ES2992017T3 - Sobreexpresión del activador/represor transcripcional GIS1 en levadura para la producción aumentada de etanol - Google Patents
Sobreexpresión del activador/represor transcripcional GIS1 en levadura para la producción aumentada de etanol Download PDFInfo
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Abstract
Se describen composiciones y métodos relacionados con células de levadura modificadas que sobreexpresan el activador/represor transcripcional GIS1. Las células de levadura producen una mayor cantidad de etanol en comparación con sus células parentales. Dicha levadura es particularmente útil para la producción de etanol a gran escala a partir de sustratos de almidón donde es deseable una mayor producción de etanol. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Sobreexpresión del activador/represor transcripcional GIS1 en levadura para la producción aumentada de etanol
CAMPO TÉCNICO
Las presentes composiciones y procedimientos se refieren a células de levadura modificadas que sobreexpresan el activador/represor transcripcional, GIS 1. Las células de levadura producen una cantidad aumentada de etanol en comparación con sus células parentales. Dicha levadura es particularmente útil para la producción de etanol a gran escala a partir de sustratos de almidón cuando es deseable una producción aumentada de etanol.
ANTECEDENTES
La producción de etanol basada en levadura se basa en la conversión de azúcares en etanol. La producción anual actual de etanol combustible por medio de este procedimiento es de aproximadamente 90 mil millones de litros en todo el mundo. Se estima que aproximadamente el 70% del coste de la producción de etanol es la materia prima. Dado que el volumen de producción de etanol es tan grande, incluso pequeñas mejoras en el rendimiento tienen una repercusión económica enorme para la industria. La conversión de un mol de glucosa en dos moles de etanol y dos moles de dióxido de carbono es redox-neutra, siendo el rendimiento teórico máximo de aproximadamente el 51%. El rendimiento industrial actual es de aproximadamente el 45%; por lo tanto, hay oportunidades para aumentar la producción de etanol. A pesar de los avances en la productividad de levaduras, existe la necesidad de modificar adicionalmente las rutas metabólicas de las levaduras para maximizar la producción de etanol sin aumentar al mismo tiempo la producción de subproductos no deseados.
SUMARIO
La presente invención, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, se refiere a un procedimiento para aumentar la producción de etanol en células de levadura cultivadas sobre un sustrato de carbohidrato, que comprende: introducir en células de levadura parentales una alteración genética que provoca que las células modificadas produzcan una cantidad aumentada de polipéptidos GIS 1 en comparación con las células parentales, en el que las células modificadas producen una cantidad aumentada de etanol en comparación con las células parentales por lo demás idénticas en condiciones de fermentación equivalentes.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
I. Definiciones
Antes de describir la presente levadura y los presentes procedimientos en detalle, se definen los siguientes términos por motivos de claridad. A los términos no definidos se les deberán conceder sus significados habituales tal como se usan en la técnica pertinente.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "alcohol" se refiere a un compuesto orgánico en que un grupo funcional hidroxilo (-OH) está unido a un átomo de carbono saturado.
Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "células de levadura", "cepas de levadura" o simplemente "levadura" se refieren a organismos de los filos Ascomycota y Basidiomycota. Los ejemplos de levaduras son levaduras de gemación del orden Saccharomycetales. Ejemplos particulares de levadura sonSaccharomycesspp., que incluyen, pero sin limitación, S.cerevisiae.Las levaduras incluyen organismos usados para la producción de alcohol combustible, así como organismos usados para la producción de alcohol potable, incluidas cepas de levadura especializadas y patentadas usadas para preparar cervezas con sabores distintivos, vinos y otras bebidas fermentadas.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "células de levadura modificadas genéticamente", "células de levadura variantes", "células de levadura modificadas" o expresiones similares, se refieren a levaduras que incluyen modificaciones genéticas y características descritas en el presente documento. Las levaduras variantes/modificadas no incluyen levaduras de origen natural.
Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "polipéptido" y "proteína" (y sus formas plurales respectivas) se usan indistintamente para referirse a polímeros de cualquier longitud que comprenden residuos de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. En el presente documento se usan los códigos convencionales de una letra o tres letras para los residuos de aminoácidos y todas las secuencias se presentan en la dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal. El polímero puede comprender aminoácidos modificados, y puede estar interrumpido por elementos que no son aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de forma natural o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcado. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluidos, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica.
Tal como se utiliza en el presente documento, se considera que proteínas funcionalmente y/o estructuralmente similares son "proteínas relacionadas" u "homólogos". Tales proteínas pueden derivarse de organismos de diferentes géneros y/o especies, o diferentes clases de organismos (por ejemplo, bacterias y hongos), o diseñarse artificialmente. Las proteínas relacionadas también abarcan homólogos determinados por análisis de la secuencia primaria, determinados por análisis de la estructura secundaria o terciaria, o determinados por reactividad cruzada inmunológica, o determinados por sus funciones.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "proteína homóloga" se refiere a una proteína que tiene una actividad y/o una estructura similar a una proteína de referencia. No se pretende que los homólogos estén necesariamente relacionados evolutivamente. Por lo tanto, se pretende que el término abarque enzimas iguales, similares o correspondientes (es decir, en términos de estructura y función) obtenidas de diferentes organismos. En algunas formas de realización, es deseable identificar un homólogo que tenga una estructura cuaternaria, terciaria y/o primaria similar a la proteína de referencia. En algunas formas de realización, las proteínas homólogas inducen una o más respuestas inmunológicas similares a una proteína de referencia. En algunas formas de realización, las proteínas homólogas se modifican genéticamente para que produzca enzimas con una o más actividades deseadas.
El grado de homología entre secuencias puede determinarse usando cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443; Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444; programas tales como g Ap, BESTFIT, FASTA y TFASTA del Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI); y Devereuxet al.(1984) Nucleic Acids Res. 12:387-95).
