ES2991300T3 - Antagonistas de PTGDR-1 y/o PTGDR-2 para prevenir y/o tratar lupus eritematoso sistémico - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un antagonista de PTGDR-1, un antagonista de PTGDR-2, un antagonista dual PTGDR-1/PTGDR-1, o una combinación de antagonista de PTGDR-1 y antagonista de PTGDR-2, y composiciones farmacéuticas que los contienen, para su uso en la prevención y/o tratamiento del LES. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Antagonistas de PTGDR-1 y/o PTGDR-2 para prevenir y/o tratar lupus eritematoso sistémico

[0001] La presente invención se refiere a un doble antagonista de PTGDR-1/PTGDR-2, y composiciones farmacéuticas que lo contienen, para su uso en la prevención y/o tratamiento de la nefritis lúpica.

[0002] El lupus eritematoso sistémico (LES) es una enfermedad autoinmune multifactorial que puede afectar a varios órganos, tales como las articulaciones y la piel, y puede ser letal cuando no se controla la afectación renal (nefritis lúpica, LN). Si se considera como una enfermedad de células B, tanto el sistema inmunitario innato como el adaptativo se desregulan durante el LES y actúan en sinergia para amplificar la producción de los principales factores patogénicos del lupus, que son autoanticuerpos dirigidos principalmente contra antígenos nucleares (ANA), tales como el ADN bicatenario (dsADN). Una vez agregados a sus antígenos y factores del complemento, estos autoanticuerpos formarán complejos inmunitarios circulantes que mediarán una inflamación crónica cuando se depositen en el órgano diana. Los brotes de la enfermedad suelen controlarse mediante tratamientos inmunosupresores fuertes y dosis altas de corticosteroides. Ensayos clínicos recientes apuntaron a disminuir la producción de autoanticuerpos en sujetos con LES dirigiéndose directamente al compartimento de células B, pero no lograron demostrar una eficacia suficiente. Desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para prevenir la aparición de brotes representa un gran desafío para la comunidad biomédica.

[0003] Los basófilos son uno de los leucocitos circulantes menos representados y son bien conocidos por su participación en enfermedades alérgicas y parasitarias. Durante la última década, se ha demostrado que los basófilos tienen potentes funciones inmunorreguladoras a pesar de su débil representación. Anteriormente se ha demostrado que los basófilos pueden apoyar la supervivencia de las células plasmáticas y la producción de anticuerposin vivo,a la vez que expresan algunos factores activadores de células B, tales como BAFf (factor activador de células B), CD40L (ligando CD40 o CD154), interleucina (IL)-4 e IL-6 ((Voehringer, D., Nat. Rev. Immunol. 13, 362-375 (2013); Charles, N. et al., Nat. Med. 16, 701-707 (2010)). Esta función inmunomoduladora está asociada a su capacidad de acumularse en los órganos linfoides secundarios (OLS) donde pueden ayudar a las células T y B en la diferenciación y maduración (Charles, N. et al., Nat. Med. 16, 701-707 (2010); Leyva-Castillo, JM, et al., Nat Commun 4, 2847 (2013); Otsuka, A., et al., Nat Commun 4, 1739 (2013)). Los mecanismos que conducen a la acumulación de basófilos OLS son poco conocidos.

[0004] El ligando 12 del motivo C-X-C (CXCL12) es una quimiocina secretada principalmente por células del estroma de la médula ósea, cavidad peritoneal, OLS y riñones. CXCL12 actúa como una quimiocina homeostática al regular la distribución fisiológica de las células madre mesenquimales, las células B y los neutrófilos a través de su interacción específica con el receptor 4 del motivo C-X-C (CXCR4). La sobreexpresión de CXCL12 tiene lugar en tejidos inflamados y es patógena en el cáncer y la nefritis lúpica, entre otras enfermedades (Wang, A., et al., J. Immunol. 182, 4448-4458 (2009)); Balabanian, K., et al., J. Immunol. 170, 3392-3400 (2003)); Hummel, S., Van Aken, H. y Zarbock, A.. Curr. Opin. Hematol. 21, 29-36 (2014)).

[0005] La prostaglandina D2 (PGD2) se produce a partir del ácido araquidónico por las ciclooxigenasas y las PGD2 sintasas específicas de tejido (PGDS). La PGD2 contribuye a varias funciones homeostáticas y está implicada en el inicio y la resolución de la inflamación a través de sus interacciones con los dos receptores de PGD2 conocidos (PTg Drs): PTGDR-1 (o DP, receptor de prostanoide D) y PTGDR-2 (o DP-2, también conocido como molécula homóloga del receptor quimioatrayente expresada en las células T auxiliares de tipo 2 (T<h>2), CRTH2). Los basófilos expresan el nivel más alto del ubicuo PTGDR-1 entre los leucocitos de sangre periférica. La expresión de PTGDR-2 es más restringida y media la activación y la quimiotaxis de basófilos, eosinófilos y células T T<h>2 CD4+. Los efectos de estos dos receptores pueden ser competitivos o cooperativos. La PGD2 se ha relacionado con enfermedades alérgicas y pulmonares, colitis ulcerosa y fibrosis renal. Recientemente se descubrió que la PGDS tipo lipocalina (L-PGDS) se expresaba de novo en riñones inflamados (Nagata, N., et al., FEBS J 276, 7146-7158 (2009) y en la orina de pacientes con NL activa (Suzuki, M., et al., Pediatr. Res. 65, 530-536 (2009); Somparn, P., et al., J. Proteomics 75, 3240-3247 (2012)).

[0006] Sin embargo, el eje PGD2/PTGDRs no se ha caracterizado en el LES.

[0007] A este respecto, la solicitud de patente internacional WO 2009/085177 ha descrito dobles antagonistas de PTGDR-1/PTGDR-2 y ha sugerido que estos antagonistas podrían ser útiles en la prevención y/o el tratamiento de una lista de enfermedades, incluido el LES. Sin embargo, el único efecto terapéutico evaluado concretamente en este documento es contra el asma. La prevención y/o el tratamiento propuestos para el LES no están fundamentados. WO 2007/042035 divulga el uso del antagonista del receptor de prostaglandina D2 laropiprant en combinación con un éster de ácido fumárico para el tratamiento del LES y la nefritis lúpica.

[0008] Los inventores demostraron recientemente que los basófilos estaban involucrados en el desarrollo de NL tanto en un modelo murino de LES espontáneo (ratonesLyn ~¡~)como en una pequeña cohorte de 42 pacientes al acumularse en OLS donde apoyan a las células T y B autorreactivas a través de una vía dependiente de IgE e IL-4 (Charles, N. et al., Nat. Med. 16, 701-707 (2010)). Dado que se sabe que la producción de potentes activadores de basófilos o quimioatrayentes está desregulada durante la patogénesis del lupus (Pellefigues, C. y Charles, N., Curr. Opin. Immunol. 25, 704-711 (2013))), se exploraron los mecanismos que subyacen al reclutamiento de basófilos a los OLS durante el LES.

[0009] Los inventores ahora han identificado dos nuevas vías por las cuales los basófilos se activan durante los brotes de la enfermedad.

[0010] La inflamación crónica de los tejidos conduce a la secreción de factores activadores de basófilos cuyas concentraciones sistémicas están desreguladas durante el lupus. En una nueva cohorte más grande de individuos con LES, los inventores confirmaron que la basopenia era una característica de los pacientes con LES y se correlacionaba con la actividad de la enfermedad. Además, en comparación con otras enfermedades renales, la basopenia era específica de la nefritis lúpica. Esta basopenia se asoció con un patrón de expresión específico en los basófilos de algunos marcadores de activación conocidos y nuevos. De hecho, la expresión de CXCR4 a nivel de proteína y en la superficie de los basófilos aumentó notablemente en pacientes activos y se asoció con la basopenia.

[0011] Los inventores descubrieron que la actividad de la enfermedad y la basopenia estaban estrechamente vinculadas entre sí y con los ejes PGD<2>/PTGDR y CXCL12/CXCR4.

[0012] Más allá de su patrón de expresión alterado en basófilos de sujetos con lupus activo, CXCR4 y CD164 condujeron a una sensibilidad drásticamente aumentada de los basófilos de LES a la migración mediada por CXCL12ex vivo.En pacientes con peritonitis no estéril, los inventores demostraron que los basófilos migrados sobreexpresaban drásticamente CXCR4 en comparación con sus homólogos de basófilos sanguíneos "no migrados", lo que sugiere firmemente que la extravasación y migración de basófilos humanos CXCR4<+>podría ser inducidain vivopor CXCL12, lo que conduce a una basopenia periférica. En ratones, CXCL12 indujo una redistribución de basófilos CXCR4<+>en el sitio de inyección y en los ganglios linfáticos de drenaje correspondientes, lo que demuestra la capacidad de migración de basófilos a CXCL12in vivo.Estas capacidades de migración, tanto en humanos como en ratones, fueron posiblesin vivoyex vivopor el eje PGD<2>/PTGDRs.

[0013] Además, los inventores demostraron que la síntesis de PGD<2>aumentó en sujetos con LES y se asoció con basopenia. Esta migración de basófilos dependiente de CXCR4 mediada por PGD<2>se debió, al menos parcialmente, a un efecto autocrino de PGD<2>sobre su síntesis por los propios basófilosex vivo,lo que dio como resultado una externalización de CXCR4. En particular, tanto en sujetos con LES como en ratonesLyn-</>-<,>los inventores descubrieron que PGD<2>(el eje PGD<2>/PTGDRs) estaba mejorando el reclutamiento de basófilos dependiente de CXCR4 a los OLS durante el lupus, lo que explica el brote de la enfermedad observado con inyecciones repetidas de PGD<2>en ratones propensos al lupus. Estos datos subrayan el efecto patogénico mediado por CXCR4 de PGD<2>durante la patogénesis del lupus, identificando ambos ejes como posibles dianas terapéuticas.

[0014] Los inventores concluyeron así que alterar estos ejes en pacientes con LES usando antagonistas específicos de PTGDR debería romper la producción de autoanticuerpos dependiente de basófilos y la inflamación renal como se muestra en el modelo de ratón de tipo lupusLyn-</>- , y debería limitar los brotes de LES y los daños a los órganos a largo plazo al prevenir la migración de los basófilos a los OLS.

[0015] Los inventores demostraron que antagonizar los PTGDRin vivoen un modelo de ratón de tipo lupus evitó el reclutamiento de basófilos dependiente de CXCR4 en los OLS sin afectar las proporciones de otros tipos de células, excepto las células plasmáticas de vida corta. Este tratamiento logró reducir el número de células plasmáticas de vida corta, la inflamación renal y los títulos de autoanticuerpos en solo 10 días.

Definiciones

[0016] Los términos " lupus" o " lupus eritematoso sistémico" o "LES" se utilizan en su significado habitual en el presente documento e incluyen un trastorno autoinmunitario caracterizado por la presencia de autoanticuerpos, erupción cutánea, úlceras orales, serositis, trastornos neurológicos, recuentos bajos de células sanguíneas, dolor e hinchazón en las articulaciones. Las pruebas utilizadas para diagnosticar incluyen pruebas de anticuerpos (por ejemplo, panel de anticuerpos antinucleares (ANA), anti-ADN bicatenario (ADNbc), anticuerpos antifosfolípidos, anticuerpos anti-Smith); hemograma completo para mostrar niveles bajos de glóbulos blancos, hemoglobina o plaquetas; radiografía de tórax que muestre pleuritis o pericarditis; biopsia de riñón; análisis de orina para mostrar sangre, cilindros o proteínas en la orina.

[0017] Por "nefritis lúpica" se entiende un trastorno caracterizado por una inflamación del riñón causada por lupus eritematoso sistémico (LES). La nefritis lúpica se caracteriza por complejos inmunes que contienen IgM, IgG e IgA depositados en los glomérulos. Estos complejos inmunes están formados por autoanticuerpos con especificidad para componentes nucleares (anticuerpos antinucleares (ANA)) o para ácidos nucleicos (tales como ADN bicatenario (ADNbc)).

[0018] Por consiguiente, tal como se utiliza en el presente documento, la prevención y/o el tratamiento del lupus eritematoso sistémico o "LES" abarca la prevención y/o el tratamiento de la nefritis lúpica.

[0019] En el contexto de la invención, el término "tratar" o "tratamiento", se refiere a un uso terapéutico (es decir, en un sujeto que padece una enfermedad determinada) y significa revertir, aliviar, inhibir el progreso de uno o más síntomas de dicho trastorno o afección. Por lo tanto, tratamiento no sólo se refiere a un tratamiento que conduce a una curación completa de la enfermedad, sino también a tratamientos que ralentizan la progresión de la enfermedad y/o prolongan la supervivencia del sujeto.

[0020] Por "prevenir" se entiende un uso profiláctico (es decir, en un sujeto susceptible de desarrollar una enfermedad determinada).

[0021] "Prostaglandina D2" o "PPG<?>" es ácido 9a,15S-dihidroxi-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oico (nombre IUPAC) (Número CAS: 41598-07-6).

