ES2907844T3 - Vesícula que incorpora una proteína transmembrana - Google Patents

Abstract

Una vesícula que incorpora una proteína transmembrana, en donde el material formador de vesículas comprende una mezcla de poli(etilenglicol)-bloque-poli(propilenglicol)-bloque-poli(etilenglicol) y polieteramina.

Description

DESCRIPCIÓN

Vesícula que incorpora una proteína transmembrana

Campo técnico

La descripción se relaciona con una vesícula que incorpora una proteína transmembrana, un método para preparar vesículas que incorporan una proteína transmembrana, una membrana de separación que comprende una vesícula que incorpora una proteína transmembrana y un método para preparar una capa compuesta de una película delgada que inmoviliza vesículas que incorporan una proteína transmembrana en una membrana de sustrato porosa.

Antecedentes de la invención

Los polimerosomas o vesículas poliméricas son estructuras autoensambladas formadas por copolímeros de bloques anfifílicos en un solvente adecuado (por ejemplo, agua), y presentan una cavidad interior vacía rodeada por una pared bicapa que puede incorporar varias estructuras, como proteínas transmembrana. La estabilidad de las vesículas de polímero aumenta con el peso molecular del polímero que las forman y su permeabilidad con el aumento de la relación hidrófila a hidrófoba. Los copolímeros en bloque de polioxietileno-polioxipropileno-polioxietileno (PEO-PPO-PEO), comúnmente conocidos como Pluronic, con valores bajos de relación hidrófila a hidrófoba pueden formar vesículas y, por lo tanto, son adecuados para obtener membranas permeables. Desafortunadamente, no son fáciles de autoensamblar por disolución directa. El ensamble en dispositivos microfluídicos es más adecuado (Debora F. do Nascimento y otros, Microfluidic Fabrication of Pluronic Vesicleswith Controlled Permeability Langmuir2016, 32, 5350­ 5355). Además, se sabe que los Pluronics con una relación PPO/PEO muy alta (por ejemplo, 68/10) se autoensamblan en estructuras vesiculares de alrededor de 100 nm, que no son muy estables. Incluso cuando se estabilizan a través de una red de interpenetración permanente (IPN) de tetraacrilato de pentaeritritol polimerizado (PETA), tienen una vida útil no superior a un mes. (Feng Li, Pluronic polymersomes stabilized by core cross-linked polymer micelles, Soft Matter, 2009, 5, 4042-4046).

Pluronics con una relación PPO/PEO pequeña pueden autoensamblarse en presencia de tensoactivos aniónicos o sales inorgánicas (como dodecilsulfato de sodio o NaF) formando estructuras entre 800 nm y 3000 nm. (Li, F.; Ketelaar, T.; Marcelis, A. T. M.; Leermakers, F. A. M.; Stuart, M. A. C.; Sudholter, E. J. R., Stabilization of polymersome vesicles by an interpenetrating polymer network. Macromolecules 2007, 40 (2), 329-333.; Chen, S.; Yang, B.; Guo, C.; Ma, J. H.; Yang, L. R.; Liang, X. F.; Hua, C.; Liu, H. Z., Spontaneous Vesicle Formation of Poly(ethylene oxide)-Poly(propylene oxide)-Poly(ethylene oxide) Triblock Copolymer. Journal of Physical Chemistry B 2008, 112 (49), 15659-15665.).

Los Pluronics se consideran no tóxicos y se usan ampliamente en los sistemas de administración de fármacos y proporcionan interesantes oportunidades para la terapia génica. (Feng Li, Pluronic polymersomes stabilized by core cross-linked polymer micelles, Soft Matter, 2009, 5, 4042-4046). Muchos estudios han demostrado el uso potencial de Pluronics como adyuvante para aumentar las respuestas inmunitarias tanto mediadas por células como mediadas por anticuerpos cuando se usa con un amplio espectro de antígenos (Jain-Gupta N, y otros, Pluronic P85 enhances the efficacy of outer membrane vesicles as a subunit vaccine against Brucella melitensis challenge in mice, FEMS Immunol Med Microbiol 66 (2012) 436-444).

Más estudios describen la capacidad del poloxámero para autoensamblarse en micelas capaces de incluir varios fármacos más hidrófobos y transportarlos en el cuerpo humano (Yapar AE, Inal O, Poly(ethylene oxide)-Poly(propylene oxide)-Based Copolymers for Transdermal Drug Delivery: An Overview, Trop J Pharm Res, October2012;11 (5) :855; Kamboj VK, Verma PK, Poloxamers based nanocarriers for drug delivery system, Der Pharmacia Lettre, 2015, 7 (2) :264-269,Batrakova EV y otros, Polymer Micelles as Drug Carriers). Los copolímeros en bloque, incluidos los Pluronics como los pluronics-copolímero poliláctico, se autoensamblan en vesículas que pueden cargar y transportar diversos cargamentos (por ejemplo, insulina) (Xiong XY Vesicles from Pluronic/poly(lactic acid) block copolymers as new carriers for oral insulin delivery, Journal of Controlled Release 120 (2007)11-17).

Pluronics puede exhibir actividad biológica, incluidos los efectos sobre la mejora de la captación celular de ADN, la translocación nuclear y la expresión génica. Los Pluronics con un mayor valor de balance hidrófilo-lipófilo conducen a una distribución homogénea en el citoplasma; aquellos con un valor de balance hidrófilo-lipófilo más bajo prefieren localizarse en el núcleo (FanW y otros, Degradable gene delivery systems based on Pluronics-modified low-molecularweight polyethyleneimine: preparation, characterization, intracellular trafficking, and cellular distribution, International Journal of Nanomedicine 2012:7 1127-1138).

Las vesículas que comprenden proteínas transmembrana, como las acuaporinas, pueden usarse para fabricar membranas que tienen acuaporinas inmovilizadas para aplicaciones como la purificación de agua (WO2006/122566) o la generación de energía de salinidad (WO2007/033675). Las vesículas se depositan generalmente en forma de capa o película sobre un sustrato de soporte, lo que permite el paso selectivo de moléculas de agua a través de las membranas mediante nanofiltración, ósmosis inversa, ósmosis directa u ósmosis retardada por presión.

WO2013/043118 describe membranas compuestas de película delgada (TFC) en las que se inmovilizan vesículas que incorporan canales de agua acuaporina (AQP). Adicionalmente, describe un método de producción de membranas compuestas de películas delgadas y sus usos en procesos de filtración, tales como procesos de nanofiltración y filtración osmótica. WO2010/146365 describe la preparación de membranas de filtración TFC-acuaporina-Z (AqpZ) que usan un copolímero tribloque anfifílico como sustancia formadora de vesículas para incorporar AQP inmovilizadas. WO2014/108827 describe un módulo de fibra hueca (HF) que tiene fibras modificadas con una capa compuesta de película delgada (TFC) que comprende canales de agua acuaporina en los que los canales de agua acuaporina pueden incorporarse en vesículas copoliméricas de bloque o lípido antes de la incorporación en la capa de TFC. Sin embargo, típicamente en el estado de la técnica, los lípidos anfifílicos y los copolímeros en bloque usados en la producción de vesículas son sólidos que deben disolverse en solventes agresivos, como el tetraclorometano (CCU) o cloroformo (CHCh), para solubilizar sus porciones predominantemente hidrófobas. En la síntesis de membranas, este solvente se evapora para permitir la formación de películas que después se rehidratan para atraer a los anfifilos hacia varias formas de emulsión (tal como vesículas), con la incorporación simultánea de la proteína de membrana AQP. Sería conveniente desarrollar un proceso que use solventes que tengan un menor impacto ambiental.

Las membranas industriales pueden tratarse a temperaturas elevadas durante el proceso de separación o el proceso de limpieza. Cuando la membrana se usa para el tratamiento de alimentos tales como productos lácteos, generalmente se desea desinfectar las membranas para evitar el desarrollo de microorganismos. Las membranas de la técnica anterior que tienen vesículas incorporadas tienden a deteriorarse rápidamente cuando se exponen a temperaturas elevadas. En un aspecto de la presente invención, el objeto es desarrollar vesículas para su incorporación en membranas, que muestren una mayor estabilidad a la temperatura, manteniendo al mismo tiempo una adecuada permeabilidad al agua después de un tratamiento a una temperatura elevada.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a una vesícula que incorpora una proteína transmembrana, en donde el material que forma la membrana de la vesícula comprende una mezcla de poli(etilenglicol)-b/oque-poli(propilenglicol)-bloquepoli(etilenglicol) y polieteramina.

La vesícula de acuerdo con la invención generalmente resiste temperaturas elevadas sin una contracción sustancial del diámetro. La baja contracción del diámetro de la vesícula da como resultado una alta estabilidad dimensional mecánica de la membrana, lo que a su vez proporciona una larga vida útil. Además, la baja contracción mantiene la permeabilidad al agua prácticamente inalterada.

El bloque de poli(etilenglicol)-poli(propilenglicol)-b/oque- el poli(etilenglicol) normalmente es un polímero sustancialmente lineal que tiene un peso molecular promedio en peso de entre aproximadamente 1o0o Da a aproximadamente 15 000 Da, tal como un peso molecular promedio entre aproximadamente 2500 Da a aproximadamente 10000 Da. En cierto aspecto, el peso molecular promedio en peso está por encima de 3000 Da, como por ejemplo por encima de 4000 Da y preferentemente por encima de 5000 Da. Sin embargo, normalmente, el peso molecular promedio en peso de este aspecto no es superior a 8000 Da, tal como no superior a 7000 Da, y preferentemente no superior a 6000 Da. En un aspecto preferido, el peso molecular promedio en peso es de alrededor de 5800 Da.

