ES2989026T3 - Información y secuenciación de tejidos específicos de genes - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un método para obtener la ubicación espacial y la información de secuencia de una secuencia diana de al menos una cadena de ARNm en una muestra de tejido que comprende los pasos a. proporcionar una sonda lineal, que contiene a) una región de unión capaz de unirse a la al menos una cadena de ARNm y b) una secuencia de anclaje que comprende una región UMI ubicada entre una primera y una segunda regiones localizadoras y c) una región de cebador; b. hibridar la sonda lineal con su región de unión a la cadena de ARNm; c. complementar la sonda lineal utilizando la cadena de ARNm como plantilla obteniendo así una cadena de ADNc transcrita de forma inversa. d. hibridar una molécula localizadora con sus extremos 3' y 5' a la primera y segunda regiones localizadoras creando así un hueco correspondiente a la longitud del UMI de la sonda lineal. e. llenar el hueco en la molécula localizadora con nucleótidos complementarios al UMI utilizando una enzima de desplazamiento no hebra creando así una plantilla circular que comprende una copia de la región UMI de la sonda lineal. multiplicar la molécula de plantilla circular por RCA en la muestra de tejido, comenzando desde una región de cebador creando así un rolón. Secuenciar al menos la porción UMI de los rolónios obteniendo así la ubicación espacial del ARNm en el tejido. Eliminar la cadena de ADNc transcrita inversamente del tejido y deshibridar la cadena de ARNm obteniendo así un oligómero de ADNc monocatenario. Proporcionar al oligómero de ADNc monocatenario un primer y un segundo cebador adaptador en los extremos 3' y 5' obteniendo un oligómero monocatenario cebado; Amplificación del oligómero monocatenario cebado por PCR. Secuenciar el oligómero monocatenario cebado amplificado y vincular la información espacial de los rolónios con la información de secuencia del oligómero monocatenario cebado amplificado a través de la secuencia UMI. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Información y secuenciación de tejidos específicos de genes

Antecedentes

Resulta problemático detectar todos los genes expresados a nivel subcelular en un tejido y obtener simultáneamente la información secuencial y/o espacial de estos genes.

Esta invención describe el método para reconocer y amplificar una región específica en un ARN mensajero (ARNm) mediante una sonda que contiene un identificador molecular único (UMI) no predefinido y generado aleatoriamente, yuxtapuesto a una porción dirigida a una región de interés que contiene una mutación o una variante de secuencia en el ARNm capturada por transcripción inversa, y una sonda localizadora de candado con hueco que copia la información secuencial de la sonda UMI lineal. La sonda de candado ligada se usa como molde circular para generar nanobolas localizadoras de ADN mediante amplificación por círculo rodante (RCA). Después de la secuenciación de las nanobolas localizadoras de ADN, el ADNc con la información UMI se recupera, extrae, amplifica y secuencia por NGS.

Compendio

Por consiguiente, un objetivo de la invención era proporcionar un método para obtener simultáneamente la localización espacial e información secuencial de una secuencia diana con mayor resolución que con las tecnologías conocidas. El documento EP4039822 se refiere a la determinación espacial de la transcripción a base de sondas de candado con códigos de barras para relleno de huecos que tienen un identificador molecular espacial único (SUMI) y que se unen directamente a la diana, este documento no describe la transcripción inversa de sondas de ácido nucleico lineales. El documento EP3936623 se refiere a un mapeo de la expresión génica que comprende el uso de sondas de candado que comprenden un SUMI y que se unen directamente a la diana, este documento hace uso de múltiples sondas de detección y no hace mención de la transcripción inversa de sondas lineales.

Aquí se describe un método para

(1) Localizar espacialmente el ARNm expresado en un tejido mediante el uso de una sonda de ADN híbrida lineal/circular con un UMI.

(2) La información nucleotídica de una región adyacente secuencia abajo de la región de la porción lineal de una sonda con un UMI se copia con transcriptasa inversa. Simultáneamente, se hibrida una sonda localizadora de candado cuyos extremos son complementarios de secuencias diana que flanquean la porción UMI en la porción lineal de la sonda para crear un pequeño hueco que corresponde a la longitud del UMI y que puede copiarse mediante la ADN polimerasa Phusion para generar un molde circular.

(3) El molde circular se usa para generar nanobolas de ADN cuyas porciones UMI se secuencian en el tejido, y se usan como indicadores para la hibridación de sondas lineales y la generación de las coordenadas del ARNm. (4) La cadena de ADNc que contiene el UMI generada por transcripción inversa se extrae después del tejido. (5) La cadena de ADNc que contiene el UMI extraída se amplifica después por PCR con cebadores con extremos adaptadores ramificados conocidos.

