ES2997116T3 - Methods of determining protein stability - Google Patents

Abstract

La divulgación proporciona un método para evaluar la estabilidad de una proteína terapéutica en una formulación que comprende los pasos de medir la estabilidad térmica de la proteína terapéutica en donde el valor de la estabilidad térmica se correlaciona con el cambio porcentual del pico principal determinado por cromatografía de exclusión por tamaño de una manera estadísticamente significativa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de determinar la estabilidad de proteínas

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional estadounidense N° 62/808.166, presentada el 20 de febrero de 2019.

INCORPORACIÓN POR REFERENCIA DEL LISTADO DE SECUENCIAS

Esta solicitud contiene, como parte separada de la divulgación, un Listado de Secuencias en formato legible por computadora (nombre de archivo: 53583A_SeqListing.txt; archivo de texto ASCII de 270.082 bytes creado el 19 de febrero de 2020) que se incorpora como referencia en esta memoria en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La divulgación proporciona métodos para evaluar la estabilidad de una proteína terapéutica, opcionalmente en una formulación, que comprenden las etapas de medir la estabilidad térmica de la proteína terapéutica, en donde el valor de la estabilidad térmica se correlaciona con el cambio porcentual del pico principal para la proteína terapéutica determinado por cromatografía de exclusión por tamaño de una manera estadísticamente significativa.

ANTECEDENTES

La estabilidad de las proteínas tiene un impacto crítico en la capacidad de fabricación y la vida útil de los medicamentos de moléculas grandes y es uno de los atributos críticos para seleccionar un candidato durante las evaluaciones moleculares tempranas. La selección de moléculas candidatas con la estabilidad óptima en el tampón de formulación reduce el análisis requerido más adelante en el desarrollo, lo que ahorra tiempo y recursos. La identificación temprana de los problemas de estabilidad en el desarrollo permite variaciones en los aspectos de la formulación tales como los agentes tampón, el tampón, el pH, los excipientes,etc.,con el fin de mejorar la estabilidad de la proteína y aumentar la vida útil.

El método de referencia actual para medir la estabilidad de las proteínas es la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés). Este método requiere mucho tiempo y es costoso. Existe la necesidad de métodos más rentables para determinar la estabilidad de las proteínas. La presente divulgación demuestra que el análisis de la estabilidad térmica se correlaciona con la estabilidad de las proteínas determinada por métodos SEC de una manera estadísticamente significativa.

El documento US2006/135427 A1 describe un método para evaluar la estabilidad térmica de una hormona de crecimiento humana (hGH) mutada mediante calorimetría diferencial (DSC) y también se determinó la estabilidad de la hGH mutada utilizando cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).

El documento WO2007/124082 A2 describe un método para evaluar/predecir la termoestabilidad de un anticuerpo terapéutico utilizando DSC o SEC.

SUMARIO

La divulgación proporciona métodos para evaluar la estabilidad de una proteína terapéutica, que comprenden las etapas de medir la estabilidad térmica de la proteína terapéutica y comparar la temperatura de desplegado térmico (fusión) (T<m>) de la proteína terapéutica con la T<m>de una proteína de control, en donde un aumento en la T<m>de la proteína terapéutica en comparación con la T<m>de la proteína de control indica un aumento en la estabilidad de la proteína terapéutica, y en donde la T<m>de la proteína terapéutica se correlaciona con significancia estadística con el cambio porcentual del pico principal en el tamaño de la proteína determinado por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).

La divulgación proporciona también métodos para predecir la estabilidad de una proteína terapéutica, según se mide por SEC, que comprenden las etapas de medir la estabilidad térmica de la proteína terapéutica y comparar la temperatura de desplegado (fusión) (T<m>) de la proteína terapéutica con la T<m>de una proteína de control, en donde la T<m>de la proteína terapéutica se correlaciona con significancia estadística con el cambio porcentual del pico principal en el tamaño de la proteína determinado por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).

Cualquiera de los métodos descritos puede comprender, además, la etapa de determinar la significancia estadística de la correlación entre la T<m>de la proteína terapéutica y el cambio del pico principal de la proteína terapéutica determinado por SEC.

En cualquiera de los métodos descritos, la T<m>de la proteína terapéutica se correlaciona con el cambio porcentual máximo principal en el tamaño de la proteína determinado por SEC con un valor p igual a o menor que 0,05, o un valor p igual a o menor que 0,01, o un valor p igual a o menor que 0,005, o un valor p igual a o menor que 0,001. Además, la significancia estadística se determina mediante análisis de regresión lineal o mediante otros métodos de ajuste de datos tales como la regresión polinómica.

Por ejemplo, la medición del valor T<m>de la proteína terapéutica predice la estabilidad de la proteína terapéutica en una formulación durante un período de al menos una semana, durante al menos dos semanas, durante al menos un mes, durante al menos dos meses, durante al menos tres meses, durante al menos cuatro meses, durante al menos cinco meses, durante al menos seis meses, durante al menos nueve meses, durante al menos 12 meses, durante al menos 18 meses, durante al menos 2 años o durante al menos 3 años.

En cualquiera de los métodos descritos, la estabilidad térmica se mide mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC, por sus siglas en inglés) o fluorimetría diferencial de barrido (DSF, por sus siglas en inglés). La DSF utilizada en los métodos puede ser nanoDSF.

Además, en cualquiera de los métodos, la T<m>de la proteína terapéutica predice el cambio porcentual del pico principal de la proteína terapéutica medido en cromatografía de exclusión por tamaño.

Los métodos descritos pueden llevarse a cabo en cualquier proteína terapéutica. Las proteínas terapéuticas incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, moléculas de activadores de células T bi-específicas (BiTE, por sus siglas en inglés), moléculas de fusión Fc y muteínas.

Anticuerpos monoclonales ejemplares incluyen los presentados en la Tabla A.

Moléculas de BiTE ejemplares incluyen moléculas de BiTE que se unen específicamente a uno o más de CD33, BCMA, FLT3, CD-19, EGFRvIM, DLL3, y CD-3.

Proteínas de fusión Fc ejemplares incluyen una proteína de fusión FC o la muteína que se une específicamente a IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21, CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, CEACAM-1, TIGIT, LAG3, CD112, CD112R, CD96, TIM3, BTLA, ICOS, OX40, 41BB, CD27, GITR.

En cualquiera de los métodos descritos, se formula la proteína terapéutica. Por ejemplo, la proteína terapéutica se formula a una concentración mayor que 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL, 100 mg/mL, 110 mg/mL, 120 mg/mL, 130 mg/mL, 140 mg/mL, 150 mg/mL, 160 mg/mL, 170 mg/mL, 180 mg/mL, 190 mg/mL, 200 mg/mL, 210 mg/mL y 220 mg/mL, y cada incremento de las mismas.

Con el fin de facilitar la comprensión de la presente divulgación, se definen en esta memoria determinados términos y expresiones. Las definiciones de determinados términos y expresiones se proporcionan al final de la descripción detallada. Se exponen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 proporciona un gráfico de apalancamiento representativo de diferentes resultados estadísticos. La Figura 2 proporciona el gráfico de apalancamiento de los datos SEC y DSC de un estudio de estabilidad de la formulación de mAb.

La Figura 3 proporciona el gráfico de apalancamiento de los datos SEC y DSC de un estudio de estabilidad de la formulación BiTE.

La Figura 4 proporciona el gráfico de apalancamiento de los datos SEC y DSC de un estudio de estabilidad de la muteína Fc.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La divulgación proporciona métodos para determinar la estabilidad de las proteínas utilizando análisis de estabilidad térmica, tales como calorimetría diferencial de barrido (DSC) y fluorimetría diferencial de barrido nano (DSF o nanoDSF). Los experimentos descritos en esta memoria demuestran que el análisis de los atributos de estabilidad térmica de una muestra de proteína se correlaciona de manera estadísticamente significativa con el análisis de la estabilidad de una muestra de proteína utilizando el método estándar actual en la técnica: cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Los métodos para determinar la estabilidad térmica de una muestra de proteína requieren menos mano de obra y menos tiempo y menos recursos (producto) para llevar a cabo el análisis en comparación con los métodos SEC. Por lo tanto, los métodos de uso de la estabilidad térmica para determinar o predecir la estabilidad de las proteínas costarán significativamente menos que llevar a cabo la SEC. Por ejemplo, la SEC requiere al menos dos puntos de tiempo, mientras que los métodos de estabilidad térmica solo requieren un punto de tiempo sin período de espera para obtener los resultados. Los métodos de la divulgación se pueden aplicar a diversas fases del desarrollo de fármacos biofarmacéuticos, incluyendo la evaluación de moléculas, el desarrollo de formulaciones, la caracterización de proteínas y otros experimentos necesarios para presentaciones reglamentarias.

Las proteínas terapéuticas sufren cambios estructurales cuando se almacenan en un entorno no fisiológico y/o se exponen a tensiones fisico-químicas. Los cambios estructurales introducen variaciones en las propiedades físicas de la proteína, variaciones en la solubilidad, variaciones en la tendencia a agregarse y variaciones en la actividad superficial, que en última instancia dan lugar a degradaciones indeseables tales como agregados solubles, precipitados insolubles, formas desplegadas o mal plegadas de la proteína, formas desnaturalizadas de la proteína,etc.La medición de la estabilidad de la proteína terapéutica mide estos cambios estructurales dentro de la proteína. Como se demuestra en esta memoria, la medición de la estabilidad térmica mide estos cambios estructurales en respuesta a los cambios de temperatura.

El estado actual de la técnica es analizar una muestra de proteína utilizando la SEC en el tiempo cero y al menos en un segundo punto de tiempo,p. ej.,6 meses a 37 °C. Un análisis por SEC típico requiere aproximadamente 1 mg/ml de proteína terapéutica en una muestra y un tamaño de muestra de aproximadamente 2 ml o más. Sin embargo, la DSC solo requiere un punto de tiempo para el análisis y requiere un tamaño de muestra de aproximadamente 0,4 ml. La nanoDSF requiere un tamaño de muestra aún más pequeño (~0.01 mL). Más importante aún, los ensayos de estabilidad térmica no requieren los largos tiempos de almacenamiento requeridos por los métodos SEC estándares.

En la actualidad, no se utilizan en la técnica métodos de análisis de la estabilidad térmica para evaluar la estabilidad de las proteínas terapéuticas en una formulación. Los métodos de la divulgación son únicos porque se basan en los datos proporcionados en esta memoria que demostraron que el análisis de la estabilidad térmica se correlacionaba con el análisis SEC de una manera estadísticamente significativa.

Los métodos de la divulgación son útiles para analizar la estabilidad de una proteína terapéutica en una formulación en todas las fases del desarrollo de un fármaco. Por ejemplo, en las primeras fases del desarrollo de un fármaco, estos métodos proporcionan un análisis rápido para determinar si se deben analizar más a fondo componentes particulares de la formulación o si se deben omitir determinados componentes al principio del desarrollo. Estos métodos también permiten el análisis de muchas formulaciones diferentes en poco tiempo, lo que permite al investigador centrar la investigación en componentes particulares de la formulación que son más adecuados para el uso a largo plazo. El método de la divulgación también permite realizar pruebas rápidas de pequeños ajustes a la formulación sin largos períodos de almacenamiento.

Los datos experimentales proporcionados en esta memoria demuestran que los valores de estabilidad térmica y los valores de estabilidad de la proteína medidos por SEC se correlacionan de manera estadísticamente significativa, lo que significa que el análisis estadístico indica que estos valores tienen una fuerte relación lineal. El nivel de significancia se indica generalmente como la probabilidad para el modelo estadístico dado (valor p) y la significancia estadística se indica mediante un valor p que es menor que 0,05 (p < 0,05).

Cuando se habla de la estabilidad de una proteína terapéutica, la estabilidad puede referirse a "estabilidad proteica" o un sub-aspecto de esta expresión. Por ejemplo, "estabilidad proteica" se refiere a un atributo de una proteína en su forma conformacional nativa y su capacidad para resistir cambios conformacionales a su forma nativa, p. ej., degradación, desplegado, agregación o cambios a otras formas de conformación no nativas, en respuesta a factores químicos o medioambientales, tales como el pH del tampón, la temperatura, las sales, la agitación mecánica,etc.El método común para determinar la estabilidad de una proteína terapéutica en una formulación es la SEC.

Un aspecto particular de la estabilidad de las proteínas es la estabilidad térmica. La "estabilidad térmica" se refiere a un atributo de una proteína para resistir cambios de confirmación en su forma,p. ej.,degradación, desplegado, agregación u otros cambios en formas de conformación no nativas, en respuesta a cambios en la temperatura. En cualquiera de los métodos de la divulgación, la estabilidad térmica se mide mediante cualquier método de medición de la estabilidad térmica, tal como calorimetría diferencial de barrido (DSC) o fluorimetría diferencial de barrido (DSF o nanoDSF).

La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) es el patrón actual de práctica para determinar la estabilidad de las proteínas. En un estudio típico de estabilidad de SEC, partes alícuotas de proteínas se almacenan a diferentes temperaturas durante diversas cantidades de tiempo. Al final de cada uno de los puntos de tiempo, se analiza el pico principal de cada una de las muestras de proteína mediante SEC. El método SEC separa las moléculas en base a su tamaño utilizando filtración a través de una matriz que consiste en perlas esféricas que contienen poros de una distribución de tamaños específica. La separación se produce cuando se incluyen o excluyen moléculas de diferentes tamaños de los poros dentro de la matriz. Las moléculas pequeñas se difunden en los poros y su flujo a través de la columna se retarda de acuerdo con su tamaño, mientras que las moléculas grandes no se introducen en los poros y se eluyen en el volumen vacío de la columna. En consecuencia, las moléculas se separan según su tamaño a medida que pasan a través de la columna y se eluyen en orden decreciente de peso molecular (PM). El pico principal representa la mayor parte de la proteína de interés en su PM correcto. Cualquier cambio porcentual en la cantidad de proteína en el pico principal indica inestabilidad de la proteína, tal como degradación, desplegado, agregación u otras formas conformacionales no nativas.

Métodos de Determinar la Estabilidad Térmica

Los métodos de la divulgación utilizan etapas para llevar a cabo un análisis de estabilidad térmica (T<m>) en una proteína terapéutica, opcionalmente en una formulación. "Análisis de estabilidad térmica" se refiere a una técnica en la que se determina y/o registra algún parámetro físico en función de la temperatura. La estabilidad térmica se refiere a un atributo de una proteína para resistir cambios conformacionales en su estructura nativa, p. ej., degradación, desplegado, agregación u otras estructuras de confirmación no nativas, en respuesta a cambios en la temperatura.

Calorimetría diferencial de barrido (DSC)

La calorimetría diferencial de barrido (DSC) es una herramienta termodinámica para la evaluación directa de la absorción de energía térmica, que se produce en una muestra dentro de un aumento o disminución regulados de la temperatura. La calorimetría se aplica para controlar las transiciones de fase. La DSC mide la capacidad térmica en función de la temperatura utilizando un instrumento de análisis térmico que determina la temperatura y el flujo de calor asociados con las transiciones de material en función del tiempo y la temperatura. La expresión "capacidad térmica" se refiere a la cantidad de energía que puede contener una unidad de materia. La capacidad térmica aumenta con la temperatura.

Durante un cambio de temperatura, la DSC mide una cantidad de calor que la muestra de proteína irradia o absorbe en exceso en función de una diferencia de temperatura entre la muestra y el material de referencia. En este análisis, un calorímetro mide el calor que entra y sale de la muestra de proteína. Durante un análisis DSC, la capacidad térmica de una célula de muestra (muestra de proteína) se compara con la de una célula de referencia (que carece de proteína) al tiempo que se aumenta gradualmente la temperatura de ambas células. Tanto la muestra como la referencia se mantienen a casi la misma temperatura durante todo el análisis. Las diferencias en los flujos de energía necesarios para calentar las células se registran y se utilizan para calcular la capacidad térmica de la muestra. La representación gráfica de la capacidad térmica en función de la temperatura produce un termograma DSC. Las transiciones de desplegado de proteínas se detectan como cambios en la capacidad térmica. El análisis de datos posterior a la ejecución produce el punto medio de la temperatura de desplegado térmico (T<m>). Las temperaturas de desplegado térmico obtenidas a partir de la DSC se pueden utilizar para evaluar la estabilidad térmica de una proteína. Se requieren cantidades de proteína en miligramos para ejecutar el análisis DSC. Véase Kodre et al. RRJA 3:11-22, 2014 y Gill et al. J. Biomed tech., 21(4): 167-193, 2010.

El análisis DSC se puede llevar a cabo utilizando una DSC de flujo de calor, DSC de flujo calorífico, DSC con compensación de potencia, DSC modulada, hiper DSC o DSC de presión. En una DSC de flujo calorífico, el material de muestra, encerrado en una bandeja, y una bandeja de referencia vacía se colocan en un disco termoeléctrico rodeado por un horno. El horno se calienta a una velocidad de calentamiento lineal y el calor se transfiere a la bandeja de muestra y de referencia a través del disco termoeléctrico. Sin embargo, debido a la capacidad térmica (C<p>) de la muestra, habría una diferencia de temperatura entre la bandeja de muestra y la de referencia, que se mide mediante termopares de área, y el flujo de calor consiguiente se determina por el equivalente térmico de la ley de Ohm (la corriente a través de un conductor entre dos puntos es directamente proporcional a la tensión a través de los dos puntos). En la DSC de flujo calorífico, la diferencia en el flujo de calor hacia la muestra y la referencia se mide mientras la temperatura de la muestra cambia a una velocidad constante.

En una DSC con compensación de potencia, las bandejas de muestra y de referencia se colocan en hornos separados calentados por calentadores separados. La muestra y la referencia se mantienen a la misma temperatura y la diferencia en la potencia térmica requerida para mantenerlas a la misma temperatura se mide y se representa gráficamente como una función de la temperatura o el tiempo. En la DSC con compensación de potencia, las temperaturas de la muestra y la referencia se mantienen iguales entre sí al tiempo que ambas temperaturas aumentan o disminuyen linealmente. Se mide la potencia necesaria para mantener la temperatura de la muestra igual a la temperatura de referencia.

La DSC modulada utiliza el mismo calentamiento y la misma disposición de celdas que el método DSC de flujo calorífico. La DSC de barrido rápido tiene la capacidad de realizar mediciones válidas de flujo de calor con velocidades controladas lineales rápidas (hasta 500 K/min), especialmente mediante enfriamiento, en que las velocidades son más altas que con la DSC compensada motorizada clásica. La DSC estándar funciona por debajo de 10 K/min. En la DSC de presión, la muestra se puede someter a diferentes presiones, lo que permite la caracterización de sustancias a las presiones de los procesos o distinguir entre picos solapantes.

Técnicas basadas en DSC adicionales incluyen DSC convencional/básica, DSC con sistemas microelectromecánicos (MEMS), DSC calentada por infrarrojos (IR), DSC de temperatura modulada (MTDSC), DSC modulada por flujo de gas (GFMDSC), nano DSC paralela (PNDSC), calorimetría por perturbación de presión (PPC), DSC autorreferencial (SRDSC) y DSC de alto rendimiento (HPer). Se sabe que las aplicaciones de DSC determinan la transición de fase estructural, el punto de fusión, el calor de fusión, el porcentaje de cristalinidad, la cinética de cristalización y las transiciones de fase, la estabilidad oxidativa, el análisis termodinámico de biomoléculas y la cinética de curado de materiales no biológicos. Las ventajas de la DSC son la facilidad para llevar a cabo los análisis y la velocidad con la que se puede utilizar este análisis para observar la transición en el producto.

Fluorimetría Diferencial de Barrido (DSF)

La fluorimetría diferencial de barrido (DSF) mide los cambios en la relación de intensidad de fluorescencia intrínseca (350:330 nm) en función de la temperatura. Las proteínas que contienen residuos de aminoácidos aromáticos (triptófano, tirosina y fenilalanina) muestran fluorescencia intrínseca. Cuando una molécula se despliega, las ubicaciones de los residuos de aminoácidos aromáticos cambian, lo que da como resultado cambios en los espectros de fluorescencia. Durante un análisis DSF o nanoDSF, la relación de intensidad de fluorescencia intrínseca (350:330 nm) se mide y registra continuamente. Al trazar la relación de intensidad de fluorescencia intrínseca (o la primera derivada de la relación) en función de la temperatura se produce un termograma DSF. El análisis de datos posterior a la ejecución produce el punto medio de la temperatura de despliegue térmico (T<m>). Las temperaturas de despliegue térmico obtenidas a partir de la DSF se pueden utilizar para evaluar la estabilidad térmica de una proteína.

Correlación

Se utiliza un enfoque estadístico para evaluar el uso potencial del atributo de estabilidad térmica para predecir la estabilidad de las proteínas. En las pruebas de hipótesis estadísticas, el nivel de significancia definido para un estudio, a, es la probabilidad de que el estudio rechace la hipótesis nula, dado que es verdadera. El nivel de significancia para un estudio se establece típicamente en 5 % (0,05). El valor p se utiliza en el contexto de las pruebas de hipótesis nulas para cuantificar la idea de significancia estadística. El valor p es la probabilidad calculada para un modelo estadístico dado. El resultado de un modelo estadístico dado,es decir,la predicción se considera estadísticamente significativa cuando p < a,es decir,p < 0,05.

Los métodos descritos en esta memoria utilizan las técnicas DSC y nanoDSF para analizar la estabilidad térmica. Los datos proporcionados en los Ejemplos demuestran que el análisis DSC y nanoDSF en una proteína diana se correlaciona con el análisis de estabilidad de proteínas realizado utilizando SEC en la misma proteína terapéutica. La divulgación contempla el uso de otros métodos para determinar la estabilidad térmica que pueden correlacionarse con el cambio porcentual en el tamaño de la proteína según se determina por el análisis SEC, que es el patrón actual para determinar la estabilidad de proteínas. Para cualquiera de estos métodos, la correlación del atributo de temperatura de desplegado térmico (T<m>) frente al valor de estabilidad de la proteína (cambio porcentual en el tamaño de la proteína) según se determina por SEC debería evaluarse para determinar si la correlación es estadísticamente significativa.

La correlación puede evaluarse utilizando la regresión lineal para analizar los datos. La regresión lineal es un enfoque lineal para modelar la relación entre una variable dependiente y una o más variables independientes (o variable explicativa). El caso de una variable explicativa se denomina regresión lineal simple. La regresión lineal simple tiene una ecuación de la forma Y = a bX, en que X es la variable explicativa e Y es la variable dependiente. En la presente invención, la variable dependiente es la estabilidad (MP%) y la variable independiente es,p. e j,T<m>. La regresión lineal genera un gráfico de apalancamiento para demostrar la corrección. El gráfico de apalancamiento muestra si los valores están dentro del modelo o, en este caso, si los datos de estabilidad térmica se correlacionan con significancia estadística con el análisis SEC. Cuando la curva de confianza cruza el eje x del gráfico de apalancamiento, la correlación es estadísticamente significativa. Además, la correlación será estadísticamente significativa cuando el valor p sea menor que 0,05.

Ejemplos de software de análisis de datos que pueden utilizarse para determinar la regresión lineal, la regresión polinomial u otros métodos para determinar la correlación incluyen el software MicroCal Origin 7 (OriginLab; Northampton, MA), el software estadístico MP<®>(SAS, Cary NC), el software IBM<®>SPSS (Armonk, NY), SAS/STAT<®>(Cary,<n C ) ,>STATA<®>(StataCorp, College Station, TX), Python (Wilmington, DE), RStudio (Boston, MA) y<p S p P>(Boston, MA).

Proteínas terapéuticas

"Proteína terapéutica" se refiere a cualquier molécula de proteína que exhibe actividad biológica terapéutica. En una realización de la presente divulgación, la molécula de proteína terapéutica es una proteína de longitud completa. En otras realizaciones, la proteína terapéutica es un fragmento activo de la proteína de longitud completa. En diversas realizaciones de la presente divulgación, la proteína terapéutica puede producirse y purificarse a partir de su fuente natural. Alternativamente, de acuerdo con la presente divulgación, la expresión "proteína terapéutica recombinante" incluye cualquier proteína terapéutica obtenida a través de tecnología de ADN recombinante.

Las proteínas, incluyendo las que se unen a uno o más de los siguientes, pueden ser útiles en los métodos descritos. Estas incluyen proteínas CD, incluyendo CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD30 y CD34; incluyendo las que interfieren con la unión al receptor. Proteínas de la familia de receptores HER, que incluyen, HER2, HER3, HER4 y el receptor de EGF. Moléculas de adhesión celular, por ejemplo,<L f A - I ,>Mol, pl50, 95, VLA-4, ICAM-I, VCAM e integrina alfa v/beta 3. Factores de crecimiento, tales como factor de crecimiento endotelial vascular ("VEGF"), hormona de crecimiento, hormona estimulante de la tiroides, hormona estimulante del folículo, hormona luteinizante, factor liberador de la hormona de crecimiento, hormona paratiroidea, sustancia inhibidora de Müller, proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-I-alfa), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento nervioso tal como NGF-beta, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento de fibroblastos, incluyendo, por ejemplo, aFGF y bFGF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factores de crecimiento transformantes (TGF), incluyendo, entre otros, TGF-a y TGF-p, incluyendo TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4 o TGF-p5, factores de crecimiento similares a la insulina-I y -II (IGF-I e IGF-II), des(I-3)-IGF-I (IGF-I del cerebro) y factores osteoinductivos. Las insulinas y proteínas relacionadas con la insulina, incluyendo la insulina, cadena A de insulina, cadena B de insulina, proinsulina y proteínas de unión al factor de crecimiento similar a insulina. Proteínas de coagulación y relacionadas con la coagulación, tales como, entre otros, factor VIII, factor tisular, factor de von Willebrand, proteína C, alfa-1-antitripsina, activadores del plasminógeno, tales como urocinasa y activador tisular del plasminógeno ("t-PA"), bombesina, trombina y trombopoyetina; (vii) otras proteínas sanguíneas y séricas, incluyendo, aunque sin limitación, albúmina, IgE y antígenos de grupos sanguíneos. Factores estimulantes de colonias y receptores de los mismos, incluyendo los siguientes, entre otros, M-CSF, GM-CSF y G-CSF, y receptores de los mismos, tales como el receptor de CSF-1 (cfms). Receptores y proteínas asociadas a receptores, incluyendo, por ejemplo, receptor flk2/flt3, receptor de obesidad (OB), receptor<l>D<l>, receptores de la hormona del crecimiento, receptores de trombopoyetina ("TPO-R", "c-mpl"), receptores de glucagón, receptores de interleucina, receptores de interferón, receptores de células T, receptores de factor de células madre tales como c-Kit, y otros receptores. Ligandos de receptores, incluyendo, por ejemplo, OX40L, el ligando para el receptor OX40. Factores neurotróficos, incluyendo factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF) y neurotrofina-3, -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6). Cadena A de relaxina, cadena B de relaxina y prorelaxina; interferones y receptores de interferón, que incluyen, por ejemplo, interferón-alfa, - p y -y, y sus receptores. Interleucinas y receptores de interleucinas, incluyendo IL-1 a IL-33 y receptores de IL-1 a IL-33, tal como el receptor de IL-8, entre otros. Antígenos víricos, incluyendo un antígeno vírico de la envoltura del virus del SIDA. Lipoproteínas, calcitonina, glucagón, factor natriurético auricular, tensioactivo pulmonar, factor de necrosis tumoral-alfa y -beta, encefalinasa, RANTES (regulado después de la activación de linfocitos T normales, expresados y secretados), péptido asociado a gonadotropina de ratón, DNasa, inhibina y activina. Integrina, proteína A o D, factores reumatoides, inmunotoxinas, proteína morfogenética ósea (BMP), superóxido dismutasa, proteínas de la membrana superficial, factor acelerador de descomposición (DAF), envoltura del virus del SIDA, proteínas de transporte, receptores de migración dirigida, adresinas, proteínas reguladoras, inmunoadhesinas, anticuerpos. Miostatinas, proteínas TALL, que incluyen TALL-1, proteínas amiloides, que incluyen, pero no se limitan a, proteínas de amiloide-beta, linfopoyetinas del estroma tímico ("TSLP"), ligando RANK ("OPGL"), c-kit, receptores de TNF, que incluyen receptor de TNF tipo 1, TRAIL-R2, angiopoyetinas, y fragmentos biológicamente activos o análogos o variantes de cualquiera de los anteriores.

