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ES2998108T3 - Antibodies useful in cancer diagnosis - Google Patents

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ES2998108T3
ES2998108T3 ES18765858T ES18765858T ES2998108T3 ES 2998108 T3 ES2998108 T3 ES 2998108T3 ES 18765858 T ES18765858 T ES 18765858T ES 18765858 T ES18765858 T ES 18765858T ES 2998108 T3 ES2998108 T3 ES 2998108T3
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ES
Spain
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antibody
seq
amino acid
acid sequence
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ES18765858T
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Rita Mitnacht-Kraus
Stefan Wöll
Korden Walter
Özlem Türeci
Ugur Sahin
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TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH
Astellas Pharma Inc
Original Assignee
TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH
Astellas Pharma Inc
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Abstract

La invención se refiere a anticuerpos dirigidos contra un epítopo ubicado dentro de la porción C-terminal de CLDN6 que son útiles, por ejemplo, para diagnosticar el cáncer y/o para determinar si las células cancerosas expresan CLDN6. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos útiles en el diagnóstico del cáncer
Las claudinas son proteínas integrales de membrana localizadas dentro de las uniones estrechas de epitelios y endotelios. Se predice que las claudinas tienen cuatro segmentos transmembrana con dos lazos extracelulares, y N- y C-terminales localizados en el citoplasma. La familia de proteínas transmembrana claudina (CLDN) desempeña un papel crítico en el mantenimiento de las uniones estrechas epiteliales y endoteliales y pueden desempeñar, además, un papel en el mantenimiento del citoesqueleto y en la señalización celular.
La claudina-6 (CLDN6) es un gen oncofetal que se expresa en células madre murinas y humanas, así como también en cuerpos embrioides comprometidos con el destino celular epitelial (Turksen, K. y otros (2001) Dev Dyn 222, 292-300; Anderson WJ. y otros (2008) Dev Dyn 237, 504-12; Turksen K. y otros (2002) Development, 129, 1775-84; Assou S. y otros (2007) Stem Cells 25, 961-73). Como un antígeno asociado a tumor, puede clasificarse como antígeno de diferenciación debido a su expresión durante la etapa temprana de la morfogénesis epidérmica, donde es crucial para la diferenciación epidérmica y la formación de barrera. Adicionalmente, se observó expresión en tejidos epiteliales o tejido epitelial normal neonatal de lengua, piel, estómago y mama (Abuazza G. y otros (2006), Am J Physiol Renal Physiol 291, 1132-1141; Troy T.C. y otros (2007), Molecular Biotechnology 36, 166-74; Zhao L. y otros (2008), Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 294, 1856-1862). Además de esto, los propios datos también revelan una expresión baja o muy baja de CLDN6 en la placenta humana, la vejiga urinaria, el endometrio, la próstata y el nervio periférico y una sobreexpresión frecuente de CLDN6 en diferentes cánceres. Se ha demostrado que CLDN6 se sobreexpresa en tumores, que incluyen tumores cerebrales pediátricos, adenocarcinomas gástricos y tumores de células germinales, así como también carcinomas viscerales tales como carcinomas de ovario. También se ha demostrado que la sobreexpresión de CLDN6 en células de cáncer gástrico resulta en una mayor invasividad, migración y proliferación, lo que sugiere que CLDN6 es un marcador de mal pronóstico y puede desempeñar un papel potencial en el mantenimiento del fenotipo maligno. Además, se ha demostrado que CLDN6 funciona como supresor del cáncer mediante la inhibición de la proliferación celular y la inducción de la apoptosis en líneas celulares de cáncer de mama.
El alineamiento de secuencias de CLDN3, CLDN4, CLDN6 y CLDN9 que se muestra en la Figura 1B ilustra que existe un alto grado de conservación de CLDN6 con respecto a otras proteínas claudina. Esta alta homología de CLDN6 con otras proteínas claudina, en particular CLDN9 y CLDN4, hace que sea difícil proporcionar anticuerpos contra CLDN6 que tengan propiedades tales como especificidad y afinidad adecuadas para fines de diagnóstico. Los presentes inventores descubrieron que los anticuerpos dirigidos contra un epítopo determinado localizado dentro de la porción C-terminal de CLDN6 cumplen con los criterios de aplicabilidad diagnóstica de los anticuerpos, en particular para detectar e identificar células que expresan CLDN6.
Los anticuerpos contra CLDN6 se conocen en la técnica, como se ilustra por HOPCRAFT SHARON E Y OTROS: "Selection of a hepatitis C virus with altered entry factor requirements reveals a genetic interaction between the E1 glycoprotein and claudins.", HEPATOLOGY, vol. 62, no. 4, octubre de 2015 (2015-10), páginas 1059-1069.
Los anticuerpos de la enseñanza son útiles, por ejemplo, en el diagnóstico del cáncer y/o en para determinar si las células cancerosas expresan CLDN6. Preferentemente, una enfermedad cancerosa o una célula cancerosa se caracteriza por la expresión de superficie de CLDN6. Las células cancerosas que expresan CLDN6 son dianas adecuadas para terapias dirigidas a CLDN6, tales como terapia con anticuerpos dirigidos contra CLDN6. En una modalidad, las células cancerosas expresan o expresan de manera aberrante CLDN6 mientras que las células normales correspondientes no expresan CLDN6 o expresan CLDN6 a un nivel más bajo.
Resumen de la enseñanza reivindicada
La presente invención se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno comprende:
una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) que comprende:
una VHCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 51 o la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 57;
una VHCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 52 o la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 58; y
una VHCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53; y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende:
una VLCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54;
una VLCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55; y
una VLCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56; y que se une: (i) a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos EYPTKNY (SEQ ID NO: 38), y/o
(ii) a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos EYPTKNYV (SEQ ID NO: 29).
La presente invención se refiere, además, a un método para detectar CLDN6 o la cantidad de CLDN6 en una muestra que comprende las etapas de:
(i) poner en contacto una muestra con el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 y
(ii) detectar la formación de un complejo o la cantidad de un complejo entre el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno y CLDN6.
La presente invención se refiere, además, a un método para detectar células que expresan CLDN6 que comprende las etapas de:
(i) poner en contacto una muestra celular con el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 y
(ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno y CLDN6 que se expresa por las células en dicha muestra.
La presente invención se refiere, además, a un método para el diagnóstico, detección o monitoreo de células cancerosas que expresan CLDN6 que comprende las etapas de:
(i) poner en contacto una muestra biológica con el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 y
(ii) detectar la formación de un complejo y/o la cantidad de un complejo entre el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno y CLDN6.
En una modalidad del método de la invención, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende:
una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) que comprende:
una VHCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 51;
una VHCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 52; y una VHCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53; y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende:
una VLCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54;
una VLCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55; y
una VLCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56; o una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) que comprende:
una VHCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 57;
una VHCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 58; y una VHCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53; y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende:
una VLCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54;
una VLCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55; y
una VLCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56.
En una modalidad del método de la invención, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende: (i) un anticuerpo que se produce por, o que puede obtenerse de un clon depositado bajo el núm. de acceso DSM ACC3313 (58-1B), DSM ACC3312 (58-3A) o DSM ACC3311 (58-4B-2), o (ii) un anticuerpo que es una forma humanizada o quimérica del anticuerpo según (i), o un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo de (i) o (ii).
En una modalidad del método de la invención, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende un anticuerpo que se produce por, o que puede obtenerse de, un clon depositado bajo el núm. de acceso DSM ACC3313 (58-1B), DSM ACC3312 (58-3A) o DSM ACC3311 (58-4B-2).
En una modalidad del método de la invención, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende:
una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) que comprende:
una VHCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 51;
una VHCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 52; y una VHCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53; y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende:
una VLCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54;
una VLCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55; y
una VLCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56; o
una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) que comprende:
una VHCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 57;
una VHCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 58; y una VHCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53; y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende:
una VLCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54;
una VLCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55; y una VLCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56.
En una modalidad del método de la invención, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende:
(i) un anticuerpo que se produce por, o que puede obtenerse de, un clon depositado bajo el núm. de acceso DSM ACC3313 (58-1B), DSM ACC3312 (58-3A) o DSM ACC3311 (58-4B-2), o (ii) un anticuerpo que es una forma humanizada o quimérica del anticuerpo según (i), o un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo de (i) o (ii).
En una modalidad del método de la invención, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende un anticuerpo que se produce por, o que puede obtenerse de, un clon depositado bajo el núm. de acceso DSM ACC3313 (58-1B), DSM ACC3312 (58-3A) o DSM ACC3311 (58-4B-2).
En una modalidad del método de la invención, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende:
una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) que comprende:
una VHCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 51;
una VHCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 52; y una VHCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53; y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende:
una VLCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54;
una VLCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55; y una VLCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56; o una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) que comprende:
una VHCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 57;
una VHCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 58; y una VHCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53; y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende:
una VLCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54;
una VLCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55; y una VLCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56.
En una modalidad del método de la invención, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende:
(i) un anticuerpo que se produce por, o que puede obtenerse de, un clon depositado bajo el núm. de acceso DSM ACC3313 (58-1B), DSM ACC3312 (58-3A) o DSM ACC3311 (58-4B-2), o (ii) un anticuerpo que es una forma humanizada o quimérica del anticuerpo según (i), o un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo de (i) o (ii).
En una modalidad del método de la invención, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende un anticuerpo que se produce por, o que puede obtenerse de, un clon depositado bajo el núm. de acceso DSM ACC3313 (58-1B), DSM ACC3312 (58-3A) o DSM ACC3311 (58-4B-2).
En una modalidad, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de la invención comprende:
una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) que comprende:
una VHCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 51;
una VHCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 52; y una VHCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53; y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende:
una VLCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54;
una VLCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55; y una VLCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56; o una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) que comprende:
una VHCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 57;
una VHCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 58; y una VHCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53; y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende:
una VLCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54;
una VLCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55; y una VLCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56.
En una modalidad, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de la invención de este comprende:
(i) un anticuerpo que se produce por, o que puede obtenerse de, un clon depositado bajo el núm. de acceso DSM ACC3313 (58-1B), DSM ACC3312 (58-3A) o DSM ACC3311 (58-4B-2), o (ii) un anticuerpo que es una forma humanizada o quimérica del anticuerpo según (i), o un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo de (i) o (ii).
En una modalidad, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de la invención comprende un anticuerpo que se produce por, o que puede obtenerse de, un clon depositado bajo el núm. de acceso DSM ACC3313 (58-1B), DSM ACC3312 (58-3A) o DSM ACC3311 (58-4B-2).
Resumen de la enseñanza general
La presente descripción proporciona enseñanzas que en algunos aspectos van más allá de la invención como tal, que se define exclusivamente mediante las reivindicaciones adjuntas. Las enseñanzas se proporcionan para colocar la presente invención en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Tal información técnica adicional que no cae dentro del alcance de las reivindicaciones anexas, no es parte de la invención. En particular, los términos "modalidad" y "aspecto" no deben interpretarse como que se refieren necesariamente a una modalidad de la invención, a menos que la "modalidad" o "aspecto" en cuestión caiga dentro del alcance de las reivindicaciones.
En un aspecto, la presente enseñanza se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este, que se une:
(i) a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos EYPTKNY (SEQ ID NO: 38), y/o
(ii) a claudina 6 (CLDN6), en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este se une a CLDN6 al unirse al menos a un epítopo dentro de CLDN6 que tiene la secuencia de aminoácidos EYPTKNY (SEQ ID NO: 38), y/o
(iii) a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos EYPTKNYV (SEQ ID NO: 29), y/o
(iv) a claudina 6 (CLDN6), en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este se une a CLDN6 al unirse al menos a un epítopo dentro de CLDN6 que tiene la secuencia de aminoácidos EYPTKNYV (SEQ ID NO: 29), y/o
(v) a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos AISRGPSEYPTKNYV (SEQ ID NO: 15), en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este no se une a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos TSAPAISRGPSEYPT (SEQ ID NO: 14), y/o
(vi) a claudina 6 (CLDN6), en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este se une a CLDN6 al unirse al menos a un epítopo dentro de CLDN6 que tiene la secuencia de aminoácidos AISRGPSEYPTKNYV (SEQ ID NO: 15), en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este no se une a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos TSAPAISRGPSEYPT (SEQ ID NO: 14).
En modalidades de aspectos descritos en la presente descripción y en aspectos adicionales, la presente enseñanza se refiere a un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión al antígeno de este que
(i) se une a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos AISRGPSEYPTKNYV (SEQ ID NO: 15) y/o
(ii) se une a la claudina 6 (CLDN6), en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este se une a CLDN6 al unirse al menos a un epítopo dentro de CLDN6 que tiene la secuencia de aminoácidos AISRGPSEYPTKNYV (SEQ ID NO: 15).
En modalidades de aspectos descritos en la presente descripción y en aspectos adicionales, la presente enseñanza se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este, que se une a uno o más, preferentemente a todos, de los siguientes péptidos:
PAISRGPSEYPTKNY (SEQ ID NO: 22), AISRGPSEYPTKNYV (SEQ ID NO: 15), ISRGPSEYPTKNYV (SEQ ID NO: 23), SRGPSEYPTKNYV (SEQ ID NO: 24), RGPSEYPTKNYV (SEQ ID NO: 25), GPSEYPTKNYV (SEQ ID NO: 26), PSEYPTKNYV (SEQ ID NO: 27), SEYPTKNYV (SEQ ID NO: 28), y EYPTKNYV (SEQ ID NO: 29), en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este no se une a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos TSAPAISRGPSEYPT (SEQ ID NO: 14).
En una modalidad, la diferencia en la afinidad de unión al péptido al que se une el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno con la afinidad más baja y al péptido al que se une el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno con la afinidad más alta es 50 % o menos, 40 % o menos, 30 % o menos, 20 % o menos, o 10 % o menos.
Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos en la presente descripción preferentemente no se unen a un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos EYPTK (SEQ ID NO: 59) y/o la secuencia de aminoácidos EYPTKN (SEQ ID NO: 60) pero no comprenden la secuencia de aminoácidos EYPTKNY (SEQ ID NO: 38). En otras palabras, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno descrito en la presente descripción que se une a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos EYPTKNY (SEQ ID NO: 38) y/o un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos EYPTKNYV (SEQ ID NO: 29) se une a dicho(s) péptido(s) debido a la presencia de la segunda tirosina que está ausente en la secuencia de aminoácidos EYPTK (SEQ ID NO: 59) y/o la secuencia de aminoácidos EYPTKN (SEQ ID NO: 60). Como se muestra en la presente descripción, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno preferidos no se unen a un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos YPTKNY (SEQ ID NO: 61) y/o EYPTKN (SEQ ID NO: 60) pero no comprenden la secuencia de aminoácidos EYPTKNY (SEQ ID NO: 38) lo que sugiere que la secuencia de aminoácidos EYPTKNY (SEQ ID NO: 38) es una secuencia que puede considerarse un epítopo mínimo para la unión de estos anticuerpos.
En modalidades de aspectos descritos en la presente descripción y en aspectos adicionales, la presente enseñanza se refiere a un anticuerpo que se produce por, o que puede obtenerse de, un hibridoma depositado en el DSMZ (Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Alemania) y que tiene una de las siguientes designaciones y números de acceso:
1. 58-4B-2, núm. de acceso DSM ACC3311, depositado el 29 de noviembre de 2016;
2. 58-3A, núm. de acceso DSM ACC3312, depositado el 29 de noviembre de 2016; o
3. 58-1B, núm. de acceso DSM ACC3313, depositado el 29 de noviembre de 2016.
Los anticuerpos de la enseñanza se designan en la presente descripción mediante la referencia a la designación del anticuerpo y/o mediante la referencia al clon que produce el anticuerpo.
La presente enseñanza se refiere, además, a un anticuerpo que compite por la unión a CLDN6 con un anticuerpo que se produce por, y que puede obtenerse de, los hibridomas descritos anteriormente y/o tiene la especificidad por CLDN6 de un anticuerpo que se produce por, o que puede obtenerse de, los hibridomas descritos anteriormente. En estas y otras modalidades, la presente enseñanza se refiere, además, a un anticuerpo que comprende una porción de unión al antígeno o un sitio de unión al antígeno, en particular una región variable, idéntica o altamente homóloga a la de los anticuerpos que se producen por, o que pueden obtenerse de, los hibridomas descritos anteriormente. Se contempla que los anticuerpos preferidos son aquellos que tienen regiones CDR idénticas o altamente homólogas a las regiones CDR de anticuerpos que se producen por, o que pueden obtenerse de, los hibridomas descritos anteriormente. Por "altamente homólogo" se contempla que a partir de 1 a 5, preferentemente, a partir de 1 a 4, tal como 1 a 3 o 1 o 2 sustituciones de aminoácidos pueden hacerse en cada región de CDR. Los anticuerpos particularmente preferidos son las formas humanizadas y quiméricas de los anticuerpos que se producen por, o que pueden obtenerse de, los hibridomas descritos anteriormente.
En consecuencia, en modalidades de aspectos descritos en la presente descripción y en aspectos adicionales, la presente enseñanza se refiere a un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en: (i) un anticuerpo que se produce por, o que puede obtenerse de, un clon depositado bajo el núm. de acceso DSM ACC3313 (58-1B), DSM ACC3312 (58-3A) o DSM ACC3311 (58-4B-2),
(ii) un anticuerpo que es una forma quimérica o humanizada del anticuerpo según (i),
(iii) un anticuerpo que compite por la unión a CLDN6 con un anticuerpo según (i),
(iv) un anticuerpo que tiene la especificidad del anticuerpo según (i),
y
(v) un anticuerpo que comprende la porción de unión al antígeno o sitio de unión al antígeno del anticuerpo según (i), o
un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo según una cualquiera de (i) a (v).
En una modalidad, la porción de unión al antígeno o sitio de unión al antígeno del anticuerpo según (i) comprende la región variable del anticuerpo según (i).
En modalidades de aspectos descritos en la presente descripción y en aspectos adicionales, la presente enseñanza se refiere a un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo que comprende:
una cadena pesada de anticuerpo que comprende:
(i) una secuencia de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con las SEQ ID NO: 40, 42 o 44, o una variante de estas,
(ii) al menos una, preferentemente dos, con mayor preferencia las tres secuencias de CDR de una secuencia de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con las SEQ ID NO: 40, 42 o 44, o una variante de estas, o
(iii) una secuencia de CDR3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 53 o una variante de esta y preferentemente que comprende además una secuencia de CDR1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 51 o 57, o una variante de esta y/o una secuencia de CDR2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 52 o 58, o una variante de esta, y
(b) un anticuerpo que compite por la unión a CLDN6 con un anticuerpo de acuerdo con (a) y/o tiene la especificidad por CLDN6 de un anticuerpo de acuerdo con (a),
o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo.
En modalidades de aspectos descritos en la presente descripción y en aspectos adicionales, la presente enseñanza se refiere a un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo que comprende:
una cadena ligera de anticuerpo que comprende:
(i) una secuencia de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con las SEQ ID NO: 41, 43 o 45, o una variante de estas,
(ii) al menos una, preferentemente dos, con mayor preferencia las tres secuencias de CDR de una secuencia de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con las SEQ ID NO: 41, 43, o 45, o una variante de estas, o
(iii) una secuencia de CDR3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 56 o una variante de esta y preferentemente que comprende además una secuencia de CDR1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 54, o una variante de esta y/o una secuencia de CDR2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 55, o una variante de esta, y
(b) un anticuerpo que compite por la unión a CLDN6 con un anticuerpo de acuerdo con (a) y/o tiene la especificidad por CLDN6 de un anticuerpo de acuerdo con (a),
o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo.
En modalidades de aspectos descritos en la presente descripción y en aspectos adicionales, la presente enseñanza se refiere a un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo que comprende:
(I) una cadena pesada de anticuerpo que comprende:
(i) una secuencia de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con las SEQ ID NO: 40, 42 o 44, o una variante de estas,
(ii) al menos una, preferentemente dos, con mayor preferencia las tres secuencias de CDR de una secuencia de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con las SEQ ID NO: 40, 42 o 44, o una variante de estas, o
(iii) una secuencia de CDR3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 53 o una variante de esta y preferentemente que comprende además una secuencia de CDR1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 51 o 57, o una variante de esta y/o una secuencia de CDR2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 52 o 58, o una variante de esta, y/o
(II) una cadena ligera de anticuerpo que comprende:
(i) una secuencia de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con las SEQ ID NO: 41, 43 o 45, o una variante de estas,
(ii) al menos una, preferentemente dos, con mayor preferencia las tres secuencias de CDR de una secuencia de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con las SEQ ID NO: 41, 43, o 45, o una variante de estas, o
(iii) una secuencia de CDR3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 56 o una variante de esta y preferentemente que comprende además una secuencia de CDR1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 54, o una variante de esta y/o una secuencia de CDR2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 55, o una variante de esta, y
(b) un anticuerpo que compite por la unión a CLDN6 con un anticuerpo de acuerdo con (a) y/o tiene la especificidad por CLDN6 de un anticuerpo de acuerdo con (a),
o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo.