[0022] "PTGDR-1" o "DP" o "receptor de prostanoides D" es un receptor de prostaglandina D2 y su actividad está mediada principalmente por proteínas G(s) que estimulan la adenilato ciclasa, lo que da como resultado una elevación del AMPc intracelular. Una secuencia de ejemplo de la proteína PTGDR-1 humana está disponible en la base de datos UniProt, con el número de acceso Q13258 (en particular Q13258-1:isoforma 1, versión de entrada 133 del 7 de enero de 2015). Una secuencia de ARNm completa que codifica PTGDR-1 está disponible en Genbank con el número de acceso EF577397.1 (publicación: 122; fecha de emisión: 21-NOV-2014).

[0023] "PTGDR-2" o "molécula homologa del receptor quimioatrayente expresada en células T auxiliares tipo 2 (TH2)" o "CRTH2" o "DP2" es un receptor acoplado a proteína G para la prostaglandina D2 que se expresa preferentemente en células T auxiliares 2 (Th2) efectoras de c D4+. Una secuencia de ejemplo de la proteína PTGDR-2 humana está disponible en la base de datos UniProt, con el número de acceso Q9Y5Y4 (versión de entrada 120 del 7 de enero de 2015). Una secuencia de ARNm completa que codifica PTGDR-2 está disponible en Genbank con el número de acceso AY507142.1 (publicación: 122; fecha de emisión: 21-NOV-2014).

[0024] Tal como se utiliza en este documento, el término "antagonista" se refiere a cualquier molécula que bloquea, inhibe, reduce o neutraliza parcial o totalmente la expresión y/o actividad biológica de una diana y/o vía de señalización.

[0025] "Antagonista de PTGDR-1" se refiere a una molécula que bloquea, inhibe, neutraliza o interfiere parcial o totalmente con la expresión y/o las actividades biológicas de una proteína PTGDR-1. Esto incluye, pero no se limita a, bloquear, inhibir, reducir o interferir con las interacciones PDG<2>/PTGDR-1. Los antagonistas de PTGDR-1 incluyen, por ejemplo, un anticuerpo neutralizante de PDG<2>, es decir, un anticuerpo que se une a PDG<2>y evita la unión de PDG<2>a PTGDR-1.

[0026] "Antagonista de PTGDR-2" se refiere a una molécula que bloquea, inhibe, neutraliza o interfiere parcial o totalmente con la expresión y/o las actividades biológicas de una proteína PTGDR-2. Esto incluye, pero no se limita a, bloquear, inhibir, reducir o interferir con las interacciones PDG<2>/PTGDR-2. Los antagonistas de PTGDR-2 incluyen, por ejemplo, un anticuerpo neutralizante de PDG<2>, es decir, un anticuerpo que se une a PDG<2>y evita la unión de PDG<2>a PTGDR-2.

[0027] Las moléculas antagonistas adecuadas incluyen específicamente, pero no se limitan a, moléculas biológicas, tales como una proteína, polipéptido, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, aptámeros, antisentido, ARN de interferencia o moléculas grandes o pequeñas no biológicas (menos de 10 kDa), en particular moléculas orgánicas pequeñas.

[0028] El antagonista puede ser un inhibidor de la expresión del gen de PTGDR-1 o PTGDR-2. Los inhibidores de la expresión génica incluyen oligonucleótidos antisentido y ARN de interferencia (ARNi).

[0029] El término "ARNi" incluye ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado (ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN producido de forma recombinante), así como ARN alterado que difiere del ARN de origen natural por la adición, eliminación, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en el extremo o los extremos del ARN o internamente (en uno o más nucleótidos del ARN). Los nucleótidos en las moléculas de ARNi también pueden comprender nucleótidos no estándar, incluidos nucleótidos o desoxirribonucleótidos que no se producen de forma natural. En conjunto, todos estos compuestos de ARNi alterados se denominan análogos o análogos de ARN de origen natural. Un ARNi solo necesita ser lo suficientemente similar al ARN natural como para que tenga la capacidad de mediar la interferencia del ARN. Tal como se utiliza en el presente documento, la frase "mediar la interferencia de ARN" se refiere a e indica la capacidad de distinguir qué ARNm se verá afectado por la maquinaria o el proceso de interferencia de ARN. El ARN que media la interferencia de ARN interactúa con la maquinaria de interferencia de ARN de manera que dirige la maquinaria degradar ARNm particulares o reducir de otro modo la expresión de la proteína diana. En una realización, las moléculas de ARNi dirigen la escisión de ARNm específico al que corresponde su secuencia. No es necesario que haya una correspondencia perfecta de las secuencias, pero la correspondencia debe ser suficiente para permitir que el ARNi dirija la inhibición de la interferencia de ARN mediante la escisión o la falta de expresión del ARNm diana. Las moléculas de ARNi pueden comprender una parte de ARN y alguna parte adicional, por ejemplo, una parte de desoxirribonucleótido. El número total de nucleótidos en la molécula de ARN es adecuadamente inferior a 49 para que sean mediadores eficaces de la interferencia de ARN. En las moléculas de ARN preferidas, el número de nucleótidos es de 16 a 29, más preferiblemente de 18 a 23 y lo más preferiblemente de 21 a 23.

[0030] Como se indicó anteriormente, el término ARNi incluye, pero no se limita a, ARNip, ARNhc, ARNmi, ARNbc y otras especies de ARN que pueden escindirsein vivopara formar ARNip.

[0031] Un "ARN de interferencia corto" o "ARNip" comprende un dúplex de ARN (región bicatenaria) y puede comprender además uno o dos salientes monocatenarios, salientes 3' o 5'.

[0032] Un "ARN de horquilla corta (ARNhc)" se refiere a un segmento de ARN que es complementario a una porción de un gen diana (complementario a una o más transcripciones de un gen diana), y tiene una estructura de tallo-bucle (horquilla).

[0033] Los "microARN" o "ARNmi" son ARN codificados endógenamente que tienen una longitud de aproximadamente 22 nucleótidos, que regulan postranscripcionalmente genes diana y generalmente se expresan de una manera altamente específica del tejido o de la etapa de desarrollo. Se pueden diseñar y expresar ARNmi artificiales basándose en las características de los genes de ARNmi existentes. La arquitectura de miR-30 (microARN 30) se puede utilizar para expresar ARNmi (o ARNip) a partir de plásmidos de expresión basados en el promotor de la ARN polimerasa II (Zeng et al, 2005, Methods enzymol. 392:371-380). En algunos casos, las moléculas de ARNmi precursoras pueden incluir más de una estructura de tallo-bucle. Las múltiples estructuras de tallo-bucle pueden estar unidas entre sí a través de un enlazador, tales como, por ejemplo, un enlazador de ácido nucleico, una secuencia flanqueante de ARNmi, otras moléculas o alguna combinación de los mismos.

[0034] Los oligonucleótidos antisentido son moléculas de ácido nucleico no enzimático que se unen al ARN diana por medio de interacciones ARN-ARN o ARN-ADN o ARN-PNA (ácido nucleico de proteína; Egholm et al, 1993 Nature 365, 566) y alteran la actividad del ARN diana. Normalmente, las moléculas antisentido son complementarias a una secuencia diana a lo largo de una secuencia contigua de la molécula antisentido. Además, el ADN antisentido se puede utilizar para reconocer el ARN mediante interacciones ADN-ARN, activando así la ARNasa H, que digiere el ARN diana en el dúplex.

[0035] El término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina y partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno. Como tal, el término anticuerpo abarca no sólo moléculas de anticuerpo completas, sino también fragmentos de anticuerpo. En particular, el anticuerpo según la invención puede corresponder a un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, un anticuerpo quimérico, humanizado o humano), un fragmento de un anticuerpo policlonal o monoclonal o un diacuerpo.

[0036] Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una parte de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región variable o de unión al antígeno del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fv, Fab, F(ab')<2>, Fab', Fd, dAb, dsFv, scFv, sc(Fv)<2>, CDR, diacuerpos y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

[0037] Los "aptámeros" son una clase de moléculas que representan una alternativa a los anticuerpos en términos de reconocimiento molecular. Los aptámeros son secuencias de oligonucleótidos u oligopéptidos con la capacidad de reconocer prácticamente cualquier clase de moléculas diana con alta afinidad y especificidad. Dichos ligandos pueden aislarse a través de la evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) de una biblioteca de secuencias aleatorias, tal como se describe en Tuerk C. y Gold L., Science, 1990, 249(4968):505-10. La biblioteca de secuencias aleatorias se puede obtener mediante síntesis química combinatoria de ADN. En esta biblioteca, cada miembro es un oligómero lineal, eventualmente modificado químicamente, de una secuencia única. Las posibles modificaciones, usos y ventajas de esta clase de moléculas se han revisado en Jayasena SD, Clin. Chem, 1999, 45(9):1628-50. Los aptámeros peptídicos consisten en una región variable de anticuerpo conformacionalmente restringida mostrada por una proteína de plataforma, tal como la tiorredoxina A de E. coli, que se selecciona de bibliotecas combinatorias mediante dos procedimientos híbridos (Colas et al., Nature, 1996, 380, 548-50.).

[0038] A lo largo de la presente solicitud, el término "que comprende" debe interpretarse como que abarca todas las características mencionadas específicamente, así como las características opcionales, adicionales y no especificadas. Tal como se utiliza en el presente documento, el uso del término "que comprende" también describe la realización en la que no están presentes características distintas de las características mencionadas específicamente (es decir, "que consiste en").

[0039] Además, el artículo indefinido "un" o "una" no excluye una pluralidad.

Descripción de la invención

[0040] La invención es como se describe en las reivindicaciones.

Antagonistas de PTGDR-1

[0041] Según un aspecto de la divulgación, un antagonista de PTGDR-1 es un antagonista de molécula pequeña.

[0042] Se han descrito numerosos antagonistas de PTGDR-1 en la técnica.

[0043] Dicho antagonista de molécula pequeña se selecciona en particular del grupo que consiste en compuestos de fórmulas I a VI como se describe a continuación:

y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, donde

n es 0 o 1; m es 1,2 o 3; R<1>es H, alquilo C<1>- C<3>, alquilo C<1>- C<3>halogenado o ciclopropilo; R<2>es 4-clorofenilo o 2,4,6-triclorofenilo.

[0044] Preferiblemente, los compuestos de fórmula I tienen la estereoconfiguración que se muestra a continuación (es decir, el centro quiral tiene la configuración R):

[0045] En particular, el compuesto de fórmula I o II es laropiprant, es decir, ácido (-)-[4-(4-clorobencil)-7-fluoro-5-(metano-sulfonil)-1,2,3,4-tetrah¡droc¡clopenta[b]¡ndol-3-¡l]acét¡co y sus sales farmacéuticamente aceptables:

[0046] La FDA ha aprobado el laropiprant para inhibir el enrojecimiento inducido por la niacina para tratar las dislipidemias.

(ii) Compuestos divulgados en la solicitud de patente WO0179169: es decir, ácido 2-[(1R)-9-(4-clorobencil)-8-((R)-metil-sulfinil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-carbazol-1-il] acético, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o ácido 2-[(1R)-9-(4-clorobencil)-8-((S)-metilsulfinil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-carbazol-1-il] acético, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

y sales, hidratos y ésteres farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde:

R1, R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en: (1) hidrógeno, y (2) Rc, R4 y R5 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en: (1) H, (2) F, (3) CN, (4) alquilo C1-6, (5) ORa y (6) S(O)<n>alquilo C1-6, donde cada uno de dichos grupos alquilo está opcionalmente sustituido con halógeno, o

R4 y R5 en el mismo átomo de carbono representan un oxo, o

R4 y R5 en el mismo átomo de carbono o en átomos de carbono adyacentes tomados juntos forman un anillo de 3 o 4 miembros que contiene 0 o 1 heteroátomo seleccionado entre N, S u O opcionalmente sustituido con uno o dos grupos seleccionados entre F, CF<3>y CH<3>;

R6 se selecciona del grupo que consiste en: (1) H, (2) alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con uno a seis grupos seleccionados independientemente entre ORa y halógeno, y (3) heterociclilo opcionalmente sustituido con uno a cuatro halógenos; o

R5 y R6 unidos a átomos de carbono adyacentes forman juntos un anillo de 3 o 4 miembros que contiene 0 o 1 heteroátomos seleccionados entre N, S u O opcionalmente sustituido con uno o dos grupos seleccionados entre F, CF<3>y CH<3>;

X se selecciona del grupo que consiste en: C=O, SO<2>y alquilo C1-4, donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido con uno a seis halógenos;

Ar es arilo o heteroarilo, cada uno opcionalmente sustituido con uno a cuatro grupos seleccionados independientemente entre Rc;

Q es alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con uno a seis grupos seleccionados independientemente entre: (1) halógeno, (2) arilo, (3) heteroarilo, (4) OH, (5) O-alquilo C1-6, (6) COOH, (7) CONRaRb, (8) C(O)NSO<2>R7, (9) tetrazolilo, donde arilo, heteroarilo y alquilo están cada uno opcionalmente sustituidos con uno a seis grupos seleccionados independientemente entre halógeno, CF<3>y COOH; o

Q y R6 juntos forman un anillo de 3 o 4 miembros que contiene opcionalmente un heteroátomo seleccionado entre N, 5 y O, y opcionalmente sustituido con uno o dos grupos seleccionados independientemente entre: (1) halógeno, (2) oxo, (3) ORa, (4) COOH, (5) C(O)NHSO<2>R7, y (6) tetrazolilo.

