ES2995178A1 - Biomarcadores y método de diagnóstico de la diabetes monogénica en adultos jóvenes portadores de alelos HNF1A deletéreos - Google Patents

Abstract

La presente invención refiere al uso in vitro de los niveles de expresión de SEQ ID NO: 3 (miR-19a-3p), SEQ ID NO: 6 (miR-16-5p) y PCR ultrasensible (PCR-hs) como biomarcadores para diagnosticar la diabetes monogénica no autoinmune de inicio en adultos jóvenes en individuos portadores de alelos HNF1A deletéreos (MODY HNF1A), el método de diagnóstico asociado y kit para llevar a cabo dicho método.

Description

DESCRIPCIÓN

Biomarcadores y método de diagnóstico de la diabetes monogénica en adultos jóvenes portadores de alelos HNF1A deletéreos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere al campo de la medicina, más específicamente al campo del pronóstico y diagnóstico médico, y aún más específicamente se refiere al uso de miARNs y PCR ultrasensible (por sus siglas en inglés“PCRhs” o PCRus)para el pronóstico y diagnóstico de la diabetes monogénica de inicio en adultos jóvenes portadores de alelos HNF1A deletéreos.

ESTADO DEL ARTE

Aunque varios genes están implicados en la diabetes monogénica“MODY”(del acrónimo en inglésMaturity Onset Diabetes of the Young),la“MODY HNF1A”(del inglés,hepatocyte nuclear factor-1 alpha)es la forma más frecuente en adultos y tiene un efecto significativo en el tratamiento cuando se hace el diagnóstico adecuadamente. Los criterios clínicos comunes para seleccionar individuos para las pruebas genéticas de MODY incluyen la aparición de diabetes antes de los 25 años, la producción de insulina endógena preservada, la ausencia de autoinmunidad pancreática y generaciones consecutivas de diabetes. Estos criterios se superponen claramente con las características de la diabetes tipo 1(DM1)y diabetes tipo 2 (DM2), por lo que muchas personas con MODY HNF1A siguen sin ser reconocidas, especialmente si no cumplen con los criterios clásicos de MODY. En este documento, definimos MODY HNF1A como diabetes no autoinmune de inicio en adultos jóvenes en individuos portadores de alelos HNF1A deletéreos.

Debido a su baja frecuencia, la diabetes monogénica no suele ser el primer diagnóstico ante un sujeto con hiperglucemia y además, muchos países tienen un acceso limitado a las pruebas genéticas para su determinación. Establecer un diagnóstico molecular correcto de MODY HNF1A permite cambiar el tratamiento a sulfonilureas o glinidas, que pueden proporcionar un excelente control de la diabetes durante décadas. El diagnóstico correcto también facilita la identificación rápida de los miembros de la familia afectados y en el futuro, planificar estrategias emergentes de terapia génica.

Criterios como la ausencia de autoanticuerpos de células Beta y la presencia de péptido C excluyen la mayoría de los casos de diabetes autoinmune o DM1. El trabajo en esta área se ha centrado principalmente en la discriminación de MODY que se presenta en la infancia mediante la selección de niños negativos a anticuerpos de células Beta para una mayor investigación. Un estudio reciente adoptó un enfoque similar con adultos jóvenes diagnosticados antes de los 30 años, aunque la mayoría tenía una etiqueta clínica de DM1.

La diferenciación de pacientes con DM2, particularmente en un grupo de mayor edad donde la proporción de MODY es menor, es más compleja. La adición de biomarcadores específicos de MODY HNF1A que se basan en manifestaciones extrapancreáticas de HNF1A podría ayudar en la diferenciación de este tipo de diabetes no autoinmune.

El gen HNF1A codifica un factor de transcripción que regula la expresión de muchos genes. La expresión de la proteína C reactiva(PCR)en el hígado está regulada por HNF1A y los estudios de asociación de todo el genoma (GWAS) mostraron que el nivel de PCR en plasma se asoció con una variación genética cercana a HNF1A. Un estudio realizado por el grupo de Owens (Juszczak et al., 2019) han informado que los niveles de PCR-hs eran más bajos en sujetos con MODY HNF1A en comparación con otras formas de diabetes, y especialmente discriminante de aquellos con DM2 de inicio en adultos jóvenes.

El uso de biomarcadores está aumentando y los avances técnicos permiten una identificación más precisa de los procesos involucrados en la progresión patológica. Recientemente, se ha demostrado que los biomarcadores alternativos, como los microARNs(miARNs)circulantes están asociados con la DM2 junto con otras muchas enfermedades (La Sala, Micheloni, De Nigris, Prattichizzo, & Ceriello, 2018; Prattichizzo et al., 2016; Zampetaki et al., 2010).

Los miARNs son ARNs endógenos pequeños no codificantes con unos 18-22 nucleótidos de longitud, capaces de modular la expresión de los ARN mensajeros complementarios emparejándose con la región no traducida (3-UTR) (DP, 2004).

También se sabe que están involucrados en la regulación de la mayoría de los procesos moleculares. Existe una evidencia científica consistente acerca de la relación de los miARNs con procesos metabólicos, incluido el metabolismo de la insulina y la homeostasis de la glucosa (Kato, Castro, & Natarajan, 2013). Diferentes estudios muestran como los miARNs alteran la expresión génica de los tejidos productores de insulina y sensibles a la insulina; los ejemplos incluyen el páncreas regulado por miR-375 (Poy et al., 2004) y el hígado por miR-122 (Esau et al., 2006). Se han detectado miARNs circulantes en el torrente sanguíneo, donde presentan una alta estabilidad y reproducibilidad. Los miARNs circulantes pueden proporcionar información clínica sobre las condiciones fisiopatológicas, lo que sugiere su importante papel en la patogénesis, el diagnóstico temprano y la evolución de la diabetes.

