ES2906173T3 - Composiciones peptídicas y procedimientos de uso - Google Patents

Abstract

Un compuesto de Fórmula 1, **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones peptídicas y procedimientos de uso

INVESTIGACIÓN O DESARROLLO CON PATROCINIO FEDERAL

Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo el número de concesión R44EY022512 otorgado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El gobierno tiene determinados derechos con respecto a esta invención.

ANTECEDENTES

Las composiciones peptídicas que protegen las células, especialmente las células de la retina, que incluyen, entre otros, fotorreceptores, el epitelio pigmentario de la retina (EPR) y las células ganglionares de la retina, que reciben información visual de los fotorreceptores, de la muerte celular mediada por vías extrínsecas, como la apoptosis mediada por Fas, la apoptosis mediada por TRAIL, la necroptosis mediada por TNF y la piroptosis, y los procedimientos de uso de las composiciones están descritas.

Varias causas importantes de pérdida de visión, como el desprendimiento de retina, el glaucoma y la degeneración macular, tienen un componente importante de señalización apoptótica, que a su vez conduce a la muerte celular programada en determinados tipos celulares muy importantes de la retina. Tres de estos tipos celulares son las células epiteliales pigmentadas de la retina, cuya pérdida se observa en el blanqueamiento de la retina, la retinosis pigmentaria y la forma seca de la degeneración macular relacionada con la edad, las células ganglionares de la retina, donde se observa la pérdida en el glaucoma, y las propias células fotorreceptoras, las principales células de señalización visual y cuya pérdida es la causa última de la pérdida de visión por enfermedades de la retina.

El desprendimiento de retina (DR), definido como la separación de la retina neurosensorial del EPR subyacente, da como resultado la muerte apoptótica de las células fotorreceptoras (Cook y col. 1995; 36(6):990-996; Hisatomi y col. Curr Eye Res. 2002; 24(3):161-172; Zacks y col. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003; 44(3):1262-1267.Yang y col. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004; 45(2):648-654). Los modelos de DR en roedores y felinos han demostrado la activación de las vías proapoptóticas casi inmediatamente después de que la retina se separa del EPR (Cook y col. 1995; 36(6):990-996; Hisatomi y col. Curr Ojo Res. 2002; 24(3):161-172; Zacks y col. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003; 44(3): 1262­ 1267. Yang y col. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004; 45(2):648-654). Los marcadores histológicos de apoptosis, como la tinción del etiquetado del extremo de la mella mediado por terminación desoxinucleotidil transferasa (TUNEL, por sus siglas en inglés), alcanzan un pico aproximadamente tres días después de la DR, con actividad apoptótica y muerte celular progresiva que persiste durante el período de desprendimiento. Esto también ha sido validado en desprendimientos de retina humanos (Arroyo y col. Am J Ophthalmol. 2005 Apr; 139(4):605-10). Sin embargo, la experiencia clínica en la reparación de desprendimientos de retina ha demostrado que existe una ventana de oportunidad para la reparación con preservación de cierta agudeza visual, pero que la agudeza visual disminuye significativamente a medida que se extiende el tiempo entre el desprendimiento y la reparación (Burton. Trans Am Ophthalmol Soc. 1982; 80:475-497; Ross y col. Ophthalmology. 1998; 105(11):2149-2153; Hassan y col. Ophthalmology. 2002; 109(1):146-152). La rápida tasa de activación de las vías pro-apoptóticas y la tasa más lenta de pérdida visual sugieren que los factores neuroprotectores intrínsecos pueden activarse dentro de la retina neural y pueden servir para contrarrestar los efectos de las vías proapoptóticas activadas por la separación del EPR retiniano.

La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) es la principal causa de pérdida permanente de la visión en los Estados Unidos (Bourne y col. Br J Ophthalmol. 2014; 98:629-638; Klein y col. Arco Oftalmol. 2011; 129:75-80; Cruciani y col. Clín Ter. 2011; 162:e35-42). La muerte de la retina externa (definida aquí como el complejo del epitelio pigmentario de la retina (EPR) y las células fotorreceptoras (FR)) es la causa principal de la pérdida de visión en la DMAE y limita la eficacia de los tratamientos actuales (Murakami y col. Prog Retin Ojo Res. 2013; 37:114-140; Huckfeldt y Vavvas. Clínica Int Oftalmol. 2013; 53:105-117). La interrupción de la homeostasis de FR-EPR da como resultado la muerte de FR. Fas se expresó significativamente en los ojos de las personas con degeneración macular asociada a la edad (DMAE) avanzada, definida como húmeda o atrófica, en comparación con controles sanos y se concentró más alrededor de las lesiones atróficas y neovasculares activas (Dunaief y col. Arch Ophthalmol. 2002; 120:1435-1442). El EPR es sensible a la apoptosis mediada por Fas en condiciones de estrés que se produce durante la progresión de la DMAE, como la inflamación o el estrés oxidativo, y se identificaron concentraciones más altas de ligando Fas soluble en pacientes con DMAE en comparación con sus contrapartes sanas de la misma edad (Jiang y col. Al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008; 37:114-140). De manera similar, el estrés oxidativo, que se produce durante la progresión de la DMAE, da como resultado una mayor expresión de Fas en el EPR (Lin y col. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011; 52:6308-6314) y la muerte del EPR que se produce en condiciones de estrés oxidativo depende de la señalización de Fas (Wang y col. Apoptosis. 2012; 17:1144-1155). Además, Fas se ha relacionado directamente con la muerte celular del EPR inducida por la acumulación de ARN Alu, otro factor reconocido de la patología de la DMAE (Kim y col. Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111:16082-16087). Se ha demostrado que el receptor TRAIL-RI (DR4), que funciona parcialmente a través de la misma vía, es un factor de riesgo genético para el receptor TRAIL-RI (DR4), que funciona parcialmente a través de la misma vía, se ha demostrado que es un factor de riesgo genético de degeneración macular relacionada con la edad. (Miyake y col. Invest Ophthalmol Vis Sci 56, 5353 (2015).

Fas también se ha implicado en la muerte de las células ganglionares de la retina asociada al glaucoma (Gregory y col. PLoS One. 2011; 6(3): e17659). Además, la presión intraocular (PIO) es un factor de riesgo importante para la progresión del glaucoma, y los modelos animales de PIO muestran una mayor expresión de Fas y FasL (Ju y col. Brain Res. 2006; 1122(1): 209-221) y muerte de las células ganglionares de la retina por apoptosis (Ji y col. Vision Res. 2005; 45(2): 169-179). Si bien el control de la PIO es un principio fundamental del tratamiento clínico del glaucoma, hay un número sustancial de pacientes que continúan experimentando progresión de la enfermedad incluso después de un control adecuado de la PIO,y el trabajo adicional ha reforzado la idea de que es necesario abordar otros factores que contribuyen al glaucoma (Kamat y col. Semin Ophthalmol. 2016; 31(1-2):147-154).

La apoptosis, o muerte celular programada, juega un papel central en el desarrollo y la homeostasis de todos los organismos multicelulares. Las alteraciones en las vías apoptóticas se han implicado en muchos tipos de patologías humanas, incluidos trastornos del desarrollo, cáncer, enfermedades autoinmunes, así como trastornos neurodegenerativos y degradación de la retina. Es una vía estrictamente regulada que rige los procesos de muerte de las células individuales y puede iniciarse de forma extrínseca o intrínseca. Este último es un mecanismo intracelular desencadenado por las mitocondrias, mientras que el primero implica la interacción de un 'receptor de muerte' con su ligando correspondiente en la membrana celular. Por tanto, las vías de muerte celular programada se han convertido en dianas atractivas para el desarrollo de agentes terapéuticos. En particular, dado que es conceptualmente más fácil matar células que mantenerlas, la atención se ha centrado en las terapias contra el cáncer que utilizan agentes proapoptóticos. Sin embargo, hay muchas enfermedades en las que la activación inadecuada de las vías apoptóticas conduce a la degeneración de los tejidos, y se deben idear tratamientos para bloquear cualquier vía apoptótica, intrínseca o extrínseca, que se haya activado en esta patología particular.

El receptor Fas es el más común de los receptores de muerte involucrados en la apoptosis en enfermedades degenerativas de la retina. (Chinsky y col. Curr Opin Ophthalmol. 201425(3); 228-233) Fas es un receptor típico de superficie celular de citoquinas y se activa por trimerización cuando se une a su ligando cognado trimérico FasL. Las células retinianas estresadas, por ejemplo, los fotorreceptores después de un DR, regulan al alza el receptor Fas. Las células inmunitarias invasoras, atraídas por la respuesta al estrés, expresan el ligando Fas de la proteína transmembrana (FasL) en su superficie. FasL se une a los receptores Fas en las células de la retina, lo que lleva a una rápida activación de la vía de muerte celular extrínseca con señalización a través de la cascada de caspasas. Inicialmente, la caspasa-8 "iniciadora" se escinde en una forma activa, que a su vez activa la caspasa 3, un "verdugo" corriente abajo de la ruta de muerte celular apoptótica. Sin embargo, en los ojos de ratones infectados con citomegalovirus murino, se ha demostrado que Fas, así como los receptores de muerte relacionados TNFRI y TRAIL, se activan, y esta actividad puede provocar apoptosis, necroptosis y piroptosis en las células del ojo. (Chien y Dix J Virol 86, 10961 (2012))

Se ha demostrado que las células fotorreceptoras en cultivo son muy sensibles a la apoptosis inducida por FasL, lo que sugiere que la apoptosis inducida por FasL es uno de los principales contribuyentes a la pérdida de visión en las enfermedades de la retina. (Burton. Trans Am Ophthalmol Soc. 1982; 80:475-497; Ross y col. Ophthalmology. 1998; 105(11):2149-2153; Hassan y col. Ophthalmology. 2002; 109(1):146-152.) Además, un pequeño péptido inhibidor del receptor Fas, Met-12, H6°HiYlGAVNYIY71(SEQ ID NO:2) derivado del dominio extracelular de unión a Fas de la oncoproteína Met, (Zou y col. Nature Medicine 13, 1078 (2007) ha demostrado ser protector de los fotorreceptores, tanto en experimentos de cultivo celular como en el contexto de la separación de la retina y del epitelio pigmentario de la retina y otras afecciones o enfermedades oculares (Besirli y col., Invest Ophthalmol Vis Sci., 51(4):2177-84 (2010); Patente de EE.UU. N.° 8.343.931). Además, se ha demostrado que c-Met, que presumiblemente usa el mismo dominio de unión con homología con Met-12, FasL, TNAa y TRAIL, bloquea la apoptosis inducida por TRAIL en varios tumores. (Du y col. PLoS One 9, e95490 (2014))

El propio péptido Met-12 tiene propiedades biofarmacéuticas, dominadas por su solubilidad acuosa extremadamente baja. Los experimentos han demostrado claramente que Met-12 tiene que dosificarse como una solución, tanto in vitro como in vivo, para mostrar una actividad óptima, y producir tales soluciones en un medio principalmente acuoso ha demostrado ser muy difícil, especialmente en condiciones aceptables para la inyección intravítrea. La dosificación de suspensiones o geles de Met-12 conduce a importantes pérdidas de potencia. Por ejemplo, incluso una solución aparentemente clara de 10 mg/mL de Met-12 en tampón citrato de 20 mM y pH 2,8 mostró una considerable pérdida de material al filtrarla, y cuando se utilizó en los ensayosin vitro e in vivo que se describen a continuación, dio lugar a una pérdida de actividad de al menos cinco veces. A pesar del extenso trabajo de desarrollo, las únicas formulaciones de solución de Met-12 que se han encontrado involucran algunas inyecciones de solución de pH muy bajo (<pH 2,8) o inyecciones de DMSO puro, todas las cuales son subóptimas para inyecciones intravítreas.

Como tales, las composiciones peptídicas que protegen las células de la retina, incluidos, entre otros, los fotorreceptores, las células ganglionares de la retina y el epitelio pigmentario de la retina, de la muerte celular de la vía extrínseca, incluida la apoptosis mediada por Fas y TRAIL, que son fáciles de formular en una solución o suspensión, que se puede administrar en el ojo de manera que se cree una exposición suficiente, sin el uso de excipientes que puedan causar toxicidad ocular (u otra), y que sea fácil de usar, aún se necesita para ayudar a preservar la visión.

El documento US2010226878 describe procedimientos para prevenir la muerte de los fotorreceptores. En particular,el documento US2010226878describe péptidos que previenen la apoptosis de fotorreceptores mediada por FAS. Cagri B. Besirli y col. "Inhibition of Retinal Detachment-Induced Apoptosis in Photoreceptors by a Small Peptide Inhibitor ofthe Fas Receptor", Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2010, vol. 51, no. 4, 2166-2194, analizan los efectos de Met-12 sobre la activación de vías de apoptosis extrínseca e intrínseca después del desprendimiento de retina.

El documento WO2007064997 describe compuestos, composiciones y procedimientos para inhibir la apoptosis y para el tratamiento de afecciones relacionadas con la misma.

Kyun-Hwan Kim y col. "Peptide amidation: Production of peptide hormones in vivo and in vitro" Biotechnology and Bioprocesses Engineering, 2001, vol 6, no.4, 244-251, analizan la amidación, con especial énfasis en la producción industrial de hormonas peptídicas.

El documento US6001962 describe polipéptidos modificados que son capaces de interaccionar con el receptor Fas, ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos, líneas celulares capaces de expresar estos ácidos nucleicos y secretar los polipéptidos, y anticuerpos que son específicamente inmunorreactivos con estos polipéptidos.

El documento US2014371161 describe procedimientos y usos de péptidos C-terminales para inhibir la muerte o disfunción de las células neuronales, como la muerte o disfunción de las células ganglionares de la retina, el tratamiento de trastornos degenerativos de la retina, accidentes cerebrovasculares, lesiones del SNC y del SNP. La descripción también se refiere a los péptidos C-terminales, proteínas de fusión y composiciones de los mismos. RESUMEN

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un compuesto de fórmula I

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En un segundo aspecto, se proporciona una sal de poliacetato o una sal de triacetato del compuesto de fórmula I. En un tercer aspecto, se proporciona una composición que comprende el compuesto de sal descrito en el presente documento y un vehículo farmacéutico configurado para administración ocular.

En el presente documento se proporcionan preparaciones farmacéuticas de formulaciones acuosas biológicamente activas de un péptido protector de fotorreceptores, preparaciones farmacéuticas de los mismos, cuyas preparaciones pueden emplearse en procedimientos para prevenir la muerte de fotorreceptores.

Compuesto I. His-His-Ile-Tyr-Leu-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Ile-Tyr-amide (SEQ ID NO:I).

Algunas realizaciones se refieren al Compuesto I (anterior), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Determinadas otras realizaciones se relacionan con una sal de poliacetato del Compuesto I. Determinadas realizaciones adicionales se relacionan con una sal detriacetato del Compuesto I. Los compuestos pueden usarse en una formulación farmacéutica para prevenir la apoptosis mediada por Fas o TRAIL en los fotorreceptores del ojo. Los compuestos pueden usarse en una formulación farmacéutica para prevenir la apoptosis mediada por Fas en células del epitelio pigmentado de la retina del ojo. Los compuestos pueden usarse en una formulación farmacéutica para el tratamiento del desprendimiento de retina. Los compuestos pueden usarse en una formulación farmacéutica para el tratamiento de enfermedades de las células ganglionares de la retina, como el glaucoma. En determinadas otras realizaciones, los compuestos pueden usarse en una formulación farmacéutica para el tratamiento de enfermedades o afecciones oculares, que incluyen las siguientes: maculopatías/degeneración de la retina, tal como: degeneración macular, incluyendo degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), tal como degeneración macular no exudativa relacionada con la edad y degeneración macular exudativa relacionada con la edad; neovascularización coroidea; retinopatía, incluyendo retinopatía diabética, neurorretinopatía macular aguda y crónica, coriorretinopatía serosa central; y edema macular, incluyendo edema macular cistoide y edema macular diabético; uveitis/retinitis/choroiditis, tales como epiteliopatía pigmentaria placoide multifocal aguda, enfermedad de Behcet, retinocoroidopatía en perdigones, infecciosa (sífilis, enfermedad de Lyme, tuberculosis, toxoplasmosis), uveítis, incluida la uveítis intermedia (pars planitis) y uveítis anterior, coroiditis multifocal, síndrome de múltiples puntos blancos evanescentes (MEWDS), sarcoidosis ocular, escleritis posterior, coroiditis serpignosa, fibrosis subretiniana, síndrome de uveítis y síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada; vascular diseases/exudative enfermedades, tales como: enfermedad oclusiva arterial retiniana, oclusión de la vena central de la retina, coagulopatía intravascular diseminada, oclusión de la vena retiniana de rama, cambios hipertensivos del fondo de ojo, síndrome isquémico ocular, microaneurismas arteriales retinianos, enfermedad de Coats, telangiectasia parafoveal, oclusión de la vena hemirretiniana, papiloflebitis, oclusión de la arteria central de la retina, oclusión de la rama de la arteria retiniana, enfermedad de la arteria carótida (CAD), angeítis en rama escarchada, retinopatía de células falciformes y otras hemoglobinopatías, estrías angioides, vitreorretinopatía exudativa familiar, enfermedad de Eales, enfermedades traumáticas/quirúrgicas: oftalmía simpática, enfermedad retiniana uveítica, desprendimiento de retina, traumatismo, láser, TFD, fotocoagulación, hipoperfusión durante la cirugía, retinopatía por radiación, retinopatía por trasplante de médula ósea; trastornos proliferativos, tales como: retinopatía vítrea proliferativa y membranas epirretinianas, retinopatía diabética proliferativa. Trastornos infecciosos: histoplasmosis ocular, toxocariasis ocular, síndrome de histoplasmosis ocular (SHO), endoftalmitis, toxoplasmosis, enfermedades de la retina asociadas con la infección por VIH, enfermedad coroidea asociada con la infección por VIH, enfermedad uveítica asociada con la infección por VIH, retinitis viral, necrosis retiniana aguda, necrosis progresiva de la retina externa, enfermedades fúngicas de la retina, sífilis ocular, tuberculosis ocular, neurorretinitis subaguda unilateral difusa y miasis; trastornos genéticos, tales como: retinitis pigmentosa, trastornos sistémicos con distrofias retinianas asociadas, ceguera nocturna estacionaria congénita, distrofias de conos, enfermedad de Stargardt y fundus flavimaculatus, enfermedad de Best, distrofia en patrón del epitelio pigmentario de la retina, retinosquisis ligada al cromosoma X, distrofia de fundus de Sorsby, maculopatía concéntrica benigna, distrofia cristalina de Bietti, pseudoxantoma elástico. Desgarros/agujeros de la retina: desprendimiento de retina, agujero macular, desgarro retiniano gigante; tumores, tales como: enfermedad retiniana asociada a tumores, hipertrofia congénita del EPR, melanoma uveal posterior, hemangioma coroideo, osteoma coroideo, metástasis coroidea, hamartoma combinado de retina y epitelio pigmentario retiniano, retinoblastoma, tumores vasoproliferativos del fondo de ojo, retina astrocitoma, tumores linfoides intraoculares; y otras enfermedades y afecciones tales como: coroidopatía interna punteada, epiteliopatía pigmentaria placoide multifocal posterior aguda, degeneración retiniana miópica, epitelitis pigmentaria retiniana aguda, distrofias o displasias corneales, y similares.

