ES2988584T3

ES2988584T3 - Subconjunto de células NKT para persistencia y actividad terapéutica in vivo y propagación del mismo

Info

Publication number: ES2988584T3
Application number: ES16783876T
Authority: ES
Inventors: Leonid S Metelitsa; Amy N Courtney; Gengwen Tian
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 2015-04-23
Filing date: 2016-04-21
Publication date: 2024-11-21
Anticipated expiration: 2036-04-21
Also published as: JP2018516548A; EP4470623A3; US12048716B2; KR20180021683A; HK1252164A1; KR102723492B1; CN107847585B; US11458168B2; JP2022058482A; JP2024073656A; JP7086375B2; AU2022201744B2; US20160310532A1; AU2025203036A1; EP3291835A4; AU2016250598A1; SG11201708600RA; PL3291835T3; US11266689B2; KR20240161837A

Abstract

Las realizaciones de la divulgación incluyen métodos y composiciones para producir células NKT eficaces para la inmunoterapia y también métodos y composiciones para proporcionar una cantidad eficaz de células NKT a un individuo que necesita inmunoterapia. En realizaciones específicas, las células NKT son CD62L+ y han sido expuestas a uno o más agentes coestimuladores para mantener la expresión de CD62L. Las células NKT pueden modificarse para incorporar un receptor de antígeno quimérico, en algunos casos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Subconjunto de células NKT para persistencia y actividad terapéuticain vivoy propagación del mismo

Esta solicitud reivindica prioridad respecto a la solicitud provisional de patente de EE. UU. n.° 62/151.690 presentada el 23 de abril de 2015, y la solicitud provisional de patente de EE. UU. n.° 62/309.525, presentada el 17 de marzo de 2016.

DECLARACIÓN CON RESPECTO A LA INVESTIGACIÓN O DESARROLLO PATROCINADOS POR EL GOBIERNO FEDERAL

La presente invención se ha realizado con el apoyo del gobierno en virtud de RO1 CA116548 y P50 CA126752 concedidas por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene determinados derechos sobre la invención.

Campo técnico

La presente divulgación abarca al menos los campos de la biología celular, biología molecular, inmunología y medicina, incluida al menos la medicina oncológica.

Antecedentes

Las células NKT (NKT) de tipo I son un subconjunto evolutivamente conservado de linfocitos innatos que expresan la cadena TCRa invariante Va24-Ja18 y reaccionan a glucolípidos propios o procedentes de microbios presentados por la molécula CD1d monomórfica de clase I similar a HLA (Porcelliet al.(1993); Lantz y Bendelac, 1994; Bendelacet al.,1995; Kimet al.,2015). La importancia potencial de las NKT para la inmunidad tumoral y la inmunoterapia se ha demostrado en múltiples modelos de cáncer en ratones y en ensayos clínicos en etapa temprana en pacientes con cáncer (McEwen-Smithet al.,2015; Dhodapkar, 2009; Exley y Nakayama, 2011; Motohashiet al.,2011; Yamasaki, 2011; Taniguchiet al.,2015). A diferencia de los linfocitos T, las NKT se desplazan de manera eficaz al sitio del tumor y pueden mediar respuestas antitumorales ya sea mediante la destrucción directa de células tumorales CD1d+, la inhibición de los macrófagos que apoyan el tumor o la transactivación de las células NK (Metelitsa, 2011). Varios estudios han revelado fuertes asociaciones positivas entre la cantidad de NKT infiltradas en tumores o circulantes y una mejor evolución de la enfermedad en pacientes con diversos tipos de tumores (Dhodapkar, 2009; Metelitsaet al.,2004; Tachibanaet al.,2005; Mollinget al.,2007; Carianiet al.,2012; Carianiet al.,2012). Por el contrario, la progresión tumoral suele ir acompañada de una disminución del número de células NKT o de la actividad funcional (16), o del descenso de la expresión de CD1d en las células malignas (Dhodapkaret al.,2003). Para contrarrestar estos mecanismos de escape del tumor, se desarrollaron métodos para expandir las NKT humanas primarias a escala clínicaex vivoy redirigir su citotoxicidad contra las células tumorales a través de la expresión transgénica de receptores quiméricos para el antígeno (CAR, del ingléschimeric antigen receptors)(Heczeyet al.,2014). Similar a las observaciones indicadas en ensayos clínicos de linfocitos T-CAR (Kalos y June, 2013; Dottiet al.,2014), existe una fuerte correlación entre la eficacia antitumoral y la persistenciain vivode productos de células NKT-CAR en un modelo de tumor xenogénico (Heczeyet al.,2014). Sin embargo, los mecanismos que gobiernan la expansiónex vivoy posterior persistenciain vivode las NKT humanas sigue siendo en gran medida desconocida, lo que obstaculiza el diseño racional de la inmunoterapia contra el cáncer basada en células NKT.

Estudios recientes de perfiles transcripcionales globales demostraron que las NKT, aunque comparten propiedades con los linfocitos T y Nk , son una población distinta de linfocitos (Cohenet al.,2013). En el ratón, el programa de desarrollo y la diferenciación funcional de las NKT se han caracterizado bastante ampliamente durante la última década, como se resume en revisiones recientes (Kimet al.,2015; Contantinides y Bendelac, 2013). También se han confirmado varias características clave de las NKT murinas en sus homólogos humanos. Tanto en ratones como en seres humanos, las NKT divergen de los linfocitos T en la etapa de timocitos CD4+CD8+ (doble positivo, DP). A diferencia de los linfocitos T, que se seleccionan positivamente por las células epiteliales tímicas, las NKT se seleccionan por los timocitos DP que expresan CD1d (Gapinet al.,2001). La expresión del factor de transcripción de dedo de zinc de leucemia promielocítica (PLZF, del ingléspromyelocyticleukemia zinc finger)inmediatamente después de la selección positiva permite la expansión intratímica y la diferenciación de tipo efectora/memoria de las NKT (Savageet al.,2008). Las NKT periféricas son linfocitos de larga vida y su mantenimiento postímico depende en gran medida de la proliferación homeostática lenta mediada por IL-15 (Matsudaet al.,2002; Baevet al.,2004). En la sangre periférica humana, las NKT se dividen en dos subconjuntos funcionales principales según la expresión de CD4: CD4+ y CD4- (principalmente CD8/CD4-doble negativo, Dn ) (Leeet al.,2002). El subconjunto CD4+ está altamente enriquecido en las NKT neonatales y experimenta menos divisiones homeostáticas en comparación con el subconjunto CD4- en adultos (Baevet al.,2004), lo que sugiere que las NKT CD4+ podrían contribuir a la persistencia a largo plazo de las NKT terapéuticas transferidas adoptivamente en ciertas condiciones. Sin embargo, la expansiónex vivode NKT humanas en respuesta a la estimulación antigénica, por ejemplo, con aGalactosilceramida (aGalCer), produce cantidades similares de NKT CD4+ y DN (28). Las NKT también presentan una diferenciación lineal similar a la de las NK con adquisición de la expresión de CD161 y, a continuación, de CD56. Al igual que en los linfocitos T, la expresión de CD56 se asocia con la diferenciación terminal y la pérdida de potencial proliferativo (Lozaet al.,2002).

A diferencia de los linfocito T periféricos, que tienen una jerarquía de desarrollo bien establecida desde indiferenciado a de memoria central, a de memoria efectora y a células efectoras terminales (Sallustoet al.,2004), las NKT se describen ampliamente como células con un fenotipo "activado/de memoria" sin el estado indiferenciado (D'Andreaet al.,2000; Kronenberg y Gapin, 2002). En la sangre del cordón umbilical, la mayoría de las NKT son CD4+ y expresan de manera conjunta CD45RO con CD62L y CCR7 sin función efectora inmediata (Baevet al.,2004; D'Andreaet al.,2000; Egeret al.,2006), por lo que se asemejan a los linfocitos T CD4 de memoria central. En la sangre periférica del adulto, las NKT se dividen equitativamente entre los subconjuntos CD4+ y CD4- (aunque con una variabilidad interindividual significativa). Las NKT adultas carecen de una demarcación clara entre los estados de "memoria" y "efector", ya que expresan de forma variable marcadores de memoria y tienen funciones efectoras inmediatas, tales como la producción de citocinas y la citotoxicidad (Baevet al.,2004; Egeret al.,2006). La mayoría de las NKT adultas, incluso en las ancianas, expresan CD28 (DelaRosaet al.,2002), lo que las hace distintas de los linfocitos T efectores diferenciados terminalmente (Okadaet al.,2008).

Informes recientes han demostrado que los linfocito T de memoria central CD62L+ tienen propiedades de células madre y una actividad terapéutica superior en productos de terapia celular (Graefet al.,2014; Wanget al.,2012; Sommermeyeret al.,2015). Se desconoce la importancia funcional de la expresión de CD62L en las NKT. En esta divulgación, el subconjunto CD62L+ es necesario para la expansiónex vivoy la persistenciain vivode las células NKT. Es importante destacar que, cuando se diseñaron para expresar CAR específico de CD19 (CAR.CD19), las NKT CAR.CD19 CD62L+, pero no CD62L, produjeron una regresión tumoral sostenida en un modelo de linfoma de linfocitos B en ratones NSG. Las NKT CD62L+ podrían mantenerse durante la expansiónex vivocuando se proporciona con ciertos ligandos coestimuladores. Con este conocimiento, se pueden genomanipular células presentadoras de antígenos artificiales (aAPC, del inglésartificial antigen-presenting cells)coestimuladoras que se pueden utilizar para generar NKT y NKT-CAR con una actividad terapéutica superior en pacientes con cáncer, por ejemplo. El documento WO 2015/051247 A1 se refiere a células presentadoras de antígenos artificiales para su uso en el tratamiento de enfermedades, incluido el cáncer.

Breve sumario

La presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

Los métodos y composiciones de la presente divulgación se refieren a inmunoterapias para un individuo que las necesita. Como se describe en el presente documento, el individuo necesita un tratamiento dirigido a una célula portadora de antígeno en particular para su destrucción, tal como cáncer, por ejemplo. La invención proporciona, en general, el uso de células NKT para inmunoterapia basada en mejoras de métodos para generar cantidades y eficacias clínicamente útiles de células NKT.

La presente invención se refiere a células NKT CD62L+ que tienen una persistencia y actividad antitumoralin vivosuperiores. La invención permite la expansión eficaz de células NKT de modo que se puedan utilizar para aplicaciones terapéuticas. Las NKT de la presente invención tienen una supervivencia y expansión mejoradas que están asociadas con la expresión de CD62L. La expresión de CD62L está presente en las células NKT y se mantiene en las células debido a la coestimulación de las células NKT. La invención se refiere a la coestimulación de células NKT para mantener la expresión de CD62L. Las células NKT se exponen a coestimulación mediante uno o más métodos, tal como, por ejemplo, tras la exposición a una o más citocinas (incluida, al menos, IL-21), uno o más anticuerpos agonistas que se unen a un receptor coestimulador y/o células presentadoras de antígenos artificiales que expresan CD1d y uno o más ligandos del receptor coestimulador. Por tanto, en realizaciones específicas, se pueden utilizar células presentadoras de antígenos artificiales para la generación de NKT enriquecidas con CD62L para una inmunoterapia eficaz contra el cáncer.

La invención se refiere a un método para preparar linfocitos T citolíticos naturales (NKT, del inglésnatural killer T)para su uso en inmunoterapia, que comprende la etapa de enriquecer una población de células NKT para células NKT positivas para CD62L. En una realización específica, las células NKT positivas para CD62L se activan mediante la estimulación del receptor de linfocitos T y la coestimulación por receptores coestimuladores y/o citocinas. En algunos casos, el método comprende además la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de las células a un individuo que necesita tratamiento. En determinados aspectos, las células se modifican para expresar uno o más receptores quiméricos para antígenos, receptores de linfocitos T, una o más citocinas, uno o más receptores de citocinas, uno o más receptores quiméricos de citocinas o una combinación de los mismos.

La invención se refiere al tratamiento de un individuo por una afección médica mediante inmunoterapia, que comprende las etapas de a) enriquecer una población de células NKT para células NKT positivas para CD62L u obtener una población de células NKT que están enriquecidas para células NKT positivas para CD62L; y b) proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz de células NKT positivas para CD62L al individuo.

La invención se refiere al tratamiento de un individuo por una afección médica mediante inmunoterapia, que comprende las etapas de expandir células NKT CD62L+ a partir de una mezcla de poblaciones de células NKT CD62L+ y células NKT CD62L- mediante la exposición de la mezcla de poblaciones a uno o más agentes coestimuladores para enriquecer y producir células NKT CD62L+ coestimuladas; y proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz de células NKT CD62L+ coestimuladas al individuo. En realizaciones específicas, los agentes estimuladores y los agentes coestimuladores comprenden a) una o más citocinas; b) un sustrato que comprende un anticuerpo agonista o ligando para el receptor de linfocitos T (por ejemplo, AcM OKT3, AcM 6B11 o CDld humano recombinante con glucolípido agonista unido, tal como alfa-galactosilceramida) y uno o más anticuerpos agonistas que se dirigen a los receptores coestimuladores; o c) una célula presentadora de antígeno que comprende la expresión de CDld y que comprende la expresión de uno o más ligandos de uno o más receptores coestimuladores. En determinadas realizaciones, la citocina se selecciona del grupo que consiste en IL-21, IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, TNFa y una combinación de ellos. El sustrato puede ser una perla, placa o un gel. En una realización específica, la célula presentadora de antígeno se transduce con uno o más polinucleótidos para expresar uno o más ligandos de uno o más receptores coestimuladores. El receptor coestimulador puede ser CD28, OX40, 4-1BB, ICOS, CD40, CD30, CD27 o una combinación de los mismos. El ligando del receptor coestimulador puede ser CD80, CD86, OX40L, 4-1BBL, ligando ICOS, CD154, CD30L o una combinación de los mismos.

