ES2992530T3

ES2992530T3 - Membrana para reestablecer la continuidad de tejidos biológicos lesionados

Info

Publication number: ES2992530T3
Application number: ES18793264T
Authority: ES
Inventors: Marco Gandini; Gessica Giusto; Paolo Saettone; Mario Cifelli; Franchini Mauro Comes
Original assignee: Bio On SpA
Current assignee: Bio On SpA
Priority date: 2018-09-06
Filing date: 2018-09-06
Publication date: 2024-12-13
Anticipated expiration: 2038-09-06
Also published as: EP3846868A1; EP3846868B1; WO2020049339A1; EP3846868C0; US20210330868A1

Abstract

Membrana para restablecer la continuidad de tejidos biológicos lesionados, que comprende un tejido no tejido de fibras de un polihidroxialcanoato (PHA) que contiene unidades monoméricas de 3-hidroxibutirato, en donde dichas fibras tienen un diámetro medio comprendido entre 800 nm y 3500 nm. Preferentemente el PHA es un homopolímero de poli-3-hidroxibutirato y al menos un principio activo está asociado a las fibras del tejido no tejido. La membrana según la presente invención presenta las ventajas de favorecer la cicatrización de tejidos biológicos lesionados de forma relativamente rápida, sin inducir reacciones inflamatorias o de rechazo excesivas, demostrando así una alta biocompatibilidad, proporcionando así un soporte válido en el proceso de cicatrización de lesiones de tejidos biológicos y previniendo la formación de dehiscencias y hernias incisionales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Membrana para reestablecer la continuidad de tejidos biológicos lesionados

La presente invención se refiere a una membrana para reestablecer la continuidad de los tejidos biológicos lesionados. En particular, la presente invención se refiere a una membrana para reestablecer la continuidad de los tejidos biológicos lesionados, en la que dicha membrana comprende una tela no tejida que comprende fibras de un polihidroxialcanoato (PHA).

Es bien conocido que en la cirugía abdominal (veterinaria y humana) existen esencialmente dos condiciones similares, aunque muy diferentes entre sí en términos de anatomía y técnica quirúrgica, en la que el cirujano se enfrenta a una serie de complicaciones y factores que impiden que se consiga un resultado satisfactorio de la intervención quirúrgica.

Dichas dos condiciones están representadas por anatomosis del tracto gastrointestinal y las hernias por incisión. De hecho, en ambos casos, el cirujano intenta reestablecer la continuidad de los tejidos daños mediante la fijación de material foráneo en el organismo, representado por suturas o mallas prostéticas. Este material favorece la continuidad de los tejidos y, por lo tanto, la cicatrización. La cicatrización está representada en ambos casos por la resistencia del constructo final (tejido+material quirúurgico) a fuerzas de tracción y se consigue mediante la aposición de colágeno por fibroblastos. En ambos casos, de hecho, el éxito final viene determinado por la aposición correcta del colágeno por fibroblastos y por su transformación en tejido fibroso.

Anatomosis intestinal

Con respecto a la anatomosis intestinal, la cicatrización intestinal comprende una serie de delicados pasos en los que se reestablece la barrera mucosa y cicatriza el tejido sujeto al insulto quirúrgico. La cicatrización sigue cuatro etapas: etapa inflamatoria, etapa de latencia, etapa de proliferación y etapa de remodelado, durante las que diferentes fenómenos fisiológicos implican mecanismos moleculares y celulares.

Las técnicas modernas de anastomosis intestinal están destinadas a reducir la interferencia con dichas etapas y promover su progresión. La dehiscencia de la anastomosis es un mecanismo multifactorial y no puede atribuirse a una única causa o a un factor de predisposición, y la búsqueda de un método para evitar este acontecimiento catastrófico actualmente sigue siendo problemática. Se han evaluado varias soluciones con fines preventivos. Además, se ha aplicado una variedad de soportes quirúrgicos con diferente éxito: endoprótesis intraluminales para soportar el sitio anastomótico y envolturas extraluminales para la protección externa.

La integridad primaria de la anastomosis intestinal depende de la técnica quirúrgica, de la capacidad de los tejidos de soportar la sutura o las grapas, y del proceso de cicatrización. Se han estudiado muchos métodos para incrementar la resistencia inicial de las anastomosis, especialmente en los primeros días postoperatorios. El método utilizado más habitualmente es la sujeción o el refuerzo de la línea de sutura mediante la interposición de diferentes materiales (pericardio bovino, materiales sintéticos) entre los extremos intestinales. También se ha sometido a ensayo la aplicación de endoprótesis intraluminales o el vendaje de la anastomosis (envoltura) con biomateriales. Estos métodos favorecen la deposición de fibrina sobre la serosa. Sin embargo, adolecen de la desventaja de que, en algunos casos, el exceso de cicatrización se convierte en estenosis.

