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ES2991993T3 - Vacuna profiláctica contra el síndrome de la caída de postura del huevo (EDS) - Google Patents

Vacuna profiláctica contra el síndrome de la caída de postura del huevo (EDS) Download PDF

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ES2991993T3
ES2991993T3 ES15783019T ES15783019T ES2991993T3 ES 2991993 T3 ES2991993 T3 ES 2991993T3 ES 15783019 T ES15783019 T ES 15783019T ES 15783019 T ES15783019 T ES 15783019T ES 2991993 T3 ES2991993 T3 ES 2991993T3
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Kiyohiko Andoh
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Meiji Animal Health Co Ltd
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Meiji Animal Health Co Ltd
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Abstract

La presente invención aborda el problema de proporcionar una vacuna contra el síndrome de caída de la postura (EDS) que sea capaz de prevenir eficazmente el EDS y que pueda suministrarse de forma estable. Para resolver este problema, se proporciona una vacuna contra el EDS que comprende como ingrediente activo una proteína fusionada en la que un polipéptido que tiene una unidad formadora de espiral superenrollada está unido a la región de la protuberancia en una proteína de fibra del virus del EDS (EDSV). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vacuna profiláctica contra el síndrome de la caída de postura del huevo (EDS)
Campo técnico
La presente invención se refiere a vacunas para prevenir el EDS de los pollos. Más concretamente, la invención se refiere a una vacuna que incluye una proteína recombinante de ingrediente activo y/o un multímero de la misma en el que la "región knob" en la proteína de fibra del virus del EDS causante del EDS (EDSV) se fusiona a un "polipéptido que tiene una unidad formadora de espiral". La inoculación de la proteína fusionada y/o un multímero de la misma a un pollo induce altos niveles de anticuerpos de inhibición de la hemaglutinación (IH) e, y permite prevenir la aparición del EDS.
Técnica antecedente
El EDS es una enfermedad de las gallinas caracterizada principalmente por una baja producción de huevos y una producción anormal de huevos en las gallinas infectadas por el EDSV (NPL1, y NPL 2). El EDSV está clasificado como miembro del grupo III de los adenovirus aviares y tiene actividad de hemaglutinación. El virus se caracteriza por su proliferación en el oviducto de las gallinas. El EDS sólo muestra síntomas clínicos menores, como diarrea leve, si la hay. La enfermedad suele aparecer entre las 30 y 40 semanas de edad, cuando la producción de huevos está en su punto álgido, y provoca la producción de huevos con cáscaras anormales, o una baja producción de huevos durante un periodo de 3 a 8 semanas en una manada infectada. Esto provoca graves perjuicios económicos. Las vacunas son eficaces para la prevención del EDS (NPL 3), y las vacunas inactivadas se incorporan a una amplia gama de programas de vacunación para ponedoras.
Una vacuna inactivada del EDS preparada inactivando los virus amplificados en un huevo en estado embrionario de pato doméstico, y mezclando los virus inactivados con un adyuvante es actualmente la corriente principal. Aunque la amplificación del EDSV en un huevo en estado embrionario de pato doméstico es deseable (NPL4, y NPL 5), la aparición de la gripe aviar y otras infecciones han suscitado la preocupación de que el futuro suministro de huevos en estado embrionario de pato doméstico pueda ser difícil. Por consiguiente, se necesita un medio para suministrar antígenos vacunales que no dependa de los huevos de patos domésticos.
El EDSV tiene un ADN genómico de doble cadena de aproximadamente 33 kb (NPL6). El EDSV tiene un único serotipo, y apenas hay diferencias de antigenicidad entre las cepas (NPL 7). Las partículas víricas se construyen a partir de varias proteínas estructurales, incluyendo la proteína del núcleo, la hexona constituyente de la cápside, las fibras triméricas que sobresalen de la cápside en forma de espigas fibrosas, y una porción de base, como una base del pentón, que proporciona una base para las fibras (NPL 1, y NPL 6). El epítopo neutralizante está presente en la hexona (NPL 8), la fibra y la base de pentón (NPL 9) . La fibra, en particular, se ha examinado en muchos estudios (NPL 11) debido a su implicación en la entrada en las células huésped (NPL 10) . La proteína de la fibra se divide en tres regiones según su función (NPL 12) . El lado N-terminal implicado en la unión a la base del pentón (NPL 13) se denomina cola, y la región situada en el centro, eje. Se ha informado de que el Knob en el terminal C tiene actividad de hemaglutinación, y está implicado en la unión al receptor celular (NPL 11). En el adenovirus humano 5, el epítopo neutralizante está presente en Knob, una de las tres regiones de la proteína de la fibra. Existe un informe que indica que la conformación es importante para exhibir la función, y que se observó actividad de unión para el receptor al expresarse con una parte de la región del eje adyacente (NPL 14).
La región del eje que constituye el eje de la proteína de fibra tiene una estructura de repetición con una serie de múltiples estructuras p en espiral (1 repetición) que incluyen regiones hidrofóbicas separadas por prolina o glicina (NPL 12, y NPL 15), y tres moléculas se ensamblan entre sí para formar una estructura p en espiral triple (NPL 15, y NPL 16) . El Knob que sigue al eje también tiene una estructura trimérica (NPL 17). Normalmente, una repetición de eje consta de 15 aminoácidos (NPL 12) . En el EDSV, sin embargo, la mayoría de las repeticiones constan de un mayor número de aminoácidos (NPL 6). En el adenovirus humano, se ha informado de que la reducción de la longitud del eje conduce a una unión más débil al receptor y a una infectividad reducida para las células de cultivo (NPL 18).
Con respecto al EDSV, hay informes de que se indujeron anticuerpos neutralizantes en un pollo al que se le administró el Knob, y 34 aminoácidos en la porción C-terminal de la región del eje adyacente al Knob como una vacuna oleosa después de la expresión en Escherichia coli (NPL 19 y NPL 20, y PTL 1). Los documentos NPL22, NPL23 y PTL2 demuestran que las proteínas de fusión consistentes en un antígeno fusionado a un dominio en espiral pueden constituir vacunas adecuadas.
En el documento NPL24 se muestra la expresión del Knob (202aa) y partes de diferentes longitudes del dominio del eje. S18 (Fig.1) tiene una longitud de 218aa y es soluble.
Lista de citas
Literatura de patentes
PTL 1: WO2004/078977
PTL 2: US2005/137156
Literatura no de patentes
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NPL 16: Stouten, P.F., Sander, C., Ruigrok, R.W. & Cusack, S. : Nuevo modelo triple helicoidal para el eje de la fibra del adenovirus. J. Mol. Biol., 226: 1073-1084, 1992
NPL 17: Xia, D., Henry, L., Gerard, R.D. & Deisenhofer, J.: Estructura del dominio de unión al receptor de la proteína de fibra del adenovirus tipo 5. Curr. Top Microbiol. Immunol, 199: 39-46, 1995
NPL 18: Shayakhmetov, D.M. & Lieber, A.: Dependencia de la infectividad del adenovirus de la longitud del dominio del eje de la fibra. J. Virol, 74: 10274-10286, 2000
NPL 19: Gutter, B., Fingerut, E., Gallili, G., Eliahu, D., Perelman, B., Finger, A. & Pitcovski, J.: La vacuna recombinante de la subunidad del síndrome de la caída de postura del huevo ofrece una alternativa a la propagación del virus en huevos de pato. Patología aviar, 37: 33-37, 2008
NPL 20: Fingerut, E., Gutter, B., Gallili, G., Michael, A. & Pitcovski, J. : Una vacuna de subunidades contra el síndrome de la caída de postura del huevo del adenovirus que utiliza parte de su proteína fibrosa. Vacuna, 21: 2761 2766, 2003
NPL 21: Adv. Protein Chem. 2005, 70, 37-78
NPL22: Arakawa T et al., Vaccine, vol.32, diciembre de 2013, páginas 864-871. 5
NPL23: Cooper J.A. et al., Molecular Pharmacology, American Society of Pharmacology and Experimental Therapeutics, US, vol.34, N°6, 1 de enero de 1997, páginas 433-440.
NPL24: Suenaga K. et al., Sci.Rep.Chemo-Sero-Therap.Res.Inst.vol.19, 2010, Páginas 51-60
Sumario de la invención
Problema técnico
La presente invención tiene por objeto proporcionar una vacuna recombinante contra el EDS capaz de prevenir eficazmente el EDS, destinada a granjas con riesgos potenciales de EDS.
Solución al problema
Para encontrar una solución a los problemas anteriores, los presentes inventores examinaron la estructura de la proteína de fibra del EDSV utilizando un modelo de predicción de estructura, y descubrieron que el límite entre la región Knob y la región del eje existe más cerca del terminal N de lo que se pensaba convencionalmente. También se descubrió que una proteína recombinante y/o un multímero de la misma en el que una región Knob demarcada para no contener la región de eje se fusionaba a un polipéptido que tenía una unidad formadora de espiral inducía anticuerpos de alta IH cuando se inoculaba como vacuna a un pollo. La presente invención se completó sobre la base de estos hallazgos.
Específicamente, la presente invención es como sigue.
Una proteína fusionada en la que la región Knob de una proteína de fibra del virus (EDSV) del síndrome de la caída de postura del huevo (EDS) se fusiona con un polipéptido que tiene una unidad de formación de espiral en espiral, en el que el polipéptido que tiene una unidad de formación de espiral en espiral y la región Knob son adyacentes entre sí o comprenden una secuencia de enlace y/o etiqueta entre ellos, en el que la región Knob consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 11, o de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 con la supresión, sustitución o adición de 1 a 3 aminoácidos.
Una proteína fusionada en la que la región Knob de una proteína de fibra del virus (EDSV) del síndrome de la caída de postura del huevo (EDS) se fusiona con un polipéptido que tiene una unidad de formación en espiral, en el que el polipéptido que tiene una unidad de formación en espiral y la región Knob son adyacentes entre sí o comprenden un enlazador entre ellos, en el que la región Knob consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 11, o de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 con la supresión, sustitución o adición de 1 a 3 aminoácidos, en la que la proteína fusionada tiene además una secuencia de etiqueta, que está situada N-terminalmente o C-terminalmente..
Una proteína fusionada como se ha definido anteriormente, en la que la unidad formadora de espiral se deriva de una proteína nativa formadora multímeros, en la que la proteína nativa formadora de multímeros es una GCN4 o una proteína de la matriz del cartílago (CMP), en la que la unidad formadora de espiral incluye un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos un 80% a s Eq ID NO: 27-31.
Una proteína fusionada como la definida anteriormente, en la que la proteína nativa formadora de multímeros es la CMP
Una proteína fusionada como se ha definido anteriormente, en la que la proteína fusionada es un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 23, o un polipéptido consistente en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 con la supresión, sustitución o adición de 1 a 9 aminoácidos.
Una proteína fusionada como se ha definido anteriormente, en la que la proteína fusionada es un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 25, o un polipéptido consistente en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 con la supresión, sustitución o adición de 1 a 9 aminoácidos.
Una proteína fusionada como la definida anteriormente, en la que la proteína nativa formadora de multímeros es la GCN4, en la que la GCN4 está unida al lado C-terminal del Knob.
Una proteína fusionada como se ha definido anteriormente, en la que la proteína fusionada es un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 21, o un polipéptido consistente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 con la supresión, sustitución o adición de 1 a 9 aminoácidos.
Un multímero de proteína fusionada de la proteína fusionada como se ha definido anteriormente.
Un fragmento de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína fusionada definida anteriormente.
Un vector de expresión recombinante que comprende el fragmento de ácido nucleico.
Una vacuna para el EDS que comprende la proteína fusionada como se ha definido anteriormente, o el multímero de proteína fusionada como se ha definido anteriormente como ingrediente activo.
Una vacuna de ADN para el EDS que comprenda como principio activo el fragmento de ácido nucleico o el vector de expresión recombinante definido anteriormente.
Un kit que comprende la proteína fusionada o un multímero de la misma como se define anteriormente, en el que el kit es para la medición de un nivel de anticuerpos contra la región Knob del EDSV en una muestra de ensayo.
Un kit que incluye el anticuerpo, en el que el kit es para medir el contenido de la región Knob del EDSV en una muestra de ensayo.
La vacuna o la vacuna de ADN definida anteriormente para su uso en la prevención del EDS.
Efectos ventajosos de la invención
Una vacuna de la presente invención que incluye una proteína de fusión proteica recombinante como se define en las reivindicaciones y/o un multímero de la misma contenido como ingredientes activos y en el que la región Knob del EDSV está fusionada a un polipéptido que tiene una unidad que forma una espiral induce anticuerpos de elevado efecto IH (inhibición de la hemaglutinación) cuando se inocula a un pollo, y puede prevenir la aparición del EDS en pollos.
Breve descripción de los dibujos
La FIG.1 es una vista esquemática de las proteínas fusionadas preparadas en los Ejemplos 1 a 4 y en el Ejemplo Comparativo 1.
FIG. 2 es un diagrama que representa el análisis SDS-PAGE que confirma la formación de multímeros de las proteínas fusionadas preparadas en los Ejemplos 1 a 4 y el Ejemplo comparativo 1.
La FIG.3 es un diagrama que representa el análisis de la distribución del peso molecular por filtración en gel de las proteínas fusionadas preparadas en los Ejemplos 1 a 4 y en el Ejemplo comparativo 1.
FIG. 4 es un diagrama que representa los resultados de los ensayos de IH de sueros de pollo inmunizados con las proteínas fusionadas preparadas en los Ejemplos 1 a 4 y el Ejemplo comparativo 1 en el Ejemplo de prueba 3.
La FIG.5 es un diagrama que representa los resultados de la prueba para la confirmación de los niveles efectivos de antígeno de Knob-GCN4 en el Ejemplo de Prueba 4.
La FIG.6 es un diagrama que representa los resultados de la prueba para la confirmación de los niveles efectivos de antígeno de CMP-Knob en el Ejemplo de Prueba 4.
FIG. 7 es un diagrama que representa los cambios en los títulos de anticuerpos IH anti-EDSV tras inmunización (valores medios) en el Ejemplo de Prueba 5.
La FIG.8 es un diagrama que representa los cambios en el recuento normal de huevos tras la infección letal por EDSV en el Ejemplo de Prueba 5.
Descripción de las realizaciones
La presente invención incluye una proteína de fusión en la que la región Knob de una proteína de fibra del virus del síndrome de la caída de postura del huevo (EDSV) se fusiona con un polipéptido que tiene una unidad de formación de espiral, en la que el polipéptido que tiene una unidad de formación de espiral y la región Knob son adyacentes entre sí o comprenden una secuencia enlazadora y/o de etiqueta entre ellos, en la que la región Knob consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 11, o de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 con la supresión, sustitución o adición de 1 a 3 aminoácidos..
La proteína de fibra del EDSV se divide en tres regiones por función: la cola, el eje y Knob del lado N-terminal. Preferiblemente, la región Knob del EDSV que constituye la proteína fusionada de la presente invención no contiene la región de eje porque tiene el riesgo de disminuir la solubilidad. Por otra parte, es preferible contener completamente la región Knob para evitar el riesgo de perder la estructura nativa de orden superior de la región Knob. Ejemplos de tal región Knob del EDSV incluyen un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 11. Esta secuencia de aminoácidos incluye una porción con nueve aminoácidos N-terminales que se pensaba que estaban contenidos en la región del eje (NPL 20) . Sin embargo, los estudios de los presentes inventores basados en un modelo de predicción de estructura predijeron que la región del pomo se extiende hasta esta posición. La región perilla del EDSV que constituye la proteína fusionada de la presente invención incluye un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 11, y un polipéptido consistente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 con la supresión, sustitución o adición de 1 a 3 aminoácidos. Como se utiliza aquí, "varios aminoácidos" significa típicamente de 2 a 9, preferiblemente de 2 a 5, más preferiblemente de 2 a 3 aminoácidos.
El gen que codifica la región Knob del EDSV incluye la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 12, una secuencia de ADN cuyos codones se han optimizado para la expresión en Escherichia coli o levadura, una secuencia de ADN preparada añadiendo un sitio de corte de enzima de restricción adecuado a estas secuencias de ADN, y una secuencia de ADN obtenida tras la supresión, sustitución o adición de una o varias bases en las secuencias de ADN anteriores. Tal como se utiliza aquí, "varias bases" significa de 2 a 9 bases, preferiblemente de 2 a 5, más preferiblemente de 2 a 3 bases. El gen codificante también incluye una secuencia de ADN que es al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 95% homóloga a la secuencia de ADN anterior.
