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ES2908438T3 - Mejoras en o relacionadas con la amplificación de ácidos nucleicos - Google Patents

Mejoras en o relacionadas con la amplificación de ácidos nucleicos Download PDF

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ES2908438T3
ES2908438T3 ES19700540T ES19700540T ES2908438T3 ES 2908438 T3 ES2908438 T3 ES 2908438T3 ES 19700540 T ES19700540 T ES 19700540T ES 19700540 T ES19700540 T ES 19700540T ES 2908438 T3 ES2908438 T3 ES 2908438T3
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Daiwei Shen
Bryan Kraynack
Victor Perez
Jarrod Provins
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LumiraDx UK Ltd
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Abstract

Un método para llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos no isotérmica, comprendiendo el método las etapas de: (a) mezclar una secuencia diana con uno o más cebadores monocatenarios complementarios en condiciones que permitan un suceso de hibridación en el que los cebadores hibridan con la diana, cuyo suceso de hibridación conduce, directa o indirectamente, a la formación de una estructura dúplex que comprende dos sitios de mellado dispuestos en o cerca de los extremos opuestos del dúplex; y llevar a cabo un procedimiento de amplificación mediante; (b) el uso de una enzima de mellado para producir una mella en cada uno de dichos sitios de mellado en las cadenas del dúplex; (c) el uso de una polimerasa para extender las cadenas melladas para formar así un ácido nucleico recién sintetizado, cuya extensión con la polimerasa recrea los sitios de mella; (d) repetición de las etapas (b) y (c) según se desee para producir la producción de múltiples copias del ácido nucleico recién sintetizado; caracterizado por que la temperatura a la que se lleva a cabo el método no es isotérmica y se somete a oscilación, una pluralidad de veces, entre una temperatura superior y una temperatura inferior durante el procedimiento de amplificación de las etapas (b)-(d), en donde a la temperatura superior, una de dicha polimerasa o enzima de mellado es más activa que la otra de dichas enzimas, de modo que hay una disparidad en la actividad de las enzimas, y a la temperatura inferior la disparidad en la actividad de las enzimas se reduce o invierte.

Description

DESCRIPCIÓN
Mejoras en o relacionadas con la amplificación de ácidos nucleicos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método de amplificación de una molécula de ácido nucleico, en especial de una forma cuantitativa.
Antecedentes de la invención
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica bien conocida y convencional usada para amplificar moléculas de ácido nucleico. Los productos amplificados de la PCR se detectan al final de la reacción. La cantidad de producto tiende a alcanzar un nivel de meseta, que no aumenta si la mezcla de reacción se deja más tiempo. Como resultado, en la PCR convencional la cantidad de producto no se correlaciona necesariamente con la concentración de la secuencia diana de la amplificación presente en la mezcla al principio.
Con el fin de obtener datos cuantitativos, se realiza una PCR cuantitativa ("qPCR"), en la que la cantidad de producto de amplificación producido se vigila o detecta en tiempo real (de ahí que la qPCR se denomine también "PCR en tiempo real" o incluso "RT-PCR", aunque esta última abreviatura no es útil ya que puede confundirse con Reverse Transcriptase-PCR (Transcriptasa inversa-PCR)), mientras la reacción sigue amplificando activamente la secuencia diana.
Típicamente, el ácido nucleico amplificado se detecta por su interacción con una entidad marcadora (normalmente, el marcador es un fluoróforo). Esta interacción puede ser no específica (es decir, la entidad marcadora se une esencialmente a cualquier molécula de ADN bicatenario) o específica (es decir, la entidad marcadora interacciona de una manera dependiente de la secuencia de nucleótidos preferiblemente con una secuencia de ácido nucleico específica presente en el producto de amplificación deseado). Un ejemplo de una entidad marcadora no específica es el colorante SYBR Green. Una entidad marcadora específica (p. ej., una molécula sonda marcada) podría ser, por ejemplo, una "baliza molecular", que emite fluorescencia cuando experimenta un cambio conformacional inducido por la hibridación con una secuencia diana.
Por lo tanto, el seguimiento del nivel de fluorescencia observado en tiempo real, durante la PCR, permite la generación de datos cuantitativos, en los que la cantidad de producto de amplificación (medido por la detección de fluorescencia, por ejemplo) se correlaciona con la concentración de la molécula diana de la amplificación en la muestra.
La qPCR como se describe en la patente de EE. UU. 6.814.943 usa intervalos de temperatura para llevar a cabo los ciclos. Típicamente, para la qPCR se lleva a cabo el siguiente procedimiento: desnaturalización a aproximadamente 95°C, reasociación a aproximadamente 55°C, extensión a aproximadamente 70°C. Estos son cambios de temperatura grandes (aproximadamente 40°C de diferencia entre las temperaturas máxima y mínima). Como resultado, la qPCR, como la PCR no cuantitativa "normal", requiere el uso de un aparato de ciclos térmicos relativamente sofisticado. Por lo tanto, aunque la qPCR es muy útil en un contexto de investigación (por ejemplo, la cuantificación de la expresión génica), no se puede aplicar fácilmente a los análisis de inmediato ("PoC" por sus siglas en inglés Point-of-Care) y similares.
Se han ideado muchas técnicas de amplificación de ácidos nucleicos, que se llevan a cabo de forma isotérmica, con el fin de evitar la necesidad de ciclos térmicos. Una lista no exhaustiva de dichas técnicas de amplificación incluye: tecnología de amplificación de ARN mediada por señales ("SMART"; documento WO 99/037805); amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos ("NASBA" Compton 1991 Nature 350, 91-92); amplificación por círculo rodante ("RCA", p. ej., véase Lizardi et al., 1998 Nature Genetics 19, 225-232); amplificación mediada por bucle ("LAMP" véase Notomi et al., 2000 Nucl. Acids Res. 28, (12) e63); amplificación por recombinasa polimerasa ("RPA" véase Piepenberg et al., 2006 PLoS Biology 4 (7) e204); amplificación por desplazamiento de cadena ("SDA"); amplificación dependiente de helicasa ("HDA" Vincent et al., 2004 EMBO Rep. 5, 795-800): amplificación mediada por transcripción ("TMA"), amplificación isotérmica de cebador único ("SPIA" véase Kurn et al., 2005 Clinical Chemistry 51, 1973-81); replicación de secuencia autosostenida ("3SR"); y reacción de amplificación por enzima de mellado ("NEAR").
La SDA es una técnica (descrita por Walker et al., 1992 Nucl. Acids Res. 20, 1691 -1696) que implica el uso de un par de cebadores que comprenden una parte complementaria de la diana y, 5' de la parte complementaria de la diana, un sitio de reconocimiento y corte para una endonucleasa. Los cebadores se hibridan con las respectivas moléculas diana monocatenarias complementarias. El extremo 3' de las cadenas diana se extiende usando una mezcla de reacción que incluye una ADN polimerasa y al menos un trifosfato de nucleótido modificado, usando el cebador como plantilla (y del mismo modo, los extremos 3' de los cebadores se extienden usando la diana como molde).
La extensión de las cadenas diana genera un sitio de reconocimiento de doble cadena para la endonucleasa. Sin embargo, debido a que la diana se extiende usando un trifosfato modificado, la endonucleasa no escinde ambas cadenas, sino que en su lugar hace una mella de una sola cadena en el cebador. Los extremos 3' en las mellas después son extendidos por la ADN polimerasa (típicamente fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, que carece de actividad de exonucleasa). A medida que se extienden los cebadores con mella, desplazan el producto de extensión producido inicialmente. El producto desplazado está entonces libre para hibridar con el cebador opuesto, ya que esencialmente replica la secuencia de la diana para el cebador opuesto. De esta forma, se consigue una amplificación exponencial de ambas cadenas de la secuencia diana.
La etapa de amplificación del proceso de SDA es esencialmente isotérmica, típicamente se realiza a 37°C, la temperatura óptima para la endonucleasa y la polimerasa. Sin embargo, antes de alcanzar la etapa de amplificación, es necesario disociar completamente la diana bicatenaria en sus cadenas simples constituyentes, con el fin de permitir que el par de cebadores se hibriden con sus cadenas diana complementarias.
Esta disociación o "fusión" normalmente se logra calentando la diana bicatenaria a una temperatura alta, generalmente aproximadamente 90°C, con el fin de romper los enlaces de hidrógeno entre las dos cadenas de la diana. Después, la mezcla de reacción se enfría para permitir la adición de las enzimas que son necesarias para la reacción de amplificación. Debido a la alta temperatura usada para generar las dianas monocatenarios, la técnica de SDA no es idealmente adecuada para un contexto de PoC.
El documento US 6.191.267 describe la clonación y expresión de la enzima de mellado N.BstNBI y su uso en la SDA, en lugar de endonucleasas de restricción y trifosfatos modificados.
Otra técnica de amplificación, que es similar a la SDA, es la reacción de amplificación por enzima de mellado (o "NEAR").
En "NEAR" (p. ej., como se describe en los documentos US2009/0017453 y EP 2.181.196), los cebadores directos e inversos (denominados "moldes" en US 2009/0017453 y EP 2.181.196) se hibridan con las cadenas respectivas de una diana bicatenaria y se extienden. Copias adicionales de los cebadores directo e inverso (presentes en exceso) se hibridan con el producto de extensión del cebador opuesto y estos mismos se extienden, creando un "dúplex de amplificación". Cada dúplex de amplificación así formado comprende un sitio de mella hacia el extremo 5' de cada cadena, que es cortado por una enzima de mellado, permitiendo la síntesis de productos de extensión adicionales. Mientras tanto, los productos de extensión sintetizados previamente pueden hibridarse con copias adicionales de los cebadores complementarios, haciendo que los cebadores se extiendan y, por lo tanto, se creen copias adicionales del "dúplex de amplificación". De esta manera, se puede lograr la amplificación exponencial.
La NEAR difiere de la SDA, en particular, en que no se requiere una etapa de disociación térmica inicial. El suceso de hibridación cebador/diana inicial necesario para desencadenar el procedimiento de amplificación tiene lugar mientras la diana todavía es sustancialmente bicatenaria: se cree que la hibridación de cebador/diana inicial aprovecha la disociación localizada de las cadenas diana, un fenómeno conocido como "respiración". (véase Alexandrov et al., 2012 Nucl. Acids Res. y revisión de Von Hippel et al., 2013 Biopolymers 99 (12), 923-954). La respiración es el aflojamiento localizado y transitorio del apareamiento de bases entre las cadenas de ADN. La temperatura de fusión (Tm) del heterodúplex cebador/diana inicial típicamente es mucho más baja que la temperatura de reacción, por lo que la tendencia es que el cebador se disocie, pero la hibridación transitoria dura lo suficiente para que la polimerasa extienda el cebador, lo que aumenta la Tm del heterodúplex y lo estabiliza.
La etapa de amplificación en NEAR se realiza de forma isotérmica, a temperatura constante. De hecho, es convencional realizar tanto la hibridación inicial de diana/cebador como las rondas de amplificación posteriores, a la misma temperatura constante, normalmente en el intervalo de 54 a 56°C.
Evitar la necesidad de ciclos térmicos significa que la NEAR es potencialmente más útil que la PCR en contextos PoC. Además, se puede lograr la síntesis de cantidades significativas de producto de amplificación, incluso cuando se parte de un número de copias muy bajo de moléculas diana (p. ej., tan pocas como 10 moléculas diana bicatenarias).
El documento WO 2011/030145 (Enigma Diagnostics Limited) describe la idea de realizar una amplificación de ácidos nucleicos "isotérmica" (se mencionan específicamente NASBA, SDA, TMA, LAMP, Q-beta replicasa, amplificación por círculo rodante y 3SR) a una temperatura predeterminada inicialmente, cambiar la temperatura de la reacción y después dejar que la temperatura vuelva a la temperatura predeterminada al menos una vez durante la reacción. Más específicamente, el documento sugiere provocar una oscilación de temperatura o "tambaleo" durante la reacción de amplificación, que se dice que "mejora el tiempo total hasta la finalización y la [relación] señal-ruido del ensayo". La idea se exploró experimentalmente usando la técnica de amplificación TMA para amplificar ARN bacteriano. Los resultados mostraron que, mientras que la reacción de "tambaleo" empezaba a amplificar la diana antes que la reacción verdaderamente isotérmica, todavía había un retraso de aproximadamente 13 minutos antes de que la señal de fluorescencia se elevara por encima del nivel de fondo inicial.
El documento WO2017/027835 describe un método de amplificación de ácidos nucleicos que implica enzimas de mellado y polimerasa, así como adaptadores ligados. La temperatura de la reacción se cambia secuencialmente para adaptarse a la actividad enzimática. No obstante, este documento no describe el uso de la enzima de mellado para formar la mella en el cebador monocatenario hibridado con la diana para la posterior extensión por la polimerasa desde el sitio de mella.
El documento US2017/183714 describe un método de amplificación de ácidos nucleicos basado en el uso de polimerasa y una enzima de mellado, así como adaptadores ligados y nucleótidos modificados. La temperatura no varía sino que se mantiene constante tanto para la extensión por la polimerasa como para la mella por la enzima de mellado.
La presente invención tiene como objetivo proporcionar una nueva técnica de amplificación de ácidos nucleicos que tiene una o más ventajas sobre las técnicas existentes y que, en particular, es capaz de generar datos cuantitativos.
Resumen de la invención
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico no isotérmica, comprendiendo el método las etapas de:
(a) mezclar una secuencia diana con uno o más cebadores monocatenarios complementarios en condiciones que permitan un suceso de hibridación en el que los cebadores hibridan con la diana, cuyo suceso de hibridación conduce, directa o indirectamente, a la formación de una estructura de dúplex que comprende dos sitios de mella dispuestos en o cerca de los extremos opuestos del dúplex; y llevar a cabo un procedimiento de amplificación mediante;
(b) el uso de una enzima de mellado para producir una mella en cada uno de dichos sitios de mella en las cadenas del dúplex;
(c) el uso de una polimerasa para extender las cadenas melladas para formar un ácido nucleico recién sintetizado, cuya extensión con la polimerasa recrea los sitios de mella;
(d) la repetición de las etapas (b) y (c) según se desee para producir la producción de múltiples copias del ácido nucleico recién sintetizado;
caracterizado por que la temperatura a la que se lleva a cabo el método no es isotérmica y está sujeta a oscilación, una pluralidad de veces, entre una temperatura superior y una temperatura inferior durante el procedimiento de amplificación de las etapas (b)-(d), en donde a la temperatura superior, una de dichas polimerasa o enzima de mellado es más activa que la otra de dichas enzimas, de modo que existe una disparidad en la actividad de las enzimas, y a la temperatura inferior la disparidad en la actividad de las enzimas se reduce o invierte.
