ES2993169T3

ES2993169T3 - Templated assembly of collagen fibers and uses thereof

Info

Publication number: ES2993169T3
Application number: ES18745077T
Authority: ES
Inventors: Frampton, Iv
Original assignee: 3dbiofibr Inc
Current assignee: 3dbiofibr Inc
Priority date: 2017-01-26
Filing date: 2018-01-26
Publication date: 2024-12-23
Anticipated expiration: 2038-01-26
Also published as: EP3573672B1; EP3573672C0; WO2018137041A1; US11299630B2; EP3573672A1; EP3573672A4; PL3573672T3; US20190367733A1

Abstract

La presente invención se refiere a un proceso de fabricación de biomateriales para la fabricación de un tejido a base de colágeno para una red de fibras de colágeno alineadas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Ensamblaje en plantilla de fibras de colágeno y usos del mismo

Campo técnico

La presente invención se refiere en general a fibras de colágeno en plantilla y alineadas con polímero y telas derivadas de composiciones de dextrano impurificado con colágeno y usos de las mismas.

Antecedentes

El colágeno es la proteína más abundante del cuerpo humano. Es un componente estructural clave de diversos tejidos y sirve de sustrato para la fijación y el crecimiento de las células. Una de las características que definen al colágeno es su capacidad para formar fibras de forma natural en el cuerpo humano. Sin embargo, las fibras de colágeno han sido notoriamente difíciles de recrear en el laboratorio.

Se conocen métodos para el aislamiento de fibras de colágeno para aplicaciones quirúrgicas tal como suturas o en forma de tejido hemostático o como material para apósitos de heridas y otros usos. Los colágenos se utilizan ampliamente como biomateriales en aplicaciones de administración de fármacos e ingeniería tisular debido a su biodegradabilidad, biocompatibilidad e hipoalergenicidad. En las aplicaciones quirúrgicas mencionadas, es importante que el material de colágeno, concretamente las fibras de colágeno, conserven su estructura nativa. Por esta razón, el método de aislamiento y purificación de la fibra de colágeno a partir del material de partida debe extraer todos los componentes no colágenos del tejido original sin desnaturalizar la estructura cristalina original del colágeno.

Varias patentes describen el método de aislar colágeno microfibrilar como agente hemostático o de reconstituir estructuras quirúrgicas a partir de geles de colágeno solubilizados. Según la patente de Battista (Patente de Estados Unidos No. 3,742,955), se producen microfibrillas de colágeno esponjosas y finamente divididas. La longitud de las fibrillas, de una media de 100 |jm, no permite un tratamiento textil posterior. Varias otras patentes se refieren a procedimientos que dan lugar a la desintegración completa de la estructura fibrilar del colágeno. Por su proceso, un gel de moléculas de colágeno dispersas se reconstituye mediante un complejo proceso en forma fibrilar por extrusión en un medio precipitante. (Veis et al, Patente de Estados Unidos Núm. 2,838,363; Smith, Patente de Estados Unidos Núm. 3,527,225; Grisef et al, Patentes de Estados Unidos Núms.

3,114,372 o 3,114,593 o 3,511,904; Nichols et al, Patente de Estados Unidos No. 3,520,402).

Koob et al. han descrito métodos de producción de fibras de colágeno polimerizadas con ácido nordihidroguayarético (NDGA, por sus siglas en inglés) para diversas aplicaciones biomédicas, algunas con resistencias a la tracción similares a las del tendón natural (por ejemplo, unos 91 MPa). Véase, por ejemplo, Koob y Hernández, Material properties of polymerized NDGA-collagen composite fibers: development of biologically based tendon constructs, Biomaterials enero de 2002; 23 (1): 203-12; y Patente de Estados Unidos Núm.

6,565,960.

Eunryel Nam et al: "Formation of Highly Aligned Collagen Nanofibers by Continuous Cyclic Stretch of a Collagen Hydrogel Sheet", (MACROMOLECULAR BIOSCIENCE, vol. 16, no. 7, 1 de julio de 2016, páginas 995-1000) divulgan la formación de nanofibras de colágeno altamente alineadas mediante el estiramiento de una lámina de colágeno hecha de colágeno de tipo I y que comprende nanofibras de colágeno. Las fibras de colágeno alineadas así obtenidas se utilizan en la fabricación de andamiajes de fibras de colágeno para su uso en medicina regenerativa.

Más recientemente, las fibras de colágeno artificiales se pueden fabricar mediante una técnica de hilado en húmedo que permite obtener fibras con diámetros superiores a 8 jm , o mediante técnicas de electrohilado. En la técnica se han descrito andamiajes de colágeno biocompatibles, por ejemplo, A Nakada et al. ("Manufacture of a weakly denatured collagen fiber scaffold with excellent biocompatibility and space maintenance ability", Biomedical Materials, (2013), Vol. 8(4)). Los autores fabricaron un andamiaje de fibras de colágeno débilmente desnaturalizado a partir de una suspensión de fibras de colágeno (pH fisiológico 7,4) mediante un proceso de liofilización y desnaturalización con calor a baja presión (1 * 10-1 Pa). El tratamiento térmico formó enlaces cruzados entre las fibras de colágeno, proporcionando al andamiaje la suficiente resistencia mecánica para mantener el espacio para la regeneración tisularin vivo.Se fabricó un andamiaje de fibras de colágeno débilmente desnaturalizado con una biocompatibilidad y una capacidad de mantenimiento del espacio moderadas mediante congelación a -10 °C, seguida de desnaturalización a 140 °C durante 6 h. Además, la dirección de las fibras de colágeno en el andamiaje se puede ajustar enfriando la suspensión sólo desde la parte inferior del recipiente. Este proceso aumentó la proporción de células que se infiltraron en el andamiaje.

Un andamiaje de fibras de colágeno débilmente desnaturalizadas se puede utilizar para la regeneración de tejidos o para el transporte de células o proteínas a un lugar determinado. En los últimos años se ha prestado gran atención a la electrohilado de colágeno, ya que este proceso es capaz de producir estructuras de nanofibras que se asemejan a las fibrillas de colágeno nativas y ofrece la posibilidad de manipular la porosidad, la estructura y la orientación de la red de fibras de colágeno. Aunque las redes de fibras ordenadas y porosidad suficiente para la infiltración celular pueden ser difíciles de conseguir debido a la naturaleza aleatoria de la deposición de fibras electrohiladas, se han desarrollado métodos para aumentar la alineación y el tamaño de los poros con la adición de fibras de sacrificio. Sin embargo, estos procesos requieren equipos de electrohilado altamente especializados. Además, se utilizan a menudo disolventes fuertes tal como fluoroalcoholes para estabilizar los chorros de colágeno disuelto durante el proceso de electrohilado. Las características únicas de estos disolventes les permiten evaporarse de forma óptima de las fibras de colágeno autoensambladas y minimizar la deposición de fibras húmedas. Sin embargo, la exposición a disolventes puede desnaturalizar el colágeno y aumentar su solubilidad al entrar posteriormente en contacto con medios acuosos.

El proceso de electrohilado también expone el colágeno a altas fuerzas de cizallamiento, lo que puede limitar su capacidad de autoensamblarse en una conformación estable. Por lo tanto, las fibras de colágeno electrohiladas se deben reticular antes de su uso como biomaterial para evitar la disolución del colágeno en entornos acuosos, lo cual no es ideal debido a que los agentes de reticulación residuales pueden interferir con las aplicaciones posteriores. La fibrogénesis del colágeno basada en la extrusión también puede producir fibras de colágeno autoensambladas y no requiere fuerzas electrostáticas ni disolventes. Sin embargo, este proceso es lento y sólo produce cada vez una fibra relativamente gruesa. Se ha intentado agilizar esta técnica y generar redes de colágeno alineadas, pero una vez más el uso de equipos especializados y el grosor de las fibras que se forman limitan este método. Por último, ha habido varios ejemplos de ensamblaje de fibras de colágeno en dispositivos microfluídicos que, si bien son eficaces para promover la organización y la alineación de fibras de colágeno de tamaños apropiados, tienen graves limitaciones de rendimiento y formato que limitan las aplicaciones posteriores.

Sigue siendo necesario desarrollar métodos de producción de fibras de colágeno en plantilla que excluyan el uso de productos químicos tóxicos y procesos laboriosos que generen fibras de colágeno biocompatibles en plantilla alineadas adecuadas para formar construcciones de colágeno bidimensionales y tridimensionales que puedan utilizarse en aplicaciones médicas de bioingeniería y cicatrización de heridas.

También existe la necesidad de desarrollar fibras de colágeno que sean estables durante largos periodos de tiempo a las temperaturas de almacenamiento, transporte y uso final (por ejemplo, entre -20°C y 40°C). Esto elimina la necesidad de transportar y mantener los productos de colágeno mediante la cadena de frío. Alternativamente, los materiales de colágeno se pueden someter a procedimientos de liofilización para prolongar su vida útil, pero se sabe que estos procedimientos afectan a la estructura final del producto biomaterial. Así pues, la producción de fibras de colágeno que puedan secarse rápidamente a medida que se producen sin necesidad de congelarlas al vacío es muy deseable desde el punto de vista de la fabricación.

Además, este material no requeriría los procedimientos de esterilización intensiva utilizados para preparar productos biomateriales derivados de tejidos humanos o animales (por ejemplo, matrices o injertos descelurizados) y disminuiría la dependencia de tampones antimicrobianos de almacenamiento u otras soluciones acuosas de almacenamiento especializadas que a veces se utilizan para prevenir el crecimiento microbiano en biomateriales y prolongar la vida útil de los materiales que deben almacenarse en condiciones hidratadas.

Sumario

Se debe entender que la presente invención incluye una variedad de versiones o realizaciones diferentes, y este sumario no pretende ser limitativo ni exhaustivo. Este sumario proporciona algunas descripciones generales de algunas de las realizaciones, pero también puede incluir algunas descripciones más específicas de otras realizaciones.

La presente invención se refiere a un proceso de fabricación de biomateriales que utiliza polímeros de cadena larga tal como el dextrano para la fabricación de una tela basada en colágeno para una red de fibras de colágeno alineadas, siendo el proceso como se define en la reivindicación 1.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un constructo de red de fibras de colágeno bidimensional o tridimensional, el método que es como se define en la reivindicación 8.

Muchos de los problemas asociados con la vida útil de las fibras de colágeno existentes utilizando métodos de fabricación hasta la fecha se superan con los métodos y composiciones de la presente divulgación. Es probable que las fibras secas divulgadas ilustradas en el presente documento sean compatibles con otras formas de esterilización que puedan ser más fáciles de realizar, por ejemplo, gas de óxido de etileno, irradiación gamma o incluso autoclave.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A a 1D muestra una representación esquemática de la síntesis de fibras de polímero de colágenodextrano (CDP, por sus siglas en inglés) de acuerdo con varias realizaciones de la presente invención. La figura 1A representa la síntesis de las fibras de CDP.

La figura 1B muestra una representación esquemática de la platina posicionable con las fibras de CDP colocadas encima.

La figura 1C representa una representación esquemática de la platina posicionable con fibras de CDP colocadas en la parte superior en el primer ciclo, en tanto que un segundo ciclo de colocación de fibras de CDP se presenta a 90 grados con respecto al primer ciclo cuando la platina posicionable se gira en el sentido de las manecillas del reloj.

La figura 1D representa una representación esquemática de la platina posicionable con fibras de CDP colocadas en la parte superior en el primer ciclo, un segundo ciclo de colocación de fibras de CDP se produce a 90 grados con respecto al primer ciclo, y un tercer ciclo de colocación de fibras de CDP en la platina posicionable después de la rotación de la platina posicionable a 45 grados en el sentido de las manecillas del reloj del primer ciclo. La figura 2A representa una representación esquemática de la síntesis de fibras de CDP. Se pueden utilizar dos sustratos planos puestos en contacto con una solución viscosa de composición de polímero de colágeno-dextrano (CDP) para alargar las fibras de CDP. Las fuerzas adhesivas entre la solución de CDP y los sustratos se equilibran con las fuerzas cohesivas para extender las fibras de CDP a medida que se secan en una zona central.

La figura 2B es una fotografía que representa telas de CDP secas que son estables en almacenamiento y se pueden manipular fácilmente para una variedad de aplicaciones. Las telas de CDP también se pueden recortar a las dimensiones deseadas. Barras de escala, 1 mm.

La figura 2C representa una fibra de CDP individual que es uniforme y se puede fabricar y recolectar fácilmente. Se muestra una región de una fibra de CDP individual formada en imagen por microscopía de campo claro. Barras de escala, 50 |jm.

La figura 2D representa imágenes de estereomicroscopía de campo oscuro de telas de CDP de ejemplo que pueden contener fibras en varias configuraciones entrelazadas que incluyen haces paralelos, redes ortogonales y configuraciones de cuadrículas multidireccionales. Barras de escala, 500 jm .

