de dosis proyectados usando estos esquemas.

Tabla 5 - Aumentos de dosis proyectados - mes 1

Las poblaciones celulares resistentes clónales se derivaron de conjuntos celulares resistentes mediante dilución limitante.

Se usaron ensayos de proliferación para rastrear los cambios en la sensibilidad al/a los agente(s) aumentado(s) a intervalos de tiempo apropiados (por ejemplo, cada mes, aunque el tiempo depende de que estén disponibles números de células adecuados). Para ensayos de proliferación, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 3000 células por pocillo en medio DMEM libre de fármaco que contenía FBS al 10 % y se permitió que se adhirieran durante la noche antes de la adición del compuesto o control de vehículo. Los compuestos se prepararon a partir de disoluciones madre en DMSO para dar un intervalo de concentración final como se muestra en las figuras 2A-H. La concentración final de DMSO fue constante al 0,1 %. Los compuestos de prueba se incubaron con las células durante 96 horas a 37 °C y el 5 % de CO²al 5 % en una atmósfera humidificada. Entonces se añadió Alamar Blue al 10% (v/v) y se incubó durante 4 horas y se detectó el producto fluorescente usando un lector de placas BMG FLUOstar. Se dedujo el valor del medio promedio solo del fondo y se analizaron los datos usando una ecuación logística de 4 parámetros en GraphPad Prism. Se usó paclitaxel como control positivo.

Los ensayos de proliferación para el mes 1 se iniciaron el día 28 usando células que se cultivan en las concentraciones de cada agente indicado en la tabla 6.

Tabla 6 - Concentraciones iniciales de fármacos usados en ensayos de proliferación - mes 1

Los ensayos de proliferación para el mes 2 se iniciaron el día 56 usando células que se cultivan en las concentraciones de cada agente indicadas en la tabla 7.

Tabla 7 - Concentraciones iniciales de fármacos usados en ensayos de proliferación - mes 2

Al final del período de aumento de 3 meses, los cultivos se mantuvieron a la concentración máxima durante 2 semanas antes de la ronda final de ensayos de proliferación y posible clonación de células individuales. Como los ensayos de proliferación/clonación de células individuales requerían células en proliferación activa, para tratamientos en los que las células proliferaban muy lentamente a la concentración máxima o que solo se aumentaron recientemente, un cultivo de reserva también se mantuvo a una concentración más baja (tabla 8). Para el tratamiento con BVD-523, donde las células parecían haber dejado de crecer casi por completo y parecían particularmente frágiles a la concentración máxima (1,8 p,M), los cultivos se mantuvieron a una concentración más baja durante el período de 2 semanas.

Tabla 8 - Detalles de los tratamientos que se cultivan a una concentración fija durante 2 semanas

Los ensayos de proliferación para el mes 3 usaron células que se cultivan en las concentraciones de cada agente indicadas en la tabla 9.

Tabla 9 - Concentraciones iniciales de fármacos usados en ensayos de proliferación - mes 3

Para estudios de combinación, se sembraron células A375 (ATCC) en placas de 96 pocillos por triplicado a una densidad celular de 3000 células/pocillo en DMEM más FBS al 10 % y se permitió que se adhirieran durante la noche antes de la adición del compuesto de prueba o control de vehículo. Las combinaciones se sometieron a prueba usando una matriz de dosis de 10x8 con una concentración final de DMSO del 0,2%. Siguió un período de incubación del ensayo de 96 horas, con la posterior adición de Alamar Blue al 10% (v/v) y 4 horas de incubación antes de la lectura en un lector de placas fluorescentes. Después de leer el Alamar Blue, la mezcla de medio/Alamar Blue se retiró y se añadieron 100 pl de CellTiter-Glo/PBS (1:1) y se procesaron las placas según las instrucciones del fabricante (Promega). Se restaron los valores del medio solo del fondo antes de analizar los datos. Luego se aplicó el modelo de aditividad de Bliss.

En resumen, los valores de inhibición fraccionarios predichos para la inhibición combinada se calcularon usando la ecuación Cbliss = A B -(A x B) donde A y B son las inhibiciones fraccionarias obtenidas por el fármaco A solo o el fármaco B solo a concentraciones específicas. Cbliss es la inhibición fraccionaria que se esperaría si la combinación de los dos fármacos fuera exactamente aditiva. Los valores de Cbliss se restan de los valores de inhibición fraccionarios observados experimentalmente para dar un valor de ‘exceso con respecto a Bliss’. Valores de exceso con respecto a Bliss mayores de 0 indican sinergia, mientras que valores inferiores a 0 indican antagonismo. Los valores de exceso con respecto a Bliss se representan gráficamente como mapas de calor ± DE.

Los datos individuales y de combinación también se presentan como curvas de dosis-respuesta generadas en GraphPad Prism (representadas gráficamente usando el % de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO).

Para estudios de combinación enfocados, los ensayos de viabilidad de Alamar Blue se realizaron como se describió anteriormente para estudios de combinación. Adicionalmente, se realizaron ensayos de Caspase-Glo 3/7. En resumen, se sembraron células HCT116 por triplicado en placas blancas de 96 pocillos a una densidad celular de 5000 células/pocillo en 5A de McCoy más FBS al 10%. Se sembraron células A375 a una densidad de 5000 células/pocillo en DMEM más FBS al 10 %. Se permitió que las células se adhirieran durante la noche antes de la adición de la cantidad indicada de compuesto de prueba o control de vehículo. La concentración final de DMSO fue del 0,2 %, y se incluyó estaurosporina 800 nM como control positivo. Se usaron períodos de incubación de ensayo de 24 y 48 horas. A continuación, se añadió Caspase-Glo® 3/750% (v/v), las placas se mezclaron durante 5 minutos en un agitador orbital y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente antes de la lectura en un lector de placas luminiscente. Se restaron los valores del medio solo del fondo antes de analizar los datos.

Ejemplo 2

Ensayos de aumento de la dosis y proliferación - mes 1

Evolución del aumento de la dosis - mes 1

Se aumento la dosis de las células A375 usando BVD-523, dabrafenib y trametinib o bien como agentes individuales o bien en combinación. Las dosis se aumentaron en pequeños incrementos durante el primer mes. Aparte de una marcada reducción en la tasa de crecimiento, las células toleraron generalmente bien los aumentos y se planificó que las dosis se aumentaran más agresivamente usando incrementos más grandes en el mes 2. Las figuras 1A-C muestran el progreso del mes 1 para los estudios de aumento de la dosis.

Resultados del ensayo de proliferación - mes 1

Se realizaron ensayos de proliferación para evaluar la respuesta de las líneas celulares aumentadas frente a la línea celular parental, a los tratamientos con BVD-523, dabrafenib y trametinib.

Las figuras 2A-H muestran resultados de ensayos de proliferación normalizados y sin procesar del mes 1 de los estudios. Obsérvese que las diferencias en las señales máximas en los controles de DMSO entre diferentes tratamientos (figuras 2D-F, 2H) sugieren tasas de crecimiento diferenciales entre tratamientos. Estas diferencias pueden influir en las respuestas de las líneas a los inhibidores en los ensayos de proliferación.

La tabla 10 muestra los datos de CI⁵⁰para el mes 1 de los estudios.

Tabla 10 - Datos de CI⁵⁰- mes 1

*Par = linea celular parental

Hubo indicios tempranos de que las células que se cultivaron en presencia de dosis crecientes de dabrafenib o trametinib, o bien como agentes individuales o bien en combinaciones, presentaban respuestas disminuidas a estos dos agentes en ensayos de proliferación.

En las primeras fases del mes 2, la tasa de crecimiento de células en el tratamiento solo con dabrafenib aumentó notablemente en relación con las primeras fases del mes 1. Esto permitió una mayor tasa de progresión y sugirió que la resistencia se estaba volviendo evidente.