La enzima de mellado y la polimerasa tendrán ciertas velocidades de actividad catalítica. Estas variarán con la temperatura. Las respectivas velocidades de actividad de las enzimas (en términos de moles de sustrato que reaccionan por unidad de tiempo por mg de enzima a una concentración de sustrato dada) normalmente serán diferentes a una temperatura particular. Cada enzima tendrá una temperatura óptima a la que su velocidad de actividad es máxima. En términos generales, cuanto más alejada es la temperatura de una mezcla de reacción de la temperatura óptima de una enzima, más lenta es la velocidad de actividad de la enzima.
El favorecimiento relativo de una enzima sobre otra (para así lograr una disparidad entre la tasa de actividad de la polimerasa y la enzima de mellado) se puede obtener usando condiciones de temperatura que permiten una mayor actividad de una de dichas enzimas que de la otra, o usando condiciones de temperatura que son menos favorables para una de las enzimas que para la otra.
A modo de explicación, se considera que la disparidad en la actividad de las enzimas se "invierte" si, a la temperatura superior, una de las enzimas tiene una actividad mayor que la otra enzima, mientras que a la temperatura inferior, la otra enzima tiene una actividad mayor.
En otras realizaciones, la disparidad en la actividad de las enzimas a la temperatura superior e inferior no se invierte, sino que simplemente se reduce. Típicamente, la disparidad en la actividad entre las enzimas a una de dichas temperaturas superior o inferior se reduce en al menos 5% a la temperatura inferior o superior, según corresponda. Más preferiblemente, la disparidad se reduce en al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40% o al menos 45%. Lo más preferiblemente, la disparidad se reduce en al menos 50% o al menos 75%.
Para evitar dudas, "actividad enzimática'' en este contexto se refiere a "actividad enzimática específica" (pmol de sustrato que reaccionan.min-1.mg-1 de enzima), medida en las mismas condiciones para la polimerasa y la enzima de mellado.
En una realización preferida, el método del primer aspecto de la invención comprende el uso de un conjunto de condiciones de temperatura en donde a una de dichas temperaturas superior e inferior, tanto la enzima de mellado como la polimerasa son sustancialmente activas (es decir, para los fines presentes, que operan a una velocidad que es al menos 50%, o mayor, de la velocidad a la que la enzima operaría a su temperatura óptima en condiciones por lo demás idénticas; preferiblemente 60% o mayor, más preferiblemente 65% o mayor; y lo más preferiblemente 70%, o mayor, de su velocidad de actividad a su temperatura óptima); mientras que a la otra de dichas temperaturas inferior y superior (según sea el caso), al menos una de la enzimas de mellado o la polimerasa se inhibe sustancialmente (es decir, que opera al 49% o menos de la velocidad a la que la enzima operaría a su temperatura óptima en condiciones por lo demás idénticas; preferiblemente a menos de 45%, más preferiblemente a menos de 40% y lo más preferiblemente a menos de 35% de su velocidad de actividad a su temperatura óptima). En algunas realizaciones, la enzima de mellado se inhibe sustancialmente a una de la temperatura superior o inferior. En algunas realizaciones, la enzima de mellado se inhibe sustancialmente a la temperatura superior.
En algunas realizaciones, la polimerasa se inhibe sustancialmente a una de la temperatura superior o inferior. En algunas realizaciones, la polimerasa se inhibe sustancialmente a la temperatura inferior; en otras realizaciones, la polimerasa se inhibe sustancialmente a la temperatura superior.
El periodo de tiempo que la mezcla de reacción se mantiene constante a la temperatura superior o a la temperatura inferior se puede denominar "tiempo de permanencia" y, para distinguirlos, se puede hacer referencia al "tiempo de permanencia a la temperatura superior" y el "tiempo de permanencia a la temperatura inferior". El tiempo de permanencia a la temperatura superior y el tiempo de permanencia a la temperatura inferior pueden ser iguales o pueden ser diferentes. Si son diferentes, el tiempo de permanencia a la temperatura superior puede ser más largo o más corto que el tiempo de permanencia a la temperatura inferior.
Un parámetro crítico para el análisis cuantitativo es cómo de bien se ajustan los datos generados a una recta de regresión, conocido como coeficiente de determinación (R2). Los datos no se consideran cuantitativos si tienen un coeficiente de determinación bajo. Para los fines presentes, los datos se consideran cuantitativos si su coeficiente de determinación es igual o mayor que 0,850, típicamente igual o mayor que 0,900, preferiblemente igual o mayor que 0,950, más preferiblemente igual o mayor que 0,975, y lo más preferiblemente igual a o mayor que 0,990. El coeficiente de determinación (R2) se puede calcular convenientemente usando el método descrito por Pfaffl (2001, Nucl. Acids Res. 29 (9) e45).
Por consiguiente, un método para llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos y/o analizar una muestra por medio de dicha reacción, se considera cuantitativo si genera datos que son cuantitativos según la definición anterior. Sorprendentemente, el método de la invención es capaz de generar datos cuantitativos.
La reacción de amplificación de la invención se lleva a cabo preferiblemente de una manera en general someramente similar a la conocida como "NEAR" y descrita en el documento EP 2.181.196. Sin embargo, es importante destacar, y bastante diferente de la técnica NEAR, que el presente método se lleva a cabo de forma no isotérmica e implica la oscilación repetida entre una temperatura superior y una inferior.
En algunas realizaciones, la temperatura superior puede favorecer relativamente la actividad de la polimerasa frente a la de la enzima de mellado, y la temperatura inferior favorecerá relativamente la actividad de la enzima de mellado frente a la de la polimerasa. Sin embargo, sorprendentemente, los autores de la invención han descubierto que las "preferencias de temperatura" se pueden invertir por completo, de modo que en algunas realizaciones la temperatura superior puede favorecer relativamente la actividad de la enzima de mellado frente a la de la polimerasa y la temperatura inferior puede favorecer relativamente la actividad de la polimerasa frente a la de la enzima de mellado.
Sin estar ligados a ninguna teoría en particular, parece que mediante la selección adecuada de una polimerasa y una enzima de mellado con diferentes temperaturas óptimas, es posible que la temperatura superior de la reacción de amplificación favorezca relativamente a la polimerasa o a la enzima de mellado, y viceversa, con respecto a la temperatura inferior de la reacción de amplificación.
Sin estar ligados a ninguna teoría en particular, los autores de la invención también plantean la hipótesis de que un posible mecanismo para la rápida amplificación lograda por el método de la presente invención apela a producir una reducción en la actividad de una o la otra de la enzima de mellado o la polimerasa, usando una temperatura que es considerablemente subóptima para la enzima, conduciendo a una acumulación de moléculas de sustrato potenciales. Cuando la temperatura de la mezcla de reacción se ajusta a una temperatura que es más cercana a la óptima para la enzima en cuestión, la actividad de la enzima aumenta significativamente, lo que, junto con la concentración relativamente alta de sustrato acumulado, da como resultado una velocidad de reacción muy acelerada. En términos simples, la velocidad de reacción promedio de este formato "rápido/lento" es mayor que la velocidad de reacción promedio que se puede lograr usando un sistema de "estado estacionario" con una temperatura constante o que cambia relativamente lentamente.
Será evidente para el experto en la técnica que puede ser deseable que la temperatura óptima de la enzima de mellado sea diferente (más alta o más baja) de la de la polimerasa usada en el método de la invención.
Típicamente, las respectivas temperaturas óptimas de la enzima de mellado y la polimerasa diferirían en al menos 1°C, preferiblemente en al menos 3°C, más preferiblemente en al menos 5°C y lo más preferiblemente en al menos 10°C. Convenientemente, las respectivas temperaturas óptimas diferirán en una cantidad en el intervalo de 10-30°C, más típicamente en el intervalo de 10-25°C.
No existe un requisito absoluto de que la temperatura óptima de la polimerasa sea mayor que la de la enzima de mellado. Por lo tanto, por ejemplo, hay realizaciones de la invención en las que la reacción usa una polimerasa (p. ej., obtenida de una fuente psicrófila) que tiene una temperatura óptima más baja que la de la enzima de mellado, mientras que en otras realizaciones la polimerasa tiene una temperatura óptima más alta que la de la enzima de mellado.
Por lo tanto, en general, la temperatura superior se selecciona preferiblemente para así favorecer relativamente una fase de extensión mediada por polimerasa específica de secuencia (es decir, formación de un complejo entre la polimerasa y el dúplex de cebador/diana inicial hibridado, seguido por la extensión mediada por polimerasa del cebador; y casi inmediatamente después, extensión del cebador opuesto hibridado con el cebador inicial extendido). El uso de una temperatura elevada tiende a reducir la formación de dímeros de cebadores y la amplificación aberrante de los dúplex mal hibridados no deseados. La polimerasa se selecciona convenientemente para que sea lo suficientemente estable a la temperatura superior como para realizar la extensión del cebador a lo largo de la duración de la reacción sin una disminución significativa de la actividad. Para los fines presentes, "disminución significativa" significa una disminución de 50% o más en la actividad enzimática específica de la polimerasa.
La temperatura inferior se selecciona preferiblemente para permitir que la enzima de mellado corte los sitios de mella en el dúplex. La enzima de mellado típicamente (pero no necesariamente) tiene una temperatura óptima que es más baja que la de la polimerasa, por lo tanto, la transición a la temperatura inferior típicamente acerca la temperatura de reacción a la temperatura óptima de la enzima de mellado.
En algunas realizaciones del método de la invención como se ilustra en el presente documento, la temperatura superior está preferiblemente en el intervalo de 50,0-64,02C, más preferiblemente en el intervalo de 55,0-63,02C. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que la "temperatura superior" preferida puede variar dependiendo de la identidad de las enzimas presentes y posiblemente también de la longitud y secuencia de los cebadores y/o la diana de amplificación prevista.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, la temperatura superior podría ser tan alta como 68°C pero, en esas condiciones:
(a) normalmente se desearía usar un perfil de oscilación térmica con un tiempo de permanencia reducido a la temperatura superior (p. ej., no más de aproximadamente 1-2 segundos por oscilación); y
(b) dicha temperatura superior alta funciona bien solo con un número de copias relativamente alto de la secuencia diana en la muestra (p. ej., aproximadamente 103 copias o mayor).
En el método de la invención como se ilustra en el presente documento, la temperatura inferior está preferiblemente en el intervalo de 20,0 --- 58,5°C, más preferiblemente en el intervalo de 35,0 --- 57,9°C. Sin embargo, de nuevo, como se ha indicado antes, los expertos en la técnica apreciarán que la "temperatura inferior" preferida puede variar dependiendo de la identidad de las enzimas presentes y, posiblemente, también de la longitud y secuencia de los cebadores y/o la diana de amplificación prevista.
Como regla general, como saben bien los expertos en la técnica, la rigurosidad de la hibridación aumenta con el aumento de la temperatura (dentro de límites), de modo que las temperaturas más altas generalmente reducirán las interacciones no específicas, tal como entre cebadores no coincidentes y secuencias de polinucleótidos no complementarios presentes en la muestra. Por lo tanto, normalmente será preferible una temperatura más alta para las reacciones de hibridación a una temperatura más baja, siempre que la temperatura no supere la temperatura de fusión de la hibridación del cebador específico/secuencia diana.
A ser posible, en realizaciones preferidas, la diferencia de temperatura entre la temperatura superior y la temperatura inferior estará en el intervalo de 4-12°C, más preferiblemente en el intervalo de 4 -Í02C, y más preferiblemente en el intervalo de 4-8°C.
Generalmente, aunque no necesariamente, se puede preferir que la mezcla de reacción se mantenga a la temperatura superior durante un periodo de tiempo más corto (el "tiempo de permanencia") que el de la temperatura inferior, aunque el "tiempo de permanencia" a las temperaturas superior e inferior podrían ser iguales o incluso, en otras realizaciones, el tiempo de permanencia a la temperatura superior podría ser más largo que el de la temperatura inferior, aunque en general esto no se prefiere.
Se prevé que, dentro de ciertos límites, en general, cuanto mayor sea la frecuencia de la oscilación térmica, más rápido procederá la reacción de amplificación. Por lo tanto, la duración de una oscilación térmica completa será preferiblemente menor de 3,0 minutos, más preferiblemente menor de 2,0 minutos y lo más preferiblemente menor de 1,0 minuto. Lo más ventajosamente, la duración de una oscilación térmica será menor de 45 segundos y lo más preferiblemente menor de 30 segundos. Una duración mínima de una oscilación térmica será típicamente de al menos 1 segundo, preferiblemente de al menos 2 segundos y más preferiblemente de al menos 5 segundos. Una duración preferida típica para una oscilación térmica completa será entre 5 y 30 segundos, preferiblemente entre 5 y 20 segundos, y lo más preferiblemente entre 5 y 15 segundos.
Un tiempo de permanencia preferido típico a la temperatura superior podría estar entre 1 y 10 segundos, preferiblemente 1-5 segundos y lo más preferiblemente 1-3 segundos.
Un tiempo de permanencia preferido típico a la temperatura inferior podría estar entre 2 y 40 segundos, más preferiblemente entre 3 y 30 segundos y lo más preferiblemente entre 3 y 15 segundos.
El tiempo que tarda en oscilar entre las temperaturas superior e inferior preferiblemente se mantiene sustancialmente en un mínimo. Se prevé que el volumen típico de una mezcla de reacción de amplificación sea menor de 500 gl, probablemente menor de 250 gl y, dado que las temperaturas superior e inferior típicamente estarán separadas en menos de 10°C, debería ser posible y preferible pasar de la temperatura inferior a la superior (o viceversa) en aproximadamente 0,5-10,0 segundos, más preferiblemente en el intervalo de 1-5 segundos.