Aunque los mecanismos precisos de liberación de miARNs al torrente sanguíneo sólo se comprenden parcialmente, parece que los miARNs llegan al sistema circulatorio a través de un complejo mecanismo de liberación de las células con vesículas extracelulares (VE) o proteínas transportadoras (de Candia, Torri, Pagani, & Abrignani, 2014). Los miARNs circulantes son candidatos como nuevos biomarcadores de resistencia a la insulina y adiposidad (Corona-Meraz et al., 2019), también para monitorear la respuesta a la terapia con respecto al objetivo glucémico (Catanzaro et al., 2018; Nunez Lopez, Retnakaran, Zinman, Pratley, & Seyhan, 2019; Yang et al., 2017) y para las complicaciones de la diabetes (Chien et al., 2015; Spinetti et al., 2013), pero se desconoce su implicación en el desarrollo de la diabetes monogénica.

El objetivo de la presente invención ha sido desarrollar un método basado en miARNs circulantes que, junto con la PCR-hs, cuyos niveles bajos se han descrito en MODY HNF1A, sea útil en el diagnóstico diferencial entre pacientes con DM2 y MODY HNF1A.

En particular, se ha evaluado el valor de diferentes miARNs que por bibliografía se seleccionaron por estar involucrados en la secreción de la insulina y regeneración de la célula beta e islotes pancreáticos, de los cuales finalmente se seleccionaron el mir-19 y mir-16-5p junto con la PCR-hs como biomarcadores, para desarrollar un algoritmo que nos distinguirá a sujetos con MODY HNF1A frente a sujetos con DM2, ya que es la situación de dilema clínico más frecuente en la atención de la diabetes con péptido C presente y autoinmunidad negativa en adultos.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Un microARN (abreviado como“miARN”)es una pequeña molécula de ARN no codificante que se encuentra tanto en plantas como en animales, y que frecuentemente ejercen una función relacionada con la regulación post-transcripcional de la expresión génica.

Los microARNs contienen aproximadamente 22 nucleótidos (aprox. 18-25 nucleótidos), son ARNs monocatenarios no codificantes con cierta estructura secundaria que regulan negativamente (inhiben) la expresión génica bien por inhibición de la traducción o escisión del ARN mensajero(mARN).Por lo tanto, los miARNs son reguladores posttranscripcionales que se unen a secuencias complementarias de los transcritos de mARN, lo que generalmente produce una represión de la traducción o la degradación del objetivo que tiene como consecuencia el silenciamiento de genes. En un aspecto particular de la invención, comprender los detalles moleculares de la acción de los miARNs de la invención no es crítico, ya que los niveles detectados de los miARNs indicativos permiten realizar los métodos de la invención.

Bajo un sistema de nomenclatura estándar, los nombres se asignan a los miARNs confirmados experimentalmente de la siguiente manera: el prefijo "mir" es seguido (por un guión y) un número, por lo que este último puede indicar el orden de los nombres.

El"mir-"sin capitalizar se refiere al pre-miARN, mientras que un "miR-" en mayúscula se refiere a la forma madura. Los miARNs con secuencias casi idénticas, excepto uno o dos nucleótidos, se anotan con una letra minúscula adicional, por ejemplo miR-99a. Los premiARNs que conducen a un 100% de miARNs maduros idénticos pero que están ubicados en diferentes lugares en el genoma se indican con un sufijo adicional de número de guión. Las especies de origen pueden designarse con un prefijo de tres letras, por ejemplo, hsamiR-223 es un miARN humano(Homo sapiens).Dado que, en el contexto de este documento, todos los miARNs individualizados son miARNs humanos, el prefijo "hsa-" a veces se omite. Cuando dos miARNs maduros se originan en brazos opuestos del mismo pre-miARN, se denotan con un sufijo -3p o -5p, como por ejemplo miR-142-3p. Cuando se conocen los niveles de expresión relativos, un asterisco después del nombre indica un miARN expresado en niveles bajos en relación con el miARN en el brazo opuesto de una horquilla. La mayoría de los genes miARN conocidos se encuentran en regiones intergénicas u orientadas de forma antisentido a los genes vecinos y, por lo tanto, se cree que se transcriben como unidades independientes. Sus genes generalmente se transcriben mediante la ARN polimerasa II, y las transcripciones se procesan, se exportan desde el núcleo y se procesan posteriormente mediante mecanismos específicos, como es bien conocido en la técnica (ver, por ejemplo, He et al., Nat. Rev. Genet. 2004 Jul; 5 (7): 522-31). Se puede acceder a las secuencias de miARN en http://www.mirbase.org.

Así, se empleará el término“miARN de la invención’’para referirnos a cualquier miARN seleccionado del grupo formado por mir-181, mir-15, mir-19a-3p, mir-24, mir-375, mir-16-5p y mir124-3p.

Tabla 1: Secuencias de miARNs de la invención.

Un primer aspecto de la invención se refiere al usoin vitrode los niveles de expresión de SEQ ID NO: 3 (miR-19a-3p), SEQ ID NO: 6 (miR-16-5p) y PCR ultrasensible (PCR-hs) como biomarcadores para pronosticar y/o diagnosticar la diabetes monogénica no autoinmune de inicio en adultos jóvenes en individuos portadores de alelos HNF1A deletéreos (MODY HNF1A).

En una realización preferida el uso de SEQ ID NO: 3 (miR-19a-3p), SEQ ID NO: 6 (miR-16-5p) y PCR ultrasensible (PCR-hs) es simultáneo.

En otra realización preferida, también se usan como biomarcadores, los niveles de expresión de uno o más de los siguientes miARNs: SEQ ID NO: 1 (miR-181); SEQ ID NO: 2 (miR-15); SEQ ID NO: 4 (miR-24), SEQ ID.NO: 5 (miR-375) y SEQ ID NO: 7 (miR-124).

