ES2991077T3

ES2991077T3 - Composiciones y procedimientos para la modificación in vitro de genomas víricos

Info

Publication number: ES2991077T3
Application number: ES15870907T
Authority: ES
Inventors: Kyle C Cady; E Magda Barbu; Christen G Dipetrillo
Original assignee: C3J Therapeutics Inc
Current assignee: C3J Therapeutics Inc
Priority date: 2014-12-16
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2024-12-02
Anticipated expiration: 2035-12-15
Also published as: US11913032B2; AU2015362618A1; EP3234136A1; CN107278227B; CN113215115B; CA2971205A1; US20160186147A1; EP3234136B1; CN107278227A; AU2015362618B2; US10221398B2; EP4484556A2; US10711253B2; JP6842417B2; US20210087538A1; WO2016100389A1; EA201791343A1; EP3234136A4; JP7133671B2; JP2021074024A

Abstract

La presente divulgación se refiere a un método de ingeniería in vitro de ácidos nucleicos. Esta divulgación se refiere además a la ingeniería in vitro de genomas virales y a la mejora de las propiedades virales mediante ingeniería genómica in vitro de genomas virales. Específicamente, la divulgación se refiere a la digestión genómica viral in vitro utilizando Cas9 guiada por ARN, el ensamblaje de un genoma recombinante mediante la inserción de un fragmento de ADN o ARN en el genoma viral digerido y la transformación de una célula huésped con el genoma recombinante. Este método también se refiere a la ingeniería in vitro para la corrección de errores de ácidos nucleicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos para la modificaciónin vitrode genomas víricos

Ámbito de la divulgación

La divulgación se dirige en general a la modificación rápida de genomas y, más específicamente, a la modificación de genomas víricosin vitro.

Información general

Los virus se utilizan en muchas aplicaciones científicas, especialmente en el desarrollo de productos profilácticos, terapéuticos y diagnósticos. Para estos fines, los virus se someten a menudo a modificación genética. La modificaciónin vivorequiere un organismo hospedador manejable y a menudo puede llevar semanas o meses crear virus y vectores víricos modificados (Levin y Bull, Nat. Rev. Microbiol., febrero de 2004, 2(2):166-173). Además, la manipulación de muchos genomas víricos en las células conlleva problemas de toxicidad. Hasta ahora, los esfuerzos por desarrollar procedimientos de modificación genéticain vitrode genomas víricos de gran tamaño se han visto limitados por la disponibilidad de secuencias diana de enzimas de restricción únicas y las bajas eficiencias obtenidas para la digestión del genoma y el posterior ensamblaje recombinante. Además, muchos esfuerzos de modificación genética se ven frustrados por la predicción incorrecta de los extremos genómicas víricas. Por ejemplo, los genomas víricos similares al PB1 de acceso público sitúan incorrectamente las secuencias terminales en el centro del genoma, un error que se produce a menudo con los procedimientos informáticos actuales de secuenciación y ensamblaje de genomas (Ceyssenset al.,Environ. Mibrobiol., noviembre de 2009, 11(11):2874-2883).

Sigue existiendo la necesidad de una modificación genética rápida de los genomas víricos, especialmente para los virus que infectan a hospedadores no genéticamente tratables. La presente divulgación utiliza la digestión y el ensamblajein vitromediados por Cas9 para la modificación específica de sitio de genomas víricos completos. Este procedimiento aumenta drásticamente la precisión, sencillez y rapidez con que pueden modificarse genéticamente los genomas víricos. Además, esta técnica supera la dificultad bien establecida de manipular genomas víricos virulentos, a menudo tóxicos, dentro de células hospedadoras nativas y heterólogas. La utilización del procedimiento de modificaciónin vitrodivulgado también permite la identificación de los extremos genómicos víricos correctos, lo que facilita la posterior modificación mediante la presente divulgación.

La corrección de erroresin vitroes una técnica inestimable para generar secuencias deseadas tras aplicar técnicas de clonación o ensamblaje. Los procedimientos convencionales de corrección de errores se basan en la PCR, que tiene dos problemas inherentes: 1) la PCR puede introducir mutaciones adicionales no deseadas en el ácido nucleico y 2) la PCR, en este contexto, tiene una restricción de tamaño de aproximadamente 5 kb antes de volverse cada vez más propensa a errores (manual del kit de mutagénesis dirigida a sitio Quick Change, New England Biolabs, EE. UU.). Por lo tanto, los procedimientos convencionales de corrección de errores basados en la PCR no pueden aplicarse de forma fiable a plásmidos de más de 5 kb, ya sea como resultado de mutaciones adicionales generadas por la PCR o por un fallo en la amplificación de la plantilla completa.

Liuet al.(2003), Gene Therap., 10: 292-303 divulgan un virusHerpes simplexde tipo 1 modificado. Luet al.(2009), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(12): 4629-4634 divulgan bacteriófagos diseñados para su uso como adyuvantes en la terapia con antibióticos. Bhattaraiet al.(2012), Biomaterials, 33(20): 5166-5174 divulgan un bacteriófago diseñado para inhibir la infección intracelularpor Chlamydia trachomatis.Linet al.(2012), PLoS ONE, 7(2):e30954 divulgan un bacteriófago recombinante.

Sumario de la divulgación

La invención se define en el conjunto de reivindicaciones adjunto. La descripción puede contener otras divulgaciones técnicas que, aunque no forman parte de la invención reivindicada, se proporcionan para situar la invención en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados.

Entre los diversos aspectos de la presente divulgación se encuentran composiciones y procedimientos para la modificaciónin vitrode secuencias de ácido nucleico utilizando una nucleasa guiada por ARN. En un aspecto, la divulgación se refiere a la mejora de propiedades víricas específicas mediante la modificación genéticain vitrode secuencias de ácido nucleico vírico y las composiciones o partículas víricas mejoradas. En otro aspecto, la divulgación se refiere a la digestiónin vitrode secuencias de ácido nucleico vírico utilizando una endonucleasa guiada por ARN, por ejemplo, Cas9, seguida del ensamblaje de una secuencia de ácido nucleico recombinante mediante la inserción de uno o varios fragmentos de ADN o ARN en el ácido nucleico vírico digerido.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un virus modificado que comprende un ácido nucleico vírico modificado capaz, tras su introducción en una célula hospedadora, de producir partículas víricas no naturales con dos o más propiedades víricas mejoradas en comparación con las partículas víricas producidas por la introducción del ácido nucleico vírico no modificado en una célula hospedadora.

En algunos aspectos, las partículas víricas producidas tienen al menos tres propiedades víricas mejoradas.

En algunos aspectos, cada propiedad vírica mejorada se selecciona del grupo que consiste en la gama de hospedadores, el ciclo lítico vírico, la adsorción, la adhesión, la inyección, la replicación y ensamblaje, la lisis, el tamaño de explosión, la evasión inmunitaria, la estimulación inmunitaria, la desactivación inmunitaria, la dispersión de biopelículas, la resistencia bacteriana a fagos, la sensibilización bacteriana a antibióticos, la modulación de factores de virulencia y la digestión o edición selectiva del genoma del hospedador.

En algunos aspectos, el ácido nucleico vírico modificado es un genoma vírico modificado.

En algunos aspectos, el genoma vírico modificado es un genoma bacteriófago modificado. En algunos aspectos, al menos una de las propiedades víricas mejoradas es la gama de hospedadores.

En algunos aspectos, cada propiedad vírica mejorada es el resultado de al menos una modificación en el ácido nucleico vírico modificado.

En algunos aspectos, al menos una propiedad vírica mejorada es el resultado de al menos dos modificaciones en el ácido nucleico vírico modificado.

En algunos aspectos, dicha al menos una modificación en el ácido nucleico vírico modificado es el resultado de una única etapa de modificación.

En algunos aspectos, dicha al menos una modificación en el ácido nucleico vírico modificado es el resultado de etapas de modificación iterativas.

En algunos aspectos, al menos una de las modificaciones se encuentra dentro de una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 85% de identidad con SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:50 o SEQ ID NO:25.

En algunos aspectos, al menos una de las modificaciones se encuentra dentro de una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:48 o SEQ ID NO:49.

En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende todo o una parte de un genoma vírico que tiene al menos un 85 % de identidad con el genoma de LUZ19. En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende además la totalidad o una parte de un gengp18heterólogo. En algunos aspectos, el gengp18heterólogo tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO:26. En algunos aspectos, el gengp18heterólogo codifica una secuencia de aminoácidos con al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO:38.

En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende todo o una parte de un genoma vírico que tiene al menos un 85 % de identidad con el genoma de LUZ19. En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende además la totalidad o una parte de un gengp34modificado. En algunos aspectos, el gengp34modificado codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una mutación en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 55 de la SEQ ID NO:5.

En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende todo o una parte de un genoma vírico que tiene al menos un 85 % de identidad con el genoma de LUZ19. En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende además una modificación en una o más secuencias que tienen al menos un 85 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:50. En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende además una modificación en cada una de una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO:1, una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO:2, una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO:3, y una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO:50. En algunos aspectos, las modificaciones comprenden una sustitución de G por A en una posición correspondiente a la posición 50 del ácido nucleico de SEQ ID NO:1, una sustitución de G por T en una posición correspondiente a la posición 160 del ácido nucleico de la SEQ ID NO:50, una sustitución de A por G en una posición correspondiente a la posición 245 del ácido nucleico de la SEQ ID NO:2, una sustitución de AT por TC en posiciones correspondientes a las posiciones 247-248 del ácido nucleico de la SEQ ID NO:2, y una sustitución de A por G en una posición correspondiente a la posición 757 del ácido nucleico de la SEQ ID NO:3.

En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende todo o una parte de un genoma vírico que tiene al menos un 85 % de identidad con el genoma de LUZ19. En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende además una modificación en una o más secuencias de ácido nucleico que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36 y SEQ ID NO:48. En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende una modificación en una secuencia de ácido nucleico que codifica cada una de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO:34, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO:35, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO:36, y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO:48. En algunos aspectos, las modificaciones comprenden una sustitución de C por Y en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 17 de la SEQ ID NO:34, una sustitución de D por Y en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 36 de la SEQ ID NO:48, una sustitución de D por G en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 82 de la SEQ ID NO:35, una sustitución de I por S en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 83 de la SEQ ID NO:35, y una sustitución de N por D en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 253 de la SEQ ID NO:36.

En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende todo o una parte de un genoma vírico que tiene al menos un 85 % de identidad con el genoma de LUZ19. En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende además una modificación dentro de una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO:25. En algunos aspectos, la modificación es una inserción de una molécula de ácido nucleico heterólogo en una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con la SEQ ID NO:25, o una sustitución de una secuencia comprendida dentro de una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con la SEQ ID NO:25 por una molécula de ácido nucleico heterólogo. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que tiene al menos un 85 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20.

En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende todo o una parte de un genoma vírico que tiene al menos un 85 % de identidad con el genoma de LUZ19. En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende además una modificación dentro de una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO:49. En algunos aspectos, la modificación es una inserción de una molécula de ácido nucleico heterólogo en una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad con la SEQ ID NO:49, o una sustitución de una secuencia de ácido nucleico comprendida dentro de una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad con la SEQ ID NO:49 por una molécula de ácido nucleico heterólogo. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46 y SEQ ID NO:47.

En algunos aspectos, el ácido nucleico vírico modificado comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo unida operativamente a un promotor que comprende una secuencia de ácido nucleico comprendida dentro de SEQ ID NO:21 o una parte de la misma.

En algunos aspectos, el ácido nucleico vírico modificado comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo unida operativamente a un terminador que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:22 o una parte de la misma.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un procedimiento para generar un virus modificado de interés que tiene dos o más propiedades víricas deseadas que comprende: (a) proporcionar un primer genoma vírico; y (b) generar un genoma vírico modificado mediante la combinación de al menos un fragmento del primer genoma vírico con al menos una molécula de ácido nucleico de reparación para generar un segundo genoma vírico que comprenda al menos una modificación en comparación con el primer genoma vírico; en el que, el segundo genoma vírico, al ser introducido en una célula hospedadora, sea capaz de producir partículas víricas con dos o más propiedades víricas mejoradas.

En algunos aspectos, el procedimiento comprende además (c) repetir las etapas (a)-(b) en una o más iteraciones.

En algunos aspectos, se utilizan indistintamente propiedad mejorada o propiedades mejoradas y propiedad vírica mejorada o propiedades víricas mejoradas.

En algunos aspectos, la generación del genoma vírico modificado en la etapa (b) comprende: (1) la digestiónin vitrode una región del primer genoma vírico utilizando una endonucleasa; y (2) el ensamblaje de al menos un fragmento del primer genoma vírico digerido con al menos una molécula de ácido nucleico de reparación.

En algunos aspectos, el primer genoma vírico se aísla de partículas víricas.

En algunos aspectos, el primer genoma vírico o dicha al menos una molécula de ácido nucleico de reparación se sintetizade novo.

En algunos aspectos, la síntesisde novocomprende la combinación de moléculas de ácido nucleico sintetizadas químicamente, secuencias de ácido nucleico amplificadas por PCR, fragmentos digeridos de moléculas de ácido nucleico aisladas, o cualquier combinación de las mismas.

En algunos aspectos, el primer genoma vírico o dicha al menos una molécula de ácido nucleico de reparación se amplifica antes de la digestiónin vitro.

En algunos aspectos, el primer genoma vírico tiene al menos 3 kb, al menos 10 kb, al menos 18 kb, al menos 25 kb o al menos 30 kb.

En algunos aspectos, el ensamblaje se realizain vitrooin vivo.

En algunos aspectos, el ensamblaje se realizain vitrocon una mezcla que comprende: (a) una exonucleasa 5' a 3' aislada que carece de actividad exonucleasa 3'; (b) una ADN polimerasa sin desplazamiento de cadena aislada y que tiene actividad exonucleasa 3', o una mezcla de dicha ADN polimerasa con una segunda ADN polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3'; (c) una ligasa aislada; y (d) una mezcla de dNTP, en condiciones que son eficaces para la inserción del fragmento en el ácido nucleico vírico digerido para formar un ácido nucleico recombinante que comprenda el genoma vírico modificado.

En algunos aspectos, la endonucleasa es una nucleasa guiada por ARN.

En algunos aspectos, el procedimiento comprende además al menos un ARN guía.

En algunos aspectos, la nucleasa guiada por ARN es Cas9 o una enzima derivada de Cas9 y en la que dicho al menos un ARN guía comprende 1) un ARNg quimérico o 2) un ARNcr y un ARNtracr.

En algunos aspectos, la endonucleasa se inactiva por calor o se retira antes del ensamblaje.

En algunos aspectos, la digestiónin vitrocomprende además espermidina.

En algunos aspectos, el procedimiento comprende además la transformación del genoma vírico modificado en una célula hospedadora.

En algunos aspectos, el procedimiento comprende además el uso de un kit de encapsidaciónin vitropara encapsidar el genoma vírico modificado en partículas víricas.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un virus modificado generado por cualquiera de los procedimientos divulgados en el presente documento. En algunos aspectos, el virus modificado es cualquiera de los virus modificados descritos en el presente documento.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un kit para la modificación de moléculas de ácido nucleico vírico que comprende: (a) una nucleasa recombinante purificada guiada por ARN; (b) una exonucleasa 5' a 3' aislada que carece de actividad exonucleasa 3'; (c) una ADN polimerasa sin desplazamiento de cadena aislada y que tiene actividad exonucleasa 3', o una mezcla de dicha ADN polimerasa con una segunda ADN polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3'; y (d) una ligasa termoestable aislada.

En algunos aspectos, el kit comprende además uno o más de: (1) un agente de aglomeración; (2) una mezcla de dNTP; y (3) un tampón adecuado.

En algunos aspectos, el kit comprende además ARN guía diseñados a medida.

En algunos aspectos, el kit comprende además moléculas de ácido nucleico sintetizadas diseñadas a medida para servir como fragmento de ADN insertado en una reacción de ensamblaje.

En algunos aspectos, el kit comprende además células hospedadoras competentes para la transformación.

En algunos aspectos, el kit comprende además ácidos nucleicos genómicos víricos aislados.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un sistema de ácido nucleico vírico modificadoin vitroque comprende: un ácido nucleico vírico aislado, una nucleasa guiada por ARN recombinante, al menos un ARN guía y un fragmento de ácido nucleico que se insertará en el sitio de digestión del ácido nucleico aislado.

En algunos aspectos, el sistema es tal que la nucleasa guiada por ARN recombinante y al menos un ARN selectivo forman un complejo capaz de digerir el ácido nucleico vírico aislado.

En algunos aspectos, el sistema comprende además espermidina.

En algunos aspectos, el sistema comprende además: una exonucleasa 5' a 3' aislada que carece de actividad exonucleasa 3'; una ADN polimerasa sin desplazamiento de cadena aislada con actividad exonucleasa 3', o una mezcla de dicha ADN polimerasa con una segunda ADN polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3'; una ligasa aislada; y una mezcla de dNTP, en el que el sistema se encuentra en condiciones que son eficaces para la inserción del fragmento de ácido nucleico en el ácido nucleico vírico aislado en el lugar de la digestión de la nucleasa guiada por ARN para formar un ácido nucleico vírico recombinante.

En algunos aspectos, el sistema descrito en el presente documento es tal que el ácido nucleico vírico recombinante es capaz de producir partículas víricas no naturales con al menos dos propiedades víricas mejoradas en comparación con las partículas víricas resultantes del ácido nucleico vírico no modificado. En algunos ejemplos, la propiedad o propiedades víricas mejoradas se seleccionan del grupo que consiste en la gama de hospedadores, el ciclo lítico vírico, la adsorción, la adhesión, la inyección, la replicación y el ensamblaje, la lisis, el tamaño de explosión, la evasión inmunitaria, la estimulación inmunitaria, la desactivación inmunitaria, la dispersión de biopelículas, la resistencia bacteriana a fagos, la sensibilización bacteriana a antibióticos, la modulación de factores de virulencia y la digestión o edición selectiva del genoma del hospedador.

En algunos aspectos, en el sistema descrito en el presente documento, la nucleasa guiada por ARN es Cas9 o una enzima derivada de Cas9. En algunos aspectos, la nucleasa guiada por ARN se inactiva o retira antes del ensamblaje.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un procedimiento de modificación de una secuencia de ácido nucleico que comprende: (a) proporcionar un ácido nucleico; (b) la digestiónin vitrode una región del ácido nucleico utilizando una nucleasa guiada por ARN; y (c) el ensamblaje de un ácido nucleico recombinante mediante la inserción de un fragmento de ADN en el ácido nucleico digerido, en el que el ensamblaje se realizain vitroen un único recipiente con una mezcla de componentes que comprende: (i) una exonucleasa 5' a 3' aislada que carece de actividad exonucleasa 3'; (ii) una ADN polimerasa sin desplazamiento de cadena aislada y que tiene actividad exonucleasa 3', o una mezcla de dicha ADN polimerasa con una segunda ADN polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3'; (iii) una ligasa aislada; y (iv) una mezcla de dNTP, en condiciones que son eficaces para la inserción del fragmento en el ácido nucleico digerido para formar un ácido nucleico recombinante.

En algunos aspectos, la nucleasa guiada por ARN es Cas9 o una enzima derivada de Cas9. En algunos ejemplos, la nucleasa guiada por ARN se inactiva por exposición al calor o se retira antes del ensamblaje.

En algunos aspectos, el procedimiento comprende además: (d) la transformación del ácido nucleico recombinante en una célula hospedadora.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimiento de modificación de un ácido nucleico en el que el ácido nucleico es un plásmido aislado de una célula hospedadora. En algunos aspectos, el plásmido tiene al menos 5 kb. En algunos aspectos, el plásmido tiene al menos 6 kb. En algunos aspectos, el plásmido tiene al menos 10 kb. En algunos aspectos, el plásmido tiene al menos 15 kb. En algunos aspectos, el plásmido tiene al menos 20 kb.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-1F muestran un esquema del procesoin vitrode modificación directa de genomas víricos. A) Los genomas se extraen de partículas víricas purificadas, utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Las líneas grises ilustran un ejemplo de genoma vírico de ADNbc. Las líneas de color gris claro en los extremos del genoma indican repeticiones terminales directas, frecuentes en muchos genomas víricos. B) A continuación, los genomas víricos se digieren en uno o más sitios específicos utilizando una nucleasa guiada por ARN, tal como Cas9, junto con ARN selectivos purificados, tales como ARNg quiméricos, ARNcr y ARNtracr, o ARNcr solos. La ilustración muestra localizaciones genómicas víricas definidas por selección con una nucleasa guiada por ARN, según lo especificado por los ARN dados. C) La nucleasa guiada por ARN se inactiva mediante procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, entre otros, la exposición al calor y/o la eliminación mediante extracción clásica con fenol-cloroformo. D) Un inserto de ADN o ARN se obtiene mediante procedimientos conocidos en la técnica, incluidos, entre otros, la síntesisin vitro,la amplificación (PCR) o la liberación mediada por enzimas a partir de plásmidos, virus o ADN genómico bacteriano (ADNg). El diagrama muestra el inserto que se ha generado (líneas grises oscuras) con las regiones de homología correspondientes a las secuencias víricas que flanquean el sitio o sitios de digestión de nucleasas guiadas por ARN (regiones terminales grises). E) Los genomas víricos digeridos y el inserto purificado se ensamblanin vitromediante procedimientos conocidos en la técnica, incluidos, entre otros, el ensamblaje de Gibson, SLIC y/o el ensamblaje de Golden Gate. Ilustración del genoma recombinante ensamblado, ahora con la nueva secuencia insertada (líneas grises oscuras) en el lugar deseado. F) Los genomas víricos recombinantes se transforman directamente en las células hospedadoras mediante procedimientos conocidos en la técnica, incluidos, entre otros, la electroporación o la transformación química. La imagen muestra la recuperación de partículas víricas funcionales tras la transformación de un genoma vírico infeccioso en células hospedadoras susceptibles.

Las figuras 2A-2F muestran la modificaciónin vitrode un genoma vírico. A) Purificación del genoma vírico de LUZ 19 de ADNbc de aproximadamente 43 kb directamente a partir de partículas víricas. B) Digestión específica de sitio del genoma vírico purificado en dos localizaciones independientes para eliminar el fragmento del gengp7utilizando la nucleasa dependiente de ARN Cas9 y ARNg transcritosin vitro.C) Se utilizó la PCR para amplificar el gengp7del virus OKF77. D) Se utilizó el ensamblaje de Gibsonin vitropara secuenciar e integrar sin discontinuidades específicamente el fragmento del gengp7de OKF77 amplificado por PCR en el genoma de LUZ 19 digerido. E) Los genomas infecciosos ensambladosin vitrose transformaron directamente en células hospedadoras para recuperar partículas víricas funcionales, como se pone de manifiesto por la formación de placas. F) Se utilizaron cebadores internos y externos para verificar por PCR que los virus contenían el nuevo fragmento de ADN en el sitio genómico correcto. Todos los clones víricos analizados dieron positivo en la PCR para el nuevo fragmento de insercióngp7de OKF77 (7 carriles de la derecha).

Las figuras 3A-3B muestran la generación de un virus con propiedades víricas mejoradas tras la modificación del genoma víricoin vitro.A) Diagrama que representa los genomas del virus LUZ19 natural y de un derivado modificado que porta el gengp18del virus LKD16 en lugar de la secuenciagp18del LUZ19 natural. Las flechas negras indican los marcos de lectura abiertos nativos de LUZ19, mientras que la flecha gris indica el gengp18 deLKD16 que se ha integrado. B) Izquierda, diagrama de Venn que muestra las bacterias hospedadoras compartidas e independientes infectadas por los virus LUZ19 y LKD16. Se analizó una colección diversa de 282 aislados clínicosde P aeruginosa.A la derecha, diagrama de Venn que muestra que un virus LUZ19 modificado que porta el gengp18de LKD16 tiene una gama de hospedadores ampliado, incluidas 3 de las 6 cepas previamente infectadas sólo por LKD16.

Las figuras 4A-4C son esquemas que muestran el proceso utilizado para identificar y seleccionar los elementos genéticos y las mutaciones puntuales necesarias para la ampliación de la gama de hospedadores y la modificación de un virus de amplia gama de hospedadores capaz de infectar toda la gama de hospedadores de un género vírico. A) Representación esquemática del proceso utilizado para identificar las mutaciones responsables de la especificidad de la gama de hospedadores. B) Representación esquemática de las modificaciones del genoma necesarias para generar un virus LUZ19 de amplia gama de hospedadores (WHR LUZ19); los asteriscos (*) identifican la ubicación de cada mutación puntual relacionada con la gama de hospedadores. Los marcadoresgp13C17Y,gp18D36Y,gp38D82G e I83S, ygp40N253D describen los productos génicos y la mutación puntual de aminoácidos vinculada a la ampliación de la gama de hospedadores de<l>U<z>19. PA7245, PA7255, PA7410, PA7427, PA7503 y PA7686 son aislados clínicos de Paeruginosasensibles únicamente a LKD16 y WHR LUZ19; PA7649 es un aislado clínico deP aeruginosasensible únicamente a OKMV y WHR LUZ19. Los aislados clínicos infectados tras la adición de una mutación determinada se muestran encima de la mutación dada. C) Izquierda, diagrama de Venn que muestra las bacterias hospedadoras compartidas e independientes infectadas por los virus LUZ19, LKD 16 y OKMV. A la derecha, diagrama de Venn que demuestra que el virus WHR LUZ 19 modificado que porta las mutaciones puntuales descritas anteriormente es capaz de infectar a las 67 cepas susceptibles al género de virus OKMV.

Las figuras 5A-5E demuestran que la mutación de la proteína Gp34 de LUZ19 mejora la actividad lítica. A) La proteína Gp34 de LUZ19 es miembro del complejo tubular de la cola vírica (véase la imagen incluida). B) Ensayo en placa en agar blando para dos fagos relacionados que expresan la Gp34 de LUZ19 de tipo salvaje o la mutación delta Leucina 55 (L55A) en Gp34 (Fago*). Las imágenes se tomaron durante un período de dos días, e ilustran que los fagos que expresan una mutación Gp34 L55A tienen zonas de lisis aumentadas. C) Ensayo de biopelícula con violeta de cristal que extrapola la biomasa de biopelícula como medida de la incorporación del violeta de cristal. El fago LUZ19* que expresa Gp34 L55A fue más capaz de alterar la biopelículade P aeruginosapreformada durante 8 horas en comparación con LUZ19 de tipo salvaje. Se utilizó gentamicina a diez veces la concentración mínima inhibidora (CMI) para eliminar completamente la biopelícula. D) Ilustración que muestra la localización de la mutacióngp34en comparación con el genoma LUZ19 de tipo salvaje. E) Tabla que demuestra la diferencia en la absorción y el tamaño de explosión entre LUZ19 y LUZ19 que expresa Gp34 L55A.

Las figuras 6A-6F son esquemas que muestran la modificación iterativa de un virus con mejora de dos propiedades independientes. A) Representación esquemática del ADNg vírico de LUZ19LKDi6gpi8 en el que el gengp18de LUZ 19 de tipo salvaje fue sustituido por el homólogo LKD 16. En negro, la secuencia genómica de LUZ19 de tipo salvaje; en gris,gp18de LKD16. B) Susceptibilidad de aislados de laboratorio y clínicos MDR al virus original purificado (LKD16 y LUZ19) y al virus modificado LUZ19LKD16gpi8, lo que demuestra la consolidación de la gama de hospedadores. C) Representación esquemática del ADNg vírico de LUZ19*LKD16gpi8 en el que se delecionó la leucina codificada en la posición 55 de la Gp34 y se sustituyó elgp18de LUZ19 por elgp18del virus LKD16. En negro, secuencia genómica de LUZ19 de tipo salvaje; en gris,gp18de LKD16; la estrella gris indica gp34ALeu55. D) Susceptibilidad de aislados de laboratorio y clínicos MDR a virus originales purificados (LKD16, LUZ19 y LUZ19LKD16gpi8 que portangp18del virus LKD16) y a virus modificados (LUZ19* que porta una deleción de la leucina codificada en la posición 55 de la GP34 y LUZ19*LKD16gpi8), lo que demuestra la consolidación de la gama de hospedadores en los virus LUZ19LKD16gpi8 y LUZ19* LKD<16>gpi<8>. E) Evaluación de la actividad lítica de los fagos de tipo salvaje y modificados contra bacterias adheridas a monocapas de queratinocitos. El número de bacterias PA01K y PA7245 adheridas a las células se indicó como porcentaje del total de bacterias incubadas con monocapas de queratinocitos. Los datos demuestran una mejor actividad lítica de los virus LUZ19* y LUZ19*LKD16gpi8. F) Mejora de la alteración de la biopelícula temprana a las 8 horas de PAO1K y PA7245 por fagos modificados en comparación con los virus originales. Se utilizó gentamicina a una concentración diez veces superior a la concentración mínima inhibidora para eliminar completamente la biopelícula. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos individuales realizados por triplicado. Las barras representan la media ± MEE; *p< 0,01;**p< 0,001; ***p < 0,0001.

Las figuras 7A-7F son esquemas que muestran un segundo ejemplo de modificación iterativa de un virus con mejora de dos propiedades independientes. A) Representación esquemática de LUZ 19 diseñado para expresar diferentes cargas activas codificadas genéticamente a partir de un locusgp49mejorado. El gengp49se sustituyó por un casete que contenía un gen de interés ("gene of interest", GOI) flanqueado por el promotor y el terminador principales de la cápside(gp32) (Pgp32y Tgp32). GOI dispersante de biopelículas utilizado: EPS despolimerasas (Pp15gp44 -gp44de la espícula de la cola dePseudomonas pudita$15; NTUgp34 -gp34de la espícula de la cola del fago NTUH-K2044-K11 (NTU)de Klebsiella pneumoniae;LKA1gp49 -gp49de la espícula de la cola del fago LKA1de P. aeruginosa),modulinas solubles en fenol tensioactivos deStaphylococcus epidermidis(PSMa) yStaphylococcus aureus(PSMa3 y PSMb2), y surfactina DspB deAggregatibacter actinomycetemcomitans.B) Ensayo de dispersión de biopelícula que muestra la actividad del fago LUZ19 modificado contra una biopelícula de 24 h de PaeruginosaPAO1K tratada con 100 fagos durante 3 h. Se utilizó gentamicina a una concentración mínima inhibidora (CMI) diez veces superior. C) Representación esquemática del fago WHR LUZ 19 previamente modificado para expresar un GOI a partir del locusgp49modificado. D) Ensayo de dispersión de biopelícula en el que se observa que el WHR LUZ19 modificado para expresar enzimas y surfactinas tiene actividad contra una biopelícula de 24 h de PaeruginosaPAO1K tratada con 100 fagos durante 3 h. Cargas activas modificadas: EPS despolimerasa Pp15gp44 y SePSMa. La gentamicina se utilizó en una concentración diez veces superior a la CMI. E) Susceptibilidad de aislados clínicos y de laboratorio a las cepas originales purificadas (LKD16 y LUZ19) y a los derivados de LUZ19, lo que demuestra la consolidación y el mantenimiento de la gama de hospedadores tras una modificación posterior para expresar elementos dispersores de biopelículas. F) Diagrama de Venn que muestra la retención de la gama de hospedadores de WHR LUZ19 tras la adición de cargas activas dispersantes de biopelículas Pp15gp44 y SePSMa.

Las figuras 8A-8C son esquemas que muestran la creación de un virus capaz de impedir que las células hospedadoras adquieran resistencia vírica cuando se combina con una concentración subinhibidora de antibiótico. A) Representación esquemática de LUZ19 de tipo salvaje modificado para expresar las lisinas de los fagos MS2 o PRR1. B) y C) Ensayos de muerte microbiana en función del tiempo que demuestran la sensibilización deP aeruginosaPAO1K a concentraciones subinhibidoras de carbenicilina (Cb - 1/5 * CMI) por LUZ19 que expresa lisinas de un bacteriófago de ARNmc. Estos datos demuestran que un bacteriófago modificado que expresa lisinas no nativas en combinación con concentraciones subinhibidoras de antibióticos puede evitar que las bacterias adquieran rápidamente resistencia a un único virus.

Las figuras 9A-9D son esquemas que muestran la creación de un segundo virus capaz de impedir que las células hospedadoras adquieran resistencia vírica. A) Representación esquemática de LUZ19 de tipo salvaje modificado para expresar la proteína bacteriocina PyoS5 a partir del locusgp49modificado. B) Ensayos de muerte microbiana en función del tiempo que muestran que el crecimiento de la cepa PA7416 de XDRPA fue inhibido inicialmente por LUZ 19 de tipo salvaje, aunque las bacterias eluyen rápidamente al virus, lo que conduce a un nuevo crecimiento bacteriano. Se añadieron aproximadamente 1 * 107 ufc por pocillo. Se añadieron MOI altas = 10 ufp/ufc y MOI bajas = 0,01 ufp/ufc del virus indicado o del vehículo a las 0 h. C) Ensayos de muerte microbiana en función del tiempo que demuestran que LUZ19 que codifica PyoS5 es capaz de inhibir el crecimiento y el crecimiento nuevo de la cepa PA7416 de x Dr PA en relación con el virus de tipo salvaje. Se añadieron aproximadamente 1 * 107 ufc por pocillo. Se añadieron MOI altas = 10 ufp/ufc y MOI bajas = 0,01 ufp/ufc del virus indicado o vehículo a las 0 h. D) Comparación del crecimiento de PA7416 tras 24 horas en presencia de LUZ19 de tipo salvaje o LUZ19+pyoS5. El gráfico muestra los datos del experimento con MOI baja.

La figura 10 es un dibujo esquemático de un sistema que integra la edición dirigida del genoma vírico con el cribado fenotípico de bacteriófagos para crear un bacteriófago modificado genéticamente con mejoras en dos o más características. El sistema se basa en rondas iterativas de cribado y secuenciación de virus mutantes o naturales con rasgos fenotípicos deseables y en la integración de esos rasgos en uno o más chasis víricos en una o varias etapas de modificación. Este proceso proporciona un procedimiento directo y racional para identificar rápidamente los elementos genéticos subyacentes a un rasgo fenotípico específico de bacteriófago, integrar múltiples mutaciones o alelos independientes en un único genoma de bacteriófago y crear un virus modificado que combine dos o más rasgos mejorados.

Las figuras 11A-11G muestran la modificaciónin vitrodel genoma del fago M13de E. coli.A) Representación esquemática de los fagos moderados M13mp18 y M13paprikadeE. coli.B) Electroforesis en gel de ADN genómico circular de M13 digeridoin vitroutilizando los ARNg 1 y 2 en reacciones independientes con la endonucleasa guiada por ARN Cas9. El diagrama que aparece debajo del gel muestra la naturaleza circular y lineal de los genomas de M13 no digeridos y doblemente digeridos, respectivamente. Estos datos demuestran que ambos ARNg digieren de forma precisa y completa el ADNbc de M13 en las localizaciones correctas. C) Electroforesis en gel de ADN genómico circular de M13 digeridoin vitroutilizando ambos ARNg y la endonucleasa Cas9 guiada por ARN en la misma reacción (doble digestión). El diagrama que aparece debajo del gel muestra la naturaleza circular y lineal de los genomas de M13 no digeridos y doblemente digeridos, respectivamente. D) Electroforesis en gel que muestra el inserto generado por PCR que contiene el indicador fluorescentepaprika.E) Transformación del ADNg deM13paprika digerido y ensambladoin vitroen células de E.colipara recuperar partículas víricas funcionales. Las placas víricas son tenues y veladas porque M13 es un bacteriófago moderado que no lisa las células hospedadoras, lo que da lugar a una escasa formación de placas. Como control positivo se utilizó ADNg de M13 no digerido. El ADNg de M13 digerido con Cas9, pero ensamblado en ausencia de un inserto (sin inserto), demuestra tanto la finalización de la digestión como el bajo nivel de fondo. F) Verificación por PCR en placa de la modificación de M13paprika. Se diseñaron cebadores directos e inversos externos para insertarlos en regiones de homología. El ADNg de M13 no modificado produjo un producto de 0,9 kb y se utilizó como control negativo para las reacciones de PCR. G) Imágenes fluorescentes (abajo) y de campo brillante (arriba) de M13paprika original y modificado durante la formación de la placa.

Las figuras 12A-12E muestran la modificaciónin vitrode un segundo genoma de fagode E. coli. A)Representación esquemática del fago AAcIIdeE. coli.El genoma del fago lineal tiene un tamaño de 48,5 kb. B) Electroforesis en gel de ADN genómico de A digeridoin vitroutilizando los ARNg 1 y 2 en reacciones independientes con una endonucleasa guiada por ARN. El diagrama que aparece debajo del gel representa los productos lineales no digeridos y los productos de la digestión previstos. Estos datos demuestran que ambos ARNg digieren de forma precisa y completa el ADNbc de A en las localizaciones correctas. C) Electroforesis en gel de ADN genómico de A doblemente digeridoin vitroutilizando tanto ARNg como una endonucleasa guiada por ARN en la misma reacción. El diagrama que aparece debajo del gel representa los productos lineales no digeridos y los productos de la doble digestión previstos. D) Esquema que representa el uso del tampón de encapsidación de fagos A para encapsidar genomas de fagos de tipo salvaje y recombinantesin vitro.Los genomas del fago A ensamblados y doblemente digeridos con Cas9 se encapsidaronin vitrosiguiendo el protocolo del fabricante y se sembraron enE. colipara recuperar los fagos AAcIIque se han modificado. E) Verificación por PCR del gen AAcII.El cebador directo se situó fuera de la región de modificación. Los clones con deleción positiva tienen un tamaño previsto de 300 pb.

Las figuras 13A-13D muestran la modificaciónin vitrode secuencias de un virus citomegalovirus humano (HCMV). A) Representación esquemática del genoma vírico del HCMV de 235 kb de longitud completa. El genoma superior en forma de cigarro representa el genoma completo, mientras que la sección negra indica la región de manipulación. La pequeña sección blanca indica la inserción de 235 pb añadida mediante el procedimiento de modificaciónin vitrodescrito en el presente documento. B) Electroforesis en gel del plásmido doblemente digeridoin vitroque porta una región de 17,8 kb del genoma del HCMV utilizando dos ARNg y la endonucleasa guiada por ARN Cas9. El diagrama que aparece debajo del gel muestra los productos circulares no digeridos y los productos lineales de la doble digestión. Estos datos demuestran que ambos ARNg digieren de forma precisa y completa la secuencia DE ADNbc del HCMV en el lugar correcto. C) Electroforesis en gel que muestra el inserto generado por PCR que contiene la nueva secuencia de inserción RL13. D) Verificación por PCR de la secuencia modificada del HCMV. El cebador directo se situó fuera de la región de modificación. Los clones positivos a la inserción tienen un tamaño previsto de 500 pb.

Las figuras 14A-14F muestran la identificación rápida de los extremos de los fagos. A) Aislamiento del ADN genómico a partir de partículas víricas purificadas. B) Secuenciación de última generación de ADNg (MiSeq o PacBio) y fusión automatizada de lecturas de alta calidad de ADN en ensamblajes más largos para reconstruir la secuencia original. En gris claro, se muestran las DTR ("direct terminal repeats", repeticiones terminales directas). El software de ensamblaje automatizado sitúa incorrectamente las DTR de los genomas terminalmente repetitivos en la región interna de la secuencia vírica. Los extremos físicos genómicos se confirman mediante la digestión con Cas9 dirigida de la secuencia predicha. C) Predicción por medios informáticos de los extremos físicos del genoma basada en la identificación de regiones de secuenciación de doble cobertura y en la búsqueda BLAST que empareja genomas con repetición terminal estrechamente relacionados. Los extremos físicos se confirman mediante la escisión por la endonucleasa Cas9 de los extremos físicos previstos. D) Tras la inactivación de Cas9, se purifican y secuencian los fragmentos de ADN correspondientes a los extremos físicos genómicos. E) Ensamblaje preciso del genoma basado en la secuenciación de extremos físicos. F) Ejemplo de cartografiado de extremos físicos genómicos de los fagos LBL3 y 14-1 (genomas con repetición terminal) utilizando digestión con Cas9 dirigida en una posición específica predicha por reordenamientos genómicos generados por medios informáticos. Las flechas de color gris claro señalan los fragmentos de ADN purificados y secuenciados.

Las figuras 15A-15C muestran esquemáticamente la estrategia de diseño y síntesis de ARNsg quimérico. A) Ilustración que muestra la ubicación de los motivos NGG PAM (secuencias subrayadas en gris oscuro) y los sitios diana de ARNsg (secuencias en gris claro) que flanquean un gen de interés (GOI). Las secuencias en negrita indican las secuencias genómicas víricas restantes. B) Diseño de oligonucleótidos utilizados como plantillas para la transcripciónin vitrode ARNsg. Las secuencias que constituyen el promotor de T7, la secuencia selectiva de ARNsg y la región conservada del ARNsg quimérico se indican subrayadas en gris oscuro, con color gris claro y en negrita, respectivamente. C) Diagrama del ARNsg quimérico transcritoin vitro.Las secuencias con color gris claro y en negrita indican las regiones quiméricas selectivas y conservadas que constituyen cada ARNsg funcional, respectivamente. Todas las N indican secuencias variables utilizadas para alterar la especificidad por la diana de cada ARNsg.

Descripción detallada de realizaciones ilustrativas

La presente divulgación proporciona composiciones y procedimientos para la modificaciónin vitroy se relaciona además con la mejora de las propiedades víricas. La presente divulgación proporciona además un procedimiento para la modificaciónin vitrode ácidos nucleicos.

Antes de describir las presentes composiciones y procedimientos, debe entenderse que la presente divulgación no se limita a composiciones, procedimientos y condiciones experimentales concretos descritos, ya que dichas composiciones, procedimientos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento se utiliza sólo con el fin de describir realizaciones concretas y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente divulgación se limitará únicamente en las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos y expresiones técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que suele entender una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece la presente divulgación. Aunque cualquier procedimiento y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden ser utilizados en la práctica o el ensayo de la divulgación, a continuación se describen los procedimientos y materiales preferidos. Las definiciones que figuran a continuación sirven para la comprensión de la divulgación, pero en ningún caso se considerará que suplantan la comprensión de los términos y expresiones por parte de los expertos en la materia.

Tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un/una" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, las referencias a "el procedimiento" incluyen uno o más procedimientos y/o etapas del tipo descrito en el presente documento que resultarán evidentes para los expertos en la materia al leer la presente divulgación, etc.

Tal como se utilizan en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se refiere a cualquier valor numérico, significa un valor de más o menos el 10 % del valor indicado. Por ejemplo, "aproximadamente 50 grados C" abarca un intervalo de temperaturas de 45 grados C a 55 grados C, ambos inclusive. Del mismo modo, "aproximadamente 100 mM" abarca un intervalo gama de concentraciones de 90 mM a 110 mM, ambos inclusive. Como alternativa, "aproximadamente" puede significar dentro del 5 % del valor indicado, o, en algunos casos, dentro del 2,5 % del valor indicado, o "aproximadamente" puede significar redondeado al dígito significativo más cercano. Todos los intervalos proporcionados en la aplicación incluyen los valores de los extremos superior e inferior del intervalo.

Los términos y expresiones "células", "cultivos celulares", "línea celular", "células hospedadoras recombinantes", "células receptoras" y "células hospedadoras", tal como se utilizan en el presente documento, incluyen las células primarias del sujeto y cualquier progenie de las mismas, sin tener en cuenta el número de transferencias. Debe entenderse que no toda la progenie es exactamente idéntica a la célula original (debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas o a diferencias en el entorno); sin embargo, dicha progenie alterada se incluye en estos términos, siempre que la progenie conserve la misma funcionalidad que la de la célula transformada originariamente.

