ES2992942T3 - Assay to determine in vivo receptor occupancy - Google Patents
Assay to determine in vivo receptor occupancy Download PDFInfo
- Publication number
- ES2992942T3 ES2992942T3 ES19729943T ES19729943T ES2992942T3 ES 2992942 T3 ES2992942 T3 ES 2992942T3 ES 19729943 T ES19729943 T ES 19729943T ES 19729943 T ES19729943 T ES 19729943T ES 2992942 T3 ES2992942 T3 ES 2992942T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- bound
- drug
- btk
- quencher
- receptor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 title description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 108
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 105
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 77
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 77
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 74
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 18
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 69
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 69
- 238000003312 immunocapture Methods 0.000 claims description 24
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims description 24
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 16
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 16
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 12
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 7
- 102000013138 Drug Receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 108010065556 Drug Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 claims 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 42
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 6
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 2
- 102000001714 Agammaglobulinaemia Tyrosine Kinase Human genes 0.000 description 92
- 108010029445 Agammaglobulinaemia Tyrosine Kinase Proteins 0.000 description 92
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 47
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 34
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 34
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 33
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 27
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 20
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 13
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 11
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 11
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 11
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 4
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 4
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000000670 ligand binding assay Methods 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012292 receptor occupancy assay Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000002877 time resolved fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- 108091005508 Acid proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 2
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 2
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001018085 Lysobacter enzymogenes Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 2
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 2
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000035100 Threonine proteases Human genes 0.000 description 2
- 108091005501 Threonine proteases Proteins 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000011948 assay development Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 2
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- KRTSDMXIXPKRQR-AATRIKPKSA-N monocrotophos Chemical compound CNC(=O)\C=C(/C)OP(=O)(OC)OC KRTSDMXIXPKRQR-AATRIKPKSA-N 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 238000013097 stability assessment Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- VJPPLCNBDLZIFG-ZDUSSCGKSA-N 4-[(3S)-3-(but-2-ynoylamino)piperidin-1-yl]-5-fluoro-2,3-dimethyl-1H-indole-7-carboxamide Chemical compound C(C#CC)(=O)N[C@@H]1CN(CCC1)C1=C2C(=C(NC2=C(C=C1F)C(=O)N)C)C VJPPLCNBDLZIFG-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 239000002177 L01XE27 - Ibrutinib Substances 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229950009821 acalabrutinib Drugs 0.000 description 1
- WDENQIQQYWYTPO-IBGZPJMESA-N acalabrutinib Chemical compound CC#CC(=O)N1CCC[C@H]1C1=NC(C=2C=CC(=CC=2)C(=O)NC=2N=CC=CC=2)=C2N1C=CN=C2N WDENQIQQYWYTPO-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000012398 clinical drug development Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 229960001507 ibrutinib Drugs 0.000 description 1
- XYFPWWZEPKGCCK-GOSISDBHSA-N ibrutinib Chemical compound C1=2C(N)=NC=NC=2N([C@H]2CN(CCC2)C(=O)C=C)N=C1C(C=C1)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 XYFPWWZEPKGCCK-GOSISDBHSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013038 irreversible inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
- G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
- G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
- G01N2030/027—Liquid chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/91—Transferases (2.)
- G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
La presente invención se refiere a ensayos para controlar y medir la unión de un fármaco de interés a un receptor. En este ensayo, una muestra de sangre extraída de un sujeto al que se le ha administrado el compuesto de interés se incuba con una solución de lisis que contiene un inhibidor. A continuación, el receptor unido al fármaco y unido al inhibidor se aísla de la muestra de sangre lisada. El receptor unido al fármaco y unido al inhibidor aislado se digiere para generar péptidos sustitutos unidos al fármaco y unidos al inhibidor. Se determina la cantidad de péptidos sustitutos. La ocupación del receptor se puede determinar comparando la cantidad de péptido sustituto unido al fármaco con el total de péptido sustituto unido al fármaco y unido al inhibidor. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Ensayo para determinar la ocupación del receptorin vivo
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para medir directamente la ocupación del receptorin vivoen tiempo real mediante un compuesto unido covalentemente en el lisado de sangre. Más específicamente, la presente invención se refiere a la medición de la ocupación del receptor de BTKin vivoen tiempo real como biomarcador farmacodinámico para el desarrollo de fármacos clínicos.
Antecedentes de la invención
El descubrimiento y desarrollo de fármacos es un proceso largo y de alto riesgo. Se ha estimado que el costo promedio de desarrollar un nuevo medicamento exitoso es de hasta 2.600 millones de dólares debido al fracaso de innumerables fármacos candidatos durante el proceso inicial de descubrimiento y desarrollo, y se estima que la tasa de supervivencia general del fármaco candidato que ingresa a los estudios clínicos es inferior al 12 % (Informe de PhRMA, "Biopharmaceutical Research & Development: The Process Behind New Medicines", 2015). Los principales problemas que provocaron el fracaso de estos fármacos candidatos estaban relacionados con una eficacia clínica insuficiente o nula durante la fase final del desarrollo, en particular durante los ensayos clínicos de prueba de concepto (fase II) (Kola, I.,et. al.,J. Nature Reviews. Drug Discovery 2004, 3, 711-715; Arrowsmith, J., Nature Reviews. Drug Discovery 2011, 10, 87; Morgan, P.,et. al.,Drug Discovery Today 2012, 17, 419-424).
Se han diseñado muchos medicamentos de moléculas pequeñas y productos biológicos en desarrollo para mediar en el sistema inmunitario. Por ello, estos fármacos candidatos a menudo requieren niveles de dosis muy bajos para desencadenar la respuesta deseada. Por lo tanto, la comprensión temprana de las propiedades farmacocinéticas (PK) y farmacodinámicas (PD) de estos fármacos candidatos es crucial para determinar el intervalo de dosis adecuado para los ensayos clínicos (Topalian, S. L.,et. al.,The New England Journal of Medicine 2012, 366, 2443 2454; Brahmer, J. R.,et. al.,The New England Journal of Medicine 2012, 366, 2455-2465; Tolcher, A. W.,et. al.,Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology 2009, 27, 5800-5807; Hua, F.,et. al.,Journal of Clinical Pharmacology 2014, 54, 14-22; Rutgeerts, P. J.,et. al.,Gut 2013, 62, 1122-1130). Para mejorar la eficiencia clínica y reducir los costos durante la fase de desarrollo de medicamentos, la medición cuantitativa del perfil PD es tan importante como el perfil PK para el diseño racional de ensayos clínicos. Esto es especialmente cierto cuando el perfil PD cambia con múltiples dosis.
Los ensayos de ocupación del receptor (RO) miden la unión de una molécula a su proteína receptora (o diana) y proporcionan datos cuantitativos que pueden usarse para generar un perfil PD (Liang, M.,et. al.,Cytometry B Clin Cytom 2016, 90, 117-127). La medición de RO es una determinación crítica para relacionar la eficacia con el mecanismo en modelos animales preclínicos y en estudios clínicos. En la práctica, la RO es particularmente útil para tomar decisiones sobre el aumento de dosis en el estudio primero en humanos (FIH).
La tirosina cinasa de Bruton (BTK) desempeña un papel clave en la transducción y activación de señales a través de las rutas de receptor de linfocitos B, receptor Fc y RANKL (Seiler, T.,et. al.,Expert Opin Investig Drugs 2017, 26, 909-915; Whang, J. A.,et. al.,Drug Discovery Today 2014, 19, 1200-1204). Para fármacos basados en anticuerpos, la RO generalmente se monitorea mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos que compiten con la molécula diana para la medición del receptor libre y anticuerpos no competitivos para la medición del receptor total (Liang, M,et. al.,Cytometry B Clin Cytom 2016, 90, 117-127; Woska, J. R., Jr.,et. al.,Journal of immunological methods 2003, 277, 101-115). Sin embargo, para antagonistas de moléculas pequeñas, no existen reactivos de anticuerpos para la detección directa del receptor ocupado mediante citometría de flujo. Anteriormente, la RO de BTK de ibrutinib en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se determinó utilizando una sonda de afinidad fluorescente que se unió al sitio de ocupación activo de BTK libre (no ocupada), seguido de detección mediante SDS/PAGE y escaneo de gel fluorescente (Honigberg, L. A.; J. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2010, 107, 13075-13080). El ensayo basado en sonda de afinidad fluorescente solo puede determinar la cantidad de BTK libre, por consiguiente, se requiere un ensayo adicional mediante inmunotransferencia tipo Western para medir la BTK total. Debido a la gran cantidad de muestras generadas en estudios clínicos, el uso de dos plataformas de ensayo no es práctico. Además, el método carece de comparabilidad directa entre la medición no unida y la medición total, lo que da como resultado una alta variación del ensayo.
Recientemente, se ha informado y utilizado un ensayo de RO de BTK basado en ELISA que utiliza una sonda covalente biotinilada en un estudio clínico con acalabrutinib y CC-292 (Barf, T.,et. al.,The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 2017; Evans, E. K.,et. al.,The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 2013, 346, 219-22). En este enfoque, sólo se detecta la BTK libre mientras se elimina la BTK unida al fármaco (DB-BTK). La concentración de BTK total se determina utilizando la muestra previa a la dosis con el supuesto de que el nivel total de BTK permanece constante en todas las muestras.