Otras realizaciones se refieren a una composición que incluye el Compuesto I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo (p. ej., sal de poliacetato y sal de triacetato), y un vehículo farmacéutico configurado para administración ocular. La composición puede formularse para administración intraocular, intravítrea o periocular. El Compuesto I, o una salfarmacéuticamente aceptable del mismo dentro de la composición, protege las células fotorreceptoras de retina desprendidas. El Compuesto I, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables dentro de la composición, previene la muerte celular por vía extrínseca, incluida la apoptosis en las células del epitelio pigmentado de la retina del ojo. El Compuesto I, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables dentro de la composición, previene enfermedades de las células ganglionares de la retina, como el glaucoma. La composición es estéril, apirógena y no tóxica para los ojos. La composición puede incluir además al menos un tensioactivo no iónico. El al menos un tensioactivo no iónico puede ser Polisorbato 80, Polisorbato 20, Poloxámero o Tiloxapol, pero no se limita a estos ejemplos. El al menos un tensioactivo no iónico puede formar aproximadamente del 0,01 % al 20 % p/p de la composición; de modo alternativo, aproximadamente del 0,05 % al 10 % p/p de la composición; y de modo alternativo, aproximadamente del 0,1 % al 3 % p/p de la composición. Alternativamente, se puede usar una mezcla de tensioactivos no iónicos, donde al menos dos de los mencionados anteriormente, u otros tensioactivos no iónicos, se usan juntos en una proporción que optimice la farmacocinética deseada de la formulación, donde las cantidades totales de los tensioactivos se encuentran dentro de los límites descritos anteriormente. La composición puede incluir además un codisolvente orgánico, como propilenglicol o dimetilsulfóxido. El cosolvente orgánico puede formar aproximadamente del 1 % al 50 % p/p de la composición; de modo alternativo, aproximadamente del 1 % al 20 % p/p de la composición; y de modo alternativo, aproximadamente del 1 % al 5 % p/p de la composición. También se puede agregar un agente de isotonicidad, como trehalosa, manitol o sorbitol, o una sal inorgánica soluble, como NaCl, para llevar la tonicidad de la solución al intervalo de 250-400 mOsm/L. La composición puede tener un pH en el intervalo de 2,5 a 6,0 y tamponarse por medios conocidos por los expertos en la técnica.

Otra realización se refiere a la composición que incluye el Compuesto I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéutico configurado para administración óptica para el uso en un procedimiento para tratar una afección ocular, enfermedad o afección o enfermedad que afecta la salud ocular en un sujeto padezca la afección, enfermedad ocular, o afección o enfermedad que afecte la salud ocular. La afección ocular, enfermedad o afección que afecta a la salud ocular puede ser desprendimiento de retina, degeneración macular, degeneración macular asociada a la edad, degeneración macular asociada a la edad no exudativa, degeneración macular asociada a la edad exudativa, neovascularización coroidea, retinopatía, retinopatía diabética, neurorretinopatía macular aguda y crónica, coriorretinopatía serosa central, edema macular, edema macular cistoide, edema macular diabético, uveítis/retinitis/coroiditis, epiteliopatía pigmentaria placoidea multifocal, enfermedad de Behcet, retinocoroidopatía en perdigones, infecciosa (sífilis, enfermedad de Lyme, tuberculosis, toxoplasmosis), uveítis, uveítis intermedia (pars planitis), uveítis anterior, coroiditis multifocal, síndrome de múltiples puntos blancos evanescentes (MEWDS), sarcoidosis ocular, escleritis posterior, coroiditis serpiginosa, fibrosis subretiniana, síndrome de uveítis, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada; enfermedad oclusiva arterial de la retina, oclusión de la vena central de la retina, coagulopatía intravascular diseminada, oclusión de la vena ramificada de la retina, cambios hipertensivos del fondo de ojo, síndrome isquémico ocular, microaneurismas arteriales de la retina, Enfermedad de Coats, telangiectasias parafoveales, oclusión de la vena hemirretiniana, papiloflebitis, oclusión de la arteria central de la retina, oclusión de la rama de la arteria retiniana, enfermedad de la arteria carótida (EAC), angeítis en rama escarchada, retinopatía falciforme y otras hemoglobinopatías, estrías angioides, vitreorretinopatía exudativa familiar, enfermedad de Eales, oftalmia simpática, retinopatía uveítica, desprendimiento de retina, traumatismos, láser, TFD, fotocoagulación, hipoperfusión durante la cirugía, retinopatía por radiación, retinopatía por trasplante de médula ósea, retinopatía vítrea proliferativa y membranas epirretinianas, retinopatía diabética proliferativa, histoplasmosis ocular, toxocariasis ocular, síndrome de histoplasmosis ocular (SHO), endoftalmitis, toxoplasmosis, enfermedades de la retina asociadas a la infección por el VIH, enfermedad coroidea asociada a la infección por el VIH, enfermedad uveítica asociada a la infección por el VIH, retinitis vírica, necrosis retiniana aguda, necrosis retiniana externa progresiva, enfermedades fúngicas de la retina, sífilis ocular, tuberculosis ocular, neurorretinitis difusa unilateral subaguda, miasis, retinosis pigmentaria, trastornos sistémicos con distrofias retinianas asociadas, ceguera nocturna estacionaria congénita, distrofias de los conos, enfermedad de Stargardt, fundus flavimaculatus, enfermedad de Best, distrofia en patrón del epitelio pigmentario de la retina, retinosquisis ligada al cromosoma X, distrofia de Sorsby del fondo del ojo, maculopatía concéntrica benigna, distrofia cristalina de Bietti, pseudoxantoma elástico, desprendimiento de retina, agujero macular, desgarro retiniano gigante, enfermedad de la retina asociada a tumores, hipertrofia congénita del EPR, melanoma uveal posterior, hemangioma coroideo, osteoma coroideo, metástasis coroideas, hamartoma combinado de retina y epitelio pigmentario retiniano, retinoblastoma, tumores vasoproliferativos del fondo de ojo, astrocitoma de la retina, tumores linfoides intraoculares, coroidopatía punctata interna, pigmentopatía placoide posterior multifocal aguda, degeneración retiniana miópica, homeostasis anormal del epitelio pigmentario de la retina, epitelitis pigmentaria aguda de la retina, glaucoma, distrofias o displasias de la córnea, y similares. La composición se puede administrar en una cantidad suficiente para atenuar la muerte celular en el sujeto. La composición se administra en una cantidad suficiente para potenciar la supervivencia de los fotorreceptores en dicho sujeto. La composición se administra en una cantidad suficiente para proteger las células del epitelio pigmentado de la retina en dicho sujeto. La composición se administra en una cantidad suficiente para proteger las células ganglionares de la retina, en dicho sujeto.

Otra realización se refiere a una composición que incluye el Compuesto I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéutico no pirógeno estéril, para usar en un procedimiento para prevenir la muerte de células ganglionares de la retina, EPR o fotorreceptores que comprende administrar a un sujeto la composición que incluye el Compuesto I, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y un vehículo farmacéutico no pirógeno estéril. La muerte celular de fotorreceptores, EPR o células ganglionares de la retina es la apoptosis de fotorreceptores o células EPR mediada por Fas. El sujeto puede estar en riesgo de muerte celular de fotorreceptores, EPR o células ganglionares de la retina. La composición se puede administrar al sujeto por vía intraocular, intravítrea o periocular.

Otra realización más se refiere a una composición que comprende el Compuesto I, o una sal farmacéuticamente aceptable del msimo, para el uso en un procedimiento para aumentar la supervivencia de los fotorreceptores, EPR o células ganglionares de la retina, incluida la administración de la composición protectora de fotorreceptores, EPR o ganglios de la retina que comprende el Compuesto I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. El aumento de la supervivencia de fotorreceptores, EPR o células ganglionares de la retina comprende inhibir la apoptosis de fotorreceptores, EPR o células ganglionares de la retina. La muerte celular de fotorreceptores, EPR o células ganglionares de la retina comprende la apoptosis de fotorreceptores, EPR o células ganglionares de la retina mediada por Fas. La muerte celular de fotorreceptores, EPR o células ganglionares de la retina comprende la apoptosis de fotorreceptores, EPR o células ganglionares de la retina mediada por TRAIL. La muerte celular de fotorreceptores, EPR o células ganglionares de la retina comprende la apoptosis de fotorreceptores, EPR o células ganglionares de la retina mediada por TNFR. La muerte celular de fotorreceptores, EPR o células ganglionares de la retina comprende la piroptosis mediada por la vía extrínseca de fotorreceptores, EPR o células ganglionares de la retina. La composición puede administrarse al sujeto sistémicamente mediante inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular, o por vía oral o local, es decir, por vía intraocular, intravítrea, tópica, supracoroidea, subconjuntival, subretiniana o periocular.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra un gráfico que representa el bloqueo de la activación de la caspasa 8 inducida por Fas por Met 12 y el trihidrocloruro del Compuesto I en células 661W. Las células 661W fueron pretratadas con varias cantidades de Met-12 o Compuesto I disuelto en DMSO, ambos a 20 mg/mL durante 1 h. A continuación, se añadió FasL (500 ng/mL), y se midió la actividad de la caspasa 8 a las 48 horas después del tratamiento con FasL. La Figura 2 muestra un gráfico que representa el bloqueo de la activación de caspasa 8 inducida por Fas por Met-12 y trihidrocloruro del Compuesto I en células 661W. Se pretrataron células 661W durante 1 h con diversas cantidades de Met-12 en DMSO (círculo), Compuesto I en DMSO (20 mg/mL diamante) y el Compuesto I en Polisorbato (PS) 20 al 2 %, formulación de propilenglicol (PG) al 2 % pH 4 (triángulo), todas las formulaciones a una concentración de 10 mg/mL. A continuación, las células se trataron con FasL (500 ng/mL) y la actividad de caspasa 8 se midió 48 horas después del tratamiento con FasL.

La Figura 3 muestra un gráfico que representa el bloqueo de la activación de caspasa 8 inducida por Fas por el trihidrocloruro del Compuesto I en células 661W. Las células 661W se pretrataron durante 1 hora con varias cantidades del Compuesto I en DMSO (20 mg/mL) (círculo), y en Polisorbato 20 al 3 %, formulación de propilenglicol al 3 %pH 4 (triángulo), y en Polisorbato 20 al 1 %, formulación de propilenglicol al 3 % pH 4 (diamante), todas las formulaciones a una concentración de 10 mg/mL. A continuación, las células se trataron con FasL (500 ng/mL) y la actividad de caspasa 8 se midió 48 horas después del tratamiento con FasL.

La Figura 4 muestra un gráfico que representa el bloqueo de la activación de caspasa 8 inducida por Fas por trihidrocloruro del Compuesto I en células 661W. Las células 661W se pretrataron con varias cantidades de trihidrocloruro del Compuesto I en DMSO (20 mg/mL) (círculo), y en una formulación de Polisorbato-20 al 0,4 %, manitol al 4,5 %, acetato 10 mM, pH 4 (triángulo), a una concentración de 2 mg/mL. A continuación, las células se trataron con FasL (500 ng/mL) y la actividad de caspasa 8 se midió 48 horas después del tratamiento con FasL. La Figura 5a representa un gráfico logarítmico de las concentraciones en retina de conejo del Compuesto I administrado por vía intravítrea en tres formulaciones de Poloxámero.

La Figura 5b representa un gráfico logarítmico de las concentraciones de Compuesto I en retina de conejo administradas por vía intravítrea para comparar una formulación basada en Poloxámero 407 con una formulación basada en Polisorbato-20 a lo largo del tiempo.

La Figura 6a muestra un gráfico lineal de las concentraciones de humor vítreo (HV) de conejo a lo largo del tiempo del Compuesto I administrado por vía intravítrea en tres formulaciones de Poloxámero con concentraciones variables de tensioactivo (0,4 % o 0,1 %) y concentraciones variables del Compuesto I (2 mg/mL frente a 0,5 mg/mL).

La Figura 6b muestra un gráfico lineal de las concentraciones de HV en conejos a lo largo del tiempo con diferentes opciones de tensioactivo (0,4 % de Poloxámero 407 frente a 0,4 % de Polisorbato 20) y cantidades variables de compuesto I (2 mg/mL frente a 1 mg/mL)

La Figura 7 muestra las cantidades totales de triacetato del Compuesto I en el humor vítreo (oscuro) y lasconcentracionesen las retinas (claro) de ratas Brown Norway 24 y 72 horas después de una inyección nominal de 300 ng de triacetato del Compuesto I (5 pL de 0,06 mg/mL) en manitol al 4,5 %, ácido acético 10 mM, Poloxámero al 0,4 % (PX) 407, pH 4,5

La Figura 8 muestra un gráfico de barras que representa el número de células apoptóticas después de 72 horas despuésde tratamientos in vivode retinas desprendidas en ratas con trihidrocloruro de Met-12 (raya clara) (5 pg en 5 pL de DMSO) y trihidrocloruro de Compuesto I (oscuro) (0,5, 1,0, 5 y 10 pg en 5 pL de DMSO) o vehículo DMSO (ligero). La barra LHS es una retina de control no separada, sin inyección.

La Figura 9 muestra un gráfico de barras que representa el número de células apoptóticas después de 72 horas después de tratamientos in vivo de retinas desprendidas en ratas con trihidrocloruro del Compuesto I (1,0 y 5 pg en 5 pL de F1 o F2), frente a lo mismo (5pg en 5 pL) en DMSO o vehículo DMSO (gris). La barra LHS es una retina de control no separada, sin inyección. F1 (5/1 pg) es 1,0/0,2 mg/mL de trihidrocloruro del compuesto I en PG al 3 %/PS-20 al 3 % a pH 4,0 (negro), y F2 (5/1 pg) es 1,0/0,2 mg/mL de trihidrocloruro del compuesto I en PG al 2 %/PX-407 al 2 % a pH 4,0 (rayas verticales).

La Figura 10 muestra un gráfico de barras que representa el porcentaje de células apoptóticas después de 72 horas después de tratamientos in vivo de retinas desprendidas en ratas. La barra I es un vehículo de control en las retinas desprendidas. Barra 2 con 1 pg de triacetato del Compuesto I como solución de DMSO de 0,2 mg/mL. Barra 3 es 1 pg de trihidrocloruro del Compuesto I como solución de DMSO de 0,2 mg/mL. La barra 4 es una retina de control no separada, sin inyección.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Se describen composiciones peptídicas biológicamente activas, preparaciones farmacéuticas de composiciones peptídicas biológicamente activas y procedimientos para usar las composiciones peptídicas.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un fármaco o agente (p. ej., Compuesto I) eficaz para facilitar un efecto terapéutico deseado en una clase particular de sujeto (p. ej., lactante, niño, adolescente, adulto). Tal y como se utiliza en este documento, el término "subterapéutico" se refiere a una cantidad de un fármaco o agente farmacéutico que es insuficiente para lograr el resultado terapéutico deseado y/o previsto tras su administración a un sujeto medio y/o típico (por ejemplo, de tamaño medio, que no toma agentes farmacéuticos contraindicados, que tiene una reacción a la dosis similar a la de la mayoría de la población, etc.). Las dosis recomendadas por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) son indicativas de una dosis terapéutica.

Como se usa en el presente documento, los términos "fármaco farmacéutico" o "agente farmacéutico" se refieren a un compuesto, péptido, macromolécula u otra entidad que se administra (p. ej., dentro del contexto de una composición farmacéutica) a un sujeto para provocar una respuesta biológica deseada. Un agente farmacéutico puede ser un "fármaco" o cualquier otro material (p. ej., péptido, polipéptido), que es biológicamente activo en un ser humano u otro mamífero, localmente y/o sistémicamente. Algunos ejemplos de medicamentos están descritos en Merck Index y Physicians Desk Reference.

Como se usa en el presente documento, el término "formulación farmacéutica" se refiere a al menos un agente farmacéutico (p. ej., el Compuesto I) en combinación con uno o más componentes adicionales que ayudan a hacer que el agente farmacéutico sea adecuado para lograr el efecto deseado tras administración a un sujeto. La formulación farmacéutica puede incluir uno o más aditivos, por ejemplo, excipientes, vehículos, mejoradores de la penetración, recubrimientos, estabilizadores, tampones, ácidos, bases u otros materiales farmacéuticamente aceptables asociados físicamente con el agente farmacéutico para mejorar la administración, la liberación (p. ej., tiempo de liberación), entregabilidad, biodisponibilidad, efectividad, etc. de la forma de dosificación. La formulación puede ser, por ejemplo, un líquido, una suspensión, un sólido, una nanopartícula, una emulsión, una micela, un ungüento, un gel, una emulsión, un recubrimiento, etc. Una formulación farmacéutica puede contener un solo agente farmacéutico (p. ej., el Compuesto I) o múltiples agentes farmacéuticos. Una composición farmacéutica puede contener una sola formulación farmacéutica o múltiples formulaciones farmacéuticas. En algunas realizaciones, un agente farmacéutico (p. ej., Compuesto I) se formula para un modo particular de administración (p. ej., administración ocular (p. ej., administración intravítrea, etc.), etc.). Una formulación farmacéutica es estéril, no pirógena y no tóxica para los ojos.

Tal como se usa en esta invención, la expresión “composición farmacéutica” se refiere a la combinación de un agente activo con un portador inerte o activo, que hace que la composición sea especialmente adecuada para el uso diagnóstico o terapéuticoin vivo o ex vivo. Una composición farmacéutica comprende la entidad física que se administra a un sujeto, y puede adoptar la forma de dosificación sólida, semisólida o líquida, como comprimido, cápsula, comprimido de disolución oral, píldora, polvo, supositorio, solución, elixir, jarabe, suspensión, crema, pastilla, pasta, spray, etc. Una composición farmacéutica puede comprender una única formulación farmacéutica (p. ej., liberación prolongada, liberación inmediata, liberación retardada, nanopartículas, etc.) o formulaciones múltiples (p. ej., liberación inmediata y liberación retardada, nanopartículas y no nanopartículas, etc.). Los términos "composición farmacéutica" y "formulación farmacéutica" pueden usarse indistintamente.