El término "ensamblaje" o "ensamblar", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la unión de moléculas de ADN o ARN.

La expresión "molécula de ácido nucleico de reparación", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de ensamblarse con uno o más fragmentos de ADN o un plásmido de ADN o molécula de ácido nucleico de ADN digerido o escindido para generar una molécula de secuencia de ácido nucleico contigua o ADN plasmídico cerrado.

Las expresiones " síntesisde novo","ensamblajede novo","síntesis química" y "síntesis de ADN" se refieren a procedimientos de creación de secuencias de ácido nucleico sin necesidad de una plantilla precursora preexistente.

En aquellos procedimientos de la divulgación que se llevan a cabo"in vitro",todos los componentes proteicos están aislados y/o sustancialmente purificados. Las reacciones de ensamblajein vitrono se llevan a cabo en una célula viva o con un extracto celular bruto; las reacciones se llevan a cabo en un entorno acelular.

Una "molécula de ARN funcional" es una molécula de ARN que puede interactuar con una o más proteínas o moléculas de ácido nucleico para realizar o participar en una función estructural, catalítica o reguladora que afecta a la expresión o actividad de un gen o producto génico distinto del gen que produjo el ARN funcional. Un ARN funcional puede ser, por ejemplo, un ARN de transferencia (ARNt), un ARN ribosómico (ARNr), un ARN antisentido (ARNas), un microARN (miARN), un ARN de horquilla corto (ARNhc), un ARN interferente pequeño (ARNpi), un ARN guía (ARNg), un ARN crispr (ARNcr) o un ARN transactivador (ARNtracr) de un sistema CRISPR, ARN nucleolares pequeños (snoARN), ARN que interactúa con piwi (piARN) o una ribozima.

El término "gen" se utiliza ampliamente para indicar cualquier segmento de una molécula de ácido nucleico (normalmente ADN, pero opcionalmente ARN) que codifica un polipéptido o ARN expresado. Así, los genes incluyen secuencias que codifican ARN expresado (que pueden incluir secuencias codificadoras de polipéptidos o, por ejemplo, ARN funcionales, tales como ARN ribosómicos, ARNt, ARN antisentido, microARN, ARN de horquilla corta, ARNg, ARNcr, ARNtracr, ribozimas, etc.). Los genes pueden comprender además secuencias reguladoras necesarias para su expresión o que la afecten, así como secuencias asociadas a la secuencia codificadora de proteínas o ARN en su estado natural, tales como, por ejemplo, secuencias de intrones, secuencias no traducidas 5' o 3', etc. En algunos ejemplos, un gen puede referirse únicamente a una parte codificante de proteínas de una molécula de ADN o ARN, que puede o no incluir intrones. Un gen tiene preferentemente más de 50 nucleótidos de longitud, más preferentemente más de 100 nucleótidos de longitud, y puede tener, por ejemplo, entre 50 nucleótidos y 500000 nucleótidos de longitud, tal como entre 100 nucleótidos y 100000 nucleótidos de longitud o entre aproximadamente 200 nucleótidos y aproximadamente 50000 nucleótidos de longitud, o entre aproximadamente 200 nucleótidos y aproximadamente 20 000 nucleótidos de longitud. Los genes pueden obtenerse de diversas fuentes, incluida la clonación a partir de una fuente de interés o la síntesis a partir de información de secuencias conocidas o predichas.

Las expresiones "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a un segmento de ADN o ARN (por ejemplo, ARNm), y también incluye ácidos nucleicos con esqueletos modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos, ácidos nucleicos bloqueados) o nucleobases modificadas o no naturales. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser bicatenarias o monocatenarias; un ácido nucleico monocatenario que comprende un gen o una parte del mismo puede ser una cadena codificante (sentido) o una cadena no codificante (antisentido).

Las expresiones "secuencia codificante" o "región codificante", tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a regiones de una secuencia de ácido nucleico que pueden transcribirse para producir un ARN funcional o un transcrito de ARN que puede traducirse en un polipéptido cuando se sitúa bajo el control de secuencias de control de expresión apropiadas y en presencia de la maquinaria celular o las enzimas adecuadas. La expresión "secuencia no codificante" o "región no codificante" se refiere a regiones de una secuencia de ácido nucleico que no se transcriben ni se traducen en aminoácidos (por ejemplo, intrones, regiones no traducidas, etc.) o no se transcriben o no forman al menos una parte de una secuencia de ARN funcional madura.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "proteína" o "polipéptido" pretende abarcar un "polipéptido" en singular, así como "polipéptidos" en plural, y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto. Por lo tanto, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término o expresión utilizado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos se incluye en la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" puede utilizarse en lugar de cualquiera de estos términos o indistintamente con respecto a los mismos.

Una molécula de ácido nucleico puede "derivarse de" una fuente indicada, lo que incluye el aislamiento (total o parcial) de un segmento de ácido nucleico de una fuente indicada. Una molécula de ácido nucleico también puede derivarse de una fuente indicada, por ejemplo, mediante clonación directa, amplificación por PCR o síntesis artificial a partir de la fuente de polinucleótidos indicada o basándose en una secuencia asociada a la fuente de polinucleótidos indicada. Los genes o moléculas de ácido nucleico derivados de una fuente o especie concreta también incluyen genes o moléculas de ácido nucleico que tienen modificaciones de secuencia con respecto a las moléculas de ácido nucleico de origen. Por ejemplo, un gen o molécula de ácido nucleico derivado de una fuente (por ejemplo, un gen de referencia concreto) puede incluir una o más mutaciones con respecto al gen o molécula de ácido nucleico de origen que no sean intencionadas o que se introduzcan deliberadamente, y si una o más mutaciones, incluidas sustituciones, deleciones o inserciones, se introducen deliberadamente, las alteraciones de la secuencia pueden introducirse por mutación aleatoria o dirigida de células o ácidos nucleicos, por amplificación u otras técnicas de biología molecular, o por síntesis química, o cualquier combinación de las mismas. Un gen o molécula de ácido nucleico derivado de un gen o molécula de ácido nucleico de referencia que codifica un ARN o polipéptido funcional puede codificar un ARN o polipéptido funcional que tenga al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90% o al menos un 95 % de identidad de secuencia con el ARN o polipéptido funcional de referencia o de origen, o con un fragmento funcional del mismo. Por ejemplo, un gen o molécula de ácido nucleico derivado de un gen o molécula de ácido nucleico de referencia que codifica un ARN o polipéptido funcional puede codificar un ARN o polipéptido funcional que tenga al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con el ARN o polipéptido funcional de referencia o de origen, o con un fragmento funcional del mismo.

Tal como se utiliza en el presente documento, un ácido nucleico o proteína "aislado" se retira de su medio natural o del contexto en el que el ácido nucleico o proteína existe en la naturaleza. Por ejemplo, una proteína o molécula de ácido nucleico aislada se extrae de la célula u organismo con el que está asociada en su entorno nativo o natural. Un ácido nucleico o una proteína aislados pueden estar, en algunos casos, parcial o sustancialmente purificados, pero no se requiere un nivel concreto de purificación para el aislamiento. Así, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico aislada puede ser una secuencia de ácido nucleico que ha sido extirpada del cromosoma, genoma o episoma en el que está integrada en la naturaleza.

Una molécula de ácido nucleico o secuencia de nucleótidos o una proteína o secuencia polipeptídica "purificada" está sustancialmente exenta de material celular y componentes celulares. La molécula de ácido nucleico o proteína purificada puede estar exenta de sustancias químicas más allá del tampón o disolvente, por ejemplo. "Sustancialmente libre" no significa que otros componentes, además de las moléculas de ácido nucleico novedosas, sean indetectables.

El término "natural" y la expresión "de tipo salvaje" se refieren a una forma que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico, una secuencia de nucleótidos o una proteína natural o de tipo salvaje puede estar presente y aislada de una fuente natural y no ha sido modificada intencionadamente por la manipulación humana.

Tal como se utiliza en el presente documento, "expresión" incluye la expresión de un gen al menos al nivel de producción de ARN, y un "producto de expresión" incluye el producto resultante, por ejemplo, un polipéptido o ARN funcional (por ejemplo, un ARN ribosómico, un ARNt, un ARN antisentido, un microARN, un ARNhc, una ribozima, etc.), de un gen expresado. La expresión "aumento de la expresión" incluye una alteración de la expresión génica para facilitar el aumento de la producción de ARNm y/o el aumento de la expresión de polipéptidos. El "aumento de la producción", cuando se refiere a la abundancia de proteína o a la abundancia de proteína activa como resultado de la expresión génica, las tasas de recambio de proteínas, los estados de activación de proteínas y similares, incluye un aumento en la cantidad de expresión de un polipéptido, en el nivel de la actividad enzimática de un polipéptido, o una combinación de ambos, en comparación con la producción o la actividad enzimática nativa del polipéptido.

Una "molécula de ácido nucleico exógeno" o "gen exógeno" se refiere a una molécula de ácido nucleico o gen que ha sido introducido ("transformado") en una célula o virus. Un organismo transformado puede denominarse célula o virus recombinante, en el que pueden introducirse uno o más genes exógenos adicionales. Un descendiente de una célula o virus transformado con una molécula de ácido nucleico también se denomina "transformado" o "recombinante" si ha heredado la molécula de ácido nucleico exógeno. El gen exógeno puede ser de una especie diferente (y por tanto "heterólogo"), o de la misma especie (y por tanto "homólogo"), en relación con el organismo que se transforma. Una molécula de ácido nucleico, gen o proteína "endógena" es una molécula de ácido nucleico, gen o proteína nativa tal y como se encuentra en el organismo o es producida de forma natural por él.

Además, el término "exógeno", tal como se utiliza en el presente documento en el contexto de un gen o proteína, se refiere a un gen o proteína que no se deriva de la especie del organismo hospedador.

El término "transgén", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un gen exógeno, es decir, un gen introducido en un microorganismo o un progenitor por intervención humana.

El término "ortólogo" de un gen o proteína, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a su equivalente funcional en otra especie.

Los números de registro de genes y proteínas, que suelen proporcionarse en el presente documento entre paréntesis después del nombre de un gen o especie, son identificadores distintivos para un registro de secuencias de acceso público en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (National Center for Biotechnology Information, NCBI) (ncbi.nlm.nih.gov) mantenido por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos. El número de identificación de secuencias "GenInfo Identifier" (GI) es específico de una secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Si una secuencia cambia de algún modo, se le asigna un nuevo número GI. Existe una herramienta de historial de revisiones de secuencias que permite realizar un seguimiento de los distintos números de GI, números de versión y fechas de actualización de las secuencias que aparecen en un registro específico de GenBank. La búsqueda y obtención de secuencias de ácidos nucleicos o genes o secuencias de proteínas basadas en números de registro y números de GI es bien conocida en las técnicas, por ejemplo, de la biología celular, la bioquímica, la biología molecular y la genética molecular.

Tal como se utilizan en el presente documento, la expresión "porcentaje de identidad" o el término "homología", con respecto a las secuencias de ácido nucleico o polipéptido, se definen como el porcentaje de residuos de nucleótidos o aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a los polipéptidos conocidos, después de alinear las secuencias para obtener el máximo porcentaje de identidad e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de homología. Las inserciones o deleciones N-terminales o C-terminales no se interpretarán como que afectan a la homología, y las deleciones y/o inserciones internas en la secuencia polipeptídica de menos de aproximadamente 30, menos de aproximadamente 20 o menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos no se interpretarán como que afectan a la homología. La homología o identidad a nivel de secuencia de nucleótidos o aminoácidos puede determinarse mediante el análisis BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) utilizando el algoritmo empleado por los programas blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx (Altschul (1997), Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402, y Karlin (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268), que se adaptan a la búsqueda de similitudes de secuencias. El enfoque utilizado por el programa BLAST consiste en considerar en primer lugar segmentos similares, con y sin huecos, entre una secuencia de consulta y una secuencia de la base de datos, evaluar después la significación estadística de todas las coincidencias identificadas y, por último, resumir sólo aquellas coincidencias que satisfacen un umbral de significación preseleccionado. Para un análisis de los aspectos básicos de la búsqueda de similitudes en las bases de datos de secuencias, véase Altschul (1994), Nature Genetics, 6, 119-129. Los parámetros de búsqueda para histograma, descripciones, alineaciones, suposición (es decir, el umbral de significación estadística para notificar las coincidencias con las secuencias de la base de datos), valor de corte, matriz y filtro (baja complejidad) pueden estar en la configuración predeterminada. La matriz de puntuación por defecto utilizada por blastp, blastx, tblastn y tblastx es la matriz BLOSUM62 (Henikoff (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10915-10919), recomendada para secuencias de consulta de más de 85 de longitud (bases nucleotídicas o aminoácidos).

Para blastn, diseñado para comparar secuencias de nucleótidos, la matriz de puntuación se establece por las proporciones de M (es decir, la puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes) a N (es decir, la puntuación de penalización para residuos no coincidentes), en el que los valores por defecto para M y N pueden ser 5 y -4, respectivamente. Se pueden ajustar cuatro parámetros de blastn como se indica a continuación: Q = 10 (penalización por creación de huecos); R = 10 (penalización por extensión de huecos); w ink= 1 (genera aciertos de palabra en cada enésima posición de guiño a lo largo de la consulta); y gapw= 16 (establece el ancho de ventana dentro del cual se generan alineaciones con huecos). Los ajustes equivalentes de los parámetros Blastp para la comparación de secuencias de aminoácidos pueden ser: Q = 9; R = 2; guiño =1; y gapw = 32. Una comparación Bestfit entre secuencias, disponible en el paquete GCG versión 10.0, puede utilizar los parámetros de ADN GAP = 50 (penalización por creación de huecos) y LEN = 3 (penalización por extensión de huecos), y los ajustes equivalentes en las comparaciones de proteínas pueden ser GAP = 8 y LEN = 2.

Así, cuando se hace referencia a las secuencias polipeptídicas o de ácido nucleico de la presente divulgación, se incluyen identidades de secuencia de al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, de al menos un 70 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, o al menos un 85 %, por ejemplo, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, o aproximadamente un 100% de identidad de secuencia con la secuencia polipeptídica o de ácido nucleico de longitud completa, o a fragmentos de la misma que comprendan una secuencia consecutiva de al menos 100, al menos 125, al menos 150 o más residuos de aminoácidos de la proteína completa; variantes de dichas secuencias, por ejemplo, en las que se ha insertado al menos un residuo de aminoácido N- y/o C-terminal a y/o dentro de las secuencias divulgadas que contienen la inserción y sustitución. Las variantes contempladas pueden incluir, además o como alternativa, las que contienen mutaciones predeterminadas, por ejemplo, mediante recombinación homóloga o mutagénesis dirigida a sitio o por PCR, y los correspondientes polipéptidos o ácidos nucleicos de otras especies, incluidos, entre otros, los descritos en el presente documento, los alelos u otras variantes de origen natural de la familia de polipéptidos o ácidos nucleicos que contienen una inserción y sustitución; y/o derivados, en los que el polipéptido ha sido modificado covalentemente por sustitución química, enzimática o por otros medios apropiados, con un resto distinto de un aminoácido natural que contiene la inserción y sustitución (por ejemplo, un resto detectable, tal como una enzima).

El término "nativo" se utiliza en el presente documento para referirse a secuencias de ácido nucleico o secuencias de aminoácidos tal y como se encuentran de forma natural en el hospedador, organismo o virus. El término "no nativo" se utiliza en el presente documento para referirse a secuencias de ácidos nucleicos o secuencias de aminoácidos que no aparecen de forma natural en el hospedador, organismo o virus. Una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos que ha sido extraída de una célula o virus, sometida a manipulación en laboratorio e introducida o reintroducida en una célula o virus hospedador se considera "no nativa" Los genes sintéticos o parcialmente sintéticos introducidos en una célula hospedadora o virus son "no nativos" Los genes no nativos incluyen además genes endógenos al virus unidos operativamente a una o más secuencias reguladoras heterólogas que han sido recombinadas en el genoma del hospedador.

Una molécula de ácido nucleico "recombinante" o "modificada" es una molécula de ácido nucleico que ha sido alterada mediante manipulación humana. Como ejemplos no limitantes, una molécula de ácido nucleico recombinante incluye cualquier molécula de ácido nucleico que: 1) ha sido parcial o totalmente sintetizada o modificadain vitro,por ejemplo, mediante técnicas químicas o enzimáticas (por ejemplo, mediante el uso de síntesis química de ácidos nucleicos, o mediante el uso de enzimas para la replicación, polimerización, digestión (exonucleolítica o endonucleolítica), ligación, transcripción inversa, transcripción, modificación de bases (incluida, por ejemplo, la metilación), integración o recombinación (incluida la recombinación homóloga y específica de sitio) de moléculas de ácido nucleico); 2) incluye secuencias de nucleótidos unidas que no están unidas en la naturaleza, 3) ha sido modificada mediante técnicas de clonación molecular de forma que carece de uno o más nucleótidos con respecto a la secuencia de la molécula de ácido nucleico natural, y/o 4) ha sido manipulada mediante técnicas de clonación molecular de forma que presenta uno o más cambios o reordenamientos de secuencia con respecto a la secuencia de ácido nucleico natural. Como ejemplos no limitantes, un ADNc es una molécula de ADN recombinante, al igual que cualquier molécula de ácido nucleico que haya sido generada por una o más reacciones de polimerasain vitro,o a la que se hayan unido conectores, o que haya sido integrada en un vector, tal como un vector de clonación o un vector de expresión.

La expresión "proteína recombinante", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una proteína producida por modificación genética.

Cuando se aplica a organismos o virus, el término recombinante, modificado o modificado genéticamente se refiere a organismos o virus que han sido manipulados mediante la introducción de una secuencia de ácido nucleico recombinante heteróloga o exógena (por ejemplo, no nativa) en el organismo o virus, e incluye, sin limitación, la inactivación de genes, mutaciones dirigidas y sustitución de genes, sustitución, deleción o inserción de promotores, o transferencia de una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un transgén, gen sintético, promotor u otra secuencia en el organismo o virus. Los organismos o virus recombinantes o modificados genéticamente también pueden ser organismos o virus en los que se han introducido construcciones para la "atenuación" de genes. Tales construcciones incluyen, entre otras, uno o más ARN guía, ARNi, microARN, ARNhc, ARNip, antisentido y construcciones ribozima. También se incluyen los organismos o virus cuyos genomas han sido alterados por la actividad de nucleasas Cas, meganucleasas o nucleasas de dedos de zinc. Una molécula de ácido nucleico exógeno o recombinante puede integrarse en el genoma del organismo o virus recombinante/genéticamente modificado o, en otros casos, no integrarse en el genoma del organismo o virus recombinante/genéticamente modificado. Tal como se utiliza en el presente documento, "virus recombinante" o "célula hospedadora recombinante" incluye la progenie o los derivados del virus recombinante de la divulgación. Dado que pueden producirse algunas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutaciones o a influencias medioambientales, es posible que dicha progenie o derivados no sean idénticos a la célula madre, pero aun así se incluyen en el alcance del término tal y como se utiliza en el presente documento.

La expresión "etapa de modificación", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la ejecución de cualquier procedimiento de modificación divulgado en el presente documento o conocido en la técnica. Por ejemplo, una "etapa de modificación" puede ser una única ronda de un procedimiento de modificación de interés, tal como, por ejemplo, una única ronda del procedimiento de modificaciónin vitrodivulgado en el presente documento, una única mutagénesis mediada por PCR o una única reacción de ligación que una dos fragmentos de ADN. Asimismo, "etapas iterativas de modificación" se refiere a la ejecución de un procedimiento de modificación dos o más veces consecutivas.

El término "heterólogo", cuando se utiliza en referencia a un polinucleótido, un gen, un ácido nucleico, un polipéptido o una enzima, se refiere a un polinucleótido, un gen, un ácido nucleico, un polipéptido o una enzima que no se deriva de la especie hospedadora. Por ejemplo, un "gen heterólogo" o una "secuencia de ácido nucleico heterólogo", tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a un gen o secuencia de ácido nucleico procedente de una especie diferente a la especie del organismo hospedador o virus en el que se introduce. Cuando se hace referencia a una secuencia reguladora de un gen o a una secuencia auxiliar de ácido nucleico utilizada para manipular la expresión de una secuencia génica (por ejemplo, una región no traducida 5', una región no traducida 3', una secuencia de adición de poli A, una secuencia de intrón, un sitio de corte y empalme, un sitio de unión a ribosomas, una secuencia de entrada interna a ribosomas, una región de homología del genoma, un sitio de recombinación, etc.) o a una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de proteína o una secuencia de localización de proteínas, "heteróloga" significa que la secuencia reguladora o auxiliar o la secuencia que codifica un dominio de proteína o una secuencia de localización procede de una fuente diferente a la del gen con el que la secuencia de ácido nucleico reguladora o auxiliar o la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de proteína o una secuencia de localización está yuxtapuesta en un genoma, cromosoma o episoma. Así pues, un promotor unido operativamente a un gen al que no está unido operativamente en su estado natural (por ejemplo, en el genoma de un organismo o virus no modificado genéticamente) se denomina en el presente documento "promotor heterólogo", aunque el promotor pueda proceder de la misma especie (o, en algunos casos, del mismo organismo o virus) que el gen al que está unido. Del mismo modo, cuando se hace referencia a una secuencia de localización de una proteína o a un dominio de proteína de una proteína modificada, "heterólogo" significa que la secuencia de localización o el dominio de proteína se derivan de una proteína diferente de aquella a la que se incorporan por modificación genética.

"Secuencia reguladora", "elemento regulador" o "secuencia de elemento regulador" se refiere a una secuencia de nucleótidos situada cadena arriba (5'), dentro o cadena abajo (3') de una secuencia codificante. La transcripción de la secuencia codificante y/o la traducción de una molécula de ARN producida por la transcripción de la secuencia codificante suelen verse afectadas por la presencia o ausencia de la secuencia reguladora. Estas secuencias de elementos reguladores pueden comprender promotores, elementos cis, potenciadores, terminadores o intrones. Los elementos reguladores pueden aislarse o identificarse a partir de regiones no traducidas ("UnTranslated Regions", UTR) de una secuencia polinucleotídica concreta. Cualquiera de los elementos reguladores descritos en el presente documento puede estar presente en un elemento regulador de la expresión quimérico o híbrido. Cualquiera de los elementos reguladores descritos en el presente documento puede estar presente en una construcción recombinante de la presente divulgación.

El término y las expresiones "promotor", "región promotora" o "secuencia promotora" se refieren a una secuencia de ácido nucleico capaz de unirse a la ARN polimerasa para iniciar la transcripción de un gen en dirección 5' a 3' ("cadena abajo"). Un gen está "bajo el control de" un promotor o "regulado por" el mismo cuando la unión de la ARN polimerasa al promotor es la causa inmediata de la transcripción de dicho gen. El promotor o la región promotora suele proporcionar un sitio de reconocimiento para la ARN polimerasa y otros factores necesarios para el correcto inicio de la transcripción. Un promotor puede aislarse de la región 5' no traducida (5' UTR) de una copia genómica de un gen. Como alternativa, un promotor puede producirse sintéticamente o diseñarse alterando elementos de ADN conocidos. También se consideran los promotores quiméricos que combinan secuencias de un promotor con secuencias de otro promotor. Los promotores pueden definirse por su patrón de expresión basado, por ejemplo, en condiciones metabólicas, ambientales o de desarrollo. Un promotor puede utilizarse como elemento regulador para modular la expresión de una molécula polinucleotídica transcribible unida operativamente, por ejemplo, una secuencia codificante. Los promotores pueden contener, además de secuencias reconocidas por la ARN polimerasa y, preferentemente, otros factores de transcripción, elementos de secuencia reguladores, tales como elementos cis o dominios potenciadores que afectan a la transcripción de genes unidos operativamente. Un "promotor vírico" es un promotor nativo o no nativo que inicia la transcripción de uno o más genes localizados dentro de un genoma vírico.

El término promotor "constitutivo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un promotor que es activo en la mayoría de las condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor constitutivo está activo independientemente del entorno externo, tal como la luz y la composición del medio de cultivo. En algunos ejemplos, un promotor constitutivo es activo en presencia y en ausencia de un nutriente. Por ejemplo, un promotor constitutivo puede ser un promotor activo (que media en la transcripción de un gen al que está unido operativamente) en condiciones de agotamiento de nitrógeno, así como en condiciones en las que el nitrógeno no es limitante (condiciones de reposición de nitrógeno). Por el contrario, un promotor "inducible" es un promotor que se activa en respuesta a condiciones ambientales concretas, tales como la presencia o ausencia de un nutriente o regulador, la presencia de luz, etc.

La expresión "unido operativamente", tal como se utiliza en el presente documento, indica una configuración en la que una secuencia de control se sitúa en una posición adecuada con respecto a la secuencia codificante de una secuencia polinucleotídica, de tal manera que la secuencia de control dirige o regula la expresión de la secuencia codificante de un polipéptido y/o ARN funcional. Así, un promotor está en unión operativa con una secuencia de ácido nucleico si puede mediar en la transcripción de la secuencia de ácido nucleico. Cuando se introduce en una célula hospedadora, un casete de expresión puede dar lugar a la transcripción y/o traducción de un ARN o polipéptido codificado en condiciones adecuadas. Las construcciones antisentido o sentido que no son o no pueden ser traducidas no están excluidas de esta definición. Tanto en el caso de la expresión de transgenes como en el de la supresión de genes endógenos (por ejemplo, mediante antisentido o ARNi), un experto reconocerá que la secuencia polinucleotídica insertada no tiene por qué ser idéntica, sino que puede ser sólo sustancialmente idéntica, a la secuencia del gen del que procede. Como se explica en el presente documento, estas variantes sustancialmente idénticas están específicamente cubiertas por referencia a una secuencia específica de ácido nucleico.

La expresión "marcador seleccionable" o "gen marcador seleccionable", tal como se utiliza en el presente documento, incluye cualquier gen que confiere un fenotipo a una célula en la que se expresa para facilitar la selección de las células que se transfectan o transforman con una construcción de ácido nucleico de la divulgación. La expresión también puede utilizarse para referirse a los productos génicos que ponen de manifiesto dichos fenotipos. Algunos ejemplos no limitantes de marcadores seleccionables incluyen los siguientes: 1) genes que confieren resistencia a antibióticos, tales como amikacina(aphA6),ampicilina(ampR),blasticidina(bls, bsr, bsd),bleomicina o fleomicina (ZEOCIN™)(ble),cloranfenicol(cat),emetina (RBS14p ocry1-1),eritromicina(ermE),G418 (GENETICIN™)(neo),gentamicina(aac3oaacC4),higromicina B(aphlV, hph, hpt),kanamicina(nptlI),metotrexato(DHFR mtxR),penicilina y otros p-lactámicos (p-lactamasas), estreptomicina o espectinomicina(aadA, spec/strep)y tetraciclina(tetA, tetM, tetQ);2) genes que confieren tolerancia a herbicidas, tales como aminotriazol, amitrol, andrimid, ariloxifenoxipropionatos, atrazinas, bipiridilos, bromoxinil, ciclohexandiona oximas dalapon, dicamba, diclfop, diclorofenil dimetil urea (DCMU), difunona, dicetonitrilos, diurón, fluridona, glufosinato, glifosato, hidrobenzonitrilos halogenados, haloxifop, 4-hidroxipiridinas, imidazolinonas, isoxasflutol, isoxazoles, isoxazolidinonas, miroamida B, pnitrodifeniléteres, norflurazón, oxadiazoles, m-fenoxibenzamidas, N-fenil imidas, pinoxadina, inhibidores de la protoporfirionógeno oxidasa, piridazinonas, pirazolinatos, sulfonilureas, 1,2,4-triazolpirimidina, tricetonas o urea; acetil CoA carboxilasa (ACCasa); acetohidroxiácido sintasa (ahas); acetolactato sintasa(als, csr1-1, csr1-2, im rl, imr2),aminoglucósido fosfotransferasa (apt), antranilato sintasa, bromoxinil nitrilasa(bxn),citocromo P450-NADH-citocromo P450 oxidorreductasa, dalapón deshalogenasa(dehal),dihidropteroato sintasa(sul),5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa de clase I (EPSPS), EPSPS de clase II(aroA),EPSPS que no pertenece a la clase I/II, glutatión reductasa, glifosato acetiltransferasa(gat),glifosato oxidorreductasa (gox), hidroxifenilpiruvato deshidrogenasa, hidroxifenilpiruvato dioxigenasa(hppd),isoprenil pirofosfato isomerasa, licopeno ciclasa, fosfinotricina acetil transferasa(pat, bar),fitoeno desaturasa(crtI),prenil transferasa, protoporfirina oxidasa, el polipéptido psbA del fotosistema II(psbA)y la superóxido dismutasa(sod)SMM esterasa(SulE);3) genes que pueden utilizarse en cepas auxotróficas o para conferir otros efectos metabólicos, tales comoarg7, his3, hisD, hisG, lysA, manA, metE, nit1, trpB, ura3, xylA,un gen de la dihidrofolato reductasa, un gen de la manosa-6-fosfato isomerasa, un gen de la nitrato reductasa o un gen de la ornitina descarboxilasa; un factor de selección negativa, tal como la timidina quinasa; o factores de resistencia a toxinas, tales como un gen de resistencia a la 2-desoxiglucosa.

Un "gen indicador" es un gen que codifica una proteína detectable o que tiene una actividad que produce un producto detectable. Un gen indicador puede codificar un marcador visual o una enzima que produzca una señal detectable, tal comocat, lacZ, uidA, xylE,un gen de fosfatasa alcalina, un gen de a-amilasa, un gen de a-galactosidasa, un gen de p-glucuronidasa, un gen de p-lactamasa, un gen de peroxidasa de rábano picante, un gen de luciferina/luciferasa, un gen de locus R, un gen de tirosinasa, o un gen que codifica una proteína fluorescente, incluidas, entre otras, una proteína fluorescente azul, cian, verde, roja, de pimentón ("paprika") o amarilla, una proteína fluorescente fotoconvertible, fotoconmutable o resaltadora óptica, o cualquiera de sus variantes, incluidas, entre otra, variantes con optimización de codones, de plegamiento rápido, monoméricas, de estabilidad aumentada y de fluorescencia mejorada.

La expresión "nucleasa guiada por ARN" o "endonucleasa guiada por ARN", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una enzima de corte y empalme de ácido nucleico que es guiada al sitio diana de corte y empalme por uno o más ARN guía. Algunos ejemplos no limitantes de nucleasas guiadas por ARN incluyen Cas9, Cpfl, C2c1, C2c2 y C2c3.

El término "terminador" o las expresiones "secuencia terminadora" o "terminador de la transcripción", tal como se usan en el presente documento, se refieren a una sección reguladora de una secuencia genética que causa que la ARN polimerasa cese la transcripción.

La expresión "introducción en una célula hospedadora" y el término "transformación", tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a la introducción de una o más secuencias exógenas de ácido nucleico o polinucleótidos en una célula u organismo hospedador utilizando uno o más procedimientos físicos, químicos o biológicos. Los procedimientos físicos y químicos de transformación (es decir, "transfección") incluyen, a modo de ejemplo no limitante, la electroporación, el bombardeo de partículas, la competencia inducida químicamente y la administración de liposomas. Los procedimientos biológicos de transformación (es decir, "transducción") incluyen la transferencia de ADN mediante virus o microbios (por ejemplo,Agrobacterium).

Tal como se usa en el presente documento, "diseñar" un genoma se refiere a determinar la secuencia de ácido nucleico deseada del genoma final de interés. El diseño puede basarse en conocimientos básicos, fuentes bibliográficas, datos experimentales o cualquier combinación de éstos.

Tal como se utiliza en el presente documento, "recombinante" o "modificado", cuando se refiere a una molécula de ácido nucleico, proteína, partícula vírica o combinación de las mismas, significa una molécula de ácido nucleico, proteína, partícula vírica o combinación de las mismas que no es natural y que se genera mediante manipulación humana. Como ejemplos no limitantes, una molécula de ácido nucleico recombinante o modificada incluye cualquier molécula de ácido nucleico que: 1) ha sido parcial o totalmente sintetizada o modificadain vitro,por ejemplo, mediante técnicas químicas o enzimáticas (por ejemplo, mediante el uso de síntesis química de ácidos nucleicos, o mediante el uso de enzimas para la replicación, polimerización, digestión (exonucleolítica o endonucleolítica), ligación, transcripción inversa, transcripción, modificación de bases (incluida, por ejemplo, la metilación), integración o recombinación (incluida la recombinación homóloga y específica de sitio) de moléculas de ácido nucleico); 2) incluye secuencias de nucleótidos unidas que no están unidas en la naturaleza, 3) ha sido modificada mediante técnicas de clonación molecular de forma que carece de uno o más nucleótidos con respecto a la secuencia de molécula de ácido nucleico natural, y/o 4) ha sido manipulada mediante técnicas de clonación molecular de forma que presenta uno o más cambios o reordenamientos de secuencia con respecto a la secuencia de ácido nucleico natural. Como ejemplos no limitantes, un ADNc es una molécula de ADN recombinante, al igual que cualquier molécula de ácido nucleico que haya sido generada por una o más reacciones de polimerasain vitro,o a la que se hayan unido conectores, o que haya sido integrada en un vector, tal como un vector de clonación o un vector de expresión. Un ARN o proteína recombinante o modificada es aquel que se transcribe o traduce, respectivamente, a partir de una molécula de ácido nucleico recombinante o modificada. Una partícula vírica o virus recombinante o modificado es aquel que se genera a partir de una secuencia vírica o genoma vírico modificado.

La expresión "genoma vírico" se refiere al complemento genético completo contenido en una o más moléculas de ADN o ARN en una partícula vírica, que incluye genes y secuencias no codificantes. La expresión "genoma vírico modificado" se refiere a un genoma vírico no natural que es el resultado de la manipulación humana y que es capaz de producir partículas víricas no naturales tras su introducción en una célula hospedadora compatible.

La expresión "ácido nucleico vírico" se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia derivada de un genoma vírico. El "ácido nucleico vírico" puede comprender un genoma vírico completo o una parte de un genoma vírico. Los ácidos nucleicos víricos pueden codificar secuencias de aminoácidos que comprenden proteínas víricas. En algunos casos, las secuencias completas y maduras de proteínas o polipéptidos codificadas por un marco abierto de lectura vírico determinado pueden no estar definidas ni caracterizadas. Las secuencias de aminoácidos proporcionadas en el presente documento que están codificadas por secuencias de ácidos nucleicos víricos que pueden incluir un sitio adecuado para la mutación (tal como alteración, deleción o sustitución) o inserción de secuencias heterólogas pueden divulgarse en el presente documento como secuencias de aminoácidos codificantes que pueden comprender la totalidad o una parte de un polipéptido o proteína vírica.

La expresión "partícula vírica" y el término "virión" se refieren a la forma independiente en la que existe un virus cuando no está dentro de una célula infectada ni en proceso de infectar una célula. Estas partículas víricas (viriones) están formadas por un genoma de ADN o ARN rodeado por una cubierta proteica denominada cápside. Algunos viriones también tienen una envoltura lipídica adicional dentro o fuera de la cubierta proteica de la cápside. La expresión "partícula vírica" y los términos "virión" y "virus" pueden utilizarse indistintamente.

La expresión "propiedad vírica", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier aspecto de la replicación o del ciclo de vida del virus o a un aspecto resultante de la replicación o del ciclo de vida del virus. Tal como se utiliza en el presente documento, una "propiedad vírica" se refiere a menudo a propiedades que pueden alterarse o modificarse mediante la intervención humana para lograr un resultado deseado. Entre los ejemplos no limitantes de propiedades víricas se incluyen la gama de hospedadores, el ciclo lítico vírico, la adsorción, la adhesión, la inyección, la replicación y el ensamblaje, la lisis, el tamaño de explosión, la evasión inmunitaria, la estimulación inmunitaria, la desactivación inmunitaria, la dispersión de biopelículas, la resistencia bacteriana a fagos, la sensibilización bacteriana a antibióticos, la modulación de factores de virulencia y la digestión o edición selectiva del genoma del hospedador. En algunos aspectos, se utilizan indistintamente propiedad mejorada o propiedades mejoradas, y propiedad vírica mejorada o propiedades víricas mejoradas .

Los términos "bacteriófago" y "fago" pueden utilizarse indistintamente y se refieren a un virus que infecta bacterias.

Sistemas CRISPR

Los CRISPR ("clustered regularly interspaced short palindromic repeats", grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares) son loci de ADN que contienen repeticiones cortas de secuencias de bases. Cada repetición va seguida de segmentos cortos de "ADN espaciador" procedentes de exposiciones anteriores a elementos genéticos móviles. Los CRISPR se encuentran en aproximadamente el 40 % de los genomas secuenciados de bacterias y en el 90 % de los de arqueas. Los CRISPR se asocian a menudo con genes asociados a CRISPR(cas)que codifican proteínas relacionadas con la función CRISPR. El sistema CRISPR-Cas es un sistema inmunitario procariota que confiere resistencia a elementos genéticos extraños, tales como plásmidos y fagos, y proporciona una forma de inmunidad adquirida. Los espaciadores de CRISPR codifican pequeños ARNcr que guían específicamente las endonucleasas Cas hasta las secuencias diana y cortan estos elementos genéticos exógenos de forma análoga al ARNi en los organismos eucariotas.

Los sistemas CRISPR-Cas de tipo II se han utilizado para la edición y regulación de genes en muchas especies. Estos sistemas son especialmente útiles porque sólo requieren una única endonucleasa Cas (Cas9) y un ARNcr selectivo. En los sistemas naturales, la endonucleasa Cas9 requiere dos ARN transcritos independientemente para su actividad; sin embargo, estos dos ARN también pueden unirse covalentemente para formar un único ARNg quimérico. Al introducir la proteína Cas9 y los ARNg adecuados en una célula, se puede cortar el genoma del organismo en cualquier lugar deseado. Los sistemas CRISPR-Cas constituyen un sistema de defensa guiado por ARN que protege contra virus, plásmidos y otros elementos genéticos móviles. Esta vía defensiva consta de tres etapas. En primer lugar, se integra una copia del ácido nucleico invasor en la matriz de CRISPR. A continuación, la matriz de CRISPr se transcribe en un transcrito de CRISPR grande y posteriormente se procesa en ARNcr maduros. A continuación, los ARNcr se incorporan a complejos efectores, en los que el ARNcr guía al complejo hasta el ácido nucleico invasor y las proteínas Cas degradan este ácido nucleico. Como se ha indicado anteriormente, los sistemas CRISPR-Cas nativos de tipo II requieren tanto un ARNcr transactivador (ARNtracr) como un pre-ARNcr para permitir la activación de Cas9. El ARNtracr es complementario y se aparea con un pre-ARNcr para formar un dúplex de ARN. Éste es cortado por la ARNasa III, una ribonucleasa específica del ARN, para formar un híbrido de ARNcr/ARNtracr. Este híbrido actúa como guía para la endonucleasa Cas9, que corta el ácido nucleico invasor generando una rotura bicatenaria en el ADN invasor para proteger a la célula hospedadora. El corte mediado por Cas9 depende estrictamente de la presencia de un motivo adyacente al protoespaciador ("protospacer adjacent motif', PAM) en el ácido nucleico diana. La capacidad de programar Cas9 para que realice el corte en sitios específicos definidos por los ARN guía ha llevado a su adopción como plataforma versátil para la modificación genómica y la regulación génica. Este procedimiento de modificación genómica se ha descrito en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. n.os 2014/0068797, publicada el 6 de marzo de 2014, 2014/0170753, publicada el 19 de junio de 2014, y 2014/0273037 y 2014/0273226, ambas publicadas el 18 de septiembre de 2014.

Se han descrito otros sistemas CRISPR-Cas programables que pueden utilizarse para la modificación genómica, incluidos los sistemas Cpfl, C2c1, C2c2 y C2c3. El sistema Cpf1 es un sistema CRISPr de tipo V y media en el corte del ADN de extremo pegajoso a través de un único ARN guía (Zetscheet al.,Cell (2015), 163, 1-13). C2c1 y C2c3 son ambos sistemas CRISPR de tipo V, mientras que se propone que C2c2 es un sistema CRISPR de tipo VI (Shmakovet al.,Molecular Cell (2015), 60, 1-13).

Ensamblaje del ADN

Existen diversos procedimientos conocidos en la técnica para el ensamblaje del ADN durante la modificación genética. Para ensamblar partes del genoma deM. genitaliumse utilizó un procedimiento basado en un termociclador de dos etapas, como se describe en Gibson, D. G.,et al.,"Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a Mycoplasma genitalium genome", Science (2008), 319:1215-1220 y la publicación PCT WO2009/103027. Otro enfoque es el descrito por Li, M. Z.,et al.,Nature Meth., (2007), 4:251-256. En la publicación PCT WO2006/021944 se describe un procedimiento de ensamblaje de una sola etapa que emplea la exonucleasa 5' de T7 y la proteína de unión al ADN monocatenario. Las técnicas combinatorias de ensamblaje de compuestos químicos para su uso en el cribado de alto rendimiento están ya muy consolidadas. Además, desde hace varios años se practican técnicas de barajado de genes, en las que las secuencias codificantes se fragmentan y reordenan aleatoriamente. Por ejemplo, los protocolos para crear bancos de fragmentos de genes quiméricos se describen en Meyer, M.,et al.,"Combinatorial Recombination of Gene Fragments to Construct a Library of Chimeras", Current Protocols in Protein Science (2006), 26.2.1-26.2.17; McKee, A. E.,et al.,resumen de JBE i. Se han establecido técnicas para ensamblar diversos componentes en genomas completos o mínimos. Por ejemplo, la publicación de patente estadounidense 2000/0264688, publicada el 15 de noviembre de 2007, describe procedimientos para construir un genoma sintético generando y ensamblando casetes que comprenden partes del genoma. Un procedimiento jerárquico por etapas para ensamblar ácidos nucleicos se describe en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2007/004041, publicada el 4 de enero de 2007.

Además, se describe un procedimiento de un recipiente para el ensamblaje de ADN en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. n.os 2010/0035768 y 2012/0053087, publicadas el 11 de febrero de 2010 y el 1 de marzo de 2012, respectivamente. Este procedimiento se ha denominado procedimiento de ensamblaje de Gibson y permite ensamblar con éxito múltiples fragmentos de ADN, independientemente de la longitud del fragmento o de la compatibilidad de los extremos. La reacción de ensamblaje de Gibson se lleva a cabo en un tubo único en condiciones isotérmicas utilizando tres actividades enzimáticas: una exonucleasa 5' que genera proyecciones largas, una polimerasa que rellena los huecos de las regiones monocatenarias hibridadas y una ADN ligasa que sella las mellas de los huecos hibridados y rellenados. Este procedimiento ha sido ampliamente adoptado y es uno de los principales procedimientos útiles en los proyectos de biología sintética en todo el mundo. Aplicando esta metodología, se ensambló el genoma mitocondrial de ratón de 16,3 kb a partir de 600 60-meros solapados. En combinación con el ensamblajein vivoen levadura, se utilizó el ensamblaje de Gibson para sintetizar el genoma de 1,1 Mpb deMycoplasma mycoides.El genoma sintetizado se trasplantó a una célula receptora deM. capricolum,creando nuevas células autorreplicantes deM. mycoides.La actividad exonucleasa 5' mastica las secuencias del extremo 5' y expone la secuencia complementaria para la hibridación. A continuación, la actividad polimerasa rellena los huecos de las regiones hibridadas. A continuación, una ADN ligasa sella la mella y une covalentemente los fragmentos de ADN. La secuencia solapante de fragmentos contiguos es mucho más larga que las utilizadas en el ensamblaje de Golden Gate, por lo que se obtiene un mayor porcentaje de ensamblajes correctos.