Como alternativa, se puede utilizar un ensayo independiente basado en transferencia de energía por resonancia de fluorescencia con resolución temporal (TR-FRET) para BTK libre y total para estimar la ocupación de BTK en mononucleocitos de sangre periférica (PBMC) (Lutz, J. D. N.,et. al.,Poster presentation at the 7th American Conference on Pharmacometrics (ACoP7) in Bellevue, WA. 23-26 de octubre de 2016. 2016). Sin embargo, la BTK libre y total se miden de forma independiente, en lugar de simultáneamente en la misma muestra y se encontró que los niveles de BTK total variaban significativamente entre muestras (Honigberg, L. A., supra). Por lo tanto, los enfoques basados en ELISA o TR-FRET están limitados por la variabilidad inherente resultante de la elección metodológica.
El documento WO 2016/100593 describe métodos y sistemas de ensayo tanto para la determinación cuantitativa de una diana tal como BTK como para la ocupación de la diana, incluida la cantidad relativa de diana disponible asociada con un inhibidor o ligando de diana, como un inhibidor irreversible de BTK.
El ensayo de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (CL-EM/EM) ha demostrado potencial en la cuantificación de proteínas debido a su excelente selectividad de ensayo y capacidad de multiplexación (Neubert, H.,et. al.,Bioanalysis 2014, 6 , 1731-1733). En particular, el ensayo<l>B<a>-CL-EM "híbrido" que combina el enriquecimiento por inmunocaptura, seguido de la detección por CL-EM/EM se ha convertido en una poderosa plataforma tecnológica para medir biomarcadores proteicos o agentes terapéuticos con una excelente selectividad de detección (Stevenson, L.,et. al.,Bioanalysis 2013, 5, 2903-2918). El principal beneficio del ensayo de CL-EM es su capacidad de cuantificar tanto DB-BTK como BTK libre simultáneamente en la misma muestra. Por lo tanto, la determinación de RO es mucho menos sensible a la variación de la muestra o del proceso.
Sin embargo, el desarrollo del ensayo de CL-EM plantea una serie de desafíos. En primer lugar, las muestras de sangre de animales o humanos a los que se les ha administrado un fármaco pueden contener una cantidad excesiva del fármaco, que reaccionará con el receptor libreex vivopara formar un receptor unido al fármaco, lo que da como resultado una sobreestimación de la RO. En segundo lugar, la CL-EM/EM suele ser menos sensible que un ensayo ELISA.
Breve sumario de la invención
La presente invención se refiere en general a ensayos para monitorear y medir la unión de un fármaco de interés a un receptor. En este ensayo, una muestra de sangre extraída de un sujeto al que se le ha administrado el compuesto de interés se incuba con una solución de lisis que contiene un desactivador. Luego, el receptor unido al fármaco y unido al desactivador se aísla de la muestra de sangre lisada. El receptor unido al fármaco y unido al desactivador aislado se digiere para generar péptidos sustitutos unidos al fármaco y unidos al desactivador. La cantidad de péptidos sustitutos se determina. La ocupación del receptor se puede determinar comparando la cantidad de péptido sustituto unido al fármaco con el péptido sustituto unido al fármaco y unido al desactivador total. Más específicamente, la invención se refiere a un método de ensayo para determinar la ocupación del receptor de fármacos en un sujeto al que se le administra un fármaco de interés que se une covalentemente al receptor de interés, comprendiendo dicho método las etapas de:
a. recoger una muestra de sangre del sujeto tratado con el fármaco de interés
b. añadir una solución de lisis que comprende un desactivador que se une irreversiblemente al mismo sitio de receptor que el fármaco de interés a la muestra de sangre,
c. aislar el receptor unido al fármaco y unido al desactivador mediante inmunocaptura,
d. digerir el receptor unido al fármaco y unido al desactivador aislado para generar péptidos sustitutos unidos al fármaco y unidos al desactivador,
e. medir la cantidad de péptidos sustitutos utilizando CL-EM/EM y determinar la cantidad de receptor unido al fármaco comparando la cantidad de péptido sustituto unido al fármaco con la cantidad total de péptidos sustitutos unidos al fármaco y unidos al desactivador.
En una realización de la invención, el desactivador compite con el compuesto de interés para unirse irreversiblemente al receptor en el mismo sitio que el compuesto de interés.
En otra realización de la invención, el desactivador se añade al tampón de lisis en niveles en exceso molar del compuesto de interés. En otra realización de la invención, el desactivador se añade al tampón de lisis en una cantidad de 105 a 1000 veces en exceso, basándose en la concentración del receptor endógeno.
En otra realización de la invención, la solución de lisis con desactivador se añade inmediatamente después de recoger la muestra de sangre. En otra realización de la invención, la solución de lisis con desactivador se añade en el intervalo de 5 minutos posteriores a la recogida de la muestra de sangre.
En otra realización de la invención, el receptor se une específicamente al agente de captura, que está inmovilizado en un soporte sólido (por ejemplo, perlas magnéticas, perlas de agarosa o material de relleno de columna), y por lo tanto está separado de otras proteínas y péptidos endógenos, que no se unen muy fuertemente al anticuerpo de captura [Fung, E.N.et. al.,Bioanalysis 2016, 8, 847-856].
En otra realización de la invención, el receptor unido al fármaco y unido al desactivador se elimina del sustrato de inmunocaptura antes de la etapa de digestión.
En otra realización de la invención, el receptor unido al fármaco y unido al desactivador se digiere mientras todavía está asociado con el sustrato de inmunocaptura.
En otra realización de la invención, la proteasa utilizada durante la etapa de digestión se selecciona del grupo que consiste en serina proteasas, cisteína proteasas, treonina proteasas, ácido aspártico proteasas, ácido glutámico proteasas y metaloproteasas. Los ejemplos de proteasas incluyen tripsina, quimotripsina, Glu-C proteasa, Lys-C proteasa, Lys-N proteasa, Asp-N proteasa, Arg-C proteasa.
En otra realización de la invención, los péptidos sustitutos unidos al fármaco y unidos al desactivador se miden simultáneamente mediante una única ejecución de CL-EM/EM.
En el ensayo de la invención, la ocupación del receptor se calcula comparando la cantidad de péptido sustituto unido al fármaco con la cantidad total de péptido sustituto unido al fármaco y unido al desactivador.
En una realización de la invención, la ocupación del receptor se mide 1) recogiendo sangre de un sujeto al que se le administra un compuesto de interés que se une irreversiblemente al receptor, 2) agregando inmediatamente a la sangre recogida una solución de lisis que contiene un compuesto desactivador que se une irreversiblemente al mismo sitio que el compuesto de interés, 3) aislando el receptor unido al fármaco y al desactivador de la muestra de sangre lisada y desactivada utilizando una etapa de inmunocaptura, 4) digiriendo el receptor unido al fármaco y al desactivador aislado mientras aún está unido al sustrato de inmunocaptura, 5) midiendo la cantidad de péptidos sustitutos unidos al fármaco y unidos al desactivador simultáneamente en una única ejecución de CL-EM/e M y 6) determinando la ocupación del receptor comparando la cantidad de péptido sustituto unido al fármaco con la cantidad total de péptido sustituto unido al fármaco y unido al desactivador.
En un aspecto preferido de las realizaciones anteriores, el receptor es BTK, el compuesto de interés se muestra en la Figura 1A y el desactivador correspondiente se muestra en la Figura 1B.
En otro aspecto preferido de las realizaciones anteriores, el sustrato de inmunocaptura son perlas de captura de estreptavidina T1.
En otro aspecto preferido de las realizaciones anteriores, el clon de Acm n.° MAB 5807 o el clon de Acm n.° MAB D3H5 es el anticuerpo anti-BTK unido al sustrato de inmunocaptura.
En otro aspecto preferido de las realizaciones anteriores, la BTK aislada unida al desactivador y unida al fármaco se digiere con tripsina mientras aún está asociada con la perla de inmunocaptura.
En otro aspecto preferido de las realizaciones anteriores, la ocupación del receptor de BTK se calcula comparando la cantidad de péptido sustituto unido al fármaco con el péptido sustituto unido al fármaco y unido al desactivador total.
En una realización de la invención, la ocupación del receptor de BTK se mide 1) recogiendo sangre de un sujeto al que se le administra el compuesto mostrado en la Figura 1a , 2) agregando inmediatamente una solución de lisis que contiene el compuesto desactivador mostrado en la Figura 1B, 3) aislando la BTK unida al fármaco y al desactivador usando una etapa de inmunocaptura, 4) digiriendo la BTK unida al fármaco y al desactivador aislada con tripsina mientras aún está asociada con la perla de inmunocaptura, 5) midiendo la cantidad de péptidos sustitutos unidos al fármaco y unidos al desactivador simultáneamente en una única ejecución de CL-EM/EM y 6) determinando la ocupación del receptor de BTK comparando la cantidad de péptido sustituto unido al fármaco con el péptido sustituto unido al fármaco y unido al desactivador total.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1A y 1B muestra la estructura de A) Compuesto A; B) compuesto desactivador.