Como se usa en esta invención, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar, como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones (p. ej., como emulsiones aceite/agua o agua/aceite), y varios tipos de agentes humectantes. Las composiciones también pueden incluir estabilizadores y conservantes. Para ejemplos de vehículos, estabilizadores y adyuvantes, véase, por ejemplo,Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, Pa. [1975].

Como se usa en esta invención, el término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier ácido o base de un agente farmacéutico o un metabolito activo o residuo del mismo. Como saben los expertos en la técnica, las «sales» de los compuestos de la presente invención se pueden derivar de ácidos y bases inorgánicos u orgánicos. Los ejemplos de ácidos incluyen, de modo no taxativo, ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, láctico, salicílico, succínico, tolueno-p-sulfónico, tartárico, acético, cítrico, metanosulfónico, etanosulfónico, fórmico, benzoico, malónico, naftaleno-2-sulfónico, bencenosulfónico y similares. Se pueden emplear otros ácidos, tales como los oxálicos, aunque no sean farmacéuticamente aceptables en sí mismos, en la preparación de sales útiles como intermedios para obtener los compuestos de la invención y sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables.

Como se usa en esta invención, el término "administración" se refiere al acto de administrar un fármaco, profármaco u otro agente, o tratamiento terapéutico (p. ej., composiciones de la presente invención) a un sujeto (p. ej., un sujeto o in vivo, in vitro o células , tejidos y órganosex vivo). Vías ejemplares de administración al cuerpo humano pueden ser a través de los ojos (oftálmica), boca (oral), piel (transdérmica), nariz (nasal), pulmones (inhalante), mucosa oral (bucal), oreja, rectal, por inyección (por ejemplo, por vía intravenosa, por vía subcutánea, por vía intratumoral, por vía intraperitoneal, etc.) y similares.

Como se usa en esta invención, el término "coadministración" se refiere a la administración de al menos dos agentes (p. ej., el Compuesto I y uno o más agentes terapéuticos adicionales) o terapias a un sujeto. En algunas realizaciones, la administración conjunta de dos o más agentes/terapias es concurrente. En otras realizaciones, la administración conjunta de dos o más agentes/terapias es secuencial (por ejemplo, una primer agente/terapia se administra antes de un segundo agente/terapia). En algunas realizaciones, las dos o más terapias se administran simultáneamente, pero se liberan (p. ej., se absorben, se vuelven biodisponibles, etc.) secuencialmente. Los expertos en la técnica entienden que las formulaciones y/o vías de administración de los distintos agentes/terapias utilizados puede variar. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente la dosificación adecuada para la coadministración. En algunas realizaciones, cuando los agentes/terapias son coadministrados, los respectivos agentes/terapias se administran en dosis más bajas que las adecuadas para su administración sola.

La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.

En esta invención se proporcionan preparaciones farmacéuticas de formulaciones acuosas biológicamente activas de un péptido protector de fotorreceptores, preparaciones farmacéuticas de las mismas y procedimientos para prevenir la muerte de los fotorreceptores con las mismas, así como procedimientos terapéuticos.

Compuesto I. His-His-Ile-Tyr-Leu-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Ile-Tyr-amide (SEQ ID NO:I); Fórmula I.

Algunas realizaciones se refieren al Compuesto I (anterior), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Determinadas realizaciones se refieren a una sal de poliacetato del Compuesto I. Determinadas realizaciones adicionales se refieren a una sal de triacetato del Compuesto I.

Los compuestos pueden usarse en una formulación farmacéutica para prevenir la apoptosis mediada por Fas o TRAIL en los fotorreceptores del ojo. En un modelo de toxicidad de fotorreceptores inducido por FasL, en células 661W, el Compuesto I es 10 veces más potente para prevenir la activación de la caspasa 8 que Met-12 según IC50, y aproximadamente 3 veces más potente que Met-12 medido por potencia de dosis en máxima inhibición. En un modelo de desprendimiento de retina en ratas in vivo, el Compuesto I es al menos 10 veces más potente que Met-12 para proteger las células fotorreceptoras de la apoptosis y, a diferencia de Met-12, puede administrarse de manera eficaz en formulaciones clínicamente aceptables.

Como se demuestra en los ejemplos, la inhibición de Fas por el Compuesto I dio como resultado una conservación significativa de las células fotorreceptoras invivo. En las células 661W, el tratamiento con el Compuesto I dio como resultado una profunda inhibición de la activación de la caspasa 8. Como tal, se cree que la administración del Compuesto I a un sujeto con una afección ocular, enfermedad, o afección o enfermedad que afecta a la salud ocular puede producir una mejor protección de las células de la retina, que incluye, pero no se limita a, los fotorreceptores, las células del epitelio pigmentario de la retina y las células ganglionares de la retina, de la apoptosis mediada por Fas, lo que resulta en la mejora y/o tratamiento de la afección ocular, enfermedad, o afección o enfermedad que afecta a la salud ocular.

En la práctica clínica, los pacientes generalmente presentan un desprendimiento que ya se ha producido. Los modelos animales de separación retina-EPR muestran que la activación de la vía Fas se produce temprano y permanece elevada durante la duración del desprendimiento (Zacks y col. Arch Ophthalmol 2007; 125:1389-1395,Zacks y col. IOVS 2004; 45(12):4563-4569.8.). La separación de la retina y el EPR también se encuentra en un amplio espectro de enfermedades de la retina. Se contempla que la relevancia clínica de la terapia anti-Fas en la supervivencia de las células de la retina no se limita al desprendimiento de retina. Por ejemplo, la apoptosis mediada por Fas puede desempeñar un papel en la muerte de células fotorreceptoras en la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) (Dunaief y col. Arch Ophthalmol. 2002; 120(11):1435-1442; Zacks y col. Arco Oftalmol 2007; Petrukhin K. New therapeutic targets in atrophic age-related macular degeneration. Expert Opin Ther Targets. 2007. 11:625-639; Miller JW. Treatment of age-related macular degeneration: beyond VEGF. Jpn J Ophthalmol. 2010. 54:523 — 528; Rogala J, Zangerl B, Assaad N, Fletcher EL, Kalloniatis M, Nivison-Smith L. In Vivo Quantification of Retinal Changes Associated with Drusen in Age-Related Macular Degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015. 56:1689-1700). La degeneración macular relacionada con la edad se caracteriza por una degeneración progresiva del EPR y provoca una degeneración y reorganización de la retina externa similar a la que se produce después de un desprendimiento de retina (Jager y col. N Engl J Med. 2008; 358:2606-17, Johnson y col. Invertir Ophthalmol Vis Sci. 2003; 44:4481-488). En la forma neovascular de la DMAE también existe la exudación de líquido debajo de la retina, creando una separación real de este tejido del EPR subyacente (Jager y col. N Engl J Med. 2008; 358:2606-17). La DMAE neovascular puede resultar en períodos prolongados de separación retina-EPR y activación de la vía Fas. Lo más probable es que la utilidad del tratamiento anti-Fas sea como un complemento destinado a proteger las células de la retina (como los fotorreceptores y el epitelio pigmentario de la retina) mientras se trata el trastorno subyacente (Brown y col. N Engl J Med. 2006 oct. 5; 355(14):1432-44).

El glaucoma es una afección ocular degenerativa progresiva que se caracteriza por la muerte de las células ganglionares de la retina (CGR), y una investigación publicada anteriormente ha demostrado que las CGR mueren por apoptosis (Ji y col. Vision Res. 2005; 45(2): 169-179). La presión intraocular (PIO) es un factor de riesgo importante para el desarrollo de glaucoma y se han dedicado esfuerzos sustanciales a reducir la PIO utilizando análogos de prostaglandinas para prevenir la apoptosis de las CGR (Doucette y Walter. Ophthalmic Genet. 2016; 12:1-9). Fas también ha estado implicado en la muerte de las CGR (Gregory y col. PLoS One. 2011; 6(3):e 17659), y los modelos animales de PIO muestran una mayor expresión de Fas y FasL (Ju y col. Brain Res. 2006; 1122(1): 209-221), lo que indica la utilidad potencial de la inhibición de Fas como medio para proteger la viabilidad de las CGR y mitigar la naturaleza degenerativa del glaucoma.

En algunas realizaciones, el polipéptido descrito se puede preparar mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, el Compuesto I reivindicado se puede sintetizar utilizando técnicas estándar de síntesis de polipéptidos en fase sólida (p. ej., Fmoc). Alternativamente, el polipéptido se puede sintetizar usando tecnología de a Dn recombinante (p. ej., usando sistemas de expresión bacterianos o eucarióticos), que sobreexpresan tanto el péptido como una enzima amidasa adecuada para llevar a cabo la amidación C-terminal.

Específicamente, como se describe en el Ejemplo I, el Compuesto I puede obtenerse construyendo la secuencia del péptido Met-12, H 60 HIYLGAVNYIY71 (Se Q ID NO: 2) en una resina amínica, como saben los expertos en la técnica para producir después de la desprotección y escisión de la resina, su amida C-termina1H 6° HIYLGAVNYIY-NH 2 Compuesto I (SEQ ID NO: I).

Específicamente, el Compuesto I puede obtenerse conceptualmente a partir de la secuencia de c-Met mediante una hidrólisis de amida normal entre los residuos 59 y 60, y una ruptura no natural de la cadena peptídica entre el nitrógeno peptídico y el carbono a del residuo 72, en lugar de en el carbonilo de carbono del residuo 71. Esto no es una escisión, que se produce deforma natural. Met-12 se ha descrito anteriormente en la patente de EE.UU. N.° 8.343.931.

El uso de un péptido amidado en el extremo C, es decir, el Compuesto I, se basó en la creencia de que esta modificación específica podría aumentar el pH al cual el péptido es soluble en agua o miscible en micelas mediante la eliminación del ácido carboxílico libre, que se desprotona significativamente por encima de pH 3. La especie resultante no tendría un anión C-terminal a ningún pH fisiológicamente relevante, ni sería un ion dipolar en ninguna circunstancia físicamente relevante, y sería una especie tricatiónica por debajo de pH 5. Esta alteración se podría lograr más fácilmente mediante la conversión en una amida o un éster, ninguno de los cuales es desprotonable en condiciones fisiológicas. Las amidas son más estables biológica y químicamente que los ésteres, y también menos hidrofóbicas, por lo que se eligió la amida primaria simple.

En determinadas realizaciones, el Compuesto I se puede producir convirtiendo Met-12 en su amida primaria C-terminal, para formar el Compuesto I, aunque generalmente es más práctico construir el péptido a partir de un primer residuo de aminoácido ya aminado, mediante el uso de una resina amínica, familiar para un experto en la técnica. Como se indica en la sección de ejemplos a continuación, el Compuesto I se obtuvo y probó originalmente como un trihidrocloruro, aunque más tarde se consideró más ventajoso para la formulación una sal de triacetato.

Hay determinadas ventajas de usar el Compuesto I sobre Met-12. Específicamente, como se muestra en los ejemplos a continuación, el Compuesto I se puede formular con tensioactivos para producir soluciones micelares a pH y cantidades aditivas, que tienen precedentes en las formulaciones oculares. En segundo lugar, basado en el ensayo de eficacia in vitro, el compuesto I es sorprendentemente 10 veces más potente que Met-12 según la determinación de IC50 y aproximadamente 3 veces más potente medido por la concentración de la inhibición máxima. Específicamente, cuando Met-12 y el Compuesto I se prueban en la misma formulación in vitro, el Compuesto I tiene una mayor potencia de dosis que Met-12. Esto permite lograr el mismo efecto fisiológico con menores cantidades de Compuesto I que de Met-12. En tercer lugar, en pruebas in vivo en un modelo de desprendimiento de retina en ratas, el Compuesto I sorprendentemente es al menos cinco veces más potente que Met-12 para prevenir la apoptosis en células fotorreceptoras en la parte desprendida de la retina. En cuarto lugar, en algunas de las formulaciones descritas del Compuesto I, la eficacia en el modelo de desprendimiento de retina de rata se logra a niveles más de 10 veces menores que los observados con Met-12. Finalmente, el Compuesto I muestra vidas medias muy prolongadas tanto en el humor vítreo como en las retinas de conejos tratados intravítreamente, y estas vidas medias pueden extenderse en diferentes grados mediante el uso de diferentes formulaciones, lo que permite controlar la exposición total de la retina al Compuesto I mediante la formulación elegida.

En algunas realizaciones, el Compuesto I es efectivo en uno o más de:iedir/inhibir/reducir la apoptosis de los fotorreceptores mediada por Fas, prevenir la apoptosis en células del epitelio pigmentado de la retina del ojo, aumentar la supervivencia de los fotorreceptores, prevenir la muerte celular relacionada con la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), prevenir la muerte celular relacionada con el desprendimiento de retina, etc. En algunas realizaciones adicionales, el compuesto I es eficaz para proteger las células ganglionares de la retina, que reciben información visual de los fotorreceptores a través de dos tipos de neuronas intermedias: las células bipolares y las células amacrinas de la retina.

En algunas realizaciones, se administra una cantidad terapéuticamente activa del Compuesto I o una preparación del mismo (es decir, una formulación o una composición) a un sujeto mamífero que necesita tratamiento (por ejemplo, para una afección ocular particular) y en un lugar suficiente para inhibir o atenuar la apoptosis dentro del paciente (p. ej., dentro del tejido deseado). El sujeto preferido es un ser humano con una afección, enfermedad ocular o afección o enfermedad que afecta la salud ocular.

La cantidad administrada es suficiente para mejorar la protección de las células de la retina y/o de las células ganglionares de la retina, incluidos, entre otros, los fotorreceptores, el epitelio pigmentario de la retina y los ganglios de la retina, frente a la apoptosis mediada por Fas, o para prevenir la muerte de las células de la retina, lo que da lugar a la mejora y/o el tratamiento de la afección ocular, la enfermedad o la afección que afecta a la salud ocular.

La determinación de una dosis terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los profesionales de esta técnica. En algunas realizaciones, una dosis humana eficaz estará en el intervalo de 5-10000 pg/ojo, 50-5000 pg/ojo, o 100-2000 pg/ojo. Se contemplan dosis repetidas para mantener un nivel eficaz (p. ej., semanalmente, cada dos semanas, mensualmente, trimestralmente, semestralmente, etc.).

En algunas realizaciones, una formulación farmacéutica es un líquido estéril, no pirogénico y comprende al menos 0,1 mg/ml (por ejemplo, >0,1, >0,2, >0,5, >0,6, >0,7, >0,8 y >0,9), al menos 1 mg/ml (por ejemplo, >1 mg/ml, >2 mg/ml, >5 mg/ml, >10 mg/ml, etc.) de un péptido/polipéptido descrito en esta invención (por ejemplo, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, o más) de un péptido/polipéptido (por ejemplo, el compuesto 1).

En algunas realizaciones, una dosis terapéutica comprende al menos 0,01 ml (p. ej., 0,01 ml... 0,02 ml... 0,05 ml... 0,1 ml... 0,2 ml... 0,5 ml... 1 ml... 2 ml... 3 ml... 4 ml, y volúmenes e intervalos de los mismos) de una formulación farmacéutica líquida que comprende un péptido/polipéptido protector de los fotorreceptores o del EPR (por ejemplo, el compuesto I). En algunas realizaciones, se inyecta un volumen de líquido de 10 a 500 pl en el ojo humano (por ejemplo, 10 pl, 20 pl, 30 pl, 40 pl, 50 pl, 75 pl, 100 pl, 200 pl, 300 pl, 400 pl, 500 pl, y volúmenes y intervalos en el mismo). En algunas realizaciones, se inyecta un volumen de 50 a 600 pl en el ojo humano (por ejemplo, 50 pl, 75 pl, 100 pl, 200 pl, 300 pl, 400 pl, 500 pl, 600 pl, y volúmenes y intervalos en el mismo). En algunas realizaciones, cuando se inyectan intraoperatoriamente se pueden usar volúmenes de escala de mililitros (p. ej., hasta el volumen total de la cavidad vitrea (p. ej., aproximadamente 4 ml). En algunas realizaciones, el compuesto puede incorporarse en una solución de perfusión utilizada para mantener la presión ocular interna durante una vitrectomía.

En algunas realizaciones, se proporciona una dosis única (p. ej., para tratar una afección aguda (p. ej., desprendimiento de la retina). En algunas realizaciones, se proporcionan múltiples dosis (p. ej., diaria, semanal, mensual, etc.) para el tratamiento de una afección crónica. La formulación puede ser diferente según la duración necesaria de la exposición para la afección que se está tratando.

En algunas realizaciones, las dosis de tratamiento se valoran hacia arriba desde un nivel bajo para optimizar la seguridad y la eficacia. En algunas realizaciones para inyección intravítrea, una dosis incluye de 0,01 a 5 mg de péptido (p. ej., 0,1 y 2,0 mg).

En algunas realizaciones, las preparaciones farmacéuticas (es decir, formulaciones y/o composiciones) comprenden uno o más excipientes. Los excipientes comúnmente usados en composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, demulcentes, agentes de tonicidad, conservantes, agentes quelantes, agentes amortiguadores y tensioactivos. Los agentes de ajuste de tonicidad adecuados incluyen, pero no se limitan a, manitol, cloruro de sodio, glicerina, y similares. Los conservantes adecuados incluyen ésterde ácido p-hidroxibenzoico, cloruro de benzalconio, bromuro de benzododecinio, policuaternio-1 y similares. Los agentes quelantes adecuados incluyen edetato de sodio y similares. Los agentes tamponantes adecuados incluyen fosfatos, boratos, citratos, acetatos, trometamina y similares. Los tensioactivos adecuados incluyen tensioactivos iónicos y no iónicos, aunque se prefieren los tensioactivos no iónicos, como polisorbatos, derivados de aceite de ricino polietoxilados, ácidos grasos polietoxilados, alcoholes polietoxilados, copolímeros de bloque de polioxietileno-polioxipropileno (Poloxámero) y polímero de octilfenol formaldehído terciario oxietilado (Tiloxapol). También se pueden incluir otros tensioactivos adecuados. Los antioxidantes adecuados incluyen sulfitos, tiosulfato, ascorbatos, BHA, BHT, tocoferoles y similares.