El poli(etilenglicol)-b/oque-poli(propilenglicol)-b/oque-poli(etilenglicol) puede tener diferente composición y proporción de los bloques pero, generalmente, el compuesto puede estar representado por la fórmula química:

en la que

x denota un número entero entre 10-30

y denota un número entero entre 50-100

z denota un número entero entre 10-30

En una determinada modalidad de la invención, x indica un número entero entre 15 y 25, e indica un número entero entre 60 y 80 y z indica un número entero entre 15 y 25. En una determinada implementación de la invención, x e y tienen el mismo significado. Además, x y zson preferentemente alrededor de 20 y es alrededor de 70. Este compuesto está disponible como Pluronic P-123. En una modalidad alternativa, x y z están en el intervalo de 30-200 e y está en el intervalo de 40-60. Un ejemplo concreto de acuerdo con esta modalidad alternativa es el poloxámero 407 (nombre comercial BASF: Pluronic Fl27), en el que x = z = 101 e y = 56.

La polieteramina normalmente contiene uno o más grupos amino primarios unidos a un esqueleto de poliéter. El esqueleto de poliéter se basa normalmente en óxido de propileno (PO) o una mezcla de óxido de propileno (PO) y óxido de etileno (EO). Cuando se usa una mezcla de óxido de propileno (PO) y óxido de etileno (EO), la relación molar PO/EO suele ser superior a 1, es decir, la polieteramina se basa predominantemente en polipropilenglicol (PPG). En un aspecto preferido, la relación molar PO/EO suele ser superior a 2, como superior a 3.

La cadena principal de poliéter puede contener de 1 a 3 grupos amino, es decir, el poliéter es una monoamina, diamina o triamina. En un aspecto preferido de la invención, la poliéter amina es una monoamina. Cuando se aplica una mezcla de óxido de propileno (PO) y óxido de etileno (EO), el grupo amino se coloca predominantemente al final de la parte de la molécula de óxido de propileno (PO).

El peso molecular de la poliéteramina generalmente oscila entre 500 y 5000 Da. En cierto aspecto de la invención, el peso molecular es de 1000 a 4000 Da, tal como 1500 a 3000 Da. En un aspecto preferido de la invención, el peso molecular de la polieteramina es de alrededor de 2000 Da.

En una determinada modalidad de la invención, la polieteramina tiene la estructura general

en la que

m es un número entero de 1-15

n es un número entero de 5-50

R es CH3.

En cierto aspecto de la invención, la relación n/m es 1 o más, como 2 o 3 o más. Más adecuado, m designa un número entero de 2 a 10, como 4 - 8. Lo más preferido alrededor de 6. n está adecuadamente en el intervalo de 10 a 40, como en el intervalo de 25 a 35.

La proporción entre el poli(etilenglicol)-b/oque-poli(propilenglicol)-b/oque-poli(etilenglicol) y la polieteramina se pueden seleccionaren amplios intervalos. Por lo general, sin embargo, la proporción en peso entre el poli(etilenglicol)-b/oquepoli(propilenglicol)-b/oque-poli(etilenglicol) y la polieteramina es de 5 a 1.

Actualmente se cree que el poli(etilenglicol)-b/oque-poli(propilenglicol)-b/oquepoli(etilenglicol) forma la cadena principal de la vesícula, en la que las unidades de propilenglicol se ensamblan en un dominio hidrófobo y el etilenglicol sobresale hacia el espacio extravesicular. La parte hidrófoba de la polieteramina anclará la molécula en la vesícula, lo que dará como resultado que los grupos amino sobresalgan hacia el espacio extravesicular. Así, se puede decir que la polieteramina decora la superficie de las vesículas con grupos amino.

Las proteínas transmembrana abarcan en su entorno natural toda la membrana bilipídica, es decir, desde el interior de la célula hasta el espacio extracelular. Muchas de las proteínas transmembrana funcionan como puertas de entrada para sustancias específicas, de esta manera permite el intercambio de estas sustancias entre el interior de la célula y el líquido extracelular. Un rasgo característico de las proteínas transmembrana es la presencia de un área hidrófoba, que asegurará la integración de la proteína transmembrana en la membrana. La proteína transmembrana tiene además segmentos hidrófilos a ambos lados de la zona de fibra hueca, estando dichos segmentos hidrófilos dirigidos al interior de la célula y al líquido extracelular, respectivamente. En la presente invención, la proteína transmembrana se incorpora a la parte hidrófoba de las vesículas.

Aunque cualquier proteína transmembrana puede incorporarse en el material de membrana descrito en la presente invención, generalmente se desea usar proteína transmembrana que transporte iones (canales iónicos) y agua (canales de agua acuaporina). Los canales iónicos incluyen canales de cloruro y transportadores de iones metálicos. Los canales de cloruro además del ion cloruro también conducen HCO3-, I-, SCN-, y NO3- en algunas proteínas transmembrana. Los transportadores de iones metálicos incluyen transportadores de magnesio, canales de iones potasio, canales de iones sodio, canales de calcio, canales de protones, etc.

En una modalidad preferida de la invención, la proteína transmembrana es un canal de agua acuaporina. Los canales de agua acuaporina facilitan el transporte de agua dentro o fuera de una célula. En una membrana industrial, los canales de agua acuaporina aseguran el flujo de agua por ósmosis, mientras que otros solutos en la solución son rechazados.

Las proteínas transmembrana tienden a agregarse y precipitar en soluciones acuosas y, por tanto, puede ser adecuado que la proteína transmembrana se solubilice en un detergente. Si bien pueden usarse varios detergentes, generalmente el detergente se selecciona del grupo que consiste en N-óxido de laurildimetilamina (LDAO), octilglucósido (OG), dodecilmaltósido (DDM) o sus combinaciones.

La invención también se refiere a un método para preparar vesículas que incorporan una proteína transmembrana que comprende las etapas de

a. mezclar una solución acuosa de proteína transmembrana y polieteramina,

b. añadir poli(etilenglicol)-b/oque-poli(propilenglicol)-b/oque-poli(etilenglicol) como una solución acuosa a la mezcla preparada en la etapa a,

c. agitar la solución obtenida en la etapa b.

Las vesículas preparadas también pueden denominarse polimerosomas o vesículas poliméricas. Las vesículas son estructuras autoensambladas formadas por copolímeros de bloques anfifílicos en un solvente adecuado (por ejemplo, agua) durante la etapa de agitación. Las vesículas presentan una cavidad interna vacía rodeada por una pared bicapa que puede incorporar diversas estructuras, como proteínas transmembrana.

La estabilidad de las vesículas de polímero aumenta con el peso molecular del polímero que la forma. Por lo tanto, el peso molecular promedio del poli(etilenglicol)-b/oque-poli(propilenglicol)-bloque-poli(etilenglicol) es al menos 1000 Dalton. Sin embargo, un peso molecular demasiado alto tiende a ser difícil de ensamblar en una vesícula. Por lo tanto, el peso molecular promedio del poli(etilenglicol)-b/oque-poli(propilenglicol)-b/oque-poli(etilenglicol) preferentemente no está por encima de 15 000 Dalton. En una modalidad preferida de la invención, el poli(etilenglicol)-b/oquepoli(propilenglicol)-b/oque-poli(etilenglicol) es un polímero sustancialmente lineal que tiene un peso molecular promedio en peso entre aproximadamente 2500 Da a aproximadamente 10000 Da. En una modalidad alternativa de la invención, el poli(etilenglicol)-b/oque-poli(propilenglicol)-b/oque-poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de 10000 a 15000 Da.

La permeabilidad de la vesícula generalmente aumenta con el aumento de la relación hidrófila a hidrófoba. Por tanto, la cantidad de unidades de propilenglicol es generalmente mayor que la cantidad de unidades de etilenglicol. Los copolímeros en bloque de polioxietileno-polioxipropileno-polioxietileno (PEO-PPO-PEO), comúnmente conocidos como Pluronic, tienen valores bajos de relación hidrófila a hidrófoba y por lo tanto son adecuados para obtener membranas permeables. En una modalidad de la invención, el poli(etilenglicol)-bloque-poli(propilenglicol)-b/oquepoli(etilenglicol) tiene la fórmula química:

en la que

x indica un número entero entre 10-30, preferentemente entre 15-25;

y indica un número entero entre 50-100, preferentemente entre 60-80; y

z indica un número entero entre 10-30, preferentemente entre 15-25.

La polieteramina es adecuadamente de la estructura general

en la que

m es un número entero de 1-15

n es un número entero de 5-50

R = CHa.

En una modalidad de la invención, la proporción en peso entre el poli(etilenglicol)-b/oque-poli(propilenglicol)-b/oquepoli(etilenglicol) y la polieteramina es de 5 a 1.

Antes de que la proteína transmembrana acuosa, tal como la acuaporina, se mezcle con la poliéteramina en la etapa a, la proteína transmembrana se solubiliza adecuadamente en un detergente. La solubilización de la proteína transmembrana en un detergente previene o mejora la tendencia de la proteína transmembrana a precipitar en la solución acuosa. Adecuadamente, el detergente se selecciona del grupo que consiste en N-óxido de laurildimetilamina (LDAO), octilglucósido (OG), dodecilmaltósido (DDM) o sus combinaciones.

En una modalidad de la invención, las vesículas producidas como se describe anteriormente se incluyen en una membrana de separación. En una modalidad, la membrana de separación comprende una capa activa que incorpora la vesícula y una membrana de soporte poroso. La membrana de soporte poroso no debe impedir sustancialmente el flujo de agua y/o el ion transportado por la proteína transmembrana. El objetivo principal de la membrana de soporte poroso es servir como andamio para la capa activa que incorpora las vesículas, permitiendo así que la proteína transmembrana sea el elemento predominante de discriminación.

