ES2988818T3 - Transferrina para su uso en trasplante de riñón - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos de tratamiento de afecciones relacionadas con el factor inducible por hipoxia (HIF), y en particular a métodos de tratamiento de afecciones relacionadas con HIF que comprenden la administración de una composición que comprende transferrinas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Transferrina para su uso en trasplante de riñón

Campo de la invención

La presente invención se refiere a método de tratamiento de un órgano en la preparación para el trasplante en un humano que comprende la administración de una composición que comprende transferrinas.

Antecedentes de la invención

La protección de las células, y especialmente de las neuronas, del daño provocado por diversos factores, incluyendo accidente cerebrovascular, enfermedad neurodegenerativa, lesión traumática, etc., es importante para la recuperación a largo plazo de la función celular o neuronal. El tratamiento terapéutico de células o neuronas lesionadas mediante agentes individuales tiene ventajas, pero a menudo no es suficiente para movilizar la complejidad de moléculas necesarias para ayudar a restaurar la función completa.

La respuesta fisiológica para proteger las neuronas u otras células frente a acontecimientos hipóxicos o isquémicos, o frente a la oxidación, a menudo se considera que está mediada por la expresión de genes que están regulados por incremento a través de la ruta de señalización del factor inducible por hipoxia (HIF), una ruta reguladora clave que es sensible a ataques celulares. En el cerebro, se cree que la regulación por incremento de moléculas neuroprotectoras es un factor crítico en la protección de las células frente a un daño irreparable. Sin embargo, pocos fármacos disponibles son suficientemente capaces de prevenir, restaurar o reducir el daño a las neuronas y otros tejidos. Adicionalmente, a menudo son tóxicos, tienen semividas cortas, o ambos. Por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO2006/20727 propone el uso de deferoxamina como agente neuroprotector contra los efectos nocivos de la reperfusión; sin embargo, la administración de deferoxamina plantea problemas debido a su semivida reducida en plasma.

Las transferrinas son glicoproteínas del plasma sanguíneo de unión a hierro que controlan el nivel de hierro libre en los líquidos biológicos. Las transferrinas funcionan como el principal transportador del hierro en la circulación en la que existe en una forma de apo-transferrina (Apo-Tf) libre de hierro, como transferrina monoférrica, o como holotransferrina diférrica (Holo-Tf). Normalmente, el hierro se une al 30 % de todos los sitios de unión a transferrina en la circulación. La función de neuroprotección de Apo-Tf pero no de Holo-Tf la han divulgado Chen-Roetlinget al.(Chen-Roetling J., Chen L., y Regan R.F. Neuropharmacology, 2011; 60(2-3): 423-431), lo que sugiere que Apo-Tf puede mitigar la neurotoxicidad de la hemoglobina después de hemorragia intracerebral.

Los presentes inventores han descubierto que puede ser posible reforzar las propiedades neuroprotectoras de la administración de transferrina en pacientes combinándola con otros agentes quelantes de hierro o con otra proteína plasmática de unión a hierro, tal como apolactoferrina, que se ha demostrado que aumenta los niveles de proteína de HIF-1a en algunos tejidos y tiene efectos sobre los niveles de EPO en plasma (Zakharova E.T.et al.Biometals (2012) 25:1247-1259). Se ha sugerido que las moléculas con capacidades de quelación de hierro son activadores de la ruta de HIF bloqueando la actividad de prolil-hidroxilasas.

Por tanto, la presente invención se refiere a un método de tratamiento de afecciones relacionadas con el factor inducible por hipoxia (HIF) que comprende la administración de una composición que comprende transferrina. La presente invención también se refiere a un método de tratamiento de afecciones relacionadas con el factor inducible por hipoxia (HIF) en el que la composición administrada comprende además una combinación de una transferrina y un quelante de hierro.

Tal como se usa en el presente documento, el término “transferrina” y su plural se refieren a Apo-Tf sola, u Holo-Tf sola o una mezcla de las mismas.

Breve descripción de los dibujos

La presente invención se describe adicionalmente con referencia a los siguientes dibujos, en los que:

La figura 1 muestra que las composiciones de Apo-Tf mayoritaria y Holo-Tf mayoritaria inducen la proteína HIF-1a en condiciones normóxicas e hipóxicas 6 horas tras el tratamiento.

La figura 2 muestra que las composiciones de Apo-Tf mayoritaria y Holo-Tf mayoritaria inducen la proteína HIF-1a en condiciones normóxicas 24 horas tras el tratamiento.

La figura 3 muestra que las mezclas de Apo-Tf y Holo-Tf inducen la proteína HIF-1a 6 horas tras el tratamiento. La figura 4A muestra los niveles de expresión de ARNm de Glut1 en condiciones normóxicas e hipóxicas en presencia de HSA, apo-transferrina u holo-transferrina.

La figura 4B muestra los niveles de expresión de ARNm de VEGF en condiciones normóxicas e hipóxicas en presencia de HSA, apo-transferrina u holo-transferrina.

La figura 5A muestra la toxicidadin vitrooin vivode composiciones que comprenden o bien Holo-Tf mayoritaria o bien Apo-Tf mayoritaria.

La figura 5B muestra las puntuaciones de Bederson modificada y de comportamiento general para ratas tratadas por vía intravenosa con fármaco que comprende Apo-Tf u Holo-Tf mayoritaria.

La figura 6A muestra el gráfico de dispersión del volumen de infarto del tratamiento con Apo-Tf (385 mg/kg, i.v.) o solución salina en un modelo de rata de oclusión transitoria de la arteria cerebral media (MCAo).

La figura 6B muestra secciones coronales teñidas con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) de una rata de control representativa y una tratada con Apo-Tf.

La figura 7 muestra la protección de células neuronales frente a los efectos tóxicos de Abeta(1-42) por mezclas que comprenden principalmente Apo-Tf y Holo-Tf.

La figura 8A muestra el tratamiento de células neuronales SH-SY5Y con 4 mg/ml de Apo-Tf mayoritaria y con una combinación de Apo-Tf mayoritaria y DFO o IOX2.

La figura 8B muestra el tratamiento de células neuronales SH-SY5Y con 4 mg/ml de la proteína indicada y con una combinación de la proteína indicada y M3010 uM más.

La figura 8C muestra el tratamiento de células neuronales SH-SY5Y con 4 mg/ml de la proteína indicada y con una combinación de la proteína indicada y DFO 200 uM.

La figura 9A muestra los niveles de expresión de ARNm de Glut1 en respuesta a combinaciones de apotransferrina mayoritaria y DFO o IOX2.

La figura 9B muestra los niveles de expresión de ARNm de VEGF en respuesta a combinaciones de apotransferrina mayoritaria y DFO o IOX2.

La figura 10A muestra los niveles de HIF-1a después del tratamiento de células epiteliales del túbulo proximal renal humanas primarias (RPTEC) con 4 mg/ml de apo-transferrina mayoritaria, holo-transferrina mayoritaria o diversas mezclas de cada una durante 6 horas en niveles normales de oxígeno.

La figura 10B muestra los niveles de HIF-1a después del tratamiento de células epiteliales corticales primarias (HRCE) con 4 mg/ml de apo-transferrina mayoritaria, holo-transferrina mayoritaria o diversas mezclas de cada una durante 6 horas en niveles normales de oxígeno.

La figura 11A muestra la viabilidad de células epiteliales del túbulo proximal renal humanas primarias (RPTEC) o epiteliales corticales (HRCE) cuando se tratan con Apo-Tf mayoritaria o DFO durante 48 horas.

La figura 11B muestra la viabilidad de células RPTEC o HRCE cuando se tratan durante 72 horas con 4 mg/ml de Apo-Tf mayoritaria, Holo-Tf mayoritaria, mezclas de transferrina.

La figura 12 muestra la activación de caspasas 3/7 dentro de células de riñón primarias humanas en presencia de Apo-Tf mayoritaria o DFO.

La figura 13A muestra los niveles de HIF-1a después del tratamiento de la línea de células de pulmón NCI-H1650 con 4 mg/ml de apo-transferrina mayoritaria, holo-transferrina mayoritaria o pd-transferrina durante 6 horas en niveles normales de oxígeno.

La figura 13B muestra los niveles de HIF-1a después del tratamiento de células de hepatocitos primarios con 4 mg/ml de apo-transferrina mayoritaria, holo-transferrina mayoritaria o pd-transferrina durante 6 horas en niveles normales de oxígeno.

La figura 14A muestra la viabilidad de la línea de células de pulmón humanas, NCI-H1650, cuando se trata durante 72 horas con 4 mg/ml de Apo-Tf mayoritaria, Holo-Tf mayoritaria o pd-transferrina.

La figura 14B muestra la viabilidad de hepatocitos humanos primarios cuando se tratan durante 72 horas con 4 mg/ml de Apo-Tf mayoritaria, Holo-Tf mayoritaria o pd-transferrina.

Descripción detallada de la invención

En un aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende que comprende una mezcla de apo-transferrina (Apo-Tf) y holo-transferrina (Holo-Tf) para su uso en un método de trasplante de órganos, comprendiendo el método tratar un órgano en la preparación para el trasplante en un humano, en la que dicho órgano es el riñón, y en la que dicha mezcla tiene una razón en porcentaje entre 99:1 y 30:70 (Apo-Tf:Holo-Tf). Preferiblemente, la transferrina es transferrina recombinante, derivada de plasma o sintetizada químicamente.

Cuando la transferrina es recombinante, puede obtenerse según cualquier técnica conocida en la técnica de expresión, producción y purificación de proteínas. Por ejemplo, puede insertarse una secuencia de ácido nucleico de la transferrina en cualquier vector adecuado para la expresión en la célula huésped seleccionada, por ejemplo bacterias(Escherichia coli, Bacilus subtilis, Salmonella typhimurium, Pseudomonas, StreptomycesyStaphylococcus),levaduras (géneroSaccharomyces, PichiaoKuyveromyces),células de insecto (géneroBombyx mori, Mamestra brassicae, Spodoptera frugiperda, Trichoplusia nioDrosophila melanogaster)o células de mamífero (células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS-1), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células 293 transformadas con adenovirus humano, células L-929 de ratón, líneas celulares de hámster HaK, células 3T3 murinas derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH, línea celular CV-1, cepas celulares derivadas de cultivoin vitrode tejido primario o explantes primarios).