Las composiciones de la presente invención comprenden opcionalmente un agente activo adicional. Estos agentes activos adicionales podrían incluir anticuerpos anti-TNF, como Adalimumab (Ophthalmic Surg Lasers Imaging Retina 45, 332 (2014), Curr Eye Res 39, 1106 (2014)) o etanercept (PLoS One, 7, e40065), o inhibidores de cinasas que han demostrado preservar la estructura de la retina, como el inhibidor de ROCK Y-27632 (Molecular Medicine Reports 12, 3655 (2015)), el inhibidor de la adenosina cinasa ABT-702 (Life Sci 93, 78 (2013), o el péptido inhibidor de JNK D-JNK-I (Diabetes 50, 77 (2001), Adv Exptl Med Biol 854, 677 (2016)), o ácido docosahexaenoico (J Lipid Res, 54,2236 (2013)) o el panagonista RXR PA024 (ibid) o la necrostatina, o los inhibidores de la cinasa RIP como el Dabrafenib (Cell Death Dis 5, 1278 (2014)).

En algunas realizaciones ejemplares, al menos uno de los excipientes, como Polisorbato 20 (p. ej., hasta el 3 %), Poloxámero 407 (p. ej., hasta el 2 %), Tyloxapol (p. ej., hasta el 3 %), cremóforo (p. ej., hasta el 1 %); y/o codisolventes (p. ej., entre el 0,5 y el 50 %), tales como N,N-dimetilacetamida, etanol, PEG-400, propilenglicol, dimetilsulfóxido (DMSO); aceites o ciclodextrinas pueden añadirse a una preparación farmacéutica.

En realizaciones ejemplares adicionales, puede incluirse al menos un tensioactivo no iónico (por ejemplo, 0,1 %-20 % p/p/ de la composición), tal como Polisorbato 80, Polisorbato 20, Poloxámero o Tiloxapol en la composición farmacéutica. Además, un codisolvente orgánico, como propilenglicol o dimetilsulfóxido en una cantidad de aproximadamente un 1-50 %, puede incluirse en la composición farmacéutica. Alternativamente, un cosolvente orgánico, como N,N-dimetilacetamida, etanol, PEG-400, propilenglicol, DMSO en una cantidad de aproximadamente un 1-20%, puede incluirse en la composición farmacéutica. Alternativamente, un codisolvente orgánico, como propilenglicol o dimetilsulfóxido en una cantidad de aproximadamente un 1-5%, puede incluirse en la composición farmacéutica. Alternativamente, se puede incluir en la composición farmacéutica un agente de isotonicidad como manitol, sorbitol, glucosa o trehalosa, o una sal inorgánica como cloruro de sodio, en las cantidades necesarias para llevar la tonicidad de la composición al intervalo de 250-400 mOsm/L.

El pH de la composición puede estar en el intervalo de 2,5-6,0. El pH puede controlarse mediante un tampón adecuado y estar en el intervalo de 3,0 a 5,0 o en el intervalo de 3,5 a 4,5.

En otra realización ejemplar, puede incluirse al menos un tensioactivo no iónico (por ejemplo, 0,5%-10% p/p/ de la composición), tal como Polisorbato 80, Polisorbato 20, Poloxámero o Tiloxapol en la composición farmacéutica. Además, un codisolvente orgánico, como propilenglicol o dimetilsulfóxido en una cantidad de aproximadamente un 1­ 50 %, puede incluirse en la composición farmacéutica. Alternativamente, un codisolvente orgánico, como propilenglicol o dimetilsulfóxido en una cantidad de aproximadamente un 1-20%, puede incluirse en la composición farmacéutica. Alternativamente, un cosolvente orgánico, como N,N-dimetilacetamida, etanol, PEG-400, propilenglicol, DMSO en una cantidad de aproximadamente un 1-5%, puede incluirse en la composición farmacéutica. Alternativamente, se puede incluir en la composición farmacéutica un agente de isotonicidad como manitol, sorbitol, glucosa o trehalosa, o una sal inorgánica como cloruro de sodio, en las cantidades necesarias para llevar la tonicidad de la composición al intervalo de 250-400 mOsm/L. El pH de la composición puede estar en el intervalo de 2,5-6,0. El pH puede controlarse mediante un tampón adecuado y estar en el intervalo de 3,0 a 5,0 o en el intervalo de 3,5 a 4,5.

En otra realización ejemplar más, puede incluirse al menos un tensioactivo no iónico (por ejemplo, 1%-3% p/p/ de la composición), tal como Polisorbato 80, Polisorbato 20, Poloxámero o Tiloxapol en la composición farmacéutica. Además, un codisolvente orgánico, como propilenglicol o dimetilsulfóxido en una cantidad de aproximadamente un 1­ 50 %, puede incluirse en la composición farmacéutica. Alternativamente, un cosolvente orgánico, como N,N-dimetilacetamida, etanol, PEG-400, propilenglicol, DMSO en una cantidad de aproximadamente un 1-20%, puede incluirse en la composición farmacéutica. Alternativamente, un codisolvente orgánico, como propilenglicol o dimetilsulfóxido en una cantidad de aproximadamente un 1-5%, puede incluirse en la composición farmacéutica. Alternativamente, se puede incluir en la composición farmacéutica un agente de isotonicidad como manitol, sorbitol, glucosa o trehalosa, o una sal inorgánica como cloruro de sodio, en las cantidades necesarias para llevar la tonicidad de la composición al intervalo de 250-400 mOsm. El pH de la composición puede estar en el intervalo de 2,5-6,0. El pH puede controlarse mediante un tampón adecuado y estar en el intervalo de 3,0 a 5,0 o en el intervalo de 3,5 a 4,5.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede incluir el Compuesto I o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y Poloxámero 407 (p. ej., 0,1-2 %p/p/ de la composición) en un medio acuoso que tenga un pH en el intervalo de 3,0-6,0.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede incluir el Compuesto I o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y Poloxámero 407 (p. ej., 0,1-2 %p/p/ de la composición) en un medio acuoso tamponado por propanoato de sodio/ácido propanoico o acetato de sodio/ácido acético que tenga un A pH en el intervalo de 4,0-5,0.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede incluir el Compuesto I o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y Poloxámero 407 (p. ej., 0,1-2 %p/p/ de la composición) en un medio acuoso tamponado por propanoato de sodio/ácido propanoico o acetato de sodio/ácido acético que tenga un pH en el intervalo de 4,0-5,0, y se hace isotónico con manitol al 3-5 %.

En alguna realización adicional, la composición farmacéutica puede incluir el Compuesto I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, Polisorbato-20 (p. ej., 0,1-3 % p/p/ de la composición) y propilenglicol (p. ej., 3 % p/p/ de la composición) en un medio acuoso en el intervalo de pH de 3,0-6,0.

En determinadas realizaciones adicionales, la composición farmacéutica puede incluir el Compuesto I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, Polisorbato-20 (p. ej., 0,1-3 % p/p/ de la composición) y propilenglicol (p. ej., 3 % p/p/ de la composición) en un medio acuoso tamponado con acetato de sodio/ácido acético en el intervalo de pH de 4,0-5,0.

En alguna realización adicional, la composición farmacéutica puede incluir el Compuesto I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, Polisorbato-20 (p. ej., 0,1-3 % p/p/ de la composición) y manitol (p. ej., 3-5 % p/p/ de la composición) en un medio acuoso en el intervalo de pH de 3,0-6,0.

En determinadas realizaciones adicionales, la composición farmacéutica puede incluir el Compuesto I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, Polisorbato-20 (p. ej., 0,1-3 % p/p/ de la composición) y manitol (p. ej., 3-5 % p/p/ de la composición) en un medio acuoso tamponado con acetato de sodio/ácido acético en el intervalo de pH de 4,0-5,0.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede incluir el Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y Poloxamer407 (por ejemplo, 0,1-2% en peso de la composición) y Polisorbato 20 (por ejemplo, 0,1-2% en peso de la composición) en un medio acuoso que tiene un pH en el intervalo de 3,0-6,0.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede incluir el Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y Poloxamer 407 (por ejemplo, 0,1-2% p/p/ de la composición) y Polisorbato 20 (por ejemplo, 0,1-2% p/p/ de la composición) en un medio acuoso tamponado por propanoato de sodio/ácido propanoico o acetato de sodio/ácido acético que tiene un pH en el intervalo 4,0-5,0.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede incluir el Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y Poloxámero 407 (por ejemplo, 0,1-2% p/p/ de la composición) y Polisorbato 20 (por ejemplo, 0,1-2% p/p/ de la composición) en un medio acuoso tamponado por propanoato de sodio/ácido propanoico o acetato de sodio/ácido acético que tiene un pH en el intervalo 4,0-5,0, y se hace isotónico con manitol al 3-5 %.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente pueden incluir el Compuesto I, pero no el cloruro como contraión, siendo el acetato una alternativa preferida. Dichas composiciones pueden mostrar propiedades superiores a las que contienen iones de cloruro.

En algunas realizaciones, la relación de peso del péptido/polipéptido (por ejemplo, el Compuesto I) es del 1% al 25% en relación con el peso de los excipientes no acuosos de la formulación farmacéutica, que es, por el contrario, del 0,1 al 20% de excipientes, como Poloxamer, Polisorbato 20, propilenglicol y manitol.

Esta relación de peso del péptido/polipéptido (p. ej., Compuesto I) en relación con el peso de la formulación farmacéutica puede ser al menos aproximadamente del 0,1 %, al menos del 0,5%, al menos del 1 %, al menos aproximadamente del 2 %, al menos aproximadamente del 3 %.

Las siguientes dos composiciones ejemplares, que tienen una cantidad de cada ingrediente en el intervalo indicado, proporcionarán dos de varias composiciones que se pueden usar para tratar o prevenir diversas enfermedades o afecciones oculares (p. ej., de la retina) o prevenir la muerte celular de la retina resultante de enfermedades o afecciones oculares o similares en un sujeto:

Formulación ejemplar I

Formulación ejemplar II:

En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención se administran por vía ocular, por ejemplo, mediante las técnicas descritas en esta invención, y/o otras técnicas (por ejemplo, inyección, administración tópica, etc.) conocidas por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Janoria y col., Expert Opin Drug Deliv., 4(4): 371 -388 (July 2007); Ghate & Edelhauser, Expert Opin Drug Deliv., 3(2):275-87 (2006); Bourges y col., Adv Drug Deliv Rev., 58(11):1182-202 (2006), Epub 2006 Sep. 22; Gomes Dos Santos y col., Curr Pharm Biotechnol., 6(1):7-15 (2005)). La composición se puede administrar utilizando cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia. Los ejemplos no limitativos incluyen inyección tópica, subconjuntival, sub-Tenon, intravítrea, subretiniana o en la cámara anterior del ojo de un sujeto. Otros procedimientos de administración incluyen la administración sistémica, incluida la administración intravenosa así como la administración oral. En determinadas realizaciones, la composición se administra por vía intravítrea.

Determinadas realizaciones se refieren a una composición farmacéutica que comprende el polipéptido del Compuesto I y un portador farmacéuticamente aceptable. Cualquier vehículo que pueda suministrar un polipéptido sin destruir el vector dentro del vehículo es un vehículo adecuado, y tales vehículos son bien conocidos en la técnica.

La composición se puede formular y envasar adecuadamente para la administración parenteral, oral o tópica. Por ejemplo, una formulación parenteral sería un producto estéril, no pirogénico y podría consistir en una preparación líquida de liberación rápida o sostenida, polvo seco, emulsión, suspensión o cualquier otra formulación estándar. Una formulación oral de la composición farmacéutica podría ser, por ejemplo, una solución líquida, como una cantidad efectiva de la composición disuelta en diluyentes (por ejemplo, agua, solución salina, jugo, etc.), suspensiones en un líquido adecuado o emulsiones adecuadas. Una formulación oral también podría administrarse en forma de tableta y podría incluir excipientes, colorantes, diluyentes, agentes tamponadores, agentes humectantes, conservantes, agentes aromatizantes y excipientes farmacológicamente compatibles. Una formulación tópica podría incluir compuestos para mejorar la absorción o penetración del ingrediente activo a través de la piel u otras áreas afectadas, como el dimetilsulfóxido y análogos relacionados. La composición farmacéutica también podría administrarse por vía tópica utilizando un dispositivo transdérmico, como un parche, que podría incluir la composición en un sistema disolvente adecuado con un sistema adhesivo, como una emulsión acrílica y un parche de poliéster. Las composiciones estériles podrían administrarse a través de gotas para los ojos u otro procedimiento de administración ocular tópica. Las composiciones estériles, no pirogénicas, pueden administrarse por vía intraocular, en cualquier parte del ojo, incluyendo, por ejemplo, la cavidad vítrea, la cámara anterior, etc. Las composiciones estériles y no pirogénicas pueden administrarse por vía intravítrea, como suele hacerse con las inyecciones intravítreas de Lucentis (ranabizumab), Avastin (bevazizumab), acetónido de triamcinolona, antibióticos, etc. Las composiciones pueden administrarse por vía periocular (por ejemplo, en el tejido que rodea el globo ocular pero dentro de la órbita ósea). Las composiciones pueden administrarse a través de un implante intraocular (p. ej., implante de ganciclovir, implante de fluocinolona, etc.). En la administración de implantes intraoculares, los dispositivos que contienen composiciones de la presente invención se implantan quirúrgicamente (p. ej., dentro de la cavidad vítrea) y el fármaco se libera en el ojo (p. ej., a una velocidad predeterminada). Las composiciones se pueden administrar mediante tecnología de células encapsuladas (p. ej., de Neurotech) en la que las células modificadas genéticamente se manipulan para producir y secretar una composición que comprende el polipéptido del Compuesto I. Las composiciones pueden administrarse a través de la administración transcleral del fármaco mediante un dispositivo suturado o situado junto al globo que eluirá lentamente el fármaco, que a continuación se difundirá en el ojo.

Algunas realizaciones se relacionan con composiciones, kits, sistemas, y/o procedimientos para prevenir, inhibir, bloquear, y/o reducir la muerte de fotorreceptores, células EPR o células ganglionares de la retina. Algunas realizaciones se refieren a la inhibición de la apoptosis de los fotorreceptores. Algunas realizaciones se refieren a la inhibición de la apoptosis en células del epitelio pigmentado de la retina del ojo. Algunas realizaciones se refieren a la inhibición de la apoptosis en células de los ganglios de la retina del ojo. En algunas realizaciones, la muerte y/o apoptosis de los fotorreceptores y/o apoptosis de las células del epitelio pigmentado de la retina y/o apoptosis y/o apoptosis de las células ganglionares de la retina y/o muerte es causada por desprendimiento de retina, degeneración macular relacionada con la edad, glaucoma, trauma, cáncer, tumor, inflamación, uveítis, diabetes, degeneración retiniana hereditaria, y/o una enfermedad que afecta a las células fotorreceptoras, el epitelio pigmentario retiniano anormal o los ganglios retinianos.

En algunas realizaciones, la presente invención mejora la viabilidad de los fotorreceptores, EPR o células ganglionares de la retina y/o inhibe la muerte de los fotorreceptores (por ejemplo, durante el desprendimiento de retina y/o en afecciones oculares que no involucran desprendimiento de retina).

En algunas realizaciones, la presente invención encuentra utilidad en la mejora de la viabilidad de los fotorreceptores, el EPR o las células ganglionares de la retina y/o inhibe la muerte de los fotorreceptores, el EPR o las células ganglionares de la retina en una variedad de afecciones y/o enfermedades que incluyen, pero no se limitan a la degeneración macular (p. ej., seca, húmeda, no exudativa o exudative/neovascular), tumores oculares, glaucoma, degeneraciones hereditarias de la retina (p. ej., retinitis pigmentosa, enfermedad de Stargardt, síndrome de Usher, etc.), enfermedad inflamatoria ocular (p. ej., uveítis), infección ocular (p. ej., bacteriana, fúngica, viral), retinitis autoinmune (p. ej., provocada por una infección) , traumatismo, retinopatía diabética, neovascularización coroidea, isquemia retiniana, enfermedad oclusiva vascular retiniana (p. ej., oclusión de rama de la vena retiniana, oclusión de la vena central de la retina, oclusión de rama de la arteria retiniana, oclusión de la arteria central de la retina, etc.), miopía patológica, estrías angioides, edema macular (por ejemplo, de cualquier etiología), coriorretinopatía serosa central..

Algunas realizaciones se refieren a la administración de una composición para inhibir la muerte de fotorreceptores, EPR o células ganglionares de la retina (p. ej., apoptosis). En algunas realizaciones, una composición comprende un fármaco, una pequeña molécula, un péptido, un ácido nucleico, un complejo molecular, etc. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona la administración de un polipéptido protector de fotorreceptores, EPR o células ganglionares de la retina para inhibir la apoptosis de fotorreceptores o EPR o células ganglionares de la retina.

Algunas realizaciones se refieren a un procedimiento para emplear un polipéptido para atenuar la activación de uno o más miembros de la superfamilia TNFr , deseablemente Fas o TRAIL en fotorreceptores y/o retinas. En algunas realizaciones, dicho procedimiento se emplea, por ejemplo, para inhibir la muerte celular (p. ej., apoptosis) en células y tejidos, y puede emplearse in vivo, ex vivo o in vitro. Por lo tanto, el Compuesto I puede usarse para atenuar la muerte celular (p. ej., muerte celular de la retina) según dichos procedimientos. Para la aplicación in vitro, el Compuesto I se puede proporcionar a las células, típicamente a una población de células (p. ej., dentro de una preparación adecuada, como una solución tamponada) en una cantidad y durante un transcurso de tiempo suficiente para inhibir la apoptosis dentro de las células o para inhibir la inflamación. Si se desea, se puede observar una población controlada no tratada con el polipéptido de la invención para confirmar el efecto del polipéptido de la invención en la reducción de la inhibición de la muerte o inflamación celular dentro de una población similar de células.

