ES2987238T3

ES2987238T3 - Proteínas F del RSV modificadas y métodos de su uso

Info

Publication number: ES2987238T3
Application number: ES20171841T
Authority: ES
Inventors: Peter Pushko; Yingyun Wu; Michael Massare; Ye Liu; Gale Smith; Bin Zhou
Original assignee: Novavax Inc
Current assignee: Novavax Inc
Priority date: 2008-12-09
Filing date: 2009-12-09
Publication date: 2024-11-14
Anticipated expiration: 2029-12-09
Also published as: JP2012511579A; EP2370099A1; JP6782289B2; SI3067064T1; JP6462048B2; HUE029037T2; CN106146671A; HK1161690A1; MX358836B; EP3067064B1; US9731000B2; SG172022A1; CN102307591B; JP2015171378A; RU2011128371A; DK2370099T3; SG10201500161XA; PL2370099T3; US12357684B2; PL3067064T3

Abstract

La presente invención se relaciona en general con proteínas de fusión del virus respiratorio sincitial (F) modificadas o mutadas y métodos para elaborarlas y usarlas, incluyendo composiciones inmunogénicas tales como vacunas para el tratamiento y/o prevención de la infección por VRS. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas F del RSV modificadas y métodos de su uso

Campo técnico

La presente invención está relacionada con métodos para elaborar proteínas de fusión (F) del virus respiratorio sincitial modificadas o mutadas.

Antecedentes de la invención

El virus sincitial respiratorio (RSV,Respiratory Syncytial Virus)es un miembro del géneroPneumovirusde la<familia Paramyxoviridae. El RSV humano>(H<r>S<v>)<es la causa principal de enfermedad grave del tracto>respiratorio inferior en niños pequeños y es responsable de una morbilidad y mortalidad considerables en seres humanos. El RSV también está reconocido como un agente importante de enfermedad en adultos inmunocomprometidos y en ancianos. Debido a la resistencia incompleta a RSV en el hospedador infectado después de una infección natural, el RSV puede infectar múltiples veces durante la niñez y la vidaadulta.

Este virus tiene un genoma compuesto por un ARN con una única hebra de sentido negativo, que está estrechamente asociado con la proteína vírica para formar la nucleocápsida. La envuelta vírica está compuesta por una membrana plasmática derivada de la bicapa lipídica que contiene proteínas estructurales codificadas por el virus. Se empaqueta una polimerasa vírica con el virión y transcribe el ARN genómico en ARNm. El genoma del RSV codifica tