ES2908296T3 - Microalgas adaptadas a condiciones de cultivo heterótrofas - Google Patents
Microalgas adaptadas a condiciones de cultivo heterótrofas Download PDFInfo
- Publication number
- ES2908296T3 ES2908296T3 ES18199852T ES18199852T ES2908296T3 ES 2908296 T3 ES2908296 T3 ES 2908296T3 ES 18199852 T ES18199852 T ES 18199852T ES 18199852 T ES18199852 T ES 18199852T ES 2908296 T3 ES2908296 T3 ES 2908296T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- strain
- seq
- microalgae
- strains
- fatty acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 108
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 90
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 36
- 101710132674 Monosaccharide transporter Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims abstract description 12
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 claims description 83
- 108020002982 thioesterase Proteins 0.000 claims description 76
- 241001074118 Prototheca moriformis Species 0.000 claims description 75
- 102000005488 Thioesterase Human genes 0.000 claims description 69
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 66
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 66
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 66
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 61
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 53
- 101710154134 Stearoyl-[acyl-carrier-protein] 9-desaturase, chloroplastic Proteins 0.000 claims description 37
- 241000195645 Auxenochlorella protothecoides Species 0.000 claims description 33
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 29
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 25
- 241000196250 Prototheca Species 0.000 claims description 24
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 claims description 19
- 108010087894 Fatty acid desaturases Proteins 0.000 claims description 19
- PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N alpha-D-ara-dHexp Natural products OCC1OC(O)CC(O)C1O PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 240000005636 Dryobalanops aromatica Species 0.000 claims description 18
- 102000009114 Fatty acid desaturases Human genes 0.000 claims description 17
- DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N (R)-camphor Chemical compound C1C[C@@]2(C)C(=O)C[C@@H]1C2(C)C DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N 0.000 claims description 16
- 241000195649 Chlorella <Chlorellales> Species 0.000 claims description 14
- 241001149163 Ulmus americana Species 0.000 claims description 14
- 240000006262 Cuphea hookeriana Species 0.000 claims description 10
- 241000167559 Cuphea palustris Species 0.000 claims description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 8
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 8
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 7
- 108700021044 acyl-ACP thioesterase Proteins 0.000 claims description 6
- 125000004050 enoyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 6
- 108700037654 Acyl carrier protein (ACP) Proteins 0.000 claims description 4
- 102000048456 Acyl carrier protein (ACP) Human genes 0.000 claims description 4
- 244000050403 Iris x germanica Species 0.000 claims description 4
- 235000002971 Iris x germanica Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 4
- 241000219919 Cuphea lanceolata Species 0.000 claims description 3
- 244000270834 Myristica fragrans Species 0.000 claims description 3
- 235000009421 Myristica fragrans Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 claims description 3
- LPMXVESGRSUGHW-UHFFFAOYSA-N Acolongiflorosid K Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1CC2(O)CCC3C4(O)CCC(C=5COC(=O)C=5)C4(C)CC(O)C3C2(CO)C(O)C1 LPMXVESGRSUGHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 claims description 2
- LPMXVESGRSUGHW-GHYGWZAOSA-N Ouabain Natural products O([C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O1)[C@H]1C[C@@H](O)[C@@]2(CO)[C@@](O)(C1)CC[C@H]1[C@]3(O)[C@@](C)([C@H](C4=CC(=O)OC4)CC3)C[C@@H](O)[C@H]21 LPMXVESGRSUGHW-GHYGWZAOSA-N 0.000 claims description 2
- 229940126902 Phlorizin Drugs 0.000 claims description 2
- 244000166550 Strophanthus gratus Species 0.000 claims description 2
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 claims description 2
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 claims description 2
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 claims description 2
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003343 ouabain Drugs 0.000 claims description 2
- LPMXVESGRSUGHW-HBYQJFLCSA-N ouabain Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C[C@@]2(O)CC[C@H]3[C@@]4(O)CC[C@H](C=5COC(=O)C=5)[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@@H]3[C@@]2(CO)[C@H](O)C1 LPMXVESGRSUGHW-HBYQJFLCSA-N 0.000 claims description 2
- IOUVKUPGCMBWBT-UHFFFAOYSA-N phloridzosid Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC(O)=CC(O)=C1C(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 IOUVKUPGCMBWBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- IOUVKUPGCMBWBT-GHRYLNIYSA-N phlorizin Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(O)=CC(O)=C1C(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 IOUVKUPGCMBWBT-GHRYLNIYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000019139 phlorizin Nutrition 0.000 claims description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims 6
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims 3
- 101000935487 Agrobacterium fabrum (strain C58 / ATCC 33970) 3-oxopimeloyl-[acyl-carrier-protein] synthase Proteins 0.000 claims 1
- 241000218199 Umbellularia Species 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 64
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 abstract description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 104
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 95
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 95
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 72
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 71
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 70
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 69
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 63
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 63
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 63
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 57
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 56
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 51
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 50
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 49
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 48
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 45
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 45
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 44
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 44
- 239000000047 product Substances 0.000 description 44
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 36
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 35
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 32
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 32
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 31
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 31
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 28
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 28
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 26
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 25
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 25
- 101710184309 Probable sucrose-6-phosphate hydrolase Proteins 0.000 description 24
- 101710112652 Sucrose-6-phosphate hydrolase Proteins 0.000 description 24
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 24
- GVEZIHKRYBHEFX-MNOVXSKESA-N 13C-Cerulenin Natural products CC=CCC=CCCC(=O)[C@H]1O[C@@H]1C(N)=O GVEZIHKRYBHEFX-MNOVXSKESA-N 0.000 description 23
- GVEZIHKRYBHEFX-UHFFFAOYSA-N caerulein A Natural products CC=CCC=CCCC(=O)C1OC1C(N)=O GVEZIHKRYBHEFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- GVEZIHKRYBHEFX-NQQPLRFYSA-N cerulenin Chemical compound C\C=C\C\C=C\CCC(=O)[C@H]1O[C@H]1C(N)=O GVEZIHKRYBHEFX-NQQPLRFYSA-N 0.000 description 23
- 229950005984 cerulenin Drugs 0.000 description 23
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 22
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 22
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 22
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 22
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 21
- 102100036049 T-complex protein 1 subunit gamma Human genes 0.000 description 20
- 101150062912 cct3 gene Proteins 0.000 description 20
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 20
- 101100119773 Arabidopsis thaliana FATA gene Proteins 0.000 description 19
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 19
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 19
- XEFQLINVKFYRCS-UHFFFAOYSA-N Triclosan Chemical compound OC1=CC(Cl)=CC=C1OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl XEFQLINVKFYRCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 19
- 239000000463 material Substances 0.000 description 19
- 102400000472 Sucrase Human genes 0.000 description 18
- 229960003500 triclosan Drugs 0.000 description 18
- 108010005155 delta-12 fatty acid desaturase Proteins 0.000 description 17
- -1 for example Substances 0.000 description 17
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 description 16
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 15
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 15
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 15
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 15
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 15
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 14
- 241000195597 Chlamydomonas reinhardtii Species 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 13
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 13
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 13
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 13
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 10
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 10
- 240000009108 Chlorella vulgaris Species 0.000 description 9
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 9
- 229940025250 camphora Drugs 0.000 description 9
- 239000010238 camphora Substances 0.000 description 9
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 9
- VUFNLQXQSDUXKB-DOFZRALJSA-N 2-[4-[4-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]butanoyloxy]ethyl (5z,8z,11z,14z)-icosa-5,8,11,14-tetraenoate Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)OCCOC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 VUFNLQXQSDUXKB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 8
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 8
- 235000015191 beet juice Nutrition 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- HBROZNQEVUILML-UHFFFAOYSA-N salicylhydroxamic acid Chemical compound ONC(=O)C1=CC=CC=C1O HBROZNQEVUILML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000007089 Chlorella vulgaris Nutrition 0.000 description 7
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 description 7
- NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N Potassium ion Chemical compound [K+] NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 7
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 7
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 6
- 101100119780 Arabidopsis thaliana FATB gene Proteins 0.000 description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 6
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 6
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 6
- 244000025271 Umbellularia californica Species 0.000 description 6
- WCDYMMVGBZNUGB-ORPFKJIMSA-N [(2r,3r,4s,5r,6r)-6-[[(1r,3r,4r,5r,6r)-4,5-dihydroxy-2,7-dioxabicyclo[4.2.0]octan-3-yl]oxy]-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]methyl 3-hydroxy-2-tetradecyloctadecanoate Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](COC(=O)C(CCCCCCCCCCCCCC)C(O)CCCCCCCCCCCCCCC)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]2OC[C@H]2O1 WCDYMMVGBZNUGB-ORPFKJIMSA-N 0.000 description 6
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 6
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 6
- OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-methylcholesta-5,22-dien-3beta-ol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(C)C(C)C)C1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JKMPXGJJRMOELF-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazole-2,4,5-tricarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1=NC(C(O)=O)=C(C(O)=O)S1 JKMPXGJJRMOELF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 5
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 5
- 101150083108 FATB1 gene Proteins 0.000 description 5
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 5
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 5
- ICUTUKXCWQYESQ-UHFFFAOYSA-N triclocarban Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1NC(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 ICUTUKXCWQYESQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YRIZYWQGELRKNT-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-trichloro-1,3,5-triazinane-2,4,6-trione Chemical compound ClN1C(=O)N(Cl)C(=O)N(Cl)C1=O YRIZYWQGELRKNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 7-Dehydrostigmasterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 4
- 102100040870 Glycine amidinotransferase, mitochondrial Human genes 0.000 description 4
- BTEISVKTSQLKST-UHFFFAOYSA-N Haliclonasterol Natural products CC(C=CC(C)C(C)(C)C)C1CCC2C3=CC=C4CC(O)CCC4(C)C3CCC12C BTEISVKTSQLKST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000893303 Homo sapiens Glycine amidinotransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 4
- FSNCEEGOMTYXKY-JTQLQIEISA-N Lycoperodine 1 Natural products N1C2=CC=CC=C2C2=C1CN[C@H](C(=O)O)C2 FSNCEEGOMTYXKY-JTQLQIEISA-N 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 108020004166 alternative oxidase Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 244000213578 camo Species 0.000 description 4
- 235000009120 camo Nutrition 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- KZJWDPNRJALLNS-FBZNIEFRSA-N clionasterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 KZJWDPNRJALLNS-FBZNIEFRSA-N 0.000 description 4
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 4
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 4
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 4
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 4
- 239000003346 palm kernel oil Substances 0.000 description 4
- 235000019865 palm kernel oil Nutrition 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 4
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 4
- HCXVJBMSMIARIN-PHZDYDNGSA-N stigmasterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 HCXVJBMSMIARIN-PHZDYDNGSA-N 0.000 description 4
- BFDNMXAIBMJLBB-UHFFFAOYSA-N stigmasterol Natural products CCC(C=CC(C)C1CCCC2C3CC=C4CC(O)CCC4(C)C3CCC12C)C(C)C BFDNMXAIBMJLBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100039164 Acetyl-CoA carboxylase 1 Human genes 0.000 description 3
- 101710146995 Acyl carrier protein Proteins 0.000 description 3
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 3
- SGNBVLSWZMBQTH-FGAXOLDCSA-N Campesterol Natural products O[C@@H]1CC=2[C@@](C)([C@@H]3[C@H]([C@H]4[C@@](C)([C@H]([C@H](CC[C@H](C(C)C)C)C)CC4)CC3)CC=2)CC1 SGNBVLSWZMBQTH-FGAXOLDCSA-N 0.000 description 3
- 101100119778 Cuphea viscosissima FATB2 gene Proteins 0.000 description 3
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 3
- 101000963424 Homo sapiens Acetyl-CoA carboxylase 1 Proteins 0.000 description 3
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 3
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 3
- HZYXFRGVBOPPNZ-UHFFFAOYSA-N UNPD88870 Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)=CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 HZYXFRGVBOPPNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N beta-Sitostanol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SGNBVLSWZMBQTH-PODYLUTMSA-N campesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@@H](C)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 SGNBVLSWZMBQTH-PODYLUTMSA-N 0.000 description 3
- 235000000431 campesterol Nutrition 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000002190 fatty acyls Chemical group 0.000 description 3
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 210000002374 sebum Anatomy 0.000 description 3
- NLQLSVXGSXCXFE-UHFFFAOYSA-N sitosterol Natural products CC=C(/CCC(C)C1CC2C3=CCC4C(C)C(O)CCC4(C)C3CCC2(C)C1)C(C)C NLQLSVXGSXCXFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229950005143 sitosterol Drugs 0.000 description 3
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 235000016831 stigmasterol Nutrition 0.000 description 3
- 229940032091 stigmasterol Drugs 0.000 description 3
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 3
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FMKJUUQOYOHLTF-OWOJBTEDSA-N (e)-4-azaniumylbut-2-enoate Chemical compound NC\C=C\C(O)=O FMKJUUQOYOHLTF-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- JTTIOYHBNXDJOD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-triaminopyrimidine Chemical compound NC1=CC(N)=NC(N)=N1 JTTIOYHBNXDJOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100025230 2-amino-3-ketobutyrate coenzyme A ligase, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100039217 3-ketoacyl-CoA thiolase, peroxisomal Human genes 0.000 description 2
- SYQNUQSGEWNWKV-XUIVZRPNSA-N 4-hydroxy-3,5-dimethyl-5-(2-methyl-buta-1,3-dienyl)-5h-thiophen-2-one Chemical compound C=CC(/C)=C/[C@@]1(C)SC(=O)C(C)=C1O SYQNUQSGEWNWKV-XUIVZRPNSA-N 0.000 description 2
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- SNSZJFZKAOZQQC-OLVFGWLSSA-N 5'-GAGACCC-3' RNA fragment Chemical compound Nc1ccn([C@@H]2O[C@H](COP(O)(=O)O[C@@H]3[C@@H](COP(O)(=O)O[C@@H]4[C@@H](COP(O)(=O)O[C@@H]5[C@@H](COP(O)(=O)O[C@@H]6[C@@H](COP(O)(=O)O[C@@H]7[C@@H](COP(O)(=O)O[C@@H]8[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]8O)n8cnc9c8[nH]c(N)nc9=O)O[C@H]([C@@H]7O)n7cnc8c(N)ncnc78)O[C@H]([C@@H]6O)n6cnc7c6[nH]c(N)nc7=O)O[C@H]([C@@H]5O)n5cnc6c(N)ncnc56)O[C@H]([C@@H]4O)n4ccc(N)nc4=O)O[C@H]([C@@H]3O)n3ccc(N)nc3=O)[C@@H](O)[C@H]2O)c(=O)n1 SNSZJFZKAOZQQC-OLVFGWLSSA-N 0.000 description 2
- SYQNUQSGEWNWKV-UHFFFAOYSA-N 5R-Thiolactomycin Natural products C=CC(C)=CC1(C)SC(=O)C(C)=C1O SYQNUQSGEWNWKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 2
- 241000023308 Acca Species 0.000 description 2
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 2
- 108010087522 Aeromonas hydrophilia lipase-acyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000609240 Ambelania acida Species 0.000 description 2
- 101100478627 Arabidopsis thaliana S-ACP-DES2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100480489 Arabidopsis thaliana TAAC gene Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000003285 Caltha palustris Species 0.000 description 2
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100040004 Gamma-glutamylcyclotransferase Human genes 0.000 description 2
- 241000371004 Graesiella emersonii Species 0.000 description 2
- 101100153048 Homo sapiens ACAA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000886680 Homo sapiens Gamma-glutamylcyclotransferase Proteins 0.000 description 2
- 101000724418 Homo sapiens Neutral amino acid transporter B(0) Proteins 0.000 description 2
- 101000601661 Homo sapiens Paired box protein Pax-7 Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101100264174 Mus musculus Xiap gene Proteins 0.000 description 2
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000195659 Neodesmus pupukensis Species 0.000 description 2
- 102100028267 Neutral amino acid transporter B(0) Human genes 0.000 description 2
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 102100037503 Paired box protein Pax-7 Human genes 0.000 description 2
- 108010035473 Palmitoyl-CoA Hydrolase Proteins 0.000 description 2
- 102000008172 Palmitoyl-CoA Hydrolase Human genes 0.000 description 2
- 101001135788 Pinus taeda (+)-alpha-pinene synthase, chloroplastic Proteins 0.000 description 2
- 101150038966 SAD2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102100028644 Tenascin-R Human genes 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 235000008674 Umbellularia californica Nutrition 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000010905 bagasse Substances 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N beta-sitosterol Natural products CCC(CCC(C)C1CCC2(C)C3CC=C4CC(O)CCC4C3CCC12C)C(C)C NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 2
- 238000002242 deionisation method Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 239000011121 hardwood Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000011122 softwood Substances 0.000 description 2
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000003760 tallow Substances 0.000 description 2
- 108010020387 tenascin R Proteins 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- 239000002916 wood waste Substances 0.000 description 2
- RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N (22E)-cholesta-5,7,22-trien-3beta-ol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CCC(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGNBVLSWZMBQTH-ZRUUVFCLSA-N 24-epicampesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@H](C)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 SGNBVLSWZMBQTH-ZRUUVFCLSA-N 0.000 description 1
- NOEGNKMFWQHSLB-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxymethylfurfural Chemical compound OCC1=CC=C(C=O)O1 NOEGNKMFWQHSLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100020925 Adenosylhomocysteinase Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OILXMJHPFNGGTO-NRHJOKMGSA-N Brassicasterol Natural products O[C@@H]1CC=2[C@@](C)([C@@H]3[C@H]([C@H]4[C@](C)([C@H]([C@@H](/C=C/[C@H](C(C)C)C)C)CC4)CC3)CC=2)CC1 OILXMJHPFNGGTO-NRHJOKMGSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 101710184216 Cardioactive peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001625972 Cephalosporium caerulens Species 0.000 description 1
- 241000701248 Chlorella virus Species 0.000 description 1
- YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N Citric acid monohydrate Chemical compound O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001495477 Cuphea wrightii Species 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N Ergosterol Natural products CC(C)[C@@H](C)C=C[C@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@@H]3CC[C@]12C DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241001123946 Gaga Species 0.000 description 1
- 101000716952 Homo sapiens Adenosylhomocysteinase Proteins 0.000 description 1
- 101000957437 Homo sapiens Mitochondrial carnitine/acylcarnitine carrier protein Proteins 0.000 description 1
- 101001128634 Homo sapiens NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 2, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000666730 Homo sapiens T-complex protein 1 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- PNLQLFIVEMDDQE-UHFFFAOYSA-N Leucomelon Natural products O=C1C(O)=C(C=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)C(O)=C1C1=CC=C(O)C(O)=C1 PNLQLFIVEMDDQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 240000003433 Miscanthus floridulus Species 0.000 description 1
- 102100038738 Mitochondrial carnitine/acylcarnitine carrier protein Human genes 0.000 description 1
- 102100032194 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 2, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241001579016 Nanoa Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N Nitroglycerin Chemical compound [O-][N+](=O)OCC(O[N+]([O-])=O)CO[N+]([O-])=O SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 229940087098 Oxidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241001520808 Panicum virgatum Species 0.000 description 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 1
- HCXVJBMSMIARIN-LWINXXIXSA-N Poriferasterol Natural products CC[C@H](C=C[C@H](C)[C@H]1CC[C@H]2[C@@H]3CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C)C(C)C HCXVJBMSMIARIN-LWINXXIXSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241001656951 Protheca Species 0.000 description 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 101100183521 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) MEP3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038410 T-complex protein 1 subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- GFKPPJZEOXIRFX-UHFFFAOYSA-N TCA A Natural products CC(CCC(=O)O)C1=CCC2(C)OC3=C(CC12)C(=O)C(O)CC3 GFKPPJZEOXIRFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- OILXMJHPFNGGTO-ZRUUVFCLSA-N UNPD197407 Natural products C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)C=C[C@H](C)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-ZRUUVFCLSA-N 0.000 description 1
- 101100119784 Umbellularia californica FATB1 gene Proteins 0.000 description 1
- YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N acetylacetone Chemical compound CC(=O)CC(C)=O YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 101150082675 amt3 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FKQQKMGWCJGUCS-UHFFFAOYSA-N atromentin Chemical compound O=C1C(O)=C(C=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)C(O)=C1C1=CC=C(O)C=C1 FKQQKMGWCJGUCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AAEDGQBSNHENEM-UHFFFAOYSA-N atromentin Natural products OCC1(O)C2=C(C(=O)C(=C(C2=O)c3ccc(O)cc3)O)c4ccc(O)cc14 AAEDGQBSNHENEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 1
- OILXMJHPFNGGTO-ZAUYPBDWSA-N brassicasterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)/C=C/[C@H](C)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-ZAUYPBDWSA-N 0.000 description 1
- 235000004420 brassicasterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229940097217 cardiac glycoside Drugs 0.000 description 1
- 239000002368 cardiac glycoside Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960002303 citric acid monohydrate Drugs 0.000 description 1
- 238000010954 commercial manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000008406 cosmetic ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000008995 epigenetic change Effects 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N ergosterol Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H](CC[C@]3([C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](C)C(C)C)CC[C@H]33)C)C3=CC=C21 DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- AEOCXXJPGCBFJA-UHFFFAOYSA-N ethionamide Chemical compound CCC1=CC(C(N)=S)=CC=N1 AEOCXXJPGCBFJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002001 ethionamide Drugs 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 101150045241 fatA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 230000037442 genomic alteration Effects 0.000 description 1
- 150000002303 glucose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M hexadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- RJGBSYZFOCAGQY-UHFFFAOYSA-N hydroxymethylfurfural Natural products COC1=CC=C(C=O)O1 RJGBSYZFOCAGQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 230000004132 lipogenesis Effects 0.000 description 1
- 235000015073 liquid stocks Nutrition 0.000 description 1
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000010813 municipal solid waste Substances 0.000 description 1
- CJWXCNXHAIFFMH-AVZHFPDBSA-N n-[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r)-2-acetamido-4,5,6-trihydroxy-1-oxohexan-3-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-methyloxan-4-yl]acetamide Chemical compound C[C@H]1O[C@@H](O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@@H]1O CJWXCNXHAIFFMH-AVZHFPDBSA-N 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 150000003109 potassium Chemical class 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- JETDZFFCRPFPDH-UHFFFAOYSA-N quinacrine mustard dihydrochloride Chemical compound [H+].[H+].[Cl-].[Cl-].C1=C(Cl)C=CC2=C(NC(C)CCCN(CCCl)CCCl)C3=CC(OC)=CC=C3N=C21 JETDZFFCRPFPDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 229930002534 steroid glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000008143 steroidal glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000010907 stover Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229940057070 sugarcane extract Drugs 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229960001325 triclocarban Drugs 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N tris phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(N)(CO)CO JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/89—Algae ; Processes using algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
- C12N1/125—Unicellular algae isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Botany (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Método para producir una cepa de microalgas mejorada que tiene al menos una mejora del 5 % en el contenido de aceite con respecto a una cepa de microalgas original, donde el método comprende cultivar una cepa de microalgas original en presencia de un inhibidor de un transportador de monosacáridos y aislar una cepa de microalgas mejorada que es capaz de crecer en presencia del inhibidor del transportador de monosacáridos y que tiene al menos una mejora del 5 % en el contenido de aceite en comparación con una cepa de microalgas original.
Description
DESCRIPCIÓN
Microalgas adaptadas a condiciones de cultivo heterótrofas
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Financiación gubernamental
[0001] Algunas formas de realización de esta invención se realizaron con el apoyo del estado de California bajo la Subvención de la Comisión de Energía de California (California Energy Commission Grant) número pir-08-048. Dicho organismo tiene algunos derechos sobre esta invención.
Campo técnico
[0002] La presente invención se refiere a cepas de microalgas adaptadas a condiciones de cultivo heterótrofas y a métodos para producir tales cepas. Estas cepas son particularmente útiles para la producción de productos de cultivo como triglicéridos y ácidos grasos, así como productos derivados elaborados a partir de productos de cultivo, como productos oleoquímicos.
Antecedentes
[0003] Algunas microalgas son capaces de convertir fuentes de energía de carbono fijo en productos de mayor valor, como triglicéridos, ácidos grasos, carbohidratos y proteínas. Además, las propias microalgas pueden ser valiosas como fuente de alimento. Algunas especies de microalgas se han modificado genéticamente para producir "aceites modificados”, lo que significa que su contenido de triglicéridos muestra distribuciones de longitudes de cadena y saturación alteradas de ácidos grasos con respecto a las cepas de las que se derivaron. Véanse las publicaciones PCT n.° 2008/151149, 2009/126843, y 2010/045358. Si bien las cepas de Chlorella han sido el foco de muchos esfuerzos en el desarrollo de métodos de producción de triglicéridos, más recientemente se han identificado cepas del género Prototheca como aún más prometedoras como nuevas fuentes de triglicéridos, incluyendo los aceites modificados para aplicaciones específicas. Véanse las publicaciones PCT n.° 2010/063031 y 2010/063032 y las solicitudes PCT n.° US11/038463 y US11/038464.
[0004] Un desafío importante en el uso de microalgas para la producción de triglicéridos y otros productos químicos valiosos es el coste de usar una fuente de energía de carbono fijo. Las materias primas de carbono fijo se refieren a fuentes de carbono que no son dióxido de carbono, que tiene una energía libre demasiado baja para ser óptima para su uso como fuente energética para el cultivo de microalgas heterótrofas. Las fuentes de carbono fijo que se han utilizado para el cultivo de microalgas incluyen glucosa, fructosa, sacarosa y glicerol. Cuando se utiliza azúcar purificado (por ejemplo, sacarosa o glucosa) como materia prima de carbono fijo para un cultivo, la purificación del azúcar a partir de material vegetal como caña de azúcar, remolacha azucarera y materiales celulósicos procesados incrementa considerablemente los costes generales del cultivo. La purificación suele ser necesaria, ya que la materia prima de carbono fijo puede contener sustancias inhibidoras o tóxicas para las microalgas. Por ejemplo, las grandes cantidades de sales de potasio y/o sodio y compuestos como xilosa y furfurales presentes en estas fuentes de azúcar de bajo coste pueden inhibir el crecimiento de microalgas y la producción de triglicéridos.
[0005] Como añadido a estos problemas, es posible que las microalgas no conviertan gran parte de la fuente de carbono fijo añadida a un cultivo en el producto deseado debido a las vías metabólicas competitivas de las microalgas.
[0006] Finalmente, muchas especies de microalgas poseen un crecimiento óptimo a temperaturas que requieren un enfriamiento del medio de cultivo, lo que añade un coste considerable al cultivo.
Resumen
[0007] En un aspecto de la invención, se proporciona un método para producir una cepa de microalgas mejorada que tiene al menos una mejora del 5 % en el contenido de aceite en comparación con una cepa de microalgas original, donde el método comprende cultivar una cepa de microalgas original en presencia de un inhibidor de un transportador de monosacáridos y aislar una cepa de microalgas mejorada que es capaz de crecer en presencia del inhibidor del transportador de monosacáridos y que tiene al menos una mejora del 5 % en el contenido de aceite en comparación con una cepa de microalgas original.
Breve descripción de los dibujos
[0008] Las características anteriores de la invención se entenderán más fácilmente con referencia a la siguiente descripción detallada, tenida en cuenta con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La figura 1 es un gráfico de barras en el que se muestra la biomasa de triglicéridos y la biomasa que no son triglicéridos (NTB) de una cepa de microalgas no adaptada en comparación con la de una cepa adaptada en condiciones de control y una concentración de sal elevada;
La Fig. 2 es un gráfico de barras en el que se muestra el tiempo de duplicación de una cepa original ("control") no adaptada, un cultivo mutagenizado de la cepa original y una serie de cultivos de la cepa original mutagenizada adaptados para utilizar glucosa como fuente primaria de carbono más de manera más eficiente (véase el Ejemplo 2);
En la Fig. 3 se muestra la producción de aceite de varios cultivos de control y adaptados a células a lo largo del tiempo utilizando sacarosa purificada y jarabe de caña;
En la Fig. 4 se muestra un transcurso de tiempo para la acumulación de potasio para varias cepas de microalgas en sacarosa y en jarabe de caña;
En la Fig. 5 se muestra un transcurso de tiempo para la producción de aceite por las cepas de microalgas de la Fig. 4 en sacarosa y jarabe de caña; y
En la Fig. 6 se muestra el transcurso de tiempo del rendimiento en términos de gramos de aceite producidos por gramo de azúcar fermentable para las cepas de las Fig. 4 y 5.
Descripción detallada de formas de realización de la invención
Definiciones
[0009] Como se usa en el presente documento, el término "adaptar" o "adaptado/a” se refiere a cambios persistentes en una cepa de microalgas resultantes de la exposición de una población de microalgas derivadas de la cepa a una presión de selección. Los cambios incluyen cualquier cambio persistente, incluidos los cambios genéticos y epigenéticos. El término "adaptado/a en laboratorio" se refiere a una cepa de microalgas producida por selección no natural, es decir, la que resulta cuando el ser humano la expone a una presión de selección (independientemente de si esta selección se lleva a cabo literalmente en un "laboratorio" o en cualquier otra instalación).
[0010] Como se usa en el presente documento, la expresión "cepa de microalgas mejorada" se refiere a una cepa de microalgas que se ha derivado de una cepa original y que tiene al menos una propiedad que se ha mejorado con respecto a la cepa original.
[0011] "Cultivado/a", y variantes como "fermentado/a", se refieren al fomento intencional del crecimiento de una o más células mediante el uso de condiciones seleccionadas y/o controladas. Entre los ejemplos de condiciones seleccionadas y/o controladas se incluyen el uso de un medio definido (con características conocidas como pH, fuerza iónica y fuente de carbono), temperatura especificada, tensión de oxígeno, niveles de dióxido de carbono y crecimiento en un biorreactor. “Cultivado/a” no se refiere al crecimiento o propagación de microorganismos en la naturaleza o de otro modo sin intervención humana.
[0012] Como se usa en el presente documento, "crecimiento" abarca aumentos en el tamaño celular, el contenido celular y/o la actividad celular y/o aumentos en el número de células mediante la mitosis.
[0013] "Tiempo de duplicación" se refiere a la duración del tiempo necesario para que una célula o cultivo de células se duplique en número en condiciones seleccionadas. Cuando el tiempo de duplicación de una cepa de microalgas (por ejemplo, una cepa adaptada) se expresa en comparación con el tiempo de duplicación de otra cepa de microalgas (por ejemplo, una cepa original), se entiende que estos tiempos de duplicación se determinan en las mismas condiciones de cultivo.
[0014] El término "iones de sodio y potasio combinados totales" se refiere al valor de concentración obtenido al sumar la concentración de iones de sodio y la concentración de iones de potasio de una solución, por ejemplo, medios de cultivo o solución de azúcar, incluyendo jugo de caña de azúcar, jugo de remolacha, melaza o jugo de sorgo, o soluciones de celulosa despolimerizada o hemicelulosa despolimerizada. Este término no pretende implicar que ambos iones deban estar presentes, sino que abarca valores de concentración en los que todos los iones pueden ser sodio o, por el contrario, todos los iones pueden ser potasio, o están presentes tanto iones de sodio como iones de potasio.
[0015] El término "producto de microalgas" se refiere a cualquier material producido por y/o derivado de una microalga. El término abarca productos secretados, productos que se extraen de la microalga (por ejemplo, triglicéridos y/o ácidos grasos), la biomasa residual que queda después de cualquier proceso de extracción y cualquier componente de la biomasa de microalgas. El término también abarca cualquier producto derivado que incorpore cualquier material producido por una microalga y/o derivado de esta.
[0016] El término "materia prima" se refiere a una materia prima (entrada) introducida en un proceso para su conversión en algo diferente (salida). Este término se usa en este caso para describir la(s) sustancia(s) orgánica(s) suministrada(s) a un cultivo de microalgas para proporcionar al menos algunos de los requisitos de energía y carbono de las algas cuando el cultivo es heterótrofo. Una materia prima que contiene un azúcar (monosacáridos o
disacáridos simples u oligosacáridos o polisacáridos complejos) se denomina en el presente documento "materia prima de azúcar".
[0017] Como se usa en este documento, un material se describe como "desionizado" cuando el material (por ejemplo, jugo de caña de azúcar) se ha sometido a un paso de procesamiento para eliminar iones, como, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico. El término no implica que todos los iones se eliminen necesariamente del material.
[0018] El término "azúcar VHP”, por sus siglas en inglés, se refiere a lo que comúnmente se conoce como azúcar de muy alta polaridad, azúcar de alta polaridad o azúcar de uso alimenticio. Por ejemplo, el azúcar VHP puede tener un valor ICUMSA de entre 600 y 1200.
[0019] El término “contenido de aceite" se usa en este caso para referirse al contenido de aceite presente en una microalga o cultivo de microalgas. Tal como se usa en referencia a los métodos de adaptación del presente documento, el contenido de aceite se expresa a menudo como un porcentaje del contenido de aceite de la cepa de microalgas original.
[0020] Los términos "idéntico/a" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más secuencias de aminoácidos o nucleótidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para obtener la máxima correspondencia, medido usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual.
[0021] Para la comparación de secuencias para determinar el porcentaje de identidad de nucleótidos o aminoácidos, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de la subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia(s) de prueba en comparación con la secuencia de referencia en función de los parámetros de programa designados. La alineación óptima de las secuencias para la comparación se puede realizar utilizando BLAST configurado con los parámetros predeterminados.
Métodos para crear cepas de microalgas mejoradas
[0022] La presente invención proporciona métodos para fabricar cepas de microalgas con propiedades mejoradas en comparación con las cepas de las que se derivan. En formas de realización ilustrativas, los métodos se llevan a cabo para producir cepas de microalgas adaptadas para su uso en la producción industrial de productos de biomasa derivados de microalgas, incluyendo, entre otros, triglicéridos y ácidos grasos, o productos derivados de estos, incluyendo combustibles, alimentos, tensioactivos y productos oleoquímicos.
[0023] Según formas de realización ilustrativas de la invención, se adaptan cepas de microalgas heterótrofas para su uso en la producción industrial de productos de biomasa derivados de microalgas, incluyendo triglicéridos y ácidos grasos. Puede emplearse cualquier cepa de microalgas heterótrofas en los métodos descritos en el presente documento, y las cepas iniciales (originales) adecuadas pueden variar, dependiendo del producto de biomasa derivado de microalgas que se vaya a producir. Entre las cepas originales o no adaptadas adecuadas para las aplicaciones descritas en este documento se incluyen las descritas en los documentos US 2010/0239712, publicado el 23 de septiembre de 2010, y US 2011/0294174, publicado el 1 de diciembre de 2011. Los ejemplos específicos de cepas adecuadas para su uso en los métodos descritos en este documento incluyen especies del género Prototheca o Chlorella, por ejemplo, Prototheca moriformis o Chlorella protothecoides, por ejemplo, cualquiera de las cepas UTEX 1435, 1806, 411, 264, 256, 255, 250, 249, 31, 29, 25 y las cepas CCAP 211/17 y 211/8d.
[0024] La longitud de la cadena y la distribución de la saturación de los ácidos grasos producidos por las células de microalgas se pueden adaptar utilizando métodos de ingeniería genética, incluidos los que se describen en los documentos WO2008151149, WO2010063032, y la solicitud de PCT n.° US11/38463, ya sea antes o después de la adaptación. Las microalgas pueden comprender una o más de una acil-ACP tioesterasa (incluida una acil-ACP tioesterasa con actividad o especificidad por C8, C10, C12, C14, C16 o C18), sacarasa o desaturasa de ácidos grasos exógena. Como alternativa, o además, las microalgas pueden comprender una inactivación o atenuación de una desaturasa de ácido graso o acil-ACP tioesterasa endógena. Una mutación (incluyendo una inactivación) o inhibición (por ejemplo, usando antisentido o ARNi) de uno o más genes endógenos de desaturasa (por ejemplo, una esteroil-ACP desaturasa o un desaturasa de ácidos grasos que incluye una desaturasa de ácido graso delta 12) puede reducir o eliminar la actividad de la desaturasa para producir un perfil de triglicéridos con una saturación más completa. Las microalgas también pueden comprender una mutación (incluyendo una inactivación) o una inhibición (que incluye antisentido o ARNi) de un gen de cetoacil sintasa endógeno y/o pueden comprender un gen de cetoacil sintasa exógeno. En algunas formas de realización, las cepas se adaptan en el laboratorio para mejorar su crecimiento en medios con alto contenido de sal, su crecimiento en una fuente de carbono alternativa, su crecimiento a temperatura elevada, para mejorar la eficiencia de conversión de azúcar en triglicéridos, para mejorar el contenido
de aceite y/o para mejorar los niveles de C18:0 y/o C18:1. En formas de realización adicionales, las cepas adaptadas se usan para producir productos tales como ácidos grasos o triglicéridos.
Adaptación para el crecimiento en condiciones adversas
[0025] La presente invención proporciona métodos para fabricar cepas de microalgas adaptadas para el crecimiento o la supervivencia en condiciones adversas. Como resultado de la adaptación de la cepa, esta puede tener una producción sustancialmente inalterada o incrementada de un producto deseado, tal como triglicéridos de microalgas en esa condición o incluso en otras condiciones. En algunas formas de realización, el método produce cepas que poseen mayores tasas de crecimiento en comparación con la cepa no adaptada (por ejemplo, como puede medirse mediante el tiempo de duplicación, la tasa de crecimiento específica o la constante de tasa), en condiciones de cultivo que inhiben el crecimiento de una cepa no adaptada (es decir, una presión de selección). Por ejemplo, una cepa adaptada en el laboratorio puede caracterizarse por una tasa de crecimiento que es un 5 % mayor que una cepa original o una cepa natural de esa especie, cuando se cultiva en las mismas condiciones. En diversas formas de realización, el método comprende cultivar la cepa no adaptada en condiciones inhibidoras del crecimiento durante múltiples generaciones hasta que se produzca una cepa adaptada. Normalmente, el cultivo continuará durante al menos 10 a 20 generaciones, incluyendo, por ejemplo, al menos 50 generaciones o al menos 70, 80 o 150 generaciones. El cultivo de múltiples generaciones bajo la presión de selección se puede realizar en un quimiostato o mediante subcultivos sucesivos (por ejemplo, en matraces de agitación). En algunas formas de realización, el proceso implica la adaptación de una cepa mutagenizada. Las condiciones que inducen las mutaciones adecuadas incluyen la exposición a un mutágeno químico y/o radiación UV o de otro tipo. Por lo general, al final del período de adaptación, se obtienen, se caracterizan y se almacenan cepas aisladas del cultivo para uso futuro. En una forma de realización, se elige una cepa aislada que mantiene un nivel mínimo de producción de triglicéridos (por ejemplo, una producción comparable a la cepa original, por ejemplo, una producción medida por el % de peso en seco de las células del producto final, el rendimiento por volumen de medio de cultivo, y/ o la tasa de producción de triglicéridos por célula). En formas de realización específicas, la cepa adaptada es capaz de producir entre un 10 % y un 90 %, por ejemplo, de 20 a 30, de 30 a 40, de 40 a 50, de 60 a 70, de 70 a 80, de 80 a 90 o de 75 a 85 % de triglicéridos por peso en seco de las células. Como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica, la capacidad de producir estas cantidades de triglicéridos se puede determinar utilizando condiciones adecuadas para la producción de triglicéridos. Por ejemplo, la falta/la limitación de nitrógeno es un inductor conocido de la lipogénesis en microorganismos oleaginosos y, por lo tanto, la producción de triglicéridos puede, en algunas formas de realización, llevarse a cabo en condiciones de bajo nitrógeno, por ejemplo, como se describe en el documento US 2011/0294174, publicado el 1 de diciembre de 2011.
Alto contenido de sal
[0026] La condición inhibidora del crecimiento puede ser un medio de cultivo que tenga una concentración de sal más elevada en comparación con una concentración típica para la cepa original, en el que la concentración de sal más elevada limita el crecimiento (denominada en este documento "concentración de sal elevada” o “condición de sal elevada”). La concentración de sal elevada puede ser el resultado de sales que incluyen cationes de potasio, sodio, calcio y/o magnesio. En varias formas de realización, una concentración de sal elevada incluye, por ejemplo y sin limitación, concentraciones de iones de potasio y/o sodio (por ejemplo, "iones de sodio y potasio combinados totales") de 10 a 1000, 50 a 900 o 100 a 800 mM más altas que las típicas para el crecimiento de una cepa no adaptada (es decir, una cepa original o una cepa natural) en las mismas condiciones de crecimiento. Por ejemplo, la concentración de iones de potasio o sodio (individualmente o en total) puede ser 10, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 mM mayor que la concentración típica para el crecimiento de una cepa no adaptada, cuando se cultiva en condiciones de cultivo convencionales para esa cepa. Las condiciones convencionales para especies de Prototheca y Chlorella incluyen, por ejemplo, las divulgadas en los documentos US 2010/0239712, publicado el 23 de septiembre de 2010, y US 2011/0294174, publicado el 1 de diciembre de 2011 (por ejemplo, crecimiento en 4,2 g/L de K2HPO4, 3,1 g/l de NaH2PO4, 0,24 g/L de MgSÜ4 -7H2O, 0,25 g/L de ácido cítrico monohidrato, 0,025 g/L de CaCl2 2H2O, 2g/L de extracto de levadura más glucosa al 2 % durante 7 días a 28 °C con agitación (200 r.p.m.)). En particular, el "nivel típico" de la concentración de iones de potasio y/o sodio es el nivel que proporciona la tasa de crecimiento más alta (por ejemplo, un aumento en el número de células) de la cepa no adaptada en condiciones seleccionadas. Este nivel se puede determinar cultivando la cepa no adaptada en un rango de diferentes concentraciones de sal y determinando la tasa máxima de crecimiento a partir de una gráfica de la tasa de crecimiento frente a la concentración de sal. Como ejemplo, la concentración típica de sodio y/o potasio para una cepa no adaptada puede ser de aproximadamente 40 mM. La concentración elevada pero subletal de sal empleada en el método puede ser de 100 a 1000 mM de iones de sodio y/o potasio, por ejemplo, de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, o 1000 mM o iones de sodio y/o potasio. La sal puede obtenerse mediante el uso de fuentes de carbono económicas (por ejemplo, jugo de caña de azúcar, azúcar VHP, jugo de remolacha, jugo de sorgo, melaza, glicerol sin refinar o material celulósico despolimerizado, incluyendo celulosa despolimerizada y/o preparaciones de hemicelulosa). Estas preparaciones de azúcar pueden tener concentraciones de sal que, cuando se añaden a un cultivo, producen mayores concentraciones de sal que la concentración de sal típica para una cepa determinada.
[0027] Después de varias generaciones (por ejemplo, 5-50, 100, 150 o más) de cultivo en condiciones de alto contenido de sal, el cultivo contiene células que se multiplican más rápido que la cepa original en condiciones de alto
contenido de sal. A continuación, se pueden aislar una o más células del cultivo para establecer una nueva cepa adaptada, que luego se caracteriza por las características de producción deseadas, como la productividad de triglicéridos y la distribución de la longitud y la saturación de la cadena de ácidos grasos. La cepa adaptada puede usarse entonces para producir triglicéridos en presencia de concentraciones de sal elevadas (incluyendo condiciones de sal elevadas en un grado menor que la condición de evolución). Como resultado, se pueden usar fuentes de carbono con alto contenido de sal y de bajo coste sin costosos pasos de eliminación de sal (desionización) o con una combinación de fuentes de carbono con bajo contenido de sal y alto contenido de sal para mejorar la economía de la producción de triglicéridos. Tales formas de realización son particularmente útiles en comparación con especies de microalgas que no han evolucionado de manera natural para ser tolerantes a la sal; es decir, especies que no son especies marinas o halófilas.
Fuentes de carbono alternativas
[0028] Las células se pueden adaptar para que crezcan con azúcar VHP como fuente de carbono primaria o única.
[0029] La condición inhibidora del crecimiento puede ser una fuente de carbono distinta de la fuente de carbono típica, tal como la glucosa purificada, como fuente de carbono primaria. Las fuentes alternativas de carbono pueden ser glicerol, sacarosa, particularmente en forma de jugo de remolacha, azúcar VHP, melaza, jugo de sorgo (típicamente extraído de la caña de la planta de sorgo, por ejemplo, mediante trituración, trituración o corte), jugo de caña de azúcar y xilosa, particularmente xilosa derivada de materiales celulósicos. Tales fuentes de carbono "alternativas" producen tasas de crecimiento más bajas que las fuentes de carbono que se emplean convencionalmente para el cultivo, en condiciones de cultivo definidas. La fuente de carbono puede ser una materia prima de origen vegetal que sea predominantemente sacarosa, glucosa o fructosa, o un material celulósico hidrolizado. Entre los ejemplos de tales materias primas se incluyen extracto de caña de azúcar (incluyendo jugo claro o jarabe), extracto de remolacha azucarera (incluyendo jugo claro o jarabe), azúcar de palma o rastrojo de maíz despolimerizado o bagazo de caña de azúcar. La cepa se puede adaptar para que metabolice y/o tolere azúcares de cinco carbonos, incluidos, por ejemplo, xilosa, arabinosa y ribosa, o para que tolere sustancias inhibidoras que se encuentran en material celulósico, como los furfurales.
Sustancias inhibidoras
[0030] La condición inhibidora del crecimiento puede ser un medio de cultivo que contenga una sustancia, distinta de sodio o potasio, que sea inhibidora del crecimiento. En particular, la sustancia inhibidora del crecimiento puede ser una sustancia presente en el material celulósico despolimerizado. La biomasa celulósica es económica y fácil de obtener y generalmente constituye residuos de cultivos energéticos herbáceos y leñosos, así como cultivos agrícolas, es decir, las partes de la planta, principalmente tallos y hojas, que no se recogen de los campos con el alimento principal o el producto de fibra. Entre los ejemplos se incluyen desechos agrícolas como bagazo de caña de azúcar, cascarillas de arroz, fibra de maíz (incluidos tallos, hojas, cáscaras y mazorcas), paja de trigo, paja de arroz, pulpa de remolacha azucarera, pulpa de cítricos, cáscaras de cítricos; desechos forestales tales como los de entresacas de maderas duras y blandas, y residuos de operaciones madereras de maderas duras y blandas; desechos de madera tales como desechos de aserraderos (astillas de madera, serrín) y desechos de plantas de celulosa; desechos urbanos tales como fracciones de papel de desechos sólidos municipales, desechos urbanos de madera y desechos verdes urbanos tales como recortes de césped municipal; y residuos de construcción de madera. Los celulósicos adicionales incluyen cultivos celulósicos dedicados, como el pasto varilla, la madera de álamo híbrido, el miscanto, la caña de fibra y el sorgo de fibra.
[0031] La biomasa celulósica se puede despolimerizar para hacer que el azúcar contenido en ella esté disponible para las microalgas como fuente de energía, y la biomasa celulósica despolimerizada resultante incluye una serie de materiales que pueden inhibir el crecimiento de las microalgas y la producción de triglicéridos. Tales materiales incluyen, sin limitación, lignina, hidroximetilfurfural, acetato, concentraciones de sal elevadas y xilosa. Las cepas de microalgas adaptadas según los métodos de la invención se pueden usar para producir triglicéridos a partir de una materia prima de azúcar en presencia de sustancias inhibidoras, incluidas las concentraciones de sal elevadas de muchas materias primas celulósicas despolimerizadas. Los altos niveles de sal están presentes de manera natural en el material celulósico despolimerizado o surgen del proceso de despolimerización. Por ejemplo, la despolimerización de materiales celulósicos puede requerir condiciones altamente ácidas o alcalinas. La neutralización del pH de las condiciones altamente ácidas o alcalinas da como resultado fuentes de azúcar con concentraciones elevadas de potasio y/o sodio. Utilizando las cepas adaptadas de la presente invención, se puede reducir o eliminar la necesidad de desionizar una materia prima de azúcar antes de añadirla al medio de cultivo. La desionización se puede realizar, por ejemplo, mediante intercambio iónico u ósmosis inversa, y conlleva un coste adicional. Por el contrario, los cultivos de las cepas de la presente invención pueden alimentarse con materia prima no desionizada "sin refinar" o materia prima parcialmente desionizada (es decir, eliminando solo una fracción de la sal de la materia prima o mezclando materia prima desionizada con materia prima no desionizada). Como resultado, la producción de biomasa, incluyendo los triglicéridos y otros productos derivados de la biomasa, se vuelve más rentable debido a una tasa de crecimiento o tasa de producción de triglicéridos que aumenta en comparación con la cepa original para una concentración de inhibidor elevada determinada. (En este contexto, el término “alto/a” o “elevado/a” abarca la presencia de un inhibidor que no suele estar presente en los cultivos convencionales, así como
la presencia de un inhibidor en una cantidad superior a la habitual en los cultivos convencionales). Según los métodos adaptativos de la invención, una cepa no adaptada se cultiva continuamente en medios de cultivo que contienen una cantidad elevada de uno o más de estos materiales inhibidores o una composición que los comprende, es decir, material celulósico despolimerizado, durante múltiples generaciones (por ejemplo, 10-50, 100, 150, o más) o hasta que el cultivo muestre un aumento en la tasa de crecimiento.
Temperatura atípica
[0032] La condición inhibidora del crecimiento puede ser una temperatura diferente a la temperatura típica de crecimiento (alrededor de 32 °C para muchas cepas de microalgas). Si bien la forma de realización de la invención se puede poner en práctica para crear cepas adaptadas al crecimiento y/o la producción de triglicéridos a temperaturas por debajo de 32 °C, más típicamente, estas formas de realización se ponen en práctica para crear cepas adaptadas para crecer y producir triglicéridos a temperaturas por encima de 32 °C, es decir, de 37 °C y superiores. Según los métodos adaptativos de la divulgación, una cepa no adaptada se cultiva continuamente a la temperatura deseada hasta que el cultivo contenga células que crecen más rápido y/o producen más triglicéridos que la cepa no adaptada a esa temperatura. Alternativamente, una cepa de microalgas se adapta a una primera temperatura elevada para la cual la cepa original crece o produce triglicéridos a un ritmo subóptimo (por ejemplo, reducido en aproximadamente un 70 %). Después de varias generaciones, la cepa se adapta a una segunda temperatura elevada que es más alta que la primera temperatura elevada. Si es necesario o se desea, el proceso puede repetirse con temperaturas más elevadas. Si se utiliza un método con quimiostato, la temperatura se puede aumentar al observar un aumento en la densidad celular del cultivo. Como resultado, se produce una cepa adaptada, que puede poseer un mejor crecimiento y/o una mejor producción de triglicéridos a una temperatura elevada, reduciendo así la energía, los materiales o los bienes de equipo necesarios para enfriar un cultivo exotérmico de microalgas.
pH atípico
[0033] La condición inhibidora del crecimiento puede ser un pH diferente al pH de crecimiento típico (por ejemplo, 6,5-8 para muchas cepas de microalgas). En esta forma de realización de la invención, se preparan cepas adaptadas al crecimiento y/o a la producción de triglicéridos a pH bajo o alto. Según un método adaptativo de la presente invención, una cepa no adaptada se cultiva continuamente al pH deseado hasta que el cultivo contenga células que crezcan más rápido y/o que produzcan más triglicéridos que la cepa no adaptada a ese pH. Alternativamente, una cepa de microalgas se adapta a un primer pH para el cual la cepa original crece o produce triglicéridos a un ritmo subóptimo (por ejemplo, reducido en aproximadamente un 70 %). Después de varias generaciones, la cepa se adapta a un segundo pH que es más bajo o más alto que el primer pH. Si es necesario o se desea, el proceso puede repetirse a un pH más bajo o más alto. Si se usa un método con quimiostato, el pH se puede disminuir o aumentar al observar un aumento en la densidad celular del cultivo. Como resultado, se produce una cepa adaptada, que puede crecer y/o producir triglicéridos en medios de cultivo que tengan un pH bajo o elevado. En una forma de realización específica, el pH reducido o elevado es uno que es inferior a 6,5 o superior a 8, respectivamente. El cultivo de microalgas a un pH inferior a 6,5 o superior a 8 puede ser útil para minimizar la contaminación del medio de cultivo durante el cultivo.
Adaptación para mejorar la eficiencia en la producción de triglicéridos
[0034] En una forma de realización, el método se lleva a cabo para crear una cepa que convierta una fuente de carbono, por ejemplo, un azúcar como glucosa, sacarosa o alcohol de azúcar, como glicerol, en un producto final deseado, por ejemplo, triglicéridos, de manera más eficiente que una cepa equivalente no adaptada. La eficiencia se mide en el sentido metabólico; aumenta el número de moles de triglicéridos por mol de fuente de carbono utilizada. En estas formas de realización, el método comprende cultivar la cepa no adaptada en concentraciones que limitan el crecimiento de la fuente de carbono durante múltiples generaciones hasta que se produzca una cepa adaptada. Cuando la fuente de carbono es un azúcar, una "concentración que limita el crecimiento" del azúcar se denomina en el presente documento "baja concentración de azúcar" o "condición de bajo contenido de azúcar". Por ejemplo, la concentración de azúcares utilizables puede ser inferior a aproximadamente 1,0 g/L, por ejemplo, inferior a alrededor de 0,8 g/L, 0,5 g/L, 0,2 g/L, 0,1 g/L, 0,08 g/L, 0,05 g/L, 0,02 g/L, 0,01 g/L, o tan baja como aproximadamente 0,005 g/L. Como en las otras formas de realización, el cultivo en condiciones adaptativas continúa durante al menos 10 a 20 o más generaciones, es decir, al menos 70 generaciones y, a veces, durante 150 generaciones o más. En varias formas de realización, el método implica seleccionar una cepa de microalgas adaptada capaz de producir al menos un 50 % de triglicéridos por peso en seco de las células en condiciones de cultivo convencionales, donde el crecimiento no está limitado por la concentración de azúcar del cultivo (es decir, donde el azúcar es "no limitante").
[0035] En una forma de realización de la invención, la condición inhibidora del crecimiento es una inhibición de la oxidasa alternativa (AOX). La inhibición de la AOX puede ser química o por desactivación o atenuación de genes. La inhibición química se puede lograr con ácido salicilhidroxámico (SHAM). Por ejemplo, las células de microalgas se pueden mutagenizar químicamente y/o usando radiación. A continuación, las células mutagenizadas pueden sembrarse en placas con un inhibidor tal como SHAM y se pueden seleccionar colonias que crezcan vigorosamente. Luego se puede analizar las tasas de crecimiento, las concentraciones de triglicéridos y la eficiencia en la conversión
de azúcar en triglicéridos de las colonias seleccionadas. Luego se aísla una colonia muíante que tiene una mayor eficiencia en la conversión de azúcar en triglicéridos en condiciones de cultivo convencionales. En formas de realización particulares de la descripción, la colonia mutante es capaz de producir del 10 al 90 %, por ejemplo, al menos el 50 %, de triglicéridos por peso en seco de las células. Sin ceñirse a la teoría, la cepa aislada puede tener una o más mutaciones que desvían más carbono a triglicéridos y menos carbono a CO2. En diversas formas de realización de la invención, estas microalgas sometidas a este método no son de especies marinas o halófilas. Cepas ilustrativas de Chlorella y cepas de Prototheca, incluyendo, entre otras, cepas de Chlorella protothecoides y cepas de Prototheca moriformis. Las cepas adaptadas se pueden producir utilizando los métodos de adaptación proporcionados en este documento. La cepa mutante puede usarse para producir aceite a partir de azúcar con una alta eficiencia. El aceite resultante se puede utilizar para fabricar combustibles, productos químicos, alimentos u otros productos.
Adaptación para un contenido de aceite mejorado
[0036] En determinadas formas de realización, el método se lleva a cabo para aislar una cepa de microalgas mejorada que tiene un contenido de aceite mejorado en comparación con una cepa original. En algunas formas de realización, el método implica cultivar una cepa de microalgas originales en presencia de un inhibidor de un transportador de monosacáridos y aislar un mutante de la cepa de microalgas originales que es capaz de crecer en presencia de un inhibidor de un transportador de monosacáridos. Los transportadores de monosacáridos incluyen proteínas de transporte de membrana que se unen a monosacáridos (como la glucosa) e iones de sodio, que entran juntos en la célula. Luego, los iones de sodio son bombeados hacia el exterior de la célula por una ATPasa de sodio y potasio. La velocidad y la extensión del transporte de azúcar depende de la concentración de iones de sodio. Los inhibidores del sistema de transporte de monosacáridos son ampliamente conocidos e incluyen florizina, citocalasina B, 2-desoxiglucosa e inhibidores del sistema ATPasa de sodio y potasio, como los glucósidos cardíacos (por ejemplo, digoxina y ouabaína). Cualquier inhibidor que sea capaz de inhibir un transportador de monosacáridos de microalgas puede emplearse en el método.
Adaptación para niveles mejorados de C18:0 y/o C18:1
[0037] En formas de realización particulares, el método se utiliza para aislar una cepa de microalgas mejorada que tiene niveles aumentados de C18:0 y/o C18:1 en comparación con una cepa original. En algunas formas de realización de la invención, el método implica cultivar una cepa de microalgas originales en presencia de un inhibidor de una p-cetoacil-ACP sintasa (KAS) o de una reductasa de proteína transportadora de enoil-acilo (ACP), y aislar un mutante de la cepa de microalgas original que sea capaz de crecer en presencia del inhibidor. Se puede inhibir cualquier p-cetoacil-ACP sintasa (KAS) presente en una célula de microalgas, incluidos, por ejemplo, KASI, KASII y/o KASIII. El inhibidor puede ser selectivo para una de estas enzimas o puede inhibir más de una. Los inhibidores ilustrativos de KAS incluyen cerulenina del hongo Cephalosporium caerulens, tiolactomicina (TLM) del actinomiceto Nocardia spp., isoniazida (hidrazida del ácido isonicotínico), etionamida y triclosán [5-cloro-2-(2,4-diclorofenoxi)-fenol]. Como alternativa a la inhibición de KAS, o además, se puede inhibir cualquier reductasa de proteína transportadora de enoil-acilo (ACP) (ENR) presente en una célula de microalgas, incluyendo ENR (NADPH, especificidad por A) y/o ENR (NADPH, especificidad por B). El inhibidor puede ser selectivo para una de estas enzimas o puede inhibir más de una. Los inhibidores de ENR ilustrativos incluyen triclosán, triclocarbán, atromentina y leucomelona. En algunas formas de realización de la invención, el inhibidor inhibe tanto KAS como ENR; el triclosán, por ejemplo, inhibe ambas enzimas.
Consideraciones generales para los métodos
[0038] En las formas de realización de los métodos adaptativos de la invención, la condición inhibidora del crecimiento y/o la producción de un producto deseado mantenida durante el proceso de adaptación no es letal para las células y no evita completamente la división celular. Al contrario, las condiciones de cultivo se mantienen de tal modo que la división celular es más lenta que la observada en condiciones convencionales, de modo que existe una presión de selección sobre el cultivo que experimenta la adaptación. Por ejemplo, se puede utilizar una condición que disminuya la tasa de crecimiento (que extienda el tiempo de duplicación) entre un 5 y un 95 %. En diversas formas de realización, la velocidad de crecimiento se ralentiza entre un 20 % y un 90 %, entre un 30 y un 85 %, entre un 40 y un 75 % o entre un 50 y un 70 %. En una forma de realización particular, la tasa de crecimiento se ralentiza en aproximadamente un 70 %.
[0039] En formas de realización de los métodos adaptativos de la invención, el cultivo para múltiples generaciones se puede realizar en un quimiostato o mediante subcultivos sucesivos en matraces de agitación. Además, en estas diversas formas de realización, la cepa que se desea adaptar puede mutagenizarse antes del cultivo en las condiciones de adaptación o en cualquier punto o de forma continua a lo largo del proceso de adaptación. La mutagénesis se puede lograr fácilmente por medios conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, sin limitación, la exposición a un mutágeno químico; por ejemplo, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, metanosulfonato de etilo o 2-metoxi-6-cloro-9-[3-(etil-2-cloroetil)aminopropilamino]acridina diclorhidrato o rayos UV, rayos X , rayos gamma u otra radiación electromagnética o de partículas.
[0040] En formas de realización de los métodos adaptativos de la invención, los métodos se utilizan para adaptar una cepa de microalgas a una serie de parámetros diferentes, como dos o más de las condiciones inhibitorias descritas anteriormente. Por ejemplo y sin limitación, una cepa puede adaptarse para que tolere tanto el cultivo a alta temperatura como a concentraciones de sal elevadas. En otras formas de realización, la cepa se puede adaptar para que utilice una fuente de carbono de manera más eficiente y para que tolere concentraciones de sal elevadas. En otras formas de realización, la cepa se puede adaptar al cultivo a alta temperatura y a una concentración de sal elevada, así como para que utilice una fuente de carbono de manera más eficiente. En diversas formas de realización, estas cepas adaptadas de forma múltiple se adaptan en un proceso en el que todas las adaptaciones se realizan simultáneamente. En otras formas de realización, estas cepas adaptadas de forma múltiple se adaptan en una serie de procesos de adaptación secuenciales.
[0041] En formas de realización de los métodos adaptativos de la invención, el profesional puede aislar células individuales de un cultivo adaptado. Los aislados de una sola célula se caracterizarán para confirmar que tienen uno o más de los atributos deseados del cultivo adaptado, como un aumento en la producción de triglicéridos, un aumento en la eficiencia de conversión de azúcar en triglicéridos o la capacidad de producir triglicéridos con una distribución deseada de ácidos grasos, y los aislados confirmados de este modo se almacenarán o se "guardarán" para un uso futuro, incluso para una adaptación adicional.
Cepas de microalgas mejoradas
[0042] En otro aspecto, la presente invención también proporciona cepas de microalgas producidas mediante los métodos de la invención. Estas cepas, que pueden denominarse en el presente documento "cepas adaptadas en laboratorio", muestran, en comparación con las cepas de las que se derivaron, un crecimiento y/o producción de triglicéridos mejorados en condiciones inhibidoras del crecimiento y/o la producción de triglicéridos de las cepas no adaptadas. En diversas formas de realización, entre estas cepas adaptadas se incluyen cepas que poseen una tasa de crecimiento más rápida y/o una mayor producción de triglicéridos que las cepas equivalentes no adaptadas para una condición particular. En varias formas de realización, estas cepas adaptadas poseen una tasa de crecimiento más rápida y/o una mayor producción de triglicéridos en comparación con las cepas no adaptadas en una o más condiciones, como una temperatura de cultivo más alta, por ejemplo, temperaturas de 37 grados C o más, donde la cepa no adaptada se cultiva típicamente a temperaturas de unos 32 grados C; concentraciones de sal más altas, por ejemplo, de sal de potasio y/o sodio, por ejemplo, concentraciones de sal de 100 a 800 mM más altas que la concentración de sal en medios de crecimiento típicos (por ejemplo, potasio 40 mM); y condiciones en las que la fuente de carbono principal es una fuente de carbono distinta de la glucosa, por ejemplo, glicerol. En diversas formas de realización, estas cepas adaptadas son capaces de convertir un tipo específico de fuente de carbono en un producto final deseado, por ejemplo, triglicéridos, con mayor eficiencia que la cepa no adaptada de la que se derivaron. En diversas formas de realización, estas cepas de microalgas de la invención no son de especies marinas o halófilas. Entre las cepas de Chlorella y las cepas de Prototheca ilustrativas, se incluyen, entre otras, cepas de Chlorella protothecoides y cepas de Prototheca moriformis. Las cepas adaptadas se pueden producir utilizando los métodos de adaptación proporcionados en este documento.
Tolerancia a la sal
[0043] En una forma de realización, la presente invención proporciona una cepa adaptada de microalgas de una especie que es capaz de ser cultivada de manera heterótrofa. Gracias a la adaptación, la cepa es capaz de crecer en presencia de concentraciones de sal elevadas, por ejemplo, de 100 a 800 mM, o 700 mM más que la concentración típica utilizada para cultivar las microalgas. En algunas formas de realización, la concentración de sal más alta es una concentración de una sal de sodio y/o potasio que es al menos 100 mM, al menos 300 mM o hasta 800 mM mayor que la concentración típica para la cepa no adaptada. Por ejemplo, la concentración de sal elevada puede provenir del uso de una materia prima de azúcar que tiene al menos 50, 100, 150 o 200 mM de iones de sodio y/o potasio. En algunas formas de realización, la cepa muestra una tasa de crecimiento específica en las concentraciones de sal elevadas que es al menos un 5 %, al menos un 10 %, un 20 %, al menos un 30 % o al menos un 50 % más rápida (por ejemplo, medida por aproximación a la cinética de primer orden o tiempo de duplicación) que la de la cepa no adaptada bajo las mismas concentraciones de sal.
[0044] En algunas formas de realización, la cepa adaptada tiene un tiempo de duplicación en concentraciones de sal elevadas de 12 horas o menos, por ejemplo, alrededor de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 horas, por ejemplo, alrededor de 4-5 horas, cuando las microalgas de esa especie de origen natural tienen un tiempo de duplicación mayor o igual a 12 horas en las concentraciones de sal elevadas. En diversas formas de realización, la reducción del tiempo de duplicación puede ser de al menos 15 minutos, al menos 30 minutos, al menos 1 hora o al menos 2 horas o más. En diversas formas de realización, la reducción del tiempo de duplicación puede estar en el rango de 15 minutos a 8 horas, de 2 a 48 horas, de 3 a 24 horas o de 3,5 a 12 horas. El tiempo de duplicación se puede medir de manera conveniente usando lecturas de densidad óptica, como se ilustra en los ejemplos siguientes y como se hace comúnmente en la técnica para otras aplicaciones, o mediante cualquier otro método adecuado. En varias formas de realización, la cepa adaptada posee dicho tiempo de duplicación reducido en medios en los que la concentración de sal está en el rango de 50 a 800 mM, 100 a 600 mM o 200 a 400 mM mayor que la concentración de sal típica para
la cepa no adaptada. Por ejemplo, la concentración combinada de sodio y potasio puede ser de 100 a 1000, de 100 a 200, de 200 a 300, de 300 a 400, de 400 a 500, de 500 a 600, de 700 a 800, de 800 a 900 o de 900 a 1000 mM.
[0045] En formas de realización particulares, una cepa de microalgas adaptada en laboratorio se puede someter a cultivo heterótrofo para que crezca en presencia de ion potasio 100 mM con un tiempo de duplicación de 12 o menos horas, por ejemplo, de aproximadamente 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 horas, por ejemplo, de alrededor de 4-5 horas, mientras que la cepa original no adaptada de la microalga adaptada o la microalga natural de esa especie es incapaz de crecer o tiene un tiempo de duplicación mayor o igual a 12 horas en presencia de ion potasio 100 mM. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, el tiempo de duplicación de la cepa adaptada está entre 2 y 12 horas en presencia de ion potasio 100 mM. En diversas formas de realización, la cepa adaptada en laboratorio es capaz de crecer en presencia de iones de potasio y/o sodio 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 mM. La cepa adaptada en laboratorio es capaz, en algunas formas de realización, de producir un 10-90 % de triglicéridos por peso en seco de las células.
[0046] Es importante destacar que, como lo demuestran los ejemplos que aparecerán a continuación con respecto a las sales de potasio y sodio, los métodos para adaptar las cepas de microalgas a concentraciones de sal elevadas se pueden poner en práctica con una sal, como el potasio, un inhibidor del crecimiento común que se encuentra en materias primas de azúcar como el jugo de caña de azúcar, para generar una cepa adaptada que muestre características mejoradas de crecimiento y/o producción de triglicéridos en presencia de concentraciones elevadas de otras sales, incluyendo, entre otras, sales de sodio, de calcio o de magnesio.
Tolerancia a fuentes de carbono alternativas
[0047] En determinadas formas de realización, una cepa de microalgas adaptada en laboratorio es capaz de someterse a cultivo heterótrofo para que crezca en un medio de cultivo que comprende jugo de caña de azúcar, jugo de remolacha o jugo de sorgo, en el que el jugo de caña de azúcar, jugo de remolacha o jugo de sorgo comprende ion potasio y/o sodio, y en el que el medio de cultivo comprende al menos 100 mM de ion potasio e ion sodio combinados en total. La cepa adaptada tiene un tiempo de duplicación de 12 horas o menos, por ejemplo, unas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 horas, por ejemplo, alrededor de 4-5 horas, en estas condiciones, mientras que la cepa original no adaptada de las microalgas adaptadas o las microalgas naturales de esa especie es incapaz de crecer o tiene un tiempo de duplicación mayor o igual a 12 horas en presencia de ion potasio 100 mM Por ejemplo, en determinadas formas de realización, el tiempo de duplicación de la cepa adaptada está entre 2 y 12 horas, por ejemplo, menos de 8 horas, en presencia de ion potasio 100 mM. En diversas formas de realización, la cepa adaptada en el laboratorio es capaz de crecer en presencia de iones de potasio y/o sodio 250, 350, 450, 550, 600, 700, 800, 900 o 1000 mM. El jugo de caña de azúcar, jugo de remolacha o jugo de sorgo puede ser desionizado, parcialmente desionizado o no desionizado. En diversas formas de realización, el jugo de caña de azúcar, jugo de remolacha o jugo de sorgo está desionizado a una cantidad de aproximadamente 300 mM de iones de sodio y potasio combinados en total. La cepa adaptada en laboratorio es capaz, en algunas formas de realización, de producir 10-90 % de triglicéridos por peso en seco de las células.
Eficiencia mejorada en la producción de triglicéridos
[0048] En una forma de realización de la invención, se proporciona una cepa de microalga adaptada en laboratorio de una especie adaptada en condiciones de azúcar limitante para que tenga un mayor rendimiento, por ejemplo, en al menos un 3 %, de triglicéridos en comparación con una cepa original en las mismas condiciones de cultivo. En varias formas de realización de la descripción, esta cepa adaptada en laboratorio tiene un tiempo de duplicación de entre 2 horas y 24 horas en condiciones de cultivo convencionales (es decir, donde el azúcar no es limitante). La cepa adaptada en laboratorio es capaz, en algunas formas de realización, de producir un 10-90 % de triglicéridos por peso en seco de las células.
Contenido de aceite mejorado
[0049] Otro aspecto de la invención incluye una cepa de microalgas mejorada que tiene un contenido de aceite mejorado, en comparación con una cepa de microalgas original. En algunas formas de realización, la cepa de microalgas mejorada es una cepa adaptada en el laboratorio producida aislando un mutante de la cepa original de microalgas que se ha expuesto a un inhibidor de un transportador de monosacáridos, como se ha descrito anteriormente. En formas de realización particulares, la cepa de microalgas mejorada se produce aislando un mutante de la cepa original de microalgas que se ha expuesto a 2-desoxiglucosa. En diversas formas de realización, la cepa de microalgas mejorada tiene al menos una mejora del 5 % en el contenido de aceite, por ejemplo, al menos una mejora en el contenido de aceite del 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 % o más, por ejemplo, hasta 16 %, 17 %, 18 %, 19 % , 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 % o 25 %, en comparación con la cepa de microalgas original. La cepa de microalgas mejorada también puede tener un porcentaje de mejora en el contenido de aceite que se encuentre dentro de cualquier rango delimitado por cualquiera de estos valores, por ejemplo 5 % -25 %, 10 % - 20 % y 11 % - 15 %. el contenido de aceite se puede medir usando cualquier método convencional; generalmente se utiliza el mismo método para medir el contenido de aceite de la cepa mejorada frente a la original.
Niveles de C18:0 y/o C18:1 mejorados
[0050] Otro aspecto de la invención incluye una cepa de microalgas mejorada que es capaz de producir aceite con un porcentaje mayor de C18:0 y/o C18:1 que una cepa de microalgas original. En algunas formas de realización de la invención, la cepa de microalgas mejorada es una cepa adaptada en laboratorio producida mediante el aislamiento de un mutante de la cepa de microalgas original que se ha expuesto a un inhibidor de una p -cetoacil-ACP sintasa (KAS) y/o de una reductasa de proteína transportadora de enoil:acilo (ACP). En algunas formas de realización de la invención, el inhibidor incluye cerulenina. En algunas formas de realización de la invención, el inhibidor incluye triclosán. En diversas formas de realización, la cepa de microalgas mejorada tiene un aumento de al menos un 10 % en el porcentaje de C18:0 y/o C18:1, en comparación con la cepa original. Por ejemplo, aumento de al menos el 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 % o más, por ejemplo, de hasta el 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 % o 60 % en el porcentaje de C18:0 y/o C18:1. La cepa de microalgas mejorada también puede tener un aumento porcentual en los niveles de C18:0 y/o C18:1 dentro de cualquier rango delimitado por cualquiera de estos valores, por ejemplo, 10 % - 60 %, 15 % - 50 %, y 20 % -30 %. Los niveles de C18:0 y C18:1 se pueden medir usando cualquier método convencional; generalmente se utiliza el mismo método para medir el contenido de aceite de la cepa mejorada frente a la original. El "aumento en el porcentaje de C18:0 y/o C18:1" puede ser un aumento en el porcentaje de C18:0 solo o un aumento en el porcentaje de C18:1 solo o un aumento en los niveles combinados de C18:0 y C18 :1.
[0051] En algunas formas de realización, la cepa de microalgas mejorada es capaz de producir ácidos grasos que incluyen al menos un 70 % de C18:0 y/o C18:1, por ejemplo, al menos un 73 %, 75 %, 78 %, 80 %, 83 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 % o más, por ejemplo, hasta un 93 % o 95 % C18:0 y/o C18:1. La cepa de microalgas mejorada también puede tener un porcentaje de C18:0 y/o C18:1 que se encuentre dentro de cualquier rango delimitado por cualquiera de estos valores, por ejemplo, 70 % - 95 %, 75 % - 90 % y 80 % - 85 %. Como se ha indicado anteriormente, estos porcentajes se pueden calcular en función de C18:0 solo, C18:1 solo o los niveles combinados de C18:0 y C18:1.
[0052] En algunas formas de realización, el contenido de aceite de la cepa de microalgas mejorada es de al menos el 98 % de la cepa de microalgas original, por ejemplo, al menos el 99 % o equivalente a la cepa de microalgas original. En algunas formas de realización, el contenido de aceite es al menos un 5 % mayor, por ejemplo, al menos un 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 % o mayor, por ejemplo, hasta un 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 % o un 25 % mayor que la cepa de microalgas original. La cepa de microalgas mejorada también puede tener un aumento porcentual en el contenido de aceite que se encuentre dentro de cualquier rango delimitado por cualquiera de estos valores, por ejemplo, 5 % - 25 %, 10 % - 20 % y 11 % - 15 %.
Consideraciones generales para mejorar cepas de microalgas
[0053] En algunas formas de realización, cualquiera de las cepas de microalgas mejoradas mencionadas anteriormente es de una especie que no es una especie marina o halófila. En determinadas formas de realización, la cepa de microalgas mejorada es capaz de producir del 10 al 90 % de triglicéridos en peso en seco de las células. En formas de realización particulares, la cepa de microalgas mejorada es de una especie del género Prototheca o Chlorella. En diversas formas de realización, la especie es Prototheca moriformis o Chlorella protothecoides. En diversas formas de realización, la cepa de microalgas mejorada es capaz de producir al menos un 50 % de triglicéridos por peso en seco de las células.
Ingeniería genética de cepas de micoalgas originales o mejoradas
[0054] En diversas formas de realización de todos los métodos de la invención, la cepa progenitora o adaptada se manipula genéticamente para que exprese uno o más genes exógenos, ya sea antes o después del proceso de adaptación. Por ejemplo, la cepa progenitora o adaptada puede manipularse genéticamente para que produzca una distribución alterada de longitudes de cadena de ácidos grasos y/o saturación de ácidos grasos. En formas de realización particulares, la cepa de microalgas empleada en los métodos de la invención se habrá modificado genéticamente para que exprese un gen de sacarasa exógeno de manera que la cepa produzca suficiente sacarasa para permitirle metabolizar sacarosa de manera eficiente. En muchas de estas formas de realización, el gen de sacarasa codificará una sacarasa que se secreta en el medio de cultivo. Como alternativa o además, la cepa de microalgas puede manipularse genéticamente para que exprese una acil-ACP tioesterasa exógena, una desaturasa exógena o una p-cetoacil-ACP sintasa (KAS) exógena o para suprimir una tioesterasa o desaturasa endógena.
[0055] En formas de realización ilustrativas de las cepas de microalgas mejoradas descritas anteriormente y métodos relacionados, la microalga se modifica genéticamente para que produzca una longitud de cadena de ácido graso alterada y/o una distribución de la saturación mediante la supresión de una tioesterasa endógena y la introducción de un gen que codifica una p-cetoacil-ACP sintasa (KAS). Por ejemplo, se puede introducir un kAs II exógeno.
Métodos para producir productos a partir de cepas de microalaas mejoradas
[0056] En otro aspecto, la invención proporciona métodos para producir productos útiles a partir de cepas de microalgas adaptadas. En diversas formas de realización, estos métodos se ponen en práctica para producir triglicéridos que, a su vez, se utilizan como alimento, materia prima química, ingrediente cosmético o combustible. En varias formas de realización, estos métodos implican cultivar la cepa adaptada en una fuente de carbono (por ejemplo, un azúcar) en la que una cepa no adaptada crecería más lentamente o produciría menos producto deseado que la cepa adaptada. En varias formas de realización, estos métodos implican cultivar la cepa adaptada en un medio de cultivo en el que una cepa no adaptada crecería más lentamente que la cepa adaptada. En diversas formas de realización, estos métodos implican cultivar la cepa adaptada a una temperatura a la que una cepa no adaptada crecería más lentamente que la cepa adaptada. En determinadas formas de realización, los métodos implican el cultivo de una cepa de microalgas mejorada (por ejemplo, una que tenga un contenido de aceite mejorado o niveles de C18:0 y/o C18:1 mejorados). En diversas formas de realización, se combinan dos o más de los métodos descritos aquí, es decir, una cepa adaptada que crece más rápidamente en glucosa y en medios de cultivo con alto contenido de sal se cultiva con glucosa en un medio de cultivo con alto contenido de sal para producir triglicéridos. En diversas formas de realización, el producto deseado es biomasa de microalgas, que se incorpora, directamente o después del procesamiento, en un producto alimentario. En varias formas de realización, el producto deseado es triglicérido de microalgas que se aísla de la biomasa de microalgas y luego se incorpora directamente, o después de un procesamiento adicional, en el alimento. En varias formas de realización, el producto deseado es triglicérido de microalgas que se aísla de la biomasa de microalgas y luego se procesa para obtener un combustible, como biodiésel, diésel renovable, combustible para aviones u oleoquímico.
[0057] Por ejemplo, en una forma de realización, la invención proporciona un método para producir un producto de microalgas, en el que el método implica el cultivo heterótrofo de una microalga en un medio de cultivo que tiene una concentración de sal elevada, en el que la microalga está adaptada para crecer en condiciones de alto contenido de sal, y recuperar el producto de microalgas. El producto de microalgas puede, por ejemplo, incluir un triglicérido o un ácido graso, en cuyo caso el método puede incluir la separación del triglicérido o ácido graso de la biomasa de microalgas restante. En varias formas de realización, la microalga es capaz de producir un 20 % y hasta aproximadamente un 90 % de triglicéridos por peso en seco de las células, por ejemplo, en el rango de aproximadamente 20-30 %, 30-40 %, 40-50 %, 60-70 %, 70-80 %, o 80-90 %. En diversas formas de realización, la microalga no es de especies marinas o halófilas. Las microalgas adecuadas ilustrativas incluyen cepas de Chlorella y cepas de Prototheca, incluyendo, entre otras, cepas de Chlorella protothecoides y cepas de Prototheca moriformis. La microalga adaptada puede cultivarse en una condición de sodio o potasio que sea al menos 100, 200, 300, 400 o 500 mM mayor que la condición típica (por ejemplo, condiciones de salinidad del agua dulce, por ejemplo, agua con menos de 500 partes por millón (ppm) de sales disueltas, alrededor de 7 mg/L o menos de iones de sodio y alrededor de 3 mg/L o menos de iones de potasio) para el crecimiento de la cepa original o natural. En algunas formas de realización, el cultivo se alimenta con una materia prima que es un producto derivado vegetal que es predominantemente sacarosa, glucosa o fructosa, una celulosa hidrolizada y/o hemicelulosa hidrolizada. La concentración de sal elevada en el medio de cultivo de este método puede deberse a la adición al medio de una materia prima de azúcar con alto contenido de sal. En formas de realización particulares, el cultivo se alimenta con una materia prima que tiene una concentración de sal de al menos 100 mM, 150 mM, 200 mM o 250 mM de iones de sodio o potasio combinados totales para elevar la concentración de iones de sodio o potasio combinados totales del medio de cultivo a más de 50 mM. En algunas formas de realización, el cultivo se alimenta con una materia prima de azúcar que se desioniza en menor grado que el que sería necesario sin el uso de la microalga adaptada. Por ejemplo, la materia prima de azúcar se puede desionizar a un nivel de 300 mM o 150 mM de iones de sodio y potasio combinados totales y, en algunas formas de realización, el tiempo de duplicación de la microalga a esta concentración de sal es de 5 horas o menos, por ejemplo, de 4, 3 o 2 horas. La microalga adaptada se puede producir, como se describe en este documento, mediante propagación en una concentración de sal alta pero subletal, cuya propagación se puede llevar a cabo durante al menos 10 generaciones, por ejemplo, al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 o más generaciones. En diversas formas de realización, la concentración elevada pero subletal de sal está entre 100 y 1000 o entre 500 y 900 mM de iones de sodio o potasio combinados totales. En diversas formas de realización, la concentración de sal elevada es superior o igual a 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 mM de iones de sodio o potasio combinados totales. En algunas formas de realización, la microalga adaptada se produce por mutagenización de la microalga antes de la propagación en presencia de una concentración de sal elevada pero subletal.
[0058] En otra forma de realización, la invención proporciona un método para producir un producto de microalgas, en el que el método implica el cultivo heterótrofo de una microalga en un medio de cultivo, en el que la microalga está adaptada para crecer en condiciones de bajo azúcar y recuperar el producto de microalga. En algunas formas de realización, la microalga adaptada produce al menos un 20 % de triglicéridos por peso en seco de las células en condiciones de cultivo convencionales (es decir, donde el azúcar no es limitante), y la adaptación de la microalga da como resultado una mayor eficiencia de conversión de azúcar en ácido graso. El producto de microalga puede, por ejemplo, incluir un triglicérido o ácido graso, en cuyo caso, el método puede incluir la separación del triglicérido o ácido graso de la biomasa de microalgas restante. En varias formas de realización, la microalga es capaz de producir un 20 % y hasta aproximadamente un 90 % de triglicéridos por peso en seco de las células, por ejemplo, en el rango de aproximadamente 20-30 %, 30-40 %, 40-50 %, 60-70 %, 70-80 % u 80-90 % de triglicéridos por peso en
seco de las células. Las microalgas adecuadas ilustrativas incluyen cepas de Chlorella y cepas de Prototheca, incluyendo, entre otras, cepas de Chlorella protothecoides y cepas de Prototheca moriformis. La microalga adaptada se puede producir, como se describe en este documento, mediante propagación en presencia de la condición de bajo contenido de azúcar durante al menos 10 generaciones, por ejemplo, al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 o más generaciones. En algunas formas de realización, la condición de bajo contenido de azúcar es una concentración de azúcar de menos de aproximadamente 1,0 g/L, por ejemplo, de menos de alrededor de 0,8 g/L, 0,5 g/L. 0,2 g/l, 0,1 g/l, 0,08 g/l, 0,05 g/l, 0,02 g/l, 0,01 g/l, tan baja como alrededor de 0,005 g/L. En algunas formas de realización, la microalga adaptada se produce por mutagenización de la microalga antes de la propagación en presencia de la condición de bajo contenido de azúcar.
[0059] Opcionalmente, después de aplicar una presión de selección como se ha descrito anteriormente para obtener una cepa con una tasa de crecimiento más rápida con una condición inhibidora, y la ingeniería genética opcional, se aíslan múltiples clones de microalgas y se pone a prueba su capacidad para producir un producto deseado, como un triglicérido de cierta longitud de cadena o grado de saturación, o su capacidad para producir mayores cantidades del producto deseado. A continuación, se selecciona una cepa clonal que tiene tanto una tasa de crecimiento aumentada como la capacidad de producción deseada y se almacena para su uso futuro.
[0060] En diversas formas de realización, la cepa de microalgas produce triglicéridos que tienen > 25 %, > 30 %, > 40 %, > 50 %, > 60 %, > 70 %, > 80 %, > 90 % de C12. Alternativamente, o además, la cepa de microalgas produce triglicéridos que tienen > 60 %, > 70 %, > 80 %, > 90 % C18:1. Alternativamente o además, la cepa de microalgas produce triglicéridos que tienen > 20 %, > 30 %, > 40 %, > 50 %, > 60 %, > 70 %, > 80 %, > 90 % C18:0. Alternativamente o además, la cepa de microalgas produce triglicéridos que tienen > 30 %, > 40 %, > 50 %, > 60 %, > 70 %, > 80 %, > 90 % C12-C14. En formas de realización ilustrativas, la cepa de microalgas produce triglicéridos que tienen una de las siguientes características de distribución de ácidos grasos: > 25 % C12, > 60 % C18:1, > 20 % C18:0 o > 30 % C12-C14.
Perfiles de ácidos grasos de células de microalgas mejoradas
[0061] En algunas formas de realización, la presente invención proporciona una célula de microalgas (por ejemplo, una célula tolerante a un alto contenido de sal o una célula que tiene una eficacia mejorada para convertir el azúcar en triglicéridos) que comprende un aceite de triglicéridos, en el que el perfil de ácidos grasos del aceite de triglicéridos se selecciona del grupo consistente en: al menos alrededor del 1 %, al menos alrededor del 2 %, al menos alrededor del 5 %, al menos alrededor del 7 %, al menos alrededor del 10 %, o al menos alrededor del 15 % C8:0; al menos alrededor del 1 %, al menos alrededor del 5 %, al menos alrededor del 15 %, al menos alrededor del 20 %, al menos alrededor del 25 %, o al menos alrededor del 30 % de C10:0; al menos alrededor del 1 %, al menos alrededor del 5 %, al menos alrededor del 10 %, al menos alrededor del 15 %, al menos alrededor del 20 %, al menos alrededor del 25 %, al menos alrededor del 30 %, al menos alrededor del 35 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, o al menos aproximadamente 80 % C12:0; al menos alrededor del 2 %, al menos alrededor del 5 %, al menos alrededor del 10 %, al menos alrededor del 15 %, al menos alrededor del 20 %, al menos alrededor del 25 %, al menos alrededor del 30 %, al menos alrededor del 35 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 45 % o al menos aproximadamente el 50 % de C14:0; al menos alrededor del 30 %, al menos alrededor del 35 %, al menos alrededor del 40 %, al menos alrededor del 45 %, al menos alrededor del 50 %, al menos alrededor del 55 %, al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 65 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 75 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 85 %, o al menos alrededor del 90 %, C16:0; al menos alrededor del 5 %, al menos alrededor del 10 %, al menos alrededor del 15 %, al menos alrededor del 20 %, al menos alrededor del 25 %, al menos alrededor del 30 %, al menos alrededor del 35 %, al menos alrededor del 40 %, al menos alrededor del 45 %, o al menos alrededor del 50 % C18:0; al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 65 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 75 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 85 %, o al menos alrededor del 90 % C18:1; menos del 7 %, menos del 5 %, menos del 3 %, menos del 1 % o alrededor del 0 % C18:2; y al menos alrededor del 35 %, al menos alrededor del 40 %, al menos alrededor del 45 %, al menos alrededor del 50 %, al menos alrededor del 55 %, al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 65 %, al menos alrededor del 70 %, al menos al menos alrededor del 75 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 85 % o al menos alrededor del 90 % de ácidos grasos saturados.
[0062] En algunas formas de realización, la célula de microalgas comprende aceite de triglicéridos que comprende un perfil de ácidos grasos seleccionado del grupo que consiste en: cantidades combinadas totales de C8:0 y C10:0 de al menos alrededor del 10 %, al menos alrededor del 20 %, al menos alrededor del 30 % %, al menos alrededor del 40 %, al menos alrededor del 50 %, al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 90 % o alrededor del 100 %; cantidades combinadas totales de C10:0, C12:0 y C14:0 de al menos alrededor del 50 %, al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 90 % o alrededor del 100 %; cantidades combinadas totales de C16:0, C18:0 y C18:1 de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 100 %; cantidades
combinadas totales de C18:0, C18:1 y C18:2 de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 100 %; cantidades combinadas totales de C14:0, C16:0, C18:0 y C18:1 de al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 90 % o alrededor del 100 %; y cantidades combinadas totales de C18:1 y C18:2 de menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, o alrededor del 0 %,
[0063] En algunas formas de realización, la célula de microalgas comprende aceite de triglicéridos que tiene un perfil de ácidos grasos que comprende una proporción de ácidos grasos seleccionados del grupo que consiste en: una proporción de C8:0 a C10:0 de al menos aproximadamente 5 a 1, al menos 6 a 1 , al menos 7 a 1, al menos 8 a 1, al menos 9 a 1, o al menos 10 a 1; una proporción de C10:0 a C12:0 de al menos aproximadamente 6 a 1, al menos 7 a 1, al menos 8 a 1, al menos 9 a 1 o al menos 10 a 1; una proporción de C12:0 a C14:0 de al menos aproximadamente 5 a 1, al menos 6 a 1, al menos 7 a 1, al menos 8 a 1, al menos 9 a 1 o al menos 10 a 1; una proporción de C14:0 a C12:0 de al menos 7 a 1, al menos 8 a 1, al menos 9 a 1 o al menos 10 a 1; y una proporción de C14:0 a C16:0 de al menos 1 a 2, al menos 1 a 3, al menos 1 a 4, al menos 1 a 5, al menos 1 a 6, al menos 1 a 7, al menos 1 a 8, al menos 1 a 9, o al menos 1 a 10.
Perfiles de ácidos grasos de composiciones de aceite de triglicéridos de células de microalgas mejoradas
[0064] En algunas formas de realización, la presente invención proporciona una composición de aceite de triglicéridos de microalgas, en la que el perfil de ácidos grasos del aceite de triglicéridos se selecciona del grupo que consiste en: al menos alrededor del 1 %, al menos alrededor del 2 %, al menos alrededor del 5 %, al menos al menos alrededor del 7 %, al menos alrededor del 10 % o al menos alrededor del 15 % de C8:0; al menos alrededor del 1 %, al menos alrededor del 5 %, al menos alrededor del 15 %, al menos alrededor del 20 %, al menos alrededor del 25 %, o al menos alrededor del 30 % de C10:0; al menos alrededor del 1 %, al menos alrededor del 5 %, al menos alrededor del 10 %, al menos alrededor del 15 %, al menos alrededor del 20 %, al menos alrededor del 25 %, al menos alrededor del 30 %, al menos alrededor del 35 %, al menos alrededor del 40 %, al menos alrededor del 45 %, al menos alrededor del 50 %, al menos alrededor del 55 %, al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 65 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 75 %, o al menos aproximadamente 80 % de C12:0; al menos alrededor del 2 %, al menos alrededor del 5 %, al menos alrededor del 10 %, al menos alrededor del 15 %, al menos alrededor del 20 %, al menos alrededor del 25 %, al menos alrededor del 30 %, al menos alrededor del 35 %, al menos alrededor del 40 %, al menos alrededor del 45 % o al menos alrededor del 50 % de C14:0; al menos alrededor del 30 %, al menos alrededor del 35 %, al menos alrededor del 40 %, al menos alrededor del 45 %, al menos alrededor del 50 %, al menos alrededor del 55 %, al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 65 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 75 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 85 %, o al menos alrededor del 90 % de C16:0; al menos alrededor del 5 %, al menos alrededor del 10 %, al menos alrededor del 15 %, al menos alrededor del 20 %, al menos alrededor del 25 %, al menos alrededor del 30 %, al menos alrededor del 35 %, al menos alrededor del 40 %, al menos alrededor del 45 %, o al menos alrededor del 50 % de C18:0; al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 65 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 75 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 85 %, o al menos alrededor del 90 % de C18:1; menos del 7 %, menos del 5 %, menos del 3 %, menos del 1 % o alrededor del 0 % de C18:2; y al menos alrededor del 35 %, al menos alrededor del 40 %, al menos alrededor del 45 %, al menos alrededor del 50 %, al menos alrededor del 55 %, al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 65 %, al menos alrededor del 70 %, al menos al menos alrededor del 75 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 85 % o al menos alrededor del 90 % de ácidos grasos saturados.
[0065] En algunas formas de realización, la composición de aceite de triglicéridos de microalgas comprende aceite de triglicéridos que comprende un perfil de ácidos grasos en el que: la cantidad total combinada de C10:0, C12:0 y C14:0 es al menos alrededor del 50 %, al menos alrededor del 60 %, al menos al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 90 % o alrededor del 100 %; la cantidad total combinada de C16:0, C18:0 y C18:1 es al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 90 % o alrededor del 100 %; la cantidad total combinada de C18:0, C18:1 y C18:2 es al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 90 % o alrededor del 100 %; la cantidad total combinada de C14:0, C16:0, C18:0 y C18:1 es al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 90 % o alrededor del 100 %; las cantidades combinadas totales de C8:0 y C10:0 son menos del 50 %, menos del 45 %, menos del 40 %, menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos de alrededor del 20 %, menos de alrededor del 15 %, menos de alrededor del 10 %, menos de alrededor del 5 % o alrededor del 0 %.
[0066] En algunas formas de realización, la composición de aceite de triglicéridos de microalgas comprende aceite de triglicéridos que tiene un perfil de ácidos grasos que comprende una relación de ácidos grasos seleccionados del grupo que consiste en: una relación de C8:0 a C10:0 de al menos aproximadamente 5 a 1, al menos aproximadamente 6 a 1, al menos aproximadamente 7 a 1, al menos aproximadamente 8 a 1, al menos aproximadamente 9 a 1, o al menos aproximadamente 10 a 1; una relación de C10:0 a C12:0 de al menos aproximadamente 6 a 1, al menos aproximadamente 7 a 1, al menos aproximadamente 8 a 1, al menos aproximadamente 9 a 1, o al menos aproximadamente 10 a 1; una relación de C12:0 a C14:0 de al menos
aproximadamente 5 a 1, al menos aproximadamente 6 a 1, al menos aproximadamente 7 a 1, al menos aproximadamente 8 a 1, al menos aproximadamente 9 a 1, o al menos aproximadamente 10 a 1; una relación de C14:0 a C12:0 de al menos aproximadamente 7 a 1, al menos aproximadamente 8 a 1, al menos aproximadamente 9 a 1, o al menos aproximadamente 10 a 1; una relación de C14:0 a C16:0 de al menos aproximadamente 1 a 2, al menos aproximadamente 1 a 3, al menos aproximadamente 1 a 4, al menos aproximadamente 1 a 5, al menos aproximadamente 1 a 6, al menos aproximadamente 1 a 7, al menos alrededor de 1 a 8, al menos alrededor de 1 a 9, o al menos alrededor de 1 a 10.
[0067] En algunas formas de realización, la presente invención proporciona un método para producir una composición de aceite de triglicéridos de microalgas que tiene un perfil de ácidos grasos seleccionado del grupo que consiste en: al menos alrededor del 1 %, al menos alrededor del 2 %, al menos alrededor del 5 %, al menos alrededor del 7 %, al menos alrededor del 10 %, o al menos alrededor del 15 % de C8:0; al menos alrededor del 1 %, al menos alrededor del 5 %, al menos alrededor del 10 %, al menos alrededor del 15 %, al menos alrededor del 20 %, al menos alrededor del 25 %, o al menos alrededor del 30 % de C10:0; al menos alrededor del 1 %, al menos alrededor del 5 %, al menos alrededor del 10 %, al menos alrededor del 15 %, al menos alrededor del 20 %, al menos alrededor del 25 %, al menos alrededor del 30 %, al menos alrededor del 35 %, al menos alrededor del 40 %, al menos alrededor del 45 %, al menos alrededor del 50 %, al menos alrededor del 55 %, al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 65 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 75 %, o al menos aproximadamente 80 % de C12:0; al menos alrededor del 2 %, al menos alrededor del 5 %, al menos alrededor del 10 %, al menos alrededor del 15 %, al menos alrededor del 20 %, al menos alrededor del 25 %, al menos alrededor del 30 %, al menos alrededor del 35 %, al menos alrededor del 40 %, al menos alrededor del 45 % o al menos alrededor del 50 % de C14:0; al menos alrededor del 30 %, al menos alrededor del 35 %, al menos alrededor del 40 %, al menos alrededor del 45 %, al menos alrededor del 50 %, al menos alrededor del 55 %, al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 65 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 75 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 85 %, o al menos alrededor del 90 % de C16:0; al menos alrededor del 5 %, al menos alrededor del 10 %, al menos alrededor del 15 %, al menos alrededor del 20 %, al menos alrededor del 25 %, al menos alrededor del 30 %, al menos alrededor del 35 %, al menos alrededor del 40 %, al menos alrededor del 45 %, o al menos alrededor del 50 % de C18:0; al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 65 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 75 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 85 %, o al menos alrededor del 90 % de C18:1; menos del 7 %, menos del 5 %, menos del 3 %, menos del 1 % o alrededor del 0 % de C18:2; y al menos alrededor del 35 %, al menos alrededor del 40 %, al menos alrededor del 45 %, al menos alrededor del 50 %, al menos alrededor del 55 %, al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 65 %, al menos alrededor del 70 %, al menos al menos alrededor del 75 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 85 % o al menos alrededor del 90 % de ácidos grasos saturados, en el que el método comprende los pasos de: (a) cultivar una población de células de microalgas en un medio de cultivo hasta que al menos el 10 % del peso celular seco de las células de microalgas sea aceite de triglicéridos; y (b) aislar la composición de aceite de triglicéridos de las células de microalgas.
[0068] En algunas formas de realización, el método para producir composiciones de aceite de triglicéridos de microalgas produce aceites de triglicéridos que comprenden un perfil de ácidos grasos en el que: la cantidad total combinada de C10:0, C12:0 y C14:0 es al menos alrededor del 50 %, al menos alrededor del 60 % %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 90 % o alrededor del 100 %; la cantidad total combinada de C16:0, C18:0 y C18:1 es al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 90 % o alrededor del 100 %; la cantidad total combinada de C18:0, C18:1 y C18:2 es al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 90 % o alrededor del 100 %; la cantidad total combinada de C14:0, C16:0, C18:0 y C18:1 es al menos alrededor del 60 %, al menos alrededor del 70 %, al menos alrededor del 80 %, al menos alrededor del 90 % o alrededor del 100 %; la cantidad total combinada de C8:0 y C10:0 es menos de alrededor 50 %, menos de alrededor 45 %, menos de alrededor 40 %, menos de alrededor 35 %, menos de alrededor 30 %, menos de alrededor 25 %, menos de alrededor del 20 %, menos de alrededor del 15 %, menos de alrededor del 10 %, menos de alrededor del 5 % o alrededor del 0 %.
[0069] En algunas formas de realización, el método para producir composiciones de aceite de triglicéridos de microalgas produce aceites de triglicéridos que tienen un perfil de ácidos grasos que comprende una proporción de aceites de triglicéridos seleccionados del grupo que consiste en: una proporción de c 8:0 a C10:0 de al menos aproximadamente 5 a 1, al menos aproximadamente 6 a 1, al menos aproximadamente 7 a 1, al menos aproximadamente 8 a 1, al menos aproximadamente 9 a 1, o al menos aproximadamente 10 a 1; una relación de C10:0 a C12:0 de al menos aproximadamente 6 a 1, al menos aproximadamente 7 a 1, al menos aproximadamente 8 a 1, al menos aproximadamente 9 a 1, o al menos aproximadamente 10 a 1; una relación de C12:0 a C14:0 de al menos aproximadamente 5 a 1, al menos aproximadamente 6 a 1, al menos aproximadamente 7 a 1, al menos aproximadamente 8 a 1, al menos aproximadamente 9 a 1, o al menos aproximadamente 10 a 1; una relación de C14:0 a C12:0 de al menos aproximadamente 7 a 1, al menos aproximadamente 8 a 1, al menos aproximadamente 9 a 1, o al menos aproximadamente 10 a 1; y una relación de C14:0 a C16:0 de al menos aproximadamente 1 a 2, al menos aproximadamente 1 a 3, al menos aproximadamente 1 a 4, al menos aproximadamente 1 a 5, al menos aproximadamente 1 a 6, al menos aproximadamente 1 a 7, al menos aproximadamente de 1 a 8, al menos aproximadamente de 1 a 9, o al menos aproximadamente de 1 a 10.
[0070] Se descubrió que el aceite producido por Chlorella protothecoides producía esteróles que parecían ser brasicasterol, ergosterol, campesterol, estigmasterol y p-sitosterol, cuando se detectó mediante GC-MS. Sin embargo, se cree que todos los esteroles producidos por Chlorella tienen estereoquímica C24p. Por eso, se cree que las moléculas detectadas como campesterol, estigmasterol y p-sitosterol, son en realidad 22,23-dihidrobrassicasterol, proferasterol y clionasterol, respectivamente. Por lo tanto, en algunas formas de realización, los aceites producidos por las microalgas descritas anteriormente se pueden distinguir de los aceites vegetales por la presencia de esteroles con estereoquímica C24p y la ausencia de esteroquímica C24a en los esteroles presentes. Por ejemplo, los aceites producidos pueden contener 22,23-dihidrobrasicasterol y carecer de campesterol; contener clionasterol pero carecer de p-sitosterol y/o contener poriferasterol pero carecer de estigmasterol. Alternativamente, o además, los aceites pueden contener cantidades significativas de A7-poriferasterol.
[0071] Por lo tanto, la presente divulgación incluye varios aspectos y formas de realización diferentes. En una forma de realización, las cepas proporcionadas por la invención se han adaptado en el laboratorio para que puedan tener tasas de crecimiento y/o de producción de triglicéridos más altas en condiciones de alto contenido de sal, incluyendo las que se encuentran en el jugo de caña de azúcar sin refinar. En otras formas de realización, las cepas se han adaptado para que conviertan la glucosa u otro azúcar en ácidos grasos y/o triglicéridos de forma más eficaz. En otras formas de realización, las cepas adaptadas se usan para producir productos tales como triglicéridos. Las formas de realización descritas de la invención pretenden ser meramente ejemplares, y numerosas variaciones y modificaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Se pretende que todas estas variaciones y modificaciones estén dentro del alcance de la presente invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Adaptación de cepas de Prototheca a condiciones de alto contenido de sal
[0072] Este ejemplo ilustra los métodos de la invención con respecto a la adaptación de la cepa de Prototheca moriformis UTEX 1435 para el cultivo a concentraciones elevadas de potasio (540 - 640 mM). La cepa se adaptó en matraces de agitación. Se prepararon cinco matraces repetidos para cada condición analizada. Los cultivos se mantuvieron en la fase de crecimiento exponencial y se obtuvieron subcultivos cada 1-4 días, normalmente 1-3 días. La densidad óptica a 750 nm (O750) de los cultivos estuvo entre 0,4 y 20.
[0073] Las tasas de crecimiento específicas iniciales para todas las condiciones fueron las siguientes: control (glucosa como fuente de carbono) - 0,21 h-1; temperatura elevada - 0,07 h-1; alto [KCl] - 0,08 h-1; de glicerol como fuente de carbono - 0,15 h-1.
[0074] Los cinco cultivos adaptados a temperatura elevada se adaptaron durante 85 a 88 generaciones y mostraron tasas de crecimiento en el rango de 0,15 a 0,17 h.-1. Los cinco cultivos adaptados a una concentración elevada de KCl se adaptaron durante 70 a 73 generaciones y mostraron tasas de crecimiento en el rango de 0,08 a 0,10 h.-1; la adaptación continuó hasta la generación 161 a 165 para cuatro de estos cultivos, que luego mostraron tasas de crecimiento en el rango de 0,09 a 0,11 h-1. Los cinco cultivos adaptados al glicerol se adaptaron durante 186 a 188 generaciones y mostraron tasas de crecimiento en el rango de 0,17 a 0,19 h.-1.
[0075] Después de la adaptación a lo largo del número de generaciones indicado, el contenido de los matraces se almacenó y se usó como fuente de inóculos para las pruebas de producción de triglicéridos. En condiciones de control utilizando glucosa como fuente de carbono, la cepa UTEX 1435 no adaptada produjo alrededor de 17 g/l de triglicéridos y alrededor de 6 g/l de biomasa sin triglicéridos (NTB).
[0076] En condiciones de control usando glicerol como fuente de carbono, la cepa UTEX 1435 no adaptada produjo alrededor de 6 g/l de triglicéridos y alrededor de 5 g/l de biomasa sin triglicéridos (NTB). La población de cepas mixtas adaptadas produjo de manera similar alrededor de 6 g/l de triglicéridos en glicerol y alrededor de 4 g/l de NTB.
[0077] En condiciones de control de una temperatura de cultivo elevada de 37,6 grados C (la temperatura óptima es de 32 grados C), la cepa UTEX 1435 no adaptada produjo alrededor de 15 g/l de triglicéridos y alrededor de 5 g/l de NTB. La población de cepas mixtas adaptadas produjo alrededor de 6 g/L de triglicéridos y alrededor de 5 g/L de NTB a esta temperatura, lo que indica que la adaptación no resultó en una mayor producción de triglicéridos con esta cepa.
[0078] En condiciones de ensayo de concentración elevada de KCl (300 mM más que el [KCl] óptimo de 40 mM), la cepa UTEX 1435 no adaptada produjo solo alrededor de 2 g/l de triglicéridos y 1 g/l de NTB, mientras que la población de cepas mixtas adaptadas produjo alrededor de 3 a 5 g/L de triglicéridos y de 2 a 3 g/L de NTB. En resumen, el rendimiento de los cinco cultivos altos en [KCl] con respecto a la producción de biomasa y triglicéridos fue superior al de la cepa no adaptada.
[0079] Para obtener una cepa aislada clonal pura genéticamente, se aislaron alrededor de 10 colonias individuales de cada uno de los cultivos altos en [KCl] adaptados para 70 generaciones. Se prepararon bancos de células de las
cepas aisladas y se analizó la producción de triglicéridos en las cepas aisladas. De las 50 cepas aisladas resultantes, los contenidos de triglicéridos de 47 fueron superiores a los de la cepa no adaptada.
[0080] A continuación, se analizó la producción de triglicéridos de las cinco cepas aisladas principales en cultivos con una concentración elevada de KCl y, por separado, con una concentración elevada de NaCl (exceso de sal de 300 mM). Todas las cepas aisladas tuvieron un rendimiento mejor que la cepa no adaptada, en términos de producción de triglicéridos, en las condiciones de alto contenido de sal, y tres de las cepas aisladas tuvieron un rendimiento mejor, con respecto a este parámetro, que la cepa no adaptada incluso en condiciones de control (sal normal). Así, en las condiciones de control, la cepa UTEX 1435 no adaptada produjo alrededor de 17 g/L de triglicéridos, mientras que este valor para las 5 cepas adaptadas osciló entre 11 y 19. En el medio alto en KCl, la cepa no adaptada produjo alrededor de 3 g de triglicéridos, mientras que este valor para las 5 cepas adaptadas osciló entre 8 y 13. En el medio alto en NaCl, la cepa no adaptada produjo alrededor de 4 g/L de triglicéridos, mientras que este valor para las 5 cepas adaptadas osciló entre 8 y 13.
[0081] A continuación, se comparó la producción de triglicéridos de una de las cepas adaptadas con la de la cepa original no adaptada en una variedad de condiciones de sal diferentes. Los resultados se muestran en la figura 1. Como se puede ver en la figura, la cepa adaptada produjo más triglicéridos en todas las condiciones analizadas, incluida no solo la condición baja en sal óptima para la cepa no adaptada, sino también en varias condiciones de concentración de sal elevada (concentraciones que están por encima de las concentraciones de condición óptima): Na 150 mM; K 150 mM; Na 300 mM; K 300 mM; Na y K 150 mM cada uno; MgSO470 mM; y MgSO4150 mM.
[0082] Este ejemplo demuestra que los métodos de la invención se pueden usar para producir cepas de microalgas con características mejoradas, que incluyen un tiempo de duplicación reducido en condiciones inhibidoras del crecimiento y una producción aumentada de triglicéridos en condiciones inhibidoras de la producción de triglicéridos. Las cepas adaptadas a condiciones de alto contenido de sal tienen una aplicación particular para la producción de triglicéridos utilizando materias primas económicas, como jarabes de caña, jarabes de remolacha, melazas y muchas materias primas derivadas de la celulosa, que tienen concentraciones de sal elevadas. Además, algunas de estas cepas mostraron una producción mejorada de triglicéridos incluso en condiciones de control (concentración de sal normal). Además, los fenotipos alterados de algunas de las células adaptadas, que se manifiestan como una mayor lisis en condiciones de control, podrían ofrecer ventajas con respecto al procesamiento posterior, ya que el uso de estas cepas podría permitir una separación eficiente del aceite de la biomasa/medio de cultivo.
Ejemplo 2. Adaptación de Prototheca para aumentar el rendimiento de conversión de azúcar en triglicéridos [0083] Este ejemplo ilustra un método de la invención con respecto a la adaptación de una cepa de una microalga heterótrofa obligada, Prototheca moriformis, para aumentar la tasa de crecimiento y el rendimiento de conversión de azúcar en triglicéridos en medios de cultivo que contienen glucosa como fuente principal de carbono en concentraciones limitantes del crecimiento. Se usó la cepa S1920 de Prototheca moriformis como cepa de partida, y esta cepa se sometió a mutagénesis tanto por medios físicos (irradiación UV) como químicos (EMS y NTG) antes de la adaptación en cultivo. El cultivo se llevó a cabo en un quimiostato que permitía un cultivo continuo. Se añadió medio nuevo y se eliminó el caldo de cultivo a una velocidad controlada. El crecimiento celular estuvo limitado por el agotamiento de la glucosa como fuente de carbono; la tasa de crecimiento de las células se controló así por la tasa de alimentación de glucosa, también conocida como tasa de dilución. S1920 es una cepa clásicamente mutagenizada seleccionada por un mayor contenido de lípidos obtenida de un laboratorio de pago por servicio. La cepa original de la que proviene S1920 es UTEX1435.
[0084] La(s) cepa(s) mutada(s), como una población mixta, se cultivó/cultivaron primero en cultivo por lotes. Luego, el medio de cultivo que contenía glucosa se alimentó continuamente al quimiostato a una tasa de dilución de 0,05 h.-1, lo que permitió que las células crecieran al 25 % de la tasa de crecimiento específica máxima. Después del crecimiento durante aproximadamente 70 generaciones en estas condiciones de glucosa limitada, la población mixta se sembró en placas para aislar colonias individuales. Luego, las cepas aisladas individuales se cultivaron en matraz para medir la producción de triglicéridos y el rendimiento de conversión de glucosa en triglicéridos.
[0085] Los resultados se muestran en la Fig. 2. Se observó un aumento en la tasa de crecimiento de la población adaptada a medida que avanzaba la adaptación. El tiempo de duplicación de la cepa original no mutagenizada y no adaptada fue de aproximadamente 3,4 horas (tasa de crecimiento específica de 0,21 h-1); la población mutagenizada de la cepa original tuvo un tiempo de duplicación de aproximadamente 3,7 horas. A medida que aumentó el número de generaciones de adaptación, disminuyó el tiempo de duplicación: 12 generaciones - ~3,2 horas; 24 generaciones - ~3,1 horas; 48 generaciones - ~2,95 horas; y 71 generaciones - ~2,9 horas, con una tasa de crecimiento del cultivo adaptado de 71 generaciones de 0,238. Así, después de 71 generaciones, la tasa de crecimiento específica máxima de la población heterogénea resultante aumentó en un 16 %, y su tiempo de duplicación disminuyó en aproximadamente 30 minutos en comparación con la cepa no adaptada no mutagenizada.
[0086] Se obtuvieron clones aislados del cultivo adaptado, y más del 50 % de las 94 cepas aisladas analizadas tuvieron contenidos de triglicéridos más altos (en tamices de matraces de agitación) en comparación con la cepa
original, y algunas cepas aisladas mostraron un aumento del rendimiento en comparación con la cepa original de alrededor del 3,6 % en términos de gramos de triglicéridos producidos por gramo de glucosa consumido.
[0087] A continuación, estos dos aislados adaptados se analizaron para determinar la producción de triglicéridos en la escala de 7 L utilizando sacarosa de grado reactivo al 70 % como fuente de carbono. Se realizó un cultivo de control de la cepa original para la comparación. Los triglicéridos totales producidos en los cultivos aislados adaptados excedieron los del control durante todo el cultivo, y los cultivos aislados mostraron un aumento del 9 % al final del día seis. El rendimiento máximo de las cepas aisladas fue aproximadamente un 3-7 % mayor que el de la cepa de control.
[0088] Este ejemplo demuestra que el método de la invención se puede utilizar para crear cepas de microalgas que crezcan más rápido y produzcan más triglicéridos con una fuente de carbono fijo determinada, o más triglicéridos por gramo de fuente de carbono, que las cepas no adaptadas. El método es aplicable a fuentes de carbono distintas de la glucosa, es decir, fuentes como la fructosa, el glicerol y la xilosa, así como fuentes de carbono que contienen glucosa, como la sacarosa, incluida la caña de azúcar, el jugo de remolacha y las fuentes de carbono derivadas de la celulosa.
Ejemplo 3. Evolución de cepas de Prototheca tolerantes a la sal y evaluación en jarabe de caña de azúcar sin refinar
[0089] A través de la fermentación secuencial por lotes de las cepas de alta producción de aceite, las cepas S1133 y S1331 de Prototheca morifomis, en medio que contenía una concentración elevada de potasio, se obtuvieron dos cepas mutantes evolucionadas (cepas S2939 y S2941) que son ambas tolerantes a la sal y tienen productividades altas de triglicéridos. El proceso de evolución involucró el cultivo de las cepas originales en medio de siembra que se complementó con KCl 650 mM. La concentración de potasio se eligió de modo que redujera la tasa máxima de crecimiento específico de las cepas originales en aproximadamente un 70 %, lo que sirvió como presión de selección. El crecimiento celular se mantuvo en fase exponencial durante 70 generaciones mediante subcultivos secuenciales. Al final del proceso de evolución, la población de cultivos mixtos se sembró en placas para el aislamiento de colonias individuales, que luego se seleccionaron en matraces de agitación para identificar los mutantes con contenidos altos de triglicéridos y rendimientos tanto en un medio de control como en un medio suplementado con KCl 300 mM
[0090] Las cepas S2939 (derivadas de la cepa S1133) y S2941 (derivadas de la cepa S1331) resultaron ser las de mejor rendimiento en nuestra evaluación de matraces y se analizaron en la escala de 7 L con sacarosa de grado reactivo o jarabe de caña sin refinar como fuente de carbono. El contenido de azúcar fermentable, la concentración de potasio y la concentración de sodio de este jarabe de caña fueron 58 % (p/p), 190 mM y 25 mM, respectivamente. Se llevaron a cabo experimentos de control con una cepa metabolizadora de sacarosa, S1868, diseñada para expresar sacarasa, fabricada según el Ejemplo 11, para comparar el rendimiento.
