ES2902730A1 - Metodo para el diagnostico y/o pronostico de esofagitis eosinofilica en saliva - Google Patents
Metodo para el diagnostico y/o pronostico de esofagitis eosinofilica en saliva Download PDFInfo
- Publication number
- ES2902730A1 ES2902730A1 ES202030978A ES202030978A ES2902730A1 ES 2902730 A1 ES2902730 A1 ES 2902730A1 ES 202030978 A ES202030978 A ES 202030978A ES 202030978 A ES202030978 A ES 202030978A ES 2902730 A1 ES2902730 A1 ES 2902730A1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- eoe
- expression levels
- subject
- biomarker
- abhd4
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 201000000708 eosinophilic esophagitis Diseases 0.000 title claims abstract description 89
- 206010064212 Eosinophilic oesophagitis Diseases 0.000 title claims abstract description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 63
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 title claims abstract description 39
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000013519 translation Methods 0.000 title description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 93
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims abstract description 90
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 72
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 64
- 101000929842 Homo sapiens (Lyso)-N-acylphosphatidylethanolamine lipase Proteins 0.000 claims description 59
- 102100032826 Homeodomain-interacting protein kinase 3 Human genes 0.000 claims description 58
- 101001066389 Homo sapiens Homeodomain-interacting protein kinase 3 Proteins 0.000 claims description 58
- 102100035906 (Lyso)-N-acylphosphatidylethanolamine lipase Human genes 0.000 claims description 57
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 39
- 102100023152 Scinderin Human genes 0.000 claims description 37
- 101001068552 Homo sapiens Proline-rich protein 15-like protein Proteins 0.000 claims description 36
- 101710190410 Staphylococcal complement inhibitor Proteins 0.000 claims description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 36
- 102100033950 Proline-rich protein 15-like protein Human genes 0.000 claims description 35
- 102100032881 DNA-binding protein SATB1 Human genes 0.000 claims description 34
- 101000655234 Homo sapiens DNA-binding protein SATB1 Proteins 0.000 claims description 34
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 19
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 17
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 13
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 5
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 36
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 36
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 34
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 34
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 15
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 13
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 12
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 101150091716 ABHD4 gene Proteins 0.000 description 3
- 101150021280 HIPK3 gene Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 2
- -1 CAST Proteins 0.000 description 2
- 101150033217 CAST gene Proteins 0.000 description 2
- 102000006440 Chemokine CCL26 Human genes 0.000 description 2
- 108010083698 Chemokine CCL26 Proteins 0.000 description 2
- 206010008479 Chest Pain Diseases 0.000 description 2
- 208000019505 Deglutition disease Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100148760 Homo sapiens SATB1 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- 101150061379 PRR15L gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 2
- 206010067171 Regurgitation Diseases 0.000 description 2
- 101150110863 SCIN gene Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 201000006549 dyspepsia Diseases 0.000 description 2
- 238000001839 endoscopy Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 208000024798 heartburn Diseases 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006784 Burning sensation Diseases 0.000 description 1
- 102100037084 C4b-binding protein alpha chain Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035037 Calpastatin Human genes 0.000 description 1
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010014950 Eosinophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000000289 Esophageal Achalasia Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010022998 Irritability Diseases 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710149086 Nuclease S1 Proteins 0.000 description 1
- 206010030136 Oesophageal achalasia Diseases 0.000 description 1
- 206010065567 Oesophageal food impaction Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710136733 Proline-rich protein Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010047897 Weight gain poor Diseases 0.000 description 1
- 201000000621 achalasia Diseases 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010044208 calpastatin Proteins 0.000 description 1
- ZXJCOYBPXOBJMU-HSQGJUDPSA-N calpastatin peptide Ac 184-210 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(C)=O)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 ZXJCOYBPXOBJMU-HSQGJUDPSA-N 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 230000012085 chronic inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000011461 current therapy Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000001434 dietary modification Nutrition 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010339 dilation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000013568 food allergen Substances 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 208000021302 gastroesophageal reflux disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000670 ligand binding assay Methods 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010073419 scinderin Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 108091029842 small nuclear ribonucleic acid Proteins 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Método para el diagnóstico y/o pronóstico de esofagitis eosinofílica en saliva. La presente invención se encuentra dentro del campo del diagnóstico y/o pronóstico de esofagitis eosinofílica (EoE) en saliva, en concreto en el diagnóstico y/o pronóstico por detección y cuantificación del nivel de expresión de genes biomarcadores de EoE presentes en la saliva de sujetos.
Description
DESCRIPCIÓN
Método para el diagnóstico y/o pronóstico de esofagitis eosinofílica en saliva
La presente invención se encuentra dentro del campo del diagnóstico y/o pronóstico de esofagitis eosinofílica (EoE) en saliva, en concreto en el diagnóstico y/o pronóstico por detección y cuantificación del nivel de expresión de genes biomarcadores de EoE presentes en la saliva de sujetos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La esofagitis eosinofílica (EoE) es una enfermedad inflamatoria caracterizada por un elevado número de eosinófilos en el esófago. Provoca síntomas como dificultad para para tragar, impactación alimentaria esofágica, vómitos, pirosis o regurgitación. Además, en los niños la EoE provoca rechazo al alimento, dolor torácico o abdominal, irritabilidad y un bajo aumento de peso. Tales síntomas variables se podrían confundir con los de otras patologías digestivas, como la enfermedad por reflujo gastroesofágica o la enfermedad celiaca. Aunque se desconoce la causa exacta de la enfermedad, se sabe que es una patología multifactorial a la que contribuyen factores genéticos y ambientales, siendo los factores ambientales más aceptados los alérgenos alimentarios.
La EoE está aumentando en incidencia y prevalencia a un ritmo alto, lo que puede deberse en parte a un mayor reconocimiento y conciencia de los síntomas, pero además a cambios ambientales y etiológicos (Dellon, E. S. y Hirano, I, Gastroenterology 2018; 154(2): 319-332). Debido a este aumento la EoE se ha convertido en una causa importante de morbilidad gastrointestinal superior en niños y adultos.
Uno de los problemas relacionados con la EoE está en el retraso en el diagnóstico y consecuente retraso en el tratamiento. El diagnóstico tardío de la enfermedad y la persistencia de una respuesta inflamatoria crónica en el esófago origina fenómenos de remodelación fibrosa del esófago, con depósito de colágeno en la pared del esófago y formación de estenosis, cuya frecuencia se relaciona directamente con el tiempo de evolución de los síntomas y el retraso diagnóstico. Así, un diagnóstico temprano de la enfermedad puede afectar positivamente a su curso clínico. Una mejor comprensión de la naturaleza progresiva de la enfermedad, su carga de síntomas a lo largo del tiempo y el impacto de las terapias actuales en la resolución de los síntomas son cruciales para
dirigir la práctica clínica actual.
Los criterios actuales de diagnóstico de EoE requieren la realización de una endoscopia esofágica además de una biopsia esofágica para confirmar la presencia de infiltraciones de eosinófilos en el esófago ante un paciente con síntomas compatibles, haciendo que el proceso diagnóstico se extienda en el tiempo y sea altamente invasivo (Dellon et al., Gastroenterology. 2018; 155(4): 1022-1033).
Se han realizado varios trabajos para encontrar biomarcadores de EoE y métodos de diagnóstico y/o pronóstico de EoE que sean menos invasivos y más sencillos y rápidos de realizar. El documento US2017006711 divulga varios posibles biomarcadores para EoE, así como un método de diagnóstico donde se analiza la concentración de eotaxina-3 en la sangre de un paciente donde un nivel elevado de eotaxina-3 en comparación con valores de referencia es indicativo de EoE. El documento US20160304960 divulga un método para diferenciar entre EoE y esofagitis crónica a través del análisis de los niveles de expresión de genes en una biopsia esofágica del paciente. El documento WO2015142739 divulga un método de diagnóstico y/o pronóstico que consiste en determinar el genotipo del paciente para variantes genéticas que están asociadas con el desarrollo de EoE.