La figura 2E representa micrografías de inmunofluorescencia de fibras de CDP después de la hidratación en las que el dextrano se disuelve rápidamente de las telas de CDP, dejando atrás una red de fibras de colágeno que corresponde a la configuración de plantilla seca. Las imágenes de inmunofluorescencia para C1A1, un anticuerpo que reconoce el colágeno helicoidal nativo, demuestran un autoensamblaje apropiado del colágeno. Barras de escala, 50 jm.

La figura 3A representa una gráfica de barras que compara la densidad de fibra frente a la fracción en masa de colágeno en la fibra de CDP seca.

La figura 3B representa una gráfica de barras que compara la densidad de fibra frente a la fracción en masa de colágeno en la fibra de CDP hidratada.

La figura 3C representa una gráfica de barras que compara el diámetro de la fibra (micrones) versus la fracción en masa de colágeno en la fibra de CDP seca.

La figura 3D representa una gráfica de barras que compara el diámetro de la fibra (micrones) versus la fracción en masa de colágeno en la fibra de CDP hidratada.

La figura 4 representa fotografías transcurridas en el tiempo de imágenes de microscopio óptico de disolución de dextrano de fibras de CDP en líquido.

La figura 5 representa micrografías de inmunofluorescencia que demuestran que las fibras que contienen fracciones de masa de colágeno de 0,004 o más forman redes de fibras de colágeno robustas que muestran inmunofluorescencia C1A1. Las fibras delicadas se forman esporádicamente para las fracciones de menor masa de colágeno. Escala, 20 jm .

La figura 6 representa una imagen de fotomicrografía de birrefringencia de fibra de colágeno representativa. Las fibras con diferentes orientaciones muestran características refractivas diferenciales cuando se someten a iluminación polarizada.

La figura 7 representa una imagen fotomicrográfica de una red de tela de colágeno representativa teñida con tinción tricrómica de Masson, que incluye tinción con azul de anilina responsable de la tinción de colágeno, lo que demuestra que las fibras de colágeno formadas después de la disolución de dextrano en fibras de CDP están altamente enriquecidas en colágeno.

La figura 8A representa una representación esquemática del proceso para formar un constructo de red de fibras de colágeno 2-D y 3-D de acuerdo con varias realizaciones de la presente invención. En una realización, como se muestra en la figura 8A, las telas de colágeno fabricadas de acuerdo con la presente invención se pueden inmovilizar en la superficie de hidrogeles de poliacrilamida para facilitar el análisis del crecimiento celular.

La figura 8B representa fotomicrografías de inmunofluorescencia de redes de colágeno que se muestran permaneciendo unidas a las superficies de hidrogel después del cultivo celular. Las imágenes mostradas son de inmunofluorescencia de C1A1 después de 3 días en cultivo. Las flechas indican regiones de deposición celular adicional de colágeno de tipo I. Todas las barras de escala, 50 |jm.

La figura 8C representa fotomicrografías de redes de colágeno teñidas con tinción nuclear de actina-faloidina y Hoechst de células que crecen a lo largo de las redes de fibras de colágeno mostradas en (figura 8B). Todas las barras de escala, 50 jm.

La figura 9A representa un histograma de la fracción de fibras versus la orientación de las fibras (paralela, ortogonal y multidireccional) cuando se seca.

La figura 9B representa un histograma de la fracción de fibras versus la orientación de las fibras (paralela, ortogonal y multidireccional) cuando están hidratadas.

La figura 10A representa una representación esquemática para la síntesis de un constructo de red de fibras de colágeno 3-D de acuerdo con varias realizaciones de la presente invención. Todas las barras de escala, 50 |jm. La figura 10B representa imágenes de fotomicrografías de epifluorescencia de actina-faloidina y tinción nuclear de Hoechst de tela de CDP y tela de dextrano (con y sin colágeno) que demuestran que las telas de CDP promueven la alineación a gran escala de células C2C12 encapsuladas en agarosa. No se observa alineación y crecimiento celular para las telas de dextrano de control que no contienen colágeno. Todas las barras de escala, 50 jm . La figura 10C representa fotomicrografías de imágenes de proyección confocal de máxima intensidad de alta resolución que muestran detalles de estructuras tipo fascículos alineadas en telas de CDP. El posicionamiento de los núcleos celulares y las estructuras del citoesqueleto interconectadas son indicativos de la formación de miotubos. No se observan miotubos y estructuras tipo fascículos para las células cultivadas con telas de dextrano de control (sin colágeno). Todas las barras de escala, 50 jm .

La figura 10D representa fotomicrografías de transferencias Western realizadas en lisados de células C2C12 que crecen a lo largo de redes de colágeno que contienen colágeno preparadas a partir de telas de CDP Se observan marcadores de diferenciación de células de músculo esquelético incluyendo cadena pesada de miosina y parvalbúmina.

La figura 11A muestra fotografías de hilos y tubos formados a partir de fibras de CDP

La figura 11B muestra fotografías de telas circulares de diferentes tamaños formadas a partir de hidroxipropilcelulosa y dextrano.

Estas figuras se proporcionan sólo a manera de ejemplo y no se propone que limiten el alcance de la invención.

Descripción detallada

Definiciones:

Con propósitos de la divulgación, salvo que se definan de otra manera, los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que normalmente se entendería por un experto en la técnica a la que pertenece la esta invención. Véase, por ejemplo Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, N.Y 1989). Dichas referencias se incorporan íntegramente a la presente divulgación.

Antes de describir las presentes composiciones y métodos, debe entenderse que cualquier invención no se limita a los procesos, composiciones o metodologías particulares descritos, ya que éstos pueden variar. Además, los procesos, composiciones y metodologías descritos en determinadas realizaciones son intercambiables. Por lo tanto, por ejemplo, una composición, régimen de dosificación, vía de administración, etc. descritos en una realización particular pueden utilizarse en cualquiera de los métodos descritos en otras realizaciones particulares. También debe entenderse que la terminología utilizada en la descripción tiene por objeto describir únicamente las versiones o realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se definan claramente de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que los entendidos comúnmente por un experto en la materia. Aunque cualquier método similar o equivalente a los descritos en el presente documento se puede utilizar en la práctica o el ensayo de las realizaciones de la presente invención, a continuación se describen los métodos preferidos.

Cabe señalar que, tal como se utilizan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen una referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Las realizaciones que incluyen la frase de transición "compuesto de" o "compuesto esencialmente de" incluyen únicamente los componentes e ingredientes inactivos mencionados.

En el presente documento, el término "aproximadamente" significa más o menos el 10% del valor numérico del número con el que se utiliza. Por lo tanto, alrededor del 50% significa entre el 45% y el 55%.

"Opcional" u "opcionalmente" puede entenderse en el sentido de que la estructura, el hecho o la circunstancia descritos a continuación pueden producirse o no, y que la descripción incluye tanto casos en los que se produce el hecho como casos en los que no.

El uso de valores numéricos en los diversos rangos especificados en esta solicitud, a menos que se indique expresamente lo contrario, se indican como aproximaciones como si los valores mínimo y máximo dentro de los rangos indicados estuvieran ambos precedidos por la palabra "aproximadamente". De este modo, se pueden utilizar ligeras variaciones por encima y por debajo de los intervalos indicados para obtener prácticamente los mismos resultados que los valores dentro de los intervalos. Además, a menos que se indique lo contrario, la divulgación de estos rangos se entiende como un rango continuo que incluye todos los valores entre el mínimo y el máximo.

Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la materia. Para las definiciones y los términos de la técnica, se recomienda consultar Current Protocols in Molecular Biology (Ansubel). Las abreviaturas de los residuos de aminoácidos son los códigos estándar de 3 letras y/o 1 letra utilizados en la técnica para referirse a uno de los 20 L-aminoácidos comunes.

El término "aminoácido" no sólo abarca los 20 aminoácidos comunes en las proteínas sintetizadas de forma natural, sino que también incluye cualquier aminoácido modificado, inusual o sintético. Un experto en la materia estaría familiarizado con los aminoácidos modificados, inusuales o sintéticos.

Tal y como se utiliza aquí, "proteína" es un polímero compuesto esencialmente por cualquiera de los 20 aminoácidos. Aunque "polipéptido" se utiliza a menudo en referencia a polipéptidos relativamente grandes, y "péptido" se utiliza a menudo en referencia a polipéptidos pequeños, el uso de estos términos en la técnica se solapa y es variado. Los términos "péptido(s)", "proteína(s)" y "polipéptido(s)" se utilizan aquí indistintamente.

Tal y como se utiliza aquí, el término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos y no a una longitud específica del producto. De esta forma, los péptidos, oligopéptidos y proteínas se incluyen en la definición de polipéptido. Este término tampoco excluye las modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Se incluyen en la definición, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto naturales como no naturales. Como es conocido en la técnica, las "proteínas", "péptidos", "polipéptidos" y "oligopéptidos" son cadenas de aminoácidos (típicamente L-aminoácidos) cuyos carbonos alfa están unidos mediante enlaces peptídicos formados por una reacción de condensación entre el grupo carboxilo del carbono alfa de un aminoácido y el grupo amino del carbono alfa de otro aminoácido. Normalmente, los aminoácidos que componen una proteína se numeran en orden, empezando por el residuo amino terminal y aumentando en dirección hacia el residuo carboxi terminal de la proteína.

Un polímero puede incluir un compuesto formado por la unión covalente de moléculas más pequeñas, que aquí se denominan residuos, o subunidades poliméricas, cuando se incorporan a un polímero. Antes de su incorporación a un polímero, los residuos suelen describirse como monómeros. Los polímeros pueden tener cualquier topología, incluyendo, sin limitación, cadena lineal, cadena ramificada, estrella, dendrítica, peine, etc. Una lista no limitante de polímeros útiles en los métodos y estructuras descritos en la presente incluye: dextrano y colágeno.

El término polipéptido "aislado" o "purificado", tal como se utiliza aquí, se refiere a un polipéptido que ha sido separado o purificado de los componentes celulares que lo acompañan de forma natural. Típicamente, el polipéptido se considera "purificado" cuando está al menos en un 70% (por ejemplo, al menos en un 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%) en peso seco, libre de las proteínas y moléculas naturales con las que está naturalmente asociado.

Como se utiliza aquí, el término "dextrano" significa un polisacárido de cadena larga formado a partir de enlaces glucosídicos alfa-1-6 de moléculas de glucosa.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "viscosidad" se refiere a la resistencia de un fluido al esfuerzo de cizallamiento o de tracción (el "espesor" de un fluido).

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "colágeno" se refiere generalmente a una proteína helicoidal abundante que se encuentra en los tejidos conectivos. Los tipos I, II, III, V, XI son colágenos fibrilares que forman una estructura jerárquica que va desde la triple espiral de tropocolágeno hasta las fibras y haces de fibras que se contemplan para su uso en la presente invención.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "fibra" se refiere generalmente a un material cilíndrico continuo y flexible cuya longitud es mucho mayor que el diámetro de su sección transversal. Otras expresiones para las dimensiones de las fibras pueden ser

Tal como se utiliza aquí, el término "tela" se refiere a un material formado a partir del tejido o la agregación de un gran número de fibras.

Tal y como se utiliza aquí, el término "pre-material" se refiere generalmente a una mezcla de partida o material sin procesar que se manipula para formar un material final, en este caso, una solución viscosa de dextrano y colágeno que se alarga y se seca en forma de fibra.

A. Fibras en plantilla de colágeno aisladas

En varias realizaciones de la presente invención, los inventores han descubierto un método para producir fibras de colágeno en plantilla a partir de composiciones poliméricas, por ejemplo, composiciones que contienen dextrano y colágeno (composiciones poliméricas de colágeno-dextrano (CDP, por sus siglas en inglés)). Las fibras producidas que pueden formarse a partir de cualquiera de los materiales enumerados en la TABLA 1 tienen longitudes y diámetros controlados. TABLA 1. Lista de polímeros capaces de formar fibras. Estos polímeros pueden utilizarse para producir formulaciones poliméricas alternativas útiles para la creación de redes de colágeno y otros materiales. Algunos de estos polímeros pueden reticularse tras la formación de las fibras para producir fibras que no se disuelvan en contacto con disolventes acuosos.

Tabla 1. Polímeros ejemplares capaces de formar fibras de acuerdo con los métodos aquí descritos.

A continuación, las fibras recogidas se manipulan colocando fibras individuales que se secan a medida que se forman sobre un sustrato posicionable. En el caso de las telas de CDP, los tejidos se tratan posteriormente para eliminar el dextrano dejando fibras de colágeno en plantilla y alineadas.

Las fibras poliméricas pueden colocarse en capas sobre un sustrato posicionable para formar telas organizadas con una alineación controlada de las fibras, superando muchas de las limitaciones de otros enfoques basados en fibras. Dependiendo del número de capas de fibra y de la orientación dentro de la tela, se pueden conseguir propiedades mecánicas únicas. En algunas realizaciones, los tejidos formados a partir de fibras poliméricas también son capaces de liberar agentes bioactivos a medida que las telas se degradan.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un enfoque de fabricación de biomateriales para desarrollar un método simple, rápido y versátil para generar fibras de colágeno de tamaños apropiados que se pueden organizar en redes para soportar el crecimiento bidimensional (2-D) y tridimensional (3-D) de células vivas, por ejemplo, células de músculo esquelético, células de cardiomiocitos, neuronas y células epiteliales. La presente invención proporciona un proceso de fabricación operable para producir un material basado en colágeno accesible y ajustable que puede ser prometedor como una matriz o andamiaje para apoyar el crecimiento de una amplia variedad de tipos de células adicionales, y como un material para ingeniería de tejidos, cicatrización y reconstrucción de heridas.