[0091] Como se muestra en la Fig. 3, la producción de triglicéridos de las cepas S2939 y S2941 cultivadas con jarabe de caña sin refinar fue comparable a la de la cepa S1868 cultivada con sacarosa de grado reactivo y muy superior a la de la cepa S1868 cultivada con jarabe de caña. A pesar de la acumulación de > 160 mM K en las fermentaciones con jarabe de caña sin refinar, los triglicéridos totales producidos por S2939 y S2941 fueron un 90 -110 % de los producidos por la cepa S1868 en la fermentación de control con sacarosa grado reactivo. Los triglicéridos totales producidos por las cepas S2939 y S2941 en jarabe de caña fueron un 70 % y un 40 % más altos, respectivamente, que los producidos por la cepa E en la misma materia prima. Dado que la acumulación de > 50 mM K en el medio de fermentación puede reducir significativamente la capacidad de la cepa S1868 para producir triglicéridos, estos resultados demuestran claramente la solidez de las cepas S2939 y S2941.
Ejemplo 4: Selección de mutantes en presencia de un inhibidor de oxidasa alternativo
[0092] SHAM se usó como presión de selección para mejorar el rendimiento en Prototheca moriformis. Una cepa S1920 altamente productora de aceite, del Ejemplo 2, se mutagenizó con N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) o metanosulfonato de etilo (EMS) más radiación ultravioleta (UV) para generar una población celular heterogénea. A continuación, las células se extendieron sobre placas de agar que contenían medio de cultivo con una concentración final de SHAM de 8 mM o 10 mM. Las células de la población mutagenizada mostraron mayores tasas de supervivencia en las placas que contenían SHAM que las de la población no mutagenizada, que sirvió como control. Además, algunas de las colonias de la población mutagenizada crecieron a un tamaño mucho mayor en las placas que contenían SHAM que en las de la población de control. Estas colonias más grandes (un total de 96) se seleccionaron inicialmente para su evaluación en cultivos discontinuos para determinar sus contenidos de triglicéridos y los rendimientos de conversión de glucosa a triglicéridos. Las cinco cepas aisladas que mostraron contenidos de triglicéridos más altos, así como rendimientos de conversión más altos, en comparación con la cepa original, se analizaron de nuevo en matraces de agitación para confirmar su mejora en el rendimiento. Entre estos mutantes, la cepa S3150 mostró de manera constante un aumento en el rendimiento en comparación con la cepa original, la cepa S1920.
[0093] Para evaluar su rendimiento en condiciones de alta densidad celular, se evaluó la cepa S3150 en termentadores de 7 L utilizando un proceso de alimentación por lotes optimizado con sacarosa como fuente de carbono. También se realizaron ciclos de control replicados con la cepa original, la cepa S1920, para comparar el rendimiento. El rendimiento de la cepa S3150 fue superior al de la cepa original, la cepa S1920, y la cepa S3150 logró un aumento en el rendimiento de azúcar/triglicéridos de aproximadamente un 7 % en comparación con la cepa S1920. Además, la cantidad total de lípidos producidos por la cepa S3150 fue comparable a la observada para su matriz, la cepa S1920. Estos resultados sugieren que el uso de SHAM como presión de selección para el cribado es un método eficaz para aislar mutantes con un rendimiento mejorado.
Ejemplo 5: Ingeniería genética de Chlorella protothecoides para expresar una sacarasa exóaena
[0094] Cepas y medios: Chlorella protothecoides (UTEX 250) se obtuvo de la Colección de cultivos de algas de la Universidad de Texas (Culture Collection of Alga at the University of Texas) (Austin, Texas, EE. UU.). Los cultivos madre se mantuvieron en medio de proteosa (Proteose) modificado. El medio de proteosa modificado consiste en 0,25 g de NaNOa, 0,09 g de K2HPO4, 0,175 g de KH2PO40,025 g, 0,025 g de CaCfc-2H2O, 0,075 g de MgSO4 -7H2O, y 2 g de extracto de levadura por litro (g/L).
[0095] Construcción de plásmidos: Para expresar la forma secretada de invertasa en Chlorella protothecoides, se puso el gen SUC2 de Saccharomyces cerevisiae bajo el control de tres promotores diferentes: el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CMV), el promotor del virus de Chlorella (NC-1A) y el promotor de Chlorella HUP1. Se sintetizó un gen SUC2 de levadura para permitir el uso de codones optimizados para C. protothecoides y que incluía una secuencia señal requerida para dirigir la secreción extracelular de invertasa. Cada construcción se construyó en pBluescript KS+, y los sitios EcoRI/AscI, Ascl/Xhol y Xhol/BamHI se introdujeron en cada promotor, gen de invertasa y 3'UTR de CMV, respectivamente, mediante amplificación por PCR usando cebadores específicos. Los productos de PCR purificados se clonaron de manera secuencial.
[0096] Transformación de Chlorella protothecoides: Se dejó crecer un cultivo de Chlorella protothecoides en medio de proteosa modificado en un agitador giratorio bajo luz continua a 75 pmol fotones m-2 segundo-1 hasta alcanzar una densidad celular de 6*106células/ml.
[0097] Para la transformación biolística, se prepararon portadores de oro S550d de Seashell Technology según el protocolo del fabricante. Brevemente, se mezcló una construcción linealizada (20 pg) por Bsal con 50 pl de solución amortiguadora de unión y 60 pl (3 mg) de portadores de oro S550d y se incubó en hielo durante 1 min. Se añadió solución amortiguadora de precipitación (100 pl) y la mezcla se incubó en hielo durante 1 min más. Después de agitación suave, las partículas recubiertas de ADN se sedimentaron haciéndolas girar a 10000 r.p.m. en una microcentrífuga Eppendorf durante 10 segundos. El sedimento de oro se lavó una vez con 500 pl de etanol frío al 100 %, se sedimentó mediante un breve giro en la microcentrífuga y se resuspendió con 50 pl de etanol enfriado con hielo. Después de una breve sonicación (1-2 segundos), se transfirieron inmediatamente 10 pl de partículas recubiertas de ADN a la membrana portadora. Las células se recolectaron, se lavaron una vez con agua destilada estéril, se resuspendieton en 50 pl de medio (1 x 107 células) y se extendieron en el tercio central de una placa Proteous no selectiva. Las células se bombardearon con el sistema de suministro de partículas biolísticas PDS-1000/He (Bio-Rad). Se usaron discos de ruptura (1100 y 1350 psi), y las placas se colocaron 9-12 cm por debajo del conjunto pantalla/macroportador. Se permitió que las células se recuperaran a 25 °C durante 12-24 horas. Tras la recuperación, las células se separaron de las placas con una espátula de goma, se mezclaron con 100 pl de medio y se extendieron sobre placas de medio de proteosa modificado con sacarosa al 1 %. Después de 7-10 días de incubación a 25 °C en la oscuridad, en las placas eran visibles colonias que representaban las células transformadas.
[0098] Para la transformación con electroporación, las células se recogieron, se lavaron una vez con agua destilada estéril y se resuspendieron en una solución amortiguadora Tris-fosfato (20 mM Tris-HCl, pH 7,0; fosfato de potasio 1 mM) que contenía sacarosa 50 mM a una densidad de 4x108células/ml. Alrededor de 250 pl de suspensión celular (1x108células) se colocaron en una cubeta de electroporación desechable de 4 mM de separación. A la suspensión celular, se añadieron 5 pg de ADN de plásmido linealizado y 200 pg de ADN transportador (ADN de esperma de salmón fragmentado). A continuación, la cubeta de electroporación se incubó en un baño de agua con hielo a 16 °C durante 10 min. Luego se aplicó un pulso eléctrico (1100 V/cm) a la cubeta a una capacitancia de 25 pF (no se usó resistencia de derivación para la electroporación) usando un aparato de electroporación Gene Pulser II (Bio-Rad Labs, Hercules, CA). A continuación, la cubeta se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos, después de lo cual la suspensión celular se transfirió a 50 ml de medio de proteosa modificado y se agitó en un agitador giratorio durante 2 días. Después de la recuperación, las células se recogieron a baja velocidad (4000 r.p.m.), se resuspendieron en medio de proteosa modificado y se sembraron a baja densidad en placas de medio de proteosa modificado con sacarosa al 1 %. Después de 7-10 días de incubación a 25 °C en la oscuridad, en las placas eran visibles colonias que representaban células transformadas.
[0099] Cribado de transformantes y genotipado: Las colonias se recogieron de placas de proteosa modificada cultivadas en la oscuridad con sacarosa al 1 %, y se transfirió aproximadamente la misma cantidad de células a placas de 24 pocillos que contenían 1 ml de medio líquido de proteosa modificado con sacarosa al 1 %. Los cultivos
se mantuvieron en la oscuridad y se agitaron con un agitador orbital de Labnet (Berkshire, Reino Unido) a 430 r.p.m. durante 5 días.
[0100] Para verificar la presencia del gen de la invertasa introducido en los transformantes de Chlorella, se aisló el ADN de cada transformante y se amplificó con un conjunto de cebadores específicos del gen (construcción CMV: cebador directo (CAACCACGTCTTCAAAGCAA) (SEQ ID N.°: 1)/cebador inverso (TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA ) (SEQ ID N.°:2), construcciones CV: cebador directo (TTGTCGgAa TGTCATATCAA) (SEQ ID N.°:3)/cebador inverso (TCCGGT GT GTT GT AAGTCCA) (SEQ ID N.°:2) 171), y construcción HUP1: cebador directo (AACGCCTTTGTACAACTGCA) ( SEQ ID N.°:4)/cebador inverso (TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA) (SEQ ID N.°:2) 171)). Para el aislamiento rápido del ADN, se resuspendió un volumen de células (aproximadamente de 5 a 10 uL de tamaño) en 50 uL de Na-EDTA 10 mM. La suspensión celular se incubó a 100 °C durante 10 min y se sonicó durante 10 s. Después de centrifugación a 12000 g durante 1 min, se usaron 3 uL de sobrenadante para la reacción de PCR. La amplificación por PCR se realizó en el termociclador de ADN (Perkin-Elmer GeneAmp 9600). La mezcla de reacción (50 uL) contenía 3 uL de ADN extraído, 100 pmol de cada uno de los cebadores respectivos descritos anteriormente, dNTP 200 uM, 0,5 unidades de ADN polimerasa Taq (NEB) y solución amortiguadora de ADN polimerasa Taq según las instrucciones del fabricante. La desnaturalización del ADN se llevó a cabo a 95 °C durante 5 min para el primer ciclo y luego durante 30 s. Las reacciones de hibridación y extensión del cebador se llevaron a cabo a 58 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 1 minuto, respectivamente. A continuación, los productos de la PCR se visualizaron en geles de agarosa al 1 % teñidos con bromuro de etidio.
[0101] Crecimiento en cultivo líquido: Después de cinco días de cultivo en la oscuridad, los transformantes con genotipo positivo mostraron crecimiento en medio mínimo de proteosa líquida sacarosa al 1 % en la oscuridad, mientras que las células de tipo salvaje no mostraron crecimiento en el mismo medio en la oscuridad.
Ejemplo 6: Transformación de cepas de algas con una invertasa secretada derivada de S. cerevisiae
[0102] Invertasa secretada: Un gen que codifica una sacarasa secretada (n.° de acceso Gen Bank NP_012104 de Saccharomyces cerevisiae) se sintetizó por segunda vez como un fragmento Asc I-Xho de 1599 pb que posteriormente se subclonó en un derivado pUC19 que poseía el promotor 35s del virus del mosaico de la coliflor y 3'UTR como casetes EcoR I/Asc I y Xho/Sac I, respectivamente.
[0103] Crecimiento de células de algas: Los medios utilizados en estos experimentos fueron medios de base líquida (2 g/l de extracto de levadura, NaNÜ3 2,94 mM, CaCb^2H2O 0,17 mM, MgSÜ4^7H2O 0,3 mM, K2HPO4 0,4 mM, KH2PO41,28 mM, NaCl 0,43 mM) y medios de base sólida (+ agarosa al 1,5 %) que contenían carbono fijo en forma de sacarosa o glucosa (según se designe) a una concentración final del 1 %. Las cepas utilizadas en este experimento no crecieron en la oscuridad en medios básicos en ausencia de una fuente de carbono fijo adicional. Las especies se sembraron en estrías en placas y se cultivaron en la oscuridad a 28 °C. Se recogieron colonias individuales y se usaron para inocular 500 ml de medio base líquido que contenía glucosa al 1 % y se dejaron crecer en la oscuridad hasta la fase logarítmica media, midiendo los recuentos de células cada día. El crecimiento en sacarosa en la oscuridad como única fuente de carbono de cada una de las siguientes cepas se había analizado previamente y no mostró crecimiento, por lo que se eligieron para la transformación con una invertasa secretada: (1) Chlorella protothecoides (UTEX 31); (2) chlorella minutissima (UTEX 2341); y (3) Chlorella emersonii (CcAp 211/15).
[0104] Transformación de células de algas mediante bombardeo de partículas: Se centrifugó suficiente cultivo para dar aproximadamente 1-5 x 108 células totales. El sedimento resultante se lavó con medio base sin fuente fija de carbono añadida. Las células se centrifugaron de nuevo y el sedimento se resuspendió en un volumen de medio base suficiente para dar 5 x 107 a 2 x 108 células/ml. A continuación, se sembraron en placas 250-1000 pl de células en medios de base sólida suplementados con sacarosa al 1 % y se dejaron secar sobre la placa en una cabina de flujo laminar. El ADN del plásmido se precipitó sobre partículas de oro según las recomendaciones del fabricante (Seashell Technology, La Jolla, CA). Las transformaciones se llevaron a cabo usando un sistema de suministro de partículas BioRad PDS He-1000 usando discos de ruptura de 1350 psi con el ensamblaje del macroportador colocado a 9 cm del soporte del disco de ruptura. Después de las transformaciones, las placas se incubaron en la oscuridad a 28 °C. Todas las cepas generaron múltiples colonias transformantes. Las placas de control transformadas sin inserto de invertasa, pero por lo demás preparadas de manera idéntica, no contenían colonias.
[0105] Análisis de transformantes de Chlorella protothecoides: El ADN genómico se extrajo de células de Chlorella protothecoides de tipo salvaje y colonias transformantes de la siguiente manera: las células se resuspendieron en 100 ul de solución amortiguadora de extracción (87,5 mM Tris Cl, pH 8,0, NaCl 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8,0, SDS al 0,25 %) y se incubaron a 60 °C, con mezcla ocasional por inversión, durante 30 minutos. Para la PCR, las muestras se diluyeron 1:100 en Tris Cl 20 mM, pH 8,0.
[0106] El genotipado se realizó en ADN genómico extraído del WT (tipo salvaje), los transformantes y el ADN plasmídico. Las muestras se genotiparon para identificar el gen marcador. Los cebadores 2383 (5' CT GACCCGACCT ATGGGAGCGCTCTTGGC 3') (SEQ ID N.°: 5) y 2279 (5' CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3') (SEQ ID N.°: 6) se usaron en esta PCR de genotipado. El perfil de
PCR utilizado fue el siguiente: desnaturalización a 94 °C durante 5 min; 35 ciclos de 94 °C -30 seg, 60 °C - 30 seg, 72 °C -3 min; 72 °C -5 min. Se amplificó una banda de tamaño idéntico a partir de los controles positivos (plásmido) y dos transformantes de Chlorella protothecoides (UTEX 31).
[0107] Análisis de transformantes de Chlorella minutissima y Chlorella emersonii: El ADN genómico se extrajo del WT de Chlorella y los transformantes de la siguiente manera: las células se resuspendieron en 100 ul de solución amortiguadora de extracción (Tris Cl 87,5 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8,0, SDS al 0,25 %) y se incubaron a 60 °C, con mezcla ocasional mediante inversión, durante 30 minutos. Para la PCR, las muestras se diluyeron a 1:100 en Tris-Cl 20 mM, pH 8,0. El genotipado se realizó en el ADN genómico extraído del WT, los transformantes y el ADN plasmídico. Las muestras se genotiparon para identificar el gen marcador. Los cebadores 2336 (5' GTGGCCATATGGACTTACAA 3') (SEQ ID N.°: 7) y 2279 (5' CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3') (SEQ ID N.°: 6) se denominaron conjunto de cebadores 2 (producto esperado de 1215 pb), mientras que los cebadores 2465 (5' CAAGGGCTGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACG 3') (SEQ ID N.°: 8) y 2470 (5' CACCCGTCGTCATGTTCACGGAGCCCAGTGCG 3') (SEQ ID N.°: 9) se denominaron conjunto de cebadores 4 (producto esperado de 1442 pb). El perfil de PCR utilizado fue el siguiente: desnaturalización a 94 °C durante 2 min; 29 ciclos de 94 °C -30 seg, 60 °C - 30 seg, 72°C - 1 min, 30 seg; 72 °C -5 min. Se usó un control de plásmido que contenía la invertasa secretada como control para la PCR.
[0108] La secuencia de la construcción de invertasa corresponde a la SEQ ID N.°: 10.
Ejemplo 7: Recombinación homologa en especies de Prototheca
[0109] La recombinación homóloga de transgenes tiene varias ventajas. Primero, la introducción de transgenes sin recombinación homóloga puede ser impredecible porque no hay control sobre el número de copias del plásmido que se introduce en la célula. Además, la introducción de transgenes sin recombinación homóloga puede ser inestable debido a que el plásmido puede permanecer episomal y perderse durante las subsiguientes divisiones celulares. Otra ventaja de la recombinación homóloga es la capacidad de “inactivar” elementos genéticos que se desee, introducir etiquetas de epítopos, cambiar promotores de genes endógenos y alterar de otro modo elementos genéticos que se desee (por ejemplo, la introducción de mutaciones puntuales).
[0110] Se construyeron dos vectores usando una región específica del genoma de Prototheca moriformis (UTEX 1435), designada KE858. KE858 es un fragmento genómico de 1,3 kb que abarca parte de la región codificante de una proteína que comparte homología con la familia de proteínas del ARN de transferencia (ARNt). Las transferencias de Southern han demostrado que la secuencia KE858 está presente en una sola copia en el genoma de Prototheca moriformis (UTEX 1435). El primer tipo de vector que se construyó, denominado SZ725 (SEQ ID N.°: 11), consistió en el fragmento completo de KE858 de 1,3 kb clonado en un esqueleto del vector pUC19 que también contenía el gen de invertasa de levadura (suc2) con codones optimizados. El fragmento KE858 contiene un sitio SnaB1 único que no aparece en ningún otro lugar de la construcción de acceso. El segundo tipo de vector que se construyó, denominado SZ726 (SEQ ID N.°: 12), consistía en la secuencia KE858 que había sido interrumpida por la inserción del gen de la invertasa de levadura (suc2) en el sitio SnaB1 dentro de la secuencia genómica KE858. El fragmento de ADN completo que contiene las secuencias KE858 que flanquean el gen de la invertasa de levadura puede escindirse del esqueleto del vector mediante digestión con EcoRI, que realiza la escisión en cualquiera de los extremos de la región KE858.
[0111] Ambos vectores se usaron para dirigir la recombinación homóloga del gen de la invertasa de levadura (suc2) en la correspondiente región KE858 del genoma de Prototheca moriformis (UTEX 1435). Los extremos de ADN lineal homólogos a la región genómica que era el objetivo de la recombinación homóloga se expusieron mediante la digestión de la construcción del vector SZ725 con SnaB1 y la construcción del vector SZ726 con EcoRI. Luego, las construcciones de vectores digeridos se introdujeron en cultivos de Prototheca moriformis utilizando los métodos descritos anteriormente. A continuación, se seleccionaron los transformantes de cada construcción de vector utilizando placas de sacarosa. Se analizaron diez transformantes clonalmente puros independientes de cada transformación de vector para detectar la recombinación exitosa del gen de la invertasa de levadura en la ubicación genómica deseada (usando transferencias de Southern) y la estabilidad del transgén.
[0112] El análisis de transferencia Southern de los transformantes de SZ725 mostró que 4 de los 10 transformantes seleccionados para el análisis contenían las bandas recombinantes predichas, lo que indica que se había producido un evento de cruce único entre las secuencias KE858 del vector y las secuencias KE858 del genoma. Por el contrario, los diez transformantes de SZ726 contenían las bandas recombinantes predichas, lo que indica que se habían producido eventos de cruce doble entre el fragmento EcoRI de pSZ726 que lleva la secuencia KE858 que flanquea el transgén de la invertasa de levadura y la región KE858 correspondiente del genoma.
[0113] La expresión de sacarasa y la estabilidad del transgén se evaluaron mediante cultivo de los transformantes durante más de 15 generaciones en ausencia de selección. Se seleccionaron los cuatro transformantes de SZ725 y los diez transformantes de SZ276 que dieron positivo para el transgén mediante transferencia de Southern y se cultivaron en serie 48 colonias individuales de cada uno de los transformantes: primero sin selección en medios que contenían glucosa y luego con selección en medios que contenían sacarosa como única fuente de carbono. Los diez
transformantes de SZ276 (100 %) conservaron su capacidad de crecer en sacarosa después de 15 generaciones, mientras que aproximadamente el 97 % de los transformantes de SZ725 conservaron su capacidad de crecer en sacarosa después de 15 generaciones. Los transgenes introducidos por un evento de cruce doble (vector SZ726) tienen una estabilidad extremadamente alta durante las duplicaciones generacionales. Por el contrario, los transgenes introducidos por un solo evento cruzado (vector SZ725) pueden dar lugar a cierta inestabilidad en las duplicaciones generacionales porque, si se introdujeron copias en tándem de los transgenes, las regiones homólogas repetidas que flanquean los transgenes pueden recombinarse y escindir el ADN transgénico ubicado entre ellas.
[0114] Estos experimentos demuestran el uso exitoso de la recombinación homóloga para generar transformantes de Prototheca que contienen un gen heterólogo de sacarasa que está integrado de forma estable en los cromosomas nucleares del organismo. El éxito de la recombinación homóloga permite otras alteraciones genómicas en Prototheca, incluidas las deleciones de genes, las mutaciones puntuales y el etiquetado de epítopos de un producto génico deseado.
Uso de la recombinación homóloga para eliminar un gen de Prototheca moriformis endógeno
[0115] En un cribado genómico/de ADNc de Prototheca moriformis, se identificó un ADNc de estearoil ACP desaturasa (SAPD) endógena. Las enzimas estearoil ACP desaturasa son parte de la ruta de síntesis de lípidos y funcionan para introducir dobles enlaces en las cadenas de acilo graso. En algunos casos, puede ser ventajoso eliminar o reducir la expresión de las enzimas de la ruta de los lípidos para alterar el perfil de ácidos grasos. Se creó una construcción de recombinación homóloga para evaluar si la expresión de una enzima estearoil ACP desaturasa endógena se puede reducir (o inactivar) y si se puede observar una reducción correspondiente de ácidos grasos insaturados en el perfil de lípidos de la célula hospedadora. Una secuencia codificante de aproximadamente 1,5 kb de un gen de estearoil ACP desaturasa de Prototheca moriformis (UTEX 1435) se identificó y se clonó (SEQ ID N.°:13). La construcción de recombinación homóloga se construyó utilizando 0,5 kb de la secuencia codificante de SAPD en el extremo 5' (sitio de direccionamiento 5'), seguido del promotor de p-tublina de Chlamydomonas reinhardtii que activa un gen suc2 de sacarasa de levadura con codones optimizados con la región 3'UTR de Chlorella vulgaris. A continuación, se insertó el resto (~1 kb) de la secuencia de codificación de SAPD de Prototheca moriformis después de la región 3'UTR de C.vulgaris para formar el sitio de direccionamiento de 3'. La secuencia para este casete de recombinación homóloga se enumera en la SEQ ID N.°:14. Como se ha mostrado antes, la tasa de éxito para la integración del casete de recombinación homóloga en el genoma nuclear se puede aumentar linealizando el casete antes de transformar las microalgas, dejando los extremos expuestos. El casete de recombinación homóloga dirigido a una enzima SAPD endógena de Prototeca moriformis se linealiza y luego se transforma en la célula hospedadora (Prototheca moriformis, UTEX 1435). Una integración exitosa eliminará la región codificante de la enzima SAPD endógena del genoma hospedador a través de un evento de recombinación recíproca doble, mientras que la expresión del gen suc2 recién insertado estará regulada por el promotor de la ptubulina de C.reinhardtii. Los clones resultantes pueden examinarse utilizando placas/medios que contienen sacarosa como única fuente de carbono. Los clones que contengan una integración exitosa del casete de recombinación homóloga tendrán la capacidad de crecer con sacarosa como única fuente de carbono y los cambios en la saturación general de los ácidos grasos en el perfil de lípidos servirán como un factor secundario de confirmación. Además, los ensayos de transferencia de Southern que utilizan una sonda específica para el gen suc de sacarasa de levadura y la RT-PCR también pueden confirmar la presencia y expresión del gen de la invertasa en clones positivos. Como alternativa, se puede usar la misma construcción sin el promotor de p-tubulina para escindir la región codificante de la enzima SAPD endógena. En este caso, el gen suc2 de sacarasa de levadura recién insertado estará regulado por el promotor SAPD/5'UTR endógeno.
Ejemplo 8: Expresión de diversas tioesterasas en Prototheca
[0116] En la Solicitud PCT No. PCT/US2009/66142 se han descrito previamente métodos y efectos para expresar un gen heterólogo de tioesterasa en especies de Prototheca. Se investigó más a fondo el efecto de otros genes/productos genéticos de tioesterasa de especies de plantas superiores. Estas tioesterasas incluyen tioesterasas de las siguientes plantas superiores:
GenBank
Especies N° de acceso Especificidad ID SEQ N°:
Cinnamomum camphora Q39473 C14 SEQ ID N.°: 15-16
Umbellularia californica Q41635 C10-C12 SEQ ID N.°: 17-18
Cuphea hookeriana AAC49269 C8-C10 SEQ ID N.°: 19-20
Cuphea palustris AAC49179 C8 SEQ ID N.° 21-22 Cuphea lanceolata CAB60830 C10 SEQ ID N.°: 23-24
Iris germanica AAG43858.1 C14 SEQ ID N.°: 25-26 Myristicafragrans AAB717291.1 C14 SEQ ID N.°: 27-28 Cuphea palustris AAC49180 C14 SEQ ID N.°: 29-30 Ulmus americana AAB71731 amplio SEQ ID N.° 31-32
[0117] En todos los casos, cada una de las construcciones de tioesterasa anteriores se transformó en Prototheca moriformis (UTEX 1435) mediante bombardeo de partículas biolísticas. Otros métodos de transformación, incluida la recombinación homóloga, como se describe en la Solicitud PCT N.° PCT/US2009/66142, también serían adecuados para la expresión heteróloga de genes de interés. Se realizó una transformación de Prototheca moriformis (UTEX 1435) con cada una de las construcciones de tioesterasa anteriores. Cada una de las construcciones contenía un gen NeoR y la selección de clones positivos se llevó a cabo usando 100 pg/ml de G418. Se optimizaron los codones de todas las regiones de codificación para reflejar el sesgo de codones inherente a genes nucleares de Prototheca moriformis UTEX 1435. Tanto las secuencias de aminoácidos como las secuencias de ADNc para la construcción utilizada se enumeran en el listado de secuencias. El péptido de tránsito para cada una de las tioesterasas de plantas superiores se reemplazó con un péptido de tránsito con codones optimizados procedente de desaturasa de ácidos grasos delta 12 de Prototheca moriformis (SEQ ID N.°: 33) o de estearoil ACP desaturasa de Chlorella protothecoides (SEQ ID N.°: 34). Todas las construcciones de tioesterasa fueron dirigidas por el promotor de betatubulina/5'UTR de Chlamydomanas reinhardtii. El crecimiento y la producción de lípidos de los clones positivos seleccionados se compararon con los de Prototheca moriformis (UTEx 1435) de tipo salvaje (sin transformar). Los clones positivos seleccionados y de tipo salvaje se cultivaron en placas G418 con glucosa al 2 %. El análisis de perfiles de lípidos en clones positivos seleccionados para cada construcción se resume a continuación (expresado en % de área) en la Tabla 1.
Tabla 1. Perfiles de lípidos de Prototheca moriformis que expresan varias tioesterasas heterólogas
[0118] Los resultados muestran que todas las tioesterasas expresaron perfiles de ácidos grasos afectados en algún grado. Teniendo en cuenta la fila “Saturados totales”, el grado de saturación se vio profundamente afectado por la expresión de varias de las tioesterasas, incluidas las de U. californica, C. camphora y, de manera más notable, U. americana. Estos cambios en el porcentaje de saturados totales fueron inesperados porque la expresión heteróloga de tioesterasas de plantas superiores aparentemente puede afectar a más que solo a las longitudes de cadena de lípidos; también puede afectar a otros atributos de los perfiles de lípidos producidos por las microalgas, a saber, el grado de saturación de los ácidos grasos.
[0119] Se cultivaron adicionalmente clones seleccionados transformados con tioesterasa C8 de C. palustris, tioesterasa de C. hookeriana, tioesterasa de U. Californica y C. camphora en cantidades variables de G418 (de 25
mg/L a 50 mg/L) y a temperaturas variables (de 22 °C a 25 °C) y se determinó el perfil de lípidos para estos clones. La Tabla 2 resume el perfil de lípidos (en % de área) de clones representativos que contienen cada tioesterasa. Una segunda construcción que contiene la tioesterasa de U. americana se construyó y se transformó en Prototheca moriformis (UTEX 1435) utilizando los métodos biolísticos descritos anteriormente. Esta segunda construcción se introdujo en la célula mediante recombinación homóloga. Los métodos de recombinación homóloga en especies de Prototheca se habían descrito previamente en la Solicitud PCT N.° PCT/US2009/66142. El ADN homólogo que se utilizó fue de la secuencia de ADN genómico de "6S" de Prototheca moriformis UTEX 1435. El agente de selección fue la capacidad de crecer en sacarosa, utilizando un gen suc2 de S. cerevisiae con codones optimizados dirigido por el promotor de beta tubulina de C. Reinhardtii. El péptido de tránsito de U. americana nativo se reemplazó con el péptido de tránsito de estearoil ACP desaturasa de Chlorella protothecoides (UTEX 250). El ADNc de esta construcción se enumera en el Listado de secuencias como la SEQ ID N.°:35. La selección de clones positivos se realizó en placas con sacarosa al 2 % y los cultivos resultantes para la determinación del perfil de lípidos también se cultivaron en medio que contenía sacarosa al 2 %. Un perfil de lípidos representativo para esta cepa de Prototheca moriformis que contiene una tioesterasa de U. americana heteróloga homólogamente recombinada se resume en la Tabla 2.
T l 2 P rfil li í i Pr h m rif rmi ni n n n h r l i r
[0120] Al igual que con los clones descritos anteriormente, todos los transformantes que contenían un gen de tioesterasa heterólogo mostraron perfiles de ácidos grasos afectados en algún grado, y el porcentaje total de ácidos grasos saturados también cambió, en comparación con la Prototheca moriformis de tipo salvaje (sin transformar). La Prototheca moriformis que contenía la tioesterasa de U. americana introducida por recombinación homóloga tuvo el mayor aumento en los saturados totales.
[0121] Además, los clones transgénicos que contenían la tioesterasa de C. hookeriana, C. camphora, U. Californica o U. americana exógena se evaluaron para detectar nuevos perfiles de lípidos. El clon de C. hookeriana que contenía tioesterasa logró el siguiente perfil de lípidos cuando se cultivó en glucosa al 2 %, 25 mg/ml de G418 a 22 °C: 5,10 % C8:0; 18,28 % C10:0; 0,41 % C12:0; 1,76 % C14:0; 16,31 % C16:0; 1,40 % C18:0; 40,49 % C18:1; y 13,16 % C18:2. El clon de C. camphora que contenía tioesterasa (que también contenía una sacarasa exógena) logró el siguiente perfil de lípidos cuando se cultivó en sacarosa al 2 % a 25 °C: 0,04 % C10:0; 6,01 % C12:0; 35,98 % C14:0; 19.42 C16:0; 1,48 % C18:0; 25,44 % C18:1; y 9,34 % C18:2. El clon de U. calfornica que contenía tioesterasa logró el siguiente perfil lipídico cuando se cultivó en glucosa al 2 %, 25-100 mg/ml G418 a 22 °C: 0 % C8:0; 0,11 % C10:0; 34,01 % C12:0; 5,75 % C14:0; 14,02 % C16:0; 1,10 % C18:0; 28,93 % C18:1; y 13,01 % C18:2. El clon de U. americana que contenía tioesterasa logró el siguiente perfil lipídico cuando se cultivó en glucosa al 2 % a 28 °C: 1,54 % C10:0; 0,43 % C12:0; 7,56 % C14:0; 39,45 % C16:0; 2,49 % C18:0; 38,49 % C18:1; y 7,88 % C18:2.
Ejemplo 9: Transformación de Prototheca con múltiples genes de tioesterasa heterólogos exógenos
[0122] Se transformó la cepa de microalgas Prototheca moriformis (UTEX 1435) usando los métodos descritos anteriormente para expresar múltiples tioesterasas en un solo clon. La expresión de múltiples tioesterasas en un solo clon permite que las microaglas produzcan aceites con perfiles de ácidos grasos completamente diferentes de los elaborados cuando se expresa cualquier tioesterasa sola (como se demuestra en los Ejemplos anteriores). Prototheca moriformis (UTEX 1435) se transformó por primera vez con la tioesterasa de Cinnamomum camphora (una tioesterasa con preferencia por C14) junto con un gen de sacarasa, el suc2 de S. cerevisiae (la selección fue la capacidad de crecer en sacarosa) usando recombinación homóloga. El ADN utilizado para esta construcción de recombinación homóloga procede de la región KE858 de ADN genómico de Prototheca moriformis, como se describe en la Sección III anterior. La porción relevante de esta construcción se enumera en el Listado de Secuencias como la SEQ ID N.°:36. Los clones positivos se seleccionaron en placas que contenían sacarosa. Luego, un clon positivo se volvió a transformar con uno de tres casetes, cada uno de los cuales codificaba resistencia al antibiótico G418, así como una tioesterasa adicional: (1) gen de tioesterasa de Cuphea hookeriana (prefiriendo C8-10), SEQ ID N.°:37; (2) gen de tioesterasa de Umbellularia californica (con preferencia por C12), SeQ ID N.°:38; o tioesterasa de Ulmus americana (amplio; con preferencia por C10-C16), SeQ ID N.°:39. En el listado de Secuencias está incluida la secuencia de la porción relevante de cada construcción. Los clones que expresaban ambos genes de tioesterasa se seleccionaron en medio que contenía sacarosa con 50 pg/ml de G418.
Se seleccionaron los clones positivos y se analizaron el crecimiento y el perfil lipídico. La Tabla 3 resume el perfil lipídico de clones positivos representativos (expresado en % de área).
Tabla 3. Perfiles li ídicos de Prototheca moriformis transformada con múlti les tioesterasas.
[0123] Además, un clon con tioesterasa doble con tioesterasas de C. camphora y U. californica se cultivó en un medio que contenía sacarosa al 2 % con 50 mg/l de G418 a 22 °C. El perfil de ácidos grasos obtenido de esta cepa en estas condiciones de crecimiento fue: C8:0 (0); C10:0 (0,10); C12:0 (31,03); C14:0 (7,47); C16:0 (15,20); C18:0 (0,90); C18:1 (30,60); C18:2 (12,44); y C18:3a (1,38), con un total de saturados de 54,7.
[0124] Se fabricaron clones con tioesterasa doble con dos construcciones de recombinación homóloga (una dirigida a la región 6S y la otra dirigida a la región KE858) que contenían la tioesterasa de C. camphora. Un clon representativo positivo tenía un perfil de ácidos grasos de: 0 % C8:0; 0,06 % C10:0; 5,91 % C12:0; 43,27 % C14:0; 19,63 % C16:0; 0,87 % C18:0; 13,96 % C18:1; y 13,78 % C18:2, con un total de saturados de 69,74 %. Este clon tenía un nivel de C12-C14 superior al 49 %, que es más de 37 veces el nivel de C12-C14 en las células de tipo salvaje.
[0125] Los datos anteriores muestran que se pueden coexpresar con éxito múltiples tioesterasas en microalgas. La coexpresión de múltiples tioesterasas da como resultado perfiles de ácidos grasos alterados que difieren significativamente no solo de la cepa de tipo salvaje, sino también del perfil de ácidos grasos obtenido por la expresión de cualquiera de las tioesterasas individuales. La expresión de múltiples tioesterasas con especificidad de longitud de cadena superpuesta puede dar como resultado aumentos acumulativos en esos ácidos grasos específicos.
[0126] La expresión de tioesterasas heterólogas (solas o en combinación) en Prototheca moriformis no solo altera los perfiles de ácidos grasos/lípidos de la cepa hospedadora, sino que, en comparación con los aceites actualmente disponibles de una variedad de cultivos de semillas, estos perfiles son aceites verdaderamente únicos y no se encuentran en ningún otro sistema actualmente disponible. Las cepas transgénicas no solo muestran diferencias significativas con respecto a la cepa de tipo salvaje no transformada, sino que tienen perfiles notablemente diferentes respecto de muchos aceites comerciales. Por ejemplo, tanto el aceite de coco como el de palmiste tienen contenidos de ácidos grasos C8-C10 que oscilan entre el 5,5 y el 17 %. La cepa transgénica que expresa la tioesterasa de C. palustris con preferencia por C8 o la tioesterasa de C. hookeriana con preferencia por C10 se acumula entre el 3,66 y el 8,65 %, respectivamente. Estos contenidos de ácidos grasos C8-C10 son similares al aceite de coco y el palmiste; sin embargo, las cepas de algas transgénicas carecen de los ácidos grasos C12:0 significativamente más altos y tienen C16:0 extremadamente altos (un 23 % en transgénicos frente a un 11-16 % en aceite de coco o de palmiste, respectivamente y/o 18:1 (un 50-57 % en transgénicos frente a un 8-19 % en aceite de coco o de palmiste, respectivamente).
Ejemplo 10: Alteración de los contenidos de ácidos grasos saturados en las microalgas Prototheca m oriform is
[0127] Como parte de una evaluación genómica utilizando un enfoque bioinformático basado en ADNc, transcriptoma Illumia y secuenciación Roche 454 de ADN genómico de Prototheca moriformis (UTEX 1435), se identificaron dos grupos específicos de genes implicados en la desaturación de ácidos grasos: estearoil ACP desaturasas (SAD) y desaturasas de ácidos grasos delta 12 (A12 FAD). Las enzimas estearoil ACP des aturasas forman parte de la vía de síntesis de lípidos y funcionan para introducir enlaces dobles en las cadenas de acilo graso, por ejemplo, la síntesis de ácidos grasos C18:1 a partir de ácidos grasos C18:0. Las desaturasas de ácidos grasos delta 12 también forman parte de la vía de síntesis de lípidos y funcionan para introducir dobles enlaces en ácidos grasos ya insaturados, por ejemplo, la síntesis de ácidos grasos C18:2 a partir de ácidos grasos C18:1. El análisis de transferencia Southern utilizando sondas basadas en las dos clases de genes de desaturasa de ácidos grasos identificados durante los procesos de bioinformática indicó que cada clase de genes de desaturasa
probablemente estaba compuesta por varios miembros de la familia. Además, los genes que codifican estearoil ACP desaturasas se dividieron en dos familias distintas. Sobre la base de estos resultados, se diseñaron tres construcciones de interrupción de genes para interrumpir potencialmente múltiples miembros de la familia de genes al dirigirse a regiones codificantes más altamente conservadas dentro de cada familia de enzimas desaturasas.
[0128] Se diseñaron tres construcciones dirigidas a la recombinación homóloga utilizando:
(1) porciones altamente conservadas de la secuencia codificante de los miembros de la familia de la desaturasa de ácidos grasos delta 12(d12FAD) y (2) dos construcciones dirigidas a cada una de las dos familias distintas de SAD, cada una con regiones conservadas de las secuencias codificantes de cada familia. Esta estrategia introduciría un gen marcador seleccionable (el Casete suc2 de sacarasa de S. cerevisiae que confiere la capacidad de hidrolizar la sacarosa) en estas regiones codificantes altamente conservadas (dirigidas a varios miembros de la familia) en lugar de una estrategia clásica de reemplazo de genes en la que la recombinación homóloga se dirigiría a las regiones flanqueantes del gen deseado.
[0129] Todas las construcciones se introdujeron en las células mediante transformación biolística utilizando los métodos descritos anteriormente y las construcciones se linealizaron antes de introducirlas en las células. Los transformantes se seleccionaron en placas/medios que contenían sacarosa y los cambios en el perfil de lípidos se analizaron utilizando el método descrito anteriormente. Las secuencias relevantes de cada una de las tres construcciones dirigidas se enumeran a continuación.
Descripción
[0130] SEQ ID N.°: secuencia 5' de la región codificante de d12FAD de la construcción de direccionamiento SEQ ID N.°: 40 Secuencia 3' de la región codificante de d12FAD de la construcción de direccionamiento SEQ ID N.°: 41 secuencia de ADNc de la construcción de direccionamiento de d12FAD SEQ ID N.°: 42 Secuencia 5' de la región codificante de SAD2A SEQ ID N.°: 43 Secuencia 3' de la región codificante de SAD2A SEQ ID N.°: 44 Secuencia de ADNc de la construcción de direccionamiento de SAD2A SEQ ID N.°: 45 Secuencia 5' de la región codificante de SAD2B SEQ ID N.°: 46 Secuencia 3' de la región codificante de SAD2B SEQ ID NO :47 Secuencia de ADNc de la construcción de direccionamiento de SAD2B SEQ ID N.°:48
[0131] Se seleccionaron clones positivos representativos de transformaciones con cada una de las construcciones y se determinaron los perfiles de lípidos para estos clones (expresados en % de área), que se resumen en la Tabla 4 siguiente.
Tabla 4. Perfiles de lípidos para desaturasas inactivadas (KO).
Ácido graso d12FAD KO SAD2A KO SAD2B KO UTEX 1435 WT
C8:0 0 0 0 0
C10:0 0,01 0,01 0,01 0,01
Ácido graso d12FAD KO SAD2A KO SAD2B KO UTEX 1435 WT
C12:0 0,03 0,03 0,03 0,03
C14:0 1,08 0,985 0,795 1,46
C16:0 24,42 25,335 23,66 29,87
C18:0 6,85 12,89 19,555 3,345
C18:1 58,35 47,865 43,115 54,09
C18:2 7,33 10,27 9,83 9,1
C18:3 alfa 0,83 0,86 1 0,89
C20:0 0,48 0,86 1,175 0,325
[0132] Cada una de las construcciones tuvo un impacto medible en la clase deseada de ácido graso y, en los tres casos, los niveles de C18:0 aumentaron notablemente, en particular con las dos SAD inactivadas. La comparación adicional de múltiples clones de SAD inactivadas indicó que las líneas SAD2B inactivadas tenían reducciones significativamente mayores en los ácidos grasos C18:1 que los niveles de ácidos grasos C18:1 observados con las líneas SAD2A inactivadas.
[0133] Se generaron inactivaciones adicionales de desaturasa de ácido graso A12 (FAD) sobre una Prototheca moriformis utilizando los métodos descritos anteriormente. Con el fin de identificar posibles homólogos de A12FAD, se usaron los siguientes cebadores para amplificar una región genómica que codifica una supuesta FAD Cebador 15'-TCACTTCATGCCGGCGGTCC-3' SEQ ID N.°:49
Cebador 25'- GCGCTCCTGCTTGGCTCGAA-3' SEQ ID N°:50
[0134] Las secuencias resultantes de la amplificación genómica de ADN genómico de Prototheca moriformis utilizando los cebadores anteriores fueron muy similares, pero esto indicó que existen múltiples genes o alelos de A12FAD en Prototheca.
[0135] En función de este resultado, se diseñaron dos construcciones de interrupción de genes que buscaban inactivar uno o más genes A12FAD. La estrategia sería incrustar un casete de sacarasa (suc2 de S. cerevisiae), lo que confiere la capacidad de hidrolizar la sacarosa como un marcador seleccionable, en regiones codificantes altamente conservadas en lugar de utilizar una estrategia clásica de reemplazo de genes. La primera construcción, denominada pSZ1124, contenía secuencias de direccionamiento genómico en 5' y 3' que flanqueaban un promotor de p-tubulina de C. Reinhardtii que dirige la expresión del gen suc2 de S. cerevisiae y una 3'UTR de nitrato reductasa de Chlorella vulgaris (casete suc2 de S. cerevisiae). La segunda construcción, denominada pSZ1125, contenía secuencias de direccionamiento genómico en 5' y 3' que flanqueaban un promotor de p -tubulina de C. Reinhardtii que dirige la expresión del gen suc2 de S. cerevisiae y una 3'UTR de nitrato reductasa de Chlorella vulgaris. Las secuencias relevantes de las construcciones se enumeran en el Listado de secuencias:
pSZ1124 (FAD2B) secuencia de direccionamiento genómico 5' SEQ ID N.°:51
pSZ1124 (FAD2B) secuencia de direccionamiento genómico 3' SEQ ID N.°:52
Casete suc2 de S. cerevisiae SEQ ID N.°:53
pSZ1125 (FAD2C) secuencia de direccionamiento genómico 5' SEQ ID N.°:54
pSZ1125 (FAD2C) secuencia de direccionamiento genómico 3' SEQ ID N.°:55
[0136] pSZ1124 y pSZ1125 se introdujeron cada uno en una Prototheca moriformis y se seleccionaron clones de fondo y positivos en función de la capacidad para hidrolizar sacarosa. En la Tabla 5 se resumen los perfiles de lípidos (en % de área, generados utilizando los métodos descritos anteriormente) obtenidos en dos líneas transgénicas en las que se utilizaron los vectores de direccionamiento pSZ1124 y pSZ1125.
Tabla 5. Perfiles de lí idos de A12FAD inactivadas
[0137] La línea transgénica que contenía la construcción FAD2B (pSZ1124) dio un resultado muy interesante e inesperado en el perfil de lípidos, ya que los niveles de C18:2, que se esperaría que disminuyeran, solo disminuyeron en aproximadamente un % de área. Sin embargo, los contenidos de ácidos grasos C18:1 aumentaron significativamente, casi exclusivamente a expensas de los niveles de C16:0, que disminuyeron significativamente. La línea transgénica que contenía la construcción FAD2C (pSZ1125) también produjo un cambio en el perfil de lípidos: los niveles de C18:2 se redujeron significativamente junto con un aumento correspondiente en los niveles de C18:1.
Mimético de sebo de bovino
[0138] Se seleccionó un clon positivo generado a partir del experimento de SAD2B inactivada anterior como se ha descrito antes para utilizarlo como base para la introducción adicional de un gen de tioesterasa de acilo graso-ACP con preferencia por C14. La construcción que introduce la tioesterasa de C. camphora con preferencia por C14 contenía una secuencia dirigida a la región genómica 6S (que permite la integración dirigida del ADN transformante a través de la recombinación homóloga) y la construcción de expresión contenía el promotor de p-tubulina de C. Reinhardtii que dirige la expresión del gen neoR con la 3'UTR de nitrato reductasa de Chlorella vulgaris, seguida de un segundo promotor de p-tubulina de C. Reinhardtii que dirige la expresión de un codón optimizado de tioesterasa de C. camphora con un péptido de tránsito de estearoil ACP desaturasa de Chlorella protothecoides con una segunda 3'UTR de nitrato reductasa de Chlorella vulgaris. La secuencia 5' del donante genómico 6S se enumera en la SEQ ID N.°: 56; la secuencia 3' del donante genómico 6S se enumera en la SEQ ID N.°: 57; y la construcción de expresión relevante para la tioesterasa de C. camphora se enumera en la SEQ ID N.°:58.
[0139] La transformación se llevó a cabo usando métodos biolísticos como se ha descrito anteriormente y se permitió que las células se recuperaran durante 24 horas en placas que contenían sacarosa al 2 %. Después de este tiempo, las células se resuspendieron y se sembraron en placas que contenían sacarosa al 2 % y 50 pg/ml de G418 para la selección. Se seleccionaron nueve clones de los clones positivos generados para la producción de lípidos y el perfil de lípidos. Los nueve clones transgénicos (con SAD2b KO y expresión de tioesterasa de C. camphora con preferencia por C14) se cultivaron como se ha descrito anteriormente y se analizó su perfil de lípidos. Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 6. El perfil de lípidos para el sebo también se incluye en la Tabla 6 siguiente (National Research Council 1976: Fat Content and Composition of Animal Product).
Tabla 6. Perfil lipídico de clones transformados con tioesterasa.
C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18 C20 :3
Clon 1 de TE de C. 0,01 0,33 6,13 24,24 0,19 11,08 42,03 13,45 0,98 0,73 camphora SAD2BKO
Clon 2 de TE de C. 0,01 0,16 3,42 23,80 0,40 9,40 50,62 10,2 0,62 0,70 camphora SAD2BKO
Clon 3 de TE de C. 0,01 0,20 4,21 25,69 0,40 7,79 50,51 9,37 0,66 0,63 camphora SAD2BKO
Clon 4 de TE de C. 0,01 0,21 4,29 23,57 0,31 9,44 50,07 10,07 0,70 0,70 camphora SAD2BKO
Clon 5 de TE de C. 0,01 0,18 3,87 24,42 0,32 9,24 49,75 10,17 0,71 0,71 camphora SAD2BKO
Clon 6 de TE de C. 0,01 0,28 5,34 23,78 0,33 9,12 49,12 10,00 0,68 0,70 camphora SAD2BKO
Clon 7 de TE de C. 0,01 0,15 3,09 23,07 0,32 10,08 51,21 10,00 0,66 0,74 camphora SAD2BKO
Clon 8 de TE de C. 0,01 0,29 5,33 24,62 0,37 7,02 49,67 10,74 0,69 0,70 camphora SAD2BKO
Clon 9 de TE de C. 0,01 0,12 2,74 25,13 0,30 10,17 50,18 9,42 0,71 0,71 camphora SAD2BKO
UTEX 1435 WT 0,01 0,02 0,96 23,06 0,79 3,14 61,82 9,06 0,46 0,27 SAD2BKO 0,01 0,03 0,80 23,66 0,13 19,56 43,12 9,83 1,00 1,18 Sebo 0,00 0,00 4,00 26,00 3,00 14,00 41,00 3,00 1,00 0,00
[0140] Como puede verse en la Tabla 6, los perfiles lipídicos de las líneas transgénicas son bastante similares al perfil lipídico del sebo. En conjunto, los datos demuestran la utilidad de combinar fondos transgénicos específicos, en este caso, una SAD2B inactiva con una tioesterasa con preferencia por C14 (de C. camphora), para generar una cepa de algas transgénicas que produzcan un aceite similar al perfil lipídico del sebo.
Construcción utilizada para regular a la baja la expresión de B-cetoacil sintasa II (KASII) mediante un enfoque de inactivación dirigida
[0141] La expresión del gen KASII que regula a la baja el vector mediante un enfoque de inactivación dirigida se introdujo en un derivado mutagenizado clásicamente de UTEX 1435, S1331. Se utilizó el gen de invertasa de Saccharomyces cerevisiae como marcador seleccionable, lo que le confirió la capacidad de crecer en sacarosa. El casete de expresión de invertasa bajo el control del promotor de tubulina B de C. Reinhardtii se insertó en el centro de la región genómica KASII de 315 pb de longitud para permitir la integración dirigida (pSZ1503).
[0142] Los sitios de restricción relevantes en pSZ1503 se indican en minúsculas, en negrita y subrayados, y son 5'-3' BspQ 1, kpn I, AscI, Xho I, Sac I, BspQ I, respectivamente. Los sitios BspQI delimitan los extremos 5' y 3' del ADN transformante. Las secuencias en minúsculas y en negrita representan el ADN genómico de S1331 que permite la integración dirigida en el locus KASII a través de la recombinación homóloga. En la dirección de 5' a 3', el promotor de la tubulina B de C. reinhardtii que dirige la expresión del gen de la sacarasa de levadura (que confiere la capacidad de S1331 para metabolizar la sacarosa) se indica mediante un recuadro de texto. El iniciador ATG y el terminador TGA para la invertasa se indican en cursiva mayúscula y negrita, mientras que la región codificante se indica en cursiva minúscula. La 3'UTR de nitrato reductasa de Chlorella vulgaris se indica mediante texto subrayado en minúsculas.
[0143] Secuencia de nucleótidos del ADN transformante contenido en pSZ1503_[KASII_btub-y.inv-nr_KASII]:
gctcttcccgcaccggctggctccaccccaacttgaacctcgagaaccccgcgcctggcgtcgaccccgtcgtgctcgtggggccgc ggaaggagcgcgccgaagacctggacgtcgtcctctccaactcctttggctttggcgggcacaattcgtgcgtcggtaccctttcttg cgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgcttcgaccccc cgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaatagccaggcccccgattgcaaagac attatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcactaccacttctacacaggccactcgagcttgtgatcgcactccgct aagggggcgcctcttcctcttcgtttcagtcacaacccgcaaacggcgcgcc A TGctQctQcopQccttcctQttcctQctpQCCQp cttcgccgccaagatcogcgcctccatgacgaacgagocgtccgoccgccccctggtgcocttcacccccoacoagggctggat gaacgaccccaacggcctgtggtocgacgagaoggacgccoagtggcacctgtacttccogtacaacccgaacgacaccgtc tgggggacgcccttgttctggggccacgccacgtccgacgacctgaccaactgggaggaccagcccotcgccatcgccccgaa gcgcaacgactccggcgccttctccggctccatggtggtggactacaacaacacctccggcttcttcaacgacaccotcgacccg cgccagcgctgcgtggccatctggacctacaocaccccggagtccgaggogcagtocatctcctacagcctggacggcggcta caccttcaccgagtaccogaagooccccgtgctggccgccaactccocccagttccgcgacccgaaggtcttctggtocgogcc ctcccagaagtggotcatgaccgcggccaagtcccaggactocoagatcgagatctactcctccgacgocctgoagtcctgga agctggogtccgcgttcgccoocgogggcttcctcggctoccagtocgagtgccccggcctgotcgaggtccccaccgogcog gaccccagcaogtcctactgggtgatgttcotctccatcooccccggcgccccggccggcggctccttcaaccogtacttcgtcg gcagcttcaacggcacccacttcgaggccttcgacaoccagtcccgcgtggtggacttcggcaoggactactacgccctgcoga ccttcttcoococcgocccgacctacgggogcgccctgggcotcgcgtgggcctccaactgggogtactccgccttcgtgcccac caacccctggcgctcctccatgtccctcgtgcgcaagttctccctcaacaccgagtaccaggccaacccggagacggagctgatc aacctgaaggccgogccgatcctgaacatcagcaocgccggcccctggagccggttcgccaccoocaccacgttgacgaogg ccoocogctocoacgtcgacctgtccaacagcaccggcaccctggagttcgogctggtgtocgccgtcoococcacccagacg atctccaagtccgtgttcgcggacctctccctctggttcaagggcctggoggaccccgaggagtocctccgcatgggcttcgagg tgtccgcgtcctccttcttcctggoccgcgggaacagcaoggtgoogttcgtgaaggogaacccctocttcaccaoccgcotga gcgtgaocoaccagcccttcaagogcgagaocgacctgtcctoctacoaggtgtacggcttgctggaccogaacatcctggo gctgtacttcaacgacggcgacgtcgtgtccaccaacacctacttcatgaccaccgggaacgccctgggctccgtgaacatgac qqcqqqqqfqqqcqqccfqftctacqfcqqcqqqftccqqqfqcqcqqqqfcqqqTGAcaattggcagcagcagctcggata gtatcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggactgttgccgccacacttgctgccttgacctgtgaatatccctgccgcttttatc aaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttgtgctatttgcgaataccacccccagcatcc ccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatccctcagcgctgctcctgctcctgctcactgc
ccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggaagt agtgggatgggaacacaaatggaggatcgtagagctcatcttccgaaagtacgacgagtgagcgagctgattctctttgagcggg gtcgggtggttcggggagagtgcgcggaaaggcgcagagacgtgcggccggccgtgtccctccgtcttcccctggttggtgctata gtaacctgcctgtgtcgcgtgcgcgtcgggaagagc (SEQ ID NO:59)
[0144] Los ADNc del alelo 1 y el alelo 2 de KAS II se identifican en las SEQ ID N.°: 66 y 68, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de los alelos 1 y 2 se identifican en las SEQ ID N.°: 67 y 69, respectivamente.
[0145] Para determinar el impacto de la inactivación de KASII en la composición de lípidos, el ADN del vector pSZ1503 se transformó en S1331 para generar un fenotipo inactivado de KASII dirigido. Los clones individuales iniciales se aislaron y cultivaron en condiciones estándar de producción de lípidos a pH 5,0. Los perfiles resultantes del mejor clon representativo y las células de tipo salvaje se muestran a continuación en la Tabla 7.