En algunas realizaciones, se proporcionan en esta invención procedimientos para tratar diversas enfermedades o afecciones oculares (por ejemplo, de la retina) o para prevenir la muerte de las células de la retina como resultado de enfermedades o afecciones oculares, que incluyen las siguientes: glaucoma, maculopatías/degeneración de la retina, tal como: degeneración macular, incluyendo degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), tal como degeneración macular no exudativa relacionada con la edad y degeneración macular exudativa relacionada con la edad; neovascularización coroidea; retinopatía, incluyendo retinopatía diabética, neurorretinopatía macular aguda y crónica, coriorretinopatía serosa central; y edema macular, incluyendo edema macular cistoide y edema macular diabético; uveitis/retinitis/choroiditis, tales como epiteliopatía pigmentaria placoide multifocal aguda, enfermedad de Behcet, retinocoroidopatía en perdigones, infecciosa (sífilis, enfermedad de Lyme, tuberculosis, toxoplasmosis), uveítis, incluida la uveítis intermedia (pars planitis) y uveítis anterior, coroiditis multifocal, síndrome de múltiples puntos blancos evanescentes (MEWDS), sarcoidosis ocular, escleritis posterior, coroiditis serpignosa, fibrosis subretiniana, síndrome de uveítis y síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada; vascular diseases/exudative enfermedades, tales como: enfermedad oclusiva arterial retiniana, oclusión de la vena central de la retina, coagulopatía intravascular diseminada, oclusión de la vena retiniana de rama, cambios hipertensivos del fondo de ojo, síndrome isquémico ocular, microaneurismas arteriales retinianos, enfermedad de Coats, telangiectasia parafoveal, oclusión de la vena hemirretiniana, papiloflebitis, oclusión de la arteria central de la retina, oclusión de la rama de la arteria retiniana, enfermedad de la arteria carótida (CAD), angeítis en rama escarchada, retinopatía de células falciformes y otras hemoglobinopatías, estrías angioides, vitreorretinopatía exudativa familiar, enfermedad de Eales, enfermedades traumáticas/quirúrgicas: oftalmía simpática, enfermedad retiniana uveítica, desprendimiento de retina, traumatismo, láser, TFD, fotocoagulación, hipoperfusión durante la cirugía, retinopatía por radiación, retinopatía por trasplante de médula ósea; trastornos proliferativos, tales como: retinopatía vítrea proliferativa y membranas epirretinianas, retinopatía diabética proliferativa. Trastornos infecciosos: histoplasmosis ocular, toxocariasis ocular, síndrome de histoplasmosis ocular (SHO), endoftalmitis, toxoplasmosis, enfermedades de la retina asociadas con la infección por VIH, enfermedad coroidea asociada con la infección por VIH, enfermedad uveítica asociada con la infección por VIH, retinitis viral, necrosis retiniana aguda, necrosis progresiva de la retina externa, enfermedades fúngicas de la retina, sífilis ocular, tuberculosis ocular, neurorretinitis subaguda unilateral difusa y miasis; trastornos genéticos, tales como: retinitis pigmentosa, trastornos sistémicos con distrofias retinianas asociadas, ceguera nocturna estacionaria congénita, distrofias de conos, enfermedad de Stargardt y fundus flavimaculatus, enfermedad de Best, distrofia en patrón del epitelio pigmentario de la retina, retinosquisis ligada al cromosoma X, distrofia de fundus de Sorsby, maculopatía concéntrica benigna, distrofia cristalina de Bietti, pseudoxantoma elástico. Desgarros/agujeros de la retina: desprendimiento de retina, agujero macular, desgarro retiniano gigante; tumores, tales como: enfermedad retiniana asociada a tumores, hipertrofia congénita del EPR, melanoma uveal posterior, hemangioma coroideo, osteoma coroideo, metástasis coroidea, hamartoma combinado de retina y epitelio pigmentario retiniano, retinoblastoma, tumores vasoproliferativos del fondo de ojo, retina astrocitoma, tumores linfoides intraoculares; y otras enfermedades y afecciones tales como: coroidopatía interna punteada, epiteliopatía pigmentaria placoide multifocal posterior aguda, degeneración retiniana miópica, epitelitis pigmentaria retiniana aguda, distrofias o displasias corneales, y similares.

Determinadas realizaciones proporcionan procedimientos para aumentar la supervivencia de fotorreceptores, EPR o ganglios retinianos que comprenden administrar una composición farmacéutica que comprende el Compuesto I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. El compuesto farmacéutico se puede administrar en forma de una composición que se formula con un vehículo farmacéuticamente aceptable y excipientes, adyuvantes, etc. opcionales según las buenas prácticas farmacéuticas. La composición puede estar en forma de dosificación sólida, semisólida o líquida: tal como polvo, solución, elixir, jarabe, suspensión, crema, gotas, pasta y spray. Los expertos en la técnica reconocerán, que la forma de composición se selecciona según la vía de administración elegida. En general, se prefiere usar una forma de dosificación unitaria estéril del inhibidor de la invención para lograr una administración fácil y exacta del compuesto farmacéutico activo. En general, el compuesto farmacéutico terapéuticamente eficaz está presente en dicha forma de dosificación a un nivel de concentración que oscila entre aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 1,0 % en peso de la composición total: es decir, en una cantidad suficiente para proporcionar la dosis unitaria deseada.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se puede administrar en dosis únicas o múltiples. La vía de administración particular y el régimen de dosificación lo determinará un experto en la técnica, acorde con la afección del individuo a tratar y la respuesta de tal individuo al tratamiento. En algunas realizaciones, la composición es una forma de dosificación unitaria para la administración a un sujeto, que comprende un compuesto farmacéutico y uno o más portadores, adyuvantes o vehículos no tóxicos farmacéuticamente aceptables. La cantidad del ingrediente activo que puede combinarse con dichos materiales para producir una sola forma de dosificación variará dependiendo de varios factores, tal como se indicó anteriormente. Se puede usar una variedad de materiales como portadores, adyuvantes y vehículos en la composición de la invención, como están disponibles en la técnica farmacéutica. Las preparaciones inyectables, tales como soluciones, suspensiones o emulsiones oleaginosas, pueden formularse como se conoce en la técnica, usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados, según sea necesario. La preparación inyectable estéril puede emplear un diluyente o disolvente no tóxico aceptable por vía parenteral, como agua estéril no pirógena o 1,3-butanodiol. Entre los otros vehículos y solventes aceptables que pueden emplearse están la inyección de dextrosa al 5 %, la inyección de Ringer y la inyección de cloruro de sodio isotónico (como se describe en el documento USP/NF). Además, los aceites fijos estériles pueden emplearse convencionalmente como disolventes o medios de suspensión. Con esta finalidad, se puede usar cualquier aceite fijo no volátil, incluyendo mono-, di- o triglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, como el ácido oleico, también pueden utilizarse en la preparación de composiciones inyectables.

Hay varias rutas posibles de administración de fármacos en los tejidos oculares. La vía de administración depende del tejido diana. En determinadas realizaciones, las vías de administración pueden ser vías de administración convencionales, como la tópica o la sistémica. La administración tópica, principalmente en forma de gotas para los ojos, se puede emplear para tratar trastornos que afectan al segmento anterior del ojo. La administración también puede ser mediante inyección directa, por ejemplo, inyección intravítrea, que implica la inyección de una solución de fármaco directamente en el humor vítreo (HV) utilizando, por ejemplo, una aguja de 30 G. También pueden ser adecuadas otras vías de administración, por ejemplo, utilizando vehículos de fármacos.

En algunas realizaciones, la composición puede administrarse por vía ocular (es decir, en el ojo), por ejemplo, usando las técnicas descritas en el presente documento. También se analizan en esta invención otras técnicas (p. ej., inyección, administración tópica, etc.) conocidas por losexpertos en la materia (véase, p. ej., Janoria y col. Expert Opinion on Drug Delivery. julio de 2007, Vol. 4, No. 4, páginas 371-388; Ghate & Edelhauser. Expert Opin Drug Deliv.

2006 March; 3(2):275-87; Bourges y col. Adv Drug Deliv Rev. 2006 Nov. 15; 58(11):1182-202. Epub 2006 22 de septiembre; Gomes Dos Santos y col. Curr Pharm Biotechnol. febrero de 2005; 6(1):7-15.

En algunas realizaciones, la composición se puede coadministrar con uno o más agentes para una protección eficaz de los fotorreceptoresy/o inhibición de la apoptosis.

En algunas realizaciones, se proporcionan kits que comprenden el Compuesto I, o preparaciones farmacéuticas del mismo. En algunas realizaciones, los kits proporcionan además dispositivos, materiales, tampones, controles, instrucciones, recipientes (p. ej., viales, jeringas), etc. (p. ej., para la administración). Por ejemplo, cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente y/o las formulaciones pueden estar envasadas. Cualquiera de las composiciones y formulaciones mencionadas anteriormente puede distribuirse en jeringas precargadas. La composición y el procesamiento dan como resultado un producto estéril y apirógeno. El envase funciona para mantener la esterilidad del producto.

EJEMPLOS

Se realizaron experimentos durante el desarrollo de las realizaciones descritas para desarrollar una formulación farmacéutica biológicamente activa del Compuesto I (p. ej., para administración intravítrea). Las propiedades protectoras de los fotorreceptores del Compuesto I se examinaron in vitro e in vivo después de la dosificación de soluciones peptídicas en d Ms O. El compuesto I tiene poca solubilidad acuosa por encima pH~3 y alta tendencia a formar geles o precipitados en ambientes acuosos. Del ajuste proporcional de la dosis eficaz en ratas a humanos según el volumen vítreo intra especie, una concentración objetivo de 10-20 mg/mL se definió como meta inicial, con concentraciones más bajas (0,5-2,0 mg/mL) volviéndose más deseable a medida que las pruebas demostraron la potencia y exposición sorprendentemente superiores de las realizaciones descritas. (Ejemplo 6-1).

Ejemplo I: Preparación y ensayo del Compuesto I.

El péptido del Compuesto I (péptido His-His-Ile-Tvr-Leu-Glv-Ala-Val-Asn-Tvr-Ile-Tvr-NH?: SEQ ID NO:I) fue sintetizado en resina Fmoc-Amide-AMS mediante química Fmoc, por múltiples proveedores. Los aminoácidos protegidos con Fmoc se adquirieron de GL Biochem. Los reactivos para el acoplamiento y la escisión se adquirieron de Aldrich. Los disolventes se adquirieron de Fisher Scientific.

La cadena peptídica se ensambló sobre resina mediante la eliminación repetitiva del grupo protector Fmoc y el acoplamiento del aminoácido protegido. DIC y HOBt se usaron como reactivo de acoplamiento, y NMM se usó como base; Se usó piperidina al 20 % en DMF como reactivo de eliminación de Fmoc. La prueba de ninhidrina se realizó después de cada acoplamiento para verificar la eficiencia del acoplamiento.

Después del último acoplamiento, la resina se lavó y secó, y el péptido se escindió de la resina tratándolo con un cóctel de escisión. (TFA/Tis/H2O/DOTA: 95/3/2/2). El péptido se precipitó en éter frío y se recogió por filtración, se obtuvieron 13 g de péptido cruda con una pureza del 46 % (rendimiento: 127 %).

Para cada una de las dos series de purificación preparatoria, se purificaron alrededor de 4,4 g de péptido crudo mediante una columna de polímeros de 2 pulgadas con tampón TFA (tampón A, TFA al 0,1 % en agua; tampón B, acetonitrilo al 100 %), las fracciones resultantes con una pureza >85 % se purificaron de nuevo mediante una columna C18 de 2 pulgadas con tampón TFA. Las fracciones recogidas con una pureza >95 % se liofilizaron para secarlas, y se obtuvieron 3,68 g de material como sal TFA con una pureza >95% a partir de 8,8g del péptido crudo. A los 1,5 g de péptido (TFA como contraión), se añadió suficiente solución acuosa de HCl para disolver el péptido. El péptido en solución acuosa de HCl se liofilizó hasta secarlo. Se obtuvieron 1,4 g de péptido final como sal de HCl con una pureza del 97,0 %. HPLC de ACN al 15% en agua TFA al 0,1 %, Venusil XBP-C184,6 * 250 mm 1,0 mL/min; RT 17,79 min. Espectro de masas APCl MH 1461,5.

Microanálisis. Hallado: C, 52,21; H, 6,49; N, 15,42; Cl, 6,73. KF, 3,75 %. Calculado para C71H100N18O16-3HCl-3,4 H2O: C, 52,24; H, 6,59; N, 15,45; Cl, 6,52. KF, 3.75%. %Activo = 89,55 %.

Las muestras posteriores del péptido todavía se sintetizaron como la sal de trifluoroacetato, pero se llevó a cabo un intercambio aniónico con acetato, para dar el Compuesto I como sal de triacetato.

Ejemplo 2: Perfil de pH-solubilidad del Compuesto I

El compuesto I se obtuvo como una sal de trihidrocloruro, como se describe en el Ejemplo I, y se evaluó la solubilidad acuosa a diferentes pH, realizando titulaciones de pH según el siguiente protocolo. En algunos casos, Met-12 se sometió a un procedimiento experimental idéntico para determinar su perfil de pH de solubilidad en las mismas condiciones. Múltiples experimentos anteriores no habían logrado encontrar ninguna condición en la que Met-12 pudiera formularse satisfactoriamente en un medio mayoritariamente acuoso a cualquier pH superior a 2,7.

El compuesto I (10 mg) se disolvió en agua (270-900 j l) en un tubo de centrífuga de plástico transparente de 2 ml con agitación vorticial para obtener una solución con pH ~2,4. En todos los casos, el péptido formó una solución clara, lo que sugiere una solubilidad de al menos 40 mg/mL a pH bajo. A continuación, esta solución se diluyó con la cantidad adecuada de codisolvente u otro excipiente (azúcar, tensioactivo, etc.) para producir una solución ácida clara de 10 mg del Compuesto I en 900 jL de la solución de prueba a temperatura ambiente (22-23 °C ). Se agregaron pequeñas alícuotas de una solución básica (generalmente hidróxido de sodio 1,0 M o 0,1 M, pero a veces otras bases cuando se investigan tampones) mediante una jeringa de microlitros. Entre adiciones, la solución se mezcló mediante agitación vorticial y la solución se inspeccionó visualmente en busca de precipitados de varios tipos, turbidez, como un signo probable de microprecipitados, y viscosidad para detectar la formación de gel. Se tomaron medidas de pH en todos estos puntos de observación. Algunos experimentos valoraron desde el bajo pH endógeno hasta pH 10, pero las titulaciones posteriores no se llevaron a un pH muy superior a 7, o a veces incluso más bajo.

La titulación de la solución acuosa del Compuesto I con hidróxido de sodio sugirió una solubilidad limitada por el pH ligeramente mejor que la del Met-12, con una solución móvil transparente a un pH de aproximadamente 3,3, en comparación con el pH 3,0 de Met-12. Sin embargo, cuando las titulaciones se llevaron a cabo usando cinco bases amortiguadoras, Tris, histidina, citrato de sodio, borato de sodio y fosfato de sodio, en lugar de hidróxido de sodio, la viscosidad y los signos de agregación generalmente se observaron en el intervalo de pH 2,6-2,9. También se observó formación de fibrillas por debajo de pH 3 en uno o dos casos. A partir de estos experimentos parece que el Compuesto I no tiene mejor perfil de pH-solubilidad acuosa que Met-12.

Ejemplo 3: Solubilidad dependiente del pH del Compuesto I en mezclas codisolventes.

La solubilidad dependiente del pH del Compuesto I se examinó utilizando codisolventes y aditivos y se comparó con la solubilidad de Met-12 en las mismas condiciones.

El experimento con DMSO al 70 % fue similar a la titulación de Met-12 con un gel que se formó alrededor de un pH de 5,5, pero en este caso, probablemente debido a la incapacidad del extremo C para ionizarse, el gel no se volvió a disolver a pH más altos.

El propilenglicol (PG) al 70 % mejoró la solubilidad del Compuesto I en comparación con Met-12, sin que se produjera gelificación hasta alrededor de pH 4,7, en comparación con pH 3,2 para Met-12, y a continuación permaneciendo como un gel a pH 10. Esta titulación se repitió con cantidades más bajas de PG (35%, 10%), pero ninguno pareció mejorar el perfil de solubilidad sobre el agua sola.

Las soluciones de PEG400 al 70 % y de glicerol al 70 % no parecieron ser útiles, ni tampoco los dos aditivos de azúcar, manitol al 10 % otrehalosa al 10 %.

A partir de estos experimentos se concluyó que el propilenglicol puede ser un codisolvente útil bajo algunas circunstancias limitantes para el Compuesto I, pero no para Met-12.

Ejemplo 4: Solubilidad dependiente del pH del Compuesto I en mezclas de tensioactivos no iónicos.

Sorprendentemente, algunos de los tensioactivos examinados proporcionaron mejoras significativas en el perfil de solubilidad del pH del Compuesto I, mientras que ninguno de los tensioactivos probados mejoró el perfil pH-solubilidad de Met-12. El Compuesto I en presencia de Tyloxapol al 10 % permaneció claro y con una viscosidad aceptable, hasta que el pH estuvo por encima de 5,87. Con Polisorbato 80 al 10 %, la solución clara no se volvió apreciablemente viscosa hasta por encima de pH 6,36. Con Polisorbato 20 al 10 % se observaron fibrillas a pH 3,2 pero sin signos de turbidez o gelificación hasta pH 7,14. El Poloxámero 407 al 10 % fue algo ambiguo en cuanto a dónde podría producirse el inicio de la insolubilidad, ya que una segunda fase estaba claramente presente en el intervalo de pH 5­ 9, aunque la solución parecía ser móvil. Este parecía consistir en glóbulos claros muy grandes formados en la solución. Se cree que esto es un artefacto de la alta concentración de Poloxámero, ya que las soluciones de Poloxámero al 15 % gelifican completamente a 27 °C, mientras que el Poloxámero al 10 % no gelifica apreciablemente a 25 °C, pero varios aditivos pueden aumentar o disminuir la temperatura crítica de sol-gel., y las mediciones de viscosidad habituales para la gelificación no detectarán eficientemente la apariencia inicial de una fase de gel separada. Por lo tanto, se cree que no hubo pérdida de solubilidad del péptido en la mezcla, pero la gran cantidad de Poloxámero formó dos fases de Poloxámero, una fase sol y una fase gel. La Povidona K30 produjo una solución viscosa a pH 3,60, que gelificó por encima de pH 4,0.

A continuación, algunos de los tensioactivos se valoraron a la baja con respecto a la cantidad de tensioactivo añadido. Cuando el Polisorbato 20 se tituló hasta concentraciones del 3 % y 1 %, se observó formación de fibrillas por debajo de pH 2,5, pero en ambos casos no se observaron otros signos de precipitación hasta pH 4,14 y 3,76 respectivamente. Poloxámero 407 al 4 % produjo un número pequeño y aparentemente no creciente de fibrillas al inicio de la titulación, pero ningún otro signo de precipitación hasta por encima de pH 6.2, y al 2 % produjo una solución clara hasta por encima de pH 5,6. Al 0,5% se observaron fibrillas en solución una vez que se inició la titulación, pero no se observaron más signos de precipitación hasta por encima de pH 4,5.