(6) El producto de PCR se circulariza y se amplifica por RCA.

(7) El producto de RCA puede secuenciarse por NGS.

(8) Las secuencias obtenidas se hacen corresponder con la localización real en el tejido por medio de los UMI. Es objeto de la invención un método para obtener la localización espacial y la información secuencial de una secuencia diana de al menos una cadena de ARNm en una muestra de tejido que comprende las etapas

a. proporcionar una sonda lineal que contiene a) una región de unión capaz de unirse a la al menos una cadena de ARNm, b) una secuencia de anclaje que comprende una región UMI situada entre una primera y una segunda región localizadora y c) una región cebadora;

b. hibridar la sonda lineal en su región de unión con la cadena de ARNm;

c. complementar la sonda lineal utilizando la cadena de ARNm como molde, para así obtener una cadena de ADNc por transcripción inversa;

d. hibridar una molécula localizadora con sus extremos 3' y 5' sobre la primera y la segunda región localizadora para así crear un hueco correspondiente a la longitud del UMI de la sonda lineal;

e. rellenar el hueco en la molécula localizadora con nucleótidos complementarios del UMI mediante una enzima sin desplazamiento de cadena para así crear un molde circular que comprende una copia de la región UMI de la sonda lineal;

f. multiplicar la molécula molde circular por RCA en la muestra de tejido a partir de una región cebadora para así crear una rolonia;

g. secuenciar al menos la porción UMI de las rolonias para así obtener la localización espacial del ARNm en el tejido;

h. extraer del tejido la cadena de ADNc obtenida por transcripción inversa y deshibridar la cadena de ARNm para así obtener un oligómero de ADNc monocatenario;

i. proporcionar al oligómero de ADNc monocatenario un primer y un segundo cebador adaptador en los extremos 3' y 5' para obtener un oligómero monocatenario cebado; amplificar el oligómero monocatenario cebado mediante PCR;

j. secuenciar el oligómero monocatenario cebado amplificado y combinar la información espacial de las rolonias con la información secuencial del oligómero monocatenario cebado amplificado a través de la secuencia UMI.

En una primera realización, la molécula localizadora se hibrida primero en su región de unión con la cadena de ARNm y después la sonda lineal se hibrida con la molécula localizadora. En otras palabras, las etapas a) a d) se realizan en la secuencia a), c), d) y d).

En una segunda realización, la molécula localizadora se hibrida primero con la sonda lineal, que luego se hibrida en su región de unión con la cadena de ARNm. En otras palabras, las etapas a) a d) se realizan en la secuencia a), d), b) y c).

La presente invención se refiere a un método para realizar una localización espacial de un gen de interés en un tejido dado mediante un cebador de ADN lineal que contiene una secuencia complementaria de una región secuencia arriba de una región de interés en un ARNm o una secuencia de poliT complementaria de colas de poliA de un ARNm y que también contiene una porción de no unión que incluye una secuencia aleatoria (UMI) situada entre dos regiones que se usan para la hibridación de una molécula sonda localizadora de candado (regiones A y B). La información secuencial de una región de interés particular en el ARNm se captura primero por transcripción inversa del ARNm en una molécula de ADNc a partir del cebador de ADN lineal.

La molécula sonda localizadora de candado puede unirse previamente a la región de no unión del cebador de ADN lineal (regiones A y B) o puede hibridarse con el cebador de ADN lineal después de que dicho cebador lineal se haya unido a la secuencia situada secuencia arriba de una región deseada en un ARNm directamente en un tejido (figura 1).

La hibridación de la sonda localizadora con el cebador de ADN lineal crea una estructura similar a un candado en círculo abierto con un hueco correspondiente a la secuencia aleatoria en el cebador lineal. El hueco se rellena mediante una enzima sin desplazamiento de cadena y los dos extremos se ligan para formar una molécula circular cerrada que después puede amplificarse mediante amplificación por círculo rodante (RCA) a partir de un cebador oligonucleotídico directamente en un tejido. La RCA genera nanobolas de ADN (rolonias) en la misma posición en donde el ARNm se copia en ADNc en la sección del tejido. La secuencia aleatoria y no predefinida puede descodificarse luego secuenciando el producto de RCA en el tejido, donde se usa una serie de coordenadas para cada una de las rolonias generadas.

El ADNc generado con el cebador lineal se recupera entonces físicamente y se extrae del tejido.