Polipéptidos y anticuerpos ejemplares incluyen Activase® (Alteplase); alirocumab, Aranesp® (Darbepoetina-alfa), Epogen® (Epoetina alfa o eritropoyetina); Avonex® (Interferón p-1a); Bexxar® (Tositumomab); Betaseron® (Interferónp); bococizumab (anticuerpo monoclonal anti-PCSK9 designado L1L3, véase el documento U.S.P.N. 8.080.243); Campath® (Alemtuzumab); Dynepo® (Epoetina delta); Velcade® (bortezomib); MLN0002 (Ab anti-a4p7); MLN1202 (Ab receptor de quimioquina anti-CCR2); Enbrel® (etanercept); Eprex® (Epoetina alfa); Erbitux® (Cetuximab); evolocumab; Genotropin® (Somatropina); Herceptin® (Trastuzumab); Humatrope® (somatropina [origen ADNr] para inyección); Humira® (Adalimumab); Infergen® (Interferón Alfacon-1); Natrecor® (nesiritida); Kineret® (Anakinra), Leukine® (Sargamostim); LymphoCide® (Epratuzumab); BenlystaTM (Belimumab); Metalyse® (Tenecteplasa); Mircera® (metoxi polietilenglicol-epoetina beta); Mylotarg® (Gemtuzumab ozogamicina); Raptiva® (efalizumab); Cimzia® (certolizumab pegol); SolirisTM (Eculizumab); Pexelizumab (Complemento Anti-C5); MEDl-524 (Numax®); Lucentis® (Ranibizumab); Edrecolomab (,Panorex®); Trabio® (lerdelimumab); TheraCim hR3 (Nimotuzumab); Omnitarg (Pertuzumab, 2C4); Osidem® (IDM-I); OvaRex® (B43.13); Nuvion® (visilizumab); Cantuzumab mertansine (huC242-DMI); NeoRecormon® (Epoetina beta); Neumega® (Oprelvekin); Neulasta® (filgastrim pegilado, G-CSF pegilado, hu-Met-G-CSF pegilado); Neupogen® (Filgrastim); Orthoclone<o>K<t>3® (Muromonab-CD3), Procrit® (Epoetina alfa); Remicade® (Infliximab), Reopro® (Abciximab), Actemra® (Receptor Ab anti-IL6), Avastin® (Bevacizumab), HuMax-CD4 (zanolimumab), Rituxan® (Rituximab); Tarceva® (Erlotinib); Roferon-A®-(Interferón alfa-2a); Simulect® (Basiliximab); StelaraTM (Ustekinumab); Prexige® (lumiracoxib); Synagis® (Palivizumab); 146B7-CHO (anticuerpo anti-IL15, véase el documento U.S.P.N. 7.153.507), Tysabri® (Natalizumab); Valortim® (MDX-1303, anti-B. Ab Antígeno Protector anthracis); ABthraxTM; Vectibix® (Panitumumab); Xolair® (Omalizumab), ETI211 (Ab anti-MRSA), IL-I Trap (la porción Fc de IgG 1 humana y los dominios extracelulares de ambos componentes del receptor de IL-1 (el receptor de Tipo I y la proteína accesoria del receptor)), VEGF Trap (dominios Ig de VEGFRI condensado a Fc de IgG1 Fc), Zenapax® (Daclizumab); Zenapax® (Daclizumab), Zevalin® (Ibritumomab tiuxetan), Zetia (ezetimibe), Atacicept (TACI-Ig), Ab antia4p7 (vedolizumab); galiximab (anticuerpo monoclonal anti-CD80), Ab anti-CD23 (lumiliximab); BR2-Fc (proteína de fusión huBR3 / huFc, antagonista de BAFF soluble); SimponiTM (Golimumab); Mapatumumab (Ab del Receptor-1 anti-TRAIL humano); Ocrelizumab (Ab anti-CD20 humano); HuMax-EGFR (zalutumumab); M200 (Volociximab, Ab de integrina anti-a5p1); MDX-010 (Ipilimumab, Ab anti-CTLA-4 y VEGFR-1 (IMC-18F1); Ab anti-BR3; Abs de Toxina A y Toxina B C anti-C. difficile MDX-066 (CDA-I) y MDX-1388); conjugados dsFv-PE38 anti-CD22 (CAT-3888 y CAT-8015); Ab anti-CD25 (HuMax-TAC); anticuerpos anti-TSLP; anticuerpo del receptor anti-TSLP (véase el documento U.S.P.N.

8.101.182); anticuerpo anti-TSLP designado A5 (véase el documento U.S.P.N. 7.982.016); (véase el Ab anti-CD3 (NI-0401); Adecatumumab (MT201, Ab anti-EpCAM-CD326); MDX-060, SGN-30, SGN-35 (Abs anti-CD30); MDX-1333 (anti-IFNAR); HuMax<c>D38 (Ab anti-CD38); Ab anti-CD40L; Ab anti-Cripto; Fibrinógeno Idiopático Fibrosis Pulmonar Fase 1 anti-CTGF (FG-3019); Ab anti-CTLA4; Ab anti-eotaxina! (CAT-213); Ab anti-FGF8; Ab GD2 anti-gangliósido; anticuerpos anti-esclerostina (véase el documento U.S.P.N. 8.715.663 o U.S.P.N. 7.592.429) anticuerpo antiesclerostina designado Ab-5 (véase el documento U.S.P.N. 8.715.663 o U.S.P.N. 7.592.429); Ab GM2 anti-gangliósido; Ab anti-GDF-8 humano (MYO-029); Ab Receptor anti-GM-CSF (CAM-3001); Ab anti-HepC (HuMax HepC); MEDI-545, MDX-1103 (Ab anti-IFNa); Ab anti-IGFIR; Ab anti-IGF-IR (HuMax-Inflam); Ab anti-IL12/lL23p40 (Briakinumab); Ab anti-IL-23p19 (LY2525623); Ab anti-IL13 (CAT-354); Ab anti-IL-17 (AIN457); Ab anti-IL2Ra (HuMax-TAC); Ab Receptor antiIL5; Ab receptores anti-integrina (MDX-OI8, CNTO 95); Ab Colitisi Ulcerativa anti-IPIO (MDX- 1100); anticuerpo anti-LLY; BMS-66513; Ab Receptor/hCGp anti-Manosa (MDX-1307); conjugado dsFv-PE38 anti-mesotelina (CAT-5001); Ab anti-PDI (MDX-1 106 (ONO- 4538)); anticuerpo anti-PDGFRa (IMC-3G3); Ab anti-TGFp (GC-1008); Ab Receptor-2 humano anti-TRAIL (HGS-ETR2); Ab anti-TWEAK; Ab anti-VEGFR/Flt-1; Ab anti- ZP3 (HuMax-ZP3); Anticuerpo n° 1 de NVS; Anticuerpo n° 2 de NVS; y un anticuerpo monoclonal amiloide-beta que comprende secuencias, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:6 (véase el documento U.S.P.N. 7906625).