R7 se selecciona del grupo que consiste en: (1) alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con uno a seis halógenos, (2) arilo y (3) heteroarilo, en donde dicho arilo y heteroarilo están opcionalmente sustituidos con halógeno, O-alquilo C1-5, alquilo C1-5 y en donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido con uno a seis halógenos;

Ra y Rb se seleccionan independientemente entre hidrógeno y alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con uno a seis halógenos;

Rc es (1) halógeno, (2) CN, (3) alquilo C1-6 opcionalmente sustituido con uno a seis grupos seleccionados independientemente entre halógeno, NRaRb, C(O)Ra, C(ORa)RaRb y ORa, (4) alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido con uno a seis grupos seleccionados independientemente entre halógeno y ORa, (5) heterociclilo, (6) arilo, (7) heteroarilo, (8) C(O)Ra, (9) C(ORa)RaRb (10) C(O)ORa, (11) CONRaRb, (12) OCONRaRb, (13) S(O)<n>R7, (14) NRaC(O)O-alquilo C1-6, en donde el alquilo está opcionalmente sustituido con uno a seis halógenos y (15) S(O)<n>NRaRb, en donde el heterociclilo, arilo y heteroarilo están opcionalmente sustituidos con uno a cuatro grupos seleccionados independientemente entre halógeno; n es 0, 1 o 2.

(iv) Compuestos divulgados en la solicitud de patente WO03062200:

y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, donde

n es 0 o 1; m es 1,2 o 3; Ri es H, alquilo Ci - C3 , alquilo C 1 - C3 halogenado o ciclopropilo; R2 es 4-clorofenilo o 2,4,6 triclorofenilo.

[0047] En particular, un compuesto de fórmula IV es ácido (-H4-(4-clorobencil)-7-fluoro-5-(metanosulfonil)-1,2,3,4-tetrahidrociclopenta[b]¡ndol-3-¡l]acét¡co o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, es decir:

[0048] (v) Compuestos divulgados en la solicitud de patente W02004103970:

y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, donde m es 1 o 2, y R1 es alquilo C1 - C 3 opcionalmente sustituido con 1 a 5 átomos de halógeno.

[0049] Dicho compuesto de fórmula V se selecciona en particular del grupo que consiste en:

Ácido [(3R)-4-[(1S)-1-(4-clorofenil)etil]-7-fluoro-5-(metilsulfonil)-1,2,3,4-tetrahidrociclopenta[b]indol-3-il] acético y sales farmacéuticamente aceptables del mismo,

Ácido [(1R)-9-[(1S)-1-(4-clorofenil)etil]-6-fluoro-8-(metilsulfonil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-carbazol-1-il] acético y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Ácido [(1R)-9-[(1R)-1-(4-clorofenil)-2-fluoroetil]-6-fluoro-8-(metilsulfonil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-carbazol-1-il] acético y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, y

Ácido [(1R)-9-[(1R)-1-(4-clorofenil)-2,2-difluoroetil]-6-fluoro-8-(metilsulfonil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-carbazol-1-il] acético y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

[0050] (vi) Ácido [2-(oxazol-2-il)-5-(4-{4-[(propan-2-il)oxi]fenilsulfonil}piperazin-1-il)fenoxi]acético

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se describe en EP2762141. Este compuesto se puede sintetizar de acuerdo con un procedimiento conocido, por ejemplo, un procedimiento como el descrito en WO 2007/037187 o WO 2008/123349.

[0051] Los antagonistas de ejemplo de PTGDR-1 incluyen, pero no se limitan a, compuestos descritos por tener actividad antagonista de p Gd2 en Solicitudes publicadas PCT WO97/00853, WO98/25919, WO01/66520, WO02/094830, WO03/022814, WO03/078409, y WO2004/103370; Solicitudes de patente europea EP945450, EP944614, y EP 1305286; y Solicitud de patente de EE.UU. N.° de publicación: 20040220237, 20070244107, y 20080194600.

[0052] Según otros aspectos de la divulgación, el antagonista de PTGDR-1 es un antagonista de molécula biológica.

[0053] Por ejemplo, dicho antagonista de PTGDR-1 es un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de anticuerpo, o un aptámero dirigido contra PTGDR-1. Los procedimientos para producir anticuerpos policlonales o monoclonales están fácilmente disponibles para el experto en la materia.

[0054] Dicho antagonista de PTGDR-1 también puede ser un ARN antisentido o de interferecía que inhibe la expresión de PTGDR-1.

[0055] En un aspecto, dicho antagonista de PTGDR-1 es un oligonucleótido antisentido, en particular un oligonucleótido antisentido que comprende o consiste en una de las secuencias SEQ ID NO: 4415 a SEQ ID No: 5483, tal como se describe en la solicitud de patente internacional publicada como WO02/081628.

Antagonistas de PTGDR-2

[0056] Según un aspecto de la divulgación, un antagonista de PTGDR-2 es un antagonista de molécula pequeña.

[0057] Se han descrito numerosos antagonistas de PTGDR-2 en la técnica.

[0058] En algunos aspectos, un antagonista de PTGDR-2 se selecciona del grupo que consiste en:

R1 es alquilo C1-C6;

R2 es halógeno;

R3 es arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre halo, OH, CN, R6, COR6, CH2R6, OR6, SR6, SO<2>R6 o SO<2>YR6;

R6 es alquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C8, heterociclilo, arilo o heteroarilo, cualquiera de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre halo, OH, CN, NO2, alquilo C1-C6 u O(alquilo C1-C6); y

Y es NH o una cadena de alquileno C1-C4 lineal o ramificada;

R4 es H o alquilo C1-C4; y

R5 es hidrógeno, alquilo C1-C6, arilo, (CH2)<m>OC(=O)alquilo C1-C6, ((CH2)<m>O)<n>CH2CH2X, (CH2)<m>N(R7)<2>o CH((CH2)<m>O(O)R8)<2>;

m es 1 o 2;

n es 1-4;

X es OR7 o N(R7)2;

R7 es hidrógeno o metilo;

R8 es alquilo C1-C,8;

o una sal, hidrato, solvato o complejo farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0059] (ii) cicloalcano(1,2-b)indol-sulfonamidas como se describe en EP0242518B1

R2 es fenilo que está sustituido por flúor, cloro, trifluorometilo, metilo, etilo, propilo, isopropilo o metoxi, y

Y es 0 o 1,

o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

[0060] En particular, un compuesto de fórmula VIII se selecciona del grupo que consiste en:

o una forma termodinámicamente estable del mismo como se describe en EP1051398,

- y análogos de Ramatroban, en particular TM30642 (ácido 3-{3-[(4-fluoro-bencenosulfonil)-metil-amino]1,2,3,4-tetrahidro-carbazol-9-il {-propiónico):

TM30643 (ácido [3-(4-fluoro-bencenosulfonilamino)-1,2,3,4-tetrahidro-carbazol-9-il]-acético):

y

TM30089 (también llamado CAY10471) (CAS 627865-18-3: Ácido 2-[3-[(4-fluorofenN)sulfonN-metilamino]-1,2,3,4-tetrahidrocarbazol-9-il]acético):

[0061] (iii) OC000549 (ácido 5-fluoro-2-metil-3-(2-quinolinilmetil)-1 H-indol-1 -acético)

[0062] (iv) Setipiprant

y AZD1981 (ácido 4-(acetilamino)-3-[(4-clorofenil)tio]-2-metil-1H-indol-1-acético).

[0063] Se pueden encontrar antagonistas de PTGDR-2 adicionales en las siguientes publicaciones: EP1170594, EP1435356, WO2003/066046, WO2003/066047, WO2003/097042, WO2003/097598, WO2003/101961, WO2003/101981, WO2004/007451, WO2004/032848, WO2004/035543, WO2004/106302, WO2005/019171, WO2005/054232, WO2005/018529, WO2005/040112, GB2,407,318, WO2005/040114, WO2005/044260, WO2005/095397, WO2005/100321, WO2005/102338, WO2005/123731, WO2006/034419, WO2006/095183, WO2007/107772, WO2008024746, US 7.405.215.

[0064] Según otros aspectos, el antagonista de PTGDR-2 es un antagonista de una molécula biológica.

[0065] Por ejemplo, dicho antagonista de PTGDR-2 es un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de anticuerpo, o un aptámero dirigido contra PTGDR-2. En un aspecto, dicho antagonista de PTGDR-2 es un anticuerpo que agota las células que expresan PTGDR-2, tal como se describe en la solicitud de patente internacional WO2014144865.

[0066] Dicho antagonista de PTGDR-2 también puede ser un ARN antisentido o interferente que inhibe la expresión de PTGDR-2.

Dobles antagonistas de PTGDR-1/PTGDR-2

[0067] Como se utiliza en el presente documento, un doble antagonista de PTGDR-1/PTGDR-2 es un antagonista para el cual la relación de actividad antagonista contra PTGDR-1 y PTGDR-2, respectivamente, es de 1:10 a 10:1, en particular de 1:50 a 50:1, preferiblemente de 1:100 a 100:1, aún preferiblemente de 1:250 a 250:1.

[0068] Los dobles antagonistas de PTGDR-1/PTGDR-2 que se pueden utilizar en el marco de la invención incluyen,

y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos,

donde R1 es alquilo o cicloalquilo; R2 es halo, alquilo, haloalquilo, alcoxi, haloalcoxi o cicloalquilo; y X es cloro o flúor.

[0069] Preferiblemente, dicho compuesto de fórmula VI es AMG 853 (ácido 2-(4-(4-(terc-butilcarbamoil)-2-(2-cloro-4-ciclopropilfenil sulfonamido)fenox¡)-5-cloro-2-fluorofen¡l)acét¡co):

AMG 853, así como un procedimiento para preparar este compuesto, también se describen en Liu et al., ACS Med Chem Lett. 2 de marzo de 2011; 2 (5): 326-30.

[0070] Sin embargo, en una realización, los dobles antagonistas de PTGDR-1/PTGDR-2 de fórmula VI están excluidos del alcance de la invención.

[0071] La caracterización de la actividad antagonista de una molécula hacia PTGDR-1 y/o PTGDR-2 se puede realizar, por ejemplo, mediante procedimientos descritos en Liu et al., ACS Med Chem Lett. 2 de marzo de 2011; 2 (5): 326-30. Estos procedimientos incluyen:

(i) Determinación de la IC50 de la molécula hacia PTGDR-1 y/o PTGDR-2. Esto se puede realizar, por ejemplo, en células HEK-293 que expresan de forma estable PTGDR-1 o PTGDR-2 humanos. Para medir la unión, se incuba PGD<2>marcado de forma detectable, por ejemplo, [<3>H]-PGD<2>, junto con células HEK-293 (PTGDR-1 o PTGDR-2) en presencia de concentraciones crecientes de la molécula que se va a ensayar. Después de la incubación, se lavan las células y se mide la cantidad de PGD<2>marcado que permanece unido a las células mediante un procedimiento apropiado (por ejemplo, recuento de centelleo si es [<3>H]-PGD<2>), y se determina la concentración de compuestos necesaria para lograr una inhibición del 50% de la unión a [<3>H]-PGD2 (la IC<50>). El tampón de unión contiene BSA al 0,5 % (unión a tampón) o plasma humano al 50 % (unión a plasma).

(ii) Determinación de la afinidad de la molécula por PTGDR-1. Esto se puede realizar, por ejemplo, en sangre completa extraída en tubos Vacutainer con ácido-citrato-dextrosa, tratada con la molécula de prueba o DMSO y, a continuación, estimulada con una respuesta a la dosis de PGD<2>. A continuación, las células se lisan y se mide el AMPc utilizando un ELISA competitivo. La comparación de la respuesta a la dosis a PGD<2>en muestras que contienen solo DMSO y muestras que contienen la molécula de prueba se utiliza para determinar K<b>utilizando la ecuación de Schild (Schild HO. PA2, a new scale for the measurement of drug antagonism. Brit J Pharmacol 1947;2:189-206).

(i) Determinación de la afinidad de la molécula por PTGDR-2. Esto se puede realizar, por ejemplo, en sangre completa extraída en tubos anticoagulados con ácido citrato-dextrosa, tratada con la molécula de prueba o DMSO y, a continuación, estimulada con una respuesta a dosis de PGD<2>. Los anticuerpos conjugados con fluorocromo se utilizan para marcar los granulocitos positivos para PTGDR-2 y la internalización del receptor de PTGDR-2 se monitoriza mediante citometría de flujo. La K<b>se determina utilizando la ecuación de Schild.

Monotratamiento o tratamiento combinado

[0072] Dado que ambos PTGDR pueden actuar en sinergia, antagonizar tanto el PTGDR-1 como el PTGDR-2 es una modalidad terapéutica ventajosa para tratar y/o prevenir el lupus. Además, esto debería evitar cualquier riesgo de potenciación del efecto de PGD2 sobre los basófilos y otras células a través del PTGDR no bloqueado, si solo se actúa sobre uno de los dos receptores de PGD2.

[0073] De acuerdo con la invención, se contemplan dobles antagonistas de PTGDR-1/PTGDR-2.