Los métodos de diagnóstico y/o pronostico mencionados, son métodos invasivos, necesitan equipamiento y personal altamente especializado, y/o necesitan de análisis de datos complicados y engorrosos. Así, de acuerdo con lo anteriormente expuesto, es necesario desarrollar un método de diagnóstico alternativo que permita la detección de EoE de modo rápido, simple y no invasivo.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han detectado varios biomarcadores de EoE cuyo nivel de expresión cambia significativamente en pacientes que sufren de EoE y que además dicho cambio del nivel de expresión es detectable, de manera rápida y eficaz, en una muestra de saliva del paciente. Esto ha permitido a los inventores desarrollar un método simple y rápido de diagnóstico y/o pronóstico de EoE, y que además permite determinar la respuesta al tratamiento de EoE, a partir de una muestra de saliva, evitando así procedimientos invasivos para obtener muestras biológicas, como biopsias, con las
cuales realizar el diagnóstico y/o pronóstico.
Así, la presente invención hace referencia a biomarcadores de EoE, especialmente los genes HIPK3 y/o ABHD4 en muestras de saliva, así como a métodos de diagnóstico y/o pronóstico y/o de determinación de respuesta al tratamiento de EoE haciendo uso de dichos biomarcadores.
Un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de los niveles de expresión del biomarcador HIPK3 y/o ABHD4 para el diagnóstico y/o el pronóstico in vitro de EoE en una muestra de saliva aislada de un sujeto, de ahora en adelante el uso diagnóstico de la invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los niveles de expresión del biomarcador HIPK3 y/o ABHD4 para determinar in vitro la respuesta al tratamiento de la EoE en una muestra de saliva aislada de un sujeto, de ahora en adelante el uso de respuesta de la invención.
El término “HIPK3” (número de acceso: ENSG00000110422.12) hace referencia al gen humano de la proteína cinasa 3 que interactúa con homeodominios - Homeodomaininteracting protein kinase 3 y que comprende la SEQ ID NO: 1. El gen HIPK3 codifica para la proteína HIPK3 la cual tiene 6 isoformas y variantes, isoforma 2 (V3) (Número de acceso a la base de datos NCBI protein: NP_001041665.1), isoforma 2 (V2) (Número de acceso: NP_001265091.1), isoforma 2 (V4) (Número de acceso: NP_001265092.1), isoforma 1 (V1) (Número de acceso: NP_005725.3), isoforma X1 (Número de acceso: XP_005252786.1 ), isoforma X1 (Número de acceso: XP_016872565.1). En una realización particular del uso de la invención el nivel de expresión es de un gen con al menos un 85% identidad con el gen HIPK3 que comprende la SEQ ID NO: 1, preferiblemente un 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% identidad.
El término "identidad" en la presente invención hace referencia a la proporción de aminoácidos o nucleótidos idénticos entre dos péptidos/proteínas o secuencias de nucleótidos comparados, respectivamente, a lo largo de su secuencia completa. Los métodos para comparar secuencias son conocidos en el estado del arte, e incluyen, sin limitación, a los programas BLASTP o BLASTN, ClustalW y FASTA. Se puede
considerar que los péptidos, las proteínas o las secuencias de nucleótidos con identidades porcentuales de al menos el 85% mantendrán las mismas propiedades que la secuencia a la que se refieren.
El término “ABHD4” (número de acceso: ENSG00000100439.10) hace referencia al gen humano que codifica la dominio de la abhidrolasa que contiene 4, N-actil fosfolipasa B -abhydrolase domain containing 4, N-acylphospholipase B- y que comprende la SEQ ID NO: 2. El gen ABHD4 codifica para la proteína ABHD4 (Número de acceso: NP_071343.2) la cual tiene una isoforma (número de acceso: XP_005268043.1). En una realización particular del uso de la invención el nivel de expresión es de un gen con al menos un 85% identidad con el gen ABHD4 que comprende la SEQ ID NO: 2, preferiblemente un 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% identidad.
Además de los genes HIPK3 y ABHD4, los inventores también detectaron otros biomarcadores en muestras de saliva aisladas, los cuales en conyugación con HIPK3 y/o ABHD4, permiten el diagnóstico y/o pronóstico de EoE. Así, en una realización particular, el uso de diagnóstico de la invención o el uso de respuesta de la invención comprende además el uso de los niveles de expresión de al menos uno de los biomarcadores seleccionados de la lista que consiste en: CAST (número de acceso: ENSG00000153113.23), PRR15L (número de acceso: ENSG00000167183.3), SATB1 (número de acceso: ENSG00000182568.17), SCIN (número de acceso: ENSG00000006747.15) y cualquiera de sus combinaciones, es decir, el uso de diagnóstico de la invención o el uso de respuesta de la invención comprende los niveles de expresión de HIPK3 y CAST, HIPK3 y PRR15L, HIPK3 y SATB1.HIPK3 y SCIN, HIPK3 y CAST y SATB1, HIPK3 y CAST y SCIN, HIPK3 y CAST y PRR15L, HIPK3 y SATB1 y SCIN, HIPK3 y SATB1 y PRR15L, HIPK3 y SCIN y PRR15L, HIPK3 y CAST y SATB1 y SCIN, HIPK3 y CAST y SATB1 y PRR15L, HIPK3 y CAST y SCIN y PRR15L, HIPK3 y SATB1 y SCIN y PRR15L, ABHD4 y CAST, ABHD4 y PRR15L, ABHD4 y SATB1, ABHD4 y SCIN, ABHD4 y CAST y SATB1, ABHD4 y CAST y SCIN, ABHD4 y CAST y PRR15L, ABHD4 y SATB1 y SCIN, ABHD4 y SATB1 y PRR15L, ABHD4 y SCIN y PRR15L, ABHD4 y CAST y SATB1 y SCIN, ABHD4 y CAST y SATB1 y PRR15L, ABHD4 y CAST y SCIN y PRR15L, ABHD4 y SATB1 y SCIN y PRR15L, ABHD4 y CAST ySATBI ySCINy PRR15L, HIPK3yABHD4, HIPK3 y ABHD4 y CAST, HIPK3yABHD4 ySATBI, HIPK3yABHD4ySCIN, HIPK3 y ABHD4 y PRR15L, HIPK3 y ABHD4 y CAST
y SATB1, HIPK3yABHD4y CASTy SCIN, HIPK3 y ABHD4 y CAST y PRR15L, HIPK3 y ABHD4 y SATB1 y SCIN, HIPK3 y ABHD4 y SATB1 y PRR15L, HIPK3 y ABHD4 y SCIN Y PRR15L, HIPK3 y ABHD4 y CAST y SATB1 y SCIN, HIPK3 y ABHD4 y CAST y SATB1 y PRR15L, HIPK3 y ABHD4 y CAST y SCIN y PRR15L, HIPK3 y ABHD4 y SATB1 y SCIN y PRR15L o HIPK3 y ABHD4 y CAST y SATB1 y SCIN y PRR15L.
El término “CAST” hace referencia al gen humano que codifica la Calpastatina, un inhibidor de la proteasa cisteínica dependiente de calcio y que comprende la SEQ ID NO: 3. El gen CAST codifica para la proteína CAST la cual tiene 21 isoformas, isoforma f (Número de acceso: NM_001042440.5), isoforma g (Número de acceso: NM_001042441.3), isoforma h (Número de acceso: NM_001042442.3), isoforma i (Número de acceso: NM_001042443.2), isoforma j (Número de acceso: NM_001042444.2), isoforma k (Número de acceso: NM_001042445.2), isoforma I (Número de acceso: NM_001042446.2), isoforma m (Número de acceso: NM_001190442.1), isoforma n (Número de acceso: NM_001284212.3), isoforma o (Número de acceso: NM_001284213.3), isoforma p (Número de acceso: NM_001330626.2), isoforma q (Número de acceso: NM_001330627.2), isoforma r (Número de acceso: NM_001330628.2), isoforma s (Número de acceso: NM_001330629.2), isoforma t (Número de acceso: NM_001330630.1), isoforma u (Número de acceso: NM_001330632.1), isoforma v (Número de acceso: NM_001330633.1), isoforma w (Número de acceso: NM_001330634.1), isoforma x (Número de acceso: NM_001375317.1), isoforma a (Número de acceso: NM_001750.7) e isoforma b (Número de acceso: NM_173060.4). En una realización particular del uso de la invención el nivel de expresión es de un gen con al menos un 85% identidad con el gen CAST que comprende la SEQ ID NO: 3, preferiblemente un 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% identidad.