Virus

Un virus es un agente infeccioso ultramicroscópico y metabólicamente inerte que se replica únicamente dentro de las células de hospedadores vivos. Los virus pueden infectar todo tipo de formas de vida, incluidos animales, plantas, hongos, algas, bacterias y arqueas. Cuando no están dentro de una célula infectada o en proceso de infectar una célula, los virus existen en forma de partículas independientes. Estas partículas víricas (viriones) están formadas por un genoma de ADN o ARN rodeado por una cubierta proteica denominada cápside. Algunos viriones también tienen una envoltura lipídica adicional dentro o fuera de la cubierta proteica de la cápside.

Existen dos ciclos de replicación vírica, aunque la terminología varía entre los campos víricos de procariotas y de eucariotas. Los virus latentes o lisogénicos integran el material genético vírico en el genoma de la célula hospedadora o forman un replicón episómico. Cuando la célula hospedadora se replica, el material genético vírico también se copia y continúa segregándose con el genoma del hospedador hasta el inicio de la producción vírica. El inicio de la producción vírica y la muerte celular son marcadores del ciclo lítico o virulento. Durante el ciclo lítico, el genoma vírico se replica por separado del genoma del hospedador y secuestra la maquinaria de replicación y traducción de la célula para generar más virus. Una vez que se han acumulado suficientes virus, las proteínas víricas especializadas disuelven la pared y/o la membrana de la célula hospedadora. La célula hospedadora estalla debido a la alta presión osmótica interna, un proceso denominado lisis. Esto libera los virus de progenie al medio ambiente, donde pueden infectar otras células y repetir el proceso. Los virus virulentos son aquellos que no entran en estado latente o lisogénico, sino que se replican únicamente secuestrando la maquinaria de la célula hospedadora (a diferencia de los virus moderados, que sí entran en estado latente).

Estudios de mutaciones víricas

Los estudios de mutaciones víricas, tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a la evolución rápida, la adaptación y/o los estudios de mutagénesis aleatoria o dirigida, y los términos pueden utilizarse indistintamente. Los estudios de evolución y/o adaptación implican la selección de virus para rasgos específicos o en condiciones específicas. Estos procedimientos son especialmente útiles en el caso de los virus, debido a la elevada tasa de mutación natural inherente a la replicación vírica, que da lugar a una gran diversidad vírica. Por ejemplo, las cepas podrían evolucionar en condiciones de alta temperatura para observar los cambios moleculares que facilitan la supervivencia y la reproducción en esas condiciones. Como ejemplos no limitantes, se puede utilizar la evolución o adaptación de experimentos con virus o bacteriófagos para seleccionar variantes con cambios en la gama de hospedadores, el ciclo lítico vírico, la adsorción, la adhesión, la inyección, la replicación y el ensamblaje, la lisis, el tamaño de explosión, la evasión inmunitaria, la estimulación inmunitaria, la desactivación inmunitaria, la dispersión de biopelículas, la resistencia bacteriana a fagos, la sensibilización bacteriana a antibióticos, la modulación de factores de virulencia o la digestión o edición selectiva del genoma del hospedador. Algunos ejemplos no limitantes de experimentos de evolución o adaptación vírica incluyen experimentos de coinfección, coevolución o cotransformación. La coinfección se refiere a más de un virus que infecta al mismo hospedador al mismo tiempo, lo que a menudo da lugar al intercambio de genes entre dichos dos o más virus. La coevolución se refiere al estudio en el que se produce la recombinación entre dos o más virus o bacteriófagos dentro de un hospedador permisivo o no permisivo que da lugar al ensamblaje de un nuevo virus o bacteriófago con propiedades víricas diferentes, tales como, por ejemplo, una gama más amplia de hospedadores. Se habla de cotransformación cuando dos genomas desnudos se transforman juntos en una cepa permisiva o no permisiva. Cualquiera de estos estudios de evolución o adaptación puede realizarse en un hospedador permisivo (susceptible) o no permisivo (resistente). Estos tipos de experimentos suelen implicar el pase del virus varias veces en el hospedador seleccionado en ausencia o presencia de otro u otros virus seleccionados. Los virus adquirirán mutaciones que darán lugar a múltiples variantes. A lo largo del pase, determinadas variantes se enriquecerán en función de las condiciones de pase y selección.

La mutagénesis puede ser por cualquier procedimiento, por ejemplo, mutagénesis por inserción, mutagénesis química, irradiación con radiación gamma o ultravioleta, o mutagénesis mediada por PCR. Los procedimientos para generar mutantes o variantes de secuencias genómicas son bien conocidos. Por ejemplo, la irradiación gamma, la irradiación UV y el tratamiento con cualquiera de un gran número de posibles mutágenos químicos (por ejemplo, 5-bromodesoxiuridina, metanosulfonato de etilo (EMS), metanosulfonato de metilo (MMS), sulfato de dietilo (DES), nitrosoguanidina (NTG), compuestos de ICR, etc.) o el tratamiento con compuestos tales como antibióticos de enediina que causan la rotura cromosómica (por ejemplo, bleomicina, adriamicina, neocarzinostatina) son procedimientos que se han empleado para la mutagénesis de algas, hongos y quítridos (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU.

8 232090; la solicitud de patente de EE. UU. 20120088831; la solicitud de patente de EE. UU. 20100285557; la solicitud de patente de EE. UU. 20120258498). En la técnica se conoce un gran número de mutágenos químicos, incluidos, entre otros, agentes intercalantes, agentes alquilantes, agentes desaminantes, análogos de bases. Los agentes intercalantes incluyen, como ejemplos no limitantes, los derivados de la acridina o los derivados de la fenantridina, tales como el bromuro de etidio (también conocido como bromuro de 2,7-diamino-10-etil-6-fenilfenantridio o bromuro de 3,8-diamino-5-etil-6-fenilfenantridinio). Algunos ejemplos no limitantes de agentes alquilantes incluyen derivados de nitrosoguanidina (por ejemplo, N-metil-N'-nitro-nitrosoguanidina), metanosulfonato de etilo (EMS), etanosulfonato de etilo, sulfato de dietilo (DES), metanosulfonato de metilo (MMS), ácido nitroso o HNO<2>, y las mostazas nitrogenadas o compuestos de ICR. Algunos ejemplos no limitantes de análogos de bases que pueden utilizarse como mutágenos incluyen el compuesto 5-bromo-uracilo (también conocido como desoxinucleósido 5bromodesoxiuridina), 5-bromo desoxiuridina y 2-aminopurina. Los procedimientos de mutagénesis basados en la PCR son bien conocidos en la técnica y a menudo comprenden condiciones de reacción y/o una ADN polimerasa que aumenta la tasa de error a lo largo de la amplificación por PCR.

La mutagénesis puede incluir además, o como alternativa, la introducción de moléculas de ácido nucleico exógeno directamente en el genoma vírico o en la célula hospedadora para su posterior recombinación en el genoma vírico de interés. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico exógeno introducida en la célula hospedadora puede integrarse en un locus genético vírico por integración aleatoria o dirigida, afectando a la expresión de los genes en los que se inserta el ADN extraño o de los genes proximales al ADN extraño insertado en el genoma (por ejemplo, patente de EE. UU. 7019 122; patente de EE. UU. 8216844). Normalmente, la molécula de ácido nucleico introducida incluye un gen marcador seleccionable para la selección de los transformantes que han integrado la construcción de molécula de ácido nucleico exógeno. La molécula de ácido nucleico exógeno, en algunas realizaciones, puede incluir un elemento transponible o un componente del mismo, tales como, por ejemplo, repeticiones invertidas que pueden ser reconocidas por una transposasa y/o un gen que codifica una transposasa, o la molécula de ácido nucleico exógeno puede basarse al menos en parte en un virus, tal como un virus integrador.

Para la mutagénesis por inserción aleatoria, una construcción incluye preferentemente un marcador seleccionable que puede usarse para seleccionar transformantes que tengan una construcción integrada, y opcionalmente también puede servir como marcador de segregación y marcador molecular para el aislamiento e identificación de un gen interrumpido por el gen marcador seleccionable integrado. Los marcadores selectivos no se limitan a los genes de resistencia a antibióticos, sino que también incluyen cualquier gen que pueda proporcionar una ventaja de crecimiento a un virus (tanto genes de función establecida como hipotética). Como alternativa, puede dirigirse a un locus genético específico. La construcción para la alteración génica puede incluir, por ejemplo, un gen marcador seleccionable flanqueado por secuencias del locus genético de interés, por ejemplo, al menos una parte del gen que codifica un regulador, y, opcionalmente, secuencias genómicas adicionales que rodean al gen. Dichas secuencias flanqueantes pueden comprender, por ejemplo, al menos 50 nucleótidos, al menos 100 nucleótidos, al menos 500 nucleótidos o al menos 1 kilobase de secuencia genómica.

La colección de variantes víricas puede generarse por cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente, otros procedimientos bien conocidos en la técnica, o cualquier combinación de los mismos. A continuación, la colección de variantes puede cribarse en busca del fenotipo deseado. Los virus aislados con el fenotipo o fenotipos deseados pueden someterse a rondas adicionales de estudios de mutación. Los virus aislados que muestren las propiedades o fenotipos deseados además, o como alternativa, pueden secuenciarse para identificar la mutación genética responsable de la propiedad o fenotipo deseado. Estas lesiones genéticas identificadas pueden confirmarse recapitulando la mutación en un trasfondo de referencia limpio y comprobando la propiedad o el fenotipo deseados.

Cargas activas víricas

Enzimas líticas

Una "enzima lítica" incluye cualquier enzima lítica de la pared celular bacteriana que destruya una o más bacterias en condiciones adecuadas y durante un periodo de tiempo pertinente. Algunos ejemplos de enzimas líticas incluyen, entre otras, diversas amidasas de la pared celular. Una enzima lítica puede ser una enzima lítica de bacteriófago, que se refiere a una enzima lítica extraída o aislada de un bacteriófago, o una enzima lítica sintetizada con una estructura proteica similar que mantiene una funcionalidad de enzima lítica.

Una enzima lítica es capaz de romper específicamente los enlaces presentes en el peptidoglucano de las células bacterianas para romper la pared celular bacteriana. En la actualidad también se postula que el peptidoglucano de la pared celular bacteriana está muy conservado entre la mayoría de las bacterias, y que la ruptura de sólo unos pocos enlaces puede alterar la pared celular bacteriana. Algunos ejemplos de enzimas líticas que rompen estos enlaces son las muramidasas, las glucosaminidasas, las endopeptidasas o las N-acetil-muramoil-L-alanina amidasas. Fischettiet al.(1974) notificaron que la enzima lisina del fago estreptocócico C1 era una amidasa. Garcíaet al.(1987, 1990) notificaron que la lisina Cpl de un S.pneumoniaeprocedente de un fago Cp-1 es una lisozima. Caldentey y Bamford (1992) notificaron que una enzima lítica del fago 06de Pseudomonases una endopeptidasa, que divide el puente peptídico formado por el ácido melo-diaminopimilico y la D-alanina. Las enzimas líticas T1 y T6 del fago deE. colison amidasas, al igual que la enzima lítica del fago deListeria(ply) (Loessneret al.,1996). También existen otras enzimas líticas conocidas en la técnica que son capaces de romper una pared celular bacteriana.

Una enzima lítica codificada genéticamente por un bacteriófago incluye un polipéptido capaz de destruir a una bacteria hospedadora, por ejemplo, porque tiene al menos alguna actividad degradante de la pared celular o inhibidora de la síntesis de la pared celular contra la bacteria hospedadora. El polipéptido puede tener una secuencia que incluya enzimas líticas nativas y variantes de las mismas. El polipéptido puede aislarse de diversas fuentes, tales como de un bacteriófago ("fago"), o prepararse por procedimientos recombinantes o sintéticos. El polipéptido puede comprender, por ejemplo, una parte de unión a colina en el lado carboxilo terminal y puede caracterizarse por una actividad enzimática capaz de romper el peptidoglucano de la pared celular (tal como una actividad amidasa para actuar sobre los enlaces amida en el peptidoglucano) en el lado amino terminal. Se han descrito enzimas líticas que incluyen múltiples actividades enzimáticas, por ejemplo, dos dominios enzimáticos, tal como la lisina PlyGBS. Además, se han descrito otras enzimas líticas que sólo contienen un dominio catalítico y ningún dominio de unión a la pared celular.

Polipéptidos de interrupción de la percepción de quorum

Los autoinductores son pequeñas moléculas químicas de señalización producidas y utilizadas por las bacterias que participan en la percepción dequorum.La percepción dequorumpermite a las bacterias percibirse unas a otras mediante la presencia de autoinductores y regular una amplia variedad de comportamientos a nivel de grupo. Estos comportamientos incluyen la simbiosis, la virulencia, la motilidad, la producción de antibióticos y la formación de biopelículas. Los autoinductores se presentan en distintas formas químicas según la especie, pero el efecto que tienen es similar en muchos casos, lo que permite a los bacteriófagos modificados genéticamente afectar a una amplia diversidad de bacterias utilizando autoinductores similares. En general, las bacterias gramnegativas utilizan AHL como autoinductores, y las grampositivas utilizan oligopéptidos procesados para comunicarse, mientras que el autoinductor 2 (AI-2) es universal para las bacterias gramnegativas y grampositivas.

Las AHL producidas por diferentes especies de bacterias gramnegativas varían en la longitud y composición de la cadena lateral de acilo, que a menudo contiene de 4 a 20 átomos de carbono. Las AHL son capaces de difundirse dentro y fuera de las células tanto por mecanismos de transporte pasivo como de transporte activo. Los receptores para detectar AHL incluyen una serie de reguladores transcripcionales, tales como LuxR, que actúan como factores de transcripción de unión al ADN que pueden activar la expresión de diversos genes que regulan los comportamientos de la población bacteriana.

Los autoinductores pueden ser inhibidos por polipéptidos de interrupción de la percepción dequorum.Los polipéptidos de interrupción de la percepción dequorumpueden modificar o degradar los autoinductores para hacerlos menos activos o inactivos. Determinados polipéptidos de interrupción de la percepción dequorumson enzimas que inactivan un autoinductor (por ejemplo, por modificación o degradación), tal como la proteína AiiA lactonasa descrita en el presente documento que escinde los anillos de lactona de las moléculas de acilo de las AHL con una especificidad de sustrato de amplio espectro para inactivar las AHL de diversas bacterias (Wanget al.(2004), J. Biol. Chem., 279(14):136.45-51).

El procedimiento de modificaciónin vitrodescrito en el presente documento puede emplearse para generar bacteriófagos sintéticos modificados para que codifiquen, por ejemplo, un polipéptido de interrupción de la percepción dequorumderivado dePseudomonas aeruginosa.Los polipéptidos de interrupción de la percepción dequorumpueden expresarse en forma de proteínas libres que se liberan hacia la zona que rodea a un fago y/o bacteria, por ejemplo, tras la infección por el fago y la lisis de la bacteria hospedadora. También es posible que los polipéptidos de interrupción de la percepción dequorumpueden expresarse y secretarse activamente desde la célula hospedadora bacteriana utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Del mismo modo, los polipéptidos de interrupción de la percepción dequorumpueden fusionarse traduccionalmente a una proteína de bacteriófago, por ejemplo, una proteína de la cápside, de la cola o del cuello.

Fibras de la cola

La divulgación contempla, en algunas realizaciones, el ajuste de la gama de hospedadores de bacteriófagos mediante la modificación de bacteriófagos recombinantes. En algunas realizaciones, el ajuste de la gama de hospedadores de virus implica la modificación del virus para que tenga fibras de cola heterólogas, nativas, no nativas y cualquier combinación de las mismas. La especificidad por la célula hospedadora del bacteriófago puede verse influida por la fibra o fibras de la cola de la partícula vírica. Al alterar (por ejemplo, intercambiando y/o mutando) las fibras de la cola, o partes de fibras de la cola, de un bacteriófago hospedador, se puede alterar (por ejemplo, ampliar) la gama de hospedadores.

Las proteínas de la fibra de la cola suelen contener determinantes de antigenicidad y determinantes de la gama de hospedadores. Una fibra de la cola heteróloga puede estar codificada por un conjunto de fragmentos genómicos aislados o sintetizados a partir del genoma de un tipo de bacteriófago. El conjunto de fragmentos del gen de la fibra de la cola puede contener subconjuntos de fragmentos genómicos aislados de los genomas de varios bacteriófagos o generados a partir de estos genomas. Por ejemplo, las regiones conservadas de una fibra de la cola pueden estar codificadas por fragmentos genómicos aislados del genoma del chasis del bacteriófago, mientras que las regiones determinantes de la gama de hospedadores pueden estar codificadas por fragmentos genómicos aislados del genoma de un tipo diferente de bacteriófago.

Péptidos antimicrobianos

La divulgación contempla, como ejemplo no limitante, bacteriófagos diseñados para expresar un péptido antimicrobiano que opcionalmente es secretado por la célula hospedadora. Por ejemplo, los bacteriófagos modificados pueden expresar un agente antimicrobiano, tal como un péptido antimicrobiano ("antimicrobial peptide", AMP) o un polipéptido antimicrobiano, incluidos, entre otros, péptidos naturales para prevenir el desarrollo y/o propagación de la resistencia de la bacteria hospedadora al bacteriófago, y para permitir una eliminación más rápida y eficaz de las bacterias en infecciones bacterianas, tales como infecciones bacterianas que comprenden más de una especie bacteriana diferente.

Los bacteriófagos proporcionan un agente antimicrobiano atractivo para eliminar las infecciones bacterianas debido a su mecanismo de amplificación y de depredador-hospedador, por ejemplo, propagándose en las bacterias hospedadoras y destruyendo después a las bacterias a medida que se produce la lisis para liberar los bacteriófagos propagados, que posteriormente infectan y destruyen a las bacterias circundantes por el mismo mecanismo. El uso práctico de los bacteriófagos para eliminar las infecciones bacterianas se ve frenado por limitaciones significativas, tales como (i) una gama de hospedadores bacterianos muy estrecha, tanto intraespecíficos como interespecíficos, y (ii) un desarrollo muy rápido de resistencia contra el bacteriófago por parte de la población del hospedador bacteriano. Así, como parece habitual en muchas áreas de la ciencia, el resultado teórico es difícil de alcanzar en situaciones de la vida real. Por lo tanto, aunque los bacteriófagos parecen útiles como agentes antimicrobianos en la teoría, en la práctica tienen propiedades antimicrobianas limitadas, y su uso para eliminar las infecciones bacterianas es muy difícil de conseguir debido al rápido desarrollo de la resistencia del hospedador al bacteriófago. En consecuencia, los bacteriófagos han sido ineficaces en la eliminación a largo plazo de la bacteria hospedadora.

En consecuencia, la presente divulgación contempla bacteriófagos modificados con agentes antimicrobianos, en los que el bacteriófago se modifica para expresar un péptido antimicrobiano (AMP) que es secretado opcionalmente por la célula hospedadora. Al menos uno o cualquier combinación de diferentes bacteriófagos modificados con agentes antimicrobianos puede utilizarse de modo individual o en cualquier combinación para eliminar o destruir una infección bacteriana. En algunas realizaciones, un bacteriófago modificado con agentes antimicrobianos puede utilizarse con otros agentes, tales como otro bacteriófago modificado con agentes antimicrobianos, uno o más péptidos antimicrobianos purificados o un antibiótico de molécula pequeña. Los bacteriófagos modificados con péptidos antimicrobianos (o bacteriófagos modificados con AMP) pueden codificar cualquier agente antimicrobiano conocido por un experto en la materia.

En algunas realizaciones de aspectos de la divulgación, un bacteriófago modificado con un agente antimicrobiano puede expresar y secretar un agente antimicrobiano que es un ácido nucleico, por ejemplo, un agente antimicrobiano que actúa por "silenciamiento génico" de genes bacterianos ampliamente conocidos por las personas con conocimientos ordinarios en la materia. Un agente antimicrobiano basado en ácidos nucleicos incluye, por ejemplo y entre otros, moléculas inductoras de interferencia de ARN (ARNi), por ejemplo y entre otras, ARNip, ARNbc, ARNtp, ARNhc, miARN y versiones modificadas de los mismos, en los que el gen de la molécula de interferencia de ARN silencia la expresión de un gen expresado e importante para la viabilidad (es decir, la supervivencia) de la bacteria. Un agente antimicrobiano basado en ácido nucleico puede ser un ácido oligonucleico antisentido o un análogo de ácido nucleico, por ejemplo, entre otros, ADN, ARN, ácido nucleico peptídico (PNA), PNA pseudocomplementario (PNApc), o ácido nucleico bloqueado (LNA) y similares. Como alternativa, un agente antimicrobiano basado en ácido nucleico puede ser un ADN o ARN, y análogos de ácido nucleico, por ejemplo, PNA, PNApc y LNA. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario, y puede seleccionarse de un grupo que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de interés, oligonucleótidos, PNA, etc. Tales inhibidores de ácido nucleico incluyen, por ejemplo, entre otros, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que es un represor transcripcional, o una molécula antisentido, o una ribozima, o una secuencia de ácido nucleico inhibidora pequeña, tal como un ARNi, un ARNhc, un ARNip, un micro ARNi (miARN), un oligonucleótido antisentido, etc.

Además, o como alternativa, los péptidos antimicrobianos pueden ser enzimas antibacterianas. Algunos ejemplos de actividades antibacterianas pueden incluir, entre otras, una enzima lítica, una acilasa, una aminopeptidasa, una amilasa, una carbohidrasa, una carboxipeptidasa, una catalasa, una celulasa, una quitinasa, una cutinasa, una ciclodextrina glucosiltransferasa, una desoxirribonucleasa, una esterasa, una alfa-galactosidasa, una betagalactosidasa, una glucoamilasa, una alfa-glucosidasa, una beta-glucosidasa, una haloperoxidasa, una invertasa, una lacasa, una lipasa, una manosidasa, una oxidasa, una enzima pectinolítica, una peptidoglutaminasa, una peroxidasa, una fitasa, una polifenoloxidasa, una enzima proteolítica, una ribonucleasa, una transglutaminasa, una xilanasa, una ARNasa, una ADNasa, una lisoestafina o péptidos formadores de poros.

Los péptidos o polipéptidos antimicrobianos pueden alterar directamente la membrana bacteriana uniéndose a la membrana microbiana cargada negativamente y alterando la membrana mediante la formación de canales acuosos, haciendo que la bicapa lipídica se pliegue sobre sí misma o cubriendo la membrana para formar micelas. Además de sus efectos bactericidas directos, los péptidos y polipéptidos antimicrobianos también pueden activar la transducción de señales de TLR y respuestas inmunitarias adicionales, pueden actuar como quimioatrayentes de leucocitos, aumentar la opsonización bactericida por parte de los fagocitos invasores, captar nutrientes vitales que las bacterias necesitan para crecer e inhibir proteasas bacterianas, o cualquier combinación de los mismos.

Biotensioactivos

La formación de biopelículas bacterianas puede dar lugar a infecciones localizadas, así como a infecciones sistémicas difíciles de tratar y, en ocasiones, mortales, como la bacteriemia (presencia de bacterias en la sangre) y la sepsis bacteriana (fallo multiorgánico causado por la propagación de bacterias o sus productos a través del torrente sanguíneo). Las sustancias extracelulares que componen la matriz de la biopelícula pueden actuar como una barrera que protege y aísla a las bacterias residentes dentro de la biopelícula frente a los mecanismos normales de defensa inmunológica, tales como los anticuerpos y los fagocitos, así como de los agentes antimicrobianos, incluidas las enzimas antibacterianas y los antibióticos. La biopelícula también facilita el crecimiento y la proliferación de las bacterias residentes en su interior.

La presente divulgación proporciona procedimientos de generación y composiciones de virus de modificación que expresan un agente adicional utilizado para facilitar la retirada o el desprendimiento de la biopelícula depositada en una superficie. Por ejemplo, las composiciones pueden incluir un biotensioactivo. Algunos ejemplos de biotensioactivos incluyen, entre otros, glucolípidos, lipopéptidos, depsipéptidos, fosfolípidos, ácidos grasos sustituidos, lipopolisacáridos, surlactina, surfactina, visconsina y ramnolípidos.

Modificación vírica

Los procedimientos de modificación genética de partículas víricas son laboriosos y largos debido a la falta de procedimientos de modificaciónin vitroampliamente aplicables y dirigidos. Los procedimientosin vivoactuales pueden tardar semanas o meses en crear virus y vectores víricos modificados (Levin y Bull, Nat. Rev. Microbiol., febrero de 2004, 2(2): 166-173). Además, la manipulación de los genomas víricos en las células conlleva una toxicidad inherente. Antes de la presente divulgación, los esfuerzos para desarrollar procedimientos ampliamente aplicables para la modificación genética precisain vitrode virus han sido en gran parte infructuosos. En el presente documento se describe un proceso ampliamente aplicable para modificar rápidamente genomas víricos completamentein vitro.

Los sistemas y procedimientos de modificación genéticain vitrodivulgados en el presente documento tienen varias ventajas sobre los procedimientos existentes de modificación genética vírica: 1) permiten la manipulación sencilla de genes/productos tóxicos completamentein vitro;2) son rápidos, es decir, pueden realizarse en un día en comparación con las semanas o meses de los procedimientosin vivo; 3) permiten conservar la modificación genómica en la mayor parte del genoma vírico; 4) no requieren vías de recombinación en el hospedador; 5) son más directos y menos propensos a errores que los procedimientos anteriores; y 6) son aplicables a múltiples virus sin cambios en el protocolo.

La presente divulgación proporciona procedimientos para la digestión mediada por nucleasas guiadas por ARN y el ensamblajein vitropara la modificación específica de sitio de genomas víricos completos. La presente divulgación aumenta significativamente la precisión, la sencillez y la rapidez con la que se pueden modificar genéticamente genomas víricos. Además, esta técnica supera la dificultad bien establecida de manipular genomas víricos virulentos, a menudo tóxicos, dentro de las células hospedadoras. Este enfoque completamentein vitrotambién elimina el requisito de una cepa hospedadora genéticamente tratable para la modificación, un requisito que impide la manipulación de muchos virus importantes e interesantes de arqueas, procariotas y eucariotas. Este enfoque no amplifica los genomas víricos que se manipulan, por lo que permite conservar la mayoría de las modificaciones del genoma vírico, tales como la metilación. Está demostrado que las modificaciones del genoma pueden tener profundos efectos en la aptitud de los virus, por lo que la conservación de estas modificaciones del genoma ofrece una clara ventaja sobre otras técnicas de modificación. Además, esta técnica es distinta de otros procedimientos relativos a la modificación del genomain vivocon nucleasas guiadas por ARN, ya que no se centra en el uso de nucleasas guiadas por ARN, tales como Cas9, y ARNg para la edición del genoma eucariota, sino que se refiere a la superación de problemas conocidos de modificación vírica completamentein vitro.

En algunos aspectos, los procedimientos novedosos proporcionados en el presente documento pueden incluir la modificación del ácido nucleico vírico o genoma vírico, por ejemplo, utilizando una nucleasa guiada por ARN y ensamblaje como se describe en el presente documento, y la introducción del ácido nucleico vírico modificado o genoma vírico modificado directamente en un hospedador que producirá partículas víricas modificadas o virus modificados que comprenden el ácido nucleico vírico modificado o genoma vírico modificado. Por ejemplo, en algunos aspectos, los procedimientos incluyen la modificación de un ácido nucleico vírico o genoma vírico sin introducir el ácido nucleico vírico modificado o genoma vírico modificado en un hospedador de clonación con fines de amplificación del ácido nucleico vírico modificado o genoma vírico modificado, por ejemplo, mediante replicación en un vector. Por ejemplo, en algunos procedimientos, el ácido nucleico vírico modificado o el genoma vírico modificado no se introducen en levaduras,E. coliu otros hospedadores de clonación conocidos. tales como, entre otros, especies deBacillus o Vibrio,antes de introducir el ácido nucleico vírico modificado o el genoma vírico modificado en una célula hospedadora que producirá partículas víricas modificadas o virus modificados.

Los procedimientos novedosos proporcionados en el presente documento permiten la modificación dirigida de dos, tres, cuatro, cinco o más sitios en un genoma vírico. Los procedimientos pueden realizarse íntegramentein vitro,lo que permite la producción de genomas víricos alterados en múltiples sitios, un logro que no se consigue con los procedimientos de modificación convencionales. En el presente documento se proporcionan virus modificados que comprenden un ácido nucleico vírico modificado y/o genomas víricos modificados que tienen dos, tres, cuatro, cinco o más modificaciones con respecto al ácido nucleico vírico no modificado o al genoma vírico no modificado. Dichas dos o más modificaciones pueden ser una inserción, una deleción, una sustitución o cualquier combinación de las mismas. Dichas dos o más modificaciones pueden dar lugar a una, dos o más propiedades víricas mejoradas, tales como cualquiera de las descritas en el presente documento. Los virus modificados pueden generarse íntegramente mediante los procedimientos de modificaciónin vitrodescritos en el presente documento. Los procedimientos de modificaciónin vitrodescritos en el presente documento dan lugar a modificaciones selectivas en contraposición a la mutagénesis clásica o aleatoria. A diferencia de las modificaciones generadas por mutagénesis clásica o aleatoria, las modificaciones dirigidas pueden cribarse convenientemente utilizando procedimientos convencionales de laboratorio de genética molecular, tales como la PCR y/o la secuenciación, antes de cualquier ensayo fenotípico.

En el presente documento también se divulga un sistema para generar virus sintéticos con propiedades víricas mejoradas (por ejemplo, véase la figura 10). El sistema comprende la identificación de secuencias de ácido nucleico responsables de conferir una propiedad deseada y, a continuación, la incorporación de esos cambios de secuencia en un genoma vírico seleccionado con el fin de generar partículas víricas con propiedades víricas mejoradas. Las secuencias de ácido nucleico capaces de conferir una propiedad vírica deseada pueden identificarse mediante conocimientos científicos básicos, búsqueda bibliográfica, pruebas empíricas, estudios de mutación o cualquier combinación de los mismos. Los estudios de mutación pueden incluir estudios de evolución, estudios de adaptación, estudios de mutagénesis y/u otros enfoques experimentales bien conocidos en la técnica. Los estudios de mutagénesis pueden incluir mutagénesis con ultravioleta (UV), química y/o por inserción. La mutagénesis por inserción puede incluir la mutagénesis por inserción de transposones y/o marcadores seleccionables. Los experimentos de mutación utilizados para identificar las secuencias de ácidos nucleicos de interés pueden realizarse utilizando el virus o el genoma vírico del virus que será el punto de partida para la modificaciónin vitro.Además, o como alternativa, en lugar del virus o genoma vírico seleccionado, se puede utilizar un virus o genoma vírico relacionado o heterólogo en un estudio de mutación con el fin de identificar secuencias de ácidos nucleicos recombinantes para incorporar al virus o genoma vírico seleccionado originariamente con el fin de conferir propiedades adicionales al virus seleccionado.

Las propiedades deseadas pueden incluir una o más de las siguientes: gama de hospedadores, ciclo lítico vírico, adsorción, adhesión, inyección, replicación y ensamblaje, lisis, tamaño de explosión, evasión inmunitaria, estimulación inmunitaria, desactivación inmunitaria, dispersión de biopelículas, resistencia bacteriana a fagos, sensibilización bacteriana a antibióticos, modulación de factores de virulencia y digestión o edición selectiva del genoma del hospedador, otras propiedades deseables que serían fácilmente conocidas por un experto en la materia, o cualquier combinación de las mismas. Las secuencias de ácido nucleico identificadas que confieren la propiedad deseada pueden incorporarse al genoma vírico seleccionado utilizando el procedimiento de modificaciónin vitrodivulgado en el presente documento para incorporar uno o más cambios en un único genoma vírico a través de una o más rondas de modificación iterativa y ensayos hasta que se haya confirmado el conjunto deseado de una o más propiedades víricas mejoradas. El genoma vírico final de interés puede ser una combinación de moléculas de ácido nucleico de origen natural y sintetizadas, o puede sintetizarse completamentede novoutilizando los procedimientos descritos en el presente documento y/o los conocidos en la técnica. La generación de virus o partículas víricas con propiedades víricas mejoradas puede implicar la introducción del genoma vírico modificado de interés en una célula compatible, en la que el genoma se activa generando así partículas víricas o virus. Para preparar la molécula de ácido nucleico identificada para conferir una propiedad deseada para su incorporación en el genoma vírico seleccionado, la secuencia de interés puede aislarse o amplificarse a partir del genoma vírico del que se identificó mediante digestión, amplificación por PCR, síntesis, otros procedimientos bien conocidos en la técnica o cualquier combinación de los mismos. La secuencia de ácido nucleico sintetizada puede sintetizarse químicamente o ensamblarse a partir de oligonucleótidos solapantes sintetizados químicamente. Además, o como alternativa, la molécula de ácido nucleico que se incorporará al genoma vírico seleccionado para conferir el fenotipo deseado puede ser una combinación de secuencias de ácido nucleico de origen natural y de síntesis. En función del diseño de la molécula de ácido nucleico que se va a incorporar al genoma vírico seleccionado, el genoma vírico modificado resultante puede tener secuencias de ácido nucleico añadidas, delecionadas, sustituidas por secuencias alternativas o cualquier combinación de las mismas con el fin de conferir la propiedad vírica deseada. Los procedimientos para diseñar moléculas de ácido nucleico con el fin de alterar una secuencia de tal manera que se eliminen, delecionen, sustituyan secuencias o cualquier combinación de las mismas son bien conocidos por los expertos en la materia. Los genomas víricos modificados generados por el sistema y los procedimientos descritos en el presente documento pueden utilizarse para generar virus o partículas víricas con propiedades víricas mejoradas. La generación de virus o partículas víricas con propiedades víricas mejoradas puede implicar la introducción del genoma vírico modificado en una célula compatible, en la que el genoma se activa generando así partículas víricas o virus. La introducción del genoma modificado en la célula puede realizarse por electroporación, transformación, conjugación, contacto de la célula con genomas víricos preencapsidados, etc., u otros procedimientos bien conocidos en la técnica.

La presente divulgación se refiere además al descubrimiento de un procedimiento para la modificación de ácidos nucleicosin vitroutilizando una endonucleasa guiada por ARN. La presente divulgación se refiere además a la mejora de las propiedades víricas mediante la modificación genéticain vitrode ácidos nucleicos víricos. En concreto, la divulgación se refiere a la digestiónin vitrode secuencias víricas utilizando una endonucleasa, tal como una endonucleasa guiada por ARN, por ejemplo, Cas9, seguida del ensamblaje de un ácido nucleico recombinante mediante la inserción de un fragmento o fragmentos de ADN o ARN en el genoma vírico digerido.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimientoin vitrode modificación de un ácido nucleico vírico que comprende el aislamiento de un ácido nucleico vírico; la digestiónin vitrode una región del ácido nucleico vírico utilizando una nucleasa guiada por ARN; y el ensamblaje de un ácido nucleico recombinante mediante la inserción de un fragmento de ADN o ARN en el ácido nucleico vírico digerido. En algunos ejemplos, la digestiónin vitroes una digestión enzimática guiada por ARN. En algunos ejemplos, la digestión enzimática se realiza mediante una nucleasa guiada por ARN. En algunos ejemplos, la nucleasa guiada por ARN es Cas9, una enzima derivada de Cas9, una enzima relacionada con Cas9 o cualquier nucleasa programable purificada guiada por ARN. En algunos ejemplos, la digestión comprende además ARN selectivos. En algunos ejemplos, la digestión comprende además espermidina. En algunos ejemplos, los ARN selectivos son ARNg, ARNcr y/o ARNtracr. En algunos ejemplos, tras la digestión, la nucleasa guiada por ARN se inactiva mediante procedimientos convencionales, tales como la exposición al calor y/o se elimina mediante procedimientos convencionales, tales como, por ejemplo, la extracción con fenolcloroformo. En algunos ejemplos, el calor en la activación se consigue exponiendo la solución que comprende la proteína al calor, tal como, por ejemplo, al menos a 80 °C.

Cualquier nucleasa programable guiada por ARN puede utilizarse en los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento, por ejemplo, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (también conocidas como Csn1 y Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpfl, C2c1, C2c2, C2c3 u homólogos de las mismas, o versiones modificadas de las mismas. Cualquier sistema CRISPR programable puede utilizarse en los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento, incluidos los de tipo I, tipo II, tipo III, tipo IV, tipo V, tipo VI o cualquier combinación de los mismos. La nucleasa guiada por ARNi puede ser una proteína Cas9, tal como una proteína Cas9 deStaphylococcus pyogenes, S. thermophilus, S. pneumonía, S. aureusoNeisseria meningitidis,como ejemplos no limitantes. También se consideran las proteínas cas9 proporcionadas como SEQ ID NO:1-256 y 795-1346 en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2014/0068797 y proteínas Cas9 quiméricas que pueden combinar dominios de más de una proteína Cas9, así como variantes y mutantes de proteínas Cas9 identificadas. Además de Cas9, un experto en la materia reconocería fácilmente que cualquier equivalente funcional conocido sería un ejemplo alternativo suficiente.

Las partículas víricas pueden ser virus específicos de arqueas, procariotas o eucariotas. Por ejemplo, el virus puede ser un virus que puede infectar aPseudomonas aeruginosa, E. coliuHomo sapiens.En algunos ejemplos, el virus puede ser un virus que infecta a especies patógenas, tales como las de los génerosAcinetobacter, Clostridium, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Klebsiella, Mycobacterium, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, StaphylococcusoStreptococcus.En algunos ejemplos, el virus puede infectar especies de arqueas, tales como las del géneroAcidianus, Aeropyrum, Haloarcula, Haloferax, Halorulbum, Methanobacterium, Pyrobaculum, Pyrococcus, Stygiolobus, SulfolobusoThermoproteus.En algunos ejemplos, el virus puede infectar a hospedadores eucariotas, tales como seres humanos, mamíferos, animales, plantas, algas u hongos. El ácido nucleico vírico puede ser ADN o ARN. En algunos ejemplos, el ácido nucleico vírico consiste en un genoma vírico completo, una parte del genoma vírico o uno o varios genes víricos. En algunos ejemplos, una parte del genoma vírico se subclona en un plásmido antes de la modificación.

El ácido nucleico vírico puede ser sometido a digestión sencilla o doble (o más) por una nucleasa guiada por ARN, tal como Cas9, acoplada con ARN selectivosin vitropara eliminar uno o más nucleótidos, un único gen, múltiples genes o una región genómica de cualquier tamaño o para abrir el ADN para la inserción de una nueva secuencia. Además de Cas9, un experto en la materia entiende que cualquier nucleasa programable guiada por ARN u otro mecanismo selectivo de corte del ADN sería suficiente y funcionalmente equivalente. Se pueden realizar múltiples digestiones simultáneamente; sin embargo, se descubrió que la digestión secuencial con Cas9 guiada por ARN puede aumentar la eficiencia. Además, se puede añadir espermidina a la mezcla de reacción para aumentar la disociación de Cas9 del ADN, lo que permite una mayor disponibilidad de Cas9 para la actividad enzimática. La secuencia vírica eliminada por el corte de Cas9 no se recombina de nuevo en el genoma, porque Cas9 es una enzima de corte romo y los fragmentos no contienen homología con el sitio de inserción. Además, la desactivación térmica de Cas9 permite pasar directamente de la digestión a las reacciones de ensamblaje, lo que simplifica el protocolo.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "ARN selectivo" o "ARN guía" se refiere a ARN de CRISPR (ARNcr), ARNcr transactivadores (ARNtracr), ARN guía quiméricos modificados (ARNg) que incorporan tanto ARNcr como ARNtracr, o ARNg individuales compatibles con el sistema CRISPR elegido. Los<a>R<n>de CRISPR (ARNcr) se transcriben a partir de un locus CRISPR, se incorporan a complejos efectores y guían al complejo hasta las secuencias de ácido nucleico invasoras, lo que da lugar a una digestión del ácido nucleico mediada por nucleasas guiadas por ARN. Los ARNtracr son complementarios y se aparean con un pre-ARNcr formando un dúplex de ARN necesario para la ruptura mediada por Cas9. Los ARNg híbridos son ARN quiméricos que unen el ARNcr selectivo con un ARNtracr, permitiendo el uso de un único ARN para la digestión mediada por Cas9. La digestión mediada por Cas9 puede realizarse tanto con mezclas de ARNcr-ARNtracr transcritosin vitrocomo con ARNg quiméricos.

El inserto de ADN o ARN puede obtenerse por cualquier medio conocido en la técnica y, específicamente, mediante síntesisin vitro,síntesis química, síntesisde novo,ensamblajede novo,amplificación (PCR), liberación mediada por enzimas a partir de plásmidos, virus o bacterias, o cualquier combinación de los mismos. En un aspecto, el inserto de ADN o ARN se genera mediante el ensamblaje de oligos o PCR con cebadores que contienen secuencias solapantes al sitio de integración. El inserto de ADN o ARN puede ser una combinación de ácidos nucleicos de origen natural y de síntesis, o de origen totalmente natural o sintético.