Ejemplo 3

Ensayos de aumento de la dosis y proliferación - mes 2

Evolución del aumento de la dosis - mes 2

El segundo mes de estudios verificó que la mayoría de los tratamientos pasan a una fase donde las dosis aumentaron en incrementos mayores (1,5 veces) en comparación con la fase inicial de aumento suave. El aumento de agente individual de dabrafenib y trametinib fue el más rápido, cultivándose las células en concentraciones equivalentes a 100x CI⁵⁰de las células parentales (figuras 3A, B). El aumento de agente individual de BVD-523 progresó más lentamente en comparación con dabrafenib y trametinib (figura 3C). Véase la figura 3D para una comparación de los aumentos de agente individual. Las células con aumento de BVD-523 tenían una apariencia más “frágil” y había un mayor número de células flotantes en comparación con las poblaciones con aumento de dabrafenib y trametinib. Los aumentos de agente combinado progresaron más lentamente que los tratamientos con agente individual. La combinación de BVD-523/trametinib fue particularmente eficaz en la prevención de que las células progresaran. Resultados del ensayo de proliferación - mes 2

Los ensayos de proliferación en poblaciones de células con dabrafenib y trametinib aumentados como agente individual revelaron cambios modestos en las curvas de respuesta a la dosis, lo que sugiere que un período adicional de aumento sería beneficioso para enriquecer adicionalmente las células resistentes. De manera interesante, en el ensayo de proliferación, había pruebas que sugieren que las células expuestas a BVD-523 crecieron menos bien tras la retirada del inhibidor, indicando quizá un nivel de adicción.

Las figuras 4A-H muestran resultados de ensayos de proliferación normalizados y sin procesar del mes 2 de los estudios. Obsérvese que las diferencias en las señales máximas en los controles de DMSO entre diferentes tratamientos (figuras 4D-F, 4H) sugieren tasas de crecimiento diferenciales entre tratamientos. Estas diferencias pueden influir en las respuestas de las líneas a los inhibidores en los ensayos de proliferación.

Las figuras 5A-H muestran resultados de ensayos de proliferación normalizados y sin procesar del mes 2 de los estudios con un enfoque en los datos de la línea parental y BVD-523 solamente.

La tabla 11 muestra los datos de CI50 para el mes 2 de los estudios. Las CI50 relativas se determinaron a partir de ajustes de curva de 4 parámetros en Prism.

Tabla 11 - Datos de CI50 - mes 2

*Par= línea celular parental

Ejemplo 4

Ensayos de aumento de la dosis y proliferación - mes 3

Evolución del aumento de la dosis - mes 3

Las figuras 6A-C muestran un aumento de agente individual y de combinación para el mes 3 de los estudios. La figura 6D muestra una comparación de los aumentos de agente individual.

Resultados del ensayo de proliferación - mes 3

La figura 7 muestra una evaluación del crecimiento durante el ensayo de proliferación en pocillos de control de DMSO. Las figuras 8A-D muestran los resultados del mes 3 de los estudios. Las figuras 9A-D muestran los resultados del mes 3 de los estudios con un enfoque en líneas celulares de tratamiento individual.

La tabla 12 muestra los datos de CI⁵⁰para el mes 3 de los estudios. Las CI⁵⁰relativas se determinaron a partir de ajustes de curva de 4 parámetros en Prism. Los valores de CI⁵⁰no se determinaron para la línea celular aumentada con trametinib debido a la falta de crecimiento durante el ensayo (ND: no realizado).

Tabla 12 - Datos de CI⁵⁰- mes 3

* P a r = l í n e a c e l u l a r p a r e n t a l

Ejemplo 5

Resultados del estudio de combinación

Como se esperaba, las células A375, que portan una mutación de BRAF (V600E), fueron sensibles a dabrafenib. Los valores de CI⁵⁰de agente individual calculados usando Alamar Blue (figuras 10, 12, 14) fueron en general ligeramente inferiores para dabrafenib y BVD-523 en comparación con los derivados usando CellTiter-Glo (figuras 11, 13, 15). Los valores de CI⁵⁰publicados para dabrafenib y trametinib en un ensayo CellTiter-Glo de 72 horas fueron 28 ± 16 nM y 5 ± 3 nM respectivamente (Greger et al, 2012; King et al, 2013) (los resultados de agente individual notificados en el presente documento son consecuentes con estos valores). Hubo alguna evidencia de una ventana de sinergia en todos los tratamientos. La variación entre muestras por triplicado fue baja, sin embargo, hubo alguna evidencia de efectos de borde que probablemente explica el crecimiento aumentado aparente observado en algunos tratamientos frente al control sin fármacos (por ejemplo, particularmente evidente en la combinación de trametinib/BVD-523). Esto hace que la interpretación del análisis de Bliss sea más complicada ya que en algunos tratamientos puede haber dado como resultado una potenciación de artefacto en el nivel de sinergia.

Los ensayos de combinación se repitieron para células A375. Adicionalmente, se usaron células HCT116 en un ensayo de combinación de seguimiento. Los resultados de estos experimentos se muestran en las figuras 31-41. Las potencias de BVD-523, trametinib y dabrafenib como agente individual fueron consecuentes con las notificadas en los estudios previos.

Las células HCT116 son células de cáncer colorrectal humano con mutaciones en KRAS. Dabrafenib y trametinib fueron antagonistas a concentraciones relevantes en la diana. Por el contrario, trametinib presentó sinergia con AZ628 a lo largo de una amplia gama de combinaciones, y con concentraciones más altas de sorafenib. BVD-523 presentó ventanas de sinergia tanto con AZ628 como con sorafenib.

En células A375, trametinib presentó bolsillos de sinergia a concentraciones más bajas de dabrafenib y AZ628. BVD-523 presentó una ventana de sinergia con las concentraciones más bajas de sorafenib.

Ejemplo 6

BVD-523 alteró los marcadores de actividad de MAPK quinasa y función efectora

Para los estudios de inmunotransferencia de tipo Western, se sembraron células HCT116 (5 x 106) en placas de 10 cm en 5A de McCoy más FBS al 10 %. Se sembraron células A375 (2,5 x 106) en placas de 10 cm en DMEM más FBS al 10 %. Se permitió que las células se adhirieran durante la noche antes de la adición de la cantidad indicada de compuesto de prueba (BVD-523) o control de vehículo. Las células se trataron durante 4 o 24 horas antes del aislamiento de lisados de proteínas de células completas, como se especifica a continuación. Las células se recogieron mediante tripsinización, se sedimentaron y se congelaron inmediatamente. Se prepararon lisados con tampón RIPA (ensayo de radioinmunoprecipitación), se clarificaron por centrifugación y se cuantificaron por ensayo con ácido bicinconínico (BCA). Se resolvieron 20-50 pg de proteína mediante electroforesis en SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF y se estudiaron con sonda usando los anticuerpos detallados en la tabla 13 (para el tratamiento de 4 horas) y la tabla 14 (para el tratamiento de 24 horas) a continuación.

Tabla 13 - Detalles de anticuerpos

Tabla 14 - Detalles de anticuerpos

Las figuras 16-18 muestran análisis de inmunotransferencia de tipo Western de células tratadas con BVD-523 a diversas concentraciones para lo siguiente: 1) componentes de señalización de MAPK en células A375 después de 4 horas; 2) señalización de ciclo celular y apoptosis en tratamiento de 24 horas de A375 con diversas cantidades de BVD-523; y 3) señalización de MAPK en células HCT-116 tratadas durante 4 horas. Los resultados muestran que el tratamiento agudo y prolongado con BVD-523 en células cancerosas mutantes para RAF y RAS in vitro afecta tanto a la fosforilación del sustrato como a las dianas efectoras de las quinasas ERK. Las concentraciones de BVD-523 requeridas para inducir estos cambios están normalmente en el intervalo micromolar bajo.