Se contempla que la transferrina derivada de plasma se aísle de una fracción de plasma adecuada. En una realización preferida, la transferrina se aísla de la fracción IV, y lo más preferiblemente de la fracción IV-I o la fracción IV-IV, del procedimiento de fraccionamiento de Cohn. En otra realización preferida, la transferrina deriva de una fracción residual de un método de purificación de inhibidor de la proteinasa alfa1 (A1PI). Preferiblemente, dicho método de purificación es el siguiente:

(a) retirar una porción de proteínas contaminantes de la disolución acuosa mediante precipitación para obtener una disolución purificada que contiene A1PI;

(b) hacer pasar la disolución purificada a través de una resina de intercambio aniónico de modo que A1PI se una a la resina de intercambio aniónico;

(c) eluir A1PI de la resina de intercambio aniónico para obtener una disolución eluida que contiene A1PI;

(d) hacer pasar la disolución eluida a través de una resina de intercambio catiónico;

(e) recoger un flujo continuo de la resina de intercambio catiónico que contiene A1PI; y

(f) poner en contacto la disolución eluida de la etapa (c) o el flujo continuo de la etapa (e) con un adsorbente hidrófobo de al menos un medio de HIC.

En la realización más preferida, la disolución acuosa usada en el método de purificación (A1PI) mencionado anteriormente es sangre, plasma o una fracción derivada de plasma.

En una realización adicional, la transferrina comprende al menos una modificación postraduccional, preferiblemente pegilación, glicosilación, polisialilación o una combinación de las mismas.

En una realización, la transferrina usada en el método de tratamiento de la presente invención es una transferrina de longitud completa con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1. Realizaciones adicionales abarcan el uso en el método de tratamiento de la presente invención de derivados de transferrina con al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % de homología o similitud con la SEQ ID NO: 1 siempre que se conserve el 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o el 100% de la actividad de quelación de hierro de la transferrina de tipo natural. Un experto habitual en la técnica reconocería fácilmente que las diferencias en homología entre transferrina y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 pueden deberse a sustituciones de aminoácidos conservativas y/o no conservativas que no afectan a la función de quelación de hierro. En otra realización, se contempla que se usa un fragmento de la transferrina de tipo natural (SEQ ID NO: 1) en el procedimiento de tratamiento de la presente invención. Un experto habitual en la técnica seleccionaría fácilmente un fragmento adecuado de la transferrina de tipo natural de modo que se mantuviera la actividad de quelación de hierro de la transferrina de tipo natural.

En una realización adicional, la transferrina se modifica para aumentar su afinidad de unión a hierro. Un experto habitual en la técnica contemplaría que pueden determinarse los residuos o las zonas que han de modificarse mediante varias técnicas conocidas en la técnica tales como, por ejemplo, mutagénesis dirigida, barrido de alanina, cristalografía o análisis de deleciones y/o inserciones.

Se contempla que la transferrina usada en el método de tratamiento de la presente invención esté en forma de un conjugado de proteína o una proteína de fusión con el fin de, por ejemplo, prolongar su semivida en sangre, en la que la transferrina se conjuga o fusiona con cualquier otra proteína, fragmento de proteína, dominio de proteína o péptido. En una realización preferida, la transferrina se conjuga o fusiona con un fragmento, dominio o péptido de longitud completa de albúminas séricas (tales como por ejemplo, bovinas, de conejos o de humanos), hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulina (incluyendo el dominio Fc de inmunoglobulinas), tiroglobulina, ovoalbúmina, toxoide tetánico, o un toxoide de otras bacterias patógenas, tales como difteria,E. coli,cólera oH. pylori,o un derivado de toxina atenuado, citocinas, quimiocinas, péptido-1 similar al glucagón, exendina-4 o XTEN. La transferrina usada en el método de la presente invención es una mezcla de Apo-Tf y Holo-Tf y dicha mezcla tiene una razón en porcentaje entre 99:1 y 30:70 (Apo-Tf:Holo-Tf), incluso más preferiblemente, dicha mezcla tiene una proporción o razón en porcentaje que es comparable a la de una fracción obtenida o purificada a partir de líquidos biológicos. En la realización más preferida, la mezcla de Apo-Tf y Holo-Tf usada en el método de la presente invención tiene una proporción o razón en porcentaje de Apo-Tf y Holo-Tf como la proporción o razón en porcentaje de Apo-Tf y Holo-Tf presentes en sangre o plasma humano.

En el método de la presente invención, la composición puede comprender además un quelante de hierro o inhibidor de la enzima PHD2. En una realización preferida, el quelante de hierro se selecciona del grupo que comprende M30, deferoxamina (DFO), deferasirox, deferiprona, deferitrina, L1NAII, CP363, CP502, iOx 2 ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o combinaciones de los mismos. En la realización más preferida, el quelante de hierro es deferoxamina (DFO).