Convenientemente, el perfil de duración/temperatura de cada una de la pluralidad de oscilaciones es esencialmente idéntico, esto simplifica la realización del método. Por lo tanto, por ejemplo, cada uno de la pluralidad de oscilaciones térmicas tendrá convenientemente la misma duración total, el mismo tiempo de permanencia a la temperatura superior, el mismo tiempo de permanencia a la temperatura inferior, etc.
Sin embargo, en algunas realizaciones (especialmente aquellas en las que hay detección en tiempo real del producto/productos directos o indirectos de la reacción de amplificación), puede ser deseable alterar el perfil de la oscilación térmica durante el curso de la reacción, de modo que no todas las oscilaciones son idénticas. Más específicamente, si la cuantificación en tiempo real del producto/productos de la reacción de amplificación (ya sea directa o indirecta) indica que la reacción está avanzando más lentamente de lo que es deseable, esta información se podría retroalimentar al aparato de regulación térmica que regula la temperatura de la mezcla de reacción, haciendo que el aparato ajuste el perfil de la oscilación térmica, para así aumentar la velocidad de reacción. Esto podría ser necesario si, por ejemplo, la secuencia diana está presente en un número de copias muy bajo. El aparato podría ajustar el perfil de oscilación térmica aumentando o disminuyendo la temperatura superior y/o inferior y/o aumentando o disminuyendo el tiempo de permanencia en la temperatura superior y/o inferior. También es factible que el aparato pudiera aumentar o disminuir el tiempo que tarda en la transición entre las temperaturas superior e inferior (es decir, aumentar o disminuir el tiempo de transición de la temperatura ascendente, o la transición de temperatura descendente, o ambos).
La oscilación térmica se puede comenzar sustancialmente inmediatamente después de que se hayan puesto juntos todos los componentes necesarios de la mezcla de reacción.
Alternativamente, la oscilación térmica se puede comenzar después de un intervalo de retraso. Por ejemplo, es posible, y potencialmente deseable, que la mezcla de reacción se pueda mantener a una temperatura elevada (que podría ser igual o diferente a la temperatura superior usada en la oscilación térmica). Como ilustración, dicho intervalo de retraso podría ser de, p. ej. de 5 segundos a 1 o 2 minutos.
Además, la oscilación térmica se puede llevar a cabo convenientemente de manera sustancialmente continua durante la reacción de amplificación, o puede estar sujeta a una o más pausas. Típicamente, y preferiblemente, una vez que comienza, la oscilación térmica no se interrumpirá hasta que la reacción de amplificación haya alcanzado un punto de tiempo deseado, típicamente cuando se haya obtenido una señal de fluorescencia (u otra) detectable y que permita ventajosamente la determinación cuantitativa de la cantidad y/o concentración de la secuencia diana en la muestra.
La oscilación térmica de la mezcla de reacción de amplificación se puede efectuar convenientemente usando un aparato de regulación térmica automatizado, tal como el disponible comercialmente para realizar ciclos térmicos en la PCR. Claramente, los perfiles de temperatura generados por el aparato tendrán que coincidir con las condiciones preferidas aplicables cuando se lleva a cabo la presente invención.
En un segundo aspecto, la descripción proporciona una mezcla de reacción, que no se reivindica, para llevar a cabo una amplificación de ácidos nucleicos, comprendiendo la mezcla una secuencia diana para amplificar, dos o más cebadores, siendo uno de dichos cebadores complementario de una primera cadena de la diana y siendo el otro de dichos cebadores complementario de una segunda cadena de la diana, una ADN polimerasa y una enzima de mellado; estando dicha mezcla de reacción en asociación de regulación térmica con medios de regulación de temperatura programables, estando programados dichos medios de regulación de temperatura para realizar una oscilación térmica entre una temperatura superior e inferior, como se ha definido previamente en relación con el primer aspecto de la invención.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un método para determinar la cantidad y/o concentración de un polinucleótido diana en una muestra, comprendiendo el método las etapas de: llevar a cabo una reacción de amplificación de acuerdo con el primer aspecto de la invención definido antes para amplificar la diana y detectar, de forma cuantitativa, el/los producto/productos directos o indirectos de la reacción de amplificación, de forma que permita determinar la cantidad y/o concentración del polinucleótido diana en la muestra.
El procedimiento de amplificación del método de la invención se puede aplicar a las técnicas de amplificación convencionales y generalmente conocidas que incluyen SDA y NEAR, que usan una polimerasa y una enzima de mellado.
Por lo tanto, por ejemplo, el procedimiento de amplificación se puede basar en el procedimiento de amplificación empleado en la amplificación por desplazamiento de cadena, o basado en el usado en NEAR o de hecho en cualquier otro procedimiento de amplificación de ácido nucleico que se base en la creación de una mella de una sola cadena y la subsiguiente extensión desde el extremo 3' de la cadena mellada. Otras además de las enseñanzas del estado de la técnica en relación con el mantenimiento de la temperatura constante durante la amplificación, las enseñanzas del estado de la técnica en relación con las etapas de amplificación de SDA o NEAR serán, en general, igualmente aplicables al procedimiento de amplificación del método de la presente invención.
El método de la presente invención es una mejora de la técnica de amplificación denominada reacción de amplificación de temperatura selectiva (o "STAR") descrita en el documento WO2018/002649. El método de la presente invención, en realizaciones preferidas, permite la detección cuantitativa en tiempo real de secuencias diana, y se denomina en el presente documento "qSTAR", aunque esto no pretende indicar que el método de la invención proporcionará resultados cuantitativos en tiempo real en todas las condiciones.
Preferiblemente, la etapa (a) comprende mezclar una muestra que contiene una diana bicatenaria con dos cebadores monocatenarios, siendo uno de dichos cebadores complementario de una primera cadena de la diana, y siendo el otro de dichos cebadores complementario de una segunda cadena de la diana, de modo que los dos cebadores hibridan con la diana y los extremos 3' libres de dichos cebadores están enfrentados uno con otro.
Los dos cebadores se pueden describir convenientemente como cebadores "directo" e "inverso".
Convenientemente, tanto los cebadores directos como los inversos comprenderán la secuencia de un sitio de reconocimiento de la enzima de mellado. Típicamente, la mella creada por una enzima de mellado estará justo fuera y típicamente en 3' del sitio de reconocimiento de la enzima de mellado.
En una realización preferida, el cebador directo comprenderá una parte en o cerca de su extremo 3' que es complementario de y puede hibridar con el extremo 3' de la cadena antiparalela de la secuencia diana, mientras que el cebador inverso comprende una parte en o cerca de su extremo 3' que es complementario de y puede hibridar con el extremo 3' de la cadena paralela de la secuencia diana.
De esta forma, se introduce un sitio de reconocimiento de la enzima de mellado en los extremos opuestos de la secuencia diana, y la amplificación de la secuencia diana (junto con cualquier secuencia intermedia de los cebadores secuencia abajo del sitio de mella) se logra realizando múltiples ciclos de extensión de polimerasa de los cebadores directo e inverso para formar un sitio de reconocimiento de enzima de mellado de doble cadena, y mediante mellado de los sitios con una enzima de mellado, permitiendo la extensión adicional de los cebadores mellados por una polimerasa, etc., esencialmente como se describe, por ejemplo, en el documento US 2009/0017453.
La diana puede ser monocatenaria, bicatenaria o comprender una mezcla de los dos. La diana puede comprender ARN, ADN o una mezcla de los dos. En particular, la diana podría incorporar uno o más trifosfatos de nucleótidos modificados (es decir, un trifosfato de nucleótido que no se encuentra normalmente en los ácidos nucleicos de origen natural), aunque esto no es esencial y, de hecho, no se prefiere.
La diana se puede seleccionar de la siguiente lista no exhaustiva: ácido nucleico genómico (término que abarca el ácido nucleico genómico de cualquier animal, planta, hongo, bacteria o virus), ADN plasmídico, ADN mitocondrial, ADNc, ARNm, ARNr, ARNt, o un oligonucleótido sintético u otra molécula de ácido nucleico.
En particular, el método puede comprender adicionalmente una etapa inicial de transcripción inversa. Por ejemplo, se puede usar ARN (p. ej., ARN genómico viral o ARNm celular o ARN de alguna otra fuente) para sintetizar ADN o ADNc usando una transcriptasa inversa por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. A continuación, el ADN se puede usar como una secuencia diana en el método de la invención. El ARN original típicamente será degradado por la actividad de ribonucleasa de la transcriptasa inversa, pero si se desea, se puede añadir RNasa H adicional después de que se haya completado la transcripción inversa. Las moléculas de ARN a menudo están presentes en las muestras con un mayor número de copias que las secuencias de ADN correspondientes (p. ej., genómicas), por lo que puede ser conveniente hacer transcritos de ADN a partir de la molécula de ARN con el fin de aumentar de manera efectiva el número de copias de la secuencia de ADN.
La "secuencia diana" es la secuencia de bases en el ácido nucleico diana, y puede referirse a la cadena codificante y/o antiparalela de una diana de doble cadena, y también abarca, a menos que el contexto indique lo contrario, la misma secuencia de bases que se reproduce o replica en copias amplificadas, productos de extensión o productos de amplificación del ácido nucleico diana inicial.
La secuencia diana puede estar presente en cualquier tipo de muestra, p. ej. biológica o ambiental (agua, aire, etc.). Una muestra biológica puede ser, por ejemplo, una muestra de alimentos o una muestra clínica. Las muestras clínicas pueden incluir lo siguiente: orina, saliva, sangre, suero, plasma, moco, esputo, líquido lagrimal o heces.
La muestra se puede someter o no a procesamiento antes de ponerla en contacto con los cebadores. Dicho procesamiento puede incluir uno o más de: filtración, concentración, purificación parcial, sonicación, lisis química y similares. Dichos procedimientos son bien conocidos por los expertos en la técnica.
El método de la presente invención implica el uso de un sitio de mella y medios para crear una mella en el sitio de mella. Una "mella" es la escisión de la cadena principal de fosfodiéster de solo una cadena de una molécula de ácido nucleico, total o al menos parcialmente bicatenaria. El sitio de mella es la ubicación en la molécula donde se hace una mella.
En realizaciones preferidas, un "sitio de reconocimiento de mellado" estará presente en, dentro o junto a un sitio de mella. ("Junto a" en este contexto significa que la base más cercana del sitio de reconocimiento de mellado está en el espacio de 10 bases del sitio de mella, preferiblemente en el espacio de 5 bases del sitio de mella).
El sitio de reconocimiento de mellado puede comprender al menos una cadena del sitio de reconocimiento de una endonucleasa de restricción, y el sitio de mella puede comprender al menos una cadena de una secuencia de bases de ácido nucleico que, cuando está presente como una molécula bicatenaria, es cortado por una endonucleasa de restricción. Típicamente, una endonucleasa de restricción cortará ambas cadenas de una molécula de ácido nucleico bicatenaria. En la presente invención, se puede evitar una rotura de doble cadena mediante la incorporación de una o más bases modificadas en o cerca del sitio de mella, cuyas bases modificadas hacen que una cadena de ácido nucleico no sea susceptible de escisión por la endonucleasa de restricción. De esta forma, se puede usar una endonucleasa de restricción, que normalmente corta ambas cadenas de una molécula de ácido nucleico bicatenaria, para introducir una mella de una sola cadena en una molécula bicatenaria. Las bases modificadas y similares adecuadas para lograr esto son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, todos los trifosfatos de nucleósidos modificados con alfa fosfato y los trifosfatos de nucleósidos modificados con alfa borano, específicamente; 2'-desoxiadenosina 5'-O-(tiotrifosfato), 5'-trifosfato de 5-metildesoxicitidina, 5'-trifosfato de 2'-desoxiuridina, 5'-trifosfato de 7-desaza-2'desoxiguanosina, 2'-desoxiguanosina-5'-O-(1-boranotrifosfato) y otros. Los trifosfatos que incluyen la base modificada pueden estar presentes en una mezcla de reacción usada para llevar a cabo el procedimiento de amplificación, de modo que se incorporan bases modificadas en posiciones relevantes durante las rondas posteriores de amplificación para evitar la formación de un sitio de doble cadena escindible por la endonucleasa.
Sin embargo, en realizaciones preferidas, la mella se hace en el sitio de mella por medio de una enzima de mellado. Las enzimas de mellado son moléculas que, en circunstancias normales, solo rompen una sola cadena en una molécula de ácido nucleico bicatenaria. La enzima de mellado tiene típicamente un sitio de reconocimiento de mellado y el sitio de mella puede estar dentro del sitio de reconocimiento de mellado o puede estar en 5' o 3' del sitio de reconocimiento. Muchas enzimas de mellado son conocidas por los expertos en la técnica y están disponibles comercialmente. Una lista no exhaustiva de ejemplos de enzimas de mellado incluye: Nb.Bsml, Nb.Bts, Nt.Alwl, Nt.BbvC, Nt.BstNBI y Nt.Bpu101. La última enzima está disponible comercialmente de ThermoFisher Scientific; las otras están disponibles p. ej., de New England Biolabs.
En realizaciones preferidas, la enzima de mellado se introduce en la mezcla de reacción al principio del método (p. ej., en el plazo de un minuto de poner en contacto la muestra con los cebadores y la ADN polimerasa). Sin embargo, en algunos casos puede ser deseable introducir la enzima de mellado en la mezcla de reacción después de un retraso más prolongado (p. ej., para permitir que la temperatura esté más cerca de la temperatura óptima de la enzima de mellado).
El método de la invención implica el uso de una ADN polimerasa. Preferiblemente, pero no necesariamente, el método de la invención puede comprender el uso de al menos una ADN polimerasa termófila (es decir, que tiene una temperatura óptima superior a 60°C). Preferiblemente, la ADN polimerasa es una polimerasa de desplazamiento de cadena. Preferiblemente, la ADN polimerasa no tiene actividad de exonucleasa. Preferiblemente, la ADN polimerasa es una polimerasa de desplazamiento de cadena sin actividad de exonucleasa, y también es preferiblemente termófila.