^
Ejemplo 11. Ingeniería genética de una microalga tras la adaptación a un alto contenido de sal
[0146] Una cepa de Prototheca morifomis, la S2939, se identificó como mutante tolerante a la sal utilizando las técnicas descritas anteriormente. Para conferir la capacidad de crecer en sacarosa, la cepa se transformó con sacarasa de Saccharomyces cerevisiae por recombinación en uno de los dos sitios de integración genómica según los métodos descritos en el Ejemplo 7 del presente documento y en las solicitudes de titularidad conjunta WO2010/063031, WO2010/063032, WO2011/150411, WO2012/106560, WO2013/158938, PCT/US2014/059161. Se analizó la producción de aceite de veintiún transformantes en cultivos de 10 ml utilizando sacarosa como única fuente de carbono. Se obtuvieron múltiples transformantes, incluyendo S1868, que, cuando se cultivaron en sacarosa como fuente de carbono, produjeron el 90 % o más del aceite producido por la cepa original, que requirió enzima sacarasa añadida para la propagación y la producción de aceite en sacarosa.
Ejemplo 12: Rendimiento de cepas tolerantes a la sal en jarabe de caña en fermentadores de 7 L
[0147] A través de la fermentación secuencial por lotes de una población mutagenizada de la cepa de alta producción de aceite, la cepa de Prototheca morifomis S1920, en medio que contiene una concentración elevada de potasio, se obtuvieron dos cepas mutantes tolerantes a la sal con alta productividad de aceite (Cepa S3303 y Cepa S3304). El proceso de evolución implicó el cultivo de las células mutagenizadas en medio de siembra que se complementó con KCl 600 - 650 mM. Esta concentración de potasio se eligió para reducir la tasa de crecimiento específica máxima de la cepa original, la cepa S1920, en aproximadamente un 70 %. Las células se cultivaron en 10 mL de medio de siembra en tubos de biorreactor de 50 mL y su crecimiento se mantuvo en la fase exponencial durante aproximadamente 70 generaciones a través de subcultivos secuenciales. Al final del proceso de evolución, la población de cultivos mixtos se sembró en placas para el aislamiento de colonias individuales, que luego se seleccionaron en matraces de agitación para identificar los mutantes con altos contenidos de aceite y rendimientos en medios de producción con y sin la suplementación de 300 KCl mM.
[0148] La cepa S3303 y la cepa S3304 fueron las dos con el mejor rendimiento en matraces y luego se analizaron en la escala de 7 L con un proceso de alta densidad celular usando sacarosa de grado reactivo al 60 % (p/p) y jarabe de caña sin refinar como fuente de carbono. El contenido de sacarosa, la concentración de potasio y la conductividad de este jarabe de caña fueron 60 % (p/p), potasio 214 mM y 42 mS/cm, respectivamente. Se llevaron a cabo experimentos de control con la cepa original para comparar el rendimiento. Se añadió invertasa a las fermentaciones para catalizar la conversión de sacarosa en glucosa y fructosa para su consumo.
[0149] Como se muestra en las figuras 4 y 5, los rendimientos de las cepas S3303 y S3304 son superiores a los de la cepa S1920 en jarabe de caña. A pesar de una acumulación de >170 mM K en la fermentación con jarabe de caña (Fig. 4), las cantidades totales de aceite producidas por las cepas S3303 y S3304 fueron comparables a las observadas en las fermentaciones con sacarosa de grado reactivo (Fig. 5). Estas también fueron un 10 % y un 20 % más altas que las cantidades totales de aceite producido por la cepa S1920 en las pruebas realizadas con la misma materia prima de caña, respectivamente. Además, como puede verse en la figura 5, la cantidad total de aceite producido por la cepa S3304 en jarabe de caña fue comparable a la producida por la cepa S1331 en sacarosa de grado reactivo. Las cepas S3303 y S3304 con jarabe de caña y sacarosa de grado reactivo lograron rendimientos máximos más altos en términos de g de aceite/g de azúcar fermentable que la cepa original S1920 (Figura 6). Además, las Cepas S3303 y S3304 mantuvieron sus altos rendimientos hasta el final de las pruebas, mientras que el rendimiento de la Cepa S1920 cayó precipitadamente después de 90 h de fermentación. Estos resultados demuestran la robustez de las cepas tolerantes a la sal en fermentaciones de alta densidad celular con jarabe de caña sin refinar.
Ejemplo 13: Selección de mutantes en presencia de 2-desoxiglucosa para aumentar el contenido de aceite
[0150] La capacidad de aumentar la producción de aceite, maximizar el rendimiento de aceite en carbono y modular el perfil de ácidos grasos del aceite producido son fundamentales para el desarrollo de un proceso de fabricación comercial rentable con la microalga oleaginosa heterótrofa, Prothetheca moriformis. En este ejemplo se describe el uso de 2-desoxiglucosa (2-DG) como agente selectivo para la identificación de mutantes con contenidos de aceite aumentados en comparación con la cepa original. 2-DG es un análogo de la glucosa y un inhibidor de los transportadores de monosacáridos.
[0151] Para aprovechar el uso de 2-DG para la identificación de mutantes de P. moriformis con contenidos de aceite aumentados, las cepas productoras de alto contenido de aceite (cepas originales S2949, S2952, S3150, S3331 y S3332) se mutagenizaron usando W-metil-W-nitro-W-nitrosoguanidina (NTG) sola, metanosulfonato de etilo (EMS) solo o EMS más radiación ultravioleta (UV) para generar una población mutante heterogénea como se ha
mencionado anteriormente. Las cepas originales S2949, S2952, S3150, S3331 y S3332 tenían contenidos de lípidos similares. Las células mutagenizadas obtenidas de las cepas originales se agruparon y cultivaron en medio de cultivo que contenía 10 g/L de fructosa con 6 - 20 g/L de 2-DG o en medio de cultivo que contenía 10 g/L de glucosa con 30 - 50 g/L 2-DG durante 5 - 7 días. A continuación, las células cultivadas en cultivo de fructosa se extendieron sobre placas TSA (agar de soja y triptona) que contenían 20 g/L de fructosa y 12 - 20 g/L de 2-DG, mientras que las células cultivadas en cultivo de glucosa se extendieron sobre placas de TSA que contenían 20 g/L glucosa y 50 g/L 2-DG. Las cepas originales S2949, S2952, S3150, S3331 y S3332 se prepararon según el Ejemplo 2.
[0152] Las cepas aisladas resistentes a 2-DG que crecieron en las placas de TSA complementadas con fructosa o glucosa se seleccionaron para su evaluación en tubos de biorreactor de 50 ml. En esta selección primaria, los mutantes se cultivaron en un medio de producción que contenía tanto glucosa como fructosa como fuentes de carbono. De las 192 cepas aisladas analizadas, cinco de ellas mostraron contenidos de aceite que eran aproximadamente un 10 % más altos que los de la cepa original, la cepa S3150 (Tablas 8 - 9). Dos de estos mutantes se originaron a partir del cultivo líquido que se complementó con fructosa, mientras que los otros tres mutantes se originaron a partir del cultivo líquido que se complementó con glucosa. Sus mejoras en el contenido de aceite en comparación con la cepa original se confirmaron en la selección secundaria (Tabla 10). Los cultivos de producción para este cribado secundario se cultivaron en tubos de biorreactor de 50 ml durante 5 días y se alimentaron con glucosa como única fuente de carbono.
Tabla 8. Rendimientos de los mutantes más resistentes a 2-DG que se aislaron de medio sólido suplementado con fructosa y 2-DG
Tabla 9. Rendimientos de los mutantes más resistentes a 2-DG que se aislaron de medio sólido suplementado con glucosa y 2-DG
Tabla 10. Rendimientos de los mutantes más resistentes a 2-DG en el cribado secundario
Ejemplo 14: Selección de mutantes en presencia de Cerulenina o Triclosán para aumentar los niveles de ácidos grasos C18:0 o C18:1
[0153] En este ejemplo se describe el uso de cerulenina y triclosán como agentes selectivos para la identificación de mutantes con contenidos aumentados de ácidos grasos C18:0 o C18:1 en comparación con las cepas originales.
[0154] La cerulenina es un inhibidor de KASI y KASII, mientras que el triclosán es un inhibidor de la enoil:ACP reductasa en la vía biosintética de los ácidos grasos. Es probable que las cepas microbianas resistentes a estos inhibidores alberguen mutaciones en su genoma que les permitan sobreexpresar KASI, KASII o la enoil:ACP reductasa. También pueden expresar formas mutadas de estas enzimas que son más activas que las de tipo salvaje. Como resultado, las cepas resistentes pueden poseer una mayor capacidad para la biosíntesis de ácidos grasos.
[0155] Para identificar nuevas cepas de P. moriformis con contenidos de aceite mejorados, las cepas base principales (cepas S22949, S2952, S3150, S3331 y S3332) se mutagenizaron por NTG, EMS o EMS UV y se seleccionaron por su resistencia a la cerulenina o al triclosán. A continuación, las células mutagenizadas se
agruparon y se esparcieron sobre placas TSA que contenían cerulenina 15 - 35 pM y/o triclosán 4 pM. Luego, las cepas aisladas resistentes se cultivaron en tubos de biorreactor de 50 ml durante 5 días y se alimentaron con glucosa como fuente de carbono, seguido de la determinación del perfil y el contenido de aceite. Ninguna de las cepas aisladas mostró contenidos de aceite superiores a los de las cepas originales. Sin embargo, dos de las cepas aisladas resistentes a la cerulenina (cepa S5l00 y cepa S5226) produjeron aceites que eran significativamente más altos en los niveles de C18:1 y más bajos en los niveles de C16:0 que los aceites producidos por las cepas originales (Tabla 11).
[0156] Tabla 11. Rendimiento de dos mutantes resistentes a la cerulenina que mostraron niveles aumentados de C18:1 y niveles reducidos de C16:0 en comparación con la cepa original, la cepa S3150.
[0157] Para confirmar la capacidad de la cepa S5100 para producir aceite con un mayor nivel de C18:1, se evaluó de nuevo su rendimiento en un fermentador de 7 L utilizando un proceso de alimentación por lotes y 70 % (p/p) de sacarosa como fuente de carbono. Se añadió invertasa exógena para la hidrólisis de sacarosa. Como se muestra en la Tabla 12, el rendimiento final y la producción total de aceite logrados por la cepa S5100 fueron comparables a los logrados por la cepa original, la cepa S3150. Sin embargo, el nivel de C18:1 de la cepa S5d100 fue significativamente mayor que el de la cepa S3150. Al final de la fermentación, se alcanzó el 75 % de la cantidad total de ácidos grasos producidos. De nuevo, este nivel elevado de C18:1 fue acompañado por una caída en el nivel de C16:0. Todos estos resultados son coherentes con los observados para el cultivo en tubo en la pantalla principal.
[0158] Tabla 12. Rendimiento del mutante resistente a la cerulenina, la Cepa S5100, y su cepa original, la Cepa S3150, en fermentaciones de alta densidad celular.
[0159] Además de nuestro trabajo con las cepas de base principales, también mutagenizamos la cepa transgénica, la cepa S3168, solo por NTG o por EMS UV y seleccionamos las cepas aisladas que eran resistentes a la cerulenina o al triclosán. La cepa S3168 es una FATA (invertasa que expresa tioesterasa inactivada bajo el control del promotor de beta tubulina) y también tiene una Cuphea wrightii FATB bajo el control del promotor amt03 (activa a pH 7 pero no a pH5). El plásmido pSZ1925: FatA1_Btub:inv:nr::amt03-CwTE2:nr_FatA1 y una microalga recombinante diseñada para expresar pSZ1925 se divulgaron en una solicitud de titularidad conjunta WO2012/061647. Cuando se cultiva a un pH bajo, esta cepa es una cepa con alto contenido de ácido oleico que es capaz de producir aceite con un nivel de C18:1 de hasta el 77 %. Después del procedimiento de mutagénesis, las células se extendieron sobre placas TSA que contenían cerulenina 12 pM o triclosán 4 pM. las cepas aisladas resistentes resultantes se cultivaron luego en tubos de biorreactor de 50 ml para su evaluación. A partir de este examen primario, se descubrió que uno de los mutantes resistentes al triclosán (Cepa S5692) presentaba un nivel elevado de C18:1 en comparación con la Cepa S3168, y su rendimiento se evaluó posteriormente en un fermentador de 7 L con un proceso de alimentación discontinua y 70 % (p/p) de sacarosa como alimentación de carbono. Se añadió invertasa exógena para la hidrólisis de sacarosa adicional. Como se muestra en la Tabla 13, el rendimiento final y la producción total de aceite logrados por la cepa S5692 fueron muy similares a los observados para la cepa original, la cepa S3168. Sin embargo, el nivel de C18:1 de la Cepa T fue considerablemente más alto, alcanzando el 84 - 85 % al final de las fermentaciones. Mientras tanto, el nivel de C16:0 representó solo el 6 - 7 % de la cantidad total de ácidos grasos producidos.
Tabla 13. Rendimiento del mutante resistente al triclosán, la cepa S5692, y su cepa original, la cepa S3168, en fermentaciones de alta densidad celular de Solaz me.
[0160] Dado que la formación de C18:0 es un paso intermedio en la conversión de C16:0 a C18:1 en la vía biosintética de ácidos grasos, la cerulenina y el triclosán también pueden usarse como agentes selectivos para la
identificación de imitantes de P. moriformis con niveles aumentados de C18:0. Por lo tanto, tres cepas transgénicas diferentes (Cepa S4424, Cepa S4440 y Cepa S4442) que ya habían sido modificadas genéticamente para producir aceites con niveles elevados de C18:0 que oscilaban entre el 38 y el 44 % se mutagenizaron solo con NTG o EMS UV. La cepa S4424 (6SA: :Cr(bTub)-syn(yInv)-Cv(nr):Pm(hxt_14757G)-Pm(SAD2hpC)-Cv(nr)::6SB), la cepa S4440 (THI4a5'::Cr(bTub )-syn(yInv)-Cv(nr)::Cr(bTub)-Pm(SAD2hpD)-Cv(nr)::THI4a3) y la cepa S4442_(DAO1b5'::Cr(bTub)-syn(yINV)- Cv(nr)::Cr(bTub)-Pm(SAD2hpD)-Cv(nr)::DAO1b3') expresan todas una construcción de ARNi de horquilla SAD2 e invertasa, pero en diferentes sitios de integración. Después de la mutagénesis, las células resultantes se extendieron sobre placas TSA que contenían 15 - 35 pM de cerulenina o 4 pM de triclosán. Las cepas aisladas que eran resistentes a cualquiera de estos inhibidores se cultivaron en tubos de biorreactor de 50 ml para determinar el perfil y el contenido de aceite. Como se muestra en las Tablas 14 - 17, muchas de las cepas aisladas resistentes a la cerulenina o al triclosán mostraron aumentos marcados en sus niveles de C18:0 en comparación con sus cepas originales: las cepas S4424, S4440 o S4442. Aunque la mayoría de estas cepas aisladas no experimentaron ninguna mejora en sus contenidos de aceite, tres de ellas (JV33-1, JV33-104 y JV33-125) mostraron contenidos de aceite >10 % mayores que los de la cepa original, las cepas S4424. S4440 o S4442. Estos resultados, junto con los presentados anteriormente, indican claramente que la 2-DG, la cerulenina y el triclosán son agentes selectivos eficaces para aislar mutantes de P. moriformis con contenidos de aceite mejorados y/o son capaces de producir aceites con mayores niveles de ácidos grasos de cadena larga, como C18:0 y C18:1.
[0161] Tabla 14. Rendimiento de mutantes resistentes a la cerulenina que mostraron niveles aumentados de C18:0 y niveles disminuidos de C16:0 en comparación con la cepa original, la cepa S4424. Los cultivos de producción se cultivaron en tubos de biorreactor de 50 ml durante 5 días y se alimentaron con glucosa como fuente de carbono.
[0162] Tabla 15. Rendimiento de mutantes resistentes al triclosán que mostraron niveles aumentados de C18:0 y niveles disminuidos de C16:0 en comparación con la cepa original, la cepa S4424. Los cultivos de producción se cultivaron en tubos de biorreactor de 50 ml durante 5 días y se alimentaron con glucosa como fuente de carbono.
[0163] Tabla 16. Rendimiento de mutantes resistentes a la cerulenina que mostraron niveles aumentados de C18:0 y niveles disminuidos de C16:0 en comparación con la cepa original, la cepa S4440. Los cultivos de producción se cultivaron en tubos de biorreactor de 50 ml durante 5 días y se alimentaron con glucosa como fuente de carbono.
[0164] Tabla 17. Rendimiento de imitantes resistentes a la cerulenina que mostraron niveles aumentados de C18:0 y niveles disminuidos de C16:0 en comparación con la cepa original, la cepa S4442. Los cultivos de producción se cultivaron en tubos de biorreactor de 50 ml durante 5 días y se alimentaron con glucosa como fuente de carbono.
Ejemplo 15: Regulación a la baja de FATA1 y sobreexpresión de ceto-acil-ACP sintasa II (PmKASII) en Prototheca moriformis resistentes a la cerulenina para obtener un aceite rico en ácidos grasos insaturados
[0165] Se introdujeron construcciones que interrumpen una sola copia del alelo FATA1 mientras sobreexpresan simultáneamente el gen KASII de P. moriformis en una cepa de base alta oleica (Cepa S5100), obtenida por mutagénesis clásica y selección en cerulenina 15 micromolar. Una de las cepas resultantes (S5587) produjo un 85 % de C18:1 (oleato) con un total de insaturados de alrededor del 93 % en múltiples procesos de fermentación. La cepa S5587 tiene una mejora significativa tanto en el perfil de lípidos como en la productividad con respecto a una cepa similar que no se seleccionó en cerulenina.
[0166] El gen de la invertasa de Saccharomyces cerevisiae (número de acceso: NP 012104) se utilizó como marcador seleccionable para introducir el PmKASII en el locus FATA1 de la cepa de P. moriformis S5100 por recombinación homóloga utilizando métodos de transformación biolística. Para investigar la actividad de KASII cuando la dirigen diferentes promotores, se fusionó PmKASII con promotores como PmUAPA1, PmLDH1 y PmAMT3. Se ha de tener en cuenta que todas las construcciones de integración se diseñaron con orientación inversa al gen FATA1, porque se descubrió que la mayoría de los transformantes resultantes de las construcciones con orientación directa eran inestables en la expresión de sacarasa. Por lo tanto, las construcciones que se han expresado en la cepa S5100 se pueden escribir como:
1) FATA1 3'::CrTUB2:ScSUC2:CvNR::PmUAPA1:PmKASII-CvNR::FATA1 5' (pSZ2533)
2) FATA1 3'::CrTUB2:ScSUC2:CvNR::PmLDH1:PmKASII-CvNR::FATA1 5' (pSZ2532)
3) FATA1 3'::CrTUB2:ScSUC2:CvNR::PmAMT3:PmKASII-CvNR::FATA1 5' (pSZ2750)
[0167] Con referencia a la Tabla 18, los sitios de restricción relevantes en la construcción pSZ2533 FATA13'::CrTUB2:ScSUC2:CvNR::PmUAPA1:PmKASII-CvNR::FATA1 5' se indican en minúsculas, negrita y subrayado y son 5'-3' BspQ 1, kpn I, Asc I, Mfe I, EcoRV, SpeI, AscI, ClaI, Sac I, BspQ I, respectivamente. Los sitios BspQI elimitan los extremos 5' y 3' del ADN transformante. Las secuencias en minúsculas y en negrita representan el ADN genómico 3' de FATA1 que permite la integración dirigida en el locus FATA1 a través de la recombinación homóloga. Procediendo en la dirección de 5' a 3', el promotor de p-tubulina de C. Reinhardtii que dirige la expresión del gen de la sacarasa de levadura se indica mediante recuadros de texto. El iniciador ATG y el terminador TGA para la invertasa se indican en cursiva mayúscula y negrita, mientras que la región codificante se indica en cursiva minúscula. La 3'UTR de nitrato reductasa de Chlorella vulgaris se indica mediante texto subrayado en minúsculas seguido del promotor UAPA1 de P. moriformis, indicado por texto en cursiva recuadrado. Los codones iniciador ATG y terminador TGA del PmKASII se indican en cursiva en negrita y mayúsculas, mientras que el resto de la región codificante se indica en cursiva en negrita. El péptido de tránsito de estearoil-ACP desaturasa S106 de Chlorella protothecoides se encuentra entre el iniciador ATG y el sitio asc I. La 3'UTR de nitrato reductasa de C. vulgaris se indica de nuevo con texto subrayado en minúsculas seguido de la región genómica 5' de FATA1 indicada con texto en negrita y minúsculas.
Tabla 18. Secuencia de nucleótidos de ADN transformante contenido en pSZ2533 gctcttcacccaactcagataataccaatacccctccttctcctcctcatccattcagtacccccccccttctcttcccaaagcagcaa gcgcgtggcttacagaagaacaatcggcttccgccaaagtcgccgagcactgcccgacggcggcgcgcccagcagcccgcttggc cacacaggcaacgaatacattcaatagggggcctcgcagaatggaaggagcggtaaagggtacaggagcactgcgcacaaggg gcctgtgcaggagtgactgactgggcgggcagacggcgcaccgcgggcgcaggcaagcagggaagattgaagcggcagggagg aggatgctgattgaggggggcatcgcagtctctcttggacccgggataaggaagcaaatattcggccggttgggttgtgtgtgtgc acgttttcttcttcagagtcgtgggtgtgcttccagggaggatataagcagcaggatcgaatcccgcgaccagcgtttccccatcca gccaaccaccctgtcggtaccctttcttgcgctatgacacttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgc
ctgcaggccttcctgttcctgctggccggcttcgccgccaagatcagcgcctccatgacgaacgagacgtccgaccgccccctgg tgcacttcacccccaacaagggctggatgaacgaccccaacggcctgtggtacgacgagaaggacgccaagtggcacctgta cttccagtacaacccgaacgacaccgtctgggggacgcccttgttctggggccacgccacgtccgacgacctgaccaactggg aggaccagcccatcgccatcgccccgaagcgcaacgactccggcgccttctccggctccatggtggtggactacaacaacacct ccggcttcttcaacgacaccatcgacccgcgccagcgctgcgtggccatctggacctacaacaccccggagtccgaggagcag tacatctcctacagcctggacggcggctacaccttcaccgagtaccagaagaaccccgtgctggccgccaactccacccagttcc gcgacccgaaggtcttctggtacgagccctcccagaagtggatcatgaccgcggccaagtcccaggactacaagatcgagat ctactcctccgacgacctgaagtcctggaagctggagtccgcgttcgccaacgagggcttcctcggctaccagtacgagtgcec cggcctgatcgaggtccccaccgagcaggaccccagcaagtcctactgggtgatgttcatctccatcaoccccggcgccccggc cggcggctccttcaaccagtacttcgtcggcagcttcaacggcacccocttcgaggccttcgacaaccagtcccgcgtggtggac
ttcggcaaggactactacgccctgcagaccttcttcaacaccgacccgacctacgggagcgccctgggcatcgcgtgggcctcc aactgggagtactccgccttcgtgcccaccaacccctggcgctcctccatgtccctcgtgcgcaagttctccctcaacaccgagta ccaggccaacccggagacggagctgatcaacctgaaggccgagccgatcctgaacatcagcaacgccggcccctggagccg gttcgccaccaacaccacgttgacgaaggccoacagctacaacgtcgacctgtccaacagcaccggcaccctggagttcgagc tggtgtacgccgtcaacaccacccagacgatctccaagtccgtgttcgcggacctctccctctggttcaagggcctggaggaccc cgaggagtacctccgcatgggcttcgaggtgtccgcgtcctccttcttcctggaccgcgggaacagcaaggtgaagttcgtgaa ggagaacccctacttcaccaaccgcatgagcgtgaacaaccagcccttcaagagcgagaacgacctgtcctactacaaggtgt acggcttgctggaccagaacatcctggagctgtacttcaacgacggcgacgtcgtgtccaccaacacctacttcatgaccaccg ggaacgccctgggctccgtgaacatgacgacgggggtggacaacctgttctacatcgacaagttccaggtgcgcgaggtcaa gTGAca attggcagcagcagctcggatagtatcgacacactctggacgctggtcgtgtgatggactRttgccgccacacttgctgc cttgacctgtgaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttgatcttgtgtgtacgcgcttttgcgagttgctagctgcttg tgctatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaacttatctacgctgtcctgctatc cctcagcgctgctcctgctcctgctcactgcccctcgcacagccttggtttgggctccgcctgtattctcctggtactgcaacctgtaaa ccagcactgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatgggaacacaaatggaggatcccgcgtctcgaacagagcgcgcagagg aacgctgaaggtctcgcctctgtcgcacctcagcgcggcatacaccacaataaccacctgacgaatgcgcttggttcttcgtccatta gcgaagcgtccggttcacacacgtgccacgttggcgaggtggcaggtgacaatgatcggtggagctgatggtcgaaacgttcacag
agtcgacgcgacgagcggcgcaggatccgacccctagacgagctctgtcattttccaagcacgcagctaaatgcgctgagac cgggtctaaatcatccgaaaagtgtcaaaatggccgattgggttcgcctaggacaatgcgctgcggattcgctcgagtccgct gccggccaaaaggcggtggtacaggaaggcgcacggggccaaccctgcgaagccgggggcccgaacgccgaccgccggc cttcgatctcgggtgtccccctcgtcaatttcctctctcgggtgcagccacgaaagtcgtgacgcaggtcacgaaatccggttac gaaaaacgcaggtcttcgcaaaaacgtgagggtttcgcgtctcgccctagctattcgtatcgccgggtcagacccacgtgcag aaaagcccttgoataacccgggaccgtggttaccgcgccgcctgcaccagggggcttatataagcccacaccacacctgtctc accacgcatttctccaactcgcgacttttcggaagaaattgttatccacctagtatagactgccacctgcaggaccttgtgtcttg cagtttgtattggtcccggccgtcgagctcgacagatctgggctagggttggcctggccgctcggcactcccctttagccgcgcg catccgcgttccagaggtgcgattcggtgtgtggagcattgtcatgcgcttgtgggggtcgttccgtgcgcggcgggtccgccat gggcgccgacctgggccctagggtttg ttttcgggccaagcgag cccctctcacctcg tcg cccccccg cattccctctctcttgca gccttgcc actagtA TGgccaccgcatccactttctcggcgttcaatgcccgctgcggcgacctgcgtcgctcggcggg ctccg ggccccggcgcccagcgaggcccctccccgtgcgcgggcgcgccgccgccgccgccgacgccaaccccgcccgccccgagcg ccgcgtggtgatcaccggccagggcgtggtgacctccctgggccagaccatcgagcagttctactcctccctgctggagggcg tgtccggcatctcccagatccagaagttcgacaccaccggctacaccaccaccatcgccggcgagatcaagtccctgcagctg gacccctacgtgcccaagcgctgggccaagcgcgtggacgacgtgatcaagtacgtgtacatcgccggcaagcaggccctg gagtccgccggcctgcccatcgaggccgccggcctggccggcgccggcctggaccccgccctgtgcggcgtgctgatcggca ccgccatggccggcatgacctccttcgccgccggcgtggaggccctgacccgcggcggcgtgcgcaagatgaaccccttctgc atccccttctccatctccaacatgggcggcgccatgctggccatggacatcggcttcatgggccccaactactccatctccaccg cctgcgccaccggcaactactgcatcctgggcgccgccgaccacatccgccgcggcgacgccaacgtgatgctggccggcgg cgccgacgccgccatcatcccctccggcatcggcggcttcatcgcctgcaaggccctgtccaagcgcaacgacgagcccgagc gcgcctcccgcccctgggacgccgaccgcgacggcttcgtgatgggcgagggcgccggcgtgctggtgctggaggagctgg agcacgccaagcgccgcggcgccaccatcctggccgagctggtgggcggcgccgccacctccgacgcccaccacatgaccg agcccgacccccagggccgcggcgtgcgcctgtgcctggagcgcgccctggagcgcgcccgcctggcccccgagcgcgtgg gctacgtgaacgcccacggcacctccacccccgccggcgacgtggccgagtaccgcgccatccgcgccgtgatcccccagga ctccctgcgcatcaactccaccaagtccatgatcggccacctgctgggcggcgccggcgccgtggaggccgtggccgccatcc aggccctgcgcaccggctggctgcaccccaacctgaacctggagaaccccgcccccggcgtggaccccgtggtgctggtggg
cccccgcaaggagcgcgccgaggacctggacgtggtgctgtccaactccttcggcttcggcggccacaactcctgcgtgatct tccgcaagtacgacgagatggactacaaggaccacgacggcgactacaaggaccacgacatcgactacaaggacgacga cqqcaaqTGAatcgatagatctcttaaggcagcagcagctcggatagtatcgacacactctggacgctggtcatgtaatggactg ttgccgccacacttgctgccttgacctatgaatatccctgccgcttttatcaaacagcctcagtgtgtttaatcttgtgtgtacgcgctttt gcgaattfictagctgcttgtactatttgcgaataccacccccagcatccccttccctcgtttcatatcgcttgcatcccaaccgcaactt atctacgctgtcctgctatccctcaacgctgctcctgctcctgctcactacccctcgcacagccttggtttggactccacctgtattctcct ggtactgcaacctgtaaaccagcactgcaatgctgatgcacgggaagtagtgggatgggaacacaaatggaaagcttaattaaga gctcttgttttccagaaggagttgctccttgagcctttcattctcagcctcgataacctccaaagccgctctaattgtggagggggttc gaaccgaatgctgcgtgaacgggaaggaggaggagaaagagtgagcagggagggattcagaaatgagaaatgagaggtgaa ggaacgcatccctatgcccttgcaatggacagtgtttctggccaccgccaccaagacttcgtgtcctctgatcatcatgcgattgatt acgttgaatgcgacggccggtcagccccggacctccacgcaccggtgctcctccaggaagatgcgcttgtcctccgccatcttgcag ggctcaagctgctcccaaaactcttgggcgggttccggacggacggctaccgcgggtgcggccctgaccgccactgttcggaagca gcggcgctgcatgggcagcggccgctgcggtgcgccacggaccgcatgatccaccggaaaagcgcacgcgctggagcgcgcaga
gga ccacagaga agcgga agaga cgccagt actggca agcaggctggtcggtgccatggcgcgctactaccctcgcta tga etc gggtcctcggccggctggcggtgctgacaattcgtttagtggagcagcgactccattcagetaceagtcgaactcagtggcacagt gactccgctcttc
(SEQ ID NO:60)
[0168] Además de la construcción pSZ2533, se investigó la actividad de PmKASII cuando el gen KASII estaba dirigido por otros promotores, incluidos PmLDH1 y PmAMT3. El plásmido pSZ2532 se puede escribir como FATA1 3'::CrTUB2:ScSUC2:CvNR::PmLDH1:PmKASII-CvNR::FATA1 5', mientras que el plásmido pSZ2750 se puede escribir como FATA1 3'::CrTUB2:ScSUC2: CvNR:: PmAMT3:PmKASII-CvNR::FATA1 5'. Dado que las secuencias de estos dos plásmidos son las mismas que pSZ2533 excepto por el promotor que dirige el PmKASII, las Tablas 19 y 20 solo muestran la secuencia de los promotores PmLDH1 y PmAMT3.
Tabla 19. Secuencia de nucleótidos del promotor PmLDH1 que dirige la expresión de PmKASII en pSZ2532.
Tabla 20. Secuencia de nucleótidos del promotor PmAMT3 que dirige la expresión de PmKASII en pSZ2750.
Resultados
[0169] Los transformantes primarios se purificaron clonalmente y se cultivaron en condiciones estándar de producción de lípidos a pH 5,0 o pH 7,0, según los promotores que dirigeron la expresión del gen PmKASII (AMT3 es sensible al pH y se inhibe a pH 5). Líneas transgénicas derivadas de las transformaciones con pSZ2533 (D1636*) y pSZ2532 (D1637*) se analizaron en medios de producción de lípidos a pH 5,0, debido a la naturaleza de los promotores y al hecho de que P. moriformis produce más lípidos a pH 5,0. Líneas transgénicas generadas a partir de la transformación de pSZ2750 (D1684*) se analizaron a pH 7,0 para permitir la máxima expresión del gen PmKASII cuando estaba dirigido por el promotor PmAMT3 regulado por pH. Los perfiles resultantes de los clones representativos que surgen de las transformaciones con D1636 (pSZ2533), D1637 (pSZ2532) y D1684 (pSZ2750) se muestran en la Tabla 21, 21 y 23, respectivamente.
[0170] El impacto de la desactivación de FATA1 y, al mismo tiempo, la sobreexpresión del gen KASII de P. moriformis es una clara disminución de las longitudes de cadena C16:0 con un aumento significativo en C18:1. A pH 5,0, parece que PmUAPA1 es más fuerte que PmLDH1, ya que el nivel de palmitato en los transformantes D1636 está cerca del 3 %, mientras que ninguno de los transformantes en D1637 baja del 7 % en las mismas condiciones. El ácido oleico (18:1) es elevado (por ejemplo, por encima del 70 o 75 %) en comparación con la cepa de tipo salvaje (por ejemplo, alrededor del 54 %).
Tabla 21. Perfil de lípidos de clones representativos que surgen de la transformación con ADN de D1636 (pSZ2533).
Tabla 22. Perfil de lípidos de clones representativos que surgen de la transformación con ADN de D1637 (pSZ2532).
Tabla 23. Perfil de lípidos de clones representativos que surgen de la transformación con ADN de D1684 (pSZ2750).
Ejemplo 16: Regulación a la baja/inactivación de THI4a y sobreexpresión de CpalFATBI o CpalFATB2 en Prototheca moriformis
[0171] Se introdujeron en Prototheca moriformis construcciones que interrumpen una única copia del alelo THI4a y que, a la vez, sobreexpresan los genes FATB1 o FATB2 de Cuphea palustris.
[0172] Para los plásmidos pSZ4440 y pSZ4442, el gen de invertasa de Saccharomyces cerevisiae (número de acceso: NP 012104) se utilizó como marcador seleccionable para introducir CpalFATB2 en el locus THI4a de P. moriformis por recombinación homóloga utilizando métodos de transformación biolística. Las construcciones que se han expresado en la cepa S5100 se pueden escribir como:
(pSZ4440): THI4a5'::CrTUB2_ScSUC2_PmPGH::AMT1-1p_CpSAD1tp-CpalFATB2_ExtB_Flag_PmEF1::THI4a3' (pSZ4442): THI4a5'::CrTUB2_ScSUC2_PmPGH::PmSAD2-2ver2_CpSAD1tp-CpalFATB2_ExtB_Flag_PmAHCY::THI4a3'
(pSZ4424): THI4a::CrTUB2-NeoR-PmPGH:PmSAD2-2Ver3-CpSAD1tp_CpalFATB1ExtC_M230G_FLAG-CvNR::THI4a
[0173] En dirección de 5 'a 3' para pSZ4440 y pSZ4442, la región THI4a5' para el direccionamiento precede a un casete de expresión de selección que comprende el promotor de p-tubulina de C. reinhardtii que dirige la expresión del gen de sacarasa de levadura seguido por 3'-UTR de PGH de Prototheca moriformis. Los promotores AMT1-1p (pSZ4440) o PmSAD2-2ver2 (pSZ4442) dirigen la expresión de un péptido de tránsito de estearoil-ACP desaturasa de Chlorella protothecoides S106 fusionado con CpalFATB2_ExtB de Cuphea palustris. Una etiqueta FLAG precede a 3'UTR de EF1 de Prototheca moriformis o de AHCY de Prototheca moriformis y a la región THI4a3' para el direccionamiento.
[0174] En dirección de 5' a 3' para pSZ4424, la región THI4a5' para el direccionamiento precede a un casete de expresión de selección que comprende el promotor de p -tubulina de C. Reinhardtii que dirige la expresión del gen de resistencia a la neomicina seguido de 3'-UTR PGH de Prototheca moriformis. El promotor PmSAD2-2ver3 dirige la expresión de un péptido de tránsito de estearoil-ACP desaturasa de Chlorella protothecoides S106 fusionado con CpalFATB2_ExtC de Cuphea palustris con una sustitución de Met a Gly en la posición 230. Una etiqueta FLAG precede a la región 3'UTR de CvNR y a la región THI4a3' para el direccionamiento.
[0175] Se entiende que los ejemplos y formas de realización descritos en el presente documento tienen fines ilustrativos únicamente y que se sugerirán diversas modificaciones o cambios a la luz de estos a los expertos en la técnica y se incluirán dentro del alcance de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
LISTADO DE SECUENCIAS INFORMAL
[0176]
SEQ ID N.°:1
CAACCACGTCTTCAAAGCAA
SEQ ID N.°:2
TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA SEQ ID N.°:3
TTGTCGGAATGTCATATCAA SEQ ID N.°:4
AACGCCTTTGTACAACTGCA SEQ ID N.°:5
CTGACCCGACCTATGGGAGCGCTCTTGGC SEQ ID N.°:6
CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG SEQ ID N.°:7
GTGGCCATATGGACTTACAA SEQ ID N.°:8
CAAGGGCTGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACG SEQ ID N.°:9
CACCCGTCGTCATGTTCACGGAGCCCAGTGCG SEQ ID N.°:10
Sacarasa de S. cerevisiae NP_012104
GAAT T C C C C AAC AT G GT G GAG C AC GAC AC TCTCGTCTACTC C AAGAAT AT C AAAGAT AC AGT C T C AGAA GACCAAAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCA G C TAT C T GT CAC T T CAT CAAAAG GACAGTAGAAAAG GAAG GT G G CAC C TACAAAT G C CAT CAT T G C GAT AAAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGG AGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGAACATGGTGGA GCACGACACTCTCGTCTACTCCAAGAATATCAAAGATACAGT CT CAGAAGACCAAAGGGCTATT GAGAC TTTTCAACAAAGGGTAATATCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCAA AAG GACAGTAGAAAAG GAAG GT G G CAC C TACAAAT G C CAT CAT T G C GATAAAG GAAAG G C TAT C GT T CA AGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGA CGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACA ATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTG AAATCACCAGTCTCTCTCTACAAATCTATCTCTGGCGCGCCATATCAATGCTTCTTCAGGCCTTTCTTT TTCTTCTTGCTGGTTTTGCTGCCAAGATCAGCGCCTCTATGACGAACGAAACCTCGGATAGACCACTTG T G CAC T T TACAC CAAACAAG G G C T G GAT GAAT GAC C C CAAT G GAC TGTGGTAC GAC GAAAAAGAT G C CA AGTGGCATCTGTACTTTCAATACAACCCGAACGATACTGTCTGGGGGACGCCATTGTTTTGGGGCCACG CCACGTCCGACGACCTGACCAATTGGGAGGACCAACCAATAGCTATCGCTCCGAAGAGGAACGACTCCG GAGCATTCTCGGGTTCCATGGTGGTTGACTACAACAATACTTCCGGCTTTTTCAACGATACCATTGACC C GAGACAAC GCTGCGTGGC CATAT G GAC T TACAACACAC C G GAGT C C GAG GAG CAGTACAT C T C GTATA GCCTGGACGGTGGATACACTTTTACAGAGTATCAGAAGAACCCTGTGCTTGCTGCAAATTCGACTCAGT
TCCGAGATCCGAAGGTCTTTTGGTACGAGCCCTCGCAGAAGTGGATCATGACAGCGGCAAAGTCACAGG ACTACAAGATCGAAATTTACTCGTCTGACGACCTTAAATCCTGGAAGCTCGAATCCGCGTTCGCAAACG AGGGCTTTCTCGGCTACCAATACGAATGCCCAGGCCTGATAGAGGTCCCAACAGAGCAAGATCCCAGCA AGTCCTACTGGGTGATGTTTATTTCCATTAATCCAGGAGCACCGGCAGGAGGTTCTTTTAATCAGTACT TCGTCGGAAGCTTTAACGGAACTCATTTCGAGGCATTTGATAACCAATCAAGAGTAGTTGATTTTGGAA AGGACTACTATGCCCTGCAGACTTTCTTCAATACTGACCCGACCTATGGGAGCGCTCTTGGCATTGCGT GGGCTTCTAACTGGGAGTATTCCGCATTCGTTCCTACAAACCCTTGGAGGTCCTCCATGTCGCTCGTGA GGAAATTCTCTCTCAACACTGAGTACCAGGCCAACCCGGAAACCGAACTCATAAACCTGAAAGCCGAAC CGATCCTGAACATTAGCAACGCTGGCCCCTGGAGCCGGTTTGCAACCAACACCACGTTGACGAAAGCCA ACAGCTACAACGTCGATCTTTCGAATAGCACCGGTACACTTGAATTTGAACTGGTGTATGCCGTCAATA CCACCCAAACGATCTCGAAGTCGGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTTAAAGGCCTGGAAGACCCCG AGGAGTACCTCAGAATGGGTTTCGAGGTTTCTGCGTCCTCCTTCTTCCTTGATCGCGGGAACAGCAAAG TAAAATTT GT TAAGGAGAACCCATATTTTACCAACAGGAT GAGCGTTAACAACCAACCATT CAAGAGCG AAAACGACCTGTCGTACTACAAAGTGTATGGTTTGCTTGATCAAAATATCCTGGAACTCTACTTCAACG ATGGTGATGTCGTGTCCACCAACACATACTTCATGACAACCGGGAACGCACTGGGCTCCGTGAACATGA CGACGGGTGTGGATAACCTGTTCTACATCGACAAATTCCAGGTGAGGGAAGTCAAGTGAGATCTGTCGA TCGACAAGCTCGAGTTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAGGGAATTAGGGTTCCTATA GGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTAT CAATAAAAT T T C TAAT T C C TAAAACCAAAATCCAGTACTAAAAT CCAGATCC CCCGAATTAA
SEQ ID N.°:11
Construcción de recombinación homologa de KE858 SZ725
GCCCTTTGTCATCGTTGGCATGCTTTTTGCGTATGTACCATATGTTGAATGTATAATACGAACGGTTGA CCGTCTGAGATGCGAGCTTTGGGTCTTGTCAAATGCGTGGCCGCACGGCTCCCTCGCACCCAGCCCCGA GGCGTCGCG CAC C T G G C GAG GAG CAGAC C CAC G C CAAGAAAGT C TAGT C CAG CAT GTAACAACAT CAG G CAATGTGACGTTTTCGGTTCCCGATTTCTCTGCCGCTCTTTGACGGCAGGCACGGGCGAGCAACCGGCG GCGCTCGCGTCAGGCACGATGGATGCGGCGCTGCCCACCTGTCAATGTACCCCACCAGTCTGTCGATCG CTACAAGCAACCTTGTGCTCCACATTCCCACTTGCAGACAGTCTAGTCGATTTTGCCAAGCTGGATGTG AGGATTGGCCATATCTTGGAGGCCAAGATTCACCCGGATGCTGATGGGTACGTACGCGAGCCAGGCAGG CAGCTGCGTTGACTTTCTGATTGGCACAAAGCTTTGGCTACTCTCAATACCAACCACGTGCCCCTTCTG CACACCTGCTTCCTTCTGATGACCACTCGCCACGCATGTCGCAGTCTGTACGTCGAGCAGATCGACCTC GGCGAGGAGGGGGGCCCTCGCACCATCGTGAGTGGCCTGGTCCGGCACGTGACCCTGGAGGACCTTGTC GGCCGGCGGGTGGTGGTGCTGGCCAACCTCAAGCCTCGGAGCATGCGCGGGGTCAAATCGGCTGGGATG CTGCTCTGCGCCGCCAACGCGGATCACACCGCGGTGGAGCCGCTGCGGGTCCCGGACGCCGCCGTGACG GGGGAGCGGGTCTGGGCGGGGGACGAGGCACTCCTGTCCACGGAGCCTGCCACACCCAATCAGGTAAGG ACACGTTATTGGTGCGCATGGTGCGAATGCGTGGTCTGACCTGCTGTGGGTATGTGTTGTGGGATTGGA AACCGAATGAGGGCCGTTCAGGATTGAGCCCTTGGCCCCACCCTGCTCATCCTCTCACGCCCGCAGGTC CAGAAGAAGAAAATCTGGGAGGCAGTACAGCCGCTGCTGAGAGTGAACGCCCAGGGGATCGCTACTGTG GCAGGAGAGGCTATGGTGACCAGTGCGGGGCCACTGACCGCGCCCACGCTGGTTGACGCCGCGATTTCC TGACGCGAGCGACTGATTCTTGACCTTTGAGAAGCCACCACAGCACCATTTTCATTGTTCATCCTTGAT TTCAGTACGACTTCTCACCATTTCAGTACTGTAGGACCCCCAAAATAGTGTGATCACGCTCGCAAGGCA CCTGTGTGATCACGGGGAAGGGCGAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGG GCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGG GCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAG AC AT T AT AG C GAG C T AC C AAAG C C AT AT T C AAAC AC C T AGAT C AC TAC C AC T T C T AC AC AG G C C AC T C G AGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCG CGCCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGAC GAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGG CCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTG GGGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGC CATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTC CGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGA GT C C GAG GAG CAGTACAT C T C C TACAG C C T G GAC G G C G G C TACAC C T T CAC C GAGTAC CAGAAGAAC C C CGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAAGTG GATCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTCCTG GAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGA GGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAACCCCGGCGCCCC GGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAA CCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCCGAC CTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTTCGTGCCCACCAACCC
CTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGAC GGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGC CAC CAACAC CAC GT T GAC GAAG G C CAACAG C TACAAC GT C GAC C T GT C CAACAG CAC C G G CAC C C T G GA GTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCT CTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTT CTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCATGAG CGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCA GAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGG GAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGT G C G C GAG GT CAAGT GAT TAAT TAAC T C GAG G CAG CAG CAG C T C G GATAGTAT C GACACAC T C T G GAC G C TGGTCGTGTGA TGG ACTGTTG CCGCCA CACTTG CTG CCTTGA CCTG TG AATATCCCTGCCGCTTTTATC AA ACA G CCTCA G TG TG TTTG A TCTTG TG TG TA CG CG CTTTTG CG A G TTG CTA G CTG CTTG TG CTA TTTG CGAATACCACCC CCAGCA TCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTG CATCCCAA CCGCAA CTTATCTACG CTGTCCTG CTA TCCCTCA G CG CTG CTCCTG CTCCTG CTCA CTG CCCCTC G CA CA G CCTTG G TTTG G G CT CCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGG GAT GGGAACACAAAT GGAAAGCT T
SEQ ID N.°:12
Construcción de recombinación homologa SZ726
CCCGTGATCACACAGGTGCCTTGCGAGCGTGATCACACTATTTTGGGGGTCCTACAGTACTGAAATGGT GAGAAGTCGTACTGAAATCAAGGATGAACAATGAAAATGGTGCTGTGGTGGCTTCTCAAAGGTCAAGAA TCAGTCGCTCGCGTCAGGAAATCGCGGCGTCAACCAGCGTGGGCGCGGTCAGTGGCCCCGCACTGGTCA CCATAG CCTCTCCTGCCACAGTAGCGATCCCCTGGGCGTTCACTCTCAGCAGCGGCTGTACTGCCTCCC AGATTTTCTTCTTCTGGACCTGCGGGCGTGAGAGGATGAGCAGGGTGGGGCCAAGGGCTCAATCCTGAA C G G C C C T CAT TCG G TTTC CAAT C C CACAACACATAC C CACAG CAG GT CAGAC CAC G CAT T C G CAC CAT G CGCACCAAATAACGTGTCCTTACCTGATTGGGTGTGGCAGGCTCCGTGGACAGGAGTGCCTCGTCCCCC GCCCAGACCCGCTCCCCCGTCACGGCGGCGTCCGGGACCCGCAGCGGCTCCACCGCGGTGTGATCCGCG TTGGCGGCGCAGAGCAGCATCCCAGCCGATTTGACCCCGCGCATGCTCCGAGGCTTGAGGTTGGCCAGC ACCACCACCCGCCGGCCGACAAGGTCCTCCAGGGTCACGTGCCGGACCAGGCCACTCACGATGGTGCGA GGGCCCCCCTCCTCGCCGAGGTCGATCTGCTCGACGTACAGACTGCGACATGCGTGGCGAGTGGTCATC AGAAGGAAGCAGGTGTGCAGAAGGGGCACGTGGTTGGTATTGAGAGTAGCCAAAGCTTTGTGCCAATCA GAAAGTCAACGCAGCTGCCTGCCTGGCTCGCGTACAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAA AGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAA GCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCC C GAT T G CAAAGACAT TATAG C GAG C TAC CAAAG C CATAT T CAAACAC C TAGAT CAC TAC CAC T T C TACA CAG GCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACC CGCAAACGGCGCGCCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGC GCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAAC GACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAAC GACACCGTCTGGGGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGAC CAGCCCATCGCCATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTAC AACAACACCTCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTAC AACACCCCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCTTCACCGAGTAC CAGAAGAACCCCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCC T C C CAGAAGT G GAT CAT GAC C G C G G C CAAGT C C CAG GAC TACAAGAT C GAGAT CTACTCCTCC GAC GAC CTGAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCC GGCCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAAC CCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAG GCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAAC ACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTTCGTG CCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCC AACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGG AGCCGGTTCGC CAC CAACAC CAC GT T GAC GAAG G C CAACAG C TACAAC GT C GAC C T GT C CAACAG CAC C GGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCG GACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCC GCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTTCACC AACCGCATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTACGGC TTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTC ATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGAC AAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGATTAATTAACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACAC
ACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTG CCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCT TGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCA ACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCT TGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACG GGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTTGAGCTCGGTACCCGTACCCATCAGCATCCGGGTG AATCTTGGCCTCCAAGATATGGCCAATCCTCACATCCAGCTTGGCAAAATCGACTAGACTGTCTGCAAG TGGGAATGTGGAGCACAAGGTTGCTTGTAGCGATCGACAGACTGGTGGGGTACATTGACAGGTGGGCAG CGCCGCATCCATCGTGCCTGACGCGAGCGCCGCCGGTTGCTCGCCCGTGCCTGCCGTCAAAGAGCGGCA GAGAAATCGGGAACCGAAAACGTCACATTGCCTGATGTTGTTACATGCTGGACTAGACTTTCTTGGCGT GGGTCTGCTCCTCGCCAGGTGCGCGACGCCTCGGGGCTGGGTGCGAGGGAGCCGTGCGGCCACGCATTT GACAAGAC C CAAAGCT C GCAT CT CAGAC GGT CAAC C GT T C GTAT TATACAT T CAACATAT GGTACATAC GCAAAAAGCATG
SEQ ID N.°:13
Recombinación homologa: Casete de direccionamiento para la interrupción de la región codificante de estearoil ACP desaturasa de Prototheca moriformis (casete suc2 dirigido por p-tubulina)
TTTGGCCCCGCTTTCCAGCTCCGGATCTGCTGGCGTCCGCCGCGAGACGTGACATCGCACGTCGCCGGG AGCGCCAGCTTGATCACTTGGCAGGGGGCCGTGCTCTACAAATACCAGGCCCCGCGGCGGTCAGTTCGC ACATCCAATACCTGCCGAGCCATCTTGCCTACACTTTTTATCGACTCCTCTACTCTGTTCGCGAGAGCG CTCGGTCCAGGCTTGGAATTCGCCGAATTCAGCTCGATCAGTCGCTTCTGCAACTGATCTCGGCCGTTC GCAGACTGCCTTTTCTCAGCTTGTCAGGTAGCGAGTTGTTGTTTTATATTTATTCGATTTCATCTGTGT TGCATGTCTTGTTCGTGCTGTGCGTTCTTTCTGGGCCGCGCTGTCGGGTCGCATGGGCTAGCTGTACTC ATGTTAGTCATGCCGGTCCGACCTTGTTCGAGGAAGGCCCCACACTGAGCGTGCCCTCTTTCTACACCC CTTGTGCAGAAATTAGATAGAAAGCAGAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGG CGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTC GGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCA AAGACAT TATAG C GAG C TAC CAAAG C CATAT T CAAACAC C TAGAT CAC TACCACTTC TACACAG G C CAC TCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACG GCGCGCCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCAT GACGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAA CGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGT CTGGGGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCAT CGCCATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACAC CTCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCC G GAGT C C GAG GAG CAGTACAT C T C C TACAG C C T G GAC G G C G G C TACAC C T T CAC C GAGTAC CAGAAGAA CCCCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAA GTGGATCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTC CTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGAT CGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAACCCCGGCGC CCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGA CAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCC GACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTTCGTGCCCACCAA CCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGA GACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTT C G C CAC CAACAC CAC GT T GAC GAAG G C CAACAG C TACAAC GT C GAC C T GT C CAACAG CAC C G G CAC C C T GGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTC CCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTC CTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCAT GAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGA CCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCAC CGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCA G GT G C G C GAG GT CAAGT GAT TAAT TAAC T C GAG G CAG CAG CAG C T C G GATAGTAT C GACACAC T C T G GA CGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTT ATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTAT TTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCT ACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGG GCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAG TGGGATGGGAACACAAATGGACCGACACGCCCCCGGCCCAGGTCCAGTTCTCCTGGGTCTTCCAGAGGC
CCGTCGCCATGTAAAGTGGCAGAGATTGGCGCCTGATTCGATTTGGATCCAAGGATCTCCAATCGGTGA TGGGGACTGAGTGCCCAACTACCACCCTTGCACTATCGTCCTCGCACTATTTATTCCCACCTTCTGCTC GCCCTGCCGGGCGATTGCGGGCGTTTCTGCCCTTGACGTATCAATTTCGCCCCTGCTGGCGCGAGGATT CTTCATTCTAATAAGAACTCACTCCCGCCAGCTCTGTACTTTTCCTGCGGGGCCCCTGCATGGCTTGTT CCCAATGCTTGCTCGATCGACGGCGCCCATTGCCCACGGCGCTGCCGCATCCATGTGAAGAAACACGGA AGAGTGCGAAGACTGGAAGTGAATTAAGAGTATAAGAAGAGGTACCAAGGGATTCTCAGGTGCTCTTAG GAACGGCTTTTCCTTCGCCAAGAGAAACTGCTACTGCTCGTGTCGCCACGGTGGTCAAGCCGCCCCATC TGCGATCCACCAGGCCCATCCGCGGACTCGCGATCAGCCTGCTGGATCCGGACTGCCGACCTGACCGCT C G CAT C CAC CAT TACAAC C C T C CAAT T G GACAC CAC T C C CAC GT C C TAAAGT T CAC CAT G CAAG C T GAT CGATCGCATTCGCCGATGCACTCGCCTGCCACAGAGGTGTGCGCTTCGGACTAGCGTGCAGGCGCCCCG AGGCCACCAGCATGCACCGATGGAAGCGGGCACGGCCGCTGCTCCAGGTCGCTGGCTCGCTCAGACCCA TAGCAACCTCCGCTGCGTCCCTAAATGTCACACAGAGCGTCTTTGATGGGTACGGATGGGAGAGAATCT GATTGGGCATTGCTGGTGCAGTGCAGGAAGATGGCAAGTGCACAGTCAGTCATGCTGTACAAACTGGTG CCTCGTAGTATTGACTCGTATAGTGCATAGTATCATGCATGGTCGTTACTTGCAA
SEQ ID N.°:14
Recombinación homologa: Casete de direccionamiento para la interrupción de la región codificante de estearoil ACP desaturasa de Prototheca moriformis (casete suc2 solo)
TTTGGCCCCGCTTTCCAGCTCCGGATCTGCTGGCGTCCGCCGCGAGACGTGACATCGCACGTCGCCGGG AGCGCCAGCTTGATCACTTGGCAGGGGGCCGTGCTCTACAAATACCAGGCCCCGCGGCGGTCAGTTCGC ACATCCAATACCTGCCGAGCCATCTTGCCTACACTTTTTATCGACTCCTCTACTCTGTTCGCGAGAGCG CTCGGTCCAGGCTTGGAATTCGCCGAATTCAGCTCGATCAGTCGCTTCTGCAACTGATCTCGGCCGTTC GCAGACTGCCTTTTCTCAGCTTGTCAGGTAGCGAGTTGTTGTTTTATATTTATTCGATTTCATCTGTGT TGCATGTCTTGTTCGTGCTGTGCGTTCTTTCTGGGCCGCGCTGTCGGGTCGCATGGGCTAGCTGTACTC ATGTTAGTCATGCCGGTCCGACCTTGTTCGAGGAAGGCCCCACACTGAGCGTGCCCTCTTTCTACACCC CTTGTGCAGAAATTAGATAGAAAGCAATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCG CCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGG GCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGT ACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCA ACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGG TGGTGGACTACAACAACACCTCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCA TCTGGACCTACAACACCCCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCT TCACCGAGTACCAGAAGAACCCCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCT G GTAC GAG C C C T C C CAGAAGT G GAT CAT GAC C G C G G C CAAGT C C CAG GAC TACAAGAT C GAGAT C TAC T CCTCCGACGACCTGAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGT ACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCA TCTCCATCAACCCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCA CCCACTTCGAGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGA CCTTCTTCAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACT CCGCCTTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCG AGTAC CAG G C CAAC C C G GAGAC G GAG C T GAT CAAC C T GAAG G C C GAG C C GAT C C T GAACAT CAG CAAC G CCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACCTGT CCAACAGCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGT CCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCT TCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACC C C TAC T T CAC CAAC C GCAT GAG C GT GAACAAC CAG C C C T T CAAGAG C GAGAAC GAC CTGTCCTAC TACA AGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCA ACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGT TCTACATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGACCGACACGCCCCCGGCCCAGGTCCAGTTCTC CTGGGTCTTCCAGAGGCCCGTCGCCATGTAAAGTGGCAGAGATTGGCGCCTGATTCGATTTGGATCCAA GGATCTCCAATCGGTGATGGGGACTGAGTGCCCAACTACCACCCTTGCACTATCGTCCTCGCACTATTT ATTCCCACCTTCTGCTCGCCCTGCCGGGCGATTGCGGGCGTTTCTGCCCTTGACGTATCAATTTCGCCC CTGCTGGCGCGAGGATTCTTCATTCTAATAAGAACTCACTCCCGCCAGCTCTGTACTTTTCCTGCGGGG CCCCTGCATGGCTTGTTCCCAATGCTTGCTCGATCGACGGCGCCCATTGCCCACGGCGCTGCCGCATCC AT GT GAAGAAACAC GGAAGAGT GC GAAGACT GGAAGTGAATTAAGAGTATAAGAAGAGGTACCAAGGGA TTCTCAGGTGCTCTTAGGAACGGCTTTTCCTTCGCCAAGAGAAACTGCTACTGCTCGTGTCGCCACGGT GGTCAAGCCGCCCCATCTGCGATCCACCAGGCCCATCCGCGGACTCGCGATCAGCCTGCTGGATCCGGA CTGCCGACCTGACCGCTCGCATCCACCATTACAACCCTCCAATTGGACACCACTCCCACGTCCTAAAGT TCACCATGCAAGCTGATCGATCGCATTCGCCGATGCACTCGCCTGCCACAGAGGTGTGCGCTTCGGACT AGCGTGCAGGCGCCCCGAGGCCACCAGCATGCACCGATGGAAGCGGGCACGGCCGCTGCTCCAGGTCGC TGGCTCGCTCAGACCCATAGCAACCTCCGCTGCGTCCCTAAATGTCACACAGAGCGTCTTTGATGGGTA CGGATGGGAGAGAATCTGATTGGGCATTGCTGGTGCAGTGCAGGAAGATGGCAAGTGCACAGTCAGTCA TGCTGTACAAACTGGTGCCTCGTAGTATTGACTCGTATAGTGCATAGTATCATGCATGGTCGTTACTTG CAA
SEQ ID N.°:15
Secuencia de aminoácidos de FATB1 de Cinnamomum camphora (Genbank Q39473) con péptido de tránsito de desaturasa de ácido graso delta 12 de Prototheca moriformis.