En un aspecto preferido de la invención, la capa activa comprende la vesícula incorporada en una capa compuesta de película delgada formada sobre una membrana de sustrato porosa. Sin desear limitarse a ninguna teoría en particular, se cree que las vesículas que contienen grupos amina en la superficie no solo se incorporarán físicamente o se inmovilizarán (adsorberán), sino que, además, se unirán químicamente en la capa de TFC, porque el reactivo grupos amina, participará en la reacción de polimerización interfacial con el cloruro de acilo, tal como un cloruro detrimesoilo (TMC). De esta manera, se cree que las vesículas se unirán covalentemente en la capa de TFC, lo que conducirá a una carga de vesículas relativamente más alta y, por lo tanto, a un mayor flujo de agua a través de las membranas. Además, se cree que el acoplamiento covalente de vesículas en la capa de TFC da como resultado una mayor estabilidad y/o longevidad de las acuaporinas y vesículas incorporadas a acuaporinas cuando se incorporan en la capa de membrana selectiva.

Además, cuando dicha proteína transmembrana comprende un canal iónico o una acuaporina o similar, y dichas vesículas que comprenden dicha proteína transmembrana se inmovilizan o incorporan en dicha capa activa o selectiva, se vuelve factible fabricar membranas de separación o membranas de filtración que tienen diversas propiedades de selectividad y transporte, por ejemplo, membranas de intercambio iónico cuando dicha proteína transmembrana es un canal iónico, o membranas de filtración de agua cuando dicha proteína transmembrana es una acuaporina. Porque la proteína transmembrana mantiene su estructura plegada biológicamente activa cuando se compleja en vesículas autoensambladas en donde puede protegerse de la degradación. Incluso las proteínas anfifílicas sensibles pueden volverse lo suficientemente estables y, por lo tanto, conservar su funcionalidad deseada cuando se procesan en membranas de separación a escala industrial y de laboratorio.

La presente invención se refiere además a un método para preparar una capa compuesta de película delgada que inmoviliza vesículas que incorpora una proteína transmembrana en una membrana de sustrato porosa, que comprende las etapas de

a. Proporcionar una solución acuosa que comprenda las vesículas preparadas como se mencionó anteriormente y un compuesto de diamina o triamina,

b. Cubrir la superficie de una membrana de soporte poroso con la solución acuosa de la etapa a,

c. Aplicar una solución hidrófoba que comprende un compuesto de haluro de acilo, y

d. Permitir que la solución acuosa y la solución hidrófoba realicen una reacción de polimerización interfacial para formar la capa compuesta de película delgada.

El compuesto de diamina se puede seleccionar entre un intervalo de compuestos que incluyen, por ejemplo, fenilendiaminas, tales como m-fenilendiamina, p-fenilendiamina, 2,5-dicloro-p-fenilendiamina, 2,5-dibromo-pfenilendiamina, 2 ,4,6-tricloro-m-fenilendiamina, 2,4,6-tribromo-m-fenilendiamina, etc.; diaminobifenilos, tales como 2,2'-diaminobifenilo, 4,4-diaminobifenilo, 3,3'-dicloro-4,4'-diaminobifenilo, 3,5,3',5'-tetrabromo-4,4'-diaminobifenilo , etc; diaminodifenilmetanos, tales como 4,4-diaminodifenilmetano, 3,3-diaminodifenilmetano, 2,2'-diaminodifenilmetano, 3,3'-dicloro-4,4'-diaminodifenilmetano, 2,2'-dicloro-4,4'-diaminodifenilmetano, 3,5,3',5'-tetracloro-4,4'-diaminodifenilmetano, 3,5,3',5'-tetrabromo-4,4'-diaminodifenilmetano, etc.; diaminobibencilos, tales como 4,4'-diaminobibencilo, 3,5,3',5'-tetrabromo-4,4'-diaminobibencilo, etc.; 2,2-bisaminofenilpropanos, tales como 2,2-bis(4'-aminofenil)propano, 2,2-bis(3',5'-dicloro-4'-aminofenil)propano, 2,2-bis(3' ,5'-dibromo-4'-aminofenil)-propano, etc.; diaminodifenilsulfonas, tales como 4,4-diaminodifenilsulfona, 3,5,3',5'-tetracloro-4,4'-diaminodifenilsulfona, 3,5,3',5'-tetrabromo-4,4'-diaminodifenilsulfona, etc.; diaminobenzofenonas, tales como 4,4'-diaminobenzofenona, 2,2'-diaminobenzofenona, 3,3'-dicloro-4,4'-diaminobenzofenona, 3,5,3',5'-tetrabromo-4,4'-diaminobenzofenona, 3,5,3',5'-tetracloro-4,4'-diaminobenzofenona, etc.; éteres diaminodifenílicos, tales como éter 3,3'-diaminodifenílico, éter 4,4'-diaminodifenílico, éter 3,3'-dibromo-4,4'-diaminodifenílico, etc. piperazina, N-fenilbenceno-1,3 diamina , melanina y mezclas de tales compuestos. En un aspecto preferido, la diamina se selecciona como m-fenilendiamina (MPD), también conocida como 1,3-diaminobenceno.

El compuesto de triamina se puede seleccionar entre un intervalo de compuestos que incluyen, por ejemplo, dietilentriamina, dipropilentriamina, fenilentriamina, bis(hexametilen)-triamina, bis(hexametilen)triamina, bis(3-aminopropil)-amina, hexametilendiamina, N-seboalquildipropileno, 1,3,5-triazina-2,4,6-triamina y mezclas de estos compuestos.

El compuesto de haluro de acilo normalmente tiene dos o tres grupos de haluro de acilo disponibles para reaccionar con el compuesto de di o triamina. Los ejemplos de compuestos de haluro de diacilo o haluro de triacilo adecuados incluyen cloruro detrimesoílo (TMC), bromuro de trimesoílo, cloruro de isoftaloílo (IPC), bromuro de isoftaloílo, cloruro de tereftaloílo (TPC), bromuro de tereftaloílo, cloruro de adipoílo, cloruro cianúrico y mezclas de estos compuestos.

Los grupos amino del compuesto de diamina o triamina competirán con los grupos del cloruro de ácido del compuesto de haluro de acilo por la reacción. Generalmente, la proporción en peso del compuesto de diamina o triamina al compuesto de haluro de acilo es de 0:1 a 30:1. Cuando se requiere una alta densidad de vesículas en la superficie, la cantidad de grupos diamina o triamina suele estar en la parte inferior del intervalo, es decir, 0:1 a 1:1, como entre 0:1 y 0,5: 1. En otras modalidades de la invención, se desea una capa de TFC más rígida y se seleccionan los reactivos del extremo superior del intervalo, tales como 1:1 a 30:1, preferiblemente 1:1 a 5:1.

La solución acuosa de amina puede añadirse a la membrana de soporte poroso en una capa uniforme y subsecuentemente secarse antes de la aplicación de la solución de haluro de acilo. En una cierta modalidad de la invención, la solución acuosa de amina se aplica a la membrana de soporte poroso y subsecuentemente se proporciona un vacío en el lado opuesto de la membrana de soporte poroso para estimular la penetración de la solución acuosa de amina en la estructura porosa. Después de aliviar el vacío, se aplica la solución de cloruro de acilo para la formación de la capa compuesta de película delgada mediante la reacción de la amina con el cloruro de acilo. Se cree que el uso de vacío para proporcionar una mejor integración de la capa compuesta de película delgada en la membrana de soporte poroso.

La membrana de soporte poroso puede estar formada por varios materiales. La elección específica del material no es esencial siempre y cuando la membrana de soporte sea capaz de soportar suficientemente la capa de TFC y resistir la descomposición durante las condiciones de operación, es decir, que sea capaz de soportar la presión y/o el entorno químico a ambos lados de la membrana. Ejemplos de materiales específicos para la membrana de soporte poroso incluyen polisulfona o un polímero de polietersulfona. El soporte puede ser simétrico o asimétrico. En el caso de que la membrana de soporte poroso sea asimétrica, la capa de TFC se forma adecuadamente en la cara de la capa de piel.

La membrana de soporte poroso puede estar además soportada por un soporte mecánico tejido o no tejido en algunas modalidades para aumentar la construcción mecánica y reducir el riesgo de fracturas durante el funcionamiento.

La membrana de soporte poroso puede tener cualquier aspecto físico conocido en la técnica, tal como membrana de lámina plana, membrana tubular o membrana de fibra hueca. En cierto aspecto de la invención, se prefiere una membrana de fibra hueca, ya que proporciona una mayor densidad de empaquetamiento, es decir, el área activa de la membrana es mayor para un cierto volumen. Las membranas pueden agruparse o ensamblarse en un módulo como se conoce en la técnica. Por lo tanto, una pluralidad de membranas de lámina plana pueden ensamblarse en una configuración de membrana de placa y marco. Los sistemas de membrana de placa y marco usan membranas colocadas encima de una estructura similar a una placa, que a su vez se mantiene unida por un soporte similar a un marco.

Las membranas de láminas planas también se pueden ensamblar en módulos de filtro enrollados en espiral. Además de las membranas de lámina plana, los módulos de membrana enrollados en espiral incluyen separadores de alimentación y separadores de permeado envueltos alrededor de un tubo hueco llamado tubo de permeado. Los elementos enrollados en espiral usan tecnología de flujo cruzado y, debido a su construcción, pueden crearse fácilmente en diferentes configuraciones con diferentes longitudes, diámetros y materiales de membrana. Se puede producir un módulo de filtro enrollado en espiral colocando primero una membrana y luego doblar por la mitad con la membrana mirando hacia adentro. El separador de alimentación se coloca, entonces, entre las membranas plegadas, y se forma un sándwich de membrana. El propósito del separador de alimentación es para proporcionar espacio para que el agua fluya entre las superficies de la membrana y permitir un flujo uniforme entre las hojas de la membrana. A continuación, el separador de permeado se une al tubo de permeado, y el sándwich de membrana preparado se une anteriormente al separador de permeado mediante el uso de pegamento. La siguiente capa de permeado se coloca y se sella con pegamento, y se repite el proceso completo hasta que todos los separadores de permeado necesarios se hayan unido a las membranas. Las capas de membrana terminadas se envuelven alrededor del tubo y se crea la forma en espiral.