Más específicamente:

• sujeción (en inglés, "buttressing"): existen tres categorías principales de sujeción, la sujeción permanente (tal como cola de fibrina y ácido poliglicólico), la sujeción semipermanente (tal como parches de pericardio bovino o pequeños parches intestinales) y la sujeción no resorbible (tal como ePTFE);

• "stenting": se utilizan endoprótesis como soporte para resistir la presión interna y las fuerzas longitudinales, mejorando de esta manera la resistencia de la anastomosis a corto plazo. La anastomosis está libre de fuerzas compresivas y se minimizan los daños a la vascularización submucosa y a los vasos mesentéricos. Dichas endoprótesis deben ser reabsorbibles y pueden administrar fármacos, aunque por sí solas no mejoran la reparación y resistencia de la anastomosis y, por lo tanto, no pueden prevenir la dehiscencia;

• envoltura: se envuelve un biomaterial en torno al sitio anastomótico para proporcionar protección y soporte a los fibroblastos.

Hernia por incisión

La lesión por incisión es aquella lesión producida durante una cirugía en la pared del abdomen (laparatomía), durante intervenciones quirúrgicas en el intestino, las vísceras abdominales y en el sistema reproductor femenino. Si la cicatrización de la lesión se complica (por infección, tensión o ruptura de los tejidos), puede dar lugar a lo que se denomina hernia por incisión (o ventral). Las hernias por incisión ocurren en 20 % de los pacientes sometidos a laparotomía. Desde el punto de vista del paciente, una hernia ventral puede causar dolor, alteración de las funciones normales y puede incrementarse en volumen, resultando en la deformación del abdomen y el aprisionamiento o estrangulación del intestino u otros órganos abdominales. La única cura conocida es la reparación de la hernia ventral mediante cirugía de repetición.

Todavía no se ha encontrado ningún tratamiento realmente eficaz y unívocamente aceptado para reducir las complicaciones de las lesiones por incisión.

El único método de eficacia probada (aunque no capaz de eliminar por completo el problema) es la utilización de una técnica perfectamente aséptica, posiblemente asociada a hilos de sutura que liberan antibióticos.

Las hernias por incisión derivan de la falta de cicatrización de los tejidos inicialmente separados y después suturados después de intervenciones de laparotomía. Tras la laparotomía, se cierra la incisión quirúrgica en uno o más planos de sutura, a los que se confía inicial y totalmente la resistencia del constructo. Tras la etapa inflamatoria inicial, los fibroblastos empiezan a fijar colágeno, que, al dar lugar seguidamente a tejido fibroso, desplaza la tarea de proporcionar resistencia al constructo del hilo de sutura a los tejidos.

Si durante esta etapa ocurren factores adversos (infecciones, tensión excesiva, trastornos metabólicos), el constructo podría degradarse, causando que los dos márgenes de la incisión inicial se separen. Esta distancia física entre los dos márgenes causa que los fibroblastos ya no apliquen eficazmente el colágeno y el resultado es la formación de una hernia.

Para remediar esta posibilidad, el método más eficaz es la implantación de material prostético, normalmente en la forma de membranas o mallas. Estas mallas actúan como un soporte y como un "puente" para los fibroblastos, que son capaces de reestablecer la continuidad de la matriz de colágeno de un lado de la incisión al otro y, de esta manera, remedir la falta inicial de cicatrización, produciendo una pared de tejido fibroso sólido que incorpora el material implantado.

Existen membranas o mallas de diferentes materiales, por ejemplo polipropileno, ácido poliglicólico y membranas de doble componente (polipropileno y teflón). Tal como puede observarse, dichos materiales son profundamente diferentes entre sí: van de aquellos que son lentamente reabsorbibles (ácido poliglicólico) a los no resorbibles (polipropileno), de aquellos que causan una fuerte reacción inflamatoria, y por lo tanto, una fijación consistente de tejido fibroso ((polipropileno) con el riesgo de adhesiones de segmentos intestinales sobre la malla misma, a aquellos con un material muy reactivo (propileno) en una cara combinada con uno no adherente (teflón) en la otra cara.

El documento n.°WO 2005/002472 A1 da a conocer una guía de nervios que comprende una membrana tubular o lámina que contiene fibras orientadas de polihidroxibutirato, en la que las fibras presentan un diámetro de entre 1000 nm y 20.000 nm.

El documento n.° US 2014/277572 A1 da a conocer membranas no tejidas para dispositivos médicos que contienen fibras de P4HB y copolímeros del mismo, producidas mediante electrohilado y que presentan un diámetro de entre 10 nm y 10 pm.

El documento n.°WO 2017/153619 A1 da a conocer guías de nervios que contienen nanofibras híbridas que comprenden poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV) que presentan un diámetro de entre 300 y 1500 nm producidas mediante electrohilado.

El documento n.° US 2012/052292 A1 da a conocer dispositivos médicos, tales como mallas para hernias recubiertas con un polímero liberador de fármaco que incluye ibuprofeno, tetraciclina, cefarzolina, paclitaxel y/o doxiciclina.

El documento n.° WO 00/56376 A1 da a conocer polímeros P3HB-co-4HB para la utilización como malla o parche, por ejemplo en la reparación de defectos o hernias en la pared abdominal.

Lo anterior deriva del hecho de que, como ocurre con frecuencia, todavía no existe un método o material de elección completamente eficaz para resolver los problemas relacionados con la reparación de las hernias por incisión.