Ejemplos de anticuerpos adecuados para los métodos descritos incluyen los anticuerpos mostrados en la Tabla A. Otros ejemplos de anticuerpos adecuados incluyen infliximab, bevacizumab, ranibizumab, cetuximab, ranibizumab, palivizumab, abagovomab, abciximab, actoxumab, adalimumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab, alacizumab pegol, ald518, alemtuzumab, alirocumab, alemtuzumab, altumomab, amatuximab, anatumomab mafenatox, anrukinzumab, apolizumab, arcitumomab, aselizumab, altinumab, atlizumab, atorolimiumab, tocilizumab, bapineuzumab, basiliximab, bavituximab, bectumomab, belimumab, benralizumab, bertilimumab, besilesomab, bevacizumab, bezlotoxumab, biciromab, bivatuzumab, bivatuzumab mertansina, blinatumomab, blosozumab, brentuximab vedotin, briakinumab, brodalumab, canakinumab, cantuzumab mertansina, cantuzumab mertansina, caplacizumab, capromab pendetide, carlumab, catumaxomab, cc49, cedelizumab, certolizumab pegol, cetuximab, citatuzumab bogatox, cixutumumab, clazakizumab, clenoliximab, clivatuzumab tetraxetan, conatumumab, crenezumab, cr6261, dacetuzumab, daclizumab, dalotuzumab, daratumumab, demcizumab, denosumab, detumomab, dorlimomab aritox, drozitumab, duligotumab, dupilumab, ecromeximab, eculizumab, edobacomab, edrecolomab, efalizumab, efungumab, elotuzumab, elsilimomab, enavatuzumab, enlimomab pegol, enokizumab, enokizumab, enoticumab, enoticumab, ensituximab, epitumomab cituxetan, epratuzumab, erlizumab, ertumaxomab, etaracizumab, etrolizumab, exbivirumab, exbivirumab, fanolesomab, faralimomab, farletuzumab, fasinumab, fbta05, felvizumab, fezakinumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, fontolizumab, foralumab, foravirumab, fresolimumab, fulranumab, futuximab, galiximab, ganitumab, gantenerumab, gavilimomab, gemtuzumab ozogamicina, gevokizumab, girentuximab, glembatumumab vedotina, golimumab, gomiliximab, gs6624, ibalizumab, ibritumomab tiuxetan, icrucumab, igovomab, imciromab, imgatuzumab, inclacumab, indatuximab ravtansine, infliximab, intetumumab, inolimomab, inotuzumab ozogamicin, ipilimumab, iratumumab, itolizumab, ixekizumab, keliximab, labetuzumab, lebrikizumab, lemalesomab, lerdelimumab, lexatumumab, libivirumab, ligelizumab, lintuzumab, lirilumab, lorvotuzumab mertansine, lucatumumab, lumiliximab, mapatumumab, maslimomab, mavrilimumab, matuzumab, mepolizumab, metelimumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, mogamulizumab, morolimumab, motavizumab, moxetumomab pasudotox, muromonabcd3, nacolomab tafenatox, namilumab, naptumomab estafenatox, narnatumab, natalizumab, nebacumab, necitumumab, nerelimomab, nesvacumab, nimotuzumab, nivolumab, nofetumomab merpentan, ocaratuzumab, ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, olaratumab, olokizumab, omalizumab, onartuzumab, oportuzumab monatox, oregovomab, orticumab, otelixizumab, oxelumab, ozanezumab, ozoralizumab, pagibaximab, palivizumab, panitumumab, panobacumab, parsatuzumab, pascolizumab, pateclizumab, patritumab, pemtumomab, perakizumab, pertuzumab, pexelizumab, pidilizumab, pintumomab, placulumab, ponezumab, priliximab, pritumumab, PRO 140, quilizumab, racotumomab, radretumab, rafivirumab, ramucirumab, ranibizumab, raxibacumab, regavirumab, reslizumab, rilotumumab, rituximab, robatumumab, roledumab, romosozumab, rontalizumab, rovelizumab, ruplizumab, samalizumab, sarilumab, satumomab pendetide, secukinumab, sevirumab, sibrotuzumab, sifalimumab, siltuximab, simtuzumab, siplizumab, sirukumab, solanezumab, solitomab, sonepcizumab, sontuzumab, stamulumab, sulesomab, suvizumab, tabalumab, tacatuzumab tetraxetan, tadocizumab, talizumab, tanezumab, taplitumomab paptox, tefibazumab, telimomab aritox, tenatumomab, tefibazumab, telimomab aritox, tenatumomab, teneliximab, teplizumab, teprotumumab, TGN1412, tremelimumab, ticilimumab, tildrakizumab, tigatuzumab, TNX-650, tocilizumab, toralizumab, tositumomab, tralokinumab, trastuzumab, TRBS07, tregalizumab, tremelimumab, tucotuzumab celmoleukin, tuvirumab, ublituximab, urelumab, urtoxazumab, ustekinumab, vapaliximab, vatelizumab, vedolizumab, veltuzumab, vepalimomab, vesencumab, visilizumab, volociximab, vorsetuzumab mafodotin, votumumab, zalutumumab, zanolimumab, zatuximab, ziralimumab y zolimomab aritox.

Los anticuerpos más preferidos para su uso en las formulaciones y métodos descritos son adalimumab, bevacizumab, blinatumomab, cetuximab, conatumumab, denosumab, eculizumab, erenumab, evolocumab, infliximab, natalizumab, panitumumab, rilotumumab, rituximab, romosozumab y trastuzumab y anticuerpos seleccionados de la Tabla A.

TABLAA

* Una concentración de ejemplo adecuada para su administración al paciente; Acadena pesada del anticuerpo HC; cadena ligera del anticuerpo LC.

Muteína

La muteína es una proteína que tiene al menos un cambio de aminoácidos debido a una mutación en la secuencia de ácido nucleico, tal como una sustitución, deleción o inserción. Muteínas ejemplares comprenden secuencias de aminoácidos que tienen al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, o tiene más de aproximadamente un 90% (p. ej., aproximadamente un 91%, aproximadamente un 92%, aproximadamente un 93%, aproximadamente un 94%, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 96%, aproximadamente un 97%, aproximadamente un 98% o aproximadamente un 99%) de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje. Además, la muteína puede ser una proteína de fusión como se describió arriba.

En realizaciones ejemplares, la muteína comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una sustitución de aminoácido con respecto a la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje, y la(s) sustitución(es) de aminoácidos es(son) una(s) sustitución(es) de aminoácidos conservativa(s). Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "sustitución de aminoácidos conservativa" se refiere a la sustitución de un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades similares,p. ej.,tamaño, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o aromaticidad, e incluye intercambios dentro de uno de los siguientes cinco grupos:

I. Pequeños residuos alifáticos, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;

II. Residuos polares con carga negativa y sus amidas y ésteres: Asp, Asn, Glu, Gln, ácido cisteico y ácido homocisteico;

III. Residuos polares con carga positiva: His, Arg, Lys; Ornitina (Orn)

IV. Residuos alifáticos grandes, no polares: Met, Leu, Ile, Val, Cys, Norleucina (Nle), homocisteína

V. Residuos aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp, acetil fenilalanina.

En realizaciones ejemplares, la muteína comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una sustitución de aminoácido con respecto a la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje, y la(s) sustitución(es) de aminoácidos es/son una(s) sustitución(es) de aminoácidos no conservativa(s). Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "sustitución de aminoácidos no conservativa" se define en esta memoria como la sustitución de un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades diferentes,p. ej.,tamaño, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o aromaticidad, e incluye intercambios fuera de uno de los cinco grupos anteriores.

En realizaciones ejemplares, la muteína comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una sustitución de aminoácido con respecto a la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje, y la sustitución de aminoácidos es una sustitución de aminoácidos que se produce de forma natural. Por "aminoácido que se produce de forma natural" o "aminoácido estándar" o "aminoácido canónico" se entiende uno de los 20 alfa aminoácidos que se encuentran en eucariotas codificados directamente por los codones del código genético universal (Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Asn, Gln, Cys, Gly, Pro, Arg, His, Lys, Asp, Glu). En aspectos ejemplares, la muteína comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una sustitución de aminoácido con respecto a la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje, y el aminoácido sustituto es un es un aminoácido no estándar, o un aminoácido que no se incorpora en las proteínas durante la traducción. Aminoácidos no estándares incluyen, pero no se limitan a: selenocisteína, pirrolisina, ornitina, norleucina, p-aminoácidos(p. ej.,p-alanina, ácido p-aminoisobutírico, pfenilalanina, p-homofenilalanina, ácido p-glutámico, p-glutamina, p-homotriptófano, p-leucina, p-lisina), homoaminoácidos (p.ej.,homofenilalanina, homoserina, homoarginina, monocisteína, homocistina), W-metil aminoácidos(p. ej.,L-abrina, W-metil-alanina, W-metil-isoleucina, W-metil-leucina), ácido 2-aminocaprílico, ácido 7-aminocefalosporánico, ácido 4-aminocinámico, ácido alfa-aminociclohexanopropiónico, ácido amino-(4-hidroxifenil)acético, ácido 4-amino-nicotínico, ácido 3-aminofenilacético y similares.

Molécula BiTE

Las moléculas de activadores de células T bi-específicas (BiTE) son una construcción de anticuerpo biespecífico o proteína de fusión biespecífica que comprende dos dominios de unión de anticuerpos (o regiones fijadoras de objetivo) enlazados entre sí. Un brazo de la molécula está diseñado para unirse a una proteína que se encuentra en la superficie de las células T citotóxicas, y el otro brazo está diseñado para unirse a una proteína específica que se encuentra principalmente en la célula tumoral. Cuando se unen ambos objetivos, la molécula BiTE forma un puente entre la célula T citotóxica y la célula tumoral, lo que permite que la célula T reconozca la célula tumoral y la combata mediante una infusión de moléculas tóxicas. Por ejemplo, el brazo de unión al tumor de la molécula se puede alterar para crear diferentes construcciones de anticuerpos BiTE que se fijen como objetivo a diferentes tipos de cáncer.

