ES2993181T3 - Circulating serum microrna biomarkers and methods for determining the progression rate of parkinson's disease - Google Patents
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Abstract
La invención proporciona biomarcadores y métodos para identificar, verificar y confirmar microARN circulantes en suero. Los microARN (PrognomiRs) se pueden utilizar para diferenciar entre pacientes con enfermedad de Parkinson (EP) de progresión rápida y pacientes con EP de progresión lenta. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Biomarcadores de microARN séricos circulantes y métodos para determinar la velocidad de progresión de la enfermedad de Parkinson
Campo de la invención
La presente invención se refiere de manera general a microARN séricos y a métodos para diferenciar pacientes que sufren de enfermedad de Parkinson basándose en la velocidad de progresión de la enfermedad, así como de ayuda al clínico en la fijación de protocolos de tratamiento para dichos pacientes.
Breve descripción de los antecedentes de la técnica
La enfermedad de Parkinson (EP) es una degeneración altamente específica de las células que contienen dopamina de la sustancia negra del mesencéfalo, que causa deficiencia de dopamina en el cuerpo estriado. La EP actualmente afecta a aproximadamente 10 millones de personas en todo el mundo. La gestión eficaz de un paciente con EP resulta posible en los primeros 5 a 7 años de tratamiento, transcurrido el cual se produce una serie de complicaciones con frecuencia debilitantes conjuntamente denominadas fluctuaciones motoras tardías (FMT). Se cree que el tratamiento con levodopa (ácido (-)-L-a-amino-beta-(3,4-dihidroxibenceno)propanoico), o L-dopa, el fármaco antiparquinsoniano más eficaz, puede facilitar o incluso estimular la aparición de FMT. Se utilizan agonistas de la dopamina como un tratamiento alternativo, aunque no ofrecen el mismo grado de alivio sintomático a los pacientes que la L-dopa.
Las terapias sintomáticas mejoran los signos y síntomas sin afectar al estado subyacente de la enfermedad. La levodopa incrementa la concentración de dopamina en el cuerpo estriado, especialmente en el caso de que su metabolismo periférico resulte inhibido por un inhibidor periférico de descarboxilasa (IPD). La terapia de levodopa/IPD se utiliza ampliamente para la terapia sintomática de la enfermedad de Parkinson, tal como combinaciones de levodopa con carbidopa (monohidrato de ácido (-)-L-a-hidrazino-a-metil-beta-(3,4-dihidroxibenceno)propanoico), levodopa y carbidopa de liberación controlada, levodopa y benserazida, o levodopa más benserazida (N'-(2,3,4-trihidroxi-bencil)-hidrazida de ácido 2-amino-3-hidroxi-propiónico) de liberación controlada.
Los inhibidores de la catecol-O-metiltransferasa (COMT) potencia el tratamiento de levodopa ya que inhiben el metabolismo de la levodopa, potenciando su biodisponibilidad y haciendo de esta manera que más del fármaco se encuentre disponible en la hendidura sináptica durante un periodo de tiempo más prolongado. Entre los ejemplos de inhibidores de la COMT se incluyen tolcapona (3,4-dihidroxi-4'-metil-5-nitrobenzofenona) y entacapona ((E)-2-ciano-3-(3,4-dihidroxi-5-nitrofenil)-N,N-dietil-2-propenamida).
