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ES2901128T3 - Proteína no fucosilada y métodos de la misma - Google Patents

Proteína no fucosilada y métodos de la misma Download PDF

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ES2901128T3 ES15759544T ES15759544T ES2901128T3 ES 2901128 T3 ES2901128 T3 ES 2901128T3 ES 15759544 T ES15759544 T ES 15759544T ES 15759544 T ES15759544 T ES 15759544T ES 2901128 T3 ES2901128 T3 ES 2901128T3
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Maloy Ghosh
Sunit Maity
Rajeshwari Pendse
Divya Unnikrishnan
Yogendra Manjunath B M
Jahnabi Hazarika
Sathyabalan M
Pavithra M
Bhargav Prasad
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Prabhat Kumar Pathak
Sanghamitra Bhattacharjee
Pravin Kumar D
Vivek Halan
Sankaranarayanan Srinivasan
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Abstract

Un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción (TALEN), en donde el dominio de unión al ADN comprende un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID No. 6 y SEQ ID No. 8; SEQ ID No. 11 y SEQ ID No. 14; SEQ ID No. 17 y SEQ ID No. 20; SEQ ID No. 23 y SEQ ID No. 26; SEQ ID No. 29 y SEQ ID No. 32; y SEQ ID No. 35 y SEQ ID No. 38.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteína no fucosilada y métodos de la misma
CAMPO TÉCNICO
La presente descripción pertenece al campo de la biotecnología, la ingeniería genética y la inmunología. En particular, la presente descripción se refiere al desarrollo de líneas celulares donde se modifican rutas biológicas específicas. Dichas modificaciones están en las enzimas de la célula, particularmente en enzimas implicadas en la glicosilación de proteínas. La presente descripción desarrolla sistemas de expresión de proteínas en donde se logra la modificación específica de la cadena de glicano de la proteína. La modificación específica de la cadena de glicano produce proteínas no fucosiladas, incluyendo anticuerpos. Estos productos se usan en el desarrollo de productos terapéuticos y biomarcadores, y en el diagnóstico y pronóstico de diversas enfermedades. La presente descripción emplea la tecnología de nucleasas efectoras de tipo activador de transcripción (TALEN).
ANTECEDENTES Y TÉCNICA ANTERIOR DE LA DESCRIPCIÓN
La glicosilación en eucariotas se ha estudiado intensamente durante décadas como el mecanismo de modificación de proteínas postraduccional covalente más común (Varki et al 2009). Se predice que aproximadamente 1-2% del transcriptoma humano (aproximadamente 250-500 glicogenes) se traduce en proteínas que son responsables de la glicosilación (Campbell y Yarema 2005). La glicosilación de proteínas celulares tiene muchas funciones biológicas clave, tales como el plegamiento de proteínas, la estabilidad, el tráfico intracelular e intercelular, la interacción célulacélula y matriz celular.
Hay cuatro grupos distintos de glicoproteínas: proteínas unidas a N, unidas a O, glicosaminoglicanos y ancladas a glicosilfosfatidilinositol. La glicosilación unida a N se produce a través del nitrógeno de la amida de la cadena lateral de los restos de asparagina, mientras que la glicosilación unida a O usa el átomo de oxígeno en la cadena lateral de los residuos de serina o treonina. La glicosilación unida a N tiene lugar en la secuencia de aminoácidos de Asn-X-Ser/Thr, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina y ácido aspártico (Helenius y Aebi 2004).
La fucosa (6-desoxi-L-galactosa) es un monosacárido que está presente en muchas glicoproteínas y glicolípidos presentes en vertebrados, invertebrados, plantas y bacterias. La fucosilación es el proceso de transferir un resto de fucosa a diversas proteínas y oligosacáridos. La fucosilación está regulada por varias moléculas, que incluyen fucosiltransferasas, enzimas sintéticas de difosfato de guanosina (GDP)-fucosa y transportador(es) de GDP-fucosa. Un gran número de glicoproteínas fucosiladas son proteínas secretoras o proteínas de membrana en la superficie celular. Un ejemplo potente de glicoproteína fucosilada es la alfa-fetoproteína (AFP) fucosilada, un importante biomarcador del cáncer (Simm, 1979).
Hay 14,1 millones de nuevos casos de cáncer, 8,2 millones de muertes por cáncer y 32,6 millones de personas que viven con cáncer (dentro de los 5 años posteriores al diagnóstico) en 2014 en todo el mundo. La alta tasa de mortalidad por cáncer sirve como recordatorio de la necesidad de terapias más efectivas. El cambio más destacado en el desarrollo de fármacos oncológicos en los últimos 20 años ha sido el paso de los citotóxicos clásicos a fármacos que afectan a las rutas de señalización implicadas en el cáncer, conocidos como "anticuerpos monoclonales'' o mAb. Hace una década, solo había dos mAb en el mercado y actualmente hay aproximadamente 30 mAb aprobados por la FDA de diversas modalidades terapéuticas, tales como Adalimumab, Infliximab, Rituximab, etc. Los mAb son el segmento de más rápido crecimiento en la industria farmacéutica y esta rápida expansión está decidida a continuar. Ahora hay más de 100 fármacos biológicos basados en anticuerpos monoclonales en ensayos clínicos. Muchos de estos se encuentran en ensayos de fase II y fase III y se presentarán ante las agencias reguladoras para su aprobación. La mejora de los productos terapéuticos de anticuerpos monoclonales a través de las tecnologías descritas aquí allanará el camino hacia un mejor resultado clínico para los pacientes.
El anticuerpo IgG1 humana es una glicoproteína altamente fucosilada. Están presentes dos oligosacáridos biantenarios unidos a N que consisten en heptasacárido central con adición variable de fucosa, galactosa, N-acetilglucosamina bisectante y ácido siálico en la Asn-297 de la IgG1. La glicosilación de anticuerpos conduce a funciones biológicas únicas conocidas como "funciones efectoras" - Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). La ADCC es un sistema inmunitario mediado por células donde las células inmunitarias (como células citolíticas naturales) lisan las células diana identificadas mediante anticuerpos contra los antígenos de la superficie celular.
La función efectora de la molécula de IgG se define por la interacción de la región Fc del anticuerpo con receptores de leucocitos, conocidos como FcyR o interacciones con componentes del complemento. La composición de la estructura del oligosacárido es de importancia crítica para la función efectora a través de la unión de FcyR (Shields et al. 2002; Shinkawa et al.2003; Niwa et al. 2004; Niwa, Shoji-Hosaka, et al. 2004; Yamane-Ohnuki et al. 2004;). El análisis de la estructura cristalina de la IgG1 humana puso de manifiesto una interacción intrincada de las cadenas de oligosacáridos con el dominio CH2 (Harris et al. 1998; Radaev et al. 2001).
La eficacia del mecanismo de ADCC depende considerablemente del nivel de fucosilación del anticuerpo; cuanto menor es la fucosilación, mayor es la tasa de ADCC. Por lo tanto, la pérdida de fucosilación tiene importantes consecuencias biológicas. La pérdida podría deberse a enzimas fucosiltransferasas no funcionales, que da como resultado la no fucosilación de proteínas celulares. La ausencia de fucosa de la N-acetilglucosamina primaria da como resultado que el anticuerpo IgG1 tenga una mayor afinidad de unión por el receptor FcYRIIIa, con el consiguiente aumento de 50-100 veces mayor eficacia de ADCC (Shinkawa et al. 2003). La mejora de la ADCC con IgG no fucosilada es directamente proporcional a la mayor afinidad por FcYRIIIa; esto permite que el Fc de IgG no fucosilada supere la competencia de altas concentraciones de IgG fucosilada en suero normal. Una razón posible para la mayor afinidad de Fc de IgG no fucosilada por FcYRIIIa puede ser la reducción o ausencia de inhibición estérica en la interfase receptor-ligando (Harris, 1998; Radaev, 2001).
En el sistema de expresión de mamíferos, la enzima a1 -6-fucosiltransferasa codificada por el gen Fut8 es responsable de transferir el resto de fucosa de GDP-fucosa a N-acetilglucosamina de la cadena de N-glicano en proteínas (Miyoshi, 1999). La alteración de la función de este gen a través de diversos medios conduce a la producción de proteínas no fucosiladas, incluidos anticuerpos (Naoko Yamane-Ohnuki, 2004).
Las formas no fucosiladas de anticuerpos terapéuticos desarrollados en plataformas de mamíferos, donde se altera la biosíntesis de fucosa, pueden tener ventaja clínica frente a las formas fucosiladas debido a la eficacia mejorada de la ADCC hacia células tumorales diana.
Históricamente, los sistemas de inactivación de genes dependían completamente de la mutación, deleción y/o inserción dirigida mediada por recombinación homóloga (HR). El sistema de HR, aunque muy específico, es muy ineficaz, ya que es necesario cribar miles de clones para encontrar un clon mutado. Además, la eliminación de variaciones alélicas llevaría aún más tiempo y un cribado mucho mayor. En la última década han evolucionado múltiples tecnologías para lograr la modificación de genes dirigida usando una combinación de un dominio de reconocimiento de secuencias de ADN y un dominio de nucleasa. Estos sistemas son muy eficientes para identificar sitios específicos de interés y después introducir roturas de cadenas de ADN. La rotura de la doble cadena de ADN (DSB) en el locus genómico objetivo activa la reparación del ADN, que se usa para modificar genes. La respuesta al daño del ADN está altamente conservada en células eucariotas. El concepto de ingeniería del genoma basada en DSB es fácilmente transferible entre organismos muy diversos. La creación de roturas de la doble cadena aumenta la frecuencia de inactivación génica en los locus objetivo en miles de veces mediante recombinación homóloga y mecanismos de unión de extremos no homólogos.
En comparación, la nucleasa de dedos de zinc (ZFN) requiere tres bases a nivel de ADN para cada matriz en tándem de dedos de zinc. Además, el solapamiento de sitios diana y la interacción entre dedos individuales en una matriz de dedos de zinc complican considerablemente la producción de ZFN específicos de secuencia. Además, el principal inconveniente de las ZFN incluye un proceso de selección experimental complejo y que requiere mucho tiempo para identificar los motivos de ZFN para el reconocimiento de secuencias de ADN específicas.
Existen métodos en la técnica anterior para la alteración de los locus genómicos de Fut8. El documento WO2013/169802 describe la inserción de un transgén de interés en la región codificante de Fut8, inactivando así el propio gen Fut8.
La presente descripción supera las desventajas o limitaciones asociadas con los métodos de la técnica anterior mediante el uso de la tecnología TALEN para dirigirse a una ubicación específica en los locus genómicos de FUT8, lo que da como resultado la alteración completa del gen FUT8 y la función relacionada, proporcionando una célula que produce proteínas no fucosiladas.
DECLARACIÓN DE LA DESCRIPCIÓN
Por consiguiente, la presente descripción se refiere a un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción, en donde el dominio de unión al ADN comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 6, SEQ ID No.8, SEQ ID No. 11, SEQ ID No.14, SEQ ID No. 17, SEQ ID No.20, SEQ ID No. 23, SEQ ID No.26, SEQ ID No. 29, SEQ ID No.32, SEQ ID No. 35, SEQ ID No.38, y combinaciones de las mismas; un polinucleótido que codifica el dominio de unión al ADN como antes, en donde el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 27, SEQ ID No.
30, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 39 y combinaciones de las mismas; una proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción que comprende el dominio de unión al ADN como antes y nucleasa; un vector que comprende un polinucleótido como antes, una célula que comprende un vector como antes; un método para obtener una célula sin actividad de fucosilación, comprendiendo dicho método las etapas de: a) Obtener una construcción de nucleasa efectora de tipo activador de transcripción, y b) Transfectar una célula con la construcción de la etapa (a) para obtener una célula sin actividad de fucosilación; un método para obtener proteína no fucosilada, comprendiendo dicho método las etapas de - a) Obtener una construcción de nucleasa efectora de tipo activador de transcripción, b) Transfectar una célula con la construcción de la etapa (a) para obtener una célula sin actividad de fucosilación, y c) Obtener la proteína no fucosilada expresada por la célula de la etapa (b); una proteína no fucosilada obtenida por el método anterior; y una composición que comprende la proteína no fucosilada como antes, opcionalmente junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS ADJUNTAS
Las características de la presente descripción serán completamente evidentes a partir de la siguiente descripción considerada junto con los dibujos adjuntos. Entendiendo que los dibujos representan solo varias realizaciones de acuerdo con la descripción y, por lo tanto, no deben considerarse limitantes de su alcance, la descripción se describirá con especificidad y detalle adicionales mediante el uso de los dibujos adjuntos:
La Figura 1 ilustra la organización de la secuencia del gen Fut8.
La Figura 2 ilustra la secuencia de aminoácidos de CHOK1 Fut8.
La Figura 3 ilustra la construcción pcDNA3.1-TALEN_L6.
La Figura 4 ilustra la construcción pcDNA3.1-TALEN_R6.
La Figura 5 y la Figura 6 ilustran las imágenes de los clones de CHOK1 seleccionados con LCA el Día 1 y Día 11. La Figura 7 y la Figura 8 ilustran el resultado gráfico y el perfil de fluorescencia observado para las líneas celulares CHOK1 en el ensayo de unión de LCA-FITC.
La Figura 9 ilustra los resultados del microscopio de contraste de fase invertido para la morfología de colonias de clones de CHOK1 en el ensayo de selección de LCA.
La Figura 10 y la Figura 11 ilustran la representación gráfica y perfil de fluorescencia observado para las líneas celulares CHOK1 en el ensayo de unión de LCA-FITC.
La Figura 12 ilustra la representación gráfica de la determinación de la curva de crecimiento para los clones con inactivación de Fut8.
La Figura 13 y la Figura 14 ilustran el ensayo de citometría de flujo de LCA y la comparación de los clones de CHOK1 mediante ensayo de citometría de flujo de LCA-FITC y Strep-FITC.
La Figura 15 ilustra el perfil de fluorescencia para el ensayo de unión de LCA-FITC y el ensayo de Strep-FITC. La Figura 16 ilustra una representación ilustrativa de los clones de CHOK1 en el ensayo de selección de LCA. La Figura 17 y la Figura 18 ilustran los resultados del ensayo de citometría de flujo de LCA y la comparación de los clones de CHOK1 mediante el ensayo de citometría de flujo de LCA-FITC y Strep-FITC.
La Figura 19 ilustra el perfil de fluorescencia para los clones de CHOK1 a través del ensayo de citometría de flujo de LCA-FITC y Strep-FITC.
La Figura 20 ilustra el producto amplificado por PCR de la muestra CHOK1-TAL6-R5 #007 cuando se lleva al gel de agarosa al 1%.
La Figura 21 ilustra el fragmento restringido de pTZ57R/T_TAL R5#095 (5,4 Kb 0,397 Kb) cuando se somete a digestión de restricción y se lleva al gel de agarosa al 1%.
La Figura 22A y B ilustran análisis de secuencia de nucleótidos del ADN genómico de los clones de CHOK1 con inactivación de FUT8 transfectados con TALEN y las líneas celulares de control de CHOK1.
La Figura 23 ilustra el alineamiento de aminoácidos de la secuencia de Fut8 con secuencias clonales seleccionadas. La Figura 24 ilustra la alineamiento de las secuencias de aminoácidos de FUT8 de rata, humana, ratón, bovino y hámster chino desde la posición de aminoácido 300 a 500 que abarca los tres motivos críticos.
Las Figuras 25A y B ilustran la representación ilustrativa de células que expresan RFP después del protocolo de transfección.
La Figura 26 ilustra el árbol de alineamiento de la variación de la secuencia de nucleótidos del locus de FUT8 entre varias líneas celulares CHOK1 con inactivación de FUT8 y línea celular CHOK1 de control.
Los diversos elementos ilustrados en los dibujos son meramente representativos y no están necesariamente dibujados a escala. Ciertas secciones de los mismos se pueden exagerar, mientras que otras se pueden minimizar. Los dibujos están destinados a ilustrar realizaciones de ejemplo de la descripción que puedan ser entendidos y llevados a cabo adecuadamente por los expertos en la técnica.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA DESCRIPCION
La presente descripción se refiere a un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción, en donde el dominio de unión al ADN comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 6, SEQ ID No.8, SEQ ID No. 11, SEQ ID No.14, SEQ ID No. 17, SEQ ID No.20, SEQ ID No. 23, SEQ ID No.26, SEQ ID No. 29, SEQ ID No.32, SEQ ID No. 35, SEQ iD No.38, y combinaciones de las mismas. En una realización de la presente descripción, la SEQ ID No. 6 se une a la SEQ ID No. 4 de la secuencia del gen Fut8. En otra realización de la presente descripción, la SEQ ID No.8 se une a la SEQ ID No. 5 de la secuencia del gen Fut8. En otra realización más de la presente descripción, la SEQ ID No. 11 se une a la SEQ ID No. 10 de la secuencia del gen Fut8.
En otra realización más de la presente descripción, la SEQ ID No.14 se une a la SEQ ID No. 13 de la secuencia del gen Fut8.
En otra realización más de la presente descripción, la SEQ ID No. 17 se une a la SEQ ID No. 16 de la secuencia del gen Fut8.
En otra realización más de la presente descripción, la SEQ ID No.20 se une a la SEQ ID No. 19 de la secuencia del gen Fut8.
En otra realización más de la presente descripción, la SEQ ID No. 23 se une a la SEQ ID No. 22 de la secuencia del gen Fut8.
En otra realización más de la presente descripción, la SEQ ID No.26 se une a la SEQ ID No. 25 de la secuencia del gen Fut8.
En otra realización más de la presente descripción, la SEQ ID No. 29 se une a la SEQ ID No. 28 de la secuencia del gen Fut8.
En otra realización más de la presente descripción, la SEQ ID No.32 se une a la SEQ ID No. 31 de la secuencia del gen Fut8.
En otra realización más de la presente descripción, la SEQ ID No.35 se une a la SEQ ID No. 34 de la secuencia del gen Fut8.
En otra realización más de la presente descripción, la SEQ ID No.38 se une a la SEQ ID No. 37 de la secuencia del gen Fut8.
La presente descripción también se refiere a un polinucleótido que codifica el dominio de unión al ADN como antes, en donde el polinucleótido comprende un secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 30, s Eq ID No. 33, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 39 y combinaciones de las mismas.
La presente descripción también se refiere a una proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción que comprende el dominio de unión al ADN como antes y nucleasa.
En una realización de la presente descripción, la nucleasa es la endonucleasa Fok1.
La presente descripción también se refiere a un vector que comprende un polinucleótido como antes.
La presente descripción también se refiere a una célula que comprende un vector como antes.
En una realización de la presente descripción, la célula es una célula de mamífero.
La presente descripción también se refiere a un método para obtener una célula sin actividad de fucosilación, comprendiendo dicho método las etapas de:
a) Obtener una construcción de nucleasa efectora de tipo activador de transcripción; y
b) Transfectar una célula con la construcción de la etapa (a) para obtener una célula sin actividad de fucosilación. La presente descripción también se refiere a un método para obtener proteína no fucosilada, comprendiendo dicho método las etapas de:
a) Obtener una construcción de nucleasa efectora de tipo activador de transcripción;
b) Transfectar una célula con la construcción de la etapa (a) para obtener una célula sin actividad de fucosilación; y
c) Obtener la proteína no fucosilada expresada por la célula de la etapa (b).