La expresión "dominio de unión" en relación con una molécula BiTE se refiere a un dominio que (específicamente) se une a / interactúa con / reconoce un epítopo diana dado o un sitio diana dado en las moléculas diana (antígenos). La estructura y función del primer dominio de unión (que reconoce el antígeno de la célula tumoral), y preferiblemente también la estructura y/o función del segundo dominio de unión (antígeno de célula T citotóxica), se basa/n en la estructura y/o función de un anticuerpo,p. ej.,de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o entera.

El "epítopo" se refiere a un sitio en un antígeno al que se une específicamente un dominio de unión, tal como un anticuerpo o inmunoglobulina o un derivado o fragmento de un anticuerpo o de una inmunoglobulina. Un "epítopo" es antigénico y, por lo tanto, al término epítopo se le alude a veces también en esta memoria como "estructura antigénica" o "determinante antigénico". Por lo tanto, el dominio de unión es un "sitio de interacción con el antígeno". También se entiende que dicha unión/interacción define un "reconocimiento específico".

Por ejemplo, la molécula BiTE comprende un primer dominio de unión caracterizado por la presencia de tres CDRs de cadena ligera(es decir,CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y tres CDRs de cadena pesada(es decir,CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH). El segundo dominio de unión preferiblemente también comprende los requisitos estructurales mínimos de un anticuerpo que permiten la unión de la diana. Más preferiblemente, el segundo dominio de unión comprende al menos tres CDRs de cadena ligera(es decir,CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y/o tres CDRs de cadena pesada(es decir,CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH). Se prevé que el primer y/o el segundo dominio de unión se produzcan o se puedan obtener mediante métodos de presentación de fagos o de cribado de colecciones en lugar de injertar secuencias de CDR de un anticuerpo pre-existente (monoclonal) en un armazón.

Un dominio de unión puede comprender típicamente una región variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo; sin embargo, no tiene por qué comprender ambos. Los fragmentos Fd, por ejemplo, tienen dos regiones VH y a menudo conservan alguna función de unión a antígeno del dominio de unión a antígeno intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno (modificados) incluyen (1) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH1; (2) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región bisagra; (3) un fragmento Fd que tiene los dos dominios VH y CH1; (4) un fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (5) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546), que tiene un dominio VH; (6) una región determinante de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) aislada, y (7) un Fv de cadena sencilla (scFv), prefiriéndose este último (por ejemplo, derivado de una colección de scFV).

Las expresiones "(específicamente) se une a", (específicamente) reconoce", "se dirige (específicamente) a" y "(específicamente) reacciona con" con respecto a una molécula de BiTE se refieren a un dominio de unión que interactúa o interactúa específicamente con uno o más, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente al menos tres y lo más preferiblemente al menos cuatro aminoácidos de un epítopo ubicado en la proteína o antígeno diana.

El término "variable" se refiere a las porciones de los dominios de anticuerpo o de inmunoglobulina que exhiben variabilidad en su secuencia y que están implicadas en la determinación de la especificidad y afinidad de unión de un anticuerpo particular (es decir, el "dominio o dominios variables"). El emparejamiento de una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) juntas forma un único sitio de unión al antígeno. El dominio CH más próximo a VH se designa CH1. Cada una de las cadenas ligeras (L) está enlazada a una cadena pesada (H) por un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están enlazadas entre sí por uno o más enlaces disulfuro de acuerdo con el isotipo de la cadena H.

La variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos; se concentra en sub-dominios de cada una de las regiones variables de la cadena pesada y ligera. Estos sub-dominios se denominan "regiones hipervariables" o "regiones determinantes de la complementariedad" (CDRs). Las porciones más conservadas (es decir, no hipervariables) de los dominios variables se denominan las regiones "estructurales" (FRM) y proporcionan un armazón para las seis CDRs en el espacio tridimensional para formar una superficie de unión al antígeno. Los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas que se producen de forma natural comprenden cada uno cuatro regiones FRM (FR1, FR2, FR3 y FR4), que adoptan en gran medida una configuración de lámina p, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de la lámina p. Las regiones hipervariables de cada una de las cadenas se mantienen unidas en estrecha proximidad por el FRM y, junto con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno (véase Kabatetal.,loc. cit.). Los dominios constantes no están directamente implicados en la unión al antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como, por ejemplo, citotoxicidad mediada por células y dependiente de anticuerpos y activación del complemento.

La CDR3 de la cadena ligera y, en particular, la CDR3 de la cadena pesada pueden constituir los determinantes más importantes en la unión del antígeno dentro de las regiones variables de la cadena ligera y pesada. En algunas construcciones de anticuerpos, la CDR3 de la cadena pesada parece constituir el área principal de contacto entre el antígeno y el anticuerpo. Los esquemas de selección in vitro en los que solo se varía la CDR3 se pueden utilizar para variar las propiedades de unión de un anticuerpo o determinar qué residuos contribuyen a la unión de un antígeno. Por lo tanto, la CDR3 es típicamente la mayor fuente de diversidad molecular dentro del sitio de unión del anticuerpo. H3, por ejemplo, puede ser tan corto como dos residuos de aminoácidos o más de 26 aminoácidos.

La secuencia de genes de anticuerpos después del ensamblaje y la mutación somática es muy variada, y se estima que estos genes variados codifican 1010 moléculas de anticuerpos diferentes (Immunoglobulin Genes, 2a ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995). Por consiguiente, el sistema inmune proporciona un repertorio de inmunoglobulinas. El término "repertorio" se refiere a al menos una secuencia de nucleótidos derivada total o parcialmente de al menos una secuencia que codifica al menos una inmunoglobulina. La(s) secuencia(s) se pueden generar mediante reordenamiento in vivo de los segmentos V, D y J de las cadenas pesadas, y los segmentos V y J de las cadenas ligeras. Alternativamente, la(s) secuencia(s) se pueden generar a partir de una célula en respuesta a la cual se produce el reordenamiento,p. ej.,estimulación in vitro. Alternativamente, parte o la totalidad de la(s) secuencia(s) se pueden obtener mediante corte y empalme de ADN, síntesis de nucleótidos, mutagénesis y otros métodos, véase,p. ej.,la patente de EE.UU. 5.565.332. Un repertorio puede incluir solo una secuencia o puede incluir una pluralidad de secuencias, incluidas las de una colección genéticamente diversa.

El término "biespecífico" tal como se utiliza en esta memoria se refiere a una construcción de anticuerpo que es "al menos biespecífico",es decir,comprende al menos un primer dominio de unión y un segundo dominio de unión, en donde el primer dominio de unión se une a un antígeno o diana, y el segundo dominio de unión se une a otro antígeno o diana. Por consiguiente, las construcciones de anticuerpo dentro de una molécula BiTE comprenden especificidades para al menos dos antígenos o dianas diferentes. La expresión "construcción de anticuerpo biespecífico" de la invención también abarca construcciones de anticuerpo multiespecíficas tales como construcciones de anticuerpo triespecíficas, incluyendo estas últimas tres dominios de unión, o construcciones que tienen más de tres(p. ej.,,cuatro, cinco...) especificidades.

Los al menos dos dominios de unión y los dominios variables de la construcción de anticuerpo dentro de una molécula BiTE pueden o no comprender enlazadores peptídicos (péptidos espaciadores). La expresión "enlazador peptídico" define de acuerdo con la presente invención una secuencia de aminoácidos mediante la cual las secuencias de aminoácidos de un dominio (variable y/o de unión) y otro dominio (variable y/o de unión) de la construcción de anticuerpo de la invención están enlazados entre sí. Una característica técnica esencial de un enlazador peptídico es que dicho enlazador peptídico no comprende actividad de polimerización. Entre los enlazadores peptídicos adecuados se encuentran los descritos en las Patentes de EE.UU. 4.751.180 y 4.935.233 o el documento WO 88/09344.

