ES2994760T3

ES2994760T3 - Methods for the detection of host cell proteins

Info

Publication number: ES2994760T3
Application number: ES20160929T
Authority: ES
Inventors: Guojie Mao
Original assignee: Lonza AG
Current assignee: Lonza AG
Priority date: 2016-04-14
Filing date: 2017-04-12
Publication date: 2025-01-30
Anticipated expiration: 2037-04-12
Also published as: CN115109148A; WO2017178526A1; KR20180129927A; IL262297A; KR102408260B1; EP3683579B1; US11353468B2; CA3020808A1; US20220268791A1; CN109564217A; EP3443348A1; IL290358A; EP3683579A1; AU2017251360A1; US12203948B2; US20190128903A1; BR112018071107A2; EA201892325A1; US20220268792A1; SG11201808992UA

Abstract

La presente divulgación se refiere a métodos para detectar y/o cuantificar impurezas de proteínas de células huésped durante la producción de un producto, por ejemplo, una proteína recombinante, por ejemplo, un anticuerpo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de detección de proteínas de las células huésped

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente divulgación se refiere a un método para producir una preparación policlonal de anticuerpos contra proteínas de células huésped, que son útiles en métodos de detección y/o cuantificación de impurezas de proteínas de células huésped durante la producción de un producto, por ejemplo, una proteína recombinante, por ejemplo, un anticuerpo.

ANTECEDENTES

La proteína celular huésped (HCP, por sus siglas en inglés) es una mezcla compleja no deseada de proteínas huésped que puede presentarse en el producto final tras procesos de fabricación variados. Aquellas HCP pueden presentar riesgos para, entre otras cosas, la eficacia del producto y la seguridad del paciente. Por lo tanto, es necesario desarrollar métodos para detectar y cuantificar las HCP en los productos biofarmacéuticos finales.

Los ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) suelen utilizarse para medir las concentraciones totales de HCP (ver Hogwood et al., Curr Opin Biotechnol., 30:153-60 (2014); Tscheliessnig et al., Biotechnol J. 8(6):655-70 (2013); y Krawitz et al., Proteomics. 6(1):94-110 (2006). Los ejemplos específicos para tales ELISA se divulgan en w O 2015/038888, WO 99/34220 y W o 2005/071410. Los métodos para producir anticuerpos anti HCP policlonales para su uso en tales ensayos se divulgan en WO 2005/071410 y Zhu-Shimoni et al., Biotechnol Bioeng. 111(12):2367-79 (2014).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente divulgación proporciona, entre otros, métodos para crear una preparación policlonal de anticuerpos contra la proteína de la célula huésped (HCP), el método comprende: a) adquirir una muestra que comprende anticuerpos, por ejemplo, antisueros, de un animal (por ejemplo, una oveja, conejo, ratón, rata, hámster, cabra, etc.) inmunizado con HCP de una célula huésped (por ejemplo, una línea celular, por ejemplo, una célula o línea celular de mamífero, roedor o insecto, por ejemplo, una célula huésped CHO, SP2,<n>S<o>); separar anticuerpos, por ejemplo, c) separar el anticuerpo anti-HCP de la preparación de anticuerpos poniendo en contacto la preparación de anticuerpos con un agente de afinidad para HCP que comprende HCP acoplado a un sustrato, produciendo así una preparación policlonal de anticuerpos anti-HCP.

En algunas formas de realización, el animal inmunizado con HCP de una célula huésped es una oveja o cabra. La célula huésped es, en algunas formas de realización, una célula de mamífero. En algunas formas de realización, la célula de mamífero es una célula CHO. En algunas formas de realización, la separación de anticuerpos comprende la purificación de un anticuerpo policlonal anti-HCP a partir de los antisueros mediante un método de purificación que comprende la cromatografía de proteína A. En algunas formas de realización, el HCP acoplado a un sustrato puede ser un sustrato insoluble o sólido, por ejemplo, una perla de agarosa, por ejemplo, Sepharase, por ejemplo, cromatografía de sustrato derivatizado con bromuro de cianógeno (CNBr) o N-hidroxisuccinimida (NHS)). En algunas formas de realización, el sustrato acoplado al HCP es un sustrato derivatizado con bromuro de cianógeno (CNBr) o un sustrato derivatizado con N-hidroxisuccinimida (NHS).

En algunas formas de realización, la purificación elimina al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de IgG específicas no de HCP. En algunas formas de realización, la purificación elimina al menos 99 % de las IgG específicas no de HCP. En algunas formas de realización, la purificación elimina más de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de las IgG específicas no de HCP. En algunas formas de realización, la purificación elimina más del 99 % de las IgG específicas no de HCP. En algunas formas de realización, la preparación de anticuerpos policlonales está sustancialmente libre de IgG específicas no de HCP. En algunas formas de realización, la preparación de anticuerpos policlonales contiene no más de 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 % de IgG específicas no de HCP. En algunas formas de realización, la preparación de anticuerpos policlonales contiene menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o 0,5 % de IgG específicas no de HCP.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 representa un procedimiento de purificación de ejemplo para anticuerpo de HCP GS-CHO de oveja.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Para que las proteínas biofarmacéuticas recombinantes sean aceptables para la administración a pacientes humanos, es importante que se eliminen los contaminantes residuales que resultan de los procesos de fabricación y purificación del producto biológico final. Estos contaminantes del proceso incluyen proteínas del medio de cultivo, ligandos de afinidad de inmunoglobulinas, virus, endotoxinas, ADN y proteína de célula huésped (HCP). Las HCP pueden generar una serie de efectos indeseables que pueden repercutir en el perfil de seguridad de un producto, como la respuesta inmunitaria, la actividad adyuvante, la actividad biológica directa o la interacción/degradación del producto. Estos contaminantes de las células huésped incluyen HCP específicos del proceso, que son impurezas/contaminantes relacionados con el proceso en los productos biológicos derivados de la tecnología del ADN recombinante.

Las normativas estadounidenses y extranjeras con frecuencia exigen la eliminación de tales contaminantes. Por ejemplo, la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. requiere que los biofarmacéuticos destinados al uso in vivo en el ser humano se encuentren tan libre como sea posible de inmunoglobulinas foráneas y contaminantes no inmunoglobulinas, y requiere análisis para la detección y cuantificación de posibles contaminantes, tales como las HCP. La Conferencia internacional sobre armonización (ICH, por sus siglas en inglés) proporciona directrices sobre los procedimientos de ensayo y criterios de aceptación para productos biotecnológicos/biológicos. Las directrices sugieren que para las HCP, se utilice un inmunoensayo sensible capaz de detectar un amplio abanico de impurezas proteínas. Aunque se dispone de ensayos y reactivos comerciales para detectar inmunoglobulinas, ADN, endotoxinas, virus, etc., actualmente no se dispone de reactivos o métodos analíticos comerciales para la detección y cuantificación de HCP de GS-CHO específicas de línea celular en el presente documento,.

DEFINICIONES

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan el mismo significado al entendido habitualmente por el experto habitual en la materia a la que se refiere la invención. Aunque pueden utilizarse cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica y/o para el ensayo de la presente invención, en el presente documento se describen los materiales y métodos preferentes. En la descripción y reivindicación de la presente invención, se utilizará la siguiente terminología según la definición que se proporcione, cuando exista una definición.

Debe entenderse, además, que la terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describe únicamente formas de realización particulares y no pretende ser limitativa.

Los artículos “un” y “una” o “el” y “ la” se utilizan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A título de ejemplo, “una célula” puede referirse a una célula o a más de una célula.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “proteína de célula huésped” o “HCP” se refiere a cualquier proteína producida o codificada por el organismo utilizado para producir un producto polipéptido recombinante y no relacionado con el producto recombinante deseado. Las HCP no son deseables en la sustancia farmacéutica final.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “GS-CHO” se refiere a una célula de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) que expresa una glutatión sintetasa (GS) recombinante, por ejemplo, una GS de CHO-K1SV (Lonza Biologics, Inc.).

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “HCP de GS-CHO” se refiere a una proteína de células huésped derivada de una célula GS-CHO.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “endógeno” se refiere a cualquier material procedente de, o naturalmente producido en,, un organismo, célula, tejido o sistema.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “exógeno” se refiere a cualquier material introducido o producido fuera de un organismo, célula, tejido o sistema. De acuerdo con ello, “ácido nucleico exógeno” e refiere a un ácido nucleico que se introduce o produce fuera de un organismo, célula, tejido o sistema. En una forma de realización, las secuencias del ácido nucleico exógeno no son producidas naturalmente, o no pueden encontrarse naturalmente, dentro del organismo, célula, tejido o sistema en el que se ha introducido el ácido nucleico exógeno. En una forma de realización, las secuencias de los ácidos nucleicos exógenos son secuencias de origen no natural, o son codificantes de productos que no se encuentran naturalmente.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “heterólogo” se refiere a cualquier material de una especie, una vez introducido en un organismo, célula, tejido o sistema de una especie diferente.

Tal como se utiliza en el presente documento, las expresiones “ácido nucleico”, “polinucleótido” o “molécula de ácido nucleico” se utilizan indistintamente y se refieren a ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), o una combinación de un ADN o ARN de los mismos y polímeros de los mismos en forma de cadena sencilla o de doble cadena. La expresión “ácido nucleico” incluye, aunque sin limitación a ellos, un gen, ADNc o un ARNm. La molécula de ácido nucleico puede ser sintética (p. ej., sintetizada químicamente o artificial) o recombinante. A menos que se limite específicamente, la expresión comprende moléculas que contienen análogos o derivados de nucleótidos naturales que presentan propiedades de unión similares a ellas del ácido nucleico de referencia y que son metabolizadas de una manera similar a los nucleótidos de origen natural o no natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de ácido nucleico también comprende implícitamente variantes modificadas conservadoramente de la misma (p. ej., sustituciones degeneradas de codones), alelos, ortólogos, los SNP, y secuencias complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, pueden conseguirse sustituciones degeneradas de codones mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos ellos) se sustituye por residuos de base mixta y/o de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Tal como se utiliza en el presente documento, los términos “péptido”, “polipéptido” y “proteína” se utilizan indistintamente, y se refieren a un compuesto que comprende residuos aminoácidos unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos, o mediante otros medios diferentes de enlaces peptídicos. Una proteína o péptido debe contener por lo menos dos aminoácidos, y no hay limitado en cuanto al número máximo de aminoácidos que puede comprender una secuencia de proteína o péptido. Una proteína puede comprender más de un, p. ej., dos, tres, cuatro, cinco o más polipéptidos, en donde cada polipéptido está asociado a otro mediante enlaces/interacciones covalentes o no covalentes. Entre los polipéptidos se incluyen cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o medios distintos de enlaces peptídicos. Tal como se utiliza en el presente documento, el término se refiere tanto a cadenas cortas, que también se denominan habitualmente en la técnica “péptidos”, “oligopéptidos” y “oligómeros”, por ejemplo, y a cadenas más largas, que generalmente se denominan en la técnica “proteínas”, de las que existen muchos tipos. Entre los “polipéptidos” se incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros.

Como se usa en el presente documento, producto se refiere a una molécula, ácido nucleico, polipéptido, o cualquier híbrido de estos, que se produce, por ejemplo, mediante una célula que ha sido modificada o diseñada para producir el producto. En una forma de realización, el producto es un producto de origen natural o artificial, por ejemplo, un producto sintético. Una parte del producto puede ser de origen natural, mientras que otra parte del producto puede ser de origen artificial. El producto puede ser un polipéptido, por ejemplo, un polipéptido recombinante. El producto puede ser adecuado para diagnóstico o uso preclínico. El producto puede ser adecuado para uso terapéutico, por ejemplo, para el tratamiento de una enfermedad. El producto puede seleccionarse de la Tabla 1 o Tabla 2. Las células modificadas o diseñadas pueden comprender un ácido nucleico exógeno que controla la expresión o codifica el producto. Las células modificadas o diseñadas pueden comprender otras moléculas, por ejemplo, que no son ácidos nucleicos, que controla la expresión o construcción del producto en la célula.

La modificación de la célula puede comprender la introducción de un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que controla o altera, por ejemplo, aumenta, la expresión de una secuencia de ácido nucleico endógeno, por ejemplo, gen endógeno. La célula modificada puede producir un producto polipéptido endógeno que la célula expresa de forma natural o endógena, pero la modificación aumenta la producción del producto y/o la calidad del producto en comparación con una célula no modificada, por ejemplo, en comparación con la producción endógena o la calidad del polipéptido.

La modificación de la célula puede comprender la introducción de un ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante como se describe en la presente. La célula modificada puede producir un producto polipéptido recombinante que puede ser de origen natural o artificial. La célula modificada puede producir un producto polipéptido recombinante que puede además ser expresado endógenamente mediante la célula o no. Donde la célula expresa de forma natural o endógena el producto polipéptido recombinante, pero la modificación puede aumentar la producción del producto y/o la calidad del producto en comparación con una célula no modificada, por ejemplo, en comparación con la producción endógena o la calidad del polipéptido.