En una realización de la presente descripción, la proteína no fucosilada es un anticuerpo no fucosilado.
En otra realización de la presente descripción, el anticuerpo no fucosilado es un anticuerpo monoclonal no fucosilado. En otra realización más de la presente descripción, la nucleasa efectora de tipo activador de transcripción es la proteína nucleasa como antes; y la proteína nucleasa escinde la secuencia del gen Fut8.
En otra realización más de la presente descripción, la secuencia del gen Fut8 que codifica la enzima a-1,6-fucosiltransferasa es escindida en el exón 9.
En otra realización más de la presente descripción, la enzima fucosiltransferasa se muta en una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en Arg- 365, Arg -366, Asp-368, Lys-369, Glu-373, Tyr-382, Asp-409, Asp-410, Asp-453, Ser-469 y combinaciones de los mismos.
En otra realización más de la presente descripción, la célula es una célula de mamífero.
En otra realización más de la presente descripción, la célula es una célula de ovario de hámster chino.
En otra realización más de la presente descripción, la célula produce una proteína endógena no fucosilada.
En otra realización más de la presente descripción, el método comprende además una etapa de introducir un gen que codifica una proteína en la célula y obtener la proteína no fucosilada.
La presente descripción también se refiere a una proteína no fucosilada obtenida mediante el método de antes. En una realización de la presente descripción, la proteína es un anticuerpo no fucosilado.
La presente descripción también se refiere a una composición que comprende la proteína no fucosilada como antes, opcionalmente junto con excipiente farmacéuticamente aceptable.
En una realización de la presente descripción, la proteína no fucosilada es un anticuerpo no fucosilado.
La presente descripción se refiere a un método para obtener proteínas no fucosiladas, por alteración o inactivación de la maquinaria de fucosilación en una célula.
En una realización, la proteína no fucosilada es un anticuerpo no fucosilado.
En una realización preferida pero no limitante, el anticuerpo no fucosilado es un anticuerpo monoclonal no fucosilado. En la presente descripción, las expresiones "anticuerpo no fucosilado" y "anticuerpo afucosilado" se usan indistintamente y tienen el mismo significado y alcance.
La presente descripción se refiere particularmente a la alteración o inactivación del gen FUT8 en una célula. El gen FUT8 codifica la enzima a-1,6-fucosiltransferasa.
En una realización de la presente descripción, la célula es una célula que produce de forma natural una proteína. En una realización de la presente descripción, la célula es una célula que produce de forma natural un anticuerpo. En una realización de la presente descripción, la célula es una célula que no produce de forma natural una proteína dada, y se introduce en la célula un gen que codifica la proteína.
En una realización de la presente descripción, la célula es una célula que no produce de forma natural un anticuerpo y se introduce en la célula un gen que codifica un anticuerpo.
En una realización de la presente descripción, la célula es una célula que produce de forma natural un anticuerpo y se introduce en la célula un gen que codifica un anticuerpo.
En una realización, la célula es una célula eucariota.
En una realización, la célula es una célula de mamífero.
En una realización no limitante, la célula es una célula de ovario de hámster chino.
En una realización no limitante, la célula es una célula de ovario de hámster chino K1 (CHOK1).
En una realización, la célula CHOK1 es una célula productora de anticuerpos.
En una realización, el anticuerpo producido por el método de la presente descripción es un anticuerpo terapéutico.
En otra realización, la célula CHOK1 no es una célula productora de anticuerpos y se introduce en la célula un gen que codifica un anticuerpo.
En realizaciones de la presente descripción, la línea celular se selecciona del grupo que consiste en COS, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO -DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV, VERO, MDCK, W138, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293-F, HEK293-H, HEK293 -T, YB23HL.P2.G11,16Ag.20, perC6, célula de hibridoma que produce anticuerpo, célula madre embrionaria, célula de Namalwa, línea celular de insecto de Spodoptera fugiperda (Sf), Pichia, Saccharomyces y Schizosaccharomyces.
En una realización, la célula se denomina una célula "inactivada para fucosa" o célula "FKO" (por sus siglas en inglés, Fucose KnockOut)" o plataforma "inactivada para fucosa" o plataforma "FKO".
En una realización, la célula se denomina célula recombinante.
En una realización, la proteína o enzima TALEN (nucleasa efectora de tipo activador de transcripción) se usa para alterar o inactivar la ruta de fucosilación de una célula.
En una realización, la proteína o enzima TALEN (nucleasa efectora de tipo activador de transcripción) se usa para alterar o inactivar uno o más genes de la ruta de fucosilación de una célula.
En una realización, la proteína o enzima TALEN (nucleasa efectora de tipo activador de transcripción) se usa para alterar o inactivar o mutar el gen seleccionado del grupo que comprende el gen a-1,6-fucosiltransferasa (gen Fut8), GDP-manosa 4,6-deshidratasa (gen GMD), GDP-ceto-6 desoximanosa 3,5-epimerasa 4-reductasa (gen FX), GDP-beta-L-fucosa pirofosforilasa (gen GEPP) y fucosa quinasa.
En una realización, la presente descripción se refiere a la alteración de una combinación de gen Fut8 y gen GMD por la proteína TALEN de la presente descripción.
En la ruta de fucosilación de novo, la GDP-fucosa se sintetiza a través de la conversión de GDP-manosa en GDP-4-ceto-6-desoxi-manosa, catalizada por la enzima GDP-manosa 4,6-deshidratasa (GMD). Esta GDP-fucosa después es transportada al interior del golgi y es usada como sustrato para la fucosilación de proteínas por la enzima a-(1-6)-fucosiltransferasa. La enzima transfiere el resto de fucosa de GDP-fucosa a N-acetilglucosamina de la cadena de N-glicano.
En una realización, la proteína o enzima TALEN (nucleasa efectora de tipo activador de transcripción) se usa para alterar el gen Fut8 que codifica la enzima a-1,6-fucosiltransferasa.
En una realización de la presente descripción, la proteína TALEN se dirige al sitio activo de la enzima fucosiltransferasa.
En una realización, la proteína TALEN se dirige al exón 9 de la secuencia génica de Fut8. Una proteína TALEN está formada por dominio de unión al ADN y dominio nucleasa. El dominio de unión al ADN también tiene 2 partes - el dominio TAL que identifica la secuencia de la izquierda del objetivo de rotura de la doble cadena (DSB) se denomina TAL-L y el dominio TAL que identifica la secuencia derecha del objetivo de DSB se denomina TAL-R. Tanto los dominios TAL-L como TAL-R se expresan como proteína de fusión con dominio nucleasa.
Se ha identificado una familia de proteínas conocida como efectoras de tipo activador de transcripción (TALE) a partir del patógeno de planta Xanthomonas, que se une a secuencias de ADN específicas del efector y activa la transcripción (Boch, 2009; Moscou, 2009). Los efectores TAL de origen natural en Xanthomonas se unen a secuencias específicas del ADN del hospedante, alterando la expresión génica de la planta infectada.
Las proteínas efectoras TAL naturales tienen dos dominios: un dominio efector y un dominio de unión al ADN. La estructura del dominio de unión al ADN se puede manipular de manera que el dominio se una específicamente a cualquier secuencia de ADN del genoma. Estos dominios de proteínas de unión al ADN se pueden unir a un dominio efector hecho a medida, tal como una nucleasa, produciendo así una proteína TALEN (nucleasa efectora de tipo activador de transcripción) quimérica.
El dominio de unión al ADN que proporciona la especificidad de la secuencia de ADN de TALE/TALEN, consiste en un número variable de repeticiones de aminoácidos. Cada repetición contiene 33-35 aminoácidos y reconoce un solo par de bases de ADN. El reconocimiento del ADN se produce a través de 2 restos de aminoácidos hipervariables en las posiciones 12 y 13 dentro de cada repetición, denominados Di-restos variables de repetición (RVD), que son fundamentales para reconocer secuencias de ADN específicas. Los RVD de las repeticiones en los efectores TAL se pueden variar para crear una proteína TAL que reconozca una secuencia de ADN diana específica. El RVD es específico de un cifrado simple como, NI = A, Hd = C, NG = T, NN = G o A (Boch, 2009; Moscou, 2009). N, I, H, D y G representan códigos de aminoácidos de una letra.
Las repeticiones del dominio de unión al ADN se ensamblan en un vector de expresión de TALE y se coexpresan con un dominio catalítico de endonucleasa de nucleasa FokI para crear la nucleasa TALE (TALEN). Dichas TALEN, una vez expresadas en las células, se unen a la secuencia específicamente y crean la rotura de la doble cadena; que es reparada por la unión de extremos no homólogos (NHEJ). Durante tales procesos celulares, las mutaciones, es decir, deleciones y/o inserciones dentro de la secuencia génica, producen productos de proteínas no funcionales.
En realizaciones de la presente descripción, el dominio de unión al ADN también se denomina dominio de reconocimiento del ADN.
En una realización de la presente descripción, también se proporcionan polinucleótidos que codifican dichas proteínas TALEN, así como células que comprenden dichos polinucleótidos y proteínas.
En una realización particular, se proporcionan nucleótidos que codifican el dominio de unión al ADN de la proteína TALEN.
En otra realización, se proporcionan nucleótidos que codifican el dominio efector o el dominio de nucleasa de la proteína TALEN.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 6.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 6.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 8.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 8.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID No. 6 y SEQ ID No.8.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 7.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 7.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No.9.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 9.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de SEQ ID No. 7 y SEQ ID No.9.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 11.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 11.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 14.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 14.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID No. 11 y SEQ ID No.14.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 12.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 12.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No.15.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 15.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de SEQ ID No. 12 y SEQ ID No.15.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 17.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 17.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 20.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 20.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID No. 17 y SEQ ID No.20. En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 18.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 18.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No.21.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 21.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de SEQ ID No. 18 y SEQ ID No.21.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 23.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 23.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 26.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 26.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID No. 23 y SEQ ID No.26. En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 24.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 24.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No.27.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 27.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de SEQ ID No. 24 y SEQ ID No.27.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 29.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 29.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 32.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 32.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID No. 29 y SEQ ID No.32. En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 30.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 30.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No.33.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 33.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de SEQ ID No. 30 y SEQ ID No.33.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 35.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 35.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 38.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 38.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID No. 35 y SEQ ID No.
38.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 36.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 36.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 39.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 39.
En una realización de la presente descripción, un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de SEQ ID No. 36 y SEQ ID No.39.
En realizaciones de la presente descripción, la SEQ ID No. 6 funciona en combinación con la SEQ ID No. 8 como dominio de unión al ADN de la proteína TALEN.
En realizaciones de la presente descripción, la SEQ ID No. 11 funciona en combinación con la SEQ ID No. 14 como dominio de unión al ADN de la proteína TALEN.
En realizaciones de la presente descripción, la SEQ ID No. 17 funciona en combinación con la SEQ ID No. 20 como dominio de unión al ADN de la proteína TALEN.
En realizaciones de la presente descripción, la SEQ ID No. 23 funciona en combinación con la SEQ ID No. 26 como dominio de unión al ADN de la proteína TALEN. En realizaciones de la presente descripción, la SEQ ID No. 29 funciona en combinación con la SEQ ID No. 32 como dominio de unión al ADN de la proteína TALEN.
En realizaciones de la presente descripción, la SEQ ID No. 35 funciona en combinación con la SEQ ID No. 38 como dominio de unión al ADN de la proteína TALEN.
En realizaciones de la presente descripción, cada unidad del dominio de unión al ADN se prepara como una construcción con la secuencia de nucelótidos de TALEN izquierda con Nucleasa.
En realizaciones de la presente descripción, cada unidad del dominio de unión al ADN se prepara como una construcción con la secuencia de nucelótidos de TALEN derecha con Nucleasa.
Se proporciona a continuación una tabla que proporciona las secuencias de nucleótidos, secuencias de aminoácidos y sitios de unión en el gen Fut8 para las proteínas TALEN 1 a 6 de la presente descripción.
Tabla 1
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En una realización de la presente descripción, el componente nucleasa de la proteína TALEN es cualquier nucleasa que tenga un sitio diana en un gen FUT8. En una realización de la presente descripción, la nucleasa es una endonucleasa de asentamiento. En otra realización, la nucleasa es una meganucleasa. También se sabe que la especificidad de las endonucleasas de asentamiento y meganucleasas se puede modificar por ingeniería genética para unirse a sitios objetivo no naturales. Además, en realizaciones de ejemplo, las endonucleasas de asentamiento incluyen I-Scel, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-ScelY, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I -CreI, I-TevI, I-TevII y I-TevIII.
Se conocen sus secuencias de reconocimiento.
En una realización, se usa una combinación de una o más de las nucleasas mencionadas antes con el dominio de unión al ADN de la proteína TALEN.
En una realización, se usa transfección para introducir una proteína TALEN en una célula. Aunque se proporciona un protocolo de lipofección como una realización de ejemplo, cualquier método de transfección conocido por un experto en la técnica es igualmente aplicable a los métodos de la presente descripción.
En otra realización, la presente descripción proporciona metodologías para producir proteínas recombinantes en cualquier célula hospedante donde la célula hospedante tiene expresión endógena del gen FUT8 que es objetivo mediante la tecnología TALEN para alterar el gen FUT8 endógeno como se describe en el presente documento. La línea celular resultante es nula para la expresión del gen FUT8 y se usa además para la expresión del gen de interés.
En la presente descripción, se crean diecinueve líneas celulares clonales con inactivación de FUT8 a partir de un cribado de menos de 280 líneas celulares. En comparación, sólo se pudieron seleccionar tres líneas celulares FUT8 -/- de aproximadamente 120.000 líneas celulares clonales como se describe en la técnica anterior.
La especificidad, seguridad y simplicidad del protocolo son algunas de las ventajas que ofrece TALEN y el método de la presente descripción frente a los métodos de la técnica anterior. La alteración de genes mediada por TALEN proporciona una ventaja única de código de "una repetición, una base" que permite que las matrices de repetición TALE hechas a medida reconozcan la secuencia diana definida por el usuario de cualquier complejidad. Las construcciones TALEN son más efectivas que las ZFN en términos de eficiencia de edición del genoma y significativamente menos tóxicas, lo que permite una mayor eficiencia en la generación de clones mutantes contra un locus particular. En la presente descripción, los locus genómicos de FUT8 son objetivo para deleciones específicas de secuencia a través de TALEN.
La metodología descrita en el presente documento ha logrado una eficiencia de más de 6,5% de tasa de éxito en la generación de líneas celulares CHOK1 con inactivación de FUT8 (19 líneas celulares inactivadas CHOK1 a partir de un cribado de menos de 280 poblaciones de células clonales). Este logro inesperado siguiendo la metodología y las construcciones TALEN específicas de la presente descripción ha mejorado enormemente el desarrollo de la línea celular con inactivación de FUT8. Además, la presente descripción ha usado solo un conjunto de construcciones TALEN dirigidas a una ubicación genómica muy específica en la secuencia de ADN de FUT8 de CHOK1. Sorprendentemente, las construcciones TALEN dan como resultado no solo la alteración de los aminoácidos diana, sino que también producen deleciones largas que introducen mutaciones de cambio de marco y codón de parada temprana. Por lo tanto, la presente descripción ha logrado líneas celulares CHOK1 con inactivación de FUT8 con modificaciones de ADN muy mínimas en el locus objetivo, así como grandes modificaciones a nivel del genoma en el locus de FUT8 objetivo. La generación de dicho número tan grande de líneas celulares CHOK1 con inactivación de FUT8 es inesperada, considerando el pequeño número de poblaciones clonales cribadas para el fenotipo de inactivación de fucosa. Este sorprendente logro permitió cribar múltiples líneas celulares CHOK1 con inactivación de FUT8 para establecer las líneas clonales de mejor rendimiento para la sobreexpresión de anticuerpos monoclonales.
En una realización, el gen de interés se introduce en la línea celular resultante a través de un vector de expresión que comprende secuencias de ADN que codifican la proteína de interés, produciendo así la proteína recombinante.
En otra realización, la proteína de interés expresada incluye anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales.
En realizaciones, la inactivación de un gen FUT8 da como resultado una línea celular que produce proteínas recombinantes en niveles más altos.
En determinadas realizaciones, la inactivación de un gen FUT8 proporciona una línea celular en la que aumentan una o más actividades (funciones) de una proteína, en comparación con las proteínas producidas en células donde el gen FUT8 no está inactivado.
En una realización, la proteína no fucosilada producida por la célula es un anticuerpo no fucosilado.
En una realización no limitante, la proteína no fucosilada es un anticuerpo IgG1 no fucosilada, y preferiblemente un anticuerpo monoclonal IgG1 no fucosilada.
En una realización, el anticuerpo no fucosilado presenta mayor función efectora que un anticuerpo fucosilado correspondiente.
En una realización, el anticuerpo no fucosilado presenta propiedades terapéuticas más eficaces que un anticuerpo fucosilado correspondiente.
En una realización, el anticuerpo no fucosilado presenta una mayor toxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) que un anticuerpo fucosilado correspondiente.
En la presente descripción, los métodos, preparación y uso de las proteínas descritas emplean, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales en biología molecular, bioquímica, química computacional, cultivo celular, tecnología de ADN recombinante, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y campos relacionados. Estas técnicas, sus principios y requisitos se explican en la bibliografía y son conocidas por un experto en la técnica. Las técnicas para determinar la identidad de secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos son conocidas por los expertos en la técnica.
La célula con la maquinaria de fucosilación alterada es una célula que produce anticuerpos, o una célula en la que se introduce un gen que codifica un anticuerpo antes o después de la alteración de la fucosilación.
Un "fragmento funcional" de una proteína, polipéptido o ácido nucleico es una proteína, polipéptido o ácido nucleico cuya secuencia no es idéntica a la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa, pero conserva la misma función que la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa.
El término "anticuerpo" usado aquí incluye preparaciones de anticuerpos tanto policlonales como monoclonales y también incluye lo siguiente: moléculas de anticuerpo quimérico, fragmentos F(ab')2 y F(ab), moléculas Fv, moléculas Fv monocatenarias (ScFv), fragmentos de anticuerpos diméricos y triméricos, minicuerpos, moléculas de anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden la región Fc del anticuerpo y cualquier fragmento funcional procedente de estas moléculas, donde las moléculas derivadas retienen la funcionalidad inmunológica de la molécula de anticuerpo parental.
La expresión "anticuerpo monoclonal" en la presente descripción, se refiere a una composición de anticuerpos que tiene una población de anticuerpos homogénea. El anticuerpo no se limita a la especie o fuente del anticuerpo ni a la forma en que se prepara. El término abarca inmunoglobulinas enteras así como fragmentos tales como Fab, F(ab')2, Fv y otros fragmentos, así como poblaciones de anticuerpos homogéneos quiméricos y humanizados que presentan propiedades de unión inmunológica de la molécula de anticuerpo monoclonal parental.
Hay que indicar que los clones/células de la presente descripción se denominan por términos tales como TAL R4 #003, TAL R4 #013, etc., que son denominaciones internas y no representan ninguna característica particular de la célula.
En una realización, se proporciona una composición que comprende el anticuerpo no fucosilado, opcionalmente junto con un vehículo o aditivo o excipiente farmacéuticamente aceptable. El vehículo o aditivo o excipiente farmacéuticamente aceptable está determinado por la composición que se administra, así como por el método particular usado para administrar la composición y son conocidos por un experto en la técnica.