En determinadas modalidades preferidas, la presente enseñanza se refiere a un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo que comprende:
(I) una cadena pesada de anticuerpo que comprende:
(i) una secuencia de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 40, o una variante de esta,
(ii) al menos una, preferentemente dos, con mayor preferencia las tres secuencias de CDR de una secuencia de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 40, o una variante de esta, o
(iii) una secuencia de CDR3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 53 o una variante de esta y preferentemente que comprende además una secuencia de CDR1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 51, o una variante de esta y/o una secuencia de CDR2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 52, o una variante de esta, y
(II) una cadena ligera de anticuerpo que comprende:
(i) una secuencia de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 41, o una variante de esta,
(ii) al menos una, preferentemente dos, con mayor preferencia las tres secuencias de CDR de una secuencia de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 41, o una variante de esta, o
(iii) una secuencia de CDR3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 56 o una variante de esta y preferentemente que comprende además una secuencia de CDR1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 54, o una variante de esta y/o una secuencia de CDR2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 55, o una variante de esta, y
(b) un anticuerpo que compite por la unión a CLDN6 con un anticuerpo de acuerdo con (a) y/o tiene la especificidad por CLDN6 de un anticuerpo de acuerdo con (a),
o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo.
En determinadas modalidades preferidas, la presente enseñanza se refiere a un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo que comprende:
(I) una cadena pesada de anticuerpo que comprende:
(i) una secuencia de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 42, o una variante de esta,
(ii) al menos una, preferentemente dos, con mayor preferencia las tres secuencias de CDR de una secuencia de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 42, o una variante de esta, o
(iii) una secuencia de CDR3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 53 o una variante de esta y preferentemente que comprende además una secuencia de CDR1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 57, o una variante de esta y/o una secuencia de CDR2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 58, o una variante de esta, y
(II) una cadena ligera de anticuerpo que comprende:
(i) una secuencia de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 43, o una variante de esta,
(ii) al menos una, preferentemente dos, con mayor preferencia las tres secuencias de CDR de una secuencia de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 43, o una variante de esta, o
(iii) una secuencia de CDR3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 56 o una variante de esta y preferentemente que comprende además una secuencia de CDR1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 54, o una variante de esta y/o una secuencia de CDR2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 55, o una variante de esta, y
(b) un anticuerpo que compite por la unión a CLDN6 con un anticuerpo de acuerdo con (a) y/o tiene la especificidad por CLDN6 de un anticuerpo de acuerdo con (a),
o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo.
En determinadas modalidades preferidas, la presente enseñanza se refiere a un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo que comprende:
(I) una cadena pesada de anticuerpo que comprende:
(i) una secuencia de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 44, o una variante de esta,
(ii) al menos una, preferentemente dos, con mayor preferencia las tres secuencias de CDR de una secuencia de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 44, o una variante de esta, o
(iii) una secuencia de CDR3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 53 o una variante de esta y preferentemente que comprende además una secuencia de CDR1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 57, o una variante de esta y/o una secuencia de CDR2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 58, o una variante de esta, y
(II) una cadena ligera de anticuerpo que comprende:
(i) una secuencia de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 45, o una variante de esta,
(ii) al menos una, preferentemente dos, con mayor preferencia las tres secuencias de CDR de una secuencia de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 45, o una variante de esta, o
(iii) una secuencia de CDR3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 56 o una variante de esta y preferentemente que comprende además una secuencia de CDR1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 54, o una variante de esta y/o una secuencia de CDR2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 55, o una variante de esta, y
(b) un anticuerpo que compite por la unión a CLDN6 con un anticuerpo de acuerdo con (a) y/o tiene la especificidad por CLDN6 de un anticuerpo de acuerdo con (a),
o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo.
En determinadas modalidades preferidas, la presente enseñanza se refiere a un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo que comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de CDR3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 53 o una variante de esta y una cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia de CDR3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 56 o una variante de esta, y
(b) un anticuerpo que compite por la unión a CLDN6 con un anticuerpo de acuerdo con (a) y/o tiene la especificidad por CLDN6 de un anticuerpo de acuerdo con (a),
o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo.
En determinadas modalidades preferidas, la presente enseñanza se refiere a un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo que comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de CDR3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 53 o una variante de esta y que comprende además una secuencia de CDR1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 51, o una variante de esta y una secuencia de CDR2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 52, o una variante de esta, y una cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia de CDR3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 56 o una variante de esta y que comprende además una secuencia de CDR1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 54, o una variante de esta y una secuencia de CDR2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 55, o una variante de esta, y
(b) un anticuerpo que compite por la unión a CLDN6 con un anticuerpo de acuerdo con (a) y/o tiene la especificidad por CLDN6 de un anticuerpo de acuerdo con (a),
o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo.
En determinadas modalidades preferidas, la presente enseñanza se refiere a un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo que comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende una secuencia de CDR3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 53 o una variante de esta y que comprende además una secuencia de CDR1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 57, o una variante de esta y una secuencia de CDR2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 58, o una variante de esta, y una cadena ligera de anticuerpo que comprende una secuencia de CDR3 de acuerdo con la SEQ ID NO: 56 o una variante de esta y que comprende además una secuencia de CDR1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 54, o una variante de esta y una secuencia de CDR2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 55, o una variante de esta, y
(b) un anticuerpo que compite por la unión a CLDN6 con un anticuerpo de acuerdo con (a) y/o tiene la especificidad por CLDN6 de un anticuerpo de acuerdo con (a),
o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo.
En determinadas modalidades preferidas, la presente enseñanza se refiere a un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 40 o una variante de esta y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 41 o una variante de esta, y
(b) un anticuerpo que compite por la unión a CLDN6 con un anticuerpo de acuerdo con (a) y/o tiene la especificidad por CLDN6 de un anticuerpo de acuerdo con (a),
o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo.
En determinadas modalidades preferidas, la presente enseñanza se refiere a un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 42 o una variante de esta y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 43 o una variante de esta, y
(b) un anticuerpo que compite por la unión a CLDN6 con un anticuerpo de acuerdo con (a) y/o tiene la especificidad por CLDN6 de un anticuerpo de acuerdo con (a),
o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo.
En determinadas modalidades preferidas, la presente enseñanza se refiere a un anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 44 o una variante de esta y una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 45 o una variante de esta, y
(b) un anticuerpo que compite por la unión a CLDN6 con un anticuerpo de acuerdo con (a) y/o tiene la especificidad por CLDN6 de un anticuerpo de acuerdo con (a),
o un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo.
En modalidades preferidas, un anticuerpo de la enseñanza comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende una región constante de la cadena pesada gamma-2a, preferentemente una región constante de la cadena pesada gamma-2a humana y/o comprende una cadena ligera de anticuerpo que comprende una región constante de la cadena ligera kappa.
Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno descritos en la presente descripción se unen a CLDN6. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la enseñanza es preferentemente capaz de unirse a CLDN6 en su estado nativo, es decir, de origen natural o estado no desnaturalizado, o en su estado desnaturalizado. En una modalidad, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este de la enseñanza se une a CLDN6, pero no a CLDN9 y, preferentemente, no se une a CLDN4 y/o CLDN3. Preferentemente, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este de la enseñanza no se une sustancialmente a una proteína CLDN distinta de CLDN6. Preferentemente, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este de la enseñanza es específico para CLDN6.
En una modalidad, CLDN6 es CLDN6 unida a la membrana de la superficie celular. En una modalidad, CLDN6 está presente en células cancerosas, en donde dichas células cancerosas son, preferentemente, células cancerosas que expresan CLDN6. En una modalidad, dichas células cancerosas son células de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de ovario, en particular adenocarcinoma de ovario y teratocarcinoma de ovario, cáncer de pulmón, que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), en particular carcinoma de células escamosas y adenocarcinoma de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer pancreático, cáncer de piel, en particular carcinoma basocelular y carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, en particular adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, en particular sarcoma sinovial y carcinosarcoma, cáncer de conductos biliares, cáncer de vejiga urinaria, en particular carcinoma de células transicionales y carcinoma papilar, cáncer de riñón, en particular carcinoma de células renales, que incluye carcinoma de células renales de células claras y carcinoma de células renales papilares, cáncer de colon, cáncer de intestino delgado, que incluye cáncer de íleon, en particular adenocarcinoma de intestino delgado y adenocarcinoma de íleon, carcinoma embrionario testicular, coriocarcinoma placentario, cáncer de cuello uterino, cáncer testicular, en particular seminoma testicular, teratoma testicular y cáncer testicular embrionario, cáncer de útero, tumores de células germinales tales como teratocarcinoma o un carcinoma embrionario, en particular tumores de células germinales de los testículos, y las formas metastásicas de estos.
En una modalidad, un anticuerpo de la enseñanza es un anticuerpo quimérico, humano o humanizado. En una modalidad, un anticuerpo de la enseñanza es un anticuerpo monoclonal.
En una modalidad, un anticuerpo de la enseñanza puede obtenerse mediante un método que comprende la etapa de inmunizar un animal con un péptido que comprende, preferentemente, que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49, o un péptido inmunológicamente equivalente, o un ácido nucleico o célula hospedadora que expresa dicho péptido. Preferentemente, dicho péptido comprende no más de 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50 o 40 aminoácidos contiguos de CLDN6.
Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de la enseñanza pueden acoplarse, es decir, unirse covalentemente o no covalentemente, a otras porciones tales como marcadores detectables.
En un aspecto adicional, la presente enseñanza se refiere a un conjugado que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno descrito en la presente descripción que se acopla a al menos un marcador detectable.
La presente enseñanza se refiere, además, a una célula tal como un hibridoma que produce un anticuerpo como se describe en la presente descripción.
Los hibridomas preferidos son aquellos depositados en el DSMZ (Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Alemania) y que tienen una de las siguientes designaciones y números de acceso:
1. 58-4B-2, núm. de acceso DSM ACC3311, depositado el 29 de noviembre de 2016;
2. 58-3A, núm. de acceso DSM ACC3312, depositado el 29 de noviembre de 2016; o
3. 58-1B, núm. de acceso DSM ACC3313, depositado el 29 de noviembre de 2016.
La presente enseñanza se refiere, además, a un péptido que comprende, preferentemente, que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 49, o un péptido inmunológicamente equivalente. Preferentemente, dicho péptido comprende no más de 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50 o 40 aminoácidos contiguos de CLDN6.
La presente enseñanza se refiere, además, a ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o partes de estos, por ejemplo, una cadena de anticuerpo, o fragmentos de unión al antígeno, o péptidos como se describe en la presente descripción. Preferentemente, un ácido nucleico de la enseñanza se une operativamente a uno o más elementos de control de la expresión que permiten la expresión en células eucariotas o procariotas. Los elementos de control que aseguran la expresión en las células eucariotas o procariotas se conocen bien por aquellos con experiencia en la técnica.
Un ácido nucleico de la enseñanza puede estar comprendido en un vector, por ejemplo, un plásmido, cósmido, virus, bacteriófago u otro vector usado, por ejemplo, convencionalmente en la ingeniería genética. El vector puede comprender otros genes tales como genes marcadores que permiten la selección del vector en una célula hospedadora adecuada y en condiciones adecuadas. Además, el vector puede comprender elementos de control de la expresión que permiten la expresión adecuada de las regiones codificantes en los hospedadores adecuados. Tales elementos de control se conocen por el técnico y pueden incluir un promotor, un casete de empalme y un codón de iniciación de la traducción.
Los métodos para la construcción de moléculas de ácido nucleico, para la construcción de vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico, para la introducción de vectores en células hospedadoras elegidas apropiadamente, o para provocar o lograr la expresión de moléculas de ácido nucleico se conocen bien en la técnica.
Un aspecto adicional de la presente enseñanza se refiere a una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico o vector como se describe en la presente descripción.
Un aspecto adicional de la presente enseñanza se refiere a la detección de CLDN6 o de células que expresan CLDN6 o la determinación de la cantidad de CLDN6 o de células que expresan CLDN6 mediante el uso de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la enseñanza. La CLDN6 o las células que expresan CLDN6 se detectan o la cantidad de CLDN6 o de las células que expresan CLDN6 se determina mediante la detección o determinación de la cantidad de un complejo entre CLDN6 y un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la enseñanza. La formación de un complejo indica la presencia de CLDN6 o de células que expresan CLDN6. Tal detección o determinación de la cantidad puede realizarse de varias maneras, que incluyen, pero no se limitan a la inmunodetección mediante el uso de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la enseñanza. Los métodos que usan anticuerpos para detectar péptidos o proteínas se conocen bien e incluyen ELISA, ensayos de unión competitiva y similares. En general, tales ensayos usan un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente al péptido o proteína diana unido directa o indirectamente a un marcador que proporciona la detección, por ejemplo, enzimas indicadoras, radiomarcadores, fluoróforos o partículas paramagnéticas. Los métodos de la enseñanza permiten evaluaciones cuantitativas y/o cualitativas, por ejemplo, evaluaciones absolutas y/o relativas, de los niveles de CLDN6 o de los niveles de las células que expresan CLDN6.
En un aspecto, la presente enseñanza se refiere a un método para detectar CLDN6 o determinar la cantidad de CLDN6 en una muestra que comprende las etapas de:
(i) poner en contacto una muestra con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la enseñanza o un conjugado de la enseñanza y
(ii) detectar la formación de un complejo o determinar la cantidad de un complejo entre el anticuerpo, el fragmento de unión al antígeno o el conjugado y CLDN6.
En una modalidad, la muestra es una muestra celular, es decir, una muestra que comprende células tales como células cancerosas. En esta modalidad, el complejo se forma, preferentemente, entre el anticuerpo, el fragmento de unión al antígeno o el conjugado y CLDN6 que se expresa por las células en dicha muestra. En un aspecto, la presente enseñanza se refiere a un método para determinar si las células expresan CLDN6 que comprende las etapas de:
(i) poner en contacto una muestra celular con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la enseñanza o un conjugado de la enseñanza y
(ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo, el fragmento de unión al antígeno o el conjugado y CLDN6 que se expresa por las células en dicha muestra.
En una modalidad, las células en la muestra son células cancerosas. El complejo se forma, preferentemente, entre el anticuerpo, el fragmento de unión al antígeno o el conjugado y CLDN6 que se expresa por las células en dicha muestra.
Otros aspectos de la presente enseñanza se refieren a métodos para diagnosticar o clasificar enfermedades mediante la detección de CLDN6, mediante el uso de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la enseñanza. Estos métodos proporcionan la detección selectiva de células que expresan CLDN6, de esta manera se diferencian estas células de células normales que no expresan CLDN6 o de células enfermas que no expresan CLDN6. Las enfermedades caracterizadas por células enfermas que expresan CLDN6 pueden ser tratadas mediante una terapia dirigida a CLDN6, tal como la terapia con anticuerpos terapéuticos dirigidos contra CLDN6. Las enfermedades preferidas para una terapia o diagnóstico son aquellas en las que se expresa CLDN6 o se expresa de manera aberrante, en particular enfermedades cancerosas, tales como las descritas en la presente descripción.
En un aspecto, la presente enseñanza se refiere a métodos para diagnóstico, detección o monitoreo, es decir, que determinan la regresión, progresión, evolución y/o inicio, de una enfermedad cancerosa que comprende la detección de CLDN6 o de células que expresan CLDN6 y/o que determinan la cantidad de CLDN6 o de células que expresan CLDN6 en una muestra biológica aislada de un paciente mediante el uso de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la enseñanza. Tales métodos pueden usarse para detectar si un sujeto tiene una enfermedad cancerosa o está en riesgo (aumentado) de desarrollar una enfermedad cancerosa o, por ejemplo, si un régimen de tratamiento es eficiente.
Por lo tanto, en un aspecto, la presente enseñanza se refiere a un método para el diagnóstico, detección o monitoreo de cáncer que comprende las etapas de:
(i) poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la enseñanza o un conjugado de la enseñanza y
(ii) detectar la formación de un complejo y/o determinar la cantidad de un complejo entre el anticuerpo, el fragmento de unión al antígeno o el conjugado y CLDN6.
En una modalidad, la muestra biológica es una muestra celular, es decir, una muestra que comprende células tales como células cancerosas. En esta modalidad, el complejo se forma, preferentemente, entre el anticuerpo, el fragmento de unión al antígeno o el conjugado y CLDN6 que se expresa por las células en dicha muestra.
Los métodos de monitoreo de acuerdo con la enseñanza comprenden, preferentemente, una detección y/o determinación de la cantidad de CLDN6 o de células que expresan CLDN6 en una primera muestra en un primer momento y en una muestra adicional en un segundo momento, en donde la regresión, progresión, evolución y/o inicio de una enfermedad tumoral pueden determinarse mediante la comparación de las dos muestras.
Típicamente, el nivel de CLDN6 o el nivel de células que expresan CLDN6 en una muestra biológica se compara con un nivel de referencia, en donde una desviación de dicho nivel de referencia es indicativa de la presencia y/o etapa de una enfermedad cancerosa en un sujeto. El nivel de referencia puede ser un nivel que se determina en una muestra de control (por ejemplo, de un tejido o sujeto saludable, en particular un paciente sin una enfermedad cancerosa) o un nivel de la mediana de sujetos saludables. Una "desviación" de dicho nivel de referencia designa cualquier cambio significativo, tal como un aumento en al menos 10 %, 20 % o 30 %, preferentemente, en al menos 40 % o 50 %, o incluso más.
Preferentemente, la presencia de CLDN6 o de células que expresan CLDN6 y/o una cantidad de CLDN6 o de células que expresan CLDN6 que aumenta en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo, en comparación con un paciente sin una enfermedad cancerosa, indica la presencia de o el riesgo de (es decir, un potencial para un desarrollo de) una enfermedad cancerosa en el paciente.
Una cantidad de CLDN6 o de células que expresan CLDN6 que disminuye en comparación con una muestra biológica tomada anteriormente de un paciente puede indicar una regresión, una evolución positiva, por ejemplo, un tratamiento exitoso, o un riesgo reducido de inicio de una enfermedad cancerosa en un paciente. Una cantidad de CLDN6 o de células que expresan CLDN6 que aumenta en comparación con una muestra biológica tomada anteriormente de un paciente puede indicar una progresión, una evolución negativa, por ejemplo, un tratamiento fallido, recurrencia o comportamiento metastásico, un inicio o un riesgo de un inicio de una enfermedad cancerosa en dicho paciente.
En un aspecto, la presente enseñanza se refiere a un método para determinar si un cáncer puede ser tratado mediante una terapia contra el cáncer dirigida a CLDN6 que comprende las etapas de:
(i) poner en contacto una muestra que comprende células cancerosas con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la enseñanza o un conjugado de la enseñanza y
(ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo, el fragmento de unión al antígeno o el conjugado y CLDN6.
El complejo se forma, preferentemente, entre el anticuerpo, el fragmento de unión al antígeno o el conjugado y CLDN6 que se expresa por células cancerosas en dicha muestra.
Tales métodos pueden usarse para detectar si un paciente es adecuado para una terapia que involucra el direccionamiento hacia células que expresan CLDN6, tal como una terapia que usa anticuerpos que ejercen una o más funciones efectoras inmunitarias tales como anticuerpos citotóxicos específicos de CLDN6, por ejemplo, anticuerpos marcados con una sustancia citotóxica tal como una toxina o un radiomarcador o que inducen un mecanismo de destrucción celular tal como CDC o ADCC. Las enfermedades caracterizadas por células enfermas que expresan CLDN6 pueden ser tratadas mediante una terapia dirigida a CLDN6, tal como enfermedades cancerosas, en particular las descritas en la presente descripción.
En una modalidad de cualquiera de los aspectos anteriores, la muestra, muestra celular o muestra biológica es de un paciente que tiene una enfermedad cancerosa, que se sospecha que tiene o enferma de una enfermedad cancerosa o que tiene un potencial para una enfermedad cancerosa. En una modalidad, la muestra, muestra celular o muestra biológica es de un tejido u órgano en donde las células cuando el tejido u órgano no tiene cáncer no expresan sustancialmente CLDN6. Preferentemente, dicho tejido es un tejido diferente al tejido de la placenta. Preferentemente, dicho tejido ya se ha diagnosticado como que está afectado por una enfermedad cancerosa, por ejemplo, mediante inspección visual o prueba de cultivo de células de dicho tejido u órgano. En esta modalidad, la presencia de CLDN6 o de células que expresan CLDN6 y/o una cantidad de CLDN6 o de células que expresan CLDN6 que aumenta en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo, en comparación con un paciente sin una enfermedad tumoral, puede indicar que un paciente es adecuado para una terapia que involucra el direccionamiento hacia células que expresan CLDN6.
En un aspecto, la enseñanza proporciona composiciones, por ejemplo, composiciones de diagnóstico, o kits, que comprenden un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno o una combinación de anticuerpos y/o fragmentos de unión al antígeno descritos en la presente descripción. Tales composiciones de diagnóstico o kits de prueba son útiles en los métodos de la enseñanza, tales como los métodos para el diagnóstico, la detección o el monitoreo de la enseñanza. Estos kits pueden comprender opcionalmente un marcador detectable, por ejemplo, enzimas indicadoras, radiomarcadores, fluoróforos o partículas paramagnéticas. Los kits pueden incluir folletos informativos, por ejemplo, folletos que informan sobre cómo usar reactivos para practicar un método descrito en la presente descripción.