El término “SATB1” hace referencia al gen humano que comprende la SEQ ID NO: 4. El gen SATB1 codifica para la proteína SATB1 la cual tiene 8 isoformas y variantes, isoforma 1 (V2) (Número de acceso: NP_001124482.1), isoforma 2 (V3) (Número de acceso: NP_001182399.1 ), isoforma 2 (Número de acceso: NP_001309800.1 ), isoforma 1 (Número de acceso: NP_001309801.1), isoforma 1 (Número de acceso: NP_001309802.1), isoforma 1 (Número de acceso: NP_001309803.1), isoforma 1 (Número de acceso: NP_001309804.1) e isoforma 3 (Número de acceso: NP_001309805.1 ). En una realización particular del uso de la invención el nivel de
expresión es de un gen con al menos un 85% identidad con el gen SATB1 que comprende la SEQ ID NO: 4, preferiblemente un 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% identidad.
El término “SCIN” hace referencia al gen humano que codifica la scinderina, una proteína que corta y tapa la actina de modo dependiente de Ca(2+) y que comprende la SEQ ID NO: 5. El gen SCIN codifica para la proteína SCIN la cual tiene 2 isoformas y variantes, isoforma 1(Número de acceso: NP_001106177.1) e isoforma 2 (Número de acceso: NP_149119.1). En una realización particular del uso de la invención el nivel de expresión es de un gen con al menos un 85% identidad con el gen SCIN que comprende la SEQ ID NO: 5, preferiblemente un 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% identidad.
El término “PRR15L” hace referencia al gen humano que codifica una proteína rica en prolina y que comprende la SEQ ID NO: 6. El gen PRR15L codifica para la proteína PRR15L la cual tiene 5 isoformas, isoforma 1 (Número de acceso: NP_077296.1 ), isoforma X1 (Número de acceso: XP_005257723.1), isoforma X1 (Número de acceso: XP_005257720.1), isoforma X1 (Número de acceso: XP_005257721.1), isoforma X1 (Número de acceso: XP_005257722.1). En una realización particular del uso de la invención el nivel de expresión es de un gen con al menos un 85% identidad con el gen PRR15L que comprende la SEQ ID NO: 6, preferiblemente un 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% identidad.
El experto en la materia entiende que las mutaciones en la secuencia de nucleótidos de los genes que dan lugar a sustituciones conservativas de aminoácidos en posiciones no críticas para la funcionalidad de la proteína son mutaciones evolutivamente neutras que no afectan a su estructura global ni a su funcionalidad, dando lugar a variantes de la proteína. Dichas variantes caen dentro del ámbito de la presente invención, es decir, aquellas variantes de la proteínas codificadas por los genes HIPK3, ABHD4, CAST, SATB1, SCIN y PRR15L que presentan inserciones, deleciones o modificaciones de uno o más aminoácidos con respecto a la secuencias SEQ ID NO: 1 -6 , respetivamente.
El término "biomarcador", tal como se utiliza en la presente invención hace referencia a un gen cuya transcripción y/o traducción produce una sustancia cuya presencia puede determinarse y cuantificarse objetivamente en una muestra de saliva y que se utiliza
como indicador de la presencia/ausencia de la enfermedad y/o del pronóstico de la misma. Además, los biomarcadores descritos en la presente invención también se utilizan como indicadores de la respuesta al tratamiento de EoE. Los biomarcadores de la enfermedad pueden ser detectados y/o cualificados, lo que significa que se puede detectar su presencia/ausencia y/o detectar cambios en su cantidad o concentración.
La expresión “niveles de expresión del biomarcador” en la presente invención hace referencia al proceso por medio del cual la información codificada por los ácidos nucleicos en los genes es transcripta y/o traducida en productos funcionales. Tal transcripción y/o traducción puede originar proteínas o ácidos ribonucleótidos (ARN) funcionales como ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), pequeños ARN nucleares o ADN complementar (ADNc). Así, los niveles de expresión se refieren a la cantidad de dichas proteínas, ARNs, ADNc o fragmentos de proteínas, ARNs y ADNc que están presentes en una muestra o se obtienen de una muestra y que se pueden cuantificar por unidades de masa por volumen (i.e., miligramos/mililitro) o unidades molares por volumen (i.e., milimoles/mililitro). Métodos para cuantificar los niveles de expresión de los biomarcadores son descritos más abajo en esta descripción en relación a los métodos de la invención, siendo igualmente válidos en relación al uso de la invención.
Así, en una realización preferida del uso diagnóstico de la invención o del uso de respuesta de la invención, la determinación de los niveles de expresión de los biomarcadores comprende medir el nivel de ADNc, o un fragmento del mismo, el nivel de ARNm, o un fragmento del mismo, y/o el nivel de la proteína(s), o un fragmento de dicha(s) proteína(s) de lo(s) biomarcador(es).
En la presente invención se entiende por “fragmento de ARNm” o “fragmento de ADNc” a la secuencia de nucleótidos de los genes asociados a los biomarcadores que comprenden uno o más nucleótidos ausentes de los extremos 3’ y/o 5’ con respecto a la secuencia de nucleótidos completa del genes asociados a los biomarcadorores. En una realización preferida del uso de diagnóstico de la invención o del uso de respuesta de la invención, el fragmento del biomarcador es un fragmento de la secuencia que se selecciona de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6, y cualquiera de sus combinanciones.
De forma análoga, en la presente invención se entiende por “fragmento de la proteína del biomarcador” a la secuencia de aminoácidos de la(s) proteína(s) de lo(s) biomarcador(es) que comprende uno o más aminoácidos ausentes de su extremo amino terminal o carboxilo terminal con respecto a la secuencia de aminoácidos completa de la proteína la(s) codificada(s) pelo(s) gen(es) biomarcador(es). En una realización preferida, el fragmento de la proteína del biomarcador es un fragmento de la secuencia proteica codificada por la secuencia que se selecciona de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6, y cualquiera de sus combinanciones.
En la presente invención se entiende por “diagnóstico” el procedimiento por el cual se identifica una determinada enfermedad, entidad nosológica, síndrome, o cualquier condición de salud-enfermedad, mediante el análisis de una serie de parámetros clínicos o síntomas característicos de dicha enfermedad, y que la distinguen de otras enfermedades con cuadros clínicos semejantes. En la presente invención la enfermedad a identificar es EoE, y el parámetro clínico es el nivel de expressión de los biomarcadores descritos en la presente invención.
El término “pronóstico” en la presente invención se refiere al procedimiento por el cual se determina la probabilidad o posibilidad de que un sujeto desarrolle una determinada enfermedad, entidad nosológica, síndrome, o cualquier condición de salud-enfermedad, mediante el análisis de una serie de parámetros clínicos o síntomas característicos de dicha enfermedad, y que la distinguen de otras enfermedades con cuadros clínicos semejantes. En la presente invención la enfermedad a identificares EoE, y el parámetro clínico es el nivel de expressión de los biomarcadores descritos en la presente invención. Además, el término “pronóstico” en la presente invención también se refiere a la determinación de la probabilidad o posibilidad de que dicha enfermedad, en la presente invención EoE, prosiga al estado siguiente de su desarrollo, en una progresión sin intervención clínica. Como entenderán los expertos en la materia, tal valoración de pronóstico, aunque se prefiere que sea, normalmente puede no ser correcta para el 100% de los sujetos que se va a diagnosticar. El término, sin embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos se pueda identificar como que padecen la enfermedad o que tienen predisposición a la misma. La cantidad que es estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse,
mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor significación P, test de Student o funciones discriminantes de Fisher, medidas no paramétricas de Mann Whitney, correlación de Spearman, regresión logística, regresión lineal, área bajo la curva de ROC (AUC). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 70%, más preferiblemente en al menos el 80%, mucho más preferiblemente en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.