El ensamblaje del inserto de ADN o ARN y el ácido nucleico vírico digerido puede realizarse utilizando cualquier procedimiento conocido en la técnica, tales como las reacciones de clonaciónin vitroo cualquiera de los procedimientos comentados anteriormente. En un aspecto, el ensamblaje del inserto de ADN o ARN en el genoma vírico digerido se realiza mediante el procedimiento de ensamblaje de Gibson. En un aspecto, el ensamblaje del inserto de ADN o ARN en el genoma vírico digerido se realizain vivoutilizando la maquinaria de recombinación de las células hospedadoras. El ensamblaje del inserto de ADN o ARN puede dar lugar a la adición, deleción, sustitución, o cualquier combinación de las mismas, de la secuencia de ácido nucleico. El proceso de diseño de una secuencia de ADN o ARN de forma que el ensamblaje en el ácido nucleico vírico digerido dé lugar a la adición, deleción, sustitución o cualquier combinación de las mismas de ácidos nucleicos de interés es bien conocido en la técnica.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimientoin vitrode modificación de una secuencia vírica que comprende el aislamiento de un ácido nucleico vírico; la digestiónin vitrode una región del ácido nucleico vírico utilizando una nucleasa guiada por ARN; y el ensamblaje de un ácido nucleico recombinante mediante la inserción de un fragmento de ADN o ARN en el ácido nucleico vírico digerido. En algunos ejemplos, el ensamblaje se realizain vitroen un único recipiente con una mezcla de componentes que comprende (a) una exonucleasa 5' a 3' no termoestable aislada que carece de actividad exonucleasa 3', (b) un agente de aglomeración, (c) una ADN polimerasa sin desplazamiento de cadena termoestable aislada con actividad exonucleasa 3', o una mezcla de dicha ADN polimerasa con una segunda ADN polimerasa que carece de actividad 3' exonucleasa, (d) una ligasa termoestable aislada, (e) una mezcla de dNTP, y (f) un tampón adecuado, en condiciones que sean eficaces para la inserción del fragmento en el ácido nucleico vírico digerido para formar un ácido nucleico recombinante. En algunos aspectos, la exonucleasa es una exonucleasa T5 y la puesta en contacto se realiza en condiciones isotérmicas y/o el agente de aglomeración es PEG y/o la ADN polimerasa sin desplazamiento de cadena es la ADN polimerasa Phusion™ o la ADN polimerasa VENT®y/o la ligasa es la Taq ligasa. En algunos ejemplos, el ensamblajein vitrose realiza mediante ensamblaje de Gibson en una etapa o isotérmico. En algunos ejemplos, el ensamblajein vitrose realiza mediante ensamblaje Gibson en dos etapas. En algunos ejemplos, el ácido nucleico digerido y el fragmento de ADN o ARN pueden ensamblarsein vitromediante ligamiento romo utilizando una enzima ligasa.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimientoin vitrode modificación de una secuencia vírica que comprende una etapa de ensamblaje. En algunos ejemplos, el ensamblaje se realizain vivoen una célula hospedadora compatible utilizando la maquinaria de recombinación de la célula hospedadora. Si bien el ácido nucleico recombinante puede ensamblarse completamentein vitroutilizando enzimas purificadas como las descritas en el presente documento, este proceso también puede llevarse a cabo utilizando vías de recombinación naturales o modificadas dentro de una cepa hospedadora susceptible. En algunos casos, las células hospedadoras compatibles pueden ser S.cerevisiae, E. coli, P aeruginosa, B. subtilis, V. natrigensu otro organismo disponible en la técnica. La transformación de genomas víricos purificados y digeridosin vitrojunto con un fragmento de reparación para inserción que porta regiones de homología terminales es suficiente para que algunas células hospedadoras ensamblen un genoma vírico recombinantein vivo.Los fragmentos de reparación para inserción pueden sintetizarse o amplificarse mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica o pueden residir dentro de plásmidos que se replican de forma estable dentro de la célula hospedadora elegida. Es probable que este procedimiento tenga una eficacia menor que el ensamblajein vitrodebido a que las células hospedadoras tienen vías de reparación del ADN homólogas y no homólogas, a la dificultad de codistribuir cantidades suficientes de inserto y genoma digerido en una célula hospedadora y a la menor eficacia de la mayoría de las vías de recombinación homóloga del hospedador. Dado que los genomas digeridos por sí solos no formarán partículas víricas funcionales ni las placas posteriores sin que haya recombinación mediada por el hospedador, las placas obtenidas tras la transformación y el cultivo en placas pueden cribarse mediante PCR para detectar la inserción dada, a fin de confirmar el correcto ensamblaje del ácido nucleico vírico modificado deseado.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimientoin vitrode modificación de una secuencia vírica que comprende una nucleasa guiada por ARN. En algunos ejemplos, la nucleasa guiada por ARN es una Cas9 de tipo II. En algunos ejemplos, la nucleasa guiada por ARN es Cas9 o una enzima derivada de Cas9. En algunos ejemplos, la nucleasa guiada por ARN es una enzima Cas9 recombinante aislada o una enzima derivada de Cas9. En algunos ejemplos, hay al menos un ARN selectivo. En algunos ejemplos, hay dos ARN selectivos. En algunos ejemplos, el ARN selectivo es un ARN guía (ARNg) quimérico o un conjunto de un ARNcr y un ARNtracr. En algunos ejemplos, la reacción de digestiónin vitroutiliza dos ARNg. En algunos ejemplos, la reacción de digestiónin vitroutiliza dos conjuntos de ARNcr y ARNtracr, por ejemplo, para dirigirse a dos secuencias simultáneamente.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimientoin vitrode modificación de una secuencia vírica que comprende una etapa de digestiónin vitro.En algunos ejemplos, tras la digestión, la nucleasa guiada por ARN se inactiva mediante procedimientos convencionales, tales como la exposición al calor, por ejemplo, al menos a 80 °C. En algunos ejemplos, tras la digestión, la nucleasa guiada por ARN se elimina mediante extracción con fenolcloroformo. En algunos ejemplos, tras la digestión, la nucleasa guiada por ARN se elimina mediante otros procedimientos de extracción bien conocidos en la técnica.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimientoin vitrode modificación de una secuencia vírica que da como resultado un ácido nucleico vírico modificado. En algunos ejemplos, el ácido nucleico vírico modificado se transforma en una célula hospedadora. En algunos ejemplos, la célula hospedadora esE. coli, P aeruginosa, S. cerevisiae,Vnatriegens, B. subtilisu otro organismo bien conocido en la técnica. En algunos ejemplos, la transformación se realiza por choque térmico, electroporación, biolística, bombardeo de partículas, conjugación, transducción, lipofección u otro procedimiento establecido bien conocido en la técnica. En algunos ejemplos, el ácido nucleico vírico modificado se transforma en una célula hospedadora y se aísla de nuevo tras la replicación. En algunos ejemplos, el ácido nucleico vírico modificado aislado se utiliza como ácido nucleico vírico de partida para otra ronda de modificaciónin vitro,un proceso denominado en el presente documento modificaciónin vitroiterativa. En algunos ejemplos, hay una ronda de modificaciónin vitroiterativa. En otros ejemplos, hay al menos una ronda de modificaciónin vitroiterativa. En otros ejemplos, hay dos o más rondas de modificaciónin vitroiterativa.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimientoin vitrode modificación de una secuencia vírica que da como resultado un ácido nucleico vírico modificado. En algunos ejemplos, el ácido nucleico vírico modificado se encapsida en partículas víricas utilizando un kit de encapsidaciónin vitroque puede estar disponible en el mercado. En algunos ejemplos, el kit de encapsidaciónin vitroes el extracto de encapsidación Maxplax lambda.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimientoin vitrode modificación de una secuencia vírica que da como resultado un ácido nucleico vírico modificado recombinante. En algunos ejemplos, el ácido nucleico vírico modificado mejora o altera una propiedad del virus en comparación con el virus de referencia y/o no modificado. En algunos ejemplos, la propiedad vírica mejorada o alterada es una propiedad tal como la gama de hospedadores, el ciclo lítico vírico, la adsorción, la adhesión, la inyección, la replicación y el ensamblaje, la lisis, el tamaño de explosión, la evasión inmunitaria, la estimulación inmunitaria, la desactivación inmunitaria, la dispersión de biopelículas, la resistencia bacteriana a fagos, la sensibilización bacteriana a antibióticos, la modulación de factores de virulencia, la digestión o edición selectiva del genoma del hospedador, o cualquier combinación de las mismas. En algunos ejemplos, la mejora de una propiedad puede consistir en un aumento, disminución o alteración de la misma. Por ejemplo, la propiedad vírica mejorada puede ser la ampliación o reducción de la gama de hospedadores, la alteración del ciclo lítico vírico, el aumento o disminución de la adsorción a una célula hospedadora, el aumento o disminución de la adhesión a una célula hospedadora, el aumento o disminución de la inyección, el aumento o disminución o alteración de la replicación y el ensamblaje, el aumento o disminución de la lisis, el aumento o disminución del tamaño de explosión, el aumento o disminución o alteración de la evasión inmunitaria, el aumento o disminución o alteración de la estimulación inmunitaria, el aumento o disminución o alteración de la desactivación inmunitaria, el aumento o disminución o alteración de la dispersión de biopelículas, el aumento o disminución o alteración de la resistencia bacteriana a los fagos, el aumento o disminución o alteración de la sensibilización bacteriana a los antibióticos, el aumento o disminución o alteración de la modulación de los factores de virulencia, el aumento o disminución o alteración de la digestión o edición selectiva del genoma del hospedador, o cualquier combinación de los mismos.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimiento para la modificación de un ácido nucleico vírico que da lugar a una propiedad vírica mejorada, tal como, por ejemplo, una mayor gama de hospedadores. La gama de hospedadores es el número de tipos celulares, cepas o especies hospedadoras que un virus es capaz de infectar. El aumento de la gama de hospedadores es una ampliación del número absoluto de tipos celulares, cepas o especies distintas que un virus es capaz de infectar en comparación con un virus de referencia y/o no modificado. En algunos ejemplos, el aumento de la gama de hospedadores es un aumento del número de cepas bacterianas o variantes dentro de una especie bacteriana que el virus es capaz de infectar. El aumento de la gama de hospedadores puede ser un aumento de al menos una o más de una cepa, tipo celular o especie. La gama de hospedadores puede ensayarse, por ejemplo, mediante un ensayo en placa convencional bien conocido en la técnica.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimiento para la modificación de un ácido nucleico vírico que da lugar a una propiedad vírica mejorada, tal como, por ejemplo, el ciclo lítico vírico. El ciclo lítico vírico es uno de los dos ciclos de replicación vírica, siendo el otro el ciclo lisogénico. El ciclo lítico provoca la destrucción de la célula infectada y de la membrana de la célula infectada. El ciclo lítico consta de seis etapas, cada una de las cuales puede modificarse individualmente. Las seis etapas del ciclo lítico vírico son la adsorción, la adhesión, la inyección, la replicación y el ensamblaje, la lisis y el tamaño de explosión.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimiento para la modificación de un ácido nucleico vírico que da lugar a una propiedad vírica mejorada, tal como, por ejemplo, la adsorción. La adsorción es el acto por el cual el virus entra en contacto con la célula hospedadora. La adsorción vírica se define como la afinidad de un virus por una célula hospedadora determinada y puede evaluarse mediante ensayos de adsorción convencionales, tales como los descritos por Hyman y Abedon (Methods in Molecular Biology, 2009). Además, o como alternativa, la adsorción vírica puede determinarse mediante otros ensayos de afinidad convencionales ampliamente utilizados en bioquímica para analizar las interacciones de receptor-ligando.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimiento para la modificación de un ácido nucleico vírico que da lugar a una propiedad vírica mejorada, tal como, por ejemplo, la adhesión. La adhesión vírica se produce cuando el virus se adhiere fuertemente a la célula hospedadora. La adhesión vírica es una interacción irreversible entre el virus y el receptor de la célula hospedadora.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimiento para la modificación de un ácido nucleico vírico que da lugar a una propiedad vírica mejorada, tal como, por ejemplo, la inyección. La inyección se refiere a la inyección del genoma vírico y se produce cuando el virus inserta su material genético en la célula hospedadora. La inyección del genoma vírico puede medirse, por ejemplo, midiendo el eflujo de iones potasio (Cadyet al.,J. Bacteriol, noviembre de 2012, 194(21):5728-5738; Leavittet al.,PLoS ONE, 20138(8): e70936.).

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimiento para la modificación de un ácido nucleico vírico que da lugar a una propiedad vírica mejorada, tal como, por ejemplo, la replicación y el ensamblaje. La replicación y el ensamblaje víricos se refieren a la célula hospedadora que construye nuevos virus. Tras la inyección del genoma vírico, se secuestra la maquinaria de la célula hospedadora y se transcriben genes víricos, se traducen proteínas víricas y se ensamblan partículas víricas que comprenden genomas víricos replicados. La replicación y el ensamblaje víricos conducirán en última instancia a la lisis de la célula hospedadora, por lo que la replicación y el ensamblaje pueden evaluarse controlando la tasa de crecimiento vírico mediante un ensayo en placa convencional o un ensayo en placa con doble capa de agar. Además, o como alternativa, las tasas de replicación vírica pueden determinarse midiendo el tamaño de explosión en un ensayo en placa convencional, una curva de una etapa, o mediante otros ensayos convencionales de aptitud vírica bien conocidos en la técnica.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimiento para la modificación de un ácido nucleico vírico que da lugar a una propiedad vírica mejorada, tal como, por ejemplo, la lisis. La lisis se refiere a la lisis de la célula hospedadora. Tras la replicación y el ensamblaje de nuevas partículas víricas, se produce una enzima que rompe la pared celular del hospedador y/o la membrana celular desde el interior y permite la entrada de líquidos, lo que en última instancia conduce a la lisis de la célula hospedadora. La capacidad de aumentar o inhibir la replicación virulenta de un virus puede aumentar o disminuir el tiempo que tarda un virus determinado en matar a una célula hospedadora por lisis. La virulencia vírica puede evaluarse analizando el tiempo transcurrido entre la infección y la lisis de la célula hospedadora, controlando la tasa de crecimiento vírico mediante un ensayo en placa convencional o un ensayo en placa con doble capa de agar. Además, o como alternativa, el aumento de la lisis bacteriana de un virus modificado en comparación con un virus de referencia y/o no modificado puede determinarse mediante las unidades formadoras de colonias (UFC) tras un ensayo, el número o el diámetro de las unidades formadoras de placas (UFP) tras un ensayo en placa, a partir de ensayos de biopelículas u otros ensayos convencionales bien conocidos en la técnica.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimiento para la modificación de un ácido nucleico vírico que da lugar a una propiedad vírica mejorada, tal como, por ejemplo, el tamaño de explosión. El tamaño de explosión se refiere al número de virus producidos por una célula infectada. El tamaño de explosión puede evaluarse mediante ensayos convencionales de tamaño de explosión como los descritos por Ellis y Delbrück (J. Gen. Physiol., 20 de enero de 1939; 22(3): 365-384) y Delbrück (Delbrück, J. Gen. Physiol., 1940, 23:643)

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimiento para la modificación de un ácido nucleico vírico que da lugar a una propiedad vírica mejorada, tal como, por ejemplo, la evasión inmunitaria. La evasión inmunitaria es la capacidad de un virus para evitar ser eliminado por el sistema inmunitario innato o adaptativo. La evasión inmunitaria puede evaluarse observando el nivel o la velocidad de producción de anticuerpos neutralizantes. Además, o como alternativa, la evasión inmunitaria puede medirse analizando la semivida o el tiempo de residencia de un virus determinado dentro de un animal.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimiento para la modificación de un ácido nucleico vírico que da lugar a una propiedad vírica mejorada, tal como, por ejemplo, la estimulación inmunitaria. La estimulación inmunitaria es la capacidad de un virus de inducir una respuesta inmunitaria que normalmente no se asocia con el virus de tipo salvaje o no modificado. Esto puede comprobarse analizando los factores inmunitarios producidos en presencia del virus mediante kits ELISA convencionales, citometría de flujo, histología u otros ensayos inmunológicos habituales conocidos por los expertos en la materia.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimiento para la modificación de un ácido nucleico vírico que da lugar a una propiedad vírica mejorada, tal como, por ejemplo, la desactivación inmunitaria. La desactivación inmunitaria es la capacidad de un virus de disminuir una respuesta inmunitaria normalmente asociada al virus de tipo salvaje o no modificado. Esto puede comprobarse analizando los factores inmunitarios producidos en presencia del virus mediante kits ELISA convencionales, citometría de flujo, histología u otros ensayos inmunológicos habituales conocidos por los expertos en la materia.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimiento para la modificación de un ácido nucleico vírico que da lugar a una propiedad vírica mejorada, tal como, por ejemplo, la dispersión de biopelículas. La dispersión de biopelículas es la capacidad de degradar, desprender o aumentar la penetrabilidad de una biopelícula. Las actividades que pueden conducir a la dispersión de biopelículas incluyen, entre otras, la degradación de los exopolisacáridos (EPS), la modulación de las moléculas de percepción dequorumy la degradación del ADN o ARN extracelular dentro de una biopelícula o un foco de infección bacteriana. La "degradación de exopolisacáridos" es la capacidad de un virus de producir una proteína o enzima capaz de degradar o disociar compuestos de alto peso molecular secretados por microorganismos hacia su entorno para formar la integridad estructural de las biopelículas. Las actividades degradantes de EPS pueden incluir, entre otras, tensioactivos, glucosidasas y proteasas. Sus actividades pueden medirse mediante ensayos bioquímicos convencionales conocidos por los expertos en la materia. La modulación de las moléculas de percepción dequorumtambién puede conducir a la dispersión de biopelículas. Se sabe que las moléculas de percepción dequorumson reguladores altamente conservados de la virulencia en una serie de bacterias patógenas humanas. Se han identificado proteínas con actividades enzimáticas capaces de degradar moléculas de percepción dequorumy sus actividades se han medido a través de diversos ensayos de indicadores microbianos, ensayos de indicadores bioquímicos o mediante el análisis de productos de escisión utilizando TLC (Rajesh y Rai, Microbiological Research, julio-agosto de 2014, volumen 169, números 7-8, páginas 561 569). La degradación del ADN o ARN extracelular dentro de una biopelícula o de un foco de infección bacteriana también puede provocar la dispersión de biopelículas. Las actividades de ADNasa o ARNasa codificadas por virus pueden medirse mediante kits comerciales conocidos por los expertos en la materia, tales como los disponibles en Jena Bioscience o Thermofisher, como ejemplos no limitantes. La prevención, penetración, destrucción o dispersión de biopelículas también puede evaluarse cuantificando la biopelícula presente tras el tratamiento y comparándola con una condición de control. Las mediciones de biopelículas son bien conocidas en la técnica e incluyen, como ejemplo no limitante, la tinción de la biopelícula con un colorante, como el violeta de cristal, y la cuantificación de la absorbancia en un espectrofotómetro.

En algunos ejemplos, la presente divulgación proporciona un procedimiento de modificación de un ácido nucleico vírico que da lugar a una propiedad vírica mejorada, tal como, por ejemplo, la resistencia bacteriana a fagos. Fago o bacteriófago son términos que pueden utilizarse indistintamente y se refieren a virus que infectan bacterias. La resistencia bacteriana a los fagos se refiere a la aparición de bacterias resistentes a los bacteriófagos a partir de una población tratada con un virus específico o expuesta a él. Esto sucede bien por mutaciones aleatorias dentro de la bacteria, bien porque determinadas bacterias de la población no pudieron ser infectadas por el virus. Cuando estas bacterias resistentes se expanden, la nueva población es resistente al virus o bacteriófago al que estuvo expuesta en un principio. Un ejemplo no limitante de evaluación de la resistencia bacteriana es el seguimiento de la tasa de crecimiento bacteriano tras el tratamiento vírico, ya que el número de bacterias resistentes influye directamente en la velocidad en que continúa creciendo la población. Los bacteriófagos pueden diseñarse para evitar que las bacterias adquieran resistencia vírica mediante al menos tres procedimientos, que incluyen 1) la inhibición de sistemas de resistencia vírica conocidos, 2) la codificación de una toxina secundaria y/o 3) el aumento de la virulencia mediante el aumento de la capacidad lítica. Los bacteriófagos pueden evitar o inhibir los sistemas de resistencia vírica conocidos mediante la expresión de proteínas inhibidoras conocidas o sintéticas, por ejemplo. La actividad de estas proteínas inhibidoras puede controlarse mediante el procedimiento clásico de titulación en placas de doble capa y/o el análisis de la eficacia del cultivo en placa. Los sistemas de resistencia vírica pueden incluir, entre otros, CRISPR-Cas y sistemas de modificación de restricción. La prevención de la resistencia vírica también puede lograrse mediante la expresión de toxinas secundarias, tales como cargas activas bactericidas. La actividad de estas toxinas secundarias es independiente de la actividad lítica natural del virus en cuestión y puede medirse mediante el análisis de la curva de crecimiento/muerte. Además, o como alternativa, la proteína tóxica codificada genéticamente puede purificarse y caracterizarse utilizando ensayos bioquímicos y/o fenotípicos establecidos y utilizados habitualmente para caracterizar toxinas proteicas y que son bien conocidos por un experto en la materia.

En algunos ejemplos, la presente divulgación proporciona un procedimiento de modificación de un ácido nucleico vírico que da lugar a una propiedad vírica mejorada, tal como, por ejemplo, la sensibilización bacteriana a antibióticos. La "sensibilización bacteriana a antibióticos" se refiere a la capacidad de un virus de expresar una carga activa codificada genéticamente para hacer que las células infectadas o vecinas sean más sensibles a un agente antimicrobiano. La carga activa puede codificarse genéticamente en el virus o bacteriófago y luego expresarse dentro de la célula hospedadora. La carga activa expresada puede ser secretada opcionalmente por la célula hospedadora o liberada tras la lisis de la célula hospedadora. La actividad de sensibilización a los antibióticos puede observarse mediante pruebas de sinergia utilizando, por ejemplo, el conocido ensayo de microdilución en damero.

En algunos ejemplos, la presente divulgación proporciona un procedimiento de modificación de un ácido nucleico vírico que da lugar a una propiedad vírica mejorada, tal como, por ejemplo, la modulación de factores de virulencia. La "modulación de factores de virulencia" se refiere a un virus que codifica genéticamente proteínas o compuestos capaces de modular la expresión o actividad de factores de virulencia conocidos. Algunos ejemplos no limitantes de moduladores de factores de virulencia son los factores de transcripción, los anticuerpos y las proteínas de inmunidad. La expresión o actividad de los factores de virulencia y de los moduladores de los factores de virulencia puede observarse, por ejemplo, en modelos animales, pruebas bioquímicas o ensayos con indicadores.

En algunos ejemplos, la presente divulgación proporciona un procedimiento de modificación de un ácido nucleico vírico que da lugar a una propiedad vírica mejorada, tal como, por ejemplo, la digestión o edición selectiva del genoma del hospedador. La "digestión o edición selectiva del genoma del hospedador" se refiere a la capacidad de un virus para codificar genéticamente una nucleasa específica de secuencia capaz de digerir el genoma de forma selectiva en un locus genético determinado y, opcionalmente, editarlo, por ejemplo, mediante la inserción de una molécula de ADN de reparación. La actividad de digestión selectiva puede observarse mediante secuenciación, recuento de viables, confirmación de la integración de nuevas secuencias y/u otras técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimientoin vitrode modificación de una secuencia vírica que comprende una etapa de digestiónin vitro.En algunos ejemplos, el ácido nucleico vírico digerido se aísla y secuencia en lugar de utilizarse en la reacción de ensamblajein vitrooin vivo.En algunos ejemplos, los resultados de la secuenciación del fragmento de ácido nucleico vírico se utilizan para determinar las terminaciones del genoma vírico. En algunos ejemplos, las secuencias genómicas víricas corregidas se utilizan para planificar y diseñar otros enfoques y etapas de modificaciónin vitro.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimientoin vitrode modificación de una secuencia vírica que comprende el aislamiento de un ácido nucleico vírico. En algunos ejemplos, el ácido nucleico vírico es un genoma vírico completo. En algunos ejemplos, el genoma vírico completo se aísla de una partícula vírica. En algunos ejemplos, el ácido nucleico vírico es una subsección del genoma vírico. En algunos ejemplos, el ácido nucleico vírico es una subsección del genoma vírico comprendida en un plásmido. En algunos ejemplos, el plásmido que comprende la subsección del genoma vírico se aísla de una célula hospedadora. En algunos ejemplos, la subsección del genoma vírico se ha clonado en un plásmido, transformado en una célula hospedadora y aislado antes de la modificaciónin vitro.En algunos ejemplos, el ácido nucleico vírico se sintetizade novo.La síntesisde novopuede incluir la síntesis de oligos y su ensamblajein vitrooin vivomediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica. En algunos ejemplos, el ácido nucleico vírico se amplifica antes de la digestión, tal como, por ejemplo, se amplifica por PCR.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un kit para la modificación de una secuencia vírica que comprende (a) una exonucleasa 5' a 3' no termoestable aislada que carece de actividad exonucleasa 3', (b) un agente de aglomeración, (c) una ADN polimerasa sin desplazamiento de cadena termoestable aislada con actividad exonucleasa 3', o una mezcla de dicha ADN polimerasa con una segunda ADN polimerasa que carece de actividad 3' exonucleasa, (d) una ligasa termoestable aislada, (e) una mezcla de dNTP, (f) un tampón adecuado, y (g) una nucleasa guiada por ARN recombinante purificada. En algunos ejemplos, la nucleasa guiada por ARN es Cas9 o una enzima derivada de Cas9. En algunos ejemplos, el kit comprende además ARN selectivos diseñados a medida. En algunos ejemplos, los ARN selectivos son ARNg quiméricos o ARNcr y ARNtracr. En algunos ejemplos, el kit comprende además moléculas de ácido nucleico sintetizadas diseñadas a medida para servir como fragmento de ADN insertado en la reacción de ensamblaje. En algunos ejemplos, el kit comprende además células hospedadoras competentes. En algunos ejemplos, el kit comprende además ácidos nucleicos víricos aislados.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un sistema para la modificaciónin vitrode un ácido nucleico vírico que comprende ácido nucleico vírico aislado, una nucleasa guiada por ARN recombinante, al menos un ARN selectivo, y un fragmento de ADN o ARN que se ensamblará en el ácido nucleico vírico aislado en el sitio de digestión. En algunos ejemplos, el ácido nucleico vírico aislado es un genoma completo aislado de partículas víricas. En algunos ejemplos, el ácido nucleico vírico aislado es una subsección del genoma vírico que se subclonó en un plásmido y se aisló de una célula hospedadora. En algunos ejemplos, la nucleasa guiada por ARN es Cas9 o una enzima derivada de Cas9. En algunos ejemplos, el ARN selectivo es un ARNcr y un ARNtracr. En algunos ejemplos, el ARN selectivo es un ARN guía quimérico (ARNg). En algunos ejemplos, hay dos ARN selectivos o ARNg. En algunos ejemplos, hay dos conjuntos de ARNcr y ARNtracr.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un sistema de ácido nucleico vírico modificado invitroque comprende: un ácido nucleico vírico aislado, una nucleasa guiada por ARN recombinante, al menos un ARN selectivo, y un fragmento de ácido nucleico que se insertará en el sitio de digestión del ácido nucleico aislado. En algunos ejemplos, el sistema es tal que la nucleasa guiada por ARN recombinante y al menos un ARN selectivo forman un complejo capaz de digerir el ácido nucleico vírico aislado. En algunos ejemplos, el sistema comprende además espermidina. En algunos ejemplos, el sistema comprende además: una exonucleasa aislada no termoestable de 5' a 3' que carece de actividad exonucleasa 3'; un agente de aglomeración; una ADN polimerasa sin desplazamiento de cadena aislada termoestable con actividad exonucleasa 3', o una mezcla de dicha ADN polimerasa con una segunda ADN polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3'; una ligasa termoestable aislada; una mezcla de dNTP; y un tampón adecuado, en el que el sistema se encuentra en condiciones que son eficaces para la inserción del fragmento de ácido nucleico en el ácido nucleico vírico aislado en el sitio de digestión de la nucleasa guiada por ARN para formar un ácido nucleico vírico recombinante.

En algunos aspectos, el sistema descrito en el presente documento es tal que el ácido nucleico vírico recombinante es capaz de producir partículas víricas no naturales con al menos una propiedad vírica mejorada en comparación con el ácido nucleico vírico de referencia y/o no diseñado. En algunos ejemplos, la propiedad vírica mejorada se selecciona del grupo que consiste en la gama de hospedadores, el ciclo lítico vírico, la adsorción, la adhesión, la inyección, la replicación y el ensamblaje, la lisis, el tamaño de explosión, la evasión inmunitaria, la estimulación inmunitaria, la desactivación inmunitaria, la dispersión de biopelículas, la resistencia bacteriana a fagos, la sensibilización bacteriana a antibióticos, la modulación de factores de virulencia y la digestión o edición selectiva del genoma del hospedador.

En algunos aspectos, en el sistema descrito en el presente documento, la nucleasa guiada por ARN es Cas9 o una enzima derivada de Cas9. En algunos ejemplos, la nucleasa guiada por ARN se inactiva o elimina tras la digestión.

El procedimiento descrito en el presente documento puede utilizarse en otros múltiples genomas víricos y construcciones de vectores víricos, utilizarse para modificar genomas de ARN editando directamente el genoma de ARN o una plantilla de ADN que luego se transcribiráin vitroen el ARN vírico, utilizarse para diseñar y modificar directamente virus procariotas y eucariotas, y utilizarse para modificar directamente genomas víricos utilizados para la presentación en fagos, la terapia con fagos, el diagnóstico vírico o el desarrollo/producción de vacunas.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un ácido nucleico vírico recombinante generado por cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. En algunos ejemplos, el ácido nucleico vírico recombinante es capaz de producir partículas víricas no naturales con al menos una propiedad vírica mejorada en comparación con el ácido nucleico vírico no modificado. En algunos ejemplos, la propiedad vírica mejorada se selecciona del grupo que consiste en la gama de hospedadores, el ciclo lítico vírico, la adsorción, la adhesión, la inyección, la replicación y el ensamblaje, la lisis, el tamaño de explosión, la evasión inmunitaria, la estimulación inmunitaria, la desactivación inmunitaria, la dispersión de biopelículas, la resistencia bacteriana a fagos, la sensibilización bacteriana a antibióticos, la modulación de factores de virulencia y la digestión o edición selectiva del genoma del hospedador.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona una composición vírica modificada que comprende un ácido nucleico recombinante capaz de producir partículas víricas no naturales con al menos una propiedad vírica mejorada en comparación con el ácido nucleico vírico no modificado. En algunos ejemplos, la propiedad vírica mejorada se selecciona del grupo que consiste en la gama de hospedadores, el ciclo lítico vírico, la adsorción, la adhesión, la inyección, la replicación y el ensamblaje, la lisis, el tamaño de explosión, la evasión inmunitaria, la estimulación inmunitaria, la desactivación inmunitaria, la dispersión de biopelículas, la resistencia bacteriana a fagos, la sensibilización bacteriana a antibióticos, la modulación de factores de virulencia y la digestión o edición selectiva del genoma del hospedador. En algunos ejemplos, el ácido nucleico vírico modificado según la presente divulgación se genera mediante cualquiera de las etapas de los procedimientos descritos en el presente documento.

El procedimiento puede utilizarse para alterar un nucleótido, un gen o una región genómica completa. Por ejemplo, tal como se describe en los ejemplos siguientes, se ha demostrado que este procedimiento sustituye el gengp18de LKD16 en LUZ19, lo que da como resultado una gama de hospedadores víricos mejorada. Además, este procedimiento puede utilizarse para insertar una única mutación en el complejo tubular vírico con el fin de mejorar la replicación vírica. El procedimiento también puede utilizarse para diseñar péptidos antimicrobianos; piocinas; EPS-despolimerasas; proteínas inhibidoras de CRISPR/Cas; fibras de la cola de bacteriófagos; genes indicadores (es decir, Lux, GFP); genes de interrupción de la percepción dequorum;nucleasas; nucleasas TALEN; proteínas del sistema CRISPR de tipo I, tipo II, tipo III, tipo IV, tipo V y tipo VI (es decir, Cas9); ARN de CRISPR; factores de transcripción y factores inmunomoduladores humanos en un bacteriófago para mejorar la actividad del bacteriófago en la terapia con bacteriófagos o usos relacionados. Estos elementos pueden estar unidos operativamente a elementos reguladores nativos o heterólogos, tales como un promotor nativo, un promotor heterólogo, un promotor inducible o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un virus modificado que comprende un ácido nucleico vírico modificado capaz, tras su introducción en una célula hospedadora, de producir partículas víricas no naturales con dos o más propiedades víricas mejoradas en comparación con el ácido nucleico vírico no modificado. En algunos aspectos, las partículas víricas producidas tienen al menos tres propiedades víricas mejoradas. En algunos aspectos, cada propiedad vírica mejorada se selecciona del grupo que consiste en la gama de hospedadores, el ciclo lítico vírico, la adsorción, la adhesión, la inyección, la replicación y el ensamblaje, la lisis, el tamaño de explosión, la evasión inmunitaria, la estimulación inmunitaria, la desactivación inmunitaria, la dispersión de biopelículas, la resistencia bacteriana a fagos, la sensibilización bacteriana a antibióticos, la modulación de factores de virulencia y la digestión o edición selectiva del genoma del hospedador.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un virus modificado que comprende un ácido nucleico vírico modificado. En algunos aspectos, el ácido nucleico vírico modificado es un genoma vírico modificado. En algunos aspectos, el genoma vírico modificado es un genoma de bacteriófago modificado. En algunos aspectos del bacteriófago modificado, al menos una de las propiedades víricas mejoradas es la gama de hospedadores.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un virus modificado, con dos o más propiedades víricas mejoradas, que comprende un ácido nucleico vírico modificado. En algunos aspectos, cada propiedad vírica mejorada es el resultado de al menos una modificación en el ácido nucleico vírico modificado. En algunos aspectos, al menos una propiedad vírica mejorada es el resultado de al menos dos modificaciones en el ácido nucleico vírico modificado. En algunos aspectos, las modificaciones comprendidas en el ácido nucleico vírico modificado son el resultado de una única etapa de modificación. En algunos aspectos, las modificaciones comprendidas en el ácido nucleico vírico modificado son el resultado de etapas de modificación iterativos.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un virus modificado, con dos o más propiedades víricas mejoradas, que comprende un ácido nucleico vírico modificado.

En algunos aspectos, al menos una de las modificaciones se encuentra dentro de una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con una secuencia comprendida dentro de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:50 o SEQ ID NO:25.

En algunos aspectos, al menos una de las modificaciones se encuentra dentro de una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:48, o SEQ ID NO:49.

En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende todo o una parte de un genoma vírico que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con el genoma de LUZ19. En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende además la totalidad o una parte de un gengp18heterólogo.

En algunos aspectos, el gen heterólogogp18tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con SEQ ID NO:26. En algunos aspectos, el gen heterólogogp18codifica una secuencia de aminoácidos con al menos un el 50 %, al menos un el 60 %, al menos un el 65 %, al menos un el 70 %, al menos un el 75 %, al menos un el 80 %, al menos un el 85 %, al menos un el 90 %, al menos un el 95 %, el 100 % o identidad completa con SEQ ID NO:38.

En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende todo o una parte de un genoma vírico que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con el genoma de LUZ19. En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende además la totalidad o una parte de un gengp34modificado.

En algunos aspectos, el gengp34modificado codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una mutación en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 55 de la SEQ ID NO:5. En algunos aspectos, el gen heterólogogp34tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con SEQ

ID NO:4.

En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende todo o una parte de un genoma vírico que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con el genoma de LUZ19. En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende además una modificación en una o más secuencias que tienen al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un

80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ iD NO:50.

En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende además una modificación en cada una de una secuencia que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con SEQ

ID NO:1, una secuencia que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con SEQ ID NO:2, una secuencia que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el

100 % o identidad completa con SEQ ID NO:3, y una secuencia que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95%, el 100% o identidad completa con SEQ ID NO:50. En algunos aspectos, las modificaciones comprenden una sustitución de G por A en una posición correspondiente a la posición 50 del ácido nucleico de SEQ

ID NO:1, una sustitución de G por T en una posición correspondiente a la posición 160 del ácido nucleico de la SEQ

ID NO:50, una sustitución de A por G en una posición correspondiente a la posición 245 del ácido nucleico de la SEQ

ID NO:2, una sustitución de AT por TC en posiciones correspondientes a las posiciones 247-248 del ácido nucleico de la SEQ ID NO:2, y una sustitución de A por G en una posición correspondiente a la posición 757 del ácido nucleico de la SEQ ID NO:3.

En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende todo o una parte de un genoma vírico que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con el genoma de LUZ19. En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende además una modificación en una o más secuencias de ácido nucleico que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:34,

SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, y SEQ ID NO:48.

En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende una modificación en una secuencia de ácido nucleico que codifica cada una de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un

65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un

95 %, el 100 % o identidad completa con SEQ ID NO:34, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con SEQ ID NO:35, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con SEQ ID NO:36, y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un

70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con SEQ ID NO:48. En algunos aspectos, las modificaciones comprenden una sustitución de C

por Y en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 17 de la SEQ ID NO:34, una sustitución de D por Y en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 36 de la SEQ ID NO:48, una sustitución de D por G en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 82 de la SEQ ID NO:35, una sustitución de I por S en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 83 de la SEQ ID NO:35, y una sustitución de N por D en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 253 de la SEQ ID NO:36.

En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende todo o una parte de un genoma vírico que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con el genoma de LUZ19. En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende además una modificación dentro de una secuencia que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, un 100 % o identidad completa con SEQ ID NO:25. En algunos aspectos, la modificación es una inserción de una molécula de ácido nucleico heterólogo en una secuencia que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con SEQ ID NO:25, o una sustitución de una secuencia comprendida dentro de una secuencia que tenga al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90%, al menos un 95%, el 100% o identidad completa con SEQ ID NO:25 con una molécula de ácido nucleico heterólogo. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:20.

En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende todo o una parte de un genoma vírico que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con el genoma de LUZ19. En algunos aspectos, el genoma vírico modificado comprende además una modificación dentro de una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con SEQ ID NO:49. En algunos aspectos, la modificación es una inserción de una molécula de ácido nucleico heterólogo en una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con SEQ ID NO:49, o una sustitución de una secuencia de ácido nucleico comprendida dentro de una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con SEQ ID NO:49 con una molécula de ácido nucleico heterólogo. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, el 100 % o identidad completa con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46 y SEQ ID NO:47.

En algunos aspectos, el ácido nucleico vírico modificado comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo unida operativamente a un terminador que comprende una secuencia de ácido nucleico comprendida dentro de SEQ ID NO:22 o una parte de la misma.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un procedimiento para generar un virus modificado de interés que tiene dos o más propiedades víricas deseadas que comprende: (a) proporcionar un primer genoma vírico; y (b) modificar un segundo genoma vírico combinando al menos un fragmento del primer genoma vírico con al menos una molécula de ácido nucleico de reparación de manera que el segundo genoma vírico resultante comprenda al menos una modificación en comparación con el primer genoma vírico, y en el que, al introducirse en una célula hospedadora, el segundo genoma vírico es capaz de producir partículas víricas con dos o más propiedades víricas mejoradas. En algunos aspectos, el procedimiento divulgado en el presente documento comprende además (c) repetir las etapas (a)-(b) en una o más iteraciones. En algunos aspectos, cada propiedad vírica mejorada se selecciona del grupo que consiste en la gama de hospedadores, el ciclo lítico vírico, la adsorción, la adhesión, la inyección, la replicación y el ensamblaje, la lisis, el tamaño de explosión, la evasión inmunitaria, la estimulación inmunitaria, la desactivación inmunitaria, la dispersión de biopelículas, la resistencia bacteriana a fagos, la sensibilización bacteriana a antibióticos, la modulación de factores de virulencia y la digestión o edición selectiva del genoma del hospedador.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un procedimiento para generar un virus modificado de interés que tiene dos o más propiedades víricas deseadas como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, la modificación del segundo genoma vírico en la etapa (b) comprende además: (1) la digestiónin vitrode una región del primer genoma vírico utilizando una endonucleasa; y (2) el ensamblaje de al menos un fragmento del primer genoma vírico digerido con al menos una molécula de ácido nucleico de reparación. En algunos aspectos, el primer genoma vírico se aísla de partículas víricas. En algunos aspectos, el primer genoma vírico o dicha al menos una molécula de ácido nucleico de reparación se sintetizade novo.En algunos aspectos, la síntesisde novocomprende la combinación de moléculas de ácido nucleico sintetizadas químicamente, secuencias de ácido nucleico amplificadas por PCR, fragmentos digeridos de moléculas de ácido nucleico aisladas o cualquier combinación de las mismas. En algunos aspectos, el primer genoma vírico o dicha al menos una molécula de ácido nucleico de reparación se amplifica antes de la digestiónin vitro.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un procedimiento para generar un virus modificado de interés que tiene dos o más propiedades víricas deseadas como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, el primer genoma vírico tiene al menos 18 kb. En algunos aspectos, el primer genoma vírico tiene entre al menos 2 kb y al menos 4 Mb. En algunos aspectos, el primer genoma vírico tiene entre al menos 18 kb y al menos 4 Mb. En algunos aspectos, el primer genoma vírico tiene al menos 5 kb, al menos 10 kb, al menos 15 kb, al menos 18 kb, al menos 20 kb, al menos 25 kb, al menos 30 kb, al menos 35 kb, al menos 40 kb, al menos 45 kb, al menos 50 kb, al menos 55 kb, al menos 60 kb, al menos 65 kb, al menos 70 kb, al menos 75 kb, al menos 80 kb, al menos 85 kb, al menos 90 kb, al menos 100 kb, al menos 125 kb, al menos 150 kb, al menos 175 kb, al menos 200 kb, al menos 250 kb, al menos 300 kb, al menos 400 kb, al menos 500 kb, al menos 600 kb, al menos 700 kb, al menos 800 kb, al menos 900 kb, al menos 1 Mb, al menos 1.5 Mb, al menos 2 Mb, al menos 2,5 Mb, al menos 3 Mb, o al menos 3,5 Mb.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un procedimiento para generar un virus modificado de interés que tiene dos o más propiedades víricas deseadas como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, el ensamblaje se realizain vitrooin vivo.En algunos aspectos, el ensamblaje se realizain vitrocon una mezcla que comprende: (a) una exonucleasa 5' a 3' no termoestable aislada que carece de actividad exonucleasa 3'; (b) un agente de aglomeración; (c) una ADN polimerasa sin desplazamiento de cadena termoestable aislada con actividad exonucleasa 3', o una mezcla de dicha ADN polimerasa con una segunda ADN polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3'; (d) una ligasa termoestable aislada; (e) una mezcla de dNTP; y (f) un tampón adecuado, en condiciones que sean eficaces para la inserción del fragmento en el ácido nucleico vírico digerido para formar un ácido nucleico recombinante que comprenda el genoma vírico modificado.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un procedimiento para generar un virus modificado de interés que tiene dos o más propiedades víricas deseadas como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, el ensamblaje se realizain vitrooin vivo.En algunos aspectos, el ensamblaje se realizain vivoen una célula hospedadora.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un procedimiento para generar un virus modificado de interés que tiene dos o más propiedades víricas deseadas como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, la endonucleasa es una nucleasa guiada por ARN. En algunos aspectos, el procedimiento comprende además uno o dos ARN guía. En algunos aspectos, la nucleasa guiada por ARN es Cas9 o una enzima derivada de Cas9. En algunos aspectos, los ARN guía comprenden 1) un ARNg quimérico o 2) un ARNcr y un ARNtracr.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un procedimiento para generar un virus modificado de interés que tiene dos o más propiedades víricas deseadas como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, la endonucleasa se inactiva por calor o se elimina. En algunos aspectos, la digestiónin vitrocomprende además espermidina.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un procedimiento para generar un virus modificado de interés que tiene dos o más propiedades víricas deseadas como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, el procedimiento comprende además la transformación del genoma vírico modificado en una célula hospedadora. En algunos aspectos, el procedimiento comprende además el uso de un kit de encapsidaciónin vitropara encapsidar el genoma vírico modificado en partículas víricas.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un virus modificado generado por cualquiera de los procedimientos divulgados en el presente documento.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona composiciones de cualquiera de los virus de modificación divulgados en el presente documento generados por cualquiera de los procedimientos de modificación divulgados en el presente documento.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un kit para la modificación de moléculas de ácido nucleico vírico que comprende: una nucleasa guiada por ARN recombinante purificada; una exonucleasa 5' a 3' no termoestable aislada que carece de actividad exonucleasa 3'; un agente de aglomeración; una ADN polimerasa sin desplazamiento de cadena termoestable aislada con actividad exonucleasa 3', o una mezcla de dicha ADN polimerasa con una segunda ADN polimerasa que carece de actividad exonucleasa 3'; una ligasa termoestable aislada; una mezcla de dNTP; y un tampón adecuado. En algunos aspectos, el kit comprende además ARN guía diseñados a medida. En algunos aspectos, el kit comprende además moléculas de ácido nucleico sintetizadas diseñadas a medida para servir como fragmento de ADN insertado en una reacción de ensamblaje. En algunos aspectos, el kit comprende además células hospedadoras competentes para la transformación. En algunos aspectos, el kit comprende además ácidos nucleicos genómicos víricos aislados.

En algunos aspectos, el sistema descrito en el presente documento es tal que el ácido nucleico vírico recombinante es capaz de producir partículas víricas no naturales con al menos una propiedad vírica mejorada en comparación con el ácido nucleico vírico no modificado. En algunos ejemplos, la propiedad vírica mejorada se selecciona del grupo que consiste en la gama de hospedadores, el ciclo lítico vírico, la adsorción, la adhesión, la inyección, la replicación y el ensamblaje, la lisis, el tamaño de explosión, la evasión inmunitaria, la estimulación inmunitaria, la desactivación inmunitaria, la dispersión de biopelículas, la resistencia bacteriana a fagos, la sensibilización bacteriana a antibióticos, la modulación de factores de virulencia y la digestión o edición selectiva del genoma del hospedador.