[0074] Además, en un aspecto, el antagonista de PTGDR-1, el antagonista de PTGDR-2 o la combinación de antagonista de PTGDR-1 y antagonista de PTGDR-2 se utiliza en combinación con cualquier otra terapia estándar para el tratamiento del lupus. Los agentes terapéuticos útiles para el tratamiento del lupus incluyen, pero sin limitación, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), hidroxicloroquina, corticosteroides, ciclofosfamida, aztioprina, metotrexato, micofenolato de mofetilo (MMF) (CelleCept®), belimumab, deshidroepiandrosterona y rituximab.

[0075] El antagonista o antagonistas de PTGDR-1 y/o PTGDR-2, y opcionalmente además el agente terapéutico estándar para el tratamiento del lupus, se formulan en una o más composiciones farmacéuticas que comprenden dicho o dichos antagonistas de PTGDR-1 y/o PTGDR-2, y opcionalmente además el agente terapéutico estándar para el tratamiento del lupus, y al menos un portador, excipiente o diluyente.

[0076] "Farmacéuticamente" o "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica o de otro tipo cuando se administran a un mamífero, especialmente a un ser humano, según corresponda. Un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable se refiere a un material de carga, diluyente, material de encapsulación o auxiliar de formulación sólido, semisólido o líquido no tóxico de cualquier tipo.

[0077] Los portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables que se pueden utilizar en las composiciones de esta invención incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, sistemas de administración de fármacos autoemulsionantes (SEDDS), tales como succinato de d-a-tocoferol de polietilenglicol 1000, surfactantes utilizados en formas de dosificación farmacéutica, tales como Tweens u otras matrices de administración poliméricas similares, proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana, sustancias tampón, tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana.

[0078] Como entenderán los expertos en la materia, la composición farmacéutica está formulada adecuadamente para ser compatible con la vía de administración prevista. Ejemplos de vías de administración adecuadas incluyen la vía tópica, la vía oral, la vía intranasal, la vía intraocular, la vía parenteral, incluyendo por ejemplo inyecciones intramusculares, subcutáneas, intravenosas, intraperitoneales o locales. La vía oral puede utilizarse, siempre que la composición esté en una forma adecuada para la administración oral, capaz de proteger el principio activo de las enzimas gástricas e intestinales.

[0079] Preferentemente, la composición farmacéutica contiene portadores que son farmacéuticamente aceptables para una formulación inyectable. Pueden ser en particular soluciones salinas estériles e isotónicas (fosfato monosódico, fosfato disódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico o cloruro magnésico, etc., o mezclas de dichas sales), o composiciones secas, en particular liofilizadas, que mediante la adición, según el caso, de agua esterilizada o suero fisiológico, pueden formar solutos inyectables.

[0080] Para la terapia combinada, (i) el antagonista de PTGDR-1 y el antagonista de PTGDR-2, (ii) el antagonista de PTGDR-1 y el agente terapéutico estándar para el tratamiento del lupus, (Ni) el antagonista de PTGDR-2 y el agente terapéutico estándar para el tratamiento del lupus, o (iv) el antagonista de PTGDR-1, el antagonista de PTGDR-2 y el agente terapéutico estándar para el tratamiento del lupus, se formulan en una única composición farmacéutica, o dichos antagonista de PTGDR-1, antagonista de PTGDR-2 y agente terapéutico estándar para el tratamiento del lupus, se formulan en composiciones farmacéuticas separadas para uso simultáneo, uso separado o uso distribuido en el tiempo.

[0081] Por lo tanto, la divulgación también proporciona una composición farmacéutica que comprende un antagonista de<p>T<g>DR-1 y un antagonista de PTGDR-2; o un doble antagonista de PTGDR-1/PTGDR-2; un antagonista de PTGDR-1 y un agente terapéutico estándar para el tratamiento del lupus; un antagonista de PTGDR-2 y un agente terapéutico estándar para el tratamiento del lupus; un antagonista de PTGDR-1, un antagonista de PTGDR-2 y un agente terapéutico estándar para el tratamiento del lupus; o un doble antagonista de PTGDR-1/PTGDR-2 y un agente terapéutico estándar para el tratamiento del lupus, para su uso en un procedimiento para prevenir y/o tratar el LES.

[0082] La divulgación también se refiere a un antagonista de PTGDR-1 y un antagonista de PTGDR-2; o un doble antagonista de PTGDR-1/PTGDR-2; un antagonista de PTGDR-1 y un producto terapéutico estándar para el tratamiento del lupus; un antagonista de PTGDR-2 y un producto terapéutico estándar para el tratamiento del lupus; un antagonista de PTGDR-1, un antagonista de PTGDR-2 y un producto terapéutico estándar para el tratamiento del lupus; o un doble antagonista de PTGDR-1/PTGDR-2 y un producto terapéutico estándar para el tratamiento del lupus, para su uso como una preparación combinada para uso simultáneo, uso separado o uso distribuido en el tiempo, en un procedimiento para prevenir y/o tratar el LES.

[0083] Los procedimientos de prevención y/o tratamiento del LES según la divulgación utilizan preferiblemente una cantidad eficaz de antagonista de PTGDR-1 y/o PTGDR-2 y/o un agente terapéutico estándar para el tratamiento del lupus.

[0084] La expresión "cantidad eficaz" pretende significar una cantidad suficiente para prevenir y/o tratar una enfermedad determinada. Se entenderá que esta cantidad variará con la eficacia del agente o agentes terapéuticos empleados, con la naturaleza de cualquier portador utilizado, con la gravedad de la enfermedad y con la edad del paciente. La determinación de las cantidades apropiadas para cualquier composición dada está dentro de la habilidad en la técnica, a través de una serie estándar de pruebas diseñadas para evaluar los niveles terapéuticos apropiados.

[0085] Según la invención, el antagonista de PTGDR-1 y/o el antagonista de PTGDR-2 evitan la migración de los basófilos a los órganos linfoides secundarios.

[0086] En el marco de la invención, el antagonista de PTGDR-1 y/o antagonista de PTGDR-2 previene, limita la extensión o reduce el aumento de los títulos de autoanticuerpos y/o la aparición de brotes de LES. Alternativamente o además, el antagonista de PTGDR-1 y/o antagonista de PTGDR-2 también previene, limita la extensión o reduce la aparición de daños en órganos, en particular en riñones, corazón, pulmones y cerebro. En un aspecto, el antagonista de PTGDR-1 y/o antagonista de PTGDR-2 previene, limita la extensión o reduce la aparición de nefritis lúpica.

[0087] La invención se ilustrará más detalladamente en vista de las siguientes figuras y ejemplos.

FIGURAS

Figura 1. Estrategia de activación de los basófilos en sangre humana y estado de activación en función de la actividad de la enfermedad LES.

[0088] (a) Análisis citométrico de flujo de los niveles de CD203c en basófilos sanguíneos de sujetos con LES inactivo, leve o activo (n = 60/40/82, respectivamente) en comparación con controles (CT, n = 100). (b) Análisis citométrico de flujo de los niveles de CD62L en basófilos sanguíneos de sujetos con LES inactivo, leve o activo (n = 43/33/66, respectivamente) en comparación con controles (CT, n = 90). (c) Análisis citométrico de flujo de los niveles de CD63 en basófilos sanguíneos de sujetos con LES inactivo, leve o activo (n = 14/6/12, respectivamente) en comparación con controles (CT, n = 12). (a-c) Los datos están normalizados a la media de los controles y se expresan en unidades arbitrarias como media s.e.m. Los análisis estadísticos se realizaron mediante pruebas de Mann-Whitney. NS: no significativo, *: P<0,05, **: P<0,01, ***: P<0,001.

Figura 2. La basopenia y el estado de activación de los basófilos se correlacionan con la actividad de la enfermedad y son específicos de la nefritis lúpica entre otras enfermedades renales activas.

[0089](a)Basófilos en sangre por pL según lo determinado por citometría de flujo de controles sanos (CT) y sujetos con LES inactivo, leve o activo(n= 87/58/38/84, respectivamente) según lo definido en los procedimientos en línea.(b)Correlación de Spearman entre los números de basófilos en sangre y SLEDAI(r= -0,3629,p< 0,0001) mostrada en una escala lineal.(c)Proporción de basófilos HLA-DR en sangre según lo determinado por citometría de flujo de controles sanos (CT) y sujetos con LES inactivo, leve o activo (n = 96/60/40/84, respectivamente).(d)Análisis de la característica operativa del receptor (ROC) de la proporción de basófilos HLA-DR+ en pacientes con LES(n =184) frente a controles(n =97) (línea gruesa, AUC = 0,9091) y de los títulos de IgG específicos de ADNbc en pacientes con LES (n = 123) frente a controles (n = 39) (línea de puntos, AUC = 0,8384).(e)Basófilos en sangre por pL como en(a)de sujetos con las siguientes enfermedades renales activas: IgA-N: nefropatía por IgA; HSP: nefropatía por púrpura de Schonlein-Henoch; DN: nefropatía diabética; MN: nefropatía membranosa; OGN: otras nefropatías glomerulares; NGKD: enfermedades renales no glomerulares; aLN: nefritis lúpica activa; en comparación con controles sanos (n = 40/20/39/22/42/46/81/87, respectivamente).(f)Proporción de basófilos HLA-DR+ en sangre en pacientes con enfermedades renales activas como en (e) (n = 40/20/39/21/51/47/77, respectivamente) en comparación con controles (n = 96).(a, c, e, f).Los datos se expresan como medias s.e.m. Los análisis estadísticos se realizaron mediante pruebas de Mann-Whitney. La comparación con la mediana de los controles sanos se muestra encima de cada barra y con las barras correspondientes cuando se indica. NS: no significativo, *: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P < 0,001, ****: P < 0,0001.

Figura 3. Los ejes PGD2/PTGDR y CXCL12/CXCR4 contribuyen al fenotipo de basófilo específico del paciente con LES

[0090](a)Análisis citométrico de flujo de los niveles de PTGDR-2 (CRTH2) en basófilos de sangre de controles sanos (CT) y sujetos con LES inactivo, leve o activo (n = 71/48/31/60, respectivamente).(b)Niveles de 11p-prostaglandina F2a (11p-PGF2a) en plasma de controles e individuos con LES inactivo, leve o activo (n = 29/31/19/37, respectivamente) medidos por EIA.(c)Basófilos de sangre por pl de sangre en sujetos con LES clasificados sobre la base de niveles plasmáticos bajos (n = 51) o altos (n = 34) de 11p-PGF2a (título por debajo o por encima de la media del título de CT 2 desviaciones estándar, respectivamente).(d)Análisis citométrico de flujo de los niveles de CXCR4 en basófilos sanguíneos de CT y sujetos con<l>E<s>inactivo, leve o activo (n = 66/32/20/51, respectivamente).(e)Niveles de CXCL12 en plasma de controles e individuos con LES inactivo, leve o activo (n = 63/43/29/59, respectivamente) medidos por ELISA.(f)Análisis citométrico de flujo de los niveles de CD164 en basófilos sanguíneos de CT y sujetos con LES inactivo, leve o activo (n = 33/15/7/26, respectivamente).(a,d,f)Los datos están normalizados a la media de los valores de CT y expresados en unidades arbitrarias.(af),Los análisis estadísticos se realizaron mediante pruebas de Mann-Whitney. La comparación con la mediana de los controles sanos se muestra encima de cada barra y con las barras correspondientes cuando se indica. Los datos se expresan como medias s.e.m. NS: no significativo, *:P< 0,05, **:P< 0,01, ***:P< 0,001, ****:P< 0,0001.

Figura 4. Asociaciones entre los títulos plasmáticos de 1ip-PGF2o y CXCL12, los niveles de expresión de CXCR4 y CD164 en basófilos y la basopenia específica del lupus

[0091](a)Correlación de Spearman entre el número de basófilos en sangre por ml de sangre y los niveles plasmáticos de 11p-PGF2a(r= -0,2585,P= 0,0169,n= 85) mostrados en una escala logarítmica.(b)Correlación de Spearman entre el número de basófilos en sangre por ml de sangre y los niveles relativos de CXCR4 en basófilos (como se define enFigura 2d) (r = -0,4692,P< 0,0001,n= 101) mostrada en una escala logarítmica.(c)Basófilos en sangre por pl de sangre en sujetos con LES activo clasificados sobre la base de niveles plasmáticos de CXCL12 bajos o altos (título por debajo o por encima de la media del título de control 2 desviaciones estándar, respectivamente). Los datos se expresan como medias s.e.m. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de Mann-Whitney. *:P< 0,05.(d)Correlación de Spearman entre el número de basófilos en sangre por ml de sangre y los niveles relativos de CD164 en los basófilos (como se define enFigura 2f) (r = -0,4165,P= 0,0029,n= 49) mostrada en una escala logarítmica.