M A IK TN R Q PV EKPPFTIGTLRK AIPA HCFERSALRGRAPDW SM LFAVTTTIFSAA EK QW TNLEW K PKPN PPQLLDDHFGPHGLVFRRTFAIRSY EV GPDRSTSIV AVM NHLQEAA LNH AKSVG ILGD GFGTTLEM SKR DLIW W KRTHVAVERYPAW GDTVEVECW VGASGNNGRRHDFLVRDCKTGEILTRCTSLSVM MNTRTRRL SK IPEEV R G EIG PA FID N V A V K D EEIK K PQ K LN D STA D Y IQ G G LTPR W N D LD IN Q H V N N IK Y V D W ILET V PD SIFESH H ISSFTIE Y R R E C T M D SV L Q SLT TV SG G SSEA G L V C E H L LQ L E G G SEV LR A K T EW R PK LT D S F R G IS V IP A E S S V
SEQ ID N.°:16
Construcción de expresión relevante con codones optimizados de ADNc de FATB1 de Cinnamomum camphora con con péptido de tránsito de desaturasa de ácido graso delta 12 de Prototheca moriformis
GGTACCCGCCTGCAACGCAAGGGCAGCCACAGCCGCTCCCACCCGCCGCTGAACCGACACGTGCTTGGG CGCCTGCCGCCTGCCTGCCGCATGCTTGTGCTGGTGAGGCTGGGCAGTGCTGCCATGCTGATTGAGGCT TGGTTCATCGGGTGGAAGCTTATGTGTGTGCTGGGCTTGCATGCCGGGCAATGCGCATGGTGGCAAGAG GGCGGCAGCACTTGCTGGAGCTGCCGCGGTGCCTCCAGGTGGTTCAATCGCGGCAGCCAGAGGGATTTC AGATGATCGCGCGTACAGGTTGAGCAGCAGTGTCAGCAAAGGTAGCAGTTTGCCAGAATGATCGGTTCA G C T GT TAAT CAAT G C CAG CAAGAGAAG G G GT CAAGT G CAAACAC G G G CAT G C CACAG CAC G G G CAC C G G GGAGTGGAATGGCACCACCAAGTGTGTGCGAGCCAGCATCGCCGCCTGGCTGTTTCAGCTACAACGGCA GGAGTCATCCAACGTAACCATGAGCTGATCAACACTGCAATCATCGGGCGGGCGTGATGCAAGCATGCC TGGCGAAGACACATGGTGTGCGGATGCTGCCGGCTGCTGCCTGCTGCGCACGCCGTTGAGTTGGCAGCA GGCTCAGCCATGCACTGGATGGCAGCTGGGCTGCCACTGCAATGTGGTGGATAGGATGCAAGTGGAGCG AATACCAAACCCTCTGGCTGCTTGCTGGGTTGCATGGCATCGCACCATCAGCAGGAGCGCATGCGAAGG GACTGGCCCCATGCACGCCATGCCAAACCGGAGCGCACCGAGTGTCCACACTGTCACCAGGCCCGCAAG CTTTGCAGAACCATGCTCATGGACGCATGTAGCGCTGACGTCCCTTGACGGCGCTCCTCTCGGGTGTGG GAAACGCAATGCAGCACAGGCAGCAGAGGCGGCGGCAGCAGAGCGGCGGCAGCAGCGGCGGGGGCCACC CTTCTTGCGGGGTCGCGCCCCAGCCAGCGGTGATGCGCTGATCCCAAACGAGTTCACATTCATTTGCAT GCCTGGAGAAGCGAGGCTGGGGCCTTTGGGCTGGTGCAGCCCGCAATGGAATGCGGGACCGCCAGGCTA GCAGCAAAGGCGCCTCCCCTACTCCGCATCGATGTTCCATAGTGCATTGGACTGCATTTGGGTGGGGCG GCCGGCTGTTTCTTTCGTGTTGCAAAACGCGCCAGCTCAGCAACCTGTCCCGTGGGTCCCCCGTGCCGA TGAAATCGTGTGCACGCCGATCAGCTGATTGCCCGGCTCGCGAAGTAGGCGCCCTCCTTTCTGCTCGCC CTCTCTCCGTCCCGCCTCTAGAATATCAATGATCGAGCAGGACGGCCTCCACGCCGGCTCCCCCGCCGC CTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCGGCTGCTCCGACGCCGCCGTGTT CCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGACCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCT GCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGGCGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGT GGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCGAGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCA CCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCGACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGC CACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCGCATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCT GGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGCACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAA GGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGT GGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCTTCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACAT CGCCCTGGCCACCCGCGACATCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTA CGGCATCGCCGCCCCCGACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGACAATT GGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACA CTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGT GTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCT CGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCT GCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCT GTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGGATCCCGCGT CTCGAACAGAGCGCGCAGAGGAACGCTGAAGGTCTCGCCTCTGTCGCACCTCAGCGCGGCATACACCAC AATAACCACCTGACGAATGCGCTTGGTTCTTCGTCCATTAGCGAAGCGTCCGGTTCACACACGTGCCAC
GTTGGCGAGGTGGCAGGTGACAATGATCGGTGGAGCTGATGGTCGAAACGTTCACAGCCTAGGGATATC GAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGC TGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCG CTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGC CATAT T CAAACAC C TAGAT CAC TAC CAC T T C TACACAG G C CAC T C GAG C T T GT GAT C G CAC T C C G C TAA GGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACACTAGTATGGCTATCAAGACGAACAGG CAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAG CGCTCGGCGCTTCGTGGGCGCGCCCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATCTTCTCC GCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAACCCCCCCCAGCTGCTGGACGAC CACTTCGGCCCCCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCAGCTACGAGGTGGGCCCCGAC CGCTCCACCAGCATCGTGGCCGTGATGAACCACCTGCAGGAGGCCGCCCTGAACCACGCCAAGTCCGTG GGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTGAAG CGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGGTGGAGTGCTGGGTGGGC GCCTCCGGCAACAACGGCCGCCGCCACGACTTCCTGGTGCGCGACTGCAAGACCGGCGAGATCCTGACC CGCTGCACCTCCCTGAGCGTGATGATGAACACCCGCACCCGCCGCCTGAGCAAGATCCCCGAGGAGGTG CGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCCGTGAAGGACGAGGAGATCAAGAAGCCCCAG AAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGGCGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACATC AAC CAG CAC GT GAACAACAT CAAGTAC GT G GAC T G GAT C C T G GAGAC C GT G C C C GACAG CAT C T T C GAG AGCCACCACATCTCCTCCTTCACCATCGAGTACCGCCGCGAGTGCACCATGGACAGCGTGCTGCAGTCC CTGACCACCGTGAGCGGCGGCTCCTCCGAGGCCGGCCTGGTGTGCGAGCACCTGCTGCAGCTGGAGGGC GGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCAAGACCGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGC GT GAT C C C C G C C GAGT C CAG C GT GAT G GAC TACAAG GAC CAC GAC G G C GAC TACAAG GAC CAC GACAT C GAC TACAAG GAC GAC GAC GACAAGT GAT GAC T C GAG G CAG CAG CAG C T C G GATAGTAT C GACACAC T C T GGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCT TTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGC TATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTA TCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTT TGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAG TAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTT
SEQ ID N.°:17
Secuencia de aminoácidos de FATB1 de Umbelullaria californica (Genbank Q41635) con péptido de tránsito de desaturasa de ácido graso delta 12 de Prototheca moriformis.
M A IK TN R Q PV EKPPFTIGTLRK AIPA HCFERSALRGRAPDW SM LFAVITTIFSA AEKQW TN LEW KPK PK LPQLLDDHFGLHGLVFRRTFAIRSYEVGPDRSTSILAVM NHM QEATLNHAKSVGILGDGFGTTLEM SKR DLMW WRRTHVAVERYPTWGDTVEVECW IGASGNNGMRRDFLVRDCKTGEILTRCTSLSVLMNTRTRRL STIPD EV RGEIGPA FIDN VAV KDD EIK KLQKLNDSTADY IQ GGLTPRW NDLDW QH W NLKY VAW VFET V PD SIFESH H ISSFTLEY R R EC TR D SV LR SLTTV SG G SSEA G LV C D H LLQ LEG G SEV LR A R TEW R PK LT D S F R G IS V IP A E P R V
SEQ ID N.°:18
Construcción de expresión relevante con codones optimizados de ADNc de FATB1 de Umbelullaria californica con péptido de tránsito de desaturasa de ácido graso delta 12 de Prototheca moriformis.
GGTACCCGCCTGCAACGCAAGGGCAGCCACAGCCGCTCCCACCCGCCGCTGAACCGACACGTGCTTGGG CGCCTGCCGCCTGCCTGCCGCATGCTTGTGCTGGTGAGGCTGGGCAGTGCTGCCATGCTGATTGAGGCT TGGTTCATCGGGTGGAAGCTTATGTGTGTGCTGGGCTTGCATGCCGGGCAATGCGCATGGTGGCAAGAG GGCGGCAGCACTTGCTGGAGCTGCCGCGGTGCCTCCAGGTGGTTCAATCGCGGCAGCCAGAGGGATTTC AGATGATCGCGCGTACAGGTTGAGCAGCAGTGTCAGCAAAGGTAGCAGTTTGCCAGAATGATCGGTTCA G C T GT TAAT CAAT G C CAG CAAGAGAAG G G GT CAAGT G CAAACAC G G G CAT G C CACAG CAC G G G CAC C G G GGAGTGGAATGGCACCACCAAGTGTGTGCGAGCCAGCATCGCCGCCTGGCTGTTTCAGCTACAACGGCA GGAGTCATCCAACGTAACCATGAGCTGATCAACACTGCAATCATCGGGCGGGCGTGATGCAAGCATGCC TGGCGAAGACACATGGTGTGCGGATGCTGCCGGCTGCTGCCTGCTGCGCACGCCGTTGAGTTGGCAGCA GGCTCAGCCATGCACTGGATGGCAGCTGGGCTGCCACTGCAATGTGGTGGATAGGATGCAAGTGGAGCG AATACCAAACCCTCTGGCTGCTTGCTGGGTTGCATGGCATCGCACCATCAGCAGGAGCGCATGCGAAGG GACTGGCCCCATGCACGCCATGCCAAACCGGAGCGCACCGAGTGTCCACACTGTCACCAGGCCCGCAAG CTTTGCAGAACCATGCTCATGGACGCATGTAGCGCTGACGTCCCTTGACGGCGCTCCTCTCGGGTGTGG GAAACGCAATGCAGCACAGGCAGCAGAGGCGGCGGCAGCAGAGCGGCGGCAGCAGCGGCGGGGGCCACC
CTTCTTGCGG GGTCG CG CCCCA G C CA G CG G TG A TG CG CTG A TC CCA A A CG A G TTCA CA TTCA TTTG C A T GCCTGGAGAAGCGAGGCTGGGGCCTTTGGGCTGGTGCAGCCCGCAATGGAATGCGGGACCGCCAGGCTA G C A G C A A AGG CGCCTCCCCTACTCCGCATCGA TG TTCCATAG TG CATTG GACTGCA TTTG GGTGG GGCG GCCG GCTG TTTC TTTC G TG TTG C A A A A C G C G C C A G C TC A G C A A C C TG TC C C G TG G G TC C C C C G TG C C G A TGA A A TCG TG TG CA CG CCG A TCA G CTG A TTG CCCG G CTCG CG A A G TA G G CG CCCTC CTTTC TG C TCG CC CTCTCTCCG TCCCG CCTCTA G A A TA TCA A TG A TCG A G CA G G A CG G C CTCCA CG CCG G CTCC CCCG CCG C CTGGG TG GAG CGCCTGTTCG GCTACGA CTG GGCCCA GCAG ACCA TCG GCTGCTCCGACG CCGCCG TGTT CCG CC TG TCCG CCCAGG GCCGCCC CGTGCTGTTCGTGA AGA CCGAC CTG TCCG GCGCCCTGA ACGA GCT GCA GGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGGCGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGT GG TG ACCGA GGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCGAGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCA CCTGGCCC CCGCCGA GAA GGTGTCCATCATGG CCGACG CCATGCGCCGCCTGCACA CCCTG GACCCCGC CACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCGCATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCT GG TG GACCAGGACGACCTGGACGAGGAGCACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAA GG CCCGCATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGT GG AGA ACGGCCGCTTCTCCGGCTTCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACAT CGCCC TGG CCACCCGCGACATCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTA CGG CATCGCC G C C C C C G A C TC C C A G C G C A TC G C C TTC TA C C G C C TG C TG G A C G A G TTC TTC TG A C A A TT GGCAGCAGCAGCTCG GATAG TA TCG ACACA CTCTGG ACGCTGG TCG TG TG ATGGA CTG TTGCCG CCACA C TTG C TG C C TT G A C C TG TG A A T A T C C C T G C C G C T T TT A T C A A A C A G C C TC A G T G T G T TT G A T C T TG TG T G TA C G C G C TTTTG C G A G TTG C TA G C TG C TTG TG C TA TTTG C G A A TA C C A C C C C C A G C A TC C C C TTC C C T C G TTTC A TA TC G C TTG C A TC C C A A C C G C A A C TTA TC TA C G C TG TC C TG C TA TC C C TC A G C G C TG C TC C T G C TC C TG C TC A C TG C C C C TC G C A C A G C C TTG G TTTG G G C TC C G C C TG TA TTC TC C TG G TA C TG C A A C C T GTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGGATCCCGCGT CTCGAACAGAGCGCGCAGAGGAACGCTGAAGGTCTCGCCTCTGTCGCACCTCAGCGCGGCATACACCAC AA TA ACCACCTG A CG A A TG CG CTTG G TTCTTCG TCCA TTA G CG A A G CG TCCG G TTCA CA CA CG TG CCA C GTTGGCGAGGTGGCAGGTGACAATGATCGGTGGAGCTGATGGTCGAAACGTTCACAGCCTAGGGATATC G A ATTCCTTTCTTGCGCTATGAC ACTTCCA GCAA AAG GTAGG GCGG GCTGCGA GACG GCTTCCCG GCGC TGCATGCA ACACCG ATGATGCTTCGACCCC CCGAA GCTCCTTCGG GGCTGCA TG GGCG CTCCG ATGCCG CTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGC CATAT T CAAACAC C TAGAT CAC TAC CAC T T C TACACAG G C CAC T C GAG C T T GT GAT C G CAC T C C G C TAA GGGGG CGCCTCTTCCTCTTCGTTTCA GTCACAA CCCGCA AACA CTA GTATG GCTATCAAG ACGA ACAG G CAGCCTGTGGAG AAG CCTCCG TTCACG ATCGGG ACGCTGCGCAA GGCCA TCCCCG CGCA CTG TTTCG AG CGCTCGG CGCTTCG TG G G C G C G C C C C C G A C TG G TC C A TG C TG TTC G C C G TG A TC A C C A C C A TC TTC A G C GCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAAGCTGCCCCAGCTGCTGGACGAC CACTTCG G CCTG CA CG G C CTG G TG TTCCG C CG CA CCTTCG CCA TCCG C TCCTA CG A G G TG G G CCCCG A C CGCAGCACCTCCATCCTGGCCGTGATGAACCACATGCAGGAGGCCACCCTGAACCACGCCAAGAGCGTG GGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCGACCTGATGTGGGTGGTGCGC CGCA CCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCACCTGGGGCGACACCGTGGAGGTGGAGTGCTGGATCGGC GCCA GCGG CAACAACGGCATGCGCCGCGACTTCCTGGTGCGCGACTGCAAGACCGGCGAGATCCTGACC CGCTGCACCTCCCTG AGCG TG CTG ATG AACACCCGCA CCCGCCG CCTG AGCA CCATCCCCGA CGAG GTG CGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCCGTGAAGGACGACGAGATCAAGAAGCTGCAG AA GCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGGCGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACGTG AA CCAGCA CGTGAACAACCTGAAGTACGTGGCCTGGGTGTTCGAGACCGTGCCCGACAGCATCTTCGAG TC C C A C C A C A TCAGCTCCTTCA CCCTG GAG TA CCGCCGC GAG TGC ACCCGCG ACTCCGTGCTGCGCA GC CTGACCACCGTGAGCGGCGGCAGCTCCGAGGCCGGCCTGGTGTGCGACCACCTGCTGCAGCTGGAGGGC GGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCCGCACCGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGC GTGATCCCCGCCGAGCCCCGCGTGATGGACTACAAGGACCACGACGGCGACTACAAGGACCACGACATC GAC TACAAG GAC GAC GAC GACAAGT GAT GAC T C GAG G CAG CAG CAG C T C G GATAGTAT C GACACAC T C T GG ACGC TG G TC G TG TG A TG G A C TG TTG C C G C C A C A C TTG C TG C C TTG A C C TG TG A A TA TC C C TG C C G C T T TTA TC A A A C A G C C TC A G TG TG TTTG A TC TTG TG TG TA C G C G C TTTTG C G A G TTG C TA G C TG C TTG TG C TA TTTG C G A A TA C C A C C C C C A G C A TC C C C TTC C C TC G TTTC A TA TC G C TTG C A TC C C A A C C G C A A C TTA T C TA C G C T G T C C TG C TA TC C C T C A G C G C T G C T C C T G C T C C TG C TC A C TG C C C C TC G C A C A G C C T TG G T T TG G G C TC C G C C TG TA TTCTCCTG GTACTGCAA CCTG TA AACCA GCACTGCA ATGCTGATGCA CGGG AAG TAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTT
SEQ ID N.°:19
Secuencia de aminoácidos de FATB2 de Cuphea hookeriana (Genbank AAC49269) con péptido de tránsito de desaturasa de ácido graso delta 12 de Prototheca moriformis.
MAIKTNRQPVEKPPFTIGTLRKAIPAHCFERSALRGRAQLPDWSRLLTAITTVFVKSKRPDMHDRKSKR PDMLVDSFGLESTVQDGLVFRQSFSIRSYEIGTDRTASIETLMNHLQETSLNHCKSTGILLDGFGRTLE MCKRDLIWWIKMQIKVNRYPAWGDTVEINTRFSRLGKIGMGRDWLISDCNTGEILVRATSAYAMMNQK TRRLSKLPYEVHQEIVPLFVDSPVIEDSDLKVHKFKVKTGDSIQKGLTPGWNDLDVNQHVSNVKYIGWI LESMPTEVLETQELCSLALEYRRECGRDSVLESVTAMDPSKVGVRSQYQHLLRLEDGTAIWGATEWRP KNAGANGAISTGKTSNGNSVS SEQ ID N.°:20
Construcción de expresión relevante con codones optimizados de ADNc de FATB2 de Cuphea hookeriana con péptido de tránsito de desaturasa de ácido graso delta 12 de Prototheca moriformis.
GGTACCCGCCTGCAACGCAAGGGCAGCCACAGCCGCTCCCACCCGCCGCTGAACCGACACGTGCTTGGG CGCCTGCCGCCTGCCTGCCGCATGCTTGTGCTGGTGAGGCTGGGCAGTGCTGCCATGCTGATTGAGGCT TGGTTCATCGGGTGGAAGCTTATGTGTGTGCTGGGCTTGCATGCCGGGCAATGCGCATGGTGGCAAGAG GGCGGCAGCACTTGCTGGAGCTGCCGCGGTGCCTCCAGGTGGTTCAATCGCGGCAGCCAGAGGGATTTC AGATGATCGCGCGTACAGGTTGAGCAGCAGTGTCAGCAAAGGTAGCAGTTTGCCAGAATGATCGGTTCA G C T GT TAAT CAAT G C CAG CAAGAGAAG G G GT CAAGT G CAAACAC G G G CAT G C CACAG CAC G G G CAC C G G GGAGTGGAATGGCACCACCAAGTGTGTGCGAGCCAGCATCGCCGCCTGGCTGTTTCAGCTACAACGGCA GGAGTCATCCAACGTAACCATGAGCTGATCAACACTGCAATCATCGGGCGGGCGTGATGCAAGCATGCC TGGCGAAGACACATGGTGTGCGGATGCTGCCGGCTGCTGCCTGCTGCGCACGCCGTTGAGTTGGCAGCA GGCTCAGCCATGCACTGGATGGCAGCTGGGCTGCCACTGCAATGTGGTGGATAGGATGCAAGTGGAGCG AATACCAAACCCTCTGGCTGCTTGCTGGGTTGCATGGCATCGCACCATCAGCAGGAGCGCATGCGAAGG GACTGGCCCCATGCACGCCATGCCAAACCGGAGCGCACCGAGTGTCCACACTGTCACCAGGCCCGCAAG CTTTGCAGAACCATGCTCATGGACGCATGTAGCGCTGACGTCCCTTGACGGCGCTCCTCTCGGGTGTGG GAAACGCAATGCAGCACAGGCAGCAGAGGCGGCGGCAGCAGAGCGGCGGCAGCAGCGGCGGGGGCCACC CTTCTTGCGGGGTCGCGCCCCAGCCAGCGGTGATGCGCTGATCCCAAACGAGTTCACATTCATTTGCAT GCCTGGAGAAGCGAGGCTGGGGCCTTTGGGCTGGTGCAGCCCGCAATGGAATGCGGGACCGCCAGGCTA GCAGCAAAGGCGCCTCCCCTACTCCGCATCGATGTTCCATAGTGCATTGGACTGCATTTGGGTGGGGCG GCCGGCTGTTTCTTTCGTGTTGCAAAACGCGCCAGCTCAGCAACCTGTCCCGTGGGTCCCCCGTGCCGA TGAAATCGTGTGCACGCCGATCAGCTGATTGCCCGGCTCGCGAAGTAGGCGCCCTCCTTTCTGCTCGCC CTCTCTCCGTCCCGCCTCTAGAATATCAATGATCGAGCAGGACGGCCTCCACGCCGGCTCCCCCGCCGC CTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCGGCTGCTCCGACGCCGCCGTGTT CCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGACCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCT GCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGGCGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGT GGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCGAGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCA CCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCGACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGC CACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCGCATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCT GGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGCACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAA GGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGT GGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCTTCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACAT CGCCCTGGCCACCCGCGACATCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTA CGGCATCGCCGCCCCCGACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGACAATT GGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACA CTTG CTG CCTTGA CCTG TG AATATCCCTGCCGCTTTTATCAA ACAG CCTCA GTGTGTTTGATCTTG TG T GTACG CGCTTTTGCGA GTTG CTA GCTGCTTGTGCTATTTG CGAA TA CCACCCCCA GCATCCCCTTCCCT CG TTTCA TA TCG CTTGCA TCCCA ACCGCA ACTTA TCTACG CTG TCCTGCTATCCCTCAG CGCTGCTCCT GCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCA CAGCCTTGGTTTG GGCTCCGCCTGTATTCTCCTGG TA CTG CAACCT GTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGGATCCCGCGT CTCGAACAGAGCGCGCAGAGGAACGCTGAAGGTCTCGCCTCTGTCGCACCTCAGCGCGGCATACACCAC AATAACCACCTGACGAATGCGCTTGGTTCTTCGTCCATTAGCGAAGCGTCCGGTTCACACACGTGCCAC GTTGGCGAGGTGGCAGGTGACAATGATCGGTGGAGCTGATGGTCGAAACGTTCACAGCCTAGGGATATC GAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGC TGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCG CTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGC C AT AT T C AAAC AC C T AGAT C AC TAC C AC T T C T AC AC AG G C C AC T C GAG C T T GT GAT C G C AC T C C G C T AA GGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACACTAGTATGGCTATCAAGACGAACAGG CAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAG CGCTCGGCGCTTCGTGGGCGCGCCCAGCTGCCCGACTGGAGCCGCCTGCTGACCGCCATCACCACCGTG TTCGTGAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCACGACCGCAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCTGGTGGACAGC TTCG GCCTGGAGTCCACCGTGCAGGACGGCCTGGTGTTCCGCCAGTCCTTCTCCATCCGCTCCTACGAG ATCGGCACCGACCGCACCGCCAGCATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACCTCCCTGAACCAC TGCAAGAGCACCGGCATCCTGCTGGACGGCTTCGGCCGCACCCTGGAGATGTGCAAGCGCGACCTGATC
TGGGTGGTGATCAAGATGCAGATCAAGGTGAACCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGATCAAC ACCCGCTTCAGCCGCCTGGGCAAGATCGGCATGGGCCGCGACTGGCTGATCTCCGACTGCAACACCGGC GAGATCCTGGTGCGCGCCACCAGCGCCTACGCCATGATGAACCAGAAGACCCGCCGCCTGTCCAAGCTG CCCTACGAGGTGCACCAGGAGATCGTGCCCCTGTTCGTGGACAGCCCCGTGATCGAGGACTCCGACCTG AAGGTGCACAAGTTCAAGGTGAAGACCGGCGACAGCATCCAGAAGGGCCTGACCCCCGGCTGGAACGAC CTGGACGTGAACCAGCACGTGTCCAACGTGAAGTACATCGGCTGGATCCTGGAGAGCATGCCCACCGAG GTGCTGGAGACCCAGGAGCTGTGCTCCCTGGCCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACTCCGTG CTGGAGAGCGTGACCGCCATGGACCCCAGCAAGGTGGGCGTGCGCTCCCAGTACCAGCACCTGCTGCGC CTGGAGGACGGCACCGCCATCGTGAACGGCGCCACCGAGTGGCGCCCCAAGAACGCCGGCGCCAACGGC GCCATCTCCACCGGCAAGACCAGCAACGGCAACTCCGTGTCCATGGACTACAAGGACCACGACGGCGAC TACAAG GAC CAC GACAT C GAC TACAAG GAC GAC GAC GACAAGT GAC T C GAG G CAG CAG CAG C T C G GATA GTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTG AATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTT GCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCAT CCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCT CGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATG CTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTT
SEQ ID N.°:21
Secuencia de aminoácidos de tioesterasa Cuphea palustris con preferencia por C8 (Genbank AAC49179) con péptido de tránsito de desaturasa de ácido graso delta 12 de Prototheca moriformis.
M A IK TN R Q PV E K PPFT IG T LR K A IPA H C FER SA L R G R A PA N G SA V T LK SG SLN TQ ED T L SSSPPPR A FF NQ LPDW SM LLTA ITTVFVAPEK RW TM FDRKSKRPNM LM D SFG LERW QDG LV FRQSFSIRSYEICAD RT ASIETVM NHV QETSLN QCKSIGLLD DGFGRSPEM CKRD LIW W TRM K IM VN RYPTW GDTIEVSTW LSQS GKIGM GRDW LISDCNTGEILVRATSVYAM M NQKTRRFSKLPHEVRQEFAPHFLDSPPAIEDNDGKLQKF D V K TG D SIRKGLTPGW YD LD W QH VSN VKY IGW ILESM PTEV LETQELCSLTLEYRRECGR DSV LESV T SMDPSKVGDRFQYRHLLRLEDGADIMKGRTEWRPKNAGTNGAISTGKT
SEQ ID N.°:22
Construcción de expresión relevante con codones optimizados de cDNA de tioesterasa de Cuphea palustris con preferencia por C8 con péptido de tránsito de desaturasa de ácido graso delta 12 de Prototheca moriformis.
GGTACCCGCCTGCAACGCAAGGGCAGCCACAGCCGCTCCCACCCGCCGCTGAACCGACACGTGCTTGGG CGCCTGCCGCCTGCCTGCCGCATGCTTGTGCTGGTGAGGCTGGGCAGTGCTGCCATGCTGATTGAGGCT TGGTTCATCGGGTGGAAGCTTATGTGTGTGCTGGGCTTGCATGCCGGGCAATGCGCATGGTGGCAAGAG GGCGGCAGCACTTGCTGGAGCTGCCGCGGTGCCTCCAGGTGGTTCAATCGCGGCAGCCAGAGGGATTTC AGATGATCGCGCGTACAGGTTGAGCAGCAGTGTCAGCAAAGGTAGCAGTTTGCCAGAATGATCGGTTCA G C T GT TAAT CAAT G C CAG CAAGAGAAG G G GT CAAGT G CAAACAC G G G CAT G C CACAG CAC G G G CAC C G G GGAGTGGAATGGCACCACCAAGTGTGTGCGAGCCAGCATCGCCGCCTGGCTGTTTCAGCTACAACGGCA GGAGTCATCCAACGTAACCATGAGCTGATCAACACTGCAATCATCGGGCGGGCGTGATGCAAGCATGCC TGGCGAAGACACATGGTGTGCGGATGCTGCCGGCTGCTGCCTGCTGCGCACGCCGTTGAGTTGGCAGCA GGCTCAGCCATGCACTGGATGGCAGCTGGGCTGCCACTGCAATGTGGTGGATAGGATGCAAGTGGAGCG AATACCAAACCCTCTGGCTGCTTGCTGGGTTGCATGGCATCGCACCATCAGCAGGAGCGCATGCGAAGG GACTGGCCCCATGCACGCCATGCCAAACCGGAGCGCACCGAGTGTCCACACTGTCACCAGGCCCGCAAG CTTTGCAGAACCATGCTCATGGACGCATGTAGCGCTGACGTCCCTTGACGGCGCTCCTCTCGGGTGTGG GAAACGCAATGCAGCACAGGCAGCAGAGGCGGCGGCAGCAGAGCGGCGGCAGCAGCGGCGGGGGCCACC CTTCTTGCGGGGTCGCGCCCCAGCCAGCGGTGATGCGCTGATCCCAAACGAGTTCACATTCATTTGCAT GCCTGGAGAAGCGAGGCTGGGGCCTTTGGGCTGGTGCAGCCCGCAATGGAATGCGGGACCGCCAGGCTA GCAGCAAAGGCGCCTCCCCTACTCCGCATCGATGTTCCATAGTGCATTGGACTGCATTTGGGTGGGGCG GCCGGCTGTTTCTTTCGTGTTGCAAAACGCGCCAGCTCAGCAACCTGTCCCGTGGGTCCCCCGTGCCGA TGAAATCGTGTGCACGCCGATCAGCTGATTGCCCGGCTCGCGAAGTAGGCGCCCTCCTTTCTGCTCGCC CTCTCTCCGTCCCGCCTCTAGAATATCAATGATCGAGCAGGACGGCCTCCACGCCGGCTCCCCCGCCGC CTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCGGCTGCTCCGACGCCGCCGTGTT CCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGACCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCT GCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGGCGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGT GGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCGAGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCA CCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCGACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGC CACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCGCATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCT
GG TG GACCAGGACGACCTGGACGAGGAGCACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAA
GG CCCGCATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGT GG AGA ACGGCCGCTTCTCCGGCTTCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACAT CGCCC TGG CCACCCGCGACATCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTA CGG CATCGCC G C C C C C G A C TC C C A G C G C A TC G C C TTC TA C C G C C TG C TG G A C G A G TTC TTC TG A C A A TT GGCAGCAGCAGCTCG GATAG TA TCG ACACA CTCTGG ACGCTGG TCG TG TG ATGGA CTG TTGCCG CCACA C TTG C TG C C TT G A C C TG TG A A T A T C C C T G C C G C T T TT A T C A A A C A G C C TC A G T G T G T TT G A T C T TG TG T G TA C G C G C TTTTG C G A G TTG C TA G C TG C TTG TG C TA TTTG C G A A TA C C A C C C C C A G C A TC C C C TTC C C T C G TTTC A TA TC G C TTG C A TC C C A A C C G C A A C TTA TC TA C G C TG TC C TG C TA TC C C TC A G C G C TG C TC C T G C TC C TG C TC A C TG C C C C TC G C A C A G C C TTG G TTTG G G C TC C G C C TG TA TTC TC C TG G TA C TG C A A C C T GTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGGATCCCGCGT CTCGAACAGAGCGCGCAGAGGAACGCTGAAGGTCTCGCCTCTGTCGCACCTCAGCGCGGCATACACCAC AA TA ACCACCTG A CG A A TG CG CTTG G TTCTTCG TCCA TTA G CG A A G CG TCCG G TTCA CA CA CG TG CCA C GTTGGCGAGGTGGCAGGTGACAATGATCGGTGGAGCTGATGGTCGAAACGTTCACAGCCTAGGGATATC G A ATTCCTTTCTTGCGCTATGAC ACTTCCA GCAA AAG GTAGG GCGG GCTGCGA GACG GCTTCCCG GCGC TGCATGCA ACACCG ATGATGCTTCGACCCC CCGAA GCTCCTTCGG GGCTGCA TG GGCG CTCCG ATGCCG CTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGC CATAT T CAAACAC C TAGAT CAC TAC CAC T T C TACACAG G C CAC T C GAG C T T GT GAT C G CAC T C C G C TAA GGGGG CGCCTCTTCCTCTTCGTTTCA GTCACAA CCCGCA AACA CTA GTATG GCTATCAAG ACGA ACAG G CAGCCTGTGGAG AAG CCTCCG TTCACG ATCGGG ACGCTGCGCAA GGCCA TCCCCG CGCA CTG TTTCG AG CGCTCGGCGCTTCGTGGGCGCGCCCCCGCGAACGGCAGCGCGGTGACCCTGAAGTCGGGCTCCCTGAAC ACCCAGGA GGA CACGC TGA GCTCGTCCCCCCCCCCCCG CGCGTTCTTCAA CCAGC TGC CCGACTGG AGC ATGCTGCTGA CCGCGA TCA CCACG GTCTTCGTGGCG CCCGA GAA GCGCTGG ACCATGTTCGACCG CAAG TCG A A GCGCCCC AACA TG CTG ATG GACTCCTTC GGCCTGG AGCG CGTGGTCCAG GACG GCCTGGTGTTC CGCCA GAGCTTCTCGATCCGCTCCTACGAGATCTGCGCGGACCGCACCGCGAGCATCGAGACGGTGATG AA CCACGTCCAG GAGACCTCGCTGAACCAGTGCAAGTCCATCGGCCTGCTGGACGACGGCTTCGGCCGC AG CCCCGAG ATGTGCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTCACCCGCATGAAGATCATGGTGAACCGCTAC CCCACGTG GGGCGACACCATCGAGGTCTCGACGTGGCTGTCCCAGAGCGGCAAGATCGGCATGGGCCGC GA CTG GCTGATCTCGGA CTG CAACA CCGGCG AGA TCCTGG TG CGCGCGACG TCCG TCTACG CGATGA TG AACCAGAAGACCCGCCG CTTCAG CAAG CTG CCCCACG AGGTGCG CCAG GAG TTCGCG CCCCACTTCCTG GACTCGCCCCCCGCGATCGAGGACAACGACGGCAAGCTGCAGAAGTTCGACGTCAAGACGGGCGACTCC ATCCGCAAGGGCCTGACCCCCGGCTGGTACGACCTGGACGTGAACCAGCACGTGAGCAACGTCAAGTAC A TCG G CTG GATCCTGGA GTCGATGCCCA CCGAG GTCCTG GAG ACGCA GGA GCTGTGCTCCCTGACCCTG GA GTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACTCGGTGCTGGAGAGCGTCACCAGCATGGACCCCTCGAAGGTG GGCGACCGCTTCCAGTACCGCCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGCGCGGACATCATGAAGGGCCGCACC GAGTGGCGCCCCAAGAACGCGGGCACGAACGGCGCGATCTCCACCGGCAAGACGTGACTCGAGGCAGCA G C A G C TC G G A TA G TA TC GACA CACTCTG GACG CTG GTCGTGTGATGG ACTGTTGC CGCCACA CTTGCTG C C TTG A C C TG TG A A TA TC C C TG C C G C TTTTA TC A A A C A G C C TC A G TG TG TTTG A TC TTG TG TG TA C G C G C T T T T G C G A G T TG C TA G C TG C TT G T G C T A T T TG C G A A TA C C A C C C C C A G C A T C C C C T TC C C T C G T T TC A T A T C G C TTG C A TC C C A A C C G C A A C TTA TC TA C G C TG TC C TG C TA TC C C TC A G C G C TG C TC C TG C TC C TG C T C A C TG C C C C TC G C A C A G C C TTG G TTTG G G C TC C G C C TG TA TTC TC C TG G TA C TG C A A C C TG TA A A C C AGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTTGAGCTC
SEQ ID N.°:23
Secuencia de aminoácidos de tioesterasa de Cuphea lanceolata con preferencia por C10 (Genbank CAB60830) con péptido de tránsito de desaturasa de ácido graso delta 12 de Prototheca moriformis.
MAIKTNRQPVEKPPFTIGTLRKAIPAHCFERSALRGRAPANGSAVNLKSGSLNTQEDTSSSPPPRAFLN QLPDWSMLLTAITTVFVAAEKQWTMLDRKSKRPDMLVDSVGLKSIVRDGLVSRQSFLIRSYEIGADRTA SIETLMNHLQETSINHCKSLGLLNDGFGRTPGMCKNDLIWVLTKMQIMVNRYPTWGDTVEINTWFSQSG KIGMASDWLISDCNTGEILIRATSVWAMMNQKTRRFSRLPYEVRQELTPHFVDSPHVIEDNDQKLHKFD VKTGDSIRKGLTPRWNDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPIEVLETQELCSLTVEYRRECGMDSVLESVTA VDPSENGGRSQYKHLLRLEDGTDIVKSRTEWRPKNAGTNGAISTSTAKTSNGNSASDDDDKLG
SEQ ID N.°:24
Región de codificación relevante con codones optimizados de tioesterasa de C u ph ea la n c e o la ta con preferencia por C10 con péptido de tránsito de desaturasa de ácido graso delta 12 de P ro to th e ca m orifo rm is .
ACTAGTATGGCTATCAAGACGAACAGGCAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGC AAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCGCTTCGTGGGCGCGCCCCCGCGAACGGCAGCGCG GTGAACCTGAAGTCGGGCTCCCTGAACACCCAGGAGGACACGAGCTCGTCCCCCCCCCCCCGCGCGTTC CTGAACCAGCTGCCCGACTGGAGCATGCTGCTGACCGCGATCACCACCGTCTTCGTGGCGGCGGAGAAG CAGTGGACGATGCTGGACCGCAAGTCGAAGCGCCCCGACATGCTGGTGGACTCCGTCGGCCTGAAGAGC ATCGTGCGCGACGGCCTGGTCTCGCGCCAGTCCTTCCTGATCCGCAGCTACGAGATCGGCGCGGACCGC ACCGCGTCGATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACGTCCATCAACCACTGCAAGAGCCTGGGC CTGCTGAACGACGGCTTCGGCCGCACCCCCGGCATGTGCAAGAACGACCTGATCTGGGTGCTGACCAAG ATGCAGATCATGGTCAACCGCTACCCCACGTGGGGCGACACCGTCGAGATCAACACGTGGTTCTCGCAG TCCGGCAAGATCGGCATGGCGAGCGACTGGCTGATCTCGGACTGCAACACCGGCGAGATCCTGATCCGC GCGACCTCCGTGTGGGCGATGATGAACCAGAAGACGCGCCGCTTCAGCCGCCTGCCCTACGAGGTCCGC CAGGAGCTGACCCCCCACTTCGTGGACTCGCCCCACGTCATCGAGGACAACGACCAGAAGCTGCACAAG TTCGACGTGAAGACCGGCGACTCCATCCGCAAGGGCCTGACGCCCCGCTGGAACGACCTGGACGTCAAC CAGCACGTGTCGAACGTGAAGTACATCGGCTGGATCCTGGAGTCCATGCCCATCGAGGTCCTGGAGACC CAGGAGCTGTGCTCGCTGACCGTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCATGGACTCCGTGCTGGAGTCGGTC ACGGCGGTGGACCCCAGCGAGAACGGCGGCCGCAGCCAGTACAAGCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGC ACCGACATCGTCAAGTCGCGCACCGAGTGGCGCCCCAAGAACGCGGGCACGAACGGCGCGATCTCCACC AGCACCGCGAAGACGTCGAACGGCAACTCCGCGAGCGATGACGATGACAAGCTGGGATGACTCGAG
SEQ ID N.°:25
Secuencia de aminoácidos de tioesterasa de Iris germánica con preferencia por C14 (Genbank AAG43858.1) con péptido de tránsito de cloroplastos de estearoil ACP desaturasa de Chlorella protothecoides.
MATASTFSAFNARCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRAAQAATRVNGSKVGLKTDTNKLEDAPFIPSSA PRTFYNQLPDWSVLLAAITTIFLAAEKQWTLIDWKRGGPDMLSDAFGLPKIIENGLLYRQKFSIRSYEI GADQTASIETLMNHLQETALNHVKCAGLLGNGFGSTPEMSKMNLIWWTKMQVLVEHYPSWGDVIEVDT WAAASGKNGMRRDWHVRDWQTGQTIMRASSNWVMMNQNTRRLSKFPEEVRAEIEPYFMERAPVIDDDNR KLPKLDDDTADHVRNGLTPRWSDLDVNQHVKNVKYIGWILESAPISILESHELASMTLEYRRECGRDSV LQSLTSVSNNCTDGSEELPIECQHLLRNEGGSEIVKGRTEWRPKKCGPFGAGRP
SEQ ID N.°:26
Región de codificación relevante con codones optimizados de tioesterasa de Iris germánica con preferencia por C14 con péptido de tránsito de estearoil ACP desaturasa de Chlorella protothecoides.
ACTAGTATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCG GGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCGCCCAGGCGGCCACCCGC GTGAACGGCAGCAAGGTGGGCCTGAAGACCGACACCAACAAGCTGGAGGACGCGCCCTTCATCCCCTCG TCCGCCCCCCGCACCTTCTACAACCAGCTGCCCGACTGGAGCGTCCTGCTGGCGGCCATCACCACCATC TTCCTGGCGGCCGAGAAGCAGTGGACCCTGATCGACTGGAAGCGCGGCGGCCCCGACATGCTGTCGGAC GCGTTCGGCCTGCCCAAGATCATCGAGAACGGCCTGCTGTACCGCCAGAAGTTCTCCATCCGCAGCTAC GAGATCGGCGCCGACCAGACCGCCTCGATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACCGCGCTGAAC CACGTCAAGTGCGCCGGCCTGCTGGGCAACGGCTTCGGCTCCACCCCCGAGATGAGCAAGATGAACCTG ATCTGGGTGGTCACCAAGATGCAGGTGCTGGTCGAGCACTACCCCTCGTGGGGCGACGTGATCGAGGTG GACACCTGGGCGGCCGCGTCCGGCAAGAACGGCATGCGCCGCGACTGGCACGTCCGCGACTGGCAGACC GGCCAGACCATCATGCGCGCCAGCTCGAACTGGGTGATGATGAACCAGAACACCCGCCGCCTGTCCAAG TTCCCCGAGGAGGTCCGCGCCGAGATCGAGCCCTACTTCATGGAGCGCGCCCCCGTGATCGACGACGAC AACCGCAAGCTGCCCAAGCTGGACGACGACACCGCGGACCACGTGCGCAACGGCCTGACCCCCCGCTGG AGCGACCTGGACGTGAACCAGCACGTCAAGAACGTGAAGTACATCGGCTGGATCCTGGAGTCGGCCCCC ATCTCCATCCTGGAGAGCCACGAGCTGGCCTCGATGACCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGAC TCCGTCCTGCAGAGCCTGACCTCGGTGTCCAACAACTGCACCGACGGCAGCGAGGAGCTGCCCATCGAG TGCCAGCACCTGCTGCGCAACGAGGGCGGCTCGGAGATCGTCAAGGGCCGCACCGAGTGGCGCCCCAAG AAGTGCGGCCCCTTCGGCGCCGGCCGCCCCTGACTCGAG
SEQ ID N.°:27
Secuencia de aminoácidos de tioesterasa de acilo graso de Myristica fragrans (Genbank AAB717291.1) con péptido de tránsito de cloroplasto de desaturasa de ácido graso delta 12 de Prototheca moriformis.
MAIKTNRQPVEKPPFTIGTLRKAIPAHCFERSALRGRAANAHTVPKINGNKAGLLTPMESTKDEDIVAA PTVAPKRTFINQLPDWSMLLAAITTIFLAAEKQWTNLDWKPRRPDMLVDFDPFSLGRFVQDGLIFRQNF SIRSYEIGADRTASIETLMNHLQETALNHVRCIGLLDDGFGSTPEMTRRDLIWWTRMQVLVDRYPSWG DVIEVDSWVTPSGKNGMKREWFLRDCKTGEILTRATSVWVMMNKRTRRLSKIPEEVRVEIEPYFVEHGV LDEDSRKLPKLNDNTANYIRRGLAPRWSDLDVNQHVNNVKYIGWILESVPSSLLESHELYGMTLEYRKE CGKDGLLQSLTAVASDYGGGSLEAGVECDHLLRLEDGSEIMRGKTEWRPKRAANTTYFGSVDDIPPANN A
SEQ ID N.°:28
Región de codificación relevante con codones optimizados de tioesterasa de acilo graso de Mysistica fragrans con péptido de tránsito de cloroplasto de desaturasa de ácido graso delta 12 de Prototheca moriformis.
ACTAGTATGGCTATCAAGACGAACAGGCAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGC AAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCGCTTCGTGGGCGCGCCGCCAACGCCCACACCGTG CCCAAGATCAACGGCAACAAGGCCGGCCTGCTGACCCCCATGGAGAGCACCAAGGACGAGGACATCGTC GCGGCCCCCACCGTGGCGCCCAAGCGCACCTTCATCAACCAGCTGCCCGACTGGTCGATGCTGCTGGCC GCGATCACCACCATCTTCCTGGCGGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGACTGGAAGCCCCGCCGCCCC GACATGCTGGTCGACTTCGACCCCTTCTCCCTGGGCCGCTTCGTGCAGGACGGCCTGATCTTCCGCCAG AACTTCAGCATCCGCTCGTACGAGATCGGCGCGGACCGCACCGCCTCCATCGAGACCCTGATGAACCAC CTGCAGGAGACCGCGCTGAACCACGTCCGCTGCATCGGCCTGCTGGACGACGGCTTCGGCAGCACCCCC GAGATGACCCGCCGCGACCTGATCTGGGTGGTCACCCGCATGCAGGTCCTGGTGGACCGCTACCCCTCG TGGGGCGACGTGATCGAGGTCGACTCCTGGGTGACCCCCAGCGGCAAGAACGGCATGAAGCGCGAGTGG TTCCTGCGCGACTGCAAGACCGGCGAGATCCTGACCCGCGCCACCTCGGTCTGGGTGATGATGAACAAG CGCACCCGCCGCCTGTCCAAGATCCCCGAGGAGGTCCGCGTGGAGATCGAGCCCTACTTCGTCGAGCAC GGCGTGCTGGACGAGGACTCGCGCAAGCTGCCCAAGCTGAACGACAACACCGCCAACTACATCCGCCGC GGCCTGGCGCCCCGCTGGTCCGACCTGGACGTCAACCAGCACGTGAACAACGTCAAGTACATCGGCTGG ATCCTGGAGAGCGTGCCCAGCAGCCTGCTGGAGTCGCACGAGCTGTACGGCATGACCCTGGAGTACCGC AAGGAGTGCGGCAAGGACGGCCTGCTGCAGTCCCTGACCGCCGTCGCCAGCGACTACGGCGGCGGCTCG CTGGAGGCCGGCGTGGAGTGCGACCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGCTCCGAGATCATGCGCGGCAAG ACCGAGTGGCGCCCCAAGCGCGCCGCGAACACCACCTACTTCGGCAGCGTCGACGACATCCCCCCCGCC AACAAC GCGTGACTCGAG
SEQ ID N.°:29
Secuencia de aminoácidos de tioesterasa de Cuphea palustris con preferencia por C14 (Genbank AAC49180) con péptido de tránsito de estearoil ACP desaturasa de Chlorella protothecoides.
MATASTFSAFNARCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRASMLLSAVTTVFGVAEKQWPMLDRKSKRPDML VEPLGVDRIVYDGVSFRQSFSIRSYEIGADRTASIETLMNMFQETSLNHCKIIGLLNDGFGRTPEMCKR DLIWWTKMQIEVNRYPTWGDTIEVNTWVSASGKHGMGRDWLISDCHTGEILIRATSVWAMMNQKTRRL SKIPYEVRQEIEPQFVDSAPVIVDDRKFHKLDLKTGDSICNGLTPRWTDLDVNQHVNNVKYIGWILQSV PTEVFETQELCGLTLEYRRECGRDSVLESVTAMDPSKEGDRSLYQHLLRLEDGADIVKGRTEWRPKNAG AKGAILT GKT SNGN S IS
SEQ ID N.°:30
Región de codificación relevante con codones optimizados de tioesterasa de Cuphea palustris con preferencia por C14 con péptido de tránsito de estearoil ACP desaturasa de Chlorella protothecoides.
ACTAGTATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCG GGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCAGCATGCTGCTGTCGGCG GTGACCACGGTCTTCGGCGTGGCCGAGAAGCAGTGGCCCATGCTGGACCGCAAGTCCAAGCGCCCCGAC ATGCTGGTCGAGCCCCTGGGCGTGGACCGCATCGTCTACGACGGCGTGAGCTTCCGCCAGTCGTTCTCC ATCCGCAGCTACGAGATCGGCGCCGACCGCACCGCCTCGATCGAGACGCTGATGAACATGTTCCAGGAG ACCTCCCTGAACCACTGCAAGATCATCGGCCTGCTGAACGACGGCTTCGGCCGCACGCCCGAGATGTGC AAGCGCGACCTGATCTGGGTCGTGACCAAGATGCAGATCGAGGTGAACCGCTACCCCACGTGGGGCGAC ACCATCGAGGTCAACACGTGGGTGAGCGCCTCGGGCAAGCACGGCATGGGCCGCGACTGGCTGATCTCC GACTGCCACACCGGCGAGATCCTGATCCGCGCGACGAGCGTCTGGGCGATGATGAACCAGAAGACCCGC CGCCTGTCGAAGATCCCCTACGAGGTGCGCCAGGAGATCGAGCCCCAGTTCGTCGACTCCGCCCCCGTG ATCGTGGACGACCGCAAGTTCCACAAGCTGGACCTGAAGACGGGCGACAGCATCTGCAACGGCCTGACC
CCCCGCTGGACGGACCTGGACGTGAACCAGCACGTCAACAACGTGAAGTACATCGGCTGGATCCTGCAG TCGGTCCCCACCGAGGTGTTCGAGACGCAGGAGCTGTGCGGCCTGACCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGC GGCCGCGACTCCGTGCTGGAGAGCGTCACGGCCATGGACCCCTCGAAGGAGGGCGACCGCTCCCTGTAC CAGCACCTGCTGCGCCTGGAGGACGGCGCGGACATCGTGAAGGGCCGCACCGAGTGGCGCCCCAAGAAC GCCGGCGCCAAGGGCGCCATCCTGACGGGCAAGACCAGCAACGGCAACTCGATCTCCTGACTCGAG
SEQ ID N.°:31
Secuencia de aminoácidos de tioesterasa de amplia especificidad de Ulmus americana (Genbank AAB71731) con péptido de tránsito de estearoil ACP desaturasa de Chlorella protothecoides.
MATASTFSAFNARCGDLRRSAGSGPRRPARPLPVRGRAQLPDWSMLLAAITTLFLAAEKQWMMLDWKPK RPDMLVDPFGLGRFVQDGLVFRNNFSIRSYEIGADRTASIETLMNHLQETALNHVKSVGLLEDGLGSTR EMSLRNLIWWTKMQVAVDRYPTWGDEVQVSSWATAIGKNGMRREWIVTDFRTGETLLRATSVWVMMNK LTRRISKIPEEVWHEIGPSFIDAPPLPTVEDDGRKLTRFDESSADFIRKGLTPRWSDLDINQHVNNVKY IGWLLESAPPEIHESHEIASLTLEYRRECGRDSVLNSATKVSDSSQLGKSAVECNHLVRLQNGGEIVKG RTVWRPKRPLYNDGAWDVPAKTS
SEQ ID N.°:32
Región de codificación relevante de tioesterasa de amplia especificidad de Ulmus americana con codones optimizados con péptido de tránsito de estearoil ACP desaturasa de Chlorella protothecoides.
ACTAGTATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCG GGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCCAGCTGCCCGACTGGAGC ATGCTGCTGGCCGCGATCACCACCCTGTTCCTGGCGGCCGAGAAGCAGTGGATGATGCTGGACTGGAAG CCCAAGCGCCCCGACATGCTGGTGGACCCCTTCGGCCTGGGCCGCTTCGTGCAGGACGGCCTGGTGTTC CGCAACAACTTCAGCATCCGCAGCTACGAGATCGGCGCGGACCGCACCGCCAGCATCGAGACCCTGATG AACCACCTGCAGGAGACCGCCCTGAACCACGTGAAGAGCGTGGGCCTGCTGGAGGACGGCCTGGGCAGC ACCCGCGAGATGAGCCTGCGCAACCTGATCTGGGTGGTGACCAAGATGCAGGTGGCGGTGGACCGCTAC CCCACCTGGGGCGACGAGGTGCAGGTGAGCAGCTGGGCGACCGCCATCGGCAAGAACGGCATGCGCCGC GAGTGGATCGTGACCGACTTCCGCACCGGCGAGACCCTGCTGCGCGCCACCAGCGTGTGGGTGATGATG AACAAGCTGACCCGCCGCATCAGCAAGATCCCCGAGGAGGTGTGGCACGAGATCGGCCCCAGCTTCATC GACGCGCCCCCCCTGCCCACCGTGGAGGACGACGGCCGCAAGCTGACCCGCTTCGACGAGAGCAGCGCC GACTTCATCCGCAAGGGCCTGACCCCCCGCTGGAGCGACCTGGACATCAACCAGCACGTGAACAACGTG AAGTACATCGGCTGGCTGCTGGAGAGCGCGCCCCCCGAGATCCACGAGAGCCACGAGATCGCCAGCCTG ACCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACAGCGTGCTGAACAGCGCCACCAAGGTGAGCGACAGC AGCCAGCTGGGCAAGAGCGCCGTGGAGTGCAACCACCTGGTGCGCCTGCAGAACGGCGGCGAGATCGTG AAGGGCCGCACCGTGTGGCGCCCCAAGCGCCCCCTGTACAACGACGGCGCCGTGGTGGACGTGCCCGCC AAGACCAGCTGACTC GAG
SEQ ID N.°:33
Secuencia de ADNc del péptido de tránsito de desaturasa de ácido graso delta 12 de Prototheca moriformis (UTEX 1435) con codones optimizados.
ACTAGTATGGCTATCAAGACGAACAGGCAGCCTGTGGAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGC AAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCGCTTCGTGGGCGCGCC SEQ ID N.°:34
Secuencia de ADNc del péptido de tránsito de estearoil ACP desaturasa de Chlorella protothecoides (UTEX 250) con codones optimizados.
ACTAGTATGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCG GGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCC
SEQ ID N.°:35
Construcción de expresión de recombinación homologa relevante de la región codificante con codones optimizados de tioesterasa de amplia especificidad de Ulmus americana.