En algunos aspectos, el procedimiento descrito en el presente documento se utiliza como procedimiento de corrección de errores para corregir secuencias en ácidos nucleicos aislados. Los procedimientos convencionales de corrección de errores se basan en la PCR, que tiene dos problemas inherentes: 1) la PCR puede introducir mutaciones adicionales no deseadas en el ácido nucleico y 2) la PCR, en este contexto, tiene una restricción de tamaño de aproximadamente 5 kb. Por lo tanto, los procedimientos convencionales de corrección de errores basados en la PCR no pueden realizarse de forma fiable en plásmidos de más de 5 kb, ya sea como resultado de mutaciones generadas por la PCR o por un fallo en la amplificación. El procedimiento descrito en el presente documento de modificaciónin vitrode una secuencia de ácido nucleico evita la necesidad de amplificación por PCR, lo que elimina la restricción de tamaño y elimina la posibilidad de mutaciones generadas por PCR.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimientoin vitrode modificación de una secuencia de ácido nucleico que comprende el aislamiento de un ácido nucleico; la digestiónin vitrode una región del ácido nucleico utilizando una nucleasa guiada por ARN; y el ensamblaje de un ácido nucleico recombinante mediante la inserción de un fragmento de ADN o ARN en el ácido nucleico digerido. En un aspecto, la digestiónin vitroes una digestión enzimática guiada por ARN. En otro aspecto, la digestión enzimática se realiza utilizando Cas9 o una enzima derivada de Cas9. En un aspecto adicional, la digestión comprende además ARN selectivos. En otro aspecto, la digestión comprende además espermidina. En un aspecto específico, los ARN selectivos son ARNg, ARNcr y/o ARNtracr. En otro aspecto, tras la digestión, la nucleasa guiada por ARN se inactiva por procedimientos convencionales, tales como la exposición al calor, por ejemplo, como mínimo a 80 °C. Además, o como alternativa, la nucleasa guiada por ARN se elimina mediante procedimientos convencionales, tales como, por ejemplo, la extracción con fenol-cloroformo.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimientoin vitrode modificación de una secuencia de ácido nucleico que comprende el aislamiento de un ácido nucleico; la digestiónin vitrode una región del ácido nucleico utilizando una nucleasa guiada por ARN; y el ensamblaje de un ácido nucleico recombinante mediante la inserción de un fragmento de ADN o ARN en el ácido nucleico digerido. En algunos ejemplos, el ensamblaje se realizain vitroen un único recipiente con una mezcla de componentes que comprende (a) una exonucleasa 5' a 3' no termoestable aislada que carece de actividad exonucleasa 3', (b) un agente de aglomeración, (c) una ADN polimerasa sin desplazamiento de cadena termoestable aislada con actividad exonucleasa 3', o una mezcla de dicha ADN polimerasa con una segunda ADN polimerasa que carece de actividad 3' exonucleasa, (d) una ligasa termoestable aislada, (e) una mezcla de dNTP, y (f) un tampón adecuado, en condiciones que sean eficaces para la inserción del fragmento en el ácido nucleico vírico digerido para formar un ácido nucleico recombinante. En algunos aspectos, la exonucleasa es una exonucleasa T5 y la puesta en contacto se realiza en condiciones isotérmicas y/o el agente de aglomeración es PEG y/o la ADN polimerasa sin desplazamiento de cadena es la ADN polimerasa Phusion™ o la ADN polimerasa VENT®y/o la ligasa es la Taq ligasa. En algunos ejemplos, el ensamblajein vitrose realiza mediante ensamblaje de Gibson en una etapa o isotérmico. En algunos ejemplos, el ensamblajein vitrose realiza mediante ensamblaje Gibson en dos etapas.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimientoin vitrode modificación de una secuencia de ácido nucleico que comprende una nucleasa guiada por ARN. En algunos ejemplos, la nucleasa guiada por ARN es una Cas9 de tipo II. En algunos ejemplos, la nucleasa guiada por ARN es Cas9 o una enzima derivada de Cas9. En algunos ejemplos, la nucleasa guiada por ARN es una enzima Cas9 recombinante aislada o una enzima derivada de Cas9. En algunos ejemplos, hay al menos un ARN selectivo. En algunos ejemplos, hay dos ARN selectivos. En algunos ejemplos, el<a>R<n>selectivo es un ARN guía (ARNg) quimérico o un conjunto de un ARNcr y un ARNtracr. En algunos ejemplos, la reacción de digestiónin vitroutiliza dos ARNg. En algunos ejemplos, la reacción de digestiónin vitroutiliza dos conjuntos de ARNcr y ARNtracr.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimientoin vitrode modificación de una secuencia de ácido nucleico que comprende una etapa de digestiónin vitro. En algunos ejemplos, tras la digestión, la nucleasa guiada por ARN se inactiva mediante procedimientos convencionales, tales como la exposición al calor, por ejemplo, como mínimo a 80 °C. En algunos ejemplos, tras la digestión, la nucleasa guiada por ARN se elimina mediante extracción con fenol-cloroformo. En algunos ejemplos, tras la digestión, la nucleasa guiada por ARN se elimina mediante otros procedimientos de extracción bien conocidos en la técnica.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimientoin vitrode modificación de una secuencia de ácido nucleico que da como resultado un ácido nucleico modificado. En algunos ejemplos, el ácido nucleico modificado se transforma en una célula hospedadora. En algunos ejemplos, la célula hospedadora esE. coli, P. aeruginosa, S. cerevisiae,Vnatriegens, B. subtilisu otro microorganismo bien conocido en la técnica. En algunos ejemplos, la transformación se realiza por choque térmico, electroporación, biolística, bombardeo de partículas, conjugación, transducción, lipofección u otro procedimiento establecido bien conocido en la técnica.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimientoin vitrode modificación de una secuencia de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico aislado. En algunos ejemplos, el ácido nucleico es un genoma completo aislado de una célula hospedadora. En algunos ejemplos, la célula hospedadora esE. coli, S. cerevisiae, B. subtilis, V. natriegens, P aeruginosau otro microorganismo conocido. En algunos ejemplos, el ácido nucleico es un plásmido. En algunos ejemplos, el plásmido se aísla de una célula hospedadora. En algunos ejemplos, el ácido nucleico de interés se ha clonado en un plásmido, transformado en una célula hospedadora y aislado antes de la modificaciónin vitromediante el procedimiento descrito en el presente documento.

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimientoin vitrode modificación de una secuencia de ácido nucleico que comprende el aislamiento de un ácido nucleico. En algunos ejemplos, el ácido nucleico aislado es un genoma o un plásmido. En algunos ejemplos, el genoma o plásmido aislado tiene al menos 6 kb, al menos 7 kb, al menos 8 kb, al menos 9 kb, al menos 10 kb, al menos 12 kb, al menos 15 kb, al menos 20 kb, al menos 25 kb o al menos 28 kb. En algunos ejemplos, el genoma o plásmido aislado tiene entre 6 kb y 1 MB. En algunos ejemplos, el genoma o plásmido aislado está entre: 6 kb y 10 kb, 8 kb y 15 kb, 12 kb y 20 kb, 15 kb y 22 kb, 20 kb y 25 kb, 22 kb y 28 kb, 25 kb y 30 kb, 25 kb y 50 kb, o de 40 kb a 100 kb.

La divulgación en todos sus aspectos se ilustra con más detalle en los siguientes ejemplos. No obstante, los ejemplos no limitan el alcance de la divulgación, que queda definido por las reivindicaciones adjuntas. La exposición de los procedimientos generales que se ofrece en el presente documento sólo tiene fines ilustrativos. Otros procedimientos alternativos y realizaciones serán evidentes para los expertos en la materia tras el análisis de la presente divulgación.

Ejemplos

Ejemplo I

Modificación de un genoma víricoin vitro

El genoma vírico de LUZ19 de ADNbc de 43 kb (n.° de registro NC_010326.1) se aisló de partículas víricas, por ejemplo, usando el kit de aislamiento de ADN de fagos Norgen Biotek o cualquier otro procedimiento conocido por los expertos en la materia (figura 2A). Se realizó una digestión específica de sitio utilizando la nucleasa Cas9 guiada por a Rn y ARNg transcritosin vitroen dos ubicaciones independientes. El ADN genómico no digerido de 43 kb migra considerablemente menos que la banda más grande de la escalera de ADN (10 kb). La digestión del genoma lineal produce fragmentos de tres tamaños: aproximadamente 39 kb, aproximadamente 4,3 kb y aproximadamente 200 pb. Los ARNg selectivos se utilizaron en exceso y obstruyeron el fragmento de 200 pb (figura 2B). Se amplificó por PCR un fragmento degp7de OKF77 (figura 2C) utilizando cebadores que portan colas 5' con 100 pb de homología con las regiones directamente cadena arriba y cadena abajo de los sitios de digestión de LUZ19. Se utilizó el procedimiento de ensamblaje de Gibson para integrar sin discontinuidades el fragmento degp7de OKF77 amplificado por PCR (SEQ ID NO:8) en el genoma digerido de LUZ19 para sustituir la región nativade gp7(SEQ ID NO:23) (figura 2D). Se observa poco fondo porque la acción de rotura de Cas9 da lugar a roturas bicatenarias de extremos romos que carecen de la homología necesaria para el ensamblaje de Gibsonin vitro. Los genomas editadosin vitrose transformaron directamente en células hospedadoras para producir partículas víricas funcionales (figura 2E). La integración del fragmento del gen de OKF77 en los virus recuperados se verificó mediante PCR con cebadores internos y externos a la región de modificación. Se utilizó ADNg de LUZ19 sin editar como control negativo, mientras que todos los virus experimentales contenían el nuevo fragmento del gen de OKF77 (últimos 7 carriles).

Estos datos presentan un ejemplo de puesta en práctica de una modificación víricain vitro paraeditar el genoma de un fago líticodePaeruginosa.La modificación de fagos como LUZ19 no puede realizarse por procedimientos convencionales debido a los efectos de toxicidad en hospedadores bacterianos heterólogos, tales comoE. coli, a lafalta de marcadores seleccionables adecuados para virus virulentos y a la falta de sitios de enzimas de restricción convencionales exclusivos dentro del genoma de LUZ19. Por lo tanto, estos datos demuestran cómo el procedimiento de modificaciónin vitrodescrito en el presente documento permite la modificación directa y rápida de genomas víricos que, de otro modo, no serían genéticamente tratables.

Para las transformaciones en P.aeruginosa,se prepararon célulasde P aeruginosaquímicamente competentes como se describe en Irani y Rowe (Irani, V.R. y Rowe, J.J., BioTechniques, 1997, 22, 54-56). Básicamente, se diluyó un cultivo iniciador de 3 ml de células deP aeruginosaen 400 ml de LB fresco. El cultivo se realizó a 37 °C con agitación (220 rpm) hasta una DO<600>= 0,6, a menos que se indique lo contrario. Las células se enfriaron durante 10 minutos en hielo, se transfirieron a un frasco de centrífuga de 500 ml y se sedimentaron en una centrífuga refrigerada (4 °C) a 5000 g durante 20 minutos. El sedimento bacteriano se lavó con 100 ml de MgCh 150 mM helado antes de dividirlo en dos tubos cónicos de 50 ml y sedimentarlo a 5000 g en una centrifugadora refrigerada (4 °C). Las células se lavaron una vez más con 30 ml de MgCh 150 mM antes de centrifugarlas y resuspenderlas en 15 ml de MgCh 150 mM frío. La suspensión celular se incubó en hielo durante 1 h antes de ser centrifugada a 4 °C y se resuspendió en 4 ml de MgCh 150 mM refrigerado. Se situaron partes alícuotas de 200 pl en tubos de microcentrífuga individuales de 1,5 ml y se mantuvieron en hielo durante un máximo de 2 días. Se añadió ADN purificado a cada parte alícuota de células, se agitó brevemente en vórtice y se incubó en hielo durante 1 h más. Las células se sometieron a un choque térmico a 50 °C durante 3 min y se volvieron a situar directamente en hielo durante 5 min antes del cultivo en placa. Cada transformación se añadió a 4 ml de agar LB superior a 50 °C y se cultivó en una placa LB precalentada. Las placas se invirtieron y se incubaron a 37 °C durante la noche para permitir la formación de placas.

Ejemplo II

Virus modificado con gama ampliada de hospedadores

Se cribó un gran banco clínico (282 aislados deP aeruginosa)para determinar la susceptibilidad a los fagos LUZ 19 y LKD16, utilizando el ensayo en placa con doble capa de agar. Sesenta y seis cepas pudieron ser infectadas por al menos uno de los dos virus, con 18 y 6 cepas infectadas únicamente por LUZ19 y LKD16, respectivamente. Así pues, se seleccionó LUZ19 como chasis para ensayar los elementos genéticos de LKD16 responsables de la ampliación de la gama de hospedadores. La genómica comparativa entre los dos virus indicó que el producto génico 18(gp18)de LKD16 tenía una secuencia distinta del homólogo degp18de LUZ 19, lo que indica que puede ser responsable de la determinación de la gama de hospedadores. El genoma vírico se aisló a partir de partículas víricas de LUZ19 como se ha descrito anteriormente. Se realizó una digestión específica utilizando una nucleasa dependiente de ARN y ARNg transcritosin vitropara eliminar el gengp18de LUZ19. Elgp18de LKD16 se amplificó por PCR con extremos homólogos de LUZ19 para su integración. Se utilizó el procedimiento de ensamblaje de Gibson para integrar sin discontinuidades elgp18de LKD16 amplificada por PCR (SEQ ID NO:7) en el genoma digerido de LUZ 19 con el fin de reemplazar la secuencia nativa degp18(<s>E<q>ID NO:50). Los genomas modificadosin vitrose transformaron directamente en células hospedadoras para producir partículas víricas funcionales. El virus LUZ19 modificado que portaba el gengp18de LKD16 fue capaz de infectar todas las cepas normalmente infectadas por el fago LUZ19, así como 3 cepas previamente infectadas sólo por LKD16, lo que demuestra la ampliación de la gama de hospedadores (figura 3B y 6b ). Esto demuestra quegp18es un elemento genético responsable de la gama diferencial de hospedadores de LKD 16 y que el virus<l>U<z>19 diseñado, que porta este gen, es más capaz de replicarse en más cepas hospedadoras.

Estos datos demuestran la aplicación del procedimiento de modificaciónin vitrodivulgado en el presente documento a un genoma vírico que, de otro modo, no sería genéticamente tratable, que dio como resultado la propiedad vírica mejorada de ampliar la gama de hospedadores. La capacidad de diseñar racionalmente bacteriófagos con una gama ampliada de hospedadores es una propiedad de gran valor a la hora de desarrollar virus que destruyan bacterias.

Ejemplo III

Virus modificado con gama de hospedadores de un género vírico

Se utilizó LUZ19 y/o un derivado de LUZ19 como material de partida para experimentos de evolución o coinfección con el fin de identificar dianas para colapsar la gama de hospedadores del género vírico OKMV en un único virus representativo. Los experimentos de cotransformación o coinfección se realizaron en un hospedador permisivo (PAO1K) o no permisivo (resistente) (PA7410 o PA7649) (figura 4A). Tanto la coinfección como la cotransformación se realizaron en presencia de LKD16 o OKMV, respectivamente. La gama de hospedadores se comprobó mediante el ensayo en placa con doble capa de agar con las cepas bacterianas indicadas. Tras el cribado para ampliar la gama de hospedadores en la cepa de interés, el fago evolucionado se hizo pasar 3-5 veces alternativamente a través de cepas permisivas y selectivas (una cepa que sólo está infectada por LUZ19 - PA7632). Los fagos evolucionados se amplificaron en PAO1K, se purificó el ADNg y se secuenció. Se utilizó la genómica comparativa entre LUZ19 y LUZ19 evolucionado capaz de infectar cepas previamente sensibles sólo a LKD16 o OKMV para identificar la mutación puntual responsable de la ampliación de la gama de hospedadores (figura 4B).

Se cribó un gran banco clínico (282 aislados de Paeruginosa)en busca de susceptibilidad al género de virus OKMV, utilizando el ensayo en placa con doble capa de agar. Tres fagos (LUZ19, LKD16 y OKMV) mostraron una gama diferencial de hospedadores y fueron capaces de infectar 67 cepas, siendo LUZ19 el que infectó a la mayoría de los aislados clínicos (figura 4C). Seis cepas clínicas aisladas (PA7245, PA7255, PA7427,<p>A7503, PA7686 y PA7410) sólo fueron sensibles a LKD16 y una cepa clínica aislada sólo fue sensible a OKMV (PA7649). Así pues, se seleccionó LUZ19 como chasis para experimentos de evolución/coinfección/cotransformación con el fin de obtener una variante capaz de infectar todos los aislados clínicos sensibles al género de OKMV. La genómica comparativa reveló que varias mutaciones puntuales eran necesarias para que LUZ 19 infectara cepas susceptibles únicamente a LKD16 o OKMV: (i)gp13C17Y (posición 50 de SEQ ID No :1) es necesaria para la infección de PA7427; (ii)gp18D36Y (posición 106 de S<e>Q ID NO:50) es necesaria para la infección de PA7245, PA7503 y PA7686;gp38D82<g>y 183S (posiciones 245 y 247-248 de S<e>Q ID NO:2 respectivamente) permiten la infección de PA7410 y PA7649; (iv)gp40N253D (posición 757 de SEQ ID NO:3) permite la infección de PA7255 (figura 4B). La modificación iterativa de las mutaciones mencionadas en el chasis de LUZ19 utilizando el procedimiento de modificaciónin vitrodescrito en el presente documento dio como resultado un LUZ19 de amplia gama de hospedadores (WHR LUZ19) capaz de infectar todos los aislados clínicos susceptibles al fago del género de OKMV (figura 4C).

Estos datos proporcionan un ejemplo del uso del procedimiento de modificaciónin vitrodivulgado en el presente documento para colapsar la gama de hospedadores de un género vírico en un único genoma vírico, identificando, en primer lugar, las mutaciones genéticas responsables de las diferencias en la gama de hospedadores mediante experimentos de evolución, cribado, secuenciación, genómica comparativa y cualquier combinación de los mismos.

Ejemplo IV

La mejora de la replicación vírica favorece la alteración temprana de la biopelícula

En otro ejemplo, la evolución vírica y la genómica comparativa indicaron que un fago LUZ19 evolucionado con una mutación LSS<a>dentro de la proteína tubular de la cola B (Gp34) se replicaba a mayor velocidad debido a un mayor tamaño de explosión (figura 5b ). Para validar que la mutación Gp34 LSSA mejoraba las propiedades víricas, se aisló el genoma vírico de LUZ19 a partir de partículas víricas. Se realizó una digestión específica de sitio utilizando una nucleasa dependiente de ARN y ARNg transcritosin vitropara eliminar el gengp34(SEQ ID NO:4). El gengp34LSSA, que porta una deleción del codón de leucina en la posición de aminoácido 55 (Gp34 LSSA, posición 163-165 de SEQ ID NO:4) se amplificó por PCR a partir de un fago LUZ19 evolucionado. Se utilizó el procedimiento de ensamblaje de Gibson para integrar sin discontinuidades el gengp34LSSA amplificado por PCR en el genoma digerido de LUZ19. Los genomas transformadosin vitrose transformaron directamente en células hospedadoras para producir partículas víricas funcionales. El virus LUZ19 modificado que porta Gp34 LSSA fue capaz de difundirse y lisar bacterias. Se utilizaron ensayos en placa con doble capa de agar para demostrar que el fago LUZ19 que portaba la mutacióngp34LSSA (fago*) tenía una zona de aclaramiento mayor que el LUZ19 de tipo salvaje. Se tomaron imágenes y se midieron las zonas de aclaramiento durante un periodo de dos días (figura 5B). La ampliación de la anchura de la zona de lisis indica que los virus que portan mutacionesGp34LSSA son más capaces de difundirse y lisar bacterias. El ensayo de biopelícula con violeta de cristal mide la acumulación de la biopelícula como medida de la incorporación de violeta de cristal (figura 5C). Las muestras tratadas con virus que portaban mutacionesgp34L55A presentaron una reducción significativa de la biopelícula en comparación con los virus con un gengp34de tipo salvaje. Se presenta una ilustración que muestra la localización de la mutacióngp34(asterisco) en comparación con el genoma de LUZ19 de tipo salvaje (figura 5D). Se utilizaron ensayos convencionales conocidos en la técnica para medir la adsorción vírica, el periodo latente y el tamaño de explosión tanto para el tipo salvaje como para los mutantesgp34LSSA. Estos datos indicaban que los virus que portaban una mutacióngp34L55A tenían un tamaño de explosión mucho mayor (figura 5E).

Estos datos proporcionan un ejemplo del uso del procedimiento de modificaciónin vitrodivulgado en el presente documento para crear un virus con las propiedades víricas mejoradas de mayor lisis bacteriana, tamaño de explosión, replicación y alteración temprana de la biopelícula.

Ejemplo V

Virus con modificaciones iterativas con alteración temprana de biopelículas y ampliación de la gama de hospedadores

El genoma vírico recombinante de LUZ19LKD16gpi8 con una gama de hospedadores ampliada creado en el ejemplo II se aisló a partir de partículas víricas. Se realizó una digestión específica para eliminar elgp34(SEQ ID NO:4) utilizando una nucleasa dependiente de ARN y ARNg transcritosin vitro.La mutacióngp34ALeu55 que aumenta la actividad lítica (posición 163-165 de SEQ ID NO:4) caracterizada en el ejemplo IV se amplificó por PCR y se ensambló en el genoma vírico de LUZ19LKD16gpi8 digerido mediante ensamblaje de Gibson. Los genomas diseñadosin vitrode forma iterativa se transformaron directamente en células hospedadoras para producir partículas víricas funcionales, es decir, el virus LUZ19 diseñado que porta tanto el gengp18de LKD16 como la mutacióngp34ALeu55 (LUZ19\KD16gpis).

Se analizó el virus LUZ19*LKD16gpi8 en busca de propiedades víricas mejoradas, utilizando ensayos en placa con doble capa de agar, de biopelícula y de fijación de queratinocitos humanosin vitro.La figura 6D demuestra que LUZ19* LKD<16>gpi<8>había aumentado la gama de hospedadores. Se comparó LUZ19*LKD16gpi8 con LUZ19 nativo en cuanto a su capacidad para alterar biopelículas preformadas de PaeruginosaMDR. En concreto, LUZ19*LKDi6gpí8 y LUZ19 de tipo salvaje se incubaron con una biopelícula de Paeruginosay la alteración se midió utilizando violeta de cristal. La figura 6E demuestra que LUZ19*LKD16gpi8 tiene una mayor capacidad para alterar biopelículas preformadas deP. aeruginosaMDR en comparación con LUZ19 de tipo salvaje. Se analizó la eficacia del virus LUZ19*LKD16gpi8 en el tratamiento con fagos contra bacterias adheridas a queratinocitos humanos. En concreto, P.aeruginosase adhirió a una monocapa de células HaCaT A continuación, las células se incubaron con LUZ19*LKD16gpi8 o LUZ19 de tipo salvaje. Los resultados indicaron que el fago LUZ19*_KD16gpi8 era más capaz de eliminar células deP aeruginosaresistentes a múltiples fármacos ("multi-drug resistant", MDR) adheridas a queratinocitos humanos (véase la figura 6F).

Estos datos proporcionan un ejemplo de cómo el procedimiento de modificaciónin vitrodescrito en el presente documento se utilizó en un sistema para modificar de forma iterativa bacteriófagos con múltiples propiedades víricas mejoradas independientes, tales como una gama de hospedadores ampliado y un mayor tamaño de explosión. Y lo que es más importante, estas etapas de modificación no podrían realizarse tan directamente o en absoluto utilizando procedimientos convencionales. Además, estos datos demuestran que el procedimiento de modificaciónin vitrodivulgado en el presente documento se utilizó secuencialmente para rondas iterativas de modificación, una propiedad importante para aplicaciones de biología sintética.

Ejemplo VI

Virus con modificaciones iterativas con cargas activas dispersantes de biopelículas y una gama ampliada de hospedadores que cubren un género vírico completo

Se clonaron exopolisacáridos (EPS) despolimerasas o modulinas solubles en fenol (PSM) en LUZ19 sustituyendogp49(SEQ ID NO:25), utilizando el procedimiento de modificaciónin vitrodivulgado en el presente documento, para determinar su capacidad de dispersar biopelículas maduras (figura 7). Con el fin de diseñar LUZ19 y WHR LUZ19 para que expresasen la despolimerasa de la matriz extracelular o polipéptidos tensioactivos, se eliminó elgp49(SEQ ID NO:25) de LUZ19 o WHR LUZ19 mediante digestión utilizando una nucleasa dependiente de ARN, en este caso Cas9, y ARNg transcritosin vitroy, posteriormente, se sustituyó por el gen de interés (GOI) flanqueado por el promotorPgp32(SEQ ID NO:21) y el terminadorTgp32(SEQ ID NO:22) principales de la cápside utilizando el ensamblaje de Gibson (figura 7A y 7C). En el caso de LUZ19 de tipo silvestre, los GOI fueron EPS despolimerasas (Pp15gp44 -gp44de la espícula de la cola dePseudomonas pudita015 (SEQ ID NO:14); NTUgp34 -gp34de la espícula de la cola del fago NTU deKlebsiella pneumoniae(s Eq ID NO:13); LKA1gp49 -gp49de la espícula de la cola del fago LKA1de Paeruginosa (SEQ ID NO:12), modulinas solubles en fenol surfactantes deStaphylococcus epidermidis(PSMa, SEQ ID NO:18) yStaphylococcus aureus(PSMa3 (SEQ ID NO:16) y PSMb2 (SEQ ID NO:17)) y surfactina DspB deAggregatibacter actinomycetemcomitans(SEQ ID NO:15) (figura 7B). En el caso de WHR LUZ19, los GOI fueron la EPS despolimerasa Pp15gp44 (SEQ ID NO:14) y la surfactina SePSMa (SEQ ID NO:18) (figura 7D). Los fagos diseñados se amplificaron dentro de su célula hospedadora apropiada, se aislaron y se verificaron mediante secuenciación.

La capacidad de los fagos modificados para dispersar la biopelícula madura se ensayó contra una biopelícula de 24 h cultivada en un dispositivo MBEC utilizando 100 fagos por pocillo durante 3 h. Brevemente, los cultivos de una noche deP aeruginosase diluyeron (1:100) en medio mínimo M63 suplementado con sulfato de magnesio (1 mM), glucosa (al 0,2 %) y casaminoácidos (al 0,5 %), y luego se añadieron a placas de microvaloración estériles (150 pl por pocillo). La tapa con clavijas se introdujo en la placa de microvaloración. Tras 24 h de incubación a 37 °C, la tapa con clavijas se trasladó a una placa de microvaloración que contenía 160 pl de MG63 completo con 100 fagos por pocillo. Tras 3 h de incubación a 37 °C, la tapa con clavijas se lavó 3 veces con agua, se secó y se tiñó con 200 pl de violeta de cristal al 0,5 %. Posteriormente, las placas se enjuagaron con agua para eliminar el violeta de cristal no unido y se secaron. El colorante se disolvió en 200 pl de ácido acético al 30 % y la absorbancia se midió a DO = 550 nm.

DspB, que es un tensioactivo activo contra las biopelículasde E. coli,sirvió como control negativo ya que no tiene actividad contraP. aeruginosa.Dos cargas activas (Pp15gp44 y SePSMa) mostraron una marcada actividad antibiopelícula (figura 7B). Cabe destacar que las PSM, que son surfactinas con una conocida actividad antibiopelícula en bacterias grampositivas, nunca habían demostrado dispersar la biopelículadePaeruginosa.Estas cargas activas se introdujeron por modificación en WHR LUZ19 para determinar si un fago con una amplia gama de hospedadores puede modificarse para que muestre actividad dispersora de biopelículas. Los resultados demuestran que los WHR LUZ19 que codifican Pp15gp44 o SePSMa mantienen su actividad dispersora de biopelículas (figura 7D) y la capacidad de infectar todos los aislados clínicos susceptibles al género de virus de O-KMV (figura 7E, 7F).

Estos datos proporcionan un ejemplo de cómo el procedimiento de modificaciónin vitrodescrito en el presente documento puede utilizarse en un sistema para diseñar de forma iterativa bacteriófagos con múltiples propiedades víricas mejoradas independientes, tales como las propiedades no limitantes de dispersión de biopelículas y gama de hospedadores.

Ejemplo VII

Virus modificados que expresan cargas activas sensibilizadoras a los antibióticos

Usando el procedimiento de modificaciónin vitrodivulgadas en el presente documento, LUZ19 fue modificado para que expresase lisinas a partir de los virus de ARNmc PRR1 y MS2. Las lisinas de los fagos de ARNmc PRR1 (SEQ ID No :20) o MS2 (SEQ iD NO:19) se introdujeron en el locusgp49de LUZ19 (SEQ ID NO:25) flanqueadas por el promotorPgp32(SEQ ID NO:21) y el terminadorTgp32(SEQ ID NO:22) principales de la cápside para determinar su capacidad de inhibir la aparición de bacterias resistentes al fago (figura 8<a>). Estas lisinas inhiben la formación de una nueva pared celular al unirse a enzimas importantes para la síntesis de la pared celular e inactivarlas, y supuestamente sensibilizan a las bacterias a otros antimicrobianos, en especial a los antibióticos dirigidos a la pared celular, tales como la carbenicilina.

La construcción se realizó como se ha descrito anteriormente utilizando el procedimiento de modificaciónin vitrodescrito en el presente documento. Los fagos diseñados se amplificaron dentro de su célula hospedadora apropiada, se aislaron y se verificaron mediante secuenciación. La capacidad de los fagos modificados para inhibir la aparición de bacterias resistentes al tratamiento con fagos en presencia de carbenicilina a 1/5 x CMI se comprobó en un ensayo de muerte microbiana en función del tiempo convencional (figura 8B, 8C). Los resultados demuestran que el LUZ19 modificado que expresa lisinas de fagos de ARNmc en combinación con carbenicilina a concentraciones subinhibidoras (1/5 x MIC) previene un nuevo crecimiento bacteriano tras el tratamiento con el fago.

Estos datos proporcionan un ejemplo del empleo del procedimiento de modificaciónin vitrodivulgado en el presente documento para generar un virus con propiedades víricas mejoradas, específicamente, en este caso, la prevención del desarrollo de resistencia a fagos en bacterias.

Ejemplo VIII

Virus modificado que expresa una carga activa de proteína antimicrobiana específica de especie

Utilizando el procedimiento de modificaciónin vitrodivulgado en el presente documento, LUZ19 fue modificado para expresar la proteína antimicrobiana PyoS5 derivada de Paeruginosa.La bacteriocina PyoS5 es una proteína antimicrobiana específica de especie producida por una cepa de Paeruginosapara impedir el crecimiento de cepas competidoras deP aeruginosa.El ADNg de la cepa PA01de P aeruginosase utilizó como molde para amplificar por PCRpyoS5(SEQ ID NO:6) antes de clonarlo en el locusgp49de LUZ19 (SEQ ID NO:25) flanqueado por el promotorPgp32(S<e>Q ID NO:21) y el terminadorTgp32(SEQ ID NO:22) principales de la cápside (figura 9A). PyoS5 se une al receptor de pioquelina FptA, ampliamente dispersado, antes de experimentar cambios conformacionales para crear poros dentro de la membrana deP aeruginosa.

LUZ19+pyoS5 se creó como se ha descrito anteriormente utilizando el procedimiento de modificaciónin vitrodescrito en el presente documento. Los fagos diseñados se amplificaron en el hospedador susceptible PA01, se aislaron y se verificaron mediante secuenciación. Se eligió la cepa bacteriana PA7416 para el análisis porque se sabe que la cepa de laboratorio PA01 es resistente a PyoS5, aunque el análisis por medios informáticos indicó que la cepa<m>D<r>PA7416 de P.aeruginosaera susceptible al fago LUZ19 y codificaba el receptor FptA de PyoS5.

La capacidad de los fagos modificados para inhibir la aparición de bacterias PA7416 resistentes al tratamiento con fagos se ensayó en un ensayo convencional de muerte microbiana en función del tiempo. Los resultados demuestran que, aunque LUZ19 de tipo salvaje inhibe inicialmente el crecimiento de PA7416, las bacterias se vuelven rápidamente resistentes y vuelven a crecer al cabo de 8-12 h (figura 9B). Sin embargo, elLUZ19+pyoS5modificado inhibe el nuevo crecimiento bacteriano de PA7416 durante más de 24 h tras el tratamiento con fagos (figura 9C, 9D).

Ejemplo IX

Sistema de modificación iterativa de bacteriófagos para crear un producto antimicrobiano

Usando el procedimiento de modificaciónin vitrodivulgado en el presente documento, los genomas de bacteriófagos pueden ser rápidamente modificados sin una exhaustiva manipulación genética de la cepa hospedadora. La combinación de estudios de mutaciones víricas y técnicas de selección bien conocidas por los expertos en la materia, con la secuenciación completa del genoma, la genómica comparativa y el procedimiento de modificaciónin vitrodivulgado crea un sistema nuevo y mejorado para desarrollar antimicrobianos nuevos y mejorados. El sistema se basa en la mejora iterativa de 1, 2 o más de 2 propiedades distintas en un único chasis vírico para crear un antimicrobiano de base vírica. Se divulga la purificación secuencial y la edición del genoma de LUZ19 para mejorar determinadas propiedades víricas (figuras 6, 7 y 10), aunque esta técnica podría extenderse a otros múltiples bacteriófagos deP aeruginosau otros bacteriófagos que infectan cualquier otra cepa o especie de bacteria. Además, esta técnica podría utilizarse para mejorar las propiedades de múltiples bacteriófagos individuales que infectan a la misma especie bacteriana para crear un cóctel de bacteriófagos superior que prevenga o trate las infecciones bacterianas, la contaminación o altere un microbioma.

Estos datos demuestran cómo la modificaciónin v itrojunto con la secuenciación del genoma, la genómica comparativa y los estudios de mutación/selección vírica pueden realizarse secuencialmente para lograr mejoras por etapas o cambios por modificación para incorporar propiedades víricas mejoradas de interés (figura 10).

Ejemplo X

Procedimientos

Los ARN guía (ARNg) se sintetizaron y purificaron utilizando un kit de transcripciónin v itrodisponible en el mercado, tal como el kit MEGAshortscript T7 (Thermo Fisher). Los ARN guía se diseñaron utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica (figura 15).

Se diluyen los ARNg transcritosin v itrohasta obtener una disolución madre de trabajo de 500 ng/pl.

Las reacciones de ensamblaje se realizan sin nucleasa guiada por ARN purificada, tal como Cas9. La Cas9 purificada (SEQ ID NO:31) se obtuvo a partir de la expresión de un plásmido que comprendía una secuencia génica que codificaba una Cas9 marcada con His (SEQ ID NO:27) y su purificación mediante procedimientos conocidos de purificación por afinidad con níquel. Opcionalmente, se puede usar un ARNg que corte primero la parte más interna del genoma para las digestiones iterativas.

Mezcla de reacción completa:

Se lleva a cabo la etapa 1 de la reacción de ensamblaje y se incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos. Etapa 1 Mezcla de reacción:

Se incuba en hielo durante 10 minutos.

Se incuba a 37 °C durante 2 minutos.

Se añaden 4 |jl de enzima Cas9 (0,45 mg/ml). Se incuba a 37 °C durante 30 minutos.

Se lleva a cabo la reacción de la etapa 2, que consiste en la adición de un segundo ARNg y enzima Cas9 adicional.

Etapa 2 Mezcla de reacción:

Se incuba la reacción de la etapa 2 a 37 °C durante 30 minutos. Se pueden añadir etapas adicionales para digerir el genoma en más de 2 localizaciones.

Se inactiva la enzima Cas9 incubando a 80 °C durante 10 minutos. Se puede llevar a cabo una purificación opcional mediante extracción con fenol-cloroformo (aumenta la eficiencia del ensamblaje de fragmentos en el ensamblaje de Gibson) u otros procedimientos de inactivación, desactivación o purificación bien conocidos en la técnica.

Se procesan 5 j l de la muestra en gel de agarosa para verificar el corte correcto.

Para el ensamblajein v itroutilizando el ensamblaje de Gibson, se utilizó una concentración apropiada de ADN de inserción generadoin v itroy digerido de acuerdo con el protocolo de ensamblaje Gibson de NEB.

Tras el ensamblajein v itro ,opcionalmente se transforma en células hospedadoras para amplificar el genoma diseñado, la sección del genoma o recuperar el virus diseñado.

Ejemplo XI

Modificación del fago M13 deE. co li

Utilizando el procedimiento de modificaciónin v itrodivulgado en el presente documento, se modificó un virus que infecta aE sch e rich ia c o lipara expresar el indicador fluorescentep a p rik a(SEQ ID NO:5). La figura 11A muestra un esquema del enfoque de modificaciónin v itropara incorporar el gen de la proteína fluorescentep a p rikaen el genoma del fago M13 deE. c o li.Este proceso de modificación se diseñó para generar un indicador fluorescente que expresara un fago lisogénico, lo que constituiría una propiedad vírica mejorada, ya que virus similares se han utilizado como diagnósticos. El genoma vírico de M13 (número de registro X02513) se aisló a partir de partículas víricas. Dado que el diseño experimental implica el uso de dos ARNg, la funcionalidad de cada ARNg individual se confirmó primero en reacciones de digestiónin v itrode Cas9 distintas (figura 11B). Sabiendo que cada ARNg era funcional, se realizó una digestión específica de sitio utilizando una nucleasa dependiente de ARN y ambos ARNg transcritosin v itro(figura 11C). El gen indicador fluorescentep a p rik a(SEQ ID NO:29) se amplificó por PCR (figura 11D) utilizando cebadores que añadían secuencias 5' y 3' homólogas a las secuencias que flanquean el gen LacZa, que se liberó del genoma de M13 mediante digestión con nucleasas dependientes de ARN, por ejemplo, Cas9. Se utilizó el procedimiento de ensamblaje de Gibson para integrar sin discontinuidades el genpaprikaamplificado por PCR en el genoma digerido de M13, sustituyendo al gen LacZa (SEQ ID NO:28). Los genomas modificados se transformaron directamente en células hospedadoras deE. colipara producir partículas víricas funcionales que codifican el genpaprika.Los fagos diseñados se evaluaron por su capacidad para formar placas enE. coli(figura 11E). Se aisló el a Dn vírico de las placas y se amplificó por PCR para confirmar la presencia del genpaprikainsertado (figura 11F). La presencia y función de la proteínapaprikarecombinante se confirmó mediante imágenes fluorescentes (figura 11G).

Estos datos demuestran el uso con éxito del procedimiento de modificaciónin vitrodescrito en el presente documento para insertar un gen indicador en un genoma de fagode E. coli.Esto demuestra que el procedimiento divulgado es extensible a otros géneros de virus, incluidos los que infectan a otros géneros de bacterias.

Ejemplo XII

Modificación del fago A deE. coli

Utilizando el procedimiento de modificaciónin vitrodivulgado en el presente documento, se editó un segundo virus que infecta aEscherichia coli.La figura 12A muestra un esquema del enfoque de modificaciónin vitropara delecionar el gencll(SEQ ID NO:30) del genoma de fago A aislado (registro NC_001416.1). Este proceso de modificación se diseñó para generar un virus constitutivamente lítico, lo que constituiría una propiedad vírica mejorada. El genoma vírico A se aisló a partir de partículas víricas. Dado que el diseño experimental implica el uso de dos ARNg, la funcionalidad de cada ARNg individual se confirmó primero en reacciones de digestiónin vitrode Cas9 distintas (figura 12B). Sabiendo que cada ARNg era funcional, se realizó una digestión específica de sitio utilizando una nucleasa dependiente de ARN y ambos ARNg transcritosin vitro(figura 12C). Dos moléculas de ADN monocatenario sintetizadas se hibridaronin vitropara generar la plantilla de reparación de ADN bicatenario (SEQ ID NO:9) que comprende secuencias 5' y 3' homólogas a las secuencias que flanquean los sitios de corte selectivo por Cas9 en el genoma vírico A aislado. Se utilizó el procedimiento de ensamblaje de Gibson para integrar sin discontinuidades la plantilla de reparación amplificada por PCR en el genoma de A digerido. A continuación, los genomas modificados se encapsidaronin vitroutilizando el kit de extracción de encapsidación Maxplax lambda de EpiCentre de acuerdo con el procedimiento del fabricante (figura 12D). Tras la encapsidaciónin vitro,los genomas de A modificados se recuperaron en ensayos en placa con doble capa de agar utilizando las células hospedadoras deE. colisugeridas por el fabricante. Se determinó que los fagos modificados eran funcionales por su capacidad para formar placas enE. coli.Se aisló el ADN vírico de las placas formadas y se amplificó por PCR para confirmar la ausencia del gencll(figura 12E).

Estos datos demuestran el uso con éxito del procedimiento de modificaciónin vitrodescrito en el presente documento para eliminar un gen no deseado de un genoma de un fagode E. coli.Estos datos también proporcionan un ejemplo de encapsidaciónin vitrode genomas víricos modificados, lo que aumentó la eficacia de recuperación del virus y ofrece una alternativa a la transformación directa en una célula hospedadora. Además, estos datos proporcionan un ejemplo de la utilización de oligonucleótidos sintetizadosin vitrohibridados como inserto para la modificación. Además, estos datos proporcionan otro ejemplo de la utilización de este enfoque para diseñar el genoma de un fago con el fin de obtener una propiedad vírica mejorada, a saber, un fenotipo lítico constitutivo. Por último, estos datos indican que es posible diseñar un segundo género de virus que infecte aE. coliutilizando el procedimiento de modificaciónin vitrodescrito.

Ejemplo XIII

Corrección de errores del CMV humano

Utilizando el procedimiento de modificaciónin vitrodivulgado en el presente documento, se editó una parte de un virus humano. La figura 13A muestra un esquema del enfoque de modificaciónin vitroutilizado para la corrección de errores. Una subsección de 18 kb del genoma vírico HCMV de aproximadamente 230 kb estaba contenida en un plásmido replicante deE. coli.Esta subsección del genoma del HCMV (SEQ ID NO:10) contenía el inicio del genoma vírico y portaba un alelo mutante RL13 (SEQ ID NO:33). Juntos, el fragmento de HCMV y el plásmidode E. colitenían un tamaño aproximado de 28 kb, lo que supera las condiciones de la mayoría de las técnicas actuales de corrección de errores. Para la corrección de errores, se aisló el plásmido de 28 kb deE. coliy se realizó una digestión específica de sitio utilizando una nucleasa dependiente de ARN y dos ARNg transcritosin vitro(figura 13B). La digestión mediada por Cas9 extrajo una región del gen RL13 directamente cadena arriba y cadena abajo del lugar de la mutación. Se sintetizó la región corregida del gen RL13 (SEQ ID NO:32) y se amplificó por PCR con secuencias flanqueantes 5' y 3' adicionales homólogas a las regiones que bordean cada sitio de digestión de Cas9 especificado por ARN (figura 13C). Se utilizó el procedimiento de ensamblaje de Gibson para integrar sin discontinuidades la plantilla de reparación sintetizada en el plásmido digerido. A continuación, el fragmento de HCMV que contenía el RL13 corregido (SEQ ID NO:11) contenido en el plásmido se transformó en células deE. coliy se recuperó en medios que contenían antibióticos. Las colonias deE. colise analizaron mediante PCR para confirmar la presencia del gen RLl3 corregido, que contenía una secuencia adicional en comparación con el gen RL13 con errores, lo que permitía distinguirlo del gen RL13 con errores (figura 13D). A continuación, el fragmento genómico corregido de errores se amplificó enE. colimediante técnicas convencionales, para su posterior uso en aplicaciones posteriores.