Como se usa en el presente documento, polipéptido recombinante o proteína recombinante se refiere a un polipéptido que puede estar producirse mediante una célula descrita en la presente. Un polipéptido recombinante es aquel en el que al menos un nucleótido de la secuencia que codifica el polipéptido, o al menos un nucleótido de una secuencia que controla la expresión del polipéptido, se ha formado mediante ingeniería genética (de la célula o de una célula precursora). Por ejemplo, se ha alterado al menos un nucleótido, por ejemplo, se ha introducido en la célula o es el producto de un reordenamiento por ingeniería genética. En una forma de realización, la secuencia de un polipéptido recombinante no difiere de una isoforma natural del polipéptido o proteína. La secuencia de aminoácidos del polipéptido recombinante puede diferir de la secuencia de una isoforma natural del polipéptido o proteína. El polipéptido recombinante y la célula son de la misma especie. El polipéptido recombinante puede ser endógeno a la célula, es decir, la célula es de una primera especie y el polipéptido recombinante es nativo de esa primera especie. La secuencia de aminoácidos del polipéptido recombinante puede ser igual o sustancialmente igual a, o diferir por no más que 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % de un polipéptido codificado por el genoma endógeno de la célula. El polipéptido recombinante y la célula pueden ser de especies distintas, por ejemplo, el polipéptido recombinante es un polipéptido humano y la célula no es humana, por ejemplo, es de roedor, por ejemplo, un CHO, o una célula de insecto. El polipéptido recombinante puede ser exógeno a la célula, es decir, la célula es de una primera especie y el polipéptido recombinante es de una segunda especie. El polipéptido puede ser un polipéptido sintético. El polipéptido puede estar derivado de una fuente que es de origen artificial. El polipéptido recombinante puede ser un polipéptido o proteína humana que no difiera en la secuencia de aminoácidos de una isoforma natural del polipéptido o proteína humana. El polipéptido recombinante puede diferir de una isoforma natural del polipéptido humano o proteína a no más de 1,2, 3, 4, 5, 10, 15 o 20 residuos aminoácidos. El polipéptido recombinante puede diferir de una isoforma natural del polipéptido humano por no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 15 % de sus residuos aminoácidos.

"Adquirir" o "adquirir", tal y como se utilizan estos términos en el presente documento, se refiere a obtener la posesión de una entidad física o un valor, por ejemplo, un valor numérico, mediante la "adquisición directa" o la "adquisición indirecta" de la entidad física o el valor. "Adquirir directamente" significa realizar un procedimiento (por ejemplo, llevar a cabo un método sintético o analítico) para obtener la entidad física o el valor. "Adquirir indirectamente" se refiere a recibir la entidad física o el valor de otra parte o fuente (por ejemplo, un laboratorio tercero que adquirió directamente la entidad física o el valor). La adquisición directa de una entidad física incluye la realización de un proceso que incluye un cambio físico en una sustancia física, por ejemplo, un material de partida. Los cambios de ejemplo incluyen la fabricación de una entidad física a partir de dos o más materiales de partida, el cizallamiento o fragmentación de una sustancia, la separación o purificación de una sustancia, la combinación de dos o más entidades separadas en una mezcla, la realización de una reacción química que incluya la ruptura o formación de un enlace covalente o no covalente. La adquisición directa de un valor incluye la realización de un proceso que incluye un cambio físico en una muestra u otra sustancia, por ejemplo, la realización de un proceso analítico que incluye un cambio físico en una sustancia, por ejemplo, una muestra, un analito o un reactivo (a veces denominado en la presente "análisis físico"), la realización de un método analítico, por ejemplo, un método que incluye uno o más de los siguientes: separar o purificar una sustancia, por ejemplo, separar o purificar una sustancia, por ejemplo, un analito, un fragmento u otro derivado del mismo, de otra sustancia; combinar un analito, un fragmento u otro derivado del mismo, con otra sustancia, por ejemplo, un amortiguador, un solvente o un reactivo; o modificar la estructura de un analito, un fragmento u otro derivado del mismo, por ejemplo rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente, entre un primer y un segundo átomo del analito; o cambiando la estructura de un reactivo, o un fragmento u otro derivado de este, por ejemplo, rompiendo o formando un enlace covalente o no covalente, entre un primer y un segundo átomo del reactivo.

"Adquirir una muestra", tal y como se utiliza el término en el presente documento, se refiere a obtener la posesión de una muestra, por ejemplo, una muestra de tejido o una muestra de ácido nucleico, mediante la "adquisición directa" o la "adquisición indirecta" de la muestra. "Adquirir directamente una muestra" significa realizar un proceso (por ejemplo, llevar a cabo un método físico como una operación o extracción) para obtener la muestra. "Adquirir indirectamente una muestra" se refiere a recibir la muestra de otra parte o fuente (por ejemplo, un laboratorio tercero que adquirió directamente la muestra). La adquisición directa de una muestra incluye la realización de un proceso que incluye un cambio físico en una sustancia física, por ejemplo, un material de partida, tal como un tejido, por ejemplo, un tejido en un paciente humano o un tejido que ha sido aislado previamente de un paciente. Los cambios de ejemplo incluyen la fabricación de una entidad física a partir de un material de partida, la disección o raspado de un tejido; la separación o purificación de una sustancia (por ejemplo, una muestra de tejido o una muestra de ácido nucleico); la combinación de dos o más entidades separadas en una mezcla; la realización de una reacción química que incluya la ruptura o formación de un enlace covalente o no covalente. La adquisición directa de una muestra incluye la realización de un proceso que incluye un cambio físico en una muestra u otra sustancia, por ejemplo, como se describió anteriormente.

"Etapa de procesamiento posterior", tal como se utiliza el término en el presente documento, se refiere a cualquier etapa del procedimiento de producción del polipéptido recombinante que sigue después/posterior a una etapa de separación elegida, por ejemplo, después/posterior a la separación de las células de los medios que contienen el producto proteico recombinante.

"Etapa de procesamiento anterior", tal como se utiliza el término en el presente documento, se refiere a cualquier etapa del procedimiento de producción del polipéptido recombinante que precede o es anterior a una etapa de separación elegida, por ejemplo, antes de la separación del producto proteico recombinante de los medios que contienen células.

"Producto final", tal como se utiliza el término en el presente documento, se refiere a un polipéptido recombinante sustancialmente purificado de otros componentes celulares. Un producto final puede ser un polipéptido recombinante formulado para su almacenamiento, envío y/o uso como medicamento.

"Procedimiento de producción", tal como se utiliza el término en el presente documento, se refiere a un método o series de etapas que produce un polipéptido recombinante. Un procedimiento de producción puede ser un proceso de fabricación diseñado para producir un polipéptido recombinante. Un procedimiento de producción puede ser un método para purificar un polipéptido recombinante. Un procedimiento de producción puede comprender además etapas de evaluación, etapas de análisis y/o etapas de determinación basadas en dicha evaluación y análisis. El producto final de un procedimiento de producción puede ser un polipéptido recombinante formulado para su uso como medicamento.

DESCRIPCIÓN GENERAL DE LOS PROCEDIMIENTOS

La siguiente descripción de los métodos analíticos no forma parte del objeto reivindicado. Los métodos descritos en la presente pueden caracterizarse como un ensayo inmunoenzimático (ELISA). El método general de un ELISA y las variaciones ELISA son conocidos por el experto en la materia. La siguiente es una descripción general de los métodos descritos en la presente únicamente para ilustrar la cronología de las etapas implicadas en los métodos. Los componentes se describen a título meramente ilustrativo.

Un agente de recubrimiento (por ejemplo, anticuerpo anti-HCP GS-CHO) se inmoviliza sobre un sostén sólido (por ejemplo, una placa de microtitulación). Una vez que el agente de recubrimiento se ha inmovilizado en el soporte sólido, los sitios de unión restantes en el soporte sólido se bloquean utilizando un amortiguador de bloqueo (por ejemplo, 0,2 % de caseína en 1X DPBS). El amortiguador de bloqueo contiene un componente capaz de unirse de forma no específica al soporte sólido para saturar los sitios de unión abiertos, impidiendo así la unión del ligando libre a cualquier sitio sobrante del soporte sólido. Las condiciones específicas de los períodos de incubación de recubrimiento y bloqueo se seleccionan para maximizar el recubrimiento del sostén sólido; y las variaciones son conocidas por las personas del oficio de nivel medio. Después de recubrir y bloquear el soporte sólido, los estándares y/o las muestras (por ejemplo, las muestras que se están analizando para HCP) que se van a analizar se diluyen adecuadamente en un amortiguador de dilución adecuado (por ejemplo, 0,2 % de caseína en 1X DPBS) y se añaden al soporte inmovilizado. Las condiciones específicas del período de incubación estándar/muestra se seleccionan para maximizar la sensibilidad del ensayo y minimizar la disociación; las variaciones son conocidas por las personas del oficio de nivel medio.

Cualquier estándar/muestra no inmovilizada (por ejemplo, HCP) se elimina lavando el soporte sólido con un amortiguador de lavado adecuado (por ejemplo, Tween® 20 al 0,05 % en DPBS 1X), un número adecuado de veces (por ejemplo, 3X con 300 ml). El amortiguador de lavado específico y el número de lavados en cualquier etapa de lavado se seleccionan para minimizar el fondo y maximizar la sensibilidad; y las variaciones son conocidas por las personas del oficio de nivel medio. Cualquier estándar/muestra inmovilizada puede entonces detectarse indirecta o directamente. Para la detección indirecta, se añade al soporte sólido un anticuerpo (anticuerpo primario) contra el antígeno de interés en el patrón/muestra (por ejemplo, anticuerpo anti-HCP HCP GS-CHO); y se seleccionan las condiciones de incubación para maximizar la amplificación de la señal. A continuación, se elimina cualquier anticuerpo no inmovilizado lavando el soporte sólido con un amortiguador de lavado adecuado, un número adecuado de veces. A continuación, se añade al soporte sólido un anticuerpo conjugado con una fracción detectable por algún medio (anticuerpo detector) y capaz de unirse al estándar inmovilizado o al HCP de la muestra. A continuación, se elimina cualquier anticuerpo detector no unido lavando el sostén sólido con un amortiguador de lavado adecuado, un número adecuado de veces. El nivel del antígeno de interés en el estándar/muestra (por ejemplo, HCP) unido al agente de recubrimiento puede determinarse utilizando un sistema de detección compatible con el anticuerpo de detección empleado. Los medios de detección adecuados serán conocidos para El experto en la materia.

En el caso de que se emplee la detección directa del antígeno de interés en el estándar/muestra, el anticuerpo primario se conjuga con una fracción detectable por algún medio y, por tanto, es también el anticuerpo detector, es decir, el anticuerpo primario y el anticuerpo detector son el mismo. A continuación, se elimina cualquier anticuerpo detector no unido lavando el sostén sólido con un amortiguador de lavado adecuado, un número adecuado de veces. El nivel del antígeno de interés en el estándar/muestra (por ejemplo, HCP) unido al agente de recubrimiento puede determinarse utilizando un sistema de detección compatible con el anticuerpo principal/de detección empleado. Un sistema de detección adecuados será conocido para El experto en la materia.

Los resultados demuestran, entre otras cosas, un ensayo de plataforma ELISA HCP robusto y sensible para sostener múltiples sistemas de expresión de células huésped, incluyendo, por ejemplo, el sistema de expresión CHOK1SV y el sistema de expresión GS-CHO. La sensibilidad mejorada del ensayo ELISA es al menos unas 40 veces mejor que la de un método ELISA HCP que no utilice el anticuerpo policlonal HCP purificado como se describe en la presente. Durante la purificación del anticuerpo HCP, más del 99% de las IgG totales no mostraron inmunorrespuesta al HCP y, por lo tanto, se eliminaron del anticuerpo HCP final. Dado que no existen estándares de cuantificación exactamente adaptados entre la industria y la normativa, la sensibilidad del ensayo HCP es específica para la línea celular y el proceso. Los métodos descritos en la presente pueden utilizarse para generar un ensayo de plataforma ELISA de HCP robusto y sensible para cualquier célula huésped recombinante, incluyendo pero sin limitarse a, por ejemplo, células huésped de mamífero (por ejemplo, CHO, por ejemplo, GS-CHO), célula huésped eucariota, células huésped procariotas, célula de insecto. Además, estos métodos pueden utilizarse junto con los requisitos reglamentarios para la producción de proteínas recombinantes.