El término “respuesta al tratamiento” tal como se usa en la presente invención hace referencia al procedimiento por cual se determina si un sujeto al cual se ha diagnosticado una enfermedad tendrá una “respuesta a tratamiento favorable”, es decir, mediante el análisis de una serie de parámetros clínicos o síntomas característicos de dicha enfermedad se puede determinar la evolución favorable de dicha enfermedad en respuesta al tratamiento, donde en la presente invención una evolución favorable implica una reducción en el número de eosinófilos en la pared del esófago. En la presente invención dicha enfermedad es EoE y los parámetros clínicos son los biomarcadores de la presente invención. Dichos parámetros clínicos permiten determinar si hay una posibilidad de 60 % o más de que habrá una respuesta a tratamiento favorable, es decir, si el número de eosinófilos en la pared del esófago se ha reducido a 15 o menos eosinófilos por campo de gran aumento preferiblemente transcurridos 3 meses desde el diagnóstico inicial o de la no respuesta al tratamiento. La respuesta también se podrá medir por los hallazgos endoscópicos de EoE, medidos con la puntuación de referencia endoscópica de EoE validada (EREFS). Este puntaje cuantifica cinco hallazgos endoscópicos clave: exudados (puntaje 0-2), anillos esofágicos (puntaje 0-3), edema (puntaje 0-1), surcos (puntaje 0-2) y estenosis (puntaje 0-1). El puntaje EREFS varía de 0 a 9, con puntajes más altos que indican hallazgos endoscópicos más severos. También se podrá medir por la repercusión clínica de la disfagia con el índice de actividad de síntomas EoE (EEsAI) que también incorpora evitación y modificación de la dieta (los puntajes varían de 0 a 100, con puntajes más altos indican síntomas más graves; un puntaje <20 indica remisión de los síntomas). Como entenderán los expertos en la materia, tal determinación, aunque se prefiere que sea, normalmente puede no ser correcta para el 100% de los sujetos que se va a diagnosticar. La expressión, sin
embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos se pueda identificar como que tendrán una reducción del número de eosinófilos a menos de 15 células por campo de gran aumento. La cantidad que es estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor significación P, test de Student o funciones discriminantes de Fisher, medidas no paramétricas de Mann Whitney, correlación de Spearman, regresión logística, regresión lineal, área bajo la curva de ROC (AUC). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la respuesta a tratamiento favorable de forma diferencial en al menos el 70%, más preferiblemente en al menos el 80%, mucho más preferiblemente en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.
La expressión “el número de eosinófilos en la pared del esófago se ha reducido a 15 células o menos por campo de gran aumento” tal como se utiliza en la presente invención hace referencia a la técnica de histopatologia donde se identifican eosinófilos en el tejido aislado del sujeto recurriendo a microscopía óptica, en donde el aumento de magnificación es de al menos 40 veces.
El término "tratamiento", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de la enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto (preferentemente un mamífero y, más preferentemente, un humano), incluyendo:
i) Inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo; ii) Aliviar la enfermedad o el estado patológico, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o el estado patológico o su sintomatología;
ni) Estabilizar la enfermedad o el estado patológico.
Como se ha referido la enfermedad que se diagnostica, pronostica o determina la respuesta al tratamiento en la presente invención es la “esofagitis eosinofílica” o “EoE”. La EoE es una enfermedad inflamatoria caracterizada por un elevado número de eosinófilos en el esófago. Provoca síntomas variados todos ellos referidos a una
disfunción del esófago, como dificultad en tragar (disfagia), impactaciones alimentarias, náuseas, vómitos, pirosis o sensación de quemazón que se extiende desde el epigastrio hacia el tórax y región cervical, reducción de la ingesta, dolor torácico o abdominal, regurgitación, o pérdida de peso. Sin intervención clínica la inflamación crónica que caracteriza la EoE puede desarrollar una fibrostenosis progresiva y puede incluir la estenosis de la luz del esófago. A nivel tisular, la EoE se caracteriza por una infiltración densa de glóbulos blancos del tipo eosinófilo en el revestimiento epitelial del esófago. La EoE generalmente viene determinada por una reacción alérgica a los alimentos ingeridos. Los eosinófilos son células inflamatorias que liberan una variedad de señales químicas que inflaman el tejido esofágico circundante.
En la presente invención se entiende por “muestra” a una parte o cantidad pequeña de una cosa que se considera representativa del total y que se toma o se separa de ella para someterla a estudio, análisis o experimentación. En la presente invención, dicho estudio, análisis o experimentación hace referencia a la determinación del nivel de expresión de los biomarcadores descritos en la presente invención en una muestra de saliva.
Para hacer uso del nivel de expresión de los biomarcadores mencionados anteriormente es también un objeto de la presente invención métodos que permitan la detección y/o cuantificación de los biomarcadores identificados como dianas para el diagnóstico y/o pronóstico de EoE, o para determinar la respuesta al tratamiento de la EoE.
Así, otro aspecto de la presente invención es un método de diagnóstico o pronóstico in vitro de EoE en un sujeto, de ahora adelante el método diagnóstico de la invención, donde el método comprende:
a) identificar y cuantificar los niveles de expresión del biomarcador HIPK3 y/o ABHD4 en una muestra de saliva aislada del sujeto; y
b) comparar los niveles de expresión obtenidos en la etapa (a) con valores de referencia,
donde una reducción en los niveles de expresión del biomarcador HIPK3 y/o ABHD4 en la muestra del sujeto respecto a los valores de referencia para dicho biomarcador, es indicativo de padecer o estar predispuesto a padecer EoE.
En una realización preferida del método de diagnóstico de la invención en la etapa (a)
se identifican y cuantifican además los niveles de expresión de al menos uno de los biomarcadores que se seleccionan de la lista que consiste en: CAST, PRR15L, SATB1, SCIN y cualquiera de sus combinaciones, y donde una reducción en los niveles de expresión de al menos uno de los biomarcadores en la muestra del sujeto respecto a los valores de referencia para cada uno de ellos, es indicativo de padecer o estar predispuesto a padecer EoE.
Otro aspecto de la presente invención se relaciona con un método para determinar in vitro la respuesta al tratamiento de la EoE en un sujeto, de ahora en adelante el método de respuesta de la invención, donde el método comprende:
a) identificar y cuantificar los niveles de expresión del biomarcador HIPK3 y/o ABHD4 en una muestra de saliva aislada del sujeto; y
b) comparar los niveles de expresión obtenidos en la etapa (a) con valores obtenidos para el sujeto antes de iniciar el tratamiento,
donde un aumento en los niveles de expresión del biomarcador HIPK3 y/o ABHD4 en la muestra del sujeto respecto a los valores obtenidos antes de iniciar el tratamiento es indicativo de una respuesta a tratamiento favorable.
En una realización preferida del método de respuesta de la invención en la etapa (a) se identifican y cuantifican además los niveles de expresión de al menos uno de los biomarcadores que se seleccionan de la lista que consiste en: CAST, PRR15L, SATB1, SCIN y cualquiera de sus combinaciones, donde un aumento en los niveles de expresión de al menos uno de los biomarcadores en la muestra del sujeto respecto a los valores obtenidos antes de iniciar el tratamiento, es indicativo de una respuesta a tratamiento favorable.
Los términos “diagnóstico”, “pronóstico”, “respuesta al tratamiento”, “respuesta a tratamiento favorable”, “esofagitis eosinofílica (EoE)”, “niveles de expresión del biomarcador”, “HIPK3”, “ABHD4”, “CAST”, “PRR15L”, “SATB1”, “SCIN” y “muestra” se han definido anteriormente con relación al uso de la invención y dichas definiciones, así como las combinaciones de biomarcadores descritas previamente, son válidas para el presente aspecto de la invención y sus realizaciones preferidas.
El término “sujeto”, tal como se utiliza en la presente descripción, hace referencia a cualquier animal, preferiblemente un mamífero e incluye, pero no se limita a, animales
domésticos y de granja, primates, y humanos. En una realización preferida, el sujeto es un mamífero, preferibelmente un humano de cualquier sexo, edad o raza.
El término “identificar” en el método de la invención se refiere al reportar o detectar la expresión del o de los biomarcadores descritos en la presente invención en la muestra de saliva. El término “cuantificar” en el método de la invención se refiere a la determinación de cantidad, número, o concentración en unidad de volumen, del nivel de expresión del o de los biomarcadores descritos en la presente invención en la muestra de saliva.