Los ejemplos de ADN polimerasas preferidas incluyen Bst polimerasa, ADN polimerasa Vent®, polimerasa 9°N, polimerasa Manta 1.0 (Qiagen), polimerasa BstX (Qiagen), polimerasa SD (Bioron GmbH), ADN polimerasa Bsm, fragmento grande (ThermoFisher Scientific), ADN polimerasa Bsu, fragmento grande (NEB) y polimerasa "Isopol"™ (de ArcticZymes).
La siguiente tabla da ejemplos de combinaciones de una enzima de mellado y una ADN polimerasa, junto con la temperatura superior e inferior sugeridas para usar al llevar a cabo el método de la invención usando las combinaciones de enzimas de ejemplo. Aunque la tabla da ADN polimerasas específicas, estas son solo a modo de ejemplo y cualquier cadena que desplace a la exonucleasa menos, la polimerasa con actividad en el intervalo de temperatura indicado sería suficiente, como: Deep Vent (exo-), ADN polimerasa Bst I, II y III, ADN polimerasa Manta 1.0, ADN polimerasa X Bst, ADN polimerasa Bsm, ADN polimerasa IsoPol.
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En algunas realizaciones, el método de la invención puede comprender convenientemente una etapa de preamplificación o enriquecimiento. Esta es una etapa en la que la secuencia diana se pone en contacto con cebadores directos e inversos y ADN polimerasa, pero no con enzimas de mellado. Esto típicamente dura aproximadamente 1-5 minutos y produce una amplificación inicial (lineal) de la secuencia diana de aproximadamente 1000 veces, lo cual puede ser especialmente útil si la secuencia diana está presente en la muestra con un bajo número de copias.
En algunas realizaciones, la etapa de preamplificación o enriquecimiento se lleva a cabo usando una ADN polimerasa mesófila tal como la Exo-Minus Klenow ADN polimerasa o Exo-Minus psicrófila ADN polimerasa de Cenarchaeum symbiosum, a una temperatura inferior a 50°C, y la mezcla posteriormente se calienta por encima de 50°C para desnaturalizar o inactivar la ADN polimerasa termolábil, y después se añade una ADN polimerasa termófila para la amplificación secuencia abajo.
Típicamente, el método de la invención comprende una etapa de detección, en la que se detecta y opcionalmente se cuantifica uno o más de los productos directos o indirectos del procedimiento de amplificación, indicando esto la presencia y/o cantidad de la diana en la muestra. Se conocen muchas técnicas adecuadas de detección y/o cuantificación, que incluyen: electroforesis en gel, espectrometría de masas, captura de flujo lateral, incorporación de nucleótidos marcados, colorantes intercalantes u otros fluorescentes, marcadores enzimáticos, técnicas de detección electroquímica, balizas moleculares y otras sondas, especialmente oligonucleótidos que hibridan específicamente u otras moléculas que contienen ácidos nucleicos.
El producto o productos que se detectan en la etapa de detección se pueden denominar en el presente documento la "diana de detección". La "diana" en relación con la etapa de detección no es necesariamente la misma que la "diana" en el procedimiento de amplificación y, de hecho, las dos moléculas normalmente serán diferentes al menos en cierto grado, aunque pueden tener alguna secuencia (típicamente 10-20 bases) en común, donde la diana de detección comprende una molécula de ácido nucleico u oligonucleótido.
Los métodos de detección de ácidos nucleicos pueden emplear el uso de colorantes que permitan la detección específica de ADN bicatenario. Los colorantes intercalantes que presentan una fluorescencia potenciada tras la unión a ADN o ARN son bien conocidos. Los colorantes pueden ser, por ejemplo, fluoróforos intercalados de ADN o ARN y pueden incluir, entre otros, los siguientes: naranja de acridina, bromuro de etidio, Pico Green, yoduro de propidio, SYBR I, SYBR II, SYBR Gold, TOTO-3 (un dímero naranja de tiaxol) Oli Green y YOYO (un dímero amarillo de oxazol).
Los métodos de detección de ácidos nucleicos también pueden emplear el uso de nucleótidos marcados incorporados directamente en la secuencia diana de detección o en sondas que contienen secuencias complementarias o sustancialmente complementarias de la diana de detección de interés. Los marcadores adecuados pueden ser radiactivos y/o fluorescentes y se pueden resolver de cualquiera de las formas convencionales en la técnica. Los nucleótidos marcados, que se pueden detectar pero por lo demás funcionan como nucleótidos nativos (p. ej., son reconocidos por y pueden actuar como sustratos para enzimas naturales), deben distinguirse de los nucleótidos modificados, que no funcionan como nucleótidos nativos.
La presencia y/o cantidad de ácidos nucleicos diana y secuencias de ácidos nucleicos se puede detectar y vigilar usando balizas moleculares. Las balizas moleculares son oligonucleótidos en forma de horquilla que contienen un fluoróforo en un extremo y un colorante de atenuación ("atenuador") en el extremo opuesto. El bucle de la horquilla contiene una secuencia de sonda que es complementaria o sustancialmente complementaria de una secuencia diana de detección y el tallo está formado por reasociación de secuencias autocomplementarias o sustancialmente autocomplementarias situadas a ambos lados de la secuencia de sonda.
El fluoróforo y el atenuador están unidos en extremos opuestos de la baliza. En condiciones que impiden que la baliza molecular hibride con su diana o cuando la baliza molecular está libre en solución, el fluoróforo y el atenuador están próximos entre sí, evitando la fluorescencia. Cuando la baliza molecular encuentra una molécula diana de detección, se produce la hibridación; la estructura de bucle se convierte en una conformación más rígida y estable que produce la separación del fluoróforo y el atenuador permitiendo que se produzca la fluorescencia (Tyagi et al. 1996, Nature Biotechnology 14: 303-308). Debido a la especificidad de la sonda, la generación de fluorescencia se debe sustancialmente exclusivamente a la presencia de la diana de detección/producto amplificado previsto.
Como regla general, las balizas moleculares funcionan mejor a temperaturas de hibridación más bajas, ya que la relación señal/ruido disminuye al aumentar la temperatura. Esto se debe a que a temperaturas más bajas, las partes del "tallo" autocomplementarias de la baliza molecular permanecen firmemente hibridadas, permitiendo que el atenuador atenúe al fluoróforo, pero a medida que aumenta la temperatura las partes del tallo de la molécula pueden empezar a fundir, permitiendo que aumente el "ruido" de fondo de fluorescencia.
Las balizas moleculares son altamente específicas y pueden distinguir secuencias de ácidos nucleicos que difieren en una sola base (p. ej., polimorfismos de un solo nucleótido). Las balizas moleculares se pueden sintetizar con fluoróforos de diferentes colores y diferentes secuencias complementarias de dianas de detección, lo que permite detectar y/o cuantificar simultáneamente varias dianas de detección diferentes en la misma reacción, permitiendo la "multiplexación" de un solo ensayo de PoC para detectar una pluralidad de patógenos diferentes o marcadores bioquímicos. Para los procedimientos de amplificación cuantitativa, las balizas moleculares se pueden unir específicamente a la diana de detección amplificada después de la amplificación, y debido a que las balizas moleculares no hibridadas no emiten fluorescencia, no es necesario aislar híbridos de sonda-diana para determinar cuantitativamente la cantidad de producto amplificado. La señal resultante es proporcional a la cantidad del producto amplificado. Esto se puede hacer en tiempo real. Al igual que con otros formatos en tiempo real, las condiciones de reacción específicas deben optimizarse para cada conjunto de cebador/sonda para garantizar la exactitud y precisión.
La producción o presencia de ácidos nucleicos dianas de detección y secuencias de ácidos nucleicos también se puede detectar y vigilar por transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). FRET es un mecanismo de transferencia de energía entre dos fluoróforos: una molécula donadora y una aceptora. Brevemente, se excita una molécula de fluoróforo donadora a una longitud de onda de excitación específica. La posterior emisión de la molécula donadora cuando vuelve a su estado fundamental puede transferir energía de excitación a la molécula aceptora (a través de una interacción dipolo-dipolo de largo alcance). FRET es una herramienta útil para cuantificar la dinámica molecular, por ejemplo, en las interacciones ADN-ADN como se ve con las balizas moleculares. Para vigilar la producción de un producto específico, se puede marcar una sonda con una molécula donadora en un extremo y una molécula aceptora en el otro. La hibridación sonda-diana de detección produce un cambio en la distancia u orientación del donador y el aceptor y se observa un cambio en las propiedades de FRET. (Joseph R. Lakowicz. "Principles of Fluorescent Spectroscopy", Plenum Publishing Corporation, 2a edición (1 de julio de 1999)).
La producción o presencia de ácidos nucleicos dianas de detección también se puede detectar y vigilar mediante dispositivos de flujo lateral. Los dispositivos de flujo lateral son bien conocidos. Estos dispositivos generalmente incluyen una ruta de flujo permeable al fluido en fase sólida a través del cual el fluido fluye por fuerza capilar. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a ensayos con tira reactiva y placas cromatográficas de capa fina con varios recubrimientos adecuados. Hay varios reactivos de unión inmovilizados en o sobre la ruta de flujo para la muestra, parejas de unión o conjugados que implican parejas de unión para la muestra y sistemas de producción de señales. La detección de analitos se puede lograr de varias maneras diferentes, que incluyen: detección enzimática, detección electroquímica, detección de nanopartículas, detección colorimétrica y detección de fluorescencia. La detección enzimática puede implicar sondas marcadas con enzimas que se hibridan con dianas de detección de ácidos nucleicos complementarias o sustancialmente complementarias en la superficie del dispositivo de flujo lateral. El complejo resultante se puede tratar con marcadores adecuados para desarrollar una señal legible. La detección de nanopartículas implica tecnología de perlas que pueden usar oro coloidal, látex y nanopartículas paramagnéticas. En un ejemplo, las perlas se pueden conjugar con un anticuerpo anti-biotina. Las secuencias diana se pueden biotinilar directamente, o las secuencias diana se pueden hibridar con sondas biotiniladas específicas de secuencia. El oro y el látex dan lugar a señales colorimétricas visibles a simple vista y las partículas paramagnéticas dan lugar a una señal no visual cuando se excitan en un campo magnético y pueden ser interpretadas por un lector especializado.
También se conocen métodos de detección de flujo lateral basados en fluorescencia, por ejemplo, métodos de oligosonda dual marcada con biotina y fluoresceína, o el uso de puntos cuánticos.
Los ácidos nucleicos también se pueden capturar en dispositivos de flujo lateral. Los medios de captura pueden incluir métodos dependientes de anticuerpos e independientes de anticuerpos. La captura independiente de anticuerpos generalmente usa interacciones no covalentes entre dos moléculas de una pareja de unión, por ejemplo, la alta afinidad y la unión irreversible entre una sonda biotinilada y una molécula de captura de estreptavidina. Las sondas de captura se pueden inmovilizar directamente sobre las membranas de flujo lateral.
El método entero de la invención, o al menos la parte del procedimiento de amplificación del método, se puede llevar a cabo en un recipiente de reacción (tal como un tubo de reactivo de plástico de laboratorio convencional, p. ej., de Eppendorf®) o se puede llevar a cabo en y/o sobre un soporte sólido. El soporte sólido puede ser poroso o no poroso. En una realización particular, el soporte sólido puede comprender un material de membrana porosa (tal como la nitrocelulosa o similar). Más especialmente, el soporte sólido puede comprender o formar parte de un dispositivo de ensayo de flujo lateral poroso, como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, el soporte sólido puede comprender o formar parte de un ensayo de tipo microfluídico, en el que se usan uno o más tubos capilares sólidos de calibre estrecho para transportar un líquido a lo largo de un dispositivo de ensayo.
En realizaciones preferidas, todo o al menos parte del método de la invención se puede llevar a cabo usando un dispositivo de ensayo de diagnóstico inmediato (PoC). Un dispositivo de PoC típicamente tiene las siguientes características: es barato de fabricar, se desecha después de un solo uso, generalmente es independiente y no requiere ningún otro aparato o equipo para realizar o interpretar el ensayo y, convenientemente, no requiere conocimiento clínico o entrenamiento para usarlo.
El método de la invención se presta especialmente a la implementación usando un dispositivo de tipo PoC ya que, en realizaciones típicas, la diferencia de temperatura entre las temperaturas superior e inferior de la oscilación térmica es bastante pequeña. Como resultado, es suficiente la oscilación térmica/regulación de temperatura relativamente simple, en contraste, digamos, a realizar la qPCR.
No obstante, el método de amplificación de la presente invención también podría usarse en un sistema basado en laboratorio, en lugar de un dispositivo de PoC, en lugar de la qPCR y típicamente puede lograr resultados cuantitativos mucho más rápido que los que se pueden lograr realizando la qPCR.
En el presente documento se describen ejemplos de cebadores adecuados para usar en la invención. Otros ejemplos que pueden ser adecuados para usar en el método de la invención se describen, entre otros, en los documentos US 2009/0017453, US2013/0330777 y EP 2.181.196.
El experto en la técnica podrá diseñar fácilmente otros cebadores adecuados para la amplificación de otras secuencias diana sin experimentación indebida.
Como se explica en otra parte, los cebadores de uso en la invención comprenderán preferiblemente no sólo una parte complementaria de la diana, sino también un sitio de unión a la endonucleasa de mellado y un sitio de mellado, y una parte estabilizadora.
Los cebadores de uso en el método de la invención pueden comprender nucleótidos modificados (es decir, nucleótidos que no se encuentran en moléculas de ácido nucleico de origen natural). Dichos nucleótidos modificados pueden estar presentes convenientemente en la parte complementaria de la diana del cebador y/o en cualquier otra parte en el cebador. Los ejemplos preferidos de nucleótidos modificados son los nucleótidos modificados en 2', especialmente los nucleótidos modificados con 2'O-metilo, aunque los expertos en la técnica conocen muchos otros nucleótidos modificados.