Por lo tanto, el presente solicitante ha planteado el problema de desarrollar una membrana para reestablecer la continuidad de tejidos biológicos lesionados, utilizando un material que presente la capacidad de promover la cicatrización de tejidos biológicos lesionados con relativa rapidez, sin inducir reacciones inflamatorias o de rechazo.

El solicitante ahora ha encontrado que dicho problema, y otros que se ilustrarán mejor posteriormente en la presente memoria, pueden resolverse mediante la utilización de una membrana que comprende un tejido no tejido que comprende fibras de polihidroxialcanoato (PHA) tal como se define posteriormente en la presente memoria.

En un primer aspecto de la misma, por lo tanto, la presente invención se refiere a una membrana para reestablecer la continuidad de tejidos biológicos lesionados, tal como se define en la reivindicación 1 adjunta. Preferentemente, dichas fibras presentan un diámetro medio comprendido entre 1000 nm y 3000 nm.

Por lo tanto, en el contexto de la presente descripción y de las reivindicaciones adjuntas, la expresión "reestablecer la continuidad de tejidos biológicos lesionados" se refiere a que el proceso de cicatrización, conocido por el experto en la materia, mediado por la fijación de colágeno por fibroblastos, en la proximidad de los márgenes de la lesión, cuyo propósito es inducir el cierre y, por lo tanto, la cicatrización de la lesión misma.

En el contexto de la presente descripción y de las reivindicaciones adjuntas, la expresión "tejido no tejido" se refiere a una estructura textil que consiste en fibras que están dispuestas de una manera sustancialmente aleatoria, es decir, sin un orden predeterminado que, por el contrario, es característico de los tejidos verdaderos, que se obtiene mediante tejido (cruce de hilos de trama y urdimbre en un telar) o prendas de punto.

Los ensayos llevados a cabo por el solicitante (descritos en detalle posteriormente en la presente memoria) inesperadamente han mostrado que la membrana según la presente invención presenta las ventajas de promover la cicatrización de tejidos biológicos lesionados con relativa rapidez, sin inducir reacciones inflamatorias o de rechazo excesivas, mostrando de esta manera una elevada compatibilidad y proporcionando de esta manera un soporte válido en el proceso de cicatrización de lesiones de tejido biológico y evitando la formación de dehiscencias y hernias por incisión.

La membrana, con el fin de restablecer la continuidad de un tejido biológico lesionado, preferentemente se inserta en la lesión y se fija, mediante una o más suturas, en la zona contigua a la lesión de tejido. Posteriormente, se cierra la lesión mediante sutura y la membrana, en proximidad a la zona lesionada, promueve el proceso de cicatrización, restableciendo de esta manera la continuidad del tejido biológico lesionado.

En el contexto de la presente descripción y de las reivindicaciones adjuntas, la expresión "tejido biológico" se refiere a un conjunto de células, estructuralmente similares, asociadas por función. Constituye un nivel más alto de organización celular, destinado a desempeñar un papel decisivo en un organismo animal. Según la presente invención, los tejidos biológicos preferentes son: tejido epitelial, tejido muscular, tejido nervioso y tejido conectivo. Todavía más preferentemente, el tejido biológico es tejido epitelial.

Según los propósitos de la presente invención, el PHA que contiene unidades de monómero de 3-hidroxibutirato que forman las fibras del tejido no tejido es un homopolímero de poli-3-hidroxibutirato (P3HB).

En general, los PHA adecuados para la presente invención son homopolímeros que consiste en unidades de monómero de 3-hidroxibutirato:

-O-CH(CHa)-CH2-CO- (I)

También resultan adecuados, aunque no forman parte de la invención, los copolimeros de unidades de monómero de 3-hdiroxibutirato con por lo menos una unidad de monómero de hidroxialcanoato que presenta la fórmula:

-O-CHR1-(CH2)n-CO- (II)

en la que:

R<1>se selecciona de: -H y alquilo C<1>-C<12>;

n es cero o un número entero comprendido en el intervalo de entre 1 y 6, y es preferentemente 1 o 2, con la condición de que, cuando R<1>es metilo, n es diferente de 1. Preferentemente, R es metilo o etilo. Preferentemente, n es 1 o 2.

Dichos copolímeros, que no son según la invención según se reivindican, preferentemente contienen por lo menos 20 % molar, más preferentemente por lo menos 30 % molar, de unidades de monómero de 3-hidroxibutirato, siendo el resto unidades de monómero de hidroxialcanoato diferentes de 3-hidroxibutirato. En dichos copolímeros, la cantidad de unidades de monómero de 3-hidroxibutirato generalmente es igual o inferior a 99 % molar, preferentemente igual o inferior a 90 % molar. Las unidades de monómero de hidroxialcanoato adecuadas diferentes de 3-hidroxibutirato son aquellas que derivan de: 4-hidroxibutirato, 3-hidroxivalerato, 3-hidroxihexanoato, 3-hidroxioctanoato, 3-hidroxiundec-10-enoato y 4-hidroxivalerato. No forman parte de la invención según se reivindica.

En el caso de los copolímeros de PHA, que no son según la invención según se reivindica, se seleccionan preferentemente de: poli(3-hdiroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (P3HBV), poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato) (P3HBH), poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato), poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato-co-4-hidroxivalerato) (P3HBVV), o mezclas de los mismos.