Los agonistas de dopamina proporcionan un beneficio sintomático mediante la estimulación directa de los receptores postsinápticos de la dopamina estriatal. Entre los ejemplos se incluyen bromocriptina ((5a)-2-bromo-12'-hidroxi-2-(1-metiletil)-5'-(2-metilpropil)ergotamán-3',6',18-triona), pergolida (8B-[(metiltio)metil]-6-propilergolina), ropinirol (4-[2-(dipropilamino)etil]-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona), pramipexol ((S)-4,5,6,7-tetrahidro-N6-propil-2,6-benzotiazoldiamina), lisurida (N'-[(8a)-9,10-didehidro-6-metilergolín-8-il]-N,N-dietil-urea), cabergolina ((8p)-N-[3-(dimetilamino)propil]-N-[(etilamino)carbonil]-6-(2-propenil)ergolín-8-carboxamida), apomorfina ((6aR)-5,6,6a,7-tetrahidro-6-metil-4H-dibenzo[de,g]quinolín-10,11-diol), sumanirol (5-(metilamino)-5,6-dihidro-4H-imidazo {4,5,1-ij}quinolín-2(1H)-ona), rotigotina ((-)(S)-5,6,7,8-tetrahidro-6-[propil[2-(2-tienil)etil]amino]-1-naftol-), talipexol (5,6,7,8-tetrahidro-6-(2-propenil)-4H-tiazolo[4,5-d]azepín-2-amina) y dihidroergocriptina (ergotamán-3',6',18-triona, 9,10-dihidro-12'-hidroxi-2'-metil-5-(fenilmetilo) (5' cc)). Los agonistas de dopamina resultan eficaces como monoterapia precozmente en el curso de la enfermedad de Parkinson y como complemento a la levodopa en estadios más avanzados. Al contrario que la levodopa, los agonistas de la dopamina estimulan directamente los receptores postsinápticos de la dopamina. No experimentan metabolismo oxidativo y se cree que no aceleran el proceso patológico.
La amantidina (1-aminotriciclo(3,3,1,137)decano) es un agente antivírico en el que casualmente se encontró que presentaba actividad antiparquinsoniana. No se ha determinado cuál es el mecanismo de acción en la EP, aunque se cree que funciona mediante el incremento de la liberación de la dopamina. Los pacientes que reciben amantidina como monoterapia o en combinación con levodopa muestran una mejora de la aquinesia, la rigidez y los temblores.
Entre otras medicaciones utilizadas en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson se incluyen los inhibidores de MAO-B. La inhibición del metabolismo de la L-dopa mediante inactivación de la monoaminooxidasa de tipo B (MAO-B) es un medio eficaz para potenciar la eficacia tanto de la dopamina endógena residual como de la obtenida exógenamente a partir de su precursor, la L-dopa. La selegilina (metil-(1-metil-2-fenil-etil)-prop-2-inil-amina)) es un inhibidor de MAO-B. Hay pruebas de que el tratamiento con selegilina podría ralentizar la progresión de la enfermedad en la EP mediante el bloqueo de la formación de radicales libres derivados del metabolismo oxidativo de la dopamina. Entre otros ejemplos de inhibidores de MAO B se incluyen lazabemida (N-(2-aminoetil)-5-cloro-2-piridincarboxamida), rasagilina (N-propargil-l-(R)-aminoindano y caroxazona (2-oxo-2H-1,3-benzoxazín-3(4H)-acetamida).
Es imperativo diagnosticar los individuos con EP en un estadio precoz y también resulta importante determinar el pronóstico de la enfermedad a fin de incrementar la eficacia de los agentes terapéuticos. Sin embargo, no existe ningún test objetivo ni biomarcadores establecidos para el diagnóstico de la EP. Además, la heterogeneidad, subtipos y progresión de la enfermedad dificultan el desarrollo de candidatos terapéuticos específicos.