Otras características y ventajas de la enseñanza instantánea serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.
Descripción detallada de la enseñanza
Aunque la presente enseñanza se describe en detalle más abajo, debe entenderse que esta enseñanza no se limita a las metodologías, protocolos y reactivos particulares descritos en la presente descripción ya que estos pueden variar. Debe entenderse, además, que la terminología usada en la presente descripción es para el propósito de describir solo modalidades particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente enseñanza la cual solo se limitará por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente descripción tienen el mismo significado que los entendidos comúnmente por un experto en la técnica.
A continuación, se describirán los elementos de la presente enseñanza. Estos elementos se enumeran con modalidades específicas; sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear modalidades adicionales. Los ejemplos descritos de diversas maneras y las modalidades preferidas no deben interpretarse para limitar la presente invención solo a las modalidades descritas explícitamente. Esta descripción debe entenderse para sustentar y abarcar modalidades que combinan las modalidades descritas explícitamente con cualquier número de los elementos descritos y/o preferidos. Además, cualquier permutación y combinación de todos los elementos descritos en esta solicitud debe considerarse descrita por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto lo indique de cualquier otra manera.
Preferentemente, los términos usados en la presente descripción se definen como se describió en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, y H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-40l0 Basel, Suiza, (1995).
La práctica de la presente enseñanza empleará, a menos que se indique de otra forma, métodos convencionales de química, bioquímica, biología celular, inmunología y técnicas de ADN recombinante que se explican en la literatura en el campo (consulte, por ejemplo,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2da edición, J. Sambrooky otros, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
A lo largo de esta descripción y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera, la palabra "comprender", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas indicados pero no la exclusión de cualquier otro miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas aunque en algunas modalidades tal otro miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas pueden excluirse, es decir, el tema de la invención consiste en la inclusión de un miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas indicados. Los términos "un" y "una" y "el/la" y referentes similares usados en el contexto para describir la enseñanza (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otra forma en la presente descripción, o claramente se contradiga por el contexto. La enumeración de los intervalos de valores en la presente descripción pretende servir simplemente como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo. A menos que se indique de otra forma en la presente descripción, cada valor individual se incorpora en la descripción como si se enumerara individualmente en la presente descripción. Todos los métodos que se describen en la presente descripción pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique de otra forma en la presente descripción o que el contexto lo contradiga claramente de cualquier otra manera. El uso de cualquiera y de todos los ejemplos, o de lenguaje ilustrativo (por ejemplo, "tal como") proporcionados en la presente descripción, sólo tiene la intención de aclarar mejor la enseñanza y no plantea una limitación en el alcance de la enseñanza a menos que se declare de cualquier otra manera. De ninguna manera el lenguaje en la descripción debe interpretarse como indicación de cualquier elemento no reivindicado esencial para la práctica de la enseñanza.
El término "recombinante" en el contexto de la presente enseñanza significa "hecho a través de la ingeniería genética". Preferentemente, un "objeto recombinante" tal como una célula recombinante en el contexto de la presente enseñanza, no es de origen natural.
El término "de origen natural" como se usa en la presente descripción se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, es de origen natural un péptido o ácido nucleico que está presente en un organismo (que incluye los virus) y que puede aislarse a partir de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio.
El término "antígeno" se refiere a un agente que comprende un epítopo contra el cual se dirige y/o se va a generar una respuesta inmunitaria. Preferentemente, un antígeno en el contexto de la presente enseñanza es una molécula que, opcionalmente después del procesamiento, induce una reacción inmunitaria, que es, preferentemente, específica para el antígeno. El término "antígeno" incluye en particular proteínas, péptidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, especialmente ARN yADN, y nucleótidos.
El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico en una molécula tal como un antígeno, es decir, a la parte de una molécula que se reconoce por el sistema inmunitario, por ejemplo, que se reconoce por un anticuerpo. Por ejemplo, los epítopos son los sitios discretos, tridimensionales en un antígeno, que se reconocen por el sistema inmunitario. Los epítopos usualmente consisten en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas tales como los aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y tienen usualmente características específicas de estructura tridimensional, así como también características específicas de carga. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión al primero pero no al último se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. Un epítopo de una proteína tal como CLDN comprende, preferentemente, una porción continua o discontinua de dicha proteína y está, preferentemente, entre 5 y 100, preferentemente, entre 5 y 50, con mayor preferencia entre 8 y 30, con la máxima preferencia entre 10 y 25 aminoácidos de longitud, por ejemplo, el epítopo puede tener, preferentemente, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos de longitud.
El término "epítopo discontinuo" como se usa en la presente descripción, se refiere a un epítopo conformacional en un antígeno proteico que se forma a partir de al menos dos regiones separadas en la secuencia primaria de la proteína.
Los antígenos incluyen antígenos asociados a tumores, tales como CLDN6, es decir, constituyentes de células cancerosas que pueden derivarse del citoplasma, la superficie celular y el núcleo celular, en particular aquellos antígenos que se producen, preferentemente en grandes cantidades, intracelularmente o como antígenos de superficie en células cancerosas.
En el contexto de la presente enseñanza, los términos "antígeno asociado a tumor" o "antígeno tumoral" se refieren a proteínas que en condiciones normales se expresan específicamente en un número limitado de tejidos y/u órganos o en etapas del desarrollo específicas, por ejemplo, el antígeno asociado a tumor puede expresarse específicamente en condiciones normales en tejido estomacal, preferentemente, en la mucosa gástrica, en órganos reproductores, por ejemplo, en el testículo, en tejido trofoblástico, por ejemplo, en la placenta, o en células de la línea germinal, y se expresan o se expresan de manera aberrante en uno o más tejidos tumorales o cancerosos. En este contexto, "un número limitado" significa, preferentemente, no más de 3, con mayor preferencia no más de 2. Los antígenos asociados a tumores en el contexto de la presente enseñanza incluyen, por ejemplo, antígenos de diferenciación, preferentemente, antígenos de diferenciación de tipo celular específico, es decir, proteínas que en condiciones normales se expresan específicamente en un determinado tipo de célula, en una determinada etapa de diferenciación, antígenos de cáncer/testículos, es decir, proteínas que en condiciones normales se expresan específicamente en testículos y algunas veces en la placenta, y antígenos específicos de línea germinal. En el contexto de la presente enseñanza, el antígeno asociado a tumores se asocia, preferentemente, con la superficie celular de una célula cancerosa y, preferentemente, no se expresa o solo se expresa rara vez en tejidos normales. Preferentemente, el antígeno asociado a tumores o la expresión aberrante del antígeno asociado a tumores identifica células cancerosas. En el contexto de la presente enseñanza, el antígeno asociado a tumores que se expresa por una célula cancerosa en un sujeto, por ejemplo, un paciente que padece de una enfermedad cancerosa, preferentemente, es una proteína propia en dicho sujeto. En modalidades preferidas, el antígeno asociado a tumores en el contexto de la presente enseñanza se expresa en condiciones normales específicamente en un tejido u órgano que no es esencial, es decir, tejidos u órganos que cuando son dañados por el sistema inmunitario no conducen a la muerte del sujeto, o en órganos o estructuras del cuerpo que no son, o son difícilmente asequibles, al sistema inmunitario. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos del antígeno asociado a tumores es idéntica entre el antígeno asociado a tumores que se expresa en tejidos normales y el antígeno asociado a tumores que se expresa en tejidos cancerosos.
Ejemplos de antígenos de diferenciación que cumplen idealmente los criterios para antígenos asociados a tumores como estructuras diana en la inmunoterapia contra el cáncer, en particular, en la vacunación contra el cáncer son las proteínas de superficie celular de la familia claudina, tales como CLDN6. Las claudinas son una familia de proteínas que son los componentes más importantes de las uniones estrechas, donde establecen la barrera paracelular que controla el flujo de moléculas en el espacio intercelular entre las células de un epitelio. Las claudinas son proteínas transmembranas que se extienden por la membrana 4 veces con el extremo N-terminal y el extremo C-terminal, ambos localizados en el citoplasma.
El término "claudina 6" o "CLDN6" se refiere preferentemente a CLDN6 humana y, en particular, a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. Con respecto a CLDN6, el término "variante" se refiere en particular a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 del listado de secuencias en donde la Ile en la posición 143 se reemplaza por Val. El término "CLDN6" incluye cualquier variante de CLDN6 tal como variantes modificadas postraduccionalmente y variantes de conformación.
El término "CLDN9" se refiere, preferentemente, a CLDN9 humana y, en particular, a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
El término "CLDN4" se refiere, preferentemente, a CLDN4 humana y, en particular, a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 4 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
El término "CLDN3" se refiere, preferentemente, a CLDN3 humana y, en particular, a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
Se ha descubierto que CLDN6 se expresa, por ejemplo, en cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer pancreático, cáncer de piel, melanomas, cáncer de cabeza y cuello, sarcomas, cáncer de conductos biliares, cáncer de células renales y cáncer de vejiga urinaria. CLDN6 es detectable y puede seleccionarse en cáncer de ovario, en particular adenocarcinoma de ovario y teratocarcinoma de ovario, cáncer de pulmón, que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), en particular carcinoma de células escamosas y adenocarcinoma de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer pancreático, cáncer de piel, en particular carcinoma basocelular y carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, en particular adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, en particular sarcoma sinovial y carcinosarcoma, cáncer de conductos biliares, cáncer de vejiga urinaria, en particular carcinoma de células transicionales y carcinoma papilar, cáncer de riñón, en particular carcinoma de células renales, que incluye carcinoma de células renales de células claras y carcinoma de células renales papilares, cáncer de colon, cáncer de intestino delgado, que incluye cáncer de íleon, en particular adenocarcinoma de intestino delgado y adenocarcinoma de íleon, carcinoma embrionario testicular, coriocarcinoma placentario, cáncer de cuello uterino, cáncer testicular, en particular seminoma testicular, teratoma testicular y cáncer testicular embrionario, cáncer de útero, tumores de células germinales tales como teratocarcinoma o un carcinoma embrionario, en particular tumores de células germinales de los testículos, y las formas metastásicas de estos. En una modalidad, la enfermedad cancerosa asociada con la expresión de CLDN6 se selecciona del grupo que consiste en cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de ovario metastásico y cáncer de pulmón metastásico. Preferentemente, el cáncer de ovario es un carcinoma o un adenocarcinoma. Preferentemente, el cáncer de pulmón es un carcinoma o un adenocarcinoma, y preferentemente, es un cáncer bronquiolar tal como un carcinoma bronquiolar o un adenocarcinoma bronquiolar.
De acuerdo con la enseñanza, una célula que expresa CLDN6 se caracteriza, preferentemente, por CLDN6 unida a la membrana de la superficie celular, es decir, CLDN6 se asocia con la superficie celular. Además, de acuerdo con la enseñanza, la CLDN6 celular es, preferentemente, CLDN6 unida a la membrana de la superficie celular. Una célula que expresa CLDN6 o una célula caracterizada por la asociación de CLDN6 con su superficie celular es, preferentemente, una célula cancerosa, preferentemente una célula cancerosa de un cáncer descrito en la presente descripción.
El término "asociado con la superficie celular" significa que un antígeno asociado al tumor tal como CLDN6 se asocia con y se localiza en la membrana plasmática de una célula, en donde al menos una parte del antígeno asociado al tumor se orienta hacia el espacio extracelular de dicha célula y es accesible desde el exterior de dicha célula, por ejemplo, mediante anticuerpos localizados fuera de la célula. En este contexto, una parte es, preferentemente, al menos 4, preferentemente, al menos 8, preferentemente, al menos 12, con mayor preferencia al menos 20 aminoácidos. La asociación puede ser directa o indirecta. Por ejemplo, la asociación puede ser mediante uno o más dominios transmembrana, uno o más anclajes lipídicos, o mediante la interacción con cualquier otra proteína, lípido, sacárido u otra estructura que pueda encontrarse en la capa externa de la membrana plasmática de una célula. Por ejemplo, un antígeno asociado a tumor relacionado con la superficie de una célula puede ser una proteína transmembrana que tiene una porción extracelular o puede ser una proteína relacionada con la superficie de una célula mediante la interacción con otra proteína que es una proteína transmembrana.
"Superficie celular" o "superficie de una célula" se usa de acuerdo con su significado normal en la técnica, y por lo tanto incluye el exterior de la célula que es accesible a la unión por proteínas y otras moléculas.
De acuerdo con la enseñanza, CLDN6 no se expresa sustancialmente en una célula si el nivel de expresión es menor en comparación con la expresión en células de placenta o tejido de placenta. Preferentemente, el nivel de expresión es menor que el 10 %, preferentemente, menor que el 5 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 % o 0,05 % de la expresión en células de placenta o tejido de placenta o incluso menor. Preferentemente, CLDN6 no se expresa sustancialmente en una célula si el nivel de expresión excede el nivel de expresión en tejido no canceroso distinto de la placenta en no más de 2 veces, preferentemente, 1,5 veces, y preferentemente, no excede el nivel de expresión en dicho tejido no canceroso. Preferentemente, CLDN6 no se expresa sustancialmente en una célula si el nivel de expresión está por debajo del límite de detección y/o si el nivel de expresión es demasiado bajo para permitir la unión con los anticuerpos específicos a CLDN6 añadidos a las células.
De acuerdo con la enseñanza, CLDN6 se expresa en una célula si el nivel de expresión excede el nivel de expresión en tejido no canceroso distinto de la placenta, preferentemente, en más de 2 veces, preferentemente 10 veces, 100 veces, 1000 veces o 10000 veces. Preferentemente, CLDN6 se expresa en una célula si el nivel de expresión está por encima del límite de detección y/o si el nivel de expresión es suficientemente alto para permitir la unión con los anticuerpos específicos a CLDN6 añadidos a las células. Preferentemente, la CLDN6 que se expresa en una célula se expresa o se expone en la superficie de dicha célula.
El término "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, e incluye cualquier molécula que comprende una porción de unión al antígeno de estas. El término "anticuerpo" incluye los anticuerpos monoclonales y fragmentos o derivados de estos, que incluyen, sin limitación, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena única, por ejemplo, scFv y fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno tales como fragmentos Fab y Fab' e incluye, además, todas las formas recombinantes de los anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos que se expresan en procariotas, anticuerpos no glicosilados y cualquiera de los fragmentos de anticuerpo de unión al antígeno y derivados como se describió en la presente descripción. Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (abreviada en la presente descripción como VH) y una región constante de la cadena pesada. Cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (abreviada en la presente descripción como VL) y una región constante de la cadena ligera. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, F<r>2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del hospedador, que incluyen diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y al primer componente (Clq) del sistema clásico del complemento.
Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden ser anticuerpos humanos. El término "anticuerpo humano", como se usa en la presente descripción, pretende incluir los anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la enseñanza pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica del sitioin vitroo mediante mutación somáticain vivo).
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula que tiene un sitio de unión al antígeno que se deriva sustancialmente de una inmunoglobulina de una especie no humana, en donde la estructura de inmunoglobulina restante de la molécula se basa en la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión al antígeno puede comprender dominios variables completos fusionados a dominios constantes o solo las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) injertadas en regiones marco apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión al antígeno pueden ser de tipo silvestre o modificados por una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, modificados para parecerse más a las inmunoglobulinas humanas. Algunas formas de anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene las seis CDR del anticuerpo de ratón). Otras formas tienen una o más CDR que se alteran con respecto al anticuerpo original.
El término "anticuerpo quimérico" se refiere a aquellos anticuerpos en donde una porción de cada una de las secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas y ligeras es homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase particular, mientras que el segmento restante de la cadena es homólogo a secuencias correspondientes en otra. Típicamente, la región variable de las cadenas ligeras y pesadas imita las regiones variables de anticuerpos derivados de una especie de mamíferos, mientras que las porciones constantes son homólogas a secuencias de anticuerpos derivados de otra. Una clara ventaja de tales formas quiméricas es que la región variable puede derivarse convenientemente de fuentes actualmente conocidas mediante el uso de células B fácilmente disponibles o hibridomas de organismos hospedadores no humanos en combinación con las regiones constantes que se derivan de, por ejemplo, preparaciones de células humanas. Mientras que la región variable tiene la ventaja de ser fácil de preparar y que la fuente no afecta a la especificidad, la región constante que es humana, es menos probable que genere una respuesta inmunitaria de un sujeto humano cuando se inyectan los anticuerpos que si la región constante fuera de una fuente no humana. Sin embargo, la definición no se limita a este ejemplo particular.
Los términos "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de unión") o "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "fragmento de unión") se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede realizarse por los fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consisten en los dominios VL, VH, CL y CH; (ii) fragmentos F(ab')<2>, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra, (iii) fragmentos Fd que consisten en los dominios VH y CH; (iv) fragmentos Fv que consisten en los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo, (v) fragmentos dAb (Ward y otros, (1989) Nature 341: 544-546), que consisten en un dominio VH; (vi) regiones aisladas determinantes de la complementariedad (CDR), y (vii) combinaciones de dos o más CDR aisladas que pueden estar opcionalmente unidas por un conector sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, ellos pueden unirse, mediante el uso de métodos recombinantes, por un conector sintético que les permite hacerlos como una proteína de cadena única en la que las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv); véase, por ejemplo, Bird y otros (1988) Science 242: 423-426; y Huston y otros (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85: 5879-5883). También se pretende que tales anticuerpos de cadena única se abarquen dentro del término "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo. Un ejemplo adicional son las proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión que comprenden (i) un polipéptido de dominio de unión que se fusiona a un polipéptido de la región bisagra de la inmunoglobulina, (ii) una región constante CH2 de la cadena pesada de la inmunoglobulina que se fusiona a la región bisagra y (iii) una región constante CH3 de la cadena pesada de la inmunoglobulina que se fusiona a la región constante CH2. El polipéptido del dominio de unión puede ser una región variable de la cadena pesada o una región variable de la cadena ligera. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión se describen además en los documentos núms. US 2003/0118592 y US 2003/0133939. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen mediante el uso de técnicas convencionales que conocen los expertos en la técnica, y se seleccionan los fragmentos para la utilidad de la misma manera que a los anticuerpos intactos.
Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden ser anticuerpos monoclonales. El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente descripción se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Un anticuerpo monoclonal presenta una especificidad de unión y afinidad únicas. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales se producen mediante un hibridoma que incluye una célula B que se obtiene de un animal no humano, por ejemplo, un ratón, que se fusiona a una célula inmortalizada.
Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden ser anticuerpos recombinantes. El término "anticuerpo recombinante", como se usa en la presente descripción, incluye todos los anticuerpos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos que se aíslan de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico con respecto a los genes de inmunoglobulina o un hibridoma que se prepara a partir de estos, (b) anticuerpos que se aíslan de una célula hospedadora transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos que se aíslan de una biblioteca recombinante, combinatoria, de anticuerpos y (d) anticuerpos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por cualquier otro medio que involucre el empalme de secuencias génicas de la inmunoglobulina a otras secuencias de ADN.
El término "transfectoma", como se usa en la presente descripción, incluye células hospedadoras eucariotas recombinantes que expresan un anticuerpo, tal como células CHO, células NS/0, células HEK293, células HEK293T, células vegetales u hongos, que incluyen células de levadura.
Como se usa en la presente descripción, un "anticuerpo heterólogo" se define en relación con un organismo transgénico que produce tal anticuerpo. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico codificante que corresponde a la que se encuentra en un organismo que no es el organismo transgénico, y que generalmente se deriva de una especie distinta a la del organismo transgénico.
Como se usa en la presente descripción, un "anticuerpo heterohíbrido" se refiere a un anticuerpo que tiene cadenas ligeras y pesadas de organismos de diferentes orígenes. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una cadena pesada humana asociada con una cadena ligera murina es un anticuerpo heterohíbrido.
La enseñanza incluye todos los anticuerpos y derivados de anticuerpos como se describen en la presente descripción que, para los propósitos de la enseñanza, son abarcados por el término "anticuerpo". El término "derivados de anticuerpos" se refiere a cualquier forma modificada de un anticuerpo, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo.
Los anticuerpos descritos en la presente descripción son, preferentemente, aislados. Un "anticuerpo aislado" como se usa en la presente descripción, se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o químicos.
De acuerdo con la presente enseñanza, un anticuerpo es capaz de unirse a una diana predeterminada si tiene una afinidad significativa por dicha diana predeterminada y se une a dicha diana predeterminada en ensayos estándar. La "afinidad" o "afinidad de unión" a menudo se mide por la constante de disociación en equilibrio (K<d>). Preferentemente, el término "afinidad significativa" se refiere a la unión a una diana predeterminada con una constante de disociación (K<d>) de 10-5 M o inferior, 10-6 M o inferior, 10-7 M o inferior, 10-8 M o inferior, 10-9M o inferior, 10-10 M o inferior, 10-11 M o inferior, o 10-12 M o inferior.