Los cambios en varios marcadores de actividad específicos son notables. En primer lugar, la abundancia de isoformas que migran lentamente de la quinasa ERK aumenta después del tratamiento con BVD-523; pueden observarse cambios modestos de manera aguda, y aumentan después de un tratamiento prolongado. Si bien esto podría indicar un aumento en formas de ERK enzimáticamente activas, fosforiladas, sigue siendo notable que múltiples proteínas sujetas a regulación tanto directa como indirecta por ERK permanecen “apagadas” después del tratamiento con BVD-523. En primer lugar, las proteínas RSK1/2 presentan fosforilación reducida en residuos que dependen estrictamente de ERK para la modificación proteica (T359/S363). En segundo lugar, el tratamiento con BVD-523 induce cambios complejos en la fosfatasa de retroalimentación de MAPK, DUSP6: las isoformas de proteínas que migran lentamente se reducen después del tratamiento agudo, mientras que los niveles de proteína total se reducen en gran medida después del tratamiento prolongado con BVD-523. Ambos de estos hallazgos son consecuentes con la actividad reducida de las quinasas ERK, que controlan la función de DUSP6 a través de mecanismos postraduccionales y transcripcionales. En general, a pesar de los aumentos en las formas celulares de ERK que normalmente se cree que son activas, parece probable que la actividad enzimática de ERK celular se inhiba completamente después de un tratamiento agudo o prolongado con BVD-523.

Consecuente con estas observaciones, los genes efectores que requieren señalización de la ruta de MAPK se ven alterados después del tratamiento con BVD-523. El aparato de ciclo celular G1/S está regulado tanto a nivel postraduccional como transcripcional por la señalización de MAPK, y los niveles de proteína ciclina-D1 se reducen en gran medida después del tratamiento prolongado con BVD-523. De manera similar, la expresión génica y la abundancia de proteínas de los efectores de apoptosis a menudo requieren señalización de MAPK intacta, y niveles totales de aumento de Bim-EL después del tratamiento prolongado con BVD-523. Como se ha indicado anteriormente, sin embargo, no se observaron escisión de la proteína PARP y aumento de la apoptosis en el antecedente celular A375; esto sugiere que factores adicionales pueden influir en si los cambios en la señalización efectora dependiente de BVD-523/ERK se traducen en acontecimientos definitivos tales como muerte celular y detención del ciclo celular.

Consecuente con la actividad celular de BVD-523, el análisis de marcadores sugiere que la inhibición de ERK altera una variedad de acontecimientos de señalización molecular en células cancerosas, haciéndolas susceptibles tanto a la disminución de la proliferación celular como de la supervivencia.

En resumen, las figuras 16-18 muestran que BVD-523 inhibe la ruta de señalización de MAPK y puede ser más favorable en comparación con la inhibición de RAF o MEK en este entorno.

Finalmente, las propiedades de BVD-523 pueden hacer que este sea un agente preferido para su uso como inhibidor de ERK, en comparación con otros agentes con una actividad similar. Se sabe que los fármacos inhibidores de quinasa muestran interacciones únicas y específicas con sus dianas enzimáticas, y que la eficacia del fármaco está fuertemente influida tanto por el modo de inhibición directa, así como la susceptibilidad a cambios adaptativos que se producen después del tratamiento. Por ejemplo, inhibidores de las quinasas ABL, KIT, EGFR y ALK son eficaces solo cuando su diana relacionada se encuentra en configuraciones activas o inactivas. Del mismo modo, algunos de estos inhibidores son excepcionalmente sensibles a cualquier mutación genética secundaria, o cambios adaptativos postraduccionales, de la proteína diana. Finalmente, los inhibidores de RAF muestran potencia diferencial a las quinasas RAF presentes en ciertos complejos proteicos y/o localizaciones subcelulares. En resumen, ya que se sabe que las quinasas ERK existen de manera similar en diversos estados bioquímicos variables y complejos, parece probable que BVD-523 pueda interaccionar e inhibir estas dianas de una manera que sea distinta y altamente preferible a otros agentes.

Ejemplo 7

Ensayo in vivo

Ratones

Ratones desnudos atímicos hembra (Crl:NU(Ncr)-Foxn/nu, Charles River) de nueve semanas de edad con un intervalo de peso corporal (BW) de 17,5 a 26,2 gramos el día 1 del estudio. Los animales se alimentaron con agua a voluntad (ósmosis inversa, 1 ppm de CI), y NIH 31 Modified and Irradiated Lab Diet® que consiste en un 18,0 % de proteína en bruto, un 5,0 % de grasa en bruto y un 5,0% de fibra en bruto. Los ratones se alojaron en lechos de animales de laboratorio irradiados Enrich-o'cobsTM en microaisladores estáticos en un ciclo de luz de 12 horas a 20-22 °C (68 72 °F) y el 40-60 % de humedad. Se cumplieron las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio con respecto a la restricción, cría, procedimientos quirúrgicos, regulación de alimentación y fluidos, y cuidados veterinarios.

Implantación in vivo y crecimiento tumoral

Se iniciaron xenoinjertos tumorales con melanomas humanos A375 mediante trasplante subcutáneo en serie en ratones desnudos atímicos. El día del implante tumoral, cada ratón de prueba recibió un fragmento de 1 mm3 de A375 implantado por vía subcutánea en el costado derecho, y se monitorizó el crecimiento tumoral a medida que el tamaño promedio se aproximaba al intervalo objetivo de 80 a 120 mm3. Los tumores se midieron en dos dimensiones usando calibres, y el volumen se calculó usando la fórmula:

Volumen tumoral (mm3) - v? x !

2

donde w = anchura y l = longitud, en mm, del tumor. El peso tumoral puede estimarse con la suposición de que 1 mg es equivalente a 1 mm3 de volumen tumoral.

Diez días después de la implantación del tumor, designado como día 1 del estudio, los animales se clasificaron en nueve grupos (grupos 1-9) consistiendo cada uno en quince ratones y consistiendo un grupo (grupo 10) en diez ratones. Los volúmenes tumorales individuales oscilaron entre 75 y 144 mm3 y los volúmenes tumorales medios del grupo fueron de 110 o 111 mm3.

Agentes terapéuticos

Se suministraron BVD-523 y dabrafenib como polvos secos y se almacenaron a temperatura ambiente protegidos de la luz.

Las dosis de BVD-523 se prepararon suspendiendo la cantidad requerida de polvo de BVD-523 en carboximetilcelulosa al 1 % en agua desionizada (“CMC al 1 %”). Se preparó una disolución madre de BVD-523 de 10 mg/ml, y se usó para dosificar al grupo de 100 mg/kg de BVD-523. Se diluyeron alícuotas de la disolución madre con el vehículo hasta una concentración de 5,0 mg/ml para proporcionar la dosificación de 50 mg/kg de BVD-523 en un volumen de dosificación de 10 ml/kg. Las dosis de BVD-523 se almacenaron a 4 °C protegidas de la luz durante hasta una semana.

El polvo seco de dabrafenib consistió en el 85,5 % de compuesto activo, que se contabilizó cuando se prepararon las dosis. Se formuló dabrafenib en CMC al 1% a concentraciones de 11,834 y 5,917 mg/ml para producir dosificaciones de compuesto activo de 100 y 50 mg/kg, respectivamente, en un volumen de dosificación de 10 ml/kg. Las dosis de dabrafenib se almacenaron protegidas de la luz a 4 °C durante hasta una semana.

El vehículo de CMC al 1 % (“vehículo”) se usó para dosificar al grupo de control.

Se prepararon dosis de temozolomida (Temodar®, Schering Corporation, lote n.° 2RSA013) suspendiendo el contenido del número requerido de cápsulas de 100 mg de Temodar® en agua desionizada a una concentración de 15 mg/ml, que suministró a una dosificación de 150 mg/kg en un volumen de dosificación de 10 ml/kg. Se almacenó temozolomida protegida de la luz a 4 °C durante el período de dosificación de 5 días.