Los microARN ("miARN") son una clase de ARN no codificantes que desempeñan funciones clave en la regulación de la expresión génica. Los miARN actúan después de la transcripción y realizan un ajuste fino de la expresión de hasta 30 % de todos los genes codificantes de proteínas de los mamíferos. Los miARN maduros son moléculas cortas de ARN monocatenario, de aproximadamente 22 nucleótidos de longitud. Los miARN pueden estar codificados por múltiples loci y pueden estar organizados en agregados que se cotranscriben en tándem. Los genes de miARN son transcritos por la ARN polimerasa II en forma de transcritos primarios grandes (pri-microARN) que resultan procesados por un complejo proteico que contiene la enzima ARNasa III Drosha, DGCR8 y otros cofactores, formando un microARN precursor de aproximadamente 70 nucleótidos (pre-miARN). (Cathew RW, Cell, 2009; Kim VN, Nat. Rev. Mol. Cel. Biol., 2009; Siomi H, Mol. Cel., 2010; Bartel DP, Cell, 2004; Lee Y, Nature 2003; Han J, Genes Dev., 2004). El pre-miARN es transportado hasta el citoplasma por la exportina-5, en donde resulta procesada por DICER, una segunda enzima ARNasa III, junto con TRbP, PACT y Ago2 en el complejo de silenciamiento inducido por ARN, dando como resultado moléculas dúplex de miARN (Kim VN, Nat. Rev. Mol. Cel. Biol., 2009; Gregory RI, Nature 2004; MAcRae IJ, PNAS, 2008). Las cadenas guía de los dúplex de miARN se separan y se asocian con Ago 2 para la incorporación en una partícula ribonuclear, formando el complejo de silenciamiento inducido por ARN, RISC, que media en el silenciamiento génico. Los mecanismos de los miARN van desde la degradación directa o silenciamiento del ARNm y la represión de la traducción hasta las regulaciones postranscripcionales positivas. (MacRae IJ, PNAS, 2008.)
Se ha informado de la presencia de miARN en líquidos corporales, entre ellos la sangre, el líquido cefalorraquídeo (LCR), el plasma, el suero y la saliva, a niveles detectables. La especificidad de tejido de los miARN sugiere un papel vital e integral en diversos procesos fisiológicos. El enriquecimiento en tejidos es prometedor de una nueva, aunque menos explorada función como biomarcador diagnóstico y como potencial diana terapéutica. Se cree que los miARN circulantes se originan en fugas pasivas a partir de tejido dañado como resultado de la lisis celular o apoptosis, el transporte activo a partir de las células mediante microvesículas, tales como exosomas, o unidos dentro de complejos proteicos RISC (Etheridgeet al.,2011). La administración mediada por exosomas y bombas osmóticas de pequeñas moléculas de ARN en el cerebro y SNC, respectivamente, proporciona una solución para superar las limitaciones de las terapias a base de miARN (Alvarez-Ervitiet al.,2011; Kovalet al,2013, Hum. Mol. Gen). El miARN ha demostrado ser excepcionalmente estable y de esta manera se presenta como un potente candidato a biomarcador potencial (Chenet al,2008; Grasso, 2014). Khoo, S.K. divulga (2012) que el miARN miR-626 muestra una expresión más alta en la línea de base en progresores rápidos en comparación con progresores lentos y confirma (2014) dos miARN que pueden diferenciar a los pacientes de EP con progresión lenta vs. rápida y un miARN que puede diferenciar la línea base del punto final.
Descripción resumida de la invención
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
Es un objeto de la presente invención proporcionar métodos para determinar la velocidad de progresión de la enfermedad en pacientes que sufren de la enfermedad de Parkinson, en donde el método se basa en la detección del miARN hsa-miR-6865-3p (SEQ ID N° 45).
También se divulgan, pero no forman parte de la invención, métodos para identificar opciones de tratamiento basándose en la velocidad de progresión de la enfermedad en pacientes que sufren de enfermedad de Parkinson.
Dichos objetos y otros se consiguen mediante la presente invención, que proporciona biomarcadores de miARN que pueden utilizarse individualmente, en parejas o en combinación para determinar los pacientes que sufren de enfermedad de Parkinson.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra el factor promedio de cambio de cinco miARN pronósticos entre pacientes de EP de progresión rápida y lenta. Los valores de la mediana para la expresión relativa de let7b-3p, miR-3613-3p, miR-6865-3p, pre-mir-532 y miR663a se representan gráficamente como líneas, en donde cada caja muestra los cuartiles internos como medida de la distribución, con bigotes. Los resultados que se muestran son de verificación derivada mediante qRT-PCR realizada en 8 pacientes iniciales con EP de progresión rápida y 8 con EP de progresión lenta. Se muestran barras de color diferente para let7b-3p (azul), miR-3613-3p (naranja), miR-6865-3p (verde), pre-mir-532 (violeta) y miR663a (turquesa). Las medias de cada grupo se denotan como triángulos en el gráfico. La significancia se indica como *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.