El ensayo ELISA de HCP demuestra una exactitud, precisión y linealidad aceptables para una detección robusta y fiable de HCP en rangos de concentración que comprenden 0,1-100, 0,5-100, 1-100, 1,5-100, 2-100, 2,5-100, 3-100, 0. 1-90, 0,5-90, 1-90, 1,5-90, 2-90, 2,5-90, 3-90, 0,1-80, 0,5-80, 1-80, 1,5-80, 2-80, 2,5-80, 3-80, 0,1-70, 0,5-70, 1-70, 1,5-70, 2-70, 2,5-70, 3-70, 0,1-60, 0,5-60, 1-60, 1,5-60, 2-60, 2,5-60 o 3-60 ng/ml. El ensayo ELISA HCP puede demostrar una exactitud, precisión y linealidad aceptables para una detección robusta y fiable de HCP en un rango de concentración que comprende de 2 a 60 ng/ml. El ensayo ELISA de HCP puede demostrar una exactitud, precisión y linealidad aceptables para una detección robusta y fiable de HCP en un rango de concentración que comprende de 3 a 80 ng/ml. El límite de detección del ensayo EL<i>S<a>de HCP puede ser de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 ng/ml. El límite de detección del ensayo ELISA de HCP puede ser de 0,5 ng/ml. El límite de detección del ensayo ELISA de HCP puede ser de 2 ng/ml. El límite de cuantificación del ensayo ELISA de HCP puede ser de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 ng/ml. El límite de detección del ensayo ELISA de HCP puede ser de 3 ng/ml.

ANTICUERPOS ANTI-HCP GS-CHO

Los métodos descritos en la presente pueden proporcionar un anticuerpo anti-HCP GS-CHO para la detección de HCP. Los anticuerpos anti-HCP GS-CHo pueden fabricarse mediante técnicas estándar de biología molecular. El método de producción de una preparación policlonal de anticuerpos antiproteína de células huésped (HCP) de la invención comprende:

a)<adquirir una muestra que comprenda anticuerpos de un animal inmunizado con HCP de una célula huésped;>b) separar los anticuerpos de la muestra poniéndola en contacto con un reactivo de afinidad de proteína A para obtener una preparación de anticuerpos; y

c) separar el anticuerpo anti-HCP de la preparación de anticuerpos poniendo en contacto la preparación de anticuerpos con un reactivo de afinidad de HCP que comprenda HCP acoplado a un sustrato;

produciendo así una preparación policlonal de anticuerpos anti-HCP.

Los anticuerpos pueden derivarse de cualquier especie. En algunas formas de realización, el animal inmunizado con HCP de una célula huésped es una oveja. Los anticuerpos pueden ser directamente detectables mediante la unión de una etiqueta detectable, por ejemplo, una modificación química, conjugación enzimática, etiquetado con colorante fluorescente, etiquetado por luminiscencia, etc. Los anticuerpos también pueden no ser directamente detectables y requerir un medio secundario para su detección.

MUESTRAS

Las muestras pueden incluir, pero no se limitan a, muestras tomadas de un cultivo celular en cualquier periodo durante la producción de la proteína recombinante, por ejemplo, cualquier punto durante el procesamiento ascendente o descendente. Por ejemplo, las muestras pueden tomarse de un cultivo celular (por ejemplo, antes de la separación del producto proteico recombinante). Las muestras pueden tomarse durante el proceso de transformación posterior, por ejemplo, tras la separación de las células del medio que contiene el producto proteico recombinante. Se puede tomar una muestra en cualquier momento del proceso de purificación. Una muestra puede incluir una muestra del producto final. Por consiguiente, las muestras pueden incluir tanto productos en proceso (antes de la formulación final) como productos finales (por ejemplo, productos formulados finales después de todas las etapas de purificación).

SOPORTE SÓLIDO

Los soportes sólidos pueden incluir cualquier superficie sobre la que se pueda inmovilizar un agente de recubrimiento, por ejemplo, anticuerpo anti-HCP GS-CHO, o equivalente. Los soportes sólidos utilizados para la inmovilización pueden ser cualquier soporte o portador inerte que sea esencialmente insoluble en agua y útil en ensayos inmunométricos, incluyendo soportes en forma de, por ejemplo, superficies, partículas, matrices porosas, etc. Ejemplos de soportes comúnmente utilizados incluyen pequeñas láminas, Sephadex, cloruro de polivinilo, perlas de plástico y placas de ensayo o tubos de ensayo fabricados a partir de polietileno, polipropileno, poliestireno y similares, incluyendo placas de microtitulación de 96 pocillos, así como materiales particulados como papel de filtro, agarosa, dextrano reticulado y otros polisacáridos. Alternativamente, las matrices reactivas insolubles en agua, como los carbohidratos activados por bromuro de cianógeno, se emplean adecuadamente para la inmovilización del reactivo de recubrimiento. El agente de recubrimiento inmovilizado puede recubrirse en una placa de microtitulación, por ejemplo una placa de microtitulación de múltiples pocillos que puede utilizarse para analizar varias muestras a la vez. Las superficies sólidas de soporte también pueden incluir, entre otras, una membrana, por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa, una membrana de politetraetileno, una membrana de acetato de celulosa, una membrana de nitrato de celulosa, una superficie sólida recubierta con moléculas que contienen grupos hidrófobos, una superficie sólida recubierta con moléculas que contienen grupos hidrófilos. Las superficies sólidas de soporte pueden tener la forma de una placa de microtitulación, por ejemplo, una placa de microtitulación de poliestireno, una placa de cultivo celular o cualquier variación de estas.

REACTIVO DE CAPTURA

El término "reactivo de captura" se refiere a un anticuerpo que se une directamente al antígeno de interés (por ejemplo, HCP GS-CHO). El anticuerpo de captura también puede ser un anticuerpo de detección con modificación proteica, por ejemplo, biotinilación. Los anticuerpos pueden derivarse de diferentes especies, incluyendo pero no limitándose a, humano, conejo, ratón, rata, oveja, cabra, pollo, humano, caballo, perro, gato, hámster, mono, chimpancé, ovino, equino, porcino, bovino, primate, etc. El anticuerpo primario puede ser un anticuerpo anti-HCP GS-CHO producido en ovejas y purificado por afinidad.

REACTIVO DE DETECCIÓN

El término "reactivo de detección" o "detección reactivo" se refiere a un anticuerpo etiquetado utilizado para detectar un "antígeno" o "anticuerpo". El anticuerpo de detección también puede ser un anticuerpo principal. Los anticuerpos pueden derivarse de diferentes especies, incluyendo pero no limitándose a, humano, conejo, ratón, rata, oveja, cabra, pollo, humano, caballo, perro, gato, hámster, mono, chimpancé, ovino, equino, porcino, bovino, primate, etc. La etiqueta utilizada en el anticuerpo detector puede ser cualquier funcionalidad detectable que no interfiera con la unión del HCP al anticuerpo. Los ejemplos de etiquetas adecuadas son las numerosas etiquetas conocidas para el uso de inmunoensayos, incluidas las moléculas que pueden detectarse directamente, como las fluorocromáticas, quimioluminiscentes y radiactivas, así como las moléculas, como las enzimas, que deben reaccionar o derivatizarse para ser detectadas. Los métodos de etiquetado adecuados que pueden utilizarse en los ensayos descritos, pero no reivindicados, en la presente incluyen, entre otros, el etiquetado isotópico, la modificación química, la conjugación enzimática, el etiquetado con colorantes fluorescentes, el etiquetado por luminiscencia y otros métodos de etiquetado comúnmente conocidos por las personas del oficio de nivel medio.

Los anticuerpos comercialmente disponibles para una amplia variedad de antígenos son conocidos en la técnica. El experto en la materia conocerá diversos métodos de etiquetado de anticuerpos u otros agentes de detección. Los métodos de marcaje incluyen, entre otros, una enzima como el peróxido de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés), la fosfatasa alcalina (AP, por sus siglas en inglés), la beta-galactosidasa, la glucoamilasa, la lisozima, las oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas como la uricasa y la xantina oxidasa, acopladas a una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de colorante como la HRP lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, biotina/estreptavidina, biotina/estreptavidina-p-galactosidasa con MUG, etiquetas de espín, etiquetas de bacteriófagos, radicales libres estables u otras enzimas y similares. Un agente de detección también puede estar marcado con isótopos radiactivos, por ejemplo, 125I, 32P, 14C, 3H y 131I, u otro isótopo. Las etiquetas fluorescentes pueden incluir, entre otros, fluoróforos como los de tierras raras o la fluoresceína y sus derivados, la rodamina y sus derivados, el dansilo, la umbeliferona, las luceriferasas, por ejemplo, la luciferasa de luciérnaga y la luciferasa bacteriana (patente estadounidense N.° 4.737.456), luciferina, isotiocianato de fluorescina (FITC), rodamina, Texas Red, Alexa488, Cy5, Cy3, Alexa610, 7-AAD, yoduro de propidio, Cy7, ficoeritrina, etc. Un agente de detección puede estar marcado por un fluorocromo (un tinte fluorescente) que puede detectarse mediante un lector de placas fluorescentes, un microscopio fluorescente, un fluorómetro, una cámara o un escáner. Un agente de detección también puede ser marcado con un luminiscromo que puede ser detectado por métodos de luminiscencia. Alternativamente, un agente de detección puede ser biotina marcada, que puede unirse a avidina o estreptavidina. Como agentes de detección pueden utilizarse avidina 0 estreptavidina, que pueden unirse a biotina, anticuerpos biotinilados o polipéptidos biotinilados.

Existen métodos convencionales para unir covalentemente estos marcajes a proteínas o polipéptidos. Por ejemplo, pueden utilizarse agentes de acoplamiento como dialdehídos, carbodiimidas, dimaleimidas, bis-imidatos, bencidina bis-diazotizada y similares para marcar los anticuerpos con los marcajes fluorescentes, quimioluminiscentes y enzimáticos descritos anteriormente. Véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses N.° 3.940.475 (fluorimetría) y 3.645.090 (enzimas); Hunter et al. Nature 144:945 (1962); David et al. Biochemistry 13:1014-1021 (1974); Pain et al. J. Immunol. Methods 40:219-230 (1981); y Nygren J. Histochem. and Cytochem. 30:407-412 (1982). Los marcajes preferidas en este caso son fluorescentes para aumentar la amplificación y la sensibilidad a 8 pg/ml, más preferentemente biotina con estreptavidina-p-galactosidasa y MUG para amplificar la señal.

La conjugación de dicho marcaje, incluidas las enzimas, con el anticuerpo es un procedimiento de manipulación estándar para el experto habitual en las técnicas de inmunoensayo. Ver, por ejemplo, O'Sullivan et al. "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay," in Methods in Enzymology, ed. J. Langone y H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, New York, N.Y., 1981), pp. 147-166.

SISTEMA DE DETECCIÓN

El término "sistema de detección" se refiere a un medio que puede utilizarse para dar una lectura que comprenda información relacionada con la cantidad o cantidad relativa de una proteína o agente en una muestra. La elección de un sistema de detección depende de la elección del anticuerpo de detección utilizado. Por ejemplo, si un anticuerpo de detección está marcado con una enzima, en la que una reacción química puede dar lugar a color o a una señal de quimioluminiscencia; el sistema de detección puede incluir un sustrato adecuado y cualquier reactivo necesario asociado con la reacción química y un medio para detectar la reacción química, por ejemplo, inspección visual, un dispositivo capaz de detectar la señal, por ejemplo, un lector de placas de absorbancia, un lector de placas de quimioluminiscencia, una cámara CCD, etc.; alternativamente, si el anticuerpo de detección está marcado con fluorescencia, puede utilizarse un microscopio de fluorescencia, un lector de placas de fluorescencia, un clasificador celular de fluorescencia, un escáner de fluorescencia, una cámara, etc.; alternativamente, si el anticuerpo de detección está marcado con isótopos, puede utilizarse una película de rayos X u otro material sensible a los isótopos.

El experto en la materia conocerá diversos sistemas de detección adecuados para su uso. Estos sistemas de detección pueden incluir, por ejemplo, sistemas de detección que utilicen reacciones cromogénicas de enzimas informadoras como la peroxidasa de rábano picante (HRP) o la fosfatasa alcalina (AP) o similares. Las enzimas informadoras pueden utilizar diferentes sustratos para la detección cromogénica, por ejemplo, la HRP puede utilizar 4 CN (4-cloro-1-naftol), DAB/NiCh (3,3'-diaminobencidina/NiCh) o TMB como sustratos para la detección cromogénica. Las etiquetas fluorescentes incluyen, entre otras, luciferina, isotiocianato de fluorescina (FITC), rodamina, Texas Red, Alexa488, Cy5, Cy3, Alexa610, 7-AAD, yoduro de propidio, Cy7, ficoeritrina, etc. Para poner fin a una reacción de detección pueden utilizarse diversos y apropiados agentes de parada. El agente de detención específico utilizado dependerá del agente de detección utilizado y será conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, puede utilizarse ácido sulfúrico 1 M como sustrato de parada para los sistemas de detección que utilizan la enzima peroxidasa de rábano picante.