Un anticuerpo no es (sustancialmente) capaz de unirse a una diana si no tiene afinidad significativa por dicha diana y no se une significativamente, en particular no se une de manera detectable, a dicha diana en ensayos estándar. Preferentemente, el anticuerpo no se une de manera detectable a dicha diana si está presente en una concentración de hasta 2, preferentemente 10, con mayor preferencia 20, en particular 50 o 100 pg/ml o superior. Preferentemente, un anticuerpo no tiene afinidad significativa por una diana si se une a dicha diana con una Kd que es al menos 10 veces, 100 veces, 103-veces, 104-veces, 105-veces, o 106-veces mayor que la Kd para unirse a la diana predeterminada a la cual el anticuerpo es capaz de unirse. Por ejemplo, si la Kd para la unión de un anticuerpo a la diana a la que el anticuerpo es capaz de unirse es 10-7 M, la K<d>para unirse a una diana para la cual el anticuerpo no tiene afinidad significativa sería al menos 10-6 M, 10-5 M, 104 M, 10-3 M, 10-2 M, o 10-1 M.
Un anticuerpo es específico para una diana predeterminada si es capaz de unirse a dicha diana predeterminada mientras que no es capaz de unirse a otras dianas, es decir, no tiene afinidad significativa por otras dianas y no se une significativamente a otras dianas en ensayos estándar. De acuerdo con la enseñanza, un anticuerpo es específico para CLDN6 si es capaz de unirse a CLDN6, pero no es (sustancialmente) capaz de unirse a otras dianas, en particular a otras proteínas CLDN tales como CLDN9, CLDN4 y/o CLDN3 y/o proteínas distintas de proteínas claudinas, preferentemente, proteínas distintas de CLDN6. Preferentemente, un anticuerpo es específico para CLDN6 si la afinidad por y la unión a tales otras dianas no excede significativamente la afinidad por o la unión a proteínas no relacionadas con claudina tales como albúmina sérica bovina (BSA), caseína, albúmina sérica humana (HSA) o proteínas transmembrana no relacionadas con claudina tales como moléculas MHC o receptor de transferrina o cualquier otro polipéptido especificado. Preferentemente, un agente es específico para una diana predeterminada si se une a dicha diana con una Kd que es al menos 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, o 106 veces menor que la Kd de unión a una diana para la que no es específico. Por ejemplo, si la Kd para la unión de un anticuerpo a la diana para la cual es específico es 10-7 M, la K<d>para unirse a una diana para la cual no es específico sería al menos 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M, o 10-1 M.
La unión de un anticuerpo a una diana puede determinarse experimentalmente mediante el uso de cualquier método adecuado; véase, por ejemplo, Berzofsky y otros, "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press Nueva York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company Nueva York, N Y (1992), y los métodos descritos en la presente descripción. Las afinidades pueden determinarse fácilmente mediante el uso de técnicas convencionales, tales como la diálisis de equilibrio; mediante el uso del instrumento BIAcore 2000, mediante el uso de procedimientos generales delineados por el fabricante; por radioinmunoensayo mediante el uso del antígeno diana radiomarcado; o por otro método conocido por el experto en la técnica. Los datos de afinidad pueden analizarse, por ejemplo, mediante el método de Scatchard y otros, Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). La afinidad que se mide a una interacción particular antígeno anticuerpo puede variar si se mide bajo condiciones diferentes, por ejemplo, concentración de sal, pH. Por lo tanto, las mediciones de la afinidad y otros parámetros de unión al antígeno, por ejemplo, K<d>, IC<50>, se realizan, preferentemente, con las soluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno, y un tampón estandarizado.
El término "competir" se refiere a la competencia entre dos anticuerpos por unirse a un antígeno diana. Si dos anticuerpos no se bloquean entre sí para unirse a un antígeno diana, tales anticuerpos son no competitivos y esto es una indicación de que dichos anticuerpos no se unen a la misma parte, es decir, epítopo, del antígeno diana. Un experto en la técnica conoce bien cómo evaluar la competencia de los anticuerpos para unirse a un antígeno diana. Un ejemplo de tal método es un ensayo de competencia cruzada, que puede realizarse, por ejemplo, como un e LisA o mediante citometría de flujo. Por ejemplo, un ensayo basado en ELISA puede realizarse mediante el recubrimiento de los pocillos de la placa de ELISAcon uno de los anticuerpos; añadir el anticuerpo competidor y el antígeno/diana etiquetado con His y detectar si el anticuerpo añadido inhibió la unión del antígeno etiquetado con His al anticuerpo recubierto, por ejemplo, mediante la adición de anticuerpo anti-His biotinilado, seguido de estreptavidina-poli-HRP, y el desarrollo adicional de la reacción con ABTS y la medición de la absorbancia a 405 nm. Por ejemplo, un ensayo de citometría de flujo puede realizarse mediante la incubación de células que expresan el antígeno/diana con un exceso de anticuerpo no marcado, la incubación de las células con una concentración subóptima de anticuerpo marcado con biotina, seguido de la incubación con estreptavidina marcada con fluorescencia y el análisis mediante citometría de flujo.
Dos anticuerpos tienen la "misma especificidad" si se unen al mismo antígeno y al mismo epítopo. Si un anticuerpo que va a evaluarse reconoce el mismo epítopo que un anticuerpo de unión al antígeno determinado, es decir, los anticuerpos se unen al mismo epítopo, puede evaluarse mediante diferentes métodos conocidos por el experto, por ejemplo, en base a la competencia de los anticuerpos por el mismo epítopo. La competencia entre los anticuerpos puede detectarse mediante un ensayo de bloqueo cruzado. Por ejemplo, un ensayo ELISA competitivo puede usarse como un ensayo de bloqueo cruzado. Por ejemplo, el antígeno diana puede recubrir los pocillos de una placa de microtitulación y puede añadirse el anticuerpo de unión al antígeno y el anticuerpo en evaluación competidor candidato. La cantidad de anticuerpo de unión al antígeno unido al antígeno en el pocillo se correlaciona indirectamente con la capacidad de unión del anticuerpo en evaluación competidor candidato que compite con este para unirse al mismo epítopo. Específicamente, cuanto mayor sea la afinidad del anticuerpo en evaluación competidor candidato por el mismo epítopo, menor será la cantidad de anticuerpo de unión al antígeno unido al pocillo recubierto de antígeno. La cantidad de anticuerpo de unión al antígeno unido al pocillo puede medirse mediante el marcaje del anticuerpo con sustancias de marcaje detectables o medibles.
Un anticuerpo que compite por unirse a un antígeno con otro anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo que comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera como se describe en la presente descripción, o un anticuerpo que tiene la especificidad por un antígeno de otro anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo que comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera como se describe en la presente descripción, puede ser un anticuerpo que comprende variantes de dichas regiones variables de la cadena pesada y/o ligera como se describe en la presente descripción, por ejemplo, modificaciones en las CDR y/o un determinado grado de identidad como se describe en la presente descripción.
Como se usa en la presente descripción, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que se codifica por los genes de la región constante de la cadena pesada. Los anticuerpos de acuerdo con la enseñanza incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales e incluyen anticuerpos IgG2a (por ejemplo, IgG2a,k,A), IgG2b (por ejemplo, IgG2b,k,A), IgG3 (por ejemplo, IgG3,k,A) e IgM. Sin embargo, otros isotipos de anticuerpos también son abarcados por la enseñanza, que incluye anticuerpos IgG1, IgA1, IgA2, IgA secretorios, IgD e IgE.
Como se usa en la presente descripción, "cambio de isotipo" se refiere al fenómeno por el cual la clase, o isotipo, de un anticuerpo cambia de una clase de Ig a una de las otras clases de Ig.
El término "reordenado" como se usa en la presente descripción se refiere a una configuración de un locus de inmunoglobulina de cadena pesada o cadena ligera en donde un segmento V se coloca inmediatamente adyacente a un segmento D-J o J en una conformación que codifica esencialmente un dominio VH o VL completo, respectivamente. Un locus del gen de la inmunoglobulina (anticuerpo) reordenado puede identificarse por comparación con el ADN de la línea germinal; un locus reordenado tendrá al menos un elemento de homología de heptámero/nonámero recombinado.
El término "no reordenado" o "configuración de la línea germinal" como se usa en la presente descripción en referencia a un segmento V se refiere a la configuración en donde el segmento V no se recombina de manera que está inmediatamente adyacente a un segmento D o J.
De acuerdo con la enseñanza, los anticuerpos pueden derivarse de diferentes especies, que incluyen, pero no se limitan a ratón, rata, conejo, cobayo y humano. Los anticuerpos incluyen, además, moléculas quiméricas en las que una región constante de anticuerpo derivada de una especie, preferentemente humana, se combina con el sitio de unión al antígeno derivado de otra especie. Además, los anticuerpos incluyen moléculas humanizadas en las que los sitios de unión al antígeno de un anticuerpo derivado de una especie no humana se combinan con regiones constantes y de marco de origen humano.
Los anticuerpos pueden producirse mediante una variedad de técnicas, que incluyen la metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica de hibridación de células somáticas estándar de Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975). Aunque se prefieren los procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, pueden emplearse otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B o técnicas de presentación de fagos mediante el uso de bibliotecas de genes de anticuerpos.
El sistema animal preferido para preparar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión se conocen en la técnica. También se conocen las parejas de fusión (por ejemplo, las células de mieloma murino) y los procedimientos de fusión.
Otros sistemas animales preferidos para preparar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales son el sistema de rata y conejo (por ejemplo, descrito en Spieker-Polet y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), véase además Rossi y otros, Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).
Aun en otra modalidad preferida, los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra CLDN6 pueden generarse mediante el uso de ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones conocidos como ratón HuMAb y ratón KM, respectivamente, y se denominan colectivamente en la presente descripción como "ratones transgénicos". La producción de anticuerpos humanos en tales ratones transgénicos puede realizarse como se describe en detalle para CD20 en el documento núm. WO2004 035607
Aún otra estrategia para generar anticuerpos monoclonales es aislar directamente, de linfocitos que producen anticuerpos de especificidad definida, los genes que codifican anticuerpos; véase, por ejemplo, Babcock y otros, 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities. Para obtener detalles sobre la ingeniería de anticuerpos recombinantes, véase además Welschof y Kraus, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 y Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.
Para generar anticuerpos contra CLDN6, los ratones pueden inmunizarse con péptidos conjugados con portadores derivados de la secuencia de CLDN6, una preparación enriquecida de antígeno de CLDN6 expresado recombinantemente o fragmentos de este y/o células que expresan CLDN6 o fragmentos de este, como se describió. Alternativamente, los ratones pueden inmunizarse con ADN que codifica CLDN6 humano de longitud completa o fragmentos de este. En el caso de que las inmunizaciones mediante el uso de una preparación purificada o enriquecida del antígeno CLDN6 no resulten en anticuerpos, los ratones también pueden inmunizarse con células que expresan CLDN6, por ejemplo, una línea celular, para promover respuestas inmunitarias.
La respuesta inmunitaria puede monitorearse durante el transcurso del protocolo de inmunización con muestras de plasma y suero que se obtienen mediante sangrado de las venas de la cola o retroorbitario. Los ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina anti-CLDN6 pueden usarse para fusiones. Los ratones pueden estimularse por vía intraperitoneal o intravenosa con células que expresan CLDN6 de 3-5 días antes del sacrificio y de la extirpación del bazo, para aumentar la tasa de los hibridomas que secretan anticuerpos específicos.
Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales contra CLDN6, las células de ganglios linfáticos, bazo o médula ósea que se obtienen de ratones inmunizados pueden aislarse y fusionarse con una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes pueden luego tamizarse para la producción de anticuerpos antígeno-específicos. Los pocillos individuales pueden tamizarse después mediante ELISA para hibridomas que secretan anticuerpos. Mediante análisis de inmunofluorescencia y FACS mediante el uso de células que expresan CLDN6, pueden identificarse anticuerpos con especificidad por CLDN6. Los hibridomas que secretan anticuerpos pueden volverse a sembrar, volver a seleccionarse nuevamente y, si aún son positivos para anticuerpos monoclonales anti-CLDN6, pueden subclonarse mediante dilución limitante. Los subclones estables pueden después cultivarse in vitro para generar anticuerpos en medio de cultivo tisular para la caracterización.
Los anticuerpos de la enseñanza pueden producirse, además, en un transfectoma de células hospedadoras mediante el uso, por ejemplo, de una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección génica como se conocen bien en la técnica (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
Por ejemplo, en una modalidad, el(los) gen(es) de interés, por ejemplo, genes de anticuerpos, pueden ligarse a un vector de expresión tal como un plásmido de expresión eucariota tal como el que se usa por el sistema de expresión génica de GS descrito en los documentos núms. WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338841 u otros sistemas de expresión bien conocidos en la técnica. El plásmido purificado con los genes de anticuerpos clonados puede introducirse en células hospedadoras eucariotas, tales como las células CHO, células NS/0, células HEK293T o células HEK293 o alternativamente otras células eucariotas como células derivadas de plantas, células fúngicas o de levadura. El método que se usa para introducir estos genes puede estar entre los métodos que se describen en la técnica, tales como electroporación, lipofectina, lipofectamina u otros. Después de la introducción de estos genes de anticuerpos en las células hospedadoras, las células que expresan el anticuerpo pueden identificarse y seleccionarse. Estas células representan los transfectomas que luego pueden amplificarse para su nivel de expresión y aumentar su escala de producir anticuerpos. Los anticuerpos recombinantes pueden aislarse y purificarse a partir de estos sobrenadantes de cultivo y/o células.
Alternativamente, los genes de anticuerpos clonados pueden expresarse en otros sistemas de expresión, que incluyen células procariotas, tales como microorganismos, por ejemplo, E. coli. Además, los anticuerpos pueden producirse en animales transgénicos no humanos, tales como en la leche de ovejas y conejos o en huevos de gallinas, o en plantas transgénicas; véase, por ejemplo, Verma, R., y otros, (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, y otros, (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; y Fischer, R., y otros, (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.
Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos, cuyas diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, tales como aquellas que tienen una región variable derivada de un anticuerpo murino y una región constante de inmunoglobulina humana. La quimerización de anticuerpos se logra por la unión de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo murino con la región constante de las cadenas pesada y ligera humana (por ejemplo, como se describió por Kraus y otros, en Methods, en Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8). En una modalidad preferida, los anticuerpos quiméricos se generan mediante la unión de la región constante de la cadena ligera kappa humana a la región variable de la cadena ligera murina. En una modalidad también preferida, los anticuerpos quiméricos pueden generarse mediante la unión de la región constante de la cadena ligera lambda humana a la región variable de la cadena ligera murina. Las regiones constantes de la cadena pesada que se prefieren para la generación de los anticuerpos quiméricos son IgG1, IgG3 e IgG4. Otras regiones constantes de la cadena pesada que se prefieren para la generación de los anticuerpos quiméricos son IgG2, IgA, IgD e IgM.
Los anticuerpos interactúan con antígenos diana predominantemente a través de residuos de aminoácidos que se localizan en las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las cadenas pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que mimeticen las propiedades de los anticuerpos específicos de origen natural mediante la construcción de vectores de expresión que incluyen secuencias CDR del anticuerpo específico de origen natural injertado en las secuencias marco de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véase, por ejemplo, Riechmann, L. y otros (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P y otros (1986) Nature 321: 522-525; y Queen, C. y otros (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033). Tales secuencias marco pueden obtenerse a partir de bases de datos públicas de ADN que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la línea germinal. Estas secuencias de la línea germinal diferirán de las secuencias génicas del anticuerpo maduro porque no incluirán los genes variables completamente ensamblados, que se forman por la unión V (D) J durante la maduración de la célula B. Las secuencias génicas de la línea germinal diferirán además de las secuencias de un anticuerpo del repertorio secundario de alta afinidad en posiciones individuales uniformemente a través de la región variable. Por ejemplo, las mutaciones somáticas son relativamente infrecuentes en la porción amino terminal de la región marco 1 y en la porción carboxilo terminal de la región marco 4. Además, muchas mutaciones somáticas no alteran significativamente las propiedades de unión del anticuerpo. Por esta razón, no es necesario obtener la secuencia de ADN completa de un anticuerpo particular para recrear un anticuerpo recombinante intacto que tenga propiedades de unión similares a las del anticuerpo original (véase el documento núm. WO 99/45962). Las secuencias parciales de cadena pesada y ligera que abarcan las regiones CDR son típicamente suficientes para este propósito. La secuencia parcial se usa para determinar qué segmentos génicos variables y de unión de la línea germinal contribuyeron a los genes variables de anticuerpos recombinados. La secuencia de la línea germinal se usa después para completar las porciones faltantes de las regiones variables. Las secuencias líderes de cadena pesada y ligera se escinden durante la maduración de proteínas y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Para añadir secuencias faltantes, las secuencias de ADNc clonadas pueden combinarse con oligonucleótidos sintéticos mediante ligadura o amplificación por PCR. Alternativamente, la región variable completa puede sintetizarse como un conjunto de oligonucleótidos cortos y solapados y combinarse mediante amplificación por PCR para crear un clon de región variable completamente sintético. Este proceso tiene determinadas ventajas, tales como la eliminación o inclusión de sitios de restricción particulares, o la optimización de codones particulares.
Las secuencias de nucleótidos de transcritos de cadenas pesadas y ligeras de hibridomas pueden usarse para diseñar un conjunto solapado de oligonucleótidos sintéticos para crear secuencias V sintéticas con capacidades de codificación de aminoácidos idénticas a las secuencias naturales. Las secuencias de cadena pesada y kappa sintéticas pueden diferir de las secuencias naturales de tres maneras: las cadenas de bases nucleotídicas repetidas se interrumpen para facilitar la síntesis de oligonucleótidos y la amplificación por PCR; los sitios de inicio de la traducción óptimos se incorporan de acuerdo con las reglas de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870); y los sitios de HindIII se manipulan genéticamente aguas arriba de los sitios de inicio de la traducción.
Para las regiones variables de cadena pesada y ligera, las secuencias de hebras codificantes optimizadas y las correspondientes no codificantes se dividen en 30-50 nucleótidos aproximadamente en el punto medio del oligonucleótido no codificante correspondiente. Por lo tanto, para cada cadena, los oligonucleótidos pueden ensamblarse en conjuntos de doble hebra solapados que abarcan segmentos de 150-400 nucleótidos. Los grupos se usan después como moldes para producir productos de amplificación por PCR de 150-400 nucleótidos. Típicamente, un conjunto de oligonucleótidos de regiones variables únicas se dividirá en dos grupos que se amplificarán por separado para generar dos productos de PCR solapados. Estos productos solapados se combinan después mediante amplificación por PCR para formar la región variable completa. Además, puede ser conveniente incluir un fragmento solapado de la región constante de la cadena pesada o ligera en la amplificación por PCR para generar fragmentos que puedan clonarse fácilmente en los constructos de vectores de expresión.
Las regiones variables de cadena pesada y ligera, humanizada o quimérica, reconstruidas se combinan después con secuencias de promotor, líder, inicio de la traducción, región constante, 3' sin traducir, poliadenilación y terminación de la transcripción clonadas para formar constructos de vectores de expresión. Los constructos de expresión de cadena pesada y ligera pueden combinarse en un único vector, cotransfectarse, transfectarse en serie o transfectarse por separado en células hospedadoras que después se fusionan para formar una célula hospedadora que expresa ambas cadenas. Se describen plásmidos para usar en la construcción de vectores de expresión para IgGK humana. Los plásmidos pueden construirse de manera que las secuencias de ADNc de cadena ligera kappa V y pesada V amplificadas por PCR puedan usarse para reconstruir minigenes de cadena pesada y ligera completos. Estos plásmidos pueden usarse para expresar anticuerpos Kappa, Kappa o IgG4, IgGl completamente humanos o quiméricos. Pueden construirse plásmidos similares para la expresión de otros isotipos de cadena pesada, o para la expresión de anticuerpos que comprenden cadenas ligeras lambda.
Por lo tanto, en otro aspecto de la enseñanza, las características estructurales de los anticuerpos anti-CLDN6 descritos en la presente descripción, se usan para crear anticuerpos anti-CLDN6 humanizados estructuralmente relacionados que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la enseñanza, tal como la unión a CLDN6. Más específicamente, una o más regiones CDR de anticuerpos monoclonales de ratón pueden combinarse de manera recombinante con regiones marco humanas conocidas y CDR para crear anticuerpos anti-CLDN6 humanizados adicionales, manipulados genéticamente de manera recombinante.
La capacidad de un anticuerpo para unirse a CLDN6 puede determinarse mediante el uso de ensayos de unión estándar, por ejemplo, ELISA, transferencia Western, inmunofluorescencia y análisis por citometría de flujo. El ELISA puede usarse para demostrar la presencia de anticuerpos en sueros de ratones inmunizados o la unión de anticuerpos monoclonales a la proteína o péptidos de CLDN6. Los péptidos o proteínas usados para la inmunización pueden usarse para determinar la especificidad de los sobrenadantes de hibridoma o analizar los títulos de suero.