Así, en el método de diagnóstico la invención o en el método de respuesta de la invención la expresión “identificar y cuantificar los niveles de expresión” de la etapa a) se refiere al procedimiento de reportar y/o determinar la cantidad del nivel de expresión del o de los biomarcadores descritos en la presente invención, por la detección y/o determinación de la cantidad del ARNm, o un fragmento del ARNm, ADNc o un fragmento del ADNc, o de la proteína o un fragmento de la proteína, codificados por el o los biomarcadores descritos en la presente invención. Así, en una realización particular del método de diagnóstico la invención o del método de respuesta de la invención la etapa (a) se lleva a cabo mediante cuantificación de los niveles de proteína, de ARN mensajero o del ADN complementario.
Los términos “fragmento de ARNm”, “fragmento de ADNc” y “fragmento de proteína” se han definido anteriormente en relación al uso de diagnóstico de la invención y al uso de respuesta de la invención y dichas definiciones son válidas para el presente aspecto.
Si la cuantificación de la expresión de los biomarcadores va a realizarse a partir del ADNc o el ARNm, primero es necesaria la extracción del ácido nucleico de la muestra de saliva aislada del sujeto. Para este fin, la muestra de saliva se puede tratar para disgregar de forma física o mecánica la estructura del tejido o la célula, liberando los componentes intracelulares en una solución acuosa u orgánica para aislar y preparar los ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos se extraen mediante procedimientos conocidos para el experto en la materia y disponibles comercialmente (Sambroock, J., et al. 2012, "Molecular cloning: a Laboratory Manual', 4th ed., Coid Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3.).
Una vez extraído los ácidos nucleicos se procede a realizar la cuantificación de la expresión de los biomarcadores. Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para detectar y cuantificar los niveles de ARNm de los biomarcadores o de sus ADNc correspondiente. A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de ARNm de dichos biomarcadores pueden ser cuantificados mediante el empleo de métodos convencionales, por ejemplo, métodos que comprenden la amplificación del ARNm y la cuantificación del producto de la amplificación de dicho ARNm, tales como electroforesis y tinción, o alternativamente, mediante Southern blot y empleo de sondas apropiadas, northern blot y empleo de sondas específicas del ARNm del biomaracador de interés o de su ADNc correspondiente, mapeo con la nucleasa S1, RT-PCR, hibridación, microarrays, etc. En una realización preferida del método de diagnóstico de la invención o del método de respuesta de la invención la cuantificación de los niveles de ARN mensajero se lleva a cabo por reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR).
Análogamente, los niveles del ADNc correspondiente al ARNm del biomarcador o biomarcadores también pueden ser cuantificados mediante el empleo de técnicas convencionales; en este caso, el método de la invención incluye una etapa de síntesis del correspondiente ADNc mediante transcripción inversa (RT) del ARNm correspondiente seguida de amplificación y cuantificación del producto de la amplificación de dicho ADNc. Métodos convencionales de cuantificar los niveles de expresión pueden encontrarse, por ejemplo, en Sambrook et al. citado ad supra. En una realización preferida, la cuantificación de los niveles de expresión se realiza mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa, un array de ADN o ARN, o RNA-Seq o Secuenciación Masiva aplicada al estudio de ARN.
Si la cuantificación de la expresión del biomarcador o de los biomarcadores va a realizarse a partir de la proteína codificada por el gen asociado al biomarcador, entonces la muestra de saliva aislada del sujeto tiene que ser tratada para extraer las proteínas. Métodos para extraer o aislar proteínas son conocidos para el experto en la materia y están disponibles comercialmente (Sambroock, J., et al. 2012, citado ad supra).
Los niveles de proteína pueden ser cuantificados mediante cualquier método convencional que permita detectar y cuantificar dicha proteína en una muestra de un
sujeto. A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de dicha proteína pueden cuantificarse, por ejemplo, mediante el empleo de anticuerpos con capacidad de unirse a la proteína diana y la posterior cuantificación de los complejos formados.
Se entiende por “anticuerpo” a una glicoproteína del tipo gamma globulina que forma parte del sistema inmunitario humoral que se une de forma específica a un antígeno. El término anticuerpo, tal como aquí se utiliza, incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos recombinantes de anticuerpos, combibodies, fragmentos Fab y scFv de anticuerpos, así como los dominios de unión a ligando.
Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no. Los términos "marca" o "marcado" se refieren a una composición capaz de producir una señal detectable indicativa de la presencia de la molécula marcada. Ejemplos ilustrativos de marcadores adecuados incluyen, sin limitar a, radioisótopos, cromóforos de nucleótidos, enzimas, sustratos, moléculas fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas, restos bioluminescentes, y similares. Como tal, una marca es cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Existe una amplia variedad de ensayos conocidos que se pueden utilizar en la presente invención, que utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos marcados (anticuerpo secundario); entre estas técnicas se incluyen el Western-blot o transferencia Western, ELISA (enzimoinmunoensayo RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (enzimoinmunoensayo competitivo), DAS-ELISA (ELISA tipo sándwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar proteínas, incluyen técnicas de cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligando, espectrometría de masas etc. Cuando se usa un método inmunológico, se puede usar cualquier anticuerpo o reactivo que se sabe se une a la proteína diana con alta afinidad para detectar la cantidad de la misma. Ejemplos de anticuerpos o reactivos con capacidad de unirse a dicha la proteína diana incluyen, sin limitarse a, sueros policlonales, sobrenadantes de hibridomas o anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, Fv, Fab, Fab' y F(ab')2, scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y anticuerpos humanizados.
El término “valores de referencia” en la etapa b) del método de diagnóstico de la invención hace referencia a los valores del nivel de expresión del biomarcador HIPK3 y/o ABHD4, o de los biomarcadores CAST, PRR15L, SATB1 y SCIN, considerados normales en sujetos que no padecen de EoE. Estos valores pueden ser obtenidos a través de la cuantificación de los niveles de expresión de dichos biomarcadores a partir de muestras de saliva aisladas de sujetos que no padecen de EoE y representantes de la populación en la cual se encuentre el sujeto susceptible de tener o padecer enfermedad.
La expresión “comparar los niveles de expresión obtenidos en la etapa (a) con valores de referencia” en el método de diagnóstico de la invención hace referencia al proceso o procedimiento de relacionar, examinar o verificar los valores obtenidos para el nivel de expresión de los biomarcadores, y equiparar o verificar los valores obtenidos en la etapa a) con los valores que se esperan obtener para sujetos que no padecen la enfermedad, donde, según el método de diagnóstico de la invención, “una reducción en los niveles de expresión de HIPK3 y/o ABHD4 en la muestra del sujeto respecto a los valores de referencia para dicho biomarcador, es indicativo de padecer o estar predispuesto a padecer EoE”.
El término “reducción” hace referencia a un decrecimiento, disminución o rebaja de los valores del nivel de expresión obtenidos para un sujeto que padece o es susceptible de padecer de EoE cuando estos valores son equiparados con los valores de referencia, es decir, con valores de un sujeto que no padece de EoE. En particular, se entiende “reducción” del nivel de expresión, cuando los niveles de expresión del biomarcador son de, al menos, 0,1 veces, 0,5 veces, 1 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más con respecto a los niveles de expresión del biomarcador en un sujeto que no padece de EoE.
La expresión “comparar los niveles de expresión obtenidos en la etapa (a) con valores obtenidos antes de iniciar el tratamiento” en el método de respuesta de la invención hace referencia al proceso o procedimiento de relacionar, examinar o verificar los valores obtenidos para el nivel de expresión de los biomarcadores, y equiparar o verificar los valores obtenidos en la etapa a) con los valores obtenidos para dichos biomarcadores, preferiblemente por el método de diagnóstico de la invención, antes de
iniciar el tratamiento, donde, según el método de respuesta la invención, “un aumento en los niveles de expresión del biomarcador HIPK3 y/o ABHD4 en la muestra del sujeto respecto a los valores obtenidos antes de iniciar el tratamiento, es indicativo de una respuesta a tratamiento favorable”.
El término “aumento” hace referencia a un incremento, crecimiento o subida de los valores del nivel de expresión obtenidos para un sujeto que padece de EoE después de iniciar tratamiento cuando estos valores son equiparados con los valores obtenidos para los mismos biomarcadores antes de que el sujeto inicie el tratamiento. En particular, se entiende “aumento” del nivel de expresión, cuando los niveles de expresión del biomarcador son de, al menos, 1,1 veces, 1,5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más con respecto a los niveles de expresión del biomarcador del sujeto antes de iniciar tratamiento.