Por ejemplo, PILEUP es un programa útil para determinar niveles de homología de secuencias. PILEUP crea un alineamiento de múltiples secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineamientos por pares progresivos. También puede trazar un árbol que muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear el alineamiento. PILEUP usa una simplificación del procedimiento de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle (Feng y Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-60). El procedimiento es similar al descrito por Higgins y Sharp ((1989) CABIOS 5: 151 -53). Los parámetros útiles de PILEUP incluyen un peso por hueco por defecto de 3,00, un peso por longitud de hueco por defecto de 0,10 y huecos terminales ponderados. Otro ejemplo de un algoritmo útil es el algoritmo BLAST, descrito por Altschulet al.((1990) J. Mol. Biol. 215:403-10) y Karlinet al.((1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87). Un programa BLAST particularmente útil es el programa WU-BLAST-2 (véase, por ejemplo, Altschul et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:460-80). Los parámetros "W", "T" y "X" determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLAST usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase, por ejemplo, Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915), alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M'5, N'-4 y una comparación de ambas hebras.
Tal como se utilizan en el presente documento, las expresiones "sustancialmente similar" y "sustancialmente idéntico", en el contexto de al menos dos ácidos nucleicos o polipéptidos, normalmente significan que un polinucleótido o polipéptido comprende una secuencia que tiene al menos aproximadamente el 70% de identidad, al menos aproximadamente el 75% de identidad, al menos aproximadamente el 80% de identidad, al menos aproximadamente el 85% de identidad, al menos aproximadamente el 90% de identidad, al menos aproximadamente el 91% de identidad, al menos aproximadamente el 92% de identidad, al menos aproximadamente el 93% de identidad, al menos aproximadamente el 94% de identidad, al menos aproximadamente el 95% de identidad, al menos aproximadamente el 96% de identidad, al menos aproximadamente el 97% de identidad, al menos aproximadamente el 98% de identidad, o incluso al menos aproximadamente el 99% de identidad, o más, en comparación con la secuencia de referencia (es decir, la secuencia de tipo silvestre). El porcentaje de identidad de secuencia se calcula usando el algoritmo CLUSTAL W con parámetros por defecto. Véase Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680. Los parámetros por defecto para el algoritmo CLUSTAL W son:
Otra indicación de que dos polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el primer polipéptido es inmunológicamente reactivo de forma cruzada con el segundo polipéptido. Normalmente, los polipéptidos que difieren en sustituciones conservativas de aminoácidos son inmunológicamente reactivos de forma cruzada. Por lo tanto, un polipéptido es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solamente en una sustitución conservativa. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones rigurosas (por ejemplo, en un intervalo de rigurosidad de media a alta).
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "gen" es sinónimo del término "alelo" en referencia a un ácido nucleico que codifica y dirige la expresión de una proteína o ARN. Las formas vegetativas de hongos filamentosos en general son haploides; por lo tanto, una sola copia de un gen especificado (es decir, un solo alelo) es suficiente para conferir un fenotipo especificado. El término "alelo" en general se prefiere cuando un organismo contiene más de un gen similar, en cuyo caso cada gen similar diferente se denomina un "alelo" distinto.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "expresar un polipéptido" y expresiones similares se refieren al proceso celular de producción de un polipéptido usando la maquinaria de traducción (por ejemplo, ribosomas) de la célula.
Tal como se utiliza en el presente documento, "sobreexpresar un polipéptido", "aumentar la expresión de un polipéptido" y expresiones similares, se refieren a expresar un polipéptido a niveles mayores de los normales en comparación con los observados con células parentales o "de tipo silvestre" que no incluyen un modificación genética específica. La sobreexpresión puede describirse en términos de niveles de ARNm o niveles de polipéptidos, como lo permitan las condiciones experimentales.
Tal como se utiliza en el presente documento, un "casete de expresión" se refiere a un fragmento de ADN que incluye un promotor, y una región codificante de aminoácidos y un terminador (es decir, promotor: :región codificante de aminoácidos::terminador) y otra secuencia de ácido nucleico necesaria para permitir que el polipéptido codificado se produzca en una célula. Los casetes de expresión pueden ser exógenos (es decir, introducidos en una célula) o endógenos (es decir, existentes en una célula).
Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "fusionado" y "fusión" con respecto a dos fragmentos de ADN, tal como un promotor y la región codificante de un polipéptido, se refieren a un enlace físico que hace que los dos fragmentos de ADN se conviertan en una sola molécula.
Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "de tipo silvestre" y "nativo" se usan indistintamente y se refieren a genes, proteínas o cepas encontrados en la naturaleza, o que no se han modificado intencionadamente para aprovechar el beneficio de la levadura descrita en el presente documento.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "proteína de interés" se refiere a un polipéptido que se desea expresar en la levadura modificada. Dicha proteína puede ser una enzima, una proteína de unión a sustrato, una proteína con actividad de superficie, una proteína estructural, un marcador de selección, un transductor de señales, un receptor, un transportador, un factor de transcripción, un factor de traducción, un cofactor o similares, y puede expresarse. La proteína de interés está codificada por un gen endógeno o un gen heterólogo (es decir, "gen de interés") con respecto a la cepa parental. La proteína de interés puede expresarse de forma intracelular o como una proteína secretada.
Tal como se utiliza en el presente documento, "alteración de un gen" se refiere ampliamente a cualquier manipulación genética o química, es decir, una mutación, que evite sustancialmente que una célula produzca un producto génico funcional, por ejemplo, una proteína, en una célula huésped. Los ejemplos de procedimientos de alteración incluyen la deleción completa o parcial de cualquier parte de un gen, incluyendo una secuencia codificante de polipéptido, un promotor, un potenciador u otro elemento regulador, o mutagénesis de los mismos, abarcando la mutagénesis sustituciones, inserciones, deleciones, inversiones y combinaciones y variaciones, de los mismos; cualquiera de dichas mutaciones evita sustancialmente la producción de un producto génico funcional. Un gen también puede alterarse usando CRISPR, ARNi, antisentido o cualquier otro procedimiento que anule la expresión génica. Un gen puede alterarse por deleción o manipulación genética de elementos de control no adyacentes. Tal como se utiliza en el presente documento, "deleción de un gen" se refiere a su eliminación del genoma de una célula huésped. Cuando un gen incluye elementos de control (por ejemplo, elementos potenciadores) que no se encuentran inmediatamente adyacentes a la secuencia codificante de un gen, la deleción de un gen se refiere a la deleción de la secuencia codificante, y opcionalmente elementos potenciadores adyacentes, incluidos, pero sin limitación, por ejemplo, secuencias promotoras y/o terminadoras, pero no requieren la deleción de elementos de control no adyacentes. La deleción de un gen también se refiere a la deleción de una parte de la secuencia codificante, o una parte del promotor inmediatamente o no inmediatamente adyacente a la secuencia codificante, en las que no hay actividad funcional del gen de interés encontrado en la célula genéticamente modificada.
Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "manipulación genética" y "alteración genética" se usan indistintamente y se refieren a la alteración/cambio de una secuencia de ácido nucleico. La alteración puede incluir, aunque sin limitación, sustitución, deleción, inserción o modificación química de al menos un ácido nucleico en la secuencia de ácido nucleico.
Tal como se utiliza en el presente documento, un "polipéptido/proteína funcional" es una proteína que posee una actividad, tal como una actividad enzimática, una actividad de unión, una propiedad de actividad de superficie, un transductor de señales, un receptor, un transportador, un factor de transcripción, un factor de traducción, un cofactor o similares, y que no se ha mutagenizado, truncado o modificado de otro modo para anular o reducir esa actividad. Los polipéptidos funcionales pueden ser termoestables o termolábiles, según se especifique.
Tal como se utiliza en el presente documento, "un gen funcional" es un gen que puede usarse por los componentes celulares para producir un producto génico activo, normalmente una proteína. Los genes funcionales son la antítesis de los genes alterados, que se modifican de modo que no puedan usarse por los componentes celulares para producir un producto génico activo, o tienen una capacidad reducida para usarse por los componentes celulares para producir un producto génico activo.
Tal como se utiliza en el presente documento, las células de levadura se han "modificado para evitar la producción de una proteína especificada" si se han alterado genéticamente o químicamente para evitar la producción de una proteína/polipéptido funcional que presenta una actividad característica de la proteína de tipo silvestre. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, deleción o alteración del gen que codifica la proteína (tal como se describe en el presente documento), modificación del gen de modo que el polipéptido codificado carezca de la actividad mencionada anteriormente, modificación del gen para influir en el proceso postraduccional o estabilidad, y combinaciones de los mismos.
Tal como se utiliza en el presente documento, "atenuación de una ruta" o "atenuación del flujo a través de una ruta", es decir, una ruta bioquímica, se refiere ampliamente a cualquier manipulación genética o química que reduce o detiene completamente el flujo de sustratos o intermedios bioquímicos a través de una ruta metabólica. La atenuación de una ruta puede lograrse mediante una diversidad de procedimientos bien conocidos. Dichos procedimientos incluyen, pero sin limitación: deleción completa o parcial de uno o más genes, reemplazo de alelos de tipo silvestre de estos genes por formas mutantes que codifican enzimas con actividad catalítica reducida o valores de Km aumentados, modificación de los promotores u otros elementos reguladores que controlan la expresión de uno o más genes, modificación genética de las enzimas o el ARNm que codifica estas enzimas para lograr una estabilidad disminuida, direccionamiento incorrecto de las enzimas a compartimentos celulares en los que hay menos probabilidad de que interactúen con el sustrato y los intermedios, el uso de ARN interferente y similares.
Tal como se utiliza en el presente documento, "fermentación aeróbica" se refiere al crecimiento en presencia de oxígeno.
Tal como se utiliza en el presente documento, "fermentación anaeróbica" se refiere al crecimiento en ausencia de oxígeno.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "fin de la fermentación" se refiere a la fase de fermentación en la que la ventaja económica de continuar la fermentación para producir una pequeña cantidad de alcohol adicional es excedida por el coste de continuar la fermentación en términos de costes fijos y variables. En un sentido más general, "fin de la fermentación" se refiere al punto en el que una fermentación ya no producirá una cantidad significativa de alcohol adicional, es decir, no más de aproximadamente el 1% de alcohol adicional, o no queda más sustrato para la producción de más alcohol.
Tal como se utiliza en el presente documento, una "unidad de glucoamilasa (GAU)" se define como la cantidad de glucoamilasa requerida para producir 1 g de glucosa por hora a partir de sustrato de almidón soluble (4% de ds) en condiciones de ensayo de 60 °C y pH 4,2.
Tal como se utiliza en el presente documento, una "unidad de proteasa ácida espectrofotométrica (SAPU)" es la cantidad de actividad de proteasa que libera un micromol de tirosina por minuto a partir de un sustrato de caseína en condiciones de ensayo estándar.
Tal como se utiliza en el presente documento, una "unidad de almidón soluble (SSU)" se basa en el grado de hidrólisis del sustrato de almidón de patata soluble (4% de DS) por una parte alícuota de a-amilasa a un pH de 4,5, 50 °C. El contenido de azúcar reductor se mide usando el procedimiento de DNS tal como se describe por Miller, G.L. ((1959) Anal. Chem. 31: 426-28).
Tal como se utilizan en el presente documento, los artículos singulares "un", "una","el" y "la" abarcan los referentes plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Los acrónimos/abreviaturas siguientes tienen los significados siguientes a menos que se especifique lo contrario:
°C grados centígrados
AA a-amilasa
AADH acetaldehído deshidrogenasas
ADH alcohol deshidrogenasa
pb pares de bases
ADN ácido desoxirribonucleico
ds o DS sólidos secos
EC comisión de enzimas
EtOH Etanol
g o gm gramo
g/l gramos por litro
GA glucoamilasa
GAU unidad de glucoamilasa
HPLC cromatografía líquida de alto rendimiento
hr o h hora
kg kilogramo
M Molar
mg miligramo
min minuto
mL o ml mililitro
mM milimolar
ARNm ARN mensajero
N Normal
nm nanómetro
PCR reacción en cadena de la polimerasa
PKL fosfocetolasa
ppm partes por millón
PTA fosfotransacetilasa
SAPU unidad de proteasa ácido espectrofotométrica
SSU unidad de almidón soluble
A se refiere a una deleción
gg microgramo
gL y gl microlitro
gM Micromolar
II. La sobreexpresión de GIS1 en levadura aumenta la producción de etanol en levadura
El GIS1 es un factor de transcripción implicado en la regulación de la expresión génica tras la privación de nutrientes. Reconoce y se une al elemento post-cambio diáuxico 5'-T[AT]AGGGAT-3' (SEQ ID NO: 1) en la región promotora. Puede actuar como activador transcripcional (por ejemplo, de genes de estrés tales como SSA3, HSP12 y HSP26) y como un represor (por ejemplo, de pirofosfato fosfatasa DPP1). El GIS1 también actúa como un represor transcripcional sensible al daño del ADN de fotoliasa PHR1. También se ha descubierto que el GIS1 y el RPH1 controlan varios genes implicados en la formación de acetato y glicerol, metabolitos que se han involucrado en el envejecimiento.