Tratamiento

El día 1 del estudio, se clasificaron los ratones en nueve grupos (grupos 1-9) consistiendo cada uno en quince ratones y consistiendo un grupo (grupo 10) en diez ratones, y se inició la dosificación según el plan de tratamiento resumido en la tabla 15 a continuación. Cada dosis se administró por sonda oral (v.o.) en un volumen de dosificación de 10 ml/kg (0,2 ml por 20 gramos de peso corporal), aumentado hasta el peso corporal de cada animal individual. Las dosis de vehículo y dabrafenib se administraron una vez al día hasta el final del estudio (qd hasta el final), mientras que las dosis de BVD-523 se administraron dos veces al día hasta el final del estudio (bid hasta el final). Para la dosificación bid, la dosificación se inició por la tarde el día 1, de modo que se administró una dosis el primer día (“primera dosis el día 1 ”).

Tabla 15 - Diseño del protocolo para el estudio in vivo de A375

Vehículo = carboximetilcelulosa (CMC) al 1% en agua DI

Para dosis bid, se administró una dosis por la tarde el primer día y una dosis por la mañana el último día

La dosificación en los grupos de combinación se modificó durante el estudio como se describe a continuación.

Controles

El grupo 1 recibió vehículo de CMC al 1 %, y sirvió como grupo de control para el cálculo del % de TGD. El grupo 10 recibió temozolomida a 150 mg/kg una vez al día durante cinco días (qd x 5), y sirvió como grupo de referencia.

Tratamientos de monoterapia

Los grupos 6 y 7 recibieron 50 y 100 mg/kg de dabrafenib, respectivamente. Los grupos 8 y 9 recibieron 50 y 100 mg/kg de BVD-523, respectivamente.

Tratamientos de combinación

Los grupos 2 y 3 recibieron las combinaciones de 50 mg/kg de dabrafenib con 50 o 100 mg/kg de BVD-523, respectivamente. Los grupos 4 y 5 recibieron las combinaciones de 100 mg/kg de dabrafenib con 50 o 100 mg/kg de BVD-523, respectivamente. Debido a la sorprendente respuesta al tratamiento de combinación, la dosificación en los grupos 2-5 se detuvo el día 20 para monitorizar el recrecimiento tumoral. La dosificación iba a reiniciarse en un grupo cuando la carga tumoral media alcanzó 1000 mm3. Para el día 42, no se había alcanzado la carga tumoral media de 1000 mm3 en ninguno de los grupos de combinación. Se reinició la dosificación para permitir el muestreo de suero y tumor después de la dosis final para los análisis farmacocinéticos. Comenzando el día 42, los grupos 2-5 recibieron dabrafenib administrado una vez al día durante cuatro días y BVD-523 administrado dos veces al día durante tres días, seguido de una dosis de BVD-523 por la mañana el día 45. Los programas de dosificación finales se muestran a continuación en la tabla 16.

Análisis de punto final y retraso del crecimiento tumoral (TGD)

Los tumores se midieron usando calibres dos veces por semana, y cada animal se sacrificó cuando su tumor alcanzó el punto final de volumen tumoral predeterminado de 2000 mm3 o el día final, lo que se produzca primero. Los animales que dejaron el estudio para el punto final del volumen tumoral se documentaron como sacrificados para la progresión tumoral (TP), con la fecha del sacrificio. El tiempo hasta el punto final (TTE) para el análisis se calculó para cada ratón mediante la siguiente ecuación:

TTE = lodo fvoliimendepuntofinaQ - b

m

donde TTE se expresa en días, el volumen de punto final se expresa en mm3, b es la ordenada en el origen y m es la pendiente de la línea obtenida por regresión lineal de un conjunto de datos de crecimiento tumoral transformados logarítmicamente. El conjunto de datos consiste en la primera observación que excedió el volumen de punto final utilizado en el análisis y las tres observaciones consecutivas que precedieron inmediatamente a la consecución de este volumen de punto final. El TTE calculado suele ser menor que la fecha de TP, el día en que se sacrificó al animal para determinar el tamaño del tumor. A los animales con tumores que no alcanzaron el volumen de punto final se les asignó un valor de TTE igual al último día del estudio. Cualquier animal clasificado como que ha muerto por causas NTR (no relacionadas con el tratamiento) debido a una etiología accidental (NTRa) o desconocida (NTRu) se excluyó de los cálculos de TTE (y todos los análisis adicionales). A los animales clasificados como muertes TR (relacionadas con el tratamiento) o NTRm (muerte no relacionada con el tratamiento debido a metástasis) se les asignó un valor de TTE igual al día de la muerte.

El resultado del tratamiento se evaluó a partir del retraso del crecimiento tumoral (TGD), definido como el aumento en la mediana del tiempo hasta el punto final (TTE) en un grupo de tratamiento en comparación con el grupo de control:

expresado en días, o como un porcentaje de la mediana del TTE del grupo de control:

%TGD = T - C x 100

C

donde:

T = mediana de TTE para un grupo de tratamiento, y

C = mediana de TTE para el grupo de control designado.

Criterios para las respuestas de regresión

La eficacia del tratamiento puede determinarse a partir de la incidencia y magnitud de las respuestas de regresión observadas durante el estudio. El tratamiento puede causar regresión parcial (PR) o regresión completa (CR) del tumor en un animal. En una respuesta PR, el volumen tumoral fue del 50 % o menos de su volumen del día 1 durante tres mediciones consecutivas durante el curso del estudio, e igual o mayor de 135 mm3 para una o más de estas tres mediciones. En una respuesta CR, el volumen del tumor fue menor de 135 mm3 para tres mediciones consecutivas durante el curso del estudio. Un animal con una respuesta CR al finalizar un estudio se clasificó adicionalmente como un superviviente libre de tumor (TFS). Los animales se monitorizaron para detectar respuestas de regresión.

Toxicidad

Los animales se pesaron diariamente los días 1-5, luego dos veces por semana hasta la finalización del estudio. Los ratones se observaron con frecuencia para detectar signos evidentes de cualquier efecto secundario adverso relacionado con el tratamiento (TR), y se registraron los signos clínicos cuando se observaron. Se monitorizó la pérdida de peso corporal individual según el protocolo, y se sacrificó cualquier animal que excediera los límites para una pérdida aceptable de peso corporal. La pérdida de peso corporal media del grupo también se monitorizó según el protocolo. La dosificación debía suspenderse en cualquier grupo que excediera los límites para una pérdida de peso corporal media aceptable. Si se recuperó el peso corporal medio, entonces la dosificación debía reanudarse en ese grupo, pero a una dosificación más baja o menos frecuente.

La toxicidad aceptable para la dosis máxima tolerada (MTD) se definió como una pérdida de peso corporal media de menos del 20 % durante el estudio y no más del 10 % de muertes relacionadas con el tratamiento (TR). Una muerte se clasificó como TR si era atribuible a efectos secundarios del tratamiento como lo demuestran los signos clínicos y/o la necropsia, o también se clasificó como TR si se debía a causas desconocidas durante el período de dosificación o dentro de los 14 días de la última dosis. Una muerte se clasificó como no relacionada con el tratamiento (NTR) si no había evidencia de que la muerte estuviera relacionada con los efectos secundarios del tratamiento. Las muertes NTR se caracterizaron adicionalmente en función de la causa de la muerte. Una muerte se clasificó como NTRa si resultó de un accidente o error humano. Una muerte se clasificó como NTRm si la necropsia indicaba que puede haber resultado de la diseminación tumoral por invasión y/o metástasis. Una muerte se clasificó como NTRu si la causa de la muerte era desconocida y no había evidencia disponible de muerte relacionada con los efectos secundarios del tratamiento, metástasis, accidente o error humano, aunque no se puede excluir la muerte debida a efectos secundarios del tratamiento.

Muestreo

Cuando estén disponibles, se sacrificaron cinco ratones por grupo mediante punción cardíaca terminal bajo anestesia con dióxido de carbono a las 3, 6 y 12 horas después de la dosis final, y se recogió el volumen sanguíneo completo de cada animal. Se separó el suero y se almacenó congelado a -80 °C hasta el envío. Además, los tumores de estos ratones se recogieron y dividieron en dos partes. Una parte se congeló inmediatamente y se almacenó a -80 °C. La otra parte se fijó durante 16-24 horas en formalina tamponada neutra al 10 %, y después se transfirieron a etanol al 70 %. Para grupos con ratones que no tenían tumor detectable, se recogió el sitio del implante, incluyendo la piel completa y el grosor muscular, de tres ratones por grupo.