B. Soluciones de polímero

En diversas realizaciones, las composiciones de CDP utilizadas en los métodos descritos en la presente para hacer la plantilla y las fibras de colágeno alineadas comprenden, constan esencialmente de, o constan de colágeno y dextrano (composiciones de polímero de colágeno-dextrano (CDP)). La combinación de estos polímeros biocompatibles se puede hacer para ajustar el diámetro, la longitud y la reología de las composiciones de CDP combinadas. Por "biocompatible", se entiende que una composición de CDP y sus productos de degradación in vivo normales son citocompatibles y son sustancialmente no tóxicos y no cancerígenos en un paciente dentro de tolerancias útiles, prácticas y/o aceptables. Por "citocompatible", se entiende que las composiciones de CDP son sustancialmente no tóxicas para las células y habitualmente y más deseablemente pueden sostener una población de células y/o las composiciones poliméricas, andamiajes, dispositivos, copolímeros y productos de degradación de las mismas no son citotóxicas y/o cancerígenas dentro de tolerancias útiles, prácticas y/o aceptables. Por ejemplo, una composición de copolímero cuando se coloca en un cultivo de células epiteliales humanas no afecta negativamente la viabilidad, el crecimiento, la adhesión y la cantidad de células. En un ejemplo no limitante, los copolímeros, composiciones y/o dispositivos son "biocompatibles" en la medida en que son aceptables para usarse en un ser humano y un paciente veterinario de acuerdo con las normas reglamentarias aplicables en una jurisdicción legal determinada. En otro ejemplo, el colágeno biocompatible, cuando se implanta en un paciente, no causa una reacción adversa sustancial o daño sustancial a las células y tejidos en el cuerpo, por ejemplo, la composición o dispositivo de CDP no provoca necrosis o una infección que de por resultado daño a los tejidos, órganos o el organismo de las composiciones implantadas.

En algunas realizaciones, las composiciones de CDP comprenden, constan esencialmente de, o constan de colágeno: dextrano (p/p) en relaciones que varían de aproximadamente 1:1000 a aproximadamente 1:62, más preferiblemente, de aproximadamente 1:500 a aproximadamente 1:125 y todos los números enteros entre estos. En algunas realizaciones, la relación de colágeno a polvo de dextrano en masa (p/p) puede variar de aproximadamente 1 parte de colágeno a aproximadamente 500 partes de dextrano a aproximadamente 1 parte de colágeno a aproximadamente 125 partes de dextrano. En algunas realizaciones, el colágeno puede ser colágeno tipo I, tipo II, tipo III, tipo V, tipo XI, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la fuente del colágeno puede provenir de un animal mamífero, por ejemplo, porcino, bovino, murino, equino, ovino, caprino, humano, o combinaciones de los mismos. En la presente se contemplan otras fuentes de colágeno tipo I, tipo II, tipo III, tipo V, tipo XI o combinaciones de estas no citadas específicamente, pero que funcionan como aquellas enumeradas, incluidos colágenos recombinantes y reactivos asociados. En algunas realizaciones, el colágeno utilizado en la preparación de las composiciones de CDP puede incluir colágeno tipo I de un animal seleccionado de porcino, bovino, murino, equino, ovino, caprino, humano, o combinaciones de los mismos. Para la preparación de las composiciones de CDP, el colágeno se puede utilizar a concentraciones que varían de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 100 mg/mL, preferentemente de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL o más preferentemente de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL.

El dextrano útil en las composiciones de CDP descritas en la presente se puede obtener de una variedad de esquemas de producción. Cualquier polímero de dextrano puede encontrar utilidad en la presente invención, por ejemplo, un dextrano que tiene un polisacárido de cadena larga formado a partir de enlaces alfa-1-6 glicosídicos de moléculas de glucosa. En algunas realizaciones, el dextrano puede incluir dextranos de Clase 1 que contienen la estructura principal de D-glucopiranosilo unida a a (1^6 ) modificada con cadenas laterales pequeñas de ramificaciones de D-glucosa con enlace a(1^-2), a (1 ^ 3), y a(1^4). Los dextranos de clase 1 varían en su peso molecular, arreglo espacial, tipo y grado de ramificación, y longitud de las cadenas ramificadas, dependiendo de las cepas productoras de microbios y las condiciones de cultivo. La isomaltosa y la isomaltotriosa son oligosacáridos con la estructura principal de dextrano de clase 1. Se pueden utilizar dextranos de clase 2 (alternanos) que contengan una estructura principal de unidades D-glucopiranosilo alternas unidas a a (1 ^3 ) y a (1 ^ 6) con ramificaciones unidas a a(1^3). De manera similar, los dextranos de Clase 3 (mutanos) que tienen una estructura principal de unidades de D-glucopiranosilo unidas a a (1^3 ) consecutivas con ramificaciones unidas a a(1^6), se pueden utilizar en la formulación de las composiciones de CDP descritas en la presente. En algunas realizaciones, los dextranos útiles para usarse en la formulación de las composiciones de CDP descritas en la presente se producen por especies bacterianas o de levadura u hongos, por ejemplo,Leuconostoc spp.En diversas realizaciones, los dextranos útiles en la presente invención tienen un peso molecular promedio que varía de aproximadamente 40 a aproximadamente 1.000 kDa, por ejemplo, de aproximadamente 40 kDa. a aproximadamente 900 kDa., o de aproximadamente 40 kDa. a aproximadamente 800 kDa., o de aproximadamente 40 kDa. a aproximadamente 700 kDa., o de aproximadamente 40 kDa. a aproximadamente 600 kDa., o de aproximadamente 40 kDa. a aproximadamente 500 kDa., o de aproximadamente 40 kDa. a aproximadamente 400 kDa., o de aproximadamente 40 kDa. a aproximadamente 300 kDa., o de aproximadamente 40 kDa. a aproximadamente 250 kDa., o de aproximadamente 100 kDa. a aproximadamente 1000 kDa., o de aproximadamente 200 kDa. a aproximadamente 1000 kDa., o de aproximadamente 350 kDa. a aproximadamente 1000 kDa., o de aproximadamente 450 kDa. a aproximadamente 1000 kDa., o de aproximadamente 550 kDa. a aproximadamente 1000 kDa., o de aproximadamente 650 kDa. a aproximadamente 1000 kDa., o de aproximadamente 750 kDa. a aproximadamente 1000 kDa. En algunas realizaciones, el dextrano tiene un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 400 kDa a aproximadamente 600 kDa, o de aproximadamente 450 kDa a aproximadamente 550 kDa, o aproximadamente 500 kDa. En diversas realizaciones, el peso molecular promedio (Mw) de dextrano se puede calcular usando el peso molecular promedio en peso (Mw) que se puede calcular usando cromatografía en gel o cromatografía de permeación en gel usando estándares de dextrano con pesos moleculares de secuencia que varían de 8,8, 40, 71,9, 110, 200, 580 y 2000 kDa para la gráfica de una curva de calibración. En algunas realizaciones, la composición de CDP se prepara usando colágeno tipo 1 y dextrano de Leuconostoc spp. que tiene un peso molecular promedio en peso de aproximadamente, 500 kDa.

C. Métodos de fabricación de fibras de colágeno en plantilla

La invención contempla además métodos para producir las fibras de colágeno alineadas y en plantilla a partir de una composición de polímero de colágeno-dextrano. Una composición de polímero de colágeno-dextrano (CDP) de ejemplo se puede preparar al mezclar aproximadamente 1 parte de colágeno a aproximadamente 1000 partes de dextrano, o más preferentemente, mezclando aproximadamente 1 parte de colágeno a aproximadamente 500 partes de dextrano, o más preferentemente, mezclando aproximadamente 1 parte de colágeno a aproximadamente 125 partes de dextrano, o más preferentemente, mezclando aproximadamente 1 parte de colágeno a aproximadamente 62 partes de dextrano. En diversas realizaciones, la relación con base en (% p/p) de colágeno a dextrano en la composición de CDP puede variar de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1,57% de colágeno a aproximadamente 99,9% a aproximadamente 98,43% de dextrano, o más preferentemente, la relación basada en (% p/p) de colágeno a dextrano en la composición de CDP puede variar de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 0,79% de colágeno a aproximadamente 99,8% a aproximadamente 99,21% de dextrano. En ciertas realizaciones, la composición de<c>Dse mezcla extensamente para producir una pasta viscosa que tiene una viscosidad que varía de aproximadamente 15.000 centipoises a aproximadamente 100.000 centipoises, preferentemente de aproximadamente 19.000 centipoises a aproximadamente 90.000 centipoises usando el método de bola que cae vertical y un viscosímetro de bola que cae vertical cuando una solución de la composición de CDP se mide a 22°. Un viscosímetro de bola que cae tiene una bola esférica que cae a lo largo de un tubo que contiene el líquido de muestra que se va a medir, y este tubo está circundado concéntricamente por una chaqueta tubular para el control térmico. La teoría anterior usaba la ley de movimiento de Newton para describir la bola que cae alcanzando una velocidad terminal; por lo tanto, la fuerza neta de gravedad, flotabilidad, y arrastre es cero:

La fuerza de arrastre se expresa en el tercer término en el lado derecho del signo igual de acuerdo con la ley de Stokes, que es válida en la Ref. 1. Ec. (1) se puede expresar fácilmente de la siguiente forma:

Donde y es el peso específico,des el diámetro de la esfera y ut es la velocidad terminal. Los subíndices s yfrepresentan la esfera y el fluido, respectivamente. Ec. (2) se puede simplificar a la siguiente forma y es la misma que se reivindica en la norma:

p, w . dondeK - K* O )

18/

Dondeles la longitud de caída ytes el tiempo que pasa la longitud del.

Cuando se conocen las propiedades de material, las propiedades geométricas y el tiempo de caída, la viscosidad se puede obtener de la Ec. (2) o (3). En los estándares, el coeficiente deKse debe estimar al medir un líquido de referencia con una viscosidad conocida. Entonces, la viscosidad de un líquido desconocido se puede calcular fácilmente en la Ec. (3), cuando se conoce el tiempo de caída.

En ciertas realizaciones, la composición de CDP comprende una fracción en masa de colágeno:dextrano que varía de aproximadamente 0,0044 a aproximadamente 0,008. Una vez que se ha producido la composición de CDP, la composición se puede utilizar para sintetizar fibras de dextrano impurificadas con colágeno para la fabricación de telas basados en colágeno. En algunas realizaciones, la viscosidad mínima de la solución de dextrano necesaria para formar eficientemente fibras de CDP es de 19,500 centipoise, como se mide por el método de bola que cae (ver arriba). Varias muestras de dextrano pueden variar en la polidispersidad del polímero y requieren modificación de la concentración para lograr la viscosidad de trabajo. Además, si se utiliza un dextrano de diferente peso molecular, puede ser necesario optimizar la concentración requerida para producir la viscosidad deseada, que se puede lograr utilizando técnicas comunes conocidas por aquellos expertos en la técnica. La composición de CDP siempre debe disolverse completamente en soluciones acuosas, aunque sin una mezcla vigorosa puede tomar hasta 24 horas para que el dextrano se disuelva completamente. La solubilidad del dextrano y/o colágeno en la composición de CDP se puede ayudar al mezclar de manera rápida y completamente la solución de colágeno y el dextrano usando una punta de pipeta para obtener una pasta viscosa en menos de 2 minutos de mezcla.

En algunas realizaciones, el método de biofabricación para la fabricación de una tela basada en colágeno para una red de fibras de colágeno alineadas comprende los pasos:

a. proporcionar una composición de polímero de colágeno-dextrano (CDP) que comprende dextrano y colágeno; b. aplicar la composición de CDP a una primera superficie de un primer sustrato;

c. poner en contacto la composición de CDP con una primera superficie de un segundo sustrato, interponiendo de esta manera la composición de CDP entre el primer sustrato y el segundo sustrato;

d. formar una pluralidad de fibras de CDP alargadas presionando y separando el primer y segundo sustratos a lo largo de un eje horizontal, alargando de esta manera la composición de CDP y formando la pluralidad de fibras de CDP alargadas;

e. colocar las fibras de CDP alargadas en una platina posicionable formando de esta manera una capa de fibra de CDP o tela de CDP de fibras de CDP recolectadas; y

f. poner en contacto la capa de fibra de CDP o tela de CDP con un disolvente para disolver el dextrano en la capa de fibra de CDP o tela de CDP formando de esta manera la tela basada en colágeno.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método de biofabricación para la fabricación de una tela basada en colágeno para una red de fibras de colágeno alineadas. En realizaciones de ejemplo, el proceso comprende los pasos: a. proporcionar una composición de polímero de colágeno-dextrano (CDP) que comprende dextrano y colágeno; b. extruir la composición de CDP a través de un orificio que forma una fibra de CDP alargada; c. colocar una o más fibras de CDP alargadas en una platina posicionable formando de esta manera una capa de fibra de CDP o tela de CDP; y d. poner en contacto la capa de fibra de CDP o tela de CDP con un disolvente para disolver el dextrano en la capa de fibra de CDP o tela de CDP formando de esta manera la tela basada en colágeno.