Se ha descubierto ahora que la sobreexpresión de GIS1 puede aumentar la producción de etanol en más del 1% en levaduras no modificadas genéticamente así como en levaduras modificadas genéticamente que albergan una ruta modificada genéticamente. Los análisis por RNAseq sugieren que el gen GIS1 se expresa normalmente de forma débil. La sobreexpresión en 10 veces de GIS1 aumenta la producción de etanol en levaduras por lo demás idénticas en al menos el 1%. El polipéptido GIS1 ejemplificado es deSaccharomyces cerevisiaeS288c (N° de acceso al Genbank. NP_010381.1; SEQ ID NO: 5; citado posteriormente). El Genbank enumera muchas otras secuencias de polipéptidos con un alto porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 5, seguidas de un gran número de otros polipéptidos similares. Se espera que la mayor parte, si no la totalidad, de estos polipéptidos similares produzcan resultados similares en células de levadura.
En formas de realización particulares de las presentes composiciones y procedimientos, la secuencia de aminoácidos del polipéptido GIS1 que se sobreexpresa en células de levadura modificadas tiene al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o incluso al menos aproximadamente el 99% de identidad, con la SEQ ID NO: 5.
El aumento en la cantidad de GIS1 producido por las células modificadas puede ser un aumento de al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 70%, al menos el 100%, al menos el 150%, al menos el 200%, al menos el 500%, al menos el 1.000% o superior, en comparación con la cantidad de GIS1 producido por células parentales cultivadas en las mismas condiciones. Como alternativa, o adicionalmente, el aumento en la cantidad de GIS1 producido por las células modificadas puede ser de al menos 10 veces, al menos 12 veces, o al menos 15 veces, o al menos 20 veces, o superior, en comparación con la cantidad de GIS1 producido por células parentales cultivadas en las mismas condiciones.
El aumento en la fuerza del promotor usado para controlar la expresión de GIS1 producido por las células modificadas puede ser de al menos 10 veces, al menos 12 veces, al menos 15 veces, o al menos 20 veces, o superior, en comparación con la fuerza del promotor nativo que controla la expresión de GIS1, con respecto a la cantidad de ARNm producido.
Se entiende que la fuerza relativa del promotor no es un valor escalar exacto. Puede depender intensamente del medio de cultivo, el tiempo de fermentación, la temperatura y otras condiciones. Los valores obtenidos a partir de los datos de RNAseq recogidos a lo largo del curso temporal de la fermentación en medio industrial son los más preferidos; no obstante, los datos experimentales y/o de la literatura obtenidos en diferentes cultivos también pueden usarse para la selección de promotores recombinantes.
Preferentemente, la expresión aumentada de GIS1 se consigue mediante manipulación genética usando técnicas de biología molecular específicas de secuencia, a diferencia de la mutagénesis química, que en general no está dirigida a secuencias específicas de ácido nucleico. Sin embargo, la mutagénesis química no se excluye como procedimiento para preparar células de levadura modificadas.
En algunas formas de realización, las presentes composiciones y procedimientos implican introducir en células de levadura un ácido nucleico capaz de dirigir la sobreexpresión, o expresión aumentada, del polipéptido GIS1. Los procedimientos particulares incluyen, pero sin limitación, (i) introducir un casete de expresión exógeno para producir el polipéptido en una célula huésped, opcionalmente además de un casete de expresión endógeno, (ii) sustituir un casete de expresión exógeno por un casete endógeno que permita la producción de una cantidad aumentada del polipéptido, (iii) modificar el promotor de un casete de expresión endógeno para aumentar la expresión, (iv) aumentar el número de copias de casetes iguales o diferentes para la sobreexpresión de polipéptidos de GIS1, y/o (v) modificar cualquier aspecto de la célula huésped para aumentar la semivida del polipéptido en la célula huésped.
En algunas formas de realización, la célula parental que ya está modificada incluye una ruta de interés modificada genéticamente, tal como una ruta PKL para aumentar la producción de etanol, o cualquier otra ruta para aumentar la producción de alcohol. En algunas formas de realización, la célula parental que ya está modificada incluye un gen de interés, tal como un gen que codifica un marcador de selección, una enzima procesadora de carbohidratos u otro polipéptido. En algunas formas de realización, se introduce posteriormente un gen de interés en las células modificadas.
III. Células de levadura modificadas que sobreexpresan GIS1 y que albergan una ruta de PKL exógena
La expresión aumentada de GIS1 puede combinarse con la expresión de genes de la ruta de PKL para aumentar adicionalmente la tasa de producción, y/o los niveles de producción máximos, de etanol en células de levadura.
Se han descrito previamente células de levadura modificadas genéticamente que tienen una ruta PKL heteróloga en el documento WO2015148272 (Miasnikov et al.) Estas células expresan fosfocetolasa (PKL), fosfotransacetilasa (PTA) y acetil deshidrogenasa acetilante (AADH) heterolólogas, opcionalmente con otras enzimas, para dirigir el flujo de carbono lejos de la ruta de glicerol y hacia la síntesis de acetil-CoA, que después se convierte en etanol. Dichas células modificadas tienen una capacidad de producción de etanol aumentada en un proceso de fermentación en comparación con células de levadura parentales por lo demás idénticas.
IV. Sobreexpresión de GIS1 en combinación con otras mutaciones que afectan a la producción de etanol
En algunas formas de realización, además de sobreexpresar GIS1, opcionalmente en combinación con la presencia de una ruta de PKL exógena, las presentes células de levadura modificadas incluyen modificaciones adicionales que afectan a la producción de etanol.