En realizaciones particulares, las células NKT abarcadas por la invención comprenden una modificación genética. En aspectos específicos, la modificación genética proporciona a las células una actividad dirigida a las células cancerosas, tal como dirigida a un antígeno en las células cancerosas. La modificación genética puede comprender un receptor de linfocito T y/o un receptor quimérico para antígenos. En algunos casos, las células NKT se modifican genéticamente después de exponer la población a uno o más agentes coestimuladores. Las células NKT pueden modificarse genéticamente en el plazo de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más días después de la exposición de la población a uno o más agentes coestimuladores.

La invención se refiere a métodos para producir células NKT para inmunoterapia, que comprenden la etapa de coestimular una población de células NKT para mantener la expresión de CD62L en al menos algunas de las células NKT. En algunos casos, los métodos comprenden además la etapa de proporcionar una cantidad eficaz de células NKT a un individuo que las necesita.

La invención se refiere a un método para producir células NKT para inmunoterapia, que comprende la etapa de exponer una población previamente clasificada de células NKT CD62L+ o una población mixta de células NKT CD62L+ y células NKT CD62L- a uno o más agentes coestimuladores diseñados para enriquecer o retener deliberadamente una población de células NKT CD62L+. En algunos casos, el método comprende además la etapa de obtener la población mixta. En realizaciones específicas, la población mixta procede de individuo al que se le administrará la población enriquecida. En determinados aspectos, la población mixta procede de un individuo diferente del individuo al que se le administrará la población enriquecida. La población mixta puede proceder de un depósito u obtenerse comercialmente.

En el presente documento también se divulga una composición de materia que comprende una célula no natural que expresa CD1d y que expresa uno o más ligandos de uno o más receptores coestimuladores.

Breve descripción de los dibujos

Figuras 1A a 1D. Acumulación del subconjunto CD62L+ en cultivo después de la estimulación antigénicain vitrode NKT primarias. (1A) La expresión de CD62<l>se examinó mediante FACS en NKT primarias a partir de PBMC recién aisladas (día 0) y 12 días después de la estimulación con aGalCer y la expansiónin vitroen el cultivo. (1B) Cinética de la expresión de CD62L en NKT en los intervalos indicados después de la estimulación primaria (como en 1A) de donantes individuales (n = 10). (1C) La expresión de PD-1, TIM-3 y LAG-3 en la superficie de las células NKT se midieron mediante FACS los días 0 y 12. Gráficos representativos de uno de los 4 donantes (gráficos superiores) o media ± DE de la IMF para todos los donantes (gráficos inferiores). (1D) El día 12 después de la estimulación primaria, las NKT se clasificaron magnéticamente en subconjuntos CD62L+ y CD62L-, seguido del aislamiento de ARN y análisis de la expresión genética utilizando el Human Immunology Panel v.2 y el sistema de análisis nCounter. En la matriz cromática se muestran los factores de cambio log2 (CD62+/CD62L-) de genes con valorespmenores a 0,02 y un cambio de veces promedio mayor a 2. Los datos se generaron a partir de 6 donantes de células NKT (12 muestras pareadas).

Figuras 2A a 2E. Caracterización funcional de las NKT CD62L+ y CD62L-. (2A) Las células DAOY CD1d+ transducidas con luciferasa se pulsaron con PBS (control) o aGalCer durante la noche, seguido de un cultivo conjunto con NKT CD62L+ o CD62L- clasificadas magnéticamente. La citotoxicidad se analizó después de 4 h mediante la medición de la intensidad de la luminiscencia con un lector de placas. El gráfico de la izquierda es representativo de 3 donantes sin diferencias en la citotoxicidad entre los subconjuntos de NKT. El gráfico de la derecha es representativo de 3 donantes con una diferencia significativa en la citotoxicidad entre los subconjuntos de NKT. (2B) Las concentraciones de IFN-<y>e IL-4 se midieron en sobrenadantes de 24 h de NKT CD62L+ o CD62L- estimuladas con aGalCer mediante el ensayo Luminex en 3 experimentos independientes con NKT de 3 donantes. (2C) Las NKT marcadas con CFSE se clasificaron magnéticamente en los subconjuntos CD62L+ y CD62L- como se confirmó mediante FACS posterior a la clasificación (gráfico superior) y se estimularon con APC pulsadas con aGalCer irradiado. El día 3 después de la estimulación, la tinción para anexina V y 7-AAD se analizó en NKT mediante FACS después de activar los acontecimientos positivos para CFSE. Los resultados proceden de un representante de 5 donantes analizados (gráficos centrales). El gráfico de barras correspondiente (gráfico inferior) muestra la media ± DE del porcentaje de NKT anexina V+ en el día 3 (N = 5). (2D) La proliferación celular se evaluó el día 6 después de la estimulación, medida mediante dilución de CFSE. Los resultados provienen de un representante de 5 donantes evaluados (gráficos superiores) y la media ± DE de la IMF de CFSE para los 5 donantes (gráficos inferiores). (2E) Se realizaron recuentos totales de células en los intervalos de tiempo indicados después de la estimulación de las células NKT. Se muestran la media ± DE de células viables para un donante representativo (gráfico superior) o el factor de cambio para cada uno de los 5 donantes evaluados el día 6 después de la estimulación. *** P <0,001, prueba de latpara datos emparejados.

Figuras 3A a 3D. Las NKT CD62L+ tienen una persistencia y actividad antitumoralin vivosuperiores. (3A) Las NKT transducidas con luciferasa se clasificaron en subconjuntos CD62L+ y CD62L- y se inyectaron en ratones NSG. La persistenciain vivode las células NKT se controló con imágenes de bioluminiscencia. (3B) Media ± DE del recuento de fotones de bioluminiscencia en los días indicados después de la inyección de NKT CD62L+ o CD62L- (P = 0,008, prueba de latpara datos emparejados). (3C) Cada ratón recibió una inyección i.v. de 2 * 105 células de linfoma de Daudi transducidas con luciferasa (día 0) seguidas de una inyección i.v. (día 4) de 107 NKT transducidos con CAR.CD19 con IL-2 (1000 U/ratón) o PBS como control. El crecimiento del tumor se controló mediante imágenes bioluminiscentes una vez por semana. (3D) La probabilidad de supervivencia se analizó mediante el método de Kaplan-Meier (10 ratones por grupo). A continuación, se compararon las diferencias en supervivencia utilizando la prueba de orden logarítmico.

Figuras 4A a 4D. La coestimulación mantiene las NKT CD62L+ y previene el agotamiento. (4A) Las NKT se clasificaron en subconjuntos CD62L+ y CD62L- y se estimularon y examinaron para la expresión de 4-1BB y OX40 mediante FACS antes y 3 días después de la estimulación con aGalCer. Se muestran gráficos de un grupo representativo de 4 donantes. (4B) Las NKT CD62L+ se estimularon en placas recubiertas con los AcM agonistas indicados. Se muestran la media ± DE (N = 4) del factor de cambio en el número absoluto de células NKT el día 7 después de la estimulación en comparación con el día 0. P <0,001, ANOVA unifactorial. (4C) Las NKT CD62L+ se estimularon como en B y se analizaron para la expresión de CD62L (negro) frente al control de isotipo (gris) el día 7. Se muestran histogramas superpuestos representativos (gráficos superiores) y la media ± DE del porcentaje de células CD62L+, N = 4. (4D) Las NKT CD62L+ se estimularon como en B y se analizaron para la expresión de PD-1 (negro) frente al control de isotipo (gris) el día 12. Se muestran histogramas superpuestos representativos (gráficos superiores) y la media ± DE del porcentaje de células PD-1+. ** o *** P <0,01 o 0,001, ANOVA unifactorial;

Figuras 5A a 5E. Análisis fenotípico de NKT recién aisladas y expandidasin vitro.(5A) La expresión de CD4 y CD62L se examinó mediante FACS en NKT primarias (selección del subconjunto CD3+Va24-Ja18+) en células mononucleares de sangre del cordón umbilical (CBMC, del ingléscord blood mononuclear cells)recién aisladas. Las gráficas proceden de un representante de 5 donantes de CBMC. (5B) Se examinó la expresión de CD4 y CD62L en NKT primarias después de la activación como en A antes (día 0) y 12 días después de la estimulación con aGalCer y la expansiónin vitro.Las gráficas proceden de un representante de 10 donantes de PBMC. (5C) Expresión de CCR7, CD27 y CD28 en relación con la expresión de CD62L en NKT primarias después de la activación como en A antes (día 0) y 12 días después de la estimulación con aGalCer y la expansiónin vitro.Las gráficas proceden de un representante de 6 donantes de PBMC. (5D) Expresión de CD161, CD56 e IL7Ra en relación con la expresión de CD62L el día 12 después de la estimulación con aGalCer y la expansiónin vitro. Las gráficas proceden de un representante de 3 donantes de PBMC. (5E) La expresión de PLZF, LEF1 y GATA3 en relación con la expresión de CD62L y la coexpresión de LEF1 y GATA3 se analizó mediante citometría de flujo intracelular el día 12 después de la estimulación con aGalCer y la expansiónin vitro.Las gráficas proceden de un representante de 4 donantes de PBMC.

Figuras 6A a 6B. Comparación de la pureza y los números absolutos de las células NKT después de la expansión con AcM agonistas CD3/CD28 frente a PBMC irradiadas pulsadas con aGalCer. Las NKT se aislaron de cuatro PBMC. La mitad de ellas se estimularon con PBMC autólogas irradiadas pulsadas con aGalCer, la otra mitad se estimularon con una placa recubierta con AcM CD3/CD28. En ambos casos, las células se propagaron en cultivo con IL-2 (200 U/ml) añadida cada dos días. El día 12, se analizaron los cultivos para: (6A) La pureza de las células NKT se determinó mediante citometría de flujo como porcentaje de células que expresaban CD3 y iTCRa. (6B) El recuento celular absoluto de células NKT se realizó mediante un ensayo de exclusión con azul tripano por triplicado. * P <0,05, los datos se analizaron después de la transformación Log(2) utilizando la prueba de latpara datos emparejados.

Figuras 7A a 7B. Transducción de células NKT con CAR.CD19. (7A) Presentación esquemática de la construcción CAR.CD19. (7B) Las NKT se volvieron a estimular con PBMC autólogas (irradiadas con 40 Gy). El día 3 después de la reestimulación, se recubrieron placas de 24 pocillos, sin cultivo tisular, con retronectina y después del lavado se inocularon con 1 ml de sobrenadante retrovírico que contenía CAR.CD19. A continuación, se eliminó el sobrenadante vírico y se añadieron NKT a los pocillos en medio completo y 200 U/ml de rhIL-2. Después, las NKT se clasificaron magnéticamente en los subconjuntos CD62L+ y CD62L- y se analizó la expresión superficial de CAR.CD19 mediante tinción con AcM 2D3 mediante FACS 12 días después de la transducción. Se muestran gráficas FACS de un representante de 3 experimentos independientes.

Figuras 8A a 8B. Expresión de receptores coestimuladores en NKT en reposo y activados. (8A) Análisis FACS de la expresión de OX40 y 4-1BB en relación con CD4 en NKT en reposo (día 12 después de la estimulación primaria) y 3 días después de la reestimulación con aGalCer. Las gráficas proceden de un representante de 6 donantes de PBMC.

(8B) Las NKT CD62L+ y CD62L- clasificadas magnéticamente se analizaron para la expresión de OX40 y 4-1BB en relación con CD43 días después de la reestimulación de las células NKT con aGalCer. Las gráficas proceden de un representante de 4 donantes de PBMC.

Figura 9. Comparación de la expansión de células NKT utilizando concentraciones bajas y altas de AcM OKT3 unido a la placa. Las NKT quiescentes expandidasin vitrose estimularon con AcM anti-CD3 OKT3 a 20 ng/ml o 1 |jg/ml solo o con AcM anti-CD28 CD28.2 a 500 ng/ml. Las células se propagaron en cultivo con IL-2 (200 U/ml) añadida cada dos días. El día 12, El recuento absoluto de células NKT se realizó mediante un ensayo de exclusión con azul tripano por triplicado y se dividió por el número de entrada en el día 0. Los datos son M ± DE, N = 4. ** P = 0,01, prueba de latpara datos emparejados.

En la figura 10 se muestra que IL-21 aumenta la frecuencia de células NKT CD62L+ durante la expansión primaria.

En la figura 11 se demuestra que IL-21 aumenta la frecuencia de células NKT CD62L+ durante la expansión secundaria.

En la figura 12 se muestra la expresión de CD1d y moléculas coestimuladoras en células de Ramos, a modo de ejemplo.

En la figura 13 se demuestra que las células Ramos pueden expandir NKT primarias con un nivel elevado de expresión de CD62L.

En la figura 14 se muestra que las células Ramos expanden las NKT tras la estimulación secundaria con una retención significativa de la expresión de CD62L.

Descripción detallada

Como se utiliza en el presente documento en la memoria descriptiva, "un" o "uno/una" pueden significar uno o más. Como se usa en el presente documento en la reivindicación o reivindicaciones, cuando se utiliza junto con la palabra "que comprende", las palabras "un" o "uno/una" pueden significar uno o más de uno. Como se usa en el presente documento, "otro" puede significar al menos un segundo o más. En realizaciones específicas, los aspectos de la invención pueden "consistir esencialmente en" o "consistir en" una o más secuencias de la invención, por ejemplo. Algunas realizaciones de la invención pueden consistir o consistir esencialmente en uno o más elementos, etapas del método y/o métodos de la invención. Se contempla que cualquier método o composición descritos en el presente documento se puede implementar con respecto a cualquier otro método o composición descritos en el presente documento. El alcance de la presente solicitud no pretende limitarse a las realizaciones particulares del proceso, máquina, elaboración, composición de la materia, medios, métodos y etapas descritos en la memoria descriptiva.