Figura 5. La migración de basófilos mediada por CXCR4 ex vivo e in vivo se ve mejorada por PGD2

[0092](a)Ensayos de migración de basófilos de sangre humana de controles sanos (CT,n= 6) y pacientes con LES (n= 6) hacia un gradiente de CXCL12.(b)Ensayos de migración de basófilos de sangre humana hacia gradientes de IL-3, CCL3, CCL5, CXCL2 y PGD2 de controles sanos (Controles,n= 8/4/3/4/7, respectivamente) y de pacientes con LES (LES,n= 6/3/6/3/5, respectivamente).(c)Niveles relativos de IgE específica de ADNbc en plasma de individuos con LES inactivo, leve o activo (n = 41/29/51, respectivamente) normalizados a la media de los valores de control (n = 38) medidos por ELISA.(a-c)Los análisis estadísticos se realizaron mediante pruebas de Mann-Whitney en comparación con CT.(d)Los niveles de expresión de CXCR4 en basófilos de sangre después de 18 horas de incubación sin (-) o con (+) PGD2 , IgE anti-humana de ratón o IL-3 se evaluaron por citometría de flujo.(e)Ensayos de migración de basófilos de sangre humana estimulados como en (d) hacia un gradiente de CXCL12.(d,e)Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba t de Student pareada.(f)La variación del nivel de expresión de los marcadores de basófilos indicados entre basófilos peritoneales y sanguíneos de pacientes sometidos a diálisis peritoneal y tratados por peritonitis no estéril (n = 6) se evaluaron mediante citometría de flujo. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de una muestra en comparación con un valor teórico de 0.(a,b,e)Migración corregida como se describe en los procedimientos.(a-f)Los datos se expresan como medias ± s.e.m. NS: no significativo, #:P= 0,06, *:P< 0,05, **:P< 0,01, ***:P< 0,001, ****:P< 0,0001.

Figura 6. La activación subóptima de los basófilos mediada por IgE conduce a una mayor expresión de PTGDR-2 en los basófilos humanos.

[0093] Niveles de expresión de PTGDR-2 (CRTH2) (tal como se define en los procedimientos en línea) en basófilos sanguíneos de donantes sanos después de 18 horas de incubación sin (-) o con (+) PGD2, IgE anti-humana de ratón o IL-3. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba t de Student pareada.

Figura 7. La PGD2 es suficiente para mejorar la migración de los basófilos a los OLS dependiente de CXCL12 que se produce en ratones propensos al lupus.

[0094](a)Migraciónex vivode basófilos de esplenocitos WT oLynenteros a CXCL12.(b)Niveles de expresión de CXCR4 en basófilos de los compartimentos indicados en animales WT (n = 16) yLyn-1- (n= 14) envejecidos. Los datos están normalizados al nivel medio de expresión de CXCR4 de basófilos sanguíneos WT. Los análisis estadísticos colocados directamente sobre cada barra compararon el valor para un compartimento dado con el compartimento de sangre del genotipo correspondiente. También se indican los análisis estadísticos entre ambos genotipos para cada compartimento.(c)Número de basófilos por peritoneo en ratones WT jóvenes 24 horas después de la inyección intraperitoneal (ip) de PBs o CXCL12 y comparado con valores de estado estacionario (-) (n = 13/15/5, respectivamente).(d)Niveles de expresión de CXCR4 en basófilos de ganglios linfáticos mesentéricos (NLm) de ratonesLyn -l-jóvenes 24 horas después de la inyección ip de PBS o PGD<2>normalizados a la media de los valores de los ratones inyectados con PBS.(e)Número de basófilos en NLm de ratonesLyn -</ ->jóvenes 24 horas después de la inyección ip del compuesto o compuestos indicados.(f)Niveles de expresión de CXCR4 en basófilos del bazo de ratones WT de 15 semanas de edad incubadosex vivodurante 24 horas con el compuesto indicado y normalizados a la media de los valores de control.(a-f)Los datos se expresan como medias ± s.e.m. El número de basófilos y la expresión de CXCR4 se evaluaron mediante citometría de flujo. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba t no pareada con corrección de Welch(a-e) y mediante la prueba t de Student pareada(f).NS: no significativo, #:P= 0,058, *:P< 0,05, **:P< 0,01, ***:P< 0,001, ****:P< 0,0001.

Figura 8. La inyección ip de CXCL12 o PGD2 en ratones induce una acumulación de basófilos dependiente de CXCR4 en los OLS y el peritoneo.

[0095](a)Proporción de basófilos (x103) entre las células CD45+ vivas en el ganglio linfático mesentérico (mLN) de ratones W<t>jóvenes 24 horas después de la inyección intraperitoneal (ip) de PBS (n = 13) o CXCL12 (n = 15) y en comparación con los valores de estado estacionario (-) (n = 5).(b)Número de basófilos en el bazo de ratonesLyn-/-jóvenes 24 horas después de la inyección ip del compuesto o compuestos indicados.(c)Número de basófilos en el peritoneo de ratonesLyn-/-24 horas después de la inyección ip del compuesto o compuestos indicados. Los datos se expresan como medias ± s.e.m. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la pruebatde Student no pareada con corrección de Welch. NS: no significativo, *:P< 0,05, **:P< 0,01, ***:P< 0,001.

Figura 9: Efectos agonistas específicos de cAMP y PTGDR sobre la expresión de CXCR4 por basófilos del bazo de ratón ex vivo.

[0096](a-b)Niveles relativos de expresión de CXCR4 en basófilos (definidos como CD19<->TCRp<'>CD3<->CD49b<+>FcsRIa<+>CD123<+>CD45<' °>) y células T (definidas como células CD45<+>CD3<+>TCRp<+>) en esplenocitos incubados durante 4 horas sin (-) o con la concentración indicada de N6,2'-O-dibutiril-adenosina 3':5'-monofosfato cíclico (db-cAMP) o 1 pM de PGD<2>según lo determinado por citometría de flujo. Los análisis estadísticos se realizaron mediante pruebas t de Student pareadas. NS: no significativo, *:P< 0,05, **:P< 0,01, ***:P< 0,001.(c)Niveles relativos de expresión de CXCR4 en basófilos del bazo (definidos como en(a)) incubados durante 4 horas sin (0) o con la concentración indicada (nM) del compuesto o compuestos indicados. DK-PGD<2>: 13,14-dihidro-15-ceto-PGD<2>(agonista específico de PTGDR-2); BW245c: ácido 3-(3-ciclohexil-3-hidroxipropil)-2,5-dioxo-(R*,S*)-(±)-4-imidazolinheptanoico (agonista específico de PTGDR-1) determinado por citometría de flujo. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de dos vías seguido de una prueba de comparaciones múltiples de Tukey.(a-c)Los datos están normalizados a la media del valor de control (por grupo,n= 4 a 8). Los datos se expresan como media s.e.m. Todos los experimentos se realizaron con esplenocitos de ratones WT de 8 a 12 semanas de edad.

Figura 10. El bloqueo de la acumulación de basófilos en los OLS reduce la actividad de la enfermedad de tipo lupus

[0097](a,b)Proporción de basófilos (CD19<'>TCRp<'>CD49b<+>FcsRIa<+>CD123<+>CD45<lD>) entre células CD45<+>singletes vivas en ganglios linfáticos mesentéricos(a)y otros ganglios linfáticos (cervicales, braquiales e inguinales)(b)de ratonesLyn -</>- de 10 a 12 semanas de edad inyectados durante diez días con PBS (círculos no rellenos) o PGD<2>sola (cuadrados no rellenos), y PGD<2>inyectado y agotado en basófilos (MAR-1) (rombos no rellenos) o no (IgG) (triángulos no rellenos) como se describe en los procedimientos.(c)Niveles de expresión de IA-IE en basófilos de NL de ratones como en(b).NA: no aplicable.(d,e)Proporción de células plasmáticas de vida corta CD19<+>CD138<+>entre células CD45<+>singletes vivas en el bazo(d)y los ganglios linfáticos(e)en los mismos ratones que en(b). (f)Tinción de inmunofluorescencia representativa para depósitos de C3 e IgG en riñones de ratones como se indica en(b)(barra de escala = 1 mm) y sus cuantificaciones correspondientes en ratones inyectados con PBS (n = 3), PGD<2>(n = 4), PGD<2>+ IgG de control (n = 3) y PGD<2>+ MAR-1 (n = 3).(g)Aumento en números enteros de la relación albúmina/creatinina en orina antes y después del tratamiento con<p>B<s>o PGD<2>durante 10 días.(a-e)Los números de basófilos, células plasmáticas y los niveles de expresión de IA-IE se evaluaron mediante citometría de flujo.(a-g)Los datos se expresan como medias ± s.e.m. Los análisis estadísticos se realizaron mediante pruebas t de Student no pareadas. #:P =0,0571, *:P <0,05, **:P <0,01, ***:P <0,001, ****:P <0,0001. Se muestra un representante de tres experimentos independientes.

Figura 11. El bloqueo de la acumulación de basófilos en los OLS reduce la actividad de la enfermedad de tipo lupus

[0098] Cuantificaciones de la tinción de inmunofluorescencia para depósitos de C3 e IgG en riñones de ratonesLyn-l- envejecidos tratados (n= 8) o no (vehículo,n= 9) con antagonistas de PTGDR-1 y PTGDR-2 durante diez días.

Figura 12. El reconocimiento de los PTGDR bloquea la acumulación de basófilos mediada por CXCR4 en los OLS y reduce la actividad de la enfermedad de tipo lupus.

[0099](a-h)Comparaciones entre ratones de tipo salvaje (WT) envejecidos yLyn -l-tratados o no (vehículo) durante 10 días con antagonistas de PTGDR-1 y PTGDR-2 como se describe en losprocedimientos en línea. (a,b,c)Análisis citométrico de flujo de basófilos entre células CD45+ vivas en ganglios linfáticos (cervicales, axilares, inguinales y mesentéricos)(a)y bazo(b). (c)Niveles de expresión de CXCR4 en basófilos de bazo.(d)La proporción de células plasmáticas de vida corta CD19+ CD138+ entre células CD45+ vivas en ganglios linfáticos como en(a)se determinó por citometría de flujo.(e)Valores de densidad óptica (DO) a 450 nm de IgG específica de ADNbc en plasma de los ratones indicados medidos por ELISA (*103).(f)Niveles totales de IgE medidos por ELISA en plasma de los ratones indicados.(g,h)Concentración de IL-4(g)e IL-1p(h)en pg por mg de extracto de proteína renal total de los ratones indicados, medida mediante ELISA.(ah)WT Vehícul,n= 5 ; WT Tratado, n = 4;Lyn-/- vehículo, n= 8 ;Lyn-/-tratado,n= 8. Los datos se expresan como media ± s.e.m. Los análisis estadísticos se realizaron mediante pruebas t de Student no pareadas. NS: no significativo, *:P<0,05, **:P<0,01.

Figura 13. El tratamiento con antagonistas de PTGDR reduce específicamente la acumulación de basófilos en los OLS, lo que conduce a una reducción del número de células plasmáticas de vida corta y de los títulos de ANA séricos.

[0100](a-d)Comparaciones entre ratones de tipo salvaje (WT) yLyn-/-envejecidos tratados o no (vehículo) con antagonistas de PTGDR-1 y PTGDR-2 durante diez días.(a,b)Análisis citométrico de flujo de la proporción de basófilos entre células de médula ósea (BM) CD45+(a)y leucocitos sanguíneos(b). (c)Análisis citométrico de flujo de células plasmáticas de vida corta CD19+CD138+ entre células CD45+ vivas.(d)Niveles de anticuerpos antinucleares (ANA) medidos por ELISA en plasma de los ratones indicados.(a-d)WT Vehículo,n= 5; WT tratado,n= 4;Lyn-1vehículo,n= 8;Lyn-/-tratado,n= 8. Los datos se expresan como medias s.e.m.(a-c)Los análisis estadísticos se realizaron mediante la pruebatde Student no pareada .(d)El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de Mann-Whitney. NS: no significativo, *:P< 0,05, **:P< 0,01.

Figura 14. Resumen gráfico

[0101] En el lupus eritematoso sistémico (LES), una pérdida de autotolerancia induce la expansión de células T y B autorreactivas (AR). Las células plasmáticas autorreactivas secretan anticuerpos autorreactivos que se unirán a autoantígenos de origen nuclear y factores del complemento para formar complejos inmunes circulantes (CIC). La deposición de estos CIC o anticuerpos autorreactivos en órganos diana está asociada con lesiones locales, inflamación (y producción de PGD2) y daños en los órganos. Los basófilos sanos pueden activarse mediante la unión de CIC a receptores Fc (FceRI y FcyRs) para expresar más receptores de prostaglandina D2 (PGD2) (PTGDRs) y marcadores de activación, tales como CD203c. A medida que se asienta la inflamación crónica, también lo hace la secreción de varios mediadores inflamatorios en la sangre, incluyendo PGD2. La PGD2 es suficiente para inducir la producción de PGD2 por los propios basófilos circulantes, lo que conduce a un efecto autocrino de la PGD2. Esto conduce a una mayor expresión de superficie de CXCR4 y permite la sensibilidad de los basófilos a los gradientes de CXCL12. Como resultado, los basófilos están más ansiosos por migrar a los OLS, que se sabe que secretan más CXCL12 durante la patogénesis del lupus. Allí, los basófilos apoyan a las células T y B autorreactivas a través de su expresión de moléculas activadoras, tales como mBAFF, MHC-II o la secreción de varias citocinas, tales como IL-4 e IL-6. Además, los basófilos pueden promover la producción de anticuerpos autorreactivos y el intercambio de clase de IgE de las células B. A medida que aumentan los títulos de CIC e IgE autorreactiva, también lo hará la inflamación del órgano diana, los títulos de PGD2 y CXCL12 y la migración de basófilos a los OLS. Se supone que los basófilos impulsan un ciclo de amplificación de la enfermedad y el bloqueo de su reclutamiento a los OLS evitaría el aumento de los títulos de autoanticuerpos y los consiguientes brotes.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1: MATERIALES Y MÉTODOS

Ratones.