TAMPONES DE BLOQUEO

Pueden utilizarse tampones de bloqueo para bloquear los sitios de unión restantes en el soporte sólido tras la incubación con el agente de recubrimiento. Los ejemplos de tapones de bloqueo pueden incluir, entre otros, caseína, por ejemplo, caseína en 1XPBS, 0,1-1 % de caseína en 1XPBS, 0,1-0,5 % de caseína en 1XPBS, 0,2 % de caseína en 1XPBS; BSA, por ejemplo, BSA en 1XPBS, por ejemplo, 1 % de BSA en 1XPBS, 1-10 % de BSA en 1XPBS, 1-20 % de BSA en 1XPBS, 1-50 % de BSA en 1XPBS; leche descremada, gelatina de pescado u otro reactivo químico. Cualquiera de los reactivos descritos anteriormente u otro reactivo químico adecuado puede diluirse en cualquier amortiguador adecuado, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina tamponada con tris (TBS).

Se pueden utilizar tampones de lavado para eliminar los componentes no unidos en varias etapas. Ejemplos de tampones de lavado incluyen, pero no se limitan a, caseína, por ejemplo, caseína en 1XPBS, 0,1-1 % caseína en 1XPBS, 0,1-0,5% caseína en 1XPBS, 0,2% caseína en 1XPBS; BSA, por ejemplo, BSA en 1XPBS, por ejemplo, 1 % de BSA en 1XPBS, 1-10 % de BSA en 1XPBS, 1-20 % de BSA en 1XPBS, 1-50 % de BSA en 1XPBS; BSA en 1XPBS que contiene Tween® 20, por ejemplo, BSA en 1XPBS que contenga 0,05 % de Tween® 20, 1 % de BSA en 1XPBS que contenga 0,05 % de Tween® 20, 1 % de BSA en 1XPBS que contenga 0,05-1 % de Tween® 20; Tween® 20, por ejemplo, Tween® 20 en 1XPBS, por ejemplo, 0,05 % de Tween® 20 en 1XPBS; leche descremada, caseína, gelatina de pescado u otro reactivo químico. Los tampones de lavado pueden incluir cualquiera de los siguientes BSA, leche descremada, caseína, gelatina de pescado u otro agente químico en solución con Triton X 100 o Tween® 20 o similares. Estas soluciones pueden diluirse en cualquier amortiguador adecuado, incluidos, entre otros, solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina tamponada con tris (TBS).

Las etapas de lavado pueden realizarse varias veces, y dependerán del amortiguador de lavado empleado. Por ejemplo, las etapas de lavado pueden repetirse una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez veces en un periodo de lavado determinado. El experto en la materia podrá determinar la cantidad de etapas de lavado necesarias en función del amortiguador de lavado utilizado y otras condiciones experimentales.

El experto en la materia conocerá los amortiguadores utilizados para diluir cualquier estándar, muestra, anticuerpo o agente de detección y pueden incluir, entre otros, caseína, por ejemplo, caseína en 1XPBS, 0,1-1 % de caseína en 1XPBS, 0,1-0,5 % de caseína en 1XPBS, 0,2 % de caseína en 1XPBS; BSA, por ejemplo, BSA en 1XPBS, por ejemplo, 1 % de BSA en 1XPBS, 1-10 % de BSA en 1XPBS, 1-20 % de BSA en 1XPBS, 1-50 % de BSA en 1XPBS; leche descremada, caseína, gelatina de pescado u otro reactivo químico. En algunos casos, el amortiguador utilizado para diluir cualquier estándar, muestra, anticuerpo o agente de detección será el mismo agente utilizado como amortiguador de bloqueo.

PERÍODOS Y TEMPERATURAS DE INCUBACIÓN

El experto en la materia puede determinar los períodos de incubación adecuados para las distintas etapas. El período de tiempo para una etapa de incubación específica puede alterarse debido a un cambio en la temperatura de la etapa de incubación, y asimismo un cambio en el tiempo de una etapa de incubación puede requerir un cambio en la temperatura de la etapa de incubación. La etapa de recubrimiento puede llevarse a cabo, por ejemplo, durante la noche a o a alrededor de 4 °C, durante la noche a o a alrededor de 2-10 °C, durante 4 horas a o a alrededor de 37 °C, durante 2-4 horas a o a alrededor de 37 °C, durante 1-4 horas a o a alrededor de 37 °C, durante 4 horas a o a alrededor de 32 °C, durante 2-4 horas a o a alrededor de 32 °C, durante 1-4 horas a o a alrededor de 32 °C. La etapa de bloqueo puede llevarse a cabo, por ejemplo, durante 1 hora a o a alrededor de 32 °C; 1-2 horas a 32 °C o aproximadamente 32 °C; toda la noche a 4 °C o aproximadamente 4 °C. La etapa de incubación del estándar/muestra puede llevarse a cabo, por ejemplo, durante 2 horas a o alrededor de 32 °C; 1-2 horas a o alrededor de 32°C; toda la noche a o alrededor de 4°C. El paso de incubación del anticuerpo primario o del anticuerpo primario/detector puede llevarse a cabo, por ejemplo, durante 1 hora a o a alrededor de 32 °C; 1a 2 horas a 32 °Co aproximadamente 32 °C; toda la noche a 4 °C o aproximadamente 4 °C. El periodo de incubación y la temperatura de cualquier sistema de detección dependerán del anticuerpo de detección exacto empleado, y serán conocidos por las personas del oficio de nivel medio.

KITS

Los kits que comprenden uno o más componentes útiles para llevar a cabo los métodos descritos en la presente pueden incluir, entre otros, cualquier componente, reactivo o material necesario para llevar a cabo los métodos descritos en el presente documento, y/o instrucciones para llevar a cabo los métodos descritos en la presente. El kit puede incluir opcionalmente cualquier agente de lavado adicional, recipientes de incubación, superficies sólidas de apoyo y similares para llevar a cabo los métodos descritos en la presente.

El kit puede comprender un soporte sólido para los agentes de recubrimiento, que puede proporcionarse como elemento separado o sobre el que los agentes de recubrimiento ya están inmovilizados. Por lo tanto, el agente de recubrimiento en el kit puede ser inmovilizado en un soporte sólido, o pueden ser inmovilizados en dicho soporte que se incluye con el kit o proporcionado por separado del kit. Los agentes de recubrimiento pueden recubrirse en una placa de microtitulación. El anticuerpo primario puede ser marcado o no marcado. El anticuerpo primario puede estar marcado y también estar en el anticuerpo detector. Cuando la etiqueta es una enzima, el kit puede incluir sustratos y cofactores requeridos por la enzima, y cuando la etiqueta es un fluoróforo, el kit puede incluir un precursor de colorante que proporcione el cromóforo detectable. El kit también puede contener instrucciones para realizar el ensayo y/o un estándar de referencia, así como otros aditivos como estabilizadores, amortiguadores de lavado e incubación y similares.

PRODUCTOS Y ÁCIDOS NUCLEICOS QUE LOS CODIFICAN

Se divulgan, pero no se reivindican, métodos para identificar, seleccionar o fabricar una célula o línea celular capaz de producir un producto. Los productos pueden incluir, entre otros, moléculas, ácidos nucleicos, polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos recombinantes), o híbridos de estos, que pueden ser producidos, por ejemplo, expresados en una célula. Las células pueden diseñarse o modificarse para producir el producto. Dichas modificaciones incluyen la introducción de moléculas que controlan o dan lugar a la producción del producto. Por ejemplo, se modifica una célula introduciendo un ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido, por ejemplo, un polipéptido recombinante, y se cultiva la célula en condiciones adecuadas para la producción, por ejemplo, expresión y secreción, del polipéptido, por ejemplo, del polipéptido recombinante. En otro ejemplo, una célula se modifica mediante la introducción de un ácido nucleico exógeno que controla, por ejemplo, aumenta, la expresión de un polipéptido que es expresado endógenamente por la célula, de tal manera que la célula produce un mayor nivel o cantidad del polipéptido que el nivel o cantidad que se produce endógenamente, por ejemplo, en una célula no modificada.

La célula o línea celular identificada, seleccionada o generada por los métodos descritos en la presente puede producir un producto, por ejemplo, un polipéptido recombinante, útil en el tratamiento de una afección médica, trastorno o enfermedad. Entre los ejemplos de afecciones, trastornos o enfermedades se incluyen, entre otros, enfermedades o trastornos metabólicos (por ejemplo, deficiencias de enzimas metabólicas), trastornos endocrinos (por ejemplo, deficiencias hormonales), hemostasia, trombosis, trastornos hematopoyéticos, trastornos pulmonares, trastornos gastrointestinales, inmunorregulación (por ejemplo, inmunodeficiencia), infertilidad, trasplantes, cáncer y enfermedades infecciosas.

El producto puede ser una proteína exógena, por ejemplo, una proteína que la célula no expresa de forma natural. El producto puede ser una proteína terapéutica o una proteína de diagnóstico, por ejemplo, útil para el cribado de fármacos. La proteína terapéutica o de diagnóstico puede ser una molécula de anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, una proteína de fusión, una hormona, una citocina, un factor de crecimiento, una enzima, una glicoproteína, una lipoproteína, una proteína informadora, un péptido terapéutico, o un fragmento estructural y/o funcional o híbrido de cualquiera de estos.

El producto, por ejemplo, el polipéptido recombinante, puede ser una molécula de anticuerpo. Los productos pueden incluir moléculas de anticuerpos terapéuticos y de diagnóstico. Una molécula de anticuerpo de diagnóstico incluye un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo de este, útil para técnicas de imagen. Una molécula de anticuerpo terapéutico es adecuada para su administración a sujetos, por ejemplo, para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno.

Una molécula de anticuerpo es una proteína o secuencia polipeptídica derivada de una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno. La molécula de anticuerpo puede ser un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de anticuerpo. Los anticuerpos y las proteínas multiformes pueden ser policlonales o monoclonales, de cadena múltiple o simple, o inmunoglobulinas intactas, y pueden derivar de fuentes naturales o de fuentes recombinantes. Los anticuerpos pueden ser tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humano o humanizado. El anticuerpo puede ser un anticuerpo IgA, IgG, IgD o IgE. El anticuerpo puede ser un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

"Fragmento de anticuerpo" se refiere al menos a una porción de un anticuerpo intacto, o variantes recombinantes de este, y se refiere al dominio de unión al antígeno, por ejemplo, una región variable determinante antigénica de un anticuerpo intacto, que es suficiente para conferir reconocimiento y unión específica del fragmento de anticuerpo a un objetivo, tal como un antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, entre otros, fragmentos Fab, Fab', F(ab')<2>y Fv, fragmentos de anticuerpos scFv, anticuerpos lineales, anticuerpos de dominio único como sdAb (ya sea VL o VH), dominios VHH de camélidos y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos como un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región de bisagra y un CDR aislado u otros fragmentos de unión a epítopos de un anticuerpo. Un fragmento de unión a antígeno también se puede incorporar en anticuerpos de dominio único, maxicuerpos, minicuerpos, nanocuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (ver, por ejemplo, Hollinger y Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Los fragmentos de unión a antígeno también se pueden injertar en soportes basados en polipéptidos tales como fibronectina tipo III (Fn3) (ver la patente estadounidense N.°: 6.703.199, que describe minicuerpos de polipéptido de fibronectina).

En las tablas siguientes se proporcionan productos de ejemplo, por ejemplo, polipéptidos, por ejemplo, polipéptidos recombinantes, producidos en los métodos o células descritos en la presente.

Tabla 1. Productos de ejemplo

(continuación)

El producto también puede ser una molécula biespecífica. Las moléculas biespecíficas, tal como se describen en el presente documento, incluyen moléculas que pueden unirse a dos o más antígenos o dianas distintos. Una molécula biespecífica puede comprender fragmentos de anticuerpos. La molécula biespecífica puede comprender un anticuerpo biespecífico, una proteína de fusión de anticuerpos biespecíficos o un conjugado de anticuerpos biespecíficos, una molécula Bi-specific T cell Engager (BiTE), una molécula Dual Affinity Re-Targeting (DART), una molécula Dual Action Fab (DAF), un nanocuerpo u otra disposición de fragmentos de anticuerpos que dé lugar a una molécula con capacidad para reconocer o unirse a dos antígenos distintos.

Tabla 2. Productos de ejemplo, por ejemplo, moléculas biespecíficas

(continuación)

Otras proteínas terapéuticas o de diagnóstico de ejemplo incluyen, entre otras, cualquier proteína descrita en las Tablas 1 a 10 de Leader et al., "Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification", Nature Reviews Drug Discovery, 2008, 7:21-39; o cualquier conjugado, variante, análogo o fragmento funcional de los polipéptidos recombinantes descritos en la presente.