I. Realizaciones generales

La presente invención se refiere a células NKT para su uso en inmunoterapia porque son capaces de expandirse a niveles suficientes y persistirin vivoa niveles suficientes para lograr un efecto terapéutico. Las células NKT de la presente invención se manipulan para expresar y mantener la expresión de CD62L, lo que al menos en parte les permite tener una aplicabilidad terapéutica mejorada. Dicha conservación de la expresión de CD62L en las células NKT se produce, al menos en parte, con la coestimulación, incluida la exposición a uno o más agentes coestimuladores.

II. Células NKT y coestimulación de las mismas

En realizaciones particulares, las células NKT son útiles para aplicaciones terapéuticas porque han mejorado la expansiónin vitroy la persistenciain vivodespués de la exposición a uno o más agentes coestimuladores que permitieron a las células mantener la expresión de CD62L. El o los agentes coestimuladores pueden ser de cualquier tipo, pero en realizaciones específicas comprenden una o más citocinas; b) un sustrato (perla, placa, etc., por ejemplo) que comprende uno o más anticuerpos agonistas que se dirigen a los receptores coestimuladores; y/o c) una célula, tal como una célula presentadora de antígenos, que comprende la expresión de CDld y que comprende la expresión de uno o más ligandos de uno o más receptores coestimuladores. En los casos en donde las células NKT están expuestas a citocinas, las citocinas pueden ser de cualquier tipo adecuado, pero en casos específicos la citocina es IL-21, IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, IL-18, TNFa o una combinación de las mismas. En realizaciones específicas, las células NKT CD62L+ expresan el receptor de IL-21 y, al cultivarse en presencia de IL-2 e IL-21, conservan la expresión de CD62L.

En los casos en donde las células NKT están expuestas a uno o más agentes coestimuladores que son anticuerpos agonistas (al menos en algunos casos que son monoclonales) que reconocen inmunológicamente un receptor coestimulador, el receptor puede ser cualquier receptor coestimulador. Sin embargo, en realizaciones específicas, el receptor es CD28, 4-1BB, OX-40, ICOS, CD2, CD27, CD30, GITR, TIM1, LFA1, ICAM1 o HVEM, por ejemplo. Los anticuerpos pueden fijarse a un sustrato que permite que una población de células, tal como una población de células NKT, esté suficientemente expuesta a los anticuerpos. Los anticuerpos pueden obtenerse comercialmente, obtenidos como regalo o producido por medios convencionales en la materia.

En los casos en donde las células NKT están expuestas a una cantidad terapéuticamente eficaz de células que tienen actividad de célula presentadora de antígeno, tal como una célula presentadora de antígeno artificial (tal como una célula no natural con actividad de célula presentadora de antígeno), la célula se puede transducir con uno o más polinucleótidos para expresar uno o más ligandos de uno o más receptores coestimuladores. La célula puede ser de cualquier tipo siempre que exprese uno o más ligandos de uno o más receptores coestimuladores, pero, al menos en algunos casos, la célula también expresa CD1d. En realizaciones particulares, la célula es una célula presentadora de antígeno. En casos específicos, una célula que expresa CD1d y/o que expresa uno o más ligandos de uno o más receptores coestimuladores es de origen natural y puede utilizarse en los métodos abarcados en el presente documento. En otros casos, una célula que naturalmente no expresa CD1d de manera natural y/o que no expresa de manera natural uno o más ligandos de uno o más receptores coestimuladores se transduce para expresar el componente o los componentes respectivos y se utiliza en los métodos abarcados en el presente documento. El ligando del receptor coestimulador puede ser de cualquier tipo, pero en realizaciones específicas el ligando es CD80, CD86, 4-1BBL, OX40L, ICOSL, CD30L, GITRL, TIM4, LIGHT, etc. En los casos en donde la célula que tiene actividad de célula presentadora de antígeno se transduce con uno o más polinucleótidos, los polinucleótidos pueden estar comprendidos en un vector, incluido un vector vírico o un vector no vírico (tal como un plásmido). Los vectores víricos incluyen vectores retrovíricos, vectores lentivíricos, vectores adenovíricos, vectores víricos adenoasociados, etc. Los vectores comprenderán elemento(s) regulador(es) adecuado(s) para la expresión en la célula que tiene actividad de célula presentadora de antígeno. En algunos casos, el polinucleótido transducido en la célula que tiene actividad de célula presentadora de antígeno codifica dos o más regiones codificantes, tal como la codificación de dos ligandos receptores coestimuladores. En dicho caso, las regiones codificantes separadas pueden o no estar reguladas por los mismos elementos reguladores.

En realizaciones en donde la expresión de CD62L en células NKT se mantiene debido a la coestimulación de las células NKT, puede haber o no un orden general para las etapas para preparar las células NKT deseadas. En realizaciones particulares, las células NKT se obtienen de una fuente adecuada (por ejemplo, sangre (incluida la sangre periférica, sangre del cordón umbilical, etc.), mediante clasificación (por ejemplo, perlas magnéticas o FACS) y están presentes en una población mixta de células. Después de esto, las células NKT se activana través deestimulación del TCR utilizando un sustrato que contiene un anticuerpo agonista o ligando para el receptor de linfocitos T (por ejemplo, AcM OKT3, AcM 6B11 o CD1d humano recombinante con glucolípido agonista unido, tal como alfagalactosilceramida) o células presentadoras de antígeno que expresan CD1d y glucolípido agonista unido, tal como alfa-galactosilceramida. Las células NKT activadas por TCR pueden estar expuestas a coestimulación para producir niveles más elevados de células NKT CD62L+ a partir de la población de lo que se produciría en ausencia de coestimulación. En algunas realizaciones, antes de su administración a un individuo que lo necesite y después de la exposición a uno o más agentes coestimuladores, las células NKT se manipulan mediante medios recombinantes para incorporar una o más características, tales como para expresar uno o más agentes o entidades terapéuticas que hacen que las células NKT sean terapéuticas. En determinadas realizaciones, las células se modifican genéticamente para proporcionarles la capacidad de dirigirse a una célula portadora de antígeno. En realizaciones específicas, la manipulación consiste en transducir las células NKT para expresar uno o más receptores quiméricos para el antígeno y/o un receptor de linfocitos T, ya sea que se dirijan a un antígeno específico de interés. En realizaciones específicas, el antígeno es un antígeno tumoral.

Las células NKT que se utilizarán para el tratamiento de una afección médica en un individuo pueden tener su origen en el individuo al que se administrarán, pueden tener su origen en otro individuo o pueden obtenerse de un depósito de células. En realizaciones específicas, las células NKT son células NKT de tipo 1.

Las células NKT pueden clasificarse o no antes de su administración a un individuo. En realizaciones específicas, las células NKT positivas para CD62L no se separan de las células NKT negativas para CD62L, pero en realizaciones alternativas se pueden separar. En los casos en donde las células no estén separadas, por ejemplo, en función de si expresan o no CD2L, cuando las células no se separan por separación física se pueden enriquecer mediante la coestimulación de las células lo que da como resultado el mantenimiento de la expresión de CD62L.

En la mayoría de los casos, las células no se separan en función de un fenotipo particular, pero en algunos casos donde se separan las células, pueden hacerlo mediante métodos que permitan el enriquecimiento de las células deseadas, tal como, por ejemplo, mediante la recogida de las células deseadas tras exponerlas a uno o más sustratos que puedan unirse específicamente a las células. Por ejemplo, se puede utilizar la separación de las células deseadas utilizando un anticuerpo sobre un sustrato (tal como una perla, partícula, placa, matriz de gel, etc.), en donde el anticuerpo puede unirse directa o indirectamente a las células. En realizaciones específicas, se puede emplear separación magnética.

111. Modificación genética de células NKT

En realizaciones particulares, las células NKT se modifican genéticamente antes de administrarse a un individuo que las necesita. Las células NKT generalmente se modifican después de la estimulación y coestimulación del TCR; en realizaciones particulares, la modificación genética se produce en los 1, 2, 3, 4, 5 o más días después de la estimulación (y esto puede depender del tipo de transducción utilizada; por ejemplo, con vectores retrovíricos es en 2 días).

La modificación genética de las células NKT puede producirse por la mano del hombre y, en realizaciones particulares, la modificación genética hace que las células sean capaces de dirigirse específicamente a una o más células cancerosas, tales como las células cancerosas que expresan un antígeno particular, por ejemplo. En realizaciones específicas, la modificación proporciona a las células NKT un receptor no natural particular para un determinado antígeno canceroso. El receptor puede ser de cualquier tipo, pero en realizaciones específicas el receptor es un receptor de linfocitos T o un receptor quimérico para el antígeno, por ejemplo. En algunos casos, el receptor quimérico para antígeno es para CD19, CD22, CD30, GD2, GPC3, CSPG4, HER2, CEA, mesotelina,etc.

El receptor de linfocitos T para MHC/péptidos forma complejos a partir de antígenos asociados a tumores no mutados (por ejemplo, survivina, m Yc N, NY-ESO1, MAGE, PRAME, WT1, etc.) o antígenos tumorales mutados específicos del paciente revelados mediante secuenciación del ADN tumoral.

En algunos casos, las células NKT se modifican para expresar un CAR. La ingeniería genética de las células NKT para expresar receptores quiméricos para el antígeno (CAR) dirigidos a tumores puede producir células efectoras antitumorales que evitan los mecanismos de escape inmunitario del tumor que se deben a anomalías en el procesamiento y la presentación de proteínas y antígenos. Por otra parte, estos receptores transgénicos pueden dirigirse a antígenos asociados a tumores que no proceden de proteínas. En determinadas realizaciones de la divulgación, hay células NKT que están modificadas para comprender al menos un CAR. En aspectos específicos, una célula NKT particular comprende la expresión de dos o más CAR.

La presente divulgación incluye células NKT que expresan un receptor de linfocitos T artificial denominado CAR (que también pueden denominarse receptores quiméricos para linfocitos T o inmunorreceptores quiméricos). En realizaciones de la divulgación, es específico para un antígeno de cáncer. En general el CAR puede incluir un ectodominio, dominio transmembrana y endodominio. En realizaciones específicas, puede ser de primera generación, segunda generación o tercera generación.

En casos particulares, las células NKT incluyen un CAR que es quimérico, no natural, genomanipulado, al menos en parte, por la mano del hombre y dirigido a un antígeno de cáncer de interés particular. En casos particulares, el CAR genomanipulado tiene uno, dos, tres, cuatro o más componentes y, en algunas realizaciones, el uno o más componentes facilitan el direccionamiento o la unión de la célula NKT a la célula cancerosa que comprende el antígeno canceroso. En realizaciones específicas, el CAR comprende un anticuerpo para el antígeno canceroso, parte o la totalidad de un dominio de señalización citoplasmática, y/o parte o la totalidad de una o más moléculas coestimuladoras, por ejemplo, endodominios de moléculas coestimuladoras. En realizaciones específicas, el anticuerpo es un fragmento variable monocatenario (scFv). En determinados aspectos, el anticuerpo se dirige a antígenos cancerosos en la superficie celular de las células cancerosas que expresan un antígeno de interés, por ejemplo. En determinadas realizaciones, un dominio de señalización citoplasmática, tal como los procedentes de la cadena Z del receptor de linfocitos T, se emplea como al menos parte del receptor quimérico para producir señales estimuladoras para la proliferación de células NKT y la función efectora después de la interacción del receptor quimérico con el antígeno diana. Los ejemplos incluirían, pero sin limitación, endodominios de moléculas coestimuladoras, tales como CD27, CD28, 4-1BB y OX40 o los componentes de señalización de los receptores de citocinas, tales como IL7 e IL15. En realizaciones particulares, se emplean moléculas coestimuladoras para mejorar la activación, proliferación y citotoxicidad de las células NKT producidas por el CAR después de la interacción con el antígeno. En realizaciones específicas, las moléculas coestimuladoras son CD28, OX40 y 4-1BB.

En general, un ectodominio del CAR abarca un péptido señal, un dominio de reconocimiento de antígeno y un espaciador que une el dominio de reconocimiento de antígeno al dominio transmembrana. El dominio de reconocimiento de antígeno generalmente comprenderá un fragmento variable monocatenario (scFv) específico para un antígeno de cáncer particular. Sin embargo, en los casos en donde hay dos o más CAR en la misma célula, el segundo CAR puede comprender un scFv específico para otros antígenos particulares. Los ejemplos de antígenos de cáncer incluyen uno cualquiera de los antígenos asociados al melanoma (MAGE), antígeno expresado preferentemente en melanoma (PRAME), CD19, CD20, CD22, cadena ligera<k>, CD30, CD33, CD123, CD38, CD138, ROR1, ErbB2, ErbB3/4, EGFr vIII, antígeno carcinoembrionario, EGP2, EGP40, HER2, mesotelina, TAG72, PSMA, ligandos NKG2D, B7-H6, receptor a2 de IL-13, MUC1, MUC16, CA9, GD2, GD3, HMW-MAA, CD171, Lewis Y, G250/CAIX, HLA-AI MAGE A1, HLA-A2 NY-ESO-1, PSC1, receptor de folato-a, CD44v6, CD44v7/8, 8H9, NCAM, receptores de VEGF, 5T4, AchR fetal, ligandos de NKG2D o CD44v6, por ejemplo.

Los ejemplos de regiones bisagra para el ectodominio incluyen la región CH2CH3 de la inmunoglobulina, la región bisagra de IgG1 y porciones de CD3. La región transmembrana puede ser de cualquier tipo, aunque en algunos casos es CD28.