Otro aspecto de la invención se refiere a un perfil de expresión de biomarcadores adecuado para diagnosticar la diabetes monogénica no autoinmune de inicio en adultos jóvenes en individuos portadores de alelos HNF1A deletéreos (MODY HNF1A), de ahora en adelante perfil de expresión de biomarcadores de la invención, que comprende los niveles de expresión de SEQ ID NO: 3 (miR-19a-3p), SEQ ID NO: 6 (miR-16-5p) y PCR ultrasensible (PCR-hs).

En otra realización preferida, el perfil de expresión de biomarcadores de la invención comprende, además, los niveles de expresión de uno o más de los miARNs como se establece en las siguientes SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1 (miR-181); SEQ ID NO: 2 (miR-15); SEQ ID NO: 4 (miR-24); SEQ ID.NO 5 (miR-375) y SEQ ID NO: 7 (miR-124).

MÉTODO DE DIAGNÓSTICO / PRONÓSTICO DE LA INVENCIÓN

Otro aspecto de la invención se refiere a un métodoin vitropara diagnosticar y / o pronosticar la diabetes monogénica no autoinmune de inicio en adultos jóvenes en individuos portadores de alelos HNF1A deletéreos que comprende:

a) medir los niveles de expresión de SEQ ID NO: 3 (miR-19a-3p), SEQ ID NO: 6 (miR-16-5p) y PCR ultrasensible (PCR-hs) en una muestra biológica,

b) aplicar la fórmula P=1/(1 e -(0,788 -2,646*PCR-hs+4,63o*miR-i9-3p-3,246*miR-i6-5p))

donde las variables se han calculado de la siguiente manera: para aproximarlas a una distribución normal se aplicó el log10 y el Z-score (Z ~ N(0,1)) para estandarizarlas y poderlas comparar entre sí.

PCR-hs= Z score log10 PCR-hs

miR-19a-3p= Z score log102delta Ct miR-19a-3p

miR-16-5p=Z score log102delta Ct miR-16-5p

c) clasificar al individuo en el grupo de individuos que padecen MODY HNF1A cuando presentan una P mayor o igual a 0,311, más preferiblemente mayor o igual a 0,40 y mucho más preferiblemente, mayor o igual a 0,83.

El método de la presente invención permite clasificar a los individuos con valores de P< 0,05 en el grupo de individuos que no padecen MODY HNF1A con seguridad.

El primer método de la invención implica la comparación de dichos niveles de miARNs con los niveles de dichos miARNs de una muestra de referencia o con un valor mediano. En el contexto de la presente invención, se entiende por"muestra de referencia" la muestra que se usa para determinar la variación de los niveles de expresión de los miARNs de la presente invención. En una realización preferida, el valor de referencia se obtiene de los valores de expresión obtenidos de una muestra con individuos que no tienen la enfermedad, es decir, que no padece de MODY HNF1A.

Preferiblemente, se toman muestras de referencia de varios individuos que no tienen la enfermedad y se combinan, de modo que el valor de referencia refleje el valor medio de dichas moléculas en la población de individuos que no padecen MODY HNF1A."Valor de referencia"es el nivel de expresión de un miARN de la invención en una muestra de referencia.

En una realización preferente, los niveles de expresión se normalizan respecto al miARN control, con el fin de paliar las variaciones de expresión de origen no biológico. En una realización más preferente, el miARN control es el denominado spike-in template UniSp6, una molécula sintética de miRNA que introducimos cuando realizamos la RT con el kit miRCURY LNATM Universal RT de Qiagen (ref 339340) siguiendo el protocolo y recomendaciones del fabricante. Como método de estandarización, además se realizaron las RTs a partir de concentraciones de RNA total de 25ngr (medición en nanodrop).

Tabla 2: miARN control: Spike-in UniSp6.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica se selecciona de entre sangre, plasma y suero.

En una realización aun más preferida la muestra biológica es suero.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el resultado se puede obtener mediante cualquiera de las siguientes técnicas:

(i) un método de generación de perfiles de miARN, como un microarray, y/o

(ii) un método que comprende PCR (reacción en cadena de la polimerasa), tal como PCR en tiempo real y/o PCR digital.

(iii) inmunoensayo.

En la invención, el método para determinar el resultado, es decir, el nivel de expresión del miARN, no necesita estar particularmente limitado, y puede seleccionarse mediante un método de perfilado de miARN, como una micromatriz, y/o un método que comprende PCR (reacción en cadena de la polimerasa), tal como tiempo de PCR y/o inmunoensayo; Northern Blot .

La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) cuantitativa en tiempo real (generalmente abreviada como RQ-PCR, RT-qPCR, rt-PCR o qPCR) es una técnica de cuantificación de la expresión de miARNs sensible y reproducible que se puede usar particularmente para perfilar la expresión de miARN en células y tejidos. Se puede utilizar cualquier método para evaluar los resultados de la RT-PCR, y se puede preferir el método ACt y el método AACt. El método AACt se describe en detalle por Livak et al. (Methods 2001, 25: 402-408). (Ct = Valores umbral de ciclo). Al poner en práctica la presente invención, el método AACt descrito por Livak et al. (Métodos 2001, 25: 402-408) se utilizarán preferentemente. El AACtmethod incluirá una 'muestra de control' y una 'muestra de sujeto'. La 'muestra de sujeto' es una muestra del sujeto a analizar. Para cada muestra, se incluyen un miARN diana (aquí: miARN de interés) y un miARN de control sintetico y/o endógeno (como se describe a continuación) para la amplificación por PCR a partir de alícuotas (típicamente en serie). Típicamente, se utilizan varias réplicas para cada concentración diluida para derivar la eficiencia de amplificación. La eficiencia de la amplificación por PCR se puede definir como porcentaje de amplificación (de 0 a 1). Durante la reacción de qPCR, un software mide típicamente para cada muestra el número de ciclo en el que la fluorescencia (indicador de amplificación por PCR) cruza una línea arbitraria, el umbral. Este punto de cruce es el valor Ct.

Una micromatriz es una matriz sobre un sustrato sólido (generalmente una lámina de vidrio o una célula de película delgada de silicio) que analiza grandes cantidades de material biológico, en el presente caso una gran cantidad de diferentes miARNs o, preferiblemente, sus transcritos de ADN inversos, que son detectables mediante sondas específicas inmovilizadas sobre el sustrato sólido.

Una transferencia Northern implica el uso de electroforesis para separar muestras de ARN por tamaño y detección posterior con una sonda de hibridación complementaria a (parte de) la secuencia diana del ARN de interés.

El método de la presente invención se puede aplicar con muestras de individuos de cualquier sexo, es decir, hombres o mujeres, y a cualquier edad.

En el método de la presente invención, la expresión del miARN puede normalizarse, preferiblemente en relación con la expresión de otra molécula de ARN. Existen métodos de normalización bien conocidos en el estado de la técnica, aunque hasta la fecha no existe ningún consenso ni método universal para la estandarización de miRNAs en suero.

Para el desarrollo del algoritmo, se ha utilizado el miARN control denominado spike-in témplate UniSp6, por ser un método que nos permite el uso del mismo en otros grupos de sujetos y asegura la replicación de las mediciones en diferentes poblaciones.

La invención proporciona un método para asignar a un sujeto humano en uno de los dos grupos: el grupo, que comprende sujetos identificables por el método de la invención y el grupo 2, que representa los sujetos restantes.

Es posible proporcionar una terapia personalizada a un individuo dependiendo de si el individuo está asignado al grupo 1 o al grupo 2. El grupo 1 comprende sujetos identificables por el método de la invención como individuos que padecen MODY HNF1A y el grupo 2 representa los sujetos restantes.

KIT O DISPOSITIVO DE LA INVENCIÓN

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo que comprende al menos uno o más oligonucleótidos capaces de hibridar con miARNs establecidos como SEQ ID NO: 3 y 6 en condiciones rigurosas.

Se prefiere que dicho oligonucleótido (s) sea capaz de hacerlo en condiciones de astringencia. En una realización preferida, uno o más de dichos uno o más oligonucleótidos (preferiblemente DNA) se definen adicionalmente mediante las siguientes sondas o primers: hsa-miRXX-miRCURY LNA miARN medidos con syber, cebadores específicos LNA ™ PCR.

Más preferiblemente el kit también comprende oligonucleótido(s) capaces de hibridar con miARNs establecidos como SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5 y/o 7 en condiciones rigurosas.

La astringencia es un término usado en experimentos de hibridación. La astringencia refleja el grado de complementariedad entre el oligonucleótido y el ácido nucleico (que en este caso es el miARN a detectar); cuanto mayor sea la astringencia, mayor porcentaje de homología entre la sonda y el ácido nucleico unido al filtro. El experto en la materia sabe bien que la temperatura y las concentraciones de sal tienen un efecto directo sobre los resultados que se obtienen. Se reconoce que los resultados de la hibridación están relacionados con el número de grados por debajo de la Tm (temperatura de fusión) del ADN en el que se realiza el experimento. A menudo, las condiciones rigurosas se definen como un lavado con 0.1X SSC (solución salina-citrato de sodio (SSC) tampón a 65 °C. (SSC se proporciona generalmente como una solución madre 20X, que consiste en cloruro de sodio 3 M y citrato de trisodio 300 mM (ajustado a pH 7,0 con HCl)).

En realizaciones particulares, el kit se selecciona de (a) un kit adecuado para PCR, (b) un kit adecuado para Northern Blot (c) Inmunoensayo y (d) un kit adecuado para análisis de micromatrices. También se pueden combinar dos o más de estas realizaciones, de modo que el kit pueda comprender, por ejemplo, tanto (a) como (c).

En el caso de (a) un kit adecuado para la PCR, esta PCR es típicamente una PCR cuantitativa en tiempo real (RQ-PCR), una técnica de cuantificación de la expresión génica sensible y reproducible. En este caso, se desea que el kit comprenda adicionalmente un cebador de oligonucleótido poliT además del oligonucleótido (s) del kit. El cebador oligonucleotídico poliT se puede usar junto con el oligonucleótido (s) de la invención para la PCR de cebado, después de la poliadenilación de los miARNs aislados mediante métodos conocidos por los expertos, como el uso de poli-(A) polimerasa y ATP. Estos reactivos pueden estar incluidos opcionalmente en el kit.

Una transferencia Northern (b) implica el uso de electroforesis para separar muestras de ARN por tamaño y detección posterior con un oligonucleótido (s) (sonda de hibridación) complementaria a (parte de) la secuencia diana del ARN de interés.

El kit puede ser también tipo inmunoensayo (c), con controles, calibradores y curva patrón para medir la expresión de los miARNs en un espectrofotómetro.

También es posible que el oligonucleótido (s) esté inmovilizado en manchas en una superficie (preferiblemente sólida). En una realización del mismo, el kit comprende una micromatriz (d). Una micromatriz de ARN es una matriz sobre un sustrato sólido (generalmente un portaobjetos de vidrio o una célula de película delgada de silicio) que analiza grandes cantidades de diferentes ARNs (en este caso miARN), que se pueden detectar mediante sondas específicas inmovilizadas en puntos del sustrato sólido. Cada punto contiene una secuencia específica de ácido nucleico, típicamente una secuencia de ADN, conocida como sondas (o informadores). Si bien el número de manchas no está limitado, existe una realización preferida en la que la micromatriz se adapta a los métodos de la invención. En una realización, una micromatriz personalizada de este tipo comprende cincuenta puntos o menos, tales como treinta puntos o menos, incluyendo veinte puntos o menos.