Otros productos recombinantes incluyen andamiajes no anticuerpos o andamiajes proteínicos alternativos, tales como, pero no limitados a: DARPins, aficuerpos y adnectinas. Dichos andamiajes no anticuerpos o andamiajes proteicos alternativos pueden diseñarse para reconocer o unirse a una o dos, o más, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5 o más, dianas o antígenos diferentes.

También se divulgan, pero no se reivindican, ácidos nucleicos, por ejemplo, ácidos nucleicos exógenos que codifican los productos, por ejemplo, polipéptidos, por ejemplo, polipéptidos recombinantes descritos en la presente. Las secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos recombinantes deseados pueden obtenerse utilizando métodos recombinantes conocidos en la técnica, como, por ejemplo, mediante el cribado de bibliotecas de células que expresan la secuencia de ácido nucleico deseada, por ejemplo, gen, derivando la secuencia de ácido nucleico de un vector conocido por incluir la misma, o aislando directamente de células y tejidos que contienen la misma, utilizando técnicas estándar. Alternativamente, el ácido nucleico que codifica el polipéptido recombinante puede producirse sintéticamente, en lugar de clonarse. Las técnicas y la tecnología del ADN recombinante son muy avanzadas y están bien establecidas en la técnica. Por consiguiente, la persona del oficio de nivel medio que conozca la secuencia de aminoácidos de un polipéptido recombinante descrito en la presente puede prever o generar fácilmente la secuencia de ácido nucleico que codificaría el polipéptido recombinante.

El ácido nucleico exógeno puede controlar la expresión de un producto expresado endógenamente por la célula huésped. El ácido nucleico exógeno puede comprender entonces una o más secuencias de ácido nucleico que aumentan la expresión del producto endógeno (también denominada en la presente "secuencia de transactivación del producto endógeno"). Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que aumenta la expresión de un producto endógeno comprende un promotor constitutivamente activo o un promotor que es más fuerte, por ejemplo, aumenta la transcripción en el sitio deseado, por ejemplo, aumenta la expresión del producto génico endógeno deseado. Tras la introducción del ácido nucleico exógeno que comprende la secuencia de transactivación del producto endógeno, dicho ácido nucleico exógeno se integra en el genoma cromosómico de la célula, por ejemplo, en una localización preseleccionada proximal a la secuencia genómica que codifica el producto endógeno, de forma que la secuencia de transactivación del producto endógeno aumenta la transactivación o expresión del producto endógeno deseado. Otros métodos para modificar una célula, por ejemplo, introduciendo un ácido nucleico exógeno, para aumentar la expresión de un producto endógeno se describe, por ejemplo, en la Patente estadounidense. N.° 5.272.071.

La expresión de un producto descrito en la presente se consigue normalmente uniendo de forma operable un ácido nucleico que codifica el polipéptido recombinante o partes de este a un promotor, e incorporando la construcción a un vector de expresión. Los vectores pueden ser adecuados para la replicación e integración de eucariotas o procariotas. Los vectores de clonación típicos contienen otros elementos reguladores, como terminadores de transcripción y traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para regular la expresión de la secuencia de ácido nucleico deseada.

Las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente que codifican un producto, por ejemplo, un polipéptido recombinante, o que comprenden una secuencia de ácido nucleico que puede controlar la expresión de un producto endógeno, pueden clonarse en varios tipos de vectores. Por ejemplo, el ácido nucleico puede clonarse en un vector que incluya, entre otros, un plásmido, un fagémido, un derivado de fago, un virus animal y un cósmido. Los vectores de particular interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de secuenciación. El vector de expresión puede proporcionarse a una célula en forma de vector viral. La tecnología de vectores virales es bien conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY, y en otros manuales de virología y biología molecular. Los virus que son útiles como vectores incluyen, entre otros, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, y lentivirus. En general, un vector adecuado contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, una secuencia de promotores, sitios de endonucleasas de restricción convenientes, y uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, WO 01/96584; WO 01/29058; y la patente estadounidense N.° 6.326.193). Los vectores derivados de virus son herramientas adecuadas para obtener una transferencia de genes a largo plazo, dado que permiten una integración estable a largo plazo de un transgén y su propagación en células hijas.

Un vector también puede incluir, por ejemplo, una secuencia señal para facilitar la secreción, una señal de poliadenilación y un terminador de la transcripción (por ejemplo, del gen de la hormona de crecimiento bovina (BGH)), un elemento que permita la replicación episómica y la replicación en procariotas (por ejemplo, el origen SV40 y ColE1 u otros conocidos en la técnica) y/o elementos que permitan la selección, por ejemplo, un marcador de selección o un gen informador.

El vector puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido, por ejemplo, un polipéptido recombinante, comprende además una secuencia promotora responsable del reclutamiento de la polimerasa para permitir el inicio de la transcripción para la expresión del polipéptido, por ejemplo, el polipéptido recombinante. Las secuencias promotoras adecuadas para los métodos descritos en la presente suelen estar asociadas a potenciadores para impulsar grandes cantidades de transcripción y, por tanto, proporcionar grandes copias del ARNm exógeno diana. El promotor puede comprender promotores tempranos inmediatos principales del citomegalovirus (CMV) (Xia, Bringmann et al. 2006) y el promotor SV40 (Chernajovsky, Mory et al. 1984), ambos derivados de sus virus homónimos o promotores derivados de estos. Se han empleado con éxito otros promotores virales menos comunes para impulsar la transcripción tras su inclusión en un vector de expresión, como la repetición terminal larga delvirus del sarcoma de Rous(RSV-LTR) y la repetición terminal larga delvirus de la leucemia murinade Moloney (MoMLV) (Papadakis, Nicklin et al. 2004). Se pueden utilizar promotores endógenos específicos de mamíferos para impulsar la transcripción constitutiva de un gen de interés (Pontiller, Gross et al. 2008). El promotor CHO específico del factor de elongación 1-alfa del hámster chino (CHEF1a) ha proporcionado una alternativa de alto rendimiento a las secuencias basadas en virus (Deer, Allison 2004). Además de los promotores, los vectores descritos en la presente comprenden además una región potenciadora como la descrita anteriormente; una región con un motivo nucleotídico específico, proximal al promotor central, que puede reclutar factores de transcripción para aumentar la tasa de transcripción (Riethoven 2010). De forma similar a las secuencias promotoras, estas regiones a menudo derivan de virus y están englobadas dentro de la secuencia promotora, como las secuencias potenciadoras de hCMV y SV40, o pueden incluirse adicionalmente, como las secuencias derivadas de adenovirus (Gaillet, Gilbert et al. 2007).

El vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto, por ejemplo, un polipéptido, por ejemplo, un polipéptido recombinante, descrito en la presente puede comprender además una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de selección. El marcador seleccionable puede comprender glutamina sintetasa (GS); dihidrofolato reductasa (DHFR), por ejemplo, una enzima que confiere resistencia al metotrexato (MTX); o un marcador antibiótico, por ejemplo, una enzima que confiere resistencia a un antibiótico como: higromicina, neomicina (G418), zeocina, puromicina o blasticidina. El marcador de selección puede comprender o ser compatible con el sistema de selección Selexis (por ejemplo, SUREtechnology Platform™ y Selexis Genetic Elements™, disponibles comercialmente en Selexis SA) o el sistema de selección Catalant.

El vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un producto recombinante descrito en la presente puede comprender un marcador de selección que es útil para identificar una célula o células que comprenden el ácido nucleico que codifica un producto recombinante descrito en la presente. El marcador de selección puede ser útil para identificar una célula o células que comprenden la integración de la secuencia de ácido nucleico que codifica el producto recombinante en el genoma, tal como se describe en la presente. La identificación de una célula o células que han integrado la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína recombinante puede ser útil para la selección e ingeniería de una célula o línea celular que exprese de forma estable el producto.

Los vectores adecuados para su uso están disponibles comercialmente, e incluyen vectores asociados con el GS Expression System™, GS Xceed™ Gene Expression System, o la tecnología Potelligent® CHOK1SV disponible en Lonza Biologics, Inc, por ejemplo, vectores como los descritos en Fan et al., Pharm. Bioprocess. (2013); 1(5):487-502. Los vectores de expresión de Gs comprenden el gen GS, o un fragmento funcional del mismo (por ejemplo, un minigén GS), y uno o más, por ejemplo, 1, 2, o 3, o más, casetes de transcripción altamente eficientes para la expresión del gen de interés, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante descrito en la presente. Un minigén GS comprende, por ejemplo, consiste en el intrón 6 del gen genómico CHO GS. Un vector GS puede comprender un gen GS enlazado operablemente a un promotor SV40L y una o dos señales poliA. Un vector GS puede comprender un gen GS que se une operablemente a un promotor SV40E, señales de empalme y poliadenilación SV40. El casete de transcripción, por ejemplo, para la expresión del gen de interés o del polipéptido recombinante descrito en el presente documento, puede incluir entonces el promotor hCMV-MIE y secuencias no traducidas 5' del gen hCMV-MIE, incluido el primer intrón. Pueden construirse otros vectores basados en vectores de expresión GS, por ejemplo, en los que otros marcadores de selección sustituyan al gen GS en los vectores de expresión descritos en la presente.

Los vectores adecuados para los métodos descritos en la presente incluyen, entre otros, otros vectores disponibles en el mercado, como pcDNA3.1/Zeo, pcDNA3.1/CAT, pcDNA3.3TOPO (Thermo Fisher, anteriormente Invitrogen); pTarget, HaloTag (Promega); pUC57 (GenScript); pFLAG-CMV (Sigma-Aldrich); pCMV6 (Origene); pEE12 o pEE14 (Lonza Biologics), o pBK-CMV/ pCMV-3Tag-7/ pCMV-Tag2B (Stratagene).

CÉLULAS Y CULTIVO CELULAR

La siguiente sección sólo se refiere a las formas de realización de la invención en lo que respecta a las proteínas de una célula huésped. En formas de realización, la célula es una célula de mamífero. En otras formas de realización, la célula es una célula distinta de una célula de mamífero. En una forma de realización, la célula es un ratón, una rata, un hámster chino, un hámster sirio, un mono, un simio, un perro, un caballo, un hurón o un gato. En formas de realización, la célula es una célula de mamífero, por ejemplo, una célula humana o una célula de roedor, por ejemplo, una célula de hámster, una célula de ratón o una célula de rata. En otra forma de realización, la célula procede de un pato, un loro, un pez, un insecto, una planta, un hongo o una levadura. En una forma de realización, la célula es una arqueobacteria. En una forma de realización, la célula es una especie de Actinobacteria.

En una forma de realización, la célula es una célula de ovario de hámster chino (CHO). En una forma de realización, la célula es una célula CHO-K1, una célula CHO-K1 SV, una célula CHO DG44, una célula CHO DUXB11, una CHOS, una célula de inactivación CHO GS, una célula de inactivación CHO FUT8 GS, una CHOZN o una célula derivada de CHO. La célula de inactivación CHO GS (por ejemplo, célula GSKO) es, por ejemplo, una célula de inactivación CHO-K1SV GS (Lonza Biologics, Inc.). La célula de inactivación CHO FUT8 es, por ejemplo, la Potelligent® CHOK1 SV (Lonza Biologics, Inc.).

En una forma de realización, la célula es una célula de ovario de hámster chino (CHO). En una forma de realización, la célula es una célula CHO-K1, una célula CHO-K1 SV, una célula CHO-GSKO, una célula CHOXceed. La célula de inactivación CHO GS (por ejemplo, célula GS-CHO) es, por ejemplo, una célula de inactivación CHO-K1SV GS (Lonza Biologics, Inc.). La célula de inactivación CHO FUT8 es, por ejemplo, la Potelligent® CHOK1 SV (Lonza Biologics, Inc.).

En otra forma de realización, la célula es una HeIa, HEK293, HT1080, H9, HepG2, MCF7, Jurkat, NIH3T3, PC12, PER.C6, BHK (célula de riñón de hámster bebé), VERO, SP2/0, NS0, YB2/0, Y0, EB66, C127, célula L, COS, por ejemplo, COS1 y COS7, QC1-3, CHOK1, CHOK1SV, Potelligent CHOK1SV, CHO GS de inactivación, CHOK1SV GS KO, Ch OS, Ch O DG44, CHO DXB11 y CHOZN, o cualquier célula derivada de estas. En una forma de realización, la célula es una célula madre. En una forma de realización, la célula es una forma diferenciada de cualquiera de las células descritas en la presente. En una forma de realización, la célula es una célula derivada de cualquier célula primaria en cultivo.

En una forma de realización, la célula es cualquiera de las células descritas en la presente que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido recombinante, por ejemplo, expresa un polipéptido recombinante, por ejemplo, un polipéptido recombinante seleccionado de la Tabla 1 o 2.