El polipéptido que tiene una unidad formadora de espiral que se fusiona al Knob para constituir la proteína fusionada de la presente invención no está particularmente limitado, siempre que tenga la capacidad de formar una estructura de espiral. Preferiblemente, el polipéptido es uno que tiene una unidad formadora de espiral derivada de una proteína que forma un multímero nativo (una proteína formadora de multímero). Las proteínas formadoras de multímeros descritas en el documento NPL 21(Adv. Protein Chem. 2005, 70, 37-78) son ejemplos de este tipo de proteínas. Preferiblemente, el polipéptido es uno que tiene una unidad formadora de espiral en espiral derivada de, por ejemplo, GCN4, CMP derivada de pollo, o fibritina derivada de bacteriófago T4, más preferiblemente GCN4, y CMP, particularmente preferiblemente CMP, porque una proteína fusionada del Knob con tales polipéptidos puede obtenerse como una proteína soluble en alto rendimiento, y tiene un efecto inductor de anticuerpos IH deseable.
El polipéptido que tiene una unidad formadora de espiral GCN4 incluye un polipéptido dimérico que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, un polipéptido trimérico formado por las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 28 a 30, y un polipéptido consistente en una secuencia de aminoácidos obtenida tras la supresión, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos en dichas secuencias de aminoácidos. El polipéptido que tiene una unidad formadora de espiral GCN4 también incluye un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% homóloga a las secuencias de aminoácidos anteriores. Se prefiere la forma trimérica, y un polipéptido consistente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 es especialmente preferible.
El polipéptido que tiene una unidad de formación de espiral en espiral CMP incluye un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, y un polipéptido consistente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 con la supresión, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos. El polipéptido que tiene una unidad formadora de espiral CMP también incluye un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% homóloga a las secuencias de aminoácidos anteriores.
La secuencia de ADN que codifica el polipéptido que tiene una unidad formadora de espiral en espiral CMP incluye la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 32, una secuencia de ADN de, por ejemplo, SEQ ID NO: 33 cuyos codones se han optimizado para la expresión en Escherichia coli, una secuencia de ADN preparada añadiendo un sitio de corte de enzima de restricción adecuado a estas secuencias de ADN, y una secuencia de ADN obtenida tras la supresión, sustitución o adición de una o varias bases en las secuencias de ADN anteriores. La secuencia de ADN que codifica el polipéptido que tiene una unidad formadora de espiral CMP también incluye una secuencia de ADN que es al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% homóloga a las secuencias de ADN anteriores.
En la proteína fusionada de la presente invención, el polipéptido que tiene una unidad formadora de espiral de, por ejemplo, GCN4 y CMP puede fusionarse al lado N-terminal o al lado C-terminal del Knob. Por ejemplo, cuando la unidad formadora de espiral es un CMP, puede obtenerse un efecto inductor de anticuerpos IH independientemente de si el polipéptido está fusionado al lado N-terminal o al lado C-terminal del Knob. Por otra parte, cuando se utiliza GCN4, se obtiene un mayor efecto inductor de anticuerpos IH cuando el polipéptido se fusiona con el lado N-terminal del Knob. El péptido que tiene una unidad formadora de espiral y el Knob son adyacentes entre sí. Sin embargo, se puede insertar un espaciador, como una secuencia enlazadora, entre las dos para reducir la interacción intermolecular entre estas regiones. Dicha secuencia enlazadora no está particularmente limitada, y puede utilizarse, por ejemplo, una secuencia combinada de GPGP(GP)2 o GGGGS(G4S). También es posible utilizar una secuencia con una a cuatro repeticiones (G4S) ((G4S)1 a (G4SM como secuencia enlazadora, opcionalmente en combinación con (GP)2. La secuencia puede ser una secuencia de etiqueta Hisx6 (Ha). Ejemplos preferidos de la secuencia enlazadora, o una combinación de la secuencia de etiqueta y la secuencia enlazadora incluyen (G4S)<i>, (G4S)2, (G4S)2Ha(G4S)2, y (G4S)2Ha(G4S)i (G3S)i . La secuencia de etiquetado puede añadirse al terminal N o al terminal C de la proteína fusionada.
Un ejemplo de la proteína fusionada de la presente invención es una proteína fusionada Knob-GCN4 (por ejemplo, SEQ ID NO: 13 (secuencia de aminoácidos), SEQ ID NO: 14 (secuencia de ADN)) en el que se añade un polipéptido con una unidad GCN4 en espiral al lado C-terminal del Knob con la secuencia enlazadora ((G4S)2) insertada entre los dos, y la secuencia marcadora (Ha) unida al C-terminal. Otro ejemplo es una proteína fusionada GCN4-Knob (por ejemplo, SEQ ID NO: 21 (secuencia de aminoácidos), SEQ ID NO: 22 (secuencia de ADN)) en el que un polipéptido con una unidad GCN4 en espiral se dispone en el lado N-terminal del Knob con la secuencia de enlace ((G4S)1) insertada entre los dos, y una secuencia de etiqueta (He) unida al terminal C. La proteína fusionada de la presente invención incluye no sólo una proteína representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 o 21, sino un polipéptido consistente en una secuencia de aminoácidos obtenida tras la supresión, sustitución o adición de uno a 9 aminoácidos en estas secuencias de aminoácidos.
Otros ejemplos de la proteína fusionada de la presente invención incluyen una proteína fusionada (por ejemplo, SEQ ID NO: 23 (secuencia de aminoácidos), SEQ ID NO: 24 (secuencia de ADN)) en el que un polipéptido que tiene una unidad de formación de espiral CMP está unido al lado C-terminal del Knob con una secuencia de etiqueta (Ha) y una secuencia de enlace ((G4S)2) insertada entre los dos, y una proteína fusionada (por ejemplo, SEQ ID NO: 25 (secuencia de aminoácidos), SEQ ID NO: 2a (secuencia de ADN)) en el que un polipéptido con una unidad de formación de espiral CMP está unido al terminal N del Knob con una combinación de secuencia de etiqueta y secuencia de enlace ((G4S)2Ha(G4S)1(G3S)1) insertada entre los dos. La proteína fusionada de la presente invención incluye no sólo una proteína representada por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 ó 25, sino un polipéptido consistente en una secuencia de aminoácidos obtenida tras la supresión, sustitución o adición de uno a 9 aminoácidos en dichas secuencias de aminoácidos.
Para la fusión del polipéptido que tiene una unidad formadora de espiral y el Knob, estos pueden expresarse después de unirse entre sí mediante ingeniería genética. En un procedimiento ejemplar, se crea un vector de expresión que a
coloca la secuencia de ADN de la unidad formadora de espiral y la secuencia de ADN del Knob adyacentes entre sí, y el vector de expresión se introduce en un huésped adecuado para expresar la proteína fusionada. La secuencia de ADN de la unidad formadora de espiral puede estar situada en el extremo 5' o en el extremo 3' de la secuencia de ADN del Knob. Al crear el vector de expresión, las secuencias de ADN de una secuencia enlazadora y/o una secuencia marcadora pueden insertarse entre la secuencia de ADN de la unidad formadora de espirales y la secuencia de ADN del Knob, o pueden añadirse al extremo 5' o al extremo 3' de la secuencia de ADN. En un procedimiento ejemplar, puede crearse un vector de expresión en el que la secuencia de ADN del Knob, las secuencias de ADN de la secuencia de la etiqueta y/o la secuencia del enlazador, y la secuencia de ADN de la unidad formadora de espiral en espiral se disponen a partir del extremo 5'.
Las secuencias de ADN pueden obtenerse por síntesis química y utilizarse como plantillas para la amplificación mediante una técnica conocida de amplificación génica. A continuación, las secuencias de ADN pueden incorporarse a un vector de expresión utilizando diversas enzimas de restricción para crear un vector de expresión recombinante. Preferiblemente, el oligonucleótido utilizado para la amplificación génica se diseña de forma que hibride en el extremo 5' o en el extremo 3' de la secuencia de ADN molde, y que se añadan sitios de corte para enzimas de restricción. El ADN molde puede amplificarse mediante una técnica conocida de amplificación génica, utilizando, por ejemplo, el oligonucleótido, el ADN molde y una ADN polimerasa. Tras tratar la secuencia de ADN amplificada y el vector de expresión con enzimas de restricción, éstos pueden ligarse entre sí con una ADN ligasa adecuada para construir un vector de expresión recombinante en el que se inserte la secuencia de ADN diana. La presente invención también incluye un vector de expresión recombinante de este tipo.