El ADNc recuperado se amplifica entonces por PCR a partir de un cebador de PCR que hibrida con los extremos 5' y 3' del ADNc y contiene adaptadores de ADN.

El producto amplificado por PCR puede circularizarse entonces mediante un cebador oligonucleotídico puente que junta los dos extremos.

El círculo se amplifica entonces mediante amplificación por círculo rodante (RCA). El producto de RCA se secuencia a continuación.

La secuencia aleatoria del cebador lineal unido al ADNc se identifica mediante secuenciación NGS y entonces puede asignarse a la localización exacta en el tejido a través de las coordenadas obtenidas por la secuenciación de la misma secuencia aleatoria en el tejido.

Mediante secuenciación NGS de la región diana de interés en ADN genómico o ARNm, puede analizarse una mutación o una variante nucleotídica.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra las tres primeras etapas del método de la invención.

La figura 2 muestra la molécula circular utilizada como molde para generar nanobolas de ADN.

La figura 3 muestra cómo la cadena de ADNc extraída del tejido puede amplificarse por PCR y luego circularizarse añadiendo regiones adaptadoras (P1 y P2) a los cebadores de PCR.

Las figuras 3 y 5 muestran datos experimentales.

Descripción detallada

El método de la invención se describe en detalle en las figuras 1-3, y el término "etapas" se refiere a las etapas respectivas en las figuras.

La localización espacial de la molécula de ARNm por RCA y posterior secuenciaciónex situde la región de interés a partir de una molécula de ARN copiada implica RCA y secuenciaciónin situde los UMI directamente en el tejido y consiste en un proceso de ocho etapas. (Etapa 1) Hibridación de la sonda lineal que contiene una secuencia aleatoria y dos anclajes (A y B) con el ARNm en el tejido a través de la porción de secuencia específica situada en el extremo 3' y copia de la región de ARNm de interés secuencia abajo en una molécula de ADNc mediante transcripción inversa utilizando la sonda lineal como cebador. (Etapa 2) Hibridación de la molécula localizadora de candado en círculo con la sonda lineal a través de las regiones A y B, dejando un hueco correspondiente a la región UMI. Copia de la región UMI rellenando el hueco mediante una enzima sin desplazamiento de cadena y ligación de los dos extremos del candado localizador en círculo mediante una ADN ligasa para generar una molécula circular.

La molécula circular se usa como molde para generar nanobolas de ADN (rolonias) por RCA con un cebador para RCA específico del círculo (etapa 3). La porción UMI de las rolonias se secuencia directamente en el tejido, lo que proporciona las coordenadas de localización de las regiones diana (etapa 4). Durante la secuenciaciónin situ, las imágenes pueden tomarse mediante un microscopio de campo amplio (un solo plano focal) o un microscopio confocal (varios planos focales).

Extracción del tejido del ADNc que contiene el cebador lineal y las secuencias UMI (etapa 5) y síntesis de la 2.a cadena de ADNc con una secuencia adaptadora cebadora ramificada (P2), (etapa 6). Amplificación por PCR del ADNc con una secuencia adaptadora ramificada complementaria de la región A de la sonda lineal (P1) seguida de cebadores adaptadores P1/P2 (etapa 7). Circularización del producto amplificado por PCR y amplificación RCA del círculo que contiene el UMI y la región de interés (etapa 8). Secuenciación NGS de la región de interés y el UMI y determinación de la localización y la secuencia de la región de interés haciendo corresponder la secuencia del UMI fuera del tejido y en el tejido con las coordenadas respectivas (x, y y/o z) (etapa 9).

La figura 1 muestra las tres primeras etapas del proceso, con una sonda lineal que contiene una secuencia aleatoria flanqueada por dos anclajes (A y B) y una secuencia específica complementaria de la región diana de interés en el ARNm de un gen que necesita ser secuenciada. La porción específica de la sonda lineal se hibrida primero con la diana, a lo que sigue una transcripción inversa. La región de interés contendrá una secuencia para la que se sospecha un cambio nucleotídico con diferencia de variante. Una vez que la sonda lineal se ha prolongado para crear una copia de ADNc y queda unida de manera estable a la diana, el localizador en círculo se hibrida con la sonda lineal a través de las regiones A y B, dejando un hueco correspondiente a la región UMI. La región UMI se copia rellenando el hueco y el localizador en círculo se liga para generar una molécula circular (etapa 2). La molécula circular se utiliza como molde para generar nanobolas de ADN (rolonias). La porción UMI de las rolonias se secuencia directamente en el tejido, lo que proporciona las coordenadas de localización de la región diana (x, y y/o z).