El cultivo celular puede llevarse a cabo como un cultivo discontinuo, un cultivo discontinuo alimentado, un cultivo de extracción y llenado o un cultivo continuo. El cultivo celular puede ser un cultivo en suspensión. La célula o el cultivo celular se pueden colocarin vivopara la expresión del polipéptido recombinante, por ejemplo, en un organismo modelo o en un sujeto humano.

Los medios de cultivo pueden estar libres de suero. Existen medios sin suero y sin proteínas disponibles comercialmente, por ejemplo, Lonza Biologics.

Los medios y métodos de cultivo adecuados para líneas de células de mamíferos son bien conocidos en la técnica, como se describe en la patente estadounidense N.° 5.633.162, por ejemplo. Algunos ejemplos de medios de cultivo celular estándar para matraces de laboratorio o cultivos celulares de baja densidad y que se adaptan a las necesidades de tipos de células particulares son, por ejemplo: medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Morre, G., The Journal of the American Medical Association, 199, p. 519 f. 1967), medio L-15 (Leibovitz, A. et al., Amer. J. of Hygiene, 78, 1p. 173 ff, 1963), medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés), medio esencial mínimo de Eagle (MEM), medio F12 de Ham (Ham, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sc.53, p288 ff. 1965) o DMEM modificado de Iscoves que carece de albúmina, transferrina y lecitina (Iscoves et al., J. Exp. med. 1, p. 923 ff., 1978). Por ejemplo, los medios F10 o F12 de Ham fueron diseñados especialmente para el cultivo de células CHO. Otros medios especialmente adaptados al cultivo de células CHO se describen en EP-481 791. Se sabe que dichos medios de cultivo pueden complementarse con suero fetal bovino (FBS, también llamado suero fetal bovino FCS), siendo este último una fuente natural de una gran cantidad de hormonas y factores de crecimiento. El cultivo de células de mamíferos es hoy en día una operación rutinaria bien descrita en libros de texto y manuales científicos; se trata en detalle, por ejemplo, en R. lan Fresney, Culture of Animal cells, a manual, 4.a edición, Wiley-Liss/N.Y., 2000.

El experto en la materia conocerá otros métodos de cultivo adecuados y pueden depender del producto polipeptídico recombinante y de la célula huésped utilizada. Está dentro de las capacidades de un experto habitual determinar u optimizar las condiciones adecuadas para la expresión y producción del polipéptido recombinante que será expresado por la célula.

Una célula o línea celular divulgada, pero no reivindicada, en la presente comprende un ácido nucleico exógeno que codifica un producto, por ejemplo, un polipéptido recombinante. La célula o línea celular puede expresar el producto, por ejemplo, un producto terapéutico o de diagnóstico. Los métodos para modificar o diseñar genéticamente una célula para expresar un polipéptido o proteína deseados son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, transfección, transducción (por ejemplo, transducción viral) o electroporación.

Los métodos físicos para introducir un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico exógeno o un vector descrito en el presente documento, en una célula huésped incluyen precipitación con fosfato de calcio, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación y similares. En la técnica se conocen métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volúmenes 1 a 4, Cold Spring Harbor Press, NY).

Los medios químicos para introducir un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico exógeno o un vector descrito en el presente documento, en una célula huésped incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal de ejemplo para su uso como vehículo de administraciónin vitroein vivoes un liposoma (por ejemplo, una vesícula de membrana artificial). Existen otros métodos de administración direccionada de ácidos nucleicos de la técnica, como la administración de polinucleótidos con nanopartículas direccionadas u otro sistema de administración adecuado de tamaño submicrónico.

Puede desearse la integración del ácido nucleico exógeno en un ácido nucleico de la célula huésped, por ejemplo, el genoma o el ácido nucleico cromosómico de la célula huésped. Los métodos para determinar si se ha producido la integración de un ácido nucleico exógeno en el genoma de la célula huésped pueden incluir un método de selección GS/MSX. El método de selección GS/MSX utiliza la complementación de una auxotrofía de glutamina por un gen GS recombinante para seleccionar la expresión de alto nivel de proteínas de las células. Brevemente, el método de selección GS/MSX comprende la inclusión de un ácido nucleico que codifica la glutamina sintetasa en el vector que comprende el ácido nucleico exógeno que codifica el producto polipeptídico recombinante. La administración de metionina sulfoximina (MSX) selecciona células que integraron con estabilidad al genoma el ácido nucleico exógeno que codifica tanto el polipéptido recombinante como GS. Como GS se puede expresar de forma endógena mediante algunas células huésped, por ejemplo, células CHO, la concentración y duración de selección con MSX pueden optimizarse para identificar células de alta producción con integración estable del ácido nucleico exógeno que codifica el producto de polipéptido recombinante al genoma huésped. La selección y sistemas de GS de estos se describe en mayor detalle en Fan et al., Pharm. Bioprocess. (2013); 1(5):487-502.

Otros métodos para identificar y seleccionar células que integraron con estabilidad el ácido nucleico exógeno al genoma de la célula huésped pueden incluir, entre otros, la inclusión de un gen informador en el ácido nucleico exógeno y la evaluación de la presencia del gen informador en la célula, y el análisis PCR y la detección del ácido nucleico exógeno.

Las células seleccionadas, identificadas o generadas con el uso de los métodos descritos en la presente pueden ser capaces de producir rendimientos más altos del producto de proteína que las células que se seleccionan solo con un método de selección para la expresión estable, por ejemplo, la integración de ácido nucleico exógeno que codifica el polipéptido recombinante. Las células seleccionadas, identificadas o generadas con los métodos descritos en la presente pueden producir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces más del producto, por ejemplo, el polipéptido recombinante, en comparación con células que no estuvieron en contacto con un inhibidor de degradación de la proteína o células que sólo se seleccionaron por expresión estable, por ejemplo, integración del ácido nucleico exógeno que codifica el polipéptido recombinante.

MÉTODOS PARA LA LÍNEA CELULAR Y LA PRODUCCIÓN DE POLIPÉPTIDO RECOMBINANTE

El estado actual de la técnica en mamíferos y sistemas de selección microbianas es aplicar presión selectiva en el nivel de la transcripción de ADN en ARN. El gen de interés está vinculado estrechamente con el marcador de selección que hace posible que un alto nivel de expresión del marcador selectivo de como resultado la alta expresión del gen de interés. Las células que expresan el marcador de selección en altos niveles son capaces de sobrevivir y proliferar, las que no lo hacen tienen menos probabilidades de sobrevivir y proliferar, por ejemplo, apoptosis y/o muerte. De esta manera, una población de células puede estar enriquecida por células que expresan el marcador de selección y mediante la implicación del gen de interés en altos niveles. El método demostró tener éxito en cuanto a la expresión de proteínas simples.

En el presente documento se describen, pero no se reivindican, métodos para generar una célula o línea celular para producir un producto, por ejemplo, un polipéptido recombinante. En la presente también se describen, pero no se reivindican, métodos para producir un producto, por ejemplo, un polipéptido recombinante descrito en la presente con una célula identificada, clasificada, seleccionada o generada con los métodos descritos en la presente. Cualquiera de los métodos anteriores incluyen evaluar, identificar, clasificar o seleccionar una célula descrita en el presente documento, por ejemplo, haciendo que la célula entre en contacto con un inhibidor de degradación de la proteína, para identificar o hacer que una célula que tiene una capacidad de alta producción de un producto, por ejemplo, un polipéptido recombinante. Los métodos descritos en la presente aumentan la producción, por ejemplo, la expresión y/o secreción de un polipéptido recombinante.

Sin respaldo teórico, se cree que las células capaces de productividad más alta son menos susceptibles a los inhibidores de degradación de la proteína y, por lo tanto, se cree que hacer que las células entren en contacto con un inhibidor de degradación de la proteína que comprende un ácido nucleico exógeno descrito en la presente da como resultado la selección de una célula capaz de productividad más alta.

Se pueden llevar a cabo etapas adicionales para mejorar la expresión del producto, por ejemplo, la transcripción, traducción y/o secreción del producto o la calidad del producto, por ejemplo, el plegamiento y/o fidelidad adecuada de la secuencia primaria. Tales etapas adicionales incluyen introducir un agente que mejora la expresión o calidad de producto. Un agente que mejora la expresión o calidad de producto puede ser una molécula pequeña, un polipéptido o un ácido nucleico que codifica un polipéptido que mejora el plegamiento de proteínas, por ejemplo, una proteína chaperona. El ácido nucleico puede comprender un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un microARN o lncARN. El agente que asiste en el plegamiento de proteínas puede comprender un ácido nucleico que codifica una proteína chaperona, por ejemplo, BiP, PD1, o ERO1 (Chakravarthi y Bulleid 2004; Borth et al. 2005; Davis et al. 2000). Otras etapas adicionales para mejorar el rendimiento y calidad del producto incluyen la sobreexpresión de los factores de transcripción tales como SBP1 y ATF6 (Tigges y Fussenegger 2006; Cain et al. 2013; Ku et al. 2008) y de las proteínas chaperonas de unión a lectina tales como calnexina y calreticulina (Chung et al. 2004). La sobreexpresión de los agentes que asisten o mejoran el plegamiento de proteínas y la calidad de producto y las proteínas de rendimiento descritas en la presente se pueden obtener mediante la introducción de ácidos nucleicos exógenos que codifican las proteínas. El agente que mejora la expresión o calidad del producto puede ser una molécula pequeña que se puede agregar al cultivo celular para aumentar la expresión o calidad del producto. El cultivo de las células puede llevarse a cabo a temperaturas más bajas, por ejemplo, 1 °C, 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C, 6 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C o 10 °C más bajas que la temperatura a la que se cultivan generalmente las células.

Cualquiera de los métodos descritos en la presente pueden incluir además etapas de selección adicionales para identificar células que tienen alta productividad o que producen productos de alta calidad. Por ejemplo, se puede utilizar la selección FACS para seleccionar y aislar células específicas con características deseadas, por ejemplo, expresión más alta de proteínas de plegamiento de proteínas, por ejemplo, chaperonas; o expresión mejorada del producto.

En el presente documento se divulgan, pero no se reivindican, métodos que incluyen una etapa para recuperar o rescatar el producto de polipéptido recombinante. Cuando el polipéptido recombinante se secreta de la célula, los métodos pueden incluir una etapa para recuperar, recolectar o separar el polipéptido recombinante de la célula, la población celular o el medio de cultivo en el cual las células se cultivaron. Cuando el polipéptido recombinante está dentro de la célula, la purificación del producto de polipéptido recombinante puede comprender la separación del polipéptido recombinante producido por la célula de uno o más de los siguientes: proteínas de células huésped, ácidos nucleicos de células huésped, lípidos de células huésped y/u otros restos de la célula huésped.

El procedimiento descrito en el presente documento proporciona un producto de proteína sustancialmente puro. Como se usa en el presente documento, "sustancialmente puro" significa sustancialmente libre de materiales pirogénicos, sustancialmente libre de ácidos nucleicos, y/o sustancialmente libre de enzimas de proteínas celulares endógenas y componentes de la célula huésped, tales como polimerasas, proteínas ribosomales y proteínas chaperonas. Un producto de proteína sustancialmente puro contiene, por ejemplo, menos de 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de proteína endógena contaminante, ácido nucleico u otra molécula de la célula huésped.

Los métodos para recuperar y purificar un producto, por ejemplo, un polipéptido recombinante, están firmemente establecidas en la técnica. Para recuperar el producto de polipéptido recombinante, se utiliza un método físico, químico o fisicoquímico. El método físico, químico o fisicoquímico puede ser un método de filtrado, un método de centrifugación, un método de ultracentrifugación, un método de extracción, un método de liofilización, un método de precipitación, un método de cristalización, un método de cromatografía o una combinación de dos o más métodos de estos. El método de cromatografía puede comprender uno o más de una cromatografía de exclusión por tamaño (o filtración de gel), cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrófoba y/o cromatografía multimodal.

EJEMPLOS

La invención se describe con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos.

Sin descripción adicional, se cree que el experto en la materia puede, mediante el uso de la descripción anterior y los ejemplos ilustrativos siguientes, elaborar y utilizar los compuestos de la presente invención y poner en práctica los métodos reivindicados. Los siguientes ejemplos de trabajo indican específicamente diversos aspectos de la presente invención.

Ejemplo 1: Preparación del anticuerpo policlonal anti-proteína de célula huésped de GS-CHO

Los métodos proporcionados en este ejemplo se refieren a la preparación del anticuerpo policlonal de la proteína de célula huésped (HCP) anti-GS-CHO. El anticuerpo se usó para los experimentos ELISA descritos en el Ejemplo 2.