La Figura 2 muestra la alineación de secuencias de proteínas BTK de humanos y monos (macaco de la India/macaco cangrejero), respectivamente. Los recuadros indican los péptidos tripsínicos utilizados para el análisis. Dentro de la secuencia de aminoácidos, Cys 481 (marcada con la flecha) está unida al compuesto A (DB-BTK) o al compuesto desactivador (QB-BTK). El péptido tripsínico QRPIFIITEYMANGCLLNYLR (SEQ ID NO: 1, como se muestra en la Tabla 1) unido al compuesto de la Figura 1A o 1B se utilizó para la cuantificación.
La Figura 3 muestra una representación esquemática del ensayo de RO de BTK mediante inmunocaptura-CL-EM/EM. Los péptidos sustitutos utilizados son el péptido unido al fármaco (DB-QRP) y el péptido unido al desactivador (QB-QRP).
La Figura 4 muestra que los anticuerpos de captura de diferentes proveedores (■ mAb-D3H5, □ mAb-MAB5807) tienen un rendimiento de inmunocaptura diferencial entre la BTK endógena en sangre humana y la BTK recombinante (utilizada como calibradores).
La Figura 5A - 5D muestra el efecto de la concentración de tripsina, tiempo de digestión en las respuestas de CL-EM/EM de los péptidos sustitutos generados a partir de DB-Bt K (5A y 5B) y QB-BTK (5C y 5D) a 50 °C (5A y 5C) o 60 °C (5B y 5D). Los péptidos sustitutos, DB-QRP o QB-QRP se midieron mediante CL-h Rm S en un espectrómetro de masas Thermo's Q Exactive<™>Hybrid Quadrupole-Orbitrap<™>. Los experimentos se realizaron por triplicado para cada condición.
La Figura 6 muestra una comparación de la respuesta de la señal para cada etapa de carga tanto para DB-BTK(^) como para QB-BTK(^).
La Figura 7A - 7C muestra (7A) el espectro de iones de producto de EM/EM de iones positivos por electropulverización de [M+3H]<3+>enm/z967,4 para el péptido DB-QRP; (7B) el espectro de iones de producto de EM/EM de iones positivos por electropulverización de [M+3H]<3+>enm/z962,5 para el péptido QB-QRP; y (7C) el espectro de iones de producto de EM/Em de iones positivos por electropulverización de [M+3H]<3+>enm/z965,9 para el péptido SIL-QB-QRP (patrón interno) obtenido de un espectrómetro de masas Triple Quad 5500 de Sciex.
La Figura 8A - 8F muestra cromatogramas de monitoreo de reacciones múltiples (MRM) para DB-QRP (péptido sustituto para DB-BTK) (8A-8C) y QB-QRP (péptido sustituto para QB-BTK) (8D-8F), y sus patrones internos (IS); (8A y 8D) cromatogramas de los analitos obtenidos a partir de lisado de sangre de mono en blanco en los que las contribuciones de BTK endógena se eliminaron mediante pretratamiento con el desactivador o el fármaco individualmente; (8B y 8E) cromatogramas de los analitos obtenidos del lisado de sangre de mono que contiene el analito en LLOQ y su IS; (8C y 8F) cromatogramas del IS obtenidos a partir de lisado de sangre de mono que solo contiene el IS. (c y f) [13C<g>,15N]-QB-QRP se usó como el IS para DB-QRP y QB-QRP.
La Figura 9A - 9D muestra los resultados de PK y PD obtenidos de los monos n.° 5149, n.° 5151 y n.° 5169 a los que se les administró el compuesto (BMS-986195) que se muestra en la Figura 1A en dos dosis diferentes 0,10 mg/kg o 0,5 mg/kg. Se recogieron muestras de sangre a las 1, 3, 5, 7 y 24 h del día 1 para la evaluación PK (datos mostrados en 9A y 9B) y se recogieron antes de la dosis, 1, 3, 5, 7, 24, 48, 72, 144 y 168 h para la evaluación PD (datos mostrados en 9C y 9D) (véase el Ejemplo 2).
Descripción detallada de la invención
La presente invención puede entenderse más fácilmente mediante referencia a la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención y los Ejemplos incluidos en el presente documento.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "unido irreversiblemente" se refiere a un tipo de compuesto que se une permanentemente a un receptor, ya sea formando un enlace covalente con el sitio activo, o como alternativa simplemente uniéndose fuertemente de modo que la tasa de disociación sea efectivamente cero en escalas de tiempo relevantes.
Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "compuesto de interés" y "fármaco" se utilizan indistintamente y se refieren a la molécula que se une a la diana de interés.
Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "diana" y "receptor" se utilizan indistintamente cuando se hace referencia al foco del ensayo de RO.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "inmediatamente" cuando se refiere a cuando se añade la solución de lisis que contiene la molécula de desactivador a la muestra de sangre significa tan pronto como sea posible después de que se haya recogido la muestra de sangre. Como alternativa, la solución de lisis que contiene la molécula de desactivador se agrega en el intervalo de los primeros 5 minutos después de que se haya recogido la muestra de sangre.
Esta invención describe el desarrollo de un ensayo de ocupación del receptorin vivo,más específicamente, un ensayo de ocupación del receptor (RO) de tirosina cinasa de Bruton (BTK)in vivo.La sensibilidad del ensayo es clave para determinar la RO en niveles de ocupación muy altos o muy bajos donde la diana unida o libre podría ser inferior al 5 %.
La presente divulgación proporciona un método que comprende las etapas de a) recoger una muestra de sangre de un sujeto tratado con el compuesto de interés, b) agregar una solución de lisis que contiene un desactivador específico del receptor a la muestra de sangre, c) aislar el receptor de interés, d) digerir el receptor aislado para generar péptidos sustitutos, e) medir la cantidad de péptidos sustitutos y determinar la ocupación del receptor comparando la cantidad de péptido sustituto unido al fármaco con la cantidad total de péptidos sustitutos unidos al fármaco y unidos al desactivador.
Más específicamente, la invención se refiere a un método de ensayo para determinar la ocupación del receptor de fármacos en un sujeto al que se le administra un fármaco de interés que se une covalentemente al receptor de interés, comprendiendo dicho método las etapas de:
a. recoger una muestra de sangre del sujeto tratado con el fármaco de interés
b. añadir una solución de lisis que comprende un desactivador que se une irreversiblemente al mismo sitio de receptor que el fármaco de interés a la muestra de sangre,
c. aislar el receptor unido al fármaco y unido al desactivador mediante inmunocaptura,
d. digerir el receptor unido al fármaco y unido al desactivador aislado para generar péptidos sustitutos unidos al fármaco y unidos al desactivador,
e. medir la cantidad de péptidos sustitutos utilizando CL-EM/EM y determinar la cantidad de receptor unido al fármaco comparando la cantidad de péptido sustituto unido al fármaco con la cantidad total de péptidos sustitutos unidos al fármaco y unidos al desactivador.
Recogida de una muestra de sangre de un sujeto al que se le administra el compuesto de interés.
En una realización de la invención, ll compuesto de interés se une irreversiblemente a al menos un aminoácido del receptor. Un ejemplo de un compuesto de interés es el compuesto mostrado en la Figura 1A, que se une irreversiblemente a BTK.
Se añade a la muestra de sangre una solución de lisis que contiene un desactivador específico del receptor Hubo una serie de desafíos que impactaron en la selectividad y la sensibilidad del desarrollo del ensayo de ocupación del receptor (RO). En particular, la presencia del fármaco libre y receptor libre en la muestra de sangre podría generar un receptor unido al fármacoex vivodurante la etapa de lisis, lo que llevaría a una sobreestimación de la RO. Se descubrió que la adición de un desactivador específico del receptor durante la etapa de lisis convierte rápidamente el receptor libre en un receptor unido al desactivador (QB), bloqueando de ese modo la formación de receptores unidos al fármacoex vivo.
En una realización, el ensayo de RO comprende la lisis de la muestra de sangre en presencia de un desactivador para convertir el receptor endógeno en un receptor unido al desactivador, evitando de ese modo la formación del receptor endógeno unido al fármaco.
En una realización de la invención, el desactivador se une irreversiblemente al mismo aminoácido que el compuesto de interés. Preferiblemente, el desactivador compite con el compuesto de interés en la unión al receptor. En otra realización de la invención, el desactivador se añade a la solución de lisis en exceso molar con respecto al compuesto de interés. En otra realización de la invención, la solución de lisis que contiene el desactivador se añade inmediatamente después de recoger la muestra de sangre.
Un experto en la materia conocería las soluciones de lisis celular. Las soluciones de tampón de lisis celular disponibles comercialmente incluyen el tampón de lisis NP-40 (ThermoFisher Scientific), tampón de lisis RIPA (Abbexa), tampón de lisis ACK (ThermoFisher Scientific), tampón de lisis celular (10x) (n.° de cat.: 9803, Cell Signaling Technology). El tampón de lisis se utiliza para lisar células en condiciones no desnaturalizantes.
Un ejemplo de un compuesto desactivador es el compuesto mostrado en la Figura 1B, que se une irreversiblemente a BTK.