En general, el endodominio del CAR de la divulgación se utiliza para la transmisión de señales en la célula después del reconocimiento del antígeno y la agrupación de los receptores. El componente de endodominio más comúnmente utilizado es CD3Z, que contiene 3 ITAM y que transmite una señal de activación al linfocito T después de que se une el antígeno. En algunas realizaciones, se utiliza señalización coestimuladora adicional, tal como CD3Z en combinación con CD28, 4-1BB y/u OX40.

IV. Células en general

Las células de la divulgación incluyen tanto células NKT positivas para CD62L, que se han coestimulado por uno o más agentes coestimuladores, como también el agente coestimulador particular que en sí mismo es una célula presentadora de antígeno artificial (que puede denominarse una célula no natural que tiene actividad de célula presentadora de antígeno). En algunas realizaciones, hay como una composición de materia, una célula presentadora de antígeno artificial que es una célula no natural que expresa CD1d y que expresa uno o más ligandos de uno o más receptores coestimuladores.

Como se utiliza en el presente documento, el término "célula" y las expresiones "estirpe celular" y "cultivo celular" pueden utilizarse indistintamente. Todos estos términos incluyen también a su descendencia, que es todas y cada una de las generaciones subsiguientes. Se entiende que toda la descendencia puede no ser idéntica debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. En el contexto de la expresión de una secuencia de ácido nucleico heterólogo, una "célula hospedadora" puede referirse a una célula procariota o eucariota, e incluye cualquier organismo transformable que sea capaz de replicar un vector y/o expresar un gen heterólogo codificado por un vector. Una célula hospedadora puede utilizarse, y se ha utilizado, como receptor de vectores. Una célula hospedadora puede ser "transfectada" o "transformada", lo que se refiere a un proceso mediante el cual se transfiere o introduce un ácido nucleico exógeno en la célula hospedadora. Una célula transformada incluye la célula primaria y su descendencia. Como se utiliza en el presente documento, los términos células o células hospedadoras "genomanipuladas" y "recombinantes" se refieren a una célula en la que se ha introducido una secuencia de ácido nucleico exógeno, tal como, por ejemplo, un vector. Por lo tanto, las células recombinantes se distinguen de las células de origen natural en que no contienen un ácido nucleico introducido de forma recombinante.

En determinadas realizaciones, se contempla que los ARN o secuencias proteicas pueden coexpresarse con otros ARN o secuencias proteicas seleccionados en la misma célula hospedadora. La coexpresión puede lograrse mediante la cotransfección de la célula hospedadora con dos o más vectores recombinantes distintos. Como alternativa, se puede construir un único vector recombinante para incluir múltiples regiones codificantes distintas para ARN, que después podrían expresarse en células hospedadoras transfectadas con el vector único.

Algunos vectores pueden emplear secuencias de control que permiten su replicación y/o expresión tanto en células procariotas como eucariotas. Un experto en la materia comprendería además las condiciones bajo las cuales se deben incubar todas las células hospedadoras descritas anteriormente para mantenerlas y permitir la replicación de un vector. También se entienden y conocen técnicas y condiciones que permitirían la producción a gran escala de vectores, así como la producción de los ácidos nucleicos codificados por vectores y sus polipéptidos, proteínas o péptidos afines.

Las células utilizadas en la divulgación son eucariotas, incluidas de mamíferos, aunque pueden emplearse células procariotas para la manipulación en ingeniería recombinante de vectores o ADN para integrarlos en los vectores. Las células son particularmente humanas, pero pueden asociarse con cualquier animal de interés, en particular, animales domésticos, tales como equinos, bovinos, murinos, ovinos, cánidos, felinos,etc.para su uso en sus respectivos animales.

Las células pueden ser células autólogas, células singénicas, células alogénicas e incluso, en algunos casos, células xenogénicas, tales como en relación al individuo que recibe las células. Las células pueden modificarse mediante el cambio del perfil del complejo principal de histocompatibilidad ("MHC", del inglésmajor histocompatibility complex),mediante la inactivación de p<2>-microglobulina para prevenir la formación de moléculas funcionales del<m>H<c>de clase I, la inactivación de moléculas de clase II, proporcionar la expresión de una o más moléculas MHC, mejorar o inactivar las capacidades citotóxicas mediante la mejora o la inhibición de la expresión de genes asociados con la actividad citotóxica, o similares.

Los vectores de expresión que codifican un CAR se pueden introducir en las células como una o más moléculas o construcciones de ADN, donde puede haber al menos un marcador que permitirá la selección de células hospedadoras que contengan el(las) construcciones. Las construcciones se pueden preparar de forma convencional, donde los genes y las regiones reguladoras se pueden aislar, según corresponda, ligar, clonar en un hospedador de clonación adecuado, analizar por restricción o secuenciación, u otros medios convenientes. En particular, mediante PCR, se pueden aislar fragmentos individuales que incluyan toda o parte de una unidad funcional, donde se pueden introducir una o más mutaciones mediante "reparación de cebadores", ligamiento, mutagénesisin vitro, etc.,según corresponda. Una vez completados y demostrado que tienen las secuencias apropiadas, las construcciones pueden introducirse en el CTL mediante cualquier medio conveniente. Las construcciones pueden integrarse y empaquetarse en genomas víricos defectuosos no replicables, tales como adenovirus, virus adenoasociado (VAA) o virus del herpes simple (VHS) u otros, incluidos los vectores retrovíricos, para infección o transducción en células. Las construcciones pueden incluir secuencias víricas para la transfección, si se desea. Como alternativa, la construcción puede introducirse mediante fusión, electroporación, biolística, transfección, lipofección o similares. Las células hospedadoras pueden cultivarse y expandirse en cultivo antes de la introducción de las construcciones, seguido del tratamiento adecuado para la introducción de la(s) construcción(es) y la integración de la(s) construcción(es). A continuación, las células se expanden y se seleccionan en virtud de un marcador presente en la construcción. Varios marcadores que pueden utilizarse con éxito incluyen hprt, resistencia a la neomicina, timidina cinasa, resistencia a higromicina,etc.

En muchas situaciones es posible que se desee poder destruir las células modificadas, cuando se desea interrumpir el tratamiento, las células se vuelven neoplásicas, en investigaciones donde es de interés la ausencia de las células después de su presencia, u otro acontecimiento. Para este fin se puede proporcionar la expresión de determinados productos génicos en los que se pueden destruir las células modificadas en condiciones controladas. Los productos de genes suicidas, tal como la caspasa 9, son ejemplos de dichos productos.

A modo de ilustración, los pacientes con cáncer o pacientes susceptibles de padecer cáncer o sospechosos de tenerlo se pueden tratar de la siguiente manera. Las células modificadas, como se describen en el presente documento, pueden administrarse al paciente y conservarse durante períodos de tiempo prolongados. El individuo puede recibir una o más administraciones de las células. Las células se modificarían y se proporcionarían al individuo que las necesitara.

V. Polinucleótidos

También se divulga en el presente documento una composición que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR específico de antígeno como se define en el presente documento y células que albergan la secuencia de ácido nucleico. La molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico recombinante y puede ser sintética. Puede comprender ADN, ARN, así como PNA (ácido nucleico peptídico) y puede ser un híbrido de los mismos.

Por otra parte, se prevé para otros fines que las moléculas de ácido nucleico puedan contener, por ejemplo, enlaces tioéster y/o análogos de nucleótidos. Las modificaciones pueden ser útiles para la estabilización de la molécula de ácido nucleico contra endonucleasas y/o exonucleasas en la célula. Las moléculas de ácido nucleico pueden transcribirse mediante un vector adecuado que comprende un gen quimérico que permite la transcripción de dicha molécula de ácido nucleico en la célula. En este sentido, también debe entenderse que dichos polinucleótidos se pueden utilizar para enfoques de "direccionamiento genético" o "terapia genética". Las moléculas de ácido nucleico pueden estar marcadas. Los métodos para la detección de ácidos nucleicos son bien conocidos en la materia, por ejemplo, transferencia Southern y Northern, PCR o extensión de cebadores. Esto puede ser útil para los métodos de selección para verificar la introducción exitosa de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente durante los enfoques de terapia génica.

La(s) molécula(s) de ácido nucleico pueden ser una molécula de ácido nucleico quimérico producida de forma recombinante que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente, ya sea sola o en combinación. La molécula de ácido nucleico puede ser parte de un vector.

También se divulga en el presente documento una composición que comprende un vector que comprende la molécula de ácido nucleico descrita en la presente divulgación.

Los expertos en biología molecular conocen muchos vectores adecuados, la elección de los cuales dependería de la función deseada e incluiría plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores utilizados convencionalmente en ingeniería genética. Se pueden utilizar métodos bien conocidos por los expertos en la materia para construir diversos plásmidos y vectores; véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrooket al.(1989) y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). Como alternativa, los polinucleótidos y vectores de la divulgación se pueden reconstituir en liposomas para su administración a células diana. Se puede utilizar un vector de clonación para aislar secuencias individuales de ADN. Las secuencias importantes se pueden transferir a vectores de expresión donde se requiere la expresión de un polipéptido particular. Los vectores de clonación típicos incluyen pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 y pGBT9. Los vectores de expresión típicos incluyen pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT.

En realizaciones específicas, existe un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que es una secuencia reguladora unida operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR específico de antígeno definido en el presente documento. El experto en la materia conoce dichas secuencias reguladoras (elementos de control) que pueden incluir un promotor, un casete de corte y empalme, codón de iniciación de la traducción, sitio de traducción e inserción para introducir un inserto en el vector. En realizaciones específicas, la molécula de ácido nucleico está unida operativamente a dichas secuencias de control de expresión permitiendo la expresión en células eucariotas o procariotas.

Se prevé que un vector sea un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica un CAR específico de antígeno como se define en el presente documento. En aspectos específicos, el vector es un vector vírico, tal como un vector lentivírico. Los vectores lentivíricos están disponibles comercialmente, incluidos los de Clontech (Mountain View, CA) o GeneCopoeia (Rockville, MD), por ejemplo.

La expresión "secuencia reguladora" se refiere a las secuencias de ADN que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias codificantes a las que están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador. En procariotas, las secuencias de control incluyen generalmente promotores, sitios de unión ribosómica y terminadores. En eucariotas generalmente las secuencias de control incluyen promotores, terminadores y, en algunos casos, potenciadores, transactivadores o factores de transcripción. Se pretende que la expresión "secuencia de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y puede incluir también componentes ventajosos adicionales.

La expresión "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante está unida de tal manera que se consigue la expresión de la secuencia codificante en condiciones compatibles con las secuencias de control. En caso de que la secuencia de control sea un promotor, para un experto en la materia es evidente que se utiliza preferentemente un ácido nucleico bicatenario.

Por tanto, en determinadas realizaciones, el vector citado es un vector de expresión. Un "vector de expresión" es una construcción que se puede utilizar para transformar un hospedador seleccionado y permite la expresión de una secuencia codificante en el hospedador seleccionado. Los vectores de expresión pueden ser, por ejemplo, vectores de clonación, vectores binarios o vectores integradores. La expresión comprende la transcripción de la molécula de ácido nucleico preferentemente en un ARNm traducible. Los elementos reguladores que garantizan la expresión en células procariotas y/o eucariotas son bien conocidos por los expertos en la materia. En el caso de las células eucariotas, normalmente comprenden promotores que aseguran el inicio de la transcripción y, opcionalmente, señales poli-A que aseguran la terminación de la transcripción y la estabilización de la transcripción. Los posibles elementos reguladores que permiten la expresión en células hospedadoras procariotas comprenden, por ejemplo, el promotor P<l>, 1ac, trp o tac enE. coli,y ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células hospedadoras eucariotas son el promotor AOX1 o GAL1 en levadura o el promotor de CMV, SV40, RSV (virus del sarcoma de Rous), potenciador del CMV, potenciador de SV40 o un intrón de globina en células de mamíferos y otros animales.

Además de los elementos que son responsables del inicio de la transcripción, dichos elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de la transcripción, tales como el sitio SV40-poli-A o el sitio tk-poli-A, cadena abajo del polinucleótido. Por otra parte, dependiendo del sistema de expresión utilizado, se pueden añadir a la secuencia codificante de la secuencia de ácido nucleico citada secuencias líder capaces de dirigir el polipéptido a un compartimento celular o de secretarlo al medio, y son bien conocidas en la materia. La(s) secuencia(s) líder se ensamblan en la fase adecuada con las secuencias de traducción, iniciación y terminación, y preferentemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida, o una porción de la misma, en el espacio periplásmico o medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación aminoterminal que imparte características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado; véase anteriormente. En este contexto, se conocen en la materia vectores de expresión adecuados, tales como el vector de expresión de ADNc pcDV1 de Okayama-Berg (Pharmacia), pEF-Neo, pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen), pEF-DHFR y pEF-ADA, (Raumet al.Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150) o pSPORT1 (GIBCO BRL).

En algunas realizaciones, las secuencias de control de la expresión son sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células hospedadoras eucariotas, pero también se pueden utilizar secuencias de control para hospedadores procariotas. Una vez que el vector se ha incorporado en el hospedador adecuado, el hospedador se mantiene en condiciones adecuadas para una expresión de nivel elevado de las secuencias de nucleótidos y, según se desee, la recogida y purificación del polipéptido de la divulgación puede seguir. En realizaciones particulares, una o más secuencias codificables están reguladas por secuencias de control de la expresión que responden a entornos hipóxicos.

Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores tanto transcripcionales como traduccionales. De manera ventajosa, los vectores de la divulgación descritos anteriormente comprenden un marcador seleccionable y/o puntuable. Los genes marcadores seleccionables útiles para la selección de células transformadas son bien conocidos por los expertos en la materia y comprenden, por ejemplo, la resistencia a antimetabolitos como base de la selección para dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life-Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149); npt, que confiere resistencia a los aminoglucósidos neomicina, kanamicina y paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Se han descrito genes seleccionables adicionales, en concreto, trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano; hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); manosa-6-fosfato isomerasa, que permite a las células utilizar manosa (Documento WO 94/20627) y ODC (ornitina descarboxilasa), que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-omitina, DFMO (McConlogue, 1987, en: Current Communications in Molecular Biology, (Cold Spring Harbor Laboratory ed.) o desaminasa deAspergillus terreus,que confiere resistencia a Blasticidina S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338).