En el caso de que se utilice un enlazador, este enlazador es preferiblemente de una longitud y secuencia suficientes para asegurar que cada uno de los dominios primero y segundo puedan, independientemente uno de otro, conservar sus especificidades de unión diferenciales. Para los enlazadores peptídicos que conectan los al menos dos dominios de unión en la construcción de anticuerpo dentro de una molécula BiTE (o dos dominios variables), se prefieren aquellos enlazadores peptídicos que comprenden solo una pequeña cantidad de residuos de aminoácidos,p. ej.,,12 residuos de aminoácidos o menos. Por lo tanto, se prefieren los enlazadores peptídicos de 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 residuos de aminoácidos. Un enlazador peptídico previsto con menos de 5 aminoácidos comprende 4, 3, 2 o un aminoácido(s), en donde se prefieren los enlazadores ricos en Gly. Un aminoácido "único" particularmente preferido en el contexto de dicho "enlazador peptídico" es Gly. Por consiguiente, dicho enlazador peptídico puede consistir en un solo aminoácido Gly. Otra realización preferida de un enlazador peptídico se caracteriza por la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser,es decir,Gly4Ser, o polímeros de la misma,es decir,(Gly4Ser)x, en que x es un número entero de 1 o mayor Las características de dicho enlazador peptídico, que comprenden la ausencia de la promoción de estructuras secundarias, son conocidas en la técnica y se describen,p. ej.,en Dall'Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al. (Mol Immunol (1992) 29, 21 -30) y Raag y Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80) Se prefieren los enlazadores peptídicos que tampoco fomentan estructuras secundarias algunas. El enlace de dichos dominios entre sí puede proporcionarse,p. ej.,mediante ingeniería genética, como se describe en los ejemplos. Mtodos para preparar construcciones de cadena sencilla biespecíficas condensadas y enlazadas operativamente y expresarlas en células de mamíferos o bacterias son bien conocidos en la técnica(p. ej.,documento WO 99/54440 o Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001).

Las moléculas BiTE de la divulgación pueden comprender una construcción de anticuerpo en un formato seleccionado del grupo que consiste en (scFv)2, mAb de dominio único scFv, diacuerpos y oligómeros de cualquiera de los formatos mencionados anteriormente.

De acuerdo con una realización particularmente preferida, y como se documenta en los ejemplos adjuntos, la construcción de anticuerpo dentro de una molécula BiTE es una "construcción de anticuerpo de cadena sencilla biespecífico'', más preferiblemente un ''Fv de cadena sencilla" (scFv) biespecífico. Aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que permite que se formen como una cadena proteica única en la que las regiones VL y VH se aparean para formar una molécula monovalente; véase,p. ej.,Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y la función de los fragmentos se evalúa de la misma manera que los anticuerpos completos o de longitud completa. Un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) es, por lo tanto, una proteína de fusión de la región variable de la cadena pesada (VH) y de la cadena ligera (VL) de inmunoglobulinas, habitualmente conectada con un péptido enlazador corto de aproximadamente diez a aproximadamente 25 aminoácidos, preferiblemente aproximadamente 15 a 20 aminoácidos. El enlazador es habitualmente rico en glicina para su flexibilidad, así como en serina o treonina para su solubilidad, y puede conectar el extremo N del VH con el extremo C del VL, o viceversa. Esta proteína conserva la especificidad de la inmunoglobulina original, a pesar de la eliminación de las regiones constantes y la introducción del enlazador.

Moléculas de cadena sencilla biespecíficas son conocidas en la técnica y se describen en el documento WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021 -7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56. Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (véase, entre otras, la patente de EE.UU. 4.946.778, Kontermann y Dübel (2010), loc. cit. y Little (2009), loc. cit.) se pueden adaptar para producir construcciones de anticuerpos de cadena sencilla que reconozcan específicamente una o más dianas elegidas.

Fragmentos variables de cadena sencilla bivalentes (también denominados divalentes) o biespecíficos (bi-scFv o discFv que tienen el formato (scFv)2) se pueden diseñar enlazando dos moléculas scFv. Si estas dos moléculas scFv tienen la misma especificidad de unión, la molécula (scFv)2 resultante se denominará preferentemente bivalente (es decir, tiene dos valencias para el mismo epítopo diana). Si las dos moléculas scFv tienen diferentes especificidades de unión, la molécula (scFv)2 resultante se denominará preferentemente biespecífica. El enlace se puede realizar produciendo una sola cadena peptídica con dos regiones VH y dos regiones VL, produciendo scFv en tándem (véase,p. ej.,Kufer P. et al., (2004) Trends in Biotechnology 22(5):238-244). Otra posibilidad es la creación de moléculas scFv con péptidos de enlace que son demasiado cortos para que las dos regiones variables se plieguen juntas(p. ej.,,aproximadamente cinco aminoácidos), lo que obliga a los scFv a dimerizarse. Este tipo se conoce como diacuerpos (véase,p. ej.,Hollinger, Philipp et al., (julio de 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14): 6444-8.).

Los anticuerpos de dominio único comprenden simplemente un dominio variable de anticuerpo (monomérico) que es capaz de unirse selectivamente a un antígeno específico, independientemente de otras regiones o dominios V. Los primeros anticuerpos de dominio único se diseñaron a partir de anticuerpos de cadena pesada encontrados en camélidos, y estos se denominan fragmentos VHH. Los peces cartilaginosos también tienen anticuerpos de cadena pesada (IgNAR) de los cuales se pueden obtener anticuerpos de dominio único llamados fragmentos VNAR. Un enfoque alternativo es dividir los dominios variables diméricos de inmunoglobulinas comunes,p. ej.,de seres humanos o roedores en monómeros, obteniendo así VH o VL como un Ab de dominio único. Aunque la mayoría de las investigaciones sobre anticuerpos de dominio único se basan actualmente en dominios variables de cadena pesada, también se ha demostrado que los nanocuerpos derivados de cadenas ligeras se unen específicamente a epítopos diana. Ejemplos de anticuerpos de dominio único se denominan sdAb, nanocuerpos o anticuerpos de dominio variable único.

Un (mAb de dominio único)2 es, por lo tanto, una construcción de anticuerpo monoclonal compuesta por (al menos) dos anticuerpos monoclonales de dominio único, que se seleccionan individualmente del grupo que comprende VH, VL, VHH y VNAR. El enlazador está preferiblemente en forma de un enlazador peptídico. De forma similar, un "mAb de dominio único scFv" es una construcción de anticuerpo monoclonal compuesto por al menos un anticuerpo de dominio único como se describe arriba y una molécula de scFv como se describe arriba. De nuevo, el enlazador está preferiblemente en forma de un enlazador peptídico.

Moléculas BiTE ejemplares incluyen la molécula BiTE anti-CD33 y anti-CD3, la molécula BiTE anti-BCMA y anti-CD3, la molécula BiTE anti-FLT3 y anti-CD3, la molécula BiTE anti-CD19 y anti-cD3, la molécula BiTE anti-EGFRvlII y anti-CD3, la molécula BiTE anti-DLL3 y anti-CD3, BLINCYTO (blinatumomab) y Solitomab.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Métodos

Cromatografía de Exclusión por Tamaño

Los experimentos de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se realizaron utilizando un sistema HPLC Agilent 1100 con una columna TSK-GEL G3000SWxl, tamaño de partícula de 5 pm, 7,8 mm de diámetro interno (ID) x 300 mm de longitud (Tosoh Biosep) con un detector UV Agilent con longitud de onda establecida a 280 nm (Agilent; Santa Clara, CA). Las tandas SEC-LS se realizaron a temperatura ambiente, con fosfato de potasio 100 mM, cloruro de potasio 250 mM, pH 6,8 ± 0,1 tampón utilizado como fase móvil y el caudal fue de 0,5 mL/min.

Calorimetría Diferencial de Barrido

Los experimentos de calorimetría diferencial de barrido (DSC) se realizaron en un sistema MicroCal VP-Capillary DSC (Malvern Panalytical Inc.; Westborough, MA). Las concentraciones de muestra utilizadas en los experimentos de DSC fueron de aproximadamente 1 mg/mL mediante la dilución de las muestras originales utilizando el tampón de formulación correspondiente. Las muestras se calentaron de 10 °C a 100 °C a una tasa de 60 °C/hora. El pre-barrido fue de 15 minutos, el período de filtración de 10 segundos y el modo de retroalimentación ninguno. Una transición térmica endotérmica en la celda de muestra provoca una desviación positiva de la señal. El análisis de datos se realizó utilizando el software MicroCal Origin 7 (OriginLab; Northampton, MA).

Nano Fluorimetría de barrido diferencial

Los experimentos de fluorimetría diferencial de barrido nano (nanoDSF) se realizaron en un sistema nanoTemper nanoDSF (Nanotemper; South San Francisco, CA). Las concentraciones de muestra utilizadas en los experimentos de DSC fueron de aproximadamente 1 mg/mL mediante la dilución de las muestras originales utilizando el tampón de formulación correspondiente. Las muestras se calentaron de 20 °C a 95 °C a una tasa de 60 °C/hora. El análisis de datos se realizó utilizando el software PR.ThermControl (Nanotemper).

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando el software estadístico JMP<®>(Cary, Carolina del Norte). Los valores p y los gráficos de apalancamiento se obtuvieron a partir del análisis de datos de JMP. Los resultados típicos de los gráficos de apalancamiento de diferentes resultados estadísticos se muestran en la Figura 1.

Ejemplo 2

Los Datos de Estabilidad Térmica Predicen la Estabilidad de los Anticuerpos Monoclonales

La formulación que comprende un anticuerpo monoclonal (mAb-1) se analizó utilizando el método SEC y el método DSC como se describe en el Ejemplo 1. La información de la muestra, así como los datos SEC y DSC, se muestran en la Tabla 1. El pico principal consistió en mAb-1 en su forma nativa.