Las células modificadas pueden incluir además mutaciones que provocan la atenuación de la ruta nativa de biosíntesis de glicerol y/o la ruta de reutilización de glicerol, que se sabe que aumentan la producción de alcohol. Los procedimientos para la atenuación de la ruta de biosíntesis de glicerol en levaduras son conocidos e incluyen la reducción o la eliminación de la actividad del glicerol 3-fosfato deshidrogenasa (GPD) dependiente de NAD o el glicerol fosfato fosfatasa (GPP) endógena, por ejemplo mediante la alteración de uno o más de los genesGPD1, GPD2, GPP1y/oGPP2.Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 9.175.270 (Elke et al.), 8.795.998 (Pronk et al.) y 8.956.851 (Argyros et al.). Procedimientos para mejorar la ruta de reutilización de glicerol mediante la sobreexpresión de glicerol deshidrogenasa (GCY1) y dihidroxiacetona quinasa (DAK1) para convertir glicerol en fosfato de dihidroxiacetona (Zhang et al. (2013) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 40: 1153-1160).
La levadura modificada puede presentar además actividad de acetil-CoA sintasa (también denominada acetil-CoA ligasa) aumentada (EC 6.2.1.1) para atrapar (es decir, capturar) acetato producido por hidrólisis química o enzimática de acetilfosfato (o presente en el medio de cultivo de la levadura por cualquier otra razón) y convertirlo en Ac-CoA. Esto reduce parcialmente el efecto indeseable del acetato sobre el crecimiento de las células de levadura y puede contribuir además a una mejora en el rendimiento del alcohol. El aumento en la actividad de acetil-CoA sintasa puede lograrse introduciendo un gen heterólogo de la acetil-CoA sintasa, aumentando la expresión de un gen endógeno de la acetil-CoA sintasa y similares.
En algunas formas de realización, las células modificadas pueden incluir además un gen heterólogo que codifica una proteína con actividad de acetaldehído deshidrogenasa acetilante (AADH) dependiente de NAD+ y/o un gen heterólogo que codifica un piruvato formiato liasa (PFL). Se describe la introducción de tales genes en combinación con la atenuación de la ruta del glicerol, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N° 8.795.998 (Pronk et al.). En algunas formas de realización de las presentes composiciones y procedimientos, la levadura carece expresamente de un gen heterólogo (o de varios) que codifica un acetaldehído deshidrogenasa acetilante, un piruvato formiato liasa o ambas.
En algunas formas de realización, las presentes células de levadura modificadas pueden sobreexpresar además un polipéptido similar al transportador de azúcar (STL1) para aumentar la captación de glicerol (véase, por ejemplo, Ferreira et al. (2005) Mol Biol Cell 16:2068-76; Dusková et al. (2015)Mol Microbiol97:541-59 y el documento WO 2015023989 A1).
En algunas formas de realización, las presentes células de levadura modificadas incluyen además una ruta biosintética de butanol. En algunas formas de realización, la ruta biosintética de butanol es una ruta biosintética de isobutanol. En algunas formas de realización, la ruta biosintética de isobutanol comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que cataliza la conversión de un sustrato a producto seleccionada del grupo que consiste en: (a) piruvato a acetolactato; (b) acetolactato a 2,3-dihidroxiisovalerato;(c)2,3-dihidroxiisovalerato a 2-cetoisovalerato; (d) 2-cetoisovalerato a isobutiraldehído; y (e) isobutiraldehído a isobutanol. En algunas formas de realización, la ruta biosintética de isobutanol comprende polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen actividad de acetolactato sintasa, cetoácido reductoisomerasa, dihidroxiácido deshidratasa, cetoisovalerato descarboxilasa y alcohol deshidrogenasa.
En algunas formas de realización, las células de levadura modificadas que comprende una ruta biosintética de butanol comprenden además una modificación en un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de piruvato descarboxilasa. En algunas formas de realización, las células de levadura comprenden una deleción, mutación y/o sustitución en un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido que tiene actividad de piruvato descarboxilasa. En algunas formas de realización, el polipéptido que tiene actividad de piruvato descarboxilasa se selecciona del grupo que consiste en: PDC1, PDC5, PDC6 y combinaciones de los mismos. En algunas formas de realización, las células de levadura comprenden además una deleción, mutación y/o sustitución en uno o más polinucleótidos endógenos que codifican FRA2, ALD6, ADH1, GPD2, BDH1 e YMR226C.
V. Sobreexpresión de GIS1 en combinación con otras mutaciones beneficiosas
En algunas formas de realización, además de la sobreexpresión de GIS1, opcionalmente en combinación con otras modificaciones genéticas que benefician la producción de alcohol, las presentes células de levadura modificadas incluyen además cualquier número de genes adicionales de interés que codifican proteínas de interés, o de reducción de la producción, de las mismas. Pueden introducirse genes adicionales de interés antes, durante o después de manipulaciones genéticas que dan como resultado la sobreexpresión de polipéptidos GIS1. Las proteínas de interés incluyen marcadores seleccionables, enzimas de procesamiento de carbohidratos, y otros polipéptidos comercialmente relevantes que incluyen, pero sin limitación, una enzima seleccionada del grupo que consiste en una deshidrogenasa, una transcetolasa, una fosfocetolasa, una transladolasa, una epimerasa, una fitasa, una xilanasa, una p-glucanasa, una fosfatasa, una proteasa, una a-amilasa, una p-amilasa, una glucoamilasa, una pululanasa, una isoamilasa, una celulasa, una trehalasa, una lipasa, una pectinasa, una poliesterasa, una cutinasa, una oxidasa, una transferasa, una reductasa, una hemicelulasa, una mananasa, una esterasa, una isomerasa, una pectinasa, una lactasa, una peroxidasa y una lacasa. Las proteínas de interés pueden secretarse, glucosilarse y modificarse de otro modo.
VI. Uso de la levadura modificada para aumentar la producción de alcohol
Las presentes cepas de levadura y los procedimientos de uso de las mismas son para aumentar la producción de alcohol en levadura. Dichos procedimientos no se limitan a un proceso de fermentación particular. Se espera que la presente levadura modificada genéticamente represente un reemplazo "imprevisto" para la levadura convencional en cualquier instalación de fermentación alcohólica, ya sea con el uso de hidrólisis de almidón bruto, sacarificación y fermentación simultáneas, u otras variaciones estándar de producción de etanol convencional. Aunque está destinada principalmente a la producción de alcohol combustible, la presente levadura también puede usarse para la producción de alcohol potable, incluyendo vino y cerveza.