En algunas realizaciones, la composición de CDP se puede extender sobre una superficie de un primer sustrato. El primer sustrato puede ser cualquier superficie que se adhiera a la composición de CDP. En algunas realizaciones, el primer sustrato es un sustrato plano. El primer sustrato puede tener cualquier forma, con al menos una superficie que pueda adherirse a la composición de CDP. El sustrato puede estar hecho de cualquier material sólido, incluyendo, por ejemplo, un metal, un vidrio, un material natural, por ejemplo, carbono, madera, sílice y similares. En algunas realizaciones, la composición de CDP se aplica a la superficie del primer sustrato de manera que se extiende, al menos parcialmente, sobre la superficie del primer sustrato. En algunas realizaciones, la composición de CDP forma una capa sobre al menos una superficie parcial de una superficie del primer sustrato. En algunas realizaciones, la capa de composición de CDP puede tener un grosor de 10-500 micras. Posteriormente, una primera superficie de un segundo sustrato se pone en contacto con la capa de composición de CDP de la superficie del primer sustrato para formar un sándwich de composición de CDP entre los dos sustratos. En algunas realizaciones, el segundo sustrato puede ser cualquier superficie que se adhiera a la composición de CDP. En algunas realizaciones, el segundo sustrato es un sustrato plano. El primer sustrato puede tener cualquier forma, con al menos una superficie que pueda adherirse a la composición de CDP. El segundo sustrato puede estar hecho de cualquier material sólido, incluyendo, por ejemplo, un metal, un vidrio, un material natural, por ejemplo, carbono, madera, sílice y similares.

Para crear las fibras de CDP, los dos sustratos se separan y se acercan durante 2 o más ciclos. A medida que los sustratos se separan, la composición de CDP entre los dos sustratos se alarga y forma una o más fibras de CDP. A continuación, las fibras de CDP alargadas se colocan en la superficie de una platina posicionable. En otras realizaciones ejemplares, los sustratos pueden ser depresores linguales, paletas, puntas de pipeta, portaobjetos de vidrio. En cada una de estas realizaciones ejemplares, las superficies del sustrato pueden comprender o estar hechas de un material sólido, por ejemplo, plástico, madera, vidrio, silicona,

En otras realizaciones, la composición de CDP se convierte en fibras utilizando cualquier método conocido en la técnica para forzar el fluido a través de un orificio, suficiente para formar fibras, por ejemplo, la composición de CDP se puede hacer pasar a través de un receptáculo, por ejemplo, una jeringa que contiene una boquilla estrecha (cualquier objeto que tenga orificios que sean capaces de extruir material). En diversas realizaciones, las fibras de CDP de la presente invención se extruyen. En algunas realizaciones, la extrusión de una composición de CDP puede incluir una bomba de jeringa, una jeringa, un tubo conductor y una aguja roma a través de la cual se extruye la composición de CDP para formar fibras de CDP alargadas que se colocan en la superficie de una platina posicionable. En una realización, se desgasifica una solución de CDP de colágeno y dextrano, se carga en la jeringa y se conecta a la tubería guía y a la aguja. La jeringa se coloca en posición relativa a la bomba de jeringa para que la bomba pueda actuar sobre la jeringa para extruir la solución de CDP. La tubería guía y la aguja se colocan adyacentes o en la parte superior de la platina posicionable. Aunque se utilizan una bomba de jeringa y una jeringa para ilustrar la extrusión de la solución de CDP de acuerdo con la presente invención, aquellos expertos en la técnica de extrusión de polímeros reconocerán que la extrusión también se puede llevar a cabo mediante el uso de otros dispositivos convencionales.

Como se utiliza en la presente, una "platina posicionable" es una platina, sustrato, superficie, plataforma, etc. que se puede manipular en términos de su rotación o posicionamiento en el espacio. La platina posicionable puede ser cualquier material capaz de mantener la longitud de las fibras de CDP alargadas. La forma de la platina posicionable puede ser cuadrada, rectangular, triangular, o circular. Preferentemente, tiene una primera región de contacto de fibra y una segunda región de contacto de fibra, tal que la fibra de CDP que tiene una forma en general cilíndrica tenga un primer extremo terminal y un segundo extremo terminal. La platina posicionable tiene una porción que es operable para ponerse en contacto con el primer extremo terminal de la fibra y una segunda porción que puede entrar en contacto con el segundo extremo terminal de la fibra tal que los extremos terminales de la fibra se soporten por la primera y segunda porciones de la platina posicionable. La platina posicionable puede ser completamente plana o hueca en el medio dejando un perímetro que puede servir para soportar los dos extremos de las fibras de CDP. En una realización ilustrativa, la platina posicionable puede ser un cuerpo que tiene una forma sustancialmente cilíndrica, en donde el cuerpo define una superficie externa y una superficie interna, una superficie de extremo proximal, y una superficie de extremo distal en donde cada una de la superficie de extremo proximal y la superficie de extremo distal une la superficie externa a la superficie interna, y en donde la superficie interna define un pasaje que se extiende a través del cuerpo desde la superficie de extremo proximal a la superficie de extremo distal. El pasaje es accesible desde una abertura proximal formada por la superficie de extremo proximal y una abertura distal formada por la superficie de extremo distal en donde el pasaje se define en un ejemplo, por un diámetro interno en donde la superficie externa se define por un diámetro externo, en donde el cuerpo se define por un espesor que se extiende entre la superficie interna y la superficie externa en donde el cuerpo se define además por una longitud que se extiende entre la superficie de extremo proximal y la superficie de extremo distal.

En algunas realizaciones, las platinas son platinas de traslación y/o rotación que se pueden posicionar en que se pueden mover en una, dos o tres dimensiones, permitiendo y facilitando el movimiento relativo de, por ejemplo, las fibras de CDP alargadas que se colocan en su superficie. El movimiento de las platinas en una, dos o tres dimensiones se puede realizar manualmente o por el uso de controladores mecánicos o electromecánicos. El movimiento de las platinas de posición se puede controlar por computadora, tal que las tareas tal como la colocación de las fibras de CDP alargadas en la platina de posición se puedan controlar y repetir precisamente, lo que facilita la fabricación de telas de CDP utilizando las tecnologías descritas en la presente. El diseño de sistemas mecánicos, eléctricos, informáticos y robóticos apropiados y efectivos para realizar los pasos descritos en la presente se encuentran dentro de las capacidades de aquellos expertos en la técnica del diseño de sistemas mecánicos, eléctricos, informáticos y robóticos.

En el contexto del movimiento de traslación de una platina posicionable, se puede decir que la dirección del movimiento tiene un vector en cualquier dirección, lo que significa que puede moverse en cualquier dirección que exhiba movimiento a lo largo del eje indicado. La rotación de una forma de hilado de la platina de posición con relación a las fibras de CDP alargadas tendrá un efecto en el patrón de deposición de estas fibras.

En varias realizaciones, se recolectan 5 o más fibras de CDP alargadas y se colocan en la superficie de la platina de posición por ciclo, con múltiples ciclos de colocación de fibras de CDP que dan por resultado telas de fibras en plantilla controladas. La rotación de la platina de posición en el sentido de las manecillas del reloj o en sentido contrario a las manecillas del reloj creará, por ejemplo, una orientación ortogonal u otra orientación direccional de las fibras de CDP, creando de esta manera una tela de CDP que puede tener una colocación controlada de las fibras y una separación controlada entre las fibras.

Una vez que las fibras de CDP alargadas se han colocado en la platina de posición en uno o más ciclos de colocación, la tela de CDP se puede dejar secar en condiciones ambientales, o se pueden secar colocando la tela en un ambiente de temperatura y/o humedad controlada. El siguiente paso en la preparación de la tela basada en colágeno requiere la remoción del dextrano de la tela de CDP. En algunas realizaciones, las fibras de CDP o la tela de CDP se pueden hidratar para disolver el dextrano dejando una capa de fibras, o una pluralidad de capas de fibras (una tela) compuesta completamente de colágeno. La hidratación se puede realizar en una solución acuosa. Por ejemplo, las soluciones acuosas ilustrativas pueden incluir, pero no se limitan a: agua, un agente amortiguador de fosfato, solución salina fisiológica de NaCl al 0,9%, Tris 50 mM, solución salina amortiguada con Tris de NaCl 150 mM, solución de Ringer lactada, solución de Ringer-acetato, medios de cultivo de tejido, o combinaciones de los mismos. Las fibras de colágeno resultantes no son estables en agua. La hidratación se puede llevar a cabo al dejar caer las fibras de colágeno o la tela de colágeno directamente en el líquido. En algunas realizaciones, para evitar que las fibras de colágeno se rompan o pierdan su orientación debido a las fuerzas interfaciales de airelíquido y la convección de la disolución rápida de dextrano, las fibras o la tela se pueden hidratar suavemente en un sustrato semihúmedo tal como un hidrogel.

La morfología de la tela de colágeno seco (diámetro de fibra, longitud, orientación, densidad (fibras/mm2)) se puede caracterizar por estereomicroscopia de campo oscuro. También es posible caracterizar la morfología de la fibra de colágeno mediante microscopía electrónica de barrido. Además, se pueden medir las propiedades de tracción de tela seca. Si las fibras de colágeno o la tela de colágeno están hidratados, las fibras de colágeno hidratadas se pueden caracterizar por microscopía de contraste de fase, microscopía de luz polarizada para observar la birrefringencia, tinción inmunofluorescente con anticuerpos dirigidos a la forma helicoidal no desnaturalizada de colágeno, tinción con azul de anilina, o por observación de la unión y el crecimiento celular alineados. En diversas realizaciones, las fibras de colágeno hidratado resultantes producidas de esta manera de acuerdo con los presentes métodos descritos en la presente, pueden tener diámetros que varían de aproximadamente 0,1 |jm a aproximadamente 500 jm , o de aproximadamente 1 jm a aproximadamente 100 jm . En diversas realizaciones, las fibras de colágeno producidas de esta manera de acuerdo con las diversas realizaciones de la presente invención, tienen longitudes que varían de 1 mm a 10 m, por ejemplo, 1 mm a aproximadamente 5 m, o por ejemplo, 1 mm a aproximadamente 10 cm. Por consiguiente, las fibras de colágeno producidas de acuerdo con los métodos descritos en la presente tienen relaciones de aspecto (diámetro de fibra:longitud de fibra) que varían de aproximadamente 1:2*103 a aproximadamente 1:1*10®

D. Métodos para usar fibras de colágeno en plantilla y telas de colágeno

En algunas realizaciones, la composición de CDP se puede utilizar para producir una pluralidad de fibras de dextrano impurificadas con colágeno. En algunas realizaciones, las fibras de colágeno producidas en los métodos descritos en la presente se pueden utilizar para construir andamiajes biológicos bidimensionales (2-D) o tridimensionales (3-D) y se proporcionan métodos para preparar andamiajes biológicos. Como se utiliza en la presente, un "andamiaje biológico" se refiere a un andamiaje que se utiliza con materiales biológicos, tal como proteínas, células, orgánulos, órganos, u organismos. Los ejemplos no limitantes de células incluyen, pero no se limitan a, células progenitoras aisladas de la sangre periférica, o se puede utilizar hueso que se puede inducir a diferenciarse en diferentes células, células madre, células madre comprometidas, y/o células diferenciadas. Además, dependiendo del tipo de tejido u órgano que se está fabricando, se pueden utilizar tipos específicos de células madre comprometidas. Por ejemplo, las células de mioblastos se pueden utilizar para construir diversas estructuras musculares. Se pueden utilizar otros tipos de células madre comprometidas para producir órganos o tejidos tipo órganos tal como corazón, riñón, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra. Otras células incluyen, pero no se limitan a, células endoteliales, células musculares, células de músculo liso, fibroblastos, osteoblastos, mioblastos, neuroblastos, fibroblastos, glioblastos; células germinales, hepatocitos, condrocitos, queratinocitos, células de músculo cardíaco, células de tejido conectivo, células epiteliales, células secretoras de hormonas, células del sistema inmunitario, neuronas, células del corazón, riñón, hígado, páncreas, bazo, vejiga, uréter y uretra, y similares. En algunas realizaciones, no es necesario preseleccionar el tipo de célula madre que se va a utilizar, porque se puede inducir que muchos tipos de células madre se diferencien en un patrón específico de órgano una vez administrado a un órgano determinado. Por ejemplo, se puede inducir que una célula madre entregada al hígado se convierta en una célula hepática simplemente colocando la célula madre dentro del entorno bioquímico del hígado.