GCTCTTCGGCCGCCGCCACTCCTGCTCGAGCGCGCCCGACTCGCGCTCCGCCTGCGCCCGCGCGTGCGC
CGCCAGCGCCTTGGCCTTTTCGCCGCGCTCGTGCGCGTCGCTGATGTCCATCACCAGGTCCATGAGGTC
t g c c t t g c g c c g g c t g a g c c a c t g c t t c g t c c g g g c g g c c a a g a g g a g c a t g a g g g a g g a c t c c t g g t c
CAGGGTCCTGACGTGGTCGCGGCTCTGGGAGCGGGCCAGCATCATCTGGCTCTGCCGCACCGAGGCCGC
CTCCAACTGGTCCTCCAGCAGCCGCAGTCGCCGCCGACCCTGGCAGAGGAAGACAGGTGAGGGGGGTAT
GAATTGTACAGAACAACCfiCGAGCCTTGTCTAGGCAGAATCCCTACCAGTCATGGCTTTACCTGGATGA
CGGCCTGCGAACAGCTGTCCAGCGACCCTCGCTGCCGCCGCTTCTCCCGCACGCTTCTTTCCAGCACCG
TGATGGCGCGAGCCAGCGCCGCACGCTGGCGCTGCGCTTCGCCGATCTGAGGACAGTCGGGGAACTCTG
ATCAGTCTAAACCCCCTTGCGCGTTAGTGTTGCCATCCTTTGCAGACCGGTGAGAGCCGACTTGTTGTG
c g c c a c c c c c c a c a c c a c c t c c t c c c a g a c c a a t t c t g t c a c c t t t t t g g c g a a g g c a t c g g c c t c g g c c t g c a g a g a g g a c a g c a g t g c c c a g c c g c t g g g g g t t g g c g g a t g c a c g c t c a g g t a c c c t t t c t t g c g c t a t g a c a c t t c c a g c a a a a g g t a g g g c g g g c t g c g a g a c g g c t t c c c g g c g c t g c a t g c a a c a c c g a t g a t g c t t c g a c c c c c c g a a g c t c c t t c g g g g c t g c a t g g g c g c t c c g a t g c c g c t c c a g g g c g a g c g c t
GTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTA
g a t c a c t a c c a c t t c t a c a c a g g c c a c t c g a g c t t g t g a t c g c a c t c c g c t a a g g g g g c g c c t c t t c c t
CTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCGCGCCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGG
CTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCC
CAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTA
c t t c c a g t a c a a c c c g a a c g a c a c c g t c t g g g g g a c g c c c t t g t t c t g g g g c c a c g c c a c g t c c g a c g a c c t g a c c a a c t g g g a g g a c c a g c c c a t c g c c a t c g c c c c g a a g c g c a a c g a c t c c g g c g c c t t c t c c g g c t c c a t g g t g g t g g a c t a c a a c a a c a c c t c c g g c t t c t t c a a c g a c a c c a t c g a c c c g c g c c a g c g c t g c g t g g c c a t c t g g a c c t a c a a c a c c c c g g a g t c c g a g g a g c a g t a c a t c t c c t a c a g c c t g g a c g g c g g c t a c a c c t t c a c c g a g t a c c a g a a g a a c g c c g t g c t g g c c g c c a a c t c c a c c c a g t t c c g c g a c c c g a a g g t c t t c t g g t a c g a g c c c t c c c a g a a g t g g a t c a t g a c c g c g g c c a a g t c c c a g g a c t a c a a g a t c g a g a t c t a c t c c t c c g a c g a c c t g a a g t c c t g g a a g c t g g a g t c c g c g t t c g c c a a c g a g g g c t t c c t c g g c t a c c a g t a c g a g t g c c c c g g c c t g a t c g a g g t c c c c a c c g a g c a g g a c c c c a g c a a g t c c t a c t g g g t g a t g t t c a t c t c c a t c a a c c c c g g c g c c c c g g c c g g c g g c t c c t t c a a c c a g t a c t t c g t c g g c a g c t t c a a c g g c a c c c a c t t g g a g g c c t t c g a c a a c c a g t c c c g c g t g g t g g a c t t c g g c a a g g a c t a c t a c g c c c t g c a g a c c t t c t t c a a c a c c g a c c c g a c c t a c g g g a g c g c c c t g g g c a t c g c g t g g g c c t c c a a c t g g g a g t a c t c c g c c t t c g t g c c c a c c a a c c c c t g g c g c t c c t c c a t g t c c c t c g t g c g c a a g t t c t c c c t c a a c a c c g a g t a c c a g g c c a a c c c g g a g a c g g a g c t g a t c a a c c t g a a g g c c g a g c c g a t c c t g a a c a t c a g c a a c g c c g g c c c c t g g a g c c g g t t c g c c a c c a a c a c c a c g t t g a c g a a g g c c a a c a g c t a c a a c g t c g a c c t g t c c a a c a g c a c c g g c a c c c t g g a g t t c g a g c t g g t g t a c g c c g t c a a c a c c a c c c a g a c g a t c t c c a a g t c c g t g t t c g c g g a c c t c t c c c t c t g g t t c a a g g g c c t g g a g g a c c c c g a g g a g t a c c t c c g c a t g g g c t t c g a g g t g t c c g c g t c c t c c t t c t t c c t g g a c c g c g g g a a c a g c a a g g t g a a g t t c g t g a a g g a g a a c c c c t a c t t c a c c a a c c g c a t g a g c g t g a a c a a c c a g c c c t t c a a g a g c g a g a a c g a c c t g t c c t a c t a c a a g g t g t a c g g c t t g c t g g a c c a g a a c a t c c t g g a g c t g t a c t t c a a c g a c g g c g a c g t c g t g t c c a c c a a c a c c t a c t t c a t g a c c a c c g g g a a c g c c c t g g g c t c c g t g a a c a t g a c g a c g g g g g t g g a c a a c c t g t t c t a c a t c g a c a a g t t c c a g g t g c g c g a g g t c a a g t g a c a a t t g g c a g c a g c a g c t c g g a t a g t a t c g a c a c a c t c t g g a c g c t g g t c g t g t g a t g g a c t g t t g c c g c c a c a c t t g c t g c c t t g a c c t g t g a a t a t c c c t g c c g c t t t t a t c a a a c a g c c t c a g t g t g t t t g a t c t t g t g t g t a c g c g c t t t t g c g a g t t g c t a g c t g c t t g t g c t a t t t g c g a a t a c c a c c c c c a g c a t c c c c t t c c c t c g t t t c a t a t c g c t t g c a t c c c a a c c g c a a c t t a t c t a c g c t g t c c t g c t a t c c c t c a g c g c t g c t c c t g c t c c t g c t c a c t g c c c c t c g c a c a g c c t t g g t t t g g g c t c c g c c t g t a t t c t c c t g g t a c t g c a a c c t g t a a a c c a g c a c t g c a a t g c t g a t g c a c g g g a a g t a g t g g g a t g g g a a c a c a a a t g g a g g a t c c c g c g t c t c g a a c a g a g c g c g c a g a g g a a c g c t g a a g g t c t c g c c t c t g t c g c a c c t c a g c g c g g c a t a c a c c a c a a t a a c c a c c t g a c g a a t g c g c t t g g t t c t t c g t c c a t t a g c g a a g c g t c c g g t t c a c a c a c g t g c c a c g t t g g c g a g g t g g c a g g t g a c a a t g a t c g g t g g a g c t g a t g g t c g a a a c g t t c a c a g c c t a g g g a t a t c g a a t t c c t t t c t t g c g c t a t g a c a c t t c c a g c a a a a g g t a g g g c g g g c t g c g a g a c g g c t t c c c g g c g c t g c a t g c a a c a c c g a t g a t g c t t c g a c c c c c c g a a g c t c c t t c g g g g c t g c a t g g g c g c t c c g a t g c c g c t c c a g g g c g a g c g c t g t t t a a a t a g c c a g g c c c c c g a t t g c a a a g a c a t t a t a g c g a g c t a c c a a a g c c a t a t t c a a a c a c c t a g a t c a c t a c c a c t t c t a c a c a g g c c a c t c g a g c t t g t g a t c g c a c t c c g c t a a g g g g g c g c c t c t t c c t c t t c g t t t c a g t c a c a a c c c g c a a a c a c t a g t a t g g c c a c c g c a t c c a c t t t c t c g g c g t t c a a t g c c c g c t g c g g c g a c c t g c g t c g c t c g g c g g g c t c c g g g c c c c g g c g c c c a g c g a g g c c c c t c c c c g t g c g c g g g c g c g c c c a g c t g c c c g a c t g g a g c a t g c t g c t g g c c g c g a t c a c c a c c c t g t t c c t g g c g g c c g a g a a g c a g t g g a t g a t g c t g g a c t g g a a g c c c a a g c g c c c c g a c a t g c t g g t g g a c c c c t t c g g c c t g g g c c g c t t c g t g c a g g a c g g c c t g g t g t t c c g c a a c a a c t t c a g c a t c c g c a g c t a c g a g a t c g g c g c g g a c c g c a c c g c c a g c a t c g a g a c c c t g a t g a a c c a c c t g c a g g a g a c c g c c c t g a a c c a c g t g a a g a g c g t g g g c c t g c t g g a g g a c g g c c t g g g c a g c a c c c g c g a g a t g a g c c t g c g c a a c c t g a t c t g g g t g g t g a c c a a g a t g c a g g t g g c g g t g g a c c g c t a c c c c a c c t g g g g c g a c g a g g t g c a g g t g a g c a g c t g g g c g a c c g c c a t c g g c a a g a a c g g c a t g c g c c g c g a g t g g a t c g t g a c c g a c t t c c g c a c c g g c g a g a c c c t g c t g c g c
GCCACCAGCGTGTGGGTGATGATGAACAAGCTGACCCGCCGCATCAGCAAGATCCCCGAGGAGGTGTGG CACGAGATCGGCCCCAGCTTCATCGACGCGCCCCCCCTGCCCACCGTGGAGGACGACGGCCGCAAGCTG ACCCGCTTCGACGAGAGCAGCGCCGACTTCATCCGCAAGGGCCTGACCCCCCGCTGGAGCGACCTGGAC ATCAACCAGCACGTGAACAACGTGAAGTACATCGGCTGGCTGCTGGAGAGCGCGCCCCCCGAGATCCAC GAGAGCCACGAGATCGCCAGCCTGACCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACAGCGTGCTGAAC AGCGCCACCAAGGTGAGCGACAGCAGCCAGCTGGGCAAGAGCGCCGTGGAGTGCAACCACCTGGTGCGC CTGCAGAACGGCGGCGAGATCGTGAAGGGCCGCACCGTGTGGCGCCCCAAGCGCCCCCTGTACAACGAC GGCGCCGTGGTGGACGTGCCCGCCAAGACCAGCGATGACGATGACAAGCTGGGATGACTCGAGTTAATT AACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGC CGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGAT CTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCC CTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGC TGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACT GCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGC TGTAGAGCTCCTTGTTTTCCAGAAGGAGTTGCTCCTTGAGCCTTTCATTCTCAGCCTCGATAACCTCCA AAGCCGCTCTAATTGTGGAGGGGGTTCGAATTTAAAAGCTTGGAATGTTGGTTCGTGCGTCTGGAACAA GCCCAGACTTGTTGCTCACTGGGAAAAGGACCATCAGCTCCAAAAAACTTGCCGCTCAAACCGCGTACC TCTGCTTTCGCGCAATCTGCCCTGTTGAAATCGCCACCACATTCATATTGTGACGCTTGAGCAGTCTGT AATTGCCTCAGAATGTGGAATCATCTGCCCCCTGTGCGAGCCCATGCCAGGCATGTCGCGGGCGAGGAC AC C C G C CAC T C GTACAG CAGAC CAT TAT G C TAC C T CACAATAGT T CATAACAGT GAC CATAT T T C T C GA AGCTCCCCAACGAGCACCTCCATGCTCTGAGTGGCCACCCCCCGGCCCTGGTGCTTGCGGAGGGCAGGT CAACCGGCATGGGGCTACCGAAATCCCCGACCGGATCCCACCACCCCCGCGATGGGAAGAATCTCTCCC C G G GAT GT G G G C C CAC CAC CAG CACAAC CTGCTGGCC CAG G C GAG C GT CAAAC CATAC CACACAAATAT CCTTGGCATCGGCCCTGAATTCCTTCTGCCGCTCTGCTACCCGGTGCTTCTGTCCGAAGCAGGGGTTGC TAGGGATCGCTCCGAGTCCGCAAACCCTTGTCGCGTGGCGGGGCTTGTTCGAGCTTGTTCGAGCTTGAA GAGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGA AAT T GT TAT C C G C T CACAAT T C CACACAACATAC GAG C C G GAAG CATAAAGT GTAAAG CCTGGGGTGCC TAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCG TGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCC
SEQ ID N.°:36
Construcción de expresión de recombinación homologa relevante de la región codificante con codones optimizados de tioesterasa de Cinnamomum camphora con preferencia por C14.
GAATTCGCCCTCCCGTGATCACACAGGTGCCTTGCGAGCGTGATCACACTATTTTGGGGGTCCTACAGT ACTGAAATGGTGAGAAGTCGTACTGAAATCAAGGATGAACAATGAAAATGGTGCTGTGGTGGCTTCTCA AAGGTCAAGAATCAGTCGCTCGCGTCAGGAAATCGCGGCGTCAACCAGCGTGGGCGCGGTCAGTGGCCC CGCACTGGTCACCATAGCCTCTCCTGCCACAGTAGCGATCCCCTGGGCGTTCACTCTCAGCAGCGGCTG TACTGCCTCCCAGATTTTCTTCTTCTGGACCTGCGGGCGTGAGAGGATGAGCAGGGTGGGCCAAGGGCT CAAT C C T GAAC G G C C C T CAT TCGGTTTC CAAT C C CACAACACATAC C CACAG CAG GT CAGAC CAC G CAT TCCACCATGCGCACCAATAACGTGTCCTTACCTGATTGGGTGTGGCAGGCTCCGTGGACAGGAGTGCCT CGTCCCCCGCCCAGACCCGCTCCCCCGTCACGGCGGCGTCCGGGACCCGCAGCGGCTCCACCGCGGTGT GATCCGCGTTGGCGGCGCAGAGCAGCATCCCAGCCGATTTGACCCCGCGCATGCTCCGAGGCTTGAGGT TGGCCAGCACCACCACCCGCCGGCCGACAAGGTCCTCCAGGGTCACGTGCCGGACCAGGCCACTCACGA TGGTGCGAGGGCCCCCCTCCTCGCCGAGGTCGATCTGCTCGACGTACAGACTGCGACATGCGTGGCGAG TGGTCATCAGAAGGAAGCAGGTGTGCAGAAGGGGCACGTGGTTGGTATTGAGAGTAGCCAAAGCTTTGT GCCAATCAGAAAGTCAACGCAGCTGCCTGCCTGGCTCGCGTACAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTT CCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGAC CCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGC CAGGCCCCC GAT T G CAAAGACAT TATAG C GAG C TAC CAAAG CATAT T CAAACAC C TAGAT CAC TAC CAC TTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCCTTCGTTTCAGTC ACAACCCGCAAACGGCGCGCCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAG ATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGG ATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAAC CCGAACGACACCGTCTGGGGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGG GAGGACCAGCCCATCGCCATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTG GACTACAACAACACCTCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGG ACCTACAACACCCCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCTTCACC GAGTACCAGAAGAACCCCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTAC GAGCCCTCCCAGAAGTGGATCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCC
GACGACCTGAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAG TGCCCCGGCCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCC ATCAACCCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCAC TTCGAGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTC TTCAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCC TTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTAC CAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGC CCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACCTGTCCAAC AGCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGTCCGTG TTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAG GTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTAC T T CAC CAAC C G CAT GAG C GT GAACAAC CAG C C C T T CAAGAG C GAGAAC GAC CTGTCCTAC TACAAG GT G TACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACC TACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTAC ATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGATTAATTAACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTAT CGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATA TCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTA GCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAA CCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCAC AGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGAT GCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTTGAGCTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCC AGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCC CCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCA G G C C C C C GAT T G CAAAGACAT TATAG C GAG C TAC CAAAG C CATAT T CAAACAC C TAGAT CAC TAC CAC T TCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTC ACAACCCGCAAACACTAGTATGACGTTCGGGGTCGCCCTCCCGGCCATGGGCCGCGGTGTCTCCCTTCC CCGGCCCAGGGTCGCGGTGCGCGCCCAGTCGGCGAGTCAGGTTTTGGAGAGCGGGCGCGCCCCCGACTG GTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATCTTCTCCGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTG GAAGCCCAAGCCCAACCCCCCCCAGCTGCTGGACGACCACTTCGGCCCCCACGGCCTGGTGTTCCGCCG CACCTTCGCCATCCGCAGCTACGAGGTGGGCCCCGACCGCTCCACCAGCATCGTGGCCGTGATGAACCA CCTGCAGGAGGCCGCCCTGAACCACGCCAAGTCCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCT GGAGATGTCCAAGCGCGACCTGATCTGGGTGGTGAAGCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCGC CTGGGGCGACACCGTGGAGGTGGAGTGCTGGGTGGGCGCCTCCGGCAACAACGGCCGCCGCCACGACTT CCTGGTGCGCGACTGCAAGACCGGCGAGATCCTGACCCGCTGCACCTCCCTGAGCGTGATGATGAACAC CCGCACCCGCCGCCTGAGCAAGATCCCCGAGGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAA CGTGGCCGT GAAG GAC GAG GAGAT CAAGAAG C C C CAGAAG C T GAAC GAC TCCACCGCC GAC TACAT C CA GGGCGGCCTGACCCCCCGCTGGAACGACCTGGACATCAACCAGCACGTGAACAACATCAAGTACGTGGA CTGGATCCTGGAGACCGTGCCCGACAGCATCTTCGAGAGCCACCACATCTCCTCCTTCACCATCGAGTA CCGCCGCGAGTGCACCATGGACAGCGTGCTGCAGTCCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCTCCTCCGAGGC CGGCCTGGTGTGCGAGCACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCAAGACCGAGTG GCGCCCCAAGCTGACCGACTCCTTCCGCGGCATCAGCGTGATCCCCGCCGAGTCCAGCGTGATGGACTA CAAG GAC CAC GAC G G C GAC TACAAG GAC CAC GACAT C GAC TACAAG GAC GAC GAC GACAAGT GAC T C GA GGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACA CTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGT GTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTC GTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTG CTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTG TAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTGGTACCC GTACCCATCAGCATCCGGGTGAATCTTGGCCTCCAAGATATGGCCAATCCTCACATCCAGCTTGGCAAA ATCGACTAGACTGTCTGCAAGTGGGAATGTGGAGCACAAGGTTGCTTGTAGCGATCGACAGACTGGTGG GGTACATTGACAGGTGGGCAGCGCCGCATCCATCGTGCCTGACGCGAGCGCCGCCGGTTGCTCGCCCGT GCCTGCCGTCAAAGAGCGGCAGAGAAATCGGGAACCGAAAACGTCACATTGCCTGATGTTGTTACATGC TGGACTAGACTTTCTTGGCGTGGGTCTGCTCCTCGCCAGGTGCGCGACGCCTCGGGGCTGGGTGCGAGG GAGCCGTGCGGCCACGCATTTGACAAGACCCAAAGCTCGCATCTCAGACGGTCAACCGTTCGTATTATA CAT T CAACATAT G GTACATAC G CAAAAAG CAT G C CAAC GAT GACATAG G C GAAT T C
SEQ ID N.°:37
Construcción de expresión relevante para la región codificante con codones optimizados de tioesterasa de Cuphea hookeriana con preferencia por C10 con péptido de tránsito de estearoil ACP desaturasa de Chlorella protothecoides.
GGTACCCGCCTGCAACGCAAGGGCAGCCACAGCCGCTCCCACCCGCCGCTGAACCGACACGTGCTTGGG CGCCTGCCGCCTGCCTGCCGCATGCTTGTGCTGGTGAGGCTGGGCAGTGCTGCCATGCTGATTGAGGCT TGGTTCATCGGGTGGAAGCTTATGTGTGTGCTGGGCTTGCATGCCGGGCAATGCGCATGGTGGCAAGAG GGCGGCAGCACTTGCTGGAGCTGCCGCGGTGCCTCCAGGTGGTTCAATCGCGGCAGCCAGAGGGATTTC AGATGATCGCGCGTACAGGTTGAGCAGCAGTGTCAGCAAAGGTAGCAGTTTGCCAGAATGATCGGTTCA GCTGTTAATCAATGCCAGCAAGAGAAGGGGTCAAGTGCAAACACGGGCATGCCACAGCACGGGCACCGG GGAGTGGAATGGCACCACCAAGTGTGTGCGAGCCAGCATCGCCGCCTGGCTGTTTCAGCTACAACGGCA GGAGTCATCCAACGTAACCATGAGCTGATCAACACTGCAATCATCGGGCGGGCGTGATGCAAGCATGCC TGGCGAAGACACATGGTGTGCGGATGCTGCCGGCTGCTGCCTGCTGCGCACGCCGTTGAGTTGGCAGCA GGCTCAGCCATGCACTGGATGGCAGCTGGGCTGCCACTGCAATGTGGTGGATAGGATGCAAGTGGAGCG AATACCAAACCCTCTGGCTGCTTGCTGGGTTGCATGGCATCGCACCATCAGCAGGAGCGCATGCGAAGG GACTGGCCCCATGCACGCCATGCCAAACCGGAGCGCACCGAGTGTCCACACTGTCACCAGGCCCGCAAG CTTTGCAGAACCATGCTCATGGACGCATGTAGCGCTGACGTCCCTTGACGGCGCTCCTCTCGGGTGTGG GAAACGCAATGCAGCACAGGCAGCAGAGGCGGCGGCAGCAGAGCGGCGGCAGCAGCGGCGGGGGCCACC CTTCTTGCGGGGTCGCGCCCCAGCCAGCGGTGATGCGCTGATCCCAAACGAGTTCACATTCATTTGCAT GCCTGGAGAAGCGAGGCTGGGGCCTTTGGGCTGGTGCAGCCCGCAATGGAATGCGGGACCGCCAGGCTA GCAGCAAAGGCGCCTCCCCTACTCCGCATCGATGTTCCATAGTGCATTGGACTGCATTTGGGTGGGGCG GCCGGCTGTTTCTTTCGTGTTGCAAAACGCGCCAGCTCAGCAACCTGTCCCGTGGGTCCCCCGTGCCGA TGAAATCGTGTGCACGCCGATCAGCTGATTGCCCGGCTCGCGAAGTAGGCGCCCTCCTTTCTGCTCGCC CTCTCTCCGTCCCGCCTCTAGAATATCAATGATCGAGCAGGACGGCCTCCACGCCGGCTCCCCCGCCGC CTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCGGCTGCTCCGACGCCGCCGTGTT CCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGACCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCT GCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGGCGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGT GGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCGAGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCA CCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCGACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGC CACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCGCATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCT GGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGCACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAA GGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGT GGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCTTCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACAT CGCCCTGGCCACCCGCGACATCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTA CGGCATCGCCGCCCCCGACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGACAATT GGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACA CTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGT GTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCT CGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCT GCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCT GTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGGATCCCGCGT CTCGAACAGAGCGCGCAGAGGAACGCTGAAGGTCTCGCCTCTGTCGCACCTCAGCGCGGCATACACCAC AATAACCACCTGACGAATGCGCTTGGTTCTTCGTCCATTAGCGAAGCGTCCGGTTCACACACGTGCCAC GTTGGCGAGGTGGCAGGTGACAATGATCGGTGGAGCTGATGGTCGAAACGTTCACAGCCTAGGGATATC GAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGC TGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCG CTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGC CAT AT T CAAACAC C TAGAT CACTAC CACT T C TACACAG G C CAC T C GAGC T T GT GAT C G CAC T C C G C TAA GGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACACTAGTATGGCCACCGCATCCACTTTC TCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGG CCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCCAGCTGCCCGACTGGAGCCGCCTGCTGACCGCCATCACCACCGTG TTCGTGAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCACGACCGCAAGTCCAAGCGCCCCGACATGCTGGTGGACAGC TTCGGCCTGGAGTCCACCGTGCAGGACGGCCTGGTGTTCCGCCAGTCCTTCTCCATCCGCTCCTACGAG ATCGGCACCGACCGCACCGCCAGCATCGAGACCCTGATGAACCACCTGCAGGAGACCTCCCTGAACCAC TGCAAGAGCACCGGCATCCTGCTGGACGGCTTCGGCCGCACCCTGGAGATGTGCAAGCGCGACCTGATC TGGGTGGTGATCAAGATGCAGATCAAGGTGAACCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGGAGATCAAC ACCCGCTTCAGCCGCCTGGGCAAGATCGGCATGGGCCGCGACTGGCTGATCTCCGACTGCAACACCGGC GAGATCCTGGTGCGCGCCACCAGCGCCTACGCCATGATGAACCAGAAGACCCGCCGCCTGTCCAAGCTG CCCTACGAGGTGCACCAGGAGATCGTGCCCCTGTTCGTGGACAGCCCCGTGATCGAGGACTCCGACCTG AAGGTGCACAAGTTCAAGGTGAAGACCGGCGACAGCATCCAGAAGGGCCTGACCCCCGGCTGGAACGAC CTGGACGTGAACCAGCACGTGTCCAACGTGAAGTACATCGGCTGGATCCTGGAGAGCATGCCCACCGAG GTGCTGGAGACCCAGGAGCTGTGCTCCCTGGCCCTGGAGTACCGCCGCGAGTGCGGCCGCGACTCCGTG CTGGAGAGCGTGACCGCCATGGACCCCAGCAAGGTGGGCGTGCGCTCCCAGTACCAGCACCTGCTGCGC CTGGAGGACGGCACCGCCATCGTGAACGGCGCCACCGAGTGGCGCCCCAAGAACGCCGGCGCCAACGGC GCCATCTCCACCGGCAAGACCAGCAACGGCAACTCCGTGTCCATGGACTACAAGGACCACGACGGCGAC
T AC AAG GAC C AC GAC AT C GAC T AC AAG GAC GAC GAC GAC AAGT GAC T C GAG G C AG C AG C AG C T C G GATA GTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTG AATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTT GCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCAT CCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCT CGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATG CTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTTGAGCTC
SEQ ID N.°:38
Construcción de expresión relevante para la región codificante con codones optimizados de tioesterasa de Umbelullaria californica con preferencia por C12 con péptido de tránsito de estearoil ACP desaturasa de Chlorella protothecoides.
GGTACCCGCCTGCAACGCAAGGGCAGCCACAGCCGCTCCCACCCGCCGCTGAACCGACACGTGCTTGGG CGCCTGCCGCCTGCCTGCCGCATGCTTGTGCTGGTGAGGCTGGGCAGTGCTGCCATGCTGATTGAGGCT TGGTTCATCGGGTGGAAGCTTATGTGTGTGCTGGGCTTGCATGCCGGGCAATGCGCATGGTGGCAAGAG GGCGGCAGCACTTGCTGGAGCTGCCGCGGTGCCTCCAGGTGGTTCAATCGCGGCAGCCAGAGGGATTTC AGATGATCGCGCGTACAGGTTGAGCAGCAGTGTCAGCAAAGGTAGCAGTTTGCCAGAATGATCGGTTCA G C T GT T AAT C AAT G C C AG C AAGAGAAG G G GT C AAGT G C AAAC AC G G G C AT G C C AC AG C AC G G G C AC C G G GGAGTGGAATGGCACCACCAAGTGTGTGCGAGCCAGCATCGCCGCCTGGCTGTTTCAGCTACAACGGCA GGAGTCATCCAACGTAACCATGAGCTGATCAACACTGCAATCATCGGGCGGGCGTGATGCAAGCATGCC TGGCGAAGACACATGGTGTGCGGATGCTGCCGGCTGCTGCCTGCTGCGCACGCCGTTGAGTTGGCAGCA GGCTCAGCCATGCACTGGATGGCAGCTGGGCTGCCACTGCAATGTGGTGGATAGGATGCAAGTGGAGCG AATACCAAACCCTCTGGCTGCTTGCTGGGTTGCATGGCATCGCACCATCAGCAGGAGCGCATGCGAAGG GACTGGCCCCATGCACGCCATGCCAAACCGGAGCGCACCGAGTGTCCACACTGTCACCAGGCCCGCAAG CTTTGCAGAACCATGCTCATGGACGCATGTAGCGCTGACGTCCCTTGACGGCGCTCCTCTCGGGTGTGG GAAACGCAATGCAGCACAGGCAGCAGAGGCGGCGGCAGCAGAGCGGCGGCAGCAGCGGCGGGGGCCACC CTTCTTGCGGGGTCGCGCCCCAGCCAGCGGTGATGCGCTGATCCCAAACGAGTTCACATTCATTTGCAT GCCTGGAGAAGCGAGGCTGGGGCCTTTGGGCTGGTGCAGCCCGCAATGGAATGCGGGACCGCCAGGCTA GCAGCAAAGGCGCCTCCCCTACTCCGCATCGATGTTCCATAGTGCATTGGACTGCATTTGGGTGGGGCG GCCGGCTGTTTCTTTCGTGTTGCAAAACGCGCCAGCTCAGCAACCTGTCCCGTGGGTCCCCCGTGCCGA TGAAATCGTGTGCACGCCGATCAGCTGATTGCCCGGCTCGCGAAGTAGGCGCCCTCCTTTCTGCTCGCC CTCTCTCCGTCCCGCCTCTAGAATATCAATGATCGAGCAGGACGGCCTCCACGCCGGCTCCCCCGCCGC CTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCGGCTGCTCCGACGCCGCCGTGTT CCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGACCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCT GCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGGCGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGT GGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCGAGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCA CCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCGACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGC CACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCGCATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCT GGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGCACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAA GGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGT GGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCTTCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACAT CGCCCTGGCCACCCGCGACATCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTA CGGCATCGCCGCCCCCGACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTGGACGAGTTCTTCTGACAATT GGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACA CTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGT GTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCT CGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCT GCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCT GT AAAC C AG C AC T G C AAT G C T GAT G C AC G G GAAGT AGT G G GAT G G GAAC AC AAAT G GAG GAT C C C G C GT CTCGAACAGAGCGCGCAGAGGAACGCTGAAGGTCTCGCCTCTGTCGCACCTCAGCGCGGCATACACCAC AATAACCACCTGACGAATGCGCTTGGTTCTTCGTCCATTAGCGAAGCGTCCGGTTCACACACGTGCCAC GTTGGCGAGGTGGCAGGTGACAATGATCGGTGGAGCTGATGGTCGAAACGTTCACAGCCTAGGGATATC GAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGC TGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCG CTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGC C AT AT T C AAAC AC C T AGAT C AC TAC C AC T T C T AC AC AG G C C AC T C GAG C T T GT GAT C G C AC T C C G C T AA GGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACACTAGTATGGCCACCGCATCCACTTTC TCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCGGGCCCCGGCGCCCAGCGAGG CCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCGTGATCACCACCATCTTCAGC GCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAAGCTGCCCCAGCTGCTGGACGAC
C A C T T C G G C C T G C A C G G C C TG G TG TT C C G C C G C A C C T T C G C C A T C C G C TC C T A C G A G G TG G G C C C C G A C CGCA G CA CC TCCA TCCTG G CCG TG A TG A A CCA CA TG CA G G A G G CCA CCCTG A A CCA CG CCA A G A G CG TG GG C A TC C TG G G C G A C G G C TTC G G C A C C A C C C TG G A G A TG TC C A A G C G C G A C C TG A TG TG G G TG G TG C G C C G C A C C C A CG TG GCCGTGG AGCG CTA CCCCACCTGGG GCG ACACCG TG GAG GTGGAG TG CTG GATCGG C G C C A G C G G C A A C AACG GCATGCG CCGCGA CTTCCTGGTGCG CGACTGCA AGA CCGGC GAG ATC CTG ACC CG CTG CA C C TC C C TG A G C G TG C TG A TG A A C A C C C G C A C C C G C C G C C TG A G C A C C A TC C C C G A C G A G G TG CGCGGCGA GATCGG CCCCGCCTTCATCGACA ACGTGG CCGTGAA GGA CGACG AGA TCA AGA AGCTGCA G AA G C TG A A C G A C TC C A C C G C C G A C TA C A TC C A G G G C G G C C TG A C C C C C C G C TG G A A C G A C C TG G A C G TG A A C C A G C A C G TG A A C A A C C TG A A G TA C G TG G C C TG G G TG TTC G A G A C C G TG C C C G A C A G C A TC TTC G A G TC C C A C C A C A TC A G C TC C TTC A C C C TG G A G TA C C G C C G C G A G TG C A C C C G C G A C TC C G TG C TG C G C A G C CTGACCA CCG TG A G CG G C G G CA G CTCCG A G G CCG G CCTG G TG TG CG A CCA CCTG CTG CA G CTG G A G G G C G G C A G C G A G G TG CTG CG CG CCC G CA CCG A G TG G CG CCCCA A G CTG A C CG A CTCCTTCCG CG G CA TCA G C GT GAT C C C C G C C GAG CC C C G C G T GAT G GAC TACAAG GAC CAC GAC G G C GAC TACAAG GAC CAC GACAT C GAC TACAA G GAC GAC GAC GACAAGT GAC T C GAG G CAG CAG CAG C T C G GATAGTAT C GACACAC T C T G GA C G C T G G T C G T G T G A T G G A C TG TT G C C G C C A C A C T T G C T G C C T TG A C C T G T G A A TA TC C C T G C C G C TT T T A T C A A A C A G C C TC A G T G T G T T T G A T C T T G T G T G T A C G C G C T T T T G C G A G T T G C T A G C T G C T T G T G C T A T T TG C G A A TA C C A C C C C C A G C A T C C C C T T C C C T C G T T T C A T A T C G C T T G C A T C C C A A C C G C A A C T T A T C T A C G C T G T C C T G C T A T C C C T C A G C G C T G C T C C T G C T C C T G C T C A C T G C C C C T C G C A C A G C C T T G G T T T G G G C T C C G C C TG TA TTC TC C TG G TA C TG C A A C C TG TA A A C C A G C A C TG C A A TG C TG A TG C A C G G G A A G TA G TGGG ATGGGAACACAAATGGAAAGCTTGAGCTC
SEQ ID N.°:39
Construcción de expresión relevante para la región codificante con codones optimizados de tioesterasa de amplia especificidad de Ulmus americana con péptido de tránsito de estearoil ACP desaturasa de Chlorella protothecoides.
GGTACCCGCCTGCAACGCAAGGGCAGCCACAGCCGCTCCCACCCGCCGCTGAACCGACACGTGCTTGGG CGCCTGCCGCCTGCCTGCCGCA TG CTTGTGCTGG TG AGG CTG GGCA GTG CTG CCATGCTGA TTGAG GCT TGGTTCATCGGGTGGAAGCTTATGTGTGTGCTGGGCTTGCATGCCGGGCAATGCGCATGGTGGCAAGAG GG CGGCAGCACTTGCTGGAGCTGCCGCGGTGCCTCCAGGTGGTTCAATCGCGGCAGCCAGAGGGATTTC AG ATGATCGCGCGTACAGGTTGAGCAGCAGTGTCAGCAAAGGTAGCAGTTTGCCAGAATGATCGGTTCA G C T GT TAAT CAAT G C CAG CAAGAGAAG G G GT CAAGT G CAAACAC G G G CAT G C CACAG CAC G G G CAC C G G GGAGTGGAATGGCACCACCAAGTGTGTGCGAGCCAGCATCGCCGCCTGGCTGTTTCAGCTACAACGGCA GGAGTCATCCAACGTAACCATGAGCTGATCAACACTGCAATCATCGGGCGGGCGTGATGCAAGCATGCC TGGCG AAGACACATGGTGTGCGGATGCTGCCGGCTGCTGCCTGCTGCGCACGCCGTTGAGTTGGCAGCA GGCTCAGCCATGCACTGGATGGCAGCTGGGCTGCCACTGCAATGTGGTGGATAGGATGCAAGTGGAGCG AATACCAAACCCTCTGGCTGCTTGCTGGGTTGCATGGCATCGCACCATCAGCAGGAGCGCATGCGAAGG GACTGGCCCCATGCACGCCATGCCAAACCGGAGCGCACCGAGTGTCCACACTGTCACCAGGCCCGCAAG CTTTGCA GAA CCATGCTCATGGA CGCATGTAG CGCTGACG TCCCTTGACG GCGCTCCTCTC GGG TGTGG GAAACGCAATGCAGCACAGGCAGCAGAGGCGGCGGCAGCAGAGCGGCGGCAGCAGCGGCGGGGGCCACC CTTCTTGCGG GGTCGCG CCCCAGC CAGCG GTGATGCG CTG ATC CCAAA CGAG TTCACA TTCATTTGC AT GCCTGGAGAAGCGAGGCTGGGGCCTTTGGGCTGGTGCAGCCCGCAATGGAATGCGGGACCGCCAGGCTA GCA GCAA AGG CGCCTCCCCTACTCCGCATCGATGTTCCATAGTGCATTGGACTGCATTTGGGTGGGGCG G C C G G C TGTTTCTTTCGTGTTG CAAA ACG CGCCAG CTCA GCAA CCTG TCCC GTG GGTCCCCCG TG CCGA TGAAATCGTGTGCACG CCGATCAG CTG ATTG CCCGGCTCGCG AAG TA GGCG CCCTC CTTTC TGC TCG CC CTCTCTCCGTCCCG CCTCTAG AATATCAA TGA TCG AGCA GGA CGGCCTCCA CGCCGG CTCCCCCGCCGC CTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCGGCTGCTCCGACGCCGCCGTGTT CCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGACCTGTCCGGCGCCCTGAACGAGCT GCA GGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGGCGTGCCCTGCGCCGCCGTGCTGGACGT GG TGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCGAGGTGCCCGGCCAGGACCTGCTGTCCTCCCA CCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCGACGCCATGCGCCGCCTGCACACCCTGGACCCCGC CACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCGCATCGAGCGCGCCCGCACCCGCATGGAGGCCGGCCT GGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGCACCAGGGCCTGGCCCCCGCCGAGCTGTTCGCCCGCCTGAA GGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTGACCCACGGCGACGCCTGCCTGCCCAACATCATGGT GG AGA ACGGCCGCTTCTCCGGCTTCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTGGCCGACCGCTACCAGGACAT CGCCCTGGCCACCCGCGACATCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCCGACCGCTTCCTGGTGCTGTA C G G C A TCGCCGC CCCCGACTCCCA GCGCA TCG CCTTCTACCGCCTGCTGG ACGA GTTCTTCTG ACAA TT GGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACA CTTG C TG C C TTG A C C TG TG A A TA TC C C TG C C G C TTTTA TC A A A C A G C C TC A G TG TG TTTG A TC TTG TG T G TA C G C G C TTTTG C G A G TTG C TA G C TG C TTG TG C TA TTTG C G A A TA C C A C C C C C A G C A TC C C C TTC C C T C G TTTC A TA TC G C TTG C A TC C C A A C C G C A A C TTA TC TA C G C TG TC C TG C TA TC C C TC A G C G C TG C TC C T
G C T C C T G C T C A C T G C C C C T C G C A C A G C C T T G G T T T G G G C T C C G C C T G T A T T C T C C T G G T A C T G C A A C C T GTAAACCAG CACTGCAA TG CTG ATGCACG GGA AGTAG TG GGA TG GGAA CACA AATGGA GGA TCC CGCGT CTCGAA C A G A G C G C G C A G A G G A A C G C TG A A G G TC TC G C C TC TG TC G C A C C TC A G C G C G G C A TA C A C C A C A A T A A C C A C C T G A C G A A TG C G C T TG G T TC T T C G T C C A T TA G C G A A G C G TC C G G T TC A C A C A C G TG C C A C G TTG G CG A G G TG G CA G G TG A CA A TG A TCG G TG G A G CTG A TG G TCG A A A CG TTCA CA G CCTA G G G A TA TC G A A TTC C TTTC TTG C G C TA TG A C A C TTC C A G C A A A A G G TA G G G C G G G C TG C G A G A C G G C TTC C C G G C G C T G C A T G C A A C A C C G A TG A TG C TTC G A C C C C C C G A A G C TC C TTC G G G G C TG C A TG G G C G C TC C G A TG C C G C TC C A G G G C G A G C G C TG TTTA A A TA G C C A G G C C C C C G A TTG C A A A G A C A TTA TA G C G A G C TA C C A A A G C C A TA T T CAAACAC C TAGAT CAC TA C CAC T T C TACACAG G C CAC T C GAG C T T GT GAT C G CAC T C C G C TAA G G G G G C G C C T C TT C C T C TT C G T T TC A G T C A C A A C C C G C A A A C A C TA G T A TG G C C A C C G C A T C C A C T T TC TCG G CG TTC A A TG C C C G C TG C G G C G A C C TG C G TC G C TC G G C G G G C TC C G G G C C C C G G C G C C C A G C G A G G C C C C TC C C C G TG C G C G G G C G C G C C C A G C TG C C C G A C TG G A G C A TG C TG C TG G C C G C G A TC A C C A C C C TG TTCCTG G CG G CCG A G A A G CA G TG G A TG A TG CTG G A CTG G A A G CCCA A G CG CCCC G A CA TG CTG G TG G A C C C C TTC G G C C T G G G C C G C T T C G T G C A G G A C G G C C T G G T G T TC C G C A A C A A C T T C A G C A TC C G C A G C T A C G A GATCGG CGCGG ACCGCA CCGCCA GCATCGA GACCCTGA TG AACCA CCTGCAG GAG ACCGCCCTGA AC C A C G TG A A G A G C G TG GGCCTGCTGG AGG ACGG CCTG GGCA GCACC CGCGA GATGA GCCTGCGCA ACCTG A TCTG G G TG G TG A CCA A G A TG CA G G TG G CG G TG G A CCG CTA CCCCA CCTG G G G CG A CG A G G TG CA G G TG A G C A G C TG G G CG A CCG CCA TCG G CA A G A A CG G CA TG CG CCG CG A G TG G A TCG TG A CCG A CTTCCG CA CC GG CGAG A CCCTG CTG CG C G CCA CCA G CG TG TG G G TG A TG A TG A A CA A G CTG A CC CG CCG CA TCA G CA A G A T C C C C G A G G A G G TG TG G C A C G A G A TC G G C C C C A G C TTC A TC G A C G C G C C C C C C C TG C C C A C C G TG G A G G A C G A C G G C CG C A A G C TG A CCCG CTTCG A CG A G A G CA G CG CCG A CTTCA TCCG CA A G G G CCTG A CCCCC C G C TG G A G C G A CCTGGA CATCAACC AGCA CGTGAA CAACG TG AAG TAC ATC GGCTGG CTG CTG GAGA GC GCG CCCCCCG A G A TCCA CG A G A G CCA CG A G A TCG CCA G CCTG A CCCTG G A G TA CCG CCG CG A G TG CG G C CGCG ACAG CGTGCTGAA CAGCG CCACCA AGG TG AGCG ACAG CAGCCA GCTGGG CAAG AGCG CCGTGGA G TGCAA CCACCTG G TG CG CCTG CA G A A CG G CG G CG A G A TCG TG A A G G G C CG CA CCG TG TG G CG CCCC A A G CGCCCCCTG TA CA A CG A CG G CG CCG TG G TG G A CG TG CCCG CCA A G A C CA G CG A TG A CG A TG A CA A G CTG G G A TG A C TC G A G G C A G C A G C A G C TC G G A TA G TA TC G A C A C A C TC TG G A C G C TG G TC G TG TG A TG G A C TG T TG C C G C C A C A C T T G C T G C C T T G A C C T G T G A A T A T C C C T G C C G C T T T T A T C A A A C A G C C T C A G T G T G T T T G A T C T TG TG T G T A C G C G C T T T T G C G A G T T G C T A G C T G C T T G T G C T A T T T G C G A A T A C C A C C C C C A G C A T C C C C T T C C C T C G T T T C A T A T C G C T T G C A T C C C A A C C G C A A C T T A T C T A C G C T G T C C T G C T A T C C C T C A G C G C T G C T C C T G C T C C T G C T C A C T G C C C C T C G C A C A G C C T T G G T T T G G G C T C C G C C T G T A T T C T C C T G G TACTGCAA CCTG TA A A CCA G CA CTG CA A TG CTG A TG CA CG G G A A G TA G TG G G A TG G G A A CA CA A A TG G A A A G C T TG A G C T C
SEQ ID N.°:40
Secuencia de ADN del sitio donador 5' de la construcción de recombinación homologa de direccionamiento de FAD delta 12 inactivada de Prototheca moriformis
G C T C T TC G G G T T TG C TC A C C C G C G A G G T C G A C G C C C A G C A T G G C TA TC A A G A C G A A C A G G C A G C C T G T G G A G A A G C C T C C G T TC A C G A T C G G G A C G C TG C G C A A G G C C A T C C C C G C G C A C TG TT T C G A G C G C T C G G C G C T T C G T A G C A G C A T G T A C C T G G C C T T T G A C A T C G C G G T C A T G T C C C T G C T C T A C G T C G C G T C G A C G T A C A T C G A C C C T G C G C C G G T G C C T A C G T G G G T C A A G T A T G G C G T C A T G T G G C C G C T C T A C T G G T T C T T C C A G G T G T G T G T G A G G G T T G T G G T T G C C C G T A T C G A G G T C C T G G T G G C G C G C A TG G G G G A G A A G G C G C C T G T C C C G C T G A C C C C C C C G G C T A C C C T C C C G G C A C C T T C C A G G G C G C C T T C G G C A C G G G T G T C T G G G T G T G C G C G C A C G A G TG C G G C C A C C A G G C C T TT T C C TC C A G C C A G G C C A T C A A C G A C G G C G TG G G C C T G G TG TT C C A C A G C C T G C T G C T G G T G C C C T A C T A C T C C T G G A A G C A C T C G C A C C G C C G C C A C C A C T C C A A C A C G G G G T G CCTG G A CA A G G A C G A G G TG TTTG TG C C G C C G C A C C G C G C A G TG G C G C A C G A G G G C C TG G A G TG G G A G G A G TG G C T G C C C A T C C G C A T G G G C A A G G T G C T G G T C A C C C T G A C C C T G G G C T G G C C G C T G T A C C T C A T G T T C A A C G T C G C C T C G C G G C C G T A C C C G C G C T T C G C C A A C C A C T T T G A C C C G T G G T C G C C C A T C T T C A G C A A G C G C G A G G TA C C C T T TC T T G C G C T A T G A C A C T TC C A G C A A A A G G T A G G G C G G G C T G C G A G A C G G C T TC C C G G C G C T G C A T G C A A C A C C G A T G A TG C TT C G A C C C C C C G A A G C T C C TT C G G G G C TG C A TG G G C G C TC C G A TG C C G C T C C A G G G C G A G C G C TG T T TA A A T A G C C A G G C C C C C G A TT G C A A A G A C A T TA TA G C G A G C T A C CAAAG C C A TA T T CAAACAC C TAGA T CAC TA C CAC T T C TA C A C A G G C CAC T C GAG C T T GT GAT C G CAC T C C G C T A A G G G G G C G C C T C T T C C T C T T C G T T T C A G T C A C A A C C C G C A A A C G G C G C G C C
SEQ ID N.°:41
Secuencia de ADN del sitio donador 3' de la construcción de recombinación homologa de direccionamiento de FAD delta 12 inactivada de P ro to th e ca m o rifo rm is
CAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCG CCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCT TGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCT TCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTG CTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGC AAC C T GTAAAC CAG CAC T G CAAT G C T GAT G CAC G G GAAGTAGT G G GAT G G GAACACAAAT G GAG CAT C G AGGTGGTCATCTCCGACCTCGCGTTGGTGGCGGTGCTCAGCGGGCTCAGCGTGCTGGGCCGCACCATGG GCTGGGCCTGGCTGGTCAAGACCTACGTGGTGCCCTACATGATCGTGAACATGTGGCTGGTGCTCATCA CGCTGCTCCAGCACACGCACCCGGCCCTGCCGCACTACTTCGAGAAGGACTGGGACTGGCTACGCGGCG CCATGGCCACCGTCGACCGCTCCATGGGCCCGCCCTTCATGGACAGCATCCTGCACCACATCTCCGACA CCCACGTGCTGCACCACCTCTTCAGCACCATCCCGCACTACCACGCCGAGGAGGCCTCCGCCGCCATCC GGCCCATCCTGGGCAAGTACTACCAATCCGACAGCCGCTGGGTCGGCCGCGCCCTGTGGGAGGACTGGC GCGACTGCCGCTACGTCGTCCCCGACGCGCCCGAGGACGACTCCGCGCTCTGGTTCCACAAGTGAGCGC GCCTGCGCGAGGACGCAGAACAACGCTGCCGCCGTGTCTTTTGCACGCGCGACTCCGGCGCTTCGCTGG TGGCACCCCCATAAAGAAACCCTCAATTCTGTTTGTGGAAGACACGGTGTACCCCCACCCACCCACCTG CACCTCTATTATTGGTATTATTGACGCGGGAGTGGGCGTTGTACCCTACAACGTAGCTTCTCTAGTTTT CAGCTGGCTCCCACCATTGTAAAGAGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCAT GGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCA TAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCG CTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTT TGCGTATTGGGCGCTCTTCC
SEQ ID N.°:42
Construcción de direccionamiento de recombinación homologa de FAD delta 12 inactivada de P ro to th e ca m o rifo rm is
GCTCTTCGGGTTTGCTCACCCGCGAGGTCGACGCCCAGCATGGCTATCAAGACGAACAGGCAGCCTGTG GAGAAGCCTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCG CTTCGTAGCAGCATGTACCTGGCCTTTGACATCGCGGTCATGTCCCTGCTCTACGTCGCGTCGACGTAC ATCGACCCTGCGCCGGTGCCTACGTGGGTCAAGTATGGCGTCATGTGGCCGCTCTACTGGTTCTTCCAG GTGTGTGTGAGGGTTGTGGTTGCCCGTATCGAGGTCCTGGTGGCGCGCATGGGGGAGAAGGCGCCTGTC CCGCTGACCCCCCCGGCTACCCTCCCGGCACCTTCCAGGGCGCCTTCGGCACGGGTGTCTGGGTGTGCG CGCACGAGTGCGGCCACCAGGCCTTTTCCTCCAGCCAGGCCATCAACGACGGCGTGGGCCTGGTGTTCC ACAGCCTGCTGCTGGTGCCCTACTACTCCTGGAAGCACTCGCACCGCCGCCACCACTCCAACACGGGGT GCCTGGACAAGGACGAGGTGTTTGTGCCGCCGCACCGCGCAGTGGCGCACGAGGGCCTGGAGTGGGAGG AGTGGCTGCCCATCCGCATGGGCAAGGTGCTGGTCACCCTGACCCTGGGCTGGCCGCTGTACCTCATGT TCAACGTCGCCTCGCGGCCGTACCCGCGCTTCGCCAACCACTTTGACCCGTGGTCGCCCATCTTCAGCA AGCGCGAGGTACCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTC CCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCC GATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTA C CAAAG C CATAT T CAAACAC C TAGAT CAC TAC CAC T T C TACACAG G C CAC T C GAG C T T GT GAT C G CAC T CCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCGCGCCATGCTGCTGCAG GCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGAC CGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAG AAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGGACGCCCTTGTTC TGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGCCCCGAAGCGC AACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTCCGGCTTCTTCAACGAC ACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAGTCCGAGGAGCAGTAC ATCTCCTACAGCCTGGACGGCGGCTACACCTTCACCGAGTACCAGAAGAACCCCGTGCTGGCCGCCAAC TCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAAGTGGATCATGACCGCGGCC AAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCG TTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAG GACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAACCCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTC AACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTG GACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTG GGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATG TCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTG AAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTG ACGAAGGCCAACAGCTACAACGTCGACCTGTCCAACAGCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTAC GCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTG GAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGG AACAGCAAGGT GAAGTT CGT GAAGGAGAACCCCTACTT CACCAACCGCAT GAGCGT GAACAACCAGCCC TTCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTG
TACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCC GTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGA CAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCG CCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCT TGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCT TCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTG CTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGC AACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAGCATCG AGGTGGTCATCTCCGACCTCGCGTTGGTGGCGGTGCTCAGCGGGCTCAGCGTGCTGGGCCGCACCATGG GCTGGGCCTGGCTGGTCAAGACCTACGTGGTGCCCTACATGATCGTGAACATGTGGCTGGTGCTCATCA CGCTGCTCCAGCACACGCACCCGGCCCTGCCGCACTACTTCGAGAAGGACTGGGACTGGCTACGCGGCG CCATGGCCACCGTCGACCGCTCCATGGGCCCGCCCTTCATGGACAGCATCCTGCACCACATCTCCGACA CCCACGTGCTGCACCACCTCTTCAGCACCATCCCGCACTACCACGCCGAGGAGGCCTCCGCCGCCATCC GGCCCATCCTGGGCAAGTACTACCAATCCGACAGCCGCTGGGTCGGCCGCGCCCTGTGGGAGGACTGGC GCGACTGCCGCTACGTCGTCCCCGACGCGCCCGAGGACGACTCCGCGCTCTGGTTCCACAAGTGAGCGC GCCTGCGCGAGGACGCAGAACAACGCTGCCGCCGTGTCTTTTGCACGCGCGACTCCGGCGCTTCGCTGG TGGCACCCCCATAAAGAAACCCTCAATTCTGTTTGTGGAAGACACGGTGTACCCCCACCCACCCACCTG CACCTCTATTATTGGTATTATTGACGCGGGAGTGGGCGTTGTACCCTACAACGTAGCTTCTCTAGTTTT CAGCTGGCTCCCACCATTGTAAAGAGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCAT GGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCA TAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCG CTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTT TGCGTATTGGGCGCTCTTCC
SEQ ID N.°:43
Secuencia de ADN del sitio donador 5’ de la construcción de direccionamiento de recombinación homologa de SAD2A inactivada de P ro to th e ca m o rifo rm is
GCTCTTCCGCCTGGAGCTGGTGCAGAGCATGGGTCAGTTTGCGGAGGAGAGGGTGCTCCCCGTGCTGCA CCCCGTGGACAAGCTGTGGCAGCCGCAGGACTTCCTGCCCGACCCCGAGTCGCCCGACTTCGAGGACCA GGTGGCGGAGCTGCGCGCGCGCGCCAAGGACCTGCCCGACGAGTACTTTGTGGTGCTGGTGGGCGACAT GATCACGGAGGAGGCGCTGCCGACCTACATGGCCATGCTCAACACCTTGGACGGTGTGCGCGACGACAC GGGCGCGGCTGACCACCCGTGGGCGCGCTGGACGCGGCAGTGGGTGGCCGAGGAGAACCGGCACGGCGA CCTGCTGAACAAGTACTGTTGGCTGACGGGGCGCGTCAACATGCGGGCCGTGGAGGTGACCATCAACAA CCTGATCAAGAGCGGCATGAACCCGCAGACGGACAACAACCCTTACTTGGGCTTCGTCTACACCTCCTT CCAGGAGCGCGCCACCAAGTAGGTACC
SEQ ID N.°:44
Secuencia de ADN del sitio donador 3’ de la construcción de direccionamiento de recombinación homologa de SAD2A inactivada de Prototheca moriformis
CAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCG CCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCT TGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCT TCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTG CTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGC AAC C T GT AAAC C AG C AC T G C AAT G C T GAT G C AC G G GAAGT AGT G G GAT G G GAAC AC AAAT G GAAG GAT C GTAGAGCTCCAGCCACGGCAACACCGCGCGCCTGGCGGCCGAGCACGGCGACAAGGGCCTGAGCAAGAT CTGCGGGCTGATCGCCAGCGACGAGGGCCGGCACGAGATCGCCTACACGCGCATCGTGGACGAGTTCTT CCGCCTCGACCCCGAGGGCGCCGTCGCCGCCTACGCCAACATGATGCGCAAGCAGATCACCATGCCCGC GCACCTCATGGACGACATGGGCCACGGCGAGGCCAACCCGGGCCGCAACCTCTTCGCCGACTTCTCCGC CGTCGCCGAGAAGATCGACGTCTACGACGCCGAGGACTACTGCCGCATCCTGGAGCACCTCAACGCGCG CTGGAAGGTGGACGAGCGCCAGGTCAGCGGCCAGGCCGCCGCGGACCAGGAGTACGTTCTGGGCCTGCC CCAGCGCTTCCGGAAACTCGCCGAGAAGACCGCCGCCAAGCGCAAGCGCGTCGCGCGCAGGCCCGTCGC CTTCTCCTGGAGAGAAGAGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATA GCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTG TAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCA GTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTAT TGGGCGCTCTTCC
SEQ ID N.°:45
Construcción de direccionamiento de recombinación homologa de SAD2A inactivada de P ro to th e ca m o rifo rm is