A continuación, se describirán las características de la invención a modo de ejemplo ilustrativo y con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
Las figuras 1A y 1B son representaciones esquemáticas de la fase de inicio y la fase de amplificación exponencial, respectivamente, de una reacción de amplificación de ácidos nucleicos adecuada para llevar a cabo el método de la invención;
La figura 2 es un gráfico (temperatura en °C frente a tiempo, en minutos) que ilustra un perfil de temperatura típico para una mezcla de reacción durante la realización del método de la invención;
La figura 3 es una representación esquemática de una realización típica de una molécula de oligonucleótido cebador útil para llevar a cabo el método de la invención;
Las figuras 4-5C son gráficos de fluorescencia (fondo restado) (en unidades arbitrarias) frente al tiempo (segundos) para reacciones de amplificación realizadas de acuerdo con el método de la invención, usando moléculas de cebador que no comprenden, o comprenden diferentes números de bases 2'0-metiladas.
La figura 6 es un gráfico de dispersión que muestra el tiempo promedio para lograr la amplificación (At, en minutos), considerado por la generación de una señal de fluorescencia por encima de un umbral de fondo, para un método de acuerdo con la invención (gráfico de la izquierda), y un método realizado de acuerdo con el protocolo STAR descrito en el documento WO2018/002649 (gráfico central), o un protocolo de reacción isotérmica (gráfico de la derecha);
Las figuras 7 y 8 son representaciones esquemáticas de, respectivamente, un ensayo de actividad de polimerasa y un ensayo de actividad de mellado, útil para caracterizar el método de la invención;
Las figuras 9A y 9B son gráficos del promedio (de tres repeticiones) de fluorescencia relativa (en unidades arbitrarias) frente al tiempo (en minutos) de un ensayo de actividad de polimerasa (figura 9A) o un ensayo de actividad de mellado (figura 9B), llevado a cabo en una variedad de temperaturas;
Las figuras 10A-11D son gráficos de fluorescencia relativa (unidades arbitrarias) frente al número de ciclos para las reacciones de amplificación intentadas usando varias enzimas polimerasas diferentes usando condiciones de PCR convencionales (figuras 10A, 10B) o condiciones de oscilación térmica ''qSTAR'' de acuerdo con la invención, pero en el ausencia de una enzima de mellado (figuras 11A-11D);
Las figuras 12 y 13 muestran los datos obtenidos de llevar a cabo la amplificación qPCR convencional (figura 12), o amplificación "qSTAR" de acuerdo con el método de la invención (figura 13), usando muestras de partida de concentración desconocida, con un resumen de los resultados en la figura 13B;
Las figuras 14A-14D son gráficos de fluorescencia (unidades arbitrarias) frente al tiempo (segundos), que muestran los resultados de las reacciones de amplificación llevadas a cabo según el método de la invención en diferentes intervalos de temperatura;
La figura 15 es un gráfico de fluorescencia (unidades arbitrarias) frente al tiempo (minutos), que muestra los resultados de las reacciones de amplificación llevadas a cabo según el método de la invención a temperaturas en el intervalo de 38-45°C; y
La figura 16 es un gráfico de fluorescencia (unidades arbitrarias) frente al tiempo (minutos), que muestra los resultados de las reacciones de amplificación llevadas a cabo según el método de la invención, usando una secuencia diana de ARN de transcripción inversa.
Ejemplos
Ejemplo 1: Protocolo para ensayar la reacción de amplificación de temperatura selectiva cuantitativa (qSTAR)
La cuantificación de la expresión génica por la reacción de amplificación de temperatura selectiva (STAR) como se describe en el documento WO2018/002649, u otras tecnologías de amplificación de ADN/ARN relacionadas de manera similar tales como PCR, SDA o una técnica de amplificación isotérmica, sería, a lo sumo, poco fiable. La cantidad de producto producido alcanzaría una meseta que no está directamente correlacionada con la cantidad de ADN diana en la muestra de partida inicial. Al establecer un efecto de zona de oscilación de temperatura controlada en una reacción de amplificación, se pueden lograr amplificaciones cuantitativas con una polimerasa de desplazamiento de cadena y endonucleasa de mellado en las que el producto amplificado está relacionado directamente con la cantidad de partida inicial de ADN, ARN u otros ácidos nucleicos conocidos. Una reacción de amplificación de temperatura selectiva basada en enzimas de mellado, de acuerdo con la invención, se denomina en el presente documento reacción de amplificación de temperatura selectiva cuantitativa (qSTAR, por sus siglas en inglés quantitative Selective Temperature Amplification Reation). El protocolo se describe más adelante a menos que se indique lo contrario.
Enzimas, oligonucleótidos y diana
Se usó Chlamydia trachomatis (Ct) como diana inicial para el desarrollo del mecanismo de qSTAR. El ADN genómico de Chlamydia trachomatis Serovar J (ATCC VR-886) se adquirió de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). La región 6 del marco de lectura abierto del plásmido críptico se amplificó con los cebadores qSTARctF61 a (SEQ ID NO: 1 5'-CGACTCCATATGGAGTCGATTTCCCCGAATTA -3') y qSTARctR61c (SEQ ID NO: 2 5'-GGACTCCACACGGAGTCTTTTTCCTTGTTTAC -3'). El molde de ADN resultante se detectó usando una baliza molecular qSTARctMB1 (SEQ ID NO: 3, 5'- FAM/ccattCCTTGTTTACTCGTATTTTTAGGaatgg/BHQ1-3') como se describe en el documento EP N° 0728218. La ADN polimerasa Bst X se adquirió de Qiagen (Beverly, MA). La endonucleasa de mellado Nt.BstNBI se adquirió de New England BioLabs (Ipswich, MA) y se describe en la patente de EE.UU. N° 6.191.267. La misma polimerasa y endonucleasa de mellado también se usaron en los otros ejemplos descritos en el presente documento, a menos que se indique lo contrario.
Los oligonucleótidos y las balizas moleculares fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) y Bio-Synthesis (Lewisville, TX). Las características generales de los cebadores usados en las reacciones qSTAR se describen en el documento WO2018/002649.
Un resumen de los oligonucleótidos y el mecanismo de amplificación encontrado en una reacción en una realización del método de la presente invención comprende (i) una molécula de ácido nucleico diana; (ii) dos o más moléculas de oligonucleótidos cebadores que comprenden un cierto número de oligonucleótidos que son complementarios de la molécula de ácido nucleico diana y (iii) un sitio dentro del cebador que puede ser mellado por una enzima de mellado. El método implica poner en contacto una molécula de ácido nucleico diana con una polimerasa, dos o más oligonucleótidos cebadores, cada uno de los cuales se une específicamente a una secuencia complementaria en la molécula de nucleótidos diana, y una enzima de mellado, en condiciones de amplificación de temperatura selectiva, generando un amplicón detectable que comprende al menos una parte de las secuencias diana a las que se había unido un oligonucleótido cebador. Se puede entender que la reacción general de qSTAR experimenta dos fases distintas; inicio y amplificación exponencial, ilustradas esquemáticamente en las figuras 1A y 1B respectivamente. La fase de inicio es la formación inicial de un dúplex proteína-cebador a partir del cual se puede producir la extensión inicial para la amplificación exponencial. La fase exponencial es cuando la enzima de mellado se activa junto con la polimerasa conduciendo a la amplificación exponencial. En la figura 1 A, se produce el contacto inicial del cebador con un ácido nucleico diana (etapa a), seguido de la extensión de la polimerasa (etapa b) que genera el molde de inicio directo (c). El cebador de cadena opuesta se une (etapa d) al molde de inicio directo recién generado, extendiéndose (etapa e) en la dirección hacia y a través del sitio de mella del molde de inicio. Este inicio puede ocurrir simultáneamente tanto en la cadena directa como en la inversa. Puede entenderse que este proceso inicial implica predominantemente a la polimerasa para la extensión, pero esencialmente con poca o ninguna implicación de la enzima de mellado.
En la figura 1A, la diana se muestra como que es monocatenaria. Esto es con el propósito de claridad y simplicidad. En realidad, el método de la invención se lleva a cabo sin requerir el uso de altas temperaturas para "fundir" o separar las cadenas de los polinucleótidos diana bicatenarios, más bien, los cebadores se pueden asociar con la molécula diana (bicatenaria) aprovechando la relajación localizada de los enlaces de hidrógeno entre las cadenas, un fenómeno conocido como "respiración".
A una segunda temperatura selectiva (en esta realización, más baja), se favorece la formación de mella en cualquiera de las cadenas, permitiendo que la polimerasa de desplazamiento de cadena se extienda hacia el cebador opuesto ya través del sitio de mella. Este ciclo de mellado/extensión de la polimerasa da como resultado la formación del dúplex exponencial (figura 1B). Este dúplex exponencial después alimenta una amplificación bidireccional de modo que cada nuevo molde generado a partir de una mella y una extensión se convierte en una diana para otro cebador. La temperatura oscila de vuelta a la fase de inicio para la extensión específica de la polimerasa, limitando la amplificación de fondo y controlando la amplificación exponencial en fases discretas.
Al controlar las temperaturas y, por lo tanto, la actividad de la polimerasa y la endonucleasa de mellado, los autores de la invención han logrado un método para la amplificación rápida y controlada, que permite la cuantificación de la entrada de diana desconocida.
La figura 2 muestra un perfil de temperatura típico (°C frente al tiempo, en minutos) para una realización de una reacción de amplificación de acuerdo con la invención. En la realización ilustrada, la polimerasa tiene una temperatura óptima mayor que la de la enzima de mellado. La temperatura superior es 63°C, la temperatura inferior es 57°C. El tiempo de permanencia a la temperatura inferior (aproximadamente 5 segundos) es más prolongado que el tiempo de permanencia (aproximadamente 2 segundos) a la temperatura superior. Cada oscilación de temperaturas completa dura aproximadamente 8-9 segundos, de modo que se completan aproximadamente 7 oscilaciones térmicas por minuto. En la mitad superior de temperatura de la oscilación (>60°C) está favorecida y predomina la fase de inicio de la reacción (véase la figura 1B). Los expertos en la técnica apreciarán que no hay una distinción clara de temperatura entre las dos fases de la reacción de amplificación, y la línea divisoria ilustrada en la figura 2 es simplemente para ayudar a comprender.
El enfoque de amplificación de temperatura selectiva cuantitativa sorprendentemente ha dado como resultado una reacción de amplificación cuantitativa, rápida, específica y de alto rendimiento con un rendimiento significativamente mayor que los métodos existentes previamente, como se explicará e ilustrará con más detalle a continuación.
Condiciones de amplificación
La mezcla de qSTAR básica contenía dos cebadores, polimerasa y enzima de mellado (mencionado antes). Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 25 gl, que incluía cebador directo 1,0 gM, cebador inverso 0,5 gM, baliza molecular 0,25 gM, 10 gl de Mezcla maestra de qSTAR y 5 gl de muestra de ADN. La mezcla maestra de qSTAR contenía los siguientes reactivos; MgSÜ412,5 mM, Tris-HCl 90 mM (pH 8,5), 300 gM de cada dNTP, NhUOAc 20 mM, NaOAc 30 mM, DTT 2 mM, Triton X-100 al 0,02%, endonucleasa de mellado 15 U y polimerasa 60 U. La temperatura de las reacciones se controló entre dos fases de temperatura discretas para aprovechar las actividades enzimáticas inherentes. La fase de inicio, que consiste principalmente en actividad de polimerasa, era a la temperatura elevada de 62°C durante dos segundos. (A esta temperatura, la enzima de mellado estaba inhibida en gran medida; véase la figura 9B). La fase exponencial, en la que tanto la polimerasa como la enzima de mellado son moderada o altamente activas, se mantuvo a 57°C durante cinco segundos. El tiempo total para una oscilación completa era de 15 segundos. Esto es más del doble del tiempo de permanencia en cada temperatura debido a los límites del aparato en el cambio de temperatura (un instrumento más sensible permitiría una oscilación más rápida entre la temperatura superior y la inferior). La amplificación y detección del producto de qSTAR se llevaron a cabo usando el aparato de qPCR Agilent Mx3005P (Agilent).
Cada reacción tenía una incubación previa para permitir que los reactivos alcanzaran la temperatura de reacción y analizar el efecto que tenía la temperatura en la cinética de amplificación, el rendimiento de la enzima y la fluorescencia de la señal.
Procedimiento de amplificación
Las etapas exactas bajo las cuales se llevaba a cabo una reacción de amplificación son las siguientes: 1) se prepara la mezcla maestra; 2) se preparan cebadores con diana o sin diana; 3) se añaden mezclas de cebadores a las filas A-G de una placa de 96 pocillos, dependiendo del número de reacciones que se realicen por placa; 4) se añade la mezcla maestra a la fila H de la misma placa de 96 pocillos; 5) se sella la placa y se hace una preincubación de reacción durante 15 segundos; 6) se transfiere la mezcla maestra de la fila H a cada fila de mezcla de cebadores; 7) se sella e inicia el perfil de temperaturas preseleccionado y la recogida de datos.
Durante la reacción, el producto amplificado se midió al final de cada fase exponencial usando una baliza molecular como se describe a continuación. La fluorescencia de la baliza molecular en la mezcla de reacción se vigiló para medir la cantidad de producto específico que se genera durante una reacción que se une a la baliza molecular separando el fluoróforo del atenuador, generando fluorescencia.
Ejemplo 2: Resultados usando cebadores no modificados
Para demostrar el potencial de esta novedosa tecnología de amplificación, se llevó a cabo qSTAR usando cuatro repeticiones por dilución de diana a lo largo de 6 logs de introducción de ADN genómico y dos repeticiones para controles sin diana (NTC). En la figura 4 se muestran los resultados de los experimentos que usan cebadores no modificados (es decir, moléculas de cebador que no contienen ninguna base de ácido nucleico anormal químicamente modificada). La cantidad de señal (fluorescencia con fondo restado) para el "control sin diana" se indica mediante la línea oscura ("ntc"). La cantidad de señal generada en presencia de 20 cp, 200 cp, 2 k, 20 k, 200 k y 2 millones de copias de diana (ADN genómico de C. trachomatis) se indica mediante las líneas respectivas.
Las reacciones de qSTAR presentan un coeficiente de determinación lineal a partir de la introducción de la diana y, al mismo tiempo también demuestran una mejora en la velocidad, sensibilidad y fluorescencia total. Es sorprendente e inesperado que dicha mejora y separación entre las introducciones de diana podría lograrse controlando la temperatura de las reacciones entre dos regiones de temperatura cercanas, pero claramente diferentes.