Aislamiento del receptor unido al fármaco y unido al desactivador de la solución de lisado celular
La inmunocaptura es un método de limpieza de muestras altamente selectivo que aprovecha la inmunoafinidad única de la proteína diana y el agente de captura (Stevenson, L.,et. al.,Bioanalysis 2013, 5, 2903-2918). La selección del anticuerpo de captura adecuado con alta eficiencia de inmunocaptura para la diana endógena es clave para el éxito del ensayo. Un experto en la materia sabría cómo generar anticuerpos específicos para su proteína diana en caso de que un anticuerpo específico no estuviera disponible comercialmente.
Para evaluar la eficiencia de inmunocaptura, se examinan los anticuerpos utilizando dianas unidas al fármaco y unidas al desactivador. Los anticuerpos se seleccionan en función de su alta afinidad tanto con la diana unida al fármaco como con la diana unida al desactivador. Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos específicos para BTK, se evaluó la capacidad de inmunocaptura del clon de Acm disponible comercialmente n.° MAB5807 y del clon de Acm n.° D3H5. Sorprendentemente, el Acm, clon n.° MAB5807 no pudo detectar BTK endógena, DB-bTk o QB-BTK con la sensibilidad necesaria aunque muestra alta afinidad por BTK recombinante, DB-BTK o QB-BTK. Tal como se muestra en la Figura 4, mientras que la respuesta de CL-E<m>de la BTK endógena fue demasiado baja cuando se utilizó el Acm clon n.° 5807, el otro clon, el clon de Acm n.° D3H5 dio una respuesta moderada para la BTK recombinante unida al fármaco y unida al desactivador, y una respuesta mayor para la BTK endógena unida al fármaco y unida al desactivador. Dado que el objetivo final era determinar la BTK endógena unida al fármaco y unida al desactivador en la sangre humana, se seleccionó el clon n.° D3H5 para su uso en el ensayo de RO de BTK. Generación de péptidos sustitutos de receptor unido al fármaco y unido al desactivador
Los péptidos sustitutos de receptor generados para su uso en el ensayo de RO deben contener el sitio de unión del compuesto de interés. Adicionalmente, los péptidos sustitutos deben ser sensibles a la detección por CL-EM.
En una realización de la invención, el receptor unido al fármaco y unido al desactivador aislado se digiere con una o más proteasas seleccionadas del grupo que consiste en serina proteasas, cisteína proteasas, treonina proteasas, ácido aspártico proteasas, ácido glutámico proteasas y metaloproteasas. Los ejemplos de proteasas aceptables incluyen tripsina, quimotripsina, Glu-C proteasa, Lys-C proteasa, Lys-N proteasa, Asp-N proteasa, Arg-C proteasa. La Tabla 1 describe los péptidos sustitutos generados cuando BTK se digiere con diversas proteasas.
Dado que la cuantificación de la diana unida al fármaco y de la diana unida al desactivador se basa en la respuesta de EM de los péptidos sustitutos representativos, los rendimientos de la digestión de estos péptidos sustitutos podrían tener un impacto drástico en la sensibilidad de la detección.
En una realización de la invención, la etapa de digestión se realiza antes o después de la elución del receptor unido al fármaco y unido al desactivador del sustrato de inmunocaptura. Preferiblemente, la etapa de digestión se realiza mientras la diana está unida al sustrato de inmunocaptura. Por ejemplo, la BTK unida al fármaco y unida al desactivador se trató con una digestión con tripsina mientras aún estaba unida a la perla de inmunocaptura.
Medición de la cantidad de péptidos sustitutos
En una realización de la invención, la ocupación del receptor se puede determinar midiendo los péptidos sustitutos unidos al desactivador y unidos al fármaco simultáneamente en una única ejecución de CL-EM/EM.
Durante el desarrollo inicial del método, la DB-BTK y la QB-BTK generadas a partir de la reacción se analizaron utilizando una espectrometría de masas de alta resolución (EMAR) Q Exactive HF. Al utilizar la masa exacta esperada de los péptidos sustitutos, se identificaron todos los péptidos sustitutos. La abundancia de señal de cada etapa de carga se muestra en la Figura 6. Los datos muestran que tanto DB-BTK como QB-BTK dieron la respuesta más alta para la etapa de tres cargas, por consiguiente, el ion [M+3H]<3+>se utilizó tanto para DB-QRP (péptido sustituto de DB-BTK) como para QB-QRP (péptido sustituto de QB-BTK) como ion original para la detección de MRM. Como se muestra en la Figura 7A-7C, se mostraron varios iones de producto en los espectros de EM/EM. El ion de producto correspondiente al ion y<2>(m/z -288) y al ion b6(m/z ~755 para DB-QRP y QB-QRP, m/z ~ 765 para IS) muestran una buena intensidad para la detección de MRM con ion y<2>mejor que ion b6. Punto que el ion y<2>en m/z -288 tiene un pico de interferencia que se muestra en los canales de MRM de DB-QRP y QB-QRp , ion b6se utilizó como ion de producto para la detección de MRM.
Los cromatogramas de MRM típicos de DB-QRP, QB-QRP e IS a partir de lisado de sangre de mono en blanco, lisado de sangre de mono en blanco enriquecido con DB-BTK y QB-BTK a la concentración del LLOQ de 0,250 nM para DB-BTK y 0,125 nM para QB-BTK se muestran en las Figuras 8a, 8b, 8d y 8e. Los cromatogramas de masas de MRM típicos de [13C<g>,15N]-QB-QRP del lisado de sangre de mono en blanco con solo IS se muestran en las figuras 8c y 8f. No se encontraron picos de interferencia significativos del lisado de mono en blanco en el tiempo de retención ni en el canal iónico de DB-QRP, QB-QRP o IS cuando se analizó el lisado de sangre de mono en blanco de control. DB-QRP, QB-QRP y sus IS se eluyeron de la columna UHPLC con una retención de 5,02, 4,87 y 4,87 min, respectivamente.
Límite inferior de cuantificación
Los límites inferiores de cuantificación (LLOQ) para DB-QRP y QB-QRP fueron 0,250 nM y 0,125 nM, que son las concentraciones más bajas para ambos analitos en las curvas estándar. Como se muestra en las Figuras 8b y 8e, la relación señal-ruido (S/N) de DB-QRP o QB-QRP en los niveles de concentración de LLOQ fue de al menos 3 o más.
Linealidad de la curva de calibración y exactitud y precisión de los controles de calidad
Para la calificación del método para cuantificar RO de BTK en lisado de sangre, todas las curvas estándar se ajustaron a un modelo de regresión cuadrática ponderada 1/x con curvas estándar que oscilaban entre 0,250 y 12,5 nM para DB-BTK y entre 0,125 y 12,5 nM para QB-BTK. En cada ejecución, para al menos dos tercios de los patrones de calibración, las desviaciones de las concentraciones retrocalculadas con respecto a sus valores nominales estuvieron en el intervalo del ±20,0 % (±25,0 % en el nivel de LLOQ). Como se muestra en las Tablas 2-3, las desviaciones de las concentraciones retrocalculadas con respecto a sus valores nominales estuvieron en el intervalo del ±11,1 % para DB-BTK y en el intervalo del ±19,8 % para QB-BTK para tres ejecuciones de exactitud y precisión. La exactitud y precisión se evaluaron utilizando las muestras de control de calidad.