Análisis estadísticos y gráficos

Se usó Prism (GraphPad) para Windows 3.03 para representaciones gráficas y análisis estadísticos.

Se usó la prueba de rangos logarítmicos, que evalúa la experiencia de supervivencia global, para analizar la significación de las diferencias entre los valores de TTE de dos grupos. El análisis de rangos logarítmicos incluye los datos para todos los animales en un grupo, excepto los evaluados como muertes NTR. Se realizaron análisis estadísticos bilaterales a un nivel de significación P = 0,05. Las pruebas estadísticas no se ajustaron para comparaciones múltiples. Prism resume los resultados de la prueba como no significativos (ns) a P > 0,05, significativos (simbolizado por “*”) a 0,01 < P < 0,05, muy significativos (“**”) a 0,001 < P<0,01, y extremadamente significativos (“***”) a P < 0,001. Debido a que las pruebas de significación estadística no proporcionan una estimación de la magnitud de la diferencia entre grupos, todos los niveles de significación se describieron como significativos o no significativos dentro del texto de este informe.

Se construyó un gráfico de dispersión para mostrar los valores de TTE para ratones individuales, por grupo. Los volúmenes tumorales medios del grupo se representaron gráficamente en función del tiempo. Cuando un animal dejó el estudio debido al tamaño del tumor, el volumen tumoral final registrado para el animal se incluyó con los datos usados para calcular el volumen medio en puntos temporales posteriores. Las barras de error (cuando están presentes) indican un error estándar de la media (EEM). Los gráficos de Kaplan-Meier muestran el porcentaje de animales en cada grupo que permanecen en el estudio frente al tiempo. El gráfico de Kaplan-Meier y la prueba de rangos logarítmicos comparten los mismos conjuntos de datos de TTE. Se calculó el porcentaje de cambios en el peso corporal medio desde el día 1 para cada grupo para cada día de medición del peso corporal, y se representaron gráficamente en función del tiempo. Los gráficos de crecimiento tumoral y peso corporal excluyeron los datos para las muertes NTR, y se truncaron después de que el 50 % de los animales evaluables en un grupo hubiera dejado el estudio.

Resultados

Los grupos en el estudio in vivo de A375 se trataron según el protocolo modificado como se da a conocer en la tabla 15. El experimento se terminó el día 45. La tabla 16 presenta un resumen de las respuestas al tratamiento para cada grupo. La figura 26 es un gráfico de dispersión que muestra los TTE individuales para cada grupo. La figura 27 presenta gráficos de crecimiento tumoral medio (figura 27A) y supervivencia de Kaplan-Meier (figura 27B) para cada grupo en el estudio. Las figuras 28A-D presentan gráficos de crecimiento tumoral medio para las cuatro combinaciones en comparación con sus respectivas monoterapias. La figura 29 presenta gráficos del porcentaje de cambios en el peso corporal medio desde el día 1 para cada grupo.

Eficacia: Crecimiento de melanomas humanos A375 en ratones de control (grupo 1)

En el grupo 1, se encontró un ratón de control muerto más allá de la necropsia el día 4, y la muerte se evaluó como NTRu. Los otros catorce tumores de control progresaron rápida y uniformemente hasta el punto final de 2000 mm3 con una mediana de TTE de 9,2 días, estableciendo un TGD máximo posible de 35,8 días (389 %) para el estudio de 45 días (tabla 15). El gráfico de dispersión muestra una agrupación de TTE de control (figura 26). El gráfico de crecimiento tumoral medio para el grupo 1 ilustró el crecimiento tumoral de control rápido (figura 27A y figura 28A-D).

Eficacia: Respuesta a dabrafenib como monoterapia (grupos 6 y 7)

Los grupos 6 y 7 recibieron dabrafenib como monoterapia a 50 y 100 mg/kg, respectivamente, v.o. qd hasta el final. La mediana de los TTE para los grupos 6 y 7 fue de 16,1 y 28,5 días, respectivamente, correspondiente a TGD relacionados con la dosis de 6,9 días (75 %) y 19,3 días (210 %), con una diferencia de supervivencia significativa para cada uno en comparación con los controles (grupo 1 frente a 6 o 7, P < 0,001). Se registró una PR en el grupo de 100 mg/kg de dabrafenib (tabla 16). Todos los tumores del grupo 6 alcanzaron el volumen tumoral de punto final de 2000 mm3, mientras que 13/15 tumores del grupo 7 alcanzaron el punto final y dos permanecieron el día 45 con un MTV de 282 mm3 (tabla 16). Los gráficos de crecimiento tumoral medio para los grupos 6 y 7 ilustraron los retrasos relacionados con la dosis, aunque los tumores en ambos grupos progresaron durante el tratamiento (figura 27A).

Eficacia; Respuesta a BVD-523 como monoterapia (grupos 8 y 9)

Los grupos 8 y 9 recibieron BVD-523 como monoterapia a 50 y 100 mg/kg, respectivamente, v.o. bid hasta el final. La mediana de los TTE para los grupos 8 y 9 fue de 8,6 y 18,5 días, respectivamente, que correspondía a ausencia de TGD para el grupo de 50 mg/kg de BVD-523 y TGD de 9,3 días (101 %) para el grupo de 100 mg/kg de BVD-523 (tabla 16). Los análisis de rangos logarítmicos detectaron una diferencia de supervivencia significativa solo para 100 mg/kg de BVD-523 en comparación con los controles (grupo 1 frente a 8, P > 0,05; grupo 1 frente a 9, P < 0,001). El grupo 8 tenía una CR que permanecía como una TFS el día 45, mientras que el grupo 9 tenía dos CR/TFS, y todos los demás tumores en estos dos grupos alcanzaron el volumen tumoral de punto final de 2000 mm3 (tabla 16). El gráfico de crecimiento tumoral medio para el grupo de 50 mg/kg de BVD-523 fue comparable al de los controles, mientras que el grupo de 100 mg/kg de BVD-523 mostró un retraso marginal con tumores que progresaron durante el tratamiento (figura 27A).

Eficacia: Respuesta al tratamiento con combinaciones de dabrafenib y BVD-523 (grupos 2-5)

Los grupos 2 y 3 recibieron 50 mg/kg de dabrafenib con 50 o 100 mg/kg de BVD-523, respectivamente, mientras que los grupos 4 y 5 recibieron 100 mg/kg de dabrafenib con 50 o 100 mg/kg de BVD-523, respectivamente. Como se indica en la tabla 16, los regímenes de combinación se modificaron para que la dosificación terminara después del día 20 y luego se reiniciara el día 42 (tabla 16).

La mediana de los TTE para los grupos 2-5 fue cada una de 45,0 días, correspondiente al TGD máximo posible para el estudio (35,8 días, 389 %) y un beneficio de supervivencia global significativo en comparación con los controles (grupo 1 frente a 2-5, P < 0,001).

Cinco tumores en el grupo 2 alcanzaron el volumen de punto final de 2000 mm3, mientras que los grupos 3-5 no tenían tumores que crecieran hasta el volumen de punto final. El grupo 2 tenía tres PR y ocho CR, con siete ratones que permanecieron TFS el día 45 (tabla 16). El grupo 3 tuvo una muerte NTRu el día 31, y los otros catorce ratones tenían CR y permanecieron TFS al final del estudio. El grupo 4 tenía una PR y catorce CR que permanecieron TFS, mientras que el grupo 5 tenía el 100 % de TFS.