Sin limitarse lo autores de la invención a ninguna teoría en particular, se cree que las mejoras en la amplificación se pueden atribuir a al menos dos características. En la mayoría de las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos, a la larga se forman dímeros de cebadores que compiten por los reactivos limitados y, con concentraciones bajas de la diana, los dímeros de cebadores potencialmente pueden convertirse en las rutas de amplificación principales para una reacción. La limitación o retardo en la formación de dímeros de cebadores, incluso en una pequeña cantidad, proporciona beneficios significativos. Debido a la naturaleza rápida de la reacción de amplificación, retrasar la formación de dímeros de cebadores permite que sean favorecidas las rutas de amplificación preferidas (es decir, generación de molde) mejorando todos los aspectos de la amplificación. Al iniciar las reacciones a temperaturas elevadas estas rutas del molde son favorecidas e incluso preferidas. Esto se ve por la sensibilidad mejorada y la velocidad en el métodos qSTAR, mejora de la señal de fluorescencia, repeticiones más ajustadas y mayor velocidad.
Durante la fase de inicio, la reacción se lleva a cabo a una temperatura elevada, 62°C. Esta temperatura elevada inhibe selectivamente la enzima de mellado sin dañarla funcionalmente de forma permanente (como se muestra junto con la amplificación y la figura 9B, descritos en otra parte). Durante esta fase inicial, la polimerasa es favorecida relativamente, permitiendo una extensión rápida y específica, ya que la temperatura de reacción es relativamente cercana a la temperatura óptima de la polimerasa.
Después de la fase de inicio de la reacción, la temperatura se reduce a una temperatura que está más cerca de la temperatura óptima para la enzima de mellado, dando como resultado una mayor eficiencia y permitiendo una mayor generación de molde. Dado que la ruta del molde deseada ha sido favorecida frente a rutas errantes, la especificidad y la sensibilidad aumentan mucho, lo que es facilitado aún más por la oscilación de temperatura de qSTAR y la regulación selectiva de la actividad de las enzimas.
La mezcla de reacción oscila continuamente entre 62 y 57°C, para dar una tecnología de amplificación rápida y controlada que se puede usar para una cuantificación precisa.
El nuevo método de amplificación no isotérmica de la invención proporciona una mejora sustancial frente a muchos tipos de reacciones de amplificación existentes, incluyendo las reacciones isotérmicas y las que dependen de altas temperaturas para la disociación del dúplex. Al controlar la actividad enzimática por "delimitación de la temperatura" y la optimización de la cinética de la reacción, el método de la invención ha mejorado la consistencia y el control de la amplificación, al mismo tiempo que aumenta la sensibilidad de detección, para permitir una cuantificación fiable y precisa.
Ejemplo 3: Resultados usando cebadores modificados con 2' O-metilo
Como se describe en las patentes de EE. UU. 6.794.142 y 6.130.038, se sabe que el uso de cebadores modificados con 2' O-metilo reduce la formación de dímeros de cebadores durante la amplificación. El documento US 2005­ 0059003 describe el uso de modificaciones de 2' O-metilo situadas en el extremo 3' de los cebadores de SDA, lo que sugiere que la ADN polimerasa I Bst y sus derivados pueden usar eficazmente ribonucleótidos modificados en 2' como cebadores para la síntesis de ADN. Las regiones de cebadores específicas de la diana que comprenden uno o más nucleótidos modificados en 2' (p. ej., 2'-O-metilo, 2'-metoxietoxi, 2'-fluoro, 2'-alilo, 2'-O-[2(metilamino)-2- oxoetilo], 2'-hidroxilo (ARN), 4'-tio, 4'-CH3-O-2'-puente, 4'-(CH3) 3-O-2'-puente, 2'-LN A y 2'-O-(N-metilcarbamato, 2'-Suc-OH)) deberían mejorar las reacciones de amplificación. Las reacciones se llevaron a cabo usando la oscilación de temperatura selectiva de enzimas (62-57°C) como se describe en el ejemplo anterior junto con una sola base 2'-O-metilada o una cadena de bases 2'-O-metiladas situadas hacia el 3' de los cebadores (ilustrados esquemáticamente en la figura 3).
Los resultados de la amplificación usando cebadores que comprenden uno o más nucleótidos modificados en 2' en el extremo 3' se muestran en las figuras 5A-5C. Las reacciones se llevaron a cabo con un mínimo de cuatro repeticiones en las cinco concentraciones logarítmicas del ADNg introducido, junto con reacciones de control sin diana. Como se demostró, las reacciones son cuantitativas en un intervalo de cinco logaritmos con un coeficiente de determinación mayor que 0,99 (datos omitidos por brevedad). El coeficiente de determinación se calculó usando un método similar al descrito por Pfaffl en "A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR", (2001, Nucl. Acids Res. 29 (9) e45). El punto de partida de la fase exponencial, EP, de la amplificación se determinó identificando dónde empezaba la EP por encima de la fluorescencia de fondo. La fluorescencia de fondo se calculó promediando las tres primeras lecturas de cada reacción. Después, se determinó la EP basándose en el momento en que la fluorescencia relativa de cada reacción alcanzaba 2.000. Usando la entrada conocida para cada reacción, se evaluó la EP usando un algoritmo de regresión lineal para determinar el coeficiente de determinación a lo largo de valores logarítmicos. Esta curva de calibración se generó y calculó para la linealidad, típicamente con reacciones qSTAR que generan un valor de R cuadrado de 0,99 o mayor.
Los datos demuestran (figura 5A) que el uso de un cebador que incorpora un único nucleótido O-metilado en 2' detiene las reacciones de amplificación, ralentizando la velocidad de las reacciones para una mejor resolución en todas las concentraciones de entrada. Además, el uso del método qSTAR no solo mejoró el uso de la amplificación con 2' O­ metilo, sino que ilustra la funcionalidad del método con modificaciones de amplificación conocidas. Como se muestra en las figuras 5B y 5C, la incorporación de bases 2' O-metiladas adicionales a lo largo del cebador mejora la separación de la amplificación, o se eleva desde la línea base, permitiendo mayor resolución, mejorando la capacidad cuantitativa de la tecnología. En esencia, la separación entre cada concentración se mejora por la ralentización de las reacciones producida por el uso de bases 2' O-metiladas: por ejemplo, una reacción con una separación de un ciclo en aumento desde la línea base, cuando se usan cebadores no modificados, muestra una separación de 2 ciclos cuando se usan cebadores que incorporan las bases 2' o-metiladas. Esto sugiere que aunque las modificaciones de 2' O-metilo reducen la producción de amplificación errante no específica en el método ilustrado de la invención, el mayor beneficio de estas modificaciones es controlar la velocidad de las reacciones para así permitir mayor resolución y más amplificación cuantitativa.
Sin limitarse los autores de la invención a ninguna teoría en particular, se plantea la hipótesis de que las mejoras potenciales obtenidas usando uno o más nucleótidos modificados en 2' en la región del cebador se deben en gran medida a las mejoras en la fase de inicio de la amplificación. Durante la fase de extensión inicial, dos sucesos ayudan a explicar la actividad de los nucleótidos modificados en 2' en la reacción de amplificación de la invención. En primer lugar, se sabe que las bases 2' O-metiladas reducen la temperatura de fusión de los dúplex de ADN/ADN, dando como resultado un inicio más controlado al tender a inhibir las interacciones molde: molde, reduciendo así la oportunidad para la extensión por la polimerasa de complejos no específicos formados por interacciones entre cebadores. En segundo lugar, es posible que la polimerasa se detenga cuando el nucleótido entra en el bolsillo de unión. En reacciones no productivas (es decir, formación de dímero de cebadores o fuera de la diana), el efecto de detención es suficiente para minimizar la extensión aberrante porque la unión del molde está cerca de su temperatura de fusión. Por consiguiente, las modificaciones en 2' pueden restringir rutas de amplificación no deseables porque la reacción se ha atascado. qSTAR puede aprovechar las modificaciones en 2' y regular mejor la amplificación de la diana para ajustar las reacciones para mejorar la capacidad cuantitativa. Esta detención de la polimerasa explica aún más por qué qSTAR junto con las modificaciones de 2' O-metilo mejoran entre sí. La región de temperatura inicial de la polimerasa que se encuentra en el método ilustrado de la invención, además de disminuir la formación de dímeros de cebadores, ralentiza el inicio de una manera controlada y fiable. Además, puesto que qSTAR oscila repetidamente a una temperatura más baja, la reducción en la temperatura de fusión producida por las modificaciones en 2' se puede reducir a medida que avanza la reacción.
Ejemplo 4: Reproducibilidad
Para la validación de la tecnología de qSTAR, se llevó a cabo un estudio de repeticiones grande comparando el rendimiento de qSTAR con el rendimiento de STAR y otras condiciones isotérmicas publicadas, como se describe en la patente de EE. UU. 9.562.263. Las amplificaciones, (qSTAR frente a STAR frente a isotérmica), se llevaron a cabo usando más de 100 repeticiones para las reacciones que contenían la diana y 16 repeticiones para las mezclas de reacción de control sin diana. Todas las condiciones usaban los mismos tampones, polimerasa, enzima de mellado y diana. Como se muestra en el diagrama de dispersión de la figura 6, la amplificación por qSTAR y STAR muestra una clara mejora en el tiempo promedio (At) para lograr la amplificación al nivel umbral de fluorescencia (TL), sensibilidad mejorada y una desviación estándar reducida entre repeticiones, en comparación con la reacción de amplificación isotérmica. El tiempo At para reacciones llevadas a cabo según la invención era 2,38 minutos, mientras que el valor de At para reacciones llevadas a cabo de acuerdo con protocolos isotérmicos convencionales era de 4,12 minutos, una diferencia que es estadísticamente significativa (ensayo bilateral). (Nota: las reacciones que fallan se muestran con un tiempo de amplificación de 10 minutos, el tiempo máximo durante el cual se realizaron las reacciones). Además, el método qSTAR es una mejora con respecto al método STAR en lo que respecta a la velocidad. La tecnología de qSTAR demostró las repeticiones más ajustadas, mayor sensibilidad, amplificación más rápida con la menor cantidad de valores atípicos. Sin limitarse los autores de la invención a ninguna teoría en particular, se cree que la reducción significativa en el tiempo de amplificación se debe al inicio mejorado de la reacción, lo que permite una amplificación de bajo número de copias más eficiente, sucesos de dímeros de cebadores minimizados y mayor extensión específica del producto que permite la generación de productos más rápida que los métodos descritos previamente. Se logran réplicas más ajustadas aprovechando la actividad de la enzima de mellado y la polimerasa, lo que genera múltiples oportunidades para la amplificación específica, rápida y controlada de los moldes deseados.
Ejemplo 5: Funcionalidad de qSTAR
Una propiedad característica del método de la presente invención comprende la modulación de la actividad enzimática usando pequeños cambios de temperatura durante el procedimiento de amplificación, cambios de temperatura que son mucho menores que, digamos, los cambios experimentados durante la realización de la qPCR. Para verificar que la enzima de mellado tiene una actividad reducida durante la fase de inicio, pero que es muy activa durante la fase exponencial, los autores de la invención han desarrollado dos ensayos de actividad de proteínas únicos: un ensayo de actividad de polimerasa ("PAA") y un ensayo de actividad de mellado ("NAA").
Diseño del ensayo de actividad de la polimerasa, enzimas y oligonucleótidos:
Los oligonucleótidos sintéticos para el PAA fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). El diseño consiste en tres oligonucleótidos; el oligo molde (NEF), (SEQ ID NO: 4 5'-/56-FAM/ACCGCGCGCACCGAGTCTGTCGGCAGCACCGCT-3'), oligo de cebado (PO), (SEQ ID NO: 5 5'-AGCGGTGCTGCCGACA-3'), y oligo de atenuación (POQ), (SEQ ID NO: 6 5'-GGTGCGCGCGGT/3BHQ_1/-3'). Juntos, estos tres oligonucleótidos forman un complejo en solución, cada uno con funciones únicas, como se muestra en la figura 7. El NEF tiene un fluoróforo en 5', el POQ tiene un resto de atenuación en 3' que absorbe los fotones liberados por el oligo fluoróforo molde en 5'. El PO sirve como sitio de inicio para que una polimerasa de desplazamiento de cadena extienda y desplace el oligo de atenuación permitiendo que se genere fluorescencia debido a que el oligo de atenuación ya no está cerca del oligo molde. Las polimerasas de desplazamiento de cadena altamente activas generan una señal fluorescente a una velocidad mayor en comparación con las polimerasas menos activas o aquellas que carecen de actividad de desplazamiento de soporte.
Condiciones del ensayo de actividad de la polimerasa
La mezcla básica del ensayo de actividad de la polimerasa (PAA) contiene un oligo molde (NEF) con una modificación 5'-FAM, un oligo de cebado (PO) que se reasocia con el extremo 3 del molde, un oligo de atenuación (POQ) con una modificación 3'-BHQ1 que se reasocia con el extremo 5' del molde y una polimerasa bajo ensayo (mencionada antes). Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 25 gl, que incluyen NEF 0,2 gM, PO 0,3 gM, POQ 0,7 gM y 1X Mezcla maestra de PAA. A una concentración de 1X, la mezcla maestra de PAA contiene los siguientes reactivos; MgSO4 12,5 mM, Tris-HCl 90 mM (pH 8,5), 300 gM de cada dNTP, NH4CH3CO2 15 mM, Na2SO4 15 mM, DTT 5 mM, BSA 0,2 mg/ml, Triton X-100 al 0,02%, Rb2SO420 mM, L-treonina 10 mM y polimerasa 0,03 U/gl. Las reacciones se realizan isotérmicamente para determinar la actividad de enzimas seleccionadas a temperaturas específicas. El PAA se realizó con el aparato Agilent Mx3005P qPCR (Agilent). Cada reacción tenía una incubación previa a la reacción para permitir que los reactivos alcancen la temperatura para ensayar el efecto de la temperatura seleccionada y evitar cualquier variación a medida que las reacciones se calientan. Cada reacción evaluaba la cinética de amplificación, el rendimiento enzimático y la señal de fluorescencia.