Los expertos en la materia también conocen marcadores puntuables útiles que están disponibles comercialmente. De manera ventajosa, dicho marcador es un gen que codifica luciferasa (Giacomin, P1. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), proteína fluorescente verde (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) o p-glucuronidasa (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907). Esta realización es particularmente útil para la detección simple y rápida de células, tejidos y organismos que contienen un vector citado.

Como se ha descrito anteriormente, la molécula de ácido nucleico citada se puede utilizar en una célula, sola o como parte de un vector para expresar el polipéptido codificado en las células. Las moléculas de ácido nucleico o vectores que contienen las secuencias de ADN que codifican una cualquiera de las construcciones CAR específicas se introducen en las células que a su vez producen el polipéptido de interés. Las moléculas de ácido nucleico y los vectores citados pueden diseñarse para su introducción directa o para su introduccióna través deliposomas o vectores víricos (por ejemplo, adenovíricos o retrovíricos) en una célula.

De acuerdo con lo anterior, la presente divulgación se refiere a métodos para producir vectores, en particular plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos utilizados convencionalmente en ingeniería genética que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia polipeptídica de un CAR específico de antígeno definido en el presente documento. Preferentemente, dicho vector es un vector de expresión y/o un vector de transferencia o direccionamiento de genes. Los vectores de expresión procedentes de virus, tales como los retrovirus, virus de la variolovacuna, virus adenoasociados, virus del herpes o virus del papiloma bovino, puede utilizarse para administrar los polinucleótidos o vectores citados a poblaciones de células diana. Se pueden utilizar métodos bien conocidos por los expertos en la materia para construir vectores recombinantes; véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrooket al.(citado anteriormente), Ausubel (1989, citado anteriormente) u otros libros de texto convencionales. Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico y los vectores citados se pueden reconstituir en liposomas para su administración a las células diana. Los vectores que contienen las moléculas de ácido nucleico de la divulgación se pueden transferir a la célula hospedadora mediante métodos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de hospedador celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación pueden utilizarse para otros hospedadores celulares; véase Sambrook, citado anteriormente.

XII. Composiciones farmacéuticas

De acuerdo con esta divulgación, la expresión "composición farmacéutica" se refiere a una composición para administración a un individuo. La composición farmacéutica comprende una pluralidad de células NKT. La composición farmacéutica puede comprender una composición para administración parenteral, transdérmica, intraluminal, intraarterial, intratecal o intravenosa o para inyección directa en un cáncer. Dicha composición farmacéutica puede administrarse al individuoa través deinfusión o inyección. La administración de las composiciones adecuadas puede efectuarse de diferentes maneras, por ejemplo, mediante administración intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, tópica o intradérmica.

La composición farmacéutica de la presente divulgación puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la materia e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles,etc.Las composiciones que comprenden dichos vehículos se pueden formular según métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar al sujeto en una dosis adecuada.

La pauta posológica la determinará el médico tratante y en función de los factores clínicos. Como se sabe bien en el campo de la medicina, las dosis para cada paciente dependen de muchos factores, incluido el tamaño del paciente, superficie corporal, edad, el compuesto particular que se va a administrar, sexo, tiempo y vía de administración, salud general y otros medicamentos que se administran simultáneamente. El progreso se puede controlar mediante una evaluación periódica. Las NKT modificadas con CAR pueden administrarsea través deinfusión intravenosa. Las dosis pueden variar de 1 * 107/m2 a 2 * 108/m2, y en realizaciones específicas se pueden utilizar hasta 109 células.

Las composiciones de la divulgación pueden administrarse de manera local o sistémica. La administración generalmente será parenteral, por ejemplo, intravenosa; el ADN también puede administrarse directamente en el sitio diana, por ejemplo, mediante administración biolística a un sitio diana interno o externo o mediante catéter a un sitio en una arteria. La composición farmacéutica puede administrarse por vía subcutánea e incluso por vía intravenosa. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluida solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactato o aceites no volátiles. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluido y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los que se basan en la dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. Además, la composición farmacéutica de la presente divulgación podría comprender vehículos proteicos, como, por ejemplo, albúmina sérica o inmunoglobulina, preferentemente de origen humano. La composición farmacéutica puede comprender, además de las construcciones CAR o moléculas de ácido nucleico o vectores que codifican los mismos (como se describe en la presente divulgación), otros agentes biológicamente activos, dependiendo del uso previsto de la composición farmacéutica.

XII. Usos terapéuticos de las células NKT

A modo de ilustración, los pacientes con cáncer o pacientes susceptibles de padecer cáncer o con sospecha de padecerlo se pueden tratar como se describe en el presente documento. Las células NKT modificadas como se describe en el presente documento pueden administrarse al individuo y conservarse durante períodos de tiempo prolongados. El individuo puede recibir una o más administraciones de las células. En algunas realizaciones, las células modificadas genéticamente se encapsulan para inhibir el reconocimiento inmunitario y se colocan en el sitio del tumor.

En diversas realizaciones, las construcciones de expresión, secuencias de ácidos nucleicos, vectores, células hospedadoras y/o composiciones farmacéuticas que las comprenden se utilizan para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad cancerosa, tal como una enfermedad tumoral. En realizaciones particulares, la composición farmacéutica de la presente divulgación puede ser particularmente útil para prevenir, mejorar y/o tratar un cáncer, incluido un cáncer que tiene tumores sólidos, por ejemplo.

Como se utiliza en el presente documento, "tratamiento" o "que trata", incluye cualquier efecto beneficioso o deseable en los síntomas o la patología de una enfermedad o afección patológica, y puede incluir incluso reducciones mínimas en uno o más marcadores medibles de la enfermedad o afección que se está tratando, por ejemplo, cáncer. El tratamiento puede implicar opcionalmente la reducción o mejora de los síntomas de la enfermedad o afección, o el retraso de la progresión de la enfermedad o afección. "Tratamiento" no indica necesariamente la erradicación o cura completa de la enfermedad o afección, o de los síntomas asociados a ella.

Como se utiliza en el presente documento, "prevenir", y palabras similares como "prevenido", "que previene"etc.,indican un enfoque para prevenir, inhibir o reducir la probabilidad de que aparezca o reaparezca una enfermedad o afección, por ejemplo, cáncer. También se refiere a retrasar la aparición o reaparición de una enfermedad o afección o retrasar la aparición o reaparición de los síntomas de una enfermedad o afección. Como se utiliza en el presente documento, "prevención" y palabras similares también incluyen reducir la intensidad, efecto, síntomas y/o carga de una enfermedad o afección antes de la aparición o reaparición de la enfermedad o afección.

En realizaciones particulares, la presente divulgación contempla, en parte, células que albergan construcciones de expresión, moléculas de ácido nucleico y/o vectores que pueden administrarse solos o en cualquier combinación con otro tratamiento, y, en al menos algunos aspectos, junto con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, antes de la administración de las células, dichas moléculas de ácido nucleico o vectores pueden integrarse de forma estable en el genoma de las células. En realizaciones específicas, se pueden utilizar vectores víricos que sean específicos para determinadas células o tejidos y persistan en dichas células. Los vehículos y excipientes farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la materia. Las composiciones preparadas de acuerdo con la divulgación se pueden utilizar para la prevención o el tratamiento o el retraso de las enfermedades identificadas anteriormente.

Por otra parte, la divulgación se refiere a un método para la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad cancerosa (incluida una tumoral) que comprende la etapa de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de células que albergan una molécula de reconocimiento de antígeno y una molécula de resistencia a la quimioterapia, una secuencia de ácido nucleico que las codifica, un vector o vectores que las codifica, como se contempla en el presente documento y/o producidas mediante un proceso como se contempla en el presente documento.

Las posibles indicaciones para la administración de la(s) composición(es) de las células inmunitarias modificadas ilustrativas son enfermedades cancerosas, incluidas las enfermedades tumorales, incluidos los cánceres de mama, próstata, pulmón y colon o cánceres epiteliales/carcinomas, tales como MM, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cánceres del tracto genitourinario,por ejemplo.cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de cuello uterino y cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer del intestino delgado, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de vesícula biliar, cánceres del conducto biliar, cáncer de esófago, cáncer de las glándulas salivales y cáncer de la glándula tiroides, neuroblastoma, meduloblastoma, glioblastoma, neoplasias malignas hematopoyéticas, etc. Las indicaciones ilustrativas para la administración de la(s) composición(es) de células son enfermedades cancerosas, incluida cualquier neoplasia maligna que exprese un antígeno particular, por ejemplo. Además, incluyen neoplasias malignas que expresan de forma anormal otros antígenos tumorales y que también pueden ser la diana. La administración de la(s) composición(es) de la divulgación es útil para todas las etapas y tipos de cáncer, incluidas la enfermedad residual mínima, cáncer temprano, cáncer avanzado y/o cáncer metastásico y/o cáncer refractario, por ejemplo.

La divulgación abarca además protocolos de coadministración con otros compuestos,por ejemplo.construcciones de anticuerpos biespecíficos, toxinas dirigidas u otros compuestos, que actúana través decélulas inmunitarias. La pauta clínica para la coadministración de los compuestos inventivos puede abarcar la coadministración al mismo tiempo, antes y/o después de la administración del otro componente. Las terapias combinadas particulares incluyen quimioterapia, radiación, cirugía, terapia hormonal u otros tipos de inmunoterapia.

Además, en el presente documento se divulga un kit que comprende una o más células NKT como se describe en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico como se describe en el presente documento, un vector como se describe en el presente documento y/o un hospedador como se describe en el presente documento. El kit puede comprender una composición farmacéutica como la descrita anteriormente en el presente documento, ya sea sola o junto con otros medicamentos que se administrarán a un individuo que necesita tratamiento o intervención médica.

Las células NKT que se han modificado con la construcción o construcciones se cultivan después en un cultivo en condiciones selectivas y las células que se seleccionan por tener la construcción pueden después expandirse y analizarse más a fondo, usando, por ejemplo; la reacción en cadena de la polimerasa para determinar la presencia de la(s) construcción(es) en las células hospedadoras. Una vez identificadas las células hospedadoras modificadas, podrán utilizarse a continuación según lo previsto, por ejemplo, expandiéndose en cultivo o introduciéndose en un organismo hospedador.

Dependiendo de la naturaleza de las células, las células pueden introducirse en un organismo hospedador, por ejemplo,un mamífero, de muy diversas maneras. En realizaciones específicas, las células pueden introducirse en el sitio del tumo, aunque en realizaciones alternativas las células se adaptan al cáncer o se modifican para adaptarse al cáncer. El número de células que se empleen dependerá de una serie de circunstancias, el propósito de la introducción, la vida útil de las células, el protocolo a utilizar, por ejemplo, el número de administraciones, la capacidad de las células para multiplicarse, la estabilidad de la construcción recombinante y similares. Las células pueden aplicarse como dispersión, generalmente se inyecta en el sitio de interés o cerca de él. Las células pueden estar en un medio fisiológicamente aceptable.

La introducción del ADN no necesariamente tiene que dar como resultado la integración en todos los casos. En algunas situaciones, el mantenimiento transitorio del ADN introducido puede ser suficiente. De esta manera, se podría tener un efecto a corto plazo, donde las células podrían introducirse en el hospedador y, a continuación, activarse después de un tiempo predeterminado, por ejemplo, después de que las células hayan podido alojarse en un sitio determinado.

Las células pueden administrarse según se desee. Dependiendo de la respuesta deseada, el modo de administración, la vida de las células, el número de células presentes, se pueden emplear varios protocolos. El número de administraciones dependerá al menos en parte de los factores descritos anteriormente.

Se debe tener en cuenta que el sistema está sujeto a muchas variables, tales como la respuesta celular al ligando, la eficacia de la expresión y, según corresponda, al nivel de secreción, la actividad del producto de expresión, la necesidad particular del paciente, que puede variar con el tiempo y las circunstancias, la tasa de pérdida de la actividad celular como resultado de la pérdida de células o de la actividad de expresión de células individuales, y similares. Por lo tanto, se espera que, para cada paciente individual, incluso si existieran células universales que pudieran administrarse a toda la población, cada paciente se controlaría para obtener la dosis adecuada para él, y dichas prácticas de control de un paciente son rutinarias en la materia.

VI. Kits

Cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento puede estar comprendida en un kit. En un ejemplo no limitante, las células o reactivos para manipular células pueden estar incluidos en un kit. Las células NKT o una población de células que comprende células n Kt pueden estar incluidas en un kit. Dicho kit puede tener o no uno o más reactivos para la manipulación de las células. Dichos reactivos incluyen moléculas pequeñas, proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos, tampones, cebadores, nucleótidos, sales y/o una combinación de los mismos, por ejemplo. Los nucleótidos que codifican una o más citocinas, o las citocinas en sí mismas, pueden incluirse en el kit. Pueden incluirse en el kit proteínas, tales como citocinas o anticuerpos, incluidos los anticuerpos monoclonales agonistas. Pueden incluirse en el kit sustratos que componen los anticuerpos, o los propios sustratos no marcados y, en algunas realizaciones, se incluyen en el kit los reactivos para generar sustratos portadores de anticuerpos. Los sustratos pueden ser de cualquier tipo, incluso perlas o placas. Se pueden incluir en el kit células que comprendan actividad de célula presentadora de antígeno o reactivos para generarla. Se pueden incluir en el kit nucleótidos que codifican receptores quiméricos para antígeno o receptores de linfocitos T, incluidos reactivos para generar los mismos.