VII. Células de levadura adecuadas para modificación
Las levaduras son microorganismos eucarióticos unicelulares clasificados como miembros del reino de los hongos e incluyen organismos de los filos Ascomycota y Basidiomycota. Las levaduras que pueden usarse para la producción de alcohol incluyen, aunque sin limitación,Saccharomycesspp., incluida S.cerevisiae,así comoKiuyveromyces, LachanceaySchizosaccharomycesspp. Numerosas cepas de levadura están disponibles en el mercado, muchas de ellas se han seleccionado o modificado genéticamente para que presenten características deseadas, tales como alta producción de alcohol, tasa de crecimiento rápida y similares. Algunas levaduras se han modificado genéticamente para producir enzimas heterólogas, tales como glucoamilasa o a-amilasa.
VII. Sustratos y productos
La producción de alcohol a partir de varios sustratos de carbohidratos, que incluyen, pero sin limitación, almidón de maíz, caña de azúcar, mandioca y melazas, es bien conocida, como lo son las innumerables variaciones y mejoras a las condiciones enzimáticas y químicas y procesos mecánicos. Se cree que las presentes composiciones y procedimientos son completamente compatibles con dichos sustratos y condiciones.
Los productos de fermentación de alcohol incluyen un compuesto orgánico que tiene un grupo funcional hidroxilo ( OH) unido a un átomo de carbono. Los ejemplos de alcoholes incluyen, pero sin limitación, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, n-pentanol, 2-pentanol, isopentanol, y alcoholes superiores. Los alcoholes combustibles más habitualmente preparados son etanol y butanol.
Estos y otros aspectos y formas de realización de las presentes cepas de levadura y procedimientos serán evidentes para los expertos en la técnica en vista de la presente descripción.
Ejemplos
Con los siguientes ejemplos se pretende ilustrar adicionalmente, pero sin limitación, las composiciones y procedimientos descritos.
Ejemplo 1. Materiales y procedimientos
Se emplearon los siguientes protocolos a menos que se especifique lo contrario.
Preparación de licuefacto
Se preparó el licuefacto (suspensión de maíz molido) añadiendo 600 ppm de urea, 0,124 SAPU/g de ds de FERMGEN<™>2,5X (proteasa fúngica ácida), 0,33 GAU/g de ds de glucoamilasa (una glucoamilasa deTrichodermavariante) y 1,46 SSU/g de ds de GC626 (a-amilasa deAspergillus),ajustado a un pH de 4,8.
Ensayos AnKom
Se añadieron 300 gl de cultivo de levadura concentrada durante la noche a cada una de varios frascos ANKOM rellenos con 30 g de licuefacto preparado para una DO final de 0,3. Los frascos se incubaron a continuación a 32 °C con agitación (150 rpm) durante 65 horas.
Análisis por HPLC
Se recogieron muestras de experimentos de vial de suero y de AnKom en tubos Eppendorf por centrifugación durante 12 minutos a 14.000 rpm. Los sobrenadantes se filtraron con filtros de PTFE 0,2 pM y después se usaron para el análisis de HPLC (serie 1200 de Agilent Technologies) con las siguientes condiciones: columnas Bio-Rad Aminonex HPX-87H, temperatura de funcionamiento de 55 °C. flujo isocrático de H<2>SO<4>0,01 N de 0,6 ml/min, 2,5 gl de volumen de inyección. Se usaron patrones de calibración para la cuantificación de acetato, etanol, glicerol y glucosa. Las muestras de los experimentos en matraces de agitación se recogieron en tubos Eppendorf por centrifugación durante 15 minutos a 14.000 rpm. Los sobrenadantes se diluyeron en un factor de 11 usando H<2>SO<4>5 mM y se incubaron durante 5 min a 95 °C. Después del enfriamiento, las muestras se filtraron con filtros Corning FiltrEX CLS35050,2 pM y después se usaron para el análisis por HPLC. Se inyectaron 10 pl en un dispositivo de HPLC de la serie Agilent 1200 equipado con un detector de índice de refracción. La columna de separación utilizada fue una columna Phenomenex Rezex-RFQ Fast Acid H+ (8%). La fase móvil fue H<2>SO<4>5 mM y el caudal fue de 1,0 ml/min a 85 °C. Se usó la mezcla de patrón de calibración de HPLC de Bion Analytical para la cuantificación de acetato, etanol, glicerol y glucosa. A menos que se especifique lo contrario, todos los valores se expresan en g/l.
Ejemplo 2. Sobreexpresión de GIS1 con codones optimizados en levadura
El GIS1, codificado por el genYDR096Wde Saccharomyces cerevisiae S288c, se optimizó por codones y se sintetizó para generar el gen artificial, "GIS1s", mostrado como SEQ ID NO: 2:
ATGGAAATCAAGCCAGTCGAAGTTATCGACGGTGTTCCAGTCTTCAAGCCATCTATGATGGAAT TTGCCAATTTTCAATACTTCATTGACGAAATCACCAAGTTTGGTATCGAAAACGGTATTGTCAA GGTTATTCCTCCCAAGGAATGGCTGGAATTGTTGGAAGGTTCTCCACCTGCTGAATCCTTGAAG AC TATCCAAC TAGATT CTCCAATTCAACAGCAAG CCAAGAGAT GGGACAAAC ACGAAAAC GG TG TCT TTTCCAT CGAAAACGAATAC GACAACAAG TCTTACAAC TTGACACAAT GGAAGAATTTGGC TGAAT CCTTG GAT TCTAGAAT CAGTCAAGGTGAC TTCAAC GACAAGAC CTTAAAGGAAAAC TGC AGAGTCGATTCTCAACAGGATTGTTACGATTTGGCTCAATTACAAATCTTGGAATCCGACTTCT GGAAGACCATTGCCTTTTCCAAGCCATTCTACGCTGTTGACGAAAACTCTTCCATCTTCCCATA CGAC TTGACT TTATGGAACT TGAACAATT TGCCAGATTCTAT CAACTC CAGCAACAGACGT TTG CTAACTGGTCAATCCAAGTGTATCTTTCCATGGCACTTGGACGAACAAAACAAGTGTTCTATCA ACTACTTGCACTTCGGTGCTCCAAAGCAATGGTACTCCATTCCATCTGCCAACACCGATCAATT CTT GAAGATC CTATCCAAGGAAC CAT CAAGCAACAAGGAAAAT TGTCCAGCTTTCAT CCGTCAT CAAAACAT CATTACTTCT CCAGACT TTTTGAGAAAGAACAAT ATCAAG TTCAACAGAG TTGTC C AATTTCAACATGAATTTATCATTACCTTTCCTTACTGTATGTACTCCGGTTTCAACTACGGTTA CAACTTTGGCGAATCTATCGAGTTCATCTTAGATCAGCAAGCTGTTGTCAGAAAGCAACCATTG AAGTGTGGTTGCGGCAACAAGAAAGAAGAGAGAAAGTCTGGTCCATTTTCCAACTTGTCTTACG AC TCCAACGAAAG CGAACAAC GTGGTTCTAT TACCGACAAC GACAATGAT TTGTTTCAAAAGG T CAGAT CCTTC GACGAATT GCTAAACCAC TCCTC TCAAGAATT GCAAAACT TGGAAGACAACAAG AAT CCATTGT TTTCCAACAT CAATAT GAACAGAC CACAAAGC TCCTCTTTGAGGT CTACTACAC CAAAC GGTGTCAACCAAT TCTTGAACATGAAT CAAAC TACCATCAGCAGAAT TTCCTCTCCATT GTTATCAAGAATGATGGACTTGTCCAACATCGTGGAACCAACCTTGGACGATCCTGGTTCCAAG TTCAAGAGAAAGG TTTTGACTCCACAAT TACCACAAAT GAACATT CCATCCAAC TCTTCCAAC T TTGGTACTCCTTCTTTGACCAATACAAACTCCTTGCTATCAAACATCACTGCTACATCTACCAA TCCATCCAC CACTACCAAC GGC TCTCAAAAC CACAACAAT GTCAACGCCAAT GGTATCAACACC TCTGCTGCCGCTTCCATCAACAATAACATTTCCTCTACCAACAATTCTGCCAATAACAGCTCTT CCAACAATAAC GTTTC TACTGT TCCATCTT CCATGATG GACTCTT CGACCTTGAAT GGTAC TTC TGGTTTGGGTGGCGACAACGATGACAACATGTTAGCTTTGAGCCTAGCTACCTTGGCCAACAGT GCTACTGCTTCTCCAAGATTGACCTTACCACCTTTGTCTTCACCAATGAATCCCAACGGTCACA CTTCCTACAACGGTAACATGATGAACAATAACTCTGGTAACGGTTCCAACGGTAGCAACTCTTA CTCCAATGGTGTCACCACTGCTGCCGCTACCACTACATCTGCTCCACACAACTTGTCCATCGTT TCTCCAAACCCTACCTACAGTCCAAATCCCTTGTCTCTATACTTGACCAACTCCAAGAATCCAT TGAACTCTGGTTTGGCTCCATTATCTCCTTCCACTTCTAACATTCCATTCTTGAAGAGAAACAA TGTCGTTACCCTAAACATCTCCAGAGAAGCCTCCAAGTCTCCAATCTCTTCCTTTGTCAACGAC TACCGTTCTCCATTGGGTGTTTCCAATCCATTGATGTACTCTTCCACTATCAACGATTACTCCA ACGGTACTGGTATCCGTCAAAACAGCAACAACATCAATCCATTGGACGCTGGTCCATCTTTTTC TCCTTTGCACAAGAAACCAAAGAT TTTGAACG GCAATGACAAC TCCAATT TGGACAGCAACAAT TTCGATTAC TCTTTTAC TGGTAAC AAGCAAGAAT CCAATCCATCTATCTT GAACAACAATAC CA AC AATAAC GACAACTACAGAAC TTCTTCCATGAACAACAAT GGTAACAAT TACCAAGC TCACTC TTCCAAGT TTGGTGAAAAC GAAG TCATCAT GTCCGATCAC GGTAAGAT TTACATCTGTAGAGAA TGTAACAGAC AAT TTTCCTCTGGT CACCATCTAACCAGAC ACAAAAAG TCAGTTCATTCT GGTG AAAAG CCAC ACTCTTG TCCAAGAT GTGGTAAAAGAT TCAAGAGAAGAG ATCAT GTCTTGCAAC A CTTGAACAAGAAAAT C CCATGCAC TCAAGAAAT GGAAAACAC CAAG TTGGCT GAATCTTAA
El promotor de ADR1 (representado por la SEQ ID NO: 3) se unió operativamente al extremo 5' de la secuencia codificante de GIS1 con codones optimizados para controlar la expresión:
AAT AGAGTAT GAT TAT TTTTTTTATAT TTTTTTTTTT TGGAAAACAAAAT TCTTATAG TAAAGT AAGGAATAGTAGCAGAATAT TT TTCTGAAGTG TTTATAATAAAGGGAGAACCGGGAAAGTAGCA AAAT GATT GGTTAAT TTAT GCAAAT CAAT CTTATACTTCCAACGAAT AAGAGG GAGTATAT CAA AACAGAG TAACAATAAACT TTTGC TATGACACCTTTTCTTTCTTTCAAAGATAAAAGAATAAGG CTTTTCTATAGTAGTCGAGCAAATGTTGGAATAAGGAGGTATGGAATTTTGAAAATAGCCTGAG AAAT TCAGATCAATGATATAT AAC TGTTGTCTTCAAAAGG TCTTCAAG GGAAGAAAAT TTCCGA TCGGAAGT CCAGAATAAAT ACCAC AAGTATAG CACAATAAAC AACAGCAC AAC AACAATAAT AA CAACACCTGTAGCGAAAACGTTTTCCTATTTTTAAGGCGTTGTTCTTTGAAAACCTGTGGCGAA GTAAAACAT GAAAACAAATGAAAACAC CGC CAAACCAAGAAAAGAACAAC GAAAAAAT AT CACT TTTATTTAGTTCACAACGGCTAACTATCGACGTTCACCCTTCCTCAGTCTATCACATCGTCCTT AGCTCGAACAACGCCGATAGGCATCAAGTTACATTGAGCTTTACTGCACGTTCCCGCATGATGC CATTGACTAGGGCCCGCCCTTTCGGCAATCATTCTAGCATGTTCCGCATGTTC
El terminador de Eno2 (locusYHR174W;SEQ ID NO: 4) se unió operativamente al extremo 3' de la secuencia codificante de GIS1s con codones optimizados para completar el
casete de expresión ADR1 Pro::GIS1 ss::Ebo2Ter
GTGCACCTTTTTTTTCTCCTTCCAGTGCATTATGCAATAGACAGCACGAGTCTTTGAAAAAGTA
ACT TATAAAACT GTATCAATT TTTAAACCTAAATAGAT TCATAAACTAT TCGTTAATATAAAG T GTT CTAAACTATGATGAAAAAATAAGCAGAAAAGACTAATAAT TCTTAGT TAAAAGCACTTTAC AACTTGTCACCGTGGTGGAAGTTTTCACCG
La secuencia de aminoácidos del polipéptido GIS1 deSaccharomyces cerevisiaeS288c (N° de acceso al Genbank. NP_010381.1) se muestra, a continuación, como SEQ ID NO: 5:
MEIKPVEVIDGVPVFKPSMMEFANFQYFIDEITKFGIENGIVKVIPPKEWLELLEGSPPAESLK TIQLDSPIQQQAKRWDKHENGVFSIENEYDNKSYNLTQWKNLAESLDSRISQGDFNDKTLKENC RVDSQQDCYDLAQLQILESDFWKTIAFSKPFYAVDENSSIFPYDLTLWNLNNLPDSINSSNRRL LTGQSKCIFPWHLDEQNKCSINYLHFGAPKQWYSIPSANTDQFLKILSKEPSSNKENCPAFIRH QNIITSPDFLRKNNIKFNRWQFQHEFIITFPYCMYSGFNYGYNFGESIEFILDQQAWRKQPL KCGCGNKKEERKSGPFSNLSYDSNESEQRGSITDNDNDLFQKVRSFDELLNHSSQELQNLEDNK NPLFSNINMNRPQSSSLRSTTPNGVNQFLNMNQTTISRISSPLLSRMMDLSNIVEPTLDDPGSK FKRKVLTPQLPQMNIPSNSSNFGTPSLTNTNSLLSNITATSTNPSTTTNGSQNHNNVNANGINT SAAASINNNISSTNNSANNSSSNNNVSTVPSSMMHSSTLNGTSGLGGDNDDNMLALSLATLANS ATASPRLTLPPLSSPMNPNGHTSYNGNMMNNNSGNGSNGSNSYSNGVTTAAATTTSAPHNLSIV SPNPTYSPNPLSLYLTNSKNPLNSGLAPLSPSTSNIPFLKRNNWTLNISREASKSPISSFVND YRSPLGVSNPLMYSSTINDYSNGTGIRQNSNNINPLDAGPSFSPLHKKPKILNGNDNSNLDSNN FDYSFTGNKQESNPSILNNNTNNNDNYRTSSMNNNGNNYQAHSSKFGENEVIMSDHGKIYICRE CNRQFSSGHHLTRHKKSVHSGEKPHSCPRCGKRFKRRDHVLQHLNKKIPCTQEMENTKLAES