Ejemplos del vector de expresión incluyen vectores plasmídicos, vectores fago, vectores virales y vectores cromosómicos artificiales. Los vectores plasmídicos son los preferidos por su facilidad de manejo y su coste. Por ejemplo, cuando el hospedador es Escherichia coli, el vector de expresión puede ser, por ejemplo, un pFN6A (HQ) Flexi Vector (Promega), un pFN7A (HQ) Flexi Vector (Promega), un pFN2A (G<s>T) Flexi Vector (Promega), un pET-15b (MERCK), un pET-21d (MERCK), un pUC57 (GenScript), un pET-22b (MERCK), un pET-21d (MERCK), o un vector pCold (Takara Bio). En el caso de los mamíferos, el vector de expresión puede ser, por ejemplo, un pF4A CMV Flexi Vector (Promega), un pF5A CMV-neo Flexi Vector (Promega), un pF9A CMV hRluc-neo Flexi Vector (Promega), o un pCI-neo Mammalian Expression Vector (Promega) . El vector de expresión puede incluir un origen de replicación, una secuencia promotora con una función reguladora de la expresión génica, una secuencia reguladora, como una secuencia potenciadora, y una secuencia marcadora de selección.
Ejemplos de la secuencia promotora incluyen promotores de bacterias, incluyendo los promotores lacI y lacZ de E. coli, los promotores T3 y<t>7, el promotor gpt, los promotores lambda PR y PL, el promotor tac, y los promotores trp y trc. Con respecto a la secuencia promotora, entre los ejemplos de promotores de células eucariotas adecuados conocidos se incluyen el promotor inmediato del citomegalovirus (CMV), el promotor de la timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV), el promotor temprano y tardío del virus simio (SV) 40, y el promotor de repetición terminal larga (LTR) de retrovirus, incluido, por ejemplo, el promotor del virus del sarcoma de Rous (RoSV), y promotores de metalotioneína como el promotor de metalotioneína-I.
Para la expresión de la proteína fusionada utilizando células eucariotas superiores como huésped, se puede insertar una secuencia potenciadora en el vector de expresión para mejorar la actividad de transcripción. La secuencia potenciadora actúa para aumentar la actividad de transcripción del promotor en un tipo de célula huésped predeterminado. Ejemplos del potenciador incluyen el potenciador de SV40, el potenciador del promotor temprano de CMV, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, el potenciador de p actina y el potenciador de adenovirus.
Ejemplos del marcador de selección incluyen el gen resistente a la ampicilina de Escherichia coli, el gen trpl de Saccharomyces Cerevisiae y el gen resistente a la neomicina de células de mamífero.
La presente invención incluye un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia de ADN que codifica la proteína fusionada de la presente invención. El fragmento de ácido nucleico de la presente invención incluye un fragmento de ácido nucleico en el que la secuencia de ADN de la unidad de formación de espiral y la secuencia de ADN del Knob son contiguas, y un fragmento de ácido nucleico en el que la secuencia de ADN de una secuencia de etiqueta y/o una secuencia de enlace se inserta entre la secuencia de ADN de la unidad de formación de espiral y la secuencia de ADN del Knob. Por ejemplo, el fragmento de ácido nucleico incluye el fragmento de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14, 24, 26 o 28.
La secuencia completa del fragmento de ácido nucleico de la presente invención puede obtenerse mediante síntesis química. El fragmento de ácido nucleico de la presente invención también puede obtenerse uniendo una parte del fragmento de ácido nucleico y el resto del fragmento de ácido nucleico mediante el uso de una técnica conocida de recombinación génica después de obtener estos fragmentos parciales de ácido nucleico por síntesis química. Por ejemplo, tras la síntesis química de la secuencia de ADN del Knob o de la unidad formadora de espirales, éstas se amplifican mediante una técnica conocida de amplificación génica y se insertan en vectores de clonación independientes. A continuación, la secuencia de ADN del Knob o la secuencia de ADN de la unidad que forma el espiral enrollado se corta del vector de clonación con enzima de restricción y se inserta en un vector de expresión que ha sido tratado con enzima de restricción de la misma manera para crear un vector de expresión recombinante. El vector está diseñado para que estos fragmentos se dispongan de forma contigua al ser insertados. A continuación, el vector de expresión recombinante puede cortarse con una enzima de restricción o similar para obtener un fragmento de ácido nucleico que contenga la secuencia de ADN unida de la unidad formadora de espiral y el Knob. Para la producción del fragmento de ácido nucleico utilizando este procedimiento, la secuencia de ADN de una secuencia de etiqueta o una secuencia de enlace puede insertarse entre las secuencias de ADN de la unidad formadora de espiral y el Knob para crear un vector de expresión, y obtener el fragmento de ácido nucleico.
El vector de expresión creado de la manera descrita anteriormente puede utilizarse para transformar un hospedador y obtener un transformante que contenga el vector de expresión. El huésped puede ser un huésped conocido, por ejemplo, como Escherichia coli, levaduras, líneas celulares de mamíferos, células de insectos y plantas. Algunos ejemplos de Escherichia coli son la cepa BL21 y DH5a. Algunos ejemplos de levaduras son Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae. Ejemplos de células de mamífero incluyen las células CHO, las células HEK293 y las células COS-1/-7.
El vector de expresión puede introducirse en el hospedador utilizando un procedimiento conocido, como puede seleccionarse según el hospedador. Algunos ejemplos de estos procedimientos son el método del fosfato cálcico, la electroporación y la lipofección. Tras la transfección, el huésped puede cultivarse en un medio que contenga un marcador de selección para seleccionar un transformante que haya incorporado el vector de expresión en la célula huésped.
Tras la proliferación del transformante en condiciones adecuadas, puede inducirse un promotor seleccionado en condiciones específicas (pH, temperatura, adición de compuestos) para producir la proteína fusionada. La proteína fusionada expresada se acumula en las células o es secretada por ellas.
Para la expresión utilizando un huésped Escherichia coli, la proteína fusionada puede expresarse en una fracción de cuerpo de inclusión. El cuerpo de inclusión puede recogerse de la Escherichia coli utilizando un procedimiento, por ejemplo, como la disrupción ultrasónica, la homogeneización a alta presión y un procedimiento que utilice un BugBuster (Merck) .
La proteína fusionada de la presente invención obtenida de la manera descrita anteriormente puede utilizarse como monómero. Sin embargo, es más preferible utilizar la proteína fusionada de la presente invención como un multímero porque permite inducir anticuerpos de elevado efecto IH. Tales multímeros de la proteína fusionada son, por ejemplo, dímeros, trímeros y multímeros de orden superior, e incluyen una mezcla de tales multímeros . Por ejemplo, la proteína fusionada se obtiene como un multímero cuando la proteína fusionada se expresa utilizando, por ejemplo, GCN4 o CMP como el polipéptido que tiene una unidad formadora de espiral. Sin embargo, el multímero puede someterse a un proceso de replegado conocido, según sea necesario.
La proteína fusionada de la presente invención es una proteína en la que el polipéptido que tiene una unidad formadora de espiral está fusionado al Knob, en la que las secuencias de ADN codificantes son adyacentes entre sí o comprenden una secuencia de enlace y/o etiqueta entre ellas.
La proteína fusionada y un multímero de la misma obtenidos de la manera descrita anteriormente pueden aislarse y purificarse utilizando un medio de purificación común. Ejemplos de dichos medios de purificación incluyen diversas técnicas de purificación, como la cromatografía de afinidad, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de interacción hidrofóbica y la cromatografía de filtración en gel.
La presente invención incluye una vacuna para el EDS en la que la proteína fusionada de la presente invención, y/o un multímero de la proteína fusionada están contenidos como ingredientes activos. Preferiblemente, la vacuna de la presente invención contiene un multímero de la proteína fusionada. Preferiblemente, el multímero es un dímero, un trímero o un multímero de orden superior, o una mezcla de tales multímeros.
Preferiblemente, la vacuna para el EDS contiene la proteína fusionada, y/o un multímero de la proteína fusionada en una cantidad de 0,3 a 10 |jg por dosis.
La vacuna de la presente invención puede contener un portador farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de tales portadores incluyen salmuera, salmuera tamponada, dextrosa, agua, glicerol, tampón acuoso isotónico y combinaciones de los mismos. Éstos pueden mezclarse adecuadamente con aditivos, por ejemplo, como adyuvantes, emulsionantes, conservantes, agentes tonificantes y ajustadores del pH.
Ejemplos de adyuvantes incluyen adyuvantes oleosos, acetato de tocoferol, alumbre, saponinas (QS21, ISCOM) y CpG oligo.
La vacuna de la presente invención puede mezclarse con un antígeno para prevenir la infección del pollo, además de contener la proteína fusionada. Ejemplos de estas infecciones son la enfermedad de Newcastle, la bronquitis infecciosa del pollo, la coriza infecciosa, la bursitis infecciosa del pollo, la infección por reovirus, la infección por micoplasma y la infección por salmonela.