La figura 1 muestra además la hibridación de la sonda lineal que contiene una secuencia aleatoria y dos anclajes (A y B) con el ARNm en un tejido fijado en un portaobjetos en una región secuencia arriba de la región de interés de un ARNm particular (línea discontinua) a través de la porción de secuencia específica situada en el extremo 3'. La transcripción inversa de la región de interés en un ADNc (etapa 1) se inicia con la sonda lineal, que se usa como cebador. El extremo 3' de la sonda lineal consiste en una secuencia de aproximadamente 30 pb de longitud que puede hibridar con una región específica en una diana de ARNm de interés en el tejido. La hibridación de la molécula localizadora de candado en círculo con la sonda lineal a través de las regiones A y B, dejando un hueco correspondiente a la región UMI, se muestra en la etapa 2. La región UMI se copia en el candado localizador en círculo rellenando el hueco mediante una enzima sin desplazamiento de cadena, por ejemplo, ADN polimerasa Phusion, y los dos extremos del candado localizador en círculo se ligan con una ADN ligasa para generar una molécula circular (etapa 2). El tamaño del círculo puede ser de entre 100 y 400 pb de longitud, en donde la porción del hueco es de aproximadamente 10-40 pb.

La figura 2 muestra la molécula circular utilizada como molde para generar nanobolas de ADN. La molécula circular se amplifica mediante RCA (amplificación por círculo rodante) (etapa 3) y la porción UMI se secuenciain situ(etapa 4). La cadena de ADNc que contiene un UMI copiado se extrae entonces para la secuenciación de la región de interés (etapa 5).

La figura 2 muestra además el proceso de cómo se usa el localizador en círculo para generar nanobolas de ADN (rolonias) en el tejido mediante amplificación isotérmica por círculo rodante (RCA) por medio de una enzima de alta procesividad y con actividad de desplazamiento de cadena como la ADN polimerasa Phi29 y un oligonucleótido para RCA que se une al localizador en círculo como cebador (etapa 3). La localización resultante del producto de RCA en el tejido se determina por secuenciación del UMI generado aleatoriamente en el tejido para obtener las coordenadas (x, y y/o z) de todas las rolonias (etapa 4). En una realización de la invención, la sonda localizadora en círculo se hibrida primero con el anclaje de la sonda lineal antes de que esta se una a una región secuencia arriba de la región de interés en un ARNm particular (línea discontinua). El ADNc prolongado se extrae del portaobjetos con la sección del tejido en la etapa 5.

La figura 3 muestra cómo la cadena de ADNc extraída del tejido puede amplificarse por PCR y luego circularizarse mediante la adición de regiones adaptadoras (P1 y P2) a los cebadores de PCR. La 2.a cadena de ADNc se sintetiza en la etapa 6 y se amplifica por PCR para generar moléculas de ADN bicatenarias con extremos adaptadores P1/P2 (etapa 7) que pueden analizarse por secuenciación NGS (etapa 8).

La figura 3 muestra además la realización de la síntesis de la 2.a cadena de ADNc (etapa 6) y la posterior reacción de PCR (etapa 7) con un par de cebadores ramificados P1 y P2. Las regiones de unión se localizan secuencia arriba de la región del localizador en círculo para el cebador P1 y secuencia abajo de la "región de interés" para el cebador P2, lo que genera una biblioteca de ADN adaptada que contiene la región de interés y la porción UMI. La secuenciación de la biblioteca de ADN permite determinar si existe una mutación o variante nucleotídica en la región diana de interés y, mediante la secuenciación del UMI, puede identificarse la localización original o el origen de cada región de interés en el tejido por correlación con las coordenadas de las secuencias UMI del localizador en círculo generadas por secuenciación de las rolonias en una sección de tejido (etapa 8).

Ejemplos

La secuenciación de la biblioteca de ADN permite detectar la presencia de una mutación o variante nucleotídica en la región diana de interés y, mediante la secuenciación del UMI, puede identificarse la localización original o el origen de cada región de interés en el tejido por correlación con las coordenadas de las secuencias UMI del localizador en círculo generadas por secuenciación de las rolonias en una sección de tejido (etapa 8).