El compuesto I fue claramente superior al Met-12 en la mayoría de los tensioactivos examinados, en particular el Polisorbato 80, el Poloxámero 407 y el Tiloxapol, siendo los datos del Polisorbato 20 algo ambiguos debido a la formación inicial de fibrillas observada, aunque estaba claro que la mayoría de los el compuesto estaba en solución a pH 3-6, en contraste con Met-12 en el mismo vehículo. Por lo tanto, las solubilidades del Compuesto I se observaron en mezclas de codisolvente-tensioactivo, comenzando con concentraciones altas de aditivos y a continuación concentraciones más bajas de uno o ambos aditivos, en un diseño experimental de matriz escasamente poblado.

Ejemplo 5: Estudios de solubilidad del Compuesto I con tensioactivos no iónicos mixtos.

La combinación de PG al 70 % y de Polisorbato 80 al 10 % dio como resultado una solución transparente que se volvió viscosa a pH 3,4 y gelificó a pH 5,25, lo que la hizo no mejor que PG al 70 % y peor que PS-80 al 10 %.

Con PG al 70 % y PS al 3 %, la viscosidad se estableció a pH 4,6, pero el material seguía siendo un gel a pH 5,25.

Con PG al 35 % y PS-80 al 3 %, aparecieron fibrillas en solución a partir de un pH de 2,66, y se observaron agregados en solución a un pH de 3,48.

PG al 35 %, PS-80 al 10 % no mostraron signos de fibrillas ni agregados, y se observó una viscosidad apreciable a pH 4,05, y gelificación a pH 5,71 (inferior al propio PS-80 al 10 %).

PG al 10 % y PS-80 al 10 % produjeron una solución transparente con una viscosidad baja a pH 4,94, y por encima de pH 5,13 comenzó a precipitar el material.

PG al 10 % yPS-80 al 3 % produjeron una solución transparente a pH 3,16, pero se produjo algo de precipitación a pH 3,4.

Como se indicó anteriormente, la solución en Polisorbato 20 al 10 % parecía dar soluciones móviles claras hasta pH 7, pero incluso a pH bajo se observaron algunas fibrillas, y éstas tendían a aumentar en número al aumentar el pH.

Sorprendentemente, la combinación de PG al 10 % y Polisorbato 20 al 10 % dio como resultado una buena solubilidad, y el inicio de una viscosidad apreciable solo se produjo de forma reproducible por encima de pH 7, y no se observaron indicaciones visuales de precipitación. Sin embargo, al reposar durante la noche, la solución se gelificó y el pH descendió aproximadamente 0,2 unidades. Una agitación suave reconvirtió el gel en líquido, que podía inyectarse.

Polisorbato 20 al 3 %, con PG al 10 % produjo una solución móvil transparente a un pH de 5,3, pero al bajar el PS-20 al 1 % se produjeron fibrillas por debajo de pH 3.

Se agregó PG al 10 % a las formulaciones de Poloxámero al 4 %, 2 % y 0,5 %. Con la formulación de Poloxámero al 4%, pareció haber una ligera mejora, no se observaron fibrillas a pH bajo y una solución transparente a al menos pH 5,36. Poloxámero al 2% /PG al 10 % fue igualmente bueno con una solución móvil transparente a pH 5,74. La formulación de Poloxámero al 0,5 % mostró fibrillas al inicio de la titulación y mostró algo de turbidez a pH 3,45, pero permaneció de baja viscosidad hasta pH 6.

A las formulaciones de Poloxámero al 2 %, al 1 % y al 0,5 % se les añadió PG al 3 %, 1 % o nada de PG, y se midió la estabilidad a pH 4,0, pH 5,5 y pH 7,0, después de permanecer 3 días a RT, mediante ensayos visuales y filtración (véase el siguiente ejemplo). Visualmente, las fibrillas se observaron con menos frecuencia en las muestras recién preparadas, siendo más probable que se observaran con menos excipientes presentes y con un pH más alto, mientras que todas las muestras de pH 7,0 estaban inicialmente turbias y algunas tenían una precipitación evidente. Todas las muestras de pH 4.0 inicialmente no estaban turbias, con solo PX al 0,5%, PG al 0% que mostró una ligera turbidez después de la retención. Con las muestras de pH 5.5, se observó una ligera turbidez inicial en todas las muestras de PG al 0 %, y la muestra de PG al 1 % al 0,5 %PX, pero después de la retención solo la muestra de excipiente más baja (PX al 0,5 % PG al 0 %) mostró una ligera turbidez. Un par de estas muestras se volvieron ligeramente turbias al agitarlas. El ensayo de filtración contó una historia bastante diferente. Con las formulaciones de Poloxámero al 2 %, las tres formulaciones de pH 4 tuvieron una recuperación de >98 % tras la filtración, y a pH 5,5 la recuperación fue de >96 %, y a pH 7,0 las recuperaciones siguieron siendo del 86 al 93 %. En las formulaciones de PX al 1% a pH 4, la recuperación fue del 97-98 % tras la filtración, y a pH 5,5 del 87-93 %, pero a pH 7 fue solo del 1-13 %. En las formulaciones de PX al 0,5 %, la recuperación después de la filtración a pH 4 fue del 73-88 %, a pH 5,5 del 12-43 %, y a pH 7 no hubo recuperación después de la filtración en ninguna de las tres muestras.

A partir de estos experimentos, se puede concluir que cantidades relativamente bajas de PG como codisolvente pueden ser moderadamente útiles con algunos tensioactivos, pero las concentraciones altas fueron perjudiciales y la predictibilidad de estos efectos de formulación no es alta. En las formulaciones de PX, las cantidades de PX presentes y el pH de la formulación son más importantes que los niveles de PG. Además, las lecturas visuales no concuerdan necesariamente con el ensayo de filtración más fiable, y la observación de fibrillas especialmente parecía no estar correlacionada con la cantidad de fármaco filtrable presente.

Ejemplo 6: Estudios de solubilidad del Compuesto I con tensoactivos no iónicos de baja concentración.

Los experimentos de eficacia in vitro, y posteriormente, in vivo demostraron que el compuesto I es en el intervalo de 3 a más de 10 veces más potente para bloquear la apoptosis inducida por FasL (o desprendimiento de retina) en las células fotorreceptoras. Estos sorprendentes resultados permiten que la dosis humana proyectada se reduzca al intervalo de 25-200 pg/ojo, que redujo la concentración máxima requerida del fármaco formulado a 2,0 mg/mL. Se llevó a cabo un conjunto adicional de experimentos para encontrar las condiciones óptimas de formulación a esa concentración, y algunos experimentos observaron concentraciones de fármaco aún más bajas. Todo este trabajo analizó el Poloxámero 407 o el Polisorbato 20 como tensioactivo. Tanto la turbidez visible como la estimación visual de la viscosidad son observaciones de detección útiles, pero como se analizó anteriormente, se descubrió que no siempre indican la presencia de péptidos agregados, y gran parte del trabajo posterior evaluó la solubilidad midiendo la cantidad de fármaco presente en un muestra antes y después de pasarla por una membrana de PVDF de 0,2 micras o un filtro PALL 25 mm 0,2 pM Ultipor Nylon 6,6. Las soluciones turbias o muy viscosas eran generalmente difíciles o imposibles de filtrar y, cuando se podían filtrar, a menudo daban recuperaciones de fármaco muy bajas. Sorprendentemente, algunas soluciones transparentes móviles también mostraron grandes pérdidas tras la filtración, por lo que se definieron formulaciones satisfactorias como aquellas que daban una recuperación del fármaco >90 % después de la filtración. Cabe señalar que todas las mediciones de solubilidad con compuestos como el Compuesto I, que forman fibrillas, solo pueden medir la solubilidad cinética. La formación de fibrillas puede ser muy lenta en muchos conjuntos de condiciones, y se puede medir la solubilidad de soluciones metaestables, donde una verdadera solubilidad termodinámica, en relación con la forma de fibrilla más estable posible, puede tardar días o años en lograrse por completo. Sin embargo, las formulaciones se mantuvieron rutinariamente durante 24-72 horas antes de la filtración, para evitar al menos una precipitación rápida después de la formulación.

Un experimento inicial analizó soluciones de 1 mg/mL del Compuesto 1 en PS-20 al 3 %/PG al 3 % y PX al 2 %/PG al 2 % a pH 4. Todas produjeron soluciones claras, sin pérdida de API tras la filtración. El siguiente experimento analizó 2 mg/mL en PG al 2% y PX al 0.1%, 0,25 % y 0,5 %, así como PG y PX al 0,5 %, a pH ~3, pH 4, pH 5,5 y pH 7. Todos parecían claros y móviles excepto la muestra de pH 7, PX al 0,1% que estaba ligeramente turbia y aparentemente móvil, pero que no produjo recuperación cuando se filtró. La recuperación de pH 5,5 solo fue del 78 %, y a pH 4,0 del 92 %. Cantidades más altas de PX llevaron a una recuperación completa a pH 3 y 4,0 del 93-97 % a pH 5,3 y del 88­ 92 % a pH 7,0. Los PX de alto y bajo PG al 0,5 % eran esencialmente idénticos, lo que sugiere que el PG no es muy importante en esta zona de la variedad de la formulación.

Dado que, durante estos experimentos, se observaron ocasionalmente cambios de pH bastante grandes en reposo prolongado, un experimento similar con 2,0 mg/mL del Compuesto I y PX al 0,25 %. El PG al 2 % se procesó a pH 3, 4, 5,5 y 7, mientras se comparaba el material autotamponado (sal de HCl titulada con NaOH) frente a tampones de histidina, acetato y citrato 10 mM, con análisis mediante ensayo de filtración. El tampón de acetato fue al menos tan bueno como el material auto-tamponado en todos los pH, el tampón de histidina fue ligeramente peor y el tampón de citrato fue notablemente inferior en los tres pH más altos, con solo un 75 % de recuperación a pH 4, frente a un 91 % en caso del tampón de histidina, un 92 % sin tampón y un 97 % en caso del tampón de acetato. A continuación, se estandarizó el tampón de acetato.

Para examinar los efectos de los agentes de isotonicidad, se examinaron soluciones tampón de acetato 10 mM a pH 4 y pH 5,5 con 2 mg mL de Compuesto I, con PX al 0,25 %, con de PG al 0,5 % y 2 %, manitol al 4,5 %, glicerina al 2 % y cloruro sódico acuoso al 0,8 %. Todos dieron una recuperación del 98-99 % a pH 4,0 y una recuperación del 90­ 94 % a pH 5,5, excepto las muestras de cloruro de sodio, que tuvieron recuperaciones del 89 % y 79 % a los dos pH. Todos estaban en el intervalo de 230-310 mOsm/L excepto el PG al 0,5 % que era más bien hipotónico. Utilizando tampón de acetato 10 mM y manitol al 4,5 % como agente de isotonicidad, 2 mg/mL del Compuesto I, y pH 4,0 y 5,5, se observaron cinco condiciones de tensioactivo. No tenían tensioactivo, PS-20 al 0,1 %, PS-20 al 0,1 % más PX al 0,25 %, PX al 0,25 % y PX al 0,4 %. El no tensoactivo dio un 0 % de filtrado a pH alto y un 23 % a pH 4,0, y el PX al 0,4 % y la mezcla de PX al 0,25 %/ PS-20 al 0,1 %dio una recuperación completa a pH 4,0 y DEL 95 % y 91 % respectivamente a pH 5,5. El PX al 0,25 % fue algo inferior con un 96 % y 91 % respectivamente y el PS al 0,1 % bastante inferior a su vez con una recuperación del 90 % y 65 % a pH 4 y 5,5 respectivamente.

Como el experimento de isotonicidad había sugerido que el clorhidrato puede ser pobre para la solubilidad, se realizó un experimento usando 2 mg/mL de la sal de triacetato del Compuesto I. Debido a la débil acidez del ácido acético, el pH inherente de esta sal a 2 mg/mL en agua es 3,4-3,6, pero a pesar de que las muestras se disolvieron en ácido acético 10 mM, manitol al 4,5% y PX al 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,8 % y 1,0 % o PS-20 al 0,4 %, 0,5 %, 0,75 %, 1,0 % y 1,5 %, y el pH se ajustó a 4,0 o 5,5. Todas las muestras con pH no ajustado (3,4-3,6) mostraron una recuperación superior al 97% tras la filtración, y >98% a pH 4. A pH 5,5, PX al 0,4 y al 0,5 % de tuvo una recuperación del 96 %, y las concentraciones más altas de PX produjeron una recuperación del 98-99 %, mientras que las formulaciones de PS-20 tuvieron todas una recuperación del 92-94 % a ese pH. A partir de estos experimentos, una formulación optimizada podría contener menos PX que una formulación similar basada en PS-20, pero el PS-20 sigue siendo aceptable, y puede evitar algunos problemas potenciales de PX, incluso cuando se administra a concentraciones más altas.

Ejemplo 7: Eficacia in vitro del Compuesto I

Cultivo celular. La línea celular de fotorreceptores 661W fue proporcionada generosamente por Muayyad Al-Ubaidi (Departamento de Biología Celular, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma, Ciudad de Oklahoma, OK). La línea celular 661W es una línea de fotorreceptores que ha sido inmortalizada por la expresión del antígeno SV40-T bajo el control del promotor de la proteína de unión al retinol interfotorreceptor humano (IRBP) (Al-Ubaidi y col., J Cell Biol., 119 (6): 1681-1687 (1992)). Las células 661W expresan marcadores de fotorreceptores de cono, incluidos pigmentos de cono azul y verde, transducina y arrestina de cono (Tan y col., Invest Ophthalmol Vis Sci., (3):764-768 (2004)), y pueden sufrir muerte celular mediada por caspasa (Kanan y col., Invest Ophthalmol Vis Sci., 48(1):40-51 (2007)).

La línea celular 661W se mantuvo en medio de Eagle modificado por Dulbecco que contenía suero bovino fetal al 10 %, 300 mg/L glutamina, 32 mg/L putrescina, 40 pL/L p-mercaptoetanol, 40 pg/L 21-hemisuccinato de hidrocortisona y 40 pg/L progesterona. Los medios también contenían penicilina (90 U/mL) y estreptomicina (0,09 mg/mL). Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 % y aire al 95 %.

Ensayos de actividad. Las actividades de caspasa 3, caspasa 8 y caspasa 9 se midieron con kits de ensayo de escisión de tetrapéptidos colorimétricos, según las instrucciones del fabricante (BioVision, Mountain View, California). La proteína total (661W/retina) se extrajo según un protocolo previamente publicado (Zacks y col., IOVS, 44(3): 1262­ 1267 (2003)). Cien microgramos de proteína total (661W/retina) se incubaron con sustratos de caspasa 3 (DEVD-pNA), caspasa 8 (IETD-pNA) o caspasa 9 (LEHD-pNA) a 200 pM de concentración final durante 60 minutos. La absorbancia se midió a 405 nm en un lector de microplacas (Spectra-MAX 190, Molecular Devices, Sunnyvale, California). Como control negativo, (661W/retinal) la proteína se incubó con tampón de ensayo sin el tetrapéptido. Se utilizó un segundo control negativo en el que se incubó tampón de ensayo solo con el tetrapéptido. Como control positivo, se incubó caspasa 3, caspasa 8 o caspasa 9 purificada con el tetrapéptido solo.

Experimentos anteriores realizados durante el desarrollo de la presente invención demostraron que la señalización de Fas juega un papel fundamental en la activación de la caspasa 8 y la apoptosis de los fotorreceptoresin vivo.

Las células 661W se trataron con FasL. La adición de FasL dio como resultado muerte celular. La actividad de la caspasa 8 medida en lisados celulares de 661 W aumentó con el aumento de la concentración de FasL, alcanzando su punto máximo con la dosis de 500 ng/ml. Las células 661W se trataron con 500 ng/ml de FasL y se midieron los niveles de actividad en varios puntos de tiempo. La actividad de la caspasa 8 aumentó significativamente a las 48 horas en células 661W expuestas a FasL. La actividad de la caspasa 8 aumenta de forma fiable en función de la dosis en un 20-30 % en diferentes ciclos.

El sistema de ensayo descrito anteriormente se usó como un sistema de detección in vitro para encontrar posibles inhibidores de la vía de activación de caspasa 8 inducida por Fas. Cuando se probó el Met-12 (sal de trihidrocloruro) en este ensayo con células 661W, mostró una reducción dependiente de la dosis en la activación de la caspasa 8 inducida por FasL, que se maximiza a 10 pM, donde, dependiendo del ensayo, la activación de la caspasa 8 se reduce a un 0-25% de la línea de base. Esta actividad depende mucho de la formulación en la que se administra el péptido Met-12. La formulación final de Met-12 se diluyó 1000 veces para este ensayo, y para llegar a la parte superior de la curva de dosis, que normalmente es de 100 j M, se usan diluciones menores. En estas circunstancias, la potencia máxima de la dosis se observó con una solución pura de DMSO, que suministró el péptido Met-12 como un líquido transparente y móvil, donde el pH aparente está muy por debajo de 3,0. Cuando se probaron formulaciones de base acuosa, incluso cuando no hubo evidencia visual de precipitación o agregación antes de agregar el material a los pocillos de prueba, las formulaciones mostraron una potencia de dosis considerablemente menor, y la inhibición máxima no se logró hasta dosis de 50-100 j M.

Esto sugiere fuertemente que, independientemente de la forma física final en los pocillos de prueba, la agregación en la solución de dosificación conduce a especies con mucho menos fármaco disponible, incluso en estos ensayos celulares, que las soluciones verdaderas que se diluyen exactamente en las mismas condiciones, donde presumiblemente tienen la misma solubilidad potencial intrínseca. Con mucho, la explicación más probable para esto es que los agregados preformados en las no soluciones son lo suficientemente estables cinética y termodinámicamente para no desagregarse en una solución a una velocidad óptima durante la duración de la prueba, mientras que las soluciones, cuando se diluyen en los pocillos de prueba, o bien no forman agregados, o más probablemente forman agregados diferentes, que se disuelven más fácilmente. La razón principal por la que los agregados son diferentes sería que el péptido está, como mínimo, en una forma algo menos concentrada cuando se lleva de su forma soluble potenciada con codisolvente o pH a un medio acuoso al 99 % a pH 7,4. Sin embargo, dado que la mezcla eficiente es poco probable en los pocillos de prueba e imposible en el ojo y, como se analiza a continuación, los protones solvatantes (pH bajo) y los solventes de moléculas pequeñas se difundirán en el agua mucho más rápido que los péptidos hidrófobos y voluminosos, es muy probable que estos péptidos se agreguen rápidamente en los pocillos de prueba o en el humor vitreo inmediatamente después de la dosificación. Por lo tanto, aunque la dosificación en solución es claramente superior a la dosificación en suspensión/gel, no hay garantía de que no siga sequestrando gran parte del péptido en forma de agregados insolubles, y reduzca la concentración efectiva del fármaco de forma estocástica cuando se administre.