Para demostrar la presencia de anticuerpos en sueros de ratones inmunizados o la unión de anticuerpos monoclonales a células vivas, puede usarse la citometría de flujo. Las líneas celulares que expresan el antígeno natural o después de la transfección y los controles negativos que carecen de la expresión del antígeno (cultivadas en condiciones de crecimiento estándar) pueden mezclarse con diversas concentraciones de anticuerpos monoclonales en sobrenadantes de hibridoma o en PBS que contiene un 1 % de FBS, y pueden incubarse a 4 °C durante 30 minutos. Después del lavado, el anticuerpo anti IgG marcado con APC o Alexa647 puede unirse al anticuerpo monoclonal unido a antígeno en las mismas condiciones que la tinción del anticuerpo primario. Las muestras pueden analizarse mediante citometría de flujo con un instrumento FACS mediante el uso de las propiedades de dispersión lateral de la luz para atravesar las células vivas únicas. Con el fin de distinguir los anticuerpos monoclonales específicos de antígeno de los ligandos no específicos en una única medición, puede emplearse el método de cotransfección. Las células transfectadas transitoriamente con plásmidos que codifican el antígeno y un marcador fluorescente pueden teñirse como se describió anteriormente. Las células transfectadas pueden detectarse en un canal de fluorescencia diferente al de las células teñidas con anticuerpos. Como la mayoría de las células transfectadas expresan ambos transgenes, los anticuerpos monoclonales antígeno específicos se unen preferentemente a las células que expresan marcadores de fluorescencia, mientras que los anticuerpos no específicos se unen en una relación comparable a las células no transfectadas. Puede usarse un ensayo alternativo con microscopía de fluorescencia además de o en lugar del ensayo de citometría de flujo. Las células pueden teñirse exactamente como se describió anteriormente y se examinaron mediante microscopía de fluorescencia.
Para demostrar la presencia de anticuerpos anti-CLDN6 en sueros de ratones inmunizados o la unión de anticuerpos monoclonales a células vivas que expresan CLDN6, puede usarse el análisis de microscopía de inmunofluorescencia. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan espontáneamente o después de la transfección CLDN6 y los controles negativos que carecen de expresión de CLDN6 se cultivan en portaobjetos de cámara en condiciones de crecimiento estándar en medio DMEM/F12, suplementado con suero fetal de ternera (FCS) al 10 %, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 lU/ml y estreptomicina 100 |jg/ml. Las células pueden fijarse después con metanol o paraformaldehído o dejarlas sin tratar. Las células pueden reaccionar después con anticuerpos monoclonales contra CLDN6 durante 30 min a 25 °C. Después del lavado, las células pueden reaccionar con un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón marcado con Alexa555 (Molecular Probes) en las mismas condiciones. Las células pueden examinarse por microscopía de fluorescencia.
Los niveles totales de CLDN6 en células pueden observarse cuando las células se fijan con metanol o se fijan con paraformaldehído y se permeabilizan con Tritón X-100. En células vivas y en células fijadas en paraformaldehído no permeabilizadas, puede examinarse la localización de CLDN6 en la superficie. Adicionalmente, el direccionamiento de CLDN6 a las uniones estrechas puede analizarse mediante la tinción conjunta con marcadores de uniones estrechas tales como ZO-1. Además, pueden examinarse los efectos de la unión de anticuerpos y la localización de CLDN6 dentro de la membrana celular.
La IgG anti-CLDN6 puede evaluarse adicionalmente para determinar la reactividad con el antígeno CLDN6 mediante transferencia Western. Brevemente, los extractos celulares de células que expresan CLDN6 y controles negativos apropiados pueden prepararse y someterse a electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS). Después de la electroforesis, los antígenos separados se transferirán a las membranas de nitrocelulosa, se bloquearán y se analizarán con sondas con los anticuerpos monoclonales que se analizarán. La unión de IgG puede detectarse mediante el uso de anti-IgG de ratón-peroxidasa y revelarse con sustrato ECL.
Las IgG anti-CLDN6 de ratón pueden evaluarse adicionalmente para determinar la reactividad con el antígeno de CLDN6 mediante inmunohistoquímica de una manera bien conocida por el experto, por ejemplo, mediante el uso de secciones de crioconservación fijas con paraformaldehído o acetona o secciones de tejido incrustadas en parafina fijadas con paraformaldehído de tejido no canceroso o muestras de tejido canceroso que se obtienen de pacientes durante procedimientos quirúrgicos de rutina o de ratones que portan tumores xenoinjertados inoculados con líneas celulares que expresan espontáneamente o después de la transfección con CLDN6. Para la inmunotinción, los anticuerpos reactivos a CLDN6 pueden incubarse seguidos de anticuerpos anti-ratón o anti-conejos generados en cabra, conjugados con peroxidasa de rábano, de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
Una metodología particularmente preferida para las evaluaciones de CLDN6 en los métodos de la enseñanza es la inmunohistoquímica o IHC. La inmunohistoquímica o IHC se refiere al proceso de detección de antígenos (por ejemplo, proteínas) en células de una sección de tejido, por ejemplo, células de los tejidos mencionados en la presente descripción. La tinción inmunohistoquímica se usa ampliamente en el diagnóstico de células anormales tales como las que se encuentran en tumores cancerosos. La visualización de una interacción anticuerpo-antígeno puede lograrse de varias maneras. En el caso más común, un anticuerpo se conjuga a una enzima, tal como peroxidasa, que puede catalizar una reacción que produce color. Alternativamente, el anticuerpo también puede etiquetarse con un fluoróforo, tal como fluoresceína o rodamina.
La preparación de la muestra es fundamental para mantener la morfología celular, la arquitectura tisular y la antigenicidad de los epítopos diana. Esto requiere una recolección, fijación y cortes del tejido adecuadas. El paraformaldehído se usa generalmente con fijación. En dependencia del propósito y el grosor de la muestra experimental, se cortan secciones finas (aproximadamente 4-40 jm ) del tejido de interés, o si el tejido no es muy grueso y es penetrable, se usa entero. El corte se realiza generalmente mediante el uso de un micrótomo y los cortes se montan en portaobjetos.
La muestra puede requerir etapas adicionales para hacer que los epítopos estén disponibles para la unión de anticuerpos, que incluyen la desparafinización y la recuperación de antígenos. Los detergentes como Tritón X-100 generalmente se usan en inmunohistoquímica para reducir la tensión superficial, lo que permite usar menos reactivo para lograr una cobertura mejor y más uniforme de la muestra.
El método directo de tinción inmunohistoquímica usa un anticuerpo marcado, que se une directamente al antígeno que se tiñe. El método indirecto de tinción inmunohistoquímica que es más común usa un anticuerpo contra el antígeno que se está sondeando, y un segundo anticuerpo marcado contra el primero. Para reducir la tinción de fondo en IHC, las muestras se incuban con un tampón que bloquea los sitios reactivos a los que de cualquier otra manera podrían unirse los anticuerpos primarios o secundarios. Los anticuerpos primarios se inducen contra un antígeno de interés y típicamente no están conjugados (no marcados), mientras que los anticuerpos secundarios se inducen contra inmunoglobulinas de la especie del anticuerpo primario. El anticuerpo secundario generalmente se conjuga a una molécula enlazadora, tal como biotina, que después recluta moléculas indicadoras, o el anticuerpo secundario se une directamente a la propia molécula indicadora. Los tampones de bloqueo comunes incluyen suero normal, leche seca no grasa, BSA o gelatina y tampones de bloqueo comerciales.
Las moléculas indicadoras varían en base a la naturaleza del método de detección, y los métodos de detección más populares son la detección cromogénica y fluorescente mediada por enzimas y fluoróforos, respectivamente. Con los indicadores cromogénicos, un marcador enzimático reacciona con un sustrato para producir un producto intensamente coloreado que puede analizarse con un microscopio óptico ordinario. Si bien la lista de sustratos enzimáticos es extensa, la fosfatasa alcalina (AP) y la peroxidasa de rábano picante (HRP) son las dos enzimas que se usan más ampliamente como marcadores para la detección de proteínas. Está disponible una serie de sustratos cromogénicos, fluorogénicos y quimioluminiscentes para usar con cualquiera de las enzimas, que incluyen DAB o BCIP/NBT Los indicadores fluorescentes son moléculas orgánicas pequeñas usadas para la detección de IHC. Para los métodos de detección cromogénicos y fluorescentes, el análisis densitométrico de la señal puede proporcionar datos semicuantitativos y cuantitativos completos, respectivamente, para correlacionar el nivel de señal del indicador con el nivel de expresión o localización de proteínas.
Después de la tinción inmunohistoquímica del antígeno diana, a menudo se aplica una segunda tinción para proporcionar un contraste que ayude a resaltar la tinción primaria. Muchas de estas tinciones muestran especificidad por compartimentos celulares discretos o antígenos, mientras que otras teñirán la célula completa. Están disponibles tintes cromogénicos y fluorescentes para IHC para proporcionar una amplia variedad de reactivos para adaptarse a cada diseño experimental. Se usan comúnmente hematoxilina, tinción de Hoechst y DAPI.
El mapeo de epítopos reconocidos por anticuerpos puede realizarse como se describió en detalle en "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) de Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 y en "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 de Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay.
El término "funciones efectoras inmunitarias" en el contexto de la presente enseñanza incluye cualquiera de las funciones mediada por componentes del sistema inmunitario que resulta en la inhibición del crecimiento tumoral y/o la inhibición del desarrollo tumoral, que incluye la inhibición de la diseminación y metástasis tumoral. Preferentemente, las funciones efectoras inmunitarias resultan en la destrucción de las células cancerosas. Preferentemente, las funciones efectoras inmunitarias en el contexto de la presente invención son funciones efectoras mediadas por anticuerpos. Tales funciones comprenden la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP), la inducción de apoptosis en las células que portan el antígeno asociado a tumor, por ejemplo, mediante la unión del anticuerpo a un antígeno de superficie, la inhibición de la transducción de señal mediada por CD40L, por ejemplo, mediante la unión del anticuerpo al receptor CD40 o al ligando de CD40 (CD40L), y/o la inhibición de la proliferación de las células que portan el antígeno asociado a tumor, preferentemente, la ADCC y/o la CDC. Por lo tanto, los anticuerpos que son capaces de mediar una o más funciones efectoras inmunitarias son, preferentemente, capaces de mediar la destrucción de las células mediante la inducción de lisis mediada por la CDC, lisis mediada por la ADCC, apoptosis, adhesión homotípica y/o fagocitosis, preferentemente, mediante la inducción de lisis mediada por la CDC y/o lisis mediada por la ADCC. Los anticuerpos pueden ejercer, además, un efecto simplemente al unirse a antígenos asociados al tumor en la superficie de una célula cancerosa. Por ejemplo, los anticuerpos pueden bloquear la función del antígeno asociado a tumor o inducir la apoptosis solo por la unión al antígeno asociado a tumor en la superficie de una célula cancerosa.
La ADCC describe la capacidad de destrucción celular de las células efectoras, en particular los linfocitos, que preferentemente requieren que la célula diana esté marcada por un anticuerpo. La ADCC ocurre preferentemente cuando los anticuerpos se unen a antígenos en células cancerosas y los dominios Fc del anticuerpo se unen a receptores Fc (FcR) en la superficie de las células efectoras inmunitarias. Se han identificado varias familias de receptores de Fc, y las poblaciones celulares específicas que expresan de manera característica los receptores definidos de Fc. La ADCC puede verse como un mecanismo para inducir directamente un grado variable de destrucción tumoral inmediata que conduce, además, a la presentación del antígeno y a la inducción de respuestas de células T dirigidas al tumor. Preferentemente, la inducciónin vivode ADCC conducirá a respuestas de células T dirigidas al tumor y respuestas adicionales de anticuerpos derivadas del hospedador.
La CDC es otro método de destrucción celular que puede ser dirigido por anticuerpos. La IgM es el isotipo más efectivo para la activación del complemento. Además, las IgG1 e IgG3 son ambas muy efectivas para dirigir la CDC a través de la vía clásica de activación del complemento. Preferentemente, en esta cascada, la formación de complejos antígeno-anticuerpo resulta en el descubrimiento de múltiples sitios de unión a C1q en estrecha proximidad sobre los dominios C<h>2 de moléculas de anticuerpo participantes tales como moléculas de IgG (C1q es uno de los tres subcomponentes del complemento C1). Preferentemente, estas exposiciones de los sitios de unión a C1q convierten la interacción C1q-IgG, previamente de baja afinidad, en una interacción de alta avidez, que dispara una cascada de eventos que implican una serie de otras proteínas del complemento y que conduce a la liberación proteolítica de los agentes quimiotácticos, y activadores de las células efectoras, C3a y C5a. Preferentemente, la cascada del complemento termina en la formación de un complejo de ataque a la membrana, que crea poros en la membrana celular que facilitan el paso libre de agua y solutos dentro y fuera de la célula, y pueden conducir a la apoptosis.
El término "células efectoras inmunitarias" en el contexto de la presente enseñanza se refiere a células que ejercen funciones efectoras durante una reacción inmunitaria. Por ejemplo, tales células secretan citocinas y/o quimiocinas, destruyen microbios, secretan anticuerpos, reconocen células cancerosas y, opcionalmente, eliminan tales células. Por ejemplo, las células efectoras inmunitarias comprenden células T (células T citotóxicas, células T cooperadoras, células T infiltrantes de tumor), células B, células asesinas naturales, neutrófilos, macrófagos y células dendríticas.
Un ácido nucleico es de acuerdo con la enseñanza, preferentemente, ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), con mayor preferencia ARN, con la máxima preferencia ARN transcritoin vitro(ARN IVT). Los ácidos nucleicos incluyen de acuerdo con la enseñanza ADN genómico, ADNc, ARNm, moléculas preparadas recombinantemente y sintetizadas químicamente. Un ácido nucleico puede, de acuerdo con la enseñanza, estar en forma de una molécula que es de una sola hebra o de doble hebra y lineal o cerrada covalentemente para formar un círculo. Puede emplearse un nucleótido para la introducción en, es decir, la transfección de, células, por ejemplo, en forma de ARN que puede prepararse mediante transcripciónin vitroa partir de un molde de ADN. El ARN puede modificarse, además, antes de la aplicación mediante secuencias estabilizadoras, encapsulado y poliadenilación.
Los ácidos nucleicos descritos en la presente descripción pueden estar comprendidos en un vector. El término "vector" como se usa en la presente descripción incluye cualquier vector conocido por el experto en la técnica que incluye vectores de plásmidos, vectores de cósmidos, vectores de fagos tales como el fagos lambda, vectores virales tales como vectores adenovirales o baculovirales, o vectores de cromosomas artificiales tales como los cromosomas artificiales bacterianos (BAC), los cromosomas artificiales de levaduras (YAC) o los cromosomas artificiales P1 (PAC). Dichos vectores incluyen vectores de expresión, así como también de clonación. Los vectores de expresión comprenden plásmidos, así como también vectores virales y generalmente contienen una secuencia codificante deseada y secuencias de ADN apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante unida operativamente en un organismo hospedador particular (por ejemplo, bacteria, levadura, plantas, insectos o mamíferos) o en sistemas de expresiónin vitro.Los vectores de clonación se usan generalmente para modificar genéticamente y amplificar un determinado fragmento de ADN deseado y pueden carecer de las secuencias funcionales necesarias para la expresión de los fragmentos de ADN deseados.
Como el vector para la expresión de un anticuerpo, puede usarse cualquiera de un tipo de vector en el que las cadenas de anticuerpo están presentes en diferentes vectores o un tipo de vector en el que las cadenas de anticuerpo están presentes en el mismo vector.
Como se usa en la presente descripción, el término "ARN" significa una molécula que comprende residuos de ribonucleótidos. Por "ribonucleótido" se entiende un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de una porción beta-D-ribofuranosa. El término incluye ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado tal como ARN parcialmente purificado, ARN sustancialmente puro, ARN sintético o ARN producido recombinantemente, así como también ARN alterado que se diferencia del ARN de origen natural por la adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como al(los) extremo(s) de un ARN o internamente, por ejemplo, a uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en las moléculas de ARN pueden comprender también nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos que no son de origen natural o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos ARN alterados pueden referirse como análogos o análogos de ARN de origen natural.
De acuerdo con la presente enseñanza, el término "ARN" incluye y se refiere, preferentemente, a "ARNm" que significa "ARN mensajero" y se refiere a un "transcrito" que puede producirse mediante el uso de ADN como molde y codifica un péptido o proteína. El ARNm comprende típicamente una región no traducida 5', una región de codificación de proteínas o péptidos y una región no traducida 3'. El ARNm tiene una semivida limitada en las células ein vitro.
En el contexto de la presente enseñanza, el término "transcripción" se refiere a un proceso, en donde el código genético en una secuencia de ADN se transcribe en ARN.
Los ácidos nucleicos descritos de acuerdo con la enseñanza se han aislado, preferentemente. El término "ácido nucleico aislado" significa de acuerdo con la enseñanza que el ácido nucleico (i) se amplificóin vitro,por ejemplo, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) se produjo de manera recombinante mediante clonación, (iii) se purificó, por ejemplo, mediante escisión y fraccionamiento electroforético en gel, o (iv) se sintetizó, por ejemplo, mediante síntesis química. Un ácido nucleico aislado es un ácido nucleico que está disponible para su manipulación mediante técnicas de ADN recombinante.
Los ácidos nucleicos pueden, de acuerdo con la enseñanza, estar presentes solos o en combinación con otros ácidos nucleicos, que pueden ser homólogos o heterólogos. En modalidades preferidas, un ácido nucleico se une funcionalmente a secuencias de control de la expresión que pueden ser homólogas o heterólogas con respecto a dicho ácido nucleico. El término "homólogo" significa que los ácidos nucleicos también se unen funcionalmente de forma natural y el término "heterólogo" significa que los ácidos nucleicos no están unidos funcionalmente de forma natural.
Un ácido nucleico y una secuencia de control de la expresión se unen "funcionalmente" entre sí, si se unen covalentemente entre sí de tal manera que la expresión o transcripción de dicho ácido nucleico está bajo el control o bajo la influencia de dicha secuencia de control de la expresión. Si el ácido nucleico debe traducirse en una proteína funcional, entonces, con una secuencia de control de la expresión funcionalmente unida a una secuencia codificante, la inducción de dicha secuencia de control de la expresión resulta en la transcripción de dicho ácido nucleico, sin causar un cambio de marco en la secuencia codificante o que dicha secuencia codificante no sea capaz de traducirse en la proteína o péptido deseado.
El término "secuencia de control de la expresión" o "elemento de control de la expresión" comprende de acuerdo con la enseñanza, promotores, sitios de unión al ribosoma, potenciadores y otros elementos de control que regulan la transcripción de un gen o la traducción de un ARNm. En modalidades particulares de la enseñanza, pueden regularse las secuencias de control de la expresión. La estructura exacta de las secuencias de control de la expresión puede variar en función de la especie o el tipo celular, pero generalmente comprende las secuencias 5'-sin transcribir y 5'- y 3'-sin traducir que están involucradas en el inicio de la transcripción y traducción, respectivamente, tales como caja TATA, secuencia de caperuza, secuencia CAAT y similares. Más específicamente, las secuencias de control de la expresión 5'-sin transcribir comprenden una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del ácido nucleico unido funcionalmente. Las secuencias de control de la expresión pueden comprender, además, las secuencias potenciadoras o secuencias activadoras aguas arriba.
De acuerdo con la enseñanza, el término "promotor" o "región promotora" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se localiza aguas arriba (5') de la secuencia de ácido nucleico que se expresa y controla la expresión de la secuencia al proporcionar un sitio de reconocimiento y unión para la ARN-polimerasa. La "región promotora" puede incluir sitios de reconocimiento y unión adicionales para otros factores que están implicados en la regulación de la transcripción de un gen. Un promotor puede controlar la transcripción de un gen procariótico o eucariótico. Además, un promotor puede ser "inducible" y puede iniciar la transcripción en respuesta a un agente inductor o puede ser "constitutivo" si la transcripción no está controlada por un agente inductor. Un gen que está bajo el control de un promotor inducible no se expresa o se expresa solo en pequeña medida si está ausente un agente inductor. En presencia del agente inductor, el gen se enciende o se aumenta el nivel de transcripción. Esto está mediado, en general, por la unión de un factor de transcripción específico.
Los promotores que se prefieren de acuerdo con la enseñanza incluyen promotores para SP6, T3 y T7 polimerasa, promotor de ARN U6 humano, promotor de CMV y promotores híbridos artificiales de estos (por ejemplo, CMV) donde una parte o partes se fusionan a una parte o partes de promotores de genes de otras proteínas celulares tales como, por ejemplo, GAPDH humano (glicerol-3-fosfato deshidrogenasa), e incluyen o no incluyen (un) intrón adicional(es).