Descripción detallada de la invención
MÉTODOS
Manipulación y clasificación de muestras de suero
Todos los pacientes y controles participaron en el proyecto noruego ParkWest, que es un estudio de cohorte longitudinal prospectivo de base poblacional en curso que investiga la incidencia, neurobiología y pronóstico de la EP. El estudio ParkWest noruego es un estudio multicéntrico prospectivo de cohorte longitudinal de pacientes con enfermedad de Parkinson (EP) incidente en Noruega occidental y meridional. Entre el 1 de noviembre de 2004 y el 31 de agosto de 2006 se proyectó incluir todos los casos nuevos de enfermedad de Parkinson en la zona de estudio. Desde el inicio del estudio, se realizó un seguimiento de 212 de un total de 265 (80 %) de estos pacientes y su grupo de control de edad/sexo correspondiente. Puede encontrarse información adicional sobre el estudio en http://www.parkvest.no http://www.parkvest.no.
Se realizaron todos los esfuerzos posibles para establecer una cohorte no seleccionada y representativa de la población de pacientes con EP. Se incluyeron los pacientes que habían proporcionado suero al inicio del estudio y que cumplían los criterios diagnósticos de EP del National Institute of Neurological Disorders and Stroke (http://www.ninds.nih.gov/disorders/parkinsons_disease/parkinsons_disease.htm) y del UK Brain Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gap/cgi-bin/GetPdf.cgi?id=phd000042) en el último seguimiento. Los pacientes con parkinsonismo secundario al inicio del estudio fueron excluidos del mismo. Los sujetos de control se reclutaron de múltiples fuentes, incluyendo amigos, parejas y organizaciones públicas de ancianos, y se incluyeron en el presente estudio en el caso de que hubiesen proporcionado suero. Todos los pacientes y los controles eran caucásicos. Se realizó un seguimiento de los participantes del estudio durante más de ocho años para determinar la velocidad de progresión de la enfermedad.
En el presente estudio de posibles biomarcadores de la EP los presentes inventores aplicaron un procedimiento de dos etapas. En la primera etapa, de identificación, se seleccionó aleatoriamente el suero de 8 pacientes con progresión rápida y de 8 pacientes con progresión lenta de la EP. Los restantes 164 pacientes con EP que eran elegibles para el presente estudio fueron seleccionados con fines de verificación.
Las muestras de suero se recogieron el mismo día que los exámenes clínicos y después se almacenaron bajo congelación a -70° grados centígrados hasta el transporte a las instalaciones en Nueva York sobre hielo seco.
Ejemplo 1: análisis de qPCR de miARN humano de expresión diferencial
Aislamiento de ARN a partir de muestras de suero y control de calidad (QC)
Tras la descongelación sobre hielo, se centrifugaron veinticuatro muestras de suero (dieciséis muestras de EP) durante 5 min a 3000xg para eliminar los residuos. El sobrenadante se utilizó para llevar a cabo el aislamiento de ARN pequeño mediante la utilización del kit de aislamiento de ARN miRCURY, Biofluids (Exiqon, MA). Antes del aislamiento del ARN, al tampón de lisis se añadieron 0,267 fmoles/pl de cel-miR-39-3p de control de adición (Qiagen, CA). La parte restante del aislamiento del ARN se llevó a cabo siguiendo el protocolo del fabricante y el ARN aislado se cuantificó en un Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, MA). El ARN se utilizó para chips micromatrices de microARN Affymetriz v4 y para la posterior síntesis de ADNc y la qPCR. Se aisló el ARN de 180 muestras de suero (de pacientes de EP del proyecto ParkWest) tal como se ha indicado anteriormente; no se cuantificaron mediante Nanodrop, aunque los datos de qPCR que resultaron de dichas muestras se normalizaron respecto a un ARN pequeño de referencia, scaARN17.