GCTCTTCCGCCTGGAGCTGGTGCAGAGCATGGGTCAGTTTGCGGAGGAGAGGGTGCTCCCCGTGCTGCA CCCCGTGGACAAGCTGTGGCAGCCGCAGGACTTCCTGCCCGACCCCGAGTCGCCCGACTTCGAGGACCA GGTGGCGGAGCTGCGCGCGCGCGCCAAGGACCTGCCCGACGAGTACTTTGTGGTGCTGGTGGGCGACAT GATCACGGAGGAGGCGCTGCCGACCTACATGGCCATGCTCAACACCTTGGACGGTGTGCGCGACGACAC GGGCGCGGCTGACCACCCGTGGGCGCGCTGGACGCGGCAGTGGGTGGCCGAGGAGAACCGGCACGGCGA CCTGCTGAACAAGTACTGTTGGCTGACGGGGCGCGTCAACATGCGGGCCGTGGAGGTGACCATCAACAA CCTGATCAAGAGCGGCATGAACCCGCAGACGGACAACAACCCTTACTTGGGCTTCGTCTACACCTCCTT CCAGGAGCGCGCCACCAAGTAGGTACCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGC TGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGC TGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGAC AT T AT AG C GAG C TAC C AAAG C C AT AT T C AAAC AC C T AGAT C AC TAC C AC T T C T AC AC AG G C C AC T C GAG CTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCGCG CCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGA ACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCC TGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGG GGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCA TCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTCCG GCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAGT C C GAG GAG C AGT AC AT C T C C T AC AG C C T G GAC G G C G G C T AC AC C T T C AC C GAGT AC C AGAAGAAC C C C G TGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAAGTGGA TCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTCCTGGA AGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAGG TCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCAT CAACCCCGGCGCCCCGG CCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAACC AGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCCGACCT ACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTTCGTGCCCACCAACCCCT GGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGACGG AGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCA C C AAC AC C AC GT T GAC GAAG G C C AAC AG C T AC AAC GT C GAC C T GT C C AAC AG C AC C G G C AC C C T G GAGT TCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCT GGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCT TCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCATGAGCG TGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGA ACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGA ACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTGC GCGAGGTCAAGTGACAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTG ATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTC AGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCAC CCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCT ATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTAT TCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACA CAAATGGAAGGATCGTAGAGCTCCAGCCACGGCAACACCGCGCGCCTGGCGGCCGAGCACGGCGACAAG GGCCTGAGCAAGATCTGCGGGCTGATCGCCAGCGACGAGGGCCGGCACGAGATCGCCTACACGCGCATC GTGGACGAGTTCTTCCGCCTCGACCCCGAGGGCGCCGTCGCCGCCTACGCCAACATGATGCGCAAGCAG ATCACCATGCCCGCGCACCTCATGGACGACATGGGCCACGGCGAGGCCAACCCGGGCCGCAACCTCTTC GCCGACTTCTCCGCCGTCGCCGAGAAGATCGACGTCTACGACGCCGAGGACTACTGCCGCATCCTGGAG CACCTCAACGCGCGCTGGAAGGTGGACGAGCGCCAGGTCAGCGGCCAGGCCGCCGCGGACCAGGAGTAC GTTCTGGGCCTGCCCCAGCGCTTCCGGAAACTCGCCGAGAAGACCGCCGCCAAGCGCAAGCGCGTCGCG CGCAGGCCCGTCGCCTTCTCCTGGAGAGAAGAGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCG TAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCC GGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCA CTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGA GGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCC
SEQ ID N.°:46
Secuencia de ADN del sitio donador 5' de la construcción de dlrecclonamlento de recombinación homologa de SAD2B inactivada de P ro to th e ca m o rifo rm is
GCTCTTCCCGCCTGGAGCTGGTGCAGAGCATGGGGCAGTTTGCGGAGGAGAGGGTGCTCCCCGTGCTGC ACCCCGTGGACAAGCTGTGGCAGCCGCAGGACTTCCTGCCCGACCCCGAGTCGCCCGACTTCGAGGACC AGGTGGCGGAGCTGCGCGCGCGCGCCAAGGACCTGCCCGACGAGTACTTTGTGGTGCTGGTGGGCGACA TGATCACGGAGGAGGCGCTGCCGACCTACATGGCCATGCTCAACACCTTGGACGGTGTGCGCGACGACA CGGGCGCGGCTGACCACCCGTGGGCGCGCTGGACGCGGCAGTGGGTGGCCGAGGAGAACCGGCACGGCG ACCTGCTGAACAAGTACTGTTGGCTGACGGGGCGCGTCAACATGCGGGCCGTGGAGGTGACCATCAACA ACCTGATCAAGAGCGGCATGAACCCGCAGACGGACAACAACCCTTACTTGGGCTTCGTCTACACCTCCT TCCAGGAGCGCGCCACCAAGTAGGTACC
SEQ ID N.°:47
Secuencia de ADN del sitio donador 3' de la construcción de direccionamiento de recombinación homologa de SAD2B inactivada de Prototheca moriformis
CAGCCACGGCAACACCGCGCGCCTTGCGGCCGAGCACGGCGACAAGAACCTGAGCAAGATCTGCGGGCT GATCGCCAGCGACGAGGGCCGGCACGAGATCGCCTACACGCGCATCGTGGACGAGTTCTTCCGCCTCGA CCCCGAGGGCGCCGTCGCCGCCTACGCCAACATGATGCGCAAGCAGATCACCATGCCCGCGCACCTCAT GGACGACATGGGCCACGGCGAGGCCAACCCGGGCCGCAACCTCTTCGCCGACTTCTCCGCGGTCGCCGA GAAGATCGACGTCTACGACGCCGAGGACTACTGCCGCATCCTGGAGCACCTCAACGCGCGCTGGAAGGT GGACGAGCGCCAGGTCAGCGGCCAGGCCGCCGCGGACCAGGAGTACGTCCTGGGCCTGCCCCAGCGCTT CCGGAAACTCGCCGAGAAGACCGCCGCCAAGCGCAAGCGCGTCGCGCGCAGGCCCGTCGCCTTCTCCTG GAGAAGAGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTG TGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGG GTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACC TGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTT CC
SEQ ID N.°:48
Construcción de direccionamiento de recombinación homóloga de SAD2B inactivada de Prototheca moriformis
GCTCTTCCCGCCTGGAGCTGGTGCAGAGCATGGGGCAGTTTGCGGAGGAGAGGGTGCTCCCCGTGCTGC ACCCCGTGGACAAGCTGTGGCAGCCGCAGGACTTCCTGCCCGACCCCGAGTCGCCCGACTTCGAGGACC AGGTGGCGGAGCTGCGCGCGCGCGCCAAGGACCTGCCCGACGAGTACTTTGTGGTGCTGGTGGGCGACA TGATCACGGAGGAGGCGCTGCCGACCTACATGGCCATGCTCAACACCTTGGACGGTGTGCGCGACGACA CGGGCGCGGCTGACCACCCGTGGGCGCGCTGGACGCGGCAGTGGGTGGCCGAGGAGAACCGGCACGGCG ACCTGCTGAACAAGTACTGTTGGCTGACGGGGCGCGTCAACATGCGGGCCGTGGAGGTGACCATCAACA ACCTGATCAAGAGCGGCATGAACCCGCAGACGGACAACAACCCTTACTTGGGCTTCGTCTACACCTCCT TCCAGGAGCGCGCCACCAAGTAGGTACCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGG CTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGG CTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGA CAT TATAG C GAG C TAC CAAAG C CATAT T CAAACAC C TAGAT CAC TAC CAC T T C TACACAG G C CAC T C GA GCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCGC GCCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCCTGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACG AACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGCACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGC CTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGTGGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGG GGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCC ATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCGCCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTCC GGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGCGCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAG T C C GAG GAG CAGTACAT C T C C TACAG C C T G GAC G G C G G C TACAC C T T CAC C GAGTAC CAGAAGAAC C C C GTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCCGCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAAGTGG ATCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACTACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTCCTGG AAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGGGCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAG GTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGTCCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAACCCCGGCGCCCCG GCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCGTCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAAC CAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGGACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCCGACC TACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGGCCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTTCGTGCCCACCAACCCC TGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCAAGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGACG GAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGATCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCC AC CAACAC CAC GT T GAC GAAG G C CAACAG C TACAAC GT C GAC C T GT C CAACAG CAC C G G CAC C C T G GAG TTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCACCCAGACGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTC TGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGGAGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTC
TTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGAAGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCATGAGC
GTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGAACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAG AACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACGGCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGG AACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGACGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTG CGCGAGGTCAAGTGACAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGT GATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCT CAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCA CCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGC TATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTA TTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAAC ACAAATGGACAGCCACGGCAACACCGCGCGCCTTGCGGCCGAGCACGGCGACAAGAACCTGAGCAAGAT CTGCGGGCTGATCGCCAGCGACGAGGGCCGGCACGAGATCGCCTACACGCGCATCGTGGACGAGTTCTT CCGCCTCGACCCCGAGGGCGCCGTCGCCGCCTACGCCAACATGATGCGCAAGCAGATCACCATGCCCGC GCACCTCATGGACGACATGGGCCACGGCGAGGCCAACCCGGGCCGCAACCTCTTCGCCGACTTCTCCGC GGTCGCCGAGAAGATCGACGTCTACGACGCCGAGGACTACTGCCGCATCCTGGAGCACCTCAACGCGCG CTGGAAGGTGGACGAGCGCCAGGTCAGCGGCCAGGCCGCCGCGGACCAGGAGTACGTCCTGGGCCTGCC CCAGCGCTTCCGGAAACTCGCCGAGAAGACCGCCGCCAAGCGCAAGCGCGTCGCGCGCAGGCCCGTCGC CTTCTCCTGGAGAAGAGCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGC TGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTA AAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGT CGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTG GGCGCTCTTCC
SEQ ID N.°:49
Cebador FAD 1
5'-T CACTT CATGCCGGCGGT CC-3'
SEQ ID N.°:50
Cebador FAD 2
5'- GCGCTCCTGCTTGGCTCGAA-3'
SEQ ID N.°:51
Secuencia de direccionamiento genómico 5' pSZ1124 (FAD2B)
GCTCTTCGAGACGTGGTCTGAATCCTCCAGGCGGGTTTCCCCGAGAAAGAAAGGGTGCCGATTTCAAAG CAGAGCCATGTGCCGGGCCCTGTGGCCTGTGTTGGCGCCTATGTAGTCACCCCCCCTCACCCAATTGTC GCCAGTTTGCGCAATCCATAAACTCAAAACTGCAGCTTCTGAGCTGCGCTGTTCAAGAACACCTCTGGG GTTTGCTCACCCGCGAGGTCGACGCCCAGCATGGCTATCAAGACGAACAGGCAGCCTGTGGAGAAGCCT CCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCGCTTCGTAGC AGCATGTACCTGGCCTTTGACATCGCGGTCATGTCCCTGCTCTACGTCGCGTCGACGTACATCGACCCT GCGCCGGTGCCTACGTGGGTCAAGTATGGCGTCATGTGGCCGCTCTACTGGTTCTTCCAGGTGTGTGTG AGGGTTGTGGTTGCCCGTATCGAGGTCCTGGTGGCGCGCATGGGGGAGAAGGCGCCTGTCCCGCTGACC CCCCCGGCTACCCTCCCGGCACCTTCCAGGGCGCCTTCGGCACGGGTGTCTGGGTGTGCGCGCACGAGT GCGGCCACCAGGCCTTTTCCTCCAGCCAGGCCATCAACGACGGCGTGGGCCTGGTGTTCCACAGCCTGC TGCTGGTGCCCTACTACTCCTGGAAGCACTCGCACCGGGTACC
SEQ ID N.°:52
Secuencia de direccionamiento genómico 3' pSZ1124 (FAD2B)
CCGCCACCACTCCAACACGGGGTGCCTGGACAAGGACGAGGTGTTTGTGCCGCCGCACCGCGCAGTGGC GCACGAGGGCCTGGAGTGGGAGGAGTGGCTGCCCATCCGCATGGGCAAGGTGCTGGTCACCCTGACCCT GGGCTGGCCGCTGTACCTCATGTTCAACGTCGCCTCGCGGCCGTACCCGCGCTTCGCCAACCACTTTGA CCCGTGGTCGCCCATCTTCAGCAAGCGCGAGCGCATCGAGGTGGTCATCTCCGACCTGGCGCTGGTGGC GGTGCTCAGCGGGCTCAGCGTGCTGGGCCGCACCATGGGCTGGGCCTGGCTGGTCAAGACCTACGTGGT GCCCTACCTGATCGTGAACATGTGGCTCGTGCTCATCACGCTGCTCCAGCACACGCACCCGGCGCTGCC GCACTACTTCGAGAAGGACTGGGACTGGCTGCGCGGCGCCATGGCCACCGTGGACCGCTCCATGGGCCC GCCCTTCATGGACAACATCCTGCACCACATCTCCGACACCCACGTGCTGCACCACCTCTTCAGCACCAT CCCGCACTACCACGCCGAGGAGGCCTCCGCCGCCATCAGGCCCATCCTGGGCAAGTACTACCAGTCCGA CAGCCGCTGGGTCGGCCGCGCCCTGTGGGAGGACTGGCGCGACTGCCGCTACGTCGTCCCGGACGCGCC CGAGGACGACTCCGCGCTCTGGTTCCACAAGTGAGTGAGTGAGAAGAGC
SEQ ID N.°:53
Casete suc2 de S. cerevisiae
CTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATG CAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAG GGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATT CAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGC GCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACGGCGCGCCATGCTGCTGCAGGCCTTCCTGTTCC TGCTGGCCGGCTTCGCCGCCAAGATCAGCGCCTCCATGACGAACGAGACGTCCGACCGCCCCCTGGTGC ACTTCACCCCCAACAAGGGCTGGATGAACGACCCCAACGGCCTGTGGTACGACGAGAAGGACGCCAAGT GGCACCTGTACTTCCAGTACAACCCGAACGACACCGTCTGGGGGACGCCCTTGTTCTGGGGCCACGCCA CGTCCGACGACCTGACCAACTGGGAGGACCAGCCCATCGCCATCGCCCCGAAGCGCAACGACTCCGGCG CCTTCTCCGGCTCCATGGTGGTGGACTACAACAACACCTCCGGCTTCTTCAACGACACCATCGACCCGC GCCAGCGCTGCGTGGCCATCTGGACCTACAACACCCCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCCTACAGCC TGGACGGCGGCTACACCTTCACCGAGTACCAGAAGAACCCCGTGCTGGCCGCCAACTCCACCCAGTTCC GCGACCCGAAGGTCTTCTGGTACGAGCCCTCCCAGAAGTGGATCATGACCGCGGCCAAGTCCCAGGACT ACAAGATCGAGATCTACTCCTCCGACGACCTGAAGTCCTGGAAGCTGGAGTCCGCGTTCGCCAACGAGG GCTTCCTCGGCTACCAGTACGAGTGCCCCGGCCTGATCGAGGTCCCCACCGAGCAGGACCCCAGCAAGT CCTACTGGGTGATGTTCATCTCCATCAACCCCGGCGCCCCGGCCGGCGGCTCCTTCAACCAGTACTTCG TCGGCAGCTTCAACGGCACCCACTTCGAGGCCTTCGACAACCAGTCCCGCGTGGTGGACTTCGGCAAGG ACTACTACGCCCTGCAGACCTTCTTCAACACCGACCCGACCTACGGGAGCGCCCTGGGCATCGCGTGGG CCTCCAACTGGGAGTACTCCGCCTTCGTGCCCACCAACCCCTGGCGCTCCTCCATGTCCCTCGTGCGCA AGTTCTCCCTCAACACCGAGTACCAGGCCAACCCGGAGACGGAGCTGATCAACCTGAAGGCCGAGCCGA TCCTGAACATCAGCAACGCCGGCCCCTGGAGCCGGTTCGCCACCAACACCACGTTGACGAAGGCCAACA GCTACAACGTCGACCTGTCCAACAGCACCGGCACCCTGGAGTTCGAGCTGGTGTACGCCGTCAACACCA CCCAGACGATCTCCAAGTCCGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTCAAGGGCCTGGAGGACCCCGAGG AGTACCTCCGCATGGGCTTCGAGGTGTCCGCGTCCTCCTTCTTCCTGGACCGCGGGAACAGCAAGGTGA AGTTCGTGAAGGAGAACCCCTACTTCACCAACCGCATGAGCGTGAACAACCAGCCCTTCAAGAGCGAGA ACGACCTGTCCTACTACAAGGTGTACGGCTTGCTGGACCAGAACATCCTGGAGCTGTACTTCAACGACG GCGACGTCGTGTCCACCAACACCTACTTCATGACCACCGGGAACGCCCTGGGCTCCGTGAACATGACGA CGGGGGTGGACAACCTGTTCTACATCGACAAGTTCCAGGTGCGCGAGGTCAAGTGACAATTGGCAGCAG CAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGC CTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGC TTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCAT ATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGC TCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCA GCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGA
SEQ ID N.°:54
Secuencia de direccionamiento genómico 5' pSZ1125 (FAD2C)
GCTCTTCGAGGGGCTGGTCTGAATCCTTCAGGCGGGTGTTACCCGAGAAAGAAAGGGTGCCGATTTCAA AGCAGACCCATGTGCCGGGCCCTGTGGCCTGTGTTGGCGCCTATGTAGTCACCCCCCCTCACCCAATTG TCGCCAGTTTGCGCACTCCATAAACTCAAAACAGCAGCTTCTGAGCTGCGCTGTTCAAGAACACCTCTG GGGTTTGCTCACCCGCGAGGTCGACGCCCAGCATGGCTATCAAGACGAACAGGCAGCCTGTGGAGAAGC CTCCGTTCACGATCGGGACGCTGCGCAAGGCCATCCCCGCGCACTGTTTCGAGCGCTCGGCGCTTCGTA GCAGCATGTACCTGGCCTTTGACATCGCGGTCATGTCCCTGCTCTACGTCGCGTCGACGTACATCGACC CTGCACCGGTGCCTACGTGGGTCAAGTACGGCATCATGTGGCCGCTCTACTGGTTCTTCCAGGTGTGTT TGAGGGTTTTGGTTGCCCGTATTGAGGTCCTGGTGGCGCGCATGGAGGAGAAGGCGCCTGTCCCGCTGA CCCCCCCGGCTACCCTCCCGGCACCTTCCAGGGCGCCTTCGGCACGGGTGTCTGGGTGTGCGCGCACGA GTGCGGCCACCAGGCCTTTTCCTCCAGCCAGGCCATCAACGACGGCGTGGGCCTGGTGTTCCACAGCCT GCTGCTGGTGCCCTACTACTCCTGGAAGCACTCGCACCGGGTACC
SEQ ID N.°:55
Secuencia de direccionamiento genómico 3' pSZ1125 (FAD2C)
CCGCCACCACTCCAACACGGGGTGCCTGGACAAGGACGAGGTGTTTGTGCCGCCGCACCGCGCAGTGGC GCACGAGGGCCTGGAGTGGGAGGAGTGGCTGCCCATCCGCATGGGCAAGGTGCTGGTCACCCTGACCCT
GGGCTGGCCGCTGTACCTCATGTTCAACGTCGCCTCGCGGCCGTACCCGCGCTTCGCCAACCACTTTGA CCCGTGGTCGCCCATCTTCAGCAAGCGCGAGCGCATCGAGGTGGTCATCTCCGACCTGGCGCTGGTGGC GGTGCTCAGCGGGCTCAGCGTGCTGGGCCGCACCATGGGCTGGGCCTGGCTGGTCAAGACCTACGTGGT GCCCTACCTGATCGTGAACATGTGGCTCGTGCTCATCACGCTGCTCCAGCACACGCACCCGGCGCTGCC GCACTACTTCGAGAAGGACTGGGACTGGCTGCGCGGCGCCATGGCCACCGTGGACCGCTCCATGGGCCC GCCCTTCATGGACAACATCCTGCACCACATCTCCGACACCCACGTGCTGCACCACCTCTTCAGCACCAT CCCGCACTACCACGCCGAGGAGGCCTCCGCCGCCATCAGGCCCATCCTGGGCAAGTACTACCAGTCCGA CAGCCGCTGGGTCGGCCGCGCCCTGTGGGAGGACTGGCGCGACTGCCGCTACGTCGTCCCGGACGCGCC C GAG GAC GAC TCCGCGCTCTGGTTC CACAAGT GAGT GAGT GAGAAGAG C
SEQ ID N.°:56
Secuencia donadora genómica 5' de 6S
GCTCTTCGCCGCCGCCACTCCTGCTCGAGCGCGCCCGCGCGTGCGCCGCCAGCGCCTTGGCCTTTTCGC CGCGCTCGTGCGCGTCGCTGATGTCCATCACCAGGTCCATGAGGTCTGCCTTGCGCCGGCTGAGCCACT GCTTCGTCCGGGCGGCCAAGAGGAGCATGAGGGAGGACTCCTGGTCCAGGGTCCTGACGTGGTCGCGGC TCTGGGAGCGGGCCAGCATCATCTGGCTCTGCCGCACCGAGGCCGCCTCCAACTGGTCCTCCAGCAGCC GCAGTCGCCGCCGACCCTGGCAGAGGAAGACAGGTGAGGGGGGTATGAATTGTACAGAACAACCACGAG CCTTGTCTAGGCAGAATCCCTACCAGTCATGGCTTTACCTGGATGACGGCCTGCGAACAGCTGTCCAGC GACCCTCGCTGCCGCCGCTTCTCCCGCACGCTTCTTTCCAGCACCGTGATGGCGCGAGCCAGCGCCGCA CGCTGGCGCTGCGCTTCGCCGATCTGAGGACAGTCGGGGAACTCTGATCAGTCTAAACCCCCTTGCGCG TTAGTGTTGCCATCCTTTGCAGACCGGTGAGAGCCGACTTGTTGTGCGCCACCCCCCACACCACCTCCT CCCAGACCAATTCTGTCACCTTTTTGGCGAAGGCATCGGCCTCGGCCTGCAGAGAGGACAGCAGTGCCC AGCCGCTGGGGGTTGGCGGATGCACGCTCAGGTACC
SEQ ID N.°:57
Secuencia donadora genómica 3' de 6S
GAGCTCCTTGTTTTCCAGAAGGAGTTGCTCCTTGAGCCTTTCATTCTCAGCCTCGATAACCTCCAAAGC CGCTCTAATTGTGGAGGGGGTTCGAATTTAAAAGCTTGGAATGTTGGTTCGTGCGTCTGGAACAAGCCC AGACTTGTTGCTCACTGGGAAAAGGACCATCAGCTCCAAAAAACTTGCCGCTCAAACCGCGTACCTCTG CTTTCGCGCAATCTGCCCTGTTGAAATCGCCACCACATTCATATTGTGACGCTTGAGCAGTCTGTAATT GCCTCAGAATGTGGAATCATCTGCCCCCTGTGCGAGCCCATGCCAGGCATGTCGCGGGCGAGGACACCC G C CAC T C GTACAG CAGAC CAT TAT G C TAC C T CACAATAGT T CATAACAGT GAC CATAT T T C T C GAAG C T CCCCAACGAGCACCTCCATGCTCTGAGTGGCCACCCCCCGGCCCTGGTGCTTGCGGAGGGCAGGTCAAC CGGCATGGGGCTACCGAAATCCCCGACCGGATCCCACCACCCCCGCGATGGGAAGAATCTCTCCCCGGG AT GT G G G C C CAC CAC CAG CACAAC CTGCTGGCC CAG G C GAG C GT CAAAC CATAC CACACAAATAT C C T T GGCATCGGCCCTGAATTCCTTCTGCCGCTCTGCTACCCGGTGCTTCTGTCCGAAGCAGGGGTTGCTAGG GATCGCTCCGAGTCCGCAAACCCTTGTCGCGTGGCGGGGCTTGTTCGAGCTTGAAGAGC
SEQ ID N.°:58
Construcción de expresión relevante para la tioesterasa de Cinnamomum camphora (ptub::neo::mtred::ptub::C.camphora TE::nitred)
CTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATG CAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAG GGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATT CAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGC GCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACTCTAGAATATCAATGATCGAGCAGGACGGCCTC CACGCCGGCTCCCCCGCCGCCTGGGTGGAGCGCCTGTTCGGCTACGACTGGGCCCAGCAGACCATCGGC TGCTCCGACGCCGCCGTGTTCCGCCTGTCCGCCCAGGGCCGCCCCGTGCTGTTCGTGAAGACCGACCTG TCCGGCGCCCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCCGCCCGCCTGTCCTGGCTGGCCACCACCGGCGTGCCC TGCGCCGCCGTGCTGGACGTGGTGACCGAGGCCGGCCGCGACTGGCTGCTGCTGGGCGAGGTGCCCGGC CAGGACCTGCTGTCCTCCCACCTGGCCCCCGCCGAGAAGGTGTCCATCATGGCCGACGCCATGCGCCGC CTGCACACCCTGGACCCCGCCACCTGCCCCTTCGACCACCAGGCCAAGCACCGCATCGAGCGCGCCCGC ACCCGCATGGAGGCCGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAGGAGCACCAGGGCCTGGCCCCCGCC GAGCTGTTCGCCCGCCTGAAGGCCCGCATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTGACCCACGGCGACGCC TGCCTGCCCAACATCATGGTGGAGAACGGCCGCTTCTCCGGCTTCATCGACTGCGGCCGCCTGGGCGTG GCCGACCGCTACCAGGACATCGCCCTGGCCACCCGCGACATCGCCGAGGAGCTGGGCGGCGAGTGGGCC GACCGCTTCCTGGTGCTGTACGGCATCGCCGCCCCCGACTCCCAGCGCATCGCCTTCTACCGCCTGCTG GACGAGTTCTTCTGACAATTGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGT
GATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTGTGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCT CAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAGTTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCA CCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGCATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGC TATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCCCTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTA TTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAATGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAAC ACAAATGGAGGATCCCGCGTCTCGAACAGAGCGCGCAGAGGAACGCTGAAGGTCTCGCCTCTGTCGCAC CTCAGCGCGGCATACACCACAATAACCACCTGACGAATGCGCTTGGTTCTTCGTCCATTAGCGAAGCGT CCGGTTCACACACGTGCCACGTTGGCGAGGTGGCAGGTGACAATGATCGGTGGAGCTGATGGTCGAAAC GTTCACAGCCTAGGGATATCGAATTCCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCT GCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCT GCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACA T TATAG C GAG C TAC CAAAG C CATAT T CAAACAC C TAGAT CAC TAC CAC T T C TACACAG G C CAC T C GAG C TTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACACTAGTA TGGCCACCGCATCCACTTTCTCGGCGTTCAATGCCCGCTGCGGCGACCTGCGTCGCTCGGCGGGCTCCG GGCCCCGGCGCCCAGCGAGGCCCCTCCCCGTGCGCGGGCGCGCCCCCGACTGGTCCATGCTGTTCGCCG TGATCACCACCATCTTCTCCGCCGCCGAGAAGCAGTGGACCAACCTGGAGTGGAAGCCCAAGCCCAACC CCCCCCAGCTGCTGGACGACCACTTCGGCCCCCACGGCCTGGTGTTCCGCCGCACCTTCGCCATCCGCA GCTACGAGGTGGGCCCCGACCGCTCCACCAGCATCGTGGCCGTGATGAACCACCTGCAGGAGGCCGCCC TGAACCACGCCAAGTCCGTGGGCATCCTGGGCGACGGCTTCGGCACCACCCTGGAGATGTCCAAGCGCG ACCTGATCTGGGTGGTGAAGCGCACCCACGTGGCCGTGGAGCGCTACCCCGCCTGGGGCGACACCGTGG AGGTGGAGTGCTGGGTGGGCGCCTCCGGCAACAACGGCCGCCGCCACGACTTCCTGGTGCGCGACTGCA AGACCGGCGAGATCCTGACCCGCTGCACCTCCCTGAGCGTGATGATGAACACCCGCACCCGCCGCCTGA GCAAGATCCCCGAGGAGGTGCGCGGCGAGATCGGCCCCGCCTTCATCGACAACGTGGCCGTGAAGGACG AGGAGATCAAGAAGCCCCAGAAGCTGAACGACTCCACCGCCGACTACATCCAGGGCGGCCTGACCCCCC G C T G GAAC GAC C T G GACAT CAAC CAG CAC GT GAACAACAT CAAGTAC GT G GAC T G GAT C C T G GAGAC C G TGCCCGACAGCATCTTCGAGAGCCACCACATCTCCTCCTTCACCATCGAGTACCGCCGCGAGTGCACCA TGGACAGCGTGCTGCAGTCCCTGACCACCGTGAGCGGCGGCTCCTCCGAGGCCGGCCTGGTGTGCGAGC ACCTGCTGCAGCTGGAGGGCGGCAGCGAGGTGCTGCGCGCCAAGACCGAGTGGCGCCCCAAGCTGACCG ACTCCTTCCGCGGCATCAGCGTGATCCCCGCCGAGTCCAGCGTGATGGACTACAAGGACCACGACGGCG AC TACAAG GAC CAC GACAT C GAC TACAAG GAC GAC GAC GACAAGT GAC T C GAG G CAG CAG CAG C T C G GA TAGTATCGACACACTCTGGACGCTGGTCGTGTGATGGACTGTTGCCGCCACACTTGCTGCCTTGACCTG TGAATATCCCTGCCGCTTTTATCAAACAGCCTCAGTGTGTTTGATCTTGTGTGTACGCGCTTTTGCGAG TTGCTAGCTGCTTGTGCTATTTGCGAATACCACCCCCAGCATCCCCTTCCCTCGTTTCATATCGCTTGC ATCCCAACCGCAACTTATCTACGCTGTCCTGCTATCCCTCAGCGCTGCTCCTGCTCCTGCTCACTGCCC CTCGCACAGCCTTGGTTTGGGCTCCGCCTGTATTCTCCTGGTACTGCAACCTGTAAACCAGCACTGCAA TGCTGATGCACGGGAAGTAGTGGGATGGGAACACAAATGGAAAGCTT
SEQ ID N.°:59
Secuencia de nucleótidos del ADN transformante contenido en pSZ1503_[KASII_btub-y.inv-nr_KASII]
g c t c t t c c c g c a c c g g c t g g c t c c a c c c c a a c t t g a a c c t c g a g a a c c c c g c g c c t g g c g t c g a c c c c g t c g t g c t c g t g g g g c c g c g g a a g g a g c g c g c c g a a g a c c t g g a c g t c g t c c t c t c c a a c t c c t t t g g c t t t g g c g g g c a c a a t t c g t g c g t c g g t a c c c t t t c t t g c g c t a t g a c a c t t c c a g c a a a a g g t a g g g c g g g c t g c g a g a c g g c t t c c c g g c g c t g c a t g c a a c a c c g a t g a t g c t t c g a c c c c c c g a a g c t c c t t c g g g g c t g c a t g g g c g c t c c g a t g c c g c t c c a g g g c g a g c g c t g t t t a a a t a g c c a g g c c c c c g a t t g c a a a g a c a t t a t a g c g a g c t a c c a a a g c c a t a t t c a a a c a c c t a g a t c a c t a c c a c t t c t a c a c a g g c c a c t c g a g c t t g t g a t c g c a c t c c g c t a a g g g g g c g c c t c t t c c t c t t c g t t t c a g t c a c a a c c c g c a a a c g g c g c g c c A T G c t g c t g c a g g c c t t c c t g t t c c t g c t g g c c g g c t t c g c c g c c a a g a t c a g c g c c t c c a t g a c g a a c g a g a c g t c c g a c c g c c c c c t g g t g c a c t t c a c c c c c a a c a a g g g c t g g a t g a a c g a c c c c a a c g g c c t g t g g t a c g a c g a g a a g g a c g c c a a g t g g c a c c t g t a c t t c c a g t a c a a c c c g a a c g a c a c c g t c t g g g g g a c g c c c t t g t t c t g g g g c c a c g c c a c g t c c g a c g a c c t g a c c a a c t g g g a g g a c c a g c c c a t c g c c a t c g c c c c g a a g c g c a a c g a c t c c g g c g c c t t c t c c g g c t c c a t g g t g g t g g a c t a c a a c a a c a c c t c c g g c t t c t t c a a c g a c a c c a t c g a c c c g c g c c a g c g c t g c g t g g c c a t c t g g a c c t a c a a c a c c c c g g a g t c c g a g g a g c a g t a c a t c t c c t a c a g c c t g g a c g g c g g c t a c a c c t t c a c c g a g t a c c a g a a g a a c c c c g t g c t g g c c g c c a a c t c c a c c c a g t t c c g c g a c c c g a a g g t c t t c t g g t a c g a g c c c t c c c a g a a g t g g a t c a t g a c c g c g g c c a a g t c c c a g g a c t a c a a g a t c g a g a t c t a c t c c t c c g a c g a c c t g a a g t c c t g g a a g c t g g a g t c c g c g t t c g c c a a c g a g g g c t t c c t c g g c t a c c a g t a c g a g t g c c c c g g c c t g a t c g a g g t c c c c a c c g a g c a g g a c c c c a g c a a g t c c t a c t g g g t g a t g t t c a t c t c c a t c a a c c c c g g c g c c c c g g c c g g c g g c t c c t t c a a c c a g t a c t t c g t c g g c a g c t t c a a c g g c a c c c a c t t c g a g g c c t t c g a c a a c c a g t c c c g c g t g g t g g a c t t c g g c a a g g a c t a c t a c g c c c t g c a g a c c t t c t t c a a c a c c g a c c c g a c
c t a c g g g a g c g c c c t g g g c a t c g c g t g g g c c t c c a a c t g g g a g t a c t c c g c c t t c g t g c c c a c c a a c c c c t g g c g c t c c t c c a t g t c c c t c g t g c g c a a g t t c t c c c t c a a c a c c g a g t a c c a g g c c a a c c c g g a g a c g g a g c t g a t c a a c c t g a a g g c c g a g c c g a t c c t g a a c a t c a g c a a c g c c g g c c c c t g g a g c c g g t t c g c c a c c a a c a c c a c g t t g a c g a a g g c c a a c a g c t a c a a c g t c g a c c t g t c c a a c a g c a c c g g c a c c c t g g a g t t c g a g c t g g t g t a c g c c g t c a a c a c c a c c c a g a c g a t c t c c a a g t c c g t g t t c g c g g a c c t c t c c c t c t g g t t c a a g g g c c t g g a g g a c c c c g a g g a g t a c c t c c g c a t g g g c t t c g a g g t g t c c g c g t c c t c c t t c t t c c t g g a c c g c g g g a a c a g c a a g g t g a a g t t c g t g a a g g a g a a c c c c t a c t t c a c c a a c c g c a t g a g c g t g a a c a a c c a g c c c t t c a a g a g c g a g a a c g a c c t g t c c t a c t a c a a g g t g t a c g g c t t g c t g g a c c a g a a c a t c c t g g a g c t g t a c t t c a a c g a c g g c g a c g t c g t g t c c a c c a a c a c c t a c t t c a t g a c c a c c g g g a a c g c c c t g g g c t c c g t g a a c a t g a c g a c g g g g g t g g a c a a c c t g t t c t a c a t c g a c a a g t t c c a g g t g c g c g a g g t c a a g T G A c a a t t g g c a g c a g c a g c t c g g a t a g t a t c g a c a c a c t c t g g a c g c t g g t c g t g t g a t g g a c t g t t g c c g c c a c a c t t g c t g c c t t g a c c t g t g a a t a t c c c t g c c g c t t t t a t c a a a c a g c c t c a g t g t g t t t g a t c t t g t g t g t a c g c g c t t t t g c g a g t t g c t a g c t g c t t g t g c t a t t t g c g a a t a c c a c c c c c a g c a t c c c c t t c c c t c g t t t c a t a t c g c t t g c a t c c c a a c c g c a a c t t a t c t a c g c t g t c c t g c t a t c c c t c a g c g c t g c t c c t g c t c c t g c t c a c t g c c c c t c g c a c a g c c t t g g t t t g g g c t c c g c c t g t a t t c t c c t g g t a c t g c a a c c t g t a a a c c a g c a c t g c a a t g c t g a t g c a c g g g a a g t a g t g g g a t g g g a a c a c a a a t g g a g g a t c g t a g a g c t c a t c t t c c g a a a g t a c g a c g a g t g a g c g a g c t g a t t c t c t t t g a g c g g g g t c g g g t g g t t c g g g g a g a g t g c g c g g a a a g g c g c a g a g a c g t g c g g c c g g c c g t g t c c c t c c g t c t t c c c c t g g t t g g t g c t a t a g t a a c c t g c c t g t g t c g c g t g c g c g t c g g g a a g a g c
SEQ ID N.°:60
Secuencia de nucleótidos del ADN transformante contenido en pSZ2533
gctcttcacccaactcagataataccaatacccctccttctcctcctcatccattcagtaccccccccc ttctcttcccaaagcagcaagcgcgtggcttacagaagaacaatcggcttccgccaaagtcgccgagca ctgcccgacggcggcgcgcccagcagcccgcttggccacacaggcaacgaatacattcaatagggggcc tcgcagaatggaaggagcggtaaagggtacaggagcactgcgcacaaggggcctgtgcaggagtgactg actgggcgggcagacggcgcaccgcgggcgcaggcaagcagggaagattgaagcggcagggaggaggat gctgattgaggggggcatcgcagtctctcttggacccgggataaggaagcaaatattcggccggttggg ttgtgtgtgtgcacgttttcttcttcagagtcgtgggtgtgcttccagggaggatataagcagcaggat cgaatcccgcgaccagcgtttccccatccagccaaccaccctgtcggtacc|ctttcttgcgctatgaca| |cttccagcaaaaggtagggcgggctgcgagacggcttcccggcgctgcatgcaacaccgatgatgcttc| |gaccccccgaagctccttcggggctgcatgggcgctccgatgccgctccagggcgagcgctgtttaaat| |agccaggcccccgattgcaaagacattatagcgagctaccaaagccatattcaaacacctagatcacta| |ccacttctacacaggccactcgagcttgtgatcgcactccgctaagggggcgcctcttcctcttcgttt| |cagtcacaa cccgcaaac|ggcgcgccA!TGc tgetgcaggeetteetqt tcctgetqqccqqcttcqccq ccaagatcagcgcctccatgaegaaegagacgtccgaccgccccctggtgcacttcacccccaacaagg gctggatgaacgaccccaacggcctgtggtacgacgagaaggacgccaagtggcacctgtacttccagt acaacccgaacgacaccgtctgggggacgcccttgttctggggccacgccacgtccgacgacctgacca actgggaggaccagcccatcgccatcgccccgaagcgcaacgactccggcgccttctccggctccatgg tggtggactacaacaacacctccggcttcttcaacgacaccatcgacccgcgccagcgctgcgtggcca tctggacctacaacaccccggagtccgaggagcagtacatctcctacagcctggacggcggctacacct tcaccgagtaccagaagaaccccgtgctggccgccaactccacccagttccgcgacccgaaggtcttct ggtacgagccctcccagaagtggatcatgaccgcggccaagtcccaggactacaagatcgagatctact cctccgacgacctgaagtcctggaagctggagtccgcgttcgccaacgagggcttcctcggctaccagt acgagtgccccggcctgatcgaggtccccaccgagcaggaccccagcaagtcctactgggtgatgttca tctccatcaaccccggcgccccggccggcggctccttcaaccagtacttcgtcggcagcttcaacggca cccacttcgaggeettcgacaaccagtcccgcgtggtggacttcggcaaggactactacgccctgcaga ccttcttcaacaccgacccgacctacgggagcgccctgggcatcgcgtgggcctccaactgggagtact ccgccttcgtgcccaccaacccctggcgctcctceatgtccctcgtgcgcaagttctccctcaacaccg agtaccaggccaacccggagacggagctgatcaacctgaaggccgagccgatcctgaacatcagcaacg ccggcccctggagccggttcgccaccaacaccacgttgacgaaggccaacagctacaacgtcgacctgt ccaacagcaccggcaccctggagttcgagctggtgtacgccgtcaacaccacccagacgatctccaagt ccgtgttcgcggacctctccctctggttcaagggcctggaggaccccgaggagtacctccgcatgggct tegaggtgtccgcgtcctccttcttcctggaccgcgggaacagcaaggtgaagttcgtgaaggagaacc cctacttcaccaaccgcatgagcgtgaacaaccagcccttcaagagcgagaacgacctgtcctactaca aggtgtacggcttgctggaccagaacatcctggagctgtacttcaacgacggcgacgtcgtgtccacca acacctacttcatgaccaccgggaacgccctgggctccgtgaacatgacgacgggggtggacaacctgt tctacatcgacaagttccaggtgcgcgag g t c a a g r G A c a a t t g g c a g c a g c a g c t c g g a t a g t a t c g a c a c a c t c t g g a c g c t g g t c g t g t g a t g g a c t g t t g c c g c c a c a c t t g c t g c c t t g a c c t g t g a a t a t c c c t g c c g c t t t t a t c a a a c a g c c t c a g t g t g t t t g a t c t t g t g t g t a c g c g c t t t t g c g a g t t g c t a g c t g c t t g t g c t a t t t g c g a a t a c c a c c c c c a g c a t c c c c t t c c c t c g t t t c a t a t c g c t t g c a t c c c a a c c g c a a c t t a t c t a c g c t g t c c t g c t a t c c c t c a g c g c t g c t c c t g c t c c t g c t c a c t g c c c c t c g c a c a g c c t t g g t t t g g g c t c c g c c t g t a t t c t c c t g g t a c t g c a a c c t g t a a a c c a g c a c t g c a a t g c t g a t g c a c g g g a a g t a g t g g g a t g g g a a c a c a a a t g g a g g a t c c c g c g t c t c g a a c a g a g c g c g c a g a g g a a c g c t g a a g g t c t c g c c t c t g t c g c a c c t c a g c g c g g c a t a c a c c a c a a t a a c c a c c t g a c g a a t g c g c t t g g t t c t t c g t c c a t t a g c g a a g c g t c c g g t t c a c a c a c g t g c c a c g t t g g c g a g g t g g c a g g t g a c a a t g a t c q q t q q a q c t q a t q q t c q a a a c q t t c a c a q c c t a q q g a t a t c | a tagcgactgctaccccccgacca tg | tgccgaggcagaaattatatacaagaagcagatcgcaattaggcacatcgctttgcattatccacacac\ tattcatcgctgctgcggcaaggctgcagagtgtatttttgtggcccaggagctgagtccgaagtcgac\ gcgacgagcggcgcaggatccgacccctagacgagctctgtcattttccaagcacgcagctaaatgcgc\ tgagaccgggtctaaatcatccgaaaagtgtcaaaatggccgattgggttcgcctaggacaatgcgctg\ cggattcgctcgagtccgctgccggccaaaaggcggtggtacaggaaggcgcacggggccaaccctgcg\ aagccgggggcccgaacgccgaccgccggccttcgatctcgggtgtccccctcgtcaatt t c c t c t c t c ] gggtgcagccacgaaagtcgtgacgcaggtcacgaaatccggttacgaaaaacgcaggtcttcgcaaaa\ acgtgagggtttcgcgtctcgccctagcta ttcgtatcgccgggtcagacccacgtgc.agaaaagccct\ tgaataacccgggaccgtggttaccgcgccgcctgcaccagggggcttatataagcccacaccacacct gtctcaccacgcatttctccaactcgcgacttttcggaagaaattgttatccacctagtatagactgcc\ acctgcaggaccttgtgtcttgcagtttgtattggtcccggccgtcgagctcgacagatctgggctag^ gttggcctggccgctcggcactcccctttagccgcgcgcatccgcgttccagaggtgcgattcggtgtg\ tggagcattgtcatgcgcttgtgggggtcgttccgtgcgcggcgggtccgccatgggcgccgacctggg\ ccctagggtttgttttcgggccaagcgagcccctctcacctcgtcgcccccccgcattccctctctctt] gcagcct tqcófactaqtATGgccaccgcatccactttctcggcgttcaatgcccgctgcggcgacctgc gtcgctcggcgggc tccgggccccggcgccca.gcga.ggcccctccccgtgcgcgqqcqcqccgccgccg ccgccgacgcca.a.ccccgcccgccccga.gcgccgcgtggtga.tca.ccggcca.gggcgtggtgacctccc tgggcca.ga.cca.tcgagcagttetactcctccctgctggagggcgtgtccggcatetcccagatccaga agttcgacaccaccggctacaccaccaccatcgccggcgagatcaagtccctgeagetggacccctacg tgcccaagcgctgggccaagcgcgtggacgacgtgatcaagtacgtgtacatcgccggcaagcaggccc tggagtccgccggcctgcccatcgaggccgccggcctggccggcgccggcctggaccccgccctgtgcg gcgtgctgatcggcaccgccatggccggcatgacctccttcgccgccggcgtggaggccctgacccgcg gcggcgtgcgcaagatgaaccccttetgeatccccttctccatctccaacatgggcggcgccatgctgg ceatggacatcggcttcatgggccccaactactccatctccaccgcctgcgccaccggcaactactgea tcctgggcgccgccgaccacatccgccgcggcgacgccaacgtgatgctggccggcggcgccgacgccg ceatcatcccctccggcatcggcggcttcategeetgcaaggccctgtccaagcgcaacgacgagcccg agcgcgcctcccgcccctgggacgccgaccgcgacggcttcgtgatgggcgagggcgccggcgtgctgg tgctggaggagctggagcacgccaagcgccgcggcgccaccatcctggccgagctggtgggcggcgccg ccacctccgacgcccaccacatgaccgagcccgacccccagggccgcggcgtgcgcctgtgcctggagc gcgccctggagcgcgcccgcctggcccccgagcgcgtgggctacgtgaacgcccacggcacctccaccc ccgccggcgacgtggccgagtaccgcgccatccgcgccgtgatcccccaggactccctgcgcatcaact ccaccaagtccatgatcggccacctgctgggcggcgccggcgccgtggaggccgtggccgccatccagg caetgcgcaccggctggctgcaccccaacctgaacctggagaaccccgcccccggcgtggaccccgtgg tgctggtgggcccccgcaaggagcgcgccgaggacctggacgtggtgctgtccaactccttcggcttcg gcggccacaactcctgcgtgatettccgcaagtacgacgagatggactacaaggaccacgacggcgact acaaggaccacgacatcgactacaaggacgacgacgacaagTGAatcqataqatctcttaaqqcaqcaq c a g c t c g g a t a g t a t c g a c a c a c t c t g g a c g c t g g t c g t g t g a t g g a c t g t t g c c g c c a c a c t t g c t g c c t t g a c c t g t g a a t a t c c c t g c c g c t t t t a t c a a a c a g c c t c a g t g t g t t t g a t c t t g t g t g t a c g c g c t t t t g c q a g t t q c t a q c t g c t t g t g c t a t t t g c g a a t a c c a c c c c c a g c a t c c c c t t c c c t c q t t t c a t a t c g c t t g c a t c c c a a c c g c a a c t t a t c t a c g c t g t c c t g c t a t c c c t c a g c g c t g c t c c t g c t c c t g c
t c a c t g c c c c t c g c a c a g c c t t g g t t t g g g c t c c g c c t g t a t t c t c c t g g t a c t g c a a c c t g t a a a c c a g c a c t g c a a t g c t g a t g c a c g g g a a g t a g t g g g a t g g g a a c a c a a a t g g a a a g c t t a a t t a a g a g c t c t tgttttccagaaggagttgctccttgagcctttcattctcagcctcgataacctccaaagccgctctaa ttgtggagggggttcgaaccgaatgctgcgtgaacgggaaggaggaggagaaagagtgagcagggaggg attcagaaatgagaaatgagaggtgaaggaacgcatccctatgcccttgcaatggacagtgtttctggc caccgccaccaagacttcgtgtcctctgatcatcatgcgattgattacgttgaatgcgacggccggtca gccccggacctccacgcaccggtgctcctccaggaagatgcgcttgtcctccgccatcttgcagggctc aagctgctcccaaaactcttgggcgggttccggacggacggctaccgcgggtgcggccctgaccgccac tgttcggaagcagcggcgctgcatgggcagcggccgctgcggtgcgccacggaccgcatgatccaccgg aaaagcgcacgcgctggagcgcgcagaggaccacagagaagcggaagagacgccagtactggcaagcag gctggtcggtgccatggcgcgctactaccctcgctatgactcgggtcctcggccggctggcggtgctga caattcgtttagtggagcagcgactccattcagctaccagtcgaactcagtggcacagtgactccgctc ttc
SEQ ID N.°:61
Secuencia de nucleótidos del promotor PmLDHI que dirige la expresión de PmKASII en pSZ2532
SEQ ID N.°:62
Secuencia de nucleótidos del promotor PmAMT3 que dirige la expresión de PmKASII en pSZ2750
SEQ ID N.°:63
Secuencia de nucleótidos de pSZ4424 - para la expresión de C8 CpalFATBI ExtC con mutación M230G THI4a::CrTUB2-NeoR-PmPGH:PmSAD2-2Ver3-CpSAD1tp_CpalFATB1ExtC_M230G_FLAG-CvNR::THI4a
1 c c c t c a a c t g c g a c g c t g g g a a c c t t c t c c g g g c a g g c g a t g t g c g t g g g t t t g c c t c c t
61 t g g c a c g g c t c t a c a c c g t c g a g t a c g c c a t g a g g c g g t g a t g g c t g t g t c g g t t g c c a c
121 t t c g t c c a g a g a c g g c a a g t c g t c c a t c c t c t g c g t g t g t g g c g c g a c g c t g c a g c a g t c
181 c c t c t g c a g c a g a t g a g c g t g a c t t t g g c c a t t t c a c g c a c t c g a g t g t a c a c a a t c c a t
241 t t t t c t t a a a g c a a a t g a c t g c t g a t t g a c c a g a t a c t g t a a c g c t g a t t t c g c t c c a g a
301 t c g c a c a g a t a g c g a c c a t g t t g c t g c g t c t g a a a a t c t g g a t t c c g a a t t c g a c c c t g g
361 c g c t c c a t c c a t g c a a c a g a t g g c g a c a c t t g t t a c a a t t c c t g t c a c c c a t c g g c a t g g
421 a g c a g g t c c a c t t a g a t t c c c g a t c a c c c a c g c a c a t c t c g c t a a t a g t c a t t c g t t c g t
481 g t c t t c g a t c a a t c t c a a g t g a g t g t g c a t g g a t c t t g g t t g a c g a t g c g g t a t g g g t t t
541 g c g c c g c t g g c t g c a g g g t c t g c c c a a g g c a a g c t a a c c c a g c t c c t c t c c c c g a c a a t a
601 c t c t c g c a g g c a a a g c c g g t c a c t t g c c t t c c a g a t t g c c a a t a a a c t c a a t t a t g g c c t
661 c t g t c a t g c c a t c c a t g g g t c t g a t g a a t g g t c a c g c t c g t g t c c t g a c c g t t c c c c a g c
721 c t c t g g c g t c c c c t g c c c c g c c c a c c a g c c c a c g c c g c g c g g c a g t c g c t g c c a a g g c t g
781 t c t c g g a g g t a c c c t t t c t t g c g c t a t g a c a c t t c c a g c a a a a g g t a g g g c g g g c t g c g a
8 41 g a c g g c t t c c c g g c g c t g c a t g c a a c a c c g a t g a t g c t t c g a c c c c c c g a a g c t c c t t c g
9 01 g g g c t g c a t g g g c g c t c c g a t g c c g c t c c a g g g c g a g c g c t g t t t a a a t a g c c a g g c c c c
9 61 c g a t t g c a a a g a c a t t a t a g c g a g c t a c c a a a g c c a t a t t c a a a c a c c t a g a t c a c t a c c
10 21 a c t t c t a c a c a g g c c a c t c g a g c t t g t g a t c g c a c t c c g c t a a g g g g g c g c c t c t t c c t c
10 81 t t c g t t t c a g t c a c a a c c c g c a a a c t c t a g a a t a t c a a t g a t c g a g c a g g a c g g c c t c c a
11 41 c g c c g g c t c c c c c g c c g c c t g g g t g g a g c g c c t g t t c g g c t a c g a c t g g g c c c a g c a g a c
12 01 c a t c g g c t g c t c c g a c g c c g c c g t g t t c c g c c t g t c c g c c c a g g g c c g c c c c g t g c t g t t
12 61 c g t g a a g a c c g a c c t g t c c g g c g c c c t g a a c g a g c t g c a g g a c g a g g c c g c c c g c c t g t c
13 21 c t g g c t g g c c a c c a c c g g c g t g c c c t g c g c c g c c g t g c t g g a c g t g g t g a c c g a g g c c g g
13 81 c c g c g a c t g g c t g c t g c t g g g c g a g g t g c c c g g c c a g g a c c t g c t g t c c t c c c a c c t g g c
14 41 c c c c g c c g a g a a g g t g t c c a t c a t g g c c g a c g c c a t g c g c c g c c t g c a c a c c c t g g a c c c
15 01 c g c c a c c t g c c c c t t c g a c c a c c a g g c c a a g c a c c g c a t c g a g c g c g c c c g c a c c c g c a t
15 61 g g a g g c c g g c c t g g t g g a c c a g g a c g a c c t g g a c g a g g a g c a c c a g g g c c t g g c c c c c g c
16 21 c g a g c t g t t c g c c c g c c t g a a g g c c c g c a t g c c c g a c g g c g a g g a c c t g g t g g t g a c c c a
16 81 c g g c g a c g c c t g c c t g c c c a a c a t c a t g g t g g a g a a c g g c c g c t t c t c c g g c t t c a t c g a
17 41 c t g c g g c c g c c t g g g c g t g g c c g a c c g c t a c c a g g a c a t c g c c c t g g c c a c c c g c g a c a t
18 01 c g c c g a g g a g c t g g g c g g c g a g t g g g c c g a c c g c t t c c t g g t g c t g t a c g g c a t c g c c g c
18 61 c c c c g a c t c c c a g c g c a t c g c c t t c t a c c g c c t g c t g g a c g a g t t c t t c t g a c a a t t g a c
19 21 g c c c g c g c g g c g c a c c t g a c c t g t t c t c t c g a g g g c g c c t g t t c t g c c t t g c g a a a c a a g
19 81 c c c c t g g a g c a t g c g t g c a t g a t c g t c t c t g g c g c c c c g c c g c g c g g t t t g t c g c c c t c g
204 1 c g g g c g c c g c g g c c g c g g g g g c g c a t t g a a a t t g t t g c a a a c c c c a c c t g a c a g a t t g a g
210 1 g g c c c a g g c a g g a a g g c g t t g a g a t g g a g g t a c a g g a g t c a a g t a a c t g a a a g t t t t t a t
216 1 g a t a a c t a a c a a c a a a g g g t c g t t t c t g g c c a g c g a a t g a c a a g a a c a a g a t t c c a c a t t
222 1 t c c g t g t a g a g g c t t g c c a t c g a a t g t g a g c g g g c g g g c c g c g g a c c c g a c a a a a c c c t t
228 1 a c g a c g t g g t a a g a a a a a c g t g g c g g g c a c t g t c c c t g t a g c c t g a a g a c c a g c a g g a g a
234 1 c g a t c g g a a g c a t c a c a g c a c a g g a t c c c g c g t c t c g a a c a g a g c g c g c a g a g g a a c g c t
240 1 g a a g g t c t c g c c t c t g t c g c a c c t c a g c g c g g c a t a c a c c a c a a t a a c c a c c t g a c g a a t
246 1 g c g c t t g g t t c t t c g t c c a t t a g c g a a g c g t c c g g t t c a c a c a c g t g c c a c g t t g g c g a g
252 1 g t g g c a g g t g a c a a t g a t c g g t g g a g c t g a t g g t c g a a a c g t t c a c a g c c t a g g g a t a t c
258 1 g t g a a a a c t c g c t c g a c c g c c c g c g t c c c g c a g g c a g c g a t g a c g t g t g c g t g a c c t g g g
264 1 t g t t t c g t c g a a a g g c c a g c a a c c c c a a a t c g c a g g c g a t c c g g a g a t t g g g a t c t g a t c
270 1 c g a g c t t g g a c c a g a t c c c c c a c g a t g c g g c a c g g g a a c t g c a t c g a c t c g g c g c g g a a c
276 1 c c a g c t t t c g t a a a t g c c a g a t t g g t g t c c g a t a c c t t g a t t t g c c a t c a g c g a a a c a a g
282 1 a c t t c a g c a g c g a g c g t a t t t g g c g g g c g t g c t a c c a g g g t t g c a t a c a t t g c c c a t t t c
288 1 t g t c t g g a c c g c t t t a c c g g c g c a g a g g g t g a g t t g a t g g g g t t g g c a g g c a t c g a a a c g
294 1 c g c g t g c a t g g t g t g t g t g t c t g t t t t c g g c t g c a c a a t t t c a a t a g t c g g a t g g g c g a c
30 01 g g t a g a a t t g g g t g t t g c g c t c g c g t g c a t g c c t c g c c c c g t c g g g t g t c a t g a c c g g g a
30 61 c t g g a a t c c c c c c t c g c g a c c c t c c t g c t a a c g c t c c c g a c t c t c c c g c c c g c g c g c a g g
31 21 a t a g a c t c t a g t t c a a c c a a t c g a c a a c t a g t a a c a a t g g c c a c c g c a t c c a c t t t c t c g
31 81 g c g t t c a a t g c c c g c t g c g g c g a c c t g c g t c g c t c g g c g g g c t c c g g g c c c c g g c g c c c a
32 41 g c g a g g c c c c t c c c c g t g c g c g g g c g c g c c t c c t c c t c c c t g t c c c c c t c c c t g a a g c c c
33 01 a a g t c c a t c c c c a a c g g c g g c t t c c a g g t g a a g g c c a a c g c c t c c g c g c a c c c c a a g g c g
33 61 a a c g g c a g c g c g g t g a c c c t g a a g t c g g g c t c c c t g a a c a c c c a g g a g g a c a c g c t c a g c
34 21 t c g t c c c c c c c c c c c c g c g c g t t c t t c a a c c a g c t g c c c g a c t g g a g c a t g c t g c t g a c c
34 81 g c g a t c a c c a c g g t c t t c g t g g c g c c c g a g a a g c g c t g g a c c a t g t t c g a c c g c a a g t c g
35 41 a a g c g c c c c a a c a t g c t g a t g g a c t c c t t c g g c c t g g a g c g c g t g g t c c a g g a c g g c c t g
36 01 g t g t t c c g c c a g a g c t t c t c g a t c c g c t c c t a c g a g a t c t g c g c g g a c c g c a c c g c g a g c
36 61 a t c g a g a c g g t g a t g a a c c a c g t c c a g g a g a c c t c g c t g a a c c a g t g c a a g t c c a t c g g c
37 21 c t g c t g g a c g a c g g c t t c g g c c g c a g c c c c g a g a t g t g c a a g c g c g a c c t g a t c t g g g t g
37 81 g t c a c c c g c a t g a a g a t c a t g g t g a a c c g c t a c c c c a c g t g g g g c g a c a c c a t c g a g g t c
38 41 t c g a c g t g g c t g t c c c a g a g c g g c a a g a t c g g c g g c g g c c g c g a c t g g c t g a t c t c g g a c
39 01 t g c a a c a c c g g c g a g a t c c t g g t g c g c g c g a c g t c c g t c t a c g c g a t g a t g a a c c a g a a g
39 61 a c c c g c c g c t t c a g c a a g c t g c c c c a c g a g g t g c g c c a g g a g t t c g c g c c c c a c t t c c t g
40 21 g a c t c g c c c c c c g c g a t c g a g g a c a a c g a c g g c a a g c t g c a g a a g t t c g a c g t c a a g a c g
40 81 g g c g a c t c c a t c c g c a a g g g c c t g a c c c c c g g c t g g t a c g a c c t g g a c g t g a a c c a g c a c
41 41 g t g a g c a a c g t c a a g t a c a t c g g c t g g a t c c t g g a g t c g a t g c c c a c c g a g g t c c t g g a g
42 01 a c g c a g g a g c t g t g c t c c c t g a c c c t g g a g t a c c g c c g c g a g t g c g g c c g c g a c t c g g t g
42 61 c t g g a g a g c g t c a c c a g c a t g g a c c c c t c g a a g g t g g g c g a c c g c t t c c a g t a c c g c c a c
43 21 c t g c t g c g c c t g g a g g a c g g c g c g g a c a t c a t g a a g g g c c g c a c c g a g t g g c g c c c c a a g