Inesperadamente, como se muestra en la FIG. 1, cuando se probó el trihidrocloruro del Compuesto I en este ensayo como una solución no tamponada en DMSO, en comparación con Met-12 (también un trihidrocloruro en DMSO), demostró ser 10 veces más potente que Met-12 por determinación de IC50, y aproximadamente 3 veces más potente medido por la concentración que produjo la inhibición máxima de la activación de caspasa 8 inducida por FasL. La EC50fue de 0,4 j M, mientras que la del propio Met-12 fue de 4 j M, y la inhibición máxima se observó a 3 j M. Sin embargo, por encima de 3 j M, el Compuesto I mostraba una curva en forma de U, y por encima de 30 j M, parecía estar casi inactivo. En contraste, Met-12 dosificado de la misma manera alcanza su eficacia máxima (ligeramente mayor) a 10 j M, y a continuación tiene solo una ligera pérdida de potencia de rebote hasta 100 j M. (Véase la Figura 1; Actividad de la caspasa 8 tras 48 horas de tratamiento con FasL recombinante humano después de un tratamiento previo con Met-12 y el Compuesto I). El 0 % es el nivel de actividad de la caspasa 8 de los controles no tratados. El 100 % es el nivel de actividad de la caspasa 8 de los controles tratados únicamente con FasL.

Dado que el mecanismo de acción de FasL implica una trimerización de ligando trivalente del receptor Fas, es muy difícil ver cómo los derivados de Met-12 monovalentes podrían tener curvas de dosis mixtas de agonista-antagonista, y se cree que la pérdida de potencia es un artefacto de solubilidad del ensayo. Sin embargo, el aumento inesperado en la potencia de la dosis para el Compuesto I debería permitir que se administre una cantidad menor del fármaco que la requerida para el propio Met-12, lo que a su vez reduce los requisitos de solubilidad para la formulación peptídica para inyección intravítrea.

Los datos mostrados en la FIG. 2 son consistentes con la explicación anterior. Muestra una vez más que el trihidrocloruro del Compuesto I en DMSO (20 mg/mL) es algo más potente en dosis que Met-12, pero vuelve a ser inactivo en concentraciones más altas. Por el contrario, cuando se prepara a una concentración de 10 mg/mL en una solución clara filtrable presumiblemente micelar de Polisorbato 20 al 2 % y PG al 2 % a pH 4, el trihidrocloruro del Compuesto I es considerablemente más potente en dosis, pero también más eficaz que Met-12 o el Compuesto I en DMSO. Además, hay muy poca pérdida de eficacia máxima en la dosis máxima de 30 j M probada en este ensayo. Este resultado sorprendente muestra que la capacidad de formular el Compuesto I en los tensioactivos puede conducir a un gran aumento de la eficacia del fármaco.

La FIG. 3 compara una solución de 20 mg/mL de DMSO con dos formulaciones de Polisorbato del trihidrocloruro del Compuesto I que contienen PS-20 al 1 % y al 3 % y PG al 3 % a pH 4 con todos a una concentración de 10 mg/mL. Los 3 muestran una eficacia similar en este caso a concentraciones más bajas, pero el PS-20 al 1 % solo muestra una pérdida de actividad débil desde su concentración más potente de 3 j M, hasta 30 j M, mientras que el PS al 3 % muestra un aumento continuo en la actividad hasta 30 j M, la dosis máxima probada.

En la FIG. 4, se comparan las formulaciones optimizadas del trihidrocloruro del Compuesto I, a 2 mg/mL en tampón de acetato 10 mM de pH 4, manitol al 4,5 % y PS-20 al 0,4 % (triángulos oscuros) con 20 mg/mL de trihidrocloruro del Compuesto I en DMSO (círculos claros) en células 661W. El trihidrocloruro en DMSO muestra la curva habitual en forma de U con un efecto máximo a 3 j M y un rebote considerable a concentraciones más altas. La formulación solo se pudo probar a 10 j M, debido a sus bajas concentraciones, pero muestra una eficacia similar a la solución de DMSO.

Una posible explicación de la mayor eficacia observada con las formulaciones de micelas es que la solubilidad del péptido se mantiene durante un período de tiempo más prolongado debido a la propensión del tensioactivo a autoensamblarse, que solo se ve afectada lentamente por la dilución y la dispersión, en marcado contraste con gradientes de pH o codisolventes de molécula pequeña. Por lo tanto, las micelas y el péptido se dispersan más ampliamente en el medio acuoso, antes de que el péptido se libere en el medio acuoso, porque las micelas solo se deshacen lentamente, mientras que en una solución codisolvente o muy ácida, el factor solubilizante (iones de hidrógeno, molécula pequeña), se diluye muy rápidamente en el medio acuoso, antes de que el péptido tenga una oportunidad real de dispersarse más allá de las áreas en las que la inyección lo situó directamente. Esto hará que el péptido se disperse de manera menos eficiente a partir de formulaciones en solución y forme más agregados inactivos que a partir de una formulación micelar.

Ejemplo 8: Estudio farmacocinético ocular intravítreo en conejo con el Compuesto I

Este estudio se llevó a cabo para determinar las concentraciones del Compuesto I en el humor vítreo (HV) y el tejido de la retina tras las inyecciones intravítreas de conejos machos Dutch Belted. Las concentraciones se determinaron en tejidos a las 24, 72, 168 y 240 horas después de la dosis de una dosis intravítrea bilateral (IVT) de 50 pl.

El diseño del estudio se resume en la Tabla I.

Tabla I. Diseño del estudio.

El sistema de pruebas incluía lo siguiente:

Especie/cepa/género: Conejos machos Dutch Belted

Proveedor: Productos de investigación de Covance, Inc.

Intervalo de edad: 4 a 5 meses

Peso en el momento de la recepción (intervalo de pesos): 1,51-1,85 kg

Vía de administración: Inyección intravítrea (IVT)

Duración del tratamiento: Dosis individual por ojo

Concentraciones de la formulación: 2,0, 1,0 y 0,5 mg/mL triacetato del Compuesto I Volumen de la Dosis: 50 pL por ojo

Se administró una dosis ocular de inyección intravítrea (IVT) de 50 pl al globo ocular de cada uno de los ojos de conejos Dutch Belted.

En los puntos de tiempo respectivos, los conejos fueron sacrificados mediante sobredosis de barbitúricos intravenosos, y los ojos fueron enucleados y congelados instantáneamente. El humor vítreo y la retina se recogieron de todos los animales y se analizaron con respecto al Compuesto I por LC-MS/MS

Cálculos:

Coeficiente de variación porcentual: se utiliza como estimación de la precisión.

Coeficiente de variación porcentual (%CV) = (desviación estándar/ valor medio) * 100

Análisis de mínimos cuadrados cuadrático: El ajuste de la curva estándar se determinó mediante una ecuación cuadrática con ponderación 1/x2:

donde:

y = relación de área de pico de los estándares de calibración al estándar interno

x = concentración del estándar de calibración

a = coeficiente cuadrático de x2

b = coeficiente cuadrático de x

c = la constante como la intersección y de la curva de calibración

Concentración de analito cuadrática: La concentración de analito se calcula utilizando los parámetros de la curva de calibración calculados anteriormente y a continuación resolviendo el valor de x.

Resultados

Las concentraciones de retina y HV se encuentran en las Tablas 2 y 3 a continuación, y se representan gráficamente en las Figuras 1 y 2. Los parámetros farmacocinéticos se calcularon cuando fue adecuado y se resumen en las Tablas 4 y 5 a continuación.

< CD < CD < CD < CD < CD < CD < CD - CN

Tabla 3. Concentraciones de Compuesto I en humor vitreo de Dutch Belted.

Los resultados de este estudio tanto en retina como en humor vitreo se muestran en la FIG. 5 (A+B) y en la FIG. 6 (A+B) respectivamente. Las concentraciones retínales del Compuesto I fueron variables con el coeficiente de variabilidad (%CV) que van del 52 al 156 por ciento durante el transcurso del estudio para todos los grupos. El Tmáx. en retina se observó a las 72 (3 días) o 168 (7 días) horas después de la administración en caso de las tres formulaciones de Poloxámero, pero no fue dependiente de la dosis, mientras que el tmáx. en retina en caso de la formulación de Polisorbato fue 24 horas después de la administración. AUCü-último en retina siguió un patrón variable similar al de Cmáx.. El T1/2 en retina para el Compuesto I solo se pudo calcular para los datos de retina de Poloxámero de 2 mg/mL(168 horas) y Polisorbato de 1 mg/mL (199 horas).

El análisis del humor vítreo para el Compuesto I indicó que la concentración era relativamente consistente dentro de cada punto de tiempo para las formulaciones de Poloxámero. Cuando se normalizó por el peso de1HV recogido, se calculó un total teórico del Compuesto I. La cantidad total de Compuesto I inyectado en cada ojo de conejo fue de 100 |jg (2 mg/mL *50 jL ) o 25 |jg (0,5 mg/mL *50 jL ) para los poloxámeros y 50 |jg (I mg/mL *50 jL ) para el grupo de Polisorbato. La concentración media más baja para todos los grupos fue a los 10 días. El Compuesto I promedio que permanece en el HV para el Grupo 1 (100 jig) osciló entre 84,2 jg y 106 jig desde las 24 horas hasta 10 días después de la administración IVT. El Compuesto I promedio que permanece en el HV para el Grupo 2 (25 jig) osciló entre 19,5 jig y 23,0 jg desde las 24 horas hasta 10 días después de la administración IVT. El Compuesto I promedio que permanece en el HV para el Grupo 3 (25 jg ) osciló entre 26,0 jg y 20,4 jg desde las 24 horas hasta 10 días después de la administración IVT. El Compuesto I promedio que quedaba en el HV para el Grupo 4 de Polisorbato (50 jg ) osciló entre un máximo de 46,8 jg a las 24 horas y 19,4 jg a los 10 días después de la administración IVT. El grupo de Polisorbato fue la única formulación con una disminución notable en las concentraciones del Compuesto I con el tiempo. Sin embargo, en todos los grupos se detectaron cantidades sustanciales de fármaco intacto 10 días después de la administración.

El cálculo de los parámetros farmacocinéticos para el Compuesto I en HV indicó un Tmáx. de 24 o 72 horas después de la administración de IVT con una Cmáx. que coincidía estrechamente con la cantidad total de fármaco administrado para cada grupo (Tabla 4). El AUCü-últimofue casi proporcional a la dosis entre los grupos de Poloxámero con el Grupo 1 (2 mg/mL) teniendo un AUC aproximadamente cuatro veces mayor que la de los Grupos 2 y 3 (ambos 0,5 mg/mL). El grupo Polisorbato (1 mg/mL) fue menos que proporcional a la dosis en relación con los grupos de Poloxámero, pero puede explicarse fácilmente ya que fue el único grupo que tuvo una disminución notable en la concentración de HV del Compuesto I a lo largo del estudio. T1/2 para el grupo de Polisorbato fue de 183 horas con un buen ajuste lineal, mientras que t-i/2 para los grupos Poloxámero fue >900 horas con un ajuste lineal menos que óptimo.

Tabla 4. Parámetros farmacocinéticos para el compuesto I en humor vítreo.

Tabla 5. Parámetros farmacocinéticos para el Compuesto I en la retina.

En resumen, el Compuesto I cuando se administró IVT en las formulaciones de Poloxámero o Polisorbato no mostró signos de irritación o problemas de tolerabilidad a lo largo de los 10 días del estudio. El Compuesto I, cuando se administra IVT como una formulación de Poloxámero, no disminuye fácilmente en concentración durante un período de hasta 10 días, y probablemente más, en la retina o HV. El Compuesto I, cuando se administró como una formulación de Polisorbato, demostró una disminución clara, aunque lenta, de la concentración a los largo del estudio de 10 días, lo que sugiere que la farmacocinética intravítrea puede controlarse dentro de determinados parámetros mediante la elección cuidadosa del tensioactivo no iónico utilizado.

Ejemplo 9: Estudio farmacocinético ocular intravítreo en rata con el Compuesto I

Este estudio se llevó a cabo para determinar las concentraciones del trihidrocloruro del Compuesto I en el humor vítreo y los tejidos de la retina tras las inyecciones intravítreas de ratas Brown Norway. Las concentraciones se determinaron en tejidos a las 24 (Grupo I) y 72 horas (Grupos I y 2) después de la dosis de una dosis intravítrea bilateral (IVT) de 5 pL.

El diseño del estudio se resume en la Tabla 6.

Tabla 6. Diseño del estudio.

El sistema de pruebas incluía lo siguiente:

Especie/cepa/género: Ratas Norway Brown

Proveedor: Charles River, Inc.

Intervalo de edad: 1 a 2 meses

Peso en el momento de la recepción (intervalo

de pesos): 165,9-181,2 g

Vía de administración: Inyección intravítrea (IVT)

Duración del tratamiento: Dosis individual por ojo

Concentraciones de la formulación: ONL-1204 triacetato 0,06 mg/ml

Volumen de la Dosis: 5 pL por ojo

Recolección de tejidos oculares

Las ratas fueron sacrificadas mediante sobredosis de barbitúricos intravenosos, y los ojos fueron enucleados y congelados instantáneamente. El humor vítreo (HV) y la retina se recogieron de todos los animales y se analizaron con respecto al Compuesto I por LC-MS/MS.

Resultados

Concentraciones de tejido ocular

Concentraciones de trihidrocloruro del compuesto I en retina de rata Brown Norway y humor vítreo Desconocidos Homogeneización de tejidos

Instrucciones para la homogeneización del humor vitreo (HV) Desconocidos

Para cada HV desconocido o blanco de control: Pesar HV en un tubo de homogeneización.

Añadir 4 veces el peso del HV (mg) de ACN:agua: ácido clorhídrico 1 M (70:20:10, v/v/v) (j L) al tubo de homogeneización. Agregar perlas de óxido de circonio, de 2,8 y 1,4 mm de tamaño. Homogeneizar todas las muestras en Precellys®: 5500 rpm, 3 ciclos de 30 segundos y 20 segundos entre ciclos, a una temperatura entre -10 y 0 °C. Instrucciones para la homogeneización de patrones de tejido ocular de la retina

Para cada estándar de retina:

Pesar tejido de la retina en blanco en un tubo de homogeneización.

Agregar 0,5 veces el peso del tejido (mg) del estándar de calibración de trabajo de retina (j L) al tubo de homogeneización.

Añadir 3,5 veces el peso del tejido (mg) de ACN:agua: ácido clorhídrico 1 M (70:20:10, v/v/v) (j L) al tubo de homogeneización.

Agregar perlas de óxido de circonio de 1,4 mm de tamaño.

Homogeneizartodas las muestras en Precellys®: 5500 rpm, 3x 30 ciclos y 20 segundos entre ciclos, a una temperatura entre -10 y 0 °C.

Instrucciones para la homogeneización de controles en blanco de tejido de retina y desconocidos

Para cada retina desconocida o control en blanco:

Pesar el tejido de la retina en un tubo de homogeneización.

Añadir 4 veces el peso del tejido (mg) de ACN:agua: ácido clorhídrico 1 M (70:20:10, v/v/v) (j I) al tubo de homogeneización.

Agregar perlas de óxido de circonio de 1,4 mm de tamaño.

Homogeneizartodas las muestras en Precellys®: 5500 rpm, 3x 30 ciclos y 20 segundos entre ciclos, a una temperatura entre -10 y 0 °C.

Preparación de estándares, muestras y blancos

Preparación del stock de calibración y de los estándares de trabajo

Se preparó un estándar de calibración en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración de 500 jg/m L para ONL-1204. Los estándares de calibración de trabajo se prepararon para el humor vitreo mediante la dilución en serie de la solución madre de trabajo con ACN: agua: ácido clorhídrico 1M (70:20:10, v/v/v) en un intervalo de 500 ng/mL a 200.000 ng/mL de ONL-1204.

Los estándares de calibración de trabajo se prepararon para la retina mediante la dilución en serie de la solución madre de trabajo con acetonitrilo: agua: ácido clorhídrico 1M (70:20:10) en un intervalo de 100 ng/mL a 200.000 ng/mL de ONL-1204.

Preparación de estándares, desconocidos, blancos y blancos con estándar interno para análisis de humor vitreo En un tubo de polipropileno, se agregaron diez (10) j L (20 j L STD II) de patrón de calibración de trabajo o stock a 90 j L (80 j L STD II) de humor vitreo en blanco de control. Para los blancos y los blancos con patrón interno, se agregaron 100 j L de humor vitreo bovino blanco de control. Se añadieron cuatrocientos (400) j I de ACN: agua: ácido clorhídrico 1M (70:20:10, v/v/v) a cada estándar o blanco.

Cien (100) j L de cada muestra de humor vitreo con ACN: ácido fórmico (1000:1, v/v) se alicuotaron a continuación. Cien (100) j L de DMSO:agua:ácido fórmico (50:40:10) se añadieron a cada muestra de humor vitreo. Las muestras se mezclaron en vórtex y a continuación se centrifugaron durante 10 minutos a 14.000 rpm (4 °C). A 50,0 j L de sobrenadante, se añadieron 100 j L de estándar interno de trabajo (50.000 ng/mL de APi 1887 en agua) (agua para el blanco sin estándar interno), y 150 pl de agua. A continuación, las muestras se mezclaron en vórtexy se transfirieron a una placa de automuestreador para su análisis.

Preparación de estándares, desconocidos, blancos y blancos con estándar interno para análisis de retina

En un tubo de polipropileno, se añadieron 50 pl de homogeneizado desconocido de rata Brown Norway, blanco de control bovino o homogenato bovino estándar de calibración. Cincuenta (50) pL de DMSO:agua:ácido fórmico (50:40:10) se añadieron a cada muestra. Las muestras se mezclaron a continuación en vórtex y se centrifugaron durante 10 minutos a 14.000 rpm (4 °C). A continuación, se dividieron en alícuotas ochenta (80) pl de cada sobrenadante de muestra en una placa de automuestreador de 96 pocillos. Se añadieron cuarenta (40) pl de estándar interno de trabajo (5.000 ng/mL de APi 1887 en agua) (agua para el blanco sin estándar interno), y 120 pl de agua. A continuación, las muestras se mezclaron con una pipeta multicanal y se analizaron.

Cálculos

Coeficiente de variación porcentual: Se utiliza como estimación de la precisión.

Coeficiente de variación porcentual (%CV) = (desviación estándar/ valor medio) * 100

Análisis de mínimos cuadrados cuadrático: El ajuste de la curva estándar se determinó mediante una ecuación cuadrática con ponderación 1/x2:

donde:

y = relación de área de pico de los estándares de calibración al estándar interno

x = concentración del estándar de calibración

a = coeficiente cuadrático de x2

b = coeficiente cuadrático de x

c = la constante como la intersección y de la curva de calibración

Concentración de analito cuadrática: La concentración de analito se calcula utilizando los parámetros de la curva de calibración calculados anteriormente y a continuación resolviendo el valor de x.