Todas las secuencias proporcionadas en la presente descripción se leen en la dirección 5' a 3', a menos que se indique lo contrario.
Los excipientes son importantes para lograr la estabilización de las proteínas y mejorar otras cualidades de los productos biológicos. Se añaden una variedad de excipientes a las composiciones para estabilizar proteínas, actuar como antimicrobianos, ayudar en la fabricación de la forma farmacéutica, administrar el fármaco de control o diana y minimizar el dolor tras la inyección.
Los excipientes se pueden dividir ampliamente en cinco categorías en función de sus modos de acción:
1. Estabilizantes de proteínas: Estos excipientes estabilizan la conformación nativa de la proteína. Los ejemplos incluyen polioles, azúcares, aminoácidos, aminas y precipitación de sales. La sacarosa y la trehalosa son los azúcares usados con más frecuencia y los polioles grandes son mejores estabilizantes que los polioles más pequeños.
2. Polímeros y proteínas: Los polímeros hidrófilos, tales como polietilenglicoles (PEG), polisacáridos y proteínas inertes, se usan de forma no específica para estabilizar proteínas y mejorar el ensamblaje de proteínas. Los ejemplos incluyen dextrano, hidroxiletilalmidón (HETA), PEG-4000 y gelatina.
3. Tensioactivos: Los tensioactivos no iónicos se usan ampliamente para estabilizar proteínas, suprimir la agregación y ayudar en el replegado de proteínas. El polisorbato 80 y el polisorbato 20, también conocidos como Tween 80 y Tween 20, respectivamente, se usan generalmente en los productos terapéuticos de mAb. Otros ejemplos incluyen Brij 35, Triton X-10, Pluronic F127 y doceilsulfato de sodio (SDS).
4. Aminoácidos: Estos excipientes estabilizan las proteínas por una variedad de mecanismos. Los ejemplos incluyen histidina, arginina y glicina. Otros aminoácidos usados como excipientes de formulación incluyen mezclas de metionina, prolina, lisina, ácido glutámico y arginina.
5. Conservantes: Estos compuestos se incluyen en formulaciones para prevenir el crecimiento microbiano. Los ejemplos incluyen alcohol bencílico, m-cresol y fenol.
El material biológico usado en la presente descripción se obtiene de fuera de la India.
Uno de los aspectos más importantes de la presente descripción es el direccionamiento al sitio activo de la enzima a-1,6-fucosiltransferasa, codificada por el gen Fut8. Este sitio activo corresponde al Exón 9 en el ARNm del gen Fut8. Este direccionamiento no es una selección aleatoria, sino que se ha llegado, en la presente descripción, mediante experimentación para determinar la ubicación altamente específica en el gen o enzima, cuya alteración asegura que se evita la fucosilación parcial que es producida por la enzima truncada o parcialmente funcional.
Por lo tanto, el direccionamiento a la región equivalente al sitio activo de la enzima asegura la alteración completa del gen Fut8 y proporciona resultados eficaces en comparación con una técnica que no puede dirigirse a una ubicación precisa en el gen Fut8 o una técnica que se dirige a otra ubicación en el gen Fut8, que podrían dar como resultado la alteración parcial del gen Fut8 y la actividad enzimática. Una célula con la maquinaria fucosilada parcialmente funcional produce proteínas parcialmente fucosiladas, que presentan funciones terapéuticas inferiores en comparación con las proteínas no fucosiladas. Las células producidas por el método de la presente descripción producen proteínas completamente o 100% no fucosiladas, incluyendo anticuerpos 100%no fucosilados.
La presente descripción introduce mutaciones en posiciones críticas de aminoácidos en el sitio activo de la secuencia de codones de FUT8 a través de TALEN. Se ha descrito que la Arg365 y Arg366 en el gen FUT8 humano juegan un papel importante en la función catalítica de la a-1,6-fucosiltransferasa (Takahashi 2000). También se describe que algunos otros aminoácidos críticos se conservan en el gen FUT8 en todas las especies.
La Figura 24 de la presente descripción ilustra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de FUT8 de rata, humano, ratón, bovino y hámster chino desde la posición de aminoácido 300 a 500 que abarca los tres motivos críticos. Los aminoácidos 365, 366, 368, 369 y 373 están marcados con un recuadro abierto y las marcas de flechas son objetivo en este estudio. Otros aminoácidos importantes 382, 409, 410, 453 y 469 están marcados con asteriscos. Los aminoácidos en recuadro sombreado indican restos que no están alineados con la secuencia de consenso.
En la presente descripción, se analiza la secuencia de aminoácidos de FUT8 de la base de datos genómica de CHOK1 y se confirma que estos aminoácidos críticos se conservan también en el gen FUT8 derivado de la línea celular CHOK1. Se diseñan TALEN específicas de secuencia, que se dirigen a estos motivos de aminoácidos para introducir modificaciones genómicas.
Se afirma que la mutación de estos aminoácidos críticos proporciona la alteración completa de la funcionalidad del gen FUT8. Dirigirse a genes usando la tecnología TALEN es un enfoque novedoso para crear una plataforma de línea celular con inactivación de fucosa. Las células transfectadas con TALEN se criban mediante ensayos de funcionalidad del gen FUT8. Los clones seleccionados se confirman mediante la secuenciación de los locus genómicos de FUT8 para determinar mutaciones. La línea celular CHOK1 con inactivación de fucosa mutante luego se usa para expresar proteínas terapéuticas no fucosiladas, incluyendo anticuerpos monoclonales terapéuticos no fucosilados o parte del anticuerpo.
El locus del gen Fut8 completo en el genoma de la célula CHOK1 se analiza a partir de la base de datos de genoma disponible públicamente. NW_003613860 que consiste en 1822872 pb, se obtiene de Pubmed. El locus completo del gen Fut8 (Nw _003613860.1) de estos datos corresponde a la región de 570171 - 731804 bases. Esto corresponde a un total de 161634 pb. El número de acceso de Pubmed para la región codificante o ARNm del gen Fut8 es XM_003501735.1.
La secuencia diana abarca el gen Fut8 responsable de la expresión del producto génico de FUT8, la enzima a-1,6-fucosiltransferasa. La enzima cataliza la transferencia del motivo fucosa de GDP-fucosa a N-acetilglucosamina a través de un enlace a-1,6.
La herramienta de alineamiento Spidey (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/spideyweb.cgi) se usa para identificar los exones en el ADN genómico de Fut8 alineando la secuencia de ARNm con la secuencia de ADN genómico. Se identifican un total de 11 exones con los límites como se muestran a continuación en la Tabla 2. Se observa una identidad de 100% entre la secuencia de ADN genómico y ARNm. La organización del gen Fut8 que muestra los 11 exones se muestra en la figura 1 de la presente descripción.
Tabla 2: Caracterización del ARNm de Fut8
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Se han confirmado las funcionalidades de la enzima FUT8 mediante estudios de mutagénesis dirigida al sitio de restos de aminoácidos de importancia crítica en el dominio catalítico. Dos restos de arginina en las posiciones 365 y 366 junto con Asp-368, Lys-369 y Glu-373 pusieron de manifiesto la reducción de la actividad catalítica de FUT8 medida mediante ensayos basados en fluorescencia.
La SEQ ID No. 1 de la presente descripción indica el Exón 9 de la secuencia de ADN genómico en el gen Fut8 de CHO (Hámster chino o Cricetulus griseus), para el objetivo de TALEN. Las secuencias de nucleótidos que corresponden a Arg 365, Arg 366, Asp 368, Lys 369 y Glu 373 se indican en negrita y subrayadas en la secuencia del Exón 9, proporcionada a continuación.
A G T C C A T G T C A G A C G C A C T G A C A A A G T G G G A A C A G A A G C A G C C T T C C A T C C C A T T G
A G G A A T A C A T G G T A C A C G T T G A A G A A C A T T T T C A G C T T C T C G A A C G C A G A A T G A A A
G T G G A T A A A A A A A G A G T G T A T C T G G C C A C T G A T G A C C C T T C T T T G T T A A A G G A G G C A
A A G A C A A A
En la secuencia anterior:
• AGA codifica la arginina en la posición 365
• CGC codifica la arginina en la posición 366
• GAC codifica el aspartato en la posición 368
• AAA codifica la lisina en la posición 369
• GAA codifica el ácido glutámico en la posición 373
Las TALEN que se dirigen específicamente a las secuencias de codones de aminoácidos en ubicaciones genómicas se diseñan, sintetizan y clonan en vectores de expresión, p. ej., pcDNA3.1. Las construcciones de TALEN se transfectan transitoriamente en células CHOK1; las células se cultivan en placas de 96 pocillos para la generación de colonias individuales. Después, cada clon se analiza para determinar la expresión del gen FUT8 usando el ensayo de aglutinina de Lens Culinaris (LCA) basado en fluorescencia. Los clones positivos para la alteración del gen FUT8 se someten a ensayos adicionales mediante ensayos enzimáticos y análisis cinético de alelos mutantes del gen FUT8. Finalmente, se analiza en la secuencia genómica en los locus de FUT8 cualquier mutación llevada a cabo a través de TALEN. Estas mutaciones implican deleciones o inserciones, introduciendo así mutaciones de cambio de marco de la secuencia de codones de FUT8 y haciendo que la secuencia esté alterada y la enzima no sea funcional.
La línea celular CHOK1 con inactivación de fucosa derivada del procedimiento mencionado antes se usa como una plataforma de línea celular para expresar proteínas, anticuerpos monoclonales, péptidos, proteínas de fusión con fines terapéuticos, desarrollo de biomarcadores, usos de diagnóstico y pronóstico.
La presente descripción se describe además con referencia a los siguientes ejemplos, que son solo de naturaleza ilustrativa y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente descripción de ninguna manera. Preparación de reactivos
Medio de crecimiento completo DMEM avanzado - 500ml
1. Se añaden 50 ml de FBS (concentración final 10%) a la cámara superior de la unidad de filtro de 500 ml.
2. Se añaden 10 ml de glutamina 200 mM (concentración final 4 mM).
3. Se añaden 5 ml de 100X solución Pen-strep (concentración final IX).
4. El volumen se ajusta hasta 500 ml con medio DMEM avanzado.
5. El medio completo se filtra a través de un filtro de 0,22 gm.
6. Se desmonta la cámara superior y el depósito o frasco de medio se cierra.
7. El medio se puede usar en el plazo de 30 días de su preparación.
8. El medio se almacena a 2°C -8°C y alejado de la exposición continua a la luz.
9. En los casos en los que se preparan medios de selección de LCA, se mezclan 10 mililitros de reactivo LCA madre de 10 mg/mililitro con 500 mililitros de medio DMEM preparado para lograr una concentración final de LCA de 200 gg/ml en medio DMEM.
Materiales y equipo
1. Cabina de seguridad biológica
Tabla 3: Reactivos usados en esta descripción
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Tabla 4: Medios y tampones usados en esta descripción
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EJEMPLO 1: DISEÑO DE LA PROTEÍNA TALEN
El objetivo de este experimento es diseñar TALEN (nucleasa efectora similar al activador de transcripción) para la inactivación específica de alelos de FUT8.
1.1- Fundamento para dirigirse a una secuencia genómica específica en el locus de FUT 8
FUT8 se compone de tres dominios, un dominio superenrollado N-terminal, un dominio catalítico y un dominio SH3 C-terminal. La parte C-terminal del dominio catalítico de FUT8 incluye un plegamiento de Rossmann con tres regiones conservadas en a1,6-fucosiltransferasas; a1,2-fucosiltransferasas; y proteínas O-fucosiltransferasas. Además, el experimento de mutagénesis dirigida al sitio muestra que varios restos, los cuales son todos muy conservados en las tres fucosiltransferasas de este plegamiento, son esenciales para la actividad enzimática de FUT8.
El dominio catalítico putativo está compuesto por dos estructuras, una estructura de hoja abierta a/b y un plegamiento de Rossmann que se encuentra con frecuencia en proteínas de unión a nucleótidos que incluyen glicosiltransferasas. Diez restos de aminoácidos, Arg 365, Arg 366, Asp-368, Lys-369, Glu-373, Tyr-382, Asp-409, Asp-410, Asp-453 y Ser-469 de la proteína enzimática FUT8 humana están perfectamente conservados entre varias especies, que incluyen vertebrados, insectos, nematodos y ascidias como se observa en la Figura 24 de la presente descripción.
Para comprender la contribución de la secuencia de aminoácidos específica en el gen FUT8 en la actividad de la a-1,6-fucosiltransferasa, se comparan regiones de la secuencia de aminoácidos de FUT8 entre múltiples especies. El análisis muestra muchas regiones conservadas, entre ellas se observa que los restos en 361-370 son altamente homólogos y esta región es una parte esencial del dominio catalítico de la enzima. El alineamiento muestra que las secuencias de enzimas constituyen restos de aminoácidos altamente conservados en la posición Arg 365, Arg 366, Asp-368, Lys-369, Glu-373. Por lo tanto, estas posiciones de aminoácidos son el objetivo de las proteínas TALEN en el método de la presente descripción.
1.2 - Construcciones de TALEN
Las construcciones de TALEN funcionan en formas diméricas, denominadas TALEN izquierda y derecha, basado en su posición en la secuencia de ADN genómico. La secuencia entre los dos sitios de unión de TALEN es el objetivo para crear rotura de la doble cadena usando la endonucleasa FokI y se denomina secuencia espaciadora. Cada TALEN se diseña para reconocer y unirse a una secuencia de ADN de 20 pb. Las TALEN izquierda y derecha se dirigen a secuencias de ADN en cadenas opuestas. Las enzimas TALEN se construyen como proteínas de fusión que implican el dominio de unión al ADN de TALE y el dominio de nucleasa FokI monomérico. La nucleasa FokI es funcional solo en la configuración del dominio catalítico dimérico. La dimerización de FokI ocurre una vez que las proteínas de fusión TALEN derecha e izquierda se unen a una región espaciadora de aproximadamente 14-20 pb.
Por ejemplo, si la secuencia de unión de TALEN es - 5' T-N19N14-20N19-A3'
Entonces, la secuencia de TALEN izquierda es -5'T-N19-3' y la secuencia de TALEN derecha es la secuencia de la cadena antiparalela de - 5'-N19A-3'.
Donde N representa cualquier nucleótido seleccionado de A, G, T, C.
T representa la base de nucleótido timina en la secuencia de ADN objetivo.
Por lo tanto, la secuencia de aminoácidos de las construcciones TALEN izquierda y derecha se representa como: T-SEQ ID No.6
T-SEQ ID No.11
T-SEQ ID No.17
T-SEQ ID No.23
T-SEQ ID No.29
T-SEQ ID No.35
T-SEQ ID No.8
T-SEQ ID No. 14
T-SEQ ID No.20
T-SEQ ID No.26
T-SEQ ID No.32
T-SEQ ID No.38
La funcionalidad de FokI después de dimerización permite una especificidad más estricta en la ubicación genómica. La unión tanto de TALEN derecha como izquierda en una ubicación específica separada por 14-20 pb permite que los monómeros FokI se dimericen y se vuelvan funcionales para la rotura bicatenaria (DSB). La unión no específica de TALEN en ubicaciones aleatorias no crea ninguna DSB. Por lo tanto, el efecto fuera del objetivo de las construcciones TALEN es mínimo. Ésta es una de las principales ventajas del método de la presente descripción y se verifica mediante el análisis de datos de secuencias grandes.
1.3 - El procedimiento completo de obtención de la construcción TALEN se compone de las siguientes etapas: 1. Diseño de TALEN.
2. Diseño de cebadores.
3. Síntesis de oligonucleótidos.
4. Transformación de construcciones TALEN (pcDNA3.1+TAL6_Izquierda y pcDNA3.1+TAL6_Derecha) en placa de LB (caldo Luria) ampicilina.
5. Inoculación de células transformadas (construcciones TALEN) en caldo LB con ampicilina.
6. Aislamiento de ADN plasmídico pcDNA3.1+TAL6_Izquierda y pcDNA3.1+TAL6_Derecha de células DH10B o DH5alfa.
7. T ransfección en células CHOK1; cribado y selección por ensayo de LCA.
8. Aislamiento de ADN genómico de clones seleccionados usando el kit de sangre y tejido DNeasy de QIAGEN. 9. Cuantificación por espectrofotometría.
10. Optimización de las condiciones de PCR.
11. Comprobación cruzada de la muestra de ADN genómico por PCR.
12. Electroforesis en gel de agarosa.
13. Amplificación por PCR usando polimerasa Phusion y formación de cola usando polimerasa Taq.
14. Elución en gel del producto de PCR usando el kit de QIAGEN.
15. Clonación TA usando el vector pTZ57R/T.
16. Transformación de la muestra ligada pTZ57R/T+TAL(PCR) en células DH10B o DH5alfa.
17. Inoculación de células transformadas (pTZ57R/T+TAL(PCR)) en caldo LB con ampicilina.
18. Aislamiento de ADN plasmídico (pTZ57R/T+TAL(PCR) de células DH5alfa y DH10B usando el kit de aislamiento de ADN plasmídico de QIAGEN.
19. Comprobación cruzada de la presencia de inserto por digestión de restricción (sitios).
20. Cebadores de secuenciación; y
21. Confirmación de los INDEL por secuenciación.
La Figura 1 de la presente descripción representa la secuencia que codifica Fut8 y la secuencia de la proteína. La secuencia genómica de FUT8 se analiza a partir de la secuencia de la base de datos, secuencia ID NW_003613860. La secuencia genómica de FUT8 abarca desde las bases 570171 - 731804 y contiene once exones representados como E1 a E11 en la figura. También se indican las ubicaciones de los pares de bases para cada exón. E1, E2 y parte de E3 constituyen la región no traducida en la secuencia cadena arriba, y parte de E11 también es parte de la región no traducida. Las regiones traducidas se describen como CDS 1 a CDS 9. La longitud de cada CDS se indica debajo del número de CDS. CDS 1 a CDS9 codifican para secuencias de aminoácidos que varían de 38 aminoácidos a 105 aminoácidos. En esta figura, CDS7 indicada por un círculo negro es el objetivo para la modificación de aminoácidos mediante construcciones TALEN. CDS7 corresponde al exón 9 en el locus genómico.
El ARNm de fucosiltransferasa 8 (Fut8) de Cricetulus griseus o de hámster chino (3126 pb) se proporciona a continuación. También está representado por la SEQ ID No. 40 de la presente descripción. Secuencia de referencia NCBI: XM 003501735.1
CAGGTTGCTGCTCTGGCTTAGGCCATCTATGACCCTGGTGGTGTTTTCATTCACTATAAGTCCTT C C C A TC TTrTArTrTAACTGAGCAAGTTCAGctagtaaltttagiigciccgaggttcaagcaaímicücctatctctgcrwtaccgtgtggcm curníii^h <í Y íi/Lí,!;cfíl'ííf, L'"!k(i"CATGTAGAGCC'CAGGAAGCACA GGACAAGAAAGCTGCCTCCTTGT ATCACCAGGAAGATCTTTTTGTAAGAGTCATCACAGTATACCAGAGAGACTAATTTTGTCTGAAG CATCATGTGTTGAAACAACAGAAACTTATTTTCCTGTGTGGCTAACTAGAACCAGAGTACAATGT TTCCAATTCTTTGAGCTCCGAGAAGACAGAAGGGAGTTGAAACTCTGAAAATGCGGGCATGGAC TGG TTCCTGGCGTTGGATTATGCTCATTCTTTTTGCCTGGGGGACCTTATTGTTTTATATAGGTG GTCATTTGGTTCGAGATAATGACCACCCTGACCATTCTAGCAGAGAACTCTCCAAGATTCTTGCA AAGCTGGAGCGCTTAAAACAACAAAATGAAGACTTGAGGAGAATGGCTGAGTCTCTCCGíMfaíí fíg aaggccctattgatcaggggacagctacaggaagagtccgtgttttagaagaacagcttgttaaggccaaagaacagattgaaaattacaagaaacaagctagg íitíígATCTGGGAAAGGATCATGAAATCTTAAGGAGGAGGATTGAAAATGGAGCTAAAGAGCTCTG GTTTTTTCTACAAAGTGAATTGAAGAAATTAAAGAAATTAGAAGGAAACGAACTCCAAAGACATG
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Los exones alternativos se representan en letras mayúsculas y minúsculas.
