ES2991433T3 - Péptido de PACAP estabilizado - Google Patents

Abstract

El objetivo de la presente invención es proporcionar un péptido PACAP que tenga una estabilidad mejorada. La presente invención se basa en el hallazgo de que la estabilidad de PACAP se mejora significativamente sustituyendo el ácido aspártico en las posiciones 3 y 8 en la secuencia de PACAP con al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido aspártico sustituido con tetrazol (Tz), ácido glutámico sustituido con tetrazol (egTz), ácido homoglutámico sustituido con tetrazol (nvTz), ácido aspártico sustituido con sulfoxi (cya) y ácido aspártico sustituido con oxadiazolona (5Oxa). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Péptido de PACAP estabilizado

Campo técnico

La presente invención se refiere a un péptido estabilizado que tiene una actividad fisiológica de PACAP, y a un agente neuroprotector, un mejorador de la función endotelial vascular, un promotor de la formación de neuritas corneales, un secretagogo lagrimal, un agente de tratamiento del ojo seco, un agente de tratamiento del daño epitelial corneal o endotelial corneal, un agente de tratamiento de queratitis neurotrófica, un agente antiinflamatorio o una composición farmacéutica, que incluye el péptido.

Antecedentes de la técnica

Las neuronas son células que constituyen el sistema nervioso, que se divide en gran medida en el sistema nervioso central y el sistema nervioso periférico. Las neuronas son susceptibles de sufrir daños por factores externos, incluyendo accidentes cerebrovasculares tales como ictus e infarto cerebral, y factores internos incluyendo la acumulación de proteínas anormales, estrés oxidativo e inflamación, mientras que la capacidad regenerativa también es baja y, por lo tanto, cuando se dañan, pueden dar como resultado un deterioro notable de la QOL del paciente. Las enfermedades neurodegenerativas asociadas con la neurodegeneración y la pérdida del sistema nervioso central incluyen enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica y la esclerosis múltiple, y enfermedades neurodegenerativas ópticas tales como el glaucoma o la neuropatía óptica, y también enfermedades neurodegenerativas sensoriales tales como la sordera nerviosa.

Los avances en la neurociencia han llevado al descubrimiento de numerosos factores neuroprotectores, y se espera que se desarrollen como agente preventivo o terapéutico para el trastorno nervioso. Se ha encontrado que los fármacos que disminuyen los radicales libres o los aminoácidos excitadores responsables de la neurodegeneración, y los fármacos que son capaces de proteger y/o reparar las neuronas (por ejemplo, ligandos de inmunofilina, tales como factores neurotróficos, o para agentes inmunosupresores), exhiben una acción neuroprotectora. También se ha mostrado que las proteínas endógenas tales como el polipéptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria (PACAP), CD44 y la carboxipeptidasa B cerebral humana (HBCPB) muestran acción neuroprotectora (PTL 1 y 2). El polipéptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria (PACAP) es un neuropéptido descubierto originalmente en el extracto del hipotálamo de oveja. PACAP puede exhibir actividad que estimula la formación de AMPc en células de la pituitaria anterior. PACAP incluye PACAP38 que consiste en 38 restos de aminoácidos, y PACAP27 que consiste en 27 restos de aminoácidos, ambos de los cuales tienen una actividad equivalente (NPL 1 y 2). PACAP pertenece a la superfamilia del polipéptido intestinal vasoactivo (VIP)/secretina/glucagón, y la secuencia de PACAP27 humano tiene un 68 % de identidad con el polipéptido intestinal vasoactivo (VIP). PACAP y VIP se unen ambos al receptor de PAC1 (PAC1R), al receptor de VPAC1 (VPAC1R) y al receptor de VPAC2 (VPAC2R), pero difieren en sus afinidades por sus respectivos receptores. PAC1R se une a PACAP con alta selectividad. La afinidad de PAC1R por PACAP es más de 1.000 veces mayor que la afinidad de PAC1R por VIP. Por otro lado, VPAC1R y VPAC2R, tienen ambos una afinidad igual por PACAP y VIP. PACAP tiene una variedad de efectos fisiológicos, siendo conocido por tener actividad fisiológica como sustancia neuroprotectora, factor inmunosupresor, factor vasodilatador, secretagogo exocrino (PTL 3) y factor promotor de la formación de neuritas (PTL 4).

El fármaco médico se está desarrollando utilizando las diversas actividades fisiológicas de PACAP. Sin embargo, la mayoría de los péptidos tales como PACAP son inestables en solución acuosa y están asociados con el problema de una corta semivida debido a la falta de resistencia a proteasas.

[Lista de citas]

[Bibliografía de patentes]

[PTL 1] Inspección Pública de Patente Japonesa No.2014-510101

[PTL 2] Publicación de Patente Japonesa No Examinada No.2012-232952

[PTL 3] Publicación de Patente Japonesa No Examinada No.2009-269818

[PTL 4] Publicación de Patente Internacional No. WO2005/102375, folleto

[Bibliografía no de patentes]

[NPL 1] S. Bourgault (2009) Current Medicinal Chemistry 16, 4462-4480

[NPL 2] Louise Dickson (2009) Pharmacology & Therapeutics, 12, 294-316

[NPL3] Ngoc-Duc Doan et al. (2011) se refiere al diseño y caracterización in vitro de agonistas selectivos de PAC1/VPAC1 con potentes efectos neuroprotectores

Sumario de la invención

[Problema técnico]

La presente invención pretende proporcionar un péptido PACAP estabilizado con alta estabilidad en solución acuosa, así como un agente neuroprotector, un promotor de la formación de neuritas, un secretagogo de las glándulas lagrimales, una composición farmacéutica terapéutica o profiláctica para el ojo seco, una composición farmacéutica terapéutica o profiláctica para el daño epitelial corneal o endotelial corneal, una composición farmacéutica terapéutica o profiláctica para la neuropatía, o una composición terapéutica o profiláctica para la queratitis neurotrófica, que incluye el péptido.

[Solución al problema]

Los presentes inventores han realizado una investigación ávida con el fin de aumentar la estabilidad de PACAP en solución acuosa, y han completado esta invención tras encontrar que es posible aumentar enormemente su estabilidad en solución acuosa reemplazando independientemente cada uno de los ácidos aspárticos en la posición 3 y la posición 8 del péptido PACAP con un residuo seleccionado del grupo que consiste en ácido aspártico sustituido con tetrazol (Tz), ácido glutámico sustituido con tetrazol (egTz), ácido homoglutámico sustituido con tetrazol (nvTz), ácido aspártico sustituido con sulfoxi (cya) y ácido aspártico sustituido con oxadiazolona (5Oxa).

La invención se expone en las reivindicaciones.

[Efectos ventajosos de la invención]

Según la invención, es posible estabilizar en gran medida PACAP, que ha sido inestable en solución acuosa.

Descripción de realizaciones

La presente invención se refiere a un péptido como se reivindica que consiste en una secuencia en donde los residuos de ácido aspártico en la posición 3 y la posición 8 de PACAP se reemplazan cada uno independientemente por un residuo seleccionado del grupo que consiste en ácido aspártico sustituido con tetrazol (Tz), ácido glutámico sustituido con tetrazol (egTz), ácido homoglutámico sustituido con tetrazol (nvTz), ácido aspártico sustituido con sulfoxi (cya) y ácido aspártico sustituido con oxadiazolona (5Oxa), o su secuencia parcialmente modificada, en donde el péptido tiene una afinidad por PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R equivalente a la de PACAP. La "afinidad equivalente" significa que el valor de CE50 del péptido para cada receptor es hasta 100 veces el de PACAP. PACAP puede ser PACAP38 que consiste en 38 residuos, o PACAP27 que consiste en 27 residuos. PACAP38 y PACAP27 tienen las siguientes secuencias:

PACAP38:HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK (SEQ ID NO: 1) PACAP27:HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL (SEQ ID NO: 2)

Según la invención, el ácido aspártico sustituido con tetrazol (Tz), el ácido glutámico sustituido con tetrazol (egTz) y el ácido homoglutámico sustituido con tetrazol (nvTz) son residuos de aminoácidos no naturales que tienen una estructura en donde el grupo carboxilo en la cadena lateral del ácido aspártico, ácido glutámico o ácido homoglutámico, respectivamente, está reemplazado por el grupo carboxilo isóstero tetrazol. Estos están representados por las siguientes fórmulas:

[Fórmula Química 1]

Según la invención, el ácido aspártico sustituido con sulfoxi (cya) y el ácido aspártico sustituido con oxadiazolona (5Oxa) son residuos que tienen una estructura en donde el grupo carboxilo en la cadena lateral del ácido aspártico está reemplazado por el grupo carboxilo isóstero sulfoxi o 1,2,4-oxadiazol-5-ona (oxadiazolona), respectivamente. Estos están representados por las siguientes fórmulas:

[Fórmula Química 2]

Los residuos de aminoácidos no naturales con ácido aspártico en la posición 3 y en la posición 8 reemplazados pueden ser las formas L, las formas D o las formas racémicas, siempre que tengan el nivel equivalente de actividad fisiológica que PACAP. En particular, un péptido sustituido con la forma L de ácido aspártico sustituido con tetrazol y un péptido sustituido con la forma D de ácido aspártico sustituido con tetrazol tienen el nivel equivalente de afinidad como PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R. Sin intención de limitarse a ninguna teoría particular, es posible que la inclusión de la forma D de un aminoácido sea menos probable que se degrade por enzimas, permitiendo que aumente la estabilidad. También pueden introducirse en péptidos aminoácidos no naturales distintos de los aminoácidos que constituyen proteínas junto con grupos protectores mediante métodos tales como el método Fmoc, similares a los aminoácidos que constituyen proteínas.

Según la invención, una "secuencia que está parcialmente modificada" es una secuencia en la que uno o más aminoácidos de la secuencia original se han sustituido, delecionado o añadido. Más preferiblemente, una "secuencia que está parcialmente modificada" es una secuencia en la que uno o varios aminoácidos de la secuencia original se han sustituido, delecionado o añadido.

Una sustitución de aminoácidos puede estar en cualquier posición siempre que la afinidad del péptido que consiste en la secuencia que está parcialmente modificada, para PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R, no cambie. Desde el punto de vista del mantenimiento de la afinidad, la sustitución de aminoácidos en el péptido que consiste en la secuencia parcialmente modificada puede estar en la posición 2, posición 5, posición 7, posición 9, posición 11, posición 16 y posición 17 de PACAP27. Según un aspecto particularmente preferido, pueden sustituirse los aminoácidos en las posiciones X1a X7en la siguiente secuencia: H-X1-D-G-X2-F-X3-D-X4-Y-X5-R-Y-R-K-X6-X7-A-V-K-K-Y-L-A-A-V-L (SEQ ID NO: 3).

Un aspecto de la invención, por lo tanto, se refiere a un péptido que consiste en la secuencia representada por la siguiente fórmula:

H-X1-D-G-X2-F-X3-D-X4-Y-X5-R-Y-R-K-X6-X7-A-V-K-K-Y-L-A-A-V-L (SEQ ID NO: 3) {en donde

X1a X6son aminoácidos neutros, y

X7s un aminoácido no polar},

con los ácidos aspárticos en la posición 3 y en la posición 8 cada uno reemplazado independientemente por un residuo seleccionado del grupo que consiste en ácido aspártico sustituido con tetrazol (Tz), ácido glutámico sustituido con tetrazol (egTz), ácido homoglutámico sustituido con tetrazol (nvTz), ácido aspártico sustituido con sulfoxi (cya) y ácido aspártico sustituido con oxadiazolona (5Oxa), o su secuencia modificada, en donde el péptido tiene afinidad por PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R.

La sustitución también puede ser una sustitución conservadora con un aminoácido que tiene los mismos atributos. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen sustituciones de aminoácidos dentro de los siguientes grupos:

(i) Aminoácidos no polares: Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Nle, Ala

(ii) Aminoácidos neutros: Ala, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, Gln, Gly

(iii) Aminoácidos básicos: Lys, Arg, His

(iv) Aminoácidos ácidos: Asp, Glu

Entre los aminoácidos neutros, se puede usar ácido α-aminoisobutírico (Ai) que tiene un grupo metilo sustituido en la posición α de alanina y β-cianoalanina (Cn) que tiene el átomo de hidrógeno en la posición β de alanina sustituido con un grupo ciano, en lugar de alanina. En particular, se pueden usar ácido α-aminoisobutírico (Ai) y β-cianoalanina (Cn) como aminoácidos neutros en la posición 9 y la posición 11. Los aminoácidos ácido α-aminoisobutírico (Ai) y βcianoalanina (Cn) tienen las siguientes estructuras:

[Fórmula Química 3]

En la secuencia representada por la SEQ ID NO: 3 de la invención, los aminoácidos representados por X1a X7son preferentemente los siguientes:

El aminoácido neutro de X1es, en particular, alanina o serina.

El aminoácido neutro de X2es, en particular, isoleucina o alanina.

El aminoácido neutro de X3es, en particular, alanina o treonina.

Los aminoácidos neutros de X4y X5son, en particular, alanina, serina, ácido α-aminoisobutírico o β-cianoalanina. El aminoácido neutro de X6es, en particular, glutamina o alanina.

El aminoácido no polar de X7es, en particular, metionina, leucina, norleucina o alanina.

Según la invención, una "secuencia modificada" es una secuencia en la que uno o más aminoácidos de la secuencia original se han sustituido, delecionado o añadido. Más preferiblemente, una "secuencia que está parcialmente modificada" es una secuencia en la que uno o varios aminoácidos de la secuencia original se han sustituido, delecionado o añadido.

La sustitución de aminoácidos puede incluir la sustitución de uno o más aminoácidos, pero desde el punto de vista de mantener una actividad, puede sustituirse cualquier número de 1 a 10, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos. Se prefiere particularmente una sustitución de 1 a 4 aminoácidos, se prefiere más una sustitución de 3 aminoácidos, se prefiere incluso más una sustitución de dos aminoácidos y lo más preferido es una sustitución de un aminoácido. Una deleción de aminoácidos puede estar en cualquier posición siempre que la afinidad del péptido que consiste en la secuencia que está parcialmente modificada, por PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R, no cambie. El número de aminoácidos delecionados se selecciona como cualquier número de 1 a 10, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Desde el punto de vista de no alterar la afinidad, se prefiere particularmente una deleción de uno o dos aminoácidos, y especialmente una deleción de un aminoácido. La deleción de aminoácidos puede ser una deleción en el extremo N-terminal o el extremo C-terminal de la secuencia original, o una deleción dentro de la secuencia. Puesto que PACAP27 y PACAP38 tienen una afinidad de unión equivalente por PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R, se cree que la deleción de los aminoácidos presentes en el extremo C de PACAP38 tiene poco efecto sobre la afinidad.

Una adición de aminoácidos puede estar en cualquier posición siempre que la afinidad del péptido que consiste en la secuencia que está parcialmente modificada, por PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R, no cambie. El número de aminoácidos añadidos se selecciona como cualquier número de 1 a 10, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Los aminoácidos pueden añadirse en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal de la secuencia original, o pueden añadirse dentro de la secuencia. Puesto que PACAP27 y PACAP38 tienen una afinidad de unión equivalente por PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R, se cree que la adición de cualquier aminoácido en el extremo C de PACAP27 tiene poco efecto sobre la afinidad.

Una secuencia modificada de la secuencia enumerada como SEQ ID NO: 3 en donde los restos de ácido aspártico en la posición 3 y la posición 8 se reemplazan cada uno independientemente por un resto seleccionado del grupo que consiste en ácido aspártico sustituido con tetrazol (Tz), ácido glutámico sustituido con tetrazol (egTz), ácido homoglutámico sustituido con tetrazol (nvTz), ácido aspártico sustituido con sulfoxi (cya) y ácido aspártico sustituido con oxadiazolona (5Oxa), es preferiblemente la secuencia de aminoácidos enumerada como SEQ ID NO: 3 con una deleción o adición de uno o más aminoácidos. Más preferiblemente, uno o dos aminoácidos pueden delecionarse de la secuencia de aminoácidos enumerada como SEQ ID NO: 3, o la siguiente secuencia añadida C-terminal puede añadirse a la secuencia de aminoácidos enumerada como SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos enumerada como SEQ ID NO: 3 también puede tener una adición de 1 a 3 aminoácidos (tales como metionina) en el extremo N. No es nuestra intención limitarnos a ninguna teoría particular, pero dado que PACAP27 y PACAP38 tienen una afinidad de unión equivalente por PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R, la adición de cualquier aminoácido en el extremo C-terminal de PACAP27 no afecta la afinidad de unión por PAC1R. Por lo tanto, el péptido con una secuencia modificada según la invención puede incluir una secuencia añadida C-terminal en el extremo C de la secuencia de aminoácidos enumerada como SEQ ID NO: 3, similar a PACAP27. Una secuencia añadida C-terminal es una secuencia que comprende de 1 a 11 aminoácidos arbitrarios. La secuencia añadida C-terminal corresponde preferiblemente a los aminoácidos en la posición 28 a la posición 38 de PACAP38. Las siguientes secuencias pueden mencionarse, por lo tanto como secuencias C-terminales:

GKRYKQRVKNK (SEQ ID NO 43);

GKRYKQRVKN (SEQ ID NO 44);

GKRYKQRVK (SEQ ID NO 45);

GKRYKQRV (SEQ ID NO: 46);

GKRYKQR (SEQ ID NO: 47);

GKRYKQ (SEQ ID NO: 48);

GKRYK (SEQ ID NO: 49);

GKRY (SEQ ID NO: 50)

GKR;

GRR;

GK; y

GR;

G.

El péptido de la invención puede usar la forma D o la forma L de aminoácidos, o las formas racémicas de aminoácidos, siempre que no se pierda afinidad por PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R. El péptido de la invención también puede comprender aminoácidos no naturales tales como ácido 2-aminoisobutírico, y puede incluir derivados con modificación opcional de grupos amino N-terminales, grupos carboxilo C-terminales o grupos funcionales de la cadena lateral de los aminoácidos. Los ejemplos de modificaciones incluyen la adición de grupos protectores en el grupo amino (por ejemplo, acilación (formilación, acetilación, propionilación, butirilación o isobutirilación), mesilación, ureación, carbamación, protección con Boc o protección con Fmoc) y esterificación (tal como etilación) del grupo carboxilo. También pueden incluir la modificación que puede tener lugar comúnmente en el cuerpo, tal como fosforilación, amidación, metilación, esterificación y acetilación, así como la modificación que tiene lugar durante el proceso de síntesis o que se usa para facilitar la purificación, tal como biotinilación. Con el fin de extender la semividain vivodel péptido, también se puede añadir una modificación tal como PEGilación. Desde el punto de vista de aumentar la estabilidad, en particular, el grupo amino libre del aminoácido N-terminal puede protegerse con un grupo protector (tal como un grupo acilo). Por ejemplo, los grupos amino libres de aminoácidos N-terminales pueden acilarse (por ejemplo, acetilarse, propionilarse, butirilarse o isobutirilarse), o mesilarse. De manera similar, los grupos carboxilo libres de aminoácidos C-terminales pueden protegerse mediante grupos protectores (tales como grupos amida o éster). Por ejemplo, los grupos carboxilo libres de aminoácidos C-terminales pueden amidarse o esterificarse. La acetilación o mesilación del extremo N de un péptido de la invención aumenta adicionalmente la estabilidad. El extremo C puede ser un grupo carboxilo (-COOH), carboxilato (-COO-), amida (-CONH2) o éster (-COOR). El péptido de la invención también puede tener la adición de una cadena de glicosilo (véase WO2017/027848, por ejemplo).

Según un aspecto específico, la invención se refiere a los péptidos que tienen las secuencias enumeradas en la Tabla 1, a continuación, o sus secuencias modificadas como se reivindica:

[Tabla 1]

Tabla 1

En la tabla, Tz representa ácido aspártico sustituido con tetrazol, egTz representa ácido glutámico sustituido con tetrazol, nvTz representa ácido homoglutámico sustituido con tetrazol, cya representa ácido aspártico sustituido con sulfoxi, (5Oxa) representa ácido aspártico sustituido con oxadiazolona, Ai representa ácido α-aminoisobutírico y Cn representa β-cianoalanina. Tz(D) representa que el ácido aspártico sustituido con tetrazol es la forma D.

El péptido de la invención puede producirse mediante cualquier método de producción. Por ejemplo, puede producirse mediante síntesis en fase sólida o síntesis en fase líquida usando el método Boc o Fmoc. También se puede producir mediante otros métodos, usando un método de transferencia de ácido nucleico que codifica el péptido de la invención a un gen, introduciendo el gen en células huésped y sintetizando el péptido en las células huésped. La purificación después de la expresión puede conseguirse fácilmente mediante un diseño en donde se añade un péptido etiqueta tal como una etiqueta de polihistidina en los extremos del péptido.

El péptido de la invención también incluye sus sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de ácidos inorgánicos (por ejemplo, hidrocloruros, hidrobromuros, sulfatos y fosfatos), sales de ácidos orgánicos (por ejemplo, metanosulfonatos, bencenosulfonatos,p-toluenosulfonatos, formiatos, acetatos, trifluoroacetatos, oxalatos, citratos, malonatos, fumaratos, maleatos, tartratos, succinatos y malatos), o sales con bases (por ejemplo, sales de amonio, sales de metilpiridinio y sales de acetilpiridinio). El péptido de la invención también incluye hidratos o solvatos.

Un aminoácido protegido con Fmoc-N en donde el grupo carboxilo de la cadena lateral de un aminoácido (ácido aspártico) se ha reemplazado por el grupo carboxilo del isóstero tetrazol puede producirse mediante el método representado por el Esquema de Reacción 1, o un método similar, usando asparagina protegida con Fmoc-N como sustancia de partida.

[Fórmula Química 4]

Esquema de Reacción 1

{en donde

Trt representa un grupo tritilo, y

H o grupo Trt está sustituyendo en N1 o N2 del tetrazol}

En el método del Esquema de Reacción 1, el compuesto representado por (I) (por ejemplo, asparagina con el grupo amino protegido por Fmoc) se hace reaccionar con EDCI en presencia de una base en la etapa A, para producir el compuesto (II). En la etapa A, la base se usa a 1 a 50 equivalentes y preferiblemente de 10 a 25 equivalentes con respecto al compuesto (I). La base usada puede ser piridina, 4-dimetilaminopiridina, trietilamina, N,N-diisopropiletilamina o N-metilmorfolina, prefiriéndose piridina. El EDCI se usa de 1 a 10 equivalentes y preferiblemente 1 o 2 equivalentes. El disolvente no está particularmente restringido siempre que no afecte a la reacción, y los ejemplos incluyen N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida, tolueno, diclorometano, tetrahidrofurano y acetonitrilo, preferiblemente acetonitrilo. La temperatura de la reacción será normalmente de -10 a 60 °C y es preferiblemente de 0 a 30 °C, mientras que el tiempo de la reacción es de 0,5 a 12 horas y preferiblemente de 1 a 5 horas.

En la etapa B, el compuesto (II) se hace reaccionar con trimetilsililazida y óxido de dibutilestaño en tolueno para producir el compuesto (III). La trimetilsililazida se usa a 1 a 5 equivalentes y preferiblemente 2 a 4 equivalentes con respecto al compuesto (II). El óxido de dibutilestaño se utiliza a 0,3 a 1 equivalente y preferentemente a 0,7 a 0,95 equivalentes con respecto al compuesto (II). El disolvente no está particularmente restringido siempre que no afecte a la reacción, y los ejemplos incluyen benceno, tolueno y xileno, preferentemente tolueno. El tiempo de la reacción será normalmente de 0,5 a 24 horas y es preferiblemente de 0,5 a 2 horas. La temperatura de la reacción será normalmente de 80 a 150 °C y es preferentemente de 80 a 100 °C. El método de calentamiento puede ser con un baño de aceite o microondas, prefiriéndose el calentamiento por microondas.

En la etapa C posterior, el compuesto (IV) puede producirse haciendo reaccionar cloruro de tritilo en presencia de una base. La base usada en la etapa C puede ser piridina, 4-dimetilaminopiridina, trietilamina, N,N-diisopropiletilamina o N-metilmorfolina, prefiriéndose N-metilmorfolina. La cantidad de base usada es de 1 a 3 equivalentes y preferiblemente de 1 a 1,5 equivalentes con respecto al compuesto (IX). El cloruro de tritilo se utiliza a 1 a 3 equivalentes y preferentemente de 1,05 a 1,1 equivalentes. El disolvente no está particularmente restringido siempre que no afecte a la reacción, y los ejemplos incluyen N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida, tolueno, diclorometano, tetrahidrofurano y acetonitrilo, preferiblemente tetrahidrofurano. La temperatura de la reacción será normalmente de -10 a 60 °C y es preferiblemente de 0 a 30 °C. El tiempo de la reacción es de 0,5 a 12 horas y preferiblemente de 1 a 2 horas.

Fmoc-nvTz(Trt)-OH, que tiene tetrazol unido en la posición α del aminoácido a través de un alquilo que tiene 3 átomos de carbono, puede producirse mediante el método representado por el Esquema de Reacción 2 o un método similar.

[Fórmula Química 5]

Esquema de Reacción 2

En la etapa D del método del Esquema de Reacción 2, un compuesto representado por la fórmula general para el compuesto (V) se hace reaccionar con Boc2O en presencia de una base para producir el compuesto (VI). La base se usa de 1 a 10 equivalentes y preferiblemente de 1 a 2 equivalentes con respecto al compuesto (V). La base usada puede ser trietilamina, N,N-diisopropilamina, N-metilmorfolina, hidróxido sódico, carbonato potásico o hidrógenocarbonato sódico, preferentemente hidróxido sódico. El Boc2O se usa de 1 a 10 equivalentes y preferiblemente de 1 a 2 equivalentes con respecto al compuesto (V). El disolvente no está particularmente restringido siempre que no afecte a la reacción, y puede ser THF, DMF o 1,4-dioxano, y preferentemente 1,4-dioxano. La temperatura de la reacción será normalmente de 0 a 25 °C y es preferentemente de 10 a 25 °C. El tiempo de la reacción será normalmente de 1 a 24 horas y es preferentemente de 18 a 24 horas. Siempre que la reacción no se vea afectada, se puede añadir N-metilpiperazina para procesar el exceso de Boc2O.

En la etapa E posterior, el compuesto (VI) se hace reaccionar con hexahidrato de sulfato de níquel, peroxodisulfato de sodio e hidróxido de sodio para producir el compuesto (VII). En la etapa E, el peroxodisulfato de sodio se utiliza de 1 a 4 equivalentes y preferentemente de 1 a 2 equivalentes con respecto al compuesto (VI). El hexahidrato de sulfato de níquel se usa a 0,01 a 0,1 equivalentes y preferiblemente a 0,08 a 0,1 equivalentes con respecto al compuesto (VI). La base usada puede ser hidróxido sódico, a 1 a 10 equivalentes y preferiblemente 6 a 8 equivalentes en total con respecto al compuesto (VI). El disolvente usado es agua. La temperatura de la reacción es de 10 a 40 °C y preferentemente de 10 a 25 °C. El tiempo de la reacción será normalmente de 1 a 24 horas y es preferentemente de 12 a 24 horas.

En la etapa F posterior, después de hacer reaccionar el compuesto (VII) y TFA, el pH se ajusta a basicidad y la reacción se lleva a cabo con Fmoc-OSu para producir el compuesto (VIII). El ácido usado en la etapa F puede ser ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o ácido trifluoroacético, etc., y es preferiblemente ácido trifluoroacético. El disolvente no está particularmente restringido siempre que no afecte a la reacción, y puede ser THF, diclorometano o 1,4-dioxano, prefiriéndose diclorometano. La temperatura de la reacción es de 0 a 25 °C y preferiblemente de 10 a 25 °C. El tiempo de la reacción será normalmente de 0,5 a 5 horas y es preferiblemente de 0,5 a 2 horas. La base inorgánica usada para ajustar el pH después de la reacción, y como base, puede ser hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidrógenocarbonato de sodio, carbonato de sodio o carbonato de potasio, prefiriéndose el carbonato de potasio. Fmoc-OSu se usa a 1 a 3 equivalentes y preferiblemente 1 a 1,5 equivalentes con respecto al compuesto (VII). El disolvente no está particularmente restringido siempre que no afecte a la reacción, y puede ser THF, N,N-dimetilformamida, diclorometano o 1,4-dioxano, prefiriéndose 1,4-dioxano. La temperatura de la reacción es de 0 a 25 °C y preferiblemente de 10 a 25 °C. El tiempo de la reacción será normalmente de 1 a 36 horas y es preferiblemente de 1 a 24 horas.

En la etapa G posterior, el compuesto (VIII) se hace reaccionar con trimetilsililazida y óxido de dibutilestaño en tolueno para producir el compuesto (IX). En la etapa G, se utiliza trimetilsililazida de 1 a 10 equivalentes y preferentemente de 2 a 4 equivalentes con respecto al compuesto (II). El óxido de dibutilestaño se utiliza a 0,3 a 1 equivalente y preferentemente a 0,7 a 1,0 equivalentes con respecto al compuesto (II). El disolvente no está particularmente restringido siempre que no afecte a la reacción, y los ejemplos incluyen benceno, tolueno y xileno, prefiriéndose el tolueno. El tiempo de la reacción será normalmente de 0,5 a 48 horas y es preferiblemente de 0,5 a 2 horas. El tiempo de la reacción será normalmente de 80 a 150 °C y es preferentemente de 80 a 100 °C. El método de calentamiento puede ser con un baño de aceite o microondas, prefiriéndose el calentamiento por microondas.

En la etapa H posterior, el compuesto (IX) puede hacerse reaccionar con cloruro de tritilo en presencia de una base para producir el compuesto (X). La base usada para la producción del compuesto (X) puede ser piridina, 4-dimetilaminopiridina, trietilamina, N,N-diisopropiletilamina o N-metilmorfolina, prefiriéndose N-metilmorfolina. La cantidad de base usada es de 1 a 3 equivalentes y preferiblemente de 1 a 1,5 equivalentes con respecto al compuesto (IX). Se puede usar de 1 a 3 equivalentes y preferiblemente de 1,05 a 1,1 equivalentes con respecto al compuesto de cloruro de tritilo (IX). El disolvente no está particularmente restringido siempre que no afecte a la reacción, y los ejemplos incluyen N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida, tolueno, diclorometano, tetrahidrofurano y acetonitrilo, prefiriéndose tetrahidrofurano. La temperatura de la reacción será normalmente de -10 a 60 °C y es preferiblemente de 20 a 30 °C, mientras que el tiempo de la reacción es de 0,5 a 12 horas y preferiblemente de 1 a 2 horas.

Puede producirse Fmoc-(5Oxa)-OH, que tiene el grupo carboxilo del ácido aspártico reemplazado por 1,2,4-oxadiazol-5-ona, mediante el método representado por el Esquema de Reacción 3 o un método similar.

[Fórmula Química 6]

Esquema de Reacción 3

En la etapa I del método del Esquema de Reacción 3, un compuesto representado por la fórmula general del compuesto (XI) se hace reaccionar con 2-bromo-2-metilpropano en presencia de cloruro de benciltrietilamonio y una base para producir el compuesto (XII). En la etapa I, la base se usa de 10 a 30 equivalentes y preferiblemente de 10 a 25 equivalentes con respecto al compuesto (XI). La base usada puede ser carbonato potásico. Se usa cloruro de benciltrietilamonio a 1 a 3 equivalentes y preferiblemente 1 a 1,2 equivalentes con respecto al compuesto (XI). El 2-bromo-2-metilpropano se usa a de 10 a 50 equivalentes y preferiblemente de 10 a 40 equivalentes con respecto al compuesto (XI). El disolvente usado es N,N-dimetilacetamida. El tiempo de la reacción será normalmente de 1 a 24 horas y es preferiblemente de 18 a 24 horas. La temperatura de la reacción será normalmente de 25 a 70 °C y es preferiblemente de 25 a 55 °C.

En la etapa J posterior, el compuesto (XII) se hace reaccionar con hidrocloruro de hidroxilamina en presencia de una base para producir el compuesto (XIII). La base usada en la etapa J puede ser trietilamina o N,N-diisopropiletilamina, y es preferiblemente trietilamina. La base usada con el compuesto (XII) se usa de 1 a 3 equivalentes y preferiblemente de 1 a 2 equivalentes. El hidrocloruro de hidroxilamina se utiliza a 1 a 2 equivalentes y preferiblemente 1 a 1,5 equivalentes con respecto al compuesto (XII). El disolvente no está particularmente restringido siempre que no afecte a la reacción, y los ejemplos incluyen metanol, etanol, propanol e isopropanol, prefiriéndose etanol. La temperatura de la reacción será normalmente de 80 a 100 °C y es preferiblemente de 80 a 95 °C. El tiempo de la reacción será normalmente de 1 a 6 horas y es preferiblemente de 1 a 4 horas.

En la etapa K posterior, el compuesto (XIII) se hace reaccionar con carbonildiimidazol para producir el compuesto (XIV). En la etapa K, el carbodiimidazol se utiliza a 1 a 2 equivalentes y preferentemente 1 a 1,2 equivalentes con respecto al compuesto (XIII). El disolvente no está particularmente restringido siempre que no afecte a la reacción, y puede ser THF o 1,4-dioxano, y preferiblemente THF. La temperatura de la reacción es de 40 a 60 °C y preferiblemente de 40 a 55 °C. El tiempo de la reacción será usualmente de 1 a 6 horas y es preferiblemente de 1 a 3 horas. Para la reacción de ciclación continua, el disolvente no está particularmente restringido siempre que no afecte a la reacción, y puede ser tolueno, xileno o benceno, o preferiblemente tolueno. La temperatura de la reacción será normalmente de 100 a 130 °C y es preferentemente de 100 a 120 °C.