Producción de los anticuerpos anti-HCP GS-CHO

Se inmunizaron tres ovejas con la HCP y forman una línea celular nula CS-CHO (es decir, células CHO-K1SV transfectadas con un vector GS en blanco). Las HCP utilizadas como antígenos fueron del extracto celular (CE) o el sobrenadante celular (SN). El antígeno se preparó de acuerdo con los métodos estándar (por ejemplo, ver las publicaciones de la Farmacopea estadounidense (USP) sobre las directrices para el procedimiento y directrices de ensayos oficiales. En USP <1132> se describe "Residual host cell protein measurement in biopharmaceuticals" (complemento secundario a USP 38-NF 33, 7647-7667), publicado en diciembre de 2015).

Se recolectaron antisueros de ovejas en varias fechas de extracción. Los antisueros de ovejas almacenados se utilizaron para purificar la afinidad de los anticuerpos anti- HCP GS CHO.

Purificación de los anticuerpos anti-HCP GS-CHO

El procedimiento de purificación consistió en cromatografía de afinidad MabSelect SuRe (MSS), concentración/diafiltración, cromatografía de afinidad de bromuro de cianógeno (CNBr) y una etapa de diafiltración final. Particularmente, el procedimiento de ejemplo presente combina la proteína A y la cromatografía de CNBr en una purificación de afinidad de dos etapas. La purificación de afinidad de dos etapas eliminó la mayoría de IgG no específicas (es decir, IgG que no se unen a la HCP). Los métodos de purificación actuales utilizan un anticuerpo de la HCP de la mezcla de antisueros crudos (es decir, sin purificación) o IgG totales, que tienen aproximadamente 99 % de IgG no específicas.

Se llevaron a cabo dos rondas de purificación, 1.a ronda y 2.a ronda, con las mismas condiciones. El método de purificación se analizó y se confirmó en la purificación de 1.a ronda con 1800 ml de antisueros de ovejas. Los de anti-HCP GS-CHOanticuerpos anti-HCP GS-CHO purificados por afinidad se analizaron con ELISA, SDS-PAGE, electrotransferencia Western y SDS-PAGE 2D para su inmunocobertura contra la HCP GS-CHO. En la purificación de 2.a ronda, que inició con 8000 ml de antisueros, se llevó a cabo la repetición de la carga con flujo para maximizar la producción de anticuerpos de HCP GS-CHO en la purificación MSS y CNBr.

La valoración de IgG de antisueros de ovejas crudos se determinó mediante HPLC PrA y el rendimiento de la etapa MSS fue de 96,33 % en la purificación de 1.a ronda y de 122,86 % en la purificación de 2.a ronda para antisueros de ovejas CE que se inmunizaron con extractos de célula nula GS-CHO (la discrepancia del rendimiento sobre 100 % fue el resultado de distintos métodos para la concentración de proteína). En total, se eluyeron 10.315 mg de IgG en la purificación de 1.a ronda y 60.518 mg de IgG en la purificación de 2.a ronda a partir de la cromatografía MSS. Las IgG de MSS eludidas se iban a utilizar para la siguiente etapa de la purificación de CNBr tras la concentración y diafiltración. En la cromatografía de CNBr, la resina de CNBr estuvo acoplada con extractos de células GS-CHO y se usó para purificar por afinidad los anticuerpos de HCP anti-GS-CHO de IgG de CE MSS. Se purificaron 39,6 |jg de anticuerpos anti-HCP con un rendimiento del 0,37% en la purificación de 1.a ronda, mientras que se produjeron 361,2 jg del anticuerpo de la HCP con un rendimiento del 0,62 % en la purificación de 2.a ronda. Los anticuerpos anti-HCP GS-CHO de la purificación de 1.a ronda se analizaron para conocer la inmunocobertura mediante electrotransferencia Western 2DE. La cobertura contra el extracto de línea de célula nula GS-CHO fue de 72 % y 82 % contra el extracto celular de una línea celular GS-knockout en función del conteo de manchas.

Los anticuerpos anti-HCP GS-CHO de las 1.a y 2.a rondas se combinaron para generar una preparación uniforme de anticuerpo de anti-HCP GS-CHO. El total de 391 mg de anticuerpo determinado como A280 se obtuvo con un rendimiento acumulado total del 0,65 % durante la totalidad del procedimiento de purificación. Se analizó la inmunocobertura del anticuerpo final de anti-HCP GS-CHO mediante electrotransferencia Western 2DE. La cobertura contra el extracto de línea de célula nula GS-CHO fue de 77 % contra el extracto celular de una línea celular GS-CHO en función del conteo total de manchas y 71 % en función de las manchas compatibles.

El proceso de purificación de ejemplo descrito en este ejemplo se representa en la Figura 1. El anticuerpo final de anti-HCP GS-CHO se usó en el ensayo ELISA descrito en el Ejemplo 2. El anticuerpo final también se biotiniló para su uso en el ensayo ELISA descrito en el Ejemplo 2.

Ejemplo Comparativo 2: ELISA DE LA HCP GS-CHO

Los métodos proporcionados en este ejemplo se refieren a un ELISA de tipo sándwich desarrollado para detectar y cuantificar las HCP de GS-CHO. Las condiciones del ensayo ELISA se establecieron para un mayor rendimiento que los métodos actuales (ver, por ejemplo, el Ejemplo 3).

El ensayo ELISA se optimizó con el anticuerpo de CP GS-CHO purificado por afinidad descrito en el Ejemplo 1. La placa de ELISA se recubrió con 100 j l de 2 jg/m l de anticuerpo de la HCP GS-CHO en amortiguador de carbonato/bicarbonato por pocillo y se incubó a 5 ± 3 °C durante la noche (18 ± 2 horas). La placa recubierta se lavó tres veces con 300 j l de amortiguador de lavado (Tween-20 al 0,05 % en 1X DPBS), seguido de la adición de 300 j l de amortiguador de bloqueo (0,2 % de caseína en 1X DPBS) por pocillo, y se incubó durante 60 ± 5 minutos a 23 ± 2 °C con agitación de 300 ± 50 rpm. Se prepararon nueve estándares (80 ng/ml a 0,31 ng/ml) mediante una dilución serial de 1 en 2 del estándar de la HCP GS-CHO con amortiguador de bloqueo. Se proporciona un esquema de dilución de ejemplo en la Tabla 3.

Tabla 3. Preparación estándar de ELISA de HCP GS-CHO

Las soluciones de adición de HCP se prepararon conforme al ejemplo de la Tabla 4.

Tabla 4. Preparación de solución de punción ELISA de la HCP GS-CHO

La muestra se diluyó con amortiguador de bloqueo en diluciones predeterminadas, por ejemplo, 1 en 5 diluciones, 1 en 10 diluciones, etc. La placa se lavó tres veces con 300 pl de amortiguador de lavado (Tween-20 al 0,05 % en 1X DPBS). 100 pl de muestras preparadas, y las muestras se cargaron por pocillo en triplicado. Luego, la placa se incubó durante 90 ± 5 minutos a 23 ± 2 °C con agitación de 330 ± 50 rpm. La placa se lavó tres veces con 300 pl de amortiguador de lavado (Tween-20 al 0,05 % en 1X DPBS), y 100 pl de 2 pg/ml de anticuerpo de la HCP SG-CHO biotinilado diluido en amortiguador de bloqueo por pocillo. La placa se incubó durante 60 ± 5 minutos a 23 ± 2 °C con agitación a 330 ± 50 rpm. La placa se lavó tres veces con 300 pl de amortiguador de lavado (Tween-20 al 0,05 % en 1X DPBS), y 100 ml de estreptavidina-HRP 1 en 10.000 de dilución en amortiguador de bloqueo se cargó por pocillo. La placa se incubó durante 60 ± 5 minutos a 23 ± 2 °C con agitación a 330 ± 50 rpm. La placa se lavó tres veces con 300 pl de amortiguador de lavado (Tween-20 al 0,05 % en 1X DPBS), y 100 pl de TMB 1C se cargó por pocillo. La placa se incubó durante 10 ± 1 minutos a 23 ± 2 °C con agitación a 330 ± 50 rpm. Después de la incubación, la reacción se detuvo agregando 50 pl de solución de detención (2,5 M de ácido sulfúrico, almacenado a temperatura ambiente) por pocillo. La placa se leyó mediante un lector de placas a 450 nm de longitud de onda con referencia de 630 nm. Los datos se analizaron mediante SoftMax Pro (versión 5.4.3) y se trazó la curva estándar con ajuste logístico de 4 parámetros.

Ejemplo comparativo 3: Evaluación de ELISA de HCP GS-CHO

El siguiente ejemplo proporciona una evaluación de ELISA de tipo sándwich de la HCP GS-CHO descrito en el Ejemplo 2. Los resultados de la evaluación se describen a continuación.

En consecuencia, se evaluaron cinco productos purificados GS-CHO, tres productos GS-CHO en proceso y un amortiguador de formulación final para evaluar ELISA de la HCP GS-CHO. Estas muestras de ensayo representaron las muestras de producto para el ensayo ELISA de la HCP GS-CHO. Los productos GS-CHO se diluyeron con diluciones seriales de 1 en 2 y se analizaron en el ensayo ELISA descrito en el Ejemplo 2. Cinco niveles de mezcla, 1, 2, 5, 10 y 20 ng/ml, se analizaron con diluciones de producto. La recuperación de mezcla se utilizó para analizar el rendimiento de ensayo para cada producto.

Se evaluaron los cinco productos purificados (BDS Mab DV, Mab BM, producto A15, Mab DU, y Mab DH) y tres en muestras de procesos (Mab CZ, Mab BM, eluatos Mab MSS) y el amortiguador de la formulación final Mab BM. La exactitud, precisión, linealidad, intervalo de trabajo, límite de detección, límite de cuantificación y la especificidad se analizaron y se describen a continuación.

Exactitud

La exactitud de ELISA se analizó mediante la recuperación de los cinco niveles de mezcla. La exactitud de los niveles de mezcla 5, 10 y 20 ng/ml estuvo dentro de un rango aceptable de 75 % a 125 % de recuperación. Para 2 ng/ml, la mayoría de las diluciones de producto tuvieron una recuperación aceptable dentro de 75 % a 125 % de recuperación. Altos niveles de la concentración de la HCP endógena afectó la exactitud de la adición de 2 ng/ml. La exactitud total del nivel de mezcla a 1 ng/ml no fue aceptable debido al efecto del alto nivel de la HCP endógena.

Los productos GS-CHO, BDS MAb DV, MAb BM, MAb DU y MAb DH se evaluaron con tres diluciones cada uno con el método final de ELISA. Para la recuperación del control de mezcla a 2, 5, 10 y 20 ng/ml, de estos resultados (n=38) estuvieron dentro de 75 % a 125 %. Cinco de 38 recuperaciones para el control de mezcla a 1 ng/ml estuvieron fuera de la recuperación aceptable. Las recuperaciones de mezcla de cinco niveles de mezcla distintos se calcularon y la exactitud del método se evaluó en función de la recuperación de mezcla. La exactitud del ensayo se consideró aceptable si el total de porcentaje de recuperación de media en cada nivel de mezcla de la HCP estuvo entre 75 % y 125 % de recuperación. Para los niveles de mezcla de la HCP de 5, 10 y 20 ng/ml, cada una del total de recuperaciones de mezcla en los cuatro productos de BDS analizados con tres diluciones distintas estuvieron entre 75 % y 125 % de recuperación y fueron aceptables. La HCP endógena analizada varió de 1,395 ng/ml a 24,044 ng/ml.

Para el nivel de mezcla de la HCP de 2 ng/ml, la recuperación de mezcla de los cuatro productos BDS analizados con dos diluciones distintas cada uno, excepto la baja dilución de los productos BDS (por ejemplo, la dilución 1 en 2 (1 en 2) en BDS MAb DV), estuvieron entre 75 % y 125 % de recuperación y fueron aceptables. La concentración de la HCP endógena de la dilución del producto con la recuperación de mezcla fallida varió de 13,467 ng/ml a 24,044 ng/ml. La concentración de la HCP endógena de la dilución del producto con la recuperación de mezcla aceptable varió en un intervalo de 1,395 ng/ml a 4,536 ng/ml.

Para el nivel de mezcla de la HCP de 1 ng/ml, la recuperación de mezcla de los cuatro productos BDS analizados con diluciones distintas estuvieron entre 75 % y 125 % de recuperación y fueron aceptables. La concentración de la HCP endógena varió en un rango de 1,395 ng/ml a 4,536 ng/ml. La recuperación para las diluciones más bajas de los productos BDS, por ejemplo, dilución 1 en 2 (1 en 2) para MAb DV, MAb DU, MAb BM y dilución 1 en 32 (1 en 32) para MAb DH, estuvieron fuera del rango de 75 % a 125 %. Las concentraciones de la HCP endógena de la dilución del producto con las recuperaciones de mezcla fallidas varió en un intervalo de 13,467 ng/ml a 24,044 ng/ml.

De la recuperación de mezcla y los niveles de mezcla, se concluyó que el alto nivel de la HCP endógena presente en la muestra de prueba afectó la fiabilidad de la medición de la recuperación de mezcla en bajos niveles de mezcla, por ejemplo, 1 ng/ml o 2 ng/ml. Por lo tanto, la exactitud total se consideró aceptable.

Precisión

La medición de HCP en cuatro productos BDS GS-CHO (purificados) se analizó para conocer la exactitud de repetición y la exactitud intermedia. La exactitud de repetición y la exactitud intermedia fueron menos de 20 % CV. La repetición de la concentración de la HCP en el producto GS-CHO estuvo en el extremo superior del rango aceptable de 20 % CV. La exactitud se analizó adicionalmente con la medición de la HCP de los controles de interensayo y el control de mezcla en la evaluación. La exactitud de repetición y la exactitud intermedia fueron menos de 15 % CV para los controles de interensayo altos y bajos (IAC). Para los controles de mezcla 1, 2, 5, 10 y 20 ng/ml, la exactitud de repetición y la exactitud intermedia estuvieron por debajo de 15 % CV.

La exactitud de repetición (intraensayo) y la exactitud intermedia (intraensayo) para la medición de la concentración de la HCP en productos BDS GS-CHO se determinaron a partir de seis instancias de mediciones de impureza de la HCP endógena en productos BDS. La concentración de la HCP endógena en cada producto BDS se calculó de la muestra de mezcla en cada medición con corrección del factor de dilución de ensayo. Para cada medición, la HCP se midió de tres diluciones distintas para cada producto. Se calculó el % de exactitud de repetición de CV y el % de exactitud intermedia de CV de la concentración de HCP en cada producto. El % de exactitud de repetición de CV para los cuatro productos BDS GS-CHO varió en el intervalo de 10,7 % a 15,0 %. El % de exactitud de repetición de CV fue aceptable en comparación con el 20 % de diana. Cabe destacar que la repetición se calculó para los resultados en todas las diluciones. El % de exactitud de repetición de CV para los cuatro productos BDS GS-CHO varió en el rango de 7,5 % a 16,2 %. (n=18), que se consideró aceptable en comparación con el < 20 % de diana.

Linealidad

La linealidad es un parámetro de ensayo importante que demuestra que la respuesta de ensayo es proporcional a la concentración de analito en la muestra de ensayo, por lo tanto, la respuesta de la muestra se puede interpretar directamente de la curva de calibración de dosis y respuesta. La linealidad de ELISA de la HCP GS-CHO se analizó con la medición de la HCP con cinco niveles de los productos de la HCP GS-CHO de mezcla. El valor de linealidad (r2) varió en un intervalo de 0,984 a 1,000 en cada ensayo de estudio de exactitud y cuatro productos de la HCP GS-CHO probados.

Intervalo de trabajo

El intervalo de trabajo de la curva estándar ELISA de la HCP GS-CHO se determinó como el intervalo de 2 ng/ml a 80 ng/ml con exactitud aceptable. El intervalo de trabajo también se evaluó y confirmó mediciones de la HCP para los productos BDS GS-CHO

Límite de detección

Se determinó que el límite de detección (LOD) de ELISA de la HCP GS-CHO es 0,9 ng/ml, que es el LOD más alto calculado de la curva estándar en las 6 instancias de ensayos con 41 placas para cuatro productos BDS GS-CHO. El LOD de cada ensayo (placa) se calculó a partir de la concentración de la HCP interpretado de la curva estándar con la absorbancia media del control en blanco (el estándar de 0 ng/ml) más 2,5 veces de su desviación estándar que proporcionó una señal considerablemente distinta. El LOD más alto de todas las placas analizadas fue de 0,875 ng/ml, que se redondeó hacia arriba a 0,9 ng/ml. Se definió que 0,9 ng/ml es el LOD de ELISA de la HCP GS-CHO.

Límite de cuantificación

Se determinó que el límite de detección (LOQ) de ELISA de la HCP GS-CHO es 2 ng/ml. El límite de cuantificación (LOQ) del ensayo ELISA de la HCP GS-CHO se definió con la combinación de estándares retrocalculados y la exactitud aceptable para los productos GS-CHO analizados. El estándar más bajo de ELISA de la HCP GS-CHO con retrocálculo aceptable (% RE <15 %) y la exactitud de repetición (% CV<20%)fue de 1,25 ng/ml. El LOQ para cada producto con recuperación aceptable (entre 75 % y 125 % en al menos tres de cada seis instancias) se sintetizó en la Tabla 12. El LOQ para el estándar actual de ELISA de la HCP CHO es alrededor de 200 ng/ml.

Tabla 5. Límite de cuantificación para GS

Especificidad

La especificidad de ELISA de la HCP GS-CHO se evaluó contra las impurezas de la proteína A y ADN CHO que podría copurificarse con CUP durante el proceso de purificación. El % de especificidad para la proteína A y ADN CHO fue entre 97 % a 103 %. El % de reactividad cruzada fue menos de 1 % tanto en la proteína A y ADN c Ho . El resultado de especificidad sugirió que la parcialidad potencial negativa o positiva de la proteína A y ADN CHO se observó en ELISA de la HCP GS-CHO mientras se medía la HCP en productos de anticuerpos.

En resumen, los resultados de ejemplo descritos en la presente demuestran un ensayo de plataforma ELISA de la HCP robusto y sensible para sostener múltiples sistemas de expresión, incluyendo, por ejemplo, sistemas de expresión de mamíferos, por ejemplo, el sistema de expresión CHOK1SV. El anticuerpo de la h Cp policlonal criado en ovejas estuvo purificado por afinidad y la inmunocobertura del anticuerpo contra el extracto celular de células nulas de transfección simulada fue 71 % analizado mediante manchas compatibles con electrotransferencia Western bidimensional (2D). La concentración de anticuerpos, el sistema de amortiguador y el sistema de detección se optimizaron durante el desarrollo de ELISA para la inmunocobertura superior y LOQ.

El ensayo ELISA de la HCP final robusto y sensible se evaluó de acuerdo con las directrices Q2(R1) del Consejo Internacional de armonización de los requisitos técnicos para el registro de medicamentos de uso humano (ICH). Los parámetros de ensayo para ELISA de la HCP se evaluaron contra los criterios predeterminados. La exactitud, precisión intraensayos, precisión intermedia y linealidad de la concentración de la HCP teórica contra la concentración de la HCP medida fueron aceptables. El rango de trabajo de ELISA se determinó como 2 ng/ml a 80 ng/ml. El LOQ, el límite de cuantificación de ELISA de la HCP, se definió como 2 ng/ml con recuperación de espícula aceptable en función de múltiples productos purificados. La especificidad contra la proteína A y ADN CHO que son las fuentes principales de impurezas junto con la HCP también demostraron ser aceptables.

El ensayo ELISA de la HCP puede servir como un ensayo de plataforma para monitorear la impureza de la HCP durante el proceso de biopurificación y la sustancia de fármaco final. El ensayo también puede servir para la validación y liberación por lotes de productos producidos en el sistema de expresión GS-CHO. Además, los métodos descritos en la presente se pueden utilizar en conjunto con los requisitos reguladores para la producción de las proteínas recombinantes; ya que las directrices ICH Q6B 6.2 indican se debe utilizar que un inmunoensayo sensible adecuado para detectar el espectro de las HCP que puedan estar presentes en productos biológicos.

Estabilidad

Los reactivos de ELISA de la HCP GS-CHO, específicamente el analito de la HCP, se evaluaron para conocer la estabilidad en temperatura de almacenamiento, el tiempo y la condición de descongelación. La estabilidad de la HCP GS-CHO dentro de muestras MAb o de la HCP GS-CHO adicionales mezcladas en muestras MAb se evaluó en varios puntos en el tiempo después de haberse almacenado a 5 ± 3 °C o -65 °C o menos. Los resultados indicaron la inestabilidad y posible degradación a ambas temperaturas en los t=0 días a t=1 días del período de almacenamiento, pero la estabilidad de la HCP en el t=1 día a t=85 días del período de almacenamiento. Para dos o tres muestras MAb cuando no se mezcló la HCP adicional en la muestra, los cambios en la HCP fueron menos o iguales al 30 % a ambas temperaturas de almacenamiento y fueron aceptables. Esto demostró que la HCP endógena presente en la muestra MAb estuvo estable hasta 85 días de almacenamiento a 5 ± 3 °C o -65 °C o menos. Se concluyó que la temperatura de almacenamiento de -65 °C o por debajo del ensayo de la HCP fue adecuada para el análisis de las muestras purificadas y las muestras se pueden almacenar 85 días como máximo a -65 °C o menos.

Robustez

Para demostrar que la variación pequeña en el procedimiento de preparación de muestra no afecta el rendimiento del método, se evaluaron la robustez en desviación del ensayo, tiempos de incubación del ensayo, temperatura de incubación del ensayo y edad de reactivo del ensayo.

La robustez de desviación del ensayo se examinó mediante la aplicación de controles interensayo (IAC) que contienen muestras altas de pg/ml o muestras bajas de pg/ml en los pocillos de una placa ELISA y luego, después de un retraso de 5 minutos, mediante la aplicación de un segundo conjunto de IAC a la placa ELISA y diferencias de evaluación en IAC. La adición de las muestras en distintas instancias en el ensayo ELISA de la HCP no afectó la exactitud o precisión de los resultados del ensayo, todos los resultados estuvieron dentro de la variabilidad normal del ensayo, y se definió que el ensayo ELISA de la HCP es robusto para el tiempo (5 minutos como máximo) requerido para agregar muestras a la placa de ELISA.

La robustez en el tiempo de incubación del ensayo se examinó mediante la aplicación de dos muestras MAb e IAC que contienen muestras altas de pg/ml o muestras bajas de pg/ml a los pocillos de tres placas ELISA y, luego, variar los tiempos de incubación de las etapas de ensayo que experimentaron las placas de ELISA. Los resultados de IAC y los resultados de muestra MAb para las tres placas fueron aceptables. Todos los resultados estuvieron dentro de la variabilidad normal del ensayo y se definió que el método de prueba es robusto para las variaciones en el tiempo de incubación de ensayo.

La robustez en la temperatura de incubación del ensayo se examinó mediante la aplicación de dos muestras MAb e IAC que contienen muestras altas de pg/ml o muestras bajas de pg/ml a los pocillos de tres placas ELISA y, luego, mediante la evaluación de una placa a 17 °C, una placa a 23 °C y una placa a 27 °C. Los resultados de<i>A<c>y los resultados de MAb fueron aceptables. La exactitud intermedia para el control de mezcla y la mezcla de la HCP en la muestra MAb fueron aceptables para las tres placas. En general, todos los resultados estuvieron dentro de la variabilidad normal del ensayo y se definió que el método de prueba es robusto para las variaciones en la temperatura de incubación de ensayo de 17 ± 2 °C a 25 ± 2 °C.

La robustez en la edad del reactivo de ensayo se examinó mediante el uso de reactivos de ensayo (amortiguador de recubrimiento, amortiguador de bloqueo y amortiguador de lavado) se preparó 1 semana, dos semanas, tres semanas y cuatro semanas después de la preparación inicial. En general, se concluyó que los reactivos del ensayo son estables durante un mes como máximo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de producción de una preparación policlonal de anticuerpos antiproteína de células huésped (HCP), en donde el método comprende:

a)<proporcionar una muestra que comprenda anticuerpos adquiridos de un animal inmunizado con la HCP de>una célula huésped;

b)<separar los anticuerpos de la muestra poniéndola en contacto con un reactivo de afinidad de proteína A para>obtener una preparación de anticuerpos; y

c)<separar el anticuerpo anti-HCP de la preparación de anticuerpos poniendo en contacto la preparación de>anticuerpos con un reactivo de afinidad de la h Cp que comprenda la h Cp acoplada a un sustrato; produciendo así una preparación policlonal de anticuerpos anti-HCP.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el animal inmunizado con la HCP de una célula huésped es una oveja o cabra.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el sustrato acoplado a la HCP es un sustrato derivatizado con bromuro de cianógeno (CNBr) o un sustrato derivatizado con N-hidroxisuccinimida (NHS).

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el sustrato acoplado a la HCP es un sustrato derivatizado con bromuro de cianógeno (CNBr).

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la célula huésped es una célula de mamífero.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la célula de mamífero es una célula CHO.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el método elimina:

i)<al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de IgG específicas no HCP, por>ejemplo, o

ii)<más de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de IgG no específicas de HCP.>8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la preparación de anticuerpo anti-HCP policlonal contiene:

i)<no más de 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 % de IgG no específicas de HCP, o>ii)<contiene menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o 0,5 % de IgG no específicas>de HCP.