Los restos de aminoácidos en las posiciones Arg 365, Arg 366, Asp-368, Lys-369, Glu-373, Tyr-382, Asp-409, Asp-410, Asp-453 y Ser-469 juegan un papel importante en el dominio catalítico de la enzima FUT8. Por lo tanto, en el método de la presente descripción, las mutaciones de INDEL (inserción/deleción) y las mutaciones de cambio de marco en las posiciones de los aminoácidos Arg 365, Arg 366, Asp-368, Lys-369 y Glu-373 se introducen mediante TALEN para alterar la función enzimática de FUT8.
El diseño de TALEN se dirige a las posiciones de aminoácidos objetivo principales Arg 365, Arg 366, Asp-368, Lys-369 y Glu-373, ya que estos aminoácidos son críticos para la funcionalidad de la enzima FUT8. Las cuatro posiciones de aminoácidos restantes Tyr-382, Asp-409, Asp-410, Asp-453 y Ser-469 están cadena abajo del potencial sitio de rotura de la doble cadena entre las dos secuencias de unión de TALEN. Cualquier deleción o inserción o cualquier otra modificación afecta a estos aminoácidos y da como resultado una enzima FUT8 no funcional. En una realización de la presente descripción, el análisis de ADN genómico posterior de las líneas celulares CHOK1 modificadas pone de manifiesto mutaciones de deleción, inserción, codón de terminación así como de cambio de marco. Por lo tanto, la presente descripción prevé la alteración del gen Fut8 y la enzima fucosiltransferasa dirigiéndose a las posiciones de los aminoácidos Arg 365, Arg 366, Asp-368, Lys-369, Glu-373, Tyr-382, Asp-409, Asp-410, Asp-453, y Ser-469 de la proteína enzimática, directa o indirectamente.
La Figura 2 de la presente descripción representa la secuencia de aminoácidos de Fut8 de CHOK1. También se representan las posiciones de aminoácidos alteradas por el método de la presente descripción. Se proporciona la secuencia de aminoácidos completa del gen FUT8. La secuencia de aminoácidos de cada CDS se indica con puntas de flecha grandes. Las flechas pequeñas indican aminoácidos críticos presentes en CDS7 a los que se dirigen las construcciones TALEN en el gen Fut8.
La secuencia de ADN del exón-9 (CDS-7) está representada por la SEQ ID No. 1 de la presente descripción.
La secuencia de aminoácidos del exón-9 (CDS-7) de Fut8 de la célula CHO está representada por la SEQ ID No. 2 de la presente descripción. Las posiciones de los aminoácidos que son objetivo en la secuencia de proteína/péptido están subrayadas.
VHVRRTDKVGTEAAFHPIEEYMVHVEEHFOLLERRMKVDKKRVYLATDDPSLLK
EAKT
Las regiones del gen Fut8 que son objetivo en el procedimiento en el que se desarrollan los seis diseños para las construcciones de TALEN se proporcionan a continuación.
1.4 - Secuencia de interés a la que dirigirse usando TALEN
Par TAL 1: TALEN 1L y 1R
cgaaagtacatagtgaaaccagaatattaaatagtgttcatctcctcagacttcattgaaattcagtgtggcacattctccctgcctcacttcatttgtatagaacacacggaac aagtccaatttcctgagagaaacagrgattaagaggaargtaggaaagaaaagatgactgcatagtraticctgtggtcaaatccacaactggactatagtctgggargcaa uggaaacaglagcatgaaggLggeaeugUaccecaglglgL-lacagecclgactceagaUcaagucHlaaLX'clglcttlggcaat’ai:laHgalgt.’uggugagLgcLg ggaagtcagtgacttggccattgcaggtcagtgtaagtctgtattccttgctttataacattgtgacttttcttcaaaatgagaaaatgaggtctgtttctgtttgcagttgataga gaaaaaaaatgcaaaaaaagtclglaglaactlcatgaacataaaalaaccaacalcUtaaaaggctaguUglcUaaactacaggaaaiigttcatatggalcLUgUllcU agalgacUlaaaUclalgaaclgaaglgglaglaactUacaggglaaaatgaaagaaaaaaaUaataaacUlggcaíaagaalgtlacaagcaUatctUaagclUgaa ILclgUalgallllggtclcaaaaact.'aaaaaacUaaatclgUgaUccaggUcccalataltcUggalaLgccaallaclUUctgtaagcaaglglÜcalaaaacUUacU aactttcatattgacctgcactattcaacattcagctatgttaaagtatttgtgaagtgttttgaaatgattnatattttctaaggcgagaataaatgagaaaatgttttaatatgtctc caglgCLXX-calgaclagggatactaattgaglaccaglacallalcaglgtguU¿iccacIlclvu£cagAGTCGATGTCAGACGCACTGA
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Intrones - de base 1 a base 1000 y base 1178 a base 2177 se representan en minúsculas. Exón 9 - de base 1001 a bases 1177 se representa en mayúsculas. La secuencia de interés a la que dirigirse en la región del exón se representa en negrita, en particular AGA, CGC, GAC, AAA y GAA. Los sitios de unión de TALEN izquierda y derecha están subrayados.
La presente descripción proporciona TALEN para deleción/mutación en cualquier posición de aminoácido de la región del exón 9. Las construcciones TALEN de la presente descripción, en cualquier combinación de dos o más proteínas TALEN, proporcionan una mutación específica de la región del exón 9 del gen Fut8.
Esta secuencia completa de 2177 bases, compuesta de Exón 9 y dos intrones circundantes de 1000 bases cada uno, está representada por la SEQ ID No. 3 de la presente descripción. Los diseños de TALEN para TAL 2L/2R to TAL 6L/6R también se representan usando SEQ ID No. 3.
Par TAL 2: TAL2L y TAL 2R cgaaagtacatagtgaaaccagaatattaaatagtgttcatctcctcagacttcattgaaattcagtgtggcacattctccctgcctcacttcatttgtatagaacacacggaac aagtccnatttcctgagagaaacagrgattaagaggaargtaggaaagaaaagatgactgcatagtrattcctgtggtcaaatccacaactggactatagtctgggargcaa aggaaacaglagcatgaagglggcacagltaccccaglglgL-lacagccclgactccagaUcaagacalaaccclglcUlggcíUK.’actaagalgeaggagaglgclg ggaagtcagtgacttggccattgcaggtcagtgtaagtctgtattccttgctttataacattgtgacttttcttcaaaatgagaaaatgaggtctgtttctgtttgcagttgataga gaaaaaaaatgcaaaaaaagtctgtagtaacttcatgaacataaaataaccaacatctttaaaaggctagcttgtcttaaactacaggaaaagttcatatggatctttgttttctt agatgactttaaattctatgaactgaagtggtagtaactttacagggtaaaatgaaagaaaaaaattaataaactttggcataagaatgttacaagcattatctttaagctttgaa ItetgttalgallUggtcteaaaaaccaaaaaacUaaatclgUgaltccaggUcecatataltcUggatatgceaallaclUUetgtaagcaiiglgtÜcalaaaactlUaclt aactttcatattgacctgtactattcaacattcagcíatgttaaagtatttgtgaagtgttttgaaatgattttatattttctaaggtgagaataaatgagaaaatgttttaatatgtctc caglgcececiUgaclagggataclaaUgaglaeeaglacaltaleaglgtgL’tctceaeltcleeeuagAG TCCATG TCAG ACG CACTG A
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Intrones - de base 1 a base 1000 y de base 1178 a base 2177 se representan en minúsculas. Exón 9 - de base 1001 a base 1177 se representa en mayúsculas. La secuencia de interés a la que dirigirse en las regiones del exón se representa en letras en negrita, en particular AGA, CGC, GAC, AAA y GAA. Los sitios de unión de TALEN izquierda y derecha están subrayados.
Par TAL 3: TAL3L y TAL 3R cgaaagtacatagtgaaaccagaatattaaatagtgttcatctcctcagacttcattgaaattcagtgtggcacattctccctgcctcacttcatttgtatagaacacacggaac aaglccaaUl(xlgaguguaacagtgaUaagagguatglaggaaagaaaugalgactgc;UagUaUi.'i.'lglgglcaaul(xai'uactggu(;UUagti'lggg;Ug<;au aggaaacagtagcatgaaggtggcacagttaccccagtgtgctacagccctgactccagattcaagacataaccctgtctttggcaacactaagatgcaggagagtgctg ggaagtcagtgacttggccattgcaggtcagtgtaagtctgtanccttgcntataacangtgacnrtctrcaaaatgaganaatgaggtctgntctgtrtgcagngataga gaaaaaaaaCgcaaaaaaaglelglagtaacllcalgaacalaaaalaaLX'aaealcCllaaaaggclagcUgteUaaaelaeaggiiaaagUealaCggalclUgUUclt agalgacUlaaaUclalgaaclgaaglgglaglaaelUacaggglaaaalgaaagaaaaaaaUaalaaaclUggcalaagaalgUacaagcattalclUaagcUlgaa ttctgttatgatttrggrctcaaaaaccaaaaaacttaaatctgttgattccaggttcccatatattcttggatatgccaattactttttctgraagcaagtgtttcataaaacttttactt aaclucatailgacclgtaGlallcaacattGagctalgilaaaglalUgtgaaglgttttgaaalgaUUataUttciaagglgagaaiaaalgagaaaatgUUaalatglclc cagtgcccccatgactagggatactaattgagtaccagtacattatcagtgtgctctccacttctccccagAGTCCATGTCAGACXrCACTGA
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Intrones - de base 1 a base 1000 y de base 1178 a base 2177 se representan en minúsculas. Exón 9 - de base 1001 a base 1177 se representa en mayúsculas. La secuencia de interés a la que dirigirse en la región del exón 9 está en negrita, en particular AGA, CGC, GAC, AAA y GAA. Los sitios de unión de TALEN izquierda y derecha están subrayados.
Par 4 de TAL: TAL4L y TAL 4R cgaaagtacatagtgaaaccagaatattaaatagtgttcatctcctcagacttcattgaaattcagtgtggcacattctccctgcctcacttcatttgtatagíiacacacggíiac aagtccaatttcctgagagaaacagtgattaagaggaatgtaggaaagaaaagatgactgcatagttattcctgtggtcaaatccacaactggactatagtctgggatgcaa aggaaacagtagcatgaaggtggcacagttaccccagtgtgctacagccctgactccagattcaagacataaccctgtctttggcaacactaagatgcaggagagtgctg ggaaglcaglgaciLggccaugeagglcagLglaagteLglaUectlgcülaLaacaüglgacilUcttcaaaatgagaaaalgaggtclgUlcLgUtgcagtlgataga gaaaaaaaatgcaaaaaaagtctgtagtaacttcatgaacataaaataaccaacatctttaaaaggctagcttgtcttaaactacaggaaaagttcatatggatctttgttttctt agalgacUlaaaUclalgaaclgaaglgglaglaactUacaggglaaaatgaaagaaaaaaaUaataaacUlggcataagaalgUaL’aagcaUatctUaagclUgaa llelglLalgaUUggLeli'aaaaaeeaaaaaaeLlaaatelgUgaUecaggUeiTalaLaltatggaUilgeeaHllaauUclgtaageaaglglUealaaaaeUUac’U aaclucataLlgacctgiaetaUcaacaUcagclatgUaaagLaUlglgaagLgUUgaaatgalUtalalluclaaggigagaaiaaatgagaaiiatgllltaalaigtclc cagljJciTccal^üclagagatailaaU üaglai^aglacallülcaalgtgclcccüacltclccccü^AGTCCAT G T C A G A C G C A C T G A
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Intrones - de base 1 a base 1000 y de base 1178 a base 2177 se representan en minúsculas. Exón 9 - de base 1001 a base 1177 se representa en mayúsculas. Los sitios de unión de TALEN izquierda y derecha están subrayados. La secuencia de interés a la que dirigirse en la región del exón 9 es en particular AGA, CGC, GAC, AAA y GAA.
TAL par 5: TAL5L y TAL 5R cgaaagtacatagtgaaaccagaatattaaatagtgttcatctcctcagacttcattgaaattcagtgtggcacattctccctgcctcacttcatttgtatagaacacacggaac aagtccaatttcctgagagaaacagtgattaagaggaatgtaggaaagaaaagatgactgcatagttattcctgtggtcaaatccacaactggactatagtctgggatgcaa aggaaacagtagcalgaaggtggcacagttai.-ccL-agtglgt.lacagccctgafU.-L-agatU.-aagacataaccclglctUggcaaca(.-laagalgcaggagagtgclg ggaagleaglgacUggccaUgL-aggtL-agtglaüglclglulkxUgcULalaacaUgtgacUttcUcaaaatgagaaaalgagglcIgULcIgUtgi-agUgutaga gaaaaaaaatgcaaaaaaaglclglaglaaL'ÜL'algaaL'ulaaaalaacL'aat:altlUaaaaggclagfUglL'UaaaclacaggaaaagUfalalggalcUlglUU:U agatgaetttaaanctatgaactgaagtggtagtaacttracagggtaaaatgaaagaaaaaaattaataaactttggcataagaatgttacaagcattatctttaagctttgaa UclgUalgaUtcggtclcaaaaaccaaaaaacUaaalclgltgattccaggtlcccataíalk'UggalalgccaallacUUtclglaagcaaglgUtcalaaaacUltacU aactttcatattgacctgtactattcaacattcagctatgttaaagtatttgtgaagtgttttgaaatgattttatattttctaaggtgagaataaatgagaaaatgttttaatatgtctc cagt&cccccateactaagaatactaattgagtaccaetacattatcaatgtactctccacttctccccaaA G TCC A TG TC A G A C G C A C T G A
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Intrón - de base 1 a base 1000 y de base 1178 a base 2177 se representa en minúsculas. Exón 9- de base 1001 a base 1177 se representa en mayúsculas. Los sitios de unión de TALEN izquierda y derecha están subrayados. La secuencia de interés a la que dirigirse en la región del exón 9 es en particular AGA, CGC, GAC, AAA y GAA.
Par Tal 6: TAL6L y TAL 6R
cgaaagtacatagtgaaaccagaatattaaatagtgttcatctcctcagacttcattgaaattcagtgtggcacattctccctgcctcacttcatttgtatagíiacacacggíiac aagtceaantcctgagngaaacagtganaagaggaatgtaggaaagaaaagatgaclgcaiagltattcctgtggtcaaatccacaaclggactaiaglclgggatgeaa íiggaaacaglugcatgaagglggcacíigltaccccaglglgL-laoagccclguclccagaUcaagíu.'alaaL’cclglcttlggcaatatLaagalgi.-iiggagaglgclg ggaagtcagtgacttggccattgcaggtcagtgtaagtctgtattccttgctttataacattgtgacttttcUcaaaatgagaaaatgaggtctgtttctgtttgcagttgataga gaaaaaaaatgcaaaaaaagtclglaglaacttcatgaacataaaalaaccaaaalclttaaaaggctagattgtcUaaautacaggaaaagttcalatggalcLUglUtcU agatgactttaaattctatgaactgaagtggtagtaactttacagggtaaaatgaaagaaaaaaattaataaactttggcataagaatgttacaagcattatctttaagctttgaa UctgUalgaltUggtctcaaaaaccaaaiiaactlaaatctgUgaUccaggltcccatalaltcUggataLgccaallaclUUctgtaagcaaglgtücalaaaacUUacU aactttcatattgacctgtactattcaacattcagctatgttaaagtatttgtgaagtgttttgaaatgattttatattttctaaggtgagaataaatgagaaaatgttttaatatgtctc
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Intrones - de base 1 a base 1000 y de base 1178 a base 2177 se representan en minúsculas. Exón 9- de base 1001 a base 1177 se representa en mayúsculas. Los sitios de unión de TALEN izquierda y derecha están subrayados. La secuencia de interés a la que dirigirse en la región del exón es en particular AGA, CGC, GAC, AAA y GAA.
El estudio de la secuencia genómica de FUT8 pone de manifiesto la secuencia de intrones y exones alrededor del exón 9. El exón 9 es un exón pequeño que abarca más de 177 pb y contiene las siete posiciones críticas de aminoácidos necesarias para la función enzimática de FUT8. Este exón codifica el dominio catalítico crítico de la enzima. La secuencia del exón 9 permite sólo unos pocos diseños de dominios de unión al ADN de TALEN que flanquean adecuadamente las posiciones de los aminoácidos objetivo.
Los diseños 1 a 6 son los mejores diseños posibles en la secuencia del exón 9. Entre estos diseños, TAL1 está secuencia arriba de las posiciones de aminoácidos objetivo, mientras que los diseños TAL2 y TAL3 están secuencia abajo de los aminoácidos objetivo. El método de la presente descripción crea dos dominios de unión al ADN que flanquean todas las posiciones de aminoácidos objetivo o el máximo o las más importantes.
Todas las construcciones de pares TALEN TAL1L-1R a TAL6L-6R se analizan para determinar la alteración del gen Fut8 y se describe la alteración satisfactoria del gen Fut8 y la actividad enzimática resultante.
• Entre estas, TAL6 se selecciona para estudios adicionales como un ejemplo, ya que se dirige a las mutaciones más estudiadas en la funcionalidad de la enzima FUT 8, las posiciones Arg 365, Arg 366, Asp-368, Lys-369, Glu-373.
Sin embargo, hay que indicar que todos los pares de TAL proporcionados en la presente descripción, es decir, TAL 1 a TAL 6, proporcionan una alteración eficaz del gen Fut8 en la presente descripción.
Par TAL 6: sitio de unión de TALEN
TGTGCTCTCCACTTCTCCCCAGAGTCCATGTCAG/tCGCACTGACAAAGTGGGAACAG
AAGCAGCCTTCCATCC
En la secuencia génica de Fut8 proporcionada antes, el sitio de unión de TALEN izquierda está subrayado y representado como SEQ ID No. 4 y el sitio de unión de TALEN derecha está en negrita y representado como SEQ ID No. 5. Las construcciones TALEN están diseñadas para reconocer las secuencias mencionadas anteriormente. En cursiva están los nucleótidos que codifican la región que se va a mutar por el método de la presente descripción.
1.5 - Síntesis de TALEN de GeneArt
La construcción pcDNA3.1-TALEN_L6 está representada por la Figura 3 de la presente descripción. La construcción pcDNA3.1-TALEN_R6 está representada por la Figura 4 de la presente descripción.