El kit o dispositivo de la invención puede usarse y el uso no está particularmente limitado, aunque se prefiere el uso en el método de la invención en cualquiera de sus realizaciones.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los oligonucleótidos, cebadores, sondas o anticuerpos están modificados o marcados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un marcaje radiactivo o inmunológico. Así, preferiblemente, los oligonucleótidos presentan modificaciones en alguno de sus nucleótidos, como por ejemplo, pero sin limitarnos a, nucleótidos que tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiactivo, normalmente 32P o tritio, nucleótidos marcados inmunológicamente, como por ejemplo con una molécula de digoxigenina, y/o inmovilizadas en una membrana. Varias posibilidades son conocidas en el estado de la técnica.

El kit o dispositivo de la invención puede comprender controles, instrucciones de programa e información necesaria para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit según cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas para llevar a cabo cualquiera de las realizaciones del método de la invención.

AUTOMATIZACIÓN DE LOS MÉTODOS DE LA INVENCIÓN

La invención se extiende también a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los métodos de la invención. Tales programas pueden tener la forma de código fuente, código objeto, una fuente intermedia de código y código objeto, por ejemplo, como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para uso en la puesta en práctica de los procesos según la invención. Los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho procedimiento.

En particular, la invención abarca programas de ordenador dispuestos sobre o dentro de una portadora. La portadora puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de soportar el programa. Cuando el programa va incorporado en una señal que puede ser transportada directamente por un cable u otro dispositivo o medio, la portadora puede estar constituida por dicho cable u otro dispositivo o medio. Como variante, la portadora podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa, estando el circuito integrado adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de, los procesos correspondientes.

Por ejemplo, los programas podrían estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabación magnética, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Alternativamente, los programas podrían estar soportados en una señal portadora transmisible. Por ejemplo, podría tratarse de una señal eléctrica u óptica que podría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios.

La invención se extiende también a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los métodos de la invención. Tales programas pueden tener la forma de código fuente, código objeto, una fuente intermedia de código y código objeto, por ejemplo, como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para uso en la puesta en práctica de los procesos según la invención. Los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho procedimiento.

Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

En concreto, se ha desarrollado una calculadora con la fórmula del algoritmo de la invención

P=1/(1 e-(0,788 - 2,646*PCR-hs+4,630*miR-19-3p- 3,246*miR-16-5p))

para facilitar el cálculo de la probabilidad, empleando un código de programación y una interfaz amigable para el usuario

La calculadora de diagnóstico se ha creado a través del lenguaje de programación Python utilizando la librería Tkinter. Esta librería proporciona diferentes herramientas para la creación y desarrollo de una interfaz gráfica de usuario y permite que la interfaz sea compatible con la mayoría de los sistemas operativos. La interfaz se compone de una ventana de aplicación en donde se distribuyen los diferentes "widgets" que componen la "calculadora". En ella se encuentran:

- 4 cuadros de texto en los cuales se introducen los valores de las características que componen el algoritmo.

-1 botón el cual ejecuta la función para el cálculo en la ecuación obtenida en el desarrollo del algoritmo.

-1 cuadro de texto en donde se muestra el resultado del cálculo y la probabilidad de padecer la enfermedad en 4 niveles: negativo, posible positivo, probable positivo y muy probable positivo; según el valor de p sea menor a 0,311 (negativo), mayor o igual a 0,311 (posible positivo), mayor o igual a 0,40 (probable positivo), o mayor o igual a 0,83 (muy probable positivo).

Una“muestra biológica aislada”incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada es sangre venosa periférica.

El término“individuo”,tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. Los términos“individuo”"sujeto humano" y "sujeto" se usan indistintamente en esta memoria y son sinónimos de“paciente”,y no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.

Los términos“uno o más" o“al menos un”o“varios”,tal y como se usan en este documento, incluyen uno y la especificación individualizada de cualquier número que sea más de uno, como dos, tres, cuatro, cinco, seis, etc."

El término "comprende" también podrá interpretarse, en una realización particular, como“consiste en”.El término“comprende”y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos.

Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1:Curva ROC del modelo para el diseño del algoritmo. Método estadístico para determinar la exactitud diagnóstica del método de la invención, en concreto su sensibilidad y especificidad y su capacidad discriminativa, el área bajo la curva del modelo, la probabilidad de que ante un par de individuos, uno enfermo y el otro sano, la prueba los clasifique correctamente.

Figura 2:Curva ROC del modelo del algoritmo con muestras para su validación.

EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN

Participantes del estudio para diseño de algoritmo.

Los sujetos MODY HNF1A fueron reclutados en la Unidad de Diabetes del Hospital Regional Universitario de Málaga (HRUM) y los sujetos con DM2 se seleccionaron del estudio di@bet.es. Se parearon por edad, IMC y sexo.

Número de pacientes MODY HNF1A = 17 con diagnóstico previo realizado por Sanger.

Número de sujetos con DM2 = 22

Participantes del estudio para validación del algoritmo.

Los sujetos MODY HNF1A fueron reclutados en la Unidad de Diabetes del Hospital Regional Universitario de Málaga (HRUM) y los sujetos con DM2 se seleccionaron del estudio di@bet.es. Se parearon por edad, IMC y sexo.

Número de pacientes MODY HNF1A = 29 con diagnóstico previo realizado por Sanger.

Número de sujetos con DM2 = 75

Secuenciación de ADN y evaluación de alelos HNF1A.

Se hizo la extracción del ADN, se amplificó y secuenció utilizando el método Sanger. Se utilizó Mutation Surveyor versión 5.0.1 (SoftGenetics, Cambridge, Reino Unido) para la detección de variantes en comparación con la secuencia de referencia (NM_000545.5). Con posterioridad se realizó la evaluación sistemática de alelos HNF1A raros (frecuencia de alelos menores (MAF), 1%) y se alineó con la clasificación del American College of Medical Genetics (ACMG). Esto incluyó características clínicas, co-segregación del alelo con diabetes en la familia y análisisin silicode variantes de sentido erróneo utilizando la clasificación de intolerantes a tolerantes (SIFT), fenotipado de polimorfismo versión 2 (PolyPhen2), y analizador de efectos de variación de proteínas (PROVEAN). El efecto potencial sobre el empalme se examinó utilizando Human Splicing Finder (HSF).