Los datos se analizaron mediante el software estadístico JMP. El valor P obtenido del análisis estadístico JMP fue P = 0,0159, que fue inferior a 0,05. Esto sugiere que hubo una correlación estadísticamente significativa entre los datos de estabilidad SEC de 6 meses y los datos T<m>(T = 0). El gráfico de apalancamiento obtenido del análisis estadístico JMP se muestra en la Figura 2. La curva de confianza en la Figura 2 cruza la línea horizontal gris continua. Esto confirma también que hubo una correlación estadísticamente significativa entre los datos de estabilidad SEC de 6 meses y los datos T<m>(T = 0). Los resultados del análisis estadístico de los datos mAb-1 indican que el valor del atributo de estabilidad térmica se puede utilizar para predecir los datos de estabilidad SEC de mAb-1.

Tabla 1.Datos SEC y DSC del estudio de estabilidad de la formulación mAb-1

Ejemplo 3

Los Datos de Estabilidad Térmica Predicen la Estabilidad de la Molécula Activadora de Células T BiespecíficasSe analizaron formulaciones que comprendían diferentes construcciones de una molécula activadora de células T biespecíficas (BiTE-1) utilizando el método SEC y el método DSC como se describe en el Ejemplo 1. La información de la muestra se proporciona en la Tabla 2 y los datos SEC y DSC se muestran en la Tabla 3.

Los datos se analizaron mediante el software estadístico JMP. El valor P obtenido del análisis estadístico JMP fue P = 0,0014, que fue inferior a 0,05. Esto sugiere que hubo una correlación estadísticamente significativa entre los datos de estabilidad SEC de 2 semanas y los datos T<m>. El gráfico de apalancamiento obtenido de JMP se muestra en la Figura 2. La curva de confianza en la Figura 3 cruza la línea horizontal gris continua. Esto confirma también que hubo una correlación estadísticamente significativa entre los datos de estabilidad SEC de 6 semanas y los datos T<m>. Los resultados del análisis estadístico de los datos mAb-1 indican que el valor del atributo de estabilidad térmica se puede utilizar para predecir los datos de estabilidad SEC de BiTE-1.

Tabla 2.Información de Muestras y Tampones de las Muestras de BiTE-1

Tabla 3.Datos SEC y DSC del estudio de estabilidad de BiTE-1

ID de Muestra y Tampón % Cambio de MP (2w40C, SEC)* T<m1>(T=0)

** MP = pico principal, 2w = 2 semanas y 40C = 40°C

Ejemplo 4

Los Datos de Estabilidad Térmica Predicen la Estabilidad de la Proteína de Fusión Fc

Formulaciones que comprenden una protéina de fusión Fc (muteína -1) se analizaron utilizando el método SEC y el método DSC como se describe en el Ejemplo 1. La información de la muestra se proporciona en la Tabla 4 y los datos SEC y DSC se muestran en la Tabla 5.

Los datos se analizaron mediante el software estadístico JMP. El valor P obtenido del análisis estadístico JMP fue P < 0,0001, que fue inferior a 0,05. Esto sugiere que hubo una correlación estadísticamente significativa entre los datos de estabilidad SEC de 2 semanas y los datos Tm. El gráfico de apalancamiento obtenido de JMP se muestra en la Figura 4. La curva de confianza en la Figura 4 cruza la línea horizontal gris continua. Esto confirma que hubo una correlación estadísticamente significativa entre los datos de estabilidad SEC de 2 semanas y los datos Tm. Los resultados del análisis estadístico de los datos de muteína indican que el valor del atributo de estabilidad térmica se puede utilizar para predecir los datos de estabilidad de la proteína de fusión Fc, así como los datos de estabilidad de las muteínas de otras familias de estructuras tales como los mAb.

Tabla 4.Información de Muestras y Tampones de las Muestras de Muteína

Table5.Los datos SEC y DSC del estudio de estabilidad de IL-2 Muteína

Conclusiones

El enfoque estadístico demostró que la estabilidad de las proteínas medida por el método SEC se puede predecir utilizando el atributo de estabilidad térmica (T<m>) con significancia estadística. El método de medición del atributo de estabilidad térmica (T<m>) para predecir la estabilidad de las proteínas, medido por SEC, ahorra tiempo y recursos significativos durante el análisis del desarrollo de fármacos.

Tal como se utilizan en esta memoria, los términos "un", "una" y "el", "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Los términos "un" (o "una"), así como los términos "uno o más", "una o más" y "al menos uno", "al menos una" se pueden utilizar indistintamente en esta memoria. Además, "y/o" cuando se utiliza en esta memoria se debe tomar como una divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por lo tanto, el término "y/o" tal como se utiliza en una expresión tal como "A y/o B" en esta memoria pretende incluir "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B" (solo). Asimismo, el término "y/o" tal como se utiliza en una expresión tal como "A, B y/o C" pretende abarcar cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

El término "comprenden" o la expresión "que comprende" se utiliza generalmente en sentido inclusivo, es decir, para permitir la presencia de una o más características o componentes.

El término "aproximadamente" utilizado en relación con un valor numérico en toda la memoria descriptiva y las reivindicaciones designa un intervalo de precisión que resulta familiar y aceptable para un experto en la técnica. En general, dicho intervalo de precisión es de ±10 %.

A menos que se defina lo contrario, todas las expresiones y términos técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que se refiere esta divulgación. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2a ed., 2002, CRC Press; el Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3a ed., 1999, Academic Press; y el Oxford Dictionary of Biochemistry And Molecular Biology, Revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan a una persona con conocimientos un diccionario general de muchos de los términos y expresiones utilizados en esta divulgación. Los siguientes procedimientos y técnicas pueden realizarse en general de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la memoria descriptiva.

Las unidades, los prefijos y los símbolos se indican en su forma aceptada en el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxi. Los encabezamientos proporcionados en esta memoria no son limitaciones de los diversos aspectos o aspectos de la divulgación, que se pueden obtener mediante referencia a la memoria descriptiva en su conjunto.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un método para evaluar la estabilidad de una proteína terapéutica, que comprende las etapas de medir la estabilidad térmica de la proteína terapéutica y comparar la temperatura de desplegado térmico T<m>de la proteína terapéutica con la T<m>de una proteína de control, en donde un aumento en la T<m>de la proteína terapéutica en comparación con la T<m>de la proteína de control indica un aumento en la estabilidad de la proteína terapéutica, y en donde la T<m>de la proteína terapéutica se correlaciona con significancia estadística con el cambio porcentual del pico principal en el tamaño de la proteína determinado por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).

2. Un método para predecir la estabilidad de una proteína terapéutica, según se mide por (SEC), que comprenden las etapas de medir la estabilidad térmica de la proteína terapéutica y comparar la temperatura de desplegado T<m>de la proteína terapéutica con la T<m>de una proteína de control, en donde la T<m>de la proteína terapéutica se correlaciona con significancia estadística con el cambio porcentual del pico principal en el tamaño de la proteína determinado por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la T<m>de las proteínas terapéuticas se correlaciona con el cambio porcentual del pico principal determinado por SEC con un valor p de menos de 0,05.

4. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la T<m>de las proteínas terapéuticas se correlaciona con el cambio porcentual del pico principal determinado por SEC con un valor p de menos de 0,01.

5. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la T<m>de las proteínas terapéuticas se correlaciona con el cambio porcentual del pico principal determinado por SEC con un valor p de menos de 0,005.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la estabilidad térmica se mide mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) o fluorimetría diferencial de barrido (DSF).

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, que comprende, además, la etapa de determinar la significancia estadística de la correlación entre el valor de la T<m>de la proteína terapéutica y el cambio porcentual del pico principal determinado por SEC.

8. El método de la reivindicación 7, en el que la significancia estadística se determina mediante análisis de regresión lineal o regresión polinomial.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el valor T<m>de la proteína terapéutica predice la estabilidad de la proteína terapéutica durante al menos un período de seis meses.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, en el que el valor T<m>de la proteína terapéutica predice el cambio porcentual del pico principal de la proteína terapéutica medido en cromatografía de exclusión por tamaño.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la proteína terapéutica es un anticuerpo monoclonal o un fragmento o derivado del mismo, un anticuerpo multi-específico, una molécula activadora de células T biespecífica (BiTE<®>), una molécula de fusión Fc o una muteína.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en los presentados en la Tabla A.

13. El método de la reivindicación 11, en el que la molécula BiTE se une específicamente a uno o más de CD33, BCMA, FLT3, CD-19, EGFRvlll, DLL3, y CD-3.

14. El método de la reivindicación 11, en el que la molécula de fusión Fc o la muteína se une específicamente a IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21, CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, CEACAM-1, TIGIT, LAG3, CD112, CD112R, CD96, TIM3, BTLA, ICOS, OX40, 41BB, CD27, GITR.

15. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que se formula la proteína terapéutica.

16. El método de la reivindicación 15, en el que la proteína terapéutica se formula a una concentración mayor que 70 mg/mL.

17. El método de la reivindicación 15, en el que la proteína terapéutica se formula a una concentración menor que 70 mg/ml.

18. El método de la reivindicación 15, en el que la proteína terapéutica está en una concentración en mg/mL seleccionada del grupo que consiste en 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, y 220, y cada incremento en la misma.