Las construcciones TALEN consisten en dos partes, el dominio de unión al ADN y el dominio de nucleasa. El dominio de unión al ADN también tiene 2 dominios - el dominio TAL que identifica la secuencia a la izquierda del objetivo de rotura de la doble cadena (DSB) se denomina TAL-L y el dominio TAL que identifica la secuencia a la derecha del objetivo de DSB se denomina TAL-R. Tanto los dominios TAL-L como TAL-R se expresan como proteína de fusión con dominio de nucleasa Fok1.
En este ejemplo, se explica la construcción de TAL-L6 y TAL-R6. Sin embargo, los datos se proporcionan a modo de ejemplo y son aplicables a otros pares TAL.
Construcción de construcciones TAL-L6:
El TAL-L6 sintético se ensambla a partir de oligonucleótidos sintéticos y/o productos de PCR. El fragmento se clona en TALtrunc_FokI usando subfragmentos de secuencia 100% verificada. El ADN plasmídico resultante se purifica a partir de bacterias transformadas y se cuantifica por espectroscopía UV. La construcción final se confirma por secuenciación.
La secuencia de unión de TAL-L6 para el diseño de TALEN 6 es 5' TCCACTTCTCCCCAGAGTC 3' que corresponde a RVD (T)-HD-HD-NI-HD-NG-NG-HD-NG-HD-HD-HD-HD-NI-NN-NI-NN-NG-HD, donde '(T)' indica que el vector proporciona la primera repetición de unión.
La Figura 3 describe el ADN de TAL-L6 clonado en la cadena principal del vector pcDNA3.1 para la expresión en eucariotas. Las construcciones TALEN se diseñan en dos partes. La construcción descrita en esta figura identifica la secuencia de ADN genómico a la izquierda del objetivo de rotura de la doble cadena (DSB) y se denomina TAL-L6. El gen sintético de TAL_L6 se ensambla a partir de oligonucleótidos sintéticos y/o productos de PCR. El fragmento se clona en TALtrunc_FokI usando subfragmentos de secuencia 100% verificada. El marco de lectura de la secuencia de TAL -L6 completa que incluye la secuencia de Kozak se clona en los sitios de restricción NotI y HindIII. El ADN plasmídico se purifica a partir de bacterias transformadas y se determina la concentración por espectroscopía UV. La construcción final se verifica por secuenciación. La congruencia de secuencia dentro de los sitios de restricción usados es de 100%. El casete de TAL_L6 se clona en pcDNA3.1 (+)A009 con el promotor de CMV. La construcción contiene el gen de resistencia a neomicina para la selección en eucariotas.
Secuencia de aminoácidos de TAL-L6
Secuencia de aminoácidos de RVD - (T)-HD-HD-NI-HD-NG-NG-HD-NG-HD-HD-HD-HD-NI-NN-NI-NN-NG-HD. También se proporciona en SEQ ID No. 6 de la presente descripción.
La secuencia de TAL-L6 (secuencia de nucleótidos) se representa por la SEQ ID No. 7 de la presente descripción.
Construcción de construcciones TAL-R6:
El TAL-R6 sintético se ensambla a partir de oligonucleótidos sintéticos y/o productos de PCR. El fragmento se clona en TALtrunc_FokI usando subfragmentos de secuencia100% verificada. El ADN plasmídico resultante se purifica a partir de bacterias transformadas y se cuantifica por espectroscopía UV. La construcción final se confirma por secuenciación.
La secuencia de unión de TAL-R6 es 5'-TGCTTCTGTTCCCACTTTG-3' que corresponde a RVD (T)-NN-HD-NG-NG-HD-NG-NN-NG-NG-HD-HD-HD-NI-HD-NG-NG-NG-NN, donde '(T)' indica que el vector proporciona la primera repetición de unión.
La Figura 4 describe el ADN de TAL-R6 clonado en la cadena principal del vector pcDNA3.1 para expresión en eucariotas. Las construcciones TALEN se diseñan en dos partes. La construcción descrita en esta figura identifica la secuencia de ADN genómico a la derecha del objetivo de rotura de la doble cadena (DSB) y se denomina TAL-R6. El gen sintético de TAL-R6 se ensambla a partir de oligonucleótidos sintéticos y/o productos de PCR. El fragmento se clona en TALtrunc_FokI usando subfragmentos de secuencia 100% verificada. El marco de lectura de la secuencia de TAL -R6 completo que incluye la secuencia de Kozak se clona en los sitios de restricción NotI y HindIII. El casete completo se representa como un fragmento TAL_R6 con enzimas de restricción que flanquean NotI y HindIII. El ADN plasmídico se purifica a partir de bacterias transformadas y se determina la concentración por espectroscopía UV. La construcción final se verifica por secuenciación. La congruencia de secuencia dentro de los sitios de restricción usados es de 100%. El casete de TAL_R6 se clona en pcDNA3.1 (+) _ A009 con el promotor de CMV. La construcción contiene el gen de resistencia a neomicina para la selección en eucariotas.
La secuencia de aminoácidos de TAL-R6 está representada por la SEQ ID No. 8 de la presente descripción.
Secuencia de aminoácidos de RVD: (T)-NN-HD-NG-NG-HD-NG-NN-NG-NG-HD-HD-HD-NI-HD-NG-NG-NG-NN La secuencia de nucleótidos de TAL-R6 está representada por la SEQ ID No. 9 de la presente descripción.
La construcción pcDNA3.1-TALEN_L6 está representado por la Figura 3 de la presente descripción. La construcción pcDNA3.1-TALEN_R6 está representada por la Figura 4 de la presente descripción.
EJEMPLO 2: TRANSFECCIÓN DE CÉLULAS CON CONSTRUCCIONES TALEN
Este ejemplo contiene el procedimiento para la transfección de células CHOK1 con construcciones TALEN. También proporciona la selección y confirmación de líneas celulares estables de células individuales para desarrollar la línea celular CHOK1 con inactivación de FUT8 usando tecnología TALEN, y la selección de clones positivos por ensayo funcional basado en citometría de flujo.
Protocolo de transfección
La transfección se optimiza usando células CHOK1, tanto de tipo adherentes como en suspensión. Los reactivos de transfección mediada por liposomas y liposomas modificados se ensayan para, p. ej., reactivo Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000, Lipofectamine lTx con Plus™, kit de transfección de CHOK1 MIRUS TransIT, MIRUS TransIT x 2, MIRUS TransIT 2020, MIRUS TransIT 293. Se ensaya la concentración de ADN en el intervalo de 0,5 pg a 5 pg para varios tiempos de incubación, p. ej., 4 h, 24 h y 48 h. También se ensayan múltiples relaciones de ADN a reactivo de transfección (pg:pl). La eficiencia de transfección óptima se logra usando la relación de ADN a reactivo de transfección 1:5, incubación de 24 horas y el reactivo Lipofectamine LTX con Plus™. Los experimentos de optimización se llevan a cabo con proteína de fluorescencia roja (RFP) que expresa el ADN plasmídico.
La Figura 25 representa la eficiencia de transfección de la línea celular CHOK1 usando el protocolo descrito en la descripción. La eficacia de la transfección se determina usando una construcción de plásmido que expresa la proteína roja fluorescente. El número de células rojas observado después de la transfección en comparación con el número total de células viables determina la eficacia de transfección del protocolo establecido. El panel A representa la imagen de campo brillante y el panel B representa el mismo campo microscópico para la fluorescencia del canal rojo.
La eficiencia de la transfección se calcula por la siguiente fórmula:
Eficiencia de la transfección = (Número de células que expresan RFP/Número total de células)*100
La eficiencia de transfección transitoria optimizada es de aproximadamente 40-50% en células CHOK1. El proceso de transfección optimizado se usa para todas las transfecciones de construcciones TALEN en células CHOK1 en los siguientes ejemplos.
Transfección de TALEN de células CHOK1:
2.1 Transfección:
Las células CHOK1 se siembran con viabilidad de más de 90% y una densidad de 0,25 x 106 células/pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos y se deja que se adhieran durante 4 h. Las construcciones pcDNA3.1-TALEN_L6 y pcDNA3.1-TALEN_R6 se transfectan usando el reactivo Lipofectamine LTX con Plus™. Se usan 2,5 pg de cada construcción de ADN con una relación de ADN a reactivo de transfección de 1:5. Las células se incuban durante 20-24 horas después de la transfección. Antes de la transfección, se calcula la cantidad y calidad del ADN por espectrofotometría UV. El valor de A260/280 del ADN representa la calidad y la contaminación de proteínas. La relación de absorbancia a 260 nm y 280 nm se usa para evaluar la pureza del a Dn . A260/280 >1,8 se acepta en general como ADN "puro" o de buena calidad. Se ponen 3-4 pl de muestra de ADN en la microcubeta y se calcula la concentración de ADN usando el Biophotometer D30 de Eppendorf contra un blanco adecuado.
Dilución de ADN de TALEN:
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Dilución de Lipofectamine LTX:
Figure imgf000029_0001
Se proporciona cambio de medio a las células con medio exento de suero, 1 hora antes de la transfección,. Las construcciones TALEN y la solución de Lipofectamine LTX se diluyen, se mezclan suavemente y se incuban durante 10 minutos a 20-25°C. Se mezclan diluciones del ADN y reactivo de transfección (3 ml) y se incuban durante 30 minutos de 20°C a 25°C para la formación del complejo. Se aspira el medio de los pocillos. Se añaden gota a gota 1,5 ml de complejo de ADN y reactivo de transfección a las células en placa. Las células se incuban durante 4 horas a 37°C en una incubadora con CO2 al 5%. El medio completo se añade en 1,5 ml/pocillo y se incuba durante 20-24 horas a 37°C en una incubadora con CO2 al 5%. Después de 20-24 horas de transfección, las células se tripsinizan y le sigue la dilución de células individuales.
La dilución de células individuales se obtiene por dilución seriada de las células a una concentración de 0,5 células/100 pl. El recuento celular se hace con un hemocitómetro. Después de la optimización del procedimiento, las células CHOK1 se siembran a una densidad de 0,5 células/100 pl/pocillo y muestran un buen rendimiento de colonias de células individuales. Se deja que las células crezcan durante unos días a 37°C en una incubadora de CO2 al 5%. Se hace barrido de las placas para identificar colonias de células individuales bajo el microscopio de contraste de fase invertido. Las células que crecen claramente en colonias individuales pequeñas se marcan para una posterior amplificación. Después de 2-3 semanas, los clones de células individuales se amplifican de un pocillo de una placa de 96 pocillos a un pocillo de una placa de 6 pocillos por tripsinización. Se deja que las células crezcan durante 2-3 días a 37°C con 5% de CO2 en una incubadora con CO2. Las células se amplifican adicionalmente de un pocillo a dos pocillos en una placa de 24 pocillos (placa de réplica) para su posterior cribado.
2.2 - Ensayo de LCA (Aglutinina de Lens Culinaris) - Conjunto 1
Este es un ensayo funcional para cribar clones con proteínas de membrana afucosiladas. La fucosilación es un proceso bioquímico integral para muchas proteínas celulares, y muchas de ellas son proteínas de membrana. La aglutinina de Lens Culinaris (LCA) es una lectina que se une preferentemente a cualquier proteína fucosilada.
Para las células que expresan una proteína de membrana fucosilada, la LCA es reconocida e internalizada y actúa como un agente citotóxico. Como resultado, las células con proteínas de membrana fucosiladas se vuelven redondeadas y finalmente mueren dependiendo de la concentración de LCA. Por otro lado, las células con proteínas de membrana no fucosiladas sobreviven y mantienen la morfología de la colonia incluso en presencia de concentración alta de LCA. Basándose en esta propiedad, las células se clasifican rápidamente en fenotipo con inactivación de FUT8 o de tipo natural. Se lleva a cabo la optimización de la curva de destrucción por LCA y se usan 200 pg/ml de reactivo LCA para la selección basada en LCA. Después de la réplica en placa, se retiene un conjunto como placa maestra y se añaden 200 pg/ml de LCA a los clones en la placa de réplica. Se ensaya en 50 clones la resistencia a la LCA. Se realiza una observación microscópica diaria y se identifican y ensayan los clones que mantienen la morfología de la colonia para la confirmación adicional de las células con inactivación de FUT8.
2.3 Ensayo de unión de LCA-FITC (Aglutinina de Lens Culinaris-Isotiocianato de fluoresceína)
El isotiocianato de fluoresceína (FITC) es un fluorocromo conjugado con LCA. Por tanto, la presencia de proteínas fucosiladas en la membrana celular de las células CHOK1 de control es reconocida por la LCA conjugada con fluoresceína. Estas células presentan fluorescencia más brillante en un canal del citómetro de flujo específico. La fluorescencia observada se representa como unidad relativa de fluorescencia (RFU). Las células en las que la ruta de la fucosa está alterada, las líneas celulares no pueden producir proteínas celulares fucosiladas y, por lo tanto, las proteínas de la membrana celular no están fucosiladas. El ensayo de estas células con el conjugado de fluoresceína-LCA da como resultado una fluorescencia comparable a la de fondo. Por lo tanto, las células con inactivación de fucosa presentan fluorescencia a un nivel mucho más bajo (menos de 100 RFU) en comparación con la línea celular CHOK1 de control.
Las células CHOK1 transfectadas y las células CHOK1 de control no transfectadas se tripsinizan, se transfieren a un tubo de microcentrífuga y se centrifugan a 1500 rpm (revoluciones por minuto) durante 5 minutos usando la centrifuga Minispin de Eppendorf. Se retira el medio y se añade medio de nueva aportación a los tubos. Tanto las células CHOK1 transfectadas como las no transfectadas se procesan simultáneamente. Las células se ensayan por el análisis basado en citometría de flujo de LCA-FITC usando el citómetro de flujo de sobremesa "Millipore GUAVA 8 easyCyte HT". Se criban 4 clones para el perfil de inactivación de Fut8: TAL R4 #003, TAL R4 #013, TAL R4 #023 y TAL R4 #024.
La solución madre de fluoresceína-aglutinina de Lens Culinaris (LCA-FITC) de 5 mg/ml se diluye para obtener una concentración final de 2 pg/ml en tampón de ensayo (DPBS que contiene BSA al 2%). Las células se centrifugan a 1500 rpm durante 5 minutos usando la centrifuga Minispin de Eppendorf. Se aspira el medio y el sedimento se resuspende en 0,25-1 ml de tampón de ensayo que contiene 2 pg/ml de LCA-FITC. Las células de control CHOK1 se resuspenden en 0,25-1 ml de tampón de ensayo solo (control no teñido) y 0,25-1 ml de tampón de ensayo que contiene 2 pg/ml de LCA-FITC (control teñido). Todas las muestras se diluyen para obtener 0,1-0,2 X106 células/ml en el tampón de ensayo final. Después, las muestras se incuban en la oscuridad sobre hielo durante 30 minutos. Después, se ponen partes alícuotas de 200 pl de cada muestra en una placa de 96 pocillos. Después, la placa se carga en el citómetro de flujo de sobremesa Millipore GUAVA easyCyte 8HT para la adquisición y análisis de datos. El análisis de datos se hace usando el software Incyte.
Tabla 5 - Resultados del conjunto 1
Figure imgf000030_0001
La mediana de RFU se refiere al valor mediano de unidades relativas de fluorescencia
Resultados - Durante la selección con LCA de los clones transfectados, las imágenes de los clones el día 1 se ilustra en la figura 5 y las imágenes del día 11 en la figura 6 de la presente descripción. Se observa a partir de estas figuras que los siguientes clones TAL R4 #003, TAL R4 #013, TAL R4 #023 y TAL R4 #024 mantienen la morfología de la colonia incluso después de tratamiento con 200 pg/ml de LCA. Por lo tanto, se considera que estos clones son un potencial fenotipo de inactivación de FUT 8.
La Figura 5 y la Figura 6 representan los resultados del ensayo de selección con aglutinina de Lens Culinaris (LCA). Se separan múltiples poblaciones de líneas celulares clonales de células individuales en placas de réplica después de la transfección con construcciones TALEN. A continuación, estas líneas celulares se ensayan con 200 pg de reactivo LCA en el medio de cultivo. Las células se observan todos los días para confirmar la salud y la morfología de las células y se toman fotografías en los puntos de tiempo adecuados. La figura 5 indica fotografías tomadas después de un día de cultivo después del punto de inicio de la selección con LCA y la figura 6 indica fotografías tomadas después de 11 días de cultivo. Las líneas celulares TAL R4#013, TAL R4#023 y TAL R4#024 indicadas aquí muestran resistencia contra LCA representada por pocas células resistentes el día uno que se han multiplicado y crecido en colonias grandes de células después del día 11 de cultivo en presencia de reactivo LCA.
Los resultados gráficos y el perfil de fluorescencia proporcionados en la tabla anterior también se ilustran en las figuras 7 y 8 de la presente descripción. Las figuras representan el resultado gráfico y el perfil de fluorescencia observado para las líneas de células CHOK1 TAL R4#003, TAL R4#013, TAL R4#023 y TAL R4#024 en el ensayo de unión de LCA-FITC basado en citometría de flujo. Este ensayo de citometría de flujo detecta proteínas fucosiladas presentes en la superficie celular. Por lo tanto, las células CHOK1 de control presentan fluorescencia muy alta ya que están presentes muchas proteínas fucosiladas en la línea de células CHOK1 de control. En los casos en los que las construcciones TALEN pueden alterar el gen FUT8 en líneas celulares transfectadas, la fluorescencia de LCA-FITC se minimiza ya que no hay proteína fucosilada en la superficie de estas líneas celulares. La figura pone de manifiesto la pérdida de fluorescencia significativa cuando se analizan TAL R4#013, TAL R4#023 y TAL R4#024 en este ensayo, lo que indica que estas líneas celulares son líneas de células CHOK1 con inactivación de FUT8.
Se observa a partir de estas figuras que TAL R4#013 muestra un cambio completo en el perfil de unión de LCA-FITC y pone de manifiesto el fenotipo afucosilado esperado. TAL R4#003 muestra aproximadamente 50% de reducción en la unión de LCA-FITC mientras que TAL R4#023 y TAL R4#024 mostraron un perfil de unión similar a la población mixta de células, TAL R4#013 es un potencial clon con inactivación de FUT8. Los clones TAL R4#023 y TAL R4#024 se estudian en generaciones sucesivas para lograr la población clonal.
2.4- Ensayo de selección con LCA (Aglutinina de Lens Culinaris) -
Se realiza un segundo conjunto de selección con LCA para 25 clones. Sólo un clon muestra morfología de colonia resistente a LCA TAL-R4#111. Se observa la morfología celular con microscopio y las observaciones se registran los días 1, 9 y 11. Las células se observan regularmente con el microscopio de contraste de fase invertido y se vigila la morfología de la colonia, que también se ilustra en la figura 9 de la presente descripción.
La Figura 9 ilustra resultados representativos del experimento de microscopía de contraste de fase invertida para estudiar la morfología de colonias de células CHOK1 de control y uno de los clones resistentes a LCA, TAL R4#111 en el ensayo de selección con LCA. Las fotografías tomadas en diferentes puntos de tiempo del ensayo de selección con LCA con 200 pg/ml de LCA muestran claramente que las células CHOK1 de control están completamente muertas el día 9 de cultivo, mientras que el clon TAL R4#111 muestra un crecimiento celular continuo y morfología celular sana incluso después de 11 días de cultivo.
2.5 - Ensayo de unión de LCA-FITC:
Para el segundo conjunto de ensayo de unión de LCA-FITC, se criban los 5 siguientes clones seleccionados: TAL R4#003, TAL R4#013, TAL R4#023, TAL R4#024 y TAL R4#111. La solución madre de fluoresceína-aglutinina de Lens Culinaris (LCA-FITC) de 5 mg/ml se diluye para obtener una concentración final de 2 pg/ml en tampón de ensayo (DPBS que contiene BSA al 2%). Las células se centrifugan a 1500 rpm durante 5 minutos usando la centrifuga Minispin de Eppendorf. Se aspira el medio y el sedimento se resuspende en 0,25-1 ml de tampón de ensayo que contiene 2 pg/ml de LCA-FITC. Las células CHOK1 de control se resuspenden en 0,25-1 ml de tampón de ensayo solo (control no teñido) y 0,25-1 ml de tampón de ensayo que contiene 2 pg/ml de LCA-FITC (control teñido). Todas las muestras se diluyen para obtener 0,1-0,2 X106 células/ml en el tampón de ensayo final. Después, las muestras se incuban en la oscuridad sobre hielo durante 30 minutos. Después, se ponen partes alícuotas de 200 pl de cada muestra en una placa de 96 pocillos. Después, la placa se carga en el citómetro de flujo de sobremesa Millipore GUAVA easyCyte 8HT para la adquisición y análisis de datos. El análisis de datos se hace usando el software Incyte.
Tabla 6 - Resultados del ensayo de citometría de flujo de LCA FITC
Figure imgf000031_0001
Los resultados proporcionados en la tabla anterior también se ilustran en una representación gráfica en la figura 10 y el perfil de fluorescencia en la figura 11 de la presente descripción.
La Figura 10 y la Figura 11 ilustran el resultado gráfico y el perfil de fluorescencia observado para las líneas celulares CHOK1 TAL R4#003, TAL R4#013, TAL R4#023, TAL R4#024 y TAL R4#111 en el ensayo de unión de LCA-FITC basado en citometría de flujo. Las líneas celulares TAL R4#023 y TAL R4#024 se someten a pases durante días adicionales antes de analizarlas en este experimento. Este ensayo de citometría de flujo detecta proteínas fucosiladas presentes en la superficie celular. Por lo tanto, las células CHOK1 de control presentan fluorescencia muy alta puesto que hay muchas proteínas fucosiladas presentes en la línea de células CHOK1 de control. En los casos en los que las construcciones TALEN pueden alterar el gen FUT8 en líneas celulares transfectadas, la fluorescencia de LCA-FITC se minimiza ya que no hay proteína fucosilada en la superficie de estas líneas celulares. La figura pone de manifiesto la pérdida de fluorescencia significativa cuando se analizan TAL R4#013, TAL R4#023, TAL R4#024 y TAL R4#111 en este ensayo, que indica que estas líneas celulares son líneas celulares CHOK1 con inactivación de FUT8.
Dos candidatos potenciales, TAL R4#013 y TAL R4#111 están validados para el fenotipo de inactivación de FUT8 basándose en el cambio en el perfil de fluorescencia. TAL R4#111 es un nuevo clon identificado a partir del segundo conjunto de experimentos. Además, estos datos validan la observación del primer conjunto de experimentos para TAL R4#013. Otros dos clones TAL R4#023 y TAL R4#024 mostraron cambio completo en el perfil de fluorescencia. Las líneas celulares TAL R4#023 y TAL R4#024 han mostrado fenotipo de inactivación de FUT8 después de 8-10 pases en cultivo para lograr la población clonal.
EJEMPLO 3: TRANSFECCIÓN DE CÉLULAS CON CONSTRUCCIONES TALEN Transfección de TALEN con un número elevado de células para mejorar la frecuencia de las células CHOK1 transfectadas con TALEN:
3.1 Transfección
Se siembran células CHOK1 con viabilidad de más de 90% y una densidad de 0,5 x 106 células/pocillo en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos y se dejan que se adhieran durante 4 horas. Las construcciones pcDNA3.1-TALEN_L6 y pcDNA3.1-TALEN_R6 se transfectan usando el reactivo Lipofectamine LTX con Plus™. Se usan 2,5 pg de cada construcción de ADN con una relación de ADN a reactivo de transfección de 1:5. Las células se incuban durante 2024 horas después de la transfección. Antes de la transfección, se calcula la cantidad y calidad del ADN por espectrofotometría UV. El valor de A260/280 del ADN representa la calidad y la contaminación de proteínas. La relación de absorbancia a 260 nm y 280 nm se usa para evaluar la pureza del a Dn . A260/280 >1,8 se acepta en general como ADN "puro" o de buena calidad. Se ponen 3-4 pl de muestra de ADN en la microcubeta y se calcula la concentración de ADN usando el Biophotometer D30 de Eppendorf contra un blanco adecuado.
Dilución de ADN de TALEN:
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000032_0002
Dilución de Lipofectamine LTX:
Figure imgf000032_0003
Se proporciona cambio de medio a las células con medio exento de suero, 1 hora antes de la transfección. El ADN de TALEN y la solución de Lipofectamine LTX se diluyen, se mezclan suavemente y se incuban durante 10 minutos a 20-25°C. Se mezclan las diluciones de ADN y reactivo de transfección (3 ml) y se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente para la formación del complejo. Se aspira el medio de los pocillos. Se añaden gota a gota 1,5 ml de complejo de ADN y reactivo de transfección a las células en placa. Las células se incuban durante 4 horas a 37°C en una incubadora con CO2 al 5%. El medio completo se añade en 1,5 ml/pocillo y se incuba durante 20-24 horas a 37°C en una incubadora con CO2 al 5%. Después de 20-24 horas de transfección, las células se tripsinizan y le sigue la dilución de células individuales.
La dilución de células individuales se obtiene por dilución seriada de las células a una concentración de 0,5 células/100 pl. El recuento celular se hace con un hemocitómetro. Después de la optimización del procedimiento, las células CHOK1 se siembran a una densidad de 0,5 células/100 pl/pocillo y muestran un buen rendimiento de colonias de células individuales. Se deja que las células crezcan durante unos días a 37°C en una incubadora de CO2 al 5%. Se hace barrido de placa para identificar colonias de células individuales bajo el microscopio de contraste de fase invertido. Las células que crecen claramente en colonias individuales pequeñas se marcan para una posterior amplificación. Después de 2-3 semanas, los clones de células individuales se amplifican de un pocillo de una placa de 96 pocillos a un pocillo de una placa de 6 pocillos por tripsinización. Se deja que las células crezcan durante 2-3 días a 37°C con 5% de CO2 en una incubadora con CO2. Las células se amplifican adicionalmente de un pocillo a dos pocillos en una placa de 24 pocillos (placa de réplica) para su posterior cribado.
3.2 - Ensayo de selección con LCA (Aglutinina de Lens Culinaris)
La selección con LCA de los clones se inicia con 200 pg/ml para el clon TAL R5 #1-115. Los siguientes clones han mostrado una morfología de colonias saludables bajo la selección con LCA: TAL R5#007, TAL R5#009, TAL R5#010, TAL R5#016, TAL R5#032, TAL R5#045, TAL R5#047, TAL R5#052, TAL R5#064, TAL R5#066, TAL R5#067, TAL R5#095, TAL R5#099 y TAL R5#114. Las células se observan al microscopio a intervalos regulares hasta el día 11. Estos clones se seleccionan según su fenotipo de resistencia con LCA. Las células se amplifican en 2 pocillos de una placa de 6 pocillos por tripsinización de la placa maestra (placa de réplica) y se dejan crecer durante 6-7 días a 37°C en una incubadora con CO2 al 5%.
3.3- Ensayo de unión de LCA-FITC:
Se lleva a cabo un conjunto separado de ensayo de unión de LCA-FITC con los siguientes 14 clones: TAL R5#007, TAL R5#009, TAL R5#010, TAL R5#016, TAL R5#032, TAL R5#045, TAL R5#047, TAL R5#052, TAL R5#064, TAL R5#066, TAL R5#067, Ta L R5#095, TAL R5#099 y TAL R5#114. La solución madre de fluoresceína-aglutinina de Lens Culinaris (LCA-FITC) de 5 mg/ml se diluye para obtener una concentración final de 2 pg/ml en tampón de ensayo (DPBS que contiene BSA al 2%). Las células se centrifugan a 1500 rpm durante 5 minutos usando una centrífuga Minispin de Eppendorf. Se aspira el medio y el sedimento se resuspende en 0,25 - 1 ml de tampón de ensayo que contiene 2 pg/ml de LCA-FITC. Las células CHOK1 de control se resuspenden en 0,25-1 ml de tampón de ensayo solo (control no teñido) y 0,25-1 ml de tampón de ensayo que contiene 2 pg/ml de LCA-FITC (control teñido). Todas las muestras se diluyen para obtener 0,1-0,2 X106 células/ml en el tampón de ensayo final. A continuación, las muestras se incuban en la oscuridad sobre hielo durante 30 minutos. Después, se ponen partes alícuotas de 200 pl de cada muestra en una placa de 96 pocillos. Después, la placa se carga en el citómetro de flujo de sobremesa Millipore GUAVA easyCyte 8HT para la adquisición y análisis de datos. El análisis de datos se hace mediante el software Incyte.
Tabla 7 - Resultados - conjunto 1
Figure imgf000033_0001
La mediana de RFU se refiere a la mediana del valor de unidades relativas de fluorescencia.
Las Figuras 13 y 14 de la presente descripción ilustran el ensayo de citometría de flujo de LCA y la comparación de los clones mediante el ensayo de LCA-FITC y Strep-FITC, respectivamente. Para los siguientes 8 clones, se observa el fenotipo de inactivación de Fut8, TAL R5#007, t Al R5#010, TAL R5#045, TAL R5#047, TAL R5#066, TAL R5#095, TAL R5#099 y TAL R5#114. En todos estos 8 clones, se observa una reducción significativa de la fluorescencia en comparación con el control y, por lo tanto, esto prueba la ausencia de proteína fucosilada en la superficie celular de los clones. Estos datos proporcionan una prueba funcional de que estas líneas celulares carecen de proteína fucosilada debido a la alteración del gen FUT8 llevada a cabo usando las construcciones TALEN en el método de la presente descripción.
La Figura 13 representa el ensayo de citometría de flujo de LCA y la comparación de los clones de CHOK1 mediante el ensayo de citometría de flujo de LCA-FITC. Se ensayan las líneas celulares CHOK1 TAL R5#007, TAL R5#009, TAL R5#010, TAL R5#016, TAL R5#032, TAL R5#045, TAL R5#047, TAL R5#052, TAL R5#064, TAL R5#066, TAL R5#067, TAL R5#095, TAL R5#099 y Ta L R5#114 en el ensayo de unión de LCA-FITC basado en citometría de flujo. Este ensayo de citometría de flujo detecta proteínas fucosiladas presentes en la superficie celular. Por lo tanto, las células CHOK1 de control presentan fluorescencia alta ya que están presentes proteínas fucosiladas en la línea celular CHOK1de control. En los casos donde las construcciones TALEN pueden alterar el gen FUT8 en líneas celulares transfectadas, la fluorescencia de LCA-FITC se minimiza ya que no hay proteína fucosilada en la superficie de estas líneas celulares. La figura pone de manifiesto la pérdida de fluorescencia significativa cuando se ensayan TAL R5#007, TAL R5#010, TAL R5#045, TAL R5#047, TAL R5#066, TAL R5#95, TAL R5#099 y TAL R5#114 en este ensayo, indicando que estas líneas celulares son líneas celulares CHOK1 con inactivación de FUT8.
Las Figuras 14 y 15 ilustran la especificidad del ensayo de citometría de flujo de LCA -FITC desarrollado para cribar las líneas celulares CHOK1 con inactivación de FUT8. Los experimentos de citometría de flujo se llevan a cabo con conjugado de estreptavidina-FITC. La estreptavidina-FITC no reconoce las proteínas de superficie celular en la línea celular CHOK1 de control, lo que indica una interacción específica del conjugado LCA-FITC. Además, el conjugado de estreptavidina-FITC pone de manifiesto niveles similares de fluorescencia de fondo entre las líneas celulares positivas y negativas identificadas por el conjugado de LCA-FITC.
3.4 - Ensayo de selección con LCA (Aglutina de Lens Culinaris) -
Se usa otro conjunto de líneas celulares para la selección con LCA a 200 pg/ml para el clon TAL R5 #116 a TAL R5 #209. Se encuentra que los siguientes clones crecen sanos cuando se comparan los parámetros de morfología celular: TAL R5#125, TAL R5#131, TAL R5#154, TAL R5#161, TAL R5#165, TAL R5#171, TAL R5#172 y TAL R5#176. Las células se observan al microscopio a intervalos regulares hasta el día 11. Estos clones se seleccionan por su fenotipo resistente a LCA. Las células se amplifican en 2 pocillos de una placa de 6 pocillos por tripsinización de la placa maestra (placa de réplica) y se dejan crecer durante 6-7 días a 37°C en una incubadora con CO2 al 5%.
La Figura 16 de la presente descripción ilustra imágenes de clones de CHOK1 transfectados con TALEN en el ensayo de selección con LCA. Se ensayan múltiples clones de células individuales en placas de réplica mediante ensayo de selección con LCA. La línea celular CHOK1 de control también se ensaya junto con células CHOK1 transfectadas con construcciones TALEN.. La observación al microscopio de las líneas celulares después de 11 días de selección con LCA pone de manifiesto la muerte completa en las células CHOK1 de control y uno de los clones TAL R5 #125. Los clones restantes TAL R5#131, TAL R5#154, TAL R5#161, TAL R5#165, TAL R5#171, TAL R5#172 y TAL R5#176 ponen de manifiesto células resistentes después de 11 días de selección con LCA con 200 pg/ml de reactivo LCA por medio. Estos clones se seleccionan para confirmación adicional por ensayo de unión de LCA-FITC.
3.5 - Ensayo de unión de LCA-FITC:
Se lleva a cabo el ensayo de unión de LCA-FITC para los siguientes 8 clones: TAL R5#125, TAL R5#131, TAL R5#154, TAL R5#161, TAL R5#165, TAL R5#171, TAL R5#172 y TAL R5#176.
Se diluye solución madre de fluoresceína-aglutinina de Lens Culinaris (LCA-FITC) 5 mg/ml para obtener una concentración final de 2 pg/ml en tampón de ensayo (DPBS que contiene BSA al 2%). Las células se centrifugan a 1500 rpm durante 5 minutos usando la centrifuga Minispin de Eppendorf. Se aspira el medio y el sedimento se resuspende en 0,25-1 ml de tampón de ensayo que contiene 2 pg/ml de LCA-FITC. Las células CHOK1 de control se resuspenden en 0,25-1 ml de tampón de ensayo solo (control no teñido) y 0,25-1 ml de tampón de ensayo que contiene 2 pg/ml de LCA-FITC (control teñido). Todas las muestras se diluyen para obtener 0,1-0,2 X106 células/ml en el tampón de ensayo final. Después, las muestras se incuban en la oscuridad sobre hielo durante 30 minutos. Después, se ponen partes alícuotas de 200 pl de cada muestra en una placa de 96 pocillos. Después, la placa se carga en el citómetro de flujo de sobremesa Millipore GUAVA easyCyte 8HT para la adquisición y análisis de datos. El análisis de datos se hace usando el software Incyte.
Tabla 8 - Resultados - conjunto 2
Figure imgf000034_0001
La mediana de RFU se refiere a la mediana del valor de unidades relativas de fluorescencia.
Las Figuras 17 y 18 de la presente descripción representan los resultados del ensayo de fluorescencia de LCA-FITC y la comparación con el ensayo de estreptavidina-FITC según la tabla anterior. La Figura 19 representa el perfil de fluorescencia. Se ensayan los clones t Al R5#125, TAL R5#131, TAL R5#154, TAL R5#161, TAL R5#165, TAL R5#171, TAL R5#172 y TAL R5#176 para el ensayo de citometría de flujo de LCA-FITC.
Se obtiene de estas figuras que los siguientes 7 clones son positivos para el fenotipo de inactivación de FUT8 TAL R5#131, TAL R5#154, TAL R5#161, TAL R5#165, TAL R5#171, TAL R5#172 y TAL R5#176. Todos los clones mencionados anteriormente ponen de manifiesto la reducción significativa de la fluorescencia en comparación con la línea celular CHOK1 de control. Se lleva a cabo la comparación con estreptavidina-FITC para asegurar la interacción específica del conjugado de LCA-FITC. Los datos sugieren solo la fluorescencia de fondo observada con el conjugado de estreptavidina-FITC cuando se ensaya con la línea celular CHOK1 de control y cualquiera de las líneas celulares transfectadas con TALEN. La Figura 18 no muestra interacción no específica del conjugado de LCA-FITC usado en este estudio cuando se compara con el conjugado de estreptavidina-FITC.
La Figura 19 representa el perfil de fluorescencia para los clones de CHOK1 con inactivación de FUT8 mediante el ensayo de citometría de flujo LCA-FITC. Los perfiles de citometría de flujo de los clones TAL R5#131, TAL R5#154, TAL R5#161, TAL R5#165, TAL R5#171, TAL R5#172, y TAL R5#176 muestran un cambio claro en la fluorescencia en comparación con la línea celular CHOK1 de control. Los datos indican claramente que estos clones son potenciales líneas celulares CHOK1 con inactivación de FUT8.
3.6 Tinción con estreptavidina-FITC para eliminar la unión no específica del colorante FITC
Se lleva a cabo la tinción de los clones con FITC conjugado con estreptavidina (Strep-FITC) para asegurar que no hay unión no específica del colorante FITC. Las proteínas de la membrana celular no se unen al conjugado de estreptavidina-FITC, mientras que las proteínas de la membrana fucosiladas se unen específicamente al conjugado de LCA-FITC. Las células CHOK1 de control se tiñen tanto con LCA-FITC como con Strep-FITC en reacciones separadas para confirmar esta especificidad. Todos los clones se tiñen de manera similar con conjugados de estreptavidina-FITC y LCA-FITC para determinar la unión no específica.
Se criban los siguientes 14 clones del conjunto anterior de experimentos: - TAL R5#007, TAL R5#009, TAL R5#010, TAL R5#016, TAL R5#032, TAL R5#045, TAL R5#047, TAL R5#052, TAL R5#064, TAL R5#066, TAL R5#067, TAL R5#095, TAL R5#099 y TAL R5#114.
De manera similar, también se criban otros 8 clones de un experimento separado: son TAL R5#125, TAL R5#131, TAL R5#154, TAL R5#161, TAL R5#165, TAL R5#171, TAL R5#172 y TAL R5#176.
Se diluye solución madre de fluoresceína-estreptavidina (estreptavidina-FITC) 1 mg/ml para obtener una concentración final de 2 pg/ml en tampón de ensayo (DPBS que contiene BSA al 2%). Las células se centrifugan a 1500 rpm durante 5 minutos usando la centrifuga Minispin de Eppendorf. Se aspira el medio y el sedimento se resuspende en 0,25-1 ml de tampón de ensayo que contiene 2 pg/ml de estreptavidina-FITC. Las células CHOK1 de control se resuspenden en 0,25-1 ml de tampón de ensayo solo (control no teñido) y 0,25-1 ml de tampón de ensayo que contiene 2 pg/ml de estreptavidina-FITC (control teñido). Todas las muestras se diluyen para obtener 0,1-0,2 X106 células/ml en el tampón de ensayo final. Después, las muestras se incuban en la oscuridad sobre hielo durante 30 minutos. Después, se ponen partes alícuotas de 200 pl de cada muestra en una placa de 96 pocillos. Después, la placa se carga en el citómetro de flujo de sobremesa Millipore GUAVA easyCyte 8HT para la adquisición y análisis de datos. El análisis de datos se hace usando el software Incyte.