Los ejemplos también incluyen células que se han modificado genéticamente, células transformadas, y células inmortalizadas. Un ejemplo de células genéticamente modificadas útiles en la presente invención es una célula genéticamente modificada que produce y secreta una o más moléculas deseadas. Cuando se implantan constructos de red de fibras de colágeno 2-D o 3-D que comprenden células genéticamente modificadas en un organismo, las moléculas producidas pueden producir un efecto local o un efecto sistémico, y pueden incluir las moléculas identificadas anteriormente como posibles sustancias.

Las células pueden producir sustancias que inhiben o estimulan la inflamación; facilitan la curación; resisten el inmunorrechazo; proporcionan reemplazo hormonal; reemplazan los neurotransmisores; inhiben o destruyen las células cancerosas; promueven el crecimiento celular; inhiben o estimulan la formación de vasos sanguíneos; aumentan el tejido; y para complementar o reemplazar el siguiente tejido, neuronas, piel, líquido sinovial, tendones, cartílago, ligamentos, hueso, músculo, órganos, duramadre, vasos sanguíneos, médula ósea, y matriz extracelular. Los constructos de red de fibras de colágeno 2-D o 3-D biológicas de la presente invención son habitualmente biocompatibles y pueden ser bioerosionables. Los andamiajes bioerosionables se disuelven durante un período de tiempo fijo cuando se colocanin vivoy/o en cultivoin vitro.

En algunas realizaciones, las telas de colágeno producidas de acuerdo con la presente invención encuentran uso en la fabricación de constructos de red de fibras de colágeno 2-D o 3-D. En algunas realizaciones, los métodos para fabricar un constructo de red de fibras de colágeno 2-D o 3-D pueden incluir los pasos de: proporcionar una tela basada en colágeno que comprende fibras de CDP alargadas; y colocar al menos una superficie de la tela basada en colágeno en la superficie de una matriz de hidrogel porosa. Los constructos de red de fibras de colágeno 2-D y 3-D se pueden hacer colocando las fibras de CDP o la tela de CDP dentro o sobre la superficie de un material de hidrogel poroso. Opcionalmente, el dextrano se puede remover de las fibras de CDP o tela de CDP y sumergir o colocar las fibras de colágeno o tela de colágeno resultantes en el material de hidrogel poroso o en la superficie del material de hidrogel poroso. En algunas realizaciones, las fibras de CDP o tela de CDP, o fibras de colágeno o tela de colágeno de la presente invención se pueden tratar con factores de crecimiento celular, citocinas, factores de diferenciación, anticuerpos, lípidos de ácidos nucleicos y otros factores o agentes biológicos que pueden atraer, ayudar a crecer, diferenciar o afectar alguna función biológica de células que se ponen en contacto con el constructo de red de fibras de colágeno 2-D o 3-D. Las fibras de CDP o la tela de CDP, o las fibras de colágeno o la tela de colágeno de la presente invención se pueden tratar con aditivos o fármacos antes de la implantación (antes o después de que las fibras de CDP o la tela de CDP, o las fibras de colágeno o la tela de colágeno se siembren con células), por ejemplo, para promover la formación de nuevo tejido después de la implantación. Por lo tanto, por ejemplo, se pueden adicionar factores de crecimiento, citocinas, componentes de la matriz extracelular y otros materiales bioactivos a las fibras de CDP o tela de CDP, o fibras de colágeno o tela de colágeno para promover la cicatrización del injerto y la formación de nuevo tejido. En general, estos aditivos se seleccionarán de acuerdo con el tejido u órgano que se reconstruye o aumenta, para garantizar que se forme un nuevo tejido apropiado en el órgano o tejido injertado (para ejemplos de estos aditivos para usarse en la promoción de la curación ósea, ver, por ejemplo, Kirker-Head, C. A. Vet. Surg. 24 (5): 408-19 (1995)). Por ejemplo, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos de América N. ° 5,654,273 incorporada en la presente como referencia) se puede emplear para promover la formación de nuevo tejido vascular. Se pueden adicionar factores de crecimiento y otros aditivos (por ejemplo, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de tipo epidérmico de unión a heparina (HBGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), citocinas, genes, proteínas y similares) en cantidades en exceso de cualquier cantidad de estos factores de crecimiento (si los hay) que se pueden producir por las células sembradas en el sustrato. Estos aditivos se proporcionan preferentemente en una cantidad suficiente para promover la formación de nuevo tejido de un tipo apropiado para el tejido u órgano, que se va a reparar o aumentar (por ejemplo, provocando o acelerando la infiltración de células hospedadoras en el injerto). Otros aditivos útiles incluyen agentes antibacterianos tal como anti bióticos.

En una realización no limitante, las fibras de CDP o la tela de CDP, o las fibras de colágeno o la tela de colágeno de la presente invención se pueden tratar adicionalmente para proporcionar una superficie biocompatible. Por ejemplo y sin limitación, las fibras de CDP o tela de CDP, o fibras de colágeno o tela de colágeno de la presente invención se pueden tratar para proporcionar una superficie esterilizada para proteínas y/o células. Los ejemplos no limitantes de tratamientos de esterilización incluyen: exposición a luz ultravioleta; irradiación, tal como irradiación gamma; exposición a disolventes asépticos, tal como etanol; y exposición a plasma. En otro ejemplo no limitante, las fibras de CDP o la tela de CDP, o las fibras de colágeno o la tela de colágeno de la presente invención se pueden tratar con un agente para proporcionar una superficie biocompatible y/o citocompatible. Los ejemplos no limitantes de agentes incluyen: factores de crecimiento de proteínas, anticuerpos, moléculas de ácidos nucleicos, carbohidratos, y similares. Los factores de crecimiento útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a), factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), que incluyen isoformas ácidas de FGF 1 y 2, forma básica de FGF 2 y FGF 4, 8, 9 y 10, factores de crecimiento nervioso (NGF) que incluyen NGF 2.5 s, NGF 7.0 s y beta NGF y neurotrofinas, factor neurotrófico derivado de cerebro, factor derivado de cartílago, factores de crecimiento óseo (BGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico, factor de crecimiento tipo insulina (IGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento tipo insulina (IGF) I y II, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento neurotrófico glial (GDNF), factor de células madre (SCF), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factores de crecimiento de transformación (TGF), que incluyen TGF alfa, beta, betal, beta2, beta3, factor de crecimiento esquelético, factores de crecimiento derivados de matriz ósea, y factores de crecimiento derivados de hueso y mezclas de los mismos.

Las citocinas útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, cardiotrofina, factor derivado de células estromales, quimiocina derivada de macrófagos (MDC), actividad estimulante del crecimiento de melanoma (MGSA), proteínas inflamatorias de macrófagos 1 alfa (MIP-1 alfa), 2, 3 alfa, 3 beta, 4 y 5, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6,L-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, TNF-a, y TNF-p. Las inmunoglobulinas útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, y mezclas de los mismos. Algunos factores de crecimiento preferidos incluyen VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), NGF (factores de crecimiento nervioso), PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, FGFb, FGFa, y BGF.

Otras moléculas útiles como agentes terapéuticos o biológicos incluyen, pero no se limitan a, hormonas de crecimiento, leptina, factor inhibidor de leucemia (LIF), endostatina, trombospondina, proteína-1 osteogénica, proteínas 2 y 7 morfogenéticas óseas, osteonectina, péptido de tipo somatomedina, osteocalcina, interferón alfa, interferón alfa A, interferón beta, interferón gamma, e interferón 1 alfa.

Las realizaciones que implican aminoácidos, péptidos, polipéptidos, y proteínas pueden incluir cualquier tipo o combinaciones de tales moléculas de cualquier tamaño y complejidad. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, proteínas estructurales, enzimas y hormonas de péptidos. Estos compuestos pueden cumplir una variedad de funciones. En algunas realizaciones, las fibras de CDP o la tela de CDP, o las fibras de colágeno o la tela de colágeno se pueden poner en contacto con péptidos que contienen una secuencia que suprime la actividad enzimática a través de la competencia por el sitio activo. En otras aplicaciones, los agentes antigénicos que promueven una respuesta inmunitaria e invocan inmunidad se pueden incorporar en un constructo. En sustancias tal como ácidos nucleicos, puede estar presente cualquier ácido nucleico. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, ácido desoxirribonucleico (ADN), y ácido ribonucleico (ARN). Las realizaciones que involucran ADN incluyen, pero no se limitan a, secuencias de ADNc, secuencias de ADN naturales de cualquier fuente, y oligonucleótidos sentido o antisentido. Por ejemplo, el ADN puede estar desnudo (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos de América No. 5,580,859; 5,910,488) o complejadas o encapsuladas (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos de América Núm. 5,908,777; 5,787,567). El ADN puede estar presente en vectores de cualquier tipo, por ejemplo, en un vector viral o de plásmido. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos utilizados servirán para promover o inhibir la expresión de genes en células dentro y/o fuera de la matriz electrohilada. Los ácidos nucleicos pueden estar en cualquier forma que sea efectiva para mejorar su captación en las células.

Durante el uso, las fibras de CDP o la tela de CDP, o las fibras de colágeno o la tela de colágeno de la presente invención, se pueden depositar en cualquier recipiente de cultivo celular adecuado, incluyendo recipientes de plástico o vidrio, tal como matraces, placas, botellas, o cualquier recipiente adecuado para cultivar células o tejido, o en la superficie de cualquier hidrogel adherente o no adherente, y entonces se incuban con medio de cultivo de tejido y/o hidrogeles de agarosa o poliacrilamida de bajo punto de gelificación para formar constructos de red de fibras de colágeno 2-D o 3-D.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir un constructo de red de fibras de colágeno 2-D o 3-D, el método que comprende: a. proporcionar una tela de polímero de colágenodextrano (CDP) que comprende fibras de<c>Dcomo se describe anteriormente; y b. poner en contacto la tela de CDP en al menos una superficie de una matriz de hidrogel porosa.

Estos constructos de red de fibras de colágeno 2-D o 3-D permiten que las células se adhieran, se alineen y crezcan en patrones que más representan el crecimiento y/o la diferenciación de estas células o células como ellas en el tejido natural. De acuerdo con un aspecto de los métodos descritos en la presente, se proporcionan métodos para cultivar células. Como se utiliza en la presente, "células en crecimiento" se refiere a mantener las células en cultivo, incluyendo pero no limitado a la adhesión, proliferación, migración, diferenciación y/o agregación de células.

Como se describe en la presente, la migración celular, la orientación y la forma se pueden dictar por la orientación de la fibra de colágeno de la red de fibras de colágeno 2-D o 3-D preparada de acuerdo con los métodos descritos en la presente. En una realización no limitante, los miotúbulos se pueden fabricar al depositar una célula precursora muscular sobre haces de fibras sustancialmente paralelas de colágeno solas o en combinación con otros polímeros. Las células hepáticas se pueden cultivar en capas cruzadas de fibras de colágeno. Las neuronas de las células madre neurales podrían aprovecharse en concentraciones más altas en estos andamiajes. Otras células que se pueden incorporar en constructos de red de fibras de colágeno 2-D o 3-D de la presente invención pueden incluir, fibroblastos, condrocitos, osteoblastos, miocitos, hepatocitos, neuronas, y precursores de células, tal como células madre embrionarias, células adiposas, células madre de folículo piloso, células madre cardíacas, mioblastos, células madre neuronales, y células madre mesenquimatosas. En algunas realizaciones, el constructo de red de fibras de colágeno 2-D y/o 3-D también puede contener un agente bioactivo, que puede incluir, fármacos de molécula pequeña, antifúngicos/antimicóticos, factores de coagulación, citocinas, quimiocinas, anticuerpos terapéuticos, metales iónicos, sales metálicas, nanopartículas y nanomateriales orgánicos e inorgánicos, ensamblajes de nanomateriales, partículas de vidrio, micropartículas de polímero sintético y natural, materiales de matriz polimérica sintética y natural, laminina, elastina, fibronectina, proteoglicanos, otros tipos de colágeno, enzimas, constructos de genes (ARNip, plásmidos, virus, etc.), microburbujas, células eucariotas y procariotas.

En una realización, los constructos de red de fibras de colágeno 2-D o 3-D preparadas de acuerdo con los métodos descritos en la presente se pueden utilizar para organizar células musculares en estructuras tipo fascículos. En el tejido muscular, los fascículos están presentes en varios patrones, dando lugar a propiedades únicas de generación de fuerza dentro del tejido. Dentro de cada fascículo, los grupos de células musculares se organizan por fibras de colágeno, que se pueden extender a lo largo o a través de las células musculares, antes de insertarse finalmente en los tendones. Las redes de fibras de colágeno 2-D o 3-D preparadas de acuerdo con la presente invención son especialmente adecuadas para fabricar modelos de tejido que muestren este patrón de alineación de fibras de colágeno y células.