Estos datos demuestran el uso con éxito del procedimiento de modificaciónin vitrodescrito en el presente documento para diseñar genes a partir del genoma de un virus específico humano y también proporcionan un procedimiento para usar ADN sintetizado como plantilla de reparación en la reacción de ensamblajein vitro.Estos datos también demuestran el uso de este procedimiento de modificaciónin vitropara la corrección de errores del ADN o plásmidos demasiado grandes para las técnicas convencionales de corrección de errores. La técnica convencional de corrección de errores tiene una restricción de tamaño en torno a 5 kb y se basa en la PCR, que intrínsecamente puede producir más errores no deseados. El procedimiento de modificaciónin vitropresentado en el presente documento no depende de la amplificación por PCR de la totalidad o incluso de una gran parte del plásmido o del genoma vírico y, por tanto, es apto para aplicaciones de corrección de errores de secuencias de más de 5 kb de tamaño.

Ejemplo XIV

Identificación rápida de extremos víricos con terminaciones redundantes

El procedimiento de digestiónin vitrodivulgado en el presente documento también puede adaptarse para identificar las terminaciones exactas de genomas víricos con terminales redundantes. La figura 14 muestra un esquema del procedimiento de digestiónin vitroque se utilizó para determinar los extremos de los genomas de los fagos LBL3 y 14-1. El ADN genómico de los fagos LBL3 y 14-1 (número de registro NC_011703.1) se purificó a partir de partículas víricas (figura 14A). La secuenciación de nueva generación se realizó utilizando la plataforma MiSeq o PacBio, seguida de la fusión automatizada de las lecturas de ADN de alta calidad en ensamblajes más largos para reconstruir la secuencia original (figura 14B). Normalmente, el software de ensamblaje automatizado ensambla incorrectamente los genomas víricos o bacteriófagos en contigs circulares y sitúa las DTR de los genomas terminalmente repetitivos en la región interna de la secuencia vírica. La predicción por medios informáticos de los extremos físicos del genoma se realiza a partir de la identificación de regiones de secuenciación de doble cobertura y de los resultados de la búsqueda BLAST que coincidan con un genoma estrechamente relacionado con repeticiones terminales (figura 14C). Estos extremos predichos se confirmaron mediante ruptura con la endonucleasa Cas9. Tras la inactivación de Cas9, se purificaron y secuenciaron fragmentos de ADN correspondientes a los extremos físicos genómicos (figura 14D). Estos resultados de secuenciación condujeron a un ensamblaje preciso del genoma basado en las verdaderas secuencias físicas finales (figura 14E).

Uno de los mayores retos técnicos asociados con la secuenciación del genoma de fagos es el cartografiado preciso de los extremos físicos genómicos debido a su naturaleza repetitiva. Estos segmentos pueden abarcar desde 4-14 pb en genomas permutados circularmente (por ejemplo, la mayoría de los fagos deMycobacteriumyPropionibacterium acnes)hasta varios cientos de pares de bases en genomas terminalmente repetitivos (por ejemplo, géneros de fagos similares a OKMV, similares a PB1 y similares a N4 deP aeruginosa)e incluso varios miles de pares de bases (por ejemplo, T5 y DTRde E. coli).El cartografiado de los extremos repetitivos (o DTR, "direct terminal repeats", repeticiones terminales directas) se realiza actualmente mediante una combinación de análisis de secuencias en profundidad (para identificar fragmentos de ADN de doble cobertura), paseo de cebadores (secuenciación de Sanger), identificación de las principales mellas del ADN y análisis de endonucleasas de restricción. Sin embargo, cada uno de estos enfoques suele tener un uso limitado o no son concluyentes con respecto a lo siguiente: (i) límites de cobertura de doble secuenciación mal definidos en los datos de NGS; (ii) lectura de paseo de cebadores a través de concatámeros DTR que da resultados no concluyentes; (iii) baja incidencia de sitios de restricción cerca de los terminales de los fagos u obstrucción de los sitios de restricción debido a modificaciones del ADN, tales como la metilación. El uso de la ruptura selectiva con Cas9 del ADN de fagos en posiciones específicas elimina la necesidad de análisis o procedimientos poco fiables o engorrosos, y simplifica enormemente la identificación de los extremos físicos genómicos de los fagos. Este enfoque tiene el potencial de cartografiar con precisión los extremos de genomas de fagos ya secuenciados (como ilustra la cartografía de los DTR de LBL3 y 14-1), así como de identificar rápidamente las DTR de virus que han sido modificados.

El uso de la digestión selectiva con Cas9 dentro del procedimiento de modificaciónin vitrodivulgado en el presente documento para cartografiar los extremos físicos de genomas de fagos terminalmente repetitivos representa una ventaja distintiva sobre los enfoques actuales, porque no depende de cambios sutiles en la cobertura de secuenciación y puede realizarse independientemente de la formación de concatámeros. Además, la actividad de Cas9 es menos sensible a las modificaciones del ADN que muchas enzimas de restricción.

Estos datos muestran el empleo con éxito de la ruptura con Cas9in vitroguiada por ARN para permitir la identificación de la verdadera disposición de la secuencia del genoma del fago. Esta información puede utilizarse después para diseñar enfoques de modificaciónin vitroposteriores para modificar estos fagos, un logro que antes era imposible debido a la falta de límites reales del genoma.

Ejemplo XV

Procedimiento de modificación con ensamblajein vivo

La presente divulgación proporciona un procedimientoin vitrode digestión específica de sitio de un ácido nucleico vírico purificado utilizando una nucleasa guiada por ARN, y el ensamblaje de un ácido nucleico diseñado mediante la inserción de un fragmento de ADN o ARN en el ácido nucleico vírico digerido. Si bien el ácido nucleico recombinante puede ensamblarse completamentein vitroutilizando enzimas purificadas como las descritas en el presente documento, este proceso también puede llevarse a cabo utilizando vías de recombinación naturales o modificadas dentro de una cepa hospedadora susceptible. La transformación de genomas víricos purificados y digeridosin vitrojunto con un fragmento de reparación para inserción que porta regiones de homología terminales es suficiente para que algunas células hospedadoras ensamblen un genoma vírico recombinantein vivo.Los fragmentos de reparación para inserción pueden sintetizarse o amplificarse mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica o pueden residir dentro de plásmidos que se replican de forma estable dentro de la célula hospedadora elegida. Es probable que este procedimiento tenga una eficacia menor que el ensamblajein vitrodebido a que las células hospedadoras tienen vías de reparación del ADN homólogas y no homólogas, a la dificultad de codistribuir cantidades suficientes de inserto y genoma digerido en una célula hospedadora y a la menor eficacia de la mayoría de las vías de recombinación homóloga del hospedador. Dado que los genomas digeridos por sí solos no formarán partículas víricas funcionales ni las placas posteriores sin que haya recombinación mediada por el hospedador, las placas obtenidas tras la transformación y el cultivo en placas pueden cribarse mediante PCR para detectar la inserción dada, a fin de confirmar el correcto ensamblaje del ácido nucleico vírico modificado deseado.

Ejemplo XVI

Virus modificados divulgados en el presente documento

La tabla 1 resume los virus modificados generados a través del procedimiento de modificaciónin vitrodivulgado en el presente documento. En la tabla 2 se resumen los virus modificados divulgados en el presente documento, junto con el ejemplo y la figura correspondientes. La tabla 3 enumera los virus de tipo salvaje divulgados en el presente documento y los números de registro de su secuencia genómica completa. La tabla 4 enumera algunas de las secuencias de ácido nucleico de tipo salvaje divulgadas en el presente documento y las correspondientes secuencias de aminoácidos.

Tabla 1. Virus modificados divulgados en el presente documento

Tabla 2. Virus modificados divulgados en el presente documento

Tabla 3. Virus de tipo salvaje divulgados en el presente documento

Tabla 4. Secuencias de tipo salvaje divulgadas en el presente documento

A partir de la descripción anterior, un experto en la materia puede determinar fácilmente las características fundamentales de la presente divulgación, y puede realizar cambios y modificaciones de la divulgación para adaptarla a diversos usos y condiciones y para utilizar la presente divulgación en toda su extensión. Las realizaciones específicas precedentes deben interpretarse como meramente ilustrativas, y no limitantes del alcance de la divulgación en modo alguno.

��Lista de secuencias

SEQ ID NO:1

ADN

Género/especie- Virus similar a phikmv LUZ19

Título descriptivo-gp13de LUZ19 de tipo salvaje

GTGCTGGCCCTCGGTGCCTTCGACCTGTCCGGCCTGATGGTAGGTTCCTGCCTCGTAGTAGGTGGTGAGCTG AAGGCCCTGTGCGTTGATGACCGGCACAGCAGGCAGGGTATCGGCGCTGAGCTGGTACGGGCCGCTGAGCT GGCTGGTGCCGAGTATCTGACCTGCTTCGAGTTCCTGGAGCCGTTCTACGCCGACTTGGGCTGGAGCACCAC CCACCGCGAGGCGAACTGGACAGCAGGAGAGCCGGACGTGCTGCACATGAGGGCACCCGGTCATGACGTAT GA

SEQ ID NO:2

ADN

Género/especie- Virus similar a phikmv LUZ19

Título descriptivo-gp38de LUZ19 de tipo salvaje

GTGGCTCGGTTCAAGAATCCCGAGACCATCCACGTTGCAGATGGGGTCGAGGCTGTCTTCAGTCTC,GACTTC CCGTTCCTGCGGCGTGAGGACGTATTCGTCCAGGTCGATAAGATACTCGTCACCGACTATACGTGGGTAGAC GACACCAACATCCAATTGGCCGTGGTGCCGAAGAAGGACCAAGAGGTCCGCATCTTCCGCGACACGCCCGC CCAGGTCCCGGACACACAGTTCAGCC.AGGACATCCCGTTCCTGCCTCGATACATCGACGCGAACAACAAGC AGCTCCTGTACGCTGTGCAGGAAGGCATCAACACCGCGAACCTCGCTCTCGATGGCGTACTCGACGCGATCC GTATCGCCGAGGAGGCTCGTCGCCTGGCGCAGGAAGCACTCGACGCCGCCAATGAGGCGCTTCGCCGTGCC CTGGGCTTCGCTGAGATTCGCACCGTGACCGAGGACTCGGACATCGATCCGAGCTGGCGCGGTTACTGGAAC CGTTGCATCACCGCCGATAAACCTCTGACCCrGACCATGCAGATGGAAGACCCGGATGCACCGTGGGTCGA g t t c a g c g a g g t t c a c t t c g a g c a g g c c g g t g t g c g t g a c c t a a a c a t c g t a g c c g g t c -c t g g c g t t a c c a t CAACCGTTTGCAGAACACCACCATGCAGCTCTACGGCGAGAATGGCGTGTGTACTCTCAAGCGGCTGGGCGC TAACCACTGGATCGTGTTCGGGGCCATGGAGGACGAATAA

SEQ ID NO:3

ADN

Género/especie- Virus similar a phikmv LUZ19

Título descriptivo-gp40de LUZ19 de tipo salvaje

ATGTTTAAGACCGAAGTAAAGGGACGTTACACCCTGATTCGCCGCAAGGCGGACGGCACTCCGGTGGAGAC TCTGGAGTTCGACAACATCATTACGAATGCGGGCCTGGATTGGATCGCCGCTATGGATACCGACCTCATGGG

CGAACCCGTAGCGGTCAGCACTTCTACAGCCGATCCCAACCCGAGCGCACCCGCCATCCCGGAGGTTGTGCA ACGCACGTCCGCATCTGCCCCTGGTGGAGGTACTACGTCGGGCCTGGATGGCGAGTGGCTGTTC.TGGCGGAG GCGTTGCAGATTCCCGCAGGGCACCCTAGCTGGTCAAGTCCTGGCCACCGTGGGCCTCATCTGCAACTCGGA T CGT CGCTTCGAGAGT AAC ACGGGT GAGCTGATCC CGAAGGAT ACCC CGCTGT C GT AC ACTCGC ATCAAGGA CGCCGCCGGGCAGCCTACTACTCTGGTGGTGGCCGCTGACGAGATTCTGGATGTCCAGTACGAGTTCCGCAG CCGGCCCGTAGGAACGGCTGAGGCCAAGTTCGTGATCTCCGGCGTGGAACGCACCTTCCGGCTGATCCCAAA GCCTTTTGCGAACCGT GCT AATCTCT CCGGGGAACGCT AC ATCTTCT AC A ACACC AACCCCTACATCAACGG CAAGGACGCCTCCGGCGGCAATGTCCGAGACGGTCAGTGGCAGAAGAAATATCCCAAGTACGTGCGCGGCT CCTACAAGGCGCAGATCACGCTGCTGGCCCAGGrCCAGAACGGCAATATGGCTGGCGGCATCACCGGCACC GAGGAACTCCAGATTTACAATGGACGTAACTATGTGCTCGATATCAACCCGCCTGTTGTGAAGAACAATACC CAGGAGTTCACCGTGACCCTGGAGTTTACGGTGGCGAGGGCATAA

SEQ ID NO:4

ADN

Género/especie- Virus similar a phikmv LUZ19

Título descriptivo-gp34de LUZ19 de tipo salvaje

ATGAGCTACAAGCAATCCGCGTATCCCAATCTGCTGATGGGTGTGAGCCAGCAGGTGCCCTTCGAGCGCCTG CCGGGCCAGCTCAGCGAGCAGATCAACATGGTATCCGATCCCGTGTCAGGACTTCGGCGGCGCAGCGGTAT CGAGCTGATGGCCCACCTGCTGCATACCGACCACCCCTGGCCGAGGCCGTTCCTCTACCACACGAACCTCGG TGGCCGCAGCATTGCGATGCTGGTGGCGCAGCACCGTGGCGAGCTGTACCTGTTCGACGAGCGGGACGGTC GCCTGCTGATGGGTCAGCCCCTGGTGCATGACTACCTCAAGGCCAACGATTACAGGCAGCTACGGGCCGCCA CGGTGGCCGATGACCTGTTCATCGCCAACCTGAGTGTAAAGCCCGAGGCCGACCGCACCGACATCAAGGGC GTAGACCCCAACAAGGCCGGCTGGCTGTACATCAAGGCAGGCCAGTATTCGAAGGCATTCTCCATGACCATC AAGGTCAAGGACAACGCCACCGGCACCACCTACAGCCACACGGCCACCTACGTGACGCCGGACAACGCCAG CACGAACCCCAACCTCGCTGAGGCGCCATTCCAAACGAGCGTAGGCTACATCGCGTGGCAGCTCTACGGCA AGTTC'TT CGGTGCGCCGGAGT ACACTCTGC'CCA ACTCGAC.GA AGAAGT AC.CCGA AGGT AGAC.CCGGACGCC AACGCGGC AACCAT AGCCGGTT ACCT CAACC AACGGGGCGT GCAGGACGGGT ACAT CGCGTTCCGT GGCGA CGCCGATATCCACGTTGAAGTGTCCACGGACATGGGCAACAACrACGGCATAGCCTCCGGCGGTATGAGCCT CAACGCCACGGCAGACCTGCCGGCCTTACTGCCGGGCGCGGGTGCTCCTGGCGTGGGTGTGCAGTTCATGGA CGGCGCTGTCATGGCCACCGGCTCCACCAAGGCCCCGGTATACTTCGAGTGGGATTCCGCTAACCGCCGCTG GGCAGAGCGGGCCGCCTACGGCACCGATTGGGTCCTGAAGAAGATGCCACTGGCCCTGCGCTGGGATGAGG CTACCGACACCTACAGCTTGAACGAGCTGGAGTATGATCGACGTGGCTCCGGCGACGAGGATACGAACCCC ACGTT C AACTT C GTC ACCCGAGGC ATC ACCGGC AT GACGACCTTCCAGGGTCGCCTCGTCCTCCT GTC GC AG GAGTACGTCTGCATGTCGGCCAGTAACAATCCACACCGCTGGTTCAAGAAGTCGGCAGCCGCGCTGAACGA CGATGATCCTATCGAGATCGCAGCCCAGGGGAGCCTGACTGAACCGTACGAGCACGCGGTCACCTTCAACA AGGACTTGATCGTCTTCGCCAAGAAGTATCAGGCCGTGGTCCCCGGTGGCGGCATTGTAACTCCCCGGACGG CGGTTATCAGCATCACCACGCAGTACGACCTCGATACCAGGGCGGCACCTGCCGTGACTGGCCGCAGTGTGT ACTTCGCTGCGGAGCGTGCCCTGGGTTTCATGGGCCTGCATGAGATGGCCCCGTCTCCGTCCACGGACAGCC ACTACGTCGCCGAAGACGTTACCAGCCACATCCCGAGCTACATGCCGGGGCCTGCTGAGTACATCCAGGCG GCGGCCTCCAGCGGCTACCTGGTGTTCGGCACCAGCACGGCGGACGAGATGATCTGCCACCAGTACCTCTGG CAGGGCAACGAGAAAGTGCAGAACGCGTTTCATCGCTGGACGTTGCGGCATCAGATCATCGGCGCCTACTTC ACTGGTGACAACCTGATGGTTCTGATTCAGAAGGGCCAGGAGATCGCCCTGGGACGGATGCACCTGAACAG CCTGCCAGCCCGTGAGGGTCTGCAATACCCTAAATACGACTACTGGCGGCGTATCGAGGCGACCGTCGATGG TGAGCTGGA ACTGACCA A GCAGCATTGGGACCT GATC A A GGATGCCTCTGCCGTGT ACC, A GCT ACAGCCTGT GGCCGGCGCCTACATGGAGCGTACCCATCTCGGCGTGAAGCGCGAGACGAATACGAAGGTGTTCCTCGACG TGCCCGAGGCCGTGGTCGGGGCGGTGTATGTGGTCGGCTGCGAGTTCTGGTCGAAGGTGGAGTTCACTCCGC CGGTT CTCCGGGACCACAATGGCCT GC-CCAT GACCTCGACCCGTGCAGTGCTTCATCGGT AC-AACGT AAACT TCCGCTGGACCGGCCAGTTCCTGTGGCGCATCAGCGACACGGCTCGACCCAACCAGCCGTGGTACGACACG ACGCCCCTCCGGTTGTTCAGCCGGCAACTCAATGCCGGGGAGCCTCTGGTGGATAGCGCTGTGGTGCCGCTG CCGGCACGGGTCGATATGGCCACGTCCAAGTTCGAGCTGAGCTGTCACAGTCCGTACGACATGAACCTTCGG GCTGTCGAGTACAACTTCAAGTCCAACCAAACCTACAGGAGGGTGTGA

SEQ ID NO:5

Proteína

Género/especie- Virus similar a phikmv LUZ19

Título descriptivo- Proteína Gp34 de LUZ19 de tipo silvestre

MSYKQSAYPNLLMGVSQQVPFERLPGQLSEQrNMVSDPVSGLRRRSGrELMAHLLHTDQPWPRPFLYHTNLGGR SIAMLVAQIIRGELYLFDERDGRLLMGQPLVIIDYLKANDYRQLRAATVADDLFIANLSVKPEADRTDIKGVDPN KAGWLYIKAGOYSKAFSMTIK\'KDNArGTTYSHTATYVTPDKASTNPNLAEAPFOTSVGYIAWOLYGKFFGAPE YTLPNSTKKYPKVDPDANAATTAGYLNQRGVQDGYTAFRGDADIHVEVSTDY1GNNYGTASGGMSLNATADLPA LLPGAGAPGVGVQFMDGAVMATGSTKAPVYFEWDSANRRWAERAAYGTDWVLKKMPLALRWDEATDTYSL NELEYDRRGSGDEDTNPTFNFVTRGITGMTTFQGRLVLLSQEYVCMSASNNPHRWTKKSAAALKDDDPIEIAAQ GSLTEPYEHAVTFNKDLIW AKKYQAW PGGGIVTPRTAVISITTQYDLDTRAAPAVTGRS\ÍYFAAERALGFMGL HEMAPSPSTDSHYVAEDVTSHTPS’í'ATPGPAEYrQAAASSGYLWGTSTADEMTCHQAXWQGKEKVQNAFHRWTL

RHQITGAYFTGDKLMVLÍQKGQETALGRMHLKSLPAREGLQYPKYDYWRRrEATVDGELELTKQHWDLTKDASA VYQLQPVAGAYMERTIILGVKRETNTKVFLDVPEAVVGAVYVVGCEFWSKVEFrPPVXRDIINGLPMTSTRAVL HRYKVNTGWTGEFLWRISDTARPNQPWYDTTPLRLFSRQLNAGEPLVDSAVVPLPARVDMATSKFELSCHSPYD MNVRAVEYNFKSNQTYRRV

SEQ ID NO:6

ADN

Género/especie-Pseudomonas aeruginosa

Título descriptivo- Secuencia dePyoS5

ATGTCCAATGACAACGAAGTACCTGGTTCCATGGTTATTGTCGCACAAGGTCCAGACGATCAATACGCATAC GAGGTTCCCCCTATCGATAGCGCGGCCGTTGCCGGGAATATGTTTGGCGACTTAATTCAAAGAGAAATATAT CTACAGAAAAACATTTATTATCCAGTCCGATCTATTTTTGAACAAGGAACAAAAGAAAAGAAGGAGATCAA CAAGAAAGTATCTGATCAAGTCGATGGCTTGCTAAAGCAGATCACTCAAGGAAAAAGGGAGGCCACAAGGC AAGAGCGAGTCGATGTCATGTCGGCAGTCCTGCACAAGATGGAATCTGATCTTGAAGGATACAAAAAGACC TTTACCAAAGGCCCATTCATTGACTACGAAAAGCAGTCAAGCCTCTCCATCTATGAGGCCTGGGTCAAGATC TGGGAGAAGAACTCTTGGGAAGAAAGAAAGAAGTACCCTTTTCAGCAGCTTGTrAGAGATGAACTGGAGCG GGCGGTTGCCTACTACAAACAAGATTCACTCTCTGAAGCGGTAAAAGTGCTAAGACAGGAGCTCAACAAGC AAAAAGCGCTAAAGGAAAAAGAGGACCTCTCTCAACTGGAGCGGGACTACAGAACCCGAAAGGCGAATCT CGAGATGAAAGTACAATCCGAGCTTGATCAAGCGGGAAGTGCTTTGCCTCCATTGGTCAGTCCAACGCCAGA GCAATGGCTTGAACGTGCCACAAGACTGGTTACGCAAGCAATTGCTGATAAAAAGCAGCTGCAGACCACAA ACAATACTCTTATCAAGAATTCCCCAACCCCTCTAGAAAAGCAGAAAGCCATCTACAATGGTGAGCTACTTG TGGATGAGATAGCCAGTCTACAGGCCCGCTTAGTTAAGCTGAACGCCGAAACGACACGACGCAGGACAGAA GCAGAACGCAAGGCGGCCGAGGAACAAGCGTTGCAAGATGCTATTAAATTTACTGCCGACTTTTATAAGGA AGTAACTGAGAAATTTGGCGCACGAACATCGGAGATGGCGCGCCAACTGGCCGAAGGCGCCAGGGGGAAA AATATCAGGAGTTCGGCGGAAGCAATCAAGTCGTTTGAAAAGCACAAGGATGCGTTAAATAAAAAACTTAG CCTTAAAGATAGGCAAGCCATTGCCAAAGCCTTTGATTCTCTAGACAAGCAGATGATGGCGAAGAGCCTTGA GAAATTTAGCAAAGGCTTTGGAGTTGTAGGCAAAGCTATTGACGCCGCCAGCCTGTACCAAGAGTTCAAGAT ATCTACGGAAACCGGGGACTGGAAACCATTCTTTGTAAAAATTGAAACACTAGCTGCTGGTGCGGCCGCCA GTTGGCTTGTGGGTATTGCATTTGCCACGGCAACAGCCACTCCTATAGGCATTCTGGGGTTCGCACTGGTAAT GGCAGrTACCGGGGCGATGATrGACGAAGACCTTCTAGAAAAAGCAAACAATCTTGTAATATCCArTTAA

SEQ ID NO:7

ADN

Género/especie- Virus similar a phikmv LKD 16

Título descriptivo- Secuenciagp18de LKD16 añadida

GAGTACCAACTGAACACGAGCGCACCCTGCGCTGCCTGCTCCAAGACATCCACGGGCCGCTGAATCTGCTGT

t c c c a g g t a t c c g g g t g a a g g t g g a g g a g g c g t g c c t c g g a t a c t t g g g c t a c a g g g a g c g g g g c t a t t g g GAGCTGCGCCTCCAGGTGGACTACGACCACCCGAAGCTTGGGCACCTCCGCTACAGTCAGGCCGTGCCGGA GTACGTGCTGATCAACGACCGCGACAGCATCATCAAGTACCTGATGGAAGCAGTCCCTCGGCAGGTACTAG AGGGCATGCTCAATAAGGCCCAGGAATTCGTAACCAAGAACTGGTATTCCCTATGACGAC

SEQ ID NO:8

ADN

Género/especie- Virus similar a phikmv phi-KF77

Título descriptivo- Secuenciagp7de OKF77 añadida

TACAAGGTGGTGACGCCTAGCTCGGCAGAGGGCGCCGTTGTGCTGGCGACCAAGCAGACGCCTGCCCTCGC TCAGGCAGTCATCGTACTGCACAGCATGAACCCCGCGCAGTACGCGGTGGGCACGGCCATACTAAACACAG ACTGGCGGTGCCGCCGCCTGGGTGCCGGCGAGTACATCAAGCTCGTTCAAGGGGAGGCCGAC

SEQ ID NO:9

ADN

Género/especie- Lambda similar a lambda

Título descriptivo- Fago AcIIdeE. coli

ATGGTTCGTGCAAACAAACGCAACGAGGCTCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGA

SEQ ID NO:10

ADN

Género/especie- Citomegalovirus HCMV

Título descriptivo- Preedición del fragmento de HCMV

ACGACGGCC AGTGAATTGT AATACGACTCACTATAGGGCGAATTCGAGCTCGGT ACCCGATTACCCT GTTAT CCCT ACCATT C CGGGCC GT GT GCT GGGT CCC CGAGGGGCGGGGGGGT GTTTTT A GC GGGGGGGT GAAATTTG GAGTCTTGGAGCCGCGTGTGCTGTGGAGGACGGTGACGGTGGTAAGAGTGTGCTGCGGTGCGGTTGGGACG GCGGCGGCGAATAAAAGCGGCGTGCGGCGCGCACGGCGAAAAGCAGACGCGCGTCTGTGTTGTGTGTCTTT GACCGCGGCGGAACACACGCGGAAAAGCGAGTCCCAGGGGACACACGACGAGCGAGTCCCAGGGGGGGAC GACGACGGCCAGGGACGCGGAAACGACGCGGAAAAGAGGAAGTCCCCAGGGGGACGGGCGGAAAAGAGG AAGCGCCTAGGGGACCGCGGGGGCAGGAACAGACGAAGTACGCCGCAACCCGCGTCGAGGACACACGCAG AAGCGGCCGCCCAGGGGAGGGGGGGGGGGGGACTCGCGGGCCCCGGGGCACACTTGTTGTTCCCTCCGGCC GCCGACACGCACCCCGAAGCCGCGCACACCGCCGACACACCCCTGACACACCCGCGACACACCCGCCACAC GCCCGACACACGCCCGCGACACACCCGACCGACACACCCTGACACACCCCGCCAACACACCCAGCCGCACC CGCCCCGCCAACACACCCCCGACACACCCGACACACGCCCGCGACACACCCGGCACACACCCACCCACCCA GCCGCGCCCCCGACACACCCCGAACGGCGCCGGTGCGGGACAGGGCTCACGGAGGTTTGCGGGCCGTGAGC ACGCCTCCCTTTGTACACACTACCGGTGCGTGGCGTCCCACGCTATTTGTTCGCGAGACCGGACTAAGGGAG GTTTGCGGTGCGTCAGCGCGGGGCGGCGTTTGCGGCGTGTTTCGACCAGCGCTTTGTGCGCGCTGCCTGTGC GTGTCGTCCCATGGTCTTTGTCAGCGGCACGGCGCTGGGGACGGGGTTTCACCGCGCTGAGGGATCTTTCTG CGGGTGTGAGGGACGGAGCTTTTTTCGCACGCTGGGCACCGGGCTGGGGGACGGGGGGTGTGCGGGACGGC GGTGGGGCCGGGGCGTTGCGGGTACGGGGATTACGCTGGGAACGGGGACTCGCGGACCCGGGCTGAGGGA CGGGGGTGGCGGGGGTGTTTGCGGCGAGGACGGGGGCCTTTTGCGGCGGGGACGGGGACTCACCCTCGCCT ATTTAACCTCCACCCACTTCAACACACACATGCCGCACAATCATGCCAGCCACAGACACAAACAGCACCCAC ACCACGCCGCTTCACCCAGAGTACCAACACACGTTACCCTTACACCACAGCAACACACAACCGCCTATCCAA ACCTCGGACAAACACGCCAACGAAGAACACCGCACGCAGATGGAGCTCGACGCCGCGGATTACGCTGCTTG CGCGCAGGCCCGCCAACACCTCTACGCTCAAACACAACCCCAACTACACGCATACCCCAACGCCAACCCTCA GGAAAGCGCTCATTTTTCCACAGAAAATCAACATCAACTCACGCATCTACTTCACAACATTGGCGAAGGCGC AGCGCTCGGCTACCCCGTCCCCCGCGCGGAAATCCGCCGCGGCGGTGGCGACTGGGCCGACAGCGCGAGCG ACTTCGACGCCGACTGCTGGTGCATGTGGGGACGCTTCGGAACCATGGGCCGCCAACCTATCGTGACCTTAC T GTT GGC GC GCC AAC GC GACGGCCTC GCT GACT GGAACGT C GTACGCT GC CGC GGC AC AGGCTTT CGC GC AC ACGATTCCGAGGAC GGCGT CTCT GT CT GGCGTC AGCACTTGGTTTTTTTACT CGGAGGCC ACGGCCGCCGT GT ACAGTTAGAACGTCCATCCGCGGGAGAAGCCCAAGCTCGAGGCCTATTGCCACGCATCCGGATCACCCCCAT CTCCACATCTCCACGCCCAAAACCACCCCAGCCCACCATATCCACCGCATCGCACCCACATGCTACGACTCG CCCACATCACACGCTCTTTCCTATCCCTTCTACACCCTCAGCCACGGTTCACAATCCCCGAAACTACGCCGTC CAACTTCACGCCGAAACGACCCGCACATGGCGCTGGGCACGACGCGGTGAACGTGGCGCGTGGATGCCGGC CGAGAC-ATTT AC-AT GTCCC.A AGGAT AAACGTC.CCTGGT AGAC.GGGGT AGGGGGATCT ACCAGCCCAGGGAT CGCGTATTTCGCCGCCACGCTGCTTCACCGATATCCAATAAACCCATCCCCTCGCCACGACGTCTCCGCGTAT CTTTGTAGCCTCAGGAATCCGTCCCCACGTCCATCCATCCCGAGCACTCCACACGCTATAACAGACCACGGA CACGGCAAATGCATGCAAACTTCTCATTTATTGTGTCTACTACTCTGTGTTGCTACAGGGAGTGAAGGGGGT GAAGGCAAAGAAAAAAAAAAGGAACAAAATAATAGATTAGCAGAAGGAATAATCCGTGCGACCGAGCTTG T GCTTCTTTTCTTAT AAGGAGGC AA AT AT ACT AGGGAAA ACTT A AGAAT AGGAAGAAACCGAGGTTTGGGA

g a a a a g c t g a g a t a a a a t a g c g c a t t t t c c a t a c a g a g g t t g t t g t t t t t g t g g a t c c t a a g a g g t t t c a a g

CTTTTTAGGTTCTGCGAGGGACATCACGATGGATCGTTGCGATGAAGTCACGCGTACGCCTCTGGTGTGGCG CGGTGTCGTGACAGGAGAGTGTGTTTTCAGTGCAGAGCTGTCTTGATTCCTATATCCGAGTATCTGTTTTCTC GTAAGGACGGTAATCTTCTTTGGTGTAAGTACATCrAAAAGCTGCAAACTATATTTTAAGGGCTGTCTCTAG GTGTACTTTGATGCTGGAGTTTTTCGCTGTGTTGATGTGAATAAATCTACTACTACTArTATATGCAGAAAGA GTGATTATGCCGAGACAAGATTGCATTGGCTGAACTGTTTCAAAAACGCCTACACTCrACTTATCCGTAAAC CTAAGGTAATACTATGTGTAAGTTGTTTTTTTTTCTTTTTGTAGTAAAATGGTGATACGTGCAATTAAAACTG TATTCCATGTTTCCATCCTTTCATTTCAACTTTAAAGGCGGCTTTGAGAGCGAAGAAGTGCGAGGATAAAAA TGGATGACTCCTTCGTGTCCAGGGAGTCGACTACTGCAACGCTGATTGATTAAAAGATGGTCTCCGATGATG ATGTTGrTATTGATCGAATCATGGTGCAGAACGGCGACGGAGAGGAGCGTGTCC.GCCGCCGGGAAGGTGGT CTCTTTCTCTTTTCTTTTTTCAAGAAATCTTCCATGTGTTTATCGTAGTGATCGAAATCGACTGATCTCGGGTT CTTTTTGTTGGTTT CTTTTCGGTT AATCATGT ATT GTTTTCTTTTTTT ACAGAAAGAT ACTTTTTT C AT GAGC AA TTCCTCGCCC GGCGCCGGCATGC C GAGGTGGGGCCACT GC GATCAGCGGCATGCC GACGCCGACC CGGGGA TCTTGGATTCACCGTTTTCTCTCTTCTCTCTCTACATACAGACCGGGTGGCAGGAGCGGTAAGCAATCATCGT CGTCTTTCATTCTTCGATGATTATGGTAATACTAAATCTTATCTAGGAGCATATACATCTAAGATTGGAGTAC TAGTAGTCGTTTGTGGTTTCTATTTTTTTTATATTTATCTATGACAGTTTTTCTGTTTTTCGTTTTGATAATAAT ATAATAAAAACTCATGGACGTGAAATCTGGCTTGGTTGTGGTGATTTCATTCTCATTATrGTTGTTTTCTTTCC GTCTTGCGGATGAAGATGTTGCGATGCGGTTGTTGTTGGTGTTGCTATACACCGAGAGAGATGATCTTTTTGT TCTTCTGGTTCATTTCCTATGATTGTTTGGCTGCTGACCGACGCGTCAGGATGTGCAGGGCATGCGGGGAATC AGGACCGGACACGGGATAATTTCATCTACCTATACGGAGATCGCGGTCCTCGCCATGAGGATCGCGACAGG CGCGTCGAGGGGGCAGGAACACCCTTGCGGATTGACATTCTTGGTGGTGTTTCGTTGTTGTCGGTAGTTGTTG TTGACGATGAGGATAAATAAAAATGACCTTGTTTTTGTTCTGTTTTCTCTTGTTGGGAATCGTCGACTTTGAA TTCTTCGAGTTATCGGAAAGCTGAGGTACCCAAATGTCTGTAGCTTTTTTCTTTTTACCCTCTTGTTTATCATC TGCGATTCGTGGTAGGTAGGAGAGGGAAATGATAATCCGAGATTAAGGAAAGGAGAAGATAAAAAATAAA AAAAAAATAATAAAACAGAACCCGACCGGCCGCCGACCCGTTCCCCAGGACCAGCCTACGAGGAATGGATA ACGCGGTGGCGACGGCAGCGGTGGTGGCGCTGGGGGTGGCGGCAGrGGTACTGCTGATGGTAGTCGGGACG GAGGAGAGGCGATGCATACATACACGCGTGCATGCTGCATGGGTGGATGGTACGGCCGGGAGACGCGGAA GAGAAACTC.ACATAAAAAGGTGACAAAAAGAGCGGTTGAAAAAAGAAAACGAGATTCGACC.AGACAGAAG AGAAGGACCGGGGCTTGGCGACCCTTCCACGACTGCTGTTGTCATCTCGGCTCCCCCGTCTTCTCCCGGCCAC GGGCGGCTAAGTCACCGCCGTTCTCCCCATCCGTCCGAGCGCCGACCGACCAGCCGGCCGATTCGCCCGC’CG<g g g c>:<t t c t g g a g a a c g c c g g g g c a g c a g c g a t c t g g g g a a g c x>:<g c t a a a c c c c t g c g t t t t t a t a t g g t a g c>T CTGCC GAGC GCGGGCT GACGCGTT GAGT AAGC GGAAAGACGT GT GTGAC GAAAAGGGGTC CC ATGGT ATT TC ACGT GACGAT GAGGAGATGCGGTTTGGAGC AC AT ACGGTTTAGAA AAAGGGAGTTGT C GT GAC AAGGGC TGAGGGACCTCTGTCTCCATGTGTGTATAAAAAGCAAGGCACGTTCATAATGTAAAAAAGAACACGTTGTAA AC AAGCTATT GCT GTAT C ATTCGGCTGACTAT GCTT C ATTCGGACT GATTTTCTTTT C CT AACGGCGT A ACTT AAAGTGATTAACGTATGATATTTGTTCCCCAGAGTTATACTATAGTCATCATCCTAAAATTCAGATATAAATG AACACATGTCGTATGGGATTATTAAGAAACCGAAACTCTCCACAGTTCACCATCTTCTTCGTCATTCAACCG ATGACCCACTCCGTACAACGAATCAGTCTGCTGTGTCACACTGCAAACTACTAGCGACGTATGCAAACAACT TGAAACACGGGCTGTTGTATTGACGACCGTTGTACCATTACTAGTCACATTGCATAGAGACCATCCACCGTC ATCCCATCTTTCCCACCCGATGGAAAACCGTCTTCTATCATCAACTATGGTAAGATTTCGACCCTGCGAGGTA TTCAGTTTCCCCATATCCATAACCTGGATTTTATCATTAAACCCCAATATTAAACACTTTTTTAGTACCCCCCC ACCCACCAAAAAATGTGACTGGACCGGTTCCTAGCAGCTCTGGGAGCCATGTTCAGGTTGAACCACAGCTAC AGCGAAACCGAGTCCAGTGACCGGTAACCACGTCCAGCCCCTGCGTATGTACCAGTCCAAGCACGTCCGGTC ATTGTTCTACACAGGAAATCTAACTAGGTCAACGCAATTTTATTCCACCGTTACGCAGAATACTAACAAACA AACACACAAATTTAACGAATTACACGTAGTTTATTACATGAAAACTGTAAGAACACCAATTCACTAAGCGAT ACAACATTTAGCTGACTTCCAAGTGCCACACATCACCACTGTATTCATCCATGTTTTCACCGAACCAACGAG ACAGATCGAAGAAGCCAGAATCTCCCGACTTTAAATTACATAAATCCAACGTATTATGACCACAGCTCGACA CACAAATA GTTGC.GTT ACT ATTC AC, AGTA GC ATT ACCTAT ACCCGT A A CGTT GCACA ACCACTG AT C ACC ATT GTTACCAAAAACGGTTTTCCACTTAGTTGTCAACGGATCTTTCCCATGCGTAATGGTCAAATTACTACCAGTC GTCGCTTTTAGCTCATT ACGAGT ATTATCCGCATCCAC ATAT ATC'AACGTC ATAGCT AGGCACGCT AT AAGT A CCCCCCCCCC AC AATGGAAT GTT GCCAA ACCGGTTCTTT CCCGTT AT AGCC ATAGC GTTCCC AGGCAAAAGC AAACGCCAAACCTAATGCAGTGAAAAGCGCTTGCAGCCAGAACCAGCTTATGTACCAGCCACAATCACATC CGGTTATTGTTTCCACAGGAAATCCTACCAGGCAAAGCCCCGCTTGTTTTGTTCCTGACCATCTTGTTTAGCA ATTCGT AA ACTGTCAGCCT AGCGACGT CCGTTT AGATCAA AAGTCACGT AT AT AGCGACGCT GTTTCCACCC GTTTCCCCGTCCCGCCGTTTCCGAACAACCCACCCGGGTTCAGACAACCGACCACCAACAGAAATAT ACACA C AG ACCACCGGGAGTTC AGTTAA AG ATTT CATC AGGTTT ATTTTGGCT GCTGCT AGTCTTTTG CTT CTT AGAA A A A A AAT A CCC, AT AT AGAGA A AT A AT GAT AGTTT GA C A AC, ACAT AT GGC AGGG ATTT CTTCTTC ATC A AT A A GATATGCAATTCCCCCAGGGAGAGACTTTCAACAATTGAATTTACAAAAACAAAATTACATCAGGAGAAAG AGAGGATACATTAATAAATATATTATATCTGGTGTATATACTGAATGCTGCTGGTTCATAAGGTAACGATGC TACTTTTTTTAATTCCAAGATGGTTTTTCTTTGTTAGTCTTTTGTTGACTTGCTGGTTCCTAAAAGTTCGCAAA AACGATTGTGTGAAGATTATGACGTTGGTTGACTAGTTCATGAGATTCTGCTGTACGTGTGATGGTTATTCGC TGGTTCGTTCTAAGATGAGTATCGTACTGTGTCTGCGATGGTCGTCTCTTACTGGCATTCTCTCGGCTGCCTCT TGTTTTCATGATTGAAAAGGAAAAAAGGACTCCGAGGGCGCGGTCATCTTTTACTTTTCGGTTTTCTCGTTGG CGGGTCAGAGGTAGTCAGATCATGAGACTGTCGTGGTCGATGAAACTGTGTCTGCTCAAGTGACGTCCATTT CTT GT ACGGAGA AA AA AGTC.ATCGGGAT A AATA AGGC’T AT ACAAGGCGTT GTCAAGCGTGCGGCTCT A AAC. AAATTAAGCGATACAAAATTACAGTGATACGAATAATAAATTACCCCCTCCCCCTGTGGTCCCCCCGAGGCG AGAGCCACCCATCGTGTACTCTCGCACCACCCACGACCACAGGGGGAGACGGGACGAAGAGACGACGCAG AGCGCCATCTCCTCCTGGAGGCCGGCGGCGTTAACTGCTACAGCTGCGGCGGCGACGACAGCTGCGATTTGT CGGCCGACATGCCGATGGTATGGGCGGCGGCGGCGGTGGCCGCGGCAGCGGGGAGGAGAGGAGAGAGAAG AGGAGCGGGGCGTCCGAAGGCGAGGATGGCATGGTCTCGCCGGAGCGCCCGGCTTTTATGGAACACTCGCG TCCGGTTGGGTATCACCCACAGGAAGATGAATCACAACTTCCAAACCATCTTGAGACCCGAGTAACGGTTTA CAGGTCGCACGCCAGTCTCAGCTAAAAACAGCGGACAGTCCCACGCTGTTTCTGTTGTGGCTCTCTCCAGTTT CCTCATCGCCGTCTTGGTCTCCGTCATCATCGGAAGAATACCACCCGCTCTCATGCGGCAGTCGATCAGCCTC