Micromatrices de miARN y análisis de los datos
El ARN aislado de veinticuatro muestras de suero de pacientes se cuantificó y se sometió a la matriz 4.0 de miARN Affymetrix GeneChip® en el Yale Center for Genome Analysis (http://medicine.vale.edu/keck/vcga/index.aspx). Los archivos CEL normalizados que se obtuvieron del software Affymetrix Expression Console se importaron en Partek Genomics Suite versión 6.6 Copyright © 2012 (Partek, MO) para el análisis. Se utilizó el flujo de trabajo "microRNA Expression Workflow" para detectar los miARN expresados diferencialmente mediante la utilización de ANOVA, dando como resultado listas de miARN expresados significativamente (p<0,05) entre cohortes de EP rápidas y lentas. Los miARN detectados se utilizaron para la verificación adicional mediante qPCR.
Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa
Se sintetizó ADNc para la qPCR específica de miARN mediante la utilización del kit de síntesis de ADNc de microARN qScript™ (Quanta Biosciences, MD) siguiendo el protocolo del fabricante y se llevaron a cabo qPCR posteriores mediante la utilización de cebadores directos específicos de miARN (Tabla n°) y cebador de PCR universal PerfeCTa® (Quanta Biosciences, MD). Se utilizó scaARN17 y U6 como ARN pequeños de referencia para normalizar los valores de Cq de qPCR, mientras que se utilizó cel-miR-39-3p como control de adición. Se utilizó PerfeCTa® SYBR® GREEN SuperMix para IQ™ (Quanta Biosciences, MD) para todas las qPCR en un sistema de detección de PCR en tiempo real de un solo color MyiQ™ (Bio-Rad, CA). Se analizó la curva patrón para cel-miR-39-3p en MS Excel con R2=0,97882 y eficiencia de PCR de 92,96 %. Se partió de la suposición de ausencia de control de molde (ACM) en caso necesario.
Se determinaron los miARN humanos expresados diferencialmente en muestras de suero de pacientes de enfermedad de Parkinson del estudio noruego ParkWest mediante la utilización de micromatrices de miARN. Posteriormente se proporcionan miARN con expresión diferencial de >1,2 veces.
52 pre-miARN y miARN maduros expresados diferencialmente con un factor de cambio >1,2 hsa-miR-6865-3p, hsa-miR-663a, hsa-miR-92b-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-937-5p, hsa-let-7b-3p, hsa-miR-6730-3p, hsa-miR-5010-3p, hsa-miR-1825, hsa-mir-4487, hsa-miR-4783-5p, hsa-miR-2117, hsa-mir-5090, hsa-mir-4484, hsa-miR-5094, hsa-mir-611, hsa-miR-4738-3p, hsa-miR-6894-5p, hsa-mir-8072, hsa-mir-762, hsa-let-7e, hsa-miR-6768-5p, hsa-mir-3917, hsa-mir-3673, hsa-mir-4431, hsa-miR-216a-3p, hsa-miR-635, hsa-miR-490-3p, hsa-mir-601, hsa-miR-636, hsa-miR-466, hsa-miR-1271-5p, hsa-miR-548u, hsa-miR-3606-5p, hsa-miR-510-5p, hsa-miR-4306, hsa-mir-4753, hsa-mir-6128, hsa-mir-4251, hsa-miR-1306-5p, hsa-miR-8052, hsa-mir-4310, hsa-mir-3128, hsa-miR-628-5p, hsa-miR-3660, hsa-miR-3156-3p, hsa-miR-548aj-3p, hsa-miR-4791, hsa-mir-532, hsa-miR-202-5p, hsa-miR-3613-3p y hsa-miR-8075.