El término "expresión" se usa en la presente descripción en su significado más amplio y comprende la producción de ARN o de ARN y proteína o péptido. Con respecto al ARN, el término "expresión" o "traducción" se refiere en particular a la producción de péptidos o proteínas. La expresión puede ser transitoria o puede ser estable. De acuerdo con la enseñanza, el término expresión incluye, además, una "expresión aberrante" o "expresión anormal".
"Expresión aberrante" o "expresión anormal" significa de acuerdo con la enseñanza que la expresión se altera, preferentemente, aumenta, en comparación con una referencia, por ejemplo, un estado en un sujeto que no tiene una enfermedad asociada con la expresión aberrante o anormal de una proteína determinada, por ejemplo, un antígeno asociado a tumor. Un aumento de la expresión se refiere a un aumento de al menos 10 %, en particular al menos 20 %, al menos 50 % o al menos 100 %, o más. En una modalidad, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido saludable se reprime.
El término "expresada específicamente" significa que una proteína se expresa esencialmente solo en un tejido u órgano específico. Por ejemplo, un antígeno asociado a tumor expresado específicamente en la mucosa gástrica significa que dicha proteína se expresa primariamente en la mucosa gástrica, y no se expresa en otros tejidos o no se expresa de forma significativa en otros tipos de tejidos u órganos. Por lo tanto, una proteína que se expresa exclusivamente en células de la mucosa gástrica y en una extensión significativamente menor en cualquier otro tejido se expresa específicamente en células de la mucosa gástrica. En algunas modalidades, un antígeno asociado a tumor puede expresarse específicamente, además, en condiciones normales en más de un tipo de tejido u órgano, tal como en 2 o 3 tipos de tejido u órganos, pero preferentemente en no más de 3 tipos de tejido u órgano diferentes. En este caso, entonces el antígeno asociado a tumor se expresa específicamente en estos órganos.
El término "traducción" de acuerdo con la enseñanza se refiere al proceso en los ribosomas de una célula mediante el cual una hebra de ARN mensajero dirige el ensamblaje de una secuencia de aminoácidos para fabricar una proteína o péptido.
De acuerdo con la enseñanza, el término "ácido nucleico codificante" significa que el ácido nucleico, si está presente en el entorno apropiado, preferentemente, dentro de una célula, puede expresarse para producir una proteína o péptido que codifica.
El término "péptido" comprende oligo y polipéptidos y se refiere a sustancias que comprenden dos o más, preferentemente, 3 o más, preferentemente, 4 o más, preferentemente, 6 o más, preferentemente, 8 o más, preferentemente, 9 o más, preferentemente, 10 o más, preferentemente, 13 o más, preferentemente, 16 o más, preferentemente, 21 o más y hasta, preferentemente, 8, 10, 20, 30, 40 o 50, en particular 100 aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. El término "proteína" se refiere a péptidos grandes, preferentemente, a péptidos con más de 100 residuos de aminoácidos, pero en general los términos "péptidos" y "proteínas" son sinónimos y se usan indistintamente en la presente descripción.
Preferentemente, las proteínas y péptidos descritos de acuerdo con la enseñanza se han aislado. Los términos "proteína aislada" o "péptido aislado" significan que la proteína o el péptido se han separado de su ambiente natural. Una proteína o un péptido aislado pueden estar en un estado purificado esencialmente. El término "esencialmente purificado" significa que la proteína o péptido está esencialmente libre de otras sustancias con las que se asocia en la naturaleza oin vivo.
La enseñanza dada en la presente descripción con respecto a secuencias de aminoácidos específicas, por ejemplo, las mostradas en el listado de secuencias, debe interpretarse de manera que también se refiera a modificaciones, es decir, variantes, de dichas secuencias específicas que resultan en secuencias que son funcionalmente equivalentes a dichas secuencias específicas, por ejemplo, secuencias de aminoácidos que exhiben propiedades idénticas o similares a las de las secuencias de aminoácidos específicas. Una propiedad importante es retener la unión de un anticuerpo a su diana. Preferentemente, una secuencia modificada con respecto a una secuencia específica, cuando reemplaza la secuencia específica en un anticuerpo, retiene la unión de dicho anticuerpo a la diana.
Los expertos en la técnica apreciarán que, en particular, las secuencias de las secuencias de CDR, regiones hipervariables y variables pueden modificarse sin perder la capacidad de unirse a una diana. Por ejemplo, las secuencias de CDR serán idénticas o altamente homólogas a las secuencias de CDR especificadas en la presente descripción.
Por "altamente homólogas" se contempla que pueden hacerse de 1 a 5, preferentemente, de 1 a 4, tal como 1 a 3 o 1 o 2 sustituciones.
El término "variante" de acuerdo con la enseñanza incluye, además, mutantes, variantes de empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos de especies, en particular aquellos que están presentes de forma natural. Una variante alélica se refiere a una alteración en la secuencia normal de un gen, cuya importancia a menudo no está clara. La secuenciación génica completa a menudo identifica numerosas variantes alélicas para un gen determinado. Un homólogo de especie es una secuencia de ácido nucleico o aminoácidos con una especie de origen diferente a la de una secuencia de ácido nucleico o aminoácidos dada.
Para los propósitos de la presente enseñanza, las "variantes" de una secuencia de aminoácidos comprenden variantes de inserción de aminoácidos, variantes de adición de aminoácidos, variantes de deleción de aminoácidos y/o variantes de sustitución de aminoácidos. Las variantes de deleción de aminoácidos que comprenden la deleción en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína se denominan también variantes de truncamiento N-terminal y/o C-terminal.
Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos particular. En el caso de las variantes de secuencias de aminoácidos que tienen una inserción, se insertan uno o más residuos de aminoácidos en un sitio particular en una secuencia de aminoácidos, aunque es posible también una inserción aleatoria con el cribado apropiado del producto resultante.
Las variantes de adición de aminoácidos comprenden fusiones amino y/o carboxilo-terminal de uno o más aminoácidos, tales como 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, o más aminoácidos.
Las variantes de deleción de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia, tal como por la eliminación de 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 o más aminoácidos. Las deleciones pueden estar en cualquier posición de la proteína.
Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan por al menos un residuo en la secuencia que se elimina y otro residuo que se inserta en su lugar. Se da preferencia a que las modificaciones estén en posiciones en la secuencia de aminoácidos que no son conservadas entre proteínas o péptidos homólogos y/o que reemplacen aminoácidos con otros que tengan propiedades similares. Preferentemente, los cambios de aminoácidos en las variantes de proteína son cambios conservadores de aminoácidos, es decir, sustituciones de aminoácidos cargados o no cargados de manera similar. Un cambio conservador de aminoácidos involucra la sustitución de uno de una familia de aminoácidos que se relacionan en sus cadenas laterales. Los aminoácidos de origen natural se dividen generalmente en cuatro familias: aminoácidos ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y polares sin carga (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). En ocasiones la fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos.
Preferentemente, el grado de similitud, preferentemente identidad, entre una secuencia de aminoácidos dada y una secuencia de aminoácidos que es una variante de dicha secuencia de aminoácidos dada será al menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. El grado de similitud o de identidad está dado, preferentemente para una región del aminoácido que es al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o aproximadamente 100 % de la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia. Por ejemplo, si la secuencia de aminoácidos de referencia consiste en 200 aminoácidos, el grado de similitud o de identidad se da, preferentemente, para al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 180, o aproximadamente 200 aminoácidos, preferentemente, aminoácidos continuos. En modalidades preferidas, el grado de similitud o identidad está dado por la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia. El alineamiento para determinar la similitud de secuencia, preferentemente, la identidad de secuencia, puede realizarse con herramientas conocidas en la técnica, preferentemente, mediante el uso del mejor alineamiento de secuencia, por ejemplo, mediante el uso de Align, mediante el uso de configuraciones estándar, preferentemente, EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.
La "similitud de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones conservadoras de aminoácidos. "Identidad de secuencia" entre dos secuencias de aminoácidos indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias.
El término "porcentaje de identidad" pretende indicar un porcentaje de residuos de aminoácidos que son idénticos entre las dos secuencias a comparar, que se obtiene después del mejor alineamiento, este porcentaje es puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias se distribuyen aleatoriamente y en toda su longitud. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos se llevan a cabo convencionalmente mediante la comparación de estas secuencias después de haberlas alineado de forma óptima, dicha comparación se lleva a cabo por segmento o por "ventana de comparación" con el fin de identificar y comparar las regiones locales con similitud de secuencia. El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación puede producirse, además de manualmente, por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por medio del algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por medio del método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, o por medio de programas informáticos que usan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TFASTA en el paquete de programas informáticos de genética de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).
El porcentaje de identidad se calcula al determinar el número de posiciones idénticas entre las dos secuencias que se comparan, al dividir este número por el número de posiciones comparadas y al multiplicar el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.
Las secuencias de aminoácidos homólogas exhiben de acuerdo con la enseñanza al menos 40 %, en particular al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % y, preferentemente, al menos 95 %, al menos 98 o al menos 99 % de identidad de los residuos de aminoácidos.
Las variantes de secuencia de aminoácidos descritas en la presente descripción pueden prepararse fácilmente por el experto, por ejemplo, mediante la manipulación de ADN recombinante. La manipulación de secuencias de ADN para preparar proteínas y péptidos que tienen sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones, se describe en detalle en Sambrook y otros (1989), por ejemplo. Además, las variantes de aminoácidos y péptidos descritas en la presente descripción pueden prepararse fácilmente con la ayuda de técnicas conocidas de síntesis de péptidos tales como, por ejemplo, mediante la síntesis en fase sólida y métodos similares.
La enseñanza incluye derivados de los péptidos o proteínas descritos en la presente descripción que están comprendidos por los términos "péptido" y "proteína". De acuerdo con la enseñanza, los "derivados" de proteínas y péptidos son formas modificadas de proteínas y péptidos. Tales modificaciones incluyen cualquier modificación química y comprenden sustituciones, deleciones y/o adiciones, simples o múltiples, de cualquiera de las moléculas asociadas con la proteína o péptido, tales como carbohidratos, lípidos y/o proteínas o péptidos. En una modalidad, los "derivados" de proteínas o péptidos incluyen aquellos análogos modificados que resultan de la glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, palmitoilación, miristoilación, isoprenilación, lipidación, alquilación, derivatización, introducción de grupos protectores/bloqueantes, escisión proteolítica o unión a un anticuerpo u otro ligando celular. El término "derivado" se extiende, además, a todos los equivalentes químicos funcionales de dichas proteínas y péptidos. Preferentemente, un péptido modificado tiene estabilidad aumentada y/o inmunogenicidad aumentada o disminuida.
De acuerdo con la enseñanza, una variante, derivado, forma modificada, fragmento, parte o porción de una secuencia de aminoácidos, péptido o proteína tiene, preferentemente, una propiedad funcional de la secuencia de aminoácidos, péptido o proteína, respectivamente, de la cual se ha derivado, es decir, es funcionalmente equivalente. En una modalidad, una variante, derivado, forma modificada, fragmento, parte o porción de una secuencia de aminoácidos, péptido o proteína es inmunológicamente equivalente a la secuencia de aminoácidos, péptido o proteína, respectivamente, de la que se ha derivado. En una modalidad, la propiedad funcional es una propiedad inmunológica.
El término "derivado" significa, de acuerdo con la enseñanza, que una entidad particular, en particular una secuencia particular, está presente en el objeto del que se deriva, en particular un organismo o molécula. En el caso de secuencias de aminoácidos, especialmente regiones de secuencia particulares, "derivado" significa en particular que la secuencia de aminoácidos relevante se deriva de una secuencia de aminoácidos en la que está presente.
El término "célula" o "célula hospedadora" es, preferentemente, una célula intacta, es decir, una célula con una membrana intacta que no ha liberado sus componentes intracelulares normales tales como enzimas, orgánulos o material genético. Una célula intacta, preferentemente, es una célula viable, es decir, una célula viva capaz de llevar a cabo sus funciones metabólicas normales. El término "célula" incluye de acuerdo con la enseñanza células procariotas (por ejemplo, E. coli) o células eucariotas (por ejemplo, células dendríticas, células B, células CHO, células COS, células K562, células HEK293, células HELA, células de levadura y células de insectos). Se prefieren particularmente células de mamífero, tales como células de humanos, ratones, hámsteres, cerdos, cabras y primates. Las células pueden derivarse de un gran número de tipos de tejidos e incluyen células primarias y líneas celulares. El término "célula" incluye células no cancerosas y células cancerosas, tales como las células de los tipos de cáncer descritos en la presente descripción.
Una célula que comprende una molécula de ácido nucleico, preferentemente, expresa el péptido o proteína codificado por el ácido nucleico.
"Célula diana" significará una célula que es una diana para una respuesta inmunitaria tal como un anticuerpo. Las células diana incluyen cualquier célula no deseable tal como una célula cancerosa como se describe en la presente descripción. En modalidades preferidas, la célula diana es una célula que expresa CLDN6. Las células que expresan CLDN6 incluyen, típicamente, células cancerosas.
El término "animal transgénico" se refiere a un animal que tiene un genoma que comprende uno o más transgenes, preferentemente, transgenes de cadena pesada y/o ligera de anticuerpos, o transcromosomas (ya sea integrados o no integrados en el ADN genómico natural del animal) y que es, preferentemente, capaz de expresar los transgenes. Por ejemplo, un ratón transgénico puede tener un transgén de cadena ligera humana y un transgén de cadena pesada humana o un transcromosoma de cadena pesada humana, de manera que el ratón produce anticuerpos anti-CLDN6 humanos cuando se inmuniza con el antígeno CLDN6 y/o células que expresan CLDN6. El transgén de la cadena pesada humana puede integrarse en el ADN cromosómico del ratón, como es el caso de los ratones transgénicos, por ejemplo, los ratones HuMAb, tales como los ratones HCo7 o HCol2, o el transgén de la cadena pesada humana puede mantenerse extracromosómicamente, como el caso para ratones transcromosómicos (por ejemplo, KM) como se describió en el documento núm. WO 02/43478. Tales ratones transgénicos y transcromosómicos pueden ser capaces de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos contra CLDN6 (por ejemplo, IgG, IgAy/o IgE) mediante recombinación V-D-J y cambio de isotipo.
El término "inmunológicamente equivalente" significa que la molécula inmunológicamente equivalente, tal como la secuencia de aminoácidos inmunológicamente equivalente, presenta las mismas o esencialmente las mismas propiedades inmunológicas y/o ejerce los mismos o esencialmente los mismos efectos inmunológicos, por ejemplo, con respecto al tipo de efecto inmunológico tal como la inducción de una reacción inmunitaria humoral, la intensidad y/o duración de la reacción inmunitaria inducida, o la especificidad de la reacción inmunitaria. En el contexto de la presente enseñanza, el término "inmunológicamente equivalente" se usa, preferentemente, con respecto a los efectos o propiedades inmunológicas de un péptido o variante peptídica usado para la inmunización o un anticuerpo. Una propiedad inmunológica particular es la capacidad de unirse a anticuerpos y, cuando sea apropiado, generar una respuesta inmunitaria, preferentemente, por estimular la generación de anticuerpos. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos es inmunológicamente equivalente a una secuencia de aminoácidos de referencia si dicha secuencia de aminoácidos cuando se expone al sistema inmunitario de un sujeto induce una reacción inmunitaria, preferentemente, anticuerpos, que tienen una especificidad para reaccionar con la secuencia de aminoácidos de referencia, tal como la secuencia de aminoácidos de referencia que forma parte de CLDN6.
La enseñanza proporciona métodos para detectar la presencia del antígeno CLDN6 en una muestra, o medir la cantidad del antígeno CLDN6, que comprende poner en contacto la muestra, y opcionalmente una muestra de control, con un anticuerpo de la enseñanza que se une a CLDN6, en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo y CLDN6. Después se detecta la formación de un complejo, en donde una diferencia en la formación del complejo entre la muestra en comparación con una muestra de control es indicativa de la presencia del antígeno CLDN6 en la muestra.
Los métodos como se describieron anteriormente son útiles, en particular, para diagnosticar enfermedades relacionadas con CLDN6 tales como enfermedades cancerosas, por ejemplo, enfermedades cancerosas como se describen en la presente descripción. Preferentemente, una cantidad de CLDN6 en una muestra que es mayor que la cantidad de CLDN6 en una muestra de referencia o control es indicativa de la presencia de una enfermedad relacionada con CLDN6 en un sujeto, en particular un humano, del cual se deriva la muestra.
Cuando se usa en los métodos como se describió anteriormente, un anticuerpo descrito en la presente descripción puede proporcionarse con un marcador que funciona para: (i) proporcionar una señal detectable; (ii) interactuar con un segundo marcador para modificar la señal detectable proporcionada por el primer o segundo marcador, por ejemplo, FRET (transferencia de energía de resonancia de fluorescencia); (iii) afectar la movilidad, por ejemplo, movilidad electroforética, por carga, hidrofobicidad, forma u otros parámetros físicos, o (iv) proporcionar una porción de captura, por ejemplo, afinidad, anticuerpo/antígeno o formación de complejos iónicos. Adecuados como marcadores son las estructuras, tales como marcadores fluorescentes, marcadores luminiscentes, marcadores cromóforos, marcadores radioisotópicos, marcadores isotópicos, preferentemente, marcadores isotópicos estables, marcadores isobáricos, marcadores enzimáticos, marcadores de partículas, en particular marcadores de partículas metálicas, marcadores de partículas magnéticas, marcadores de partículas poliméricas, moléculas orgánicas pequeñas tales como biotina, ligandos de receptores o de moléculas de unión tales como proteínas de adhesión celular o lecitinas, secuencias de marcadores que comprenden ácidos nucleicos y/o residuos de aminoácidos que pueden detectarse mediante el uso de agentes de unión, etcétera. Los marcadores comprenden, en una manera no limitante, sulfato de bario, ácido iocetámico, ácido iopanoico, ipodato de calcio, diatrizoato de sodio, diatrizoato de meglumina, metrizamida, tiropanoato de sodio y de radiodiagnóstico, que incluyen los emisores de positrones tales como flúor 18 y carbono 11, emisores gamma tales como yodo 123, tecnecio 99m, yodo 131 e indio 111, núclidos para resonancia magnética nuclear, tales como flúor y gadolinio.
De acuerdo con la enseñanza, una "referencia" tal como una muestra de referencia u organismo de referencia puede usarse para correlacionar y comparar los resultados que se obtienen en los métodos de la enseñanza a partir de una muestra para evaluación u organismo para evaluación. Típicamente, el organismo de referencia es un organismo sano, en particular un organismo que no padece de una enfermedad tal como una enfermedad cancerosa. Un "valor de referencia" o "nivel de referencia" puede determinarse a partir de una referencia empíricamente mediante la medición de un número suficientemente grande de referencias. Preferentemente, el valor de referencia se determina mediante la medición de al menos 2, preferentemente, al menos 3, preferentemente, al menos 5, preferentemente, al menos 8, preferentemente, al menos 12, preferentemente, al menos 20, preferentemente al menos 30, preferentemente, al menos 50, o preferentemente, al menos 100 referencias.
"Reducir" o "inhibir" como se usa en la presente descripción significa la capacidad de provocar una disminución general, preferentemente de 5 % o más, 10 % o más, 20 % o más, con mayor preferencia de 50 % o más, y con la máxima preferencia de 75 % o más, en el nivel. El término "inhibir" o frases similares incluye una inhibición completa o esencialmente completa, es decir, una reducción a cero o esencialmente a cero.
Términos tales como "aumento" o "mejora" se refieren preferentemente a un aumento o mejora de al menos aproximadamente 10 %, preferentemente al menos 20 %, preferentemente al menos 30 %, con mayor preferencia al menos 40 %, con mayor preferencia al menos 50 %, aún con mayor preferencia al menos 80 % y con la máxima preferencia al menos 100 %.
Los agentes, composiciones y métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para diagnosticar un sujeto con una enfermedad. Las enfermedades que pueden diagnosticarse abarcan todas las enfermedades que expresan CLDN6. Las enfermedades particularmente preferidas son las enfermedades cancerosas tales como las enfermedades cancerosas descritas en la presente descripción.
De acuerdo con la enseñanza, el término "enfermedad" se refiere a cualquier estado patológico, que incluye las enfermedades cancerosas, en particular las formas de enfermedades cancerosas descritas en la presente descripción.
El término "normal", tal como se usa en los términos "tejido normal" o "condiciones normales", se refiere a tejido saludable o las condiciones en un sujeto saludable, es decir, condiciones no patológicas, en donde "saludable" significa, preferentemente no canceroso.
"Enfermedad que involucra células que expresan CLDN6" significa de acuerdo con la enseñanza que CLDN6 se expresa en células de un tejido u órgano enfermo. En una modalidad, la expresión de CLDN6 aumenta en comparación con el estado en un tejido u órgano saludable. Un aumento se refiere a un aumento de al menos 10 %, en particular al menos 20 %, al menos 50 %, al menos 100 %, al menos 200 %, al menos 500 %, al menos 1000 %, al menos 10 000 % o aún más. En una modalidad, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido saludable se reprime. De acuerdo con la enseñanza, las enfermedades que implican o que se asocian con células que expresan CLDN6 incluyen enfermedades cancerosas, en particular las formas de cáncer descritas en la presente descripción.