g a t g a a c g a g a c g c g g c g a c g c c t t t c t a c g g c c g a c t g g t t g t g g t g g t g a a a g a a g a g c a c c a g c a a t c c c a g g a g g a g c a a c a a g c c c t c a c a t g t c c a g g a g g t c g g g g a g a g g g c c t g t c g g a g a t g a c c g t g a g g c a t c a c g t a c g g c a g c t g a g g a g a a a c g g a g a a g a a a g g a a a a t t a c c g t c a g g g g c c g g g g t t c t t a t t a g a g a a a c a g c a c g t a g g t c a g g a t c c a g a t g c t a a t g g c a a t c a t g a t g a c g a t g a t c a t g c a g g c c a a g a c g c g g c g c a c c a a t g c a g a a t c c a a t a g c c g c c g t g c c t c c g g t t g g t g g c c g g c g g c a t c t a g a g a c a t g a t t t g g g g c g g g g a c c g g c g g c g c a a a a a g a c a g g g a g a t g g a c a g t g c c a c g g t g t t t t g t t a t g a t t a g g a c a t g g g g a c c g g a a g c c g a g a c a g a g t a c t a c a g g g t g t t g a a g g g t a a c g t g a g g g a g a t c a t g t c a t g g g c g g g c t g a a g a c c g t g c g g g g a g g a t c g a c g t g t g c g g t g c t t g t g g a a c a c g g t g t t t t a a t a t g t a t c c g c g t g t a a t g c a c g c g g t g t g c t t t t t a g c a c t c g g c t t g a t a a g c t a c g t g a c c g t c t g c g c t g a a a c c a t g g t c g c c a c c a a c t g t c t c g t g a a a a c a g a a a a t a c c c a c c t a g c a t g t a a g t g c a a t c c g a a t a g t a c a t c t a c c a a t g g c a g c a a g t g c c a c g c g a t g t g c a a a t g c c g g g t c a c a g a a c c c a t t a c c a t g c t a g g c g c a t a c t c g g c c t g g g g c g c g g g c t c g t t c g t g g c c a c g c t g a t a g t c c t g c t g g t g g t c t t c t t c g t a a t t t a c g c g c g c g a g g a g g a g a a a a a c a a c a c g g g c a c c g a g g t a g a t c a a t g t c t g g c c t a t c g g a g c c t g a c a c g c a a a a a g c t g g a a c a a c a c g c g g c t a a a a a g c a g a a c a t c t a c g a a c g g a t t c c a t a c c g a c c c t c c a g a c a g a a a g a t a a c t c c c c g t t g a t c g a a c c g a c g g g c a c a g a c g a c g a a g a g g a c g a g g a c g a c g a c g t t t a a c g a g g a a g a c g a g a a c g t g t t t t g c a c c a t g c a g a c c t a c a g c a a c t c c c t c a c g c t t g t c a t a g t c a c g t c g c t g t t t t t a t t c a c a g c t c a g g g a a g t t t a t c g a a t g c c g t c g a a c c a a t c a a a a a a c c c c t a a a g c t c g c c a a c t a c c g c g c c a c t t g c g a a a a c c g t a c a c g c a c g c t g g t t a c c a g g c t t a a c a c t a g c c a t c a c a g c g t a g t c t g g c a a c g t t a t g a t a t c t a c a g c a g a t a c a t g c g t c g t a t g c c g c c a c t t t g c a t c a t t a c a g a c g c c t a t a a a g a a a c c a c g c g t c a g g g t g g c g c a a c t t t c a c g t g c a c g c g c c a a a a t c t c a c g c t g t a c a a t c t t a c g g t t a a a g a t a c g g g a g t c t a c c t t c t a c a g g a t c a g t a t a c c g g c g a t g t c g a a g c t t t c t a c c t c a t c a t c c a c c c a c g c a g c t t c t g c c g a g c c t t g g a a a c g c g t c g a t g c t t t t a t c c g g g a c c a g g c a g a g t c GGTGTGGTCACGGATTCCCAAGAGGCAGACCGAGCAATTATCTCGGATTTAAAACGCCAGTGGTCCGGCCTC TCACTCCATTGCGCCTGGGTTTCGGGACTGATGATCTTTGTTGGCGCACTGGTCATCTGCTTTCTGCGATCGC AACGAATCGGAGAACAGGACGTTGAACATCTGCGGACGGACCTGGATACGGAACCTTTGTTGTTGACGGTG GACGGGAATTTGGAATAAAAGATGCGTAACACCTGTCGAAGATGCGATAACTTTACATACAGGCAAACAGT GTATACAATTATAGTATTTTGTATGTTGCATAAAGTTACATGCAACAGTACTGCTAACAGTACTGCATCCATT ACGCTATCCAACACTGCCTCTACCACTTTTGTAACCAACATATATTCAACTCCGAATAACAACACATCAACG ACGCCACACACATCTGTCACCTCACAAGCGTCAACCATTGGCAACATCACCAACGTTACCTCCGACTTGAGT ACTTTCACAACCGTATATTCTACATTCAATACATCATTTGCCAATATATCTAATACGGCTGTCACTACAGAAT TGATTTCAACAAATACCAACACTATCTCATCTTTTACCAACGTAACAGCAAACGCTACATCATCTTATAACAC AACAATCACCGTAACTGTCACGTCAGATGAAACTTCGCACAACGTATCCACTAATAATGCACTTATAAGCAC ACCATGGCCTACAAATTGCAGCGCCACAACATACACCACGTACAACCTTACTAACTCTTCCAACGCTTGTCA CACAGAGACAACAATCATACGTTTCAAGGAAACCAATACAACAGGAATAGAAGGGAGTAATGTCACCATAA AGGGTAATTCTACGTGGGACTGTCTTTCAGTCGCCTGGATACGACATTACAATAGATCCACACACGGACATC ATC.T AGGTT AT CGTAAGA ACGCACAT ACCCAAT C.TTGGT ATT GGC-T ACGCATCCTT ACCTCTCACACTGT ATG TCATTCTCAACATGAAAGACCTTCACTGTACCATGACTTATGTCGTTCGTGCAACAACACAGAATTACATCTG TACGATCTAAATATCACCAATTCCGGCAGGTACAGCAGACGTTGTTTTAAAGAAAATTACTTCACAGGACAT CACGAAGATGAAAATTT CT AC.CT ATT AGT A ACACCA A AAAATCAT ACT GA AGCT ATT AATGCTACTTTCGTT TGCCCT AGATACAACACCGAT ATCGAAAATGAAGATAGAGAGAAAGGAAGTCAACAT AC'T AAC'AAT ACACA t c a c c a c a a a c g t a a t c t c t a t c a t a g c t c g c a a a g a a g c c g c a c c g t a t g g a c c a t c g t g t t g g t t t g t a t GGCCTGCATAGTTCTGTTTTTTGCACGACGAGCCTTTAACAAAAAGTATCATATGTTACAAGACACCGTCAG TGAATCAGAATTCATTGTTCGATATCACCCAGAACATGAAGATTGAGCTACGTTTCCGGGCAGACATCTTAT

g a a g c t g a a c a a t a a a c t a a a a c a t t c t g t a a g a c t c a g c g t t c a a a g g a a t a t t a a t g c c c a t t g a g c g a a a a c t a a t a t t g c a a t g g a c t g g c g a t t t a c g g t t a c g t g g a c c g t t a c t t g t g a t g g t t t c a a t t a t a c a g t c c a t a a a a g a t g c g a t c g c a g t t a c g a g g t a a t c a a c g t a a c a g g a t a c g t t g g t a g c a a c a t a a c t c t a a a a a a a t g c a a t c a g a c t g a g a a a t g g c a c a a t g t a g a c t g g a t t c a t t a t g a g t a c c c c a c g c a t a a a a t g t g c g a a t t a g g c a a c t a t c a c c a a a c c a c a c c a c g g c a c g a c a t a t g t t t t g a c t g c a a c g a c a c c t c c c t a a c t a t c t a c a a c t t a a c c a c a a a a a a c g c t g g a a a a t a t a c c a g g c g t c a c c g t g a t a a c g g t c a a g a a g a a a a t t a c t a c g t a a c g g t g t t a a t t g g a g a c a c a a c g t t a t t c a c t c t t g g c a c a t g c c c t g t a a g a t a t a a AGAATCTACGAACACTGAAAACACCATrGGAAGTAGCATCATAGAAACCATTGAGAAAGCTAACATTCCCC<t g g g a a t t c a t g c t g t a t g g g c a g g c g t>AGTGGT ATCAGTGGCGCTT ATAGCGTTGT ACATGGGTAGCCATC GCATTCCCAAAAAGCCGCATTACACCAAACTTCCCAAATATGATCCAGATGAATTTTGGACTAAGGCTTAAC

CGTT AT ATTC AGTCGTT ACT AAACAAAA A AACATGGGCATGCAATGCAAC ACT AA ATTGTT ATTGCCAGTCG

C’ACT AAT ACC.GGTTGCA ATCATCCT AATTGGTACTCT AGTGCCGATACTTTT ACATGAACAAAAAAAGGCGT TTTACTGGCGACTTTTTCTGCAAAGTCAACATGTAGAAGCACCCATTACAGTAACGCAGGGAGACACAGTCT ACCTAGACGCTAGCAATAATCCCTGTAATTATTCCAGCTTTTGGTACCACGGTAATTGCGAACTTTGTGGArG GAACGGATATCTACGCAATGTTACACATTACTACACAAACACATCGTGTTCCCCGCAATTCATCTGCATAAA CGAAACTAAAGGTCTGCAGTTATATAATGTAACATTAAACGATTCAGGCGCTTATACTGAACACGTTTACGA ATGTGACCTTTCGTGTAACATTACTACTAATAACGAATATGAAATACTCAATTATTTTGATAACTGTAACTAC ACCATAAATAGCACCAAGCATATTATCACCGTGGTGTCTTCACGTCATTCTAAACAAACAAATTCCCACGTA TCCACTCACGCTGGTTGGGCAGTCGCCGTGGTGACGGTAATTATGATCTACGTTCTGATCCACTTTAACGTCC CGGCAACTCTGAGACACAAACTACGAACTAGAAACAACGTAAATCGCATAGCGTGATTATAAAGTATCGAC GCTAATTTCTCCAAGATAAAATTTGATTACTCCGTGCAGTTCTCAAAAACTGTAAGGCC.CCGCTTTTCCACTC CGTCATGAAGGATCGCA AT AGAAT ACTGCT ATGT ATCATCTTTATTTGC'ATT ATGTGCCTC-ATTTGT ATTT AC TTTAAACGTCGTTGTGTTTTTACTCCGTCTCCAGACAAAGCAGATCTGCGAGTGGAATTTCCCTCGTT ACCCC CGTGTATTGGCATACAGTGCGCTGCATGAGAACACGCGTGACACATAGCGTACCCCTGGACGGTACAGTTTA TGATAACGTAATTCAGGGAAAGTATACATTCATACCAACATGTTATCACATAACACACAGATTTTCTGCGTG TTTTATAAAAGAGCGTCTCGAAGCAGCTTGAGCCACACTACGGTCCAGATGACGAGCGTAATTAAAAATATG CCGCGCAGTATTCGAAAGCCGTACTGAGCGTGCGAGGCGGGTAGGGTGCCGAACGACGGATATGCGTCGTT GTCATCTTCGACTATAAGGArCGCGACCGAGTCTrCGGCCATGGTAAACGTCACCCTGTGTGGCTGGTATGT AGCGTATCCGGTTTGGAATTGTTCTGCTCCAGCTCGGGGGATAGTGAGGAATTCTCAAGGGATACGGGACCC AATGACTGGATAAGAGAAGGGTTTTTCCCCGTAAGATGATCCTCGTATCACATGAGGTCTGGATATGTATAA ATGAAGAGTGAAATAGGCACAGGGAATCAGATGCCAGCCTCGTGATGCAGCCGCTGGTTCTCTCGGCGAAG AAACTGTCGTCTTTGCTGACTTGCAAATACATCCCGCCTTAAGCGATGAGTCTATAAAGCACCGTTGCCCGA GTACGGTAAAAGTGACCCGGATTGTAGAACGTCCTTTTTTTTTGTTTTTGCATCGTTTATCGTCACTACTAGT GCAATATTTTGATTGTAAGGCTGAAAGAGTATCGTTATGATGCTTAGAACGTGGAGATTATTACAGATGGTA CTGCTTGCCGCGTACTGTTATTATGTTTTTGCGACTTGTTCAATCAGCACGACGACTGCTCCTGTGGAATGGA ACTCTCCCGACCGTCACATTCCCAAGAATATTACCTGCGCTAATTACTCAGGGACCGTCAACGGCAACGTTA CATTTCGAGGTCTTCAGAACAAAACGGAAGACTTTTTGTACTGGTTGTTAGGATGGGGTCATAAGTCCATTT GTTCGTTCTTCCCGAAACTCCAGGGTAACTATGACGAACAACATTACAGATATGAAGTAGCGAACCTGACGT AT AAC.TGCACCTAT AACCGCTTGACGTTGCTGAAT CT GAC.GACGGAAAACAGCGGAAAGT ACT ATTTCAAAA GGGA AGATGCGAATTTCACCTTCT ATT ACTCTTGTT ACAACTTGACCGTGTCCT AAAGATCGCACGTGAAGTT TCACAGAGCCGCGTGGCTGTAGCT ATTGTGTTT ACGTTGCTTTTGAAATGTT AAGC.GTCCCT ACGGC’GCT AAC ATGTTTCTAGGCTACTCTGACTGTGTAGATCCCGGCCTTGCTGTGTATCGTGTATCTAGATCACGCTTAAAGC TCAT GTT GT CTTTTGTGTGGTTGGTCGGTTTGCGTTTCT AT GATTGTGCCGCGTTCGAGTCCTGCTGTT AC.GAC ATCACCGAGGCGGAGAGTAACAAGGCTATATCAAGGGACGAAGCAGCATTCACCTCCAGCGTGAGCACCCG TACACCCTCCCTGGCGATCGCGCCTCCTCCTGACCGATCGATGCTGTTGTCGCGAGAGCAACAACTCGTTCC GTGGAGTCGTCTCATCATCACTAAGCAGTTCTACGGAGGCCTGATTTTCCACACCACCTGGGTCACCGGCTTC

g t c c t g c t a g g a c t c t t g a c g c t t t t c g c c a g c c t g t t t c g c g t a c c g c a a t c c a t c t g t c g t t t c t g c a t a g ACCGTCTCCGGGACATCGCCCGTCCTCTGAAATACCGCTATCAACGTCTTGTCGCTACCGTGTAGCTAGTTAG

c c a g c t g t g t g t a g t g t t t t g c t t t t g c a t a t t t g t t t t c a g t c a g a g a g t c t g a a a c g g g g t g g g a g g g a c t t t t g c g g g t a g t g c a t g c t a a g a t g a a c g g g t g g g c t g g g g t g t g c t t g a t a a c t c a c t g t t t g a a t a c g c g CTCACGCACATATGTAGCACTCAACArGTTAGCTTTTGCCCGCACGCCCCGGGGCGTGCCGAGCTGCCTTTTT AATAAAGTCTGGGTTTCCAGATACGCGCTGGTTCTGATTTTGATGGTTTGTGCCTCTGAAAGCTCTACGAGCT GGGCCGTGACATCCAATGGACTGCCTAACTGTAGCACGGTAACTAGAACAGCGGGTCAAGACGCTGAATTG CACGGTCCGGCACCGTTAAGCTGTAATGTGACCCAGTGGGGACGTTACGAGAArGGAAGCACACCCGTGTT ATGGTGCACTTTACGGGGATCAAGCATGCGAGTCTCATTAGGACACCGTGTAGCGTTTGGCTGTTCTTGGAA AACATTTTTTATTTATAACGTTTCTGAAAGTAGCGGTGGCACTTACTATCAAAAAGGTTACAACTGCACCGA CAAACATATAACACTATCTTGTTTCAACTTAACGGTGGTTCCTCGAGCGGTTCAAAGCACAACCACCGTAAT GACACCCACGCTGGTTACAAACTCCACATTCAGTGTGTCACTTGTTCCGTTGAGACTGACGACAAATTCCAG CGCGTTrGGACACGCTATTTATCAACGACAACAGCGTGTTGAAAACGGGACGTTATCCAAGAACATAACTAA CTTGGCATTCACCTATGGCAGCTGGGGCGTTGCGATGCTGCTGTTTGCCGCCGTGATGGTGCTCGTTGATTTG GGTTTGCCTCAATCGGCTTGGCGACGCTGGCGAAGCCACGTGGACGATGAAGAACGTGGTTTGTTAATGTAG GAAATAAAAGGCAGTTTGAGCATGACTGTTTCCAAACCGTAACGTGGTAAATAAATCATGGCTTCCGACGTG GGTTCTCATCCTCTGACGGTT AC ACGATTTCGCTGC AGAGT GC ATT AT GT GT AC AATAAACTGTT GATTTTAA CTTTGTTTGCCCCCGTGATTCTGGAATCCGTCATCTACCTGTCCGGGCCACAGGGAGGGAACGTTACCCTGGT ATCCAACTTCACTTCAAACATCAGCGCACGGTGGTTCCGCTGGGACGGCAACGATAGCCArCTCATTTGCTT TTACAAACGTGGAGAGGGTCTTTCTACGCCCTATGTGGGTTTAAGCCTAAGTTGTGCGGCTAACCAAATCAC CATCTTCAACCTCACGTTGAACGACTCCGGTCGTTACGGAGCAGAAGGTTTTACGAGAAGCGGCGAAAATG AAACGTTCCTGTGGTATAATTTGACCGTGAAACCCAAACCTTTGGAAACTACTCCAGCTAGTAACGTAACAA CCATCGTCACGACGACATCGACGATGATCGACGCGAAAAGTAACGTTACAGGGAACGCCAGTTTAGCACCA CAATTACGTGCCGTCGCTGGATTCTCCAATCAGACGCCTTTGGAAAACAACAC.GCACCTGGCCTTGGTAGGT GTTGTTGTGTTTTTAGTTCTGATAGTTGTTTGCATTATGGGGTGGTGGAAATTGTTGTGTGGTAAACCAGAGT TATAGTAATGTGCTTTTTATCAGGGAGAAGGTTTTGTGCCAACAATGACTAGCCCGGGACTATCTGCGTCAG AAAATTATGACGGAAATTATGAATTCACGGAAACCGCCAATACAACGCGTACAAATAGAAGTGACTGGACA ACGTT AG AAACC AGT GC ATTGCT ATT G AAAAACACGGAG ACT GC AGTGAACCTCAGC AACGCG ACT ACGGT CATCCCACAACCTGTAGAATACCCGGCTGGGGAAGTACAATATCAAAGAACGGCAACGCATTATTCTTGGAT GCTAATCATTGTCATCATTCTCATCATTTTTATTATCATCTGTCTACGAGCACCTCGAAAAATCTACCATCACT GGAAAGACAGTAAACAGTACGGACAAGTGTTTATGACAGACACGGAACTGTGACAGTGATGTCTAAGCGTT TGCAGGTATTTCCATGGATAACAATTTTATTTTACACATCAAAATCCCAGTATTGGAACTATATGGCAATACC ATGTACCCCTACAGTTGGATACGGCAGTCATAATATTAGCTTGCATCCGCTTAATAACTCATTATTTCAAGAC GAT GTTTTTGA ATGGT AC AT AGACAAACC A ATGGTT AC AAGTT ATGT CTTT ATCAAAGT AATGA ACGC AC A A AATCCAATCTAGACTCTCCAAATATT GT GTGGCAATGCACAGAT AATCGTACACT AATTCTCATGAACTT AA CCAC.A ACATACAGT AGAAACTATT ATTTTCAATCCTTT AAAT ATCTCGGAC.GAGGAGT AC.CA A A ACCGAATA ACTTGTGTTATAACGTTAGTGTACACTTrACCCACCAAACACATTGCCATACAACTACATCATCCCTGTATCC ACCTACATCTGTACACGATTCATTAGAAATATCACAGTCATTCACCTCAACCAACTTCACACATACCGCGGT CCACTACGCCACCGGTAACGTTGAAGCACAACACGACACTACCACTCCACATACAATGTGGATCATACCCCT AGTTATCGTTATAACAATCATCGTTTTAACrTGTTTCAAATTCCCCCAGAAAGCTTGGAATAAATTCACACAA TACAGATACAGCGGTATGCTCGCCGCCGCTTAAAGAATCAACGCCAAGGAAACCAAAACGTAAAAAGAATA GATATGT ACGTTTATTTTTCAGCTCACTGTTTGAATACCGTAAACATAATGACGTACATATACGTGGTTATAC AACAGGTGTTTGTGTTATGCGGCGACTGATTAACCATATCGTGAACCATGATCTTTTCCGATGGTCCGTCGTG ACCGCAAT GAT ATTTT ACAG ATATTCCGAA ACCTGT ATGGAGGT CACT GT CAGAGT AGGT GAT CC AGTT ACC CTCGGTAGTGGACATGGTTATCATCCAGGTAGGGATAACAGGGTAATGATCCTCTACAGTCGACCTGCACGC ATGCAAGCTTGAGTATTCTATAGTCTCACCTAAATAGCTTGG

SEQ ID NO:11

ADN

Género/especie- Citomegalovirus HCMV

Título descriptivo- Posedición del fragmento de HCMV

ACGACGGCC.AGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGATTACCCTGTTAT CCCTACCATTCCGGGCCGTGTGCTGGGTCCCCGAGGGGCGGGGGGGTGTTTTTAGCGGGGGGGTGAAATTTG

g a g t c t t g g a g c c g c g t g t g c t g t g g a g g a c g g t g a c g g t g g t a a g a g t g t g c t g c g g t g c g g t t g g g a c g GCGGCGGCGAATAAAAGCGGCGTGCGGCGCGCACGGCGAAAAGCAGACGCGCGTCTGTGTTGTGTGTCTTT

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TCTCATCATCACTAAGCAGTTCTACGGAGGCCTGATTTTCCACACCACCTGGGTCACCGGCTTCGTCCTGCTA GGACTCTTGACGCTTTTCGCCAGCCTGTTTCGCGTACCGCAATCCATCTGTCGTTTCTGCATAGACCGTCTCC GGGACATCGCCCGTCCTCTGAAATACCGCTATCAACGTCTTGTCGCTACCGTGTAGCTAGTTAGCCAGCTGT GTGTAGTGTTTTGCTTTTGCATATTTGTTTTCAGTCAGAGAGTCTGAAACGGGGTGGGAGGGACTTTTGCGGG TAGTGCATGCTAAGATGAACGGGTGGGCTGGGGTGTGCTTGATAACTCACTGrTTGAATACGCGCTCACGCA CATATGTAGCACTCAACATGTTAGCTTTTGCCCGCACGCCCCGGGGCGTGCCGAGCTGCCTTTTTAATAAAGT CTGGGTTTCCAGATACGCGCTGGTTCTGATTTTGATGGrTTGTGCCTCTGAAAGCTCTACGAGCTGGGCCGTG ACATCCAATGGACTGCCTAACTGTAGCACGGTAACTAGAACAGCGGGTCAAGACGCTGAATTGCACGGTCC GGCACCGTTAAGCTGTAATGTGACCCAGTGGGGACGTTACGAGAATGGAAGCACACCCGTGTTATGGTGCA CTTTACGGGGATCAAGCATGCGAGTCTCATrAGGACACCGTGTAGCGTTTGGCTGTTCTTGGAAAACATTTTT TATTTATAACGTTTCTGAAAGTAGCGGTGGCACTTACTATCAAAAAGGTTACAACTGCACCGACAAACATAT AACACTATCTTGTTTCAACTTAACGGTGGTTCCTCGAGCGGTTCAAAGCACAACCACCGTAATGACACCCAC GCTGGTTACAAACTCCACATTCAGTGTGTCACTTGTTCCGTTGAGACTGACGACAAATTCCAGCGCGTTTGG ACACGCTATTT ATCAACGACAACAGC GTGTTGAAAACGGGACGTT ATCC AAGAAC AT AACTAACTT GGCATT CACCTATGGCAGCTGGGGCGTTGCGATGCTGCTGTTTGCCGCCGTGATGGTGCTCGTTGATTTGGGTTTGCCT CAATCGGCTTGGCGACGCTGGCGAAGCCACGTGGACGATGAAGAACGTGGTTTGTTAATGTAGGAAATAAA AGGCAGTTTGAGCATGACTGTTTCCAAACCGTAACGTGGTAAATAAATCATGGCTTCCGACGTGGGTTCTCA TCCTCT GAC GGTTACACGATTT C GCT GCAGAGT GC ATTAT GTGT ACAAT AAACT GTTGATTTT AACTTTGTTT GCCCCCGTGATTCTGGAATCCGTCATCTACGTGTCCGGGCCACAGGGAGGGAACGTTACCCTGGTATCCAAC TTCACTTCAAACATCAGCGCACGGTGGTTCCGCTGGGACGGCAACCATAGCCATCTCATTTGCTTTTACAAA CGTGGAGAGGGTCTTTCTACGCCCTATGTGGGTTTAAGCCTAAGTTGTGCGGCTAACCAAATCACCATCTTC AACCTCACGTTGAACGACTCCGGTCGTTACGGAGCAGAAGGTTTTACGAGAAGCGGCGAAAATGAAACGTT CCTGTGGTATAATTTGACCGTGAAACCCAAACCTTTGGAAACTACTCCAGCTAGTAACGTAACAACCATCGT CACGACGACATCGACGATGATCGACGCGAAAAGTAACGTTACAGGGAACGCCAGTTTAGCACCACAATTAC GT GC.CGT CGCTGGATTCTCCAATCA GACGCCTTTGGA A A AC A AC ACGC ACCTGGCCTTGGT AGGTGTTGTTG TGTTTTT AGTTCTGAT AGTTGTTT GCATT ATGGGGTGGTGGAA ATTGTTGT GTGGT AAACCAGAGTTATAGT A ATGTGCTTTTT ATCAGGGAGA AGGTTTTGTGCC AAC AATGACT AGCCC'GGGACT ATCTGCGTCAGAAAATT A TGACGGAAATTATGAATTCACGGAAACCGCCAATACAACGCGTACAAATAGAAGTGACTGGACAACGTTAG AAACCAGTGCATTGCTATTGAAAAACACGGAGACTGCAGTGAACCTCAGCAACGCGACTACGGTCATCCCA CAACCTGTAGAATACCCGGCTGGGGAAGTACAATATCAAAGAACGGCAACGCATTATTCTTGGATGCTAATC ATTGTCATCATTCTCATCATTTTTATTATCATCTGTCTACGAGCACCTCGAAAAATCTACCATCACTGGAAAG ACAGTAAACAGTACGGACAAGTGTTTATGACAGACACGGAACTGTGACAGTGATGTCTAAGCGTTTGCAGG TATTTCCATGGATAACAATTTTATTTTACACATCAAAATCCCAGTATTGGAACTATATGGCAATACCATGTAC CCCTACAGTTGGATACGGCAGTCATAATATTAGCTTGCATCCGCTTAATAACTCATTATTTCAAGACGATGTT TTT GAATGGT AC ATAGACA A ACC AATGGTT AC AAGTT ATGT CTTT ATC A AAGT AATGAACGCAC AA AAT CC A ATCTAGACTCTCCAAATATTGTGTGGCAATGCACAGATAATCGTACACTAATTCTCATGAACTTAACCACAA CATACAGTAGAAACT ATTATTTTCA ATCCTTT AAAT ATCTCGGACGAGGAGTACCA A A ACC'GAATAACTT GT GTTATAACGTTAGTGTACACTTTACCCACCAAACACATTGCCATACAACTACATCATCCCTGTATCCACCTAC ATCTGTACACGATTCATTAGAAATATCACAGTCATTCACCTCAACCAACTTCACACATACCGCGGTCCACTA CGCCACCGGTAACGTTGAAGCACAACACGACACTACCACTCCACATACAATGTGGATCATACCCCTAGTTAT CGTTATAACAATCATCGTTTTAACTTGTTTCAAATTCCCCCAGAAAGCTTGGAATAAATTCACACAATACAG ATACA GCGGTATGCTCGCCGCCGCTTAAAGAATCAACGCCAAGGAAACCAAAACGTAAAAAGAATAGATAT GTACGTTTATTTTTCAGCTCACTGTTTGAATACCGTAAACATAATGACGTACATATACGTGGTTATACAACAG GTGTTTGTGTTATGCGGCGACTGATTAACCATATCGTGAACCATGATCTTTTCCGATGGTCCGTCGTGACCGC AATGATATTTTACAGATATTCCGAAACCTGTATGGAGGTCACTGTCAGAGTAGGTGATCCAGTTACCCTCGG TAGTGGACATGGTTATCATCCAGGTAGGGATAACAGGGTAATGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCA AGCTT G AGT ATT CTATAGTCTCAC CT AAATAGCTT GG

SEQ ID NO:12

ADN

Género/especie- Virus similar a phikmv LKA1

Título descriptivo- Secuenciagp49de LKA1

ATGGCGCAAACACCCAGTACATGGGCCGACTACGTAGGCGACGGCGTAGAGGATACGTTCCAAGTCACAT TCCCGTACCAGAAGCAGCAAGAGGTGTTTGTGACTGTGGGCGGCGATCCGGCAGCTTTCACATTCATCTC GGCAGGTTGCATTCAACTGGCAGCGGTCCCGGTAAATGGGGCCGCAATCCGTGTACGGCGCAGCACTGAG GCATTCGAGCCTCGGCACGAGTTCGCCAACGGCGTGCCATTACTGCCGCGATTCATAGACGAGAATAATA CCCAGTTCTTGTACACTGTACAAGAGGCAGTGAATGAGACACATGGCATTGCTTCCGAAGCGCTGAGTGT CGCAGAGGAGGCCAGAGGCATTGCGCAGGCGGCATCGGATAAAGTGGATGCTGCCACCATTGACTCCGCA CACCAGTTGCGTCTAGACCTCGCCGACCCGGCGAAGGGGCCTGGGCTGCTAGGCTACGACCGAGACGTAA GTTATCCGGTCGGGTCCGTCGGTCAAAGCCTACAGTTTCTGGAAATGGGTCGGGTCACACCAGCGCAATT TGGCGCCGTTGGTGATGGCGCCAGCCACCCCCTCTCTGAGCGATACGCAACTCTAGCGGAAGCTCAGACT GTCTATCCGCATGCAGTCGCACTCTCCGACGAAATAGACTGGGCCGCATTGCAAGCTGCCGTGGATTCAG GGGCACCTGT ACACAT ACCGTCTGGGGACTATCAGAT AA AT AGGGGGATT AGCAGT ACGGGCTCTCT ACA GATTGCGGGTGATGGCGCTACATCTATTATACGCCCGACTGCTGCGTTCACTGGTACATCGGTCCTCAGT TGTGTGGGGAGCTTAGTTGCCTTGCCGAATATATCCTCCGTGTCGGCTGGGTCCCTAACCATTGACTTTG CCAGCACCCCTAATCTTGTAGCGGGGGATGTATTCATCATCTACAACCCGACTGATAGCAGCTTCTCGGG ATTTCGGAC GAGCTATCGC GCAGGAGAGTTCT GT GAGGTCAGGGCGGTTT CT GGGAAC ACCGT GACAATC CGTTCCGCACTCTATCCCCCATACGACGGGGCTACTGTTGCTATTTACAAAGTAGTCTCTCCTGTAGTTC ATATAGCTAGCATCCAAATCGTTGGCGGGACAGTCCCAATGAATGGACTGTTAGTGGAGGCTGTCGTTTC ACCGCGCGTCGATGACGTGACGGTCACCCTTGCAAACAACGCCGGTGTGTATTTTGCCCGCTGCTATGAC GCTAAGArCACAAACAGTAATATATCGAACATCGGCGACGGTGGCGATGACTATGGAATCATCTTTGGGA ACTGTCACGACGGTGGGGCAGACAACTGTAAAGTCTACGCTAGGCGACATGCCATCGCCACGGGCGGCGA TGCAG AAGT AGGCTGCGTTCCGGT C.CGT AAT GT GC.GT ATGCGT AACTGCACACTTAGGAATGAT ATT AC.C TCTGGTACACACTGCGCAGACTTCCACGGTAACGCCGAGGATTGCAGCTACGAAAACTGCACAATCTACG GTGGTGCAACTTGGCAGGGGAAGGATATCAGCTACAGACACTGTACAATCACTAACGCGTCGGGTGGTTG GATTGTTATATCCGCTGAGATTCTTGGTGGTACATTCCTTCTCGACCAATGCACATTGTACACAACCGGC GATCCGCAGCCTGGTAACCGTGGGGTTATAGATGTAGGTGGGAACTCCGCAGTCCTCACTACAAATACAA CGCAACCCTGT A ACTTCCTT AT ACAAGGCGGC AGTCT GCGAGCGCCCAGCTT AAGT ACGTCT AGTTACCT ACTGCGCGCACGTCTT GAGGGT AGT ACAGTTC.CAGTAAAC ATACA GT ACA GCGGACAGGCT ATTGATGT A GGCTCTCTGGGCAAGGTACT ACAACTCGAT ATT ACCTCGGGCAGT ACCTCTCCTGAGT ATTTGATC'GTGG AGAATTTAGCGGGGTTGCCATCTGGCATCACGCTGGCGTCTGCTGCTGGTGGTTTCGCAAGTGCCCCGAT GCGTATGCCTGTGCTGGGTGGTAGGGTTCAAGTAACTACGGCAACCAACGCGAGTAGCGTTACTGCTCCA GTAACGTTCAGGTACATTTATCCTAAGGCCCCAACCGTCCAGGTCACAAAGACGGACAGGAGCTACGCCG GTAACAGGGTCGGCGTTGCTATCGCCAATCCGACCTCTGCGTCTGGGGCGACGTTGGGTCTGTTCACGGA CGACGGGACAAACTTTAGCTCAGCCGTTACTAACCAGTTGAACTGGCAGGCAGGTATTTATGAGGTGTAA

SEQ ID NO:13

ADN

Género/especie- Virus similar a phikmv NTUH-K2044-K1-1

Título descriptivo-gp34de NTUH-K2044-K1-1

ATGGCCCTGATCCGGCTC.GTGGCGCCCGAGCGCGTGTTCAGCGACCTGGCCAGCATGGTCGCCTATCC.GAAC TTCCAGGTGCAGGACAAGATCACCCTGCTGGGCTCGGCCGGCGGCGACTTCACCTTCACCACCACCGCGTCG GTGGTGGA CA ACGGCACCGTGTT CGC.CGTGCCCGGC.GGCTATC.TCCTGCGGAAGTTCGT C.GGC.CCGGCGT AT AGCTCGTGGTTCAGCAACTGGACCGGGATCGTCACGTTCATGAGCGCGCCGAACCGGCACCTGGTGGTGGA CACCGTGCTGCAGGCCACGAGCGTGCTGAACATCAAGAGCAACAGCACGCTGGAATTCACGGACACGGGCC GCATCCTGCCCGACGCCGCCGTGGCCCGCCAGGTGCTGAACATCACCGGCTCCGCGCCCTCGGTGTTCGTGC

c c c t c g c c g c c g a c g c c g c c g c g g g g t c g a a g g t g a t c a c c g t g g c c g c c g g c g c g c t g t c c g c g g t g a a a GGCACC.T<a c c t c t a t c t g c g c t c c a a c a a g c t g t g c>.<g a c g g c g g g c c g a a c>.<a c c t a t g g c>.<g t c a a g a t c a g c>c a a a t c c g t a a g g t g g t c g g c g t g a g c a c c a g c g g g g g c g t g a c g t c c a t c c g c c t c g a c a a a g c c c t g c a c t a t a a c t a c t a c .c t c t c g g a t g c .c g c c g a a g t g g g c a t c .c c g a c c .a t g g t g g a g a a c g t c a c c c .t g g t g a g c c c g t a c a t c a a c g a g t t c g g c t a c g a c g a c c t g a a c c g c t t c t t c a c c a g c g g c a t c t c c g c g a a c t t c g c GGCCGACCTGCACATC.CAGGACGGCGTC.ATC.ATCGGCAACAAGC.GTCC.GGGC.GC.CTCC.GAC.ATCGAGGGCC g c a g c g c c a t c a a g t t c a a c a a c t g c g t g g a t a g c a c c g t g a a g g g c a c c t g c t t c t a t a a t a t c g g c t g g t a c g g c g t g g a g g t c c t c g g c t g c t c g g a g g a c a c c g a g g t g c a c g a c a t c c a c g c c a t g g a c g t g c g c c a t g c c a t c t c c c t g a a c t g g c a a a g c a c c g c c g a c g g c g a t a a g t g c g g c g a a c c g a t c c a g t t c c t g g g c g t g a a c t g t g a g g c g t a c a g c a c c a c c c a g g c c g g c t t c g a c a c c c a c g a c a t c g g g a a g c g t g t c a a a t t c g t c c g c t g c g t g t c c t a c g a c a g c g c g g a t g a c g g c t t c c a g g c c c g c a c c a a c g g c g t g g a g t a c c t c a a c t g c c g c g c c t a c c g c g c c g c c a t g g a c g g c t t c g c c t c g a a c a c g g g c g t c g c c t t c c c g a t c t a c c g c g a a t GCCTGGCCTACGACAACGTGCGCAGCGGGTTCAACTGCAGCTACGGCGGCGGGTATGTGTACGACTGCGAG

g c g c a c g g c a g c c a g a a c g g c g t c c g c a t c a a c g g c g g c c g g g t c a a a g g c g g g c g c t a c a c c c g c a a c t c g t c g a g c c a c a t c t t c g t g a c g a a a g a t g t g g c g g a a a c c g c c c a a a c c a g c c t c g a g a t c g a c g g c .g t c t c c a t g c g g t a c g a c g g c a c c g g c c g c g c c g t g t a c t t c c a c g g c a c c g t g g g c a t c g a t c c g a c g c t c g t g a g c a t g t c c a a c a a c g a c a t g a c c g g c c a c g g c c t g t t c t g g g c c c t g c t g t c c g g c t a t a c c g t g c a g c c g a c c c c g c c g c g c a t g t c g c g c a a c c t g c t c g a c g a t a c c g g c a t c c g c g g c g t c g c g a c c c t g g t c g c g g g c g a a g c g a c c g t c a a t g c c c g c g t c c g c g g g a a c t t c g g c a g c g t g g c c a a c a g c t t c a a g t g g g t g t c g g a g g t g a a g c t g a c g c g c c t c a c g t t c c c g t c g t c g g c c g g c g c c c t c a c g g t c a c c a g c g t c g c c c a a a a c c a g g a c g t g c c g a c c c c c a a c c c g g a c c t g a a c a g c t t c g t c a t c c g c a g c a g c a a c g c c g c c g a c g t g t c c c a a g t c g c c t g g g a g g t c t a c c t g t g a

SEQ ID NO:14

ADN

Género/especie- Ppl5 similar a T7

Título descriptivo- Secuenciagp44de Pp15 añadida

a t g g c a c g a a c t a t c g t c c a g a a c g c c c t a a c a g g c g g a c a a c a g g a c t t c g a g g t a c c t t t c g a c t a c a t c t t g c a g c g c t t c g t t a a g c t t a c c c t g a t c g g i g a c g g t a a c c g a c a a g a g c t g g t c c t c g g t a c c g a c t t c CGGTTCATCGGTCCTCGCACCGTTCGCACTAACGTCTTCTGGGGACCAGCGCAGGGGTATACCTCCATCGAG ATCCGACGAGTTACCAGCGCTTCTGAT CGTCGC.GTAGAGTTCTCGGACGGGT CC.ATCCTGAC.CGCAGGTGAT CTGAACATCGCCCAGCTTCAGGCCATCCACATTGCCGAAGAAGCGCGAGACTCTGCCACTGAGAACCTGAG CCCAGATGCTGATGGCAACTACGATGCACGTGGTGCGCGCATTTACAACCTCGGTGACGCTGTTCAGCCGAA GGATGCGGTCAACCGGTACACTCTTGACCTCGCTATCGCAGCCGCTCTGGCCATGAATACCGGCAACCCGAA CAACGCCCAGAACATCTCGTACACCCCTAACGGGCCTGGTCAGTCGATCCGAAGTGTTGAAGGCCGTCTGCG GGATGCTGTGTTCGTCTCGGACTACATGACCACTCCACGTGATGGAGTTACCAGTAACCAGCAGGACCTCGA AAAGGCACTCGCTGCGGCGAACGCTAAAGGTGCCGACCTATTCTGGCCTGACGACATCCCGTTCTTCTCCAC GTCCCCGCTGGCACTGATCCACGCGGTCTACCATGTTGGACGTGGTGTCATCAACGCGAACGGTACGCTGTT CTACGTGAACCCGAAGAACGGCCAACACAACAGGCTACACGTGTCTCCCGGGGGCACCGGGGATGGTCTGG CAGCTGGCCGCCCACTGGGGACCATCTGGAGTGCACTCGCGGCCCTTAACATGCGAGCCCCACTGACCACGC GCTGGTCCTTGGAGATGACCGCTGGCGCCTATAATGAAGCCGTTACACTTCCGAACTACCTGACCAGCTGTA ACGACTACTTGGCGTTT A ACTGGCCGAACACCGGTC AGGA ACGT AT GGAGCCC ACT GC GTACCC ATCAGCT C TCGACGGCACAGGCCAGACCGGCCTCACAGGTTTCCACACTGGCATCGGCAACCGCATTACCATCAACAAC GTGTGCATGTCCAACTGGTACGACACTGCGCTGACTCCTACCCAACAGGTGCGAAGAGCGTTCGrTGTAGGT GCGTATTCGACTGCCTACGTGGTCAACTGCGCGTTCATTTACAACGGCATCGCGAGCGTGTCTGTGCTGCCC GGTGGCACTGCTATCGTAACCGGTGGCATCGTCGATGGTGGGCGGTTCGGCCTCGACAACACTGGCGGTCGC CTGTCCCTGACGGCAACCAAGAGCAATTATACGCAGGTCCGGAACTGCCTCGAATATGGACTGTACTCGAAG CATGACGCATCGACCGTAATGGACAACACCGAGTTCCGCAACTGCGGTAATCACCCTGCGGCTGTTGCGTAT

g g t g c t g c a a t c t t c g c g t a c a a g t t c a a c t g t t c t g t t g a c a c t c g t g g g g t c a a g t t c t a c g g c a a c a a c ATCGCX’CAGCACTGCCGTGGCGGTATCACCTCGGACAATCCGGGCGATCCGGACATCTACGGTACCGGCGCA GATGCTAATAAGCGTCTATTCCTGTGCACCGGTGGTGGCTCTGACGACATCCAGTTCTACGAAGCTCGGCGC

g t c a t g g a c a t c a c g a a g c g c a c t g g t g g c g g c t c a a c t a c t g c c a g c g t a t c g t c g c t g c t a c t g g c t g c c GTTGCGTCTGTCCGTAAGGGCTACTTTGCGCACAACGATCAGGTGATCCGGATGACCCTGATGTTCCGCGCT

a c a g g c t c g g c t g g c a t c t t c a c g c c g a c c t t g c g c a c a c c t c t g g g g a c t a t c c c t c t g g g t a g c t t c a g g GTCGCATCGGGACAGTACGGCGAGATCAAGTTGACCATTCGACCTACTCTGACATCTGATGGTCTCArAGTC GGGTTCTCCTGCATCAACGCCGTGCAGAATCTTGGGTCCTCTGTTGGTCAAATCATCGTCAGCGGCACCGTA GACCTCCGCACCGTCGACCAGCTGGTCGAGATGTGGGGCTATTCGGAAGCTGGTGGCACCGCTTCGTACATT CAAGGCCTGATCGAGCTGGTCGGGTGA