Diseño del ensayo de actividad de mellado (NAA), enzimas y oligonucleótidos:
Los oligonucleótidos sintéticos para el NAA fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). El ensayo implica dos oligonucleótidos; el oligo molde (NEQ), (SEQ ID NO: 7 5'-ACCGCGCGCACCGAGTCTGTCGGCA/3BHQ_1/-3') y el oligo de cebado (POF, SEQ ID NO: 8 5'-/56-FAM/CTGCCGACAGACTCGGTGCGCGCGGT-3'). Juntos, estos oligonucleótidos forman un complejo en solución, cada uno con funciones únicas, como se muestra en la figura 8. El oligo molde tiene un sitio de mellado para la actividad de la endonucleasa de mellado y secuencia abajo un atenuador 3'. El oligo de cebado tiene la secuencia complementaria del sitio de mellado y un fluoróforo 5'. Cuando están en solución, los dos forman un complejo que completa un sitio de unión de mellado que permite que la endonucleasa de mellado corte. El oligonucleótido del atenuador 3' del sitio de mella, después de la mella por una endonucleasa de mellado, ahora tiene una temperatura de fusión baja. Debido a que la reacción se realiza por encima de esta temperatura de fusión, el fragmento acortado que contiene el atenuador se libera del complejo, dando como resultado la fluorescencia no atenuada. Cuanto más activa es la enzima de mellado, más rápida y mayor es la señal fluorescente que se genera.
Condiciones del ensayo de actividad de mellado
La mezcla básica de NAA contiene el oligo molde (NEQ) con una modificación 3'-BHQ1 y el oligo de cebado (POF) con una modificación 5'-FAM que se reasocia con el molde y una endonucleasa de mellado para ser ensayada. Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 25 ql, que incluía NEQ 1,3 qM, POF 1,6 qM y 1X Mezcla maestra de NAA. En una concentración 1X, la mezcla maestra de NAA contiene los siguientes reactivos; MgSO412,5 mM, Tris-HCl 90 mM (pH 8,5), NH4CH3CO215 mM, Na2SO415 mM, DTT 5 mM, BSA 0,2 mg/ml, Triton X-100 al 0,02%, Rb2SO4 20 mM, L-treonina 10 mM y endonucleasa de mellado 0,008 U/ql. Las reacciones se realizan isotérmicamente para determinar la actividad de enzimas seleccionadas a temperaturas específicas. El NAA se realizó con el aparato Agilent Mx3005P qPCR (Agilent). Cada reacción tenía una incubación previa a la reacción para permitir que los reactivos alcancen la temperatura para ensayar el efecto de la temperatura seleccionada y evitar cualquier variación a medida que las reacciones se calientan. Cada reacción evaluaba la cinética de amplificación, el rendimiento enzimático y la señal de fluorescencia.
Perfil de temperatura de las enzimas
La figura 9A muestra el ensayo de actividad de la polimerasa para seis condiciones isotérmicas. A 63°C, la polimerasa tiene la actividad y cinética más fuertes, determinadas por la pendiente de la curva fluorescente y la fluorescencia total. Cada descenso posterior de la temperatura, 60°C, 55°C, 50°C y 45°C muestra una disminución de la actividad hasta llegar a 40°C. A esta baja temperatura, la actividad de la polimerasa parece ser sustancialmente inexistente.
La figura 9B muestra el ensayo de actividad de mellado para seis condiciones isotérmicas. A diferencia del ensayo de la polimerasa, que muestra una temperatura óptima clara hacia el extremo superior del intervalo preferido de temperaturas para el método qSTAR, el ensayo de actividad de mellado muestra un valor óptimo (aproximadamente 55°C) hacia el extremo inferior del intervalo preferido de temperaturas para el método qSTAR, a la vez que demuestra poca o ninguna actividad a 63°C. Todas las demás temperaturas muestran algún nivel de actividad para la enzima de mellado.
Los datos de estos ensayos demuestran la naturaleza distintiva de la tecnología qSTAR. A diferencia de otros métodos de amplificación que se basan en el desplazamiento de la cadena y/o la separación por temperatura, qSTAR usa de manera única la "delimitación de la temperatura" para modular la actividad enzimática y controlar la amplificación rápida. Reconociendo las características únicas de estas enzimas y la dependencia de la temperatura de la actividad, los autores de la invención han desarrollado una nueva tecnología de amplificación controlada, específica y rápida que puede cuantificar entradas de muestras desconocidas en menos de seis minutos.
Sin estar ligado a ninguna teoría en particular, se cree que en este ejemplo qSTAR implica la modulación de la actividad de la enzima de mellado cuando amplifica entre dos temperaturas. 63°C y 57°C son la elección de temperatura preferida en el sistema ilustrado descrito antes (basado en los perfiles de actividad de proteínas actuales) porque permiten la amplificación controlada, un requisito para cualquier tecnología cuantitativa. Se cree además que es deseable controlar la actividad de cualquiera de las enzimas para gestionar un suceso de amplificación eficaz conocido para la cuantificación de material de ácido nucleico desconocido.
Ejemplo 6: resultados de amplificación de qSTAR usando polimerasas de la qPCR
Para demostrar las propiedades inesperadas de qSTAR frente a otras tecnologías de amplificación, tales como la PCR, se llevó a cabo una comparación de las polimerasas de PCR comunes, que mostraba que las polimerasas y los métodos de PCR comunes son inactivos en el método qSTAR. Se usaron cuatro polimerasas de PCR; Vent, Deep Vent, Taq y Phusion para la amplificación en un método de qPCR, como se describe a continuación, y se compararon con el método de qSTAR. Debido a que las balizas moleculares solo miden un aumento en la cantidad total de producto de ADN monocatenario específico, el producto de amplificación no específico no se mide independientemente del producto de amplificación previsto. Para medir la producción de todos los productos de amplificación (p. ej., incluyendo los procedentes de la formación de dímeros de cebadores), las reacciones se llevaron a cabo en presencia de SYBR Green I. SYBR Green I es uno de los colorantes más sensibles conocidos para detectar ADN monocatenario, ARN y ADN bicatenario. Debido a que SYBR Green I tiene una fluorescencia intrínseca baja, es una buena opción para la detección de la amplificación total en una reacción, tanto específica como no específica, para demostrar que las polimerasas de PCR comunes son inactivas en el método qSTAR.
Diseño de ensayo de qPCR/qSTAR, mezcla maestra y oligonucleótidos:
Los oligonucleótidos sintéticos para el ensayo de qPCR interno (Ctx) fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) y diseñados para la amplificación del ADN genómico de Chlamydia Trachomatis. El diseño consiste en dos oligonucleótidos; el oligo de cebado directo (Ctx_L.F1, SEQ ID NO: 9 AAAAAGATTTCCCCGAATTAG), y un oligo de cebado inverso (Ctx_L.R1_3'(-2), SEQ ID NO: 10 AGTTACTTTTTCCTTGTTT). Los oligonucleótidos fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Se usó la tinción de ácido nucleico con SYBR Green I (Lonza Rockland, Inc. P/N 50513) se usó como colorante intercalante para la detección de productos de ADN bicatenarios (ADNbc). La mezcla maestra de PCR y las polimerasas usadas eran de New England Biolabs (Ipswich, MA); tampón de reacción Thermopol 10X, ADN polimerasa Vent (exo-) (P/N M0257S), Deep Vent (exo-) (P/N M0257S) y aDn polimerasa Taq (P/N M0267S), Tampón Hf Phusion 5X y ADN polimerasa Phusion HF (p/n M0530S). El ADN genómico de Chlamydia Trachomatis (cepa: UW-36/Cx) (P/N VR-886D) se adquirió a través de ATCC (Manassas, VA).
Condiciones del ensayo de qPCR/qSTAR
La mezcla interna básica del ensayo de qPCR (Ctx) contenía un oligo cebador directo, un oligo cebador inverso, un colorante intercalante de ADNbc, una concentración conocida de molde de ADN genómico, una concentración 1X de mezcla maestra de PCR comercial y su polimerasa correspondiente (mencionada antes). Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 25 gl, que incluía F1 0,3 gM, R1 0,3 gM, SYBR Green I 0,1X, 1X Mezcla maestra de PCR comercial, polimerasa 0,03 U/gl y 5000 copias de molde de ADN genómico.
El ensayo de qPCR interno se llevó a cabo usando 2 métodos; un perfil de temperatura que replica la tecnología de qSTAR o el de la qPCR convencional. En el método de qSTAR, la temperatura de las reacciones se controló entre dos temperaturas discretas para aprovechar las actividades de las enzimas. La fase de inicio, sustancialmente (solo actividad de polimerasa), era a la temperatura elevada de 62°C durante dos segundos. La fase exponencial (polimerasa y actividad de la enzima de mellado) era más cerca de la temperatura óptima para la actividad de la enzima de mellado a 57°C durante cinco segundos. El tiempo total para una oscilación completa era de 15 segundos, que es más del doble de los tiempos de permanencia a la temperatura máxima y mínima debido a los límites del aparato en el cambio de temperatura. Las reacciones de qPCR se llevaron a cabo usando un programa de 2 etapas; 95°C durante quince segundos seguido de 60°C durante sesenta segundos, ciclo 50 veces. La amplificación y detección del producto de qSTAR se realizaron con el aparato Agilent Mx3005P qPCR (Agilent).
Resultados
En las figuras 10A-B, se muestran los datos en tiempo real para la amplificación por qPCR de cinco mil copias de ADN genómico de Chlamydia trachomatis en comparación con el control sin diana ("ntc"). Se ve claramente la amplificación o actividad de todas las polimerasas usando este método de qPCR. También se debe observar que tres de las cuatro polimerasas muestran actividad en las condiciones sin diana, lo que probablemente se deba a la formación de dímeros de cebadores. Si el método de qSTAR fuera similar a la qPCR o a tecnologías de amplificación de ciclos térmicos descritas previamente, cabría esperar que todas o como mínimo una de estas polimerasas fuera activa usando el método qSTAR.
En las figuras 11A-11D, los datos en tiempo real demuestran la incapacidad de las cuatro polimerasas antes mencionadas para mostrar cualquier actividad en reacciones sin diana o usando 10, 100, 1K, 10k copias de ADN genómico de Chlamydia trachomatis bajo el protocolo de oscilación de temperatura de qSTAR. Es sorprendente que ninguna de estas polimerasas, usándose todas en sus intervalos de temperatura óptimos, es capaz de mostrar incluso una pequeña cantidad de actividad durante el transcurso de la incubación. Sin limitarse los autores de la invención a ninguna teoría en particular, se cree que esto se debe a lo siguiente; (a) las condiciones de qSTAR requieren polimerasas de desplazamiento de cadena que trabajen junto con enzimas de mellado; sin esta combinación de enzimas, la amplificación no puede continuar porque el recambio de producto no puede progresar; y (b) la PCR y otros métodos de ciclos se basan en temperaturas elevadas (~95°C) para separar las cadenas de los amplicones para el avance de la amplificación; dado que el método de qSTAR no usa dicha temperatura tan elevada y, en su lugar, usa una oscilación de temperatura más moderada para controlar la actividad enzimática (en lugar de para la separación de cadenas), podría ayudar a explicar la incapacidad de cualquiera de estas enzimas para mostrar cualquier actividad en las condiciones del protocolo de qSTAR.
Ejemplo 7: resultados de qSTAR frente a qPCR
Para demostrar la naturaleza cuantitativa de la qSTAR, se llevó a cabo una comparación frente a la qPCR. Si la qSTAR es cuantitativa, se esperaría que la tecnología tuviera un alto coeficiente de determinación y pudiera predecir correctamente la cantidad de aDn genómico en muestras con ocultación en comparación con la qPCR.
Diseño de ensayo de qPCR de C. trachomatis, mezcla maestra y oligonucleótidos:
Se diseñaron oligonucleótidos sintéticos (1) para el ensayo de qPCR de C. trachomatis (CtP) para la amplificación del ADN genómico de Chlamydia Trachomatis. El ensayo implica el uso de tres oligonucleótidos; un oligo de cebado directo, un oligo de cebado inverso y una sonda con doble marcado. Los oligonucleótidos fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). La mezcla maestra de PCR usada, PrimeTime Gene Expression Master Mix (P/N 1055770), se adquirió de Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). El ADN genómico de Chlamydia Trachomatis (cepa: UW-36/Cx) (P/N VR-886D) se adquirió a través de ATCC (Manassas, VA).
Condiciones del ensayo de la qPCR de C. trachomatis
La mezcla básica de ensayo de la qPCR (CtP) contenía dos cebadores, polimerasa y ADN genómico. Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 25 gl, que incluía cebador directo 0,3 gM, cebador inverso 0,3 gM, sonda con doble marcado 0,1 gM, 1X mezcla maestra de PCR comercial y varias concentraciones de molde de ADN genómico a partir de 100.000 copias. Las curvas de calibración se generaron usando diluciones de 10 veces del ADN genómico. La qSTAR se llevó a cabo como se ha descrito previamente junto con las curvas de calibración anteriores. Las reacciones de qPCR se llevaron a cabo usando un programa de 2 etapas; 95°C durante quince segundos seguido de 60°C durante sesenta segundos, ciclo 50x veces.
Resultados
La figura 12 muestra los datos en tiempo real de la qPCR para la curva de calibración y 5 muestras desconocidas. El coeficiente de determinación de la curva de calibración era 0,9984, a lo largo de un intervalo de 5 log. La qPCR pudo predecir correctamente las cinco muestras desconocidas. La figura 13 muestra los datos en tiempo real de la qSTAR para la curva de calibración y cinco muestras desconocidas. El coeficiente de determinación de la curva de calibración era 0,9981, a lo largo de un intervalo de 6 log. La qSTAR pudo predecir correctamente las cinco muestras desconocidas. La tabla 2 muestra una comparación resumida de las dos tecnologías; está claro a partir del resumen que qSTAR es comparable a qPCR cuando se usa la tecnología para la cuantificación.