Tabla 2. Resumen de datos obtenidos a partir de la precisión y exactitud de las muestras de curva estándar para el ______________________________________ ensayo de DB-BTK______________________________________ Ejecuciones Ejecución 1 Ejecución 2 Ejecución 3 Concentración nominal Concentración % de Concentración % de Concentración % de (nM) pred. desviación pred. desviación pred. desviación 0,250 0,229 -8,4 0,237 -5,2 0,256 2,4 0,500 0,482 -3,6 0,505 1,0 0,495 -1,0 1,000 1,080 8,0 1,110 11,0 0,986 -1,4 2,000 2,186 9,3 1,810 -9,5 2,012 0,6 5,000 4,776 -4,5 5,256 5,1 4,853 -2,9 10,000 9,568 -4,3 9,376 -6,2 11,114 11,1 12,500 12,951 3,6 13,203 5,6 11,341 -9,3
Tabla 3. Resumen de datos obtenidos a partir de la precisión y exactitud de las muestras de curva estándar para el ________________________________________ ensayo de QB-BTK______________________________________ Ejecuciones Ejecución 1 Ejecución 2 Ejecución 3 Concentración Concentración % de Concentración Concentración Concentración % de nominal (nM) pred. desviación pred. pred. pred. desviación 0,125 0,126 0,8 0,13 4,0 0,116 -7,2 0,250 0,217 -13,2 0,264 5,6 0,209 -16,4 0,500 0,544 8,8 0,442 -11,6 0,599 19,8 1,000 0,996 -0,4 0,991 -0,9 1,058 5,8 2,000 2,142 7,1 2,076 3,8 2,023 1,2 5,000 4,963 -0,7 4,846 -3,1 4,807 -3,9 10,000 9,282 -7,2 10,5 5,0 9,835 -1,7
12,500 13,159 5,3 12,116 -3,1 12,757 2,1
Tabla 4. Calificación del ensayo: datos de control de calidad obtenidos a partir de lisado de sangre de mono que contiene el 25, 50 y 90 % de ocupación de BTK
Nivel de Ejecución 1 Ejecución 2 Ejecución 3 control de DB-BTK QB-BTK % de DB-BTK QB-BTK % de DB-BTK QB-BTK % de calidad (nM) (nM) RO de (nM) (nM) RO de (nM) (nM) RO de (n=6) BTK BTK BTK QC del 25 1,331 3,821 25,8 0,933 3,616 20,5 0,951 2,768 25,6 % de RO de 1,371 3,918 25,9 1,102 3,835 22,3 0,817 2,743 22,9 BTK 1,499 4,385 25,5 1,18 4,12 22,3 0,79 2,364 25,0
1,408 3,85 26,8 0,882 3,727 19,1 0,804 2,219 26,6 1,21 3,604 25,1 1,076 3,985 21,3 0,867 2,63 24,8 1,214 3,653 24,9 0,933 3,687 20,2 0,781 2,353 24,9 QC del 50 2,541 2,283 52,7 1,849 2,391 43,6 1,739 1,739 50,0 % de RO de 2,629 2,454 51,7 2,105 2,403 46,7 1,85 1,648 52,9 BTK 2,783 2,658 51,1 1,736 2,033 46,1 1,651 1,659 49,9
2,479 2,456 50,2 2,166 2,52 46,2 1,553 1,596 49,3 2,208 2,137 50,8 2,384 2,625 47,6 1,827 1,667 52,3 2,813 2,424 53,7 2,301 2,500 47,9 1,577 1,485 51,5 QC del 90 5,035 0,449 91,8 4,299 0,471 90,1 3,234 0,35 902 % de RO de 4,830 0,384 92,6 4,600 0,495 90,3 2,684 0,237 91,9 BTK 4,881 0,427 92,0 3,652 0,436 89,3 2,933 0,274 91,5
4,080 0,356 92,0 4,677 0,495 90,4 3,139 0,286 91,6 4,631 0,419 91,7 5,009 0,511 90,7 3,235 0,296 91,6 4,485 0,420 91,4 4,710 0,505 90,3 2,866 0,279 91,1
Como se muestra en la Tabla 4, la diferencia entre el % de RO de BTK medido y el % de RO de BTK teórico estuvo en el intervalo del ±5 % para todos los QC para las tres ejecuciones, excepto para una de cada seis muestras de QC_25 % de RO y una de cada seis muestras de QC_50 % de RO en la ejecución 2 que tuvieron una diferencia entre los valores medidos y teóricos de > 5 %.
El % de CV y el % de desviación estuvieron en el intervalo del 10 % para todos los QC en las tres ejecuciones, excepto para un QC_25 % de RO, con un % de desviación de -16,2 % (Tabla 5). Los resultados demostraron que el método era preciso y exacto para el análisis del%de RO de BTK en lisado de sangre de mono.
Tabla 5. Resumen de datos de control de calidad obtenidos del lisado de sangre de mono que contiene el 25, 50 y
QCs de RO de BTK (valor DB-BTK (nM) QB-BTK (nM) RO de BTK media % % de nominal, %) medida (%) de desviación CV
Ejecución 1
QC 25 % de RO 1,339±0,113 3,872 ± 0,279 25,7 2,6 2,7 QC_50 % de RO 2,576±0,223 2,402 ± 0,177 51,7 2,5 3,4 QC 90 % de RO 4,657±0,342 0,409 ± 0,033 91,9 0,4 2,1 Ejecución 2
QC 25 % de RO 1,018±0,118 3,828 ± 0,192 21,0 6,0 -16,2 QC_50 % de RO 2,090±0,253 2,412 ± 0,204 46,4 3,3 -7,3 QC 90 % de RO 4,491±0,470 0,486 ± 0,028 90,2 0,5 0,2 Ejecución 3
:_25 % de RO 0,835 ± 2,513 ± 0,231 25,0 4,8 -0,1 0,064
_50 % de RO 1,700 ± 1,632 ± 0,086 51,0 2,9 20 0,126
_90 % de RO 3,015 ± 0,287 ± 0,037 91,3 0,6 1,5 0,224
Evaluación de estabilidad
Las estabilidades establecidas para DB-BTK y QB-BTK en lisado de sangre de mono se resumen en la Tabla 6. Los resultados indicaron que la estabilidad de DB-BTK y QB-BTK no tuvo impacto o tuvo un impacto mínimo en el % de RO de BTK, ya que la diferencia entre el % de RO de BTK medido y el % de RO de BTK teórico estuvo en el intervalo del ±5 % para todos los QC, independientemente de la concentración absoluta de DB-BTK o QB-BTK, disminuyendo después de 2 ciclos de congelación y descongelación a -80 °C o almacenados a temperatura ambiente durante 24 h o almacenados a -80 °C durante 224 días.
Tabla 6. Evaluación de la estabilidad de las muestras de control de calidad en el % de RO de BTK del 25 % y 90 % Evaluación de DB-BTK medida (nM) QB-BTK medida (nM) RO de BTK medida media CV Desv estabilidad______________________________________________________ (%)____________ (%) (%) 2 ciclos de
congelación y
descongelación
QC_25 % de RO 0,968 ± 0,108 3,435 ± 0,307 22,0 3,0 -12,2 QC_90 % de RO 4,372 ± 0,157 0,505 ± 0,050 89,7 0,9 -0,4 24 horas en TA
QC 25 % de RO 0,912 ± 0,086 3,099 ± 0,177 22,8 6,9 -9 QC 90 % de RO 3,019 ± 0,120 0,398 ± 0,040 88,4 1,0 -1,8 224 días a -80 °C
QC 25 % de RO 0,890 ± 0,067 2,500 ± 0,186 26,3 4,4 5,1 QC 90 % de RO 3,719 ± 0,039 0,367 ± 0,032 91,0 0,8 1,1
Uso del ensayo de ocupación del receptor de CL-EM/EM de inmunocaptura
La medición de RO es una determinación crítica para relacionar la eficacia con el mecanismo en modelos animales preclínicos y en estudios clínicos. En la práctica, la RO es particularmente útil para tomar decisiones sobre el aumento de dosis en el estudio primero en humanos (FIH).
EJEMPLO 1
Preparación de muestras de control de calidad y patrones de BTK unida a fármaco (DB-BTK) y BTK unida a desactivador (QB-BTK)
Reactivos y materiales
Los compuestos farmacológicos y desactivadores que se muestran en las Figuras 1A y 1B, respectivamente, fueron sintetizados por Investigación y Desarrollo en Bristol-Myers Squibb (Princeton, NJ). El anticuerpo monoclonal de conejo anti-BTK biotinilado (lote n.°: D3H5, n.° de cat.: 12624) y tampón de lisis 10 x (n.° de cat.: 9803) se adquirieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Las perlas Dynabeads My one de estreptavidina T1 (n.° de cat.: 65602) se adquirieron de ThermoFisher Scientific (Carlsbad, CA). La proteína BTK recombinante (n.° de cat.: PV3587) se adquirió de Life Technologies (Carlsbad, CA). El inhibidor de proteasa (n.° de cat.: 539134) se adquirió de Millipore Sigma (Billerica, MA). El patrón interno (IS) utilizado para el ensayo, [13C<g>,15El N]-QB-QRP que contiene aminoácidos flanqueantes tanto en el extremo N como en el C (Tabla 8), fue sintetizado por el Departamento de Síntesis Química de Bristol-Myers Squibb (BMS) (Princeton, NJ, EE.UU.). La sangre completa de mono ACD-A se adquirió de Bioreclamation Inc. (Westbury, NY). Todos los demás reactivos eran de calidad analítica. El dispositivo de separación magnética MagnaBot 96 (n.° de cat.: V8151) se adquirió de Promega Corporation (Madison, WI).
Preparación de los patrones de referencia para BTK unida al fármaco (DB-BTK)
La BTK recombinante (5,9 j M, 200 jl) se combinó con 400 j l de PBS y luego se añadió 15 j l de solución de fármaco 1,0 mg/ml (compuesto mostrado en la Figura 1A) en acetonitrilo (2701 j M de fármaco, 15 jl). La solución se incubó entonces a TA durante 1 h, dando como resultado una concentración de DB-BTK de 1919 nM. La concentración de DB-BTK se basó en la cantidad de BTK libre total utilizada para la reacción porque la conversión de BTK libre a DB-BTK fue de -100 % en presencia de una cantidad excesiva de fármaco.
Preparación de los patrones de referencia para BTK unida al desactivador (QB-BTK)
La BTK recombinante (5,9<j>M, 200 jl) se combinó con 400 j l de PBS y luego se añadió 15 j l de solución de desactivador 1,0 mg/ml (compuesto mostrado en la Figura 1B) en acetonitrilo (2806<j>M de desactivador, 15 jl). La solución se incubó a TA durante 1 h, dando como resultado una concentración de QB-BTK de 1919 nM. La concentración de QB-BTK se basó en la cantidad de BTK libre total utilizada para la reacción porque la conversión de BTK libre a QB-BTK fue de ~ 100 % en presencia de una cantidad excesiva de desactivador.