[0102] Los ratones C57BL/6J de tipo salvaje (WT) se adquirieron en Charles River Laboratories (L'Arbresle, Francia) y los ratonesLyn -l-con una base de C57BL/6 puro se criaron en nuestras instalaciones para animales. Para los estudios de enfermedades de tipo lupus, los ratones se envejecieron durante un mínimo de 40 semanas antes del tratamiento y el análisis. Para otros análisisex vivooin vivo,los ratones jóvenes tenían entre 8 y 12 semanas de edad, a menos que se especifique lo contrario. Los ratones se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos, se utilizaron de acuerdo con las directrices francesas y europeas y fueron aprobados por el comité ético local y por el Departamento de Investigación del gobierno francés según la propuesta de estudio animal 02484.01.

Pacientes.

[0103] Se recogieron muestras de sangre de sujetos adultos inscritos en un estudio prospectivo a largo plazo de lupus eritematoso sistémico (LES) y enfermedades renales crónicas. El estudio fue aprobado por el Comité Régional de Protection des Personnes (CRPP, París, Francia) con la referencia ID-RCB 2014-A00809-38. Los investigadores no conocían los diagnósticos de los pacientes hospitalizados en el momento del procesamiento de la muestra y el análisis de citometría de flujo. Las muestras de LES se obtuvieron de pacientes hospitalizados y ambulatorios y los datos clínicos se recogieron después de la aprobación de la Comission Nationale de l'Informatique et des Libertés (CNIL). Todos los sujetos con LES cumplieron los criterios de clasificación del Colegio Americano de Reumatología para LES. Las características de los donantes de LES y de control sano (HC) se muestran en la Tabla 1 (a continuación). La actividad del lupus se evaluó mediante las puntuaciones de SELENA-SLEDAI (Evaluación nacional de seguridad de los estrógenos en el lupus eritematoso - Índice de actividad de la enfermedad de LES). Según la puntuación SLEDAI, la actividad lúpica se clasificó como inactiva (0-1), leve (2-4) y activa (> 4). Todas las muestras se recogieron en tubos de extracción de sangre con heparina y se procesaron en un plazo de 4 horas. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos. Los sujetos con nefritis lúpica activa se definieron por nefritis de clases III o IV /- V histológicamente activa, de acuerdo con la clasificación ISN/RPS (Weening, JJ, et al., J. Am. Soc. Nephrol. 15, 241 250 (2004))).

Anticuerpos y citometría de flujo

[0104] Todos los anticuerpos procedían de fuentes comerciales. La adquisición por citometría de flujo se realizó con un LSRII Fortessa utilizando el software DIVA (BD Biosciences). El procedimiento de procesamiento de la muestra de sangre fue el descrito anteriormente (Charles, N. et al., Nat. Med. 16, 701-707 (2010)). Todos los datos relativos a los niveles de expresión del marcador se expresan como la relación entre la media geométrica de la intensidad de fluorescencia (Geo MFI) del marcador indicado en las células de interés y la Geo MFI del control de isotipo correspondiente. Los datos se normalizaron o no como se indica en las leyendas de las figuras. El análisis de los datos se realizó con FlowJo vX0.7 (Treestar).

Ensayos de medición de quimiocinas, citocinas, 11P-PGF 2a e inmunoglobulinas

[0105] Todos los ensayos comerciales se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los kits de inmunoensayo enzimático (EIA) de 11p-Prostaglandina F2a eran de Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI). Los kits de ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA) de ANA de ratón eran de ADI (San Antonio, TX). Los kits de ELISA de CXCL12 de humanos y ratones eran de R&D Systems (Minneapolis, MN). La evaluación del contenido de citocinas en el riñón se describió previamente (Charles, N. et al., Nat. Med. 16, 701-707 (2010)). Los kits de ELISA de IL4 e IL1p de ratón fueron de BioLegend (San Diego, CA). Los kits de ELISA de cuantificación de IgE de ratón fueron de Bethyl Laboratories (Montgomery, TX). Las IgG e IgE anti-ADNbc humanos y de ratón se cuantificaron como se describió previamente (Charles, N. et al., Nat. Med. 16, 701-707 (2010)). La absorbancia se evaluó mediante un lector de placas Infinite 200 Pro (TECAN, Mannedorf, Suiza).

Purificación y enriquecimiento de basófilos humanos.

[0106] Los basófilos humanos se purificaron hasta > 95% mediante selección negativa con el kit de enriquecimiento de basófilos humanos (Stemcell Technologies, Grenoble, Francia) para experimentos de cultivo, estimulación y quimiotaxis. En algunos experimentos de quimiotaxis, los basófilos humanos se enriquecieron hasta un 3-5% mediante selección negativa con el kit de selección positiva de PE humano (Stemcell Technologies) utilizando un cóctel de anti-CD3, CD19 y CD89 conjugados con PE (BioLegend). Estos kits se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante.

Citometría de flujo por imágenes

[0107] Los basófilos se enriquecieron al 3-5% como se describió anteriormente y se congelaron a -80 °C en 90% FCS 10% dimetilsulfóxido hasta que se recogieron suficientes muestras. Las células descongeladas se tiñeron, se fijaron (tampón de fijación IC, eBioscience) y se permeabilizaron (tampón de permeación de lavado, BioLegend) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizó anti-CXCR4 humano o su isotipo (BioLegend) para la tinción intracelular. Se añadió DAPI antes del análisis de citometría. Los basófilos se clasificaron como células Singlets/Focus high/DAPI high/PE- CD123 FcaRIa CD303'. La expresión de CXCR4 se determinó para cada basófilo como la relación de la media geométrica de su intensidad de CXCR4 sobre la intensidad media de FMO (Fluorescencia Menos Uno) de CXCR4 del basófilo. Los puntajes de internalización se determinaron utilizando la tinción F raR b como marcador de membrana y la tinción de CXCR4 como sonda. Para cada muestra, el puntaje de externalización corresponde a [1 -puntaje de internalización]. Todos los análisis se realizaron utilizando el citómetro de flujo de imágenes ImageStream X Mark II y el software IDEAS v6 (AMNIS).

Cultivo y estimulación de basófilos

[0108] Los basófilos humanos y los esplenocitos de ratón se cultivaron en un medio de cultivo (RPMI 1640 con Glutamax y 20 mM HEPES, 1 mM de Na-piruvato, aminoácidos no esenciales 1X (todos de Life Technologies, Saint-Aubin, Francia), 100 pg/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina (GE Healthcare, Vélizy, Francia) y 37,5 pM de p-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, MO)) suplementado con 20% de suero bovino fetal inactivado por calor a 37 °C y 5% de CO<2>. Se realizó una estimulación de 18 horas antes de los ensayos de migración en un medio de cultivo a 1^10<®>células por ml mediante la adición de 1 nM de IL-3 (Peprotech), 1 pM de prostaglandina D2 (PGD<2>), 1 pM del agonista específico de PTGDR-1 BW245c, 1 pM del agonista específico de PTGDR-2 13,14-dihidro-15-ceto Prostaglandina D<2>(DK-PGD<2>) (todos de Cayman chemicals) o 5 ng/ml de anti-IgE (IgE anti-humana de ratón o IgE anti-ratón de rata, ambos de Thermo Scientific). Todas las células se lavaron dos veces antes de cualquier ensayo de migración. Las condiciones de control siempre fueron con la misma concentración de vehículo que las condiciones estimuladas.

[0109] Para la modulación de la sobreexpresión de CXCR4 por antagonistas de PTGDRs, inhibidor de PGD<2>y H-PGDS, se resuspendieron basófilos purificados en RPMI que contenía BSA al 0,1% /los siguientes compuestos: vehículo (etanol 0,1%o), 1 pM de antagonista de PTGDR-1 Laropiprant, 1 pM de antagonista de PTGDR-2 CAY10471, 1 o 10 pM de PGD<2>y 1 pM de inhibidor I de la prostaglandina D sintasa (tipo hematopoyético) (catálogo n.° 16256) (todos de Cayman Chemical). Las células se incubaron durante 4 horas a 37 °C y 5% de CO<2>y la expresión en superficie de los marcadores indicados se evaluó mediante citometría de flujo.

Ensayos de migración y apoptosis de basófilos

[0110] Los ensayos de migración se realizaron en un medio de cultivo suplementado con 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA, Sigma-Aldrich) en insertos de 6,5 mm de soporte permeable de policarbonato Transwell de 5 pm (Corning, Nueva York, NY) durante 3 horas a 37 °C y 5% de CO<2>con 1x10° basófilos purificados o 2x10<5>basófilos enriquecidos a 1x10<6>células por ml. Los basófilos purificados o enriquecidos de las cámaras superior e inferior se contaron al final del ensayo. El contenido y el fenotipo de basófilos se determinaron mediante citometría de flujo analizando más de 100 basófilos. La purificación o el enriquecimiento de basófilos humanos no mostraron ninguna diferencia en la migración medida para todas las quimiocinas analizadas. La migración se definió como la relación entre el número de basófilos en la cámara inferior y el número de basófilos en las cámaras superior e inferior. La migración espontánea se definió como la migración observada sin ninguna quimiocina en la cámara inferior. La migración corregida se definió como la diferencia entre la migración específica y la espontánea. Para los ensayos de migración se utilizaron las siguientes concentraciones (que se sabe que son óptimas) para cada compuesto: IL-3 humana: 300 pM (Peprotech), CCL3, CCL5 y CXCL12 humanas: 50 nM; CXCL2 (todos de BioLegend) y PGD<2>(Cayman chemicals): 100 nM. La migración a CCL3, CCL5, CXCL2 y PGD<2>humanas se realizó en presencia de IL-3 a 300 pM en ambas cámaras. La migración con IL-3 representa quimiocinetismo: se agregó IL-3 en ambas cámaras a la misma concentración y se comparó con la migración espontánea observada sin IL-3. Los efectos de una incubación de 24 horas con IL-3 o PGD2 (como se describió anteriormente) sobre la apoptosis de los basófilos se estimaron utilizando el kit de detección de apoptosis FITC Annexin V de BD Biosciences y se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Experimentos in vivo

[0111] Para los ensayos de migraciónin vivode basófilos inducidos por CXCL12, se inyectaron intraperitonealmente (ip) 200 pL de PBS que contenía 100 ng de CXCL12 murino o PBS solo en ratones W<t>de 8-12 semanas de edad. Para los ensayos de migraciónin vivode basófilos inducida por PGD<2>, se inyectaron ip 100 pL de PBS (con 2 pL de etanol) solo, o PBS ± 20 nmoles de PGD<2>± 200 pg de AMD3100 (todos de Cayman Chemicals) en ratonesLyn -</>- de 8-12 semanas de edad. En todos los casos, 24 horas después, los ratones fueron sacrificados y se recogieron el lavado peritoneal, la sangre, los ganglios linfáticos mesentéricos y el bazo y se prepararon para el análisis FACS como se describió anteriormente (Charles, N. et al., Nat. Med. 16, 701-707 (2010)). Para acelerar el desarrollo de la enfermedad mediante inyecciones de PGD<2>, se inyectaron 20 nmoles de PGD<2>o vehículo en PBS a ratonesLyn -</>- de 12 semanas de edad por vía intraperitoneal, cada dos días durante 10 días, para un total de 6 inyecciones. Los ratones se analizaron al día siguiente de la última inyección. Para el tratamiento con antagonistas de PTGDR, se trataron ratones WT yLyn_</ ->envejecidos con dosis orales de 5 mg/kg de Laropiprant y CAY10471 (productos químicos de Cayman) o una dosis equivalente de etanol (vehículo) en agua corriente dos veces al día durante diez días. A continuación, se sacrificaron los ratones y se analizaron sangre, plasma, bazo, médula ósea, riñones y ganglios linfáticos (cervicales, braquiales, inguinales y mesentéricos) como se describió anteriormente (Charles, N. et al., Nat. Con. 16, 701-707 (2010)). El tratamiento no afectó el peso ni el número de células en los diferentes órganos. La viabilidad celular se evaluó mediante el uso de Ghost Dye Violet 510 (Tonbo, San Diego, CA).

Análisis del depósito glomerular de IgG y C3, y función renal.

[0112] La preparación del riñón para el análisis de inmunofluorescencia de los depósitos de C3 e IgG fue como se describió previamente (Charles, N et al. Nat. Med., 2010, 16, 701-707, 2159). La cuantificación de los depósitos de C3 e IgG se realizó utilizando un software de imágenes (v1.49p, NIH, EE. UU.). Se cuantificó un mínimo de 20 glomérulos por riñón. Para la evaluación de la función renal se determinó la relación albúmina/creatinina (ACR). Se recogió orina de cada ratón antes y después del tratamiento. La concentración de albúmina se midió con un ELISA de albúmina de ratón (Bethyl laboratories, Montgomery, TX). Se utilizó un ensayo de creatinina (R&D systems, Minneapolis, MN) para determinar las concentraciones de creatinina en orina. Los resultados se expresan como un aumento de veces correspondiente a la relación de la ACR después/antes del tratamiento.