Ensayos bioquímicos e inmunológicos.

La PCR-hs se midió utilizando un ensayo inmunoturbidimétrico de alta sensibilidad mejorado con látex de amplio rango en un analizador ADVIA 2400 (Siemens Healthcare Diagnostics, Erlangen, Alemania) con un límite de cuantificación de 0,01 mg / L. Las mediciones de PCRhs para las muestras MODY HNF1A se realizaron con el método de Abbott PCRhs y el nivel cuantificable más bajo fue del 0,1 mg / L.

Los métodos fueron reproducibles, con un coeficiente de variación para ambos por debajo del 10,5% en todo el rango de concentración probado. La comparación de las muestras clínicas medidas por ambos métodos mediante regresión de Passing y Bablock, mostró la concordancia del método de Abbott = 0,26 0,99 (método de Siemens).

Metodología para determinación de miARNs.

Seleccionamos por bibliografía 10 miARNs candidatos como potenciales biomarcadores para el diagnóstico de MODY HNF1A basándonos en criterios en relación a la síntesis de la insulina y procesos de regeneración de la célula beta e islotes pancréticos. A continuación, realizamos un estudio piloto con un grupo de muestras de suero de pacientes donde se midieron estos 10 miARNs candidatos, y tras esta prueba obtuvimos resultados consistentes respecto a su determinación en suero de los 7 siguientes: miR181, miR15, miR19-3p, miR124-3p, miR24, miR375 y miR16-5p.

La extracción de miARNs de muestras de suero se realizó mediante métodos automatizados en Maxwell 16 de Promega (número de serie 23627808) con Maxwell® 16 miARN Tissue Kit (Promega Biotech Ibérica SL, Madrid, España) y se convirtió a microcADN por transcripción inversa con el Kit miRCURY LNATM Universal RT de Qiagen (ref 339340)) siguiendo las recomendaciones del fabricante para cada kit. Las mediciones de los niveles de expresión de miARNs se realizaron mediante qPCR en tiempo real en 384 placas en un Light Cycler 480 (Roche Diagnostics, S.L, Barcelona, España) en la plataforma de Genómica de IBIMA. La mezcla maestra se preparó siguiendo las pautas de Exiqon con GoTaq (R) qPCR Master Mix (Promega Biotech Ibérica S.L., Madrid, España) y los conjuntos de cebadores específicos LNA ™ PCR (Qiagen). El análisis de miARN se realizó mediante el método delta Ct.

Para la normalización de datos, se incluyeron controles negativos y un calibrador específico en todas las placas para la normalización entre placas. Aquellas determinaciones de miARN con Ct > 38 se consideraron por debajo del límite de detección y se retiraron del análisis.

Análisis estadístico.

Las características de los sujetos y los resultados del trabajo experimental se analizaron mediante el software SPSS 23. Los datos continuos se presentan como medianas con el rango intercuartílico (RIQ) y se aplicó la prueba de Kruskal-Wallis para comparar grupos. Un valor de p de 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

El análisis de eficacia diagnóstica se ha realizado comparando los dos grupos de pacientes mediante análisis de regresión logística paso a paso con el que se seleccionó el mejor modelo diagnóstico. Las probabilidades predichas del modelo se dicotomizaron en función del mejor cut-off calculado por la curva ROC. A continuación, se calcularon los valores predictivos en función del cut-off.

Resultados.

Se midieron los miARNs miR-181, miR-15, miR-19-3p, miR-24, miR 124-3p, miR-375 y miR-16-5p junto con la PCR-hs en personas con DM2 y MODY HNF1A. Todos mostraron diferencias significativas ajustando por edad, sexo e IMC.

A nivel práctico para fenotipación adecuada y activación de estudio genético de MODY HNF1A nos interesa diferenciar diabetes por mutación MODY HNF1A frente a DM2; por ello, el análisis de eficacia diagnóstica se realizó entre estos dos grupos por medio de un análisis de regresión logística paso a paso.

El modelo final incluye las siguientes variables: miR-19-3p, miR-16-5p y PCR-hs, y queda definido con el siguiente algoritmo:

Por lo tanto, este logaritmo rinde la probabilidad de presentar MODY HNF1A (MODY 3) en función de las 3 variables miR-19-3p, miR-16-5p y PCR-hs, donde los valores de las variables analizadas fueron los que se indican acontinuación:

Tabla 3: Descripción de las variables utilizadas para diseño de algoritmo.

Las probabilidades predichas se dicotomizan en función del mejor cut-off calculado en función de la mejor sensibilidad y especificidad por la curva ROC = 0,311.

Los valores predictivos se calcularon con este cut-off. La R2 de Nagelkerke del modelo es 0,777, lo que indica que un 77,7% de la variabilidad de la variable dependiente es explicada por el modelo.

Valores de p> 0,837 indican MODY HNF1A con seguridad.

Valores de p< 0,056 descartan MODY HNF1A con seguridad.

Tabla 4:Variables resultado de contraste: Probabilidad pronosticada MODY HNF1AvsDM2 con el modelo algoritmo.

a. Bajo el supuesto no paramétrico

b. Hipótesis nula: área verdadera = 0,5

Tabla 5:Resultado de la prueba diagnóstica con las muestras para diseño de algoritmo.

Positivo= MODY 3; Negativo= DM2

De los 16 sujetos diagnosticados con mody HNF1a, el algoritmo clasificó correctamente a 15 y de los 23 sujetos con DM2 se clasificaron correctamente dentro de su grupo 21 aplicando el algoritmo.

Tabla 6:Características del algoritmo diagnóstico en base a las muestras utilizadas para desarrollo del mismo.

Tabla 7: Cambio de los valores predictivos en función de la prevalencia de la enfermedad en la población en la que se realiza el diagnóstico diferencial.