Preparación de cóctel de tampón de lisis que contiene desactivador: Tampón de lisis 2x con inhibidor de proteasa 0,0133x y solución de desactivador 1,5yM:
Se mezcló un vial que contenía 15 ml de tampón de lisis 10x con 1,0 ml de inhibidor de proteasa y 80 j l de solución de desactivador 0,5 mg/ml (compuesto mostrado en la Figura 1B) en DMSO. Luego, la solución se diluyó con 59 ml de agua desionizada para un volumen total de 75 ml.
Preparación de cóctel de tampón de lisis que contiene fármaco: Tampón de lisis 2x con inhibidor de proteasa 0,0133x y solución de fármaco 1,5yM
Se mezcló un vial que contenía 15 ml de tampón de lisis 10x con 1,0 ml de inhibidor de proteasa y 83 j l de solución de fármaco 0,5 mg/ml (compuesto mostrado en la Figura 1A) en DMSO. Luego, la solución se diluyó con 59 ml de agua desionizada para un volumen total de 75 ml.
Preparación del lisado+433 (100 % de QB-BTK) de sangre de mono
La sangre completa de mono ACD-A (3,5 ml) se combinó con 7 ml del tampón de lisis que contenía 1,5 j M de desactivador (compuesto mostrado en la Figura 1B). Las muestras se agitaron durante 1 hora a temperatura ambiente.
Preparación del lisado+195 (100 % de DB-BTK) de sangre de mono
La sangre completa de mono ACD-A (3,5 ml) se combinó con 7 ml del tampón de lisis que contenía 1,5<j>M de fármaco (compuesto mostrado en la Figura 1A). Las muestras se agitaron durante 1 hora a temperatura ambiente.Preparación de muestras de control de calidad (QCs) utilizando lisado de sangre que contiene BTK endógena
Las QCs de RO de BTK se preparan mezclando diferentes porcentajes de Lisado+433 y Lisado+195. QC inferior (LQC), QC medio (MQC) y QC alto (HQC) con % de RO de BTK al 25 %, al 50 % y al 90 % se prepararon mezclando Lisado+433/Lisado+195 a 2250/750, 1500/1500, 300/2700 (v/v), respectivamente tal como se muestra en la Tabla 7.
Tabla 7. Preparación de muestras de control de calidad utilizando lisado de sangre de mono que contiene BTK ________________________________________ endógena________________________________________
QCs de RO de BTK Ocupación de BTK teórica Lisado+433a (jl) Lisado+195b(jl) Volumen total (jl)
(%)
QC del 25 % de RO 25 2250 750 3000
QC 50 % de RO 50 1500 1500 3000
QC 90 % de RO 90 300 2700 3000
a El lisado+433 se obtuvo mediante el pretratamiento del lisado de mono con solución de desactivador (Figura 1B).
b El lisado+195 se obtuvo mediante el pretratamiento del lisado de mono con solución de fármaco (Figura 1A).
Preparación de la curva estándar de DB-BTK (BTK+195): Uso del Lisado+433 de sangre de monoSe prepararon patrones de calibración (STD) a 0,250, 0,500, 1,00, 2,00, 5,00, 10,0 y 12,5 nM de DB-BTK en lisado de sangre de mono que contenía el 0 % de DB-BTK mediante dilución independiente de las soluciones madre de DB-BTK (1919 nM en tampón). Durante la preparación, se prepararon diluciones intermedias de 200 y 20 nM para DB-BTK diluyendo 1919 nM de solución madre de DB-BTK con Lisado+433 de sangre, y luego se diluyeron aún más hasta obtener las muestras finales de STD. Las concentraciones nominales se basaron en el volumen de sangre, la concentración real en el lisado sanguíneo fue 1/3 de cada uno debido al factor de dilución de 3.
Preparación de la curva de estándar de QB-BTK (BTK+433): Uso del Lisado+195 de sangre de mono
Se prepararon patrones de calibración (STD) a 0,125, 0,250, 0,500, 1,00, 2,00, 5,00, 10,0 y 12,5 nM de QB-BTK en lisado de sangre de mono que contenía el 0 % de QB-BTK mediante dilución independiente de las soluciones madre de QB-BTK (1919 nM en tampón). Durante la preparación, se prepararon diluciones intermedias de 200 y 20 nM para QB-BTK diluyendo 1919 nM de solución madre de QB-BTK con Lisado+195 de sangre, y luego se diluyeron aún más hasta obtener las muestras finales de STD. Las concentraciones nominales se basaron en el volumen de sangre, la concentración real en el lisado sanguíneo fue 1/3 de cada uno debido al factor de dilución de 3.
Preparación de perlas de captura de estreptavidina T1 con anticuerpo biotinilado anti-BTK.
La concentración de perla Dynabeads My one de estreptavidina T1 para inmunoprecipitación fue de 10 mg/ml. La capacidad de unión del Acm biotinilado fue de 20 |jg de Acm/mg de perla. Se dividieron en alícuotas un total de 25 ml de perlas de estreptavidina T1 en 10 tubos de 2,5 ml cada uno. Las muestras se lavaron con 3 ml de solución PBST. Se usó un imán DynaMag<™>-5 para separar las perlas magnéticas de las matrices de muestra líquida. Después de descartar el último lavado, las perlas se resuspendieron en 2,5 ml de PBST en cada tubo, luego se añadieron 0,500 ml de anticuerpo anti-BTK biotinilado (1 mg/ml, n.° de lote: D3H5). Las muestras en 10 tubos (0,500 ml) se incubaron a TA durante 1 h. Las perlas se separaron de la solución y las perlas de cada tubo se lavaron con 3 ml de PBST. Las perlas en los tubos se resuspendieron en 2,5 ml de PBST. La concentración final de anticuerpo anti-BTK fue de 0,2 jg / j l de perlas. Las muestras se almacenaron a 4 °C para su uso futuro.
Inmunocaptura para el enriquecimiento de BTK unida al fármaco (DB-BTK) y BTK unida al desactivador (QB-BTK) a partir de lisado de sangre.Alícuotas de muestras de lisado de sangre de 3000 j l para el lisado de sangre de mono de control, patrones de calibración, muestras de control de calidad o muestras de estudio de monos se centrifugaron a temperatura ambiente. Se añadió anticuerpo de captura anti-BTK (60 j l a 0,2 jg de Acm/jl de perla) en perlas al sobrenadante de las muestras centrifugadas, las muestras se incubaron a tA durante 120 minutos seguido de centrifugación. Se eliminó el sobrenadante y se añadió PBST a las muestras con perlas. Las muestras se transfirieron a una placa LowBind de 96 pocillos en un manipulador de líquidos TECAN y se colocaron sobre el dispositivo de separación magnética MagnaBot 96. Las perlas se lavaron con 800 j l de PBST dos veces, seguido de 500 j l de NH<4>OAc 25 mM con Tween-20 al 0,05 %. Después de retirar el tampón de lavado, las perlas en la placa de 96 pocillos LowBind se utilizaron para la digestión con tripsina como se describe a continuación.
Digestión con tripsina.Después de la adición de IS (100 j l de SIL-QB-QRP 0,5 jg/ml en NH<4>OAc 25 mM con Tween-20 al 0,05 %) excepto el lisado en blanco (al que se le agregaron 100 j l de NH<4>OAc 25 mM con Tween-20 al 0,05 %) a las perlas en una placa de 96 pocillos, se añadieron 25 j l de NH<4>OHC<3>100 mM a cada muestra. Las muestras se digirieron mediante la adición de 25 j l de solución de tripsina recién preparada a 160 ng/jl en NH<4>OHC<3>100 mM y se incubó a 50 °C durante 30 minutos antes de extinguir con 20 j l de MeOH/ácido fórmico al 50 %/50 % (v/v). Las muestras se agitaron en vórtex brevemente y luego se colocaron en la parte superior de un dispositivo MagnaBot 96, el sobrenadante se transfirió a una nueva placa de 96 pocillos, seguido de una centrifugación a 4000 rpm durante 2 minutos. Las muestras se analizaron mediante CL-EM/EM.
Análisis de UHPLC-EM/EM.Para la calificación del ensayo y el análisis de muestras, se utilizó un espectrómetro de masas AB Sciex Triple Quad 5500 de Sciex (Forster City, CA) para la adquisición de datos de CL-EM/EM.