El kit puede comprender el tratamiento celular de la divulgación y también otro tratamiento contra el cáncer. En algunos casos, el kit, además de las realizaciones de tratamiento celular, también incluye un segundo tratamiento contra el cáncer, tal como la quimioterapia, terapia hormonal y/o inmunoterapia, por ejemplo. Los kits pueden adaptarse a un tipo particular de cáncer para un individuo y comprender respectivos segundos tratamientos contra el cáncer para ese individuo.

Los kits pueden comprender composiciones alícuotas adecuadas como se divulga en el presente documento. Los componentes de los kits pueden envasarse en medio acuoso o en forma liofilizada. El medio de recipiente de los kits incluirá generalmente al menos un frasco, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa u otro medio de recipiente, en el que se puede colocar un componente y, preferentemente, alicuotado adecuadamente. Cuando hay más de un componente en el kit, el kit también puede contener generalmente un segundo, tercero u otro recipiente adicional en el que los componentes adicionales se pueden colocar por separado. Sin embargo, varias combinaciones de componentes pueden estar comprendidas en un frasco. Normalmente, los kits también pueden incluir un medio para contener la composición y cualquier otro recipiente de reactivo en un espacio reducido para su venta comercial. Dichos recipientes pueden incluir recipientes de plástico moldeados por inyección o por soplado en los que se retienen los frascos deseados.

Cuando los componentes del kit se proporcionan en una y/o más soluciones líquidas, la solución líquida es una solución acuosa, siendo especialmente preferida una solución acuosa estéril. En cuyo caso, el recipiente puede ser en sí mismo una jeringa, pipeta y/u otros aparatos similares, desde el cual la formulación puede aplicarse a un área infectada del cuerpo, inyectada en un animal, y/o incluso aplicada y/o mezclada con los demás componentes del kit. Sin embargo, los componentes del kit pueden proporcionarse en forma de polvo(s) seco(s). Cuando los reactivos y/o componentes se proporcionan como polvo seco, el polvo se puede reconstituir mediante la adición de un disolvente adecuado. Se prevé que el disolvente también pueda proporcionarse en otro medio de recipiente.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la materia deben apreciar que las técnicas divulgadas en los ejemplos siguientes representan técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la práctica de la invención y, por tanto, se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica.

Ejemplo 1

LA IDENTIFICACIÓN DEL SUBCONJUNTO DE CÉLULAS NKT RESPONSABLE DE LA PERSISTENCIAIN VIVOY DE LA ACTIVIDAD TERAPÉUTICA Y LA DEFINICIÓN DE LAS CONDICIONES NECESARIAS PARA LA PROPAGACIÓN DE ESTE SUBCONJUNTO EN CULTIVO

La transferencia adoptiva de linfocitos T citolíticos naturales (NKT) invariantes se está desarrollando como una modalidad terapéutica prometedora para la inmunoterapia del cáncer, autoinmunidad y otras enfermedades. Debido a que la frecuencia de células NKT es baja en la sangre periférica humana, dichas terapias necesitan una extensa expansiónex vivode las NKT primarias mientras se conserva su longevidad y función. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares responsables del mantenimiento de las NKT tantoin vivocomoex vivosiguen siendo en gran medida desconocidos. En el presente documento se demuestra que la expansiónin vitroinducida por antígeno de NKT humanas primarias está asociada con la acumulación progresiva del subconjunto positivo para CD62L en los 5 individuos examinados, independientemente de la frecuencia inicial de ese subconjunto. Tras la clasificación magnética de las NKT en subconjuntos positivos para CD62L y negativos para CD62L, sólo las células positivas para CD62L sobrevivieron y proliferaron en respuesta a la estimulación del TCR, mientras que aproximadamente un 90 % de las células negativas para CD62L experimentaron apoptosis en 3 días. Por otra parte, las NKT positivas para CD62L persistieron 5 veces más que las negativas para CD62L después de la transferencia adoptiva a ratones NSG. Es importante destacar que, las NKT positivas para CD62L tuvieron una actividad terapéutica mucho mayor y prolongaron significativamente la supervivencia de los ratones en un modelo de linfoma xenogénico. Las células positivas para CD62L en proliferación disminuyeron o mantuvieron la expresión de CD62L cuando se activaron mediante TCR solo o con receptores coestimuladores, respectivamente. En particular, determinadas combinaciones de AcM agonistas para CD3, CD28 y/o 4-1BB permiten la expresión estable de CD62L en NKT estimuladasin vitroque se asocia con la velocidad máxima de su expansión y posterior persistenciain vivo.Por lo tanto, los resultados revelan una jerarquía funcional previamente no prevista en NKT humanas que puede aprovecharse para su expansiónex vivoeficaz para aplicaciones de terapia celular.

Por tanto, en el presente documento se identifica CD62L como un marcador de células NKT humanas con alto potencial proliferativo y actividad terapéutica superior. Se determinaron las condiciones de estimulaciónin vitroque previenen la disminución de CD62L en NKT durante la expansiónex vivoque es útil para la generación de productos de células NKT con actividad terapéutica elevada.

Ejemplo 2

LAS CÉLULAS NKT CD62L+ TIENEN PERSISTENCIA Y ACTIVIDAD ANTITUMORALIN VIVOSUPERIORES

Las células CD62L+ se acumulan en cultivo tras la estimulación antigénica de las NKT primarias. Estudios anteriores que compararon el fenotipo de las NKT humanas en sangre periférica adulta con el de la sangre del cordón umbilical observaron proporciones mucho mayores de NKT CD4+ y CD62L+ en neonatos (Baevet al.,2004; D'Andreaet al.,2000; Egeret al.,2006) (Figura 5A). La prevalencia de NKT CD4+CD62L+ en la sangre de cordón umbilical sugiere que la expresión de CD4 o/y CD62L marca un subconjunto de NKT que tiene un potencial de desarrollo superior y podría sustentar la expansiónex vivode NKT para aplicaciones terapéuticas. Para probar esta realización, se realizó inmunofenotipificación de NKT primarias inmediatamente después del aislamiento de la sangre periférica y en diferentes intervalos de tiempo en cultivo después de la estimulación con aGalCer, que produjo consistentemente una mayor frecuencia y números absolutos de n Kt en comparación con el uso de un protocolo de expansión de linfocitos T basado en la estimulación con CD3/CD28 (Figura 6). A pesar de una notable variabilidad interindividual de la expresión de CD62L en NKT recién aisladas, se observó una sorprendente acumulación de la fracción CD62L+ de NKT del 33,63 % ± 27,62 % en NKT recién aisladas al 69,92 % ± 10,57 % el día 12 del cultivo (P <0,001, Figuras 1A y 1B). Aunque CD62L se expresó con mayor frecuencia en las NKT CD4+ tanto antes como después del cultivo, la acumulación de células CD62L+ no pudo explicarse por una expansión preferencial de NKT CD4+. De hecho, al final de un cultivo de 12 días, las frecuencias de NKT<c>D62L+, CD4+ y CD62L+CD4+ aumentaron 3,9 ± 1,8, 1,9 ± 0,7 y 3,8 ±1,9 veces, respectivamente. Consistente con estos resultados, hubo un enriquecimiento del subconjunto CD62L+CD4- en el día 12 en comparación con el día 0 (Figura 5B). Una caracterización multiparamétrica adicional de las NKT mostró que CD62L a menudo se coexpresaba con CCR7 antes del cultivo, pero la expresión de CCR7 se perdió progresivamente durante el cultivo (Figura 5C). Casi todos las NKT expresaron tanto CD27 como CD28 antes del cultivo. Mientras que CD27 disminuyó en aproximadamente la mitad de las NKT el día 12 de cultivo independientemente del estado del CD62L, la expresión de CD28 permaneció inalterada (Figura 5C).

Las células CD62L- expresaron niveles más elevados de CD161 y CD56 (diferenciación similar a NK), pero un nivel más bajo de IL-7Ra (Figura 5D). Si bien las NKT recién aisladas rara vez expresaron marcadores de agotamiento (PD-1, LAG-3 o 6 TIM-3) en los subconjuntos CD62L+ o CD62L-, el subconjunto CD62L- expresó preferentemente PD-1 y TIM-3 el día 12 del cultivo de células NKT (P = 0,0043, 0,0184, Figura 5C). Por otra parte, el análisis de expresión génica relacionada con el sistema inmunitario (Plataforma nCounter®) de NKT CD62L+ y CD62L- clasificadas el día 12 reveló un aumento del ARNm de genes asociados con la supervivencia/memoria de los linfocitos T (por ejemplo, LEF1, S1PR1, IL-7Ra, IL21R) en NKT CD62L+ y con agotamiento/diferenciación terminal en NKT CD62L- (por ejemplo, PD-1, LAG-3, TIM-3, CD244, CD161, CD56, Figura 1D). El factor de transcripción factor potenciador linfoide 1 (LEF1) fue el gen relacionado con el sistema inmunitario más sobreexpresado en NKT CD62L+ en comparación con NKT CD62L-. El análisis de citometría de flujo intracelular demostró que las NKT CD62L+ expresaron uniformemente LEF1, mientras que una fracción importante de células CD62L- eran negativas para LEF1. Dado que recientemente se demostró que LEF1 media en la expansión de precursores de células NKT murinas en parte a través de la activación transcripcional de la expresión del genGATA3(Carret al.,2015), se analizó el nivel de proteína GATA3 en las NKT humanas en relación con los niveles de LEF1 y CD62L. La expresión de GATA3 se correlacionó fuertemente con la expresión de LEF1 y CD62L en NKT humanas (Figura 5E). Es interesante destacar que las NKT CD62L+ y CD62L-expresaron el mismo nivel de PLZF, un regulador principal transcripcional de la diferenciación funcional de las células NKT (Cohenet al.,2013). Por tanto, el subconjunto CD62L+ se acumula predominantemente en el cultivo tras la estimulación antigénica de las NKT primarias y la pérdida de la expresión de CD62L está asociada con la diferenciación terminal similar a la de las NK, el agotamiento y la disminución de los reguladores transcripcionales proproliferativos.

Las NKT CD62L+ son células similares a Th-0 capaces de expandirse numéricamente. A continuación, las NKT se clasificaron magnéticamente a partir del cultivo primario en subconjuntos CD62L+ y CD62L- y se examinaron sus propiedades funcionales. En la figura 2A se demuestra que ambos subconjuntos fueron igualmente citotóxicos (tres de seis donantes) o las NKT CD62L- fueron más citotóxicas que las NKT CD62L+ (tres de seis donantes) frente a las células de meduloblastoma DAOY CD1d+ cuando las células diana fueron pulsadas con aGalCer. El análisis de la producción de citocinas en las NKT estimuladas con aGalCer reveló niveles mucho más elevados de producción de IFN-<y>e IL-4 por CD62L+ en comparación con los subconjuntos CD62L- (P <0,001, Figura 2B). Las células CD62L+ presentaron una polarización similar a Th-0 (una producción equilibrada de IFN-y e IL-4, típica de toda la población de NKT de sangre periférica), mientras que el perfil de polarización de las células CD62L- no se pudo determinar de manera inequívoca debido a las bajas cantidades absolutas de cada citocina. A pesar del fuerte aumento de la expresión del ARNm de IL-23R en el subconjunto CD62L-, según lo determinado por el análisis nCounter (Figura 1D, una posible polarización Th17), no se detectó ni la expresión de la proteína IL-23R en la superficie celular de las NKT por FACS ni la producción de IL-17 tras la estimulación del TCR por ELISA.

Para examinar si la acumulación de NKT CD62L+ durante la expansiónin vitrose debe a su supervivencia o proliferación preferencial en respuesta a la estimulación antigénica, se midió su tasa de muerte celular y proliferación después de la estimulación de las células clasificadas con células presentadoras de antígeno que habían sido pulsadas con aGalCer. El día 3 después de la estimulación, el 31 % ± 21 % y el 74 % ± 7,5 % de las NKT CD62L+ y CD62L-sufrieron apoptosis, respectivamente (Figura 2C). Se observó una tasa de proliferación mucho mayor en el subconjunto CD62L+ frente al subconjunto CD62L-, medida mediante dilución de c Fs E el día 6 (Figura 2D). Por otra parte, la mayoría de las células que sobrevivieron y proliferaron en el grupo CD62L- expresaron CD62L, lo que sugiere que estas células eran descendencia de un pequeño subconjunto de células CD62L+ en la fracción de CD62L- original. Consistente con estos resultados, hubo una diferencia sorprendente en el número de NKT generadas después de un cultivo de 6 días de NKT CD62L+ frente a CD62L- clasificadas con IL-2 sola o con estimulación del TCR. De hecho, en la figura 2E (gráfico superior) se demuestra que las células CD62L+ experimentaron una expansión numérica de 2,5 y 8 veces con IL-2 sola o con estimulación del TCR, respectivamente. Por el contrario, las NKT CD62L- no pudieron expandirse en ninguna de las condiciones. Aunque el grado de proliferación de células NKT en respuesta a la estimulación antigénica varió de un donante a otro, el subconjunto CD62L- contribuyó poco o nada a la expansión de las células NKT en los cinco donantes analizados (Figura 2E, gráfico inferior). Por lo tanto, las NKT CD62L+ sobreviven y proliferan en respuesta a la estimulación antigénica y son responsables de la expansión numérica de las células NKT en cultivo.