36 miARN maduros expresados diferencialmente con un factor de cambio >1,2 veces
hsa-miR-6865-3p, hsa-miR-663a, hsa-miR-92b-3p, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-937-5p, hsa-let-7b-3p, hsa-miR-6730-3p, hsa-miR-5010-3p, hsa-miR-1825, hsa-miR-4783-5p, hsa-miR-2117, hsa-miR-5094, hsa-miR-4738-3p, hsa-miR-6894-5p, hsa-let-7e, hsa-miR-6768-5p, hsa-miR-216a-3p, hsa-miR-635, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-636, hsa-miR-466, hsa-miR-1271-5p, hsa-miR-548u, hsa-miR-3606-5p, hsa-miR-510-5p, hsa-miR-4306, hsa-miR-1306-5p, hsa-miR-8052, hsa-miR-628-5p, hsa-miR-3660, hsa-miR-3156-3p, hsa-miR-548aj-3p, hsa-miR-4791, hsa-miR-202-5p, hsamiR-3613-3p y hsa-miR-8075
16 miARN premaduros de expresión diferencial con factor de cambio >1,2 veces
hsa-mir-4487, hsa-mir-5090, hsa-mir-4484, hsa-mir-611, hsa-mir-8072, hsa-mir-762, hsa-mir-3917, hsa-mir-3673, hsamir-4431, hsa-mir-601, hsa-mir-4753, hsa-mir-6128, hsa-mir-4251, hsa-mir-4310, hsa-mir-3128 y hsa-mir-532. Estas secuencias de miARN de expresión diferencial se ilustran a continuación, en la Tabla 1, junto con los ARN pequeños de referencia/de mantenimiento cel-miR-39-3p, U6 y ScaARN17, que se utilizaron como controles. Cel-miR-39-3p es un control de adición que muestra la estabilidad de las muestras de ARN. Se utilizaron U6 y ScaARN17 como controles internos para normalizar las lecturas del resto de los miARN o miARN candidatos.
Ejemplo 1
(continuación)
(continuación)
(continuación)
Ejemplo 2: verificación de los miARN maduros humanos mediante qPCR en cohortes de muestras de 8 pacientes de progresión rápida y 8 pacientes de progresión lenta
El factor promedio de cambio para hsa-let7b-3p, hsa-miR-3613-3p y hsa-miR-6865-3p, hsa-pre-miR-532 y hsa-miR663a, PrognomiR entre pacientes de EP de progresión rápida y de progresión lenta se muestra a continuación, en la Tabla 2, y se ilustra en la figura 1.
Tabla 2
Ejemplo 3
La medición de los niveles de una combinación de dos o más miARN en el suero de los pacientes puede ayudar a diferenciar claramente entre un paciente de EP de progresión potencialmente rápida y uno de progresión lenta. Se obtuvo una muestra de suero de la sangre extraída de los pacientes con sospecha de EP. Se utilizó el suero para el aislamiento y enriquecimiento del microARN total. A continuación, dicho ARN se sometió a ensayo mediante la utilización de qPCR para medir los niveles de dos o más cualesquiera de los 52 miARN indicados en el Ejemplo 1, o uno cualquiera de los cinco miARN indicados en el Ejemplo 2. Los niveles detectables de uno o más de los 52 miARN anteriormente indicados con un factor de cambio >1,2, o uno o más cualesquiera de dichos cinco miARN confirma la velocidad de progresión de los pacientes con EP. Si se desea, pueden utilizarse otros líquidos de muestra, entre ellos el plasma, sangre venosa o arterial, o muestras de LCR extraídas mediante punción lumbar. Dichas muestras de plasma, sangre o LCR se procesan tal como se ha comentado anteriormente respecto al suero, p.ej., para proporcionar una muestra para el procesamiento y evaluación fuera del cuerpo humano o animal. Debe entenderse que la medición de más de dos miARN en combinación o de un conjunto de combinaciones utilizada en una matriz de ensayo puede incrementar deseablemente la precisión de la predicción de la progresión de la EP. Tras el diagnóstico, a continuación, se comunica el resultado al paciente.
Tal como se ha comentado e ilustrado anteriormente, la detección de los miARN anteriormente indicados con un factor de cambio >1,2 puede utilizarse para diferenciar entre EP de progresión potencialmente rápida y la EP de progresión potencialmente lenta en los pacientes afectados. Sin embargo, tal como entenderá fácilmente el experto en la materia, pueden utilizarse convenientemente otros umbrales según se desee con posible variación concomitante de la precisión, incluyendo los cambios de factor >1,0, 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 y 2,0. Además, se entenderá de manera similar que dichos umbrales variables de factor de cambio pueden utilizarse más convenientemente con miARN particulares sin afectar a la precisión.