La vacuna de la presente invención puede administrarse a través de cualquier vía de administración, incluida la administración transdérmica, la administración sublingual, la administración oftálmica, la administración intracutánea, la administración intramuscular, la administración oral, la administración enteral, la administración transnasal, la administración intravenosa, la administración subcutánea, la administración intraperitoneal y la inhalación boca a pulmón.
Con respecto a la relación entre el título de anticuerpos y la protección en las vacunas convencionales contra el EDS, se considera que la protección es posible cuando el título de anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación (título de anticuerpos IH) es de al menos 16 veces. Sin embargo, se confirmó que la vacuna de la presente invención puede mejorar en gran medida el título de anticuerpos IH por encima de este valor cuando se administra a un pollo, y prevenir eficazmente la aparición de EDS.
La presente invención incluye un kit que comprende la proteína fusionada y/o un multímero de la proteína fusionada, en el que el kit es para medir un nivel de anticuerpos contra la región del Knob del EDSV en una muestra de ensayo. El kit que comprende la proteína fusionada de la presente invención puede ser una placa con la proteína fusionada inmovilizada en ella. Se aplica una muestra de prueba a la placa, y la proteína fusionada en la placa reacciona con los anticuerpos contenidos en la muestra de prueba. Se aplican anticuerpos secundarios marcados con una enzima o una sustancia fluorescente, que reaccionan con los anticuerpos primarios. Se puede añadir un sustrato enzimático, según sea necesario, y se puede detectar el producto de la reacción enzimática o la cantidad de fluorescencia para medir cuánto anticuerpo contiene la muestra de ensayo. El kit de la presente invención puede utilizarse para evaluar la eficacia de una vacuna inmunizando a un pollo con una vacuna que contenga la proteína fusionada y/o un multímero de la proteína fusionada como ingredientes activos, y detectando la presencia o ausencia de anticuerpos derivados de la vacuna.
La presente invención incluye una vacuna de ADN para el EDS que comprende el fragmento de ácido nucleico o el vector de expresión recombinante como principio activo, tal como se ha mencionado anteriormente. En la vacuna de ADN de la presente invención, el fragmento de ácido nucleico o el vector de expresión recombinante comprende preferentemente una secuencia promotora para expresar la proteína fusionada tras la inmunización de un pollo.
Después de una prueba de provocación de un pollo realizada con EDSV antes y después de la inoculación de la vacuna de ADN de la presente invención al pollo, el fragmento de ácido nucleico o el vector de expresión recombinante que ha reducido significativamente los síntomas asociados con el EDS puede seleccionarse como ingrediente activo de un agente terapéutico del EDS, y la cantidad de ingrediente activo puede especificarse a partir de la dosis.
La vacuna de ADN de la presente invención puede contener un portador farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de tales portadores incluyen salmuera, salmuera tamponada, dextrosa, agua, glicerol, tampón acuoso isotónico y combinaciones de los mismos. Éstos pueden mezclarse adecuadamente con aditivos, como adyuvantes, emulgentes, conservantes, agentes tonificantes y ajustadores del pH.
La vacuna de ADN de la presente invención puede administrarse a través de cualquier vía de administración, incluida la administración transdérmica, la administración sublingual, la administración oftálmica, la administración intracutánea, la administración intramuscular, la administración oral, la administración enteral, la administración transnasal, la administración intravenosa, la administración subcutánea, la administración intraperitoneal y la inhalación de boca a pulmón. También se describe en el presente documento, pero no forma parte de la invención, un anticuerpo que se une a la proteína fusionada y/o a un multímero de la proteína fusionada. La producción de anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales, o sus homólogos humanos se hace posible cuando la proteína fusionada de la presente invención, y/o un multímero de la proteína fusionada se utilizan como antígenos de acuerdo con un procedimiento de inmunización común (Current Protocols in Molecular Biology, Antibody Engineering: A Practical Approach, Editado por J. McCaffertyy otros, oAntibody Engineering, Segunda edición, Editado por Carl A.K. Borrebaeck). Los anticuerpos que se unen a la proteína fusionada y/o a un multímero de la misma también pueden crearse utilizando un procedimiento de producción de anticuerpos basado en una técnica de visualización de fagos (Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Editado por Brian K. Kay y otros, Antibody Engineering: A Practical Approach, Editado por J. McCafferty y otros, o Antibody Engineering, Segunda edición, Editado por Carl A. K. Borrebaeck). El anticuerpo tiene un uso potencial como agente terapéutico para el EDS, un kit o un portador para cromatografía de afinidad, como se describe a continuación.
Adicionalmente divulgado pero no parte de la invención, es un kit que incluye un anticuerpo que se une a la proteína fusionada, y/o a un multímero de la proteína fusionada, y para medir el contenido de la región Knob del EDSV en una muestra de ensayo. El kit incluye un kit en el que un anticuerpo que se une a la proteína fusionada se inmoviliza en, por ejemplo, una placa. El kit que incluye el anticuerpo se divulga para evaluar la presencia o ausencia de infección por el EDSV, utilizando el contenido Knob como índice. Por ejemplo, se aplica una muestra de ensayo a una placa que tiene el anticuerpo inmovilizado en ella, y se aplican anticuerpos marcados con colorantes enzimáticos o fluorescentes. Tras la incubación, se lava la placa y se añade un sustrato cromogénico, según sea necesario. A continuación, se mide la cantidad de fluorescencia para evaluar el contenido de Knob en la muestra de ensayo.
Ejemplos de la placa incluyen la Nunc immunoplate MaxiSorp (Thermo scientific), la placa ELISA (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), la ELISPOT (MERCK), la inmunoplaca (Cosmo Bio Co., Ltd.), la placa Elisa (IWAKi), y la placa ELISA (ExtraGene). El anticuerpo puede fijarse a la placa mediante procedimientos comúnmente practicados por un experto en la materia.
Ejemplos del procedimiento utilizado para etiquetar anticuerpos con una enzima o un colorante fluorescente incluyen los kits de conjugación de anticuerpos EasyLink (abcam), el sistema de conjugación rápida Lightning-Link (Innova Biosciences Ltd), el kit de etiquetado de anticuerpos Oyster (Luminartis GmbH), el kit de etiquetado enzimático EZ-Link (PIERCE Biotechnology), el kit de etiquetado de proteínas Platinum Link (Kreatech Biotechnology BV) y el kit de etiquetado de anticuerpos DyLight (PIERCE Biotechnology).
Ejemplos
A continuación se describe la presente invención con mayor detalle, haciendo referencia a los Ejemplos. Sin embargo, la presente invención no está limitada en modo alguno por las siguientes descripciones.
Ejemplo 1
Preparación de la proteína Knob-GCN4 y de su multímero
(1) Construcción del vector de expresión Knob-GCN4
El ADN genómico se extrajo de la cepa del EDSV KE-80 de la siguiente manera. Tras inocular el virus en el interior de la cavidad alantoidea de un huevo en estado embrionario de un pato de 9 días, el líquido alantoideo recogido el día 6 de la inoculación se añadió a una solución de pronasa a la que se había añadido proteinasa K (1 mg/ml). A continuación, la mezcla se agitó a 50°C durante 1 h, y se volvió a agitar durante toda la noche a 37°C. A continuación, se eliminaron las proteínas mediante fenol/cloroformo, se precipitó con etanol y se trató con RNasa A (Qiagen) para extraer el ADN genómico del virus.
Utilizando el ADN genómico del virus extraído como molde, un fragmento de ADN (SEQ ID NO: 6) que codifica la región Knob de la proteína fibra y una parte de 8 repeticiones de la región eje (SEQ ID NO: 5) se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando un cebador de la cadena del sentido con una secuencia de reconocimiento NcoI (SEQ ID NO: 3) y un cebador de la cadena antisentido con una secuencia de reconocimiento XhoI (SEQ ID NO: 4) . El fragmento de ADN amplificado y un plásmido pET-15b (Merck) se cortaron con las enzimas de restricción NcoI y XhoI, y se ligaron entre sí con ADN ligasa. A continuación, el producto ligado se introdujo en Escherichia coli DH5a. El plásmido resultante de la Escherichia coli se obtuvo como vector intermedio 1.