El subconjunto CD62L+ es responsable de la persistencia y actividad terapéuticain vivode las NKT. Para determinar el papel del subconjunto CD62L+ en la persistenciain vivode las NKT transferidas adoptivamente, las NKT se transdujeron con luciferasa de luciérnaga y se clasificaron magnéticamente en subconjuntos CD62L+ y CD62L-. A continuación, los inventores transfirieron adoptivamente las células clasificadas a ratones NSG. Las imágenes bioluminiscentes longitudinales demostraron que la señal de las células CD62L- podía detectarse hasta el día 2, mientras que las células CD62L+ permanecieron detectables hasta el día 10 (P <0,001, Figuras 3A y B). A continuación, se comparó el potencial terapéuticoin vivode los subconjuntos de células NKT CD62L+ y CD62L- en un modelo de inmunoterapia redirigida por CAR para linfoma. Las NKT se transdujeron con un CAR específico de CD19 que contenía un endodominio coestimulador 4-1BB (CAR.CD19, figura 7) seguido de una clasificación en subconjuntos CD62L+ y CD62L-. A ratones NOD/SCID/IL2RY(nulo) (NSG) se les inyectaron por vía intravenosa células de linfoma Daudi CD19+ transducidas con luciferasa y cuatro días después se dividieron en dos grupos para recibir células NKT CAR.CD19 CD62L+ o CD62L-. Tanto las NKT CAR.CD19 CD62L+ como las CD62L- prolongaron la supervivencia de los animales tratados en comparación con el control no tratado (P <0,001). Es importante destacar que, sólo las NKT CAR CD62L+ indujeron una regresión tumoral sostenida en 7 de los 9 animales vivos tratados, 5 de los cuales estaban libres de tumores, durante al menos tres meses. Por el contrario, los 10 ratones tratados con NKT CAR CD62L-sucumbieron a la progresión del tumor (P <0,001, Figuras 3C y D). Por tanto, las NKT CD62L+ tienen una mayor persistenciain vivoy un potencial terapéutico superior en comparación con las NKT CD62L-.

La coestimulación mantiene las NKT CD62L+ y previene el agotamiento. Cada vez hay más pruebas de que la coestimulación desempeña un papel en la activación, supervivencia y expansión de las NKT (van den Heuvelet al.,2011). Mientras que las NKT en reposo expresan CD28, (Figura 5C), expresan poco o ningún receptor coestimulador tardío como 4-1BB y OX40 (Figura 8A). Sin embargo, la estimulación de las NKT con PBMC autólogas pulsadas con aGalCer dio lugar a una rápida inducción de 4-1BB en todas las NKT y OX40 en las NKT CD4+ (Figura 8<a>). Debido a que CD62L disminuye de forma transitoria dentro de las primeras 24 a 48 h después de la estimulación del TCR (datos no mostrados), se analizó la cinética de la expresión de 4-1BB y OX40 en NKT CD62L+ y CD62L- que se clasificaron antes de la estimulación. Se encontró que el 71,13 % ± 18,66 % y el 51,98 % ± 18,83 % de NKT CD62L+ y CD62L-aumentaron OX40 dentro de las 72 h posteriores a la estimulación (P = 0,0072, Figura 4A). De manera similar, las NKT CD62L+ estimulados expresaron un nivel más elevado de 4-1BB en comparación con las NKT CD62L- (P = 0,011, Figura 4A). OX40 aumentó de forma preferencial en el subconjunto CD4+ de las NKT CD62L+ o CD62L-, mientras que 4-1BB aumentó en todas las NKT (Figura 8B).

A continuación, se consideró si la coestimulación podría contrarrestar el agotamiento de NKT ampliadasin vitro.Las NKT clasificados CD62L+ se estimularon en placas recubiertas con un AcM agonista anti-CD3 OKT3 solo o junto con AcM para CD28, 4-1BB o ambos. OX40 no se probó en estos entornos porque los inventores no pudieron obtener un AcM anti-OX40 con actividad agonista. En primer lugar, la coestimulación con AcM anti-CD28, anti-4-1BB o con ambos aumentó la cantidad de NKT generadas en el cultivo dentro de los 7 días en comparación con la estimulación con anti-CD3 solo a 20 ng/ml (P <0,001, Figura 4B). En ausencia de coestimulación, el aumento de la concentración de OKT3 de 20 ng/ml a 1 pg/ml no afectó la cantidad de NKT generadas, mientras que la coestimulación fue eficaz para aumentar el número de células NKT solo cuando se combinó con la concentración más baja de OKT3 (Figura 9). Es importante destacar que, el día 7 después de la estimulación con OKT3 solo, menos de la mitad de las NKT fueron positivos para CD62L. La adición del AcM anti-CD28, anti-4-1BB o anti-CD28 con anti-4-1BB dio lugar a la retención de la expresión de CD62L en el 58 % ± 7,1 % (P = 0,026), el 73 % ± 9,2 % (P = 0,0036) y el 73 % ± 6,1 % (P = 0,0002) de las NKT, respectivamente (Figura 4C). En coordinación con la retención de la expresión de CD62L, las NKT provistas de señales coestimuladoras expresaron significativamente menos PD-1 (P <0,05, Figura 4D). Por lo tanto, la participación de los receptores coestimuladores durante la estimulación antigénica favorece la expresión de CD62L en las NKT proliferantes y evita su agotamiento.

Importancia de determinadas realizaciones de la divulgación

Una brecha crítica en el conocimiento de la biología de las células NKT humanas ha retrasado el desarrollo de una inmunoterapia eficaz contra el cáncer basada en células NKT. La expansión numéricaex vivode células NKT y posterior persistenciain vivo(requisitos esenciales para aplicaciones eficaces de terapia celular y génica basadas en células NKT) dependen del subconjunto CD62L+ de las NKT de sangre periférica. Sólo las NKT CD62L+ sobreviven y proliferan en respuesta a la estimulación repetida del TCR, mientras que las células CD62L- sufren un agotamiento temprano y muerte celular. Aunque la estimulación continua de las NKT está asociada con la pérdida de la expresión de CD62L, la activación de receptores coestimuladores durante la estimulación del TCR puede contrarrestar este proceso. De manera específica, los inventores determinaron experimentalmente una combinación única de moléculas CD86, 4-1BBL y OX40L y los niveles de su coexpresión en la superficie de una aAPC que permiten una expansión de células NKT a escala clínica altamente eficaz con máxima conservación de la expresión de CD62L. En determinadas realizaciones, las NKT CAR generadas utilizando aAPC como las que se incluyen en esta divulgación presentan una mayor persistenciain vivoy una actividad terapéutica superior contra modelosin vivode linfoma y neuroblastoma (como ejemplos de tipos de cáncer).

El subconjunto CD62L+ es responsable de la expansión numérica de las NKT tras la estimulación antigénicaex vivo.Los siguientes hallazgos respaldan la conclusión anterior: i) la fracción de células CD62L+ aumenta drásticamente después de la estimulación primaria de células NKT, ii) la mayoría de las células CD62L- clasificadas experimentan apoptosis, mientras que las células CD62L+ clasificadas proliferan en respuesta a una estimulación idéntica; iii) las NKT CD62L- presentan signos de diferenciación terminal (expresión de CD161 y CD56) en PBMC recién aisladas y adquieren rápidamente un fenotipo de agotamiento tras la estimulaciónin vitro,como demuestra el aumento marcado de la expresión de PD-1 y TIM-3 y la disminución de la capacidad de producir citocinas. Cuando se observan características similares en los productos terapéuticos de linfocitos T, se asocian con una falta posterior de persistencia o de respuestas objetivas después de la transferencia adoptiva a pacientes con cáncer (Gattinoniet al.,2005; Klebanoffet al.,2005).

Las NKT proliferantes eventualmente disminuyen la expresión de CD62L y adquieren un fenotipo de agotamiento durante el cultivoin vitro.Esta observación probablemente refleja la ontogenia de las NKT periféricas humanas, ya que la frecuencia de NKT CD62L+ es menor en la sangre periférica de adultos en comparación con la sangre del cordón umbilical (Egeret al.,2006; Der Vlietet al.,2000). En un informe, se encontró que las NKT de la sangre del cordón umbilical no expresaban CD62L (D'Andreaet al.,2000). En determinadas realizaciones, la razón de la discrepancia entre ese informe y otros y con los resultados actuales es técnica. M. Constantinideset al.identificaron una población indiferenciada muy rara de linfocitos T restringidos a CD1d con un nivel elevado de CD62L en la sangre periférica (Constantinideset al.,2011). Sin embargo, estas células no expresan la cadena invariante Va24 y tienen un nivel más bajo de expresión de PLZF en comparación con las NKT clásicas. En este estudio, tanto las NKT CD62L+ como las CD62L- expresaron niveles igualmente elevados de PLZF.

CD62L puede representar un marcador común de células responsables del mantenimiento a largo plazo de las células NKT y T periféricas. P. Graefet al.demostraron que los linfocitos T de memoria central CD62L+ poseen propiedades de células madre; podrían propagarse mientras dan lugar a linfocitos T efectores y de memoria (Graefet al.,2014). En el estudio publicado más recientemente, D. Sommermeyeret al.demostraron que los linfocitos T CD8 o CD4 que expresan CAR.CD19 humanos generados a partir de subconjuntos de memoria central e indiferenciados fueron más eficaces contra los xenoinjertos de linfoma de Raji en comparación con los generados a partir de subconjuntos de memoria efectora (Sommermeyeret al.,2015). Los autores también descubrieron que la combinación de los subconjuntos que expresan CAR CD4+ y CD8+ más potentes produjo una actividad antitumoral sinérgicain vivo.Se ha demostrado que la activación de las NKT conduce a la transactivación de las células NK y los linfocitos T CD8 en modelos murinos y en ensayos clínicos en seres humanos (Dhodapkaret al.,2009; Vivieret al.,2012), por lo que la combinación de NKT CAR con otros subconjuntos definidos de linfocitos que expresan CAR puede ser una estrategia terapéutica útil.

LEF1 e IL-7Ra estaban entre los genes relacionados con el sistema inmunitario que estaban más sobreexpresados en CD62L+ en comparación con las NKT CD62L-. En un informe reciente, Carret al.demostraron una función única de LEF1 en la expansión de células murinas invariantes Va14 (iNKT) durante la etapa 2 de su desarrollo tímico a través de la activación transcripcional directa de la expresión del genCD127yc-myc(Carret al.,2015). En consonancia con la observación de la expresión coordinada de LEF1 y GATA3 en<n>K<t>humanas, estos investigadores también encontraron que LEF1 aumenta el factor de transcripción GATA3, que es necesario para la producción de IL-4 en células iNKT2, así como para la producción doble de IL-4 e INFy en células iNKT1. Las últimas células se parecen mucho a las NKT de sangre periférica humana, en las que se encontró que las células CD62L+ expresan preferentemente GATA3 y producen niveles elevados de ambas citocinas. Tomando el estudio de Carret al.con NKT murinas y los resultados con NKT humanas, en realizaciones específicas, LEF1 desempeña un papel fundamental en las primeras etapas del desarrollo de las células NKT y controla su número y función. El nivel elevado de expresión de LEF1 en CD62L+ y su pérdida en subconjuntos CD62L- de NKT humanas es coherente con un modelo de progresión lineal de NKT CD62L+ menos diferenciadas con un potencial proliferativo conservado y un perfil de citocinas similar a Th-0 hacia células NKT CD62L- terminalmente diferenciadas con capacidad disminuida para proliferar y producir citocinas.

Cada vez hay más pruebas de que la coestimulación desempeña un papel fundamental en el desarrollo, la activación y las respuestas funcionales de NKT en modelos murinos (van den Heuvelet al.,2011; Uldrichet al.,2005). Sin embargo, se sabe poco sobre la expresión de receptores coestimuladores en NKT humanas. En esta divulgación, los inventores se centraron en un conjunto de receptores coestimuladores que tienen propiedades prosupervivencia pronunciadas en linfocitos T humanos: CD28, 4-1Bb y OX40 (Acutoet al.,2003; Kroczeket al.,2004; Redmondet al.,2009). En primer lugar, se confirmó que las NKT humanas recién aisladas expresan CD28 (34) y se demostró que coexpresan CD27, asemejándose así a la etapa correspondiente de diferenciación de linfocitos T de memoria con potencial funcional conservado (Okadaet al.,2008). La divulgación es la primera en caracterizar la cinética basal y posterior a la estimulación de 4-1BB y OX40 en NKT humanas. Ambos receptores son indetectables en NKT recién aisladas, pero se inducen tras la estimulación del TCR. De manera similar a los linfocitos T (Croft, 2010), las NKT humanas aumentan OX40 en el subconjunto CD4+. La mayoría de las NKT también aumentaron 4-1BB, que aumenta de forma preferencial en el subconjunto CD8+ de linfocitos T (Lynch, 2008). Es importante destacar que, la coestimulación de receptores coestimuladores individuales podría inhibir la pérdida de la expresión de CD62L y rescatar a las NKT del agotamiento. Hubo un efecto aditivo en el mantenimiento de las NKT CD62L+ cuando se activaron de manera simultánea CD28 y 4-1BB.

Ejemplo 3

EJEMPLOS DE MÉTODOS Y MATERIALES

Estirpes celulares y condiciones de cultivo.Las células Daudi, Raji, DAOY, Ramos y 293T se adquirieron de ATCC. Las células Daudi, Raji y Ramos se cultivaron en RPMI, mientras que las células DAOY y 293T se mantuvieron en IMDM (Invitrogen). Ambos tipos de medio se complementaron con FBS al 10 % (Hyclone), GlutaMAX-1 2 mM (Gibco-BRL).