La figura 4 muestra un ejemplo del análisis de secuencia realizado en bibliotecas generadas a partir de ADNc extraído y amplificado por PCR (gen MS4A1) y nanobolas de ADN. La secuenciación se realizaex situusando un oligonucleótido cebador situado secuencia arriba de la región de interés y las porciones identificadoras moleculares únicas (UMI). La porción UMI se secuencia junto con el candado localizador, y las lecturas procedentes de las rolonias localizadoras se identifican por alineamiento de las lecturas de secuencias localizadoras con la secuencia de referencia conocida del candado. Adicionalmente, también se secuencian los transcritos en la porción UMI, así como en la secuencia codificante del transcrito de ADNc que contiene el cebador lineal y las secuencias UMI que se copian en el candado localizador. Las lecturas procedentes de los transcritos de ADNc se identifican por alineamiento de las lecturas de secuencia con la secuencia de referencia conocida de la región codificante del gen de interés (en este ejemplo, el gen MS4A1).

La figura 5 muestra las lecturas reales obtenidas de las bibliotecas generadas a partir del ADNc extraído y amplificado por PCR de la porción del transcrito y realmente alineadas con el gen MS4A1. La secuenciación se realizaex situcon un oligonucleótido cebador situado secuencia arriba de la región de interés y las porciones identificadoras moleculares únicas (UMI). Se resalta la porción de la secuencia codificante de MS4A1 generada por transcripción inversa del cebador lineal (región encuadrada).

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para obtener la localización espacial e información secuencial de una secuencia diana de al menos una cadena de ARNm en una muestra de tejido que comprende las etapas

   a. proporcionar una sonda lineal que contiene a) una región de unión capaz de unirse a la al menos una cadena de ARNm, b) una secuencia de anclaje que comprende una región UMI situada entre una primera y una segunda región localizadora y c) una región cebadora;

   b. hibridar la sonda lineal en su región de unión con la cadena de ARNm;

   c. complementar la sonda lineal utilizando la cadena de ARNm como molde, para así obtener una cadena de ADNc por transcripción inversa;

   d. hibridar una molécula localizadora con sus extremos 3' y 5' sobre la primera y la segunda región localizadora para así crear un hueco correspondiente a la longitud del UMI de la sonda lineal;

   e. rellenar el hueco en la molécula localizadora con nucleótidos complementarios del UMI mediante una enzima sin desplazamiento de cadena para así crear un molde circular que comprende una copia de la región UMI de la sonda lineal;

   f. multiplicar la molécula molde circular por RCA en la muestra de tejido a partir de una región cebadora para así crear una rolonia;

   g. secuenciar al menos la porción UMI de las rolonias para así obtener la localización espacial del ARNm en el tejido;

   h. extraer del tejido la cadena de ADNc obtenida por transcripción inversa y deshibridar la cadena de ARNm para así obtener un oligómero de ADNc monocatenario;

   i. proporcionar al oligómero de ADNc monocatenario un primer y un segundo cebador adaptador en los extremos 3' y 5' para obtener un oligómero monocatenario cebado; amplificar el oligómero monocatenario cebado mediante PCR;

   j. secuenciar el oligómero monocatenario cebado amplificado y combinar la información espacial de las rolonias con la información secuencial del oligómero monocatenario cebado amplificado a través de la secuencia UMI 2. Método según la reivindicación 1, caracterizado por que las etapas a) a d) se realizan en la secuencia a), b), c) y d).

   3. Método según la reivindicación 1, caracterizado por que las etapas a) a d) se realizan en la secuencia a), d), b) y c).

   4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que el relleno del hueco de la molécula localizadora en la etapa e) se realiza mediante la ADN polimerasa Phusion o una polimerasa sin desplazamiento de cadena utilizando un cebador hibridado con una región del localizador circular.

   5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que los extremos 3' y 5' de la molécula de ADN con el hueco relleno se ligan entre sí, en donde el UMI y la primera región del localizador lineal actúan como puente.

   6. Método según la reivindicación 5, caracterizado por que la reacción de ligación en la etapa e) se realiza mediante una ADN ligasa

   7. Método según la reivindicación 6, caracterizado por que la sonda localizadora se proporciona hibridando primero el localizador lineal con la al menos una cadena de ARNm, complementando la región de ARN de anclaje de la sonda localizadora en una cadena de ADNc por transcripción inversa e hibridando después el localizador circular con el localizador lineal.

   8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que el oligómero monocatenario se cizalla físicamente para obtener un fragmento más pequeño antes de añadir un primer y un segundo cebador adaptador en los extremos 3' y 5'

   9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que el oligómero de ADN monocatenario adaptado se circulariza y se multiplica por RCA para obtener rolonias secundarias antes de la secuenciación.