Para la expresión en Escherichia coli de un polipéptido que tiene una secuencia enlazadora (G4S)2 añadida a una unidad formadora de espiral en espiral trivalente GCN4 (en adelante, "GCN4") de una proteína GCN4 modificada (NCBI#: 1CZQ_A) (en lo sucesivo, el polipéptido se denominará "(G4S)2-GCN4"; SEQ ID NO: 7), se optimizaron los codones de la secuencia de ADN que codifica el (G4S)2-GCN4, y se obtuvo una secuencia de ADN (SEQ ID NO: 8) diseñado para incluir una secuencia de reconocimiento 5' NcoI y una secuencia de reconocimiento 3' XhoI para su clonación en un vector de expresión. El ADN sintetizado y un plásmido pET-21d (Merck) se cortaron con las enzimas de restricción NcoI y XhoI, y se ligaron entre sí con ADN ligasa. A continuación, el producto ligado se introdujo en Escherichia coli DH5a. El plásmido resultante de la Escherichia coli se obtuvo como vector intermedio 2.
Utilizando el vector intermedio 1 como molde, se obtiene un fragmento de ADN (SEQ ID NO: 12) que codifica el Knob (SEQ ID NO: 11) se amplificó mediante PCR utilizando un cebador de la cadena del sentido con una secuencia de reconocimiento de NcoI (SEQ ID NO: 9) y un cebador de la cadena antisentido con una secuencia de reconocimiento NcoI (SEQ ID NO: 10) . El fragmento de ADN amplificado y el vector intermedio 2 se cortaron con la enzima de restricción NcoI y se ligaron entre sí con ADN ligasa. A continuación, el producto ligado se introdujo en Escherichia coli DH5a. El plásmido resultante de la Escherichia coli se obtuvo como pKNOB2. El pKNOB2 incluye una secuencia de ADN (Se Q ID NO: 14) que codifica un polipéptido (en lo sucesivo, "Knob-GCN4"; SEQ ID NO: 13; FIG. 1) compuesto por el Knob, la secuencia enlazadora (G4S)2 , el GCN4 y la secuencia de etiqueta Hisx6 (Ha). El pKNOB2 se introdujo en Escherichia coli BL21 (DE3) (Merck) para obtener una cepa E. coli KNOB2 que expresara Knob-GCN4.
(2) Cultivo de Escherichia coli recombinante y purificación de la proteína expresada
Se dosificaron 10 mL de medio LB y una solución de ampicilina (concentración final de 100 pg/ml) en un matraz Erlenmeyer de 200 mL, y se inoculó la cepa E. coli KNOB2 que expresa Knob-GCN4, y se agitó a 37°C durante unas 14 h (precultivo) . se dosificaron 250 mL de medio LB y una solución de ampicilina (concentración final de 100 pg/ml) en un matraz Erlenmeyer de 2 L, se inocularon 5 ml de la solución bacteriana de precultivo y se agitó a 37°C hasta que la DO590 superó 0,6. Cuando la DO590 del cultivo principal superó 0,6, se añadió isopropil-p-D-galactopiranósido (IPTG) hasta alcanzar una concentración final de 1 mM, y las células se agitaron a 37°C durante 4 h. La solución del cultivo principal se transfirió a un tubo de centrífuga y se centrifugó a 8.000 rpm a 4°C durante 30 minutos. A continuación, se recogió el sedimento bacteriano resultante.
Se añadieron dos tabletas del cóctel completo de inhibidores de proteasa (Roche) a 50 mL de BugBuster Master Mix (Novagen) para obtener una solución de disrupción celular. El sedimento bacteriano se suspendió en la solución de disrupción celular, se incubó a temperatura ambiente durante 60 minutos y se disgregó por ultrasonidos (en hielo, Output 4, Duty 70%, 10 min * 3 veces) . La solución disgregada se centrifugó (15.000 rpm, 4°C, 30 min) y se recogió el sobrenadante (fracción soluble).
La proteína de antígeno recombinante contenida en la fracción soluble se purificó utilizando una columna HisTrap HP, 5ml (GE Healthcare) según el protocolo del fabricante adjunto a la columna. La fracción soluble se aplicó a la columna tras añadir 20 mM (concentración final) de imidazol a la solución, y la columna se eluyó con un tampón que contenía 500 mM (concentración final) de imidazol tras lavar la columna con un tampón que contenía 20 mM (concentración final) de imidazol. La fracción de elución resultante se concentró con Amicon Ultra-15 10K (Millipore), y el componente tampón se desplazó con PBS mediante diálisis para obtener antígenos Knob-GCN4.
Ejemplo 2
Preparación de la proteína GCN4-Knob y de su multímero
(1) Construcción del vector de expresión GCN4-Knob
Utilizando el vector intermedio 2 como molde, se obtiene un fragmento de ADN (SEQ ID NO: 18) que codifica un polipéptido que contiene GCN4 y una secuencia enlazadora (G<4>S<)1>añadida al mismo (en lo sucesivo, el polipéptido se denominará "GCN4-(G4S)-i"; SEQ ID NO: 17) se amplificó mediante PCR, utilizando un cebador de la cadena del sentido que tenía una secuencia de reconocimiento de NcoI (SEQ ID NO: 15) y un cebador de la cadena antisentido con una secuencia de reconocimiento XhoI (SEQ ID NO: 16) . El fragmento de ADN amplificado y un plásmido pET-21d (Merck) se cortaron con las enzimas de restricción NcoI y XhoI, y se ligaron entre sí con ADN ligasa. A continuación, el producto ligado se introdujo en Escherichia coli DH5a. El plásmido resultante de la Escherichia coli se obtuvo como vector intermedio 3.
Utilizando el vector intermedio 1 como molde, un fragmento de ADN (SEQ ID NO: 12) que codifica el Knob (SEQ ID NO: 11) se amplificó mediante PCR, utilizando un cebador de la cadena del sentido que tenía una secuencia de reconocimiento XhoI (SEQ ID NO: 19) y un cebador de la cadena antisentido con una secuencia de reconocimiento XhoI (SEQ ID NO: 20) . El fragmento de ADN amplificado y el vector intermedio 3 se cortaron con la enzima de restricción XhoI y se ligaron entre sí con ADN ligasa. El producto ligado se introdujo en Escherichia coli DH5a. El plásmido resultante de la Escherichia coli se obtuvo como pKNOB3. El pKNOB3 tiene una secuencia de ADN (SEQ IDNO: 22) que codifica un polipéptido compuesto por el GCN4, la secuencia enlazadora (G<4>S<)1>, el Knob y la secuencia marcadora hexámero de histidina (el polipéptido se denominará "GCN4-Knob"; SEQ<i>D NO: 21; FIG. 1). El pKNOB3 se introdujo en Escherichia coli BL21 (DE3) (Merck) para obtener una cepa E. coli KNOB3 que expresara GCN4-Knob.
(2) Se cultivó la Escherichia coli recombinante, y la proteína expresada se purificó de la misma manera que en el Ejemplo 1 para obtener antígenos GCN4-Knob.
Ejemplo 3
Preparación de la proteína Knob-CMP y de un multímero de la misma
(1) Construcción del vector de expresión Knob-CMP
Para la expresión en Escherichia coli de un polipéptido compuesto por el Knob, una secuencia enlazadora (G<4>S)<2>H<6>(G<4>S<)2>y una unidad trivalente formadora de espiral de una proteína CMP (NCBI#: NP_001025546) (en lo sucesivo, el polipéptido se denominará "Knob-CMP"; SEQ ID NO: 23; FIG. 1), se optimizaron los codones de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido, y se obtuvo una secuencia de ADN (s Eq ID NO: 24) diseñado para incluir una secuencia de reconocimiento 5' Ndel, una secuencia de reconocimiento 3' BamHI y bases protectoras 5' y 3' para su clonación en un vector de expresión. El ADN sintetizado y un plásmido pUC57 (GenScript Inc.) cortado con la enzima de restricción EcoRV se ligaron entre sí con ADN ligasa . A continuación, el producto ligado se introdujo en Escherichia coli DH5a. El plásmido resultante de la Escherichia coli se obtuvo como vector intermedio 4.