En la etapa L posterior, el compuesto (XIV) se hace reaccionar con TFA en presencia de un secuestrador, el pH se ajusta a basicidad y la reacción se lleva a cabo con Fmoc-OSu para producir el compuesto (XV). El ácido usado en la etapa L puede ser ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o ácido trifluoroacético, y es preferiblemente ácido trifluoroacético. El secuestrador usado puede ser trietilsilano o triisopropilsilano, y es preferiblemente trietilsilano. El disolvente no está particularmente restringido siempre que no afecte a la reacción, y puede ser THF, diclorometano o 1,4-dioxano, prefiriéndose diclorometano. La temperatura de la reacción es de 0 a 25 °C y preferiblemente de 10 a 25 °C. El tiempo de la reacción será normalmente de 0,5 a 5 horas y es preferiblemente de 0,5 a 3 horas. La base inorgánica usada para ajustar el pH después de la reacción, y como base, puede ser hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidrógenocarbonato de sodio, carbonato de sodio o carbonato de potasio, prefiriéndose hidrógenocarbonato de sodio. Fmoc-OSu se usa a 1 a 3 equivalentes y preferiblemente 1 a 1,5 equivalentes con respecto al compuesto (VII). El disolvente no está particularmente restringido siempre que no afecte a la reacción, y puede ser THF, N,N-dimetilformamida, diclorometano o 1,4-dioxano, prefiriéndose 1,4-dioxano. La temperatura de la reacción es de 0 a 25 °C y preferiblemente de 10 a 25 °C. El tiempo de la reacción será normalmente de 1 a 36 horas y es preferiblemente de 1 a 24 horas.

El péptido de la invención puede presentar una actividad fisiológica similar a la de PACAP, uniéndose a PAC1R, VPAC1R y/o VPAC2R. Como ejemplos específicos, el péptido de la invención puede presentar una actividad fisiológica como una sustancia neuroprotectora, un factor de regeneración nerviosa, un factor promotor de la cicatrización de heridas, un factor supresor de la inflamación o un secretagogo exocrino. Según otro aspecto, por lo tanto, la invención puede referirse a un agente neuroprotector, un agente regenerador de nervios, un agente de cicatrización de heridas, un agente supresor de la inflamación, un agente de tratamiento del daño epitelial corneal o endotelial corneal, un agente de tratamiento del ojo seco, un secretagogo de glándula exocrina o un agente de tratamiento de queratitis neurotrófica, que contiene un péptido de la invención. Según otro aspecto más, la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene el péptido de la invención.

El agente neuroprotector de la invención es un agente de acción neuroprotectora. Por lo tanto, un agente neuroprotector es uno que puede proteger los nervios de un trastorno provocado por daños neuronales, degeneración y/o muerte celular, y puede ser un agente inhibidor de la muerte neuronal (apoptosis y/o necrosis), un agente inhibidor de la degeneración neuronal, un agente reductor del estrés neuronal, un agente mejorador de la resistencia a la neurocitotoxicidad, un agente mejorador de la viabilidad neuronal o un agente inhibidor de la acumulación de proteínas anormales.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, "acción neuroprotectora" se refiere a la acción de proteger las neuronas de su daño, degeneración y/o muerte celular, y preferiblemente es la acción de protegerlas de la muerte neuronal. Más específicamente, la acción neuroprotectora puede incluir inhibir la muerte neuronal (apoptosis y/o necrosis), inhibir la degeneración neuronal, aliviar el estrés neuronal, aumentar la resistencia a la neurocitotoxicidad, mejorar la viabilidad neuronal o inhibir la acumulación de proteínas anormales. Las neuronas sufren daño debido al daño físico, así como la exposición a sustancias neurotóxicas y la falta de oxígeno o nutrientes, y pueden experimentar muerte celular si se supera un cierto nivel de daño. Las neuronas también sufren desnaturalización por acumulación de sustancias neurotóxicas, conduciendo eventualmente a la muerte celular. Las sustancias neurotóxicas se clasifican en gran medida como sustancias tóxicas exógenas o sustancias tóxicas endógenas. Las sustancias tóxicas exógenas incluyen metales pesados, alcohol y sustancias químicas tales como toxina botulínica. Las sustancias tóxicas endógenas incluyen especies activas de oxígeno, neurotransmisores tales como ácido glutámico, y proteínas anormales. La acción neuroprotectora puede medirse fácilmente por un experto en la técnica. Como ejemplo, las neuronas pueden cultivarse en medio de cultivo que contiene una sustancia de ensayo (grupo de fármaco) o medio de cultivo que carece de la sustancia de ensayo (grupo de control) en condiciones con diversos tipos de estrés, tales como baja carga de oxígeno, exposición a sustancias neurotóxicas, agotamiento de nutrientes o irradiación ultravioleta, medición del recuento de células viables y recuento de células muertas en cada medio de cultivo y cálculo del porcentaje de células viables con respecto al número total de células, y puede evaluarse que la sustancia de ensayo tiene acción neuroprotectora si el porcentaje de células viables en el grupo de fármaco es mayor que el porcentaje de células viables en el grupo de control. Como método más preferido, se puede medir por comparación con un grupo de control positivo que contiene una sustancia añadida que se sabe que tiene acción neuroprotectora, tal como IGF-1 o NGF, determinando si la sustancia de ensayo tiene o no una acción protectora igual a o mayor que el grupo de control positivo. Como otro ejemplo, la acción neuroprotectora puede medirse mediante un experimento con animalesin vivo.

El péptido de la invención tiene la acción secretagogo de la glándula exocrina de PACAP. La glándula exocrina puede ser una glándula lagrimal o glándula salival, y el péptido puede usarse como un secretagogo de glándula exocrina tal como un agente promotor secretagogo lagrimal o secretagogo salival. Sin limitarse a ninguna teoría particular, presumiblemente PACAP y el péptido de la invención promueven la secreción de saliva o fluido lagrimal mediante la unión a receptores (PAC1R, VPAC1R, VPAC2R) expresados en células acinares de glándulas exocrinas. El fluido lagrimal cubre la superficie de la queratoconjuntiva para mantener su humectabilidad, rellenando el fluido lagrimal las hendiduras formadas por microvellosidades en la superficie corneal y permitiendo obtener imágenes claras. Las células epiteliales de la queratoconjuntiva experimentan metabolismo activo, y cuando se desprenden y descargan células o metabolitos innecesarios de la superficie más externa, el fluido lagrimal las elimina mientras suministra el oxígeno y nutrientes necesarios. El fluido lagrimal elimina también los contaminantes que se han infiltrado en la superficie de la queratoconjuntiva, mientras que la acción bacteriostática del fluido lagrimal desempeña un papel importante para la protección contra la infección por virus, bacterias y hongos que se infiltran desde el entorno exterior. También funciona como fluido sinovial entre los párpados y la queratoconjuntiva, para parpadeo suave y movimiento ocular. Aunque el fluido lagrimal constituye solo una pequeña cantidad del fluido que forma una película fina mínima en la superficie de la queratoconjuntiva, es indispensable para mantener la transparencia y la homeostasis corneales mediante una variedad de mecanismos elaborados. Las afecciones de una superficie de queratoconjuntiva anormal, debidas al trastorno en la secreción del fluido lagrimal, se denominan generalmente "ojo seco", y se han creado compuestos que promueven la secreción lagrimal cuando se ha producido un daño queratoconjuntival debido al ojo seco, que sirven como agentes profilácticos y terapéuticos que son útiles para el ojo seco y afecciones asociadas con el ojo seco. El péptido de la invención puede incluirse como secretagogo lagrimal en una gota oftálmica para el ojo.

El péptido de la invención también se puede usar como agente supresor de la inflamación, ya que tiene la acción antiinflamatoria de PACAP. Sin intención de limitarse a ninguna teoría particular, PACAP y el péptido de la invención pueden suprimir la producción de citocinas inflamatorias (TNF-α, IL-6, IL-12, etc.). El péptido de la invención puede usarse, por lo tanto, como un fármaco antiinflamatorio. Los receptores de PACAP VPAC1R y VPAC2R, en particular, están ampliamente distribuidos en el tracto gastrointestinal y también presentan acción antiinflamatoria, y pueden usarse para el tratamiento de enfermedades intestinales inflamatorias, en particular.

Según otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene una dosis terapéuticamente eficaz del péptido descrito anteriormente. La composición farmacéutica de la invención puede usarse para el tratamiento o prevención de una enfermedad que se mejora por la acción fisiológica de PACAP. Las enfermedades que se mejoran por la acción fisiológica de PACAP incluyen trastorno nervioso, enfermedades relacionadas con fluido lagrimal reducido, enfermedades inflamatorias y queratitis neurotrófica. La composición farmacéutica de la invención puede tratar una enfermedad que se mejora por la acción fisiológica de PACAP, por administración a un paciente, o puede prevenir la enfermedad por administración a un paciente con el potencial de desarrollar la enfermedad. En este caso, "tratamiento" significa que, después de la aparición de un trastorno o enfermedad, se previene el empeoramiento de la afección, o la afección actual se mantiene, alivia o invierte, mientras que "prevención" significa que la aparición de un trastorno o enfermedad se previene antes de la aparición.

El trastorno nervioso es una afección patológica en donde se pierde la función neuronal debido a la degeneración o muerte celular, e incluye trastornos cerebrovasculares y enfermedad neurodegenerativa.

Los trastornos cerebrovasculares incluyen trastornos hemorrágicos, tales como hemorragia cerebral y hemorragia subaracnoidea, y obstrucción cerebrovascular, tal como trombo cerebral, infarto cerebral e insuficiencia circulatoria cerebral. Tanto los trastornos hemorrágicos como los trastornos obstructivos dejan neuronas en el cerebro en un estado de hipoxia, lo que conduce a la muerte celular. Por lo tanto, el péptido, agente neuroprotector o composición farmacéutica de la invención se puede administrar con el fin de tratar o prevenir tales trastornos cerebrovasculares. Las enfermedades neurodegenerativas incluyen, pero no se limitan a, enfermedades degenerativas del cerebro y el sistema nervioso central, tales como demencia, enfermedad de Parkinson, degeneración espinocerebelosa, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple, enfermedad de las vacas locas y epilepsia, enfermedades neurodegenerativas motoras tales como atrofia muscular progresiva espontánea, esclerosis lateral amiotrófica y atrofia muscular espinobulbar, y enfermedades neurodegenerativas sensoriales. Las enfermedades neurodegenerativas sensoriales incluyen, pero no se limitan a, enfermedades degenerativas de los nervios visual, auditivo, táctil, gustativo y olfativo, incluyendo las enfermedades degenerativas visuales glaucoma, retinitis pigmentosa, degeneración macular relacionada con la edad y retinopatía diabética, y enfermedades neurodegenerativas auditivas que incluyen insuficiencia auditiva.

Las enfermedades relacionadas con el fluido lagrimal reducido incluyen, pero no se limitan a, ojo seco, queratoconjuntivitis seca y lagrimeo reducido.

La queratitis neurotrófica es una enfermedad corneal degenerativa que resulta del daño en el nervio trigémino, y conduce al daño del epitelio corneal. El tipo más grave puede conducir a ulceración, fusión o perforación corneal, y pérdida de visión por el paciente.

Un mejorador de la función endotelial vascular es un fármaco que mejora la función endotelial vascular. Las células endoteliales vasculares son células en la capa más interna de los vasos sanguíneos, que regulan la adhesión de células inflamatorias en las paredes vasculares, la permeabilidad vascular y el sistema de coagulación/fibrinolítico, que incluye el control de la contracción y relajación de la pared vascular (dureza/suavidad de los vasos sanguíneos). Debido a que el péptido de la invención tiene un efecto vasodilatador como acción fisiológica de PACAP, mejora los trastornos endoteliales vasculares, tales como la arteriosclerosis.