43 81 a a c g c g g g c a c g a a c g g c g c g a t c t c c a c c g g c a a g a c g a t g g a c t a c a a g g a c c a c g a c
4441 g g c g a c t a c a a g g a c c a c g a c a t c g a c t a c a a g g a c g a c g a c g a c a a g t g a t t a a t t a a c
4501 t c g a g g c a g c a g c a g c t c a g a t a g t a t c g a c a c a c t c t g g a c g c t g g t c g t g t g a t g g a c
4561 t g t t g c c g c c a c a c t t g c t g c c t t g a c c t g t g a a t a t c c c t g c c g c t t t t a t c a a a c a g c
4621 c t c a g t g t g t t t g a t c t t g t g t g t a c g c g c t t t t g c g a g t t g c t a g c t g c t t g t g c t a t t
4681 t g c g a a t a c c a c c c c c a g c a t c c c c t t c c c t c g t t t c a t a t c g c t t g c a t c c c a a c c g c a
4741 a c t t a t c t a c g c t g t c c t g c t a t c c c t c a g c g c t g c t c c t g c t c c t g c t c a c t g c c c c t c
4801 g c a c a g c c t t g g t t t g g g c t c c g c c t g t a t t c t c c t g g t a c t g c a a c c t g t a a a c c a g c a
4861 c t g c a a t g c t g a t g c a c g g g a a g t a g t g g g a t g g g a a c a c a a a t g g a a a g c t t g a g c t c c
4921 a g c g c c a t g c c a c g c c c t t t g a t g g c t t c a a g t a c g a t t a c g g t g t t g g a t t g t g t g t t t
4981 g t t g c g t a g t g t g c a t g g t t t a g a a t a a t a c a c t t g a t t t c t t g c t c a c g g c a a t c t c g g
5041 c t t g t c c g c a g g t t c a a c c c c a t t t c g g a g t c t c a g g t c a g c c g c g c a a t g a c c a g c c g c
5101 t a c t t c a a g g a c t t g c a c g a c a a c g c c g a g g t g a g c t a t g t t t a g g a c t t g a t t g g a a a t
5161 t g t c g t c g a c g c a t a t t c g c g c t c c g c g a c a g c a c c c a a g c a a a a t g t c a a g t g c g t t c c
5221 g a t t t g c g t c c g c a g g t c g a t g t t g t g a t c g t c g g c g c c g g a t c c g c c g g t c t g t c c t g c
5281 g c t t a c g a g c t g a c c a a g c a c c c t g a c g t c c g g g t a c g c g a g c t g a g a t t c g a t t a g a c a
5341 t a a a t t g a a g a t t a a a c c c g t a g a a a a a t t t g a t g g t c g c g a a a c t g t g c t c g a t t g c a a
5401 g a a a t t g a t c g t c c t c c a c t c c g c a g g t c g c c a t c a t c g a g c a g g g c g t t g c t c c c g g c g
5461 g c g g c g c c t g g c tg g g g g g a c a g c t g t t c t c g g c c a t g t g t g t a c g t a g a a g g a t g a a t t
5521 t c a g c t g g t t t t c g t t g c a c a g c t g t t t g t g c a t g a t t t g t t t c a g a c t a t t g t t g a a t g
5581 t t t t t a g a t t t c t t a g g a t g c a t g a t t t g t c t g c a t g c g a c t
SEQ ID N.°:64
Secuencia de nucleótidos de pSZ4440 THI4a5'::CrTUB2_ScSUC2_PmPGH::AMT1-1p_CpSADltp-CpalFATB2_ExtB_Flag_PmEF1::THI4a3'
1 c c c t c a a c t g c g acg c tg g g a a c c t t c t c c gggcaggcga t g t g c g t g g g t t t g c c t c c t
61 t g g c a c g g c t c t a c a c c g t c g a g ta c g c c a tg a g g c g g t g a t g g c t g t g t c g g t t g c c a c
121 t t c g t c c a g a g a cg g c a a g t c g t c c a t c c t c t g c g t g t g t ggcgcgacgc t g c a g c a g t c
181 c c t c t g c a g c a g a t g a g c g t g a c t t t g g c c a t t t c a c g c a c t c g a g t g t a c a c a a t c c a t
241 t t t t c t t a a a g c a a a t g a c t g c t g a t t g a c c a g a t a c t g t a a c g c t g a t t t c g c t c c a g a
301 t c g c a c a g a t a g c g a c c a tg t t g c t g c g t c t g a a a a t c t g g a t t c c g a a t t c g a c c c t g g
361 c g c t c c a t c c a t g c a a c a g a t g g c g a c a c t t g t t a c a a t t c c t g t c a c c c a t c g g c a t g g
421 a g c a g g tc c a c t t a g a t t c c c g a t c a c c c a c g c a c a t c t c g c t a a t a g t c a t t c g t t c g t
481 g t c t t c g a t c a a t c t c a a g t g a g t g t g c a t g g a t c t t g g t t g a c g a t g c g g t a t g g g t t t
541 g c g ccg c tg g c t g c a g g g t c tg c c c a a g g c a a g c t a a c c c a g c t c c t c t c c c c g a c a a t a
601 c t c t c g c a g g c a a a g c c g g t c a c t t g c c t t c c a g a t t g c c a a t a a a c t c a a t t a t g g c c t
661 c t g t c a t g c c a t c c a t g g g t c t g a t g a a t g g t c a c g c t c g t g t c c t g a c c g t t c c c c a g c
721 c t c t g g c g t c c c c t g c c c c g c cc a c c a g c c cacgccgcgc g g c a g t c g c t g c c a a g g c tg
781 t c t c g g a g g t a c c c t t t c t t g c g c t a t g a c a c t t c c a g c a aaa g g ta g g g c g g g c tg cg a
841 g a c g g c t t c c c g g cg c tg c a t g c a a c a c c g a t g a t g c t t c g a cc ccccg a a g c t c c t t c g
901 g g g c t g c a t g g g c g c tc c g a t g c c g c t c c a gggcgagcgc t g t t t a a a t a g ccag g cccc
961 c g a t t g c a a a g a c a t t a t a g c g a g c t a c c a a a g c c a t a t t c a a a c a c c t a g a t c a c t a c c
1021 a c t t c t a c a c a g g c c a c t c g a g c t t g t g a t c g c a c t c c g c t aagggggcg c c t c t t c c t c
1081 t t c g t t t c a g t c a c a a c c c g c a a a c t c t a g a a t a t c a a t g c t g c t g c a g g c c t t c c t g t t
1141 c c t g c t g g c c g g c t t c g c c g c c a a g a t c a g c g c c t c c a t g acgaacgaga c g tc c g a c c g
1201 c c c c c t g g t g c a c t t c a c c c ccaacaaggg c t g g a t g a a c g a cc c ca a cg g c c t g t g g t a
1261 cgacgagaag g a c g c c a a g t g g c a c c t g t a c t t c c a g t a c a ac c cg a a cg a c a c c g t c t g
1321 ggggacgccc t t g t t c t g g g g c ca c g cc a c g tc c g a c g a c c t g a c c a a c t gggaggacca
1381 g c c c a t c g c c a t c g c c c c g a agcgcaacga c t c c g g c g c c t t c t c c g g c t c c a t g g t g g t
1441 g g a c t a c a a c a a c a c c t c c g g c t t c t t c a a c g a c a c c a t c gacccgcgcc a g c g c t g c g t
1501 g g c c a t c t g g a c c t a c a a c a c c c c g g a g tc cgaggagcag t a c a t c t c c t a c a g c c tg g a
156 1 c g g c g g c t a c a c c t t c a c c g a g t a c c a g a a g a a c c c c g t g c t g g c c g c c a a c t c c a c c c a
162 1 g t t c c g c g a c c c g a a g g t c t t c t g g t a c g a g c c c t c c c a g a a g t g g a t c a t g a c c g c g g c
168 1 c a a g t c c c a g g a c t a c a a g a t c g a g a t c t a c t c c t c c g a c g a c c t g a a g t c c t g g a a g c t
174 1 g g a g t c c g c g t t c g c c a a c g a g g g c t t c c t c g g c t a c c a g t a c g a g t g c c c c g g c c t g a t
180 1 c g a g g t c c c c a c c g a g c a g g a c c c c a g c a a g t c c t a c t g g g t g a t g t t c a t c t c c a t c a a
186 1 c c c c g g c g c c c c g g c c g g c g g c t c c t t c a a c c a g t a c t t c g t c g g c a g c t t c a a c g g c a c
192 1 c c a c t t c g a g g c c t t c g a c a a c c a g t c c c g c g t g g t g g a c t t c g g c a a g g a c t a c t a c g c
198 1 c c t g c a g a c c t t c t t c a a c a c c g a c c c g a c c t a c g g g a g c g c c c t g g g c a t c g c g t g g g c
204 1 c t c c a a c t g g g a g t a c t c c g c c t t c g t g c c c a c c a a c c c c t g g c g c t c c t c c a t g t c c c t
210 1 c g t g c g c a a g t t c t c c c t c a a c a c c g a g t a c c a g g c c a a c c c g g a g a c g g a g c t g a t c a a
216 1 c c t g a a g g c c g a g c c g a t c c t g a a c a t c a g c a a c g c c g g c c c c t g g a g c c g g t t c g c c a c
222 1 c a a c a c c a c g t t g a c g a a g g c c a a c a g c t a c a a c g t c g a c c t g t c c a a c a g c a c c g g c a c
228 1 c c t g g a g t t c g a g c t g g t g t a c g c c g t c a a c a c c a c c c a g a c g a t c t c c a a g t c c g t g t t
234 1 c g c g g a c c t c t c c c t c t g g t t c a a g g g c c t g g a g g a c c c c g a g g a g t a c c t c c g c a t g g g
240 1 c t t c g a g g t g t c c g c g t c c t c c t t c t t c c t g g a c c g c g g g a a c a g c a a g g t g a a g t t c g t
246 1 g a a g g a g a a c c c c t a c t t c a c c a a c c g c a t g a g c g t g a a c a a c c a g c c c t t c a a g a g c g a
252 1 g a a c g a c c t g t c c t a c t a c a a g g t g t a c g g c t t g c t g g a c c a g a a c a t c c t g g a g c t g t a
258 1 c t t c a a c g a c g g c g a c g t c g t g t c c a c c a a c a c c t a c t t c a t g a c c a c c g g g a a c g c c c t
264 1 g g g c t c c g t g a a c a t g a c g a e g g g g g t g g a c a a c c t g t t c t a c a t c g a c a a g t t c c a g g t
270 1 g c g c g a g g t c a a g t g a c a a t t g a c g c c c g c g c g g c g c a c c t g a c c t g t t c t c t c g a g g g c
276 1 g c c t g t t c t g c c t t g c g a a a c a a g c c c c t g g a g c a t g c g t g c a t g a t c g t c t c t g g c g c c
282 1 c c g c c g c g c g g t t t g t c g c c c t c g c g g g c g c c g c g g c c g c g g g g g e g e a t t g a a a t t g t t
288 1 g c a a a c c c c a c c t g a c a g a t t g a g g g c c c a g g c a g g a a g g c g t t g a g a t g g a g g t a c a g g
294 1 a g t c a a g t a a c t g a a a g t t t t t a t g a t a a c t a a c a a c a a a g g g t c g t t t c t g g c c a g c g a
300 1 a t g a c a a g a a c a a g a t t c c a c a t t t c c g t g t a g a g g c t t g c c a t c g a a t g t g a g c g g g c g
306 1 g g c c g c g g a c c c g a c a a a a c c c t t a c g a c g t g g t a a g a a a a a c g t g g c g g g c a c t g t c c c
312 1 t g t a g c c t g a a g a c c a g c a g g a g a c g a t c g g a a g c a t c a c a g c a c a g g a t c c c g c g t c t c
318 1 g a a c a g a g c g c g c a g a g g a a c g c t g a a g g t c t c g c c t c t g t c g c a c c t c a g c g c g g c a t a
324 1 c a c c a c a a t a a c c a c c t g a c g a a t g c g c t t g g t t c t t c g t c c a t t a g c g a a g c g t c c g g t
330 1 t c a c a c a c g t g c c a c g t t g g c g a g g t g g c a g g t g a c a a t g a t c g g t g g a g c t g a t g g t c g
336 1 a a a c g t t c a c a g c c t a g g g a t a t c g a g t g c g g a g g g g c c g g c c g a c c t t t t g a t g c c g c a
342 1 a c c a c a c a t a c g t g t t g t t a t a g t c t a g t a g t a c a g t a c t g c a a g c a c c a a c t t g a a c c t
348 1 c a a g a t g g t c c g t c g a c c c a g c t c c a g t t t g c a a c g a a g g t c g g g c g g g t a t t g g a g a t c
354 1 c a g a t c a a a g c g t a a a t g c g a c c c t c t c c c g a a g a g a c t t c a t g c g t g t g t c c t g a a g t g
360 1 c a t g a a a a c a t t c c a g g c a g c g a c t c g t g c t c c a g g c t g g c g t t c t t t g c g a c t t g t t g g
366 1 c c c g c t t c g c a g t c g g a c c t a g g g g c c t g a t t c c g c g g t c g c g t t g a t g a c a c a g a a a c c
372 1 a a c g g a c g a c c c a t g t g a c a c c g g g g a c t g a a t c a c a g c t g c c c c c a g g g g c t a g g g c a t
378 1 t c g a g c t g a t a c a t t g a t a a c g c t a g a c g a a g t g c a c t g c g g c g g t a a a a a g c t c t a t t t
384 1 g t g c c a t c a c a g c g c c t t g c g t g g c t t c a g g a g c g c t t g a c g c g c t g c a t t t c t g a a g t c
390 1 g a a a g c c c t a g t c g c c a g g a g g a g g g t c g a c t c g c c c g c a g t t c g g g a a c g t t t g g a c c a
396 1 c t a g t a t g g c c a c c g c c t c c a c c t t c t c c g c c t t c a a c g c c c g c t g c g g c g a c c t g c g c c
402 1 g c t c c g c c g g c t c c g g c c c c c g c c g c c c c g c c c g c c c c c t g c c c g t g c g c g g c c g c g c c t
408 1 c c t c c c t g t c c g t g c c c t t c a a g c c c a a g t c c a a c c a c a a c g g c g g c t t c c a g g t g a a g g
414 1 c c a a c g c c t c c g c g c a c c c c a a g g c g a a c g g c a g c g c g g t g t c g c t g a a g t c g g g c t c c c
420 1 t g g a g a c c c a g g a g g a c a a g a c g a g c a g c t c g t c c c c c c c c c c c c g c a c g t t c a t c a a c c
426 1 a g c t g c c c g t g t g g a g c a t g c t g c t g t c g g c g g t g a c c a c g g t c t t c g g c g t g g c c g a g a
432 1 a g c a g t g g c c c a t g c t g g a c c g c a a g t c c a a g c g c c c c g a c a t g c t g g t c g a g c c c c t g g
438 1 g c g t g g a c c g c a t c g t c t a c g a c g g c g t g a g c t t c c g c c a g t c g t t c t c c a t c c g c a g c t
444 1 a c g a g a t c g g c g c c g a c c g c a c c g c c t c g a t c g a g a c g c t g a t g a a c a t g t t c c a g g a g a
450 1 c c t c c c t g a a c c a c t g c a a g a t c a t c g g c c t g c t g a a c g a c g g c t t c g g c c g c a c g c c c g
456 1 a g a t g t g c a a g c g c g a c c t g a t c t g g g t c g t g a c c a a g a t g c a g a t c g a g g t g a a c c g c t
462 1 a c c c c a c g t g g g g c g a c a c c a t c g a g g t c a a c a c g t g g g t g a g c g c c t c g g g c a a g c a c g
468 1 g c a t g g g c c g c g a c t g g c t g a t c t c c g a c t g c c a c a c c g g c g a g a t c c t g a t c c g c g c g a
474 1 c g a g c g t c t g g g c g a t g a t g a a c c a g a a g a c c c g c c g c c t g t c g a a g a t c c c c t a c g a g g
480 1 t g c g c c a g g a g a t c g a g c c c c a g t t c g t c g a c t c c g c c c c c g t g a t c g t g g a c g a c c g c a
486 1 a g t t c c a c a a g c t g g a c c t g a a g a c g g g c g a c a g c a t c t g c a a c g g c c t g a c c c c c c g c t
492 1 g g a c g g a c c t g g a c g t g a a c c a g c a c g t c a a c a a c g t g a a g t a c a t c g g c t g g a t c c t g c
498 1 a g t c g g t c c c c a c c g a g g t g t t c g a g a c g c a g g a g c t g t g c g g c c t g a c c c t g g a g t a c c
504 1 g c c g c g a g t g c g g c c g c g a c t c c g t g c t g g a g a g c g t c a c g g c c a t g g a c c c c t c g a a g g
510 1 a g g g c g a c c g c t c c c t g t a c c a g c a c c t g c t g c g c c t g g a g g a c g g c g c g g a c a t c g t g a
5161 a g g g c c g c a c c g a g t g g c g c c c c a a g a a c g c c g g c g c c a a g g g c g c c a t c c t g a c g g g c a
5221 a g a c c a g c a a c g g c a a c t c g a t c t c c a t g g a c t a c a a g g a c c a c g a c g g c g a c t a c a a g g
5281 a c c a c g a c a t c g a c t a c a a g g a c g a c g a c g a c a a g t g a t t a a t t a a c g c c a c c c t g a a g c
5341 c t g t g a a g g a c t t c a c g g c c c a g a t c c a g a c c c t g g a c a t c c c c g g c g a g g t c a a g g c c g
5401 g a t a c t c c c c c a t c g g c t t t g t g c g c t g c g g c c g c t c c g c c t g c c g c a t c t c c a a g a t c a
5461 a c t g g a a g g t c g g c a a g g a g a c c g g t g g c a a g a a g c t g g a g g a g c c c c a c a g c c t c a a g g
5521 c c a a c g a g a t g g c t g a g g t c g t g t t t g a g c c c g t c c a g c c c c t g g t c g t c g a c t c c t t c a
5581 a g a a c t g c g a g g g t c t g t c c c g c a t t g c c t t c c t g g a c g g c a a c a c c g c c g t c a t g c t g g
5641 g c a a g g t g g t c t c c a c c t c c g c c a a g t a g a g a g g g a c a c c t c t t c t t g t c c t c t c t g g a a
5701 a a g c t c g c a t g t g a g t g c c c a c a c g t t c t g t a g a g c t c c a g c g c c a t g c c a c g c c c t t t g
5761 a t g g c t t c a a g t a c g a t t a c g g t g t t g g a t t g t g t g t t t g t t g c g t a g t g t g c a t g g t t t
5821 a g a a t a a t a c a c t t g a t t t c t t g c t c a c g g c a a t c t c g g c t t g t c c g c a g g t t c a a c c c c
5881 a t t t c g g a g t c t c a g g t c a g c c g c g c a a t g a c c a g c c g c t a c t t c a a g g a c t t g c a c g a c
5941 a a c g c c g a g g t g a g c t a t g t t t a g g a c t t g a t t g g a a a t t g t c g t c g a c g c a t a t t c g c g
6001 c t c c g c g a c a g c a c c c a a g c a a a a t g t c a a g t g c g t t c c g a t t t g c g t c c g c a g g t c g a t
6061 g t t g t g a t c g t c g g c g c c g g a t c c g c c g g t c t g t c c t g c g c t t a c g a g c t g a c c a a g c a c
6121 c c t g a c g t c c g g g t a c g c g a g c t g a g a t t c g a t t a g a c a t a a a t t g a a g a t t a a a c c c g t
6181 a g a a a a a t t t g a t g g t c g c g a a a c t g t g c t c g a t t g c a a g a a a t t g a t c g t c c t c c a c t c
6241 c g c a g g t c g c c a t c a t c g a g c a g g g c g t t g c t c c c g g c g g c g g c g c c t g g c t g g g g g g a c
6301 a g c t g t t c t c g g c c a t g t g t g t a c g t a g a a g g a t g a a t t t c a g c t g g t t t t c g t t g c a c a
6361 g c t g t t t g t g c a t g a t t t g t t t c a g a c t a t t g t t g a a t g t t t t t a g a t t t c t t a g g a t g c
6421 a t g a t t t g t c t g c a t g c g a c t
SEQ ID NO:65 - Secuencia de nucleótidos de pSZ4442 THI4a5'::CrTUB2_ScSUC2_PmPGH::PmSAD2-2ver2_CpSAD1tp-CpalFATB2_ExtB_Flag_PmAHCY::THI4a3'
1 c c c t c a a c t g cg acgc tggg a a c c t t c t c c gggcaggcga t g t g c g t g g g t t t g c c t c c t
61 tg g c a c g g c t c t a c a c c g t c g a g ta c g c c a t g a g g c g g t g a t g g c t g t g t c g g t t g c c a c
121 t t c g t c c a g a g acg g c a ag t c g t c c a t c c t c t g c g t g t g t ggcgcgacgc t g c a g c a g t c
181 c c t c t g c a g c a g a t g a g c g t g a c t t t g g c c a t t t c a c g c a c t c g a g t g t a c a c a a t c c a t
241 t t t t c t t a a a g c a a a t g a c t g c t g a t t g a c c a g a t a c t g t a a c g c t g a t t t c g c t c c a g a
301 t c g c a c a g a t a g c g a c c a tg t t g c t g c g t c t g a a a a t c t g g a t t c c g a a t t c g a c c c t g g
361 c g c t c c a t c c a t g c a a c a g a t g g c g a c a c t t g t t a c a a t t c c t g t c a c c c a t c g g c a t g g
421 a g c a g g tc c a c t t a g a t t c c c g a t c a c c c a c g c a c a t c t c g c t a a t a g t c a t t c g t t c g t
481 g t c t t c g a t c a a t c t c a a g t g a g t g t g c a t g g a t c t t g g t tg a c g a t g c g g t a t g g g t t t
541 gcg ccg c tg g c t g c a g g g t c tg c c c a a g g c a a g c t a a c c c a g c t c c t c t c c c c g a c a a t a
601 c t c t c g c a g g c a a a g c c g g t c a c t t g c c t t c c a g a t t g c c a a t a a a c t c a a t t a t g g c c t
661 c t g t c a t g c c a t c c a t g g g t c t g a t g a a t g g t c a c g c t c g t g t c c t g a c c g t t c c c c a g c
721 c t c t g g c g t c c c c t g c c c c g ccc a cc a g cc cacgccgcgc g g c a g t c g c t g c c a a g g c tg
781 t c t c g g a g g t a c c c t t t c t t g c g c t a t g a c a c t t c c a g c a aaagg taggg cgggc tgcga
841 g a c g g c t t c c c g g cg c tg ca t g c a a c a c c g a t g a t g c t t c gaccccccga a g c t c c t t c g
901 g g g c t g c a t g g g cg c tc c g a t g c c g c t c c a gggcgagcgc t g t t t a a a t a gccaggcccc
961 c g a t t g c a a a g a c a t t a t a g c g a g c ta c c a a a g c c a t a t t c a a a c a c c t a g a t c a c t a c c
1021 a c t t c t a c a c a g g c c a c t c g a g c t t g t g a t c g c a c t c c g c taagggggcg c c t c t t c c t c
1081 t t c g t t t c a g t c a c a a c c c g c a a a c t c t a g a a t a t c a a t g c t g c t g c a g g c c t t c c t g t t
1141 c c t g c t g g c c g g c t t c g c c g c c a a g a t c a g c g c c t c c a t g acgaacgaga c g tc c g a c c g
1201 c c c c c t g g t g c a c t t c a c c c ccaacaaggg c t g g a t g a a c gaccccaacg g c c t g t g g t a
1261 cgacgagaag g a c g c c a a g t g g c a c c t g t a c t t c c a g t a c aacccgaacg a c a c c g t c t g
1321 ggggacgccc t t g t t c t g g g g ccacg ccac g t c c g a c g a c c t g a c c a a c t gggaggacca
1381 g c c c a t c g c c a t c g c c c c g a agcgcaacga c tc c g g c g c c t t c t c c g g c t c c a t g g t g g t
1441 g g a c t a c a a c a a c a c c t c c g g c t t c t t c a a c g a c a c c a t c gacccgcgcc a g c g c t g c g t
1501 g g c c a t c t g g a c c t a c a a c a c c c c g g a g tc cgaggagcag t a c a t c t c c t a c a g c c tg g a
156 1 c g g c g g c t a c a c c t t c a c c g a g t a c c a g a a g a a c c c c g t g c t g g c c g c c a a c t c c a c c c a
162 1 g t t c c g c g a c c c g a a g g t c t t c t g g t a c g a g c c c t c c c a g a a g t g g a t c a t g a c c g c g g c
168 1 c a a g t c c c a g g a c t a c a a g a t c g a g a t c t a c t c c t c c g a c g a c c t g a a g t c c t g g a a g c t
174 1 g g a g t c c g c g t t c g c c a a c g a g g g c t t c c t c g g c t a c c a g t a c g a g t g c c c c g g c c t g a t
180 1 c g a g g t c c c c a c c g a g c a g g a c c c c a g c a a g t c c t a c t g g g t g a t g t t c a t c t c c a t c a a
186 1 c c c c g g c g c c c c g g c c g g c g g c t c c t t c a a c c a g t a c t t c g t c g g c a g c t t c a a c g g c a c
192 1 c c a c t t c g a g g c c t t c g a c a a c c a g t c c c g c g t g g t g g a c t t c g g c a a g g a c t a c t a c g c
198 1 c c t g c a g a c c t t c t t c a a c a c c g a c c c g a c c t a c g g g a g c g c c c t g g g c a t c g c g t g g g c
204 1 c t c c a a c t g g g a g t a c t c c g c c t t c g t g c c c a c c a a c c c c t g g c g c t c c t c c a t g t c c c t
210 1 c g t g c g c a a g t t c t c c c t c a a c a c c g a g t a c c a g g c c a a c c c g g a g a c g g a g c t g a t c a a
216 1 c c t g a a g g c c g a g c c g a t c c t g a a c a t c a g c a a c g c c g g c c c c t g g a g c c g g t t c g c c a c
222 1 c a a c a c c a c g t t g a c g a a g g c c a a c a g c t a c a a c g t c g a c c t g t c c a a c a g c a c c g g c a c
228 1 c c t g g a g t t c g a g c t g g t g t a c g c c g t c a a c a c c a c c c a g a c g a t c t c c a a g t c c g t g t t
234 1 c g c g g a c c t c t c c c t c t g g t t c a a g g g c c t g g a g g a c c c c g a g g a g t a c c t c c g c a t g g g
240 1 c t t c g a g g t g t c c g c g t c c t c c t t c t t c c t g g a c c g c g g g a a c a g c a a g g t g a a g t t c g t
246 1 g a a g g a g a a c c c c t a c t t c a c c a a c c g c a t g a g c g t g a a c a a c c a g c c c t t c a a g a g c g a
252 1 g a a c g a c c t g t c c t a c t a c a a g g t g t a c g g c t t g c t g g a c c a g a a c a t c c t g g a g c t g t a
258 1 c t t c a a c g a c g g c g a c g t c g t g t c c a c c a a c a c c t a c t t c a t g a c c a c c g g g a a c g c c c t
264 1 g g g c t c c g t g a a c a t g a c g a e g g g g g t g g a c a a c c t g t t c t a c a t c g a c a a g t t c c a g g t
270 1 g c g c g a g g t c a a g t g a c a a t t g a c g c c c g c g c g g c g c a c c t g a c c t g t t c t c t c g a g g g c
276 1 g c c t g t t c t g c c t t g c g a a a c a a g c c c c t g g a g c a t g c g t g c a t g a t c g t c t c t g g c g c c
282 1 c c g c c g c g c g g t t t g t c g c c c t c g c g g g c g c c g c g g c c g c g g g g g e g e a t t g a a a t t g t t
288 1 g c a a a c c c c a c c t g a c a g a t t g a g g g c c c a g g c a g g a a g g c g t t g a g a t g g a g g t a c a g g
294 1 a g t c a a g t a a c t g a a a g t t t t t a t g a t a a c t a a c a a c a a a g g g t c g t t t c t g g c c a g c g a
300 1 a t g a c a a g a a c a a g a t t c c a c a t t t c c g t g t a g a g g c t t g c c a t c g a a t g t g a g c g g g c g
306 1 g g c c g c g g a c c c g a c a a a a c c c t t a c g a c g t g g t a a g a a a a a c g t g g c g g g c a c t g t c c c
312 1 t g t a g c c t g a a g a c c a g c a g g a g a c g a t c g g a a g c a t c a c a g c a c a g g a t c c c g c g t c t c
318 1 g a a c a g a g c g c g c a g a g g a a c g c t g a a g g t c t c g c c t c t g t c g c a c c t c a g c g c g g c a t a
324 1 c a c c a c a a t a a c c a c c t g a c g a a t g c g c t t g g t t c t t c g t c c a t t a g c g a a g c g t c c g g t
330 1 t c a c a c a c g t g c c a c g t t g g c g a g g t g g c a g g t g a c a a t g a t c g g t g g a g c t g a t g g t c g
336 1 a a a c g t t c a c a g c c t a g g g a t a t c c t g g c t c g g g c c t c g t g c t g g c a c t c c c t c c c a t g c
342 1 c g a c a a c c t t t c t g c t g t c a c c a c g a c c c a c g a t g c a a c g c g a c a c g a c c c g g t g g g a c t
348 1 g a t c g g t t c a c t g c a c c t g c a t g c a a t t g t c a c a a g c g c a t a c t c c a a t c g t a t c c g t t t
354 1 g a t t t c t g t g a a a a c t c g c t c g a c c g c c c g c g t c c c g c a g g c a g c g a t g a c g t g t g c g t g
360 1 a c c t g g g t g t t t c g t c g a a a g g c c a g c a a c c c c a a a t c g c a g g c g a t c c g g a g a t t g g g a
366 1 t c t g a t c c g a g c t t g g a c c a g a t c c c c c a c g a t g c g g c a c g g g a a c t g c a t c g a c t c g g c
372 1 g c g g a a c c c a g c t t t c g t a a a t g c c a g a t t g g t g t c c g a t a c c t t g a t t t g c c a t c a g c g
378 1 a a a c a a g a c t t c a g c a g c g a g c g t a t t t g g c g g g c g t g c t a c c a g g g t t g c a t a c a t t g c
384 1 c c a t t t c t g t c t g g a c c g c t t t a c c g g c g c a g a g g g t g a g t t g a t g g g g t t g g c a g g c a t
390 1 c g a a a c g c g c g t g c a t g g t g t g t g t g t c t g t t t t c g g c t g c a c a a t t t c a a t a g t c g g a t
396 1 g g g c g a c g g t a g a a t t g g g t g t t g c g c t c g c g t g c a t g c c t c g c c c c g t c g g g t g t c a t g
402 1 a c c g g g a c t g g a a t c c c c c c t c g c g a c c c t c c t g c t a a c g c t c c c g a c t c t c c c g c c c g c
408 1 g c g c a g g a t a g a c t c t a g t t c a a c c a a t c g a c a a c t a g t a t g g c c a c c g c c t c c a c c t t c
414 1 t c c g c c t t c a a c g c c c g c t g c g g c g a c c t g c g c c g c t c c g c c g g c t c c g g c c c c c g c c g c
420 1 c c c g c c c g c c c c c t g c c c g t g c g c g g c c g c g c c t c c t c c c t g t c c g t g c c c t t c a a g c c c
426 1 a a g t c c a a c c a c a a c g g c g g c t t c c a g g t g a a g g c c a a c g c c t c c g c g c a c c c c a a g g c g
432 1 a a c g g c a g c g c g g t g t c g c t g a a g t c g g g c t c c c t g g a g a c c c a g g a g g a c a a g a c g a g c
438 1 a g c t c g t c c c c c c c c c c c c g c a c g t t c a t c a a c c a g c t g c c c g t g t g g a g c a t g c t g c t g
444 1 t c g g c g g t g a c c a c g g t c t t c g g c g t g g c c g a g a a g c a g t g g c c c a t g c t g g a c c g c a a g
450 1 t c c a a g c g c c c c g a c a t g c t g g t c g a g c c c c t g g g c g t g g a c c g c a t c g t c t a c g a c g g c
456 1 g t g a g c t t c c g c c a g t c g t t c t c c a t c c g c a g c t a c g a g a t c g g c g c c g a c c g c a c c g c c
462 1 t c g a t c g a g a c g c t g a t g a a c a t g t t c c a g g a g a c c t c c c t g a a c c a c t g c a a g a t c a t c
468 1 g g c c t g c t g a a c g a c g g c t t c g g c c g c a c g c c c g a g a t g t g c a a g c g c g a c c t g a t c t g g
474 1 g t c g t g a c c a a g a t g c a g a t c g a g g t g a a c c g c t a c c c c a c g t g g g g c g a c a c c a t c g a g
480 1 g t c a a c a c g t g g g t g a g c g c c t c g g g c a a g c a c g g c a t g g g c c g c g a c t g g c t g a t c t c c
486 1 g a c t g c c a c a c c g g c g a g a t c c t g a t c c g c g c g a c g a g c g t c t g g g c g a t g a t g a a c c a g
492 1 a a g a c c c g c c g c c t g t c g a a g a t c c c c t a c g a g g t g c g c c a g g a g a t c g a g c c c c a g t t c
498 1 g t c g a c t c c g c c c c c g t g a t c g t g g a c g a c c g c a a g t t c c a c a a g c t g g a c c t g a a g a c g
504 1 g g c g a c a g c a t c t g c a a c g g c c t g a c c c c c c g c t g g a c g g a c c t g g a c g t g a a c c a g c a c
510 1 g t c a a c a a c g t g a a g t a c a t c g g c t g g a t c c t g c a g t c g g t c c c c a c c g a g g t g t t c g a g
5161 acgcaggagc t g t g c g g c c t g a c c c tg g a g t a c c g c c g c g a g tg cg g c c g c g a c t c c g t g
5221 c tg g ag a g c g t c a c g g c c a t g g a c c c c t c g aaggagggcg a c c g c t c c c t g t a c c a g c a c
5281 c t g c t g c g c c tg g a g g ac g g c g c g g a c a t c g tg a a g g g c c g c a c c g a g tg gc g cc c ca a g
5341 aacgccggcg ccaagggcgc c a t c c t g a c g g g caag acca gcaacggcaa c t c g a t c t c c
5401 a t g g a c t a c a a g g accacg a c g g c g a c t a c aag g a c ca c g a c a t c g a c t a c aag g acg ac
5461 g a c g a c a a g t g a t t a a t t a a a tg cg g g g ag tg aag g g g g a ggaaggaggc g tg g c t g g c g
5521 a t c g g g t g g t c g a g a t t g t a g a t t c a c g a t a g g g t t c g t g t g t c t t t g t g a c g c t c a a t c
5581 a a t c g a t c g a t c g a t c t t c c c g a c g c a t a g t c g c c g c c t c t t g t t g t t c c c g t g a a a t a a
5641 a t a t g t a a c c a a t a a a a a c a g a c a c t c t g c a t g g g g c a t a c a t a g a c c g a g g a g t c g t c g
5701 c t c a a a c c t g a t c g c t g c c c c c a g c c a t g t g t c a a g a t g a t a t t t t t c c g t t t c a a a c a c
5761 g g tc g g g ca c c t g g c c c c a c t c t c t a c c t c c a tc g c g a g a c a g t c g t c g g g c tc g c g g c g
5821 a t c g c g g a t c a c a c a c a a t t t a a t c a t g t g c c a c t a t t a g t a t t a c g c g t a c t c a a c a c c
5881 c a c t c c c t a g t a t a c a c a c a c a a c t c g g c a a c c a g c a g a t c a t c c t g t g g t c c c g a g a g c
5941 t c c a g c g c c a t g c c a c g c c c t t t g a t g g c t t c a a g t a c g a t t a c g g t g t t g g a t t g t g t g
6001 t t t g t t g c g t a g t g t g c a t g g t t t a g a a t a a t a c a c t t g a t t t c t t g c t c a c g g c a a t c t
6061 c g g c t t g t c c g c a g g t t c a a c c c c a t t t c g g a g t c t c a g g t c a g c c g c g c a a t g a c c a g c
6121 c g c t a c t t c a a g g a c t t g c a cg ac a ac g c c g a g g t g a g c t a t g t t t a g g a c t t g a t t g g a
6181 a a t t g t c g t c g a c g c a t a t t c g c g c tc c g c g a c a g c a c c c a a g c a a a a t g t c a a g t g c g t
6241 t c c g a t t t g c g t c c g c a g g t c g a t g t t g t g a t c g t c g g c g c c g g a tc c g c c g g t c t g t c c
6301 t g c g c t t a c g a g c t g a c c a a g c a c c c t g a c g t c c g g g t a c g c g ag c tg a g a t t c g a t t a g
6361 a c a t a a a t t g a a g a t t a a a c c c g t a g a a a a a t t t g a t g g t c g c g a a a c tg t g c t c g a t t g
6421 c a a g a a a t t g a t c g t c c t c c a c t c c g c a g g t c g c c a t c a t cgagcagggc g t t g c t c c c g
6481 gcggcggcgc c t g g c t g g g g g g a c a g c t g t t c t c g g c c a t g t g t g t a c g t a g a a g g a tg a
6541 a t t t c a g c t g g t t t t c g t t g c a c a g c t g t t t g t g c a t g a t t t g t t t c a g a c t a t t g t t g a
6601 a t g t t t t t a g a t t t c t t a g g a t g c a t g a t t t g t c t g c a t g c g a c t
SEQ ID NO:66 - KAS_II_genomic_allele_1_-_KASII-allele_1_CDS
ATGCAGACCGCGCACCAGCGGCCCCCGACCGAGGGGCACTGCTTCGGTGCGAGGCTGCCCACGGCGTCG AGGCGGGCGGTGCGCCGGGCATGGTCCCGCATCGCGCGCGCGGCGGCCGCGGCCGACGCAAACCCCGCC CGCCCTGAGCGCCGCGTGGTCATCACGGGCCAGGGCGTGGTGACCAGCCTGGGCCAGACGATCGAGCAG TTTTACAGCAGCCTGCTGGAGGGCGTGAGCGGCATCTCGCAGATACAGAAGTTCGACACCACGGGCTAC ACGACGACGATCGCGGGCGAGATCAAGTCGCTGCAGCTGGACCCGTACGTGCCCAAGCGCTGGGCGAAG CGCGTGGACGACGTGATAAAGTACGTCTACATCGCGGGCAAGCAGGCGCTGGAGAGCGCCGGCCTGCCG ATCGAGGCGGCGGGGCTGGCGGGCGCGGGGCTGGACCCGGCGCTGTGCGGCGTGCTCATCGGCACCGCC ATGGCGGGCATGACGTCTTTCGCGGCGGGCGTGGAGGCGCTGACGCGCGGCGGCGTGCGCAAGATGAAC CCCTTTTGCATCCCCTTCTCCATCTCCAACATGGGCGGCGCGATGCTGGCGATGGACATCGGCTTCATG GGCCCCAACTACTCCATCTCCACGGCCTGCGCGACGGGCAACTACTGCATCCTGGGCGCGGCGGACCAC
ATCCGGCGCGGCGACGCAAACGTGATGCTGGCCGGCGGCGCGGACGCGGCCATCATCCCCTCGGGCATC GGCGGCTTCATCGCGTGCAAGGCGCTGAGCAAGCGCAACGACGAGCCCGAGCGCGCGAGCCGGCCCTGG GACGCCGACCGCGACGGCTTCGTCATGGGCGAGGGCGCCGGCGTGCTGGTGCTGGAGGAGCTGGAGCAC GCCAAGCGCCGCGGCGCGACCATTTTGGCTGAATTAGTTGGCGGCGCGGCCACCTCGGACGCGCACCAC ATGACCGAGCCCGACCCGCAGGGCCGCGGCGTGCGCCTCTGCCTCGAGCGCGCGCTCGAGCGCGCGCGC CTCGCGCCCGAGCGCGTCGGCTACGTCAACGCGCACGGCACCAGCACGCCCGCGGGCGACGTGGCCGAG TACCGCGCCATCCGCGCCGTCATCCCGCAGGACTCACTACGCATCAACTCCACAAAGTCCATGATCGGG CACCTGCTCGGCGGCGCCGGCGCGGTCGAGGCCGTGGCCGCCATCCAGGCCCTGCGCACCGGCTGGCTC CACCCCAACTTGAACCTCGAGAACCCCGCGCCTGGCGTCGACCCCGTCGTGCTCGTGGGGCCGCGGAAG GAGCGCGCCGAAGACCTGGACGTCGTCCTCTCCAACTCCTTTGGCTTTGGCGGGCACAATTCGTGCGTC AT C T T C C GAAAGTAC GAC GAGT GA
SEQ ID NO:67 - KAS_II_genomic_allele_1_-_KASII-allele_1_CDS_translation
MQTAHQRPPTEGHCFGARLPTASRRAVRRAWSRIARAAAAADANPARPERRWITGQGWTSLGQTIEQ FYSSLLEGVSGISQIQKFDTTGYTTTIAGEIKSLQLDPYVPKRWAKRVDDVIKYVYIAGKQALESAGLP IEAAGLAGAGLDPALCGVLIGTAMAGMTSFAAGVEALTRGGVRKMNPFCIPFSISNMGGAMLAMDIGFM GPNYSISTACATGNYCILGAADHIRRGDANVMLAGGADAAIIPSGIGGFIACKALSKRNDEPERASRPW DADRDGFVMGEGAGVLVLEELEHAKRRGATILAELVGGAATSDAHHMTEPDPQGRGVRLCLERALERAR LAPERVGYVNAHGTSTPAGDVAEYRAIRAVIPQDSLRINSTKSMIGHLLGGAGAVEAVAAIQALRTGWL HPNLNLENPAPGVDPWLVGPRKERAEDLDWLSNSFGFGGHNSCVIFRKYDE
Claims (10)
1. Método para producir una cepa de microalgas mejorada que tiene al menos una mejora del 5 % en el contenido de aceite con respecto a una cepa de microalgas original, donde el método comprende cultivar una cepa de microalgas original en presencia de un inhibidor de un transportador de monosacáridos y aislar una cepa de microalgas mejorada que es capaz de crecer en presencia del inhibidor del transportador de monosacáridos y que tiene al menos una mejora del 5 % en el contenido de aceite en comparación con una cepa de microalgas original.
2. Método según la reivindicación 1, en el que el inhibidor del transportador de monosacáridos se selecciona del grupo que consiste en florizina, citocalasina B, 2-desoxiglucosa, digoxina y ouabaína.
3. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la cepa original se mutageniza antes o en cualquier punto o continuamente durante el cultivo mediante exposición a un mutágeno químico, UV, rayos X, rayos gamma u otra radiación electromagnética o de partículas.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la cepa de microalgas mejorada es capaz de producir:
a) de un 10 a un 90 % de triglicéridos por peso en seco de las células; y/o
b) al menos un 50 % de triglicéridos por peso en seco de las células.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la cepa de microalgas mejorada es:
a) de una especie que no sea una especie marina o halófila; y/o
b) de una especie del género Prototheca o Chlorella, opcionalmente donde la especie es Prototheca moriformis o Chlorella protothecoides.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la cepa de microalgas mejorada es una cepa modificada genéticamente, en el que:
a) la cepa de microalgas comprende al menos un gen de biosíntesis de ácidos grasos exógeno, opcionalmente en el que la cepa de microalgas comprende uno o más de un gen exógeno seleccionado del grupo que consiste en una acil-ACP tioesterasa, una desaturasa de ácido graso y una p-cetoacil-ACP sintasa (KAS); o
b) la microalga se manipula genéticamente para producir una longitud de cadena de ácidos grasos y/o una distribución de la saturación alteradas a través de uno o más de la introducción de un gen que codifica una tioesterasa exógena activa, la introducción de un gen que codifica una desaturasa de ácido graso exógena activa, la introducción de un gen que codifica una p-cetoacil-ACP sintasa exógena activa (KAS), la supresión de una tioesterasa endógena o la supresión de una desaturasa de ácido graso endógena.
7. Método según la reivindicación 6, en el que la acil-ACP tioesterasa exógena:
a) procede de una planta seleccionada del grupo que consiste en Cuphea palustris, Cinnamomum camphora, Umbellularia califomica, Cuphea hookeriana, Cuphea lanceolata, Iris germanica, Myristica fragrans y Ulmus Americana;
b) tiene al menos aproximadamente un 60 % de identidad de secuencia con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 21, SEQ ID N.°: 15, SEQ ID N.°: 17, SEQ ID N.°: 19, SEQ ID N.°: 23, SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 27, SEQ ID N°: 29 y SEQ ID N°: 31; y/o
c) está codificada por un polinucleótido que tiene al menos aproximadamente un 60 % de identidad de secuencia con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 22, SEQ ID N.°: 16, SEQ ID N.°: 18, SEQ ID N.°: 20, SEQ ID N°: 24, SEQ ID N°: 26, SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 30 y SEQ ID N°: 32.
8. Método según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el que la desaturasa de ácido graso exógena se selecciona del grupo que consiste en estearoil-ACP desaturasa 2B (SAD2B), desaturasa de ácido graso delta 12 (A12FAD) y estearoil-ACP desaturasa 2A (SAD2A).
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que:
a) la p-cetoacil-ACP sintasa (KAS) está codificada por un polinucleótido que tiene al menos aproximadamente un 60 % de identidad de secuencia con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 66 y la SEQ ID N.°: 68; y/o
b) la supresión de una desaturasa endógena se logra mediante la introducción de un polinucleótido que tiene al menos aproximadamente un 60 % de identidad de secuencia con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID N.°: 42, la SEQ ID N.°: 45 y la SEQ ID N.°: 48.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que la ingeniería genética se realiza:
a) antes de exponer la cepa original de microalgas al inhibidor de un transportador de monosacáridos o al inhibidor de una p-cetoacil-ACP sintasa (KAS) o de una reductasa de proteína portadora de enoil:acilo (ACP); o b) después de exponer la cepa original de microalgas al inhibidor de un transportador de monosacáridos o al inhibidor de una (3-cetoacil-ACP sintasa (KAS) o de reductasa de proteína portadora de enoil:acilo (ACP).
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562141167P | 2015-03-31 | 2015-03-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2908296T3 true ES2908296T3 (es) | 2022-04-28 |
Family
ID=55745842
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES18199852T Active ES2908296T3 (es) | 2015-03-31 | 2016-03-30 | Microalgas adaptadas a condiciones de cultivo heterótrofas |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11352602B2 (es) |
| EP (2) | EP3277793A1 (es) |
| CN (1) | CN107889502A (es) |
| AU (1) | AU2016243648A1 (es) |
| BR (1) | BR112017020906A2 (es) |
| CA (1) | CA2981278A1 (es) |
| ES (1) | ES2908296T3 (es) |
| MX (1) | MX2017012554A (es) |
| WO (1) | WO2016160999A1 (es) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110184379B (zh) * | 2019-06-06 | 2022-12-27 | 武汉市农业科学院 | 一种中型无绿藻分子生物学鉴定方法及应用 |
| CN110241047B (zh) * | 2019-06-27 | 2021-02-02 | 浙江大学 | 一种利用三氯生筛选直线形螺旋藻藻丝的方法 |
| CN118124217A (zh) | 2019-12-18 | 2024-06-04 | 格纹蛱蝶公司 | 微生物衍生材料在聚合物应用中的用途 |
| WO2023043945A2 (en) | 2021-09-17 | 2023-03-23 | Checkerspot, Inc. | High oleic oil compositions and uses thereof |
| WO2023091669A1 (en) | 2021-11-19 | 2023-05-25 | Checkerspot, Inc. | Recycled polyurethane formulations |
| WO2023102069A1 (en) | 2021-12-01 | 2023-06-08 | Checkerspot, Inc. | Polyols, polyurethane dispersions, and uses thereof |
| TWI869104B (zh) * | 2023-12-11 | 2025-01-01 | 南亞塑膠工業股份有限公司 | 藍綠菌的培養方法 |
Family Cites Families (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7135290B2 (en) | 2003-04-12 | 2006-11-14 | Solazyme, Inc. | Methods and compositions for evolving hydrogenase genes |
| CN101765661B (zh) | 2007-06-01 | 2014-08-06 | 索拉兹米公司 | 在微生物中生产油 |
| DE202007015084U1 (de) | 2007-10-30 | 2009-03-12 | Seda S.P.A., Arzano | Behälter |
| FR2924126B1 (fr) * | 2007-11-28 | 2011-04-15 | Roquette Freres | Nouveau procede de culture d'une microalgue heterotrophe |
| KR101607235B1 (ko) | 2008-04-09 | 2016-03-29 | 솔라짐, 인코포레이티드 | 미생물 바이오매스 및 미생물 오일의 직접적인 화학적 개질 |
| US8278090B1 (en) | 2008-07-03 | 2012-10-02 | Solazyme, Inc. | Heterotrophic cultivation of hydrocarbon-producing microalgae |
| MX352984B (es) | 2008-10-14 | 2017-12-15 | Terravia Holdings Inc | Composiciones alimenticias a partir de biomasa de microalgas. |
| US20110264155A1 (en) | 2008-10-14 | 2011-10-27 | Cochlear Americas | Implantable hearing prosthesis |
| US8735140B2 (en) * | 2008-11-07 | 2014-05-27 | Kuehnle Agrosystems, Inc. | Preservation and composition of bioprocess algae for production of lipids, seedstock, and feed |
| KR101763878B1 (ko) | 2008-11-28 | 2017-08-01 | 테라비아 홀딩스 인코포레이티드 | 종속영양성 미생물에서 맞춤 오일의 생성 |
| WO2010127182A1 (en) * | 2009-04-29 | 2010-11-04 | Evolugate, Llc | Adapting microorganisms for agricultural products |
| CN102656267B (zh) * | 2009-09-15 | 2015-11-25 | 蓝宝石能源公司 | 耐盐生物 |
| AU2010226882A1 (en) | 2009-10-01 | 2011-04-21 | George Tsohas | Method and system for enabling the design, manufacture, and/or acquisition of custom made jewellery |
| CA2776388A1 (en) | 2009-10-02 | 2011-04-07 | Newcastle Innovation Limited | Supercapacitor electrodes |
| JP5996527B2 (ja) | 2010-05-28 | 2016-09-21 | テラヴィア ホールディングス， インコーポレイテッド | 用途に応じた油を含む食品成分 |
| MX354145B (es) * | 2010-11-03 | 2018-02-14 | Terravia Holdings Inc | Aceites microbianos con puntos de fluidez reducidos, fluidos dielectricos producidos a partir de estos y metodos relacionados. |
| JP2014509188A (ja) * | 2011-01-28 | 2014-04-17 | アルガサイツ リミテッド | 微細藻類、藍藻類及びそれらの代謝産物の産生のためのプロセス |
| AU2012212079B2 (en) | 2011-02-02 | 2016-07-28 | Corbion Biotech, Inc. | Tailored oils produced from recombinant oleaginous microorganisms |
| WO2013005209A2 (en) * | 2011-07-04 | 2013-01-10 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Enhanced lipid production by algae |
| US10041096B2 (en) * | 2011-11-11 | 2018-08-07 | The Texas A&M University System | Methods and products for generating oils |
| US8778643B2 (en) * | 2012-03-15 | 2014-07-15 | The Regents Of The University Of California | Methods for increasing lipid levels and producing triacylglycerols in algae |
| SG11201406711TA (en) | 2012-04-18 | 2014-11-27 | Solazyme Inc | Tailored oils |
| BR112015008824B1 (pt) * | 2012-10-19 | 2022-11-29 | Indian Oil Corporation Limited | Processo de melhoria de biomassa e teor de lipídios de microalgas |
| US20140113340A1 (en) * | 2012-10-19 | 2014-04-24 | Masdar Institute Of Science And Technology | High salinity tolerant microalgae strains, products derived therefrom, and methods of producing the same |
| CN104968788A (zh) * | 2012-12-07 | 2015-10-07 | 索拉兹米公司 | 包括原始小球藻脂质途径基因的基因工程化微生物菌株 |
| MX369685B (es) * | 2013-10-04 | 2019-11-19 | Terravia Holdings Inc | Aceites adaptables. |
| CN104277976A (zh) * | 2014-10-22 | 2015-01-14 | 临沂大学 | 盐生杜氏藻提纯和驯化方法 |
-
2016
- 2016-03-30 MX MX2017012554A patent/MX2017012554A/es unknown
- 2016-03-30 EP EP16715970.6A patent/EP3277793A1/en not_active Withdrawn
- 2016-03-30 WO PCT/US2016/025023 patent/WO2016160999A1/en not_active Ceased
- 2016-03-30 EP EP18199852.7A patent/EP3447124B1/en not_active Not-in-force
- 2016-03-30 ES ES18199852T patent/ES2908296T3/es active Active
- 2016-03-30 BR BR112017020906A patent/BR112017020906A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2016-03-30 CN CN201680033198.0A patent/CN107889502A/zh active Pending
- 2016-03-30 AU AU2016243648A patent/AU2016243648A1/en not_active Abandoned
- 2016-03-30 CA CA2981278A patent/CA2981278A1/en not_active Abandoned
- 2016-03-30 US US15/562,356 patent/US11352602B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2981278A1 (en) | 2016-10-06 |
| CN107889502A (zh) | 2018-04-06 |
| US20180163170A1 (en) | 2018-06-14 |
| WO2016160999A1 (en) | 2016-10-06 |
| EP3447124B1 (en) | 2021-12-22 |
| BR112017020906A2 (pt) | 2018-07-10 |
| AU2016243648A1 (en) | 2017-11-02 |
| EP3447124A1 (en) | 2019-02-27 |
| EP3277793A1 (en) | 2018-02-07 |
| US11352602B2 (en) | 2022-06-07 |
| MX2017012554A (es) | 2018-04-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2908296T3 (es) | Microalgas adaptadas a condiciones de cultivo heterótrofas | |
| Zang et al. | Optimum conditions for transformation of Synechocystis sp. PCC 6803. | |
| US9649368B2 (en) | Genetically engineered microbial strains including prototheca lipid pathway genes | |
| EP3167053B1 (en) | Novel ketoacyl acp synthase genes and uses thereof | |
| CN104968788A (zh) | 包括原始小球藻脂质途径基因的基因工程化微生物菌株 | |
| US10125382B2 (en) | Acyl-ACP thioesterases and mutants thereof | |
| CN110423705A (zh) | 用于通过添加交替电子受体改善微生物中的产品收率和产量的方法 | |
| WO1998046776A9 (en) | Plant fatty acid synthases and use in improved methods for production of medium-chain fatty acids | |
| EP2970926B1 (en) | Engineering microorganisms | |
| US9850291B2 (en) | Genes encoding novel lipid transporters and their use to increase oil production in vegetative tissues of plants | |
| Jha et al. | Cloning and functional expression of an acyl-ACP thioesterase FatB type from Diploknema (Madhuca) butyracea seeds in Escherichia coli | |
| US20160251685A1 (en) | Thioesterases and cells for production of tailored oils | |
| Zhang et al. | Manipulation of triacylglycerol biosynthesis in Nannochloropsis oceanica by overexpressing an Arabidopsis thaliana diacylglycerol acyltransferase gene | |
| CA2991707C (en) | Enhancing microbial metabolism of c5 organic carbon | |
| CN116848228A (zh) | 具有高脂质生产率的重组藻类 | |
| US9290782B2 (en) | Modified algae for improved biofuel productivity | |
| CN111433219A (zh) | 通过基因修饰信号传导蛋白提高藻类脂质生产力 | |
| Maali et al. | Acyl-lipid∆ 12-desaturase of the cyanobacterium increases the unsaturation degree in transgenic potato (Solanum tuberosum L.) | |
| CN110168096A (zh) | 生产八氢番茄红素的方法 | |
| WO2024097353A1 (en) | Recombinant algae having high biomass and lipid productivity | |
| HK1220485B (en) | Engineering microorganisms | |
| WO2012108740A2 (en) | Mutant microorganism with enhanced sugar utilization and methods for preparing the same |