Según los cálculos, este algoritmo permite realizar el diagnóstico de un paciente de MODY HNF1A con un valor predictivo positivo del 93,4% en una consulta especializada de diabetes monogénica donde se lleve a cabo una fenotipación adecuada que aumente la probabilidad preprueba de diabetes monogénica.

Validación

A continuación, se han calculado las probabilidades predichas con los nuevos sujetos seleccionados para la validación, dicotomizando en función del mismo cut-off usado en el desarrollo del algoritmo (0,311), calculado a partir del mejor valor de especificidad y sensibilidad a partir de la curva ROC obtenida del modelo.

Tabla 8:Descripción de las variables utilizadas para la validación.

Tabla 9.Probabilidad pronosticada modelo algoritmo con muestras para validación.

a. Bajo el supuesto no paramétrico

b. Hipótesis nula: área verdadera = 0,5

Tabla 10:Resultado de la prueba diagnóstica con las muestras para validación.

Positivo= MODY 3; Negativo= DM2

De los 26 sujetos seleccionados para la validación diagnosticados con mody HNF1a, el algoritmo clasificó correctamente a 25, y de los 75 sujetos con DM2 seleccionados para la validación se clasificaron correctamente dentro de su grupo a 39 de ellos aplicando el algoritmo.

Tabla 11:Características del algoritmo diagnóstico en base a las muestras utilizadas para la validación.

El diagnóstico de MODY HNF1A se lleva a cabo mediante técnicas de secuenciación como la tecnología SANGER que son estudios gen a gen o mediante la tecnología de secuenciación masiva (NGS, siglas del término en inglés“Next generation sequencing”)que permite estudiar muchos genes a la vez. Los facultativos a menudo tienen un acceso limitado a estas pruebas pero en otros países-si tienen mayor acceso a ellas. Los biomarcadores aún pueden ser útiles como una estimación del riesgo previo a las pruebas genéticas de MODY HNF1A y también aportar información en el contexto de la interpretación de los resultados. En otros países, incluido España, se dispone de muy pocas pruebas genéticas de forma rutinaria, por lo que los biomarcadores pueden seguir desempeñando un papel en la identificación de las personas con mayor riesgo de MODY HNF1A para los enfoques de secuenciación de Sanger de un solo gen.

La combinación de biomarcadores circulantes como la PCR-hs y los miRNAs abren una nueva vía de estudio para desarrollar test diagnósticos más asequibles que sean una alternativa coste-efectiva a los test genéticos requeridos en enfermedades como las diabetes monogénicas. En aquellas situaciones en las que la disponibilidad de los test genéticos es más limitada en la práctica clínica rutinaria, estos biomarcadores pueden servir para un cribado previo para identificación de sujetos con alto riesgo de presentar un tipo de MODY. En la actualidad, el test genético es la prueba diagnóstica de primera línea, sin embargo en estos casos, el uso de estos biomarcadores pueden orientarnos acerca de la patogenicidad de las nuevas variantes no descritas o aquellas de significado incierto.

En conclusión, tras nuestro estudio encontramos que los biomarcadores mi-19-3p, mir-16-5p y PCR-hs podrían diferenciar a los individuos con alelos patológicos de HNF1A de aquellos sujetos con DM2. Un protocolo de diagnóstico que combine características clínicas con biomarcadores podría mejorar la selección de sujetos para las pruebas genéticas de MODY HNF1A, la forma más común de diabetes monogénica en adultos. La aplicación de este algoritmo podría suponer una optimización de los recursos para los sistemas sanitarios ya que permitiría tener información más precisa a la hora de indicar la prueba genética.

Tabla 12: Comparativa precio-tiempo de ejecución entre técnicas.

También es interesante apuntar que tanto la secuenciación por Sanger como la secuenciación masiva (NGS) necesitan de un aparataje mucho más costoso, que los necesarios para la determinación de miARNs y/o la PCR-hs. La medición de un miARN puede realizarse en termociclador clásico para PCR a tiempo real y la determinación de la PCR-hs solo requiere de un lector de absorbancia que puede encontrarse en cualquier laboratorio básico de análisis clínicos. Por tanto, y como se ha comentado con anterioridad en este documento, la realización de las determinaciones de los biomarcadores para la aplicación de este algoritmo de diagnóstico de MODY HFN1a sería más factible en centros que tengan más limitados sus recursos y por tanto un equipamiento mucho más discreto.

Referencias

1. Catanzaro, G., Besharat, Z. M., Chiacchiarini, M., Abballe, L., Sabato, C., Vacca, A., ...

Ferretti, E. (2018). Circulating MicroRNAs in elderly type 2 diabetic patients.International Journal of Endocrinology, 2018.

2. Chien, H. Y., Lee, T. P., Chen, C. Y., Chiu, Y. H., Lin, Y. C., Lee, L. S., & Li, W. C.

(2015). Circulating microRNA as a diagnostic marker in populations with type 2diabetes mellitus and diabetic complications.Journal of the Chínese Medical Association,Vol. 78.

3. Corona-Meraz, F. I., Vázquez-Del Mercado, M., Ortega, F. J., Ruiz-Quezada, S. L., Guzmán-Ornelas, M. O., & Navarro-Hernández, R. E. (2019). Ageing influences the relationship of circulating miR-33a and miR-33b levels with insulin resistance and adiposity.Diabetes and Vascular Disease Research,16(3), 244-253.

4. de Candia, P., Torri, A., Pagani, M., & Abrignani, S. (2014). Serum microRNAs as biomarkers of human lymphocyte activation in health and disease.Frontiers in Immunology,Vol. 5.

5. DP, B. (2004). MicroRNAs : Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function.pdf.Cell.

6. Esau, C., Davis, S., Murray, S. F., Yu, X. X., Pandey, S. K., Pear, M., ... Monia, B. P.

(2006). miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting.Cell Metabolism,3(2), 87-98.