En el método de la presente invención, comprende el tratamiento de órganos con una composición que comprende transferrina en preparación para el trasplante en un humano. El órgano es el riñón.

Además, en el método de la presente invención, el tratamiento comprende la administración de una composición que comprende transferrina a receptores de trasplantes de órganos antes o después del trasplante. En una realización preferida, el método de la presente invención comprende la administración de una composición que comprende transferrina a receptores de trasplantes de órganos antes o después del trasplante, y en el que los órganos de trasplante se han tratado previamente con una composición que comprende transferrina en la preparación para el trasplante en un humano.

Aunque la invención se describirá ahora con relación a determinadas realizaciones preferidas en los siguientes ejemplos de modo que pueden entenderse y apreciarse más completamente aspectos de la misma, no se pretende limitar la invención a estas realizaciones particulares. Por el contrario, se pretende cubrir todas las alternativas, modificaciones y equivalentes que puedan incluirse dentro del alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Por tanto, los siguientes ejemplos que incluyen realizaciones preferidas servirán para ilustrar la práctica de esta invención, entendiéndose que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y únicamente con propósitos de explicación ilustrativa de realizaciones preferidas de la presente invención y se presentan con el fin de proporcionar lo que se cree que es la descripción más útil y fácilmente entendida de procedimientos de formulación así como de los principios y aspectos conceptuales de la invención.

Ejemplos

Los experimentos realizados en los siguientes ejemplos se trataron con transferrina que comprendía cualquiera de las formas Apo u Holo. Se sometió a prueba una amplia variedad de mezclas de transferrina; se destacan los porcentajes relativos de Apo-Tf y Holo-Tf que comprenden Apo-Tf mayoritaria, Holo-Tf mayoritaria, pd-Tf y mezclas de transferrina definidas específicamente en la tabla 1 a continuación.

Tabla 1:

Ejemplo 1. Las composiciones que comprenden Apo-Tf mayoritaria y Holo-Tf mayoritaria inducen la proteína HIF-1a en condiciones normóxicas e hipóxicas después de 6 horas de tratamiento.

Se trataron células de la línea celular SH-SY5Y de neuroblastoma humano, cultivadas en medios libres de suero, con Apo-Tf y Holo-Tf derivadas de plasma (en ambos casos a una concentración de 1 mg/ml y 4 mg/ml) durante 6 horas en condiciones de normoxia (el 21 % de oxígeno) e hipoxia (el 1 % de oxígeno). Como controles, se usan células no tratadas o células tratadas con albúmina sérica humana (HSA) a una concentración de 1 mg/ml o 4 mg/ml. Después de 6 horas, se recogieron proteínas intracelulares y se sometieron a prueba para determinar los niveles de proteína de HIF-1a mediante ELISA.

Tal como se muestra en la figura 1, se produjo un aumento significativo de los niveles de proteína celular de HIF-1a en condiciones tanto normóxicas como hipóxicas y para las dos concentraciones sometidas a prueba para Apo-Tf. Con respecto a Holo-Tf, se observó un aumento significativo de los niveles de proteína celular de HIF-1a tanto para condiciones normóxicas como hipóxicas cuando se trataron las células con la concentración de 1 mg/ml y para condiciones normóxicas cuando se trataron las células con la concentración de 4 mg/ml. Cuando se trataron las células con la concentración de 4 mg/ml de Holo-Tf, se observó una tendencia hacia un aumento de los niveles de proteína celular de HIF-1a.

Ejemplo 2. Las composiciones que comprenden Apo-Tf mayoritaria y Holo-Tf mayoritaria inducen la proteína HIF-1a en condiciones normóxicas después de 24 horas de tratamiento.

Se repitió el experimento realizado en el ejemplo 1 pero realizando tratamientos durante 24 horas y sólo en condiciones normóxicas. Después de 24 horas, se recogieron proteínas intracelulares y se sometieron a prueba para determinar los niveles de proteína de HIF-1a mediante ELISA. La figura 2 muestra los resultados obtenidos para este experimento. Tal como puede observarse en dicha figura, Apo-Tf aumentó los niveles de proteína celular de HIF-1a en ambas concentraciones sometidas a prueba. Para Holo-Tf se observó un aumento significativo de los niveles de proteína celular de HIF-1a cuando se realizó el tratamiento usando una concentración de 4 mg/ml y se observó una tendencia hacia un aumento de dicha proteína cuando se usó la concentración de 1 mg/ml.

Ejemplo 3. Las mezclas de Apo-Tf y Holo-Tf inducen la proteína HIF-1a después de 6 horas de tratamiento.

Después de 6 horas, se recogieron proteínas intracelulares y se sometieron a prueba para determinar los niveles de proteína de HIF-1a mediante ELISA. Tal como se muestra en la figura 3, se observó un aumento de los niveles de proteína celular de HIF-1a después de 6 horas de tratamiento con Apo-Tf mayoritaria derivado de plasma, Holo-Tf mayoritaria o mezclas de las mismas en condiciones normóxicas. Tal como puede observarse también en dicha figura, todas las mezclas de Apo-Tf y Holo-Tf regulan por incremento la proteína HIF-1a en células neuronales SH-SY5Y.