Análisis:

Los resultados promediados globalmente se muestran en la Fig. 7. Para el Grupo I, ambos ojos de cada animal se combinaron para un único análisis. En el Grupo 2 se combinaron ambos ojos de 4 animales para hacer muestras. Las concentraciones para la retina agrupada en el Grupo 2 fueron de 462 y 1310 ng/g para las muestras A-D y E-H respectivamente. El análisis del humor vitreo para el Compuesto I se realizó usando muestras combinadas de cada ojo para cada animal en los Grupos I y 2. Cuando se normalizó por peso de HV recolectado, se calculó un total teórico de Compuesto I. La cantidad total de Compuesto I inyectado en cada ojo de rata fue de 0,3 pg (0,06 mg/mL *5 pL)). Debido a las diferentes formas en que se recolectaron los datos de 72 horas, no se calculó el error estándar. Las barras oscuras representan la cantidad de triacetato del Compuesto I en el humor vítreo de cada ojo, con la barra t = 0 que representa la dosis prevista de 300 ng, y las barras claras representan la concentración del Compuesto I en la retina expresada en ng/g. En las primeras 24 horas, aproximadamente la mitad del fármaco eliminó el hV, pero la vida media terminal fue claramente del orden de varios días. Mientras tanto, las concentraciones de la retina estaban por encima de 1 pg/g a las 24 horas, y tienen solo alrededor del 40% a las 72 horas. Esto sugiere que la retina de la rata estará expuesta al fármaco en cantidades fácilmente detectables durante al menos una semana.

Las concentraciones retinales del Compuesto I variaron de 146 a 3670 ng/g para las muestras de 24 horas del Grupo I, y de 409 a 804 ng/g en las muestras de 72 horas del Grupo I. El Compuesto I promedio que permaneció en e1Hv para el Grupo I fue de 0,157 y 0,0994 pg/muestra en los puntos de tiempo de 24 y 72 horas, respectivamente. El Compuesto I medio restante en el HV para las muestras del Grupo 2 a las 72 horas fue de 0,127 pg/muestra. Los datos indican que quedan cantidades sustanciales de fármaco intacto 72 horas después de la administración.

Ejemplo 10: Eficacia in vivo del Compuesto I.

Brevemente, los roedores fueron anestesiados con una mezcla 50:50 de ketamina (100 mg/mL) y xilazina (20 mg/mL), y las pupilas se dilataron con fenilefrina tópica (2,5 %) y tropicamida (1 %). Se usó una hoja microvitreorretiniana de calibre 20 (Walcott Scientific, Marmora, NJ) para crear una esclerotomía 2 mm posterior al limbo, evitando cuidadosamente dañar el cristalino.

Bajo visualización directa a través de un microscopio quirúrgico, se introdujo un inyector subretiniano (Glaser, punta de calibre 32; BD Ophthalmic Systems, Sarasota, FL) a través de la esclerotomía en la cavidad vítrea y a continuación a través de una retinotomía periférica en el espacio subretiniano. Se inyectó lentamente hialuronato de sodio (10 mg/mL) para separar la retina neurosensorial del epitelio pigmentario de la retina subyacente.

En todos los experimentos, se desprendió aproximadamente de un tercio a la mitad de la retina neurosensorial superonasal. En todos los animales, se crearon desprendimientos en el mismo lugar para permitir la comparación directa de los recuentos de células de la retina. Se crearon desprendimientos en el ojo izquierdo, dejando el ojo derecho como control.

En algunos ojos, Met-12 de tipo salvaje (HHIYLGAVNYIY, 5 |jg en DMSO) como su sal de trihidrocloruro se administró como control positivo, y en otros ojos, se inyectó el Compuesto I (0,5, 1,0, 5,0 o 10 jg en DMSO) como su sal de trihidrocloruro, o el vehículo (sulfóxido de dimetilo [DMSO]) en el espacio subretiniano en el área del desprendimiento en un volumen de 5 jL mediante una jeringa Hamilton (Hamilton Company, Reno, NV) inmediatamente después de la creación del desprendimiento.

Después de tres días, las ratas fueron sacrificadas, las retinas fueron extirpadas, fijadas, seccionadas y teñidas para ensayos TUNEL. Se contaron las áreas de retina desprendida para determinar el número de células apoptóticas. Cada experimento involucró 4 campos de cada una de las 4 secciones obtenidas de 5 o 6 retinas para cada grupo de dosificación. Los resultados se muestran en la FIG. 8.

Como se muestra en la FIG. 8, las retinas adheridas de control no mostraron células apoptóticas, mientras que las retinas de control DMSO tienen aproximadamente un 4 % de las células teñidas para TUNEL, y el control positivo Met-12 (5 jg ) con poco más del 1 % positivo para TUNEL. El tratamiento con sal de trihidrocloruro del Compuesto I condujo a un 0,58 % a 0,5 jg , un 1,14 % a 1 jg , un 0,82 % a 5 jg y a un 0,9 % a 10 jg . En base a una considerable experiencia con el modelo, los resultados para el Compuesto I se consideran aproximadamente equivalentes entre sí y con el control positivo Met-125 jg . Así, inesperadamente, la sal de trihidrocloruro del Compuesto I es mucho más eficaz que la sal de trihidrocloruro de Met-12 en este modelo in vivo.

Ejemplo 11: Estudio de eficacia

Usando el mismo modelo de desprendimiento de retina de roedor que en el Ejemplo 10, la dosis altamente eficaz de 5 jg del Compuesto I en DMSO se comparó con la misma dosis y una dosis de 1 jg del Compuesto I en dos formulaciones diferentes.

La primera formulación fue una solución de 1,0 o 0,2 mg/mL del trihidrocloruro del Compuesto I en propilenglicol al 3 % y de PS-20 al 3 % a pH 4,0, y la segunda formulación fue las mismas concentraciones del Compuesto I en una solución de propilenglicol al 2 % y Poloxámero 407 al 2 %, también a pH 4. Los resultados se muestran en la FIG. 9.

Las retinas de control adheridas no mostraron células apoptóticas, mientras que los desprendimientos no tratados mostraron aproximadamente un 6,5 % de células apoptóticas medidas en este momento.

El compuesto I en DMSO redujo eso a un 2,5 %, y los 5 jg PG/PS-20 fueron de una potencia similar reduciendo las células apoptóticas a un 2,9 %. Sin embargo, la formulación PG/PXfue considerablemente mejor a esa concentración al reducir las células apoptóticas al 0,3 % a 5 jg . A 1 jg , la formulación PG/PX redujo las células apoptóticas al 0,4 %, pero la dosis de 1 jg de PG/PS-20 produjo una reducción aún mayor al 0,01 %. Los datos demuestran que no solo pueden funcionar las formaciones micelares, sino que la sal de trihidrocloruro del Compuesto I puede ser incluso más potente en ellas que cuando se formula en DMSO.

Ejemplo 12: Estudio de eficacia

Usando el mismo modelo de desprendimiento de retina de roedor que en el Ejemplo 10, se usó sal de trihidrocloruro del Compuesto I en DMSO (1 jg ) como control positivo. El control negativo era un vehículo de prueba en evaluación (Poloxámero al 0,4 %, manitol al 4,5 %, ácido acético 10 mM a pH 4,5). La sal de triacetato del compuesto I en DMSO (1 jg ) se comparó con la sal de trihidrocloruro a la misma dosis.

Las retinas adheridas (Barra 4) no tenían células apoptóticas, mientras que las retinas desprendidas tratadas con vehículo (Barra 1) mostraron un 4,2 % de células apoptóticas, lo que sugiere que no hay actividad, ya que está dentro del intervalo histórico para desprendimientos de retina no tratados (Ver ejemplo 10) . La sal de trihidrocloruro del Compuesto I (DMSO) dio un 2,4 % de células apoptóticas, mientras que la sal de triacetato (DMSO) solo dio un 1,2 %, lo que demuestra que el cambio de sales de clorhidrato a acetato no tiene efectos negativos, y muy posiblemente efectos positivos sobre la eficacia.

Varias modificaciones y variaciones de los procedimientos y las composiciones descritas de la invención serán evidentes para los expertos en la materia. Aunque la invención se ha descrito en relación con realizaciones preferidas específicas, debe entenderse que la invención como se reivindica no debe limitarse indebidamente a tales

Claims (39)

1. REIVINDICACIONES

   1 Un compuesto de Fórmula 1,

   
2. 2. Una sal de poliacetato o sal de triacetato del compuesto de la reivindicación 1.
3. 3. Una composición que comprende el compuesto o la sal de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, y un vehículo farmacéutico configurado para la administración ocular.
4. 4. La composición de la reivindicación 3, donde la composición se formula para administración intraocular, intravítrea o periocular.
5. 5. La composición de la reivindicación 3 o la reivindicación 4, donde el compuesto dentro de la composición protege a las células fotorreceptoras de la retina desprendidas, previene la apoptosis o la necroptosis en las células del epitelio pigmentado de la retina del ojo, o previene la apoptosis o la necroptosis en las células de los ganglios de la retina del ojo.
6. 6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 3-5, que comprende además al menos un tensioactivo no iónico.
7. 7. La composición de la reivindicación 6, donde el al menos un tensioactivo no iónico se selecciona del grupo que consiste en Polisorbato 80, Polisorbato 20, Poloxámero 407 y Tiloxapol.
8. 8. La composición de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, donde el al menos un tensioactivo no iónico forma aproximadamente del 0,01 % al 20 % p/p de la composición, donde el al menos un tensioactivo no iónico forma aproximadamente del 0,05 % al 10 % p/p de la composición, o donde el al menos un tensioactivo no iónico forma aproximadamente del 0,25 % al 3 % p/p de la composición.
9. 9. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde se utilizan dos o más tensioactivos no iónicos en una proporción que optimiza parámetros tales como la farmacocinética vítrea o retiniana para adaptarse a la indicación que se está tratando, ya sea aguda o crónica, de manera que la cantidad total de tensioactivo no iónico añadido es del 0,01 al 20 % p/p de la composición
10. 10. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 3-9, que comprende además al menos uno de propilenglicol y dimetilsulfóxido.
11. 11. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 3-9, que comprende además un codisolvente orgánico; opcionalmente donde el codisolvente orgánico forma aproximadamente del 1 % al 50 % p/p de la composición; aproximadamente del 1 % al 20 % p/p de la composición, o aproximadamente del 1 % al 5 % p/p de la composición.
12. 12. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 3-11, donde la composición tiene un pH en el intervalo de 2,5-6,0.
13. 13. El compuesto o la sal de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para uso en la prevención de la apoptosis mediada por Fas o TRAIL en los fotorreceptores del ojo, para uso en la prevención de la apoptosis o necroptosis en las células del epitelio pigmentado de la retina del ojo, o para uso en la prevención de la apoptosis o la necroptosis en las células ganglionares de la retina.
14. 14. El compuesto o la sal de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para uso en el tratamiento de desprendimiento de retina, muerte de células del epitelio pigmentario de la retina o muerte de células ganglionares de la retina, o para prevenir enfermedades o afecciones de las células ganglionares de la retina.
15. 15. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 3-12 para uso en un procedimiento para tratar una afección ocular, enfermedad o afección o enfermedad que afecta la salud ocular en un sujeto que padece la afección, enfermedad o afección ocular que afecta la salud ocular.
16. 16. La composición de uso según la reivindicación 15, donde la afección ocular, la enfermedad o la afección que afecta a la salud ocular se selecciona de la lista que consiste en desprendimiento de retina, degeneración macular, degeneración macular asociada a la edad, degeneración macular asociada a la edad no exudativa, degeneración macular asociada a la edad exudativa, neovascularización coroidea, retinopatía, retinopatía diabética, neurorretinopatía macular aguda y crónica, coriorretinopatía serosa central, edema macular, edema macular cistoide, edema macular diabético, uveítis/retinitis/coroiditis, epiteliopatía pigmentaria placoidea multifocal, enfermedad de Behcet, retinocoroidopatía en perdigones, infecciosa (sífilis, enfermedad de Lyme, tuberculosis, toxoplasmosis), uveítis, uveítis intermedia (pars planitis), uveítis anterior, coroiditis multifocal, síndrome de múltiples puntos blancos evanescentes (MEWDS), sarcoidosis ocular, escleritis posterior, coroiditis serpiginosa, fibrosis subretiniana, síndrome de uveítis, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada; enfermedad oclusiva arterial de la retina, oclusión de la vena central de la retina, coagulopatía intravascular diseminada, oclusión de la vena ramificada de la retina, cambios hipertensivos del fondo de ojo, síndrome isquémico ocular, microaneurismas arteriales de la retina, Enfermedad de Coats, telangiectasias parafoveales, oclusión de la vena hemirretiniana, papiloflebitis, oclusión de la arteria central de la retina, oclusión de la rama de la arteria retiniana, enfermedad de la arteria carótida (EAC), angeítis en rama escarchada, retinopatía falciforme y otras hemoglobinopatías, estrías angioides, vitreorretinopatía exudativa familiar, enfermedad de Eales, oftalmia simpática, retinopatía uveítica, desprendimiento de retina, traumatismos, láser, TFD, fotocoagulación, hipoperfusión durante la cirugía, retinopatía por radiación, retinopatía por trasplante de médula ósea, retinopatía vítrea proliferativa y membranas epirretinianas, retinopatía diabética proliferativa, histoplasmosis ocular, toxocariasis ocular, síndrome de histoplasmosis ocular (SHO), endoftalmitis, toxoplasmosis, enfermedades de la retina asociadas a la infección por el VIH, enfermedad coroidea asociada a la infección por el VIH, enfermedad uveítica asociada a la infección por el VIH, retinitis vírica, necrosis retiniana aguda, necrosis retiniana externa progresiva, enfermedades fúngicas de la retina, sífilis ocular, tuberculosis ocular, neurorretinitis difusa unilateral subaguda, miasis, retinosis pigmentaria, trastornos sistémicos con distrofias retinianas asociadas, ceguera nocturna estacionaria congénita, distrofias de los conos, enfermedad de Stargardt, fundus flavimaculatus, enfermedad de Best, distrofia en patrón del epitelio pigmentario de la retina, retinosquisis ligada al cromosoma X, distrofia de Sorsby del fondo del ojo, maculopatía concéntrica benigna, distrofia cristalina de Bietti, pseudoxantoma elástico, desprendimiento de retina, agujero macular, desgarro retiniano gigante, enfermedad de la retina asociada a tumores, hipertrofia congénita del EPR, melanoma uveal posterior, hemangioma coroideo, osteoma coroideo, metástasis coroideas, hamartoma combinado de retina y epitelio pigmentario retiniano, retinoblastoma, tumores vasoproliferativos del fondo de ojo, astrocitoma de la retina, tumores linfoides intraoculares, coroidopatía punctata interna, pigmentopatía placoide posterior multifocal aguda, degeneración retiniana miópica, homeostasis anormal del epitelio pigmentario de la retina, epitelitis pigmentaria aguda de la retina, glaucoma, distrofias o displasias de la córnea, y similares.
17. 17. La composición para el uso según la reivindicación 15, donde el procedimiento comprende la administración de la composición en una cantidad suficiente para atenuar la muerte de células fotorreceptoras en el sujeto, donde la muerte de células fotorreceptoras es apoptosis de fotorreceptores mediada por Fas o TRAIL; o en una cantidad suficiente para mejorar la supervivencia de los fotorreceptores dentro de dicho sujeto.
18. 18. La composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, por administración intraocular, intravítrea o periocular al sujeto.
19. 19. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 3-12 para uso en un procedimiento para tratar el desprendimiento de la retina.
20. 20. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 3-12 para uso en un procedimiento para tratar el glaucoma.
21. 21. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 3-12 para uso en un procedimiento para tratar la degeneración macular.
22. 22. La composición para uso según la reivindicación 21, donde la degeneración macular es una degeneración macular relacionada con la edad, una degeneración macular relacionada con la edad no exudativa o una degeneración macular relacionada con la edad exudativa.
23. 23. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 3-12 para uso en un procedimiento para tratar la retinitis pigmentosa.
24. 24. La composición de cualquiera de la reivindicaciones 3-12 para uso en un procedimiento para tratar una enfermedad vascular, donde la enfermedad vascular es la enfermedad oclusiva arterial de la retina o la oclusión de la vena central de la retina.
25. 25. La composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 19-24, por administración intraocular, intravítrea o periocular u un sujeto.
26. 26. El compuesto de la reivindicación 1 para uso en un procedimiento para tratar el desprendimiento de la retina.
27. 27. El compuesto de la reivindicación 1 para uso en un procedimiento para tratar el glaucoma.
28. 28. El compuesto de la reivindicación 1 para uso en un procedimiento para tratar la degeneración macular.
29. 29. El compuesto para uso según la reivindicación 28, donde la degeneración macular es una degeneración macular relacionada con la edad, una degeneración macular relacionada con la edad no exudativa o una degeneración macular relacionada con la edad exudativa.
30. 30. El compuesto de la reivindicación 1 para uso en un procedimiento para tratar la retinitis pigmentosa.
31. 31. El compuesto de la reivindicación 1 para uso en un procedimiento para tratar una enfermedad vascular, donde la enfermedad vascular es la enfermedad oclusiva arterial de la retina o la oclusión de la vena central de la retina.
32. 32. El compuesto para uso según cualquiera de las reivindicaciones 26-31, por administración intraocular, intravítrea o periocular u un sujeto.
33. 33. La sal de la reivindicación 2 para uso en un procedimiento para tratar el desprendimiento de la retina.
34. 34. La sal de la reivindicación 2 para uso en un procedimiento para tratar el glaucoma.
35. 35. La sal de la reivindicación 2 para uso en un procedimiento para tratar la degeneración macular.
36. 36. La sal para uso según la reivindicación 35, donde la degeneración macular es una degeneración macular relacionada con la edad, una degeneración macular relacionada con la edad no exudativa o una degeneración macular relacionada con la edad exudativa.
37. 37. La sal de la reivindicación 2 para uso en un procedimiento para tratar la retinitis pigmentosa.
38. 38. La sal de la reivindicación 2 para uso en un procedimiento para tratar una enfermedad vascular, donde la enfermedad vascular es la enfermedad oclusiva arterial de la retina o la oclusión de la vena central de la retina.
39. 39. La sal para uso según cualquiera de las reivindicaciones 33-38, por administración intraocular, intravítrea o periocular u un sujeto.