Los trastornos epiteliales o endoteliales corneales son afecciones en donde las células epiteliales corneales y las células endoteliales corneales están deterioradas. Las células epiteliales corneales son células proliferativas, pero en casos de deterioro de las células epiteliales corneales, su potencia de proliferación se suprime, conduciendo la eliminación epitelial progresiva a un desequilibrio en la homeostasis epitelial. Las células endoteliales corneales no proliferan en el cuerpo y disminuyen con el envejecimiento. El daño epitelial corneal o endotelial corneal significa lesión epitelial o endotelial corneal causada por factores de enfermedad intrínsecos tales como úlcera corneal, desprendimiento epitelial corneal, queratopatía diabética, queratoconjuntivitis seca, queratitis superficial crónica, queratopatía puntiforme superficial, erosión corneal y pérdida epitelial corneal prolongada, factores de enfermedades extrínsecas tales como fármacos, traumatismo o uso de lentes de contacto, o lesión física o química.

El ojo seco es una enfermedad crónica del fluido lagrimal y el epitelio conjuntival debido a una variedad de factores, y está acompañado por incomodidad ocular y anomalías de la función visual. Las anomalías del fluido lagrimal incluyen la anomalía cuantitativa del flujo reducido del fluido lagrimal, y la anomalía cualitativa del cambio en la calidad del fluido lagrimal o capacidad para retener el fluido lagrimal. El ojo seco también incluye el ojo seco que acompaña al lagrimeo reducido, el ojo seco evaporativo del líquido lagrimal, el síndrome de Sjogren, el síndrome de Stevens-Johnson, la erosión epitelial corneal, la blefaritis, el pénfigo oftálmico, la conjuntivitis vernal, la conjuntivitis alérgica y la deficiencia de vitamina A.

Las enfermedades inflamatorias incluyen, pero no se limitan a, asma, dermatitis atópica, urticaria, hipersensibilidad al polen, choque anafiláctico, sinusitis (incluyendo sinusitis eosinofílica), reumatismo, esclerosis múltiple, artritis, lupus eritematoso sistémico, psoriasis, espondilitis anquilosante, enfermedad intestinal inflamatoria (por ejemplo, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn y enfermedad intestinal sensible al gluten), síndrome de Sjogren, enfermedad crónica de injerto contra huésped (GVHD), enfermedad infecciosa corneal, conjuntivitis alérgica, traumatismo corneal, polimiositis, dermatomiositis, miastenia grave, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y dermatoesclerosis. El péptido de la invención, o un agente neuroprotector, agente regenerador de nervios, agente supresor de la inflamación, promotor de la cicatrización de heridas o secretagogo de glándula exocrina que contiene el péptido, o la composición farmacéutica, se puede administrar por vía parenteral u oral, dependiendo de la enfermedad a tratar. La administración oral puede ser administración sublingual, intraoral u oral. Los ejemplos de administración parenteral incluyen la administración por vía intravenosa, intraarterial, subcutánea, local, intraperitoneal, intramuscular, nasal, transdérmica, transmucosal, intrameníngea, perrectal, intramuscular, intracerebral, intrameníngea, subaracnoidea, intradural, epidural, gotas oculares, gotas en el oído, gotas nasales o intraocular. Las vías intraoculares incluyen, más específicamente, las vías subconjuntival, subtenon e intravítrea. Una composición farmacéutica que contiene el péptido de la invención puede prepararse en una forma de dosificación apropiada para la vía de administración, y puede ser un colirio ocular, inyección, fármaco en polvo, preparación de infusión, gránulos, comprimidos o supositorios, por ejemplo, pero para administración parenteral es preferiblemente un colirio ocular, inyección o preparación de infusión, o un fármaco en polvo para preparación antes de su uso. Una formulación para administración intraocular puede ser una inyección intravítrea, inyección subconjuntival o inyección subtenon, por ejemplo. Tales formulaciones también pueden contener diversos adyuvantes farmacéuticamente aceptables, es decir, aditivos tales como vehículos u otros agentes auxiliares, que incluyen estabilizantes, agentes antisépticos, agentes calmantes y emulsionantes. También pueden usarse en combinación con otros fármacos que tienen efectos neuroprotectores, efectos supresores de la inflamación o efectos de secreción de glándula exocrina.

Los ejemplos de la invención descritos a continuación están destinados a servir simplemente como ilustración y no limitan el alcance técnico de la invención. El alcance técnico de la invención está limitado únicamente por la descripción en las reivindicaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1A: Síntesis de Fmoc-(D)-Tz(Trt)-OH (compuesto IV)

Se sintetizó Fmoc-D-Tz(Trt)-OH (compuesto IV) según el siguiente esquema de reacción.

[Fórmula Química 7]

Etapa A: Síntesis de Fmoc-D-Ala(β-CN)-OH:

[Fórmula Química 8]

Después de añadir una solución de piridina (30 ml) e hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (3,96 g, 21 mmoles) suspendido en acetonitrilo (35 ml) a una solución de Fmoc-D-Asn-OH (5,04 g, 14 mmoles) en acetonitrilo (35 ml), a 0 °C, la mezcla se agitó durante 4 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida, se añadió acetato de etilo al residuo, la mezcla se lavó con ácido clorhídrico 3 M y salmuera y se secó sobre sulfato sódico, y el disolvente se retiró por destilación a presión reducida. El producto en bruto obtenido se disolvió en acetona y se añadió hexano/éter dietílico (1/1) para producir un precipitado, que después se concentró a presión reducida y se filtró para obtener el compuesto diana (4,76 g, 99 %) como un sólido blanco.

<1>H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,20 (1H, brs), 8,08 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,90 (2H, d, J = 7,6 Hz), 7,72 (2H, d, J = 7,2 Hz), 7,42 (2H, t, J = 7,2 Hz), 7,33 (2H, t, J = 7,6 Hz), 4,39-4,32 (3H, m), 4,25 (1H, t, J = 7,2 Hz), 2,98 (1H, dd, J = 16,8, 4,8 Hz), 2,88 (1H, dd, J = 16,8, 9,2 Hz).

Etapa B: Síntesis de Fmoc-D-Tz-OH:

[Fórmula Química 9]

En la fórmula estructural mostrada anteriormente, H está unido a N1 o N2 en el anillo tetrazol.

Después de añadir óxido de dibutilestaño (0,710 g, 2,9 mmoles) y trimetilsililazida (1,8 ml, 14 mmoles) a una solución de Fmoc-D-Ala(β-CN)-OH (1,01 g, 3,0 mmoles) en tolueno (18 ml), la mezcla se calentó en un microondas a 100 °C durante 1,5 horas. La mezcla de reacción se devolvió a temperatura ambiente y se filtró. La sustancia filtrada obtenida se lavó con tolueno y hexano y se disolvió en etanol/diclorometano (3/2,25 ml), y después se enfrió a 4 °C, después de lo cual se añadió ácido clorhídrico 1 M (5 ml) y la mezcla se agitó durante 2 horas y 15 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se lavó con ácido clorhídrico 1 M y salmuera, el disolvente se retiró por destilación a presión reducida y después se añadió hexano para formar una suspensión que se filtró para obtener un sólido amarillo pálido del compuesto diana (1,03 g, 90 %).

<1>H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 16,00 (1H, brs), 13,07 (1H, brs), 7,89 (2H, d, H = 7,6 Hz), 7,83 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,65 (2H, t, J = 8,0 Hz), 7,41 (2H, t, J = 7,6 Hz), 7,31 (2H, t, J = 7,6 Hz), 4,53-4,48 (1H, m), 4,27-4,18 (3H, m), 3,40 (1H, dd, J = 15,2, 6,0 Hz), 3,28 (1H, dd, J = 15,2, 8,8 Hz).

Etapa C: Síntesis de Fmoc-D-Tz(Trt)-OH:

[Fórmula Química 10]

En la fórmula estructural mostrada anteriormente, un grupo Trt está unido a N1 o N2 en el anillo tetrazol.

Después de añadir N-metilmorfolina (0,72 ml, 7,2 mmoles) y cloruro de tritilo (1,63 g, 5,9 mmoles) a una solución de Fmoc-D-Tz-OH (1,99 g, 5,3 mmoles) en THF (10 ml), la mezcla se agitó durante 1,5 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se filtró y la sustancia filtrada se lavó con THF y se combinó con el filtrado, después de lo cual el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna (ODS, H2O/CH3CN = 80/20 → 30/70 → 20/80), la fracción que contenía el compuesto diana se extrajo con acetato de etilo, se lavó con salmuera y se secó sobre sulfato sódico, y después el disolvente se retiró por destilación a presión reducida y el secado al vacío se llevó a cabo a 60 °C para obtener el compuesto diana (1,29 g, 40 %) como un sólido blanco.

<1>H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,03 (1H, brs), 7,91 (2H, d, J = 7,6 Hz), 7,79 (1H, d, J = 8,8 Hz), 7,67 (2H, brd, J = 6,8 Hz), 7,44-7,23 (13H, m), 7,01-6,99 (6H, m), 4,52-4,46 (1H, m), 4,28-4,15 (3H, m), 3,40 (1H, dd, J = 15,2, 5,2 Hz), 3,27 (1H, dd, J = 15,2, 9,2 Hz).

Ejemplo 1B: síntesis de Fmoc-nvTz(Trt)-OH (compuesto X)

Se sintetizó Fmoc-nvTz(Trt)-OH (compuesto X) según el siguiente esquema de reacción.

[Fórmula Química 11]

Etapa D: Síntesis de Boc-Nε-trifluoroacetil-L-lisina:

[Fórmula Química 12]

Después de añadir una solución acuosa de hidróxido de sodio 1 M (42 ml, 42 mmoles) y Boc2O (solución al 30 % en THF, 49,8 g, 68 mmoles) a una solución de Nε-trifluoroacetil-L-lisina (10,0 g, 41 mmoles) en 1,4-dioxano (70 ml), la mezcla se agitó durante 1 día a temperatura ambiente. Después de añadir después N-metilpiperazina (3,5 ml) a la mezcla de reacción y agitar durante 2 horas a temperatura ambiente, se añadió ácido clorhídrico 1 M para ajustar la mezcla de reacción a pH 2, y se extrajo con acetato de etilo y se lavó con salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida para obtener el compuesto del título (15,9 g, >100 %) como un sólido blanco.

<1>H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 6,69 (1H, brs), 5,12 (1H, d, J = 6,8 Hz), 4,30 (1H, brs), 3,38 (2H, q, J = 6,8 Hz), 1,94-1,86 (1H, m), 1,74-1,57 (3H, m), 1,52-1,41 (3H, m), 1,45 (9H, s).

Etapa E: Síntesis de ácido (S)-2-[(terc-butoxicarbonil)amino]-5-cianopentanoico

[Fórmula Química 13]

Después de añadir Boc-Nε-trifluoroacetil-L-lisina (1,00 g, 2,9 mmoles), hidróxido sódico (276,4 mg, 6,9 mmoles) y agua (15 ml) a un matraz, se añadieron solución acuosa de hexahidrato de sulfato de níquel(II) (77,0 mg, 0,29 mmoles) (1,0 ml), peroxodisulfato sódico (1,43 g, 6,0 mmoles) e hidróxido sódico (529,5 mg, 13 mmoles) y la mezcla se agitó durante 19,5 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se ajustó a pH 2 con ácido clorhídrico 1 M y se extrajo con acetato de etilo, la capa orgánica obtenida se lavó con salmuera y se secó sobre sulfato sódico, y el disolvente se retiró por destilación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (diclorometano/metanol = 100/0 → 95/5) para obtener el compuesto del título (661,5 mg, 86 %) como un sólido blanco.