Una característica atractiva de la red de fibras de colágeno 2-D o 3-D como se describe en la presente, es que permite que las células encapsuladas dentro de los hidrogeles se alarguen y crezcan en redes. Este es uno de los aspectos más desafiantes del cultivo de células 3-D que limita la aplicabilidad de muchos sistemas de hidrogel como modelos in vitro y como materiales para medicina regenerativa. Además de la formación de miotubos en el músculo esquelético, varios otros tipos de células, tal como células neurales y células vasculares, dependen de la formación de redes para la función fisiológica apropiada. Puesto que se ha demostrado que el colágeno apoya el crecimiento de estos tipos de células y muchos otros tipos de células, la invención descrita en la presente puede resultar beneficiosa para construir muchos tipos diferentes de tejidos modelo. Además, dado que la red de fibras de colágeno 2-D o 3-D producida de acuerdo con la presente invención es una estructura independiente, es altamente versátil y se puede aplicar para funcionalizar muchos otros tipos de andamiajes y superficies de hidrogel, por ejemplo, otros hidrogeles no adherentes tal como alginato o diacrilato de polietilenglicol.

Las células se pueden cultivar en medios de cultivo apropiados para el crecimiento y la diferenciación de cualquier tipo celular determinado. Los factores de crecimiento y las citocinas, como se conocen en la técnica, se pueden utilizar para inducir el crecimiento y la diferenciación celular. La elección de las células para propagarse dentro de la matriz depende del uso previsto. Las células madre (totipotentes, pluripotentes o multipotentes) u otras células precursoras serían útiles para producir muchos tipos de células. Las células progenitoras musculares serían útiles para producir tejido muscular. Los hepatocitos serían útiles para producir tejido hepático. Las células aórticas o los cardiomiocitos serían útiles para producir tejido muscular aórtico o cardíaco. Las células madre neurales serían útiles para producir tejido nervioso. Se pueden fabricar diferentes formas de forma para diferentes usos finales.

Otros usos de ejemplo incluyen pero no se limitan a: 1) Reconstrucción y curación de lesiones cutáneas y de membranas mucosas (por ejemplo, quemaduras, abrasiones, escisiones quirúrgicas, infecciones y ulceración); 2) Reconstrucción del sistema musculoesquelético (incluyendo componentes de tejido individuales tal como músculo, tendón y hueso, así como combinaciones de distintos componentes de tejido e interfaces entre componentes). Esto sería útil para la reconstrucción quirúrgica después de una lesión traumática como lesiones en el campo de batalla, accidentes automovilísticos, necrosis grave por infección o envenenamiento, y lesiones deportivas, así como muchas otras lesiones; y 3) reparación cardiovascular y del sistema nervioso: por ejemplo, parches para reparar el daño cardíaco, materiales componentes para válvulas y stents cardíacos bioartificiales, constructos tubulares para la reparación/guía nerviosa o vascular, fibras hemostáticas para controlar el sangrado durante la cirugía vascular. Un experto en la técnica puede prever fácilmente otros usos para curar el tejido dañado, para crear materiales de ingeniería tisular para reemplazar o aumentar el tejido sano o dañado, y para muchos sistemas de administración de fármacos (medicamentos, factores de crecimiento, citocinas, etc.) que requieren administración de fármacos no inmunogénica, a corto plazo (de 1 día a 3 meses) o a largo plazo (> 3 meses) a un sujeto en necesidad de esto.

E. Artículos de Fabricación

La presente invención también proporciona fibras de CDP útiles en la fabricación de diversos artículos que incorporan fibras de colágeno alineadas y en plantilla. En algunas realizaciones de ejemplo, los artículos de fabricación que incorporan las fibras de colágeno de la presente invención pueden ser útiles en la fabricación de artículos para uso en el campo de biotecnología y/o medicina. En algunos ejemplos ilustrativos, estos artículos podrían incluir: telas para aumentar el crecimiento celular en condiciones de cultivo celular bidimensionales y tridimensionales. Las aplicaciones adicionales incluyen la administración de fármacos (por ejemplo, agentes hemostáticos y antibióticos) para usarse como materiales avanzados para la cicatrización de heridas.

Adicionalmente, los hilos/fibras de la presente invención se pueden utilizar para construir constructos de órganos de tejido modificados, o partes de constructos de órganos, por ejemplo, corazón, válvulas cardíacas, hígado, riñón, y similares. La capacidad de utilizar materiales y matrices tipo textiles para modificar tejidos u órganos crea una amplia variedad de aplicaciones de reemplazo de tejidos por bioingeniería. Los ejemplos de componentes de bioingeniería incluyen, pero no se limitan a, vasos sanguíneos, corazón, hígado, riñón, músculo esquelético, músculo cardíaco, y guías nerviosas. En algunas realizaciones, estas matrices se combinan con agentes terapéuticos que mejoran la función del implante. Por ejemplo, se pueden adicionar antibióticos, antiinflamatorios, anestésicos locales o combinaciones de estos a la matriz de un órgano de bioingeniería para acelerar el proceso de curación y reducir la incomodidad.

G.Ejemplos

Ejemplo 1. Producción de fibras alargadas de CDP que contienen composiciones de CDP

Materiales usados

Bloque de construcción de dextrano (peso molecular 500.000 g/mol) de Dextran Products Ltd. (Scarborough, ON Canadá). Rotación específica (solución al 2% en peso) de 195° y viscosidad intrínseca (solución al 1% en peso, 37°C) de 0,58 dL/g. Dextrano de alta pureza de calidad técnica (peso molecular 500.000 g/mol) de Pharmacosmos (Holbaek, Dinamarca). Ambos tipos de dextrano tienen viscosidades similares. La viscosidad de las soluciones de dextrano se calculó por el método de bola que cae. Se utilizó un rodamiento esférico de bolas de acero inoxidable de 0,399 cm de diámetro y 0,2611 g de peso, medido utilizando un calibre digital con una exactitud de 0,02 mm y una balanza analítica con una exactitud de 0,1 mg, respectivamente, para realizar la prueba dentro de un tubo cónico de poliestireno. Se utilizó un temporizador digital con una exactitud de 1 mseg y una regla con una precisión de 0,5 mm para registrar el tiempo y la distancia recorrida por la bola a través del 35, 40, 45, 50 y 55% en peso de dextrano disuelto en agua. Antes de la prueba, las soluciones de dextrano se limpiaron de burbujas de aire por centrifugación a 3000 rcf durante 15 minutos. La densidad de cada solución de dextrano se midió entonces usando un densitómetro de tubo en U oscilante de mano con una exactitud de 0,001 g/cm3.

Resultados: La viscosidad se calculó de acuerdo con

2 ( AP)ga2

9v

donde (AP) es la diferencia de densidad entre la solución de dextrano y el rodamiento de bolas, g es la aceleración debida a la gravedad, a es el radio del rodamiento de bolas y v es la velocidad del rodamiento de bolas que se desplaza a través de la solución de dextrano.

Densidad de las soluciones de dextrano - La densidad incrementa linealmente en función del % en peso de dextrano. La regresión calculada fue y=0,0044x 0,9937. La solución de dextrano al 55% era demasiado viscosa para medirla utilizando el densitómetro de tubo en U, por lo tanto, se utilizó un valor de 1,2357 (y=0,0044 x 55 0. 9937. para la base de cálculo de viscosidad en datos extrapolados.

Ambos forman fibras. El colágeno tipo I (cola de rata, alta concentración) se compró de Corning (Corning, NY EE. UU.). Todos los demás productos químicos eran de grado reactivo o mejor y se utilizaron sin modificación o purificación adicional.

Proceso

1. Mezclar el dextrano seco (1 g) con agua ultrapura/colágeno (1 g) agitando vigorosamente con una punta de pipeta para producir una pasta viscosa de dextrano al 50%.

2. Aplicar una capa delgada de pasta de dextrano al 50% a dos palillos depresores de lengua estériles.

3. Presionar repetidamente y separar los palillos tal que las fibras de dextrano altamente viscoso se alarguen entre los dos palillos.

4. Recolectar las fibras alargadas secas sobre la parte superior de un vaso de precipitados de 5,5 cm de diámetro.

5. Repetir este procedimiento el número deseado de veces, mientras gira el vaso de precipitados un ángulo predeterminado entre cada ciclo.

6. Almacenar la tela seca en condiciones ambientales hasta el uso.

Ejemplo 2.Fabricación de hidrogel de poliacrilamida 2-D (constructo de red de fibras de colágeno 2-D)

1. Activar los cubreobjetos de vidrio limpios (22 x 22 mm) en una placa calentadora a 95 °C por cobertura con 500 |jL de NaOH 0,1N.

2. Evaporar el NaOH y aplicar 500 jL de ddH<2>O para mejorar la uniformidad del recubrimiento superficial. Entonces evapore el ddH<2>O.

3. Tratar los cubreobjetos recubiertos de NaOH con una solución al 4% de (3-aminopropil)trietoxisilano en acetona durante 15 min a temperatura ambiente, lavar tres veces en ddH<2>O y secar al aire.

4. Tratar los cubreobjetos con una solución al 0,8% de glutaraldehído en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente, lavar tres veces en ddH<2>O y secar al aire.

5. Formar hidrogeles de poliacrilamida uniformes (módulo de cizallamiento -8,64) a partir de soluciones que constan de acrilamida al 7,5%, bis-acrilamida al 0,3%, persulfato de amonio al 0,08% y Temed al 0,001% entre los cubreobjetos recubiertos con glutaraldehído (unión) y portaobjetos de vidrio tratados con triclorosilano (liberación).

6. Remover los cubreobjetos de acrilamida polimerizada de los portaobjetos y lavarlos tres veces en ddH20, 7. Para proporcionar sitios para la unión de fibras de colágeno, funcionalizar las superficies de poliacrilamida mediante incubación en una solución de 2 mg/ml de sulfo-SANPAH bajo luz UV durante 5 minutos.

8. Lavar los cubreobjetos cinco veces en ddH20 y una última vez en DMEM.

9. Remover el DMEM, aplicar telas de colágeno secas (~10 capas de espesor) a las superficies de acrilamida y deje que las fibras de colágeno se adhieran durante 1 hora.

10. Incubar en medio de cultivo y adicionar suspensiones celulares para la unión a las fibras de colágeno.

Ejemplo 3. Fabricación de hidrogel de agarosa 3-D (constructo de red de fibras de colágeno 3-D)

1. Disolver Agarosa SeaPlaqueMR (Lonza, Rockland, ME EUA) en medio de cultivo libre de suero a una concentración de 2% en peso a temperaturas por encima de 70 °C.

2. Mantener la solución de agarosa a 37 °C en un baño de agua durante la preparación de células.

3. Adicionar un volumen igual de suspensión celular caliente (20 * 106 células/mL) a la agarosa al 2% para lograr una concentración celular final de 10 * 106 células/mL y una concentración final de agarosa del 1%.

4. Colocar 75 jL de esta mezcla en una tela de CDP de ~15 mg contenido dentro de una placa de cultivo de 6 pocillos.

5. Después de 5 minutos de gelificación, adicionar 2 mL de medio de cultivo a temperatura ambiente.

Ejemplo 4. El ensamblaje en plantilla de fibras de colágeno dirige el crecimiento celular en 2D y 3D

Un enfoque de fabricación de biomateriales para desarrollar un método simple, rápido, y versátil para generar fibras de colágeno de tamaños apropiados que se pueden organizar en redes para apoyar el crecimiento bidimensional (2-D) y tridimensional (3-D) de las células musculares esqueléticas. El proceso de fabricación produce un material basado en colágeno accesible y ajustable que se puede utilizar como una matriz para soportar el crecimiento de una amplia variedad de tipos de células adicionales, y como un material para la curación de heridas y la reconstrucción de tejidos.

Ejemplo 5. Métodos

Materiales y Reactivos

Se utilizó dextrano de bloque de constructo (peso molecular 500.000 g/mol) de Dextran Products Ltd. (Scarborough, ON Canadá) para la optimización del proceso de formación de fibras. Con base en las pruebas de

certificación del fabricante, la rotación específica (2% en peso de solución,MLn 0) fue de 195° y la viscosidadintrínseca (solución al 1% en peso, 37 °C) fue de 0,58 dL/g. Las telas de dextrano utilizadas en los experimentos de cultivo celular se formaron utilizando dextrano de alta pureza de calidad técnica (peso molecular 500.000 g/mol) de Pharmacosmos (Holbaek, Dinamarca). El colágeno tipo I (cola de rata, alta concentración) se compró de Corning (Corning, NY EE. UU.). Todos los demás productos químicos eran de grado reactivo o mejor y se utilizaron sin modificación o purificación adicional.

Formación de tela de CDP

Para producir fibras y telas alargadas de CDP, se utilizó una balanza analítica para pesar 1 parte de polvo de dextrano (por ejemplo, ~1 g) en un bote de pesaje de plástico. El colágeno tipo I se pesó a una concentración apropiada (entre 2 mg/mL y 8 mg/mL) en agua destilada y desionizada. Se utilizó una micropipeta para dispensar 1 parte de solución de colágeno (por ejemplo, ~1 ml o 1 g de solución) en el recipiente de pesaje que contenía el dextrano. Usando una punta de pipeta, la solución de colágeno y el dextrano se mezclaron completamente hasta que se formó una pasta viscosa. El pre-material se utilizó en un período de 15 minutos para limitar la pérdida de agua por evaporación. Una capa delgada de la pasta de composición de CDP se aplicó entonces a dos palillos depresores de lengua estériles. Los palillos se presionaron repetidamente y se separaron tal que las fibras de la composición de CDP altamente viscosa se alargaron entre los dos palillos. Después de cada ciclo de prensado y tracción, las fibras de CDP alargadas secas se recolectaron sobre la parte superior de un vaso de precipitados de 5,5 cm de diámetro como se muestra esquemáticamente en la figura 1. Los ciclos repetidos produjeron telas densas de múltiples capas que se podían recortar para remoción del vaso de precipitados y almacenarlos secos a temperatura ambiente. Después de la rehidratación en DMEM o un agente amortiguador apropiado para el autoensamblaje de la fibra de colágeno, la plantilla de dextrano se disolvió rápidamente dejando atrás redes de fibras de colágeno de la misma geometría que la tela original.

Fabricación de hidrogel de poliacrilamida 2-D

Se fabricaron hidrogeles de poliacrilamida para inmovilizar redes 2-D de fibras de colágeno. En resumen, los cubreobjetos de vidrio (22 * 22 mm) se colocaron en una placa calentadora a 95 °C y se cubrieron con 500 |jL de NaOH 0,1 N para activar la superficie. El NaOH se evaporó y entonces se aplicaron 500<j>L de ddH20 y se evaporaron para mejorar la uniformidad del recubrimiento superficial. Los cubreobjetos recubiertos con NaOH se trataron entonces con una solución al 4% de (3-aminopropil)trietoxisilano en acetona durante 15 min a temperatura ambiente. Los cubreobjetos funcionalizados con amina resultantes se lavaron tres veces en ddH20 y se secaron al aire. A continuación, los cubreobjetos se expusieron a una solución de glutaraldehído al 0,8% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Los cubreobjetos se lavaron nuevamente tres veces en ddH20 y se secaron al aire. El glutaraldehído proporcionó reticulación bifuncional de las aminas de superficie en los cubreobjetos a los grupos amida de los hidrogeles basados en acrilamida. Para formar hidrogeles de poliacrilamida uniformes (módulo de cizallamiento -8,64) en la superficie de los cubreobjetos, se intercalaron soluciones que constaban de acrilamida al 7,5%, bisacrilamida al 0,3%, persulfato de amonio al 0,08% y Temed al 0,001% entre los cubreobjetos recubiertos con glutaraldehído (unión) y portaobjetos de vidrio tratados con triclorosilano (liberación). Después de 30 minutos de polimerización, los cubreobjetos que contenían hidrogeles de poliacrilamida se retiraron cuidadosamente de los portaobjetos y se lavaron tres veces en ddH20, Para proporcionar sitios para la unión de fibras de colágeno, las superficies de hidrogel se funcionalizaron por incubación en una solución de 2 mg/ml de sulfo-SANPAH bajo luz UV durante 5 minutos. Los cubreobjetos se lavaron cinco veces en ddH20 y una última vez en DMEM. Finalmente, se retiró completamente el DMEM y se aplicaron telas secas (de 10 capas de espesor) a las superficies para permitir que las fibras de colágeno se adhirieran a los hidrogeles. Después de 1 hora de incubación, los hidrogeles que contenían fibras de colágeno unidas a la superficie se prepararon para el cultivo celular por incubación en medio de crecimiento.

Fabricación de hidrogel de agarosa 3-D

Los geles de agarosa se formaron al disolver agarosa SeaPlaqueMR (Lonza, Rockland, ME EE. UU.) en medio de cultivo sin suero a una concentración de 2% en peso a temperaturas superiores a 70 °C. La solución de agarosa se mantuvo a 37 °C en un baño de agua durante la preparación de las células. Se mezcló un volumen igual de suspensión celular caliente (20 * 106 células/mL) y 2% de agarosa para lograr una concentración celular final de 10 * 106 células/mL y una concentración final de agarosa de 1%. Se pipeteó inmediatamente un volumen de 75 j L de esta mezcla en cada tela de dextrano de ~15 mg contenido dentro de pocillos separados de una placa de cultivo de 6 pocillos. Después de 5 minutos de gelificación, se adicionaron 2 mL de medio de diferenciación a temperatura ambiente a cada pocillo.

Cultivo celular

Los mioblastos de ratón C2C12 (ATCC, CRL-1772) se cultivaron según las instrucciones de la ATCC. En resumen, las células se cultivaron en medio de crecimiento que constaba de DMEM que contenía solución antimicótica antibiótica al 1% y suero bovino fetal al 10%. Las células se pasaron a -50-60% de confluencia y se usaron antes de 20 pasajes. Para los experimentos de diferenciación, las células C2C12 se cultivaron en un medio de diferenciación que constaba de DMEM que contenía una solución antimicótica antibiótica al 1%, suero bovino fetal al 2% y una solución de insulina, transferrina y selenio (ITS) al 1%. Todos los cultivos celulares se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 °C en CO<2>al 5%.

Inmunomarcado, tinción y microscopía

Se utilizaron anticuerpos para la forma nativa (forma helicoidal, C1A1) de colágeno tipo I para marcar las estructuras de colágeno ensambladas correctamente. Se utilizaron anticuerpos contra la cadena pesada de miosina (IgG anti-miosina-hc de ratón, Novus Biologicals), nos-I (IgG anti-NOS-I de conejo, Chemicon) y parvalbúmina (IgG anti-parvalbúmina de ratón, Chemicon) para evaluar la diferenciación de C2C12 en condiciones de cultivo 3-D. Se utilizaron anticuerpos secundarios de IgG anti-ratón conjugados con HyLite 488 e IgG anti-conejo conjugados con HyLite 555 (Novus Biologicals, Oakville, ON Canadá) para la detección de inmunofluorescencia según sea apropiado. Se utilizó faloidina conjugada con rodamina para evaluar la organización del citoesqueleto de actina para diversas condiciones de cultivo. Se utilizaron Hoechst 33342 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), yoduro de propidio (Sigma) y Nuclear Green DCS1 (Abcam, Toronto, ON Canada) para la contratinción nuclear como se indica. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio de epifluorescencia Nikon Eclipse T1 para cultivos de células 2-D e imágenes de bajo aumento de cultivos de células 3-D. Se utilizó un sistema confocal Zeiss LSM 510 Meta para adquirir imágenes de alta resolución de cultivos celulares 3-D. Se utilizó estereomicroscopía para adquirir imágenes de telas secas. Se utilizó un microscopio polarizador Nikon para adquirir imágenes de birrefringencia de fibra de colágeno.

Tinción con azul de anilina

Las redes de colágeno fijadas con formalina se incubaron en una solución de ácido fosfotúngstico al 2,5%/ácido fosfomolíbdico al 2,5% en agua destilada durante 10 minutos. Las redes de colágeno se tiñeron entonces usando una solución al 2,5% de azul de anilina en ácido acético al 1% durante 5 minutos. Las redes de colágeno se enjuagaron en agua destilada, se aclararon en ácido acético al 1%, y se enjuagaron de nuevo en agua destilada antes de la obtención de imágenes por microscopía de campo claro.

Análisis de Imagen

La densidad de fibra (número de fibra/ROI) y el diámetro de las telas de colágeno secas e hidratadas se determinaron por el análisis de imágenes de estereomicroscopio utilizando Fiji. Se seleccionó una región de interés (ROI) de 1,2 mm * 1,2 mm en el centro de cada imagen. Se midieron los diámetros de fibra húmeda y seca y la densidad dentro del ROI. La densidad media de la fibra y el diámetro ± el error estándar de la media se graficó en función de la fracción en masa de colágeno.

Para el análisis de la orientación de la fibra, se procesaron imágenes de umbral de telas secas e inmunofluorescencia C1A1 utilizando el complemento Orientation! para Fiji.

Ejemplo 6.Resultados

Las fibras de CDP se alargan fácilmente conforme una solución viscosa de 50% de dextrano y 50% de colágeno (% p/p) se presiona y se separa entre dos sustratos, por ejemplo, dos depresores de lengua estériles (Ver figura 2A y figura 1A). El alargamiento de fibra de CDP se media por el equilibrio de las fuerzas adhesivas entre la solución de dextrano y los dos sustratos y las fuerzas de cohesión dentro de la solución de dextrano viscosa. Las fibras de CDP se alargan desde numerosos puntos entre los dos sustratos, lo que permite que se generen múltiples fibras a la vez. Las fibras de CDP se secan rápidamente conforme las fibras de<c>Dse alargan desde las regiones cohesivas viscosas proximales a los dos sustratos, pero permanecen lo suficientemente flexibles como para aplicarlas a una platina posicionable sin rotura. Esto permite que se apliquen múltiples capas de fibras de CDP para generar telas de CDP que tienen varios cientos de capas de espesor (figura 2B). Las fibras de CDP alargadas individuales tienen una apariencia lisa, tipo vidrio y tienen habitualmente entre 10 y 100 |jm de diámetro (figura 2C). La platina posicionable se puede rotar entre ciclos de alargamiento de fibra de CDP para generar telas de CDP con diversas configuraciones entretejidas, que incluyen telas de CDP que contienen fibras de CDP paralelas, fibras de CDP entretejidas ortogonales y fibras de CDP entretejidas multidireccionales (figura 2D). Las telas de CDP almacenadas secas en condiciones atmosféricas normales permanecen estables durante varios meses sin ninguna pérdida notable de forma, morfología de fibra o propiedades del material.

La incorporación de colágeno de tipo I en la composición de CDP no tiene una influencia significativa en el proceso de formación de fibras, como se indica por la comparación de la densidad de fibra seca (fibras/área unitaria) y el diámetro de fibra para telas de CDP y telas de control (figura 3A-3B). Sin embargo, tanto la densidad como el diámetro de las fibras de colágeno presentes después de la rehidratación incrementaron con el incremento de la fracción en masa de colágeno (figura 3C-3D). Después de la rehidratación en un agente amortiguador apropiado para el ensamblaje de fibras de colágeno, el dextrano en las fibras de CDP se disuelve rápidamente (figura 4), dejando atrás una red de fibras de colágeno (figura 2E). Las telas de CDP que contienen fracciones de masa de colágeno:dextrano de 0,004 y superiores forman eficientemente fibras ricas en colágeno después de la rehidratación (figura 5). La mayoría de las fibras de colágeno tienen entre 5 y 20 jm de diámetro, aproximándose a la escala de tamaño de las fibras de colágeno nativas observadas en diversos tejidos. Estas fibras de colágeno se reconocen por anticuerpos contra la forma nativa (helicoidal, no desnaturalizada) de colágeno tipo I, lo que sugiere que el proceso de fabricación de fibras produce fibras que contienen moléculas de colágeno con estructuras de proteínas secundarias apropiadas. Las fibras de colágeno producidas por este proceso también muestran birrefringencia intrínseca cuando se obtienen imágenes por microscopía de luz polarizada (figura 6). Este comportamiento óptico de tipo cristalino indica el orden de las moléculas de colágeno paralelas al eje de la fibra, que es una de las características de las fibras de colágeno ensambladas apropiadamente. Además, las fibras de colágeno se tiñen fuertemente con azul de anilina (figura 7), lo que sugiere además que las estructuras que permanecen después de la disolución del dextrano se componen principalmente de colágeno.

Las fibras de colágeno producidas por este proceso de fabricación se pueden utilizar como una red de biomaterial anclado a la superficie capaz de dirigir el crecimiento de mioblastos C2C12 (figura 8A). La unión de las fibras de colágeno como una red 2-D a la superficie de un hidrogel de poliacrilamida no adherente facilita la observación de la unión, alineación y crecimiento de C2C12. Las fibras de colágeno unidas a la superficie de los hidrogeles de poliacrilamida no adherentes conservan sus configuraciones tejidas en cultivo (figura 8B y figuras 9A-9B). Durante un período de 3 días de cultivo celular, las células C2C12 se unen selectivamente y crecen a lo largo de las fibras como lo indica la tinción con actina-faloidina y la tinción nuclear de Hoechst (figura 8C), formando estructuras tipo fascículo. La inspección de los patrones de crecimiento celular indica que tanto las células como el citoesqueleto de actina dentro de las células se alinean con la red de colágeno. Además, las células C2C12 indiferenciadas remodelan gradualmente la red de colágeno desplazando las fibras de colágeno a través de la fuerza de tracción y sintetizando y secretando colágeno de tipo I adicional a lo largo de las fibras existentes (flechas en la figura 8B).