Los módulos de membrana tubular son estructuras similares a tubos con paredes porosas. Los módulos tubulares funcionan mediante flujo cruzado tangencial y generalmente se usan para procesar corrientes de alimentación difíciles, como las que tienen un alto contenido de sólidos disueltos, sólidos en suspensión y/o aceite, grasa o grasas. Los módulos tubulares consisten en un mínimo de dos tubos; el tubo interno, llamado tubo de membrana, y el tubo externo, que es la cubierta. La corriente de alimentación atraviesa la longitud del tubo de membrana y se filtra hacia la cubierta exterior mientras el concentrado se acumula en el extremo opuesto del tubo de membrana.

Las membranas de fibra hueca pueden ensamblarse en un módulo. Por lo tanto, la presente invención proporciona la etapa de producir un módulo de fibra hueca mediante el ensamblaje de un conjunto de fibras huecas en una carcasa, en donde una entrada para pasar una primera solución está conectada a la luz de las fibras huecas en un extremo y una salida se conecta a la luz en el otro extremo, y se proporciona una entrada en la carcasa para pasar una segunda solución a una salida conectada a la carcasa.

Los módulos de membrana que se producen de acuerdo con la presente invención pueden usarse en diversas configuraciones, que incluyen configuraciones de ósmosis directa y configuraciones de ósmosis inversa.

La presente invención también se refiere a vesículas que comprenden una carga interna, en donde las vesículas cargadas son capaces de liberar la carga interna al cambiar el pH en el ambiente. Las vesículas que comprenden una mezcla de poli(etilenglicol)-bloque-poli(propilenglicol)-Woguepoli(etilenglicol) y la polieteramina son estables a valores de pH alcalinos, como por debajo de pH 7 o pH 8 o superior. Sin embargo, cuando el ambiente externo a las vesículas cambia a valores ácidos, tales como valores de pH de 7 o más abajo o pH 6 o más abajo, la formación de vesículas se disocia. El comportamiento selectivo de pH de las vesículas ofrece la oportunidad de incorporar carga en las vesículas a valores de pH alcalinos, transportar las vesículas con carga a una ubicación deseada y liberar la carga sometiendo las vesículas a condiciones ácidas, lo que permitirá que las vesículas se disocien.

Las vesículas para el suministro de carga tienen la misma composición y método de preparación como se describió anteriormente para la incorporación de vesículas de proteínas transmembrana. Debido al método de preparación, las vesículas tienen valores de pH muy alcalinos, es decir, pH de pH 7 a pH 14 y temperatura de 30 a 90 °C. Las pruebas iniciales sugieren que las vesículas son estables durante al menos un año a temperatura ambiente sin ningún cambio.

Además, las vesículas se vuelven a ensamblar a pH neutro o básico, lo que facilita la incorporación de carga interna cuando sea necesario sin ninguna etapa de purificación adicional.

Las vesículas que comprenden una sustancia de carga pueden usarse como un sistema portador para el suministro in situ o in vivo de diversas sustancias de carga, incluidas las fracciones bioactivas. La sustancia de carga puede ser una sustancia bioactiva, por ejemplo, tal como una sustancia bioactiva seleccionada del grupo que consiste en fármacos de molécula pequeña, biomoléculas, biomacromoléculas y células. La sustancia bioactiva puede estar soportada sobre un portador no bioactivo. La sustancia de carga puede ser una partícula polimérica o inorgánica. Los ejemplos de sustancias ilustrativos que pueden usarse como sustancias de carga de acuerdo con la presente invención incluyen, entre otros, los siguientes: fármacos de molécula pequeña, biomoléculas, biomacromoléculas (incluidos, entre otros, polisacáridos, glicosaminoglicanos y proteínas), (incluyendo células vivas), agentes terapéuticos (es decir, agentes que provocan una respuesta fisiológica medible en un animal, como un ser humano), fluoróforos, agentes cromogénicos, enzimas, proteínas (incluyendo proteínas inmunomoduladoras y metaloproteinasas de matriz), antibióticos, anestésicos, anticuerpos, factores de crecimiento, hormonas, antiinflamatorios, analgésicos, agentes cardíacos, psicotrópicos, rellenos (por ejemplo, partículas inorgánicas y/o poliméricas), inmunoterapéuticos, citocinas, oligonucleótidos, marcadores (por ejemplo, fluoróforos, radionucleótidos, fracciones fluorescentes, fracciones quimioluminiscentes, partículas magnéticas, colorantes) y similares y sus combinaciones.

Descripción detallada de la invención

En términos generales, la presente invención se refiere al uso de una mezcla de poli(etilenglicol)-bloquepoli(propilenglicol)-Wogue-poli(etilenglicol) y polieteramina, para formar vesículas autoensambladas con proteínas transmembrana, como los canales de agua acuaporina. Las vesículas que han incorporado la proteína transmembrana pueden usarse luego en la producción de membranas de separación en las que se incorporan o inmovilizan las proteínas transmembrana, por ejemplo para permitir que las moléculas de agua atraviesen la membrana. Por ejemplo, para la producción de membranas de separación que comprenden proteínas transmembrana, las vesículas pueden añadirse a una composición líquida acuosa que comprende una amina aromática, como una diamina o triamina, por ejemplo, 1,3-diaminobenceno (MPD) aplicada a la superficie de una estructura de soporte porosa, que cuando se pone en contacto con una solución de un cloruro de ácido en un solvente orgánico participará en una reacción de polimerización interfacial para formar una capa activa o selectiva compuesta de película delgada sobre dicho soporte formando así una membrana de separación, en donde dichas vesículas se han inmovilizado o incorporado.

Sin desear limitarse a ninguna teoría en particular, se cree que las vesículas que contienen los grupos reactivos NH2 libres disponibles en la superficie no solo se incorporarán físicamente o se inmovilizarán (adsorbidos), sino que, además, se unirán químicamente en la capa de TFC, porque los grupos reactivos NH2, participarán en la reacción de polimerización interfacial con el cloruro de acilo, tal como un cloruro de trimesoilo (TMC). De esta forma, se cree que las vesículas se unirán covalentemente en la capa de TFC. Además, se cree que mediante el ajuste apropiado de los componentes reactivos, se puede obtener una alta carga de vesículas y, por lo tanto, un mayor flujo a través de un área determinada de la membrana. Además, se cree que el acoplamiento covalente de vesículas en la capa de TFC da como resultado una mayor estabilidad y/o longevidad de las vesículas que comprenden las proteínas transmembrana cuando se incorporan en la capa de membrana selectiva.

Además, cuando dicha proteína transmembrana comprende un canal iónico o una acuaporina o similar, y dichas vesículas que comprenden dicha proteína transmembrana se inmovilizan o incorporan en dicha capa activa o selectiva, se vuelve factible fabricar nuevas membranas de separación o membranas de filtración que tienen selectividad diversa y propiedades de transporte, por ejemplo, membranas de intercambio iónico cuando dicha proteína transmembrana es un canal iónico, o membranas de filtración de agua cuando dicha proteína transmembrana es una acuaporina. Debido a que la proteína transmembrana mantiene su estructura plegada biológicamente activa cuando se compleja en nanoestructuras autoensambladas en donde puede protegerse de la degradación, incluso las proteínas anfifílicas sensibles pueden volverse lo suficientemente estables y, por lo tanto, conservar su funcionalidad deseada cuando se procesan en membranas de separación en el laboratorio y escala industrial.

La membrana de separación de la invención es útil en un entorno industrial o doméstico para preparar un filtrado de agua pura, como filtrar una solución acuosa a través de una membrana de separación en un proceso de nanofiltración o en un proceso de ósmosis inversa. Para los fines en la presente descripción, el término "membrana de separación" incluye membranas selectivamente permeables y membranas semipermeables para la filtración y separación de agua, tales como membranas asimétricas que comprenden una membrana de soporte poroso que tiene una capa selectiva formada en un lado, tal como una capa delgada de poliamida aromática reticulada o una película o una capa de polielectrolitos cargados alternativamente (L-B-L). El otro lado puede estar reforzado con una capa o malla tejida o no tejida, típicamente hecha de fibras de poliéster.

Además, la membrana de separación de la invención es útil en un método para la concentración de una solución de producto, comprendiendo dicho método usar una membrana de separación de la invención montada en un módulo o carcasa de filtro para extraer agua de la solución de producto, por ejemplo, por avance ósmosis.

En un aspecto de la invención, incluye un módulo de fibra hueca (HF) que tiene un conjunto de membranas de fibra hueca modificadas con una capa selectiva que comprende la formulación vesicular de la invención. Preferentemente, la capa selectiva comprende una capa compuesta de película delgada (TFC) formada en la superficie interior de las fibras a través de una reacción de polimerización interfacial, en donde dicha capa TFC comprende canales de agua acuaporina incorporados en vesículas compuestas de una mezcla de poli(etilenglicol)- bloque-poli(propilenglicol)-Wogue-poli(etilenglicol) y polieteramina.

La membrana de separación de la invención puede ser útil adicionalmente en un método para la producción de energía salina mediante el uso de ósmosis retardada por presión, comprendiendo dicho método usar dicha membrana de separación para aumentar la presión hidrostática, y usar el aumento de la presión hidrostática como fuente de energía salina, cf. WO2007/033675 y WO2014128293 (A1).

El término "canal de agua acuaporina" como se usa en la presente descripción incluye un canal de agua acuaporina o acuagliceroporina funcional natural o sintético, tales como acuaporina Z (AqpZ), GIPf, SoPIP2; 1, acuaporina 1 y/o acuaporina 2. Los canales de agua acuaporina incluyen acuaporinas bacterianas y acuaporinas eucariotas, tales como acuaporinas de levadura, acuaporinas de plantas y acuaporinas de mamíferos, así como también proteínas relacionadas de canales, tales como acuagliceroporinas. Ejemplos de acuaporinas y acuagliceroporinas incluyen: acuaporinas procariotas tales como AqpZ; acuaporinas de mamíferos, tales como Aqp1 y Aqp2; acuaporinas de plantas, tales como proteínas intrínsecas del plasma (PIP), proteínas intrínsecas del tonoplasto (TIP), proteínas intrínsecas de nodulina (NIP) y proteínas intrínsecas pequeñas (SIP), por ejemplo, SoPIP2;1, PttPIP2;5 y PtPIP2;2; acuaporinas de levadura, tales como AQY1 y AQY2; y acuagliceroporinas, tales como GlpF y Yfl054. Las proteínas del canal de agua acuaporina pueden prepararse de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción o como se establece en Karlson y otros, (FEBS Letters 537: 68-72, 2003) o como se describió en Jensen y otros, US 2012/0080377 A1 (por ejemplo, véase el Ejemplo 6).

El término "membrana de separación", tal como se usa en la presente, incluye membranas útiles para separar agua y, opcionalmente, ciertos solutos de pequeño tamaño, incluidos aniones y cationes, de otros solutos, partículas, coloides y macromoléculas. Ejemplos de membranas de separación son "membranas de filtración" tales como membranas de nanofiltración ^{( N f ),} membranas de ósmosis directa (FO) y membranas de ósmosis inversa (RO). Un tipo de membrana de filtración es una membrana "compuesta de película delgada" (o TFC), que se clasifica frecuentemente como membrana de nanofiltración y de ósmosis inversa. Las membranas TFC de lámina plana se fabrican típicamente depositando una capa de poliamida encima de una capa porosa de polietersulfona o polisulfona encima de un soporte de tela tejida o no tejida. La capa de rechazo de poliamida se forma por polimerización interfacial de una solución acuosa de una amina con una solución de un cloruro ácido en un solvente orgánico. Las membranas TFC se pueden producir como se describió en WO 2013/043118 (Universidad Tecnológica de Nanyang y Aquaporin A/S). Otros tipos de membranas de filtración son las formadas por el método de deposición capa por capa (LbL), como se describió en Gribova y otros, (Chem. Mater., 24: 854-869, 2012) y Wang y otros, (Membranes, 5(3): 369-384, 2015) . Por ejemplo, las vesículas de la invención se pueden incrustar o incorporar en las películas multicapa de polielectrolito (PEM), como se indica en la Figura 4 de Gribova y otros,

Las membranas de "compuesto de película delgada" o (TFC) como se usa en la presente se pueden preparar mediante el uso de un reactivo de amina, preferentemente una amina aromática, tal como una diamina o triamina, por ejemplo, 1,3-diaminobenceno (m-fenilendiamina, > 99 % , por ejemplo, como se adquiere de Sigma-Aldrich) en una solución acuosa, y un reactivo de haluro de acilo, como un cloruro de diácido o triácido, preferentemente un haluro de acilo aromático, por ejemplo, cloruro de benceno-1,3,5-tricarbonilo (Núm. CAS 84270-84-8, cloruro de trimesoílo (TMC), 98 %, por ejemplo, como se compra a Sigma-Aldrich) disuelto en un solvente orgánico donde dichos reactivos se combinan en una reacción de polimerización por condensación interfacial, cf. Khorshidi y otros, (2016) Scientific Reports 6, número de artículo: 22069, y Número de patente de EE.UU.: 4,277,344 que describe en detalle la formación de una membrana compuesta que comprende una poliamida laminada a un soporte de membrana porosa, en la superficie de la membrana de soporte, por ejemplo, una membrana de polietersulfona. Benceno-1,3,5-cloruro de tricarbonilo (cloruro de trimesoilo) se disuelve en un solvente, como un C6-C12 hidrocarburo que incluye hexano (>99,9 %, Fisher Chemicals), heptano, octano, nonano, decano, etc. (hidrocarburos de cadena lineal o ramificada) u otro solvente de hidrocarburo aromático bajo, por ejemplo, Isopar™ G Fluido que se produce a partir de materias primas a base de petróleo tratadas con hidrógeno en presencia de un catalizador para producir un fluido de bajo olor, cuyos componentes principales incluyen isoalcanos.

Isopar™ G Fluido: Nombre químico: Hidrocarburos, C10-C12, isoalcanos, < 2 % aromáticos; Núm. CAS: 64742-48-9, nombre químico: Nafta (petróleo), fracción pesada tratada con hidrógeno (de ExxonMobil Chemical). Las alternativas al reactivo 1,3-diaminobenceno incluyen diaminas tales como hexametilendiamina, etc., y las alternativas al reactivo benceno-1,3,5-cloruro de tricarbonoílo incluyen un cloruro de adipoílo, ácido cianúrico, etc., como se conoce en la técnica.

Las vesículas de la presente invención pueden denominarse "autoensambladas" para describir el proceso mediante el cual se forman las vesículas a través de la interacción hidrófila e hidrófoba de las sustancias anfifílicas, es decir, la mezcla de poli(etilenglicol)-bloque-poli(propilenglicol )-bloque-poli(etilenglicol) y polieteramina.

"Diámetro hidrodinámico", tal como se usa en la presente, representa el tamaño hidrodinámico de las nanopartículas en medios acuosos medido por dispersión de luz dinámica (DLS) definido como el tamaño de una esfera dura hipotética que se difunde de la misma manera que la partícula que se mide.

La ósmosis directa (FO) u ósmosis directa es un proceso osmótico que usa una membrana selectiva y permeable para efectuar la separación del agua de los solutos disueltos. La fuerza impulsora para esta separación es un gradiente de presión osmótica entre una solución de alta concentración, denominada en la presente descripción como extracción y una solución de menor concentración, denominada alimentación. El gradiente de presión osmótica induce un flujo neto de agua a través de la membrana hacia la extracción, lo cual concentra eficazmente la alimentación. La solución de extracción puede consistir en una o varias sales simples o puede ser una sustancia diseñada específicamente para aplicaciones de ósmosis directa. La solución de alimentación puede ser una corriente de producto diluido, como una bebida, una corriente de desecho o agua de mar, cf. IFOA, http://forwardosmosis.biz/education/what-isforwardósmosis/.

La mayoría de las aplicaciones de FO, por lo tanto, se dividen en tres categorías amplias: concentración de productos, concentración de desechos o producción de agua limpia como subproducto del proceso de concentración. El término "PAFO", cuando se usa en la presente descripción, describe un proceso de ósmosis directa asistida por presión. El término "PRO", cuando se usa en la presente descripción, describe la ósmosis retardada por presión que es útil en la generación de energía osmótica. Las membranas de la presente invención son útiles en todos los tipos de procesos de ósmosis directa y pueden adaptarse específicamente para cada tipo de ósmosis directa.

El término "ósmosis inversa" (OI) como se usa en la presente descripción se refiere cuando se usa una presión de agua de alimentación aplicada sobre una membrana selectivamente permeable para superar la presión osmótica. La ósmosis inversa típicamente elimina muchos tipos de sustancias disueltas y suspendidas del agua de alimentación, incluidas las bacterias, y se usa tanto en procesos industriales como en la producción de agua potable. Durante el proceso de RO, el soluto se retiene en el lado presurizado de la membrana y el solvente puro, el permeado, pasa al otro lado. La selectividad especifica que la membrana no permite que moléculas o iones más grandes atraviesen sus poros (agujeros), al tiempo que permite que los componentes más pequeños de la solución (como las moléculas de solvente) pasen libremente. Las membranas de ósmosis inversa de baja presión (LPRO), típicamente, a una presión de agua de alimentación de aproximadamente <5 bar y hasta una presión máxima de funcionamiento de aproximadamente 25 bar 15 flujo específico LMH/bar. La LPRO realizada en los intervalos de presión de alimentación más bajos, por ejemplo, de 2 a 5 bar, a veces se denomina ósmosis inversa de baja presión. Las membranas LPRO conocidas en la técnica tienen límites operativos típicos para la temperatura del agua de alimentación de aproximadamente 45 °C, el pH del agua de alimentación en el intervalo de 2 a 11 y la limpieza química en el intervalo de pH de 1 a 12.

La presente invención se ilustra adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Preparación de vesículas de Pluronic® Copolímero tribloque P-123 (poli(etilenglicol)-bloque-poli(propilenglicol)-bloquepoli(etilenglicol) Mn 5800 Da) y Jeffamine® M-2005 (polieteramina) que tiene un peso molecular nominal de 2000) y preparación de una membrana de agua mediante el uso de dichas vesículas.

Materiales:

Pluronic® El copolímero tribloque P-123 (poli(etilenglicol)-bloque-poli(propilenglicol)-bloque-poli(etilenglicol) que tiene una composición de PEG20-PPO70-PEG20 con un peso molecular de 5800 Da se adquirió de Sigma Aldrich y se usó como recibido.

Jeffamine® M-2005 es una polieteramina con una relación de óxido de polietileno y óxido de polipropileno de 29 a 6 y un peso molecular de 2000 Da y se adquirió de Huntsman y se usó tal como se recibió.

Se preparó tampón fosfato (PBS) 10 mM (pH 7,2, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl) mediante disolución de 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 y 0,24 g de H2PO4 en 800 mL de H2O purificada MiliQ, mediante ajuste del pH a 7,2 con HCl y completamiento del volumen hasta 1 L.

La solución madre de Aquaporin Z 5 mg/mL se preparó como se describe más abajo. La acuaporina-Z funcional se produjo en exceso en cultivos bacterianos de la cepa BL21(DE3) de E. coli como proteína etiquetada con His con un sitio de escisión del virus del grabado del tabaco. La proteína de fusión tiene 264 aminoácidos y un Mw de 27234 Da. Se usó ADN genómico de E. coli DH5 como fuente para amplificar el gen AqpZ. El gen AqpZ se amplificó mediante el uso de cebadores específicos de genes con la adición de un sitio de escisión del virus del grabado del tabaco (TEV); ENLYFQSN en el extremo N de AqpZ. El AqpZ amplificado se digirió con la enzima NdeI y BamHI y luego se ligó al ADN del vector pET28b de expresión marcado con 6-His digerido de manera similar. Los clones positivos se verificaron mediante tamizaje por PCR. La autenticidad de los constructos se confirmó mediante secuenciación de ADN.

Se usó la cepa BL21(DE3) de E. coli para la expresión de la proteína. Los cultivos de Luria Broth que contienen 50 |jg/mL de kanamicina se incubaron durante 13 a 16 horas a 37 °C, se diluyeron 100 veces en caldo LB nuevo y se propagaron a una densidad de aproximadamente 1,2 a 1,5 (DO a 600 nm). La expresión de la proteína recombinante se indujo mediante la adición de 1 mM de IPTG durante 3 horas a 35 °C antes de la centrifugación. Las células cosechadas se resuspendieron en tampón de unión enfriado con hielo (Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, pmercaptoetanol 2 mM, glicerol al 10 %) en presencia de 0,4 mg/mL de lisozima, 50 unidades de bensonasa y 3 % de n-octil-p-D-Glucopiranósido. La muestra se sometió a cinco ciclos de lisis en un microfluidizador a 12 000 Pa. El material insoluble se sedimentó mediante centrifugación de 30 minutos a 40000 * g. El sobrenadante se pasó a través de una columna de flujo rápido Q-Sepharose (Amersham Pharmacia), y se recogió el flujo de 10. La fracción de flujo continuo se rellenó con NaCl hasta 300 mM antes de cargarla en una columna de Ni-NTA preequilibrada. La columna se lavó con 100 volúmenes de columna de un tampón de lavado (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 25 mM, p-mercaptoetanol 2 mM, glicerol al 10 %) para eliminar el material no unido específicamente. El material unido a agarosa Ni-NTA se eluyó con cinco volúmenes de lecho de tampón de elución (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 300 mM, p-mercaptoetanol 2 mM, 15 glicerol al 10 %, que contiene n-octil p-D-Glucopyranósido 30 mM). AqpZ se purificó adicionalmente con cromatografía de intercambio aniónico; columna monoQ ^{( G e} healthcare). La mezcla de muestra se diluyó y se concentró para llevar la concentración de sal e imidazol a aproximadamente 10 mM con concentrador Amicon, límite de membrana 10000 Da antes de cargar en la columna MonoQ. El tampón que se usó durante la cromatografía de intercambio aniónico fue (A) 20 mM Tris, pH 8,0, 30 mM OG, 10 % glicerol y (B) 20 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl, 30 mM OG, 10 % glicerol. Las fracciones de los picos eluidos que contienen AqpZ de la columna de intercambio iónico se agruparon. El extracto de AqpZ purificado se mantuvo congelado a -80 °C.

Un día antes de la purificación, el extracto de AQP (almacenado en un congelador de -80 °C) se descongeló en hielo o en un refrigerador a 4 °C. Se prepararon porciones de los tampones y ddH2O a 4 °C. El extracto de AQP se agitó en un vaso de precipitado adecuadamente enfriado en un baño de hielo mediante una barra magnética para disolver cualquier precipitado. Se añadieron gradualmente 1,5 volúmenes de tampón de unión AQP libre de ^{l D a O} enfriado previamente a 1 volumen del extracto solubilizado (mediante el uso de 0,5 volúmenes más de tampón para enjuagar los tubos de extracto y la copa de filtración), se mezcló bien y se filtró a través de una taza filtro de vacío estéril de 0,45 jM . Se aplicó vacío a la taza de filtración para evitar el exceso de formación de espuma y el filtrado se colocó en hielo para usar dentro de 2 horas.

Se equilibró una columna Histrap con agua estéril seguida de tampón de unión de AQP a temperatura ambiente. El régimen de flujo se fijó en 1 mL/min (para columna preempaquetada de 1 mL) o 2,5 mL/min (para columna preempaquetada de 5 mL y columna autoempaquetada). El extracto diluido 3 veces (en baño de agua helada) se cargó en la columna Histrap mediante el uso del programa ÁKTA. El régimen de flujo se fijó en 1 mL/min (para columna preempaquetada de 1 mL) o 2,5 mL/min (para columna preempaquetada de 5 mL y columna autoempaquetada). El volumen de carga fue menos de 30 mL/mL de resina. El flujo de extracto a través de un baño de agua con hielo, se recogió y almacenó a 4 °C para su uso posterior. La columna se lavó con 10 CV (volumen de columna) de tampón de unión de AQP enfriado con hielo. El régimen de flujo se fijó en 2,5 mL/min (para columna preempaquetada de 5 mL y columna autoempaquetada) o se fijó en 1 mL/min para columna preempaquetada de 1 mL. La proteína AQP se eluyó con tampón de elución de AQP enfriado con hielo (volumen de 10 columnas) a un régimen de flujo de 2,5 mL/min mediante el uso del programa ÁKTA. El volumen de la fracción se fijó en 10 mL y la recolección comenzó en tubos de PP de 15 mL después de 0,5 - 1CV.

Las fracciones eluidas se taparon y se almacenaron en hielo a 4 °C. La pureza y conformación de AQP se examinó por desnaturalización y análisis de PAGE nativo, respectivamente. La concentración de proteína se midió por Nanodrop. El flujo de extracto puede procesarse una segunda y una tercera vez según sea necesario para producir una composición AQP de calidad adecuada.

Cuando se pasan los análisis de calidad de AQP, la concentración de proteína se ajustó a 5 mg/mL mediante la adición de tampón de unión a AQP libre de imidazol enfriado con hielo que contiene 2 % de LDAO. Finalmente, el AQP se esterilizó por filtración a través de una copa esterilizada de 0,45 pM y se almacenó a 4 °C en el refrigerador para su uso dentro de un mes o bien se almacenó a -80 °C en un congelador.

Método de preparación:

1. Preparar una solución fresca de Pluronic® P-123 disolviendo el polímero en PBS hasta una concentración final de 10 mg/mL en un cilindro de vidrio.

2. Pesar en un matraz 15 mg/mL Jeffamine® M-2005.

3. Agregue la solución madre de Aquaporin Z a una concentración final de 1/200 relación molar de proteína AQPZ/polímero, en donde el polímero es la cantidad combinada de Pluronic® P-123 y Jeffamine M-2005.

4. Añadir la solución Pluronic® P-123 preparada en la etapa 1 a la mezcla de Jeffamine® M-2005 y Aquaporin Z para llegar a 9,9 mg.

5. Agitar la mezcla durante la noche a 170 revoluciones por minuto (no más de 20 horas) a temperatura ambiente.

6. A la mañana siguiente, tomar la formulación de vesículas obtenida en la secuencia de las etapas 1 a 5, transferir al matraz de almacenamiento y mantener a temperatura ambiente.

La formulación de vesículas se analizó en cuanto a tamaño, permeabilidad al agua y punto de vista del potencial zeta mediante DLS, potencial zeta y medidas de flujo detenido en NaCl 0,5 M. Los resultados se miden 5 veces para 5 lotes diferentes.

Tabla 1

La estabilidad de la temperatura y el comportamiento térmico se probaron calentando 5 mL de formulación de vesículas durante 10 minutos a varias temperaturas que oscilaban entre 30 °C y 100 °C y su tamaño y permeabilidad al agua se determinaron más mediante DLS y mediciones de flujo detenido.

El tratamiento térmico no afecta significativamente la estabilidad de la formulación, lo que da como resultado la contracción del diámetro de las estructuras de mayor tamaño desde alrededor de 200 nm a temperatura ambiente hasta alrededor de 1800 nm. Desde el punto de vista de la permeabilidad al agua, no se pueden observar cambios hasta los 100 °C. Se registraron valores de Ki de 1700 a 1687 s-1.

El comportamiento del pH muestra el desensamblaje de la formulación de vesículas a pH que varía de 1 a 7 a micelas con un diámetro de hasta 20 nm y el reensamblaje a valores básicos de pH (de 9 a 13 mostrando el mismo tamaño 180 nm y valores de Ki alrededor de 1700 s-1.

Ejemplo 2

Preparación de membranas BWRO (ósmosis inversa de agua salobre)

Estas membranas se hicieron de acuerdo con las etapas que se detallan más abajo:

a) Disolver MPD en agua MilliQ para obtener una concentración de 2,5 % (P/P), ver más abajo

b) Disolver TMC en Isopar a una concentración final de 0,15 % P/V

c) Recubrir una membrana de forma rectangular, por ejemplo, membrana 1FPH PES de 5,5 cm x 11 cm con aproximadamente 20 mL/m2 de membrana de solución de MPD y déjela durante 30 segundos con agitación suave. d) Secar el lado no activo (lado posterior) con papel secante de laboratorio (por ejemplo, Kim-Wipe) durante 5 a 10 segundos.

e) Colocar la membrana en una placa de vidrio y séquela suavemente con N2 hasta que la superficie cambie de brillante a opaca.

f) Aplicar cinta alrededor de los bordes de la membrana (“ 1mm)

g) Colocar la placa de vidrio con la membrana sellada en un contenedor de vidrio o metal, añadir aproximadamente 155 mL/m2 de membrana TMC-Isopar en un extremo y agitar suavemente hacia adelante y hacia atrás durante 30 segundos.

h) Eliminar el reservorio de vidrio del depósito y séquela con N2 durante 10 a 15 segundos.