7. Juszczak, A., Pavic, T., Vuckovic, F., Bennett, A. J., Shah, N., Medvidovic, E. P., ...

Gornik, O. (2019). Plasma fucosylated glycans and C-reactive protein as biomarkers of HNF1A-MODY in young adult-onset nonautoimmune diabetes.Diabetes Care,42(1), 17-26.

8. Kato, M., Castro, N. E., & Natarajan, R. (2013). MicroRNAs: Potential mediators and biomarkers of diabetic complications.Free Radical Biology and Medicine,Vol. 64, pp.

85-94.

9. La Sala, L., Micheloni, S., De Nigris, V., Prattichizzo, F., & Ceriello, A. (2018, October 1).

Novel insights into the regulation of miRNA transcriptional control: implications for T2D and related complications.Acta Diabetologica,Vol. 55, pp. 989-998.

10. Nunez Lopez, Y. O., Retnakaran, R., Zinman, B., Pratley, R. E., & Seyhan, A. A. (2019).

Predicting and understanding the response to short-term intensive insulin therapy in people with early type 2 diabetes.Molecular Metabolism, 20,63-78.

11. Poy, M. N., Eliasson, L., Krutzfeldt, J., Kuwajima, S., Ma, X., MacDonald, P. E., ...

Stoffel, M. (2004). A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion.Nature,432(7014), 226-230.

12. Prattichizzo, F., Giuliani, A., De Nigris, V., Pujadas, G., Ceka, A., La Sala, L., ... Ceriello, A. (2016, September 1). Extracellular microRNAs and endothelial hyperglycaemic memory: a therapeutic opportunity?Diabetes, Obesity and Metabolism,Vol. 18, pp.

855-867.

13. Spinetti, G., Fortunato, O., Caporali, A., Shantikumar, S., Marchetti, M., Meloni, M., ...

Emanueli, C. (2013). MicroRNA-15a and MicroRNA-16 impair human circulating proangiogenic cell functions and are increased in the proangiogenic cells and serum of patients with critical limb ischemia.Circulation Research,112(2), 335-346.

14. Yang, Z. M., Chen, L. H., Hong, M., Chen, Y. Y., Yang, X. R., Tang, S. M., ... Chen, W.

W. (2017). Serum microRNA profiling and bioinformatics analysis of patients with type 2 diabetes mellitus in a Chinese population.Molecular Medicine Reports,15(4).

15. Zampetaki, A., Kiechl, S., Drozdov, I., Willeit, P., Mayr, U., Prokopi, M., ... Mayr, M.

(2010). Plasma MicroRNA profiling reveals loss of endothelial MiR-126 and other MicroRNAs in type 2 diabetes.Circulation Research,107(6), 810-817.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. El usoin vitrode los niveles de expresión de SEQ ID NO: 3 (miR-19a-3p), SEQ ID NO:

6 (miR-16-5p) y PCR ultrasensible (PCR-hs) como biomarcadores para diagnosticar la diabetes monogénica no autoinmune de inicio en adultos jóvenes en individuos portadores de alelos HNF1A deletéreos (MODY HNF1A).

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende usar como biomarcadores los niveles de expresión de uno o más miARNs a seleccionar de las siguientes SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1 (miR-181); SEQ ID NO: 2 (miR-15); SEQ ID NO: 5 (miR-375) y SEQ ID NO: 4 (miR-24).

3. Un perfil de expresión de biomarcadores adecuado para diagnosticar la diabetes monogénica no autoinmune de inicio en adultos jóvenes en individuos portadores de alelos HNF1A deletéreos (MODY HNF1A) que comprende los niveles de expresión de SEQ ID NO: 3 (miR-19a-3p, SEQ ID NO: 6 (miR-16-5p) y PCR ultrasensible PCR-hs.

4. El perfil de expresión de biomarcadores de la reivindicación 3, que comprende además los niveles de expresión de uno o más de los miARNs establecidos en la reivindicación 2.

5. Un métodoin vitropara diagnosticar la diabetes monogénica no autoinmune de inicio en adultos jóvenes en individuos portadores de alelos HNF1A deletéreos que comprende:

a) medir los niveles de expresión de SEQ ID NO: 3 (miR-19a-3p), SEQ ID NO: 6 (miR-16-5p) y PCR ultrasensible (PCR-hs) en una muestra biológica,

b) P=1/(1<+ e ' (0’788 - 2,646*PCR-hs+4,630*miR-19-3p- 3,246*m¡R-16-5p)^>

c) clasificar al individuo en el grupo de individuos que padecen MODY HNF1A cuando presentan una p mayor o igual a 0,311, más preferiblemente mayor o igual a 0,40, y mucho más preferiblemente mayor o igual a 0,83.

6. El método según la reivindicación anterior, donde la muestra biológica se selecciona entre sangre, plasma y suero.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 5-6, donde la muestra biológica es suero.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en el que dicho resultado se puede obtener mediante:

(i) un método de generación de perfiles de miARNs, como un microarray, y/o (ii) un método que comprende PCR (reacción en cadena de la polimerasa), tal como PCR en tiempo real; y/o

(iii) inmunoensayo.

9. Un kit o dispositivo que comprende al menos uno o más oligonucleótidos capaces de hibridar con miARNs establecidos como SEQ ID NO: 3 y 6 en condiciones rigurosas.

10. El kit de acuerdo con la reivindicación 9, que también comprende oligonucleótido (s) capaces de hibridar con miARNs establecidos como SEQ ID NO: 1, 2, 5, y/o 4 en condiciones rigurosas.

11. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 9-10 en un método según cualquiera de las reivindicaciones 5-8.

12. Un programa de ordenador o calculadora adaptado para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los pasos b) y c) del método según cualquiera las reivindicaciones 5-8.

13. Un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos b) y c) del método según cualquiera las reivindicaciones 5-8.

14. Una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos b) y c) del método según cualquiera las reivindicaciones 5-8.