La puesta en práctica de los usos y los métodos de la invención comprende el empleo de sondas, cebadores y/o anticuerpos, los cuáles puede formar parte de un kit.
Así, otro aspecto de la invención es un kit o dispositivo, de ahora en adelante el kit de la invención, para el diagnóstico y/o pronóstico in vitro de EoE, o para la determinación de la respuesta al tratamiento in vitro de EoE que comprende sondas, cebadores y/o anticuerpos específicos para la identificación y cuantificación de los niveles de expresión del biomarcador HIPK3 y/o ABHD4 en muestras aisladas de saliva.
En una realización preferida el kit de la invención además comprende sondas, cebadores y/o anticuerpos para la detección de los niveles de expresión de al menos un biomarcador que se seleccionan de la lista que consiste en: CAST, PRR15L, SATB1, SCIN y cualquiera de sus combinaciones. En otra realización particular del kit de la invención las sondas se seleccionan de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, y cualquiera de sus combinaciones. En aún otra realización particular del kit de la invención los cebadores se seleccionan de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, y cualquiera de sus combinaciones.
En la presente invención se entiende por “sonda” a la molécula de ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos híbrida de forma específica con la secuencia de nucleótidos del biomarcador diana. La expresión “híbrida de forma específica”, tal como se usa aquí, se refiere a las condiciones que permiten la hibridación de dos polinucleótidos en condicionales altamente o moderadamente rigurosas. Condiciones de alta rigurosidad implican, en general: (1) fuerza iónica baja y alta temperatura para el lavado, por ejemplo de cloruro de sodio 0,015M/citrato de sodio 0,0015M/0,1% dodecil sulfato de sodio a 50oC, (2) empleo durante la hibridación de un agente de desnaturalización, tales como formamida, por ejemplo, el 50% (v/v) formamida con 0,1% de albúmina de suero bovino/0,1% Ficoll/0,1% polivinilpirrolidone/tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio a 750 mM, 75 mM de citrato de sodio a 42°C, o (3) empleo de 50% de formamida, 5xSSC (0,75 M NaCI, 0,075 M citrato de sodio), fosfato sódico 50mM (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sodio, 5 veces solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 mg/mL), 0,1 % SDS, y el 10% de sulfato de dextrano a 42°C, con lavados a 42°C en 0,2xSSC (cloruro sódico/citrato de sodio) y el 50% de formamida, seguido de un lavado de alto rigor que consiste en 0,1xSSC que contiene EDTA a 550C. “Condiciones moderadamente rigurosas” incluyen el uso de solución de lavado y las condiciones de hibridación menos estrictas que las descritas anteriormente. Como llevar a cabo la hibridación de dos secuencias de nucleótidos puede encontrarse en Sambroock, J., et al. 2012, citado ad supra.
En una realización preferida del kit de la invención las sondas son sondas doblemente marcadas. El término "sonda doblemente marcadas" se refiere a una secuencia de oligonucleótidos de una sola hebra que tiene un marcador, un quencher (marcador que absorbe la señal de otro marcador) y una secuencia de sonda dispuestas entre los dos marcadores, y en la que marcador y el quencher están lo suficientemente próximos como para que el quencher impida que el marcador emita una señal detectable. La secuencia de la sonda generalmente incluye una secuencia que es sensible a la Taq polimerasa. Típicamente, la sonda comprende 20-30 nucleótidos, preferentemente 20 24 nucleótidos. Moléculas marcadoras y moléculas quencher están disponibles comercialmente. Ejemplos, no limitantes, so la molécula marcadora 6-carboxyfluoresceina (FAM) y los quencher lowa Black (lABkFQ) y ZEN de la empresa Integrated DNA Technologies.
En otra realización preferida del kit de la invención las sondas son sondas triplemente marcadas. El término “sondas triplemente marcadas” hace referencia a una sonda doblemente marcada que además contiene un segundo quencher interno localizado entre los nucleótidos 9 y 10de la secuencia de la sonda. Un ejemplo no limitante de un quencher interno es el ZEN de la empresa Integrated DNA Technologies.
Además de sondas, cebadores y/o anticuerpos, el kit puede comprender otros componentes útiles en la puesta en práctica de la presente invención, tales como, buffers, vehículos de entrega, soportes del material, componentes de controles positivos y/o negativos, etc. Opcionalmente, tales controles comprenden las sondas, cebadores y/o anticuerpos con modificaciones para su uso como controles, por ejemplo, sondas, cebadores y/o anticuerpos que no reconocen el biomarcador HIPK3 y/o el resto de los biomarcadores descritos en la presente invención. Además de los componentes mencionados, los kits podrán incluir también instrucciones para practicar el objeto de la invención. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits mencionados en una variedad de formas, uno o más de los cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, p. ej., una hoja o hojas de papel en las que se imprime la información, en el embalaje del kit, en un inserto de paquete, etc. Otro medio sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, un CD, un USB, etc., en el que se haya registrado la información. Otro medio que puede estar presente es una dirección de sitio web que puede utilizarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio remoto. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits.
Otro aspecto de la invención hace referencia al uso del del kit de la invención para el diagnóstico y/o pronóstico in vitro de EoE en una muestra aislada de saliva de un sujeto, preferiblemente un ser humano.
Aún otro aspecto de la invención hace referencia al uso del kit de la invención para determinar la respuesta al tratamiento de EoE en una muestra aislada de saliva de un sujeto, preferiblemente un ser humano.
Los términos y expresiones utilizados en el kit de la invención y en los usos del kit de la invención, sus realizaciones preferidas fueron definidos anteriormente en relación a los aspectos de uso y al método de la invención, siendo tales definiciones validas y
aplicables en referencia al kit de la invención.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Expresión relativa de los genes diferencialmente expresados en saliva. CTRL: controles, EoE: pacientes con esofagitis eosinofílica. Los datos representan la media y el error standard en 10 muestras de cada grupo. Diferencias calculadas mediante test t-Student. *p<0,05; **p<0,01.
Fig. 2. Curvas ROC de los genes diferencialmente expresados. AUC: área bajo la curva.
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto los aspectos de la presente inveción.
Ejemplo 1: Análisis de los genes que presentan expresión reducida en pacientes
Material v métodos
Reclutamiento
El proceso de reclutamiento se llevó a cabo a través del Servicio de Gastroenterología del Hospital Universitario Donostia y del Hospital General de Tomellos, donde se hizo un cribado de los potenciales pacientes para su participación en el estudio.
Se reclutaron voluntarios mayores de edad que cumplían con las características necesarias para llevar a cabo el estudio.
Los criterios de inclusión/exclusión para el reclutamiento de los participantes fueron los siguientes:
• Criterios de inclusión:
o Pacientes diagnosticados de Esofagitis Eosinofilica (EoE), que hayan
presentado impactación esofágica y que en la biopsia histológica tengan al menos 15 eosinófilos por campo.
• Criterios de exclusión:
o Acalasia o esclerodermia;
o Evidencia de causas distintas de EoE para la eosinofilia esofágica
o Antecedentes de cirugía esofágica en cualquier momento o de procedimientos de dilatación esofágica en las últimas 8 semanas antes de la detección
o Cualquier enfermedad sistémica relevante como cardiopatía isquémica, insuficiencia renal, enfermedad crónica pulmonar, hepatopatía crónica, neosplasia, etc
o Pacientes que reciban glucocorticosteroides sistémicos, inmunosupresores, medicamentos biológicos, glucocorticosteroides tópicos, por otro tipo de enfermedad.
Aquellas personas interesadas en participar en el estudio y que cumplían con los criterios de inclusión, fueron informados de forma oral y escrita de los datos relevantes del estudio y decidieron si participar o no una vez tenían conocimiento claro del estudio. El permiso para realizar el estudio se tramitó por el Comité Ético de Investigación del Área Sanitaria de Gipuzkoa (Código de Protocolo: BUJ-BIO-2020-01), y por el Comité de Etica de Investigación Clínica del Hosptital General La Mancha Centro (Código de protocolo 137-C).
Recogida datos
En todos los pacientes incluidos se obtuvieron, además de los datos clínicos habituales de información demográfica, datos del informe endoscópico y de anatomía patológica. Se recopilaron datos de seguimiento clínico, endoscópico e histológico de cara a detección de recibidas; y se contabilizó el número máximo de eosinófilos en cualquiera de los puntos del esófago.