Según los propósitos de la presente invención, el PHA es homopolímero de poli-3-hidroxibutirato (P3HB).

Los PHA adecuados para la presente invención preferentemente presentan un peso molecular medio en peso (Mw) comprendido en el intervalo de entre 5.000 y 1.500.000 Da, más preferentemente de entre 100.000 y 1.000.000 Da.

El peso molecular medio en peso puede determinarse según técnicas conocidas, en particular mediante análisis de CPG (cromatografía de permeación en gel).

El solicitante cree que la utilización de fibras de PHA que contienen unidades monoméricas de 3-hidroxibutirato, y en particular fibras de poli-3-hidroxibutirato (P3HB), garantiza una resorción sustancialmente completa de las fibras mismas por el organismo en el que se ha implantado la membrana, sin ningún efecto tóxico o perjudicial.

De hecho, cuando el PHA que contiene unidades de monómero de 3-hidroxibutirato se metaboliza dentro del organismo, se libera el monómero ácido 3-hidroxibutírico, que, debido a la presencia de un grupo OH en el carbono en la posición beta, experimenta una reacción de deshidratación catalizada por algunos enzimas, resultando en la formación de ácido crotónico (un ácido alfa-beta-insaturado). Dentro del organismo, el ácido crotónico experimenta una reacción de adición de hidrógeno con la consecuente formación de ácido butírico (un "ácido graso de cadena corta", AGCC, que resulta fácilmente asimilado por el organismo). La ruta metabólica es imposible con otros monómeros derivados de otros PHA, tal como con ácido 4-hidroxibutírico que se genera como consecuencia de la metabolización del poli-4-hidroxibutirato (P4HB): de hecho, en el ácido 4-hidroxibutírico, el grupo OH está situado en el carbono gamma y no en el carbono beta, haciendo de esta manera que resulte imposible la formación de ácido crotónico mediante deshidratación.

Las fibras de PHA del tejido no tejido según la presente invención se producen mediante electrohilado. En el contexto de la presente descripción y de las reivindicaciones adjuntas, "electrohilado" significa un método de hilado, conocido de la técnica, que aprovecha la interacción que se crea entre una solución polimérica y un campo eléctrico externo. El electrohilado hace posible producir filamentos de diámetro muy pequeño, generalmente del orden decenas o centenares de micras, con elevada velocidad y un control preciso del proceso, un resultado difícil de obtener con las técnicas habituales de producción de fibras mediante hilado por extrusión.

Un sistema de electrohilado principalmente comprende una bomba conectada a una jeringa que contiene la solución de polímero, una hilera conectada a la jeringa, una fuente de alta tensión y un colector. Debido a la acción de la bomba, la solución de polímero es empujada hacia el exterior de la jergina, hacia el colector, pasando por la hilera con un flujo constante y controlable. Al aplicar una diferencia de potencial elevada (normalmente de entre 1 y 30 kV) entre la hilera y el colector, se genera una caída de polímero en la punta de la hilera. A medida que se incrementa la diferencia de potencial, la gota se somete a fuerzas repulsivas crecientes entre sus cargas en superficie y las fuerzas electrostáticas ejercidas por el campo eléctrico externo, hasta la distorsión de la gota misma con la formación de un cono conocido habitualmente como cono de Taylor. En cuanto el campo eléctrico excede un valor crítico, específico para cada solución polimérica, prevalecen las fuerzas electrostáticas sobre la tensión superficial, conduciendo a la formación de una fibra o hebra polimérica.

El tejido no tejido según la invención se produce mediante electrohilado, con dimensiones adecuadas para las necesidades quirúrgicas, es decir, según la longitud y la extensión de la lesión que va a tratarse. El tejido no tejido presenta dimensiones comprendidas entre 1 y 50 cm2, de forma rectangular, romboidal, cuadrada, ovalada, redonda o irregular, y un grosor comprendido entre 10 pm y 700 pm, preferentemente comprendido entre 50 pm y 500 pm.

Según otro aspecto de la misma, la presente invención se refiere a un método para producir una membrana que comprende un tejido no tejido según la presente invención, que comprende:

• preparar una solución de hilado mediante solubilización del polihidroxialcanoato (PHA) que contiene unidades monoméricas de 3-hidroxibutirato en un solvente orgánico,

• someter la solución de hilado a un procedimiento de electrohilado mediante una hilera y un soporte giratorio situado en orientación sustancialmente perpendicular a la dirección de hilado, utilizando una configuración denominada "organización horizontal", de manera que se obtiene el tejido no tejido.

El solvente orgánico que peude utilizarse para la preparación de la solución de hilado puede seleccionarse de aquellas en las que el PHA es soluble y que también presenta caraterísticas adecuadas de conductividad eléctrica, polaridad, presión de vapor, etc., tal como 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP, por sus siglas en inglés), N,N-dimetilformida (DMF), o mezclas de los mismos.

En la solución de hilado, el PHA que contiene unidades de monómero de 3-hidroxibutirato preferentemente presenta una concentración comprendida entre 1 % y 20 % p/v, más preferentemente comprendida entre 2 % p/v y 10 % p/v.