<1>H RMN (400 Mz, DMSO-d6) δ 12,53 (1H, brs), 7,14 (1H, d, J = 8,4 Hz), 3,93-3,88 (1H, m), 2,53-2,48 (2H, m), 1,81-1,74 (1H, m), 1,69-1,56 (3H, m), 1,39 (9H, m)

Etapa G: Síntesis de ácido (S)-2-({[(9H-fluoren-9-il)metoxi]carbonil}amino)-5-cianopentanoico:

[Fórmula Química 14]

Una solución de ácido (S)-2-[(terc-butoxicarbonil)amino]-5-cianopentanoico (586,3 g, 2,4 mmoles) en diclorometano (2,5 ml) se enfrió hasta 0°C, y después se añadió ácido trifluoroacético (2,5 ml) y la mezcla se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. El disolvente de la mezcla de reacción se eliminó por destilación a presión reducida. Después de añadir 1,4-dioxano (3,0 ml) al residuo obtenido, se añadieron una solución acuosa de carbonato potásico al 10 % y carbonato potásico sólido a pH 9, y después se añadió Fmoc-OSu (1,26 g, 3,7 mmoles) y la mezcla se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con una solución de acetato de etilo/hexano (1/1) y se lavó con ácido clorhídrico 0,5 M y salmuera, y después la capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato sódico y el disolvente se retiró por destilación a presión reducida. El residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/hexano = 10/90 → 31/69) para obtener el compuesto del título (731,1 mg, 83 %) como un sólido blanco.

<1>H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,76 (2H, d, J = 7,2 Hz), 7,58 (2H, brd, J = 6,8 Hz), 7,40 (2H, t, J = 7,2 Hz), 7,31 (2H, t, J = 6,8 Hz), 5,38 (1H, d, J = 7,6 Hz), 4,64-4,36 (3H, m), 4,20 (1H, J = 6,4 Hz), 2,38 (1H, brt, J = 6,4 Hz), 2,28-2,07 (2H, m), 1,88-1,41 (3H, m)

Etapa H: Síntesis de Fmoc-nvTz-OH

[Fórmula Química 15]

En la fórmula estructural mostrada anteriormente, H está unido a N1 o N2 en el anillo tetrazol.

Después de añadir trimetilsililazida (1,2 ml, 9,2 mmoles) a una solución de ácido (S)-2-({[(9H-fluoren-9-il)metoxi]carbonil}amino)-5-cianopentanoico (851 mg, 2,3 mmoles) y óxido de dibutilestaño (581 mg, 2,3 mmoles) en tolueno (17 ml), la mezcla se calentó en un microondas a 100 °C durante 1,5 horas. La mezcla de reacción se devolvió a temperatura ambiente y se filtró, y el sólido obtenido se lavó con tolueno y hexano para obtener un sólido naranja pálido. Después de añadir etanol/diclorometano (3/2,50 ml) al sólido y enfriar hasta 0 °C, se añadió ácido clorhídrico 1 M (5,0 ml) y la mezcla se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. Se añadió acetato de etilo a la mezcla de reacción y la mezcla resultante se lavó con ácido clorhídrico 1 M y salmuera y se secó sobre sulfato sódico, y el disolvente se retiró por destilación a presión reducida. El residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (diclorometano/metanol = 100/0 → 95/5) para obtener el compuesto del título (367 mg, 39 %).

<1>H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,88 (2H, d, J = 7,6 Hz), 7,72 (2H, d, J = 7,2 Hz), 7,63 (1H, d, J = 7,6 Hz), 7,40 (2H, t, J = 7,6 Hz), 7,31 (2H, t, J = 7,2 Hz), 4,29-4,20 (3H, m), 4,01-3,96 (1H, m), 2,89 (2H, m), 1,78-1,46 (5H, m).

Etapa I: Síntesis de Fmoc-nvTz(Trt)-OH

[Fórmula Química 16]

En la fórmula estructural mostrada anteriormente, un grupo Trt está unido a N1 o N2 en el anillo tetrazol.

Después de añadir N-metilmorfolina (110 μl, 1,0 mmol) y cloruro de tritilo (261 mg, 0,94 mmoles) a una solución de Fmoc-nvTz-OH (365 mg, 0,89 mmoles) en THF (4,0 ml), la mezcla se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. Tras completarse la reacción y filtrar, el disolvente del filtrado obtenido se eliminó por destilación a presión reducida para obtener el compuesto del título (540 mg, 93 %) como un sólido blanco.

<1>H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,67 (1H, s), 7,89 (2H, d, J = 7,2 Hz), 7,72 (2H, m), 7,66 (1H, brs), 7,39-7,19 (13H, m), 7,02-6,98 (6H, m), 4,34-4,20 (3H, m), 3,98-3,94 (1H, m), 2,88-2,83 (2H, m), 1,77-1,62 (4H, m)

Ejemplo 1C: Síntesis de ácido (S)-2-({[(9H-fluoren-9-il)metoxi]carbonil}amino)-3-(5-oxo-4,5-dihidro-1,2,4-oxadiazol-3-il)propanoico (compuesto XV)

El compuesto ácido (S)-2-({[(9H-fluoren-9-il)metoxi]carbonil}amino)-3-(5-oxo-4,5-dihidro-1,2,4-oxadiazol-3-il)propanoico (compuesto XV) se sintetizó según el siguiente esquema de reacción.

[Fórmula Química 17]

Etapa I: Síntesis de (S)-2-[(terc- butoxicarbonil)amino]-3-cianopropanoato deterc-butilo

[Fórmula Química 18]

Después de añadir 2-bromo-2-metilpropano (46 ml, 409 mmoles) a una suspensión de Boc-Ala(CN)-OH (2,23 g, 10,4 mmoles), cloruro de benciltrietilamonio (2,38 g, 10,4 mmoles) y carbonato potásico (37,0 g, 268 mmoles) en DMA (60 ml), la mezcla se agitó durante 1 día a 55 °C. La mezcla de reacción se devolvió a temperatura ambiente, se añadió agua, la extracción se realizó con acetato de etilo y la capa orgánica obtenida se lavó con agua y salmuera y se secó sobre sulfato sódico y después el disolvente se retiró por destilación a presión reducida. El residuo obtenido se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna sobre gel de sílice (hexano/acetato de etilo = 1/0 → 1/4) para obtener el compuesto del título (2,79 g, 99 %) como un aceite incoloro.

<1>H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 5,45 (1H, brd, J = 4,8 Hz), 4,37 (1H, brq, J = 5,2 Hz), 2,94 (1H, dd, J = 16,8, 5,2 Hz), 2,88 (1H, dd, J = 16,8, 4,8 Hz), 1,51 (9H, s), 1,45 (9H, s).

Etapa J: Síntesis de(S)-2-[(terc-butoxicarbonil)amino-4-(hidroxiamino)-4-iminobutanoato deterc-butilo

[Fórmula Química 19]

Después de añadir trietilamina (2,8 ml, 20 mmoles) e hidrocloruro de hidroxilamina (1,08 g, 16 mmoles) a una solución de (S)-2-[(terc-butoxicarbonil)amino]-3-cianopropanoato deterc-butilo (2,79 g, 10 mmoles) en etanol (30 ml), la mezcla se agitó durante 4 horas a 95 °C. Se devolvió la mezcla de reacción a temperatura ambiente, se añadió agua, se extrajo la mezcla con acetato de etilo y se secó sobre sulfato de sodio, y se eliminó el disolvente por destilación a presión reducida y se secó al vacío para obtener el compuesto del título (2,85 g, 91 %) como un sólido amorfo blanco.

<1>H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 6,47 (1H, brs), 5,47 (1H, brs), 4,63 (2H, brs), 4,37 (1H, brs), 2,62-2,54 (2H, m), 1,46 (9H, s), 1,44 (9H, s).

Etapa K: Síntesis de (S)-2-[(terc-butoxicarbonil)amino]-3-(5-oxo-4,5-dihidro-1,2,4-oxadiazol-3-il)propanoato deterc-butilo

[Fórmula Química 20]

Después de añadir 1,1-carbonildiimidazol (627 mg, 3,9 mmoles) a una solución de (S)-2-[(terc-butoxicarbonil)amino]-4-(hidroxiamino)-4-iminobutanoato deterc-butilo (1,04 g, 3,4 mmoles) en THF (20 ml), la mezcla se agitó durante 1,5 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró, se añadió tolueno (20 ml) y la mezcla se agitó durante 2 horas a 100 °C. La mezcla de reacción se devolvió a temperatura ambiente, el disolvente se retiró por destilación a presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna sobre gel de sílice (hexano/acetato de etilo = 1/1) para obtener el compuesto del título (658,9 mg, 58 %) como un sólido amorfo blanco.

<1>H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,23 (1H, brs), 7,36 (1H, d, J = 8,0 Hz), 4,24 (1H, q, J = 8,0 Hz), 2,90 (1H, dd, J = 15,2, 7,2 Hz), 2,81 (1H, dd, J = 15,2, 8,4 Hz), 1,38 (9H, s), 1,37 (9H, s).

Etapa L: Síntesis de ácido (S)-2-({[(9H-fluoren-9-il)metoxi]carbonil}amino)-3-(5-oxo-4,5-dihidro-1,2,4-oxadiazol-3-il)propanoico

[Fórmula Química 21]

Después de añadir trietilsilano (1,0 ml) y ácido trifluoroacético (5,0 ml) a una solución de (S)-2-[(terc-butoxicarbonil)amino]-3-(5-oxo-4,5-dihidro-1,2,4-oxadiazol-3-il)propanoato deterc-butilo (658,9 mg, 2,0 mmoles) en diclorometano (4,0 ml) a 0 °C, la mezcla se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida, se añadieron éter dietílico y hexano, el disolvente se eliminó de nuevo por destilación a presión reducida, se añadió 1,4-dioxano (10 ml) y se añadió una solución acuosa saturada de hidrógenocarbonato sódico a pH 9. A continuación, se añadió Fmoc-OSu (813 mg, 2,4 mmoles) a 0 °C y la mezcla se agitó durante una noche a temperatura ambiente. Después de añadir una solución acuosa de ácido cítrico al 10 % a la mezcla de reacción para ajustar a pH 3, se extrajo con acetato de etilo y se secó sobre sulfato de sodio, el disolvente se retiró por destilación a presión reducida, y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (diclorometano/metanol = 100/0 → 93/7) para obtener el compuesto del título (465,3 mg, 59 %) como un sólido amorfo blanco.

<1>H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,89 (2H, d, J = 7,2 Hz), 7,70-7,63 (3H, m), 7,42 (2H, t, J = 7,2 Hz), 7,32 (2H, t, J = 7,2 Hz), 4,33-4,20 (4H, m), 2,96 (1H, dd, J = 15,2, 5,6 Hz), 2,80 (1H, dd, 15,2, 8,8 Hz),

Ejemplo 2: Síntesis peptídica

El péptido utilizado en el ensayo se sintetizó utilizando un sintetizador de péptidos (modelo: PSSM-8 de Shimadzu Corp.), utilizando síntesis en fase sólida por el método Fmoc. Los aminoácidos no naturales Fmoc-Tz-OH, Fmoc-Tz(trt)-OH y Fmoc-egTz(trt)-OH usados para la síntesis en fase sólida se adquirieron de Astatech Co., Fmoc-cya-OH se adquirió de Anaspec Co., y se usaron los compuestos (IV), (X) y (XV) sintetizados en el Ejemplo 1. F-moc-Ai-OH y Fmoc-Cn-OH se adquirieron de Watanabe Chemical Engineering, y se sintetizaron los péptidos 1 a 28 que tienen las siguientes secuencias. Los pesos moleculares de los péptidos sintéticos se analizaron por espectrometría de masas (MALDI TOF). Como se muestra en la Tabla 2, todos los valores medidos coincidían con los valores teóricos. La modificación N-terminal y C-terminal se llevó a cabo mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. [Tabla 2-1]

Tabla 2

[Tabla 2-2]

[Tabla 2-3]

En la tabla, Tz representa ácido aspártico sustituido con tetrazol, egTz representa ácido glutámico sustituido con tetrazol, nvTz representa ácido homoglutámico sustituido con tetrazol, cya representa ácido aspártico sustituido con sulfoxi, (5Oxa) representa ácido aspártico sustituido con oxadiazolona, Ai representa ácido α-aminoisobutírico y Cn representa β-cianoalanina. Tz(D) indica que el ácido aspártico sustituido con tetrazol es la forma D.