Las telas de CDP también son capaces de alinear células cultivadas en cultivo celular 3-D (figura 10A). Después de 7-10 días de cultivo de células 3-D en hidrogeles de agarosa de bajo punto de gelificación que contienen telas de CDP alineadas en una dirección individual, muchas células alargadas son evidentes por tinción con actinafaloidina (figura 10B). Por el contrario, las células que crecen en agarosa alrededor de las telas de control (sin colágeno) permanecen agrupadas en estructuras esféricas, lo que indica una falta de unión y crecimiento celular dentro del hidrogel. Las imágenes confocales de alta resolución indican que las estructuras alineadas se forman a partir de células que crecen en estructuras continuas tipo cadenas, lo que indica el potencial de formación de miotubos conforme las células se diferencian (figura 10C). No se observaron estructuras tipo miotubos en hidrogeles de agarosa que contenían telas de control sin colágeno. Muchas de las células alineadas mostraron marcadores de músculo esquelético diferenciado, como lo indica el análisis de transferencia Western de células que crecen en fibras de colágeno para la cadena pesada de miosina (una proteína motora que se encuentra en los filamentos gruesos del músculo esquelético)y parvalbúmina (una proteína de unión a Ca2+ de alta afinidad que se encuentra en las fibras de músculo esquelético de contracción rápida) (figura 10D). Colectivamente, estos resultados demuestran que el método descrito para formar redes de colágeno 3-D puede apoyar el crecimiento y la diferenciación de células de músculo esquelético dentro de hidrogeles no adherentes a células.

Una prueba de concepto adicional para la fabricación de conjuntos de fibras de diversas formas (figura 11A) y tamaños (figura 11B) demuestra la versatilidad de este enfoque para producir telas para una amplia variedad de aplicaciones en el ámbito de los biomateriales y otros campos de aplicación.

Ejemplo 7.Análisis

Utilizando células C2C12, que son una línea celular modelo bien establecida para comprender el desarrollo y la fisiología del músculo esquelético, se demuestra la producción y aplicación de un nuevo biomaterial basado en colágeno capaz de organizar las células musculares en estructuras tipo fascículos. En el tejido muscular, los fascículos están presentes en varios patrones, dando lugar a propiedades únicas de generación de fuerza dentro del tejido. Dentro de cada fascículo, los grupos de células musculares se organizan por fibras de colágeno, que se pueden extender a lo largo o a través de las células musculares, antes de insertarse finalmente en los tendones. El nuevo biomaterial a base de colágeno caracterizado en este estudio es especialmente adecuado para la fabricación de modelos de tejido que muestran este patrón de fibra de colágeno y alineación celular.

Una de las características más atractivas del material de dextrano-colágeno es que permite que las células encapsuladas dentro de los hidrogeles se alarguen y crezcan en redes. Este es uno de los aspectos más desafiantes del cultivo de células 3-D que limita la aplicabilidad de muchos sistemas de hidrogel como modelos in vitro y como materiales para medicina regenerativa. Además de la formación de miotubos en el músculo esquelético, varios otros tipos de células, tal como células neurales y células vasculares, dependen de la formación de redes para la función fisiológica apropiada. Puesto que se ha demostrado que el colágeno apoya el crecimiento de estos tipos de células y muchos otros tipos de células, este enfoque puede resultar beneficioso para construir muchos tipos diferentes de tejidos modelo. Además, puesto que la red de colágeno producida por el proceso de fabricación es una estructura independiente, es altamente versátil y se puede aplicar para funcionalizar muchos otros tipos de andamiajes y superficies de hidrogel, por ejemplo, otros hidrogeles no adherentes tal como alginato o diacrilato de polietilenglicol. Aquí, demostramos que se puede utilizar para soportar el crecimiento de mioblastos altamente específicos con dos tipos de hidrogeles no adherentes a las células (es decir, poliacrilamida y agarosa), pero es posible que este material se pueda utilizar para generar redes a gran escala de células de músculo esquelético organizadas dentro de otros tipos de biomateriales naturales y sintéticos para modelar la enfermedad musculoesquelética y su uso en la reconstrucción de heridas.

Las telas de dextrano impurificado con colágeno se podrían aplicar potencialmente para formar y aplicar estos materiales compuestos. También se podrían incluir agentes bioactivos en estas constructos, lo que permitiría la elución controlada de fármacos y/o biomoléculas útiles, además de la administración de una matriz de colágeno para aumentar la unión, alineación y crecimiento celular. En tanto que aquí el enfoque está principalmente en generar biomateriales de colágeno puro para funcionalizar sustratos de cultivo celular 2-D y 3-D, las telas de dextrano que eluyen fármacos se podrían combinar con estos hallazgos más recientes para abordar las aplicaciones de curación de heridas. Por ejemplo, las telas de dextrano que contienen trombina y antibióticos promovieron efectivamente la coagulación de plasma humano pobre en plaquetas y suprimieron el crecimiento bacterianoin vitro.La adición de fibras de colágeno podría promover además la migración endotelial, la proliferación de fibroblastos y la agregación plaquetaria para mejorar la cicatrización de heridas con este material.

En términos de fabricación, una de las fortalezas de este proceso de formación de fibras de colágeno es que sólo requiere movimientos simples para formar fibras alargadas. Por lo tanto, el procedimiento general se puede adaptar a un sistema de fabricación automatizado para mejorar aún más el rendimiento y la consistencia. Por ejemplo, los volúmenes programados de dextrano impurificado con colágeno se podrían extruir en dos brazos planos. Presionar y liberar los dos brazos a una distancia establecida a lo largo del eje y induciría la formación de fibras. Conforme se forman las fibras, los brazos podrían viajar por el eje z hacia un colector donde se depositarían las fibras. Un movimiento de giro del colector con un labio parcial en ambos extremos podría recortar los extremos de las fibras, y los brazos volverían a su posición inicial, donde se podría agregar dextrano impurificado con colágeno adicional y el proceso se repetiría para un número predeterminado de capas. La orientación de la fibra podría controlarse con giros programados del colector para generar telas organizados consistentemente con direcciones de fibra definidas. Un esquema de fabricación automatizado como este, que utiliza diseños robóticos estándar y movimientos simples, permitiría la fabricación en masa de materiales de dextrano para aplicaciones de cuidado de la salud. Una fortaleza adicional de este enfoque es que utiliza sólo unos pocos reactivos que ya se producen en instalaciones de cGMP y están fácilmente disponibles como preparaciones de calidad farmacéutica, aunque será posible diseñar fibras para indicaciones específicas a través del uso de formulaciones que comprenden otros polímeros listados en la TABLA 1, reticulación de los polímeros o empleando mezclas de polímeros.

En conclusión, se presenta un proceso completamente nuevo para fabricar fibras de colágeno de escalas de tamaño apropiadas para promover la interacción con las células. Las fibras producidas por este proceso de fabricación se pueden alinear en varias configuraciones y que el colágeno a partir del cual se forman las fibras muestre la organización molecular apropiada (por ejemplo, estructura a-helicoidal intacta y birrefringencia). También se demuestra que los mioblastos se unen y alinean fácilmente a lo largo de redes de fibras de colágeno 2-D. Además, la encapsulación de fibras de colágeno con células en hidrogeles no adherentes a células promueve el crecimiento alineado de células y soporta su diferenciación.

La facilidad de producción y versatilidad de este nuevo biomaterial basado en colágeno soportará el desarrollo futuro de una variedad de modelos y materiales de enfermedades de ingeniería tisular para la medicina regenerativa y la reconstrucción de heridas. Además, de los estudios preliminares parece que la capacidad de las células para adherirse y crecer en las fibras no se degrada con la edad de tejido. No se han observado diferencias en la unión celular entre las telas recién preparadas y las telas almacenadas a temperatura ambiente durante varios meses.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso de fabricación de biomaterial para la fabricación de una tela basada en colágeno para una red de fibras de colágeno alineadas, el proceso que comprende:

a. proporcionar una composición de colágeno-polímero que comprende un polímero y colágeno, el polímero seleccionado del grupo que consta de dextrano, hidroxipropilcelulosa, poli(2-etil-2-oxazolina), poli(ácido 4-estirenosulfónico-co-ácido maleico), poli(ácido acrílico), poli(cloruro de dialildimetilamonio), poli(ácido metacrílico), poli(metilviniléter-alt-ácido maleico), poli(alcohol vinílico) y poli(vinilpirrolidona);

b. aplicar la composición de colágeno-polímero a una primera superficie de un primer sustrato;

c. poner en contacto la composición de colágeno-polímero con una primera superficie de un segundo sustrato, interponiendo de esta manera la composición de colágeno-polímero entre el primer sustrato y el segundo sustrato; d. formar una pluralidad de fibras de colágeno-polímero alargadas al prensar y separar el primer y segundo sustratos a lo largo de un eje horizontal, alargando de esta manera la composición de colágeno-polímero y formando la pluralidad de fibras de colágeno-polímero alargadas;

e. colocar las fibras de colágeno-polímero alargadas en una platina posicionable formando de esta manera una capa de fibras de colágeno-polímero o tela de colágeno-polímero de fibras de colágeno-polímero recolectadas; y f. poner en contacto la capa de fibras de colágeno-polímero o tela de colágeno-polímero con un disolvente para disolver el polímero en la capa de fibras de colágeno-polímero o tela de colágeno-polímero formando de esta manera la tela basada en colágeno.

2. El proceso de fabricación de biomaterial de acuerdo con la reivindicación 1, donde el polímero es dextrano, la composición de colágeno-polímero es una composición de polímero de colágeno-dextrano (CDP), las fibras de colágeno-polímero alargadas son fibras de CDP alargadas, la capa de fibras de colágeno-polímero es una capa de fibra de CDP y la tela de colágeno-polímero es una tela de CDP.

3. El proceso de fabricación de biomaterial de acuerdo con la reivindicación 2, donde la relación de colágeno a dextrano en la composición de CDP puede variar de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1,57% de colágeno a aproximadamente 99,9% a aproximadamente 98,43% de dextrano.

4. El proceso de fabricación de biomaterial de acuerdo con la reivindicación 3, donde la relación de colágeno a dextrano en la composición de CDP puede variar de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 0,79% de colágeno a aproximadamente 99,8% a aproximadamente 99,21% de dextrano.

5. El proceso de fabricación de biomaterial de acuerdo con la reivindicación 2, donde el colágeno es colágeno de Tipo I, o en donde la composición de CDP tiene una fracción en masa de colágeno:dextrano que varía de 0,004 a 0,008, o donde la composición de CDP a 22° C tiene una viscosidad que varía de aproximadamente 15.000 centipoise a aproximadamente 100.000 centipoise como se mide por el método de bola que cae vertical, o donde las fibras de CDP alargadas tienen un diámetro que varía de aproximadamente 0,1 |jm a aproximadamente 500 |jm, en particular que varía de aproximadamente 1 jm a aproximadamente 100 jm , o en donde las fibras de CDP alargadas en la capa de fibra de CDP o tela de CDP se arreglan en paralelo, en orientación ortogonal (90°) o en múltiples direcciones.

6. El proceso de fabricación de biomateriales de acuerdo con la reivindicación 2, donde el disolvente para disolver el dextrano en la capa de fibra de CDP o tela de CDP comprende una solución acuosa.

7. El proceso de fabricación de biomateriales de acuerdo con la reivindicación 6, donde la solución acuosa comprende agua, solución salina fisiológica de NaCl al 0,9%, Tris 50 mM, solución salina amortiguada con Tris de NaCl 150mM, solución de Ringer lactada, solución de Ringer-acetato, medios de cultivo de telas, o combinaciones de los mismos.

8. Un método para producir un constructo de red de fibras de colágeno 2-D o 3-D, el método que comprende: a. proporcionar una tela de polímero de colágeno-dextrano (CDP) que comprende fibras de CDP, la tela de CDP que se produce en el paso e. del proceso de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7; y

b. poner en contacto la tela de<c>Den al menos una superficie de una matriz de hidrogel poroso.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, donde las fibras de CDP tienen una relación de colágeno a dextrano en las fibras de CDP que puede variar de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1,57% de colágeno a aproximadamente 99,9% a aproximadamente 98,43% de dextrano.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, donde la relación de colágeno a dextrano en las fibras de CDP puede variar de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 0,79% de colágeno a aproximadamente 99,8% a aproximadamente 99,21% de dextrano.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 8, donde el colágeno en las fibras de CDP es colágeno de Tipo I, o en donde las fibras de CDP comprenden una fracción en masa de colágeno:dextrano de al menos 0,004, o en donde las fibras de CDP tienen un diámetro que varía de aproximadamente 1 jm a aproximadamente 500 jm , en particular que varía de aproximadamente 1 |jm a aproximadamente 100 |jm, o en donde la tela de CDP tiene fibras de CDP arregladas en paralelo, en una orientación ortogonal (90°) o en una orientación multidireccional.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 8, donde la tela de CDP tiene de 2 capas a 1.000 capas de fibras de CDP

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, donde la tela de CDP tiene de 10 capas a 500 capas de fibras de CDP entretejidas ortogonales o entretejidas multidireccionales.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 8, donde la matriz de hidrogel porosa es una matriz de hidrogel de poliacrilamida o una matriz de hidrogel de agarosa.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, donde la matriz de hidrogel de poliacrilamida o la matriz de hidrogel de agarosa se activan con 3-aminopropil)trietoxisilano, glutaraldehído, 6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino)hexanoato de sulfosuccinimidilo)(sulfo-SANPAH) o combinaciones de los mismos.

v

16. El método de acuerdo con la reivindicación 8, donde la tela de CDP se coloca en al menos una superficie de la matriz de hidrogel poroso, o en donde la red de fibras de colágeno 2-D o 3-D comprende además un agente bioactivo.