Según una realización preferente de la membrana según la presente invención, por lo menos un ingrediente activo está asociado a las fibras del tejido no tejido de la membrana.

El ingrediente o ingredientes activos que pueden estar asociados a las fibras del tejido no tejido se seleccionan preferentemente de: pentoxifilina, doxiciclina, ibuprofeno, cefazolina, rifampicina, pactitaxel, itraconazol, mefoxina, hidrocloruro de tetraciclina o mezclas de los mismos.

La pentoxifilina es uno de los xenobióticos más importantes; presenta un efecto sobre la perfusión de órganos y tejidos, sobre la deformabilidad de los eritrocitos y sobre la viscosidad del plasma. Se conocen muchas sustancias vasoactivas que incrementan el flujo sanguíneo en tejidos y, en consecuencia, la oxigenación. La pentoxifilina es una de estas sustancias capaces de incrementar la flexibilidad, la capacidad de deformación y la viscosidad de los eritrocitos, reduciendo la agregación de las plaquetas.

La doxiciclina es un antibiótico y un inhibidor de metaloproteasa. Varios estudios informan de un incremento en la actividad de las metaloproteasas de matriz (MPM) en las anastomosis, con un incremento consecuente en la degradación del tejido local presente alrededor de la sutura. Por lo tanto, la administración de un ingrediente activo que inhiba las MPM conduce a una reducción de la degradación del tejido presente alrededor de la sutura.

Incluso las células y productos autólogos (plasma rico en plaquetas, PRP) pueden estar asociados a fibras de tejidos no tejidos.

Preferentemente, el ingrediente activo, asociado a fibras del tejido no tejido, es la doxiciclina. La doxiciclina está presente preferentemente a una concentración comprendida entre 0,1 % p/p y 4 % p/p, más preferentemente comprendida entre 0,2 % p/p y 2 % p/p con respecto al peso del PHA.

En el caso en que se pretende producir un tejido no tejido que comprende por lo menos un ingrediente activo, preferentemente la solución de hilado comprende, además, el ingrediente o ingredientes activos. En particular, el ingrediente o ingredientes activos pueden estar asociados a las fibras principalmente de dos maneras:

• mediante la inserción de por lo menos un ingrediente activo en la solución de hilado; en este caso, el tiempo de liberación del ingrediente activo a partir del tejido no tejido depende principalmente de la compatibilidad entre el ingrediente activo y la solución de hilado,

• mediante la inserción de por lo menos un ingrediente activo en las fibras de PHA electrohiladas; en este caso, el ingrediente activo, convenientemente disuelto en la solución de hilado, se electrohila coaxialmente, mediante una hilera específica, junto con las fibras; el ingrediente activo, al tener un tiempo insuficiente para recristalizar, se mantiene atrapado en el interior de las fibras o en la forma de un sólido amorfo o solución.

La característica de proporcionar un tejido no tejido que comprende por lo menos un ingrediente activo proporciona la ventaja de proporcionar a la mebrana según la presente invención un efecto terapéutico adicional, específico según el ingrediente activo utilizado. Por ejemplo, la utilización de doxiciclina proporciona la ventaja terapéutica de incrementar la inhibición de las MPM. Dicho efecto terapéutico resulta particularmente ventajoso para prevenir la formación de dehiscencias y hernias por incisión, ya que, tal como se ha descrito anteriormente, la administración de un ingrediente activo inhibitorio de MPM mediante la inhibición de su acción conduce a una reducción de la degradación del tejido circundante a la sutura. Dicha reducción promueve el proceso fisiológico de cicatrización.

Los ejemplos de realización siguientes se proporcionan a título puramente ilustrativo de la presente invención y no deben interpretarse como limitativos del alcance de protección definido mediante las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLO 1: Producción del tejido no tejido de P3HB.

El P3HB purificado se disolvió en cloroformo a fin de obtener una solución de hilado a una concentración de 6 % p/v. La solución se sometió a agitación en una placa de calentamiento a 800 rpm a una temperatura de 80 °C durante aproximadamente 2 horas con el fin de facilitar la disolución completa del polímero.

Tras la disolución completa, se añadió N,N-dimetilformamida (DMF) a la solución hasta alcanzar una proporción de cloroformo/DMF de 90:10 v/v.

La solución se sometió a agitación a 800 rpm a una temperatura de 25 °C durante aproximadamente 2 horas.

Después, la solución se enfrió, se vertió en una jeringa de plástico de 10 ml y se introdujo en el sistema de electrohilado para su procesamiento. La deposición de filamento de P3HB se llevó a cabo mediante una hilera y un soporte cilíndrico giratorio en orientación sustancialmente perpendicular a la dirección de hilado, utilizando una configuración denominada "organización horizontal". Una vez se había llevado a cabo la deposición en el soporte giratorio, se abrió la deposición y se extendió con el fin de obtener el tejido no tejido en la forma de una membrana plana.

La deposición del filamento de P3HB en el soporte cilíndrico giratorio, por lo tanto, permite obtener el tejido no tejido.

Se utilizaron los parámetros siguientes para el procedimiento de electrohilado.