Las cargas tumorales medias no fueron detectables en los grupos 2-5 para el día 20 cuando se detuvo la dosificación (figura 27A). El crecimiento tumoral medio se reanudó solo en el grupo de combinación de dosis más baja (grupo 2), y se mantuvo no detectable hasta el final del estudio en los otros tres grupos de combinación (figura 27AI). El gráfico de crecimiento tumoral para cada grupo de combinación mostró una actividad notable en comparación con sus monoterapias correspondientes (figuras 28A-D).

Eficacia: Respuesta al tratamiento con temozolomida (grupo 10)

El tratamiento de referencia con temozolomida dio como resultado una mediana de TTE de 10,5 días, que correspondía a TGD insignificante (1,3 días, 14 %), sin regresiones (tabla 16). Los análisis de rangos logarítmicos no detectaron diferencias de supervivencia significativas para el grupo temozolomida en comparación con los controles (grupo 1 frente a 10, P = 0,052). El gráfico de crecimiento tumoral medio para este grupo mostró un retraso insignificante en comparación con el gráfico para los controles del grupo 1 (figura 27A).

Efectos secundarios

La tabla 16 proporciona un resumen de las pérdidas medias máximas de BW, muertes TR y NTR. La figura 29 presenta gráficos de cambios de BW medios porcentuales desde el día 1 para cada grupo.

No se registraron muertes TR en el estudio, pero se evaluaron dos muertes NTRu (tabla 16). Se registró una muerte NTRu en el grupo 1 el día 4, y se registró una segunda muerte NTRu en el grupo 3 el día 31. El animal del grupo 1 se encontró muerto más allá de la necropsia sin observaciones clínicas previas, mientras que el ratón del grupo 3 estaba delgado, encorvado y letárgico justo antes de la muerte, y la necropsia reveló una masa de nódulos blancos en el hígado, lo que sugiere que la enfermedad metastásica fue una posible causa de muerte. Hubo pérdidas de BW medio insignificantes o ausentes entre los grupos en el estudio (tabla 16 y figura 29), y sin signos notables de efectos secundarios relacionados con el tratamiento entre los grupos de terapia de combinación y monoterapia con BVD-523 y dabrafenib.

Resumen

El estudio in vivo evaluó combinaciones de BVD-523 con dabrafenib para determinar la eficacia en el modelo de ratón desnudo con xenoinjerto de melanoma humano A375. BVD-523 se administró por vía oral a 50 o 100 mg/kg en un programa de dos veces al día y dabrafenib se administró por vía oral a 50 o 100 mg/kg en un programa diario, solo y en combinación. Debido a la sorprendente respuesta al tratamiento de combinación, la dosificación en los grupos de combinación se detuvo el día 20 para monitorizar el recrecimiento tumoral, y se reinició el día 42 para la recogida de muestras al final del estudio el día 45.

Los tumores de control A375 progresaron rápida y uniformemente hasta el punto final del volumen tumoral. La mediana de TTE para los controles fue de 9,2 días, estableciendo un TGD máximo posible de 35,8 días (389 %) para el estudio de 45 días. Un intervalo estrecho de TTE de control, que reflejó el crecimiento tumoral de control uniforme, permitió que la prueba de rangos logarítmicos detectara pequeñas diferencias entre los ratones de control y tratados. El tratamiento de referencia con temozolomida dio como resultado un TGD insignificante (1,3 días, 14 %) y sin regresiones, consecuente con los resultados previos para temozolomida en este modelo tumoral.

Las monoterapias de dabrafenib a 50 y 100 mg/kg produjeron eficacia relacionada con la dosis, con TGD de 6,9 días (75 %) y 19,3 días (210 %), respectivamente, y una PR en el grupo de 100 mg/kg de dabrafenib. La monoterapia de 50 mg/kg de BVD-523 fue inactiva, sin producir TGD y sin diferencia de supervivencia significativa respecto a los controles (P> 0,05). La TFS individual en este grupo podría haberse debido al tratamiento o a una regresión espontánea. La monoterapia de 100 mg/kg de BVD-523 fue marginalmente activa, dando como resultado TGD de 9,3 días (101 %), una diferencia de supervivencia significativa frente a los controles (P< 0,001), y dos TFS que podrían haberse debido al tratamiento o una regresión espontánea.

Cada una de las cuatro combinaciones de dabrafenib con BVD-523 sometidas a prueba en este estudio fue altamente activa, produciendo el TGD máximo posible, respuestas de regresión notables y supervivencia global estadísticamente superior en comparación con sus monoterapias correspondientes (P< 0,001). El grupo de combinación de dosificación más baja (grupo 2) produjo 7/15 TFS notables. Las tres combinaciones de dosis más altas (grupos 3-5) lograron 43/44 supervivientes libres de tumor al final del estudio, incluyendo 15/15 TFS en el grupo de combinación de dosificación más alta (grupo 5). Cabe destacar que, dado un tiempo de duplicación medio de menos de 3 días para los tumores de control, no se produjo ningún recrecimiento tumoral en 43/44 ratones entre los grupos 3-5 durante el descanso de la dosificación desde los días 21 a 42, que fue una duración de tiempo correspondiente a aproximadamente 7 duplicaciones tumorales. Estos resultados fueron consecuentes con actividad curativa o casi curativa.

En resumen, dabrafenib y BVD-523 produjeron cada uno eficacia marginal relacionada con la dosis como monoterapias, pero actividad notable en combinación. Las combinaciones de dabrafenib con BVD-523 sometidas a prueba en este estudio produjeron una notable supervivencia libre de tumores, y eficacia superior a cualquiera de los agentes administrados solos.

Se muestra que la inhibición de la quinasa ERK, ejemplificada usando BVD-523, es eficaz en combinación con el inhibidor de RAF dabrafenib en un modelo de melanoma mutante para BRAF. En células, el tratamiento combinado con BVD-523 y dabrafenib induce ventanas de inhibición sinérgica de la proliferación celular. Cuando se dosifican conjuntamente en un modelo de xenoinjerto, el tratamiento de combinación causa una regresión tumoral prominente y duradera en comparación con la terapia con agente individual.

Adicionalmente, cuando se induce que las células A375 presenten resistencia farmacológica adquirida después de exposición prolongada a inhibidores de la cascada de MAPK, la inhibición de ERK usando BVD-523 muestra propiedades atractivas. En el plazo de semanas después del tratamiento con dabrafenib o trametinib, pueden aislarse células A375 que crecen rápidamente en concentraciones mayores de 10 veces más que la concentración inhibidora CI⁵⁰del crecimiento del compuesto respectivo. Después de 2 meses, las células expuestas a BVD-523 solas crecen mal, y solo pueden soportar el tratamiento con aumentos de menos de 10 veces en las exposiciones a fármacos más allá de la CI⁵⁰. Las células tratadas con la combinación de BVD-523 y dabrafenib presentan de manera similar un mal crecimiento, y solo pueden cultivarse en niveles moderadamente aumentados de dabrafenib cuando está en combinación.

Por último, se sometió a prueba BVD-523 en un modelo de xenoinjerto de melanoma derivado de biopsias obtenidas de un paciente que presentaba progresión de la enfermedad después de la respuesta inicial a vemurafenib. De manera interesante, este modelo in vivo presentó resistencia cruzada adquirida, que parece insensible tanto a dabrafenib como a trametinib. Sin embargo, BVD-523 parece ser eficaz en el modelo, e indujo una potente respuesta antitumoral solo o en combinación con dabrafenib.

En total, estos resultados sugieren que el tratamiento combinado con inhibidores de ERK y RAF es eficaz en los antecedentes del melanoma mutante para BRAF. BVD-523 tiene un modo novedoso de acción farmacológica, y posiblemente presenta una duración prolongada en modelos que muestran tanto sensibilidad intrínseca como resistencia adquirida a inhibidores de BRAF o MEK. La combinación de inhibidores de RAF y ERK para cánceres mutantes para BRAF inhibe una ruta oncogénica en dos puntos de control, lo que a su vez parece crear una barrera difícil contra la subversión y la resistencia farmacológica adquirida.