Análisis estadístico.

[0113] La distribución se evaluó con la prueba de normalidad ómnibus de D'Agostino-Pearson o la prueba de Kolmogorov-Smirnov, según el tamaño de la muestra, para realizar los análisis apropiados. Cuando se compararon más de 2 grupos, se realizaron pruebas de análisis de varianza (ANOVA) de una cola antes de las pruebas posteriores indicadas cuando se alcanzó la significancia (p < 0,05). Todas las pruebas realizadas fueron de dos colas. Las estadísticas se realizaron con los programas GraphPad Prism V5 y V6 (GraphPad) y con STATA 12 (Statacorp).

EJEMPLO 2: RESULTADOS

Fenotipo de basófilos específico del LES y la nefritis lúpica

[0114] En una cohorte de individuos con LES (n=188, Tabla 1), primero validamos que los basófilos de los sujetos con LES tenían un fenotipo activado como lo demuestra el aumento de las expresiones de CD203c (un marcador de activación de basófilos) y CD62L (L-selectina, involucrada en el rodamiento de leucocitos) en comparación con los controles sanos (HC) (n=98,Figura 1a-b, Tabla 1) (Charles, N. et al., Nat. Con. 16, 701-707 (2010)).

[0115] Sin embargo, los basófilos del LES no mostraron un fenotipo desgranulado (medido por su nivel de expresión de<c>D63, Figura 1c). La basopenia pareció ser un buen marcador de enfermedad que se correlaciona con el índice de actividad de la enfermedad del<l>E<s>(SLEDAI, American College of Rheumatology Ad Hoc Committee on Systemic Lupus Erythematosus Response, C. The American College of Rheumatology response criteria for systemic lupus erythematosus clinical trials: measures of overall disease activity. Arthritis Rheum. 50, 3418-3426 (2004))) (coeficiente r de Spearman = -0,3629, P<0,0001) (Figura 2a,b), mientras que la proporción de basófilos positivos para HLA-DR fue mejor (área bajo la curva (AUC) de la característica operativa del receptor (ROC) = 0,9091) que la IgG anti-ADNbc (<r>O<c>0,8384) para discriminar a los sujetos con LES del control sano (HC) (comparación del AUC de ROC mediante el procedimiento DeLong (DeLong, e R et al., Biometrics 44, 837-845 (1988)):P= 0,03) (Figura 2c,d). Además, la basopenia y la alta proporción de basófilos HLA-DR fueron marcadores específicos de nefritis lúpica activa en comparación con otras enfermedades renales activas (Figura 2e,f). Cabe destacar que estos parámetros de basófilos específicos del LES fueron independientes de los tratamientos del paciente con LES en el momento de la extracción de sangre e independientes del género (datos no mostrados). En conjunto, estos datos validaron que los basófilos activados, la basopenia periférica y la alta proporción de basófilos HLA-DR son características distintivas de los individuos con LES activo. Además, nuestros datos sugieren firmemente que el entorno del lupus impulsa una activación subóptima de los basófilos (sin una respuesta de desgranulación detectable) y una redistribución de los basófilos a los OLS.

Tabla 1: Características de pacientes con LES y control

Variables Pacientes con lupus Controles sanos LES AII Inactivo Leve Activo

(SLEDAI<1) (1<SLEDAI<4) (SLEDAI>4) Características

demográficas

n 188 61 41 86 110 Edad, media DE, 37,8 12,3 43,4 14,1 36,1 10,2 34,7 10,6 34,5 14,9 años

Género femenino, 167 (89) 51 (84) 36 (88) 80 (93) 51 (47) n (%)

Características de

lupus

Duración de la 10,5 8,2 11,7 9,0 12,1 7,5 9,1 8,0

enfermedad, media

DE, años

Ab anti-ADNbc 104 (55) 10 (18) 27 (64 67 (79) -positivo, n (%)

Historial de nefritis 144 (77) 36 (59) 29 (66) 79 (92)

lúpica, n (%)

SLEDAI

Media DE 6,6 7,6 0,0 0,2 2,9 1,0 13,0 6,8 -Mediana (rango) 4 (0-43) 0 (0-1) 2 (2-4) 12 (5-43)Características de

tratamiento

Dosis de

prednisona actual

(mg/día)

Media DE 23,6 80,8 4,1 3,9 7,2 8,8 44,8 115,4

15 mg/día o 38 (20) 0 (0) 4 (9) 34 (40) -superior, n (%)

Terapia

inmunosupresora

simultánea (n, %)

Hidroxicloroquina, 159 (84) 54 (88) 38 (93) 67 (78)

n (%)

Micofenolato de 50 (27) 15 (24) 16 (36) 19 (22) -mofetilo, n (%)

Ciclofosfamida, n 3(2) 0 (0) 0 (0) 3 (3) -(%)

Azatioprina, n (%) 26 (14) ____ 8213)__________ u m ____11 (13)

SLEDAI: Indice de actividad de la enfermedad del lupus eritematoso sistémico

Ejes PGD2/PTGDR y CXCR4/CXCL12 en basófilos de sujetos con LES

[0116] Para descifrar la activación de los basófilos y redistribución a los OLS durante la patogénesis del lupus, analizamos en basófilos de sujetos con LES, frente a HC, los niveles de expresión de receptores para moléculas quimiotácticas que se sabe que están desreguladas en individuos con lupus o enfermedades inflamatorias crónicas (Pellefigues, C. y Charles, N., Curr. Opin. Immunol. 25, 704-711 (2013))). La mayoría de las expresiones de los receptores examinados no fueron significativamente diferentes de las observadas en los basófilos HC (Tabla 2). Cabe destacar que el receptor de linfopoyetina del estroma tímico (TSLP-R,Thymic Stromal Lymphopoietin Receptor),el receptor de IL-33 (T1/ST2), el receptor del ligando del motivo C-C (CCR) 4, CCR6 y CCR7 no pudieron detectarse en los basófilos (Tabla 2).

[0117] Sin embargo, la expresión de PTGDR-2 aumentó en los basófilos de individuos con LES (Tabla 2, Figura 3a) al igual que sus títulos de ligando en el plasma (se presentan los niveles de 11p-PGF<2>a, el principal metabolito plasmático de PGD<2>) (Figura 3b). Se encontró una correlación inversa entre los títulos de 1113-PGF2<a>y los recuentos de basófilos en sangre en sujetos con LES (Spearman r=-0,2585, 0,0169) (datos no mostrados). Además, los niveles altos de 11p-PGF2a se asociaron con un aumento de la basopenia en sujetos con LES (Figura 3c). En conjunto, estos datos sugieren firmemente que la PGD<2>y sus receptores están asociados con la activación y extravasación de los basófilos durante el lupus.

[0118] La expresión de CXCR4 aumentó en los basófilos de todos los individuos con LES, pero los pacientes con LES activo mostraron un aumento aún más marcado (Tabla 2, Figura 3d). Los títulos plasmáticos de CXCL12 siguieron el mismo patrón de aumento que su receptor en los basófilos (Figura 3e). Los niveles de expresión de CXCR4 en basófilos se correlacionaron negativamente con el recuento de basófilos en sangre en sujetos con LES (r de Spearman = -0,4692, P < 0,0001) (Figura 4b). Además, en sujetos con LES activo, los títulos altos de CXCL12 se asociaron con una basopenia más pronunciada (Figura 4c). Endolina (CD164) es una sialomucina transmembrana que mejora la sensibilidad a CXCL12 cuando se asocia a CXCR4 y también se la conoce como un marcador de activación de basófilos humanos. Los niveles de CD164 en basófilos de sujetos con LES activo siguieron el mismo patrón de expresión que CXCR4 y se correlacionaron con la basopenia (Spearman r=-0,4165, 0,0029), lo que sugiere una mayor sensibilidad de los basófilos con LES a CXCL12in vivo(Figura 3f y Figura 4d). Se sabe que los basófilos expresan CXCR4 principalmente de manera intracelular. Los análisis por citometría de flujo con imágenes mostraron que los basófilos de pacientes con LES tenían un contenido de CXCR4 mayor y que estaba más externalizado que en los basófilos de H<c>(datos no mostrados).

[0119] CXCL12 se describe como uno de los genes más sobreexpresados durante la diálisis peritoneal y se secreta activamente junto con PGD<2>durante la peritonitis. Para estudiar la migración de basófilos humanosin vivo,los analizamos tanto en sangre como en líquido de diálisis peritoneal de pacientes que estaban siendo tratados por una peritonitis no estéril. La expresión de CXCR4 aumentó drásticamente en basófilos humanos reclutados en el peritoneo inflamado en comparación con sus homólogos sanguíneos (datos no mostrados). Este reclutamiento de basófilos se asoció con una basopenia periférica (datos no mostrados), como se mostró previamente en la urticaria idiopática crónica activa (Jain, S. Dermatology research and practice 2014, 674709), lo que sugiere fuertemente que los basófilos humanos CXCR4<+>pueden migrarin vivoa tejidos inflamados que secretan CXCL12 y PGD<2>, y que la basopenia periférica refleja este reclutamiento activo de basófilos.

[0120] En conjunto, estos datos identificaron los ejes PGD<2>/PTGDR y CXCL12/CXCR4 como vías de activación de basófilos durante los brotes de LES y que pueden explicar su basopenia asociada. Por lo tanto, estos ejes pueden contribuir a la acumulación de basófilos descrita en los OLS en individuos con lupus activo.

El eje PGD2/PTGDRS mejora la migración de basófilos dependiente de CXCR4 durante el lupus

[0121] Para evaluar las consecuencias funcionales de los hallazgos anteriores, se realizaron ensayos de migraciónex vivode basófilos purificados de sujetos HC y con LES activo. Sorprendentemente, los basófilos de LES fueron atraídos por gradientes de CXCL12 mientras que los basófilos de HC no (Figura 5a), lo que refleja sus diferencias en la expresión de CXCR4 y CD164 (Figura 3d,f). Sin embargo, no se detectaron diferencias con otros compuestos quimioatrayentes de basófilos comunes, incluido el PGD<2>(Figura 5b). Dado que los títulos de PGD<2>se asociaron con la basopenia en LES (Figura 3c) y dado que la IgE autorreactiva es prevalente en sujetos con LES activo (Figura 5c y Dema, B., et al., PLoS One 9, e90424 (2014))), investigamos a continuación si estos factores podrían potenciar la migración de basófilos hacia CXCL12. Se sabe que el cultivo estándar de basófilos humanos purificados induce la externalización intracelular de CXCR4, un proceso inhibido en presencia de IL-3. El cebado de basófilos purificados durante 18 horas con 1 pM de PGD<2>mejoró su expresión de CXCR4 y su migración hacia CXCL12 (Figura 5d,e) e indujo la internalización de PTGDR-2 (datos no mostrados), sin inducir su apoptosis (datos no mostrados). Este cebado con PGD2 indujo un ligero aumento en la expresión de la cadena alfa del receptor de IgE de alta afinidad (FcsRIa) en la superficie de los basófilos, lo que puede aumentar su sensibilidad a la estimulación dependiente de IgE (datos no mostrados). La estimulación anti-IgE subóptima (MacGlashan, D., Jr., Clin. Exp. Allergy 40, 1365-1377 (2010)) (i) tendió a aumentar la expresión de CXCR4 en los basófilos (Figura 5d) lo que puede influir en su migración hacia CXCL12 aunque no se alcanzó significación estadística (Figura 5e), (ii) aumentó los niveles de expresión de PTGDR-2 en los basófilos (Fig. 6a) y (iii) no indujo la desgranulación de los basófilos (datos no mostrados). Ninguno de los otros compuestos probados (CCL3, CXCL2 y CCL5), que se sabe que tienen un efecto sobre los basófilos y que están desregulados durante el LES, indujo una mayor externalización de CXCR4ex vivocomo lo hizo PGD2 (datos no mostrados).

[0122] CXCL12 se describe como uno de los genes más sobreexpresados durante la diálisis peritoneal y se secreta activamente junto con PGD2 durante la peritonitis. Para estudiar la migración de basófilos humanosin vivo,los analizamos tanto en sangre como en líquido de diálisis peritoneal de pacientes que estaban siendo tratados por una peritonitis no estéril. Se encontró que CXCR4 aumentaba drásticamente en basófilos humanos reclutados al peritoneo inflamado en comparación con sus homólogos sanguíneos (Figura 5e). Este reclutamiento de basófilos se asoció con una basopenia periférica (Figura 5b complementaria), tal como se ha demostrado previamente en la urticaria idiopática crónica activa. Esto demostró que los basófilos humanos CXCR4+ pueden migrarin vivoa tejidos inflamados que secretan CXCL12 y PGD2.