De acuerdo con la enseñanza, el término "tumor" o "enfermedad tumoral" se refiere a una hinchazón o lesión formada por un crecimiento anormal de células (llamadas células neoplásicas o células tumorales). Por "célula tumoral" se entiende una célula anormal que crece por una proliferación celular rápida e incontrolada y continúa creciendo después de que cesan los estímulos que iniciaron el nuevo crecimiento. Los tumores muestran una carencia parcial o completa de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal, y generalmente forman una masa distinta de tejido, que puede ser benigna, pre-maligna o maligna. Un tumor benigno es un tumor que carece de las tres propiedades malignas de un cáncer. Por lo tanto, por definición, un tumor benigno no crece de una manera agresiva e ilimitada, no invade los tejidos circundantes y no se disemina a tejidos no adyacentes (metastatiza). Los ejemplos comunes de tumores benignos incluyen molas y fibromas uterinos.
El término "benigno" implica una enfermedad leve y no progresiva y, de hecho, muchos tipos de tumores benignos son inofensivos para la salud. Sin embargo, algunos neoplasmas que se definen como "tumores benignos" porque carecen de las propiedades invasivas de un cáncer, aún pueden producir efectos negativos para la salud. Los ejemplos de esto incluyen tumores que producen un "efecto de masa" (compresión de órganos vitales tales como vasos sanguíneos), o tumores "funcionales" de tejidos endocrinos, que pueden sobreproducir determinadas hormonas (los ejemplos incluyen adenomas de tiroides, adenomas adrenocorticales y adenomas hipofisarios).
Los tumores benignos típicamente están rodeados por una superficie exterior que inhibe su capacidad de comportarse de una manera maligna. En algunos casos, determinados tumores "benignos" pueden dar lugar posteriormente a cánceres malignos, que resultan de cambios genéticos adicionales en una subpoblación de las células neoplásicas del tumor. Un ejemplo destacado de este fenómeno es el adenoma tubular, un tipo común de pólipo de colon que es un precursor importante del cáncer de colon. Las células en los adenomas tubulares, como la mayoría de los tumores que progresan frecuentemente al cáncer, muestran determinadas anomalías de maduración y apariencia celular conocidas colectivamente como displasia. Estas anomalías celulares no se ven en tumores benignos que rara vez o nunca se vuelven cancerosos, pero se ven en otras anomalías tisulares precancerosas que no forman masas discretas, tales como lesiones precancerosas del cuello uterino. Algunas autoridades prefieren referirse a los tumores displásicos como "premalignos" y reservan el término "benigno" para los tumores que rara vez o nunca dan lugar al cáncer.
El neoplasma es una masa anormal de tejido como resultado de la neoplasia. Neoplasia (crecimiento nuevo en griego) es la proliferación anormal de células. El crecimiento de las células excede y no se coordina con el de los tejidos normales que las rodean. El crecimiento persiste de la misma manera excesiva incluso después que cesan los estímulos. Generalmente causa un bulto o tumor. Los neoplasmas pueden ser benignos, pre malignos o malignos.
"Crecimiento de un tumor" o "crecimiento tumoral" de acuerdo con la enseñanza se refiere a la tendencia de un tumor a aumentar su tamaño y/o a la tendencia de las células tumorales a proliferar.
El cáncer (término médico: neoplasma maligno) es una clase de enfermedades en las que un grupo de células muestra un crecimiento incontrolado (división más allá de los límites normales), invasión (intrusión y destrucción de tejidos adyacentes) y, a veces, metástasis (diseminación a otras localizaciones en el cuerpo a través de la linfa o la sangre). Estas tres propiedades malignas de los cánceres los diferencian de los tumores benignos, que son autolimitados, y no invaden ni hacen metástasis. La mayoría de los cánceres forman un tumor, pero algunos, como la leucemia, no. De acuerdo con la enseñanza, los términos "cáncer" y "tumor" o "enfermedad cancerosa" y "enfermedad tumoral" se usan generalmente indistintamente en la presente descripción para referirse a enfermedades en donde las células presentan un crecimiento incontrolado y, opcionalmente, invasión y/o metástasis.
Preferentemente, una "enfermedad cancerosa" de acuerdo con la enseñanza se caracteriza por células que expresan CLDN6. Una célula que expresa CLDN6, preferentemente, es una célula cancerosa, preferentemente, de los tumores y cánceres descritos en la presente descripción. Preferentemente, tal célula es una célula distinta de una célula de placenta.
Los cánceres se clasifican por el tipo de célula que se asemeja al tumor y, por lo tanto, al tejido que se presume que es el origen del tumor. Estas son la histología y la localización, respectivamente.
El término "cáncer" de acuerdo con la enseñanza comprende leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, linfomas, neuroblastomas, gliomas, cáncer rectal, cáncer de endometrio, cáncer de riñón, cáncer de glándula suprarrenal, cáncer de tiroides, cáncer de sangre, cáncer de piel, cáncer de cerebro, cáncer de cuello uterino, cáncer intestinal, cáncer de hígado, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de intestino, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gastrointestinal, cáncer de ganglios linfáticos, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de oído, nariz y garganta (ENT), cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de ovario y cáncer de pulmón y las metástasis de estos. Los ejemplos de estos son carcinomas de pulmón, carcinomas de mama, carcinomas de próstata, carcinomas de colon, carcinomas de células renales, carcinomas cervicales, o metástasis de los tipos de cáncer o tumores descritos anteriormente. El término cáncer de acuerdo con la enseñanza comprende, además, las metástasis del cáncer.
Los tipos principales de cáncer de pulmón son el carcinoma pulmonar de células pequeñas (SCLC) y el carcinoma pulmonar de células no pequeñas (NSCLC). Hay tres subtipos principales de carcinomas de pulmón de células no pequeñas: carcinoma de pulmón de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma de pulmón de células grandes. Los adenocarcinomas representan aproximadamente el 10 % de los cánceres de pulmón. Generalmente, este cáncer se observa periféricamente en los pulmones, a diferencia del cáncer de pulmón de células pequeñas y cáncer de pulmón de células escamosas, que tienden a tener una localización más central.
De acuerdo con la enseñanza, un "carcinoma" es un tumor maligno derivado de células epiteliales. Este grupo representa los cánceres más comunes, que incluye las formas comunes de cáncer de mama, próstata, pulmón y colon.
El "adenocarcinoma" es un cáncer que se origina en el tejido glandular. Este tejido es parte, además, de una categoría de tejido más grande conocido como tejido epitelial. El tejido epitelial incluye piel, glándulas y una variedad de otros tejidos que recubren las cavidades y los órganos del cuerpo. El epitelio se deriva embriológicamente a partir de ectodermo, endodermo y mesodermo. Para clasificarse como adenocarcinoma, las células no necesitan necesariamente formar parte de una glándula, siempre que tengan propiedades secretoras. Esta forma de carcinoma puede ocurrir en algunos mamíferos superiores, que incluye los seres humanos. Los adenocarcinomas bien diferenciados tienden a parecerse al tejido glandular del que se derivan, mientras que los pobremente diferenciados pueden no serlo. Al teñir las células de una biopsia, un patólogo determinará si el tumor es un adenocarcinoma o algún otro tipo de cáncer. Los adenocarcinomas pueden surgir en muchos tejidos del cuerpo debido a la naturaleza ubicua de las glándulas dentro del cuerpo. Mientras que cada glándula puede no secretar la misma sustancia, siempre que exista una función exocrina para la célula, se considera glandular y su forma maligna se denomina, por lo tanto, adenocarcinoma. Los adenocarcinomas malignos invaden otros tejidos y, frecuentemente, con tiempo suficiente hacen metástasis. El adenocarcinoma de ovario es el tipo más común de carcinoma de ovario. Incluye los adenocarcinomas serosos y mucinosos, el adenocarcinoma de células claras y el adenocarcinoma de endometrio.
Por "metástasis" se entiende la diseminación de células cancerosas desde su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende del desprendimiento de las células malignas del tumor primario, la invasión de la matriz extracelular, la penetración de las membranas basales del endotelio para entrar en la cavidad y en los vasos del cuerpo, y después, tras haberse transportado por la sangre, la infiltración en los órganos diana. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor, es decir, un tumor secundario o tumor metastásico, en el sitio diana depende de la angiogénesis. A menudo la metástasis del tumor ocurre incluso después de la remoción del tumor primario porque las células o componentes tumorales pueden permanecer y desarrollar un potencial metastásico. En una modalidad, el término "metástasis" de acuerdo con la descripción se relaciona con "metástasis distante" que se relaciona con una metástasis que está remoto del tumor primario y del sistema de nódulos linfáticos regional.
Las células de un tumor secundario o metastásico son similares a las del tumor original. Esto significa, por ejemplo, que, si el cáncer de ovario hace metástasis en el hígado, el tumor secundario está formado por células ováricas anormales, no por células hepáticas anormales. El tumor en el hígado se denomina cáncer de ovario metastásico, no cáncer de hígado.
Una recaída o recurrencia ocurre cuando una persona se ve afectada nuevamente por una afección que la afectó en el pasado. Por ejemplo, si un paciente ha sufrido de una enfermedad cancerosa, ha recibido un tratamiento exitoso de dicha enfermedad y nuevamente desarrolla dicha enfermedad, dicha enfermedad recién desarrollada puede considerarse como recaída o recurrencia. Sin embargo, de acuerdo con la enseñanza, una recaída o recurrencia de una enfermedad cancerosa puede ocurrir, pero no necesariamente en el sitio de la enfermedad cancerosa original. Así, por ejemplo, si una paciente ha sufrido un tumor de ovario y ha recibido un tratamiento exitoso, una recaída o recurrencia puede ser la aparición de un tumor de ovario o la aparición de un tumor en un sitio diferente al ovario. Una recaída o recurrencia de un tumor incluye, además, situaciones en donde un tumor ocurre en un sitio diferente al sitio del tumor original, así como también en el sitio del tumor original. Preferentemente, el tumor original para el cual el paciente ha recibido un tratamiento es un tumor primario y el tumor en un sitio diferente al sitio del tumor original es un tumor secundario o metastásico.
Por "tratar" se entiende administrar un compuesto o composición a un sujeto para prevenir o eliminar una enfermedad, que incluye reducir el tamaño de un tumor o el número de tumores en un sujeto; detener o ralentizar una enfermedad en un sujeto; inhibir o ralentizar el desarrollo de una nueva enfermedad en un sujeto; disminuir la frecuencia o gravedad de los síntomas y/o recurrencias en un sujeto que actualmente tiene o que anteriormente ha tenido una enfermedad; y/o prolongar, es decir, aumentar la duración de la vida del sujeto.
En particular, el término "tratamiento de una enfermedad" incluye curar, acortar la duración, mejorar, prevenir, ralentizar o inhibir la progresión o el empeoramiento, o prevenir o retrasar el inicio de una enfermedad o los síntomas de esta.
Por "estar en riesgo" se entiende un sujeto, es decir, un paciente, que se identifica como que tiene una posibilidad mayor de lo normal de desarrollar una enfermedad, en particular cáncer, en comparación con la población general. Además, un sujeto que ha tenido, o que actualmente tiene, una enfermedad, en particular cáncer, es un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, ya que tal sujeto puede continuar desarrollando una enfermedad. Los sujetos que actualmente tienen o han tenido un cáncer tienen, además, un riesgo aumentado de metástasis de cáncer.
El término "inmunoterapia" se refiere a un tratamiento que implica una reacción inmunitaria específica.
En el contexto de la presente enseñanza, los términos tales como "proteger", "prevenir", "profiláctico", "preventivo" o "protector" se refieren a la prevención o tratamiento o ambos de la aparición y/o la propagación de una enfermedad en un sujeto y, en particular, a minimizar la posibilidad de que un sujeto desarrolle una enfermedad o a retrasar el desarrollo de una enfermedad. Por ejemplo, una persona en riesgo de un tumor, como se describió anteriormente, sería un candidato para la terapia para prevenir un tumor. La inmunoterapia puede realizarse mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas, en las que los agentes funcionan para eliminar las células que expresan antígenos de un paciente.
Dentro de determinadas modalidades, la inmunoterapia puede ser inmunoterapia activa, en la que el tratamiento se basa en la estimulaciónin vivodel sistema inmunitario endógeno del hospedador para reaccionar contra células enfermas con la administración de agentes modificadores de la respuesta inmunitaria (tales como péptidos y ácidos nucleicos inmunorreactivos).
Dentro de otras modalidades, la inmunoterapia puede ser inmunoterapia pasiva, en la que el tratamiento implica el suministro de agentes con reactividad inmunitaria tumoral establecida (tales como anticuerpos) que pueden mediar directa o indirectamente efectos antitumorales y no dependen necesariamente de un sistema inmunitario intacto del hospedador.
El término "in vivo" se refiere a la situación en un sujeto.
Los términos "sujeto", "individuo", "organismo" o "paciente" se usan indistintamente y se refieren a vertebrados, preferentemente, mamíferos. Por ejemplo, los mamíferos en el contexto de la presente invención son seres humanos, primates no humanos, animales domesticados tales como perros, gatos, ovejas, vacuno, cabras, cerdos, caballos, etc., animales de laboratorio tales como ratones, ratas, conejos, conejillos de indias, etc., así como también animales en cautiverio, tal como animales de zoológicos. El término "animal" como se usa en la presente descripción incluye, además, a los humanos. El término "sujeto" puede incluir, además, a un paciente, es decir, un animal, preferentemente un humano que tiene una enfermedad, preferentemente, una enfermedad como se describe en la presente descripción.
De acuerdo con la enseñanza, una "muestra" puede ser cualquier muestra útil de acuerdo con la presente enseñanza, en particular una muestra biológica tal como una muestra de tejido, que incluye fluidos corporales, y/o una muestra celular y puede obtenerse de la manera convencional tal como mediante biopsia de tejido, que incluye biopsia por punción, y mediante la extracción de sangre, aspirado bronquial, esputo, orina, heces fecales u otros fluidos corporales. De acuerdo con la enseñanza, el término "muestra" incluye, además, muestras procesadas tales como fracciones o aislados de muestras biológicas, por ejemplo, aislados de ácidos nucleicos y péptidos/proteínas. Preferentemente, una muestra contiene células o tejido del órgano que se va a examinar, por ejemplo, que se va a diagnosticar de cáncer. Por ejemplo, si el cáncer que se va a diagnosticar es cáncer de pulmón, una muestra puede contener células o tejidos que se obtienen de los pulmones.
De acuerdo con la enseñanza, una muestra puede ser una muestra tal como una muestra corporal derivada de un paciente que contiene o se espera que contenga células tumorales o cancerosas. La muestra corporal puede ser cualquier muestra de tejido tal como sangre, una muestra de tejido que se obtiene del tumor primario o de metástasis tumorales o cualquier otra muestra que contiene células tumorales o cancerosas. La presente enseñanza se describe en detalle mediante las figuras y ejemplos más abajo, que se usan solo con fines ilustrativos y no pretenden ser limitantes. Debido a la descripción y los ejemplos, las modalidades adicionales que se incluyen igualmente en la descripción son accesibles para el trabajador experto.
Figuras:
Figura 1A: Alineamiento de secuencias de proteínas claudina 6 y claudina 9 (humana/murina)
El alineamiento de secuencias muestra la alta homología entre claudina 6 humana y murina y claudina 9 humana.
Figura 1B: Alineamiento de secuencias de las proteínas claudina 6 y claudina 3, 4 y 9 (humana)
El alineamiento de secuencias muestra la alta homología en la familia multigénica de claudina
Figuras 2 A y B: Especificidad de anticuerpos evaluados en análisis de transferencia Western
Los lisados celulares de células HEK293 transfectadas con CLDN3, 4, 6 o 9 y simuladas y células tumorales positivas para CLDN6 (PA-1 SC12 y NEC-8) se transfirieron y los anticuerpos unidos (anti-CLDN3 generado en conejo (Invitrogen) 0,5 pg/ml, anti-CLDN4 generado en ratón (Invitrogen) 1 pg/ml, anti-CLDN6 generado en conejo (IBL) 0,2 pg/ml, anti-CLDN9 generado en cabra (Santa Cruz) 0,4 pg/ml o los anticuerpos monoclonales de ratón (5 pg/ml) se detectaron mediante anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa.
Figura 3: Análisis histológico de los anticuerpos positivos por transferencia Western
Unión de los AcMmu principales 58-1B, 58-3Ay 58-4B en comparación con el antisuero rb-anti-CLDN6 IBL a secciones FFPE de cáncer de ovario.
Figura 4A: Mapeo de epítopos mediante el uso de péptidos solapados sintéticos
Los péptidos solapados se inmovilizaron en placas de microtitulación y se añadieron los anticuerpos. Los anticuerpos unidos se revelaron con reactivos secundarios conjugados con peroxidasa adecuados.
Figura 4B: Mapeo de epítopos mediante el uso de péptidos solapados sintéticos biotinilados
Se sintetizaron péptidos biotinilados con alto solapamiento en el extremo N terminal a través de un enlazador hidrófilo flexible y se cargaron en placas de microtitulación acopladas a estreptavidina. Se aplicaron anticuerpos (1 pg/ml) y se detectaron y analizaron los anticuerpos unidos.
Para la comparación de las intensidades de la señal de AcMmu 58-4B-2 con el suero rb (IBL), la unión máxima de anticuerpos al péptido C-terminal 19 se definió como 100 %.
La intensidad de unión de cada anticuerpo a un péptido se calculó con relación a la unión máxima para cada sistema de evaluación.
La unión de AcMmu se analizó en 3 experimentos independientes en triplicados.
La unión de suero de IBL se analizó en 2 experimentos independientes en triplicados.
Figura 4C: Sitio de unión del principal monoclonal 58-4B-2 y suero policlonal de rb-antiCLDN6 (IBL).
Figura 5: Secuencias de los anticuerpos 58-1B, 58-3Ay 58-4B
Figura 6: Señales de fondo de diferentes anticuerpos en tejido ovárico normal
Comparación de los anticuerpos principales AcMmu 58-1B, 58-3A y 58-4B versus el anticuerpo de IBL comercial en tejido ovárico normal (concentración de anticuerpo 5 pg/ml; protocolo similar al de clínica).Ejemplos
Las técnicas y métodos usados en la presente descripción se describen en la presente descripción o se realizan de una manera conocida por sí misma y como se describió, por ejemplo, en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Todos los métodos, que incluye el uso de kits y reactivos, se realizaron de acuerdo con la información del fabricante a menos que se indique específicamente.
Ejemplo 1: Materiales y Métodos
Mapeo del sitio de unión al anticuerpo (Figura 4A)
El mapeo de epítopos reconocidos por anticuerpos puede realizarse como se describió en detalle en "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) de Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 y en "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 de Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay. Mapeo de epítopos con péptidos biotinilados (Figura 4B)
Se realizó un ELISA de péptidos para identificar el sitio de unión al anticuerpo de los anticuerpos monoclonales principales murinos y suero policlonal de rb de IBL. Los péptidos solapados biotinilados que cubren la secuencia C-terminal de CLDN6 se acoplaron a placas recubiertas con SA. A placas de ELISA recubiertas de antígeno se aplicaron los AcMmu (1 pg/ml) purificados o suero rb de IBL (1 pg/ml) y se lavaron los anticuerpos no unidos. Los anticuerpos unidos se detectaron con el anticuerpo secundario marcado con la enzima correspondiente (IgG(1+2a+2b+3) anti-ratón generado en cabra de fosfatasa alcalina o F(ab)2 anti conejo generado en cabra de fosfatasa alcalina) y sustrato enzimático ABTS, y se analizaron las intensidades de la señal.
Para la comparación de las intensidades de la señal de AcMmu 58-4B-2 con suero rb (IBL), la unión máxima de anticuerpos al C-term del péptido 19 se definió como 100 %.
La intensidad de unión de cada anticuerpo a un péptido se calculó en relación con la unión máxima para cada sistema de evaluación (ratón o conejo) independientemente.
La unión de los AcMmu se analizó en 3 experimentos independientes en triplicados
La unión de suero de IBL se analizó en 2 experimentos independientes en triplicados
Determinación del isotipo
Para determinar el isotipo de anticuerpos purificados, se usó el kit de tipificación de anticuerpos monoclonales de ratón IsoStrip (Roche, núm. de cat. 1493027) como se describió por el fabricante.
Transferencia Western
La IgG anti-CLDN6 generada recientemente puede evaluarse adicionalmente para la unión específica al antígeno CLDN6 mediante transferencia Western. Brevemente, pueden prepararse extractos celulares de células que expresan CLDN3, 4, 6 o 9 y controles negativos apropiados y someterse a electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS). Después de la electroforesis, los antígenos separados se transferirán a las membranas de nitrocelulosa, se bloquearán y se analizarán con sondas con los anticuerpos monoclonales que se analizarán. La unión de IgG puede detectarse mediante el uso de anti-IgG de ratónperoxidasa y revelarse con sustrato ECL.