Ejemplo 4. Niveles de expresión de ARNm de Glut1 y VEGF en condiciones normóxicas e hipóxicas en presencia de HSA, apo-transferrina u holo-transferrina.

La estabilización, y el aumento, de la proteína HIF-1a conduce normalmente a una regulación por incremento de genes relacionados con HIF (aumento de la transcripción de genes seleccionados como diana por HIF), es decir, genes que tienen sitios de unión a HIF en sus elementos reguladores transcripcionales. Dos genes bien caracterizados que se activan por la proteína HIF-1a son el receptor de Glut1 y VEGF. Por tanto, para analizar los cambios de expresión de ARNm en cada uno de estos genes diana de HIF, se cultivaron células de la línea celular SH-SY5Y y se trataron con Apo-Tf mayoritaria o Holo-Tf mayoritaria a una concentración de 1 mg/ml y 4 mg/ml en condiciones normóxicas (el 21 % de oxígeno) o hipóxicas (el 1 % de oxígeno) durante 6 horas. Como controles negativos, se trataron las células con HSA (1 mg/ml o 4 mg/ml) o se dejaron sin tratar. Después de 6 horas, se recogió el ARNm intracelular y se sometió a prueba para determinar los niveles de expresión de Glut1 y VEGF mediante qPCR. Se calcularon los resultados de expresión con relación a la expresión del transcrito correspondiente observado en células no tratadas. Las figuras 4A y 4B muestran los resultados de expresión obtenidos para el receptor de Glut1 y VEGF, respectivamente. Los valores en las figuras se muestran como expresión génica relativa, con el gen diana (Glut1 o VEGF) normalizado para la expresión del gen de mantenimiento (beta-actina). Tal como puede derivar directamente de dichas figuras, en condiciones hipóxicas, la expresión tanto de Glut1 (figura 4A) como de VEGF (figura 4B) aumentó significativamente cuando se trataron con apo-transferrina con relación a los controles de HSA. Curiosamente, en condiciones normóxicas, la holo-transferrina, pero no la apo-transferrina, aumentó la expresión sólo de Glut1.

Ejemplo 5. Las mezclas de Apo-Tf y Holo-Tf no muestran toxicidadin vitrooin vivo.

Puesto que se ha notificado que Holo-Tf es tóxica para las célulasin vivoein vitro,se sometió a prueba la toxicidad de diversas composiciones que contenían Apo-Tf mayoritaria, Holo-Tf mayoritaria o mezclas de Apo-Tf Holo-Tf en células SH-SY5Y. Se trataron células SH-SY5Y con las concentraciones indicadas de Tf 4 mg/ml (tal como se indica en la figura 5A), M30 o DFO durante 72 horas. Después de 72 horas, se sometieron las células a un ensayo de viabilidad de luminiscencia de título celular. Se ajustaron las células de control, células no tratadas, en un valor del 100 % viables. Se muestran la viabilidad promedio y las desviaciones estándar para cada condición de tratamiento. No se observaron efectos tóxicos con ninguna composición que contenía Apo-Tf mayoritaria y, sorprendentemente, no se observaron toxicidad ni efectos perjudiciales de Holo-Tf mayoritaria.

Curiosamente, ni las composiciones de Apo-Tf mayoritaria ni de Holo-Tf mayoritaria mostraron diferencias significativas en estos criterios de comportamiento, lo que sugiere que no hubo efectos perjudiciales de Holo-Tfin vivo.La figura 5B muestra las puntuaciones de Bederson modificada y de comportamiento general para ratas tratadas por vía intravenosa con fármaco que comprende Apo-Tf u Holo-Tf mayoritaria. Se evaluó la función neurológicain vivomediante una puntuación de Bederson modificada (Bedersonet al.,1986b; Crumrineet al.,2011) usando las siguientes definiciones:

Puntuación 0: sin déficits neurológicos aparentes;

Puntuación 1: torsión corporal presente;

Puntuación 2: torsión corporal con debilidad del lado derecho;

Puntuación 3: torsión corporal, debilidad del lado derecho con comportamiento de dar vueltas en círculos; y Puntuación 4: actividad convulsiva.

Se desarrollaron puntuaciones de comportamiento general de las ratas por el personal de CALS con el propósito de monitorizar la recuperación de animales tras intervenciones quirúrgicas (cuidado postoperatorio de CALS convencional). Se asignó un valor numérico a las observaciones de comportamiento predeterminadas.

Puntuación 0: Comportamiento que concuerda con una rata normal no sometida previamente a experimentación (es decir, sin déficit ipsilateral);

Puntuación 1: viva/activa/receptiva; la rata se mueve espontáneamente y explora su jaula, responde a estímulos externos, explora la parte superior de la jaula;

Puntuación 2: tranquila/alerta/receptiva; comportamiento reservado pero responderá a estímulos externos, tiende a no remontar ni explorar la parte superior de la jaula;

Puntuación 3: comportamiento deprimido: tiende a no moverse a menos que se le empuje, vuelve rápidamente a un estado somnoliento, poco o ningún interés en estímulos externos;

Puntuación 4: no receptiva: permanece en una posición postrada incluso cuando se le empuja; y

Puntuación 5: actividad convulsiva que requiere eutanasia.