Este casete de expresión se amplificó usando cebadores con secuencias flanqueantes apropiadas para promover la inserción en el sitio PCT7(YHR076W)y se transformó en (i) FERMAX™ Gold (Martrex Inc., Minnesota, Estados Unidos; abreviado en el presente documento, "FG"), una levadura de fermentación bien conocida usada en la industria del etanol de cereales, o (ii) FG-PKL, levadura FG modificada genéticamente que tiene una ruta de fosfocetolasa (PKL) heteróloga que implica la expresión de fosfocetolasa (PKL), fosfotransacetilasa (PTA) y acetil deshidrogenasa acetilante (AADH) tal como se describe en el documento WO2015148272 (Miasnikov et al.). La inserción esperada del casete de expresión de GIS1 en las dos cepas parentales se confirmó por PCR.
Ejemplo 3. Producción de alcohol usando levadura que sobreexpresa GIS1s
Las cepas que sobreexpresan GIS1 se sometieron a ensayo en un ensayo Ankom, que contenía 30 g de licuefacto. Se realizaron fermentaciones a 32 °C durante 55 horas. Las muestras de fin de la fermentación se analizaron por HPLC. Los resultados se resumen en las tablas 1 y 2.
Tabla 1.Resultados de HPLC de cepas FG y FG-GIS1s
Tabla 2.Resultados de HPLC de FG-PKL y FG-PKL-GIS1s
La sobreexpresión de GIS1 dio como resultado un aumento del 1,4% en la producción de etanol en la levadura FG, que se reconoce como una levadura robusta y de alta producción de etanol para la industria de etanol combustible, aunque no es un organismo modificado genéticamente. La sobreexpresión de GIS1s dio como resultado un aumento del 1,1% de la producción de etanol en levadura FG modificada genéticamente para que tenga una ruta de PKL exógena. Estos resultados demuestran de nuevo que la sobreexpresión de GIS1 es beneficiosa para aumentar la producción de etanol.
Claims (12)
1. Un procedimiento para aumentar la producción de etanol en células de levadura cultivadas sobre un sustrato de carbohidrato, que comprende: introducir en células de levadura parentales una alteración genética que provoca que las células modificadas produzcan una cantidad aumentada de polipéptidos GIS1 en comparación con las células parentales, en el que las células modificadas producen una cantidad aumentada de etanol en comparación con células parentales por lo demás idénticas en condiciones de fermentación equivalentes.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la alteración genética comprende la introducción en las células parentales de un ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de GIS1 a un nivel superior que el de la célula parental cultivada en condiciones equivalentes.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la alteración genética comprende la introducción de un genYDR096Wexógeno.
4. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la alteración genética comprende la introducción de un promotor más fuerte en un genYDR096Wendógeno.
5. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la alteración genética comprende la introducción de un casete de expresión para expresar GIS1.
6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que las células comprenden además uno o más genes de la ruta de la fosfocetolasa.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que los genes de la ruta de fosfocetolasa se seleccionan del grupo que consiste en fosfocetolasa, fosfotransacetilasa y acetil deshidrogenasa acetilante.
8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la cantidad de aumento en la expresión de GIS1 es al menos 10 veces superior en comparación con el nivel de expresión en células parentales cultivadas en condiciones equivalentes, con respecto a la expresión de ARNm que codifica GIS1.
9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que las células comprenden además un gen exógeno que codifica una enzima procesadora de carbohidratos.
10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que las células comprenden además una alteración en la ruta del glicerol y/o la ruta de la acetil-CoA.
11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que las células comprenden además una ruta alternativa para producir etanol.
12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que las células son deSaccharomycesspp.
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