La comparación con estreptavidina-FITC se lleva a cabo para asegurar la interacción específica del conjugado de LCA-FITC. Los datos sugieren solo fluorescencia de fondo observada con el conjugado de estreptavidina-FITC cuando se ensaya con la línea celular CHOK1 de control y cualquiera de las líneas celulares transfectadas con TALEN. La Figura 18 no muestra interacción no específica del conjugado de LCA-FITC usado en este estudio cuando se compara con el conjugado de estreptavidina-FITC.
Tabla 9 - Resultados - conjunto1 y conjunto2
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0001
El perfil de fluorescencia se ilustra en la Figura 15 de la presente descripción. Se presentan los perfiles de citometría de flujo de fluorescencia de los clones TAL R5#007, TAL R5#010, TAL R5#045, TAL R5#047, TAL R5#066, TAL R5#95, TAL R5#099, y TAL R5#114. Se deduce de la figura que todos los clones mencionados antes muestran cambio significativo en el perfil de fluorescencia en comparación con la línea celular CHOK1 de control después de tinción con LCA-FITC. El perfil de tinción de estreptavidina-FITC (Strep-FITC) de todos los clones se observa en el nivel de fondo, incluida la línea celular CHOK1 de control y todas las líneas celulares transfectadas con TALEN. Los datos confirman que el conjugado de estreptavidina-FITC no se une a la membrana celular de CHOK1 en el control de CHOK1 así como a las líneas celulares transfectadas con TALEN. La reducción de la fluorescencia observada en los clones positivos significa la ausencia de proteínas fucosiladas en las líneas celulares con potencial inactivación de FUT8 transfectadas con TALEN. Esto indica que todas estas líneas son potencialmente líneas celulares CHOK1 con inactivación de FUT8.
3.7 - Determinación de la curva de crecimiento del clon seleccionado:
Se lleva a cabo la determinación de la curva de crecimiento de los clones seleccionados para asegurar que el perfil de crecimiento no se altera significativamente en comparación con las células CHOK1 de tipo natural durante el proceso de desarrollo de la línea celular con inactivación génica. Se siembran 0,1X106 células CHOK1 en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos. La siembra se hace para 5 puntos de tiempo para cada clon. Para cada punto de tiempo, se hace la siembra por triplicado (p. ej., 15 pocillos para 5 puntos de tiempo). En cada tiempo, los recuentos de células puntuales se toman por triplicado. El recuento de células viables se realiza usando el hemocitómetro o el analizador de viabilidad celular Vi-cell XR. Las respectivas curvas de crecimiento se generan con EEM como barra de error. La Tabla 10 describe datos de crecimiento representativos de una de las líneas celulares con inactivación de FUT8, TAL-R4#013.
Tabla 10: Tal-R4#013
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El gráfi
La Figura 12 ilustra la representación gráfica representativa de la curva de crecimiento de los clones de CHOK1 con inactivación de FUT8. Las líneas celulares con inactivación de fucosa desarrolladas después de transfección de las construcciones TALEN se ensayan para determinar las características de crecimiento óptimas. Estas líneas celulares clonales se usan para la sobreexpresión de proteínas terapéuticas y/o anticuerpos monoclonales. El recuento de células viables se toma todos los días durante 5 días en condiciones de crecimiento óptimas, usando el contador Vi-Cell. Las curvas de crecimiento de la línea celular CHOK1 de control y la línea celular CHOK1 con inactivación de FUT8 TAL R4#013 clonal son comparables.
EJEMPLO 4: ENSAYOS DE SECUENCIACIÓN GENÓMICA
Los clones transfectados con TALEN seleccionados mediante ensayo funcional, en concreto el ensayo de citometría de flujo de LCA-FITC, se usan para el análisis de la secuencia genómica. El locus genómico de FUT 8 del hámster chino está bien descrito en la bibliografía (NW_003613860) y se usa como secuencia de tipo natural para comprender el tipo de modificación génica en cada clon de línea celular. El objetivo de este ejemplo es analizar los resultados de la secuenciación del ADN genómico obtenidos de líneas de células CHOK1 con inactivación de FUT8 transfectadas con TALEN. Todas las líneas celulares descritas aquí son líneas celulares clonales y se seleccionan del ensayo de selección de medio de LCA y el ensayo de citometría de flujo de LCA-FITC.
Brevemente, las líneas celulares clonales seleccionadas se cultivan en condiciones de crecimiento adecuadas para el aislamiento del ADN genómico, el ADN genómico purificado se usa para la amplificación por PCR usando cebadores que flanquean el locus objetivo de FUT8, el producto amplificado por PCR después se purifica y se clona en un vector adecuado usando células competentes de E. coli, las colonias de E. coli resistentes a ampicilina resultantes se seleccionan y cultivan, el ADN plasmídico se aísla de cada clon bacteriano, se ensayan aproximadamente 5-10 colonias bacterianas individuales por línea celular clonal mediante secuenciación automatizada para comprender el tipo de modificación en el locus genómico objetivo deFUT8.
Se usan los siguientes reactivos y soluciones para llevar a cabo la secuenciación del genoma de los clones seleccionados El protocolo completo de secuenciación del genoma se divide en los siguientes cuatro procedimientos
A. Aislamiento del ADN genómico de clones seleccionados
B. Estrategia de PCR para amplificar el locus genómico específico para cada línea celular.
C. Clonación de productos de PCR en vectores de secuenciación
D. Análisis de datos de secuencia e identificación de INDEL
4.1 Aislamiento de ADN genómico de clones seleccionados
Las líneas celulares CHOK1 clonales se cultivan en medio DMEM avanzado con suero bovino fetal al 10%, glutamina 4 mM, penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100 pg/ml en matraces T175 a 37°C en presencia de 5% de CO2 y 75% de humedad relativa en incubadoras en condiciones controladas. El crecimiento celular se observa todos los días y se controla la viabilidad. Las células se recogen con una confluencia de 80% y viabilidad mayor que 95% con tripsinización. El día del aislamiento, se retira el medio de cultivo y las células adherentes primero se lavan con 10 ml de DPBS seguido de la adición de 4 mililitros de solución de tripsina EDTA al 0,05% para la tripsinización. Las células se incuban a 37°C durante 2-3 minutos y se recogen. Las células después se mezclan con 10 ml de DPBS y se centrifugan a 1500 rpm durante 5 min. El medio gastado se retira y el sedimento celular se resuspende en 10 ml de DPBS. Las células se lavan de nuevo usando centrifugación a 1500 rpm durante 5 min. El DPBS se elimina completamente por aspiración. El sedimento celular final se usa para el aislamiento del ADN genómico.
El ADN genómico se aísla de las células de control CHOK1 y las líneas celulares clonales CHOK1 transfectadas con TALEN que muestran resistencia a LCA se seleccionan mediante un ensayo de citometría de flujo de LCA. Se usa el kit de extracción de ADNg de QIAGEN disponible comercialmente para aislar el ADN genómico siguiendo el protocolo del fabricante.
4.2 - Diseño de la estrategia de PCR
La secuencia del ADN genómico del hámster chino se analiza a partir de la secuencia de base de datos disponible públicamente NW_003613860. Las secuencias de ADN de los exones 9 y 10 y la secuencia de intrón parcial (Secuencia ID N° 40) se usan para diseñar la estrategia de PCR para amplificar el locus objetivo de FUT8. Los cebadores se diseñan basándose en la longitud del cebador, longitud del producto de PCR, contenido de GC, temperatura de fusión y la posible formación de homodúplex y heterodúplex. Los cebadores se diseñan flanqueando el locus objetivo de FUT8 como se indica a continuación. El producto de PCR amplificado está destinado al análisis de mutaciones debido a la DSB mediada por TALEN y la subsiguiente reparación del ADN. La siguiente secuencia de nucleótidos representa la región de interés con secuencias de cebadores en negrita.
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Los intrones se representan desde la base 1 hasta la base 180 y desde la base 358 hasta la base 397 en minúsculas. El exón 9 se representa desde la base 181 hasta la base 357 en letras mayúsculas. Los sitios de unión del cebador de izquierda y derecha están subrayados.
4.2.1 Diseño de cebadores para identificar las INDEL por PCR
La PCR genómica se lleva a cabo usando el kit de extracción de ADNg de QIAGEN usando los siguientes cebadores mencionados en la tabla 11.
Tabla 11
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La siguiente sección proporciona detalles experimentales para la generación de productos de PCR a partir del ADN genómico de CHOK1 de líneas celulares de control y líneas celulares clonales seleccionadas con LCA, clonación de productos de PCR en células competentes de E. coli y secuenciación de productos de PCR clonados.
4.2.2 Optimización de condiciones de la PCR -
Los experimentos están diseñados para estandarizar las condiciones de la PCR. Los parámetros ensayados incluyen, concentración de ADN genómico (de 100 ng a 1000 ng), concentraciones de cebadores (de 2 nmoles a 20 nmoles), temperatura de hibridación de PCR (de 55,8°C a 62,9°C y tiempo (de 20 segundos a 50 segundos), tiempo de extensión del producto de PCR (de 30 segundos a 60 segundos) y el número de ciclo de la PCR se establece en 30 ciclos. Las condiciones optimizadas de llegada se describen en la siguiente sección. Las reacciones de PCR se llevan a cabo usando la polimerasa Phusion polimerasa correctora de errores para garantizar que las mutaciones mediadas por PCR sean limitadas. Después de los ciclos de amplificación por PCR, se añade la enzima polimerasa Taq a la mezcla para la formación de cola. La etapa de formación de cola es importante ya que la base adicional añadida a los productos de PCR permite la clonación directa en el vector de secuenciación descrito en la siguiente sección. Con el fin de añadir extremos salientes de dATP al producto de PCR para la clonación en el vector de clonación TA, el producto amplificado con polimerasa Phusion se incuba con ADN polimerasa Taq durante 15 minutos a 72°C.
4.2.3 Comprobación cruzada de la muestra de ADN genómico por PCR -
Los productos de la PCR de ADN genómico se analizan por electroforesis en gel de agarosa y la longitud del producto se confirma usando un patrón de peso molecular. Las muestras de PCR con un perfil de amplificación claro se usan en la siguiente etapa de procesamiento.
4.2.4- Elución en gel del producto de PCR usando el kit de QIAGEN -
Los productos de la PCR amplificados se cargan en gel de agarosa al 1% recién preparado y se someten a electroforesis a 100 V durante una hora) para separar los productos de PCR amplificados de los cebadores no usados y cualquier otro dímero producido durante el proceso de amplificación. Los productos amplificados se escinden del gel y se eluyen usando el kit de elución en gel de Qiagen disponible comercialmente. El ADN se eluye con agua de calidad de biología molecular de alta pureza.
4.3 Clonación de productos de PCR en vectores de secuenciación -
Los productos amplificados por PCR purificados en gel de agarosa después se usan para la clonación en el vector pTZ57R/T disponible comercialmente mediante proceso de ligado de ADN. Las condiciones para el ligado de ADN se han estandarizado previamente.
4.3.1 Transformación de la muestra ligada pTZ57R/T+TAL(PCR) en células competentes de E coli DH10B y DH5alfa - El ADN ligado se transforma en células competentes de E coli DH10B, disponibles comercialmente. Se sigue el protocolo de transformación descrito por el fabricante para lograr un nivel alto de eficiencia de transformación. Después de la transformación, las células de E. coli se cultivan en presencia de antibiótico ampicilina para el crecimiento de colonias transformadas.
4.3.2 Inoculación de células transformadas (pTZ57R1T+TAL(PCR)) en medio LB con ampicilina - Cada colonia separada se inocula en caldo de LB ampicilina en un volumen de cultivo de 5 mililitros y se deja crecer durante la noche para el aislamiento del ADN plasmídico.
4.3.4 Aislamiento del ADN plasmídico (pTZ57R1T+TAL(PCR) de células transformadas DH10B y DH5alfa - Se usan 4.5 mililitros de cultivos de crecimiento durante la noche para el aislamiento del ADN plasmídico usando el kit de aislamiento de ADN plasmídico de QIAGEN disponible comercialmente siguiendo el protocolo del fabricante. El ADN plasmídico se eluye con agua de calidad de biología molecular de alta pureza.
4.3.5 Comprobación cruzada en plásmidos de la presencia de inserto - Se ensaya en cada preparación de plásmido la presencia de inserto usando digestión adecuada con enzimas de restricción seguida de electroforesis en gel de agarosa. El tamaño del inserto se compara con patrones de peso molecular adecuados.
4.4. Análisis de datos de secuencia e identificación de INDEL
Secuenciación - Los plásmidos confirmados después se secuencian con cebadores de secuenciación específicos presentes en la cadena principal del vector pTZ57R/T. Los datos de secuencia se generan en instrumentos de secuenciación de ADN automáticos siguiendo los protocolos adecuados. La secuenciación se lleva a cabo con cebadores de secuenciación tanto directos como inversos para garantizar la información de secuencia adecuada.
Análisis de secuencia de ADN - Se analizan los datos de secuenciación de ADN de todos los plásmidos. Se comparan la secuencia de ADN del ADN plasmídico derivado de la línea celular CHOK1 de control y varias líneas celulares clonales CHOK1 con inactivación de FUT8 mediada por TALEN y se identifican las diferencias en las secuencias de ADN. A partir de cada clon de la línea celular CHOK1, se generan productos de PCR y se clonan en E. coli. Se secuencian múltiples clones de E. coli para confirmar la modificación de la secuencia de nucleótidos en el locus genómico objetivo.
El análisis compuesto de los datos de las secuencias se usa para identificar potenciales líneas con inactivación de FUT8 donde el locus genómico objetivo de FUT8 se modifica mediante deleción y/o inserciones (INDEL). Después, las secuencias de ADN se alinean para mostrar distintas diferencias. La Figura 26 proporciona la alineamiento de las secuencias de nucleótidos de la línea celular CHOK1 de control y las líneas celulares clonales con inactivación de FUT8. La información de la secuencia de ADN se usa para asignar la secuencia de aminoácidos del gen FUT8, exón 9 usando el uso de codones estándar. Las secuencias de aminoácidos después se alinean para identificar la deleción, mutación de cambio de marco, inserción de codones de parada así como sustituciones de aminoácidos en ubicaciones específicas. La Figura 26 representa la extensión de la modificación de nucleótidos observada en las líneas celulares CHOK1 con inactivación de FUT8 cuando se comparan con la línea celular CHOK1 de control. Los datos proporcionan una visión global de la organización del ADN genómico del locus de FUT8 entre múltiples líneas celulares CHOK1 con inactivación de FUT8.
4.5 - Reacción de PCR
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica potente y sensible para la amplificación de ADN. La PCR amplifica exponencialmente secuencias de ADN específicas usando múltiples ciclos de un procedimiento de tres etapas. Primero, el molde de ADN bicatenario se desnaturaliza a una temperatura alta a 94°C. Después, los cebadores específicos de secuencia mencionados en la Tabla 11 se hibridan (60,42C) con sitios que flanquean la secuencia objetivo. Una ADN polimerasa termoestable (polimerasa Phusion) extiende (72°C) los cebadores hibridados, duplicando así la cantidad de la secuencia de ADN original. Este producto recién sintetizado se convierte entonces en un molde adicional para los ciclos posteriores de amplificación. Estas tres etapas se repiten durante 30 ciclos, lo que da como resultado un aumento de 109 veces de la concentración de ADN objetivo. Con el fin de añadir extremos salientes de dATP al producto de la PCR para la clonación en el vector de clonación TA, el producto amplificado con polimerasa Phusion en la PCR se incuba con polimerasa Taq durante 15 minutos a 72°C.
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Condiciones de PCR
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La Figura 20 de la presente descripción ilustra una figura representativa del producto amplificado por PCR del clon CHOK1-TAL6-R5#007 cuando se somete a gel de agarosa al 1%. El ADN genómico se aísla y se amplifica con los cebadores TAL_P01_Fw y TAL_P01_Rv en condiciones de PCR estandarizadas. El producto amplificado se somete a electroforesis en gel de agarosa al 1 %. El resultado pone de manifiesto el tamaño de producto esperado del producto amplificado. El producto amplificado por PCR se purifica en gel y se clona en clones bacterianos y se secuencia para confirmar el estado del locus genómico de FUT8. Todas las líneas celulares clonales se ensayan siguiendo este mismo procedimiento para la confirmación de la secuenciación del ADN.
Esta figura representativa describe la amplificación por PCR del locus genómico de FUT8 objetivo usando las secuencias de cebadores de la Tabla 11 y la polimerasa Phusion. El producto de la PCR se modifica adicionalmente con la ADN polimerasa Taq para la formación de cola. Después, el producto final de la PCR se somete a electroforesis en gel de agarosa para la elución del fragmento amplificado. El "carril 1" de la figura 20 pone de manifiesto el producto de la PCR amplificado de tamaño adecuado sometido a electroforesis para la elución en gel. Se aplica el mismo procedimiento para amplificar el producto amplificado de la PCR de las líneas celulares CHOK1 de control y clonales CHOK1 con inactivación de FUT8, que se extraen del gel usando el kit de extracción en gel QIAEX II.
4.6 - Ligado
Los productos amplificados por PCR y eluídos en gel se ligan en un vector pTZ57R/T disponible comercialmente.
El protocolo de ligado se describe como sigue
Mezcla de ligado
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La mezcla de ligado anterior se incuba a 4°C durante la noche y 50% de la mezcla ligada se transforma en células competentes de E coli DH5alfa o DH10B por el método de choque térmico.
4.7 - Transformación de muestra ligada en célula bacteriana por el método de choque térmico
El propósito de transformar células bacterianas es clonar y propagar el ADN plasmídico. Se toman partes alícuotas de 20 gl de células de E. coli competentes (DH5alfa o DH10B) del congelador a -80°C y se descongelan sobre hielo durante 5 minutos. Se añade 50% de la muestra ligada (pTZ57R/T+TAL(PCR) a las células competentes y se mezcla suavemente y se incuba sobre hielo durante 20 minutos. El tubo que contiene la mezcla se pone en un baño de agua/baño seco a 42°C durante 50 segundos. El tubo se vuelve a poner sobre hielo durante 2 minutos. Se incuban 0,950 ml de caldo LB calentado a 37°C (sin antibiótico ampicilina) a 37°C, 220 rpm durante 1 hora, en un agitador. Se esparcen 100 gl del cultivo resultante en placas de cultivo de LB+ampicilina calentadas. Las placas se incuban durante la noche a 37°C en incubadora.
4.8 - Aislamiento de ADN plasmídico de células bacterianas usando QIAPrep Spin Miniprep
El propósito de este procedimiento es hacer crecer/cultivar bacterias que contienen un plásmido de ADN específico, que se usa en los siguientes experimentos. Se añaden 5 ml de caldo de LB+ampicilina en tubos tratados en autoclave, se inoculan colonias bacterianas aisladas de las placas de cultivo en los tubos de cultivo de caldo LB+ampicilina. Los tubos se incuban a 220 rpm, a 37°C durante la noche (aproximadamente 16-18 horas dependiendo del crecimiento de la bacteria). El cultivo de una noche de 4,5 ml se centrifuga a 13 rpm durante 1 minuto. El ADN plasmídico se aísla usando el kit de aislamiento de plásmidos de QIAGEN disponible comercialmente. El ADN plasmídico se eluye con agua de calidad de biología molecular de alta pureza y se almacena a -20°C en un congelador hasta su uso posterior.