Ejemplo 6. Protección celularin vivopor transferrina.

Se usó el modelo de rata MCAo (oclusión de la arteria cerebral media) de accidente cerebrovascular cerebral para evaluar la protección celular por transferrina. Se indujo quirúrgicamente un accidente cerebrovascular en 16 ratas usando la técnica de MCAo. Se trataron 8 ratas mediante inyección de solución salina en el cerebro y las otras 8 mediante inyección de Apo-Tf en el cerebro. Las figuras 6<a>y 6B muestran que se observó una disminución significativa del volumen del área infartada en las ratas tratadas con una mezcla que comprende una mayoría de Apo-Tf en comparación con ratas de control (tratadas con solución salina). La figura 6A muestra un gráfico de dispersión del volumen de infarto de tratamiento con Apo-Tf (385 mg/kg, i.v.) o solución salina en MCAo transitoria; y la figura 6B muestra secciones coronales teñidas con TTC de una rata de control representativa y una tratada con Apo-Tf.

Ejemplo 7. Apo-Tf y Holo-Tf protegen a SH-SY5Y frente a la toxicidad de Abeta 1-42.

Se sabe que la regulación por incremento de la ruta de HIF desempeña un papel protector en varias enfermedades neurodegenerativas, incluyendo patologías que dan como resultado la destrucción de células nerviosas y neuronas. Puesto que el tratamiento de SH-SY5Y regula por incremento HIF, el tratamiento de células con apo- u holotransferrina debe proporcionar un efecto protector sobre células sometidas a sustancias que se sabe que inducen neurodegeneración. La figura 7 destaca los datos que evalúan si las mayorías de la apo- y holo-transferrina podrían proteger las células SH-SY5Y frente a los efectos tóxicos del péptido Abeta 1-42 oligomerizado con toxina neurodegenerativa conocida (figura 7). Se trataron células neuronales SH-SY5Y cultivadas en medios de crecimiento con 4 mg/ml de apo-transferrina u holo-transferrina durante 24 horas en niveles normales de oxígeno. Después de 24 horas, se trataron las células con péptido Abeta1-42 oligomerizado durante 72 horas adicionales. Tras el tratamiento con Abeta1-42 oligomerizado, se sometieron las células a un ensayo de activación de caspasas 3/7 ApoGlo. Se ajustaron las células de control, células no tratadas, en un valor normalizado de 1. Se muestran la inducción de caspasas promedio, con relación a células de control, y las desviaciones estándar para cada condición de tratamiento. Curiosamente, estos datos muestran que tanto Apo-Tf como Holo-Tf mayoritarias protegen a las células SH-SY5Y frente a la toxicidad inducida por Abeta. Estos datos también confirman adicionalmente la falta de toxicidad inherente con Apo-Tf u Holo-Tf.

Ejemplo 8. Efecto sinérgico con activadores de HIF de molécula pequeña y mezclas de Apo-Tf/Holo-Tf.

La transferrina puede actuar de manera sinérgica con otras moléculas pequeñas que activan el HIF, tales como otros quelantes de hierro o inhibidores enzimáticos. Esto podría permitir que se administren menores niveles de estas moléculas pequeñas, provocando menos efectos secundarios pero conservándose altos niveles terapéuticos. Para determinar si la apotransferrina aumenta la potencia del quelante de hierro, DFO y el inhibidor de phd2 IOX2; se trataron células neuronales SH-SY5Y cultivadas en medios libres de suero con 4 mg/ml de las proteínas indicadas en presencia o ausencia de fármaco de molécula pequeña en niveles de oxígeno normales. Se muestran los resultados del experimento en las figuras 8A, 8B y 8C. Los datos mostrados en la figura 8A se refieren al tratamiento de células con una combinación de DFO o IOX2, en las concentraciones indicadas, más 4 mg/ml de proteína. Se usó CoCh como control positivo experimental. Los datos mostrados en la figura 8B se refieren al tratamiento de células con una combinación de m 30 10 uM más/menos 4 mg/ml de proteína. Los datos mostrados en la figura 8C se refieren al tratamiento de células con una combinación de DFO 200 uM más/menos 4 mg/ml de proteína. Después de 6 horas, se recogieron proteínas intracelulares y se sometieron a prueba para determinar los niveles de proteína de HIF-1a mediante ELISA. Se muestran los datos en pg/ml con la desviación estándar.

Ejemplo 9. Niveles de expresión de ARNm de Glut1 y VEGF en respuesta a combinaciones de apotransferrina mayoritaria y DFO o IOX2.