Histología
La inmunohistoquímica (IHC) se realizó en portaobjetos de muestras de tejido embebido en parafina fijadas con formalina tamponada al 4 %. La inclusión en parafina se realizó de acuerdo con los protocolos estándar.
Después de eliminar la parafina y de la rehidratación, todos los portaobjetos se sometieron a la recuperación de antígenos mediante ebullición en tampón Tris 0,1 M/EDTA 0,01 M suplementado con azida de sodio al 15 mM (pH 9,0) a 95-98 °C durante 30 min, y subsecuentemente las peroxidasas endógenas se inactivaron mediante la adición de H<2>O<2>al 3 % suplementado con NaN<3>15 mM. Después de lavar con tampón de cloruro de sodio 150 mM (pH 7,6) suplementado con Tween-20 al 0,05 % (p/v) y Proclin al 0,005 % (p/v), los portaobjetos se incubaron con el anticuerpo monoclonal anti-CLDN6 58-4B de ratón a 1,0 o 5,0 pg/ml a temperatura ambiente durante una hora. La unión de los anticuerpos se visualizó mediante el uso de una solución lista para usar que contenía un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano picante a base de polímero (Histofine MAX PO (M)/UIO MAX PO (M), Nichirei, Japón). Las secciones se contra colorearon subsecuentemente con hematoxilina de Mayer (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania) y se sometieron a evaluación por parte de los evaluadores.
Evaluación histológica
Todas las muestras se analizaron con respecto a la proporción relativa de células tumorales teñidas positivas en relación con todas las células tumorales visibles para cada sección. La intensidad de la tinción se clasificó como negativa (-), débilmente positiva (1+), medianamente positiva (2+) y fuertemente positiva (3+). Solo se consideró como positiva la tinción en la membrana. El tejido de cáncer de ovario sirvió como control positivo para cada tinción. Adicionalmente, se encontró que el tejido renal embrionario de conejos de Nueva Zelanda blancos el día 29 del período de gestación mostraba una intensidad de tinción positiva fuerte. Esto se usó como referencia de intensidad de tinción interna para la positividad de tinción (2+ - 3+).
Ejemplo 2: Generación de anticuerpos monoclonales
El objetivo de este proyecto fue generar anticuerpos monoclonales murinos específicos de CLDN6 capaces de detectar células tumorales que expresan CLDN6 en cáncer de ovario o cualquier otro tejido canceroso de cualquier histología, que incluye los tejidos FFPE de tumores peritoneales primarios o de las trompas de Falopio.
Para generar un anticuerpo de CLDN6 de diagnóstico de alta afinidad y altamente específico, fue esencial iniciar protocolos de inmunización con una variedad de inmunógenos diferentes (Tabla 1) y adyuvantes. Durante el proyecto, aproximadamente 130 ratones (C57BL/6 y BALB/c) se sometieron a varias estrategias de inmunización para desencadenar una respuesta inmunitaria a-CLDN6 (Tabla 2).
Para activar el sistema inmunitario del ratón y superar la tolerancia inmunitaria, usamos conjugados de péptidos y proteínas recombinantes que codifican diferentes partes de CLDN6 humana que se expresan como proteínas de fusión recombinantes con diferentes epítopos para facilitar la purificación por afinidad (etiqueta Polihistidina-(HIS) y Glutatión-S-transferasa-(GST)) (Tabla 1).
De 20 estrategias de inmunización diferentes, los mejores resultados se lograron mediante el tratamiento de ratones con la proteína recombinante CLDN6 etiquetada en el extremo C-terminal con GST (Tabla 2) en combinación con varios adyuvantes (Tabla 2).
El día de la fusión, los esplenocitos de ratón se aislaron y se fusionaron con la línea celular de mieloma de ratón P3X63Ag8.653 (ATCC). Para la fusión de células de ratón con la línea celular de mieloma seguimos el protocolo estándar publicado por Kohler y Milstein 1975. Después de la selección de hipoxantinaaminopterina-timidina (HAT), los sobrenadantes se evaluaron en ELISA para la secreción de anticuerpos que reconocen el antígeno usado para las inmunizaciones. Se realizaron 69 fusiones y se cribaron más de 25000 clones de células de hibridoma. Las células de hibridoma de sobrenadantes positivos por ELISA (402) se subclonaron para generar hibridomas monoclonales. Los sobrenadantes de las células de hibridoma subclonadas se volvieron a cribar mediante ELISA para determinar la unión al antígeno de Claudina6. Las células de hibridoma de 88 clones positivos (que se unen al antígeno, pero no a la cadena principal o etiqueta) se expandieron y los sobrenadantes se analizaron adicionalmente mediante transferencia Western para su especificidad.
Los tres candidatos principales (58-4B, 58-1B y 58-3A) resultaron de una estrategia de inmunización de 11 etapas (inmunización #10 durante 123 días). Tres días antes de la esplenectomía, los ratones se estimularon para activar las células B seleccionadas seguido de fusión 58 (Tabla 3).
Ejemplo 3: Cribado de anticuerpos monoclonales mediante transferencia Western
Para evaluar si los anticuerpos positivos por ELISA en los sobrenadantes son capaces de unirse específicamente a la claudina 6 recombinante, se analizaron por transferencia Western. Los anticuerpos que se unen a CLDN6, pero no a ninguna otra proteína marcada se purificaron y las células se expandieron y se crioconservaron. Los anticuerpos se purificaron por FPLC mediante el uso de resina de afinidad de proteína A MABselect. Los anticuerpos purificados seleccionados mediante el tamizaje por transferencia Western se reanalizaron mediante transferencia Western para evaluar la unión a líneas celulares tumorales positivas para CLDN6 (PA-1, NEC-8) y a células HEK293 transfectadas con CLDN3, 4, 6 o 9 (Figura 2). Además, los anticuerpos se evaluaron por su capacidad para unirse a su antígeno en tejidos embebidos en parafina fijados en formalina (FFPE) mediante inmunohistoquímica. Los sobrenadantes de 33 hibridomas que se unen específicamente a la Claudina 6 se purificaron y se analizaron adicionalmente en inmunohistoquímica.
Ejemplo 4: Análisis histológico de los anticuerpos positivos por transferencia Western
El objetivo de este experimento fue evaluar la especificidad y sensibilidad de los anticuerpos para CLDN6. Esto se realizó mediante el uso de tejidos FFPE de cáncer de ovario que expresan CLDN6 (Figura 3).
En un primer experimento, los anticuerpos purificados que dieron positivo en el 1er cribado mediante transferencia Western, se analizaron a una concentración de 1 pg/ml y 5 pg/ml en secciones FFPE de cáncer de ovario. Se usó un estándar de laboratorio y un protocolo de tinción establecido, durante toda la noche con tampón de recuperación cítrico y una temperatura de recuperación de 120 °C. Los anticuerpos que muestran tinción de CLDN6 específica de tejido sin producir altos niveles de tinción de fondo inespecífica se titularon además a 0,2, 1, 2 y 5 pg/ml en varios tejidos de cáncer de ovario para evaluar adicionalmente la sensibilidad y especificidad de estos anticuerpos. En las siguientes etapas de desarrollo, los anticuerpos generados recientemente se evaluaron directamente a concentraciones más altas, de 1 y 5 pg/ml, porque las diferencias en las intensidades de tinción de los diferentes anticuerpos no se pudieron evaluar claramente a una concentración de 0,2 pg/ml. Para los experimentos de titulación adicionales y análisis de especificidad se seleccionaron los anticuerpos que generan señales fuertes en las membranas celulares del tejido tumoral ovárico, de los tejidos seleccionados, y poca o ninguna señal de fondo en los tejidos sanos adyacentes. Los siguientes tres anticuerpos cumplieron con estos criterios y se seleccionaron como los candidatos principales para una investigación adicional: 58-1B, 58-3Ay 58-4B.
Ejemplo 5: Mapeo de epítopos de los AcMmu (Figura 4)
Se realizó un ELISA de péptidos para identificar los epítopos de unión a los anticuerpos en CLDN6. Cada anticuerpo purificado se evaluó en péptidos que se solapan 11aa que cubren la secuencia C-terminal de CLDN6. Los anticuerpos 46-5A, 58-1B, 58-3A, 58-4B y 58-9B mostraron unión específica a un epítopo cubierto por el péptido AISRGPSEYPTKNYV (péptido 7; Figura 4A). El sitio de unión de estos anticuerpos se caracterizó además mediante el uso de péptidos biotinilados que se solapan en 14 de 15 aa.
Sorprendentemente, los anticuerpos 58-1B, 58-3A y 58-4B y el subclon 58-4B-2 se unen a la secuencia EYPTKNY (Figura 4B) son capaces de unirse a CLDN6 en tejidos cancerosos FFPE de manera muy específica con bajo fondo. Por el contrario, el anticuerpo 46-5A fue capaz de unirse a péptidos que no comprenden la secuencia EYPTKNY pero que comprenden una porción de esta, es decir, la secuencia EYPTK (Figura 4B). El antisuero policlonal de rb contra anti-CLDN6 disponible comercialmente (IBL) se une a péptidos que comprenden la secuencia RGPS (Figura 4C).
Ejemplo 6: Análisis de la especificidad de anticuerpos mediante el uso de un panel de tejido normal Los anticuerpos que producen señales fuertes en el tejido de cáncer de ovario analizado (58-1B, 58-3Ay 58-4B) con el estándar de laboratorio y el protocolo de tinción establecido se analizaron adicionalmente en varios tejidos normales relevantes, es decir, tejidos de donantes sanos (por ejemplo, pulmón, testículo, útero y ovario) para garantizar la alta especificidad de direccionamiento a CLDN6. La tinción de estos tejidos seleccionados se realizó mediante el uso del estándar de laboratorio y el protocolo de tinción establecido (durante toda la noche; temperatura de recuperación de 120 °C, tampón de recuperación cítrico).
Ninguno de los tres anticuerpos seleccionados generó señales de tinción inespecíficas en el panel de tejido normal evaluado, excepto por señales inespecíficas débiles en una única región periférica de una muestra de tejido ovárico. Esta señal débil solo fue visible en la concentración más alta de ambas concentraciones evaluadas (1 y 5 pg/ml), que no representa una subestructura ovárica.
Ejemplo 7: Comparación de la sensibilidad de anticuerpos mediante el uso de muestras de panel de tejido de cáncer de ovario y normal
No se observaron diferencias significativas en el patrón de tinción y las intensidades de tinción de los anticuerpos 58-3A, 58-1B y 58-4B en los experimentos anteriores. Por lo tanto, los anticuerpos se sometieron a experimentos de tinción con un protocolo de tinción más orientado clínicamente, lo que significa más eficiente en el tiempo. Para simular los procesos de tinción aplicados en los laboratorios de patología estándar, se estableció un protocolo de un día con una etapa de incubación de anticuerpo primario de 1 hora y una etapa de recuperación en baño de agua (98 °C). Además, se compararon dos tampones de recuperación diferentes para evaluar si las diferentes condiciones de recuperación podrían influir en la sensibilidad de los anticuerpos evaluados con respecto a la detección de CLDN6.
Para todos los anticuerpos se generaron señales más intensas y una mayor cantidad de células tumorales teñidas positivas con el protocolo de un día adaptado con tampón Tris para la recuperación, en comparación con el tampón de recuperación cítrico estándar. Las señales de tinción más intensas se generaron con 58-4B que alcanzó hasta el 80 % de células tumorales teñidas 3+, mientras que las intensidades de tinción del candidato 58-1B fueron las menos intensas, alcanzando solo el 30 % de células tumorales teñidas 3+.
El protocolo de tinción con el tampón de Tris para la recuperación que resultó en las señales de tinción más sensibles se aplicó subsecuentemente para la tinción del panel de tejido normal para evaluar la especificidad de los anticuerpos seleccionados en condiciones de laboratorio clínico de rutina.
Los mejores resultados con respecto a la especificidad y sensibilidad de CLDN6 en tejidos FFPE se lograron mediante el uso del anticuerpo candidato para diagnóstico 58-4B. No se detectaron señales en los tejidos normales. Todos los demás anticuerpos generaron señales en los cristales de Reinke de la muestra de testículos. Además, el anticuerpo 58-3a generó una tinción débil en los vasos sanguíneos. El anticuerpo 58-1B demostró señales más intensas (1+) en los tejidos normales de los testículos y los ovarios.
En todas las muestras analizadas, el AcMmu 58-4B demostró un mejor desempeño con respecto a no mostrar tinción de fondo y una tinción intensa en el tejido tumoral relevante, mientras que los candidatos AcMmu 58-3A y 58-1B mostraron una tinción intensa en el tejido tumoral relevante, pero con señales de fondo más altas. Especialmente las señales producidas mediante el uso de AcMmu 58-1B fueron de alta intensidad, pero con el inconveniente de una alta tinción de fondo.
Para su uso posterior en un entorno clínico, el hibridoma correspondiente para la generación de los anticuerpos candidatos para diagnóstico se adaptó a medios libres de suero. Desafortunadamente, la adaptación del clon 58-3Aa condiciones sin suero no fue posible. Por lo tanto, el anticuerpo candidato 58-3A también se excluyó de los estudios histológicos adicionales, dejando el 58-4B como el candidato principal final.
Ejemplo 8: Análisis histológico en profundidad y caracterización de anticuerpos
En una primera etapa, el lote de anticuerpo 58-4B producido en condiciones libres de suero se comparó con el lote de anticuerpo producido en condiciones de suero mediante el uso de un panel de tejido normal TMA (MNO961) para detectar diferencias en la sensibilidad y especificidad de la diana entre los lotes. La tinción se realizó mediante el uso de un protocolo de un día similar al de la clínica (recuperación en baño de agua, tampón Tris para la recuperación) con componentes libres de regalías. Con ambos lotes de anticuerpos, se detectaron tinciones débiles en algunas muestras de tejido normal (ver Tabla 4). En comparación con el anticuerpo producido en condiciones de suero, el lote de anticuerpo libre de suero fue más limpio con menos manchas artificiales en las muestras analizadas. En el testículo, las señales de tinción fueron visibles en los cristales de Reinke con ambos lotes de anticuerpos.
En una segunda etapa, el anticuerpo producido sin suero se evaluó en un panel TMA de cáncer de ovario y se comparó con el anticuerpo de IBL disponible comercialmente. Este anticuerpo comercial ya se había usado en tinciones de estudios anteriores. El anticuerpo policlonal IBL se usó con el protocolo del estudio (durante toda la noche, temperatura de recuperación de 120 °C, tampón de recuperación cítrico). El anticuerpo 58-4B se usó con el protocolo clínico de rutina (protocolo de un día, recuperación en baño de agua, tampón Tris para la recuperación).
De los 72 casos de cáncer de ovario de TMA detectados, solo una muestra fue positiva con el anticuerpo de IBL. Por el contrario, 14/72 muestras dieron positivo para CLDN6 cuando se tiñeron con el anticuerpo 58-4B. Desafortunadamente, la calidad de las muestras de TMA de cáncer de ovario comercial fue baja, lo que resultó en señales de tinción débiles en muestras tumorales positivas. Por lo tanto, la comparación se repitió con muestras de resección tumoral del Dr. Dhaene, que representan regiones tumorales más grandes con una conservación de alta calidad de muestras de tumor pulmonar, uterino y testicular.
La tinción del 58-4B resultó en una detección más sensible y específica de CLDN6 en muestras tumorales en comparación con las tinciones realizadas con el anticuerpo policlonal IBL, lo que significa que más células tumorales fueron positivas y se detectó una intensidad más fuerte de las células tumorales teñidas.
Ejemplo 9: Análisis de secuencia de los anticuerpos principales
Un análisis de la secuencia de los anticuerpos 58-1B, 58-3Ay 58-4B se muestra en la Figura 5 y más abajo.
Análisis de secuencia de aminoácidos del anticuerpo principal 58-4B-2
Análisis de secuencia de aminoácidos del anticuerpo 58-1B
Análisis de secuencia de aminoácidos del anticuerpo 58-3A
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Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    i .Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de este, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno comprende:
    una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) que comprende:
    una VHCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 51 o la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 57;
    una VHCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 52 o la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 58; y
    una VHCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53; y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende:
    una VLCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; una VLCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55; y una VLCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56; y que se une:
    (i) a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos EYPTKNY (SEQ ID NO: 38), y/o
    (ii) a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos EYPTKNYV (SEQ ID NO: 29).
  2. 2. Un método para detectar CLDN6 o la cantidad de CLDN6 en una muestra que comprende las etapas de:
    (i) poner en contacto una muestra con el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 y
    (ii) detectar la formación de un complejo o la cantidad de un complejo entre el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno y CLDN6.
  3. 3. Un método para detectar células que expresan CLDN6 que comprende las etapas de:
    (i) poner en contacto una muestra celular con el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 y
    (ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno y CLDN6 que se expresa por las células en dicha muestra.
  4. 4. Un método para el diagnóstico, detección o monitoreo de células cancerosas que expresan CLDN6 que comprende las etapas de:
    (i) poner en contacto una muestra biológica con el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 y
    (ii) detectar la formación de un complejo y/o la cantidad de un complejo entre el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno y CLDN6.
  5. 5. El método de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende:
    una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) que comprende:
    una VHCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 51; una VHCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 52; y una VHCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53; y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende:
    una VLCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; una VLCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55; y una VLCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56; o una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) que comprende:
    una VHCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 57; una VHCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 58; y una VHCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53; y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende:
    una VLCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; una VLCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55; y una VLCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56.
  6. 6. El método de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende:
    (i) un anticuerpo que se produce por, o que puede obtenerse de, un clon depositado bajo el núm. de acceso DSM ACC3313 (58-1B), DSM ACC3312 (58-3A) o DSM ACC3311 (58-4B-2), o (ii) un anticuerpo que es una forma humanizada o quimérica del anticuerpo según (i), o un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo de (i) o (ii).
  7. 7. El método de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende un anticuerpo que se produce por, o que puede obtenerse de, un clon depositado bajo el núm. de acceso DSM ACC3313 (58-1B), DSM ACC3312 (58-3A) o DSM ACC3311 (58-4B-2).
  8. 8. El método de la reivindicación 3, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende:
    una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) que comprende:
    una VHCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 51; una VHCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 52; y una VHCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53; y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende:
    una VLCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; una VLCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55; y una VLCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56; o una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) que comprende:
    una VHCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 57; una VHCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 58; y una VHCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53; y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende:
    una VLCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; una VLCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55; y una VLCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56.
  9. 9. El método de la reivindicación 3, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende:
    (i) un anticuerpo que se produce por, o que puede obtenerse de, un clon depositado bajo el núm. de acceso DSM ACC3313 (58-1B), DSM ACC3312 (58-3A) o DSM ACC3311 (58-4B-2), o (ii) un anticuerpo que es una forma humanizada o quimérica del anticuerpo según (i), o un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo de (i) o (ii).
  10. 10. El método de la reivindicación 3, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende un anticuerpo que se produce por, o que puede obtenerse de, un clon depositado bajo el núm. de acceso DSM ACC3313 (58-1B), DSM ACC3312 (58-3A) o DSM ACC3311 (58-4B-2).
  11. 11. El método de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende:
    una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) que comprende:
    una VHCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 51; una VHCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 52; y una VHCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53; y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende:
    una VLCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; una VLCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55; y una VLCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56; o una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) que comprende:
    una VHCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 57; una VHCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 58; y una VHCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53; y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende:
    una VLCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; una VLCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55; y una VLCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56.
  12. 12. El método de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende:
    (i) un anticuerpo que se produce por, o que puede obtenerse de, un clon depositado bajo el núm. de acceso DSM ACC3313 (58-1B), DSM ACC3312 (58-3A) o DSM ACC3311 (58-4B-2), o (ii) un anticuerpo que es una forma humanizada o quimérica del anticuerpo según (i), o un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo de (i) o (ii).
  13. 13. El método de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende un anticuerpo que se produce por, o que puede obtenerse de, un clon depositado bajo el núm. de acceso DSM ACC3313 (58-1B), DSM ACC3312 (58-3A) o DSM ACC3311 (58-4B-2).
  14. 14. El anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende:
    una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) que comprende:
    una VHCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 51; una VHCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 52; y una VHCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53; y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende:
    una VLCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; una VLCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55; y una VLCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56; o una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH) que comprende:
    una VHCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 57; una VHCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 58; y una VHCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 53; y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) que comprende:
    una VLCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 54; una VLCDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 55; y una VLCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 56.
  15. 15. El anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende:
    (i) un anticuerpo que se produce por, o que puede obtenerse de, un clon depositado bajo el núm. de acceso DSM ACC3313 (58-1B), DSM ACC3312 (58-3A) o DSM ACC3311 (58-4B-2), o (ii) un anticuerpo que es una forma humanizada o quimérica del anticuerpo según (i), o un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo de (i) o (ii).
  16. 16. El anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de este comprende un anticuerpo que se produce por, o que puede obtenerse de, un clon depositado bajo el núm. de acceso DSM ACC3313 (58-1B), DSM ACC3312 (58-3A) o DSM ACC3311 (58-4B-2).
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