Ejemplo 4
Debido a que puede utilizarse una combinación de miARN para predecir el pronóstico, puede ser recomendable someter a ensayo todos los candidatos a fin de eliminar cualquier variación basada en las cohortes. Se entiende que cualesquiera cantidades detectables de miARN relevante indicarán patología de EP. Sin embargo, el experto en la materia reconocerá que puede resultar clínicamente útil utilizar valores de muestras lentas (8) vs. rápidas (8) para fijar un umbral artificial para la determinación de la velocidad de progresión de la enfermedad. Pueden utilizarse niveles diferenciales de miARN para desarrollar kits de biomarcadores pronósticos que pueden ser utilizados por el clínico para estimar el pronóstico de la enfermedad, así como para enriquecer las cohortes de pacientes en los ensayos clínicos. En el presente estudio, se determinó la presencia y cuantificación del miARN de suero mediante qRT-PCR, que amplifica y cuantifica el ARN en cuestión. Alternativamente pueden utilizarse otras técnicas adecuadas que son conocidas por el experto en la materia, incluyendo la utilización de secuencias antisentido marcadas y anticuerpos marcados. Los anticuerpos adecuados son preferentemente selectivos, en referencia a una reacción de unión entre dos moléculas que es típicamente más de 10 a 100 veces la asociación molecular de fondo bajo las condiciones de medición. De esta manera, bajo las condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una secuencia de miARN particular, identificando de esta manera su presencia. La unión específica a un anticuerpo bajo dichas condiciones requiere un anticuerpo que se selecciona para su especificidad para un miARN particular. Por ejemplo, los anticuerpos generados contra un miARN particular pueden seleccionarse mediante la substracción de los anticuerpos que reaccionan cruzadamente con otras moléculas. Puede utilizarse una diversidad de formatos de inmunoensayo para seleccionar los anticuerpos que son específicamente inmunorreactivos con un miARN particular, incluyendo los inmunoensayos ELISA de fase sólida (véase, p.ej., Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988), para una descripción de los formatos y condiciones de inmunoensayo que pueden utilizarse para determinar la inmunorreactividad específica). Los métodos para determinar si dos moléculas interactúan específicamente se dan a conocer en dicha obra, y los métodos para determinar la afinidad y especificidad de unión son bien conocidos de la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); Friefelder, "Physical Biochemistry: Applications to biochemistry and molecular biology" (W.H. Freeman and Co.
1976)). El término "anticuerpo" tal como se utiliza en la presente memoria comprende los anticuerpos naturales, así como los anticuerpos no naturales, incluyendo, por ejemplo, los anticuerpos de cadena sencilla, los anticuerpos bifuncionales y humanizados quiméricos, así como los fragmentos de unión a antígeno de los mismos (p.ej., Fab', F(ab')<2>, Fab, Fv y rIgG). Véase también Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Véase también, p.ej., Kuby, J., Immunology, 3a ed., W.H. Freeman & Co., New York (1998). Dichos anticuerpos no naturales pueden construirse mediante la utilización de la síntesis peptídica en fase sólida; pueden producirse recombinantemente o pueden obtenerse mediante, por ejemplo, el cribado de bibliotecas combinatoriales que consisten en cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables, tal como se indica en Huseet al.,Science, Vol.
246:1275-81, 1989. Dichos métodos y otros métodos de preparación de, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, con injertación de CDR, de cadena sencilla y bifuncionales son bien conocidos por el experto en la materia (Winter y Harris, Immunol. Today, vol. 14:243-46, 1993; Wardet al.,Nature, vol. 341:544-46, 1989; Harlow y Lane,supra,1988; Hilyardet al.,Protein Engineering: A practical approach (IRL Press 1992); Borrabeck, Antibody Engineering, 2a ed. (Oxford University Press 1995). Los métodos para producir anticuerpos tanto monoclonales como policlonales a partir de secuencias de ARN identificadas son bien conocidos de la técnica.