Los hallazgos de la endoscopia del esófago se clasificaron de acuerdo con el sistema de clasificación de puntuación de referencia endoscópica (EREFS) modificado, sumando las puntuaciones de los 5 campos principales (edema, exudados, surcos, estenosis y anillos). Se hizo una puntuación total y una evaluación global de la actividad endoscópica de EoE y se clasificaron como ninguna, leve, moderada o grave.
Recogida de muestras
Se recogieron muestras de saliva de casos con EoE y controles sanos. Los casos utilizados son pacientes diagnosticados por medio de histología de esofagitis eosinofílica sin tratamiento o sin respuesta al tratamiento. Los controles no presentaban ninguna enfermedad inflamatoria. Las muestras de saliva cada participante se recogieron mediante el kit DNA/RNA Shield™ Collection Tube w/ Swab (Zymo) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Selección de genes candidato
Para seleccionar los genes a estudiar se analizaron resultados de RNAseq depositados en la base de datos “GEO” con el código GSE113341. Partiendo de esos datos, se compararon los niveles de expresión de biopsias de esófago entre EoE y controles sanos y se realizó un test U de Mann-Whitney. De todos los genes analizados 69 mostraron expresión diferencial significativa después de utilizar corrección False Discovery Rate, genes que fueron utilizados para posteriores análisis de expresión (Tabla 1).
Tabla 1: Genes expresados diferencialmente y números de accesión.
Extracción de RNA
La extracción de RNA se realizó utilizando el kit DirectZol Miniprep RNA purificaron kit (Zymo) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se sustrajeron 500ul de muestra de saliva y se mezclaron 1,5 mi de Trizol. Se añadió el mismo volumen de etanol y se procedió a la limpieza del RNA mediante la columna provista en el kit. El RNA se resuspendió en 30ul de agua libre de RNAsas y la concentración se midió mediante espectrometría UV utilizando un Nanodrop ND-1000.
RT-QPCR
La RT-QPCR se realizó utilizando el kit Quantitec Probe RT-PCR (Qiagen) y sondas especificas para cada gen (IDT, Tabla 2). Se utilizaron los genes GAPDH, RPLPO y 18S como controles endógenos. Las reacciones se corrieron en duplicado en volúmenes de 5 microlitros en placas de 384 pocilios utilizando 5ng de RNA por reacción en un termocicladorBioRadCFX.
Análisis de los resultados
Los resultados se analizaron mediante el método deltaCt para calcular exrpresión relativa. La expresión de los genes candidatos que fueron detectables en saliva se calculo utilizando la media de los tres genes endógenos. Los análisis estadísticos se realizaron mediante una t-Student y los valores menores de 0,05 se consideraron significativos.
Resultados
29 de los genes analizados fueron detectados en las muestras de saliva. Solo se consideraron para el análisis aquellos genes que se expresaron en al menos un 60% de las muestras analizadas. 6 de los 29 genes detectados presentan una expresión relativa significativamente reducida en los pacientes con EoE (Fig. 1).
En una cohorte de validación en la que se incluyen 37 pacientes confirmados de EoE del Hospital Universitario Donostia y del Hospital General de Tomelloso y 27 controles sanos, se confirmó la disminución en la expresión de los genes HIPK3 y ABHD4 (Fig. 1). Además, se observa como la expresión de los biomarcadores HIPK3 y ABHD4 en saliva, cada uno de ellos por separado, presentan una sensibilidad superior al 75% (79%) una especificidad superior al 60% (65%) con un área bajo la curva ROC superior al 0.85 (Fig. 2).
Tabla 2: Sondas y cebadores para los genes indicados
Claims (15)
1. Uso de los niveles de expresión del biomarcador HIPK3 y/o ABHD4 para el diagnóstico y/o el pronóstico in vitro de esofagitis eosinofílica (EoE) en una muestra de saliva aislada de un sujeto.
2. Uso de los niveles de expresión del biomarcador HIPK3 y/o ABHD4 para determinar in vitro la respuesta al tratamiento de EoE en una muestra de saliva aislada de un sujeto.
3. Uso según la reivindicación 1 o 2 que comprende además los niveles de expresión de al menos uno de los biomarcadores seleccionados de la lista que consiste en: CAST, PRR15L, SATB1, SCIN y cualquiera de sus combinaciones.
4. Método de diagnóstico y/o pronóstico in vitro de EoE en un sujeto, donde el método comprende:
a) identificar y cuantificar los niveles de expresión del biomarcador HIPK3 y/o ABHD4 en una muestra de saliva aislada del sujeto; y
b) comparar los niveles de expresión obtenidos en la etapa (a) con valores de referencia,
donde una reducción en los niveles de expresión del biomarcador HIPK3 y/o ABHD4 en la muestra del sujeto respecto a los valores de referencia para dicho biomarcador, es indicativo de padecer o estar predispuesto a padecer EoE.
5. El método según la reivindicación 4, donde en la etapa (a) se identifican y cuantifican además los niveles de expresión de al menos un biomarcador que se seleccionan de la lista que consiste en: CAST, PRR15L, SATB1, SCIN y cualquiera de sus combinaciones, y donde una reducción en los niveles de expresión de al menos uno de los biomarcadores en la muestra del sujeto respecto a los valores de referencia para cada uno de ellos, es indicativo de padecer o estar predispuesto a padecer EoE.
6. Método para determinar in vitro la respuesta al tratamiento de EoE en un sujeto,
donde el método comprende:
a) identificar y cuantificar los niveles de expresión del biomarcador HIPK3 y/o ABHD4 en una muestra de saliva aislada del sujeto; y
b) comparar los niveles de expresión obtenidos en la etapa (a) con valores obtenidos antes de iniciar el tratamiento para EoE, donde un aumento en los niveles de expresión del biomarcador HIPK3 y/o ABHD4 en la muestra del sujeto respecto a los valores obtenidos antes de iniciar el tratamiento para EoE, es indicativo de una respuesta a tratamiento favorable.
7. El método según la reivindicación 6, donde en la etapa (a) se identifican y cuantifican además los niveles de expresión de al menos un biomarcador que se seleccionan de la lista que consiste en: CAST, PRR15L, SATB1, SCIN y cualquiera de sus combinaciones, y donde un aumento en los niveles de expresión de al menos uno de los biomarcadores en la muestra del sujeto respecto a los valores obtenidos antes de iniciar el tratamiento para EoE es indicativo de una respuesta a tratamiento favorable.
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 donde la etapa (a) se lleva a cabo mediante cuantificación de los niveles de proteína, de ARN mensajero o del ADN complementario.
9. El método según la reivindicación 8, donde la cuantificación de los niveles de proteína se lleva a cabo por Western blotting o ensayo inmunoenzimático.
10. El método según la reivindicación 8, donde la cuantificación de los niveles de ARN mensajero se lleva a cabo por reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa.
11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, donde el sujeto es un mamífero, preferiblemente un humano.
12. Uso in vitro de un kit o dispositivo para el diagnóstico y/o pronóstico de EoE que comprende sondas, cebadores y/o anticuerpos específicos para la identificación y cuantificación de los niveles de expresión del biomarcador HIPK3 y/o ABHD4 en una muestra aislada de saliva de un sujeto.
13. Uso in vitro de un kit o dispositivo para determinar la respuesta al tratamiento de EoE que comprende sondas, cebadores y/o anticuerpos específicos para la identificación y cuantificación de los niveles de expresión del biomarcador HIPK3 y/o ABHD4 en una muestra aislada de saliva de un sujeto.
14. Uso según la reivindicación 12 o 13 donde además el kit o dispositivo comprende sondas, cebadores y/o anticuerpos específicos para la identificación y cuantificación de los niveles de expresión de al menos un biomarcador que se seleccionan de la lista que consiste en: CAST, PRR15L, SATB1, SCIN y cualquiera de sus combinaciones.