Además, se determinaron los niveles de expresión de ARNm de Glut1 y VEGF en respuesta a combinaciones de apotransferrina mayoritaria y DFO o IOX2. Se trataron células neuronales SH-SY5Y cultivadas en medios libres de suero con 4 mg/ml de albúmina sérica humana o apotransferrina mayoritaria en niveles normales de oxígeno. Cuando se indica, se trataron conjuntamente o bien DFO 200 uM o bien IOX2 1 uM con la HSA y la apotransferrina mayoritaria. Después de tratamientos de 6 h, se recogió ARNm intracelular y se sometió a prueba para determinar los niveles de expresión de Glut1 y VEGF mediante qPCR. Se muestran los valores como expresión génica relativa, con el gen diana (Glut1 o VEGF) normalizado para la expresión del gen de mantenimiento (beta-actina). Se muestran las desviaciones estándar. Las figuras 9A y 9B muestran que los niveles de ARNm de Glut1 y VEGF aumentan de manera sinérgica y aditiva con la adición tanto de apotransferrina como de activadores de molécula pequeña de la ruta de HIF.

Ejemplo 10. Las composiciones de Apo-Tf mayoritaria y Holo-Tf mayoritaria inducen la proteína HIF-1a en células de riñón primarias humanas.

Se conoce bien en la técnica que muchas moléculas pequeñas usadas para el tratamiento de afecciones relacionadas o provocadas por hipoxia son tóxicas y tienen numerosos efectos secundarios, por ejemplo DFO. Uno de los efectos secundarios más evidentes de dichas moléculas pequeñas es la toxicidad renal. Por tanto, para evaluar si la transferrina y/o las mezclas aumentan los niveles de HIF-1a en las células de riñón primarias; se obtuvieron células de riñón primarias humanas, tanto células epiteliales del túbulo proximal renal humanas primarias (RPTEC) como células epiteliales corticales (HRCE). Se trataron células epiteliales del túbulo proximal renal humanas primarias (RPTEC) o epiteliales corticales primarias (HRCE) cultivadas en medios libres de suero con 4 mg/ml de apotransferrina mayoritaria, holo-transferrina mayoritaria o diversas mezclas de cada una durante 6 horas en niveles normales de oxígeno. Después de 6 horas, se recogieron proteínas intracelulares y se sometieron a prueba para determinar los niveles de proteína de HIF-1a mediante ELISA. Las figuras 10A y 10B revelan que se inducen los niveles de HIF-1a con transferrina compuesta por mezclas de apo-transferrina y holo-transferrina en RPTEC y HRCE, respectivamente.

Ejemplo 11. Viabilidad de células de riñón primarias humanas en presencia de transferrinas o DFO, incluyendo activación de caspasas 3/7 dentro de células de riñón primarias humanas en presencia de Apo-Tf mayoritaria o DFO.

Considerando el perfil de seguridad anticipado de una proteína plasmática humana, se evaluó la toxicidad de DFO y transferrinas (Apo mayoritaria, Holo mayoritaria y mezclas) en células de riñón humanas primarias. Se trataron células epiteliales del túbulo proximal renal (RPTEC) o epiteliales corticales (HRCE) con las concentraciones indicadas de Apo-Tf mayoritaria o DFO durante 48 horas (figura 11A); y se trataron las células RPTEC o HRCE durante 72 horas con 4 mg/ml de Apo-Tf mayoritaria, Holo-Tf mayoritaria, mezclas de transferrina (figura 11B). Después de 48 ó 72 horas, se sometieron las células a un ensayo de viabilidad de luminiscencia de título celular. Se ajustaron las células de control, células no tratadas, en un valor del 100% viables. Se muestran la viabilidad promedio y las desviaciones estándar para cada condición de tratamiento. Las figuras 11A y 11B muestran que aunque DFO tenía una toxicidad significativa, ninguna de las moléculas de transferrina mostró ningún efecto perjudicial sobre estas células de riñón primarias.

Con el fin de evaluar la activación de caspasas 3/7 dentro de células de riñón primarias humanas en presencia de Apo-Tf o DFO; se trataron células RPT o HRC con las concentraciones indicadas de Apo-Tf o DFO durante 48 horas. Después de 48 horas, se sometieron las células a un ensayo de activación de caspasas 3/7 ApoGlo. Se ajustaron las células de control, células no tratadas, en un valor normalizado de 1. Se muestran la actividad de caspasas promedio, con relación a las células de control, y las desviaciones estándar en la figura 12 para cada condición de tratamiento.

Ejemplo 12. No se observó regulación por incremento de HIF en hepatocitos humanos primarios o NCI-H1650, una línea de células de pulmón.

Tal como se ha detallado anteriormente, tanto la apo-transferrina como la holo-transferrina derivadas de plasma aumentan los niveles celulares de HIF-1a, en la línea celular neuronal humana SH-SY5Y. Además de las células neuronales, los trasplantes de órganos de hígado y pulmón también pueden beneficiarse de la inducción de la señalización de HIF. Por tanto, para evaluar lo mismo, se determinó el efecto de las transferrinas sobre los niveles de HIF-1a en hepatocitos primarios y una línea de células de pulmón (NCI-H1650). Se trataron la línea de células de pulmón NCI-H1650 o células de hepatocitos primarios cultivadas en medios libres de suero con 4 mg/ml de apotransferrina mayoritaria, holo-transferrina mayoritaria o pd-transferrina durante 6 horas en niveles normales de oxígeno. Después de 6 horas, se recogieron proteínas intracelulares y se sometieron a prueba para determinar los niveles de proteína de HIF-1a mediante ELISA. Los datos, tal como se resaltan en las figuras 13A y 13B, muestran que no se inducen los niveles de HIF-1a con transferrina o mezclas de apo-transferrina y holo-transferrina en NCIH1650 o hepatocitos primarios.