Ejemplo 5
Muchas enfermedades neurodegenerativas están estrechamente relacionadas entre sí en lo que respecta a los síntomas, así como respecto a los marcadores patológicos. Los marcadores pronósticos circulantes para una enfermedad neurodegenerativa pueden resultar útiles para el diagnóstico/pronóstico de otra enfermedad. Un método para diagnosticar/pronosticar otras enfermedades neurodegenerativas como la demencia con cuerpos de Lewy (DCL), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Alzheimer (EA), atrofia multisistémica (AMS), degeneración corticobasal (DCB), parálisis supranuclear progresiva (PSP), también puede desarrollarse mediante la utilización de mediciones de miARN similares de los candidatos indicados anteriormente. Pueden desarrollarse kits específicos de enfermedad similares al mencionado en el párrafo [0024] con diversas combinaciones de los miARN indicados en [0018].
Ejemplo 6
Los miARN detectados en una o más combinaciones pueden regular varias proteínas en las células. Pueden identificarse nuevas dianas proteínas para la EP mediante la utilización de dichos microARN y sus combinaciones. La participación de dichas proteínas en la etiología de la EP puede establecerse adicionalmente para dirigirlas a la terapia.
Ejemplo 7
Se diseñarán moléculas pequeñas de ácidos nucleicos derivadas de los miARN indicados en [0018] para intervenir terapéuticamente con diana específicamente en genes en los cerebros de EP para conseguir un remedio completo o parcial.
Claims (14)
1. Método para la determinación de la velocidad de progresión de la enfermedad de Parkinson en un paciente humano, que comprende las etapas de:
en una muestra que ha sido obtenida de dicho paciente humano,
determinar el nivel de expresión de un miARN según la SEQ ID NO: 45 dentro de dicha muestra, en donde dicha muestra es suero, plasma, sangre completa o LCR; y
correlacionar el nivel de expresión del miARN determinado a fin de determinar la velocidad de progresión de la enfermedad de Parkinson en el paciente.
2. Método según la reivindicación 1, en donde el nivel de expresión de dicho miARN se determina mediante la utilización de qRT-PCR.
3. Método según la reivindicación 1, en donde el nivel de expresión de dicho miARN se determina mediante la utilización de secuencias de nucleótidos antisentido.
4. Método según la reivindicación 1, en donde el nivel de expresión de dicho miARN se determina mediante la utilización de anticuerpos marcados.
5. Método según la reivindicación 4, en donde los anticuerpos marcados son monoclonales.
6. Método según la reivindicación 1, en donde se determina la expresión relativa de dichos miARN mediante la utilización del perfilado de micromatrices.
7. Método según la reivindicación 1, en donde el nivel de expresión relativa de dichos miARN se determina mediante la utilización de secuenciación NGS de alto rendimiento.
8. Método según la reivindicación 1, en donde se determina la expresión relativa de miARN según al menos las SEQ ID NOS: 12 y 45.
9. Método según la reivindicación 1, en donde se determina la expresión relativa de miARN según al menos las SEQ ID NOS: 33 y 45.
10. Método según la reivindicación 1, en donde se determina la expresión relativa de miARN según al menos las SEQ ID NOS: 42 y 45.
11. Método según la reivindicación 1, en donde se determina la expresión relativa de miARN según al menos las SEQ ID NOS: 12, 33 y 45.
12. Método según la reivindicación 1, en donde se determina la expresión relativa de miARN según al menos las SEQ ID NOS: 12, 42 y 45.
13. Método según la reivindicación 1, en donde se determina la expresión relativa de miARN según al menos las SEQ ID NOS: 33, 42 y 45.
14. Método según la reivindicación 1, en donde se determina la expresión relativa de miARN según al menos las SEQ ID NOS: 12, 33, 42 y 45.
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