Después de retirar la cinta, la membrana puede transferirse a MilliQ con el lado activo recién formado hacia arriba y mantener húmeda durante la manipulación en etapas posteriores si es necesario.

Cálculo de la solución de MPD:

Pesar 1,05 g de MPD y disolver en 35 mL de MilliQ. Agregar 7 mL de la composición líquida de AQPZ preparada como se describe en el ejemplo 1. Mantenga la solución cubierta con gas inerte (Ar o N2) tanto como sea posible.

Luego se montaron membranas TFC con formulación líquida de AQPZ de tamaños de 5.5 cm x 11 cm en una celda de fibra óptica Sterlitech CF042 (www.sterlitech.com) y se sometió a pruebas de 60 minutos (5 membranas) y pruebas de 900 minutos (4 membranas) de duración en modo FO mediante el uso de agua desionizada (MilliQ) como alimentación y solución acuosa de NaCl 1 M como extracción y velocidades de alimentación y extracción de 268 mL/min.

Los resultados se dan en la Tabla 4.

T l 4. F rm l i n v í l r n l m m r n r i n I.

Ejemplo 3

Elaboración de membranas de filtración TFC FO (ósmosis directa) artesanales

Las membranas se prepararon de acuerdo con las etapas que se detallan más abajo:

a) Proporcionar una membrana de soporte, por ejemplo, un PES no tejido que tenga una estructura en forma de dedo, tamaño 5,5 cm x 11 cm

b) Mezclar MPD al 3 % en peso con £-caprolactama al 3 % en peso, NMP al 0,5 % en peso y agua DI al 93,5 % en peso para obtener una solución.

c) Agregar 0,1 mg/mL de la formulación líquida de AQPZ del ejemplo 1 para obtener una suspensión d) Incubar la suspensión de c) durante 2 horas

e) Prepare la solución de TMC a partir de TMC al 0,09 % en peso, acetona al 0,9 % en peso y Isopar al 99,01 % en peso.

f) Recubra por inmersión la membrana de soporte en la suspensión d) durante 30 segundos

g) Aplicar secado con cuchillo de aire

h) Adicionar la solución TMC de e) para polimerización interfacial

i) Continuar con 2 minutos de secado en la campana de captación de gases

Se fabricaron y montaron tres membranas en una celda Sterlitech CF042 RO, www.sterlitech.com, operado a 5 bar mediante el uso de 500 ppm de NaCl como alimentación durante 60 minutos.

Los resultados se dan en la Tabla 5.

T l . F rm l i n v í l r n l m m r n F h h m n

Ejemplo 4

Preparación de membranas FO (ósmosis directa)

Se prepararon vesículas que incorporaban AqpZ mezclando primero la solución acuosa de proteína transmembrana (solución madre de Aquaporin Z como se preparó anteriormente) con polieteramina (15 mg/mL de Jeffamine® M-2005) para obtener una concentración final de 1/200 relación molar AQPZ/relación proteína polímero. Subsecuentemente, añadir la solución acuosa de PEO-PPO-PEO (Pluronic® P-123 que tiene un peso molecular de 5800 Da en PBS hasta una concentración final de 10 mg/mL), y se agita la mezcla durante la noche a 170 revoluciones por minuto a temperatura ambiente.

Tales vesículas preparadas se incorporaron a la membrana compuesta de película fina de poliamida (TFC), mediante polimerización interfacial sobre el soporte poroso. Se preparó una solución acuosa que comprende la mezcla de vesículas (6 mL de la mezcla preparada anteriormente) y una solución de m-fenilendiamina (preparada disolviendo 1,5 g de MPD en 52,5 mL de MilliQ). La solución orgánica compuesta por cloruro de trimesoilo (TMC) e Isopar™ E en una concentración de 0,15 % P/V.

Como se detalló anteriormente, el protocolo de recubrimiento comprendía empapar el soporte poroso con una solución acuosa, seguido de una eliminación cuidadosa del exceso. Subsecuentemente, se aplicó solución orgánica y se formó una capa de poliamida, el exceso de solución orgánica se secó suavemente. Las membranas se almacenaron en agua miliQ antes de la prueba.

Propiedades de la vesícula: Ki 1412s-1, pH 9,83, potencial Zeta -0,339 (promedio), tamaño: 204nm (promedio), 100% población. Las dimensiones de las vesículas extruidas (diámetro hidrodinámico) se determinaron mediante dispersión de luz dinámica mediante el uso de ZetaSizer NanoZs de Malvern. El flujo de agua a través de los canales AQP se probó mediante el uso de un dispositivo de flujo detenido Bio-Logic SFM 300, mediante el uso de un monocromador a 517 nm y un filtro de corte a 530 nm. Para cada ensayo de flujo detenido individual, se mezclaron rápidamente 0,13 mL de polimerosoma extruido o polimerosomas de inserción de AQP con 0,13 mL de NaCl 0,5 M, lo que provocó la salida de agua de las vesículas que dio como resultado la contracción de las vesículas. Los datos cinéticos se ajustaron con una ecuación exponencial doble y la constante de velocidad (s-1) que es directamente proporcional al flujo de agua a través de la membrana polimérica.

La prueba se realizó en la configuración de ósmosis directa con sal 1 M como solución de extracción y calceína 5 pM como alimentación. La solución de extracción y alimentación se bombeó a contracorriente, con el lado activo de la solución de alimentación frente a la membrana. Los resultados se presentan a continuación en la Tabla 6.

Tabla 6:

Vesículas incorp. Jv Js Calceína R Js/Jv

Sí 11,17±1,61 1,23±0,25 99,80 ±0,14 0,14 ± 0,02

No 4,85±1,02 0,82±0,74 99,85±0,02 0,15±0,10 Comercialmente disponible >10 <3 >99 % <0,3

Las membranas que contienen vesículas modificadas con amino que incorporan proteína AqpZ dieron como resultado un rendimiento mejorado en comparación con las membranas sin vesículas. El flujo promedio de agua a través de la membrana (Jv) se mejoró en un 84 % (Jv=11,17 ±1,61 Lm-2h-1 contra Jv=4,85 ±1,02 Lm-2h-1), mientras que el rechazo de la calceína (R) se mantuvo en el nivel comparable (R>99 %). El flujo de sal inverso aumentó en promedio un 50 % al incorporar vesículas (Js= 1,23 ± 0,25 g-2h-1 contra Js=0,82 ±0,74 g-2h-1), sin embargo, el rendimiento global por medio del flujo salino específico Js/Jv permaneció en un nivel comparable (0,14 ± 0,02 para membrana con vesículas, en comparación con 0,15 ± 0,10 para membrana sin vesículas).

Los datos muestran que las vesículas decoradas con amino que incorporan proteínas de acuaporina son una forma eficaz de incorporar la proteína AqpZ en las membranas de poliamida, lo que da como resultado una mejora del flujo de agua, sin comprometer el flujo de sal específico. Sin desear limitarse a ninguna teoría en particular, se puede explicar que las vesículas que contienen grupos amina en la superficie no solo se incorporarán físicamente, sino que además se unirán químicamente en la capa de poliamida de la membrana TFC, debido a la presencia de la grupos amino reactivos. Estos grupos amino participarán en la reacción de polimerización interfacial con cloruro de acilo para obtener vesículas unidas covalentemente a la capa. El enlace covalente abre la posibilidad de una mayor carga de vesículas y, por lo tanto, un mayor flujo de agua a través de las membranas.

Ejemplo 5

Recubrimiento mediado por vacío

El soporte poroso se montó en una celda de succión con la capa activa mirando hacia arriba y debajo se aplicó una bomba de vacío, mirando hacia la capa inactiva. El soporte usado para la capa TFC fue el soporte microporoso MicroPES 1F PH de Membrana GmbH. Se vertieron 50 mL de solución acuosa que contiene MPD y la Formulación 10-2-10 en agua RO en la celda de succión, cubriendo el soporte poroso. Posteriormente, se aplicó una succión de 100 mBar durante 5 minutos, aspirando el MPD y la formulación sobre el soporte. Se apagó el vacío y se aplicaron 50 mL de solución orgánica que contiene TMC e Isopar-E y se dio 1 minuto de tiempo de reacción para facilitar la polimerización interfacial. Luego se lavó la solución orgánica y la membrana se purgó durante 3 minutos y luego se transfirió a una placa de Petri con agua RO hasta que estuvo lista para la prueba de control de calidad.

Formulación 10-2-10: 10 mg/mL de Pluronic f127 (poloxámero 407) - 2 mg/mL de Jeffamine M2005 - 10 mg/mL de solución madre de acuaporina en tampón PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na 10 IT1M2HPO4 y 2 mM de KH2PO4).

T l 7: Pr li m m r n m i ir r r rimi n m i r v í

Si bien el flujo de agua y el rechazo de calceína no diferían sustancialmente de los cupones de control, el flujo de sal fue significativamente menor en los cupones recubiertos con soluciones que contienen formulaciones opuesto a los controles recubiertos con una capa de TFC sin formulación. Esto indica que la presencia de la formulación disminuyó el flujo de sal (y por lo tanto aumentó el rechazo de sal). La prueba t no pareada de Student mostró una fuerte tendencia al comparar el flujo de sal de las membranas de control con las formulaciones, con valores de p que oscilaban entre 0,053191 (2 %) y 0,053386 (10 %). No parecía que un aumento en la concentración porcentual de la formulación en la solución acuosa usada para el recubrimiento influyera en el nivel de rechazo de sal.