Solución de hilado: P3HB purificado, disuelto en cloroformo/DHF (90:10 v/v) al 6 % p/v,

volumen de solución procesado: 120 ml,

tasa de solución: 8 ml/hora,

velocidad de traslación de la hilera: 8 mm/s,

distancia entre la punta de la hilera y el soporte cilindrico (hueco): 15 cm,

tensión aplicada en los electrodos: 20 kV,

velocidad de rotación del soporte cilíndrico: 150 rpm,

diámetro del orificio de salida de la hilera: 2,15 mm.

La figura 1 muestra las imágenes del tejido no tejido del Ejemplo 1 obtenidas mediante microscopía electrónica de barrido (SEM, por sus siglas en inglés).

EJEMPLO 2: Producción del tejido no tejido de P3HB y doxiddina.

Simultáneamente, se preparó una solución madre de doxiciclina mediante disolución del ingrediente activo en N,N-dimetilformamida (DMF). La solución resultante se sometió a agitación en una placa a 800 rpm a una temperatura de 25 °C durante aproximadamente 1 hora.

La solución madre de doxiciclina en DMF se diluyó tres veces con el fin de obtener tres solución que presentaban diferentes concentraciones de doxiciclina:

• solución 1: P3HB (al 6 % p/v) y doxiciclina (al 0,1 % p/v) en cloroformo/DMF (90/10 v/v),

• solución 2: P3HB (al 6 % p/v) y doxiciclina (al 0,25 % p/v) en cloroformo/DMF (90/10 v/v),

• solución 3: P3HB (al 6 % p/v) y doxiciclina (al 0,5 % p/v) en cloroformo/DMF (90/10 v/v),

Las tres soluciones se sometieron a agitación a 800 rpm a una temperatura de 25 °C durante aproximadamente 2 horas.

Después, se enfriaron las tres soluciones, se vertieron respectivamente en tres jeringas de plástico de 10 ml y se fueron introduciendo una a una en el sistema de electrohilado para su procesamiento sucesivo. La deposición de filamento de P3HB+doxiciclina se llevó a cabo mediante una hilera y un soporte cilindrico giratorio en orientación sustancialmente perpendicular a la dirección de hilado, utilizando una configuración denominada "organización horizontal". Una vez se había llevado a cabo la deposición en el soporte cilindrico giratorio, se abrió la deposición y se extendió con el fin de obtener el tejido no tejido mezclado con doxiciclina en la forma de una membrana. La deposición del filamento de P3HB+doxociclina en el soporte cilíndrico giratorio, por lo tanto, permite obtener el tejido no tejido con adición del ingrediente activo.

Se utilizaron los parámetros siguientes para el procedimiento de electrohilado de la solución 1:

solución de hilado 1: P3HB purificado (al 6 % p/v) y doxiciclina (al 0,1 % p/v) disueltos en cloroformo/DMF (90/10 v/v),

volumen de solución 1 procesado: 50 ml,

tasa de solución 1: 7 ml/hora,

velocidad de traslación de la hilera: 6 mm/s,

distancia entre la punta de la hilera y el soporte cilíndrico (hueco): 20 cm,

tensión aplicada en los electrodos: 20 kV,

velocidad de rotación del soporte plano: 200 rpm,

diámetro del orificio de salida de la hilera: 2,15 mm.

La figura 2 muestra las imágenes del tejido no tejido con adición de doxociclina (al 0,1 % p/v) obtenidas mediante microscopía electrónica de barrido (SEM).

Se utilizaron los parámetros siguientes para el procedimiento de electrohilado de la solución 2:

solución de hilado 2: P3HB purificado (al 6 % p/v) y doxiciclina (al 0,25 % p/v) disueltos en cloroformo/DMF (90/10 v/v),

volumen de solución 2 procesado: 50 ml,

tasa de solución 2: 7 ml/hora,

velocidad de traslación de la hilera: 6 mm/s,

distancia entre la punta de la hilera y el soporte cilíndrico (hueco): 20 cm,

tensión aplicada en los electrodos: 20 kV,

velocidad de rotación del soporte cilíndrico: 200 rpm,

diámetro del orificio de salida de la hilera: 2,15 mm.

La figura 3 muestra las imágenes del tejido no tejido mezclado con doxociclina (al 0,25 % p/v) obtenidas mediante microscopía electrónica de barrido (SEM).

Se utilizaron los parámetros siguientes para el procedimiento de electrohilado de la solución 3:

solución de hilado 3: P3HB purificado (al 6 % p/v) y doxiciclina (al 0,5 % p/v) disueltos en cloroformo/DMF (90/10 v/v),

volumen de solución 3 procesado: 50 ml,

tasa de solución 3: 7 ml/hora,

velocidad de traslación de la hilera: 6 mm/s,

distancia entre la punta de la hilera y el soporte cilíndrico (hueco): 20 cm,

tensión aplicada en los electrodos: 20 kV,

velocidad de movimiento del soporte cilíndrico: 200 rpm,

diámetro del orificio de salida de la hilera: 2,15 mm.

La figura 4 muestra las imágenes del tejido no tejido con adición de doxociclina (al 0,5 % p/v) obtenidas mediante microscopía electrónica de barrido (SEM).

La concentración de doxociclina atrapada dentro de los tres tejidos no tejidos seguidamente se determinó mediante el método siguiente.