Ejemplo 13. Viabilidad de NCI-H1650 y hepatocitos primarios humanos en presencia de transferrinas.

Dado el perfil de seguridad anticipado de una proteína plasmática humana, se evaluó la toxicidad de las transferrinas (Apo mayoritaria, Holo mayoritaria y pd-transferrina) en NCI-H1650 y células de hepatocitos humanos primarias. Se trataron la línea de células de pulmón humanas, NCI-H1650, y hepatocitos humanos primarios durante 72 horas con 4 mg/ml de Apo-Tf mayoritaria, Holo-Tf mayoritaria o pd-transferrina. Después de 72 horas, se sometieron las células a un ensayo de viabilidad de luminiscencia de título celular. Se ajustaron las células de control, células no tratadas, en un valor del 100 % viables. Se muestran la viabilidad promedio y las desviaciones estándar en las figuras 14A y 14B para cada condición de tratamiento. Los datos muestran que no se observó toxicidad con composiciones que contenían Holo-Tf mayoritaria o Apo-Tf mayoritaria en células de pulmón, NCI-H1650 o hepatocitos primarios.

CONCLUSIONES:

Los experimentos realizados en la línea celular neuronal humana SH-SY5Y mostraron que tanto la apo-transferrina como la holo-transferrina derivadas de plasma aumentaron los niveles celulares de HIF-1a. El aumento de los niveles de HIF-1a se produjo en condiciones tanto normóxicas como hipóxicas. La administración de apotransferrina a células en condiciones normales de oxígeno elevó los niveles de HIF-1a hasta un nivel similar al observado cuando se expusieron las células a un entorno hipóxico. La exposición de células SH-SY5Y a apotransferrina en condiciones normóxicas durante periodos más largos aumentó el nivel de HIF-1a en mayor medida que en un tiempo más corto. Los controles negativos para albúmina sérica humana no tuvieron efecto sobre los niveles de HIF-1a.

Todas de varias mezclas de Apo-Tf y Holo-Tf regularon por incremento la proteína HIF-1a en células neuronales SH-SY5Y y células de riñón primarias.

No se observó regulación por incremento de HIF-1a en hepatocitos humanos primarios, o NCI-H1650, una línea de células de pulmón.

Todas de varias mezclas de Apo-Tf y Holo-Tf regularon por incremento genes diana de HIF-1a en células neuronales SH-SY5Y.

No se observó toxicidad con composiciones que contenían Holo-Tf mayoritaria o Apo-Tf mayoritaria en cualquier tipo celular (neuronal, de pulmón, de riñón o hepatocito)o in vivo.

El tratamientoin vivode ratas en un modelo de estrés neurológico de isquemia-reperfusión mostró que la transferrina (compuesta principalmente por Apo-Tf) protege a las células de rata frente al infarto.

Las mezclas que comprendían principalmente Apo-Tf u Holo-Tf protegieron las células neuronales frente a los efectos tóxicos del oligómero de Abeta (1-42).

Sólo las mezclas compuestas por Apo-Tf mayoritaria tuvieron efectos sinérgicos con M30 o DFO, y estas actividades sinérgicas sólo tuvieron lugar en células neuronales SH-SY5Y.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Composición que comprende una mezcla de apo-transferrina (Apo-Tf) y holo-transferrina (Holo-Tf) para su uso en un método de trasplante de órganos, comprendiendo el método tratar un órgano en la preparación para el trasplante en un humano, en la que dicho órgano es el riñón, y en la que dicha mezcla tiene una razón en porcentaje entre 99:1 y 30:70 (Apo-Tf:Holo-Tf).

2. Composición para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además o bien un quelante de hierro o bien un inhibidor de la enzima PHD2.

3. Composición para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas Apo-Tf y Holo-Tf son recombinantes.

4. Composición para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas Apo-Tf y Holo-Tf se modifican mediante pegilación, glicosilación, polisialilación u otras modificaciones físicas para prolongar la semivida plasmática de la proteína, incluyendo fusión covalente a dominios que prolongan la semivida en sangre, tales como el dominio Fc de inmunoglobulina, albúmina, XTEN.

5. Composición para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas Apo-Tf y Holo-Tf son conjugados de proteína entre Apo-Tf y Holo-Tf de longitud completa o fragmentos de Apo-Tf y Holo-Tf con cualquier otra proteína, fragmento de proteína o péptido.

6. Composición para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas Apo-Tf y Holo-Tf son derivados de transferrina que comprenden más del 50 % de similitud con SEQ ID NO. 1.

7. Composición para su uso, según la reivindicación 2, en la que dicho quelante de hierro es M30, deferoxamina (DFO), deferasirox, deferiprona, deferitrina, L1NAII, CP363, CP502 o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

8. Composición para su uso, según la reivindicación 2, en la que dicho inhibidor de la enzima PHD2 es IOX2, IOX3, dimetiloxalil-glicina u otras moléculas del sitio de unión a 2-oxoglutarato.