El Tz introducido para los péptidos 1 a 9 fue la forma racémica. Los aminoácidos usados para los otros péptidos eran formas L a menos que se especifique lo contrario.

Ejemplo 3: Ensayo de estabilidad 1

[Preparación de la muestra de medición 1]

Los péptidos sintetizados en el Ejemplo 2 (péptidos 1 a 9) se pesaron y disolvieron en tampón fosfato al 0,1 % (pH 7,0) para preparar soluciones peptídicas 1,0 mM. Las soluciones peptídicas 1,0 mM se diluyeron después con tampón fosfato hasta 100 μM. Después de filtrar con Chromatdisk (producto de Merck Millipore, Millex-GV, 0,22 μm), cada filtrado se dispensó en un vial de LC (vial Waters Desactived Qsert). Las soluciones peptídicas preparadas se incubaron durante un mes o 2 meses en un baño termostático a 40 °C para obtener muestras almacenadas. Se usó una muestra preparada simultáneamente entre las soluciones peptídicas que no se almacenaron como muestra estándar (muestra inicial). La muestra estándar y las muestras almacenadas se almacenaron a -30 °C hasta el análisis de las muestras.

[Permeabilidad a la humedad]

Usando el peso total de la solución peptídica acuosa y el recipiente de almacenamiento como el peso de la muestra, se registraron las mediciones como los pesos de la muestra antes del almacenamiento y los pesos de la muestra después del almacenamiento en diferentes condiciones de almacenamiento. También se midió el peso en vacío del recipiente de almacenamiento, y se determinó la permeabilidad a la humedad mediante la siguiente fórmula.

[Fórmula Matemática 1]

Después de agitar la muestra estándar y las muestras almacenadas con un mezclador vorticial, cada solución peptídica se transfirió a un vial de HPLC (vial Deactivated Qsert de Waters Co.). Se realizó HPLC de fase inversa (sistema de HPLC: Prominence de Shimadzu Corp.) en las condiciones mostradas en la Tabla 3 a continuación para el análisis de las soluciones peptídicas, y se obtuvieron cromatogramas.

[Condiciones de análisis de HPLC]

Columna: XSelect CSH C18, 5 µm, 4,6 x 250 mm, de Waters Co.

Columna de seguridad: XSelect CSH C18, 5 µm, cartucho de seguridad de 4,6 x 20 mm de Waters Co.

Longitud de onda de detección: 220 nm

Fase móvil A: solución acuosa de ácido fórmico al 0,1 %

fase móvil B: solución de formiato de acetonitrilo al 0,1 %

Tiempo de medición: 30 minutos

Tasa de inyección de la muestra de medición: 50 μl

Caudal: 1,0 ml/min

Temperatura de la columna: 40 °C

Suministro de fase móvil: La relación de mezcla de la fase móvil A y la fase móvil B se varió como se muestra en la Tabla 3 para el control del gradiente de concentración lineal.

[Tabla 3]

Tabla 3

Se calculó el valor del área del pico para el péptido en el cromatograma, y se calculó la tasa de supervivencia (tasa de supervivencia antes de la corrección para el agua) usando la fórmula (2). La tasa de supervivencia después de la corrección para el agua también se calculó a partir de la tasa de supervivencia antes de la corrección para el agua usando la fórmula (3) para tener en cuenta la permeabilidad del recipiente.

[Fórmula Matemática 2]

La Tabla 4 muestra la tasa de supervivencia después de la corrección para el agua para cada péptido entre las muestras almacenadas.

[Tabla 4]

Tabla 4

Todos los péptidos exhibieron una alta estabilidad en solución acuosa a las 4 semanas y 8 semanas a 40 °C, en comparación con PACAP27.

[Preparación de la muestra de medición 2]

Las soluciones peptídicas preparadas por el mismo método que [Preparación de la muestra de medición 1] para los péptidos sintetizados en el Ejemplo 2 (péptidos 13 a 16) se incubaron durante 2 semanas y 8 semanas en un baño termostático a 40 °C para obtener muestras almacenadas. Se usó una muestra preparada simultáneamente entre las soluciones peptídicas que no se almacenaron como muestra estándar (muestra inicial). La muestra estándar y las muestras almacenadas se almacenaron a -30 °C hasta el análisis de las muestras.

[Condiciones de análisis de HPLC]

La medición se llevó a cabo en las mismas condiciones que en [Preparación de la muestra de medición 1], cambiando solo el tiempo de medición y las condiciones de suministro de la fase móvil como se muestra a continuación.

Tiempo de medición: 20 minutos

Suministro de fase móvil: La relación de mezcla de la fase móvil A y la fase móvil B se varió como se muestra en la Tabla 5 para el control del gradiente de concentración lineal.

[Tabla 5]

Tabla 5

La Tabla 6 muestra la tasa de supervivencia después de la corrección para el agua para cada péptido entre las muestras almacenadas.

[Tabla 6]

Tabla 6

Incluso los péptidos con diferente estereoquímica de los residuos de aminoácidos sustituidos con tetrazol y diferentes longitudes entre el tetrazol y la cadena principal peptídica presentaron mayor estabilidad que PACAP27.

[Preparación de la muestra de medición 3]

Las soluciones peptídicas preparadas por el mismo método que [Preparación de la muestra de medición 1] para los péptidos sintetizados en el Ejemplo 2 (péptidos 17 a 21) se incubaron durante 4 semanas en un baño termostático a 40 °C para obtener muestras almacenadas. Se usó una muestra preparada simultáneamente entre las soluciones peptídicas que no se almacenaron como muestra estándar (muestra inicial). La muestra estándar y las muestras almacenadas se almacenaron a -30 °C hasta el análisis de las muestras.

[Condiciones de análisis de HPLC]

La medición se llevó a cabo en las mismas condiciones que en [Preparación de la muestra de medición 1], cambiando solo el tiempo de medición y las condiciones de suministro de la fase móvil como se muestra a continuación.

Tiempo de medición: 20 minutos

Suministro de fase móvil: La relación de mezcla de la fase móvil A y la fase móvil B se varió como se muestra en la Tabla 7 para el control del gradiente de concentración lineal.

[Tabla 7]

Tabla 7

La Tabla 8 muestra la tasa de supervivencia después de la corrección para el agua para cada péptido entre las muestras almacenadas.

[Tabla 8]

Tabla 8

Los péptidos con diferentes grupos acilo que se sustituyen en el extremo N mostraron una estabilidad mayor que PACAP27.

[Preparación de la muestra de medición 4]

Una solución peptídica preparada por el mismo método que [Preparación de la muestra de medición 1] para el péptido 22 sintetizado en el Ejemplo 2 se incubó durante 1 semana y 4 semanas en un baño termostático a 40 °C para obtener muestras almacenadas. Se usó una muestra preparada simultáneamente entre las soluciones peptídicas que no se almacenaron como muestra estándar (muestra inicial). La muestra estándar y las muestras almacenadas se almacenaron a -30 °C hasta el análisis de las muestras.

[Condiciones de análisis de HPLC]

La medición se llevó a cabo en las mismas condiciones que en [Preparación de la muestra de medición 1], cambiando solo el tiempo de medición y las condiciones de suministro de la fase móvil como se muestra a continuación.

Tiempo de medición: 20 minutos

Suministro de fase móvil: La relación de mezcla de la fase móvil A y la fase móvil B se varió como se muestra en la Tabla 9 para el control del gradiente de concentración lineal.

[Tabla 9]

Tabla 9

La Tabla 10 muestra la tasa de supervivencia después de la corrección para el agua para cada péptido entre las muestras almacenadas.

[Tabla 10]

Tabla 10

Los péptidos que tienen sustitución del ácido aspártico sustituido con tetrazol con ácido aspártico sustituido con oxadiazolona en la posición 3 y la posición 8 exhibieron una estabilidad mayor que PACAP27.

[Preparación de la muestra de medición 5]

Los péptidos 23 a 30 sintetizados en el Ejemplo 2 se pesaron y disolvieron en tampón Tris (pH 7,0) para preparar soluciones peptídicas 1,0 mM. La solución se filtró con un Chromatdisk (producto de Merck Millipore, Millex-GV, 0,22 μm). El filtrado se diluyó hasta 100 μM con tampón Tris (pH 7,0) y se dispensó en un tubo (Tubo Protein LoBind de Eppendorf Co.). Las soluciones peptídicas preparadas se incubaron durante 4 semanas u 8 semanas en un baño termostático a 40 °C, y durante una semana o 2 semanas en un baño termostático a 60 °C, para obtener muestras almacenadas. Se usó una muestra preparada simultáneamente entre las soluciones peptídicas que no se almacenaron como muestra estándar (muestra inicial). La muestra estándar se almacenó a -30 °C y las muestras almacenadas se almacenaron a -30 °C, hasta el análisis de las muestras.

[Condiciones de análisis de HPLC 1]

La medición se llevó a cabo en las mismas condiciones que en [Preparación de la muestra de medición 1], cambiando solo el tiempo de medición y las condiciones de suministro de la fase móvil como se muestra a continuación.

Tiempo de medición: 20 minutos

Suministro de fase móvil: La relación de mezcla de la fase móvil A y la fase móvil B se varió como se muestra en la Tabla 11 para el control del gradiente de concentración lineal.

[Tabla 11]

Tabla 11

El siguiente tiempo de gradiente se usó sólo para el péptido 30.

[Tabla 12]

Tabla 12

La Tabla 13 muestra la tasa de supervivencia después de la corrección para el agua para cada péptido entre las muestras almacenadas.

[Tabla 13]

Tabla 13

Ejemplo 4: Ensayo de estabilidad 2

Se prepararon péptidos acilados en el N-terminal para péptidos seleccionados del grupo que consiste en los péptidos 1 a 16. Se prepararon péptidos sin modificación de acilación N-terminal para péptidos seleccionados del grupo que consiste en los péptidos 17 a 30. Los péptidos modificados en el N-terminal y los péptidos no modificados en el N-terminal se disolvieron cada uno en tampón Tris (pH 7,0) para preparar soluciones peptídicas 1,0 mM. La solución se filtró con un Chromatdisk (producto de Merck Millipore, Millex-GV, 0,22 μm). El filtrado se diluyó hasta 100 μM con tampón Tris (pH 7,0) y se dispensó en un tubo (Tubo Protein LoBind de Eppendorf Co.). Las soluciones peptídicas preparadas se incubaron durante 1 semana o 2 semanas en un baño termostático a 60 °C para obtener muestras almacenadas. Se usó una muestra preparada simultáneamente entre las soluciones peptídicas que no se almacenaron como muestra estándar (muestra inicial). La muestra estándar y las muestras almacenadas se almacenaron a -30 °C hasta el análisis de las muestras.