Se recortó una porción rectangular de aproximadamente 150 mg de peso de cada tejido no tejido. A su vez, se cortó cada porción y se redujo a pequeños trozos, con el fin de promover la liberación de la doxiciclina atrapada. Los trozos de cada tejido no tejido se sumergieron en un tubo Falcon de 50 ml en 10 ml de NaOH 0,1 M. Las tres suspensiones obtenidas se sometieron a agitación durante la noche en una placa giratoria y posteriormente se centrifugaron a 6000 rpm durante 15 minutos. La solución sobrenadante de cada tubo Falcon se diluyó y se analizó mediante UV-Vis (resultados proporcionados en la Tabla 1).

Tabla 1: concentración (% p/p) de doxiciclina en los tres tejidos no tejidos

EJEMPLO 3: Estudio preclínico: implante interaperitoneal de membranas que comprenden tejidos no tejidos de los Ejemplos 1 y 2.

a) Materiales y métodos

El estudio se llevó a cabo de acuerdo con las buenas prácticas descritas en los documentos siguientes:

Norma ISO 10993-2:2006 Evaluación biológica de productos sanitarios. Parte 2: Requisitos re lativos a la protección de los animales";

"ISO 10993-6:2016 Evaluación biológica de productos sanitarios. Parte 6: Ensayos relativos a los efectos locales después de la implantación";

"F763 - 04(2016) Práctica estándar para la detección a corto plazo de materiales de implantes";

"F1904 - 14 Práctica estándar para probar respuestas biológicas a partículas in vivo";

"F1983 - 14 Práctica estándar para evaluar los efectos tisulares seleccionados de biomateriales absorbibles para aplicaciones de implantes".

Se utilizaron ratas Sprague-Dawley adultas macho de 225 a 250 g de peso cada una.

Se asignaron aleatoriamente 42 animales (del total de 120 utilizado) a los grupos:

• Grupo P3HB (membrana que comprende el tejido no tejido del Ejemplo 1);

• Grupo P3HB+doxiciclina (membrana que comprende el tejido no tejido del Ejemplo 2 en una proporción 1:1000 de doxiciclina).

b) Biocompatibilidad

Los animales se sometieron a un implante interaperitoneal de una porción de 1cm2 de membrana que comprendía el tejido no tejido que iba a someterse a ensayo. Tras la laparotomía en la línea media, se implantó la membrana en el abdomen adherida al peritoneo parietal aproximadamente 1 cm a la izquierda de la línea blanca.

Se llevó a cabo una incisión de 2 cm en el plano medio que comprendía piel, tejido subcutáneo y línea alba.

A continuación, se implantó la membrana tal como se describe en "Azab AK, Doviner V, Orkin B, Kleinstern J, Srebnik M, Nissan A, Rubinstein A: Biocompatibility evaluation of crosslinked chitosan hydrogels after subcutaneous and intraperitoneal implantation in the rat; J Biomed Mater Res A 2007, nov.; 83(2):414-422". Brevemente, se insertó una única porción de 1 cm2 a través de la incisión quirúrgica y se fijó a aproximadamente 1 cm de la línea alba en la pared abdominal izquierda con un único punto de sutura simple. A continuación, se cerró la herida abdominal en dos planos con una sutura continua simple con glicómero 631 USP 3-0 para la banda y nailón USP 3-0 para la piel.

En el grupo de control negativo, se llevó a cabo el procedimiento de la misma manera, aunque sin inserción de la membrana.

Los procedimientos quirúrgicos duraron aproximadamente 20 minutos cada uno, mientras que el tiempo de anestesia de cada rata fue de aproximadamente 1 hora.

Durante y después de los procedimientos, las ratas se mantuvieron sobre una placa calefactora y bajo una lámpara de infrarrojos para evitar la hipotermia y se administraron por vía subcutánea 5 ml de solución fisiológica isotónica (al 0,9 %) antes de introducirlos en sus jaulas respectivas.

En el periodo postoperatorio, se realizó la administración de analgésicos (carprofeno 5 a 10 mg/kg por vía subcutánea durante 2 a 3 días), antibióticos (penicilina+dihidroestreptomicina 0,2 a 0,3 mg/kg por vía subcutánea cada 2 días 2 veces al día).

Los sujetos se mantuvieron en jaulas individuales y después se sometieron a eutanasia el día 14 y después, de cada rata, se extrajo la pared abdominal izquierda, en la porción que comprendía la membrana, y se fijó en formalina. Después, se diseccionó el tejido, se tiñó con hematoxilina y eosina y fue examinada por un patólogo con enmascaramiento a la asignación de grupo de las muestras.

Se consideró que los parámetros siguientes definían histológicamente la respuesta del tejido:

• neovascularización,

• fibrosis,

• infiltración adiposa.

Para cada parámetro, se asignó una puntuación en una escala de 0 (ausente) a 4 (muy abundante).

La figura 5 muestra un ejemplo de una preparación histológica del Ejemplo 3.

Además, se evaluó la expresión de COX-2 (ciclooxigenasa-2) para definir el grado de inflamación del tejido.

Todos los datos obtenidos fueron analizados a fin de verificar la normalidad de los mismos, mediante la prueba de Shapiro-Wilk.