Aislamiento, transducción, expansión y clasificación de células NKT.Para analizar las células NKT de la sangre del cordón umbilical, se utilizaron unidades de sangre del cordón umbilical descartadas obtenidas del Banco de Sangre del Cordón Umbilical del MD Anderson Cancer Center, de acuerdo con los protocolos aprobados por las Juntas de Revisión Institucional del MD Anderson Cancer Center y el Baylor College of Medicine. Las PBMC de donantes sanos (de al menos 18 años de edad) se aislaron mediante centrifugación en gradiente a partir de capas leucocíticas adquiridas en el Gulf Coast Regional Blood Center. Las NKT se purificaron mediante microperlas anti-iNKT (Miltenyi Biotec). La fracción PBMC negativa se irradió (40 Gy) y se dividió en alícuotas. Las NKT se estimularon con una alícuota de PBMC autólogas pulsadas con aGalCer 100 ng/ml (Kyowa Hakko Kirin). Se añadió IL-2 recombinante (200 U/ml, National Cancer Institute Frederick) en días alternos en RPMI completo (HyClone RPMI 1640, suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % y Glutamax 2 mM). Las NKT se expandieron durante 10 días y, a continuación, se volvieron a estimular con PBMC autólogas (irradiadas con 40 Gy) o células Ramos como aAPC (irradiadas con 100 Gy) cuando estuvo indicado. El día 3 después de la reestimulación, se recubrieron placas de cultivo no tisular de 24 pocillos con retronectina (Takara Bio) y después del lavado se inocularon con 1 ml de sobrenadante retrovírico que contenía CAR.CD19 y se centrifugaron durante 60 minutos a 4600g. A continuación, se eliminó el sobrenadante vírico y se añadieron NKT estimuladas a los pocillos en medio completo y rhIL-2 200 U/ml. Las células se retiraron de la placa después de 48 h, se lavaron, se resuspendieron a la concentración de 106 célula/ml en RPMI completo con IL-2 200 U/ml y se colocaron en placas para expansión continua. El número de células NKT se determinó mediante recuento con azul tripano (Life Technologies). Cuando se indicó, las NKT o NKT CAR se marcaron con AcM CD62L-PE (GREG-56, BD Biosciences) y microperlas anti-PE (Miltenyi) seguido de clasificación magnética en subconjuntos CD62L+ y CD62L- de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fenotipo de las células clasificadas se determinó mediante FACS.

Construcciones retrovíricas y producción de retrovirus.Las construcciones CAR.CD19 y CAR.GD2 se realizaron como se describió previamente (Heczeyet al.,2014; Puleet al.,2005) y contenían un scFv del anticuerpo específico de CD19 FMC-63 o el anticuerpo específico de GD2 14G2a conectados a través de un espaciador corto procedente de la región bisagra de IgG1 al dominio transmembrana procedente de CD8a, seguido de secuencias de endodominio de señalización de 4-1BB fusionadas con la cadena Z. Los sobrenadantes retrovíricos se produjeron mediante la transfección de células 293T con una combinación de plásmidos quiméricos que contenían antígenos, el plásmido RDF que codifica la envoltura RD114 y el plásmido PegPam3 que codifica la gag-pol de MoMLV como se describió previamente (Veraet al.,2006).

Ensayos de proliferación y apoptosis.Las NKT se marcaron con CFSE (Invitrogen) y se estimularon con PBMC pulsadas con aGalC, o placas recubiertas con 20 ng/ml de anti-CD3 (OKT3) solo o junto con 0,5 pg/ml de anti-CD28 (CD28.2) y/o 1,5 pg/ml de anti-4-1BB (h41BB-M127) (BD Biosciences). La proliferación celular se examinó los días 3 y 6 mediante la medición de la dilución de CFSE mediante citometría de flujo. Además, las etapas tempranas y tardías de la apoptosis se midieron el día 3 mediante tinción con anexina-V y 7-AAd (BD Biosciences) seguido de citometría de flujo.

Ensayo de cuantificación de citocinas múltiple.Las NKT se estimularon durante 24 horas con APC o placas recubiertas con anticuerpos agonistas (clon 6B11, BD Biosciences). Los sobrenadantes se recogieron y analizaron con el kit de inmunoensayo de citocinas/quimiocinas humanas (Millipore) utilizando el ensayo Luminex® de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Citometría de flujo.Se realizó inmunofenotipificación utilizando los siguientes AcM para: HLA-C EMR8-5, CDld CD1d42, CD862331,4-1BBL C65-485, OX40L ik-1, CD3 OKT, Va24-Ja186B11, CD4 SK3, CD62L DREG-56, CD134 ACT35, CD137 4B4-1, PD-1 EH12.1, GATA3 L50-823 (BD Biosciences), LAG-3 policlonal, TIM-3 344823 (sistema R&D) y AcM de conejo anti-LEF1 EP2030Y (ABCAM). Se utilizaron fluorocromos y anticuerpos de isotipo coincidentes sugeridos por BD o R&D como controles negativos. La expresión de CAR.CD19 en NKT se determinó utilizando el AcM específico anti-Id (clon 136.20.1) CD19-CAR (Torikaiet al.,2013) y AcM de cabra anti-IgG de ratón (BD Biosciences). El análisis se realizó en un citómetro de flujo de cinco láseres LSR-II (BD Biosciences) utilizando el programa informático BD FACSDiva v.6.0 y FlowJo 7.2.5 (Tree Star).

Ensayo de citotoxicidad in vitro.La citotoxicidad de las NKT parentales y CAR.CD19 contra células DAOY o Raji se evaluó utilizando el ensayo de luciferasa de 4 horas como se describió previamente (Liuet al.,2013).

Análisis de la expresión génica.El ARN total se recogió utilizando el reactivo TRIzol (Qiagen). El análisis de la expresión génica se realizó utilizando Immunology Panel v.2 (NanoString) en BCM Genomic and RNA Profiling Core utilizando el sistema de análisis nCounter. Los datos se analizaron con el programa informático nSolver 2.0 (NanoString).

Experimentos in vivo.La colonia de ratones NSG se obtuvo originalmente del Laboratorio Jackson y se mantuvo en las instalaciones de BCM Animal Care. El crecimiento del tumor se inició mediante una inyección i.v. de 2 * 105 células de linfoma de Raji transducidas con luciferasa. En el día 3, los ratones se trataron con 4 a 8 * 106 NKT CAR seguido de inyección i.p. de IL-2 (1000 U/ratón) cada 3 días. El crecimiento del tumor se evaluó dos veces por semana mediante imágenes bioluminiscentes (instalaciones del Small Animal Imaging Core, Texas Children's Hospital). Para los experimentos de persistenciain vivo,las NKT se cotransdujeron con CAR.CD19 y luciferasa utilizando construcciones retrovíricas, se inyectaron i.v. a ratones libres de tumores o con tumores, y se controlaron mediante imágenes bioluminiscentes dos veces por semana. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el IACUC.

Estadísticas.Para los experimentosin vitroein vivo,los inventores utilizaron la prueba de latde Student para datos emparejados bilateral para evaluar la variable continua de 2 grupos y ANOVA unifactorial con prueba de Bonferroni posterior para evaluar variables continuas de más de 2 grupos. La supervivencia se analizó mediante el método de Kaplan-Meier y la prueba del orden logarítmico (Mantel-Cox) para comparar pares de grupos. Las estadísticas se calcularon utilizando GraphPad™ Prisma 5.0 (programa GraphPad). Las diferencias se consideraron significativas cuando el valor depfue menor a 0,05.

Aprobación del estudio.Las unidades de sangre del cordón umbilical se obtuvieron del Banco de Sangre del Cordón Umbilical del MD Anderson Cancer Center de acuerdo con los protocolos aprobados por las Juntas de Revisión Institucional del MD Anderson Cancer Center (H-16320) y el Baylor College of Medicine (H-20911). Se recibió el consentimiento informado por escrito de todas las mujeres participantes antes de su inclusión en el estudio según el protocolo H-16320. Las unidades de sangre del cordón umbilical que no eran aptas para uso clínico (generalmente debido a recuentos bajos de células) fueron descartadas o utilizadas para fines de investigación según el protocolo H-20911 en el Baylor College of Medicine. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el protocolo AN-5194 aprobado por el Institutional Animal Care and Use Committees del Baylor College of Medicine.

Ejemplo 4

EFECTO DE IL-21 EN LAS CÉLULAS NKT

Este ejemplo demuestra que IL-21 tiene un efecto beneficioso en las células NKT tras la exposición de las células a IL-21. En la figura 10 se muestra que IL-21 aumenta la frecuencia de las células NKT CD62L+ durante la expansión primaria. Las NKT se aislaron de tres donantes y se estimularon con PBMC cargadas con aGalCer e IL-2 (100 U/ml) o IL-2 con IL-21 (10 ng/ml) durante 12 días. Se recogieron las NKT y se tiñeron para CD62L seguido de un análisis FACS. En la figura 11 se demuestra que IL-21 aumenta la frecuencia de las células NKT CD62L+ durante la expansión secundaria. Después de la expansión primaria (Figura 10), las NKT de tres donantes se reestimularon con PBMC cargadas con aGalCer e IL-2 (100 U/ml) o IL-2 con IL-21 (10 ng/ml) durante 12 días. Se recogieron las NKT y se tiñeron para CD62L seguido de un análisis FACS. En la figura 12 se muestra la expresión de CD1d y moléculas coestimuladoras en células de Ramos. La estirpe celular de linfoma de linfocitos B de Ramos se obtuvo de ATCC y se analizó mediante FACS para la expresión de CD1d, CD86, 4-1BBL y OX40L utilizando AcM correspondientes o control de IgG. Las células Ramos pueden expandir NKT primarios con niveles elevados de expresión de CD62L (Figura 13). Las NKT se aislaron de tres donantes y se estimularon con células Ramos cargadas con aGalCer (2 * 106/pocillo) en un medio que contenía IL-2 durante 10 días. Las NKT se recogieron, contaron y tiñeron para CD3, 6B11 y CD62L. Por último, en la figura 14 se muestra que las células Ramos expanden las NKT tras la estimulación secundaria con una retención significativa de la expresión de CD62L. Tras la expansión primaria con PBMC (como en la figura 10), las NKT (1 * 10-/pocillo) se volvieron a estimular con células Ramos cargadas con aGalCer (2 * 106/pocillo) en un medio que contenía IL-2 durante 10 días. Las NKT se recogieron, contaron y tiñeron para CD3, 6B11 y CD62L.

Bibliografía

Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de los expertos en la materia a la que pertenece la invención.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una población de linfocitos T citolíticos naturales (NKT) de tipo I obtenidos mediante el enriquecimiento de células NKT con células NKT positivas para CD62L para su uso en inmunoterapia administrada a un paciente que lo necesita, en donde las células NKT se enriquecen mediante la exposición de las células NKT a IL-21.

2. Una población de células NKT de tipo I para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las células NKT positivas para CD62L se obtienen a partir de una etapa de clasificación previa.

3. Una población de células NKT de tipo I para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde las células NKT se clasifican mediante la exposición de las células a uno o más sustratos que se unen específicamente a las células NKT positivas para CD62L, por ejemplo, en donde el sustrato comprende un anticuerpo específico para CD62L-positivo.

4. Una población de células NKT de tipo I para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las células se clasifican mediante separación magnética.

5. Una población de células NKT de tipo I para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dichas células NKT positivas para CD62L se activan mediante la estimulación del receptor de linfocitos T y la coestimulación por un receptor coestimulador y/o citocina.

6. Una población de células NKT de tipo I para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el uno o más agentes estimuladores y los agentes coestimuladores se seleccionan del grupo que consiste en:

una citocina;

un sustrato que comprende un anticuerpo o ligando agonista para el receptor de linfocitos T y uno o más anticuerpos agonistas que se dirigen a receptores coestimuladores;

una célula presentadora de antígeno que comprende la expresión de CD1d y que comprende la expresión de uno o más ligandos de uno o más receptores coestimuladores; y una combinación de lo anterior.

7. Una población de células NKT de tipo I para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde las células están modificadas genéticamente para expresar uno o más de los siguientes: un receptor quimérico para el antígeno, un receptor de linfocitos T, una citocina, un receptor de citocinas, un receptor quimérico de citocinas o una combinación de los mismos, en particular un receptor quimérico para el antígeno o un receptor de linfocitos T.

8. Una población de células NKT de tipo I para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde las células NKT expresan un receptor quimérico de linfocitos T.

9. Una población de células NKT de tipo I para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el receptor quimérico de linfocitos T comprende un endodominio de moléculas coestimuladoras seleccionadas de CD27, c D28, 4-1BB y OX40.

10. Una población de células NKT de tipo I para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha inmunoterapia es para el tratamiento de un cáncer.

11. Una población de células NKT de tipo I para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de cuello uterino, cáncer de riñón, cáncer gástrico, cáncer del intestino delgado, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de vesícula biliar, cánceres del conducto biliar, cáncer de esófago, cáncer de las glándulas salivales y cáncer de la glándula tiroides, neuroblastoma, meduloblastoma, glioblastoma y neoplasias hematopoyéticas.

12. Un métodoin vitrode preparación de linfocitos T citolíticos naturales (NKT) de tipo I, que comprende las etapas de enriquecer una población de células NKT para células NKT positivas para CD62l mediante la exposición de la población de células NKT a IL-21 y, opcionalmente, exponer las células NKT a una mezcla de uno o más agentes estimuladores y/o coestimuladores seleccionados del grupo que consiste en:

a) una citocina;

b) un sustrato que comprende un anticuerpo o ligando agonista para el receptor de linfocitos T y uno o más anticuerpos agonistas que se dirigen a receptores coestimuladores;

c) una célula presentadora de antígeno que comprende la expresión de CD1d y que comprende la expresión de uno o más ligandos de uno o más receptores coestimuladores; y

d) una combinación de los anteriores.

13. El método de la reivindicación 12, en donde la población de células NKT está preclasificada para la expresión positiva de CD62L.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, que comprende además la etapa de modificar genéticamente las células NKT para expresar uno o más de los siguientes: un receptor quimérico para el antígeno, un receptor de linfocitos T, una citocina, un receptor de citocinas, un receptor quimérico de citocinas o una combinación de los mismos, en particular un receptor quimérico para el antígeno o un receptor de linfocitos T.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde las células NKT se modifican genéticamente en los 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más días después de la exposición de la población a uno o más agentes coestimuladores.