La siguiente condición de CL-EM/EM se utilizó para la calificación del ensayo y el análisis de muestras de PD. Para cada muestra procesada, se inyectó un volumen de 50 j l del digesto en un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC) (modelo LC-30AD, Shimadzu Scientific Instruments, Inc., Columbia, MD). Las condiciones de UHPLC-EM/EM descritas a continuación se utilizaron específicamente para la cuantificación de BTK ocupada y desactivada en lisado de sangre de mono. Se usó una columna Waters CORTECS<™>UPLC C18+ (2,1 * 100 mm, 1,6 jm, Waters Corporation, Milford, MA) para el análisis del péptido DB-QRP y QB-QRP. La fase móvil A estaba compuesta por el 0,1 % de ácido fórmico en agua; mientras que la fase móvil B era ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo. La separación por UHPLC se realizó utilizando una elución en gradiente comenzando con 15 % de B y mantener durante 0,5 min, seguido de cambiar % de B del 15 % al 30 % en 2,5 min, y luego cambiar % de B del 30 % al 45 % en 4,9 min, luego aumentar % de B del 45 % al 90 % en 0,1 min y mantener durante 1 min, luego disminuir % de B del 95 % al 15 % en 0,1 min, mantener durante 1,0 min y detener a los 10,0 min. El caudal fue de 0,600 ml/min y la temperatura de la columna fue de 60 °C. Con una configuración de válvula de conmutación, el eluyente UHPLC se introdujo con un intervalo de tiempo de 3,0-6,5 min en un espectrómetro de masas Triple Quad 5500™ equipado con una fuente de pulverización de iones turbo obtenida de AB Sciex (Forster City, CA). El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo de ionización por electropulverización positiva con los siguientes ajustes: gas de cortina, 30 unidades; gas CAD, 9 unidades; gas 1, 65 unidades; gas 2, 65 unidades; tensión de pulverización de iones turbo de 4000 V positivos y temperatura de la sonda turbo a 600 °C. El espectrómetro de masas se operó en modo MRM con la transición de m/z 962,493 > 755,40, 967,174 > 755,40 y 965,825 > 765,50 para QB-QRp , DB-QRP y SIL-QB-QRP (IS), respectivamente (Tabla 8). Los datos sin procesar se procesaron utilizando el software Analyst® (versión 1.6.2, AB SCIEX) para la integración de picos cromatográficos y los resultados procesados se exportaron a Watson LIMS™ (versión 7.4, ThermoFisher Scientific Inc.) para regresión de patrones de calibración y cálculos de concentración de QCs y otras muestras. Los datos estadísticos sobre el rendimiento del ensayo (ANOVA) se calcularon utilizando Watson LIMS™.
Tabla 8. Transiciones de MRM utilizadas para la detección por CL-EM/EM de péptidos sustitutos y sus patrones internos marcados con isótopos estables.____________________________________________________________ ______ Péptido sustituto____________ Secuencias de péptido sustituto______ [M+3H]3+____ Transición de MRM
DB-QRPa (n.° de aa 467-487) 966,8368 m/z 967,17^755,4
QRPIFIITEYMANGCLLNYLR
Fórmula: C135H205FN34O32S2
QB-QRPa (n.° de aa 467-487) 962,1649 m/z 962,50^755,4
QRPIFIITEYMANGCLLNYLR
Fórmula: C<134>H<203>FN<34>O<32>S<2>
[13C<g>,15N]-QB-QRP<b>(patrón
interno) 965,5073 m/z 965,83 ^ 765,5
TRQRPKF*)IITEYMANGCLLNYLREA
Fórmula después de la digestión con
tripsina:
13C9C<l 25>H203F15NN33O32S2
a El péptido sustituto se denomina QRP basándose en los primeros tres símbolos de aminoácidos de los 21 aminoácidos del péptido tripsínico. DB-QRP = Péptido QRP unido al fármaco; QB-QRP = Péptido QRP unido al desactivador.
b El símbolo de F* representa una [13C9,15N]-fenilalanina. El segmento peptídico subrayado fue un péptido tripsínico y se controló mediante un ensayo de CL-EM/EM._______________________________________________________
Calificación del ensayo.La calificación del ensayo consistió en tres ejecuciones de precisión y exactitud con una evaluación adicional de la estabilidad que incluyó congelación y descongelación, TA y estabilidad a largo plazo de las QCs de RO de BTK. La linealidad del método se evaluó utilizando siete puntos de curva de calibración de DB-BTK (0,250 nM - 12,5 nM) u ocho de QB-BTK (0,125 nM - 12,5 nM) en todas las ejecuciones de calificación. Para la cuantificación se utilizó un modelo de regresión cuadrática con ponderación 1/x. Los criterios de aceptación fueron los siguientes: en cada ejecución, para al menos dos tercios de los patrones de calibración, las desviaciones de las concentraciones retrocalculadas con respecto a sus valores nominales estuvieron en el intervalo del ±20,0 % (±25,0 % en el nivel de LLOQ). Para las QCs de RO de BTK, para al menos el 50 % de las QCs en cada nivel, la diferencia entre el % de RO de BTK medido y el % de RO de BTK teórico debe estar en el intervalo de ±5 %. Por ejemplo, para QC_25 % de RO de BTK, el % de RO de BTK medido debe estar en el intervalo del 25,0 ± 5,0 %. La selectividad del ensayo se evaluó utilizando únicamente lisado de sangre en blanco, QC0 (lisado en blanco con IS únicamente).
EJEMPLO 2
Aplicación a estudios de PD de mono.
Para evaluar la utilidad y solidez del ensayo de RO de BTK por CL-EM/EM en comparación con un ensayo basado en ELISA establecido, se realizó un estudio de dosis única ascendente del compuesto mostrado en la Figura 1A. A los macacos cangrejeros se les administró el compuesto farmacológico 1A a 0,1, 0,2 y 0,5 mg/kg por vía oral. Se recogieron muestras de sangre a las 1, 3, 5, 7 y 24 h del día 1 para la evaluación PK y se recogieron antes de la dosis, 1, 3, 5, 7, 24, 48, 72, 144 y 168 h para la evaluación PD utilizando ensayos de RO de BTK por CL-EM/EM así como el ensayo de unión de ligando (LBA) descrito en el Ejemplo 3.
Muestras de PD para el ensayo de RO de BTK por CL-EM/EM.
Antes de la toma de muestras de PD, se preparó el siguiente cóctel de tampón de lisis que contenía tampón de lisis 2x con inhibidor de proteasa 0,0133x y solución de desactivador 1,5 pM (compuesto mostrado en la Figura 1B): Se mezcló un vial que contenía 15 ml de tampón de lisis 10x con 1,0 ml de inhibidor de proteasa y 80 pl de desactivador 0,5 mg/ml compuesto 1B en DMSO. Luego, la solución se diluyó con 59 ml de agua desionizada para un volumen total de 75 ml.
Como se ha mencionado anteriormente, se recogieron 2 ml de muestras de sangre en el momento establecido. Se lisaron 1,5 ml de la sangre recogida con 3 ml del cóctel de tampón de lisis que contenía el desactivador compuesto 1B. Inmediatamente después del mezclado, las muestras se agitaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras de lisado de sangre se almacenaron a o por debajo de -70 °C inmediatamente después de la recogida. Las muestras se utilizaron para inmunocaptura con ensayo por CL-EM/EM.
EJEMPLO 3
Ensayo de RO de BTK mediante LBA
Se recogió sangre completa de mono tratada con ACD-A en puntos de tiempo establecidos después de la dosificación y se agregó a una placa de 96 pocillos, de fondo en V, de 2 ml (Costar, n.° de cat. 3960) y se lisó con tampón de lisis 2x (Cell Signaling, n.° de cat. 9803) que contiene inhibidor de proteasa (Calbiochem, n.° de cat.
539134) y sonda biotinilada (BMT-105186). El lisado se transfirió a una placa recubierta de estreptavidina (ThermoFisher Scientific, neutrAvidin® n.° de cat. 15128) y se incubó con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadió el anticuerpo anti-BTK (Cell Signaling, n.° de cat. 8547, dilución 1:1000 en PBS Tween20 al 0,05 % BSA al 0,5 %) y se incubó mientras se agitaba durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa de lavó, seguido de la adición de anticuerpo secundario de peroxidasa de rábano picante de cabra anti conejo (Invitrogen, G21234) a una dilución de 1:2500 en PBS Tween20 al 0,05 % B<s>A al 0,5 %. La prueba ELISA se desarrolló con la adición de tetrametilbencidina (TMB) (Sigma, n.° de cat. T0440) y se dejó desarrollar y se detuvo con la adición de ácido sulfúrico 2,0 N. Se leyó la absorbancia a 450 nm y se calculó el % relativo de inactivación de BTK de las muestras de estudio a partir de una curva estándar de muestras que contenían diferentes proporciones de lisados de sangre de mono normal mezclados con lisados desactivados de sangre pretratada con BMT-1268672 pM para permitir la inactivación completa de BTK antes de la lisis.
Análisis farmacocinético mediante CL-EM
Se recogieron 0,5 ml de sangre de mono en los puntos temporales establecidos para la evaluación PK. Cada muestra de sangre se centrifugó para separar el plasma. Se agregaron inmediatamente 10 pl de la solución de desactivador 125 pM (compuesto mostrado en la Figura 1B) a 200 pl de plasma. Después de mezclar, las muestras se almacenaron a -20 °C y se utilizaron para análisis de CL-EM/EM.
Claims (5)
1. Un método de ensayo para determinar la ocupación del receptor de fármacos en un sujeto al que se le administra un fármaco de interés que se une covalentemente al receptor de interés, comprendiendo dicho método las etapas de:
a. recoger una muestra de sangre de un sujeto tratado con el fármaco de interés,
b. añadir una solución de lisis que comprende un desactivador que se une irreversiblemente al mismo sitio de receptor que el fármaco de interés a la muestra de sangre,
c. aislar el receptor unido al fármaco y unido al desactivador mediante inmunocaptura,
d. digerir el receptor unido al fármaco y unido al desactivador aislado para generar péptidos sustitutos unidos al fármaco y unidos al desactivador,
e. medir la cantidad de péptidos sustitutos utilizando CL-EM/EM y determinar la cantidad de receptor unido al fármaco comparando la cantidad de péptido sustituto unido al fármaco con la cantidad total de péptidos sustitutos unidos al fármaco y unidos al desactivador.