A continuación, se utilizaron pruebas no paramétricas (de Kruskal-Wallis) para determinar su significancia.

c) Resultados

La Tabla 2 informa de los resultados referidos a la neovascularización.

Tabla 2 (neovascularización)

Estos resultados indican que las dos membranas que comprenden tejidos no tejidos son comparables con respecto a la neovascularización.

La Tabla 3 informa de los resultados referidos a la fibrosis.

Tabla 3 (fibrosis)

Estos resultados indican que P3HB+DOXICICLINA induce una fibrosis más pronunciada que P3HB. Ello es atribuible al hecho de que la doxiciclina presenta un efecto inhibidor de las metaloproteasas responsables de la inhibición del remodelado del colágeno.

La Tabla 4 informa de los resultados referidos a la infiltración adiposa.

Tabla 4 (infiltración adiposa)

Estos resultados indican que P3HB+DOXICICLINA induce una infiltración adiposa inferior a la inducida por P3HB. Este resultado también puede explicarse por la inhibición de las metaloproteasas por la doxiciclina, que potencialmente causa una sustitución del tejido adiposo por tejido fibroso.

La expresión de COX-2 no era significativamente diferente en los dos grupos (datos no mostrados). Lo anterior indica que el grado de inflamación inducido por la presencia de las dos membranas que comprendían el tejido no tejido era comparable.

d) Conclusiones

La membrana que comprendía el tejido no tejido P3HB+DOXICICLINA se encontró que inducía una respuesta tisular superior a la de la membrana que comprendía el tejido no tejido de P3HB, causando una mayor aposición de tejido fibroso.

Al no mostrar ningún signo de toxicidad y no causar reacciones diferentes de las esperadas para este tipo de implante, las dos membranas que comprendían los tejidos no tejidos sometidos a ensayo han probado ser biocompatibles en gran medida, capaces de promover la cicatrización del tejido biológico lesionado con relativa rapidez, sin inducir reacciones inflamatorias o de rechazo. Las membranas que comprendían los tejidos no tejidos sometidos a ensayo, por lo tanto, probaron ser un soporte válido en el proceso de cicatrización de lesiones de tejidos biológicos, capaces de prevenir la formación de dehiscencias y hernias por incisión.

Claims

REIVINDICACIONES

i. Membrana para restablecer la continuidad de los tejidos biológicos lesionados, que comprende un tejido no tejido de fibras de un polihidroxialcanoato (PHA) que contiene unidades de monómero de 3-hidroxibutirato, en la que dichas fibras presentan un diámetro medio comprendido entre 800 nm y 3500 nm,

en la que el PHA es un homopolímero de poli-3-hidroxibutirato (P3HB),

en la que las fibras de PHA del tejido no tejido se producen mediante electrohilado,

en la que el tejido no tejido presenta dimensiones comprendidas entre 1 y 50 cm2, de forma rectangular, romboidal, cuadrada, ovalada, redonda o irregular, y un grosor comprendido entre 10 pm y 700 pm.
2. Membrana según la reivindicación 1, en la que el PHA presenta un peso molecular medio en peso (Mw) comprendido en el intervalo de entre 5.000 y 1.500.000 Da, más preferentemente de entre 100.000 y 1.000.000 Da.
3. Membrana según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que por lo menos un ingrediente activo está asociado a las fibras del tejido no tejido.
4. Membrana según la reivindicación 3, en la que el ingrediente o ingredientes activos se seleccionan de:

pentoxifilina, doxiciclina, ibuprofeno, cefazolina, rifampicina, paclitaxel, itraconazol, mefoxina, hidrocloruro de tetraciclina o mezclas de los mismos.
5. Membrana según la reivindicación 4, en la que el ingrediente activo es la doxiciclina.
6. Membrana según la reivindicación 5, en la que la doxiciclina presenta una concentración comprendida entre 0,1 % p/p y 4 % p/p, más preferentemente comprendida entre 0,2 % p/p y 2 % p/p con respecto al peso del PHA.
7. Método para producir una membrana que comprende un tejido no tejido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende:

- preparar una solución de hilado mediante solubilización del polihidroxialcanoato (PHA) que contiene unidades monoméricas de 3-hidroxibutirato en un solvente orgánico, en el que el PHA es un homopolímero de poli-3-hidroxibutirato (P3HB),

- someter la solución de hilado a un procedimiento de electrohilado mediante una hilera y un soporte giratorio situado en orientación sustancialmente perpendicular a la dirección de hilado, utilizando una configuración denominada "organización horizontal", de manera que se obtiene el tejido no tejido.
8. Método según la reivindicación 7, en el que el solvente orgánico utilizable para la preparación de la solución de hilado se selecciona de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP), cloroformo, N,N-dimetilformamida (DMF) o mezclas de los mismos.
9. Método según la reivindicación 7 u 8, en la que, en la solución de hilado, el PHA que contiene unidades de monómero de 3-hidroxibutirato presenta una concentración comprendida entre 1 % y 20 % p/v, más preferentemente comprendida entre 2 % p/v y 10 % p/v.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la solución de hilado comprende, además, por lo menos un ingrediente activo.