Estos hallazgos indican que la terapia con la combinación de inhibidores de ERK y RAF puede ser eficaz en una variedad de cánceres, particularmente aquellos que albergan cambios oncogénicos en BRAF, incluyendo cánceres de melanoma, tiroides, pulmón y colon.

Ejemplo 8

Estudios de combinación adicionales

Ensayo de proliferación de agente individual

Se sembraron células en placas de 96 pocillos a las densidades y condiciones de medios indicadas en la tabla 17 y se permitió que se adhirieran durante la noche antes de la adición del compuesto o el control de vehículo. Los compuestos se prepararon a partir de disoluciones madre en DMSO para dar las concentraciones finales deseadas. La concentración final de DMSO fue constante al 0,1 %. Los compuestos de prueba se incubaron con las células durante 72 h a 37 °C, CO²al 5 % en una atmósfera humidificada. Se añadió reactivo CellTiter-Glo^®(Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante y se detectó la luminiscencia usando el lector de placas BMG FLUOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Alemania). Se dedujo el valor del medio promedio solo del fondo y los datos se analizaron usando una ecuación logística de 4 parámetros en GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Ensayo de proliferación de combinación

Se sembraron células por triplicado en placas de 96 pocillos a las densidades y condiciones de medios indicadas en la tabla 17 y se permitió que se adhirieran durante la noche antes de la adición del compuesto o el control del vehículo. Los compuestos se prepararon a partir de disoluciones madre en DMSO para dar las concentraciones finales deseadas. La concentración final de DMSO fue constante al 0,2 %. Las combinaciones se sometieron a prueba usando una matriz de dosis de 10 x 8. Los compuestos de prueba se incubaron con las células durante 72 h a 37 °C, CO²al 5 % en una atmósfera humidificada. Se añadió reactivo CellTiter-Glo^®(Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante y se detectó la luminiscencia usando el lector de placas BMG FLUOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Alemania). Se dedujo el valor del medio promedio solo del fondo y se analizaron los datos.

Para los ensayos de combinación de 10 x 8, se determinaron las interacciones de combinación a través de la matriz de dosis mediante los modelos de aditividad de Loewe e independencia de Bliss usando el software Chalice™ Combination Analysis (Horizon Discovery Group, Cambridge, MA) como se explica resumidamente en el manual del usuario (disponible en chalice.horizondiscovery.com/chalice-portal/documentation/analyzer/home.jsp). La sinergia se determina comparando el nivel de inhibición observado experimentalmente en cada punto de combinación con el valor esperado para la aditividad, que se deriva de las respuestas de agente individual a lo largo de los bordes de la matriz. Se identificaron posibles interacciones sinérgicas mostrando el exceso de inhibición calculado con respecto al predicho como aditivo a través de la matriz de dosis como un mapa de calor, y notificando una 'puntuación de sinergia' cuantitativa basada en el modelo de Loewe. Los datos de agente individual derivados de las placas de ensayo de combinación se presentaron como curvas de dosis-respuesta generadas en GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA) (representadas gráficamente usando el porcentaje de viabilidad en relación con los controles tratados solo con DMSO).

Tabla 17 - Densidad de siembra de la línea celular y medios de crecimiento

Resultados

El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos de combinar inhibidores de ERK con inhibidores de RAF de tipo I. Un inhibidor novedoso de ERK, BVD-523, con dos inhibidores de RAF de tipo I, dabrafenib (GSK2118436) y vemurafenib (PLX4032), y un inhibidor de tipo II, TAK-632, en dos líneas celulares de melanoma mutantes para BRAF V600E, A375 y G-361. Un segundo inhibidor de ERK, mecanísticamente distinto (SCH772984), también se sometió a prueba en combinación con dabrafenib (GSK2118436) y vemurafenib (PLX4032).

Se realizaron en primer lugar ensayos de proliferación de agente individual para seleccionar un intervalo de concentración apropiado para los estudios de combinación. Si bien ambas líneas celulares tenían un nivel similar de sensibilidad al paclitaxel, las células G-361 parecían ser de 4 a 6 veces menos sensibles a la inhibición tanto de ERK como de RAF en comparación con las células A375 (figura 42). Los resultados de CI⁵⁰se resumen en la tabla 18.

Tabla 18 - Valores de CI⁵⁰de agente individual para compuestos sometidos a prueba

* L o s v a l o r e s p a r a d a b r a f e n i b d e b e n c o n s i d e r a r s e a p r o x i m a d o s y a q u e la p a r t e s u p e r i o r d e la s c u r v a s n o e s t a b a n b i e n d e f i n i d a s p o r e l I n t e r v a l o d e d o s i s s o m e t i d o a p r u e b a .

Las interacciones de combinación entre dos compuestos se evaluaron a través de una matriz de 8x10 de concentraciones usando los modelos de aditividad de Loewe y de independencia de Bliss con el software ChaliceTM Bioinformatics (Horizon Discovery Group, Cambridge, MA). Chalice™ permite identificar posibles interacciones sinérgicas mostrando el exceso de inhibición calculado con respecto al predicho como aditivo a través de la matriz de dosis como un mapa de calor, y notificando una 'puntuación de sinergia' cuantitativa basada en el modelo de Loewe.

En células A375 (figura 43 - figura 48), el análisis usando el modelo de Loewe indicó que las combinaciones con BVD-523 parecían principalmente aditivas. Los resultados usando el método de Bliss fueron similares, aunque este método sugirió la presencia de una región de antagonismo leve a concentraciones más altas para cada combinación. Por el contrario, en células G-361 (figura 49 - figura 54), mientras que la mayoría de las interacciones a través de la matriz de dosis también fueron aditivas, ambos modelos de análisis también revelaron pequeños bolsillos de sinergia modesta a las concentraciones medias. Se obtuvieron resultados similares con un segundo inhibidor de ERK mecanísticamente distinto (SCH772984). Esto respalda la noción de que es probable que las sinergias observadas en G-361 estén específicamente relacionadas con la inhibición de ERK y no debido a efectos fuera de diana.

En resumen, estos resultados sugieren que las interacciones entre BVD-523 y los inhibidores de RAF tipo I y tipo II son al menos aditivas, y en algunos casos sinérgicas, en líneas celulares de melanoma que portan una mutación de BRAF V600E.

Las interacciones sinérgicas se puntuaron de dos maneras (figura 55 - figura 57). El exceso de actividad con respecto a lo predicho si una combinación era aditiva puede calcularse usando una puntuación de volumen simple, que calcula el volumen entre la superficie de respuesta medida y la predicha. Esta puntuación de volumen muestra si la respuesta global a una combinación es sinérgica (valores positivos), antagonista (valores negativos) o aditiva (valores ~ 0). Adicionalmente, una 'puntuación de sinergia' es un volumen ponderado por inhibición positiva con respecto a la aditividad de Loewe. Esto proporciona una priorización adicional que favorece combinaciones cuya sinergia se produce a altos niveles de efecto, ignorando porciones antagonistas de la superficie de respuesta.

Ejemplo 9

Interacciones de combinación entre inhibidores de ERK

Se cultivaron células de la línea celular de melanoma mutante para RAF A375 se cultivaron en DMEM con FBS al 10 % y se sembraron en placas de 96 pocillos por triplicado a una densidad inicial de 2000 células por pocillo. Las interacciones de combinación entre los inhibidores de ERK BVD-523 y SCH772984 se analizaron después de 72 horas como se describió anteriormente en el ejemplo 8. La viabilidad se determinó usando el reactivo CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante y se detectó la luminiscencia usando el lector de placas BMG FLUOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Alemania).

La visualización de los mapas térmicos de 'exceso de inhibición” de Bliss y Loewe sugería que la combinación de BVD-523 y SCH772984 era principalmente aditiva con posibles ventanas de sinergia en dosis de intervalo medio (figura 58).

En resumen, estos resultados sugieren que las interacciones entre BVD-523 y SCH772984 son al menos aditivas, y en algunos casos sinérgicas.