Ejemplo 6

Vesícula decorada con amino que incorpora proteína transmembrana

Método de preparación de vesículas que incorporan Aquaporin Z:

1. Preparar una solución fresca de Pluronic® P-123 disolviendo el polímero en PBS hasta una concentración final de 10 mg/mL en un cilindro de vidrio.

2. Pesar en un matraz 15 mg/mL Jeffamine® M-2005.

3. Agregar la solución madre de Aquaporin Z a Jeffamine® M-frasco 2005, para obtener una concentración final de 1/200 AQPZ/P-123-relación proteína molar de Jeffamine.

4. Añadir Pluronic® P-123 solución preparada en la etapa 1 a la mezcla de Jeffamine® M-2005 y Aquaporin Z para alcanzar 9,9 mg/mL.

5. Agitar la mezcla durante la noche a 170 revoluciones por minuto (no más de 20 horas) a temperatura ambiente.

6. A la mañana siguiente, tomar la formulación de vesículas obtenida en la secuencia de las etapas 1 a 5, transferir al matraz de almacenamiento y mantener a temperatura ambiente.

Método de preparación de vesículas de control que no incorpora Aquaporin Z:

1. Preparar una solución fresca de Pluronic® P-123 disolviendo el polímero en PBS hasta una concentración final de 10 mg/mL en un cilindro de vidrio.

2. Pesar en un matraz 15 mg/mL Jeffamine® M-2005.

4. Añadir Pluronic® P-123 solución preparada en la etapa 1 a la mezcla de Jeffamine® M-2005 para llegar a 9,9 mg/mL.

5. Agitar la mezcla durante la noche a 170 revoluciones por minuto (no más de 20 horas) a temperatura ambiente.

6. A la mañana siguiente, tomar la formulación de vesículas obtenida en la secuencia de las etapas 1 a 5, transferir al matraz de almacenamiento y mantener a temperatura ambiente.

Las formulaciones de vesículas se ensayaron en tamaño, permeabilidad al agua y punto de vista del potencial zeta mediante DLS, potencial zeta y medidas de flujo detenido en NaCl 0,5 M.

Caracterización de vesículas:

Las dimensiones de las vesículas (diámetro hidrodinámico) se determinan mediante dispersión de luz dinámica mediante el uso de ZetaSizer Nano ZS de Malvern. El flujo de agua a través de la membrana de la vesícula se prueba mediante el uso de un dispositivo de flujo detenido (SF) Bio-Logic SFM 300, mediante el uso de un monocromador a 517 nm y un filtro de corte a 530 nm. Para cada ensayo SF individual, se mezclaron rápidamente 0,13 mL de polímerosomas o muestras de polímerosomas incrustados de AqpZ con 0,13 mL de NaCl 0,5 M, lo que provocó la salida de agua de las vesículas, lo que resultó en la contracción de las vesículas.

Tabla 8.

| Pluronic® vesículas sin Aquaporin Z | 147 ± 49 - 95 % | 33 ± 6 - 5 % | 3 | 9,9^ | 200 1

La tabla 8 muestra el coeficiente osmótico kI, que se calcula en función del crecimiento exponencial de los resultados de dispersión de luz de flujo detenido para las vesículas que incorporan Aquaporin Z y las en blanco. El análisis de crecimiento exponencial se realiza sobre la primera población de las estructuras que muestran la contracción más rápida. El coeficiente osmótico kI (s-1) es directamente proporcional al flujo de agua a través de la membrana polimérica y los resultados muestran que la presencia de acuaporinas en las vesículas aumenta significativamente el flujo de agua a través de la membrana polimérica. Las otras propiedades de las vesículas no se ven sustancialmente afectadas por la presencia de acuaporina Z, es decir, el diámetro hidrodinámico, el potencial zeta y el pH permanecen al mismo nivel.

Ejemplo 7

Método de preparación de membranas TFC FO que incorporan vesículas que reconstituyen Aquaporin Z:

a) Proporcionar una membrana de soporte, por ejemplo, PES no tejido que tenga una estructura en forma de dedo, tamaño 5,5 cm x 11 cm.

b) Preparar la solución de MPD en agua MiliQ, para obtener una concentración de 2,5 % (p/p). Si se van a incorporar acuaporinas a la membrana, añadir la solución de vesículas. La concentración final de la solución de MPD puede contener de 10 g/L a 100 g/L de solución de vesículas.

c) Preparar solución de TMC en Isopar E, para obtener 0,15 % (P/V)

d) Remojar la membrana en forma de rectángulo en solución de MPD para recubrir completamente la superficie de la membrana.

e) Transferir la membrana en forma de rectángulo de la solución de MPD para secar el lado que será el lado no activo en el papel de secado del laboratorio (por ejemplo, Kim-Wipe) durante 5 a 10 segundos.

f) Colocar la membrana en una placa de vidrio y séquela suavemente con N2 hasta que la superficie cambie de brillante a opaca.

g) Aplicar cinta alrededor de los bordes de la membrana (“ 1mm)

h) Transferir una placa de vidrio con la membrana sellada a un contenedor de vidrio y recubrir la membrana con solución de TMC, para recubrir completamente la superficie de la membrana.

i) Eliminar la placa de vidrio del reservorio y secar con N2 hasta que la superficie cambie de brillante a tenue. j) Colocar la membrana en una placa de vidrio en posición horizontal durante aproximadamente 10 segundos y eliminar la cinta.

k) Transferir la membrana al primer contenedor rellenado con MilliQ durante 5 minutos

l) Transferir la membrana al segundo contenedor rellenado con MilliQ para su almacenamiento, previa prueba descrita en etapas posteriores.

Ensayo de membranas TFC FO

A continuación, se montaron membranas TFC FO con formulación Aquaporin Z de 5,5 cm x 11 cm en una celda Sterlitech CF042 FO (www.sterlitech.com) y se sometió a pruebas de 200 minutos de duración en modo FO, mediante el uso de calceína 5 pM en agua desionizada (MilliQ) como alimentación y solución acuosa de NaCl 1 M como extracción y velocidades de alimentación y extracción de 50 mL/min.

Tabla 9.

La Tabla 9 muestra los resultados del experimento FO con membranas que incorporan vesículas que incorporan proteínas Aquaporin Z y la comparación con las en blanco (membranas de control). Se puede concluir que Jv aumenta por la incorporación de las vesículas que incorporan Aquaporina Z y que la Js/Jv se mantiene al mismo nivel.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una vesícula que incorpora una proteína transmembrana, en donde el material formador de vesículas comprende una mezcla de poli(etilenglicol)-b/oque-poli(propilenglicol)-b/oque-poli(etilenglicol) y polieteramina.

2. La vesícula de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el poli(etilenglicol)-b/oque-poli(propilenglicol)-b/oquepoli(etilenglicol) es un polímero sustancialmente lineal que tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 1.000 Da a aproximadamente 15.000 Da.

3. La vesícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el poli(etilenglicol)-b/oquepoli(propilenglicol)-b/oque-poli(etilenglicol) tiene la fórmula química:

en la que

x denota un número entero entre 10-30

y denota un número entero entre 50-100

z denota un número entero entre 10-30.

4. La vesícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la poliéteramina tiene la estructura general

en la que

m es un número entero de 1-15

n es un número entero de 5-50

R = CH3.

5. La vesícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la proteína transmembrana es un canal de agua acuaporina.

6. Un método para preparar vesículas que incorporan una proteína transmembrana que comprende las etapas de a. mezclar una solución acuosa de proteína transmembrana y polieteramina,

b. añadir poli(etilenglicol)-b/oque-poli(propilenglicol)-b/oque-poli(etilenglicol) como una solución acuosa a la mezcla preparada en la etapa a,

c. agitar la solución obtenida en la etapa b.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el poli(etilenglicol)-b/oque-poli(propilenglicol)-bloquepoli(etilenglicol) es un polímero sustancialmente lineal que tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 1.000 Da a aproximadamente 15.000 Da.

8. El método de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7, en donde el poli(etilenglicol)-b/oque-poli(propilenglicol)-b/oque-poli(etilenglicol) tiene la fórmula química:

en la que

x denota un número entero entre 10-30

y denota un número entero entre 50-100

z denota un número entero entre 10-30.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde la polieteramina tiene la estructura general

en la que

m es un número entero de 1-15

n es un número entero de 5-50

R = CH3.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde la proteína transmembrana es un canal de agua acuaporina.

11. Una membrana de separación que comprende una vesícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

12. La membrana de separación de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la membrana de separación comprende una capa activa que incorpora la vesícula y una membrana de soporte poroso.

13. Un método para preparar una capa compuesta de película delgada que inmoviliza vesículas que incorporan una proteína transmembrana en una membrana de sustrato porosa, que comprende las etapas de a. Proporcionar una solución acuosa que comprende las vesículas preparadas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 y un compuesto de diamina o triamina,

b. Cubrir la superficie de una membrana de soporte poroso con la solución acuosa de la etapa a, c. Aplicar una solución hidrófoba que comprende un compuesto de haluro de acilo, y

d. Permitir que la solución acuosa y la solución hidrófoba realicen una reacción de polimerización interfacial para formar la capa compuesta de película delgada.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la membrana de soporte poroso es una fibra hueca.

15. El método de acuerdo con las reivindicaciones 13 o 14, en donde la membrana de soporte poroso es una lámina plana.