La muestra almacenada se analizó en condiciones de análisis de HPLC apropiadas, y la tasa de supervivencia después de la corrección para el agua para el péptido en la muestra almacenada se calculó de la misma manera que en el Ejemplo 3. Se puede confirmar que los péptidos modificados en el N-terminal, y especialmente acilados en el N-terminal, y acetilados adicionales tienen una estabilidad mejorada.

Ejemplo de referencia: Ensayo de estabilidad 3

Los péptidos preparados para los Ejemplos de Referencia 1 a 6 se pesaron y disolvieron en tampón Tris (pH 7,0) para preparar soluciones peptídicas 1,0 mM. La solución se filtró con un Chromatdisk (producto de Merck Millipore, Millex-GV, 0,22 μm). El filtrado se diluyó hasta 100 μM con tampón Tris (pH 7,0) y se dispensó en un tubo (Tubo Protein LoBind de Eppendorf Co.). Las soluciones peptídicas preparadas se incubaron durante 1 semana o 2 semanas en un baño termostático a 60 °C para obtener muestras almacenadas. Se usó una muestra preparada simultáneamente entre las soluciones peptídicas que no se almacenaron como muestra estándar (muestra inicial). La muestra estándar y las muestras almacenadas se almacenaron a -30 °C hasta el análisis de las muestras.

Cada muestra almacenada se midió en las siguientes condiciones de análisis por HPLC, y la tasa de supervivencia después de la corrección para el agua para cada péptido entre las muestras almacenadas se calculó de la misma manera que en el Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la Tabla 15.

[Condiciones de análisis de HPLC]

Columna: XSelect CSH C18 de Waters Co., 5 μm, 4,6 x 250 mm

Columna de seguridad: XSelect CSH C18 de Waters Co., 5 μm, cartucho de seguridad de 4,6 x 20 mm Longitud de onda de detección: 220 nm

Fase móvil A: solución acuosa de ácido fórmico al 0,1 %

Fase móvil B: solución de formiato de acetonitrilo al 0,1 %

Tiempo de medición: 20 minutos

Tasa de inyección de la muestra de medición: 50 μl

Caudal: 1,0 ml/min

Temperatura de la columna: 40 °C

Enfriador de muestras: 25 °C

Suministro de fase móvil: La relación de mezcla de la fase móvil A y la fase móvil B se varió como se muestra en la Tabla 14 para el control del gradiente de concentración lineal.

[Tabla 14]

Tabla 14

La Tabla 15 muestra la tasa de supervivencia después de la corrección para el agua para cada péptido entre las muestras almacenadas.

[Tabla 15]

Tabla 15

El Ejemplo de Referencia 1 (PACAP) tuvo una estabilidad muy pobre, al 26,6 % después del almacenamiento durante 1 semana a 60 °C y el 15,8 % después del almacenamiento durante 2 semanas, mientras que el Ejemplo de Referencia 2, que tenía el extremo N de PACAP acetilado, mostró solo estabilidad equivalente. Los Ejemplos de Referencia 3 y 4, por otro lado, que tenían los grupos carboxilo de los ácidos aspárticos en la posición 3 y la posición 8 reemplazados por tetrazol (Ejemplo de Referencia 3 que también tenía la metionina en la posición 17 reemplazada por norleucina (indicada como "Nl" en la secuencia) y el Ejemplo de Referencia 4 que además tenía la metionina en la posición 17 reemplazada por leucina), tuvieron una estabilidad drásticamente aumentada, al 91,3 % y 91,7 % después del almacenamiento durante 1 semana a 60 °C, y 82,4 % y 84,8 % después del almacenamiento durante 2 semanas. En los Ejemplos de Referencia 5 y 6, en donde los extremos N de los Ejemplos de Referencia 3 y 4 se acetilaron adicionalmente, la estabilidad se mejoró adicionalmente, con 98,1 % y 98,4 % después del almacenamiento durante 1 semana a 60 °C, y 92,9 % y 92,8 % después del almacenamiento durante 2 semanas. Una prueba acelerada durante 1 semana y 2 semanas a 60 °C corresponde respectivamente a aproximadamente 1 año y 2 años a temperatura ambiente (25 °C). Por lo tanto, se espera que los Ejemplos de Referencia 5 y 6 sean estables (tasa de supervivencia del 90 % o superior) durante 2 años a temperatura ambiente.

Ejemplo 5: Ensayo de AMPc de PACAP27 y su péptido modificado

[Cultivo celular]

Se prepararon células CHO-K1 (línea celular de alta expresión del receptor PAC1 o VPAC1: adquiridas en DiscoveRx Co.) que se habían tratado con mitomicina, y células congeladas con reactivo de siembra celular (producto de DiscoveRx) a 1,35 x 10<4>células/100 μl/pocillo, y después se sembraron en una placa de cultivo de 96 pocillos. Las células se cultivaron durante 18 a 24 horas a 37 °C en un incubador con CO2al 5 %, adhiriendo las células a la placa.

[Preparación de reactivos]

Los péptidos 1 a 30 sintetizados en el Ejemplo 2, y el polvo del Ejemplo de Referencia 1 (PACAP) se disolvieron en agua a 0,1 mM, y después se diluyeron a 20 µM con tampón de ensayo celular (DiscoveRx) (que contenía IBMX 0,5 mM y BSA al 0,001 %). Se preparó entonces una serie de diluciones de 5 veces con el mismo tampón de ensayo celular y se usó en un ensayo.

[Ensayo de AMPc]

El ensayo de AMPc se llevó a cabo usando un kit de ensayo de AMPc Hit Hunter para Biológicos (producto de DiscoveRx, No. de Cat.90-0075LM25), según las instrucciones incluidas en el kit. La solución de anticuerpo de AMPc y las soluciones de péptidos 1 a 30 diluidos a diferentes concentraciones se combinaron para preparar mezclas líquidas de péptido-anticuerpo de AMPc. A continuación, se retiró el medio de cultivo de la placa de cultivo celular de CHO-K1, se realizó el lavado con PBS y se añadieron las mezclas líquidas de péptido-anticuerpo de AMPc a las células y se incubaron durante 30 minutos bajo una atmósfera de CO2al 5 % a 37 °C. Después, se añadió una solución de detección de trabajo y la placa de cultivo se protegió de la luz con papel de aluminio y se incubó a 25 °C durante 1 hora. Después de la incubación, se añadió la Solución A y la placa de cultivo se protegió de la luz con papel de aluminio y luego se incubó a 25 °C durante 3 horas. Finalmente, la señal de quimioluminiscencia se detectó usando un detector GloMax (Promega) en condiciones con luminiscencia y un tiempo de integración de 1 seg. El valor obtenido para la Unidad de Luminiscencia Relativa (RLU) se analizó con GraphPad Prism Ver 6.05 (producto de Graph Pad) y se calculó el valor de CE50el valor para cada péptido.

[Tabla 16]

Tabla 16

Para resumir los resultados descritos anteriormente, los péptidos de la invención (péptidos 1 a 30) tienen una estabilidad extremadamente mejorada en solución acuosa en comparación con PACAP, mientras que también mantienen una actividad fisiológica equivalente a la de PACAP. En particular, debido a que tienen una vida de almacenamiento superior a 2 años a temperatura ambiente, permiten desarrollar formulaciones líquidas como productos tales como viales, ampollas y gotas oculares.

Ejemplos de formulación

Una medicina que contiene un péptido de la invención como ingrediente activo puede producirse mediante la siguiente formulación. La medicina de la presente invención se ilustrará ahora adicionalmente mediante ejemplos de formulación, entendiéndose que la invención no se limita a los ejemplos de formulación.

1. Cápsulas

Después de mezclar las cantidades totales de (1), (2) y (3) y 1/2 de (4), la mezcla se granula. Se añade la cantidad remanente de (4) y se encapsula toda la mezcla en cápsulas de gelatina.

2. Comprimidos

Después de mezclar las cantidades totales de (1), (2) y (3), 2/3 de (4) y 1/2 de (5), la mezcla se granula. Las cantidades remanentes de (4) y (5) se añaden a los gránulos, que después se moldean a presión en comprimidos.

3. Inyección vítrea

Los componentes (1) a (6) se disuelven en el agua purificada esterilizada (7) para preparar una inyección vítrea. 4. Fármaco oftálmico

Los componentes (1) a (4) se disolvieron en el agua purificada esterilizada (5) y el pH se ajustó para preparar gotas oculares.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido que consiste en la secuencia representada por H-X1-D-G-X2-F-X3-D-X4-Y-X5-R-Y-R-K-X6-X7-A-V-K-K-Y-L-A-A-V-L (SEQ ID NO: 3)

{en donde

X1es un aminoácido neutro,

X2es un aminoácido neutro,

X3es un aminoácido neutro,

X4es alanina, serina, Ai o Cn,

X5es alanina, serina, Ai o Cn,

X6es glutamina o alanina y

X7es un aminoácido no polar},

con los ácidos aspárticos en la posición 3 y en la posición 8 cada uno reemplazado independientemente por un residuo seleccionado del grupo que consiste en ácido aspártico sustituido con tetrazol (Tz), ácido glutámico sustituido con tetrazol (egTz), ácido homoglutámico sustituido con tetrazol (nvTz), ácido aspártico sustituido con sulfoxi (cya) y ácido aspártico sustituido con oxadiazolona (5Oxa), o su secuencia modificada, en donde el péptido tiene afinidad por PAC1R y VPAC1R, y la secuencia modificada es la secuencia enumerada como SEQ ID NO: 3, en donde:

(A) se añaden de 1 a 10 aminoácidos en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal, o

(B) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las siguientes:

GKRYKQRVKNK (SEQ ID NO 43);

GKRYKQRVKN (SEQ ID NO 44);

GKRYKQRVK (SEQ ID NO 45);

GKRYKQRV (SEQ ID NO: 46);

GKRYKQR (SEQ ID NO: 47);

GKRYKQ (SEQ ID NO: 48);

GKRYK (SEQ ID NO: 49);

GKRY (SEQ ID NO: 50)

GKR;

GRR;

GK; y

GR

G;

se añade al extremo C del péptido, o

(C) uno o dos, preferiblemente un aminoácido, se deleciona en el extremo N-terminal o C-terminal.

2. El péptido según la reivindicación 1, en donde X1es serina o alanina, y/o

en donde X2es isoleucina o alanina, y/o

en donde X3es alanina o treonina, y/o

en donde X7es metionina, leucina, norleucina o alanina.

3. El péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde en los casos en donde los aminoácidos en la posición 3 y la posición 8 son ácido aspártico sustituido con tetrazol (Tz), ácido glutámico sustituido con tetrazol (egTz) o ácido homoglutámico sustituido con tetrazol (nvTz), los aminoácidos son las formas L, las formas D o las formas racémicas.

4. El péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el extremo N del péptido está modificado con un grupo protector, en donde opcionalmente el grupo protector es un grupo acilo.

5. El péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el extremo C del péptido está modificado con un grupo protector, en donde opcionalmente el grupo protector es un grupo amida o un grupo éster.

6. El péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1(A) a 5, en donde la secuencia modificada es la secuencia con 1 a 3 aminoácidos añadidos al extremo N de la secuencia.

7. Un agente neuroprotector que contiene el péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un secretagogo lagrimal que contiene el péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Un agente antiinflamatorio que contiene el péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

10. Un mejorador de la función endotelial vascular que contiene el péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

11. Un agente de tratamiento del daño epitelial corneal o endotelial corneal que contiene el péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

12. Un agente de tratamiento del ojo seco que contiene el péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

13. Una composición farmacéutica que contiene el péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.