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Claims

REIVINDICACIONESi. Un primer agente anticancerígeno (i), que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un segundo agente anticancerígeno (ii), para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto, en el que el segundo agente anticancerígeno es

(ii-1) un inhibidor de RAF de tipo 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; o

(ii-2) AZ628 (Axon Medchem BV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. Un método in vitro para efectuar la muerte de células cancerosas que comprende poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad eficaz del primer y segundo agente anticancerígeno según la reivindicación 1.
3. Un kit para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que comprende una cantidad eficaz del primer y segundo agente anticancerígeno según la reivindicación 1, empaquetado junto con instrucciones para su uso.
4. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto, comprendiendo la composición farmacéutica un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz del primer y segundo agente anticancerígeno según la reivindicación 1, en la que la administración de los agentes anticancerígenos primero y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier agente anticancerígeno solo.
5. El primer y segundo agente anticancerígeno para el uso según la reivindicación 1, método in vitro según la reivindicación 2, el kit para el uso según la reivindicación 3 o la composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 4, en los que

(i) el sujeto es un mamífero, o en los que la célula cancerosa se ha obtenido de un sujeto, que es un mamífero; y en los que el mamífero puede seleccionarse del grupo que consiste en seres humanos, primates, animales de granja y animales domésticos; y/o

(ii) el sujeto con cáncer, o el sujeto del que se ha obtenido la célula cancerosa, tiene una mutación de BRAF somática o es resistente al tratamiento con un inhibidor de la ruta de MAPK.
6. El primer y segundo agente anticancerígeno para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5, el método in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 5, el kit para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 5, o la composición farmacéutica para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5, en los que el inhibidor de RAF de tipo 1 se selecciona del grupo que consiste en vemurafenib, dabrafenib, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.
7. El primer y segundo agente anticancerígeno para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 y 6, el método in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 5 y 6, el kit para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3, 5 y 6, o la composición farmacéutica para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en los que va a administrarse al menos un agente terapéutico adicional al sujeto o a la célula cancerosa, o en los que el kit comprende al menos un agente terapéutico adicional; en los que el agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo o fragmento del mismo, una toxina, un radionúclido, un inmunomodulador, un agente terapéutico fotoactivo, un agente radiosensibilizante, una hormona, un agente antiangiogénico, y combinaciones de los mismos; en los que el agente terapéutico adicional puede ser un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, tal como un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt que se selecciona del grupo que consiste en A-674563 (n.° CAS 552325-73-2), AGL 2263, AMG-319 (Amgen, Thousand Oaks, CA), AS- 041164 (5-benzo[1,3]dioxol-5-ilmetilen-tiazolidin-2,4-diona), AS-604850 (5-(2,2-difluoro-benzo[1,3]dioxol-5-ilmetilen)-tiazolidin-2,4-diona), AS-605240 (5-quinoxilin-6-metilen-1,3-tiazolidin-2,4-diona), AT7867 (n.° CAS 857531-00-1), serie de bencimidazol, Genentech (Roche Holdings Inc., South San Francisco, CA), BML-257 (n.° CAS 32387-96-5), CAL-120 (Gilead Sciences, Foster City, CA), CAL-129 (Gilead Sciences), CAL-130 (Gilead Sciences), c A l -253 (Gilead Sciences), CAL-263 (Gilead Sciences), n.° CAS 612847-09-3, n.° CAS 681281-88-9, n.° CAS 75747-14-7, n.° CAS 925681-41-0, n.° CAS 98510-80-6, CCT128930 (n.° CAS 885499-61-6), CH5132799 (n.° CAS 1007207-67-1), CHR-4432 (Chroma Therapeutics, Ltd., Abingdon, Reino Unido), FPA 124 (n.° CAS 902779-59-3), GS-1101 (CAL-101) (Gilead Sciences), GSK 690693 (n.° CAS 937174-76-0), H-89 (n.° CAS 127243-85-0), Honokiol, IC87114 (Gilead Science), IPI-145 (Intellikine Inc.), KAR-4139 (Karus Therapeutics, Chilworth, Reino Unido), KAR-4141 (Karus Therapeutics), KIN-1 (Karus Therapeutics), KT 5720 (n.° CAS 108068-98-0), miltefosina, diclorhidrato de MK-2206 (n.° CAS 1032350-13-2), ML-9 (n.° CAS 105637-50-1), clorhidrato de naltindol, OXY-111A (NormOxys Inc., Brighton, MA), perifosina, PHT-427 (n.° CAS 1191951-57-1), inhibidor de PI3 quinasa delta, Merck KGaA (Merck & Amp; Co., Whitehouse Station, NJ), inhibidores de PI3 quinasa delta, Genentech (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 quinasa delta, Incozen (Incozen Therapeutics, Pvt. Ltd., Hydrabad, India), inhibidores de PI3 quinasa delta-2, Incozen (Incozen Therapeutics), inhibidor de PI3 quinasa, Roche-4 (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 quinasa, Roche (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 quinasa, Roche-5 (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3-alfa/delta, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd., South San Francisco, CA), inhibidores de PI3-delta, Cellzome (Cellzome AG, Heidelberg, Alemania), inhibidores de PI3-delta, Intellikine (Intellikine Inc., La Jolla, CA), inhibidores de PI3-delta, Pathway Therapeutics-1 (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta, Pathway Therapeutics-2 (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-delta/gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-delta/gamma, Intellikine (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Intellikine (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidor de PI3-gamma Evotec (Evotec), inhibidor de PI3-gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3K delta/gamma, Intellikine-1 (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3K delta/gamma, Intellikine-1 (Intellikine Inc.), pictilisib (Roche Holdings Inc.), PIK-90 (n.° CAS 677338-12-4), SC-103980 (Pfizer, Nueva York, NY), SF-1126 (Semafore Pharmaceuticals, Indianápolis, IN), SH-5, SH-6, tetrahidrocurcumina, TG100-115 (Targegen Inc., San Diego, CA), triciribina, X-339 (Xcovery, West Palm Beach, FL), XL-499 (Evotech, Hamburgo, Alemania), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.
8. El primer y segundo agente anticancerígeno para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 7, el método in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 5-7, o el kit para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 5-7, en los que la administración de los agentes anticancerígenos primero y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier agente anticancerígeno solo; o en los que poner en contacto la célula cancerosa con los agentes anticancerígenos primero y segundo proporciona un efecto sinérgico en comparación con poner en contacto la célula cancerosa con cualquier agente anticancerígeno solo.
9. El primer y segundo agente anticancerígeno para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 8, en los que el segundo agente anticancerígeno es dabrafenib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y en los que BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y/o dabrafenib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo van a administrarse en forma de una composición farmacéutica, que comprende además un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
10. La composición farmacéutica para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en la que

(i) la composición farmacéutica está en una forma farmacéutica unitaria que comprende ambos agentes anticancerígenos; o

(ii) el primer agente anticancerígeno está en una primera forma farmacéutica unitaria y el segundo agente anticancerígeno está en una segunda forma farmacéutica unitaria, separado del primero.
11. La composición farmacéutica para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en la que

(i) los agentes anticancerígenos primer y segundo van a administrarse de manera conjunta al sujeto; o

(ii) en la que los agentes anticancerígenos primero y segundo van a administrarse al sujeto en serie; en la que el primer agente anticancerígeno puede administrarse al sujeto antes del segundo agente anticancerígeno; o en la que el segundo agente anticancerígeno puede administrarse al sujeto antes del primer agente anticancerígeno.
12. Una composición para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto, en la que la composición comprende BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en combinación con

(i) un inhibidor de RAF de tipo 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; o

(ii) AZ628 (Axon Medchem BV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
13. Una composición para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto, en la que la composición comprende

(i) un inhibidor de RAF de tipo 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; o

(ii) AZ628 (Axon Medchem BV) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en combinación con BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
14. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, en la que el inhibidor de RAF de tipo 1 se selecciona del grupo que consiste en vemurafenib, dabrafenib, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.