Tabla 2
Figure imgf000020_0001
Ejemplo 8: Intervalos de temperatura elevada de qSTAR
Otro beneficio de la tecnología de qSTAR es la capacidad de amplificar a lo largo de varios intervalos de temperatura. Como se describe en las patentes de EE. UU. n° 5.712.124, 9.562.263, 5.399.391 y 6.814.943, la mayoría de las tecnologías tienen un intervalo de temperatura ajustado en el que puede producirse la amplificación, y la desviación de estos intervalos inhibe la reacción. Para demostrar la versatilidad de qSTAR, se llevaron a cabo amplificaciones como se describe en la Tabla 3 a continuación.
Tabla 3
Figure imgf000020_0002
Las figuras 14A, 14B, 14C y 14D son gráficos de fluorescencia (unidades arbitrarias) frente al tiempo (minutos). La figura 14A muestra los resultados para las reacciones que comienzan a 63°C. La figura 14B muestra los resultados para las reacciones que comienzan a 64°C. La figura 14C muestra los resultados para las reacciones que comienzan a 65°C y la figura 14D muestra los resultados para las reacciones que comienzan a 66°C. En todos los casos, las reacciones de control negativo "sin diana" no generaron ninguna señal de fluorescencia, mientras que hubo una buena amplificación para 10, 100 y 1000 copias. Aunque la señal de fluorescencia era ligeramente superior para la reacción a 63°C, todas las condiciones de temperatura demostraron una amplificación fuerte en menos de 3 minutos. Siempre que se logre la modulación enzimática, el método de qSTAR puede amplificar bien. Se cree que cualquier temperatura por encima de 62°C reduce significativamente la actividad de la enzima de mellado (con respecto a la enzima de mellado de ejemplo, Nt. Bst NBI).
Ejemplo 9: qSTAR fuera de intervalos de temperatura conocidos
La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), como se describe en la patente de EE. UU. 6.814.943, describe intervalos de temperatura para ciclos térmicos. Típicamente, para qPCR se lleva a cabo el siguiente procedimiento: desnaturalización aproximadamente a 95°C, reasociación aproximadamente a 55°C, extensión aproximadamente a 702C. Sería sorprendente e inesperado si una tecnología pudiera amplificar en regiones de temperatura claramente diferentes. Además, las personas con conocimientos en la técnica no esperarían una ventana de temperatura tan grande para que funcionara una tecnología. El documento WO 2011/030145A1 describe "bamboleo" en el que la temperatura del ensayo oscila alrededor de un punto de referencia de temperatura isotérmica publicado de no más de 15°C, pero más preferiblemente alrededor de 5°C. Esta "oscilación" de temperatura para algunas tecnologías isotérmicas ha permitido mejorar la cinética de amplificación. Sería sorprendente si qSTAR fuera capaz de trabajar en intervalos de temperatura considerablemente diferentes y aun así lograr la amplificación.
Condiciones de amplificación
La mezcla de qSTAR a baja temperatura contenía dos cebadores (SEQ ID NO: 11 (5'-tGACTCCAcAcGGAGTCataaATCCTGCTGCmUA-3') y SEQ ID NO: 12 (5'-TGACTCCAcAcGGAGTCAGAACCAACAAGAAGA-3')), polimerasa Isopol suministrada por ArticZymes (Tromso, Noruega), y enzima de mellado (mencionada anteriormente). Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 25 pl, que incluía 1,0 pM del cebador directo, 0,5 pM del cebador inverso, 0,25 pM de baliza molecular (SEQ ID NO: 13 (5'-/56-FAM/tgaggTGCTGCTATGCCTCA/3IABkFQ/-3')), 10 pl de mezcla maestra de qSTAR y 5 pl de muestra de ADN. La mezcla maestra de qSTAR contenía los siguientes reactivos; MgSO412,5 mM, Tris-HCl 90 mM (pH 8,5), 300 pM de cada dNTP, NH4OAc 20 mM, NaOAc 30 mM, DTT 2 mM, Triton X-100 al 0,02%, endonucleasa de mellado 12,5 U, polimerasa 75 U. La temperatura de las reacciones se controló entre dos fases de temperatura discretas para aprovechar las actividades enzimáticas inherentes. La fase exponencial, que consiste principalmente en actividad de polimerasa y de mellado, era a la temperatura elevada de 45°C durante dos segundos. La fase de inicio, en la que la polimerasa es muy activa y la enzima de mellado tiene una actividad muy reducida, se mantuvo a 38°C durante cinco segundos. El tiempo total para una oscilación completa era de 15 segundos, que es más del doble de los tiempos de permanencia en cada una de las temperaturas máxima y mínima debido a los límites del aparato en el cambio de temperatura. La amplificación y la detección del producto de qSTAR se realizaron con el aparato Agilent Mx3005P qPCR (Agilent).
Resultados
La figura 15 muestra datos cuantitativos en tiempo real para la amplificación por qSTAR en el intervalo mencionado anteriormente. Lo primero que debe notarse es que, en este ejemplo, en comparación con los ejemplos anteriores, las fases de temperatura se han cambiado: la fase de temperatura más alta es para la amplificación exponencial, en la que ambas enzimas son activas, mientras que la temperatura más baja es para el inicio, en el que la polimerasa es muy activa y la enzima de mellado está relativamente inhibida. La diferencia de temperatura entre qSTAR y dicha qSTAR de "baja temperatura" es de 24°C. Es sorprendente e inesperado que una tecnología pueda funcionar en un intervalo tan amplio de temperaturas y demuestra además que este método de amplificación es diferente a cualquier método de amplificación conocido previamente, según el mejor conocimiento de los autores de la invención.
Sin limitar a los autores de la invención a ninguna teoría en particular, se cree que qSTAR todavía puede lograr la amplificación a estas temperaturas bajas porque la actividad de la enzima de mellado se reduce en gran medida a la temperatura inferior. Esta delimitación de enzimas permite la amplificación controlada y precisa de moldes y los autores de la invención pueden prever muchas formas en las que se pueden usar múltiples enzimas, cebadores y esquemas de temperatura en una sola reacción para lograr resultados nuevos, rápidos y cuantitativos.
Ejemplo 10: Resultados usando ácido ribonucleico
qSTAR puede amplificar a partir de cualquier ácido nucleico, usando cualquier composición de ADN (ADNC y ADNg), ArN (ARNm, ARNt, ARNr, ARNip, microARN), análogos de ARN/ADN, análogos de azúcar, híbridos, ácido nucleico de poliamida y otros análogos conocidos. La amplificación del ARN ribosómico se llevó a cabo como se describe a continuación.
Enzimas, oligonucleótidos y diana:
Se usó Listeria monocytogenes como diana para el desarrollo de un ensayo de ARN de qSTAR. El ADN genómico de Listeria monocytogenes (ATCC VR-886) se adquirió de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Se realizó un cribado inicial en el ADNg y se encontró que una región 23S de ARN ribosómico era amplificada con los cebadores LMONF72 ACAC 5-OM (SEQ ID NO: 14, 5'-GGACTCGACACCGAGTCCAGTTACGATTmTmGmTmTmG-3') y LMONR86 ATAT (SEQ ID NO: 15, 5'- gGACTCCATATGGAGTCCTACGGCTCCGCTTTT-3'). El molde de ADN resultante se detectó usando una baliza molecular LMONMB1 (SEQ ID NO: 16, 5'-FAM/gctgcGTTCCAATTCGCCTTTTTCGCagc/BHQ1-3') como se describe en el documento EP N° 0728218.
El ARN total se aisló usando el mini kit RNeasy Plus Qiagen (Hilden, Alemania) combinado con lisis mecánica rápida en un molino Mini Bead 4 (VWR). Listeria monocytogenes (ATCC BAA-2660) se adquirió de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se revivió cultivando en placas de agar de infusión de cerebro y corazón (BHI). Se usó una sola colonia para inocular 25 ml de medio BHI que se cultivó durante 18 horas a 37°C hasta alcanzar la fase estacionaria. Después, el cultivo se diluyó de nuevo en dos porciones de 50 ml de BHI en matraces de 250 ml y se cultivó durante cuatro horas adicionales antes de la recolección. Las bacterias se recogieron de dos partes alícuotas de 30 ml del cultivo vuelto a diluir a 5000xg durante 15 min. Los sedimentos se volvieron a suspender y se combinaron

Claims (23)

REIVINDICACIONES
1. Un método para llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos no isotérmica, comprendiendo el método las etapas de:
(a) mezclar una secuencia diana con uno o más cebadores monocatenarios complementarios en condiciones que permitan un suceso de hibridación en el que los cebadores hibridan con la diana, cuyo suceso de hibridación conduce, directa o indirectamente, a la formación de una estructura dúplex que comprende dos sitios de mellado dispuestos en o cerca de los extremos opuestos del dúplex; y llevar a cabo un procedimiento de amplificación mediante;
(b) el uso de una enzima de mellado para producir una mella en cada uno de dichos sitios de mellado en las cadenas del dúplex;
(c) el uso de una polimerasa para extender las cadenas melladas para formar así un ácido nucleico recién sintetizado, cuya extensión con la polimerasa recrea los sitios de mella;
(d) repetición de las etapas (b) y (c) según se desee para producir la producción de múltiples copias del ácido nucleico recién sintetizado;
caracterizado por que la temperatura a la que se lleva a cabo el método no es isotérmica y se somete a oscilación, una pluralidad de veces, entre una temperatura superior y una temperatura inferior durante el procedimiento de amplificación de las etapas (b)-(d), en donde a la temperatura superior, una de dicha polimerasa o enzima de mellado es más activa que la otra de dichas enzimas, de modo que hay una disparidad en la actividad de las enzimas, y a la temperatura inferior la disparidad en la actividad de las enzimas se reduce o invierte.
2. El método según la reivindicación 1, en donde en la etapa (a) la diana comprende dos cadenas complementarias de ácido nucleico, y el cebador comprende cebadores directos e inversos, cada uno de los cuales es complementario a una cadena respectiva de la diana, de modo que los extremos 3' de los cebadores directo e inverso están orientados uno hacia el otro.
3. El método según la reivindicación 1 o 2, en donde las etapas (b)-(d) se llevan a cabo sustancialmente inmediatamente después de la etapa (a), y en donde las etapas (a)-(d) se llevan a cabo preferiblemente en el mismo recipiente de reacción o en el mismo soporte sólido.
4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además la etapa de detectar, directa o indirectamente, el ácido nucleico recién sintetizado, y en donde dicha etapa de detección comprende preferiblemente el uso de una baliza molecular o un colorante fluorescente, una sonda marcada de flujo lateral, o una enzima que cataliza una reacción electroquímica.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cantidad de ácido nucleico recién sintetizado se cuantifica o mide durante la realización de la reacción de amplificación, preferiblemente en donde la cantidad de ácido nucleico recién sintetizado se usa para determinar la cantidad y/o concentración de la secuencia diana de una forma cuantitativa.
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la temperatura superior favorece relativamente la actividad de la polimerasa.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la temperatura superior favorece relativamente la actividad de la enzima de mellado.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la temperatura óptima de la polimerasa difiere de la temperatura óptima de la enzima de mellado en una cantidad en el intervalo de 10-30°C, preferiblemente de 10-25°C.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la temperatura superior está en el intervalo de 50-64°C, preferiblemente 55-63°C.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la temperatura inferior está en el intervalo de 20,0-58,5°C, preferiblemente en el intervalo de 35,0-57,9°C, más preferiblemente en el intervalo de 36,0-57,9°C, y lo más preferiblemente en el intervalo de 37,0-57,9°C.
11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la oscilación de temperatura se lleva a cabo continuamente durante una pluralidad de oscilaciones y preferiblemente a lo largo de un periodo de al menos dos minutos, más preferiblemente a lo largo de un periodo de al menos tres minutos.
12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde cada una de la pluralidad de oscilaciones es sustancialmente idéntica.
13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde cada uno de la pluralidad de oscilaciones de temperatura tiene una duración en el intervalo de 5-60 segundos, preferiblemente 5-45 segundos, más preferiblemente 5-30 segundos y lo más preferiblemente 5-20 segundos.
14. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde cada una de la pluralidad de oscilaciones de temperatura tiene un tiempo de permanencia a la temperatura superior en el intervalo de 1-10 segundos, preferiblemente 1-5 segundos.
15. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde cada una de la pluralidad de oscilaciones de temperatura tiene un tiempo de permanencia a la temperatura inferior en el intervalo de 2-40 segundos, preferiblemente 2-30 segundos.
16. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde cada una de la pluralidad de oscilaciones de temperatura tiene un tiempo de transición entre la temperatura inferior y la temperatura superior en el intervalo de 0,5-10 segundos, preferiblemente en el intervalo de 1-5 segundos.
17. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa (a) está precedida por la realización de una etapa de transcripción inversa, que comprende poner en contacto un analito de ARN de interés con una transcriptasa inversa para formar así un transcrito de ADN del analito de ARN de interés, y preferiblemente que comprende además la etapa de producir ADN bicatenario a partir del transcrito de ADN.
18. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además una etapa de preamplificación o enriquecimiento.
19. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde uno o más de los cebadores comprende un nucleótido modificado, preferiblemente en donde el nucleótido modificado está en una parte del cebador complementaria de la diana.
20. El método según la reivindicación 19, en donde uno o más cebadores comprenden un nucleótido modificado en 2', preferiblemente un nucleótido modificado con 2' O-metilo, y preferiblemente una pluralidad de nucleótidos modificados con 2' O-metilo.
21. El método según la reivindicación 20, en donde uno o más cebadores comprenden hasta siete nucleótidos modificados con 2' O-metilo.
22. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde uno o más de los cebadores comprenden una parte autocomplementaria, preferiblemente en donde la parte autocomplementaria forma una estructura de horquilla, comprendiendo dicha horquilla preferiblemente de 5 a 10 pares de bases.
23. Un método para determinar la cantidad y/o concentración de un polinucleótido diana en una muestra, comprendiendo el método los etapas de: llevar a cabo la reacción de amplificación según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para amplificar el polinucleótido diana en la muestra; y detectar, de una manera cuantitativa, el/los producto/s directo/s o indirecto/s de la reacción de amplificación, para permitir así una determinación de la cantidad y/o concentración del polinucleótido diana en la muestra.
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