SEQ ID NO:15

ADN

Género/especie-Aggregatibacter actinomycetemcomitans

Título descriptivo- Secuencia dedspBañadida

ATGAACTGTTGCGTCAAGGGCAATTCCATCTACCCCCAGAAGACCTCCACCAAGCAGACCGGCCTGATGCTC GAT ATCGCCCGGCATTT CT ACAGCCCCGAGGT GATCAAGAGCTTCATCGAT ACGATCAGCCTGAGCGGCGGC AACTTCCTCCACCTGCACTTCTCGGACCATGAAAACTATGCCATCGAGTCGCACCTGCTCAACCAGCGGGCG GAGAACGCCGTCCAGGGGAAGGATGGCATCTACATCAATCCGTACACCGGGAAACCGTTCCTGAGCTACCG CCAGCTGGACGACATCAAGGCCTACGCCAAGGCCAAGGGCATCGAACTGATCCCGGAGCTGGACAGCCCGA ACCATATGACGGCCATCTTCAAACTGGTCCAGAAGGACCGCGGCGTCAAGTACCTGCAGGGGCTGAAATCC CGCCAGGTGGACGACGAGATCGACATCACCAACGCCGATAGCATCACCTTCATGCAGAGCCTGATGAGCGA GGT CATCGAT ATCTT CGGCG AC ACGAGCC AGCACTTCCACATCGGCGGC GAC GA ATTCGGCT ACT CCGTC GA GAGCAACCACGAGTTCATCACCTACGCCAACAAGCTGTCGTACTTCCTGGAGAAGAAGGGGCTCAAGACCC GCATGTGGAACGACGGCCTCATCAAGAACACCTTCGAGCAGATCAATCCCAACATCGAAATCACGTACTGG TCGTACGACGGCGACACCCAGGATAAGAACGAAGCGGCCGAGCGCCGCGACATGCGCGTGAGCCTGCCGGA GCTGCTGGCGAAGGGCTTCACCGTGCTGAACTACAACAGCTACTACCTCTACATCGTGCCGAAGGCGAGCCC GACGTTCTCGCAGGACGCCGCCTTCGCCGCCAAAGACGTGATCAAGAACTGGGATCTGGGCGTCTGGGATG GCCGGAACACCAAGAACCGCGTGCAGAACACCCATGAGATCGCCGGGGCGGCGCTGTCGATCTGGGGCGAG GATGCGAAGGCGCTCAAGGACGAGACGATCCAGAAGAACACCAAAAGCCTGCTCGAGGCCGTCATCCACAA GACCAACGGCGACGAGTGA

SEQ ID NO:16

ADN

Género/especie-Staphylococcus aureus

Título descriptivo- Secuencia de SaPSMa3 añadida

ATGGAGTTCGTGGCGAAGCTCTTCAAGTTCTTCAAGGACCTGCTCGGGAAGTTCCTGGGGAATAACTGA

SEQ ID NO:17

ADN

Género/especie-Staphylococcus aureus

Título descriptivo- Secuencia de SaPAMb2 añadida

ATGACCGGCCTGGCCGAGGCGATCGCGAATACCGTCCAGGCGGCCCAGCAGCACGACAGCGTCAAGCTGGG C ACCT C GATCGTGGAC ATCGT CGCCAACGGCGT GGGCCTGCTGGGC AAACT CTTCGGCTT CTGA

SEQ ID NO:18

ADN

Género/especie-Staphylococcus epidermidis

Título descriptivo- Secuencia de SePSMa añadida

ATGGCGGACGTCATCGCCAAGATCGTCGAGATCGTGAAGGGCCTGATCGACCAGTTCACCCAGAAGTGA SEQ ID NO:19

ADN

Género/especie- Levivirus MS2

Título descriptivo- Secuencia de MS2 L añadida

ATGGAGACCCGGTTCCCGCACCAGTCCCAGCAAACCCCGGCCACCACCAACCGCCCCCCCCCCTTCAAGCA CGAGGACTACCCGTGCCGCCGGCAGCAGCGCAGCTCCACCCTGTACGTGCTGATCTTCCTGGCGATCTTCCT GAGCAAGTTCACCAACCAGCTGCTGCTGTCCCTGCTGGAGGCGGTCATCCGGACCGTCACCACCCTGCAGCA GCTGCTGACCTGA

SEQ ID NO:20

ADN

Género/especie- Levivirus PRR1

Título descriptivo- Secuencia de PRR1 L añadida

ATGTGCAAGGTGTCTACTAAGGTAGACTCTAAACTGACTGAGTCAGTTGGACAACTCACCATAAGGAGCTAC CTATGGCTACGGAATATCCTAGCATTAGCAGGACTTCTTTTCGTAATCCTTCTTGCGACCAATCATTTATCCA TCGCTATCTACAGTCCGTAA

SEQ ID NO:21

ADN

Género/especie- Virus similar a phikmv LUZ19

Título descriptivo- promotor degp32de LUZ19 (P<32>)

CGACCCTGCCCTACTCCGGCCTTAAACCCACATCCAAAAGAGAGAGAATCGC

SEQ ID NO:22

ADN

Género/especie- Virus similar a phikmv LUZ19

Título descriptivo- Terminador degp32de LUZ19 (T<32>)

TGCCACGAAACCCCGCACTTCGGTGTGGGGTTTCTTCAAAGCCTAACGACCCGCGCAGATTCCCTGCGTGGG TTTTT GCGCTTT AGGAGAAACCCT

SEQ ID NO:23

ADN

Género/especie- Virus similar a phikmv LUZ19

Título descriptivo- Región degp7de LUZ19 de tipo salvaje

TACAAGGTGGTGGCACCCAGCTCGGCGGAAGGTATCATTGTGCTGGCGACCAAGCAGACGCCGGCGCTAGC CCAAGCAGCCGTCGTACTGCACAGCATGAACCCTGCGCAGTATCCCGCAGGTTCGGCTATCCTCAACACGGC CTGGAAGTGCCGCCGCCTGGGAGTGGGCGAGTACGTCAAGCTCGTCCAAGGGGAGGAGGAC

SEQ ID NO:24

ADN

Género/especie- Virus similar a phikmv LUZ19

Título descriptivo- Región degp18de LUZ19 de tipo salvaje

GAATGCCAACCGAAGAAGAACGCATGATCCGCTGTTTACTGGCGGATATCCACGAGCCACTGGACCTGCTGT TCCCCGGCCTCCGTACCAAGGCCCATATGGACCCGCAAGCAGAGGAACTGTCGATTCGAATTGACTACGACC ATGCGAAGCTGGGCCGTATGGGATTCTGCCACGCGGTATCCCTATATCAACTGTCCATATATGGCCGCGAGG GGATGGTCCGCTACCTGATGCAGGAGATTCCCCGCCGCGTGCTGGAAGGTCTGCTGGTCAAGGCGCAGCAGT AC AGCC AA AGCAACTGGT AC AG C AAAT GAC GAC

SEQ ID NO:25

ADN

Género/especie- Virus similar a phikmv LUZ19

Título descriptivo-gp49y región intergénicagp48-gp49de LUZ19 de tipo salvaje

GGGGACACCATGAGCAAAGCCAAACTACGAGTCATCGCCGACACCCCGGAGCTGGAGTCAGTGCTAAAAGC ATTGCTGACCGCCACCTACGCTATCGAGGACCTGCTCAACGAGGCCGTGGCTAGCAAGGTGCTAAACTCCCG CCTGGGCTGGTCCGCAGTCGGCGAGTATGTCGAACTGTTCAACCGCACGCAATCCCGCGTGGCCGGGTTGAT TCCCGAGTAG

SEQ ID NO:26

ADN

Género/especie- Virus similar a phikmv LKD16

Título descriptivo- Gengp18de LKD16 de tipo salvaje

GTGCGAGTACCAACTGAACACGAGCGCACCCTGCGCTGCCTGCTCCAAGACATCCACGGGCCGCTGAATCTG CTGTTCCCAGGTATCCGGGTGAAGGTGGAGGAGGCGTGCCTCGGATACTTGGGCTACAGGGAGCGGGGCTA TTGGGAGCTGCGCCTCCAGGTGGACTACGACCACCCGAAGCTTGGGCACCTCCGCTACAGTCAGGCCGTGCC GGAGTACGTGCTGATCAACGACCGCGACAGCATCATCAAGTACC'TGATCGAAGCAGTCCCTCGGCAGGTAC TAGAGGGCATGCTCAATAAGGCCCAGGAATTCGTAACCAAGAACTGGTATTCCCTATGA

SEQ ID NO:27

ADN

Sintético (artificial/desconocido)

Título descriptivo- Gen que codifica NLS-FLAG-CAS9-His

ATGCCCAAGAAAAAGCGGAAGGTCGGCGAC.TACAAGGATGACGATGACAAGTTGGAGCCTGGAGAGAAGC c c t a c a a a t g c c c t g a g t g c g g a a a g a g c t t c a g c c a a t c t g g a g c c t t g a c c c g g c a t c a a c g a a c g c a t ACACGAGACAAGAAGTACTCCATCGGGCTGGACATCGGGACGAACTCCGTGGGATGGGCCGTGATCACAGA

c g a a t a c a a g g t g c c t t c c a a g a a g t t c a a g g t g c t g g g g a a c a c g g a c a g a c a c t c c a t c a a g a a g a a c c t c a t c g g g g c c t t g c t c t t c g a c t c c g g a g a a a c c g c c g a a g c a a c g c g a t t g a a a a g a a c c g c c a g a a g a c g a t a c a c a c g a c g g a a g a a c c g c a t c t g c t a c c t c c a g g a g a t c t t c a g c a a c g a g a t g g c c a a g g t g g a c g a c t c g t t c t t t c a t c g c c t g g a g g a g a g c t t c c t g g t g g a g g a a g a c a a g a a a c a t g a g c g c c a c c c g a t c t t c g g g a a c a t c g t g g a c g a a g t g g c c t a c c a c g a g a a a t a c c c c a c g a t c t a c c a c t t g c g c a a g a a a c t c g t g g a c t c c a c g g a c a a a g c g g a c t t g c g g t t g a t c t a c t t g g c c t t g g c c c a c a t g a t c a a a t t t c g g g g c c a c t t c c t g a t c g a g g g c g a c t t g a a t c c c g a c a a t t c c g a c g t g g a c a a g c t c t t c a t c c a g c t g g t g c a g a c c t a c a a c c a g c t c t t c g a g g a g a a c c c c a t c a a t g c c t c c g g a g t g g a c g c c a a a g c c a t c t t g t c c GCCC GATT GT CC AAATCC AGACGCTT GGAGAACTTGAT CGC AC AACTT CCTGGCGAGA AG AAGAACGGCCT

c t t c g g c a a c t t g a t c g c g c t g t c g c t g g g a t t g a c g c c t a a c t t c a a g t c c a a c t t c g a c t t g g c c g a g g a c g c c a a g t t g c a a c t g t c c a a g g a c a c c t a c g a c g a c g a c c t c g a c a a c c t g c t g g c c c a a a t t g g c g a c c a a t a c g c g g a c t t g t t t t t g g c g g c c a a g a a c t t g a g c g a c g c c a t c t t g t t g a g c g a c a t c t t g c g c g t g a a t a c g g a g a t c a c c a a a g c c c c t t t g t c c g c c t c t a t g a t c a a g c g g t a c g a c g a g c a c c a c c a a g a c t t g a c c c t g t t g a a a g c c c t c g t g c g g c a a c a a t t g c c c g a g a a g t a c a a g g a g a t c t t c t t c g a c c a g t c c a a g a a c g g g t a c g c c g g c t a c a t c g a c g g a g g a g c c t c c c a a g a a g a g t t c t a c a a g t t c a t c a a g c c c a t c c t g g a g a a g a t g g a c g g c a c c g a g g a g t t g c t c g t g a a g c t g a a c c g c g a a g a c t t g t t g c g a a a a c a g c g g a c<g t t c g a c a a t g g c a g c a t c c>'<c c c a c c a a a t c c a t t t g g g a g a g t t g c a c g c c a t c t t g c g a c g g c a a g a g g>ACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACCGCGAGAAAATCGAGAAGATCCTGACGTTCAGAATCCCCTACTACG TGGGACCCTTGGCCCGAGGCAATTCCCGGTrTGCATGGATGACGCGCAAAAGCGAAGAGACGATCACCCCC TGGAACTTCGAAGAAGTGGTCGACAAAGGAGCATCCGCACAGAGCTTCATCGAGCGAATGACGAACTTCGA CAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGTTGCCCAAGCATTCGCTGCTGTACGAGTACTTCACGGTGTACAACGA GCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGCAAACCCGCGTTCCTGTCGGGAGAGCAAAAGAAGG CCATTGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAACAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAG AAGATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAGATCTCCGGCGTGGAGGACCGATTCAATGCCTCCTTGGGAACCTAC CATGACCTCCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGA CATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGAGAGATGATCGAGGAACGGTTGAAAACGTACGCCCACTT GTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAACGCCGCCGCTACACCGGATGGGGACGATTGAGCCGCAAAC TGATTAATGGAATTCGCGACAAGCAATCCGGAAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGTCCGACGGGTTCGCCA ACCGCAACTTCATGCAGCTCATCCACGACGACTCCTTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAAGTGT

c c g g a c a a g g a g a c t c c t t g c a c g a g c a c a t c g c c a a t t t g g c c g g a t c c c c c g c a a t c a a a a a a g g c a t c TTGCAAACCGTGAAAGTGGTCGACGAACTGGTGAAGGTGATGGGACGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGAT

c g a a a t g g c c c g c g a g a a c c a a a c c a c c c a a a a a g g a c a g a a g a a c t c c c g a g a g c g c a t g a a g c g g a t c GAAGAGGGCATCAAGGAGTTGGGCTCCCAGATCCTGAAGGAGCATCCCGTGGAGAATACCCAATTGCAAAA

c g a g a a g c t c t a c c t c t a c t a c c t c c a g a a c g g g c g g g a c a t g t a c g t c g a c c a a g a g c t g g a c a t c a a c c g c c t c t c c g a c t a c g a t g t g g a t c a t a t t g t g c c c c a g a g c t t c c t c a a g g a c g a c a g c a t c g a c a a c a a g g t c c t g a c g c g c a g c g a c a a g a a c c g g g g c a a g t c t g a c a a t g t g c c t t c c g a a g a a g t c g t g a a g a a g a t g a a g a a c t a c t g g c g g c a g c t g c t c a a c g c c a a g c t c a t c a c c c a a c g g a a g t t c g a c a a c c t g a c c a a g g c c g a g a g a g g a g g a t t g t c c g a g t t g g a c a a a g c c g g c t t c a t t a a a c g c c a a c t c g t g g a g a c c c g c c a g a t c a c g a a g c a c g t g g c c c a a a t c t t g g a c t c c c g g a t g a a c a c g a a a t a c g a c g a g a a t g a c a a g c t g a t c c g c g a g g t g a a g g t g a t c a c g c t g a a g t c c a a g c t g g t g a g c g a c t t c c g g a a g g a c t t c c a g t t c t a c a a g g t g c g g g a g a t c a a c a a c t a c c a t c a c g c c c a t g a c g c c t a c c t g a a c g c c g t g g t c g g a a c c g c c c t g a t c a a g a a a t a c c c c a a g c t g g a g t c c g a a t t c g t g t a c g g a g a t t a c a a g g t c t a c g a c g t g c g g a a g a t g a t c g c g a a g t c c g a g c a g g a g a t c g g c a a a g c c a c c g c c a a g t a c t t c t t t t a c t c c a a c a t c a t g a a c t t c t t c a a g a c c g a g a t c a c g c t c g c c a a c g g c g a g a t c c g c a a g c g c c c c c t g a t c g a g a c c a a c g g c g a g a c g g g a g a g a t t g t g t g g g a c a a a g g a a g a g a t t t t g c c a c a g t g c g c a a g g t g c t g t c c a t g c c t c a g g t g a a c a t c g t g a a g a a g a c c g a g g t g c a a a c a g g a g g g t t t t c c a a a g a g t c c a t t t t g c c t a a g a g g a a t t c c g a c a a g c t c a t c g c c c g c a a g a a g g a c t g g g a c c c c a a g a a g t a c g g g g g c t t c g a c t c c c c c a c g g t g g c c t a c t c c g t g t t g g t g g t g g c c a a a g t g g a g a a a g g g a a g a g c a a g a a g c t g a a a t c c g t g a a g g a g t t g c

t c g g a a t c a c g a t c a t g g a a c g a t c g t c g t t c g a g a a a a a c c c c a t c g a c t t c c t c g a a g c c a a a g g g t a c a a a g a g g t g a a g a a g g a c c t g a t c a t c a a g c t g c c c a a g t a c t c c c t g t t c g a g c t g g a g a a c g g c c g c a a g c g g a t g c t g g c c t c c g c c g g g g a a c t g c a g a a a g g g a a c g a a t t g g c c t t g c c c t c c a a a t a c g t g a a c t t c c t c t a c t t g g c c t c c c a t t a c g a a a a g c t c a a a g g a t c c c c t g a g g a c a a t g a g c a g a a g c a a c t c t t c g t g g a a c a a c a c a a g c a c t a c c t g g a c g a g a t c a t c g a g c a g a t c a g c g a g t t c t c c a a g c g c g t g a t c c t c GCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTCTCCGCCTACAACAAGCACCGCGACAAGCCrATCCGCGAGCAAGC c g a c a a t a t c a t t c a c c t g t t t a c c c t g a c c a a t t t g g g a g c c c c t g c c g c c t t t a a a t a c t t t g a c a c c a c c ATCGACCGCAAAAGATACACCTCCACCAAGGAAGTCTTGGACGCCACCCTCATCCACCAGTCCATCACGGGC CTCTACGAGACGCCCATCGACCTCTCCCAATTGGGCGGCGACCATCATCACCACCACCACTAA

SEQ ID NO:28

ADN

Género/especie- Inovirus M13MP18

Título descriptivo- Región M13MP18 de tipo salvaje reemplazada

ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT'G GCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCA CATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGC CTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGA TCTTCCTGAGGCCGATACGGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACAC CAACGTAACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTC AC ATTTAATGTTGATGAA AGCTGGCT ACAGGAAGGCC AGACGCGAATT ATTTTTGATGGCGTT CCT ATT GGT TAA

SEQ ID NO:29

ADN

Desconocido/artificial- Disponible en el mercado en DNA2.0

Título descriptivo- Secuenciapaprika

ATGGTGTCAAAGGGAGAAGAACTGATCAAAGAGAATATGAGGATGAAACTCTACATGGAAGGAACTGTGA ACAACCACCATTTCAAGTGCACGAGCGAGGGTGAAGGGAAACCTTACGAAGGTACCCAGACCATGCCGATT AAGGTCGTCGAAGGAGGACCACTCCCCTTCGCATTCGACATCCTGGCCACTTCCTTCATGTACGGGTCGCGC ACTTTCATCAAGTACCCAAAAGGGATCCCCGACTTCTTCAAGCAGTCCTTTCCGGAGGGATTCACTTGGGAA CGCGTCACTAGATACGAGGATGGCGGAGTGGTCACCGTGATGCAAGACACCTCTTTGGAAGATGGATGCCT GGTGTACCACGTGCAAGTCAGAGGAGTGAACTTTCCGAGCAATGGGCCGGTGATGCAGAAGAAAACCAAGG GCTGGGAACCGAACACCGAAATGCTGTATCCAGCAGACGGAGGCTTGGAGGGCCGGTCCGACATGGCTCTG

a a g c t t g t t g g a g g a g g a c a t c t g t c c t g c t c g t t c g t g a c g a c c t a c c g g a g c a a g a a g c c g g c g a a a a a CCTTAAGATGCGGGGGATCCACGCGGTGGATCATCGCCTGGAAAGGCTCGAGGAGTCAGACAACGAGATGT TTGTCGTGCAACGCGAGCACGCCGTGGCCCGCTACTGTGATCTCCCTTCAAAGCTGGGCCACAAGCTGAATT CCGGCCTCCGGTCGAGAGCCCAGGCTTCGAATTCAGCCGTGGACGGAACTGCGGGCCCTGGTTCGACCGGA AGCCGATGA

SEQ ID NO:30

ADN

Género/especie- Lambda similar a lambda

Título descriptivo- Secuencia del fago AcIIdeE. colide tipo salvaje

ATGGTTCGTGCAAACAAACGCA ACGAGGCTCT AC.GAATCGAGAGTGCGTT GCTT AACAAAATCGCAATGCTT GGAACrGAGAAGACAGCGGAAGCTGTGGGCGTTGATAAGTCGCAGArCAGCAGGTGGAAGAGGGACTGGA TTCCAAAGTTCTCAATGCTGCTTGCTGTTCTTGAATGGGGGGTCGTTGACGACGACATGGCTCGATTGGCGC GACAAGTTGCTGCGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATG GAGTTCTGA

SEQ ID NO:31

Proteína

Sintético (artificial/desconocido)

Desciiptive title- NLS-FLAG-CAS9-IIis protein translated frora SEQ ID NO:27 MPKKKRKVGDYKDDDDK.LEPGEKPYKCPECGKSFSQSGALTRHQRTHTRDK.KYSIGLDIGTNSVGWAVITDCYK VPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICY'LQEIFSNEMAKVDDSFFHRLE ESFLVEEDKKIIERIIPIFGNIVDEVAYIIEKYPTIYIILRKKLVDSTDKADLRLIYLALAIIMIKFRGIIFLIEGDLKPDN SDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFK.SN FDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKKXSDATLLSDILRWTErTKAPLSASMIKRYDEHHQ DLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYLDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFD KGSlPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLBCDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNrEEVA'D KGASAQSFIERMTNFDKNLPKEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRK.PAFLSGEQKKAIVDLLFKTNR KVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYIIDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEE RLKTYAHLFDDKVMK.QLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRKFY1QLIHDDSLTFKEDIQ

KAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKR IEEGIKELGSQILKEIIPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDY'DIIIVPQSFLKDDSIDNKVLTR SDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFTKRQLVETRQTTKHVA QILDSRJV1NTKYDEKDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESE FVYGDYKATDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLAKGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATV RKVESMPQVKTV'KKTEVQTGGFSKESTLPKRNSDKLTARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKWKGKSKKL KSVKELLG1TIMERSSFEKNP1DFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELEKGRKRVILASAGELQKGNELALPSKYV KFLYLASITYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQirKIIYLDETTEQTSEFSKRVTLADANLDKVLSAYNKTIRDKPrREQAENrr HLFTLTNLGAPAAFKYFDTTrDRKRYTSTKEVLDATLTHqSTTGLYETRTDLSQLGGDHHHHHH

SEQ ID NO:32

ADN

Género/especie- Citomegalovirus HCMV

Título descriptivo- Posedición del fragmento HCMV RL13

ATGGACTGGCGATTTACGGTTACGTGGACGATACTAATGTCCGCGTTGTCAGAAAGCTGCAATCAAACCTGT TCTTGTCAATGTCCCTGTAGTACTACCGTTAACTATTCAACTAGTACTGAGACAGCCACATCAACATACAGTA CAACAGTTATCAGCAATAAAAGCACTTCAGAATCTATAAATTGCTCTACTGCAACTACACCAGCAAACACCG TTTCTACAAAACCGTCGGAAACAACCACACAGATATCCACAACGACGAACACAAACGTTGAGACTACCACA TGTACCAACACCACCACGACCGTT a c t t g t g a t g g t t t c AATT a t a c a g t c c a ta a a a g a t g c g a t c g c a g t T ACGAGGTAATCAACGTAACAGGATACGTTGGT AGCAACAT AACTCT AAAAAAATGCAATCAGACTGAGAA ATGGCACAATGTAGACTGGATTCATTATGAGTACCCCACGCATAAAATGTGCGAATTAGGCAACTATCACCA AACCACACCACGGCACGACATATGTTTTGACTGCAACGACACCTCCCTAACTATCTACAACTTAACCACAAA AAACGCTGGAAAATATACCAGGCGTCACCGTGATAACGGTCAAGAAGAAAATTACTACGTAACGGTGTTAA TTGGAGACACAACGTTATTCACTCTTGGCACATGCCCTGTAAGATATAAAGAATCTACGAACACTGAAAACA CC ATTGGAAGT AGCAT C AT AG A AACC ATT GAGAAAGCT AAC ATTCCCCTGGGAATT C ATGCTGT ATGGGCAG GCGTAGTGGTATCAGTGGCGCTTATAGCGTTGTACATGGGTAGCCATCGCATTCCCAAAAAGCCGCATTACA CCAAACTTCCCAAATATGATCCAGATGAATTTTGGACTAAGGCTTAA

SEQ ID NO:33

ADN

Género/especie- Citomegalovirus HCMV

Título descriptivo- Preedición del fragmento HCMV RL 13

ATGGACTGGCGATTT ACGGTT ACGTGGACCGTT ACTTGTGATGGTTTCAATT AT ACAGT CCAT A AAAGAT GC. GATCGCAGTTACGAGGTAATCAACGTAACAGGATACGTTGGTAGCAACATAACTCTAAAAAAATGCAATCA GACTGAGAAATGGCACAATGTAGACTGGATTCATTATGAGTACCCCACGCATAAAATGTGCGAATTAGGCA ACTATCACCAAACCACACCACGGCACGACATATGTTTTGACTGCAACGACACCTCCCTAACTATCTACAACT TAACCACAAAAAACGCTGGAAAATATACCAGGCGTCACCGTGATAACGGTCAAGAAGAAAATTACTACGTA ACGGTGTTAATTGGAGACACAACGTTATTCACTCTTGGCACATGCCCTGTAAGATATAAAGAATCTACGAAC ACTGAAAACACCATTGGAAGTAGCATCATAGAAACCATTGAGAAAGCTAACATTCCCCTGGGAATTCATGCT

g t a t g g g c a g g c g t a g t g g t a t c a g t g g c g c t t a t a g c g t t g t a c a t g g g t a g c c a t c g c a t t c c c a a a a a g CCGCATTACACCAAACTTCCCAAATATGATCCAGATGAATTTTGGACTAAGGCTTAA

SEQ ID NO:34

Proteína

Género/especie- Virus similar a phikmv LUZ19

Título descriptivo- Secuencia de la proteína Gpl3 de LUZ19 de tipo silvestre

MLALGAFDLSGLMVGSCLVVGGELKALCVDDRHSRQGIGAELVRAAELAGAEYLTCFEFLEPFYADLGWSTTH REANWTAGEPDVLIIMRAPGIIDV

SEQ ID NO:35

Proteína

Género/especie- Virus similar a phikmv LUZ19

Título descriptivo- Secuencia de la proteína Gp38 de LUZ19 de tipo silvestre

MARFKNPET1HVADGVEAVFSLDFPFLRREDVFVQVDKILVTDYTWVDDTNIOLAVVPKKDQEVRIFRDTPAQVP DTOFSQDIPFLPRYIDANNKQLLYAVOEGINTANLALDGVIDAIRIAEEARRLAOEALDAANEALRRALGFAEIRT VT’EDSDIDPSWGYWKRCITADKPLTLTMQMEDPDAPWVEFSEV'HFEQAGVRDLNIVAGPGVTIKRLQNTTMQL Y GEN G V CTLKRLGANH W1VF GAMEDE

SEQ ID NO:36

Proteína

Género/especie- Virus similar a phikmv LUZ19

Título descriptivo- Secuencia de la proteína Gp40 de LUZ19 de tipo silvestre

MFKTEVKGRYTLIRRKADGTPVETLEFDNUTNAGLDWIAAMDTDLMGEPVAVSTSTADPNPSAPAIPEWQRTS ASAPGGGTTSGLDGEU'LFWRRRW'RFPQGTLAGQVLATVGLICNSDRRFESKTGELIPKDTPLSYTRIKDAAGQPT

TLVVAADEILDVQYEFRSRPVGTAEAKFVISGVERTFRLIPKPFANRANLSGERYIFYNTKPYINGKDASGGNVRD GQWQKKYPKYVRGSYKAQITLLAQVQNGNMAGGITGTEELQiYNGRNYVLDINPPVVKNNTQEFTVTLEFTVAR A

SEQ ID NO:37

Proteína

Género/especie-Pseudomonas aeruginosa

Título descriptivo- Secuencia de la proteína PyoS5

MSNDK’EVPGSMVIVAQGPDDQYAYEVPPIDSAAVAGNMFGDLIQREIYLQKNIYYPVRSIFEQGTKEKKEINKKV SDQVDGLLKQITQGKREATRQERVDVMSAVLHKMESDLEGYKKTFTKGPFIDYEKQSSLSIYEAWVKIWEKNSW EERKKYPFQQLVRDELERAVAYYKQDSLSEAVKVLRQELNKQKALKEKEDLSQLERDYRTRKANLEMKVQSEL DQAGSALPPLVSPTPEQWLERATRLVTQATADKKQLQTTNKTLIKKSPTPLEKQKATYKGELLVDEIASLQARLVK LNAETTRRRTEAERKAAEEQALQDA1KFTADFYKEVTEKFGARTSEMARQLAEGARGKN1RSSAEA1KSFEKÍ1KD ALNKKLSLKDRQAIAKAFDSLDKQMMAKSLEKFSKGFGVVGKATDAASLYQEFKISTETGDWKPFFVKIETLAA GAAASWLVGIAFATATATPIGILGFALVMAVTGAMIDEDLLEKANNLVISI

SEQ ID NO:38

Proteína

Género/especie- Virus similar a phikmv LKD16

Título descriptivo- Secuencia de la proteína Gp18 de LKD16

MRWTETTERTLRCLLQDmGPLNLLFPGTRVKVEEACLGYLGYRERGYWELRLQVDYDnPKLGrTLRYSQAVPEY VLIKDRDSUKYLMEAWRQVLEGMLNKAQEFVTKNWYSL

SEQ ID NO:39

Proteína

Género/especie- Virus similar a phikmv LKA1

Título descriptivo- Secuencia de la proteína Gp49 de LKD16

MAQTPSTWADYVGDGVEDTFQVTFPYQKQQEVFVTVGGDPAAFTFISAGWIQLAAVPVNGAAIRVRRSTEAFEP RIIEFANGV’PLLPRFLDENNTQFLYTVQEAVNETIIGIASEALSVAEEARGIAQAASDKVDAATIDSAIIQLRLDLAD PAKGPGLLGYDRDVSYPVGSVGQSLQFLEMGRVTPAQFGAVGDGASHPLSERYATLABAQTVYPHAVALSDETD WAALQAAVDSGAPVÜIPSGDY01NRG1SSTGSLQ1AGDGATSIIRPTAAFTGTSVLSCVGSLVALPNISSVSAGSLT1 DFASTPKLVAGDVFITYNPTDSSFSGFRTSYRAGEFCEVRAVSGNTVTIRSALYAAYDGATVAÍYKVVSGVVDTASI QIVGGTVPMNGLLVEAVVSPRVDDVTVTLANNAGVYFARCYDAKITNSNISNIGDGGDDYGUFGNCHDGGADN CKVYARRIIAIATGGDAEVGCVPVRNVRMRKCTLRNDITSGTIICADFIIGNAEDCSYENCTIYGGATW'OGKDISY RHCTITNASGGWIVISAEILGGTFLLDQCTLYTTGDPQPGNRGVIDVGGNSAVLTTNTTQPCNFLIQGGSLRAPSLS TSSYLLRARLEGSTVPVNTQYSGQAIDVGSLGKVLQLDITSGSTSPEYLIVENLAGLPSGITLASAAGGFASAPMRlVf PVLGGRVQVTTATNASSVTAPVTFRYIYPKAPTVQVTKTDRSYAGNRVGVAIANPTSASGArLGLFTDDGTNFSS AVTNQLNWQAGIYEV

SEQ ID NO:40

Proteína

Género/especie- Virus similar a phikmv NTUH-K2044-K1-1

Título descriptivo- Secuencia de la proteína Gp34 de LKD16

MALIRLVAPERVFSDLASMVAYPKFQVQDKITLLGSAGGDFTFTTTASVVDNGTVFAVPGGYLLRKFVGPAYSS WFSNWTGIVTFMSAPNRIILWDTVLQATSVLNIKSKSTLEFTDTGRILPDAAVARQVLKITGSAPSVFWLAADA AAGSKVrTVAAGALSAVKGTYLYLRSNKLCDGGPNTYGATCISQIRKVVGVSTSGGVTSIRLDKALITYNYYLSDA AEVGIPTMVENVTLVSPYINEFGYDDLNRFFTSGISANFAADLHÍQDGVIIGKKRPGASDIEGRSAIKFKNCVDSTV KGTCFYNIGWYGVEVLGCSEDTEWDIHAMDVRHAISLNWQSTADGDKWGEPIEFLGVNCEAYSTTQAGEDTH DIGKRVKFVRCVSYDSADDGFQARTNGVEYLKCRAYRAAYIDGFASNTGVAFPIYRECLAYDIS VRSGFKCSYGG GYVYDCEAHGSQNGVRINGGRVKGGRYTRNSSSHEFVTKDVAETAQTSLEIDGVSMRYDGTGRAVYFHGTVGID PTLVSMSKNDMTGIIGLFW'ALLSGYTVQPTPPRMSRNLLDDTGIRGVATLVAGEATWARWGNFGSVAKSEKW VSEVKLTRLTFPSSAGALTWSVAQNQDVPTPNPDLNSFVIRSSNAADVSQVAWEVYL

SEQ ID NO:41

Proteína

Género/especie- Ppl5 similar a T7

Título descriptivo- Secuencia de la proteína Gp44 de Pp15

MARTIVQNALTGGQQDFEVPFDYILQRFVKLTLTGDGKRQELVLGTDFRFTGPRTVRTNVFWGPAQGYTSTETRRV TSASDRRVEFSDGSiLTAGDLMAQLQAUlIAEEARDSATENLSPDADGNYDARGARIYNLGDAVQPKDAVNRYT LDLAIAAALAMNTGNPNNAQNISYTPNGPGQSrRSVEGRLRDAVFVSDYMTTPRDGVTSNQQDLEKALAAANAK GADLF\\TDDIPFFSTSPLALmAVYIIVGRGVINANGTLFYVNPKNGQIINRLIIVSPGGTGDGLAAGRPLGTrWSAL AALNMRAPLTTRWSLEMTAGAYKEAVTLPNYLTSCNÜYLAFNWPNTGQERMEPTAYPSALDGTGQTGLTGFnT GIGNRITINNVCMSNWYDTALTPTQQVRRAFVVGAYSTAYVVNCAFIYNGIASVSVLPGGTAIVTGGIVDGGRFG LDNTGGRLSLTATKSNYTQVRNCLEYGLYSK.HDASTVV1DNTEFRNCGNHPAAVAYGAAIFAYKFNCSVDTRGV

KFYGNNIAQIICRGGITSDNPGDPDIYGTGADANKRLFLCTGGGSDDIQFYEARRVMDITKRTGGGSTTASVSSLL LAAVASVRKGYFAHNDQVTRMTLWRATGSAGTFTPTLRTPLGTIPLGSFRVASGQYGEIKLTIRPTLTSDGLrVGF SCINAVQNLGSSVGQIIVSGT\'DLRT\'DQLVEMWGYSEAGGTASYIQGLELVG

SEQ ID NO:42

Proteína

Género/especie-Aggregatibacter actinomycetemcomitans

Título descriptivo- Secuencia de la proteína DspB

MNCCVKGNSrYPQKTSTKQTGLMLDIARHFYSPEVIKSFIDTISLSGGNFLHLHFSDHEKYAIESHLLNQRAENAV QGKDG1YINPYTGKPFLSYRQLDDIKAYAKAKGIELIPELDSPNHMTAIFKLVQKDRGVKYLQGLKSRQVDDEIDI TNADSITFMQSLMSEVIDIFGDTSQIIFIIIGGDEFGYSVESNIIEFITYANKLSYFLEKKGLKTRMWNDGLIKNTFEQI KPNIEITYWSYDGDTQDKNEAAERRDMRVSLPELLAKGFTVLKYKSYYLY1VPKASPTFSQDAAFAAKDVIKNW DLG\rWDGRNTKNRVQKTnETAGAALSTWGEDAKALKDETTQKNTKSLLEAVniKTNGDE

SEQ ID NO:43

Proteína

Género/especie-Staphylococcus aureus

Título descriptivo- Secuencia de la proteína SaPSMa3

MEFVAKLFKFFKDLLGKFLGNN

SEQ ID NO:44

Proteína

Género/especie-Staphylococcus aureus

Título descriptivo- Secuencia de la proteína SaPAMb2

MTGLAEAIANTVQAAQQHDSVKLGTSIVDIVANGVGLLGKLFGF

SEQ ID NO:45

Proteína

Género/especie-Staphylococcus epidermidis

Título descriptivo- Secuencia de la proteína SePSMa

MADVIAKIVEIVKGLIDQFTQK

SEQ ID NO:46

Proteína

Género/especie- Levivirus MS2

Título descriptivo- Secuencia de la proteína MS2 L

METRFPQQSQQTPASTNRRRPFKHEDYPCRRQQRSSTLYVLIFLAIFLSKFTNQLLLSLLEAVIRTVTTLQQLLT

SEQ ID NO:47

Proteína

Género/especie- Levivirus PRR1

Título descriptivo- Secuencia de la proteína PRR1L

MCKVSTKVDSKLTESVGQLTIRSYLWLRNILALAGLLFVILLATNHLSIAIYSP

SEQ ID NO:48

Proteína

Género/especie- Virus similar a phikmv LUZ19

Título descriptivo- Secuencia de la proteína Gp18 de LKD16

MRMPTEEERVtlRCLLADIITEPLDLLFPGLRTKAniVfDPQAEELSIRIDYDTTAKLGRMGFCTTAVSLYQLSTYGREGM VRYLMQEIPRRVLEGLL VKAQQYSQSNWY SK

SEQ ID NO:49

Proteína

Género/especie- Virus similar a phikmv LUZ19

Título descriptivo- Secuencia de la proteína Gp49 de LUZ19

MSKAKLRVIADTPELESVLKALLTATYAIEDLLNEAVASKVLNSRLGWSAVGEYVELFNRTQSRVAGLIPE

SEQ ID NO:50

ADN

Género/especie- Virus similar a phikmv LUZ19

Título descriptivo- Secuencia del gengp18de LUZ19

ATGAGAATGCCAACCGAAGAAGÁACGCATGATCCGCTGTTTACTGGCGGATATCCACGAGCCACTGGACCT GCTGTTCCCCGGCCTCCGTACCAAGGCCCATATGGACCCGCAAGCAGAGGAACTGTCGATTCGAATTGACTA CGACCATGCGAAGCTGGGCCGTATGGGATTCTGCCACGCGGTATCCCTATATCAACTGTCCATATATGGCCG

CGAGGGGATGGTCCGCTACCTGATGCAGGAGATTCCCCGCCGCGTGCTGGAAGGTCTGCTGGTCAAGGCGC AGCAGTACAGCCAAAGCAACTGGTACAGCAAATGA

SEQ ID NO:51

ADN

Género/especie- Virus similar a phikmv LUZ19

Título descriptivo- Secuencia de la proteína Gp49 de LKD16

ATGAGCAAAGCCAAACTACGAGTCATCGCCGACACCCCGGAGCTGGAGTCAGTGCTAAAAGCATTGCTGAC CGCCACCTACGCTATCGAGGACCTGCTCAACGAGGCCGTGGCTAGCAAGGTGCTAAACTCCCGCCTGGGCTG GTCCGCAGTCGGCGAGTATGTCGAACTGTTCAACCGCACGCAATCCCGCGTGGCCGGGTTGATTCCCGAGTA

G

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un bacteriófago modificado que comprende un genoma vírico que tiene al menos un 85% de identidad con el genoma de LUZ19 del Genbank NC_010326.1, en el que el bacteriófago modificado comprende además;

(i) un gen gp34 modificado, en el que el gen gp34 modificado codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una deleción en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 55 de SEQ ID NO:5 (proteína gp34), por lo que dicho bacteriófago muestra una mayor actividad lítica en comparación con LUZ19 de tipo salvaje; o

(ii) una modificación en una o más secuencias de ácido nucleico que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N<o>:34 (proteína gp13), SEQ ID NO:35 (proteína gp38), SEQ ID NO:36 (proteína gp40) y SEQ ID N0:48 (proteína gp18), en el que las modificaciones comprenden una sustitución de C por Y en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 17 de SEQ ID NO:34 (proteína gp13), una sustitución de D por Y en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 36 de SEQ ID NO:48 (proteína gp18), una sustitución de D por G en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 82 de SEQ ID NO:35 (proteína gp38), una sustitución de I por S en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 83 de SEQ ID NO:35 (proteína gp38), y una sustitución de N por D en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 253 de SEQ ID NO:36 (proteína gp40), por lo que dicho bacteriófago muestra una gama de hospedadores mejorada en comparación con LUZ19 de tipo silvestre; o

(iii) en el que el bacteriófago modificado expresa un péptido antimicrobiano y comprende una inserción de una molécula de ácido nucleico heterólogo en una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO:49 (proteína gp49), o una sustitución de una secuencia de ácido nucleico comprendida dentro de una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO:49 (gp49) por una molécula de ácido nucleico heterólogo, en el que dicho ácido nucleico heterólogo comprende un gen que codifica un agente dispersante de biopelículas; o

(iv) un gen gp18 heterólogo, en el que el gen gp18 heterólogo codifica una secuencia de aminoácidos con al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO:38 (secuencia de la proteína gp18), por lo que dicho bacteriófago muestra una gama de hospedadores mejorada en comparación con LUZ19 de tipo salvaje.

2. El bacteriófago modificado según la reivindicación 1, en el que dicho bacteriófago comprende una sustitución de una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO:49 (gp49) por un ácido nucleico heterólogo.

3. El bacteriófago modificado de la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico heterólogo codifica una exopolisacárido (EPS) despolimerasa o una modulina soluble en fenol (PSM).

4. El bacteriófago modificado de la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico heterólogo comprende un gen de interés seleccionado del grupo que consiste en EPS despolimerasa (Pp15gp44- gp44 de la espícula de la cola precedente de 015 dePseudomonas pudita(SEQ ID NO:14)), NTn34- gp34 de la espícula de la cola procedente del fago NTU deKlebsiella pneumoniae(SEQ ID NO:13), LKAlgp49- gp49 de la espícula de la cola procedente del fago LKA1de P. aeruginosa(SEQ ID NO:12)), modulinas solubles en fenol tensioactivas deStaphylococcus epidermidis(PSMa, SEQ ID NO:18),Staphylococcus aureus(PSMa3 (SEQ ID NO:16) y/o PSMb2 (SEQ ID NO:17)) y surfactina DspB deAggregatibacter actinomycetemcomitans(SEQ ID NO: 15).

5. El bacteriófago modificado según la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácido nucleico heterólogo está unida operativamente a un promotor principalPgp32(SEQ ID NO:21) de la cápside.

6. El bacteriófago modificado según la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácido nucleico heterólogo está unida operativamente a un terminadorTgp32(SEQ ID NO:22).

7. El bacteriófago modificado de la reivindicación 1, en el que el péptido antimicrobiano se selecciona del grupo que consiste en una enzima lítica, una acilasa, una aminopeptidasa, una amilasa, una carbohidrasa, una carboxipeptidasa, una catalasa, una celulasa, una quitinasa, una cutinasa, una ciclodextrina glucosiltransferasa, una desoxirribonucleasa, una esterasa, una alfa-galactosidasa, una beta-galactosidasa, una glucoamilasa, una alfaglucosidasa, una beta-glucosidasa, una haloperoxidasa, una invertasa, una lacasa, una lipasa, una manosidasa, una oxidasa, una enzima pectinolítica, una peptidoglutaminasa, una peroxidasa, una fitasa, una polifenoloxidasa, una enzima proteolítica, una ribonucleasa, una transglutaminasa, una xilanasa, una ARNasa, una ADNasa, una lisoestafina o un péptido formador de poros.

8. El bacteriófago modificado de la reivindicación 1, en el que el péptido antimicrobiano es una ADNasa.

9. El bacteriófago modificado de cualquier reivindicación anterior, en el que dicho genoma modificado comprende un genoma de phiKMV modificado.

10. El bacteriófago modificado de cualquier reivindicación anterior, en el que dicho genoma modificado comprende un genoma de LUZ19 modificado.

11. El bacteriófago modificado de la reivindicación 10, en el que elgp18de LUZ19 de tipo salvaje se sustituye por elgp18del virus LKD16 (SEQ ID NO:7).