15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde el sujeto es un mamífero, preferiblemente un humano.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES202030978A ES2902730A1 (es) | 2020-09-29 | 2020-09-29 | Metodo para el diagnostico y/o pronostico de esofagitis eosinofilica en saliva |
| PCT/ES2021/070705 WO2022069780A1 (es) | 2020-09-29 | 2021-09-29 | Método para el diagnóstico y/o pronóstico de esofagitis eosinofílica basado en biomarcadores salivales |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES202030978A ES2902730A1 (es) | 2020-09-29 | 2020-09-29 | Metodo para el diagnostico y/o pronostico de esofagitis eosinofilica en saliva |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2902730A1 true ES2902730A1 (es) | 2022-03-29 |
Family
ID=78536237
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES202030978A Withdrawn ES2902730A1 (es) | 2020-09-29 | 2020-09-29 | Metodo para el diagnostico y/o pronostico de esofagitis eosinofilica en saliva |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2902730A1 (es) |
| WO (1) | WO2022069780A1 (es) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4407045A1 (en) * | 2023-01-27 | 2024-07-31 | Universidad del Pais Vasco - Euskal Herriko Unibertsitatea (UPV/EHU) | Non-invasive method for the diagnosis of eosinophilic esophagitis |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012094643A2 (en) * | 2011-01-06 | 2012-07-12 | Children's Hospital Medical Center | Esophageal cytokine expression profiles in eosinophilic esophagitis |
| WO2013126834A1 (en) * | 2012-02-24 | 2013-08-29 | Children's Hospital Medical Center | Esophageal microrna expression profiles in eosinophilic esophagitis |
| WO2014059178A1 (en) * | 2012-10-10 | 2014-04-17 | Rhode Island Hospital | Differential expression of novel protein markers for the diagnosis and treatment of eosinophilic esophagitis |
| WO2016023026A1 (en) * | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Children's Hospital Medical Center | Diagnostic method for distinguishing forms of esophageal eosinophilia |
| WO2017165663A1 (en) * | 2016-03-23 | 2017-09-28 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Biomarkers for cancer associated with hedgehog pathway activity and related uses thereof |
| WO2020160516A1 (en) * | 2019-01-31 | 2020-08-06 | The Regents Of The University Of California | Materials and methods for identifying and treating eosinophilic disorders |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006083390A2 (en) * | 2004-12-07 | 2006-08-10 | Children's Hospital Medical Center | Eotaxin-3 in eosinophilic esophagitis |
| WO2006119343A1 (en) | 2005-05-03 | 2006-11-09 | Children's Hospital Medical Center | Determination of eosinophilic esophagitis |
| CA2840086A1 (en) * | 2011-06-21 | 2012-12-27 | Children's Hospital Medical Center | Diagnostic methods for eosinophilic esophagitis |
| DE102013227003A1 (de) | 2013-12-20 | 2015-06-25 | Robert Bosch Gmbh | Elektronisches Steuermodul und Verfahren zur Herstellung eines elektronischen Steuermoduls |
| WO2015142739A1 (en) | 2014-03-17 | 2015-09-24 | Children's Hospital Medical Center | Genetic test for determining susceptibility for eosinophilic esophagitis |
-
2020
- 2020-09-29 ES ES202030978A patent/ES2902730A1/es not_active Withdrawn
-
2021
- 2021-09-29 WO PCT/ES2021/070705 patent/WO2022069780A1/es not_active Ceased
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012094643A2 (en) * | 2011-01-06 | 2012-07-12 | Children's Hospital Medical Center | Esophageal cytokine expression profiles in eosinophilic esophagitis |
| WO2013126834A1 (en) * | 2012-02-24 | 2013-08-29 | Children's Hospital Medical Center | Esophageal microrna expression profiles in eosinophilic esophagitis |
| WO2014059178A1 (en) * | 2012-10-10 | 2014-04-17 | Rhode Island Hospital | Differential expression of novel protein markers for the diagnosis and treatment of eosinophilic esophagitis |
| WO2016023026A1 (en) * | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Children's Hospital Medical Center | Diagnostic method for distinguishing forms of esophageal eosinophilia |
| WO2017165663A1 (en) * | 2016-03-23 | 2017-09-28 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Biomarkers for cancer associated with hedgehog pathway activity and related uses thereof |
| WO2020160516A1 (en) * | 2019-01-31 | 2020-08-06 | The Regents Of The University Of California | Materials and methods for identifying and treating eosinophilic disorders |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BHARDWAJ NEETI ET AL. MiR-4668 as a Novel Potential Biomarker for Eosinophilic Esophagitis.. Allergy & rhinology (Providence, R.I.) United States. , 31/12/2019, Vol. 11, Páginas 2152656720953378 ISSN 2152-6575 (Print), (DOI: doi:10.1177/2152656720953378 pubmed:32923026) todo el documento. * |
| JHAVERI P LAMBERT K ISHMAEL F JHAVERI P ET AL. Salivary miRNA Profiles in Pediatric Eosinophilic Esophagitis. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 01/02/2020, Vol. 145, Páginas AB343 ISSN 0091-6749 (print) ISSN 1097-6825 (electronic), (DOI: doi:10.1016/j.jaci.2019.12.082) 2020 Annual Meeting of the American-Academy-of-Allergy-Asthma-and-Immunology (AAAAI) Annual Meeting. Philadelphia, PA, USA; March 13 -16, 2020. todo el documento. * |
| LIU YIFEI ET AL. The expression level and prognostic value of HIPK3 among non-small-cell lung cancer patients in China. OncoTargets and Therapy 2018. , 30/11/2017, Vol. 11, Páginas 7459-7469 ISSN 1178-6930(print) ISSN 1178-6930(electronic), (DOI: doi:10.2147/OTT.S166878) todo el documento. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022069780A1 (es) | 2022-04-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20240309440A1 (en) | Novel immunoprobe-based method to assess organ injury status through a biofluid-based cell-free dna (cfdna) assay | |
| CN103140760B (zh) | 结肠直肠癌的诊断 | |
| ES2391792T3 (es) | Método para la diferenciación de EII y SII y la distinción adicional entre tipos patológicos de EII | |
| US10788493B2 (en) | Composition for diagnosing infectious diseases or infectious complications by using tryptophanyl-tRNA synthetase and method for detecting diagnostic marker | |
| JP2015503920A (ja) | 乳癌の予測および診断のためのバイオマーカー | |
| BRPI0707642A2 (pt) | taxas de expressço de gene de urina para detecÇço de cÂncer | |
| JP6847972B2 (ja) | 大腸がん診断用組成物と診断マーカー検出方法 | |
| WO2017039359A1 (ko) | 트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 이용한 감염 질환 또는 감염 합병증의 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법 | |
| US20230220467A1 (en) | Normal-pressure hydrocephalus diagnosis composition and diagnosis marker detection method, using level of expression of chi3l1 in blood | |
| JP2018517775A (ja) | クローン病を治療する方法 | |
| ES2528672B1 (es) | Neurofilina-1 (NRP-1) urinaria como marcador pronóstico de nefritis y nefritis lúpica | |
| WO2022069780A1 (es) | Método para el diagnóstico y/o pronóstico de esofagitis eosinofílica basado en biomarcadores salivales | |
| US11519042B2 (en) | Method for the diagnosis or prognosis, in vitro, of lung cancer | |
| US8372594B2 (en) | Secreted phospholipase A2 biomarkers for arthritis | |
| TWI507412B (zh) | Gastric cancer biological markers and their use, as well as gastric cancer-related detection methods | |
| KR101192295B1 (ko) | 대장암 및 전이에 대한 바이오마커, 이를 이용한 대장암 진단 및 치료제 스크리닝 | |
| US20160376657A1 (en) | Method of diagnosing renal disorders | |
| EP4407045A1 (en) | Non-invasive method for the diagnosis of eosinophilic esophagitis | |
| KR100969692B1 (ko) | 대장암 과발현 유전자를 이용한 대장암 진단 마커 | |
| WO2022144485A9 (es) | Biomarcadores y método para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento con inhibidores de braf y de mek (brafi + meki) | |
| CN119220684A (zh) | 用于诊断和治疗胃癌的标志物 | |
| HK40010652A (en) | A novel immunoprobe-based method to assess organ injury status through a biofluid-based cell-free dna (cfdna) assay | |
| MX2008010297A (es) | Deteccion de cancer mediante niveles elevados de linfoma 2 de celulas b |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA2A | Patent application published |
Ref document number: 2902730 Country of ref document: ES Kind code of ref document: A1 Effective date: 20220329 |
|
| FA2A | Application withdrawn |
Effective date: 20220714 |