2. El ensayo de la reivindicación 1, en donde el fármaco de interés se muestra en la Figura 1A.
3. El ensayo de la reivindicación 1, en donde el desactivador de la etapa (b) se muestra en la Figura 1B.
4. El ensayo de la reivindicación 1, en donde
la etapa de digestión (d) es la digestión con tripsina.
5. Un método para determinar la ocupación del receptor de tirosina cinasa de Bruton (BTK) en un sujeto al que se le administra un fármaco mostrado en la Figura 1A, comprendiendo dicho método las etapas de:
a. recoger una muestra de sangre del sujeto al que se le administra el fármaco,
b. añadir a la muestra de sangre una solución de lisis que contiene el desactivador mostrado en la Figura 1B, c. aislar la BTK unida al fármaco y unida al desactivador con anticuerpo biotinilado anti-BTK unido a perlas de estreptavidina T1,
d. digerir el complejo BTK unida al fármaco y unida al desactivador aislada-anticuerpo con tripsina para generar péptidos sustitutos,
e. medir la cantidad de péptidos sustitutos usando cromatografía CL-EM/EM y determinar la cantidad de BTK unida al fármaco comparando la cantidad de péptido sustituto unido al fármaco con la cantidad total de péptidos sustitutos unidos al fármaco y unidos al desactivador.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862669442P | 2018-05-10 | 2018-05-10 | |
| PCT/US2019/031524 WO2019217684A1 (en) | 2018-05-10 | 2019-05-09 | Assay to determine in vivo receptor occupancy |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2992942T3 true ES2992942T3 (en) | 2024-12-20 |
Family
ID=66821369
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES19729943T Active ES2992942T3 (en) | 2018-05-10 | 2019-05-09 | Assay to determine in vivo receptor occupancy |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US12085564B2 (es) |
| EP (1) | EP3791183B1 (es) |
| JP (2) | JP7570925B2 (es) |
| KR (2) | KR102764357B1 (es) |
| CN (2) | CN112105930B (es) |
| ES (1) | ES2992942T3 (es) |
| WO (1) | WO2019217684A1 (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019217684A1 (en) | 2018-05-10 | 2019-11-14 | Bristol-Myers Squibb Company | Assay to determine in vivo receptor occupancy |
| CN115932261B (zh) * | 2022-08-15 | 2025-07-25 | 广州医科大学附属第五医院 | 一种btk受体占有率的检测方法 |
| CN116482345B (zh) * | 2023-06-16 | 2023-09-22 | 军科正源（北京）药物研究有限责任公司 | 用于检测双靶点药物受体占有率的方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090062255A1 (en) * | 2007-08-17 | 2009-03-05 | Thallion Pharmaceuticals Inc. | Tumor-targeting evaluation methodology and compounds related thereto |
| US20130210030A1 (en) * | 2010-07-19 | 2013-08-15 | Cellzome Ag | In vivo method for the evaluation of a compound-target interaction |
| EP3033625B1 (en) * | 2013-08-13 | 2020-01-22 | The Scripps Research Institute | Cysteine-reactive ligand discovery in proteomes |
| WO2016100593A1 (en) * | 2014-12-17 | 2016-06-23 | Pharmacyclics Llc | Methods and assays for quantification and normalization of kinase and ligand binding |
| WO2019217684A1 (en) | 2018-05-10 | 2019-11-14 | Bristol-Myers Squibb Company | Assay to determine in vivo receptor occupancy |
-
2019
- 2019-05-09 WO PCT/US2019/031524 patent/WO2019217684A1/en not_active Ceased
- 2019-05-09 CN CN201980031353.9A patent/CN112105930B/zh active Active
- 2019-05-09 US US17/051,466 patent/US12085564B2/en active Active
- 2019-05-09 KR KR1020207035120A patent/KR102764357B1/ko active Active
- 2019-05-09 EP EP19729943.1A patent/EP3791183B1/en active Active
- 2019-05-09 JP JP2020563439A patent/JP7570925B2/ja active Active
- 2019-05-09 ES ES19729943T patent/ES2992942T3/es active Active
- 2019-05-09 CN CN202110955643.1A patent/CN113804873B/zh active Active
- 2019-05-09 KR KR1020257003448A patent/KR20250021652A/ko active Pending
-
2024
- 2024-07-31 US US18/791,084 patent/US20250085279A1/en active Pending
- 2024-10-09 JP JP2024177293A patent/JP2025011208A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US12085564B2 (en) | 2024-09-10 |
| CN112105930A (zh) | 2020-12-18 |
| JP7570925B2 (ja) | 2024-10-22 |
| WO2019217684A1 (en) | 2019-11-14 |
| KR20210008028A (ko) | 2021-01-20 |
| EP3791183B1 (en) | 2024-07-24 |
| CN113804873A (zh) | 2021-12-17 |
| KR20250021652A (ko) | 2025-02-13 |
| JP2021523367A (ja) | 2021-09-02 |
| US20210156854A1 (en) | 2021-05-27 |
| CN112105930B (zh) | 2025-02-28 |
| JP2025011208A (ja) | 2025-01-23 |
| CN113804873B (zh) | 2024-06-18 |
| EP3791183A1 (en) | 2021-03-17 |
| KR102764357B1 (ko) | 2025-02-10 |
| US20250085279A1 (en) | 2025-03-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Faria et al. | Comparison of a stable isotope labeled (SIL) peptide and an extended SIL peptide as internal standards to track digestion variability of an unstable signature peptide during quantification of a cancer biomarker, human osteopontin, from plasma using capillary microflow LC–MS/MS | |
| US20250085279A1 (en) | Assay to determine in vivo receptor occupancy | |
| Knight et al. | A high-sensitivity electrochemiluminescence-based ELISA for the measurement of the oxidative stress biomarker, 3-nitrotyrosine, in human blood serum and cells | |
| Chen et al. | Development of immunocapture‐LC/MS assay for simultaneous ADA isotyping and semiquantitation | |
| Ji et al. | A universal strategy for development of a method for absolute quantification of therapeutic monoclonal antibodies in biological matrices using differential dimethyl labeling coupled with ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry | |
| US10150984B2 (en) | Tyrosine kinase biosensors and methods of use | |
| Becher et al. | Quantification of Small Therapeutic Proteins in Plasma by Liquid Chromatography− Tandem Mass Spectrometry: Application to an Elastase Inhibitor EPI-hNE4 | |
| Zhang et al. | Immunoaffinity LC–MS/MS for quantitative determination of a free and total protein target as a target engagement biomarker | |
| Xu et al. | Development and characterization of a pre-treatment procedure to eliminate human monoclonal antibody therapeutic drug and matrix interference in cell-based functional neutralizing antibody assays | |
| Zhang et al. | LC-MS/MS-based targeted proteomics quantitatively detects the interaction between p53 and MDM2 in breast cancer | |
| WO2008027379A2 (en) | Indicators of sirtuin activity and methods of use thereof | |
| Kim et al. | Quantitative analysis of low-abundance serological proteins with peptide affinity-based enrichment and pseudo-multiple reaction monitoring by hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry | |
| Grote et al. | Using pure protein to build a multiple reaction monitoring mass spectrometry assay for targeted detection and quantitation | |
| Li et al. | Comparison of LC-MS/MS-based targeted proteomics and conventional analytical methods for monitoring breast cancer resistance protein expression | |
| Zhi et al. | Selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry without isotope labeling can be used for rapid protein quantification | |
| Geumann et al. | A sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for the quantification of insoluble membrane and scaffold proteins | |
| Martos et al. | Quantification of SARS-CoV-2 monoclonal IgG mass fraction by isotope dilution mass spectrometry | |
| Xiao et al. | Chemically labeled ThUBD permits rapid and super-sensitive imaging of polyubiquitination signals | |
| Mesmin et al. | Mass spectrometric quantification of AcSDKP‐NH2 in human plasma and urine and comparison with an immunoassay | |
| JP2013158281A (ja) | 新規ｂａｃｅ１活性測定方法 | |
| Wu et al. | Human CCDC47 sandwich immunoassay development with electrochemiluminescence technology | |
| Fonseka | Measurement of uPAR and αvꞵ6 for early stage colorectal cancer diagnosis | |
| Shen et al. | An Antibody Cocktail-Based Immunoaffinity-LC-MS Method Enabled Ultra-Sensitive and Robust Quantification of Circulating Proinsulin Proteoforms and C-peptide | |
| Li et al. | Comparative evaluation of immunoaffinity and antibody-free isotope dilution mass spectrometry approaches for plasma ProGRP quantification | |
| Li et al. | Simultaneous analysis of glycosylated and sialylated PSA reveals differential distribution of glycosylated PSA isoforms in prostate cancer tissues |