4.9 - Clones positivos seleccionados usando digestión de restricción con enzimas EcoR I-HF y Hind III-HF
Se analiza en el ADN plasmídico así aislado la presencia de inserto, en este caso el fragmento amplificado por PCR. El vector pTZ57R/T contiene múltiples sitios de enzimas de restricción que flanquean el producto de PCR clonado. Los sitios de restricción de EcoRI y HindIII están en CHOK1 para la digestión de restricción como se describe en la siguiente tabla. La reacción se lleva a cabo a 37°C durante 2 horas para completar la digestión del ADN plasmídico. Después de la digestión por restricción, la mezcla se somete a electroforesis en gel de agarosa al 1% durante 1 hora. El inserto del producto de PCR, si está presente, se separa de la cadena principal del vector pTZ57R/T y los clones bacterianos confirmados se usan para la secuenciación del ADN.
Digestión con enzimas de restricción - Mezcla de reacción
Figure imgf000041_0002
La Figura 21 de la presente descripción representa la digestión con enzimas de restricción del producto amplificado por PCR en el vector pTZ57R/T para confirmar la presencia de inserto. Las preparaciones de ADN plasmídico de clones bacterianos independientes se digieren con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII que flanquean el fragmento de PCR clonado en el vector y la mezcla se somete a electroforesis en gel de agarosa al 1%. El tamaño de los fragmentos de ADN resultantes se calcula a partir de los patrones de peso molecular de ADN. Los resultados ponen de manifiesto que todos los clones ensayados albergan insertos de producto de la PCR de aproximadamente 397 pb de longitud. La cadena principal del vector pTZ57R/T está representado por el fragmento observado en la posición de la banda de aproximadamente 5,4 Kb. Basándose en estos datos, se seleccionan muestras individuales de ADN plasmídico y se usan para la secuenciación del ADN. Se aplica el mismo procedimiento a todos los productos de PCR clonados en el vector pTZ57R/T y se seleccionan los clones confirmados para la secuenciación del ADN. El resultado indica la presencia de inserto que es secuenciado con cebadores de secuenciación presentes en la cadena principal del vector.
EJEMPLO 5: CONFIRMACIÓN DE LOS INDEL POR SECUENCIACIÓN
La secuenciación de ADN del ADN plasmídico bacteriano seleccionado se realiza con cebadores de secuenciación secuencia arriba y secuencia abajo ubicados en la cadena principal del vector pTZ57R/T. Los datos de secuenciación se recopilan usando ambos cebadores y se analizan para obtener información adecuada de la secuencia de ADN. Se secuencian múltiples plásmidos bacterianos para generar información de secuencia de ADN compuesta en el locus genómico objetivo de FUT8 para la línea celular CHOK1 de control y la línea celular CHOK1 con inactivación de FUT8 clonal lograda mediante construcciones TALEN.
Más abajo se proporcionan las secuencias de ADN genómico de la línea celular CHOK1 de control y las líneas celulares clonales CHOK1 con inactivación de FUT8, que confirman la presencia de mutaciones de inserción y/o deleción en el gen Fut8, por construcciones TALEN, según el método de la presente descripción. El locus genómico objetivo amplificado de cada línea celular, incluyendo la línea celular CHOK1 de control, se clona como productos de la PCR en múltiples clones bacterianos independientes. La verificación de la secuencia se lleva a cabo con cebadores de secuenciación tanto directos como inversos de múltiples clones bacterianos independientes (que varía de 5-15) para comprender la variabilidad alélica del locus objetivo de FUT8. Los datos de la secuencia de ADN más abajo, son representativos de las secuencias genómicas en el locus de FUT8 objetivo de varias líneas celulares con inactivación de FUT8.
Análisis de secuencia de ADN
Línea celular CHOK1 de control (tipo natural) - la secuencia del exón-9 está en mayúsculas. La secuencia del intrón está en minúsculas y subrayada.
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A continuación se proporcionan las secuencias de la línea celular CHOK1 clonal con inactivación de FUT8. Se observa que la secuencia del exón 9 está mutada en las líneas celulares.
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TAL R5 #047 a -tgctctccacttctccccagAGTCACTGACAAAGTGGGAACAGAAGCAGCCTTCCATCCCATTGA GGAATACATGGTACACGTTGAAGAACATTTTCAGCTTCTCGAACGCAGAATGAAAG TGGATAAAAAAAGAGTGTATCTGGCCACTGATGACCCTTCTTTGTTAAAGGAGGCAA AGACAAAgtaagttagaccaacaagtg
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TAL R5#095 b -
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El alineamiento de secuencias de ADN genómico representativo en clones de líneas celulares FKO que muestran deleción en la secuencia del gen FUT8 se proporciona en la figura 22 de la presente descripción. Las Figuras 22A y 22B ilustran el análisis de la secuencia de nucleótidos. El ADN genómico de los clones CHOK1 con inactivación de FUT8 seleccionados transfectados con TALEN y las líneas celulares CHOK1 de control se usan para amplificar por PCR el locus genómico de FUT8 objetivo. Los datos de secuencia se recogen del análisis de 5-15 clones bacterianos independientes secuenciados con cebadores de secuenciación tanto directos como inversos. Los datos de secuenciación sugieren deleciones de longitudes variables en múltiples clones en comparación con la línea celular CHOK1 de control. La deleción más grande de 113 bases se observa en el clon TAL R4#013 y la deleción más pequeña es de solo 2 bases en el clon TAL R5#095. Todas las deleciones se encuentran en el sitio objetivo de TALEN. En la figura 22B, los sitios de unión al ADN de TALEN izquierda y derecha se indican mediante recuadros abiertos. La Figura 22 indica un alelo del clon TAL R5#095a donde los datos de la secuencia ponen de manifiesto la inserción de la nueva secuencia de ADN en comparación con la línea celular CHOK1 de control.
Los datos sugieren varias INDEL presentes en el locus genómico de FUT8 en las líneas celulares CHOK1 con inactivación de FUT8. En muchos casos, se observa que hay modificaciones muy específicas en las bases objetivo y, en otros casos, los cambios son amplios e implican tramos más largos de ADN. Dicha diversidad de modificación genómica a través de construcciones TALEN es posible debido a la reparación de la rotura de doble cadena del ADN endógeno mediante la unión de extremos no homólogos. Todas estas líneas celulares se seleccionan mediante dos ensayos de cribado funcional separados, en concreto el ensayo de selección de medio de LCA y el ensayo de citometría de flujo de LCA-FITC. Los resultados también implican una alta eficiencia de estos dos ensayos funcionales para aislar e identificar la línea celular CHOK1 con inactivación de FUT8.
También se pone de manifiesto que el diseño de la construcción TALEN representada en esta descripción es único, ya que este par de construcciones TALEN proporcionaba una alteración génica altamente específica de secuencia en el locus de FUT8 objetivo en las líneas celulares CHOK1.
Análisis de la secuencia de aminoácidos de las líneas celulares CHOK1 con inactivación de FUT8
La secuencia de ADN genómico de FUT8 de las líneas celulares CHOK1 de control y CHOK1 con inactivación de FUT8 se analizan adicionalmente para comprender el impacto de INDEL de la secuencia de ADN en el estado de la proteína FUT8. Las secuencias de ADN en el locus de FUT8 objetivo se traducen en secuencias de aminoácidos usando sesgo de codones de vertebrados. La secuencia de aminoácidos de la región del exón9 se estudia de cerca y los resultados se resumen en la tabla 12. Cuando se compara con la línea celular CHOK1 de control, las líneas celulares con inactivación de FUT8 ponen de manifiesto modificaciones que incluyen deleciones tan pequeñas como 3 aminoácidos (TAL -R4#111) hasta tan largas como 10 aminoácidos (TAL R4#003) que se eliminan en las líneas celulares con inactivación de FUT8.
En muchos casos, se observan mutaciones de cambio de marco, que alteran la región C-terminal de la proteína FUT8 para convertirla en enzima no funcional. Además, en varios casos se introduce el codón de parada como un efecto de la mutación de cambio de marco y, por lo tanto, la proteína FUT8 está trunca y no es funcional en estos clones (TAL R4#013 y TAL R4#023).
Tabla 12
N
QLL
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Además, se observa que la selección de aminoácidos objetivo en la secuencia de la proteína FUT8 es muy eficaz. Dirigirse a los aminoácidos conservados en las posiciones Arg 365, Arg 366, Asp-368, Lys-369 y Glu-373 de la proteína FUT8 de tipo natural con solo un par de construcciones TALEN ha creado mutaciones en el locus objetivo en múltiples líneas celulares con inactivación génica.
En la Figura 23 de la presente descripción se proporciona un alineamiento de secuencias de aminoácidos representativo en las líneas celulares CHOK1 de control y CHOK1 con inactivación de FUT8 que muestran la deleción en la secuencia del gen FUT8. La secuencia de aminoácidos traducida se predice usando el uso de codones estándar. Los datos indican varios efectos sobre la secuencia de aminoácidos de FUT8 debido a la deleción y/o inserción de nucleótidos observada. Las flechas negras indican aminoácidos críticos para la funcionalidad de FUT8 que es objetivo en esta descripción. Otros aminoácidos importantes en la región del Exón9 se indican con asteriscos. El clon TAL R4#111, TAL R5#007, TAL R5#047 y TAL R4#003 puso de manifiesto la deleción dirigida de la posición del aminoácido específico en Arg366 además de otros aminoácidos en la región. Los clones restantes pusieron de manifiesto una deleción seguida de mutaciones de cambio de marco que dieron como resultado codones de parada tempranos. Todas estas modificaciones indican la proteína FUT8 no funcional en las líneas celulares CHOK1 con inactivación de FUT8 transfectadas con TALEN.
Además, la construcción TALEN creó mutaciones de cambio de marco que alteraban la región c-terminal de la enzima FUT8 que contiene el motivo II y el motivo III importantes junto con las posiciones de aminoácidos específicos Tyr-382, Asp-409, Asp-410, Asp-453 y Ser-469 que están implicados en el dominio catalítico de la enzima FUT8. El resultado final de estas mutaciones críticas es la enzima a-1,6-fucosiltransferasa no funcional, el producto proteína del gen FUT8 en las líneas celulares CHOK1 con inactivación de FUT8.
EJEMPLO 7 - USO DE LA LÍNEA CELULAR CON INACTIVACIÓN DE FUCOSA PARA PRODUCIR ANTICUERPOS NO FUCOSILADOS
La plataforma de expresión de células CHOK1 con inactivación de fucosa se usa para la expresión de anticuerpos no fucosilados, en particular de anticuerpos monoclonales no fucosilados. Los genes del anticuerpo que codifican la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo monoclonal se clonan en plásmidos de expresión génica adecuados y se transfectan en la plataforma de células CHOK1 con inactivación de fucosa descrita en los ejemplos anteriores. El anticuerpo monoclonal producido usando esta plataforma/método se expresa como anticuerpo no fucosilado. El producto se purifica siguiendo protocolos y pautas establecidos para desarrollar un producto de anticuerpo monoclonal biomejor para uso terapéutico. El anticuerpo biomejor no fucosilado producido usando esta plataforma da como resultado un nivel más alto de ADCC y, por lo tanto, mejor resultado terapéutico.
Los datos de citometría de flujo de LCA-FITC y los experimentos de secuenciación adicionales de la presente descripción confirman que las líneas FKO son incapaces de fucosilar proteínas de membrana. Por lo tanto, la célula obtenida en la presente descripción produce proteínas no fucosiladas, específicamente anticuerpo no fucosilado. Las propiedades características y las ventajas terapéuticas de los anticuerpos no fucosilados, tales como una ADCC superior, son conocidos por los expertos en la técnica.
Aunque la descripción y la ejemplificación se han proporcionado a modo de ilustraciones y ejemplos con el propósito de claridad y comprensión, es evidente para una persona experta en la técnica que se pueden practicar varios cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu o alcance de la descripción. Por consiguiente, las descripciones y ejemplos anteriores no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente descripción.
Se pretende que el alcance de la descripción esté limitado no por esta descripción detallada, sino más bien por las reivindicaciones adjuntas a la misma. También debe entenderse que las siguientes reivindicaciones pretenden cubrir todas las características genéricas y específicas de la descripción descrita en el presente documento.
Son posibles muchas modificaciones y variaciones a la luz de las enseñanzas anteriores. Por lo tanto, debe entenderse que la materia objeto reivindicada se puede poner en práctica de otra manera que la descrita específicamente. Cualquier referencia a elementos de reivindicación en singular, por ejemplo, usando los artículos "un", "una", "el", "la" o "dicho", "dicha" no debe interpretarse como que limita la descripción.
La descripción de las realizaciones de la presente descripción pone de manifiesto la naturaleza general de las realizaciones que son fácilmente adecuadas para modificación y/o adaptación para diversas aplicaciones aplicando los conocimientos actuales. Dichas realizaciones específicas de la descripción, sin apartarse del concepto genérico y, por lo tanto, dichas adaptaciones y modificaciones deben y están destinadas a ser comprendidas y consideradas dentro del significado y la variedad de equivalentes de las realizaciones descritas.
También debe entenderse que las frases o términos empleados en el presente documento tienen el propósito de describir y no pretenden ser de limitación alguna. A lo largo de la presente descripción, se debe entender que la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" dondequiera que se use, implican la inclusión de un elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas establecidos, pero no la exclusión de ningún otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.
Cuando se exponen en el presente documento un límite o intervalo numérico, están incluidos los puntos finales. Además, los valores y subintervalos dentro de un límite o intervalo numérico se incluyen específicamente como si estuvieran escritos explícitamente.
Con respecto al uso de cualquier término en plural y/o singular en la presente descripción, los expertos en la técnica pueden traducir del plural al singular y/o del singular al plural según se considere adecuado para el contexto y/o aplicación. Las diversas permutaciones de singular/plural pueden establecerse expresamente en el presente documento en aras de la claridad.
Cualquier discusión de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos y similares que se haya incluido en esta memoria descriptiva es únicamente con el propósito de proporcionar un contexto para la presente descripción. No debe considerase como una admisión que cualquiera o todos estos asuntos forman parte de la base de la técnica anterior o son de conocimiento general común en el campo relevante para la presente descripción, ya que existía en cualquier lugar antes de la fecha de prioridad de esta solicitud.
El contenido de todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a lo largo de esta solicitud se incorporan en el presente documento por referencia para todos los propósitos.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un dominio de unión al ADN de la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción (TALEN), en donde el dominio de unión al ADN comprende un par de secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID No. 6 y SEQ ID No. 8; SEQ ID No. 11 y SEQ ID No. 14; SEQ ID No. 17 y SEQ ID No. 20; SEQ ID No. 23 y SEQ ID No. 26; SEQ ID No. 29 y SEQ ID No. 32; y SEQ ID No. 35 y SEQ ID No. 38.
2. El dominio de unión al ADN según la reivindicación 1, en donde la SEQ ID No. 6 se une a la SEQ ID No. 4 de la secuencia del gen Fut8, la SEQ ID No. 8 se une a la SEQ ID No. 5 de la secuencia del gen Fut8, la SEQ ID No. 11 se une a la SEQ ID No. 10 de la secuencia del gen Fut8, la SEQ ID No. 14 se une a la SEQ ID No. 13 de la secuencia del gen Fut8, en donde la SEQ ID No. 17 se une a la SEQ ID No. 16 de la secuencia del gen Fut8, la SEQ ID No. 20 se une a la SEQ ID No. 19 de la secuencia del gen Fut8, la SEQ ID No. 23 se une a la SEQ ID No. 22 de la secuencia del gen Fut8, la SEQ ID No. 26 se une a la SEQ ID No. 25 de la secuencia del gen Fut8, la SEQ ID No. 29 se une a la SEQ ID No. 28 de la secuencia del gen Fut8, la SEQ ID No. 32 se une a la SEQ ID No. 31 de la secuencia del gen Fut8, la SEQ ID No. 35 se une a la SEQ ID No. 34 de la secuencia del gen Fut8, la SEQ ID No. 38 se une a la SEQ ID No. 37 de la secuencia del gen Fut8.
3. Un polinucleótido o un par de polinucleótidos que codifican el dominio de unión al ADN de la reivindicación 1.
4. Un polinucleótido según la reivindicación 3, en donde el polinucleótido comprende un par de secuencias de nucleótidos seleccionadas de SEQ ID No. 7 y SEQ ID No. 9; s Eq ID No. 12 y SeQ ID No. 15; SEQ ID No. 18 y SEQ ID No. 21; SEQ ID No. 24 y SEQ ID No. 27; SEQ ID No. 30 y SEQ ID No. 33; y SEQ ID No. 36 y SEQ ID No. 39.
5. Una proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción que comprende el dominio de unión al ADN según la reivindicación 1 y nucleasa.
6. La proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción según la reivindicación 5, en donde la nucleasa es la endonucleasa Fokl.
7. Un vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 3 o reivindicación 4.
8. Una plataforma de células con inactivación de fucosa que comprenden un vector según la reivindicación 7; en donde la célula es una célula de mamífero, en donde la plataforma de células con inactivación de fucosa carece de actividad de fucosilación.
9. Un método de obtención de la plataforma de células con inactivación de fucosa según la reivindicación 8, comprendiendo dicho método las etapas de:
a) Obtener una construcción de nucleasa efectora de tipo activador de transcripción que comprende el polinucleótido de la reivindicación 3 o reivindicación 4; y
b) Transfectar una célula con la construcción de la etapa (a) para obtener la plataforma de células con inactivación de fucosa.
10. Un método de obtención de proteína no fucosilada, comprendiendo dicho método las etapas de:
a) Obtener una construcción de nucleasa efectora de tipo activador de transcripción que comprende el polinucleótido de la reivindicación 3 o reivindicación 4;
b) Transfectar una célula con la construcción de la etapa (a) para obtener la plataforma de células con inactivación de fucosa de la reivindicación 8; y
c) Obtener la proteína no fucosilada expresada por la célula de la etapa (b).
11. El método según la reivindicación 10, en donde la proteína no fucosilada es un anticuerpo no fucosilado; y en donde el anticuerpo no fucosilado es un anticuerpo monoclonal no fucosilado.
12. El método según la reivindicación 9 o 10, en donde la construcción de nucleasa efectora de tipo activador de transcripción codifica la proteína nucleasa efectora de tipo activador de transcripción de la reivindicación 5; en donde la proteína nuclease escinde la secuencia del gen Fut8; y en donde la secuencia del gen Fut8 que codifica la enzima a-1,6-fucosiltransferasa se escinde en el exón 9; y en donde la enzima fucosiltransferasa se muta en una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en Arg- 365, Arg -366, Asp-368, Lys-369, Glu-373, Tyr-382, Asp-409, Asp-410, Asp-453, Ser-469, y combinaciones de las mismas; y en donde la célula es célula de mamífero; y en donde la célula es célula de ovario de hámster chino.
13. El método según la reivindicación 10, en donde la célula produce una proteína no fucosilada endógena o una proteína no fucosilada codificada por el gen introducido en la célula.
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