El vector intermedio 4 se cortó con las enzimas de restricción Ndel y BamHI para obtener un fragmento de ADN que codifica Knob-CMP. El fragmento de ADN y un plásmido pET-11a (Merck) cortado con las enzimas de restricción Ndel y BamHI se ligaron entre sí con ADN ligasa. El producto ligado se introdujo en Escherichia coli DH5a. El plásmido resultante de la Escherichia coli se obtuvo como pKNOB4. A continuación, el pKNOB4 se introdujo en Escherichia coli BL21 (DE3) (Merck) para obtener una cepa E. coli KNOB4 que expresara Knob-CMP
(2) Se cultivó la Escherichia coli recombinante, y la proteína expresada se purificó de la misma manera que en el Ejemplo 1 para obtener antígenos Knob-CMP
Ejemplo 4
Preparación de la proteína CMP-Knob y de un multímero de la misma
(1) Construcción del vector de expresión CMP-Knob9
Para la expresión en Escherichia coli de un polipéptido compuesto por un CMP, una secuencia enlazadora (G<4>S)<2>H<6>(G<4>S)<i>(G<3>S)<i>y el Knob (en lo sucesivo, el polipéptido se denominará "CMP-Knob "; SEQ ID NO: 25; FIG. 1), se optimizaron los codones de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido, y se obtuvo una secuencia de ADN (SEQ ID NO: 26) diseñado para incluir una secuencia de reconocimiento 5' NdeI, una secuencia de reconocimiento 3' BamHI y bases protectoras 5' y 3' para su clonación en un vector de expresión. El ADN sintetizado y un plásmido pUC57 (GenScript Inc.) cortado con la enzima de restricción EcoRV se ligaron entre sí con ADN ligasa. A continuación, el producto ligado se introdujo en Escherichia coli DH5a. El plásmido resultante de la Escherichia coli se obtuvo como vector intermedio 5.
El vector intermedio 5 se cortó con las enzimas de restricción NdeI y BamHI para obtener un fragmento de ADN que codifica CMP-Knob. El fragmento de ADN y un plásmido pET-11a(Merck) cortado con las enzimas de restricción NdeI y BamHI se ligaron entre sí con ADN ligasa. El producto ligado se introdujo en Escherichia coli DH5a. El plásmido resultante de la Escherichia coli se obtuvo como pKNOB5. A continuación, el pKNOB5 se introdujo en Escherichia coli BL21 (DE3) (Merck) para obtener una cepa E. coli KNOB5 que expresara CMP-Knob.
(2) Se cultivó la Escherichia coli recombinante, y la proteína expresada se purificó de la misma manera que en el Ejemplo 1 para obtener antígenos CMP-Knob.
Ejemplo comparativo 1
Preparación de la proteína Knob y de un multímero de la misma(1) Construcción del vector de expresión Knob
Para la expresión en Escherichia coli de un polipéptido (SEQ ID NO: 1; FIG. 1) preparado mediante la adición de una secuencia de etiqueta hexámero de histidina a la región Knob de la proteína de fibra del EDSV, se optimizaron los codones de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido, y una secuencia de ADN (SEQ ID NO: 2) fue sintetizada artificialmente y diseñada para incluir una secuencia de reconocimiento 5' NdeI y una secuencia de reconocimiento 3' BamHI para su clonación en un vector de expresión. El ADN sintetizado y un plásmido pET-11a (Merck) se cortaron con las enzimas de restricción NdeI y BamHI, y se ligaron entre sí con ADN ligasa. El producto ligado se introdujo en Escherichia coli DH5a. El plásmido resultante de la Escherichia coli se obtuvo como pKNOB1. A continuación, el pKNOB1 se introdujo en Escherichia coli BL21 (DE3) (Merck) para obtener una cepa E. coli KNOB1 que expresara Knob.
(2) Se cultivó la Escherichia coli recombinante, y la proteína expresada se purificó de la misma manera que en el Ejemplo 1 para obtener antígenos Knob.
Ejemplo de prueba 1
Las cinco proteínas antígeno recombinantes (Knob, GCN4-Knob, Knob-GCN4, CMP-Knob, y Knob-CMP) purificadas en los Ejemplos 1 a 4, y el Ejemplo comparativo 1 se cuantificaron con un kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce). Los resultados se presentan en la Tabla 1.
Habla 11
Ejemplo de prueba 2
Análisis de las propiedades de las proteínas recombinantes
Las cinco proteínas antigénicas recombinantes (Knob, GCN4-Knob, Knob-GCN4, CMP-Knob y Knob-CMP) purificadas en los Ejemplos 1 a 4 y el Ejemplo comparativo 1 se analizaron por SDS-PAGE. Las proteínas de antígenos recombinantes se mezclaron cada una con un tampón de muestra que no contenía ningún agente reductor, y las muestras de proteínas sometidas a un tratamiento de desnaturalización térmica a 100°C durante 5 min, y las muestras de proteínas sin tratamiento de desnaturalización térmica se aplicaron a los carriles correspondientes en un gel de trisglicina de concentración uniforme al 12,5% (Atto, E-R12.5L) en 2 pg/carril, y se electroforaron a 10 mA durante 130 min. La tinción de CBB se realizó con Ez Stain Aqua (Atto, AE-1340). Para transferencia Western, las proteínas de la muestra se transfirieron a una membrana de PVDF siguiendo un procedimiento ordinario. Se realizó una reacción de anticuerpo primario con una dilución 1:100 de suero de pollo con proteína anti-Knob. Se realizó una reacción de anticuerpo secundario con una dilución 1:4.000 de anticuerpo IgG antipollo, conjugado con HRP (Chicken IgG (IgY)-heavy and light chain Antibody, Bethyl Laboratories). La reacción de anticuerpos secundarios fue seguida de una reacción de quimioluminiscencia utilizando un Western Lightning Plus-ECL (Perkin Elmer Life and Analytical Science), y la imagen luminiscente producida se registró con un Image Quant LAS4000 mini (GE Healthcare) . Se confirmó que las cinco proteínas antigénicas recombinantes formaban moléculas que se creía que eran trímeros (FIG. 2).
El análisis por filtración en gel se realizó con una columna HiLoad 16/60 Superdex 200 prepgrade (GE Healthcare) unida a AKTA Prime Plus (GE Healthcare). El caudal se fijó en 0,8 ml/min y se utilizó tampón PBS. Se utilizaron kits de calibración de filtración en gel LMW y HMW (GE Healthcare) como marcadores de peso molecular. El análisis confirmó que las cinco proteínas antígeno recombinantes formaban moléculas que se creía que eran trímeros (FIG.
3) .
Ejemplo de prueba 3
Evaluación de la inmunogenicidad del antígeno recombinante
(Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (ensayo IH))
Las cinco proteínas antígeno recombinantes (Knob, GCN4-Knob, Knob-GCN4, CMP-Knob y Knob-CMP) purificadas en los Ejemplos 1 a 4 y el Ejemplo comparativo 1 se utilizaron para inmunizar pollos, y se midieron los títulos de anticuerpos IH inducidos. Las vacunas se prepararon mezclando las proteínas recombinantes del antígeno con un adyuvante oleoso (una mezcla de parafina líquida ligera, monooleato de sorbitán y polisorbato 80) en una cantidad de 10 pg/0,5 mL en términos Knob. Como vacuna de control se utilizó el antígeno vacunal del EDSV (EB66), disponible en el mercado, del Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute. El EDSV cultivado con células EB66 se mezcló con un adyuvante oleoso (una mezcla de parafina líquida ligera, monooleato de sorbitán y polisorbato 80) en 1067 TCID50/0,5 mL o más para preparar una vacuna. Las vacunas se administraron a pollos SPF, de 29 días de edad, mediante inyección intramuscular de 0,5 mL de las vacunas en el músculo de la pata de los pollos . Transcurridas 7 semanas desde la inmunización, se extrajo sangre del pollo y el suero recogido se sometió al ensayo de IH. En el ensayo de IH, el suero problema se mezcló con caolín al 25% utilizado en 3 veces el volumen del suero (=dilución x 4) , y la mezcla se procesó durante 20 min a temperatura ambiente mientras se agitaba cada 5 min. La muestra obtenida tras la centrifugación realizada a 2.000 rpm durante 5 min se utilizó como muestra de medición. La muestra de medición se diluyó en serie dos veces con PBS (-), y se añadieron 0,025 mL de antígenos de HA preparados en 4 unidades/0,025 mL a 0,025 mL de la muestra diluida. La muestra se sensibilizó a temperatura ambiente durante 10 a 20 minutos. A continuación, se añadieron 0,05 mL de glóbulos rojos de pollo al 0,5% suspendidos en PBS, y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante 1 h. A continuación, se determinó el título de anticuerpos IH a partir de la imagen de hemaglutinación. La prueba confirmó que el título de anticuerpos IH inducidos era mayor en las proteínas antígeno recombinantes con la unidad formadora de multímeros, en particular los 3 tipos de proteínas antígeno recombinantes como la GCN4-Knob, la CMP-Knob y la Knob-CMP (FIG. 4).
Ejemplo de prueba 4
Prueba de confirmación del nivel efectivo de antígeno
Las proteínas antigénicas recombinantes (Knob-GCN4 y CMP-Knob) purificadas en los Ejemplos 1 y 4 se probaron para confirmar los niveles efectivos de antígeno para el pollo. Las vacunas se prepararon mezclando las proteínas antigénicas recombinantes (Knob-GCN4 y CMP-Knob) con un adyuvante oleoso (una mezcla de parafina líquida ligera, monooleato de sorbitán y polisorbato 80) en cantidades de 10 pg/0,5 mL.5 mL, 3 pg/0,5 mL, 1 pg/0,5 mL, y 0,3 pg/0,5 mL en términos de Knob, y se administraron a pollos SPF, de 29 días de edad, mediante inyección intramuscular de 0,5 mL de las vacunas en el músculo de la pata de los pollos. Transcurridas 7 semanas desde la inmunización, se extrajo sangre del pollo y el suero recogido se sometió al ensayo de IH. En el ensayo de IH, el suero problema se mezcló con caolín al 25% utilizado en 3 veces el volumen del suero (=dilución x 4), y la mezcla se procesó durante 20 min a temperatura ambiente mientras se agitaba cada 5 min. La muestra obtenida tras la centrifugación realizada a 2.000 rpm durante 5 min se utilizó como muestra de medición. La muestra de medición se diluyó en serie dos veces con PBS (-), y se añadieron 0,025 mL de antígenos de HA preparados en 4 unidades/0,025 mL a 0,025 mL de la muestra diluida. La muestra se sensibilizó a temperatura ambiente durante 10 a 20 minutos. A continuación, se añadieron 0,05 mL de glóbulos rojos de pollo al 0,5% suspendidos en PBS, y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante 1 h. A continuación, se determinó el título de anticuerpos IH a partir de la imagen de hemaglutinación. La prueba confirmó que las proteínas antígeno recombinantes Knob-GCN4 y CMP-Knob muestran un efecto inductor de anticuerpos IH deseable cuando se utilizan en 1 pg/0,5 mL o más, y 0,3 pg/0,5 mL o más, respectivamente (FIGS. 5 y 6) .
Ejemplo de prueba 5
Prueba de confirmación del efecto protector contra la infección letal por EDSV
La proteína antígeno recombinante (CMP-Knob) purificada en el Ejemplo 4 se probó para confirmar su efecto de protección contra el inicio de la infección letal por EDSV en pollos inmunizados con la proteína. Se preparó una vacuna mezclando la proteína antígeno recombinante (CMP-Knob) con un adyuvante oleoso (una mezcla de parafina líquida ligera, monooleato de sorbitán y polisorbato 80) en una cantidad de 10 pg/0,5 mL en términos de Knob. Como vacuna de control se utilizó el antígeno vacunal del EDSV (EB66), disponible en el mercado, del Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute. El EDSV cultivado con células EB66 se mezcló con un adyuvante oleoso (una mezcla de parafina líquida ligera, monooleato de sorbitán y polisorbato 80) en 1067 TCID5o/0,5 mL o más para preparar una vacuna. Las vacunas se administraron a gallinas comerciales (ponedoras), de unos 210 días de edad, mediante inyección intramuscular de 0,5 mL de las vacunas en la pata de las gallinas. Se recogió sangre en las semanas 4, 6, 9, 12 y 16 después de la inmunización, y el suero recogido se sometió al ensayo de IH. En el ensayo de IH, el suero problema se mezcló con un 25% de caolín utilizado en 3 veces el volumen del suero (=dilución x 4), y la mezcla se procesó durante 20 min a temperatura ambiente mientras se agitaba cada 5 min. La muestra obtenida tras la centrifugación realizada a 2.000 rpm durante 5 minutos se utilizó como muestra de medición. La muestra de medición se diluyó en serie dos veces con PBS (-), y se añadieron 0,025 mL de antígenos de HA preparados en 4 unidades/0,025 mL a 0,025 mL de la muestra diluida. La muestra se sensibilizó a temperatura ambiente durante 10 a 20 minutos. A continuación, se añadieron 0,05 mL de glóbulos rojos de pollo al 0,5% suspendidos en PBS, y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante 1 h. A continuación, se determinó el título de anticuerpos iH a partir de la imagen de hemaglutinación. Tras 16 semanas desde la inmunización, los pollos fueron infectados mediante la administración oral de una cepa letal del EDSV KE-80 en 1065 TCID<50>/pollo. Se observó la producción de huevos de las gallinas durante 4 semanas después de la provocación. La prueba confirmó que la proteína antigénica recombinante (CMP-Knob) mantiene altos títulos de anticuerpos IH durante 16 semanas después de la inmunización cuando se utiliza en 10 pg/0,5 mL (FIG. 7) . También se confirmó que los síntomas clínicos, como la pérdida de producción de huevos, y la producción anormal de huevos pueden reducirse en gran medida en los pollos inmunizados con la proteína antígeno recombinante (CMP-Knob), incluso cuando los pollos fueron inyectados con EDSV letal después de 16 semanas de la inmunización (FIG. 8).
Aplicabilidad industrial
La vacuna de la presente invención en la que una proteína recombinante y/o un multímero de la misma que contiene la región Knob del EDSV fusionada a un polipéptido que tiene una unidad de formación de espiral están contenidos como ingredientes activos puede inducir anticuerpos de elevado efecto IH al ser inoculada a un pollo, y puede prevenir la aparición del EDS en pollos. La invención permite prevenir la aparición del EDS en granjas con riesgo potencial de EDS. La vacuna de la presente invención puede producirse sin depender de huevos de patos domésticos, y puede suministrarse de forma estable.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína fusionada en la que la región Knob de una proteína de fibra del virus del síndrome de la caída de postura del huevo (EDSV) se fusiona con un polipéptido que tiene una unidad de formación de espiral, en la que el polipéptido que tiene una unidad de formación de espiral y la región Knob son adyacentes entre sí o comprenden una secuencia de enlace y/o etiqueta entre ellos, en la que la región Knob consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 11, o de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 con la supresión, sustitución o adición de 1 a 3 aminoácidos.
2. Una proteína fusionada en la que la región Knob de una proteína de fibra del virus (EDSV) del síndrome de la caída de postura del huevo (EDS) se fusiona con un polipéptido que tiene una unidad de formación en espiral, en el que el polipéptido que tiene una unidad de formación en espiral y la región Knob son adyacentes entre sí o comprenden un enlazador entre ellos, en la que la región Knob consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 11, o de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 con la supresión, sustitución o adición de 1 a 3 aminoácidos, en la que la proteína fusionada tiene además una secuencia de etiqueta, que se localiza N-terminal o C-terminal.
3. La proteína fusionada según la reivindicación 1 o 2, en la que la unidad formadora de espiral se deriva de una proteína nativa formadora de multímeros, en la que la proteína nativa formadora de multímeros es una GCN4 o una proteína de la matriz del cartílago (CMP), en la que la unidad formadora de espiral incluye un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos un 80% a SEQ ID NO: 27-31.
4. La proteína fusionada según la reivindicación 3, en la que la proteína nativa formadora de multímeros es la CMP.
5. La proteína fusionada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la proteína fusionada es un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 23, o un polipéptido consistente en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 con la supresión, sustitución o adición de 1 a 9 aminoácidos.
6. La proteína fusionada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la proteína fusionada es un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 25, o un polipéptido consistente en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 con la supresión, sustitución o adición de 1 a 9 aminoácidos.
7. La proteína fusionada según la reivindicación 3, en la que la proteína nativa formadora del multímero es la GCN4, en la que la GCN4 está unida al lado C-terminal del Knob.
8. La proteína fusionada según la reivindicación 7, en la que la proteína fusionada es un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 21, o un polipéptido consistente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 con la supresión, sustitución o adición de 1 a 9 aminoácidos.
9. Un multímero de proteína fusionada de la proteína fusionada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Un fragmento de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína fusionada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
11. Un vector de expresión recombinante que comprende el fragmento de ácido nucleico de la reivindicación 10.
12. Una vacuna para el EDS, que comprende la proteína fusionada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el multímero de proteína fusionada de la reivindicación 9 como ingrediente activo.
13. Una vacuna de ADN para el EDS, que comprende el fragmento de ácido nucleico de la reivindicación 10, o el vector de expresión recombinante de la reivindicación 11 como ingrediente activo.
14. Un kit que comprende la proteína fusionada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el multímero de proteína fusionada de la reivindicación 9, en el que el kit es para medir un nivel de anticuerpos contra la región Knob del EDSV en una muestra de ensayo.
15. La vacuna de la reivindicación 12 o la vacuna de ADN de la reivindicación 13 para su uso en la prevención del EDS.
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