[0123] A continuación estudiamos el mecanismo por el cual PGD2 indujo la externalización de CXCR4 por basófilos humanos. Tanto PTGDR-1 como PTGDR-2 estuvieron involucrados cooperativamente ya que el antagonismo de uno, el otro o ambos receptores condujo al bloqueo de la externalización de CXCR4 (datos no mostrados). Además, el bloqueo de PTGDR condujo a una externalización espontánea reducida de CXCR4. Esto sugirió que el cultivoex vivoy/o la estimulación mediada por PGD2 de basófilos humanos los llevó a producir PGD2 para tener un efecto autocrino como lo hacen los eosinófilos. Para confirmar esta hipótesis, utilizamos un inhibidor específico de H-PGDS que dio lugar a la misma inhibición de la externalización espontánea de CXCR4 que la inducida por los antagonistas de PTGDR, y a una internalización reducida de PTGDR-2 (datos no mostrados). Junto con el hecho de que el efecto inhibidor de H-PGDS fue superado solo por una concentración de PGD2 diez veces mayor (datos no mostrados), aquí confirmamos nuestra hipótesis anterior de que PGD2 condujo a la externalización de CXCR4 parcialmente al estimular la producción de PGD2 por los propios basófilos.

[0124] En conjunto, estos datos sugieren firmemente que el eje PGD2/PTGDRs influye directamente en la sensibilidad a CXCL12 de los basófilos de pacientes con LES al aumentar tanto su expresión como su externalización de CXCR4, y que el entorno del lupus (incluyendo IgE autorreactiva, CXCL12 y PGD2) facilita esta comunicación cruzada que da como resultado la extravasación de basófilos y la basopenia periférica. Por lo tanto, PGD2 podría ser necesaria para permitir la migración de basófilos dependiente de CXCR4 a OLS en pacientes con LES. De hecho, ambos ejes PGD2/PTGDRs y CXCL12/CXCR4 se asociaron con la basopenia y la actividad de la enfermedad en sujetos con lupus (Figura 3).

Ejes CXCR4/CXCL12 y PGD2/PTGDRS en ratones Lyn propensos al lupus

[0125] Previamente demostramos que los ratonesLyn -1 -envejecidos desarrollan un sesgo por T<h>2 dependiente de basófilos que contribuye a una nefritis de tipo lupus dependiente de IgE, IL-4 y basófilos (Charles, N. et al., Nat. Con.

16, 701-707 (2010); Charles, N., et al., Imunity 30, 533-543 (2009))). En este modelo de enfermedad de tipo lupus, los basófilos se acumulan en los OLS, lo que conduce a un ciclo de amplificación de la enfermedad (Charles, N., et al., Immunity 30, 533-543 (2009))).

[0126] A continuación, evaluamos si este modelo de ratón involucraba tanto los ejes CXCL12/CXCR4 como PGD2/PTGDRs como lo hicieron los sujetos con LES. En ensayos de migraciónex vivo, los basófilos del bazo deLyn -1 -migraron hacia CXCL12 mientras que sus homólogos WT no lo hicieron (figura 7a) imitando las diferencias observadas entre sujetos con LES y HC (Figura 5a). Los niveles de expresión de CXCR4 aumentaron en los basófilos deLyn -1 -de la sangre, la médula ósea (Méd. Ósea) y los OLS en comparación con sus homólogos WT en animales envejecidos (figura 7b). Además, la expresión de CXCR4 aumentó en los basófilos de WT yLyn -1 -de los OLS en comparación con sus homólogos sanguíneos, lo que sugiere una participación de CXCR4 en su acumulación en estos órganos (figura 7b). La inyección intraperitoneal (ip) de CXCL12 en ratones WT indujo la migración de basófilosin vivoal sitio de la inyección (Figura 7c) y a los ganglios linfáticos mesentéricos de drenaje (NLm) (Figura 8a).

[0127] La inyección ipin vivode PGD2 aumentó la expresión de CXCR4 en los basófilos de NLm deLyn ~-~(Figura 7d), como ocurrióex vivoen basófilos humanos (Figura 5d), e impulsó su acumulación en los OLS y el peritoneo (Figura 7e y Figura 8b,c). Además, la inyección intraperitonealin vivode PGD2 en ratonesLyn ~-~provocó una basopenia periférica significativa, pero transitoria, en comparación con las condiciones de estado estacionario (datos no mostrados), como se observó en pacientes con diálisis peritoneal (datos no mostrados). Este reclutamiento de basófilos inducido por PGD2 dependía estrictamente del eje CXCL12/CXCR4, ya que la coinyección con AMD3100, un antagonista específico de CXCR4, eliminó por completo el reclutamiento de basófilos tanto en los OLS como en el peritoneo (Figura 7e y Figura 8b,c). En ratones, la regulación positiva de CXCR4 inducida por PGD2 también estuvo mediada por PTGDR-1 y PTGDR-2 (CRTH2), como lo demuestran los efectos de sus agonistas específicos (BW245c y DK-PGD2, respectivamente) sobre los basófilos de WT de bazo ex vivo (Figura 7f). Ambos agonistas indujeron un aumento significativo pero mucho menor en la expresión de CXCR4 en otros esplenocitos de WT, incluidas las células T y B (datos no mostrados).

[0128] Se sabe que PTGDR-1 induce la producción de monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) tras la interacción con PGD<2>. A continuación, analizamos el efecto de un AMPc permeable a la membrana (N6,2'-O-dibutiril-adenosina 3':5'-monofosfato cíclico (db-cAMP)) sobre la externalización de CXCR4 por basófilos de bazo de ratón WTex vivo.Los basófilos externalizaron CXCR4 tras la exposición a db-cAMP (Higo. 9a) con una sensibilidad 100 veces mayor que las células T a este compuesto (Figura 9b). La PGD<2>no pudo inducir suficiente AMPc a través de PTGDR-1 para provocar la externalización de CXCR4 por las células T en estos entornos, a diferencia de lo que se observó en los basófilos (Figura 9a,b). Los experimentos de respuesta a la dosis de cada agonista específico de PTGDR en presencia o no del inhibidor de H-PGDS sugirieron nuevamente que ambos PTGDR pudieron inducir cooperativamente la externalización de CXCR4 en los basófilos a través de la síntesis de PGD<2>inducida por PTGDR-2 que actúa de manera autocrina sobre la producción de AMPc mediada por PTGDR-1 (Figura 9c).

[0129] Estos resultados sugieren fuertemente que en ratonesLyn -</>-viejos, como en sujetos con LES, PGD<2>mejora la acumulación de basófilos dependiente de CXCL12in vivoen tejidos inflamados y OLS mediante la modulación de sus niveles de expresión de CXCR4 a través de la activación de PTGDR-1 y PTGDR-2.

La exposición crónica a PGD2 acelera el desarrollo de una enfermedad de tipo lupus de manera dependiente de los basófilos

[0130] Por lo tanto, una exposición más crónica a PGD<2>en ratones propensos al lupus antes de que comiencen a desarrollar la enfermedad debería conducir a una acumulación crónica de basófilos en los OLS, un mayor número de células plasmáticas autorreactivas y una aceleración del desarrollo de la enfermedad. Para verificar esta hipótesis, inyectamos repetidamente PGD<2>ip a ratonesLyn -</>-jóvenes (12 semanas de edad) cada dos días durante diez días. Como se esperaba, los basófilos aumentaron sus niveles de expresión de CXCR4 (datos no mostrados) y se acumularon sistémicamente en los OLS (Figura 10a,b) donde se activaron como lo demuestra su mayor expresión de IA-IE (Figura 10c). Esto se asoció con una mayor proporción de células plasmáticas CD19<+>CD138<+>en los OLS (Figura 10d,e), lo que resulta en un aumento de la deposición de complejos inmunes en el riñón, tal como lo demuestra la cuantificación de la deposición de C3 e IgG (Figura 10f). En consecuencia, casi todos los ratonesLyn ~-~inyectados con PGD<2>presentaron una albuminuria aumentada a diferencia de sus homólogos inyectados con PBS al final del protocolo (Figura 10g). Otros tipos de células inmunes analizados no mostraron ningún aumento significativo en su expresión en superficie de CXCR4 (datos no mostrados). Es importante destacar que esta aceleración de la enfermedad de tipo lupus inducida por PGD<2>dependía de los basófilos, ya que el agotamiento de basófilos mediado por anticuerpos (MAR-1) durante todo el protocolo condujo a un rescate completo de los efectos de PGD<2>en el desarrollo de la enfermedad (Figura 10b-e). Estos resultados confirmaron que la PGD<2>, al permitir la acumulación de basófilos dependiente de CXCR4 en los OLS, contribuye a la enfermedad de tipo lupus y al daño renal mediado por autoanticuerpos.

El direccionamiento al eje PGD2 reduce la acumulación de basófilos mediada por CXCR4 en los OLS y atenúa la enfermedad de tipo lupus

[0131] El direccionamiento al eje CXCL12/CXCR4 en el lupus murino ya se ha descrito y ha demostrado cierta eficacia en la actividad de la enfermedad (Balabanian, K., et al., J. Immunol. 170, 3392-3400 (2003)), Wang, A., et al., J. Immunol. 182, 4448-4458 (2009))). Sin embargo, se sabe que el antagonismo de CXCR4 (con<a>M<d>3100), desarrollado inicialmente como un fármaco contra el VIH, induce una liberación de células madre hematopoyéticas e interfiere con las funciones homeostáticas (Devi, S. et al.. J. Exp. Med. 210, 2321-2336, (2013), Hummel, S. et al., Curr. Opin. Hematol. 21, 29-36 (2014))). Prevenir la regulación positiva de CXCR4 en los basófilos de ratonesLyn ~-~propensos al lupus mediante el bloqueo del eje PGD<2>/PTGDRs parecía un enfoque más seguro para desactivar el ciclo de amplificación dependiente de basófilos de la producción de autoanticuerpos en los OLS.

[0132] A continuación, tratamos ratonesLyn-</>- y WT envejecidos mediante sonda oral con ambos antagonistas específicos de PTGDR-1 y PTGDR-2, Laropiprant y CAY10471, respectivamente, a una dosis de 5 mg/kg cada uno, dos veces al día durante diez días. Este tratamiento condujo a una reducción drástica en los números de basófilos en los OLS de los animalesLyn ~-~(Figura 12a,b) asociado con una expresión disminuida de CXCR4 en los basófilos del bazo (Figura 12c). Cabe destacar que las proporciones de BM y basófilos en sangre no se vieron afectadas por el tratamiento (Figura 13a,b). Estos resultados validaron el enfoque consistente en deshabilitar la acumulación de basófilos en los OLS mediante el direccionamiento a PTGDR.

[0133] Como se esperaba, esta reducción en la acumulación de basófilos se asoció con una disminución significativa del número de células plasmáticas de vida corta CD19<+>CD138<+>(Figura 12d y Figura 13c). Sorprendentemente, las proporciones de todas las demás poblaciones de células inmunes analizadas (células B, neutrófilos, monocitos Ly6C<+>y monocitos Ly6C<'>) no se vieron afectadas por el tratamiento, al igual que sus niveles de expresión de CXCR4 (datos no mostrados). El bloqueo de PTGDR en animalesLyn -</>-, al deshabilitar la acumulación de basófilos en los OLS, disminuyó sus títulos de autoanticuerpos (Figura 12e y Figura 13d) y su sesgo por T<h>2 medido por las concentraciones plasmáticas de IgE total (Figura 12f). En consecuencia, este tratamiento permitió también una disminución significativa del contenido renal de depósitos de C3 e IgG (Figura 11) y las citocinas proinflamatorias IL-4 e IL-1p (Figura 12g,h). Por lo tanto, un tratamiento a corto plazo con antagonistas de PTGDR permitió una disminución eficiente de la actividad de la enfermedad observada en nuestros animales propensos al lupus.

[0134] En conjunto, estos resultados sugieren que apuntar al eje PGD<2>/PTGDR podría ser un nuevo enfoque terapéutico valioso en el LES. De hecho, el bloqueo de los PTGDR, al romper la migración de los basófilos dependiente de CXCL12 a los OLS, podría desactivar el ciclo de amplificación dependiente de los basófilos de la producción de autoanticuerpos, previniendo eficazmente los brotes y el daño orgánico posterior en el LES (Figura 14).

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Doble antagonista de PTGDR-1/PTGDR-2 para su uso en la prevención y/o tratamiento de la nefritis lúpica.

2. Composición farmacéutica que comprende un doble antagonista de PTGDR-1/PTGDR-2, para su uso en la prevención y/o tratamiento de la nefritis lúpica.

3. Doble antagonista de PTGDR-1/PTGDR-2 para su uso, según la reivindicación 1, o composición farmacéutica para su uso, según la reivindicación 2, en que dicho doble antagonista de PTGDR-1/PTGDR-2 se administra para limitar la extensión o reducir la aparición de daño orgánico.

4. Doble antagonista de PTGDR-1/PTGDR-2 para su uso, según la reivindicación 1, o composición farmacéutica para su uso, según la reivindicación 2, en que el doble antagonista de PTGDR-1/PTGDR-2 impide la migración de los basófilos a órganos linfoides secundarios.

5. Doble antagonista de PTGDR-1/PTGDR-2 para su uso, según la reivindicación 1, o composición farmacéutica para su uso, según la reivindicación 2, en que el doble antagonista de PTGDR-1/PTGDR-2 limita la extensión o reduce el aumento en los títulos de autoanticuerpos y/o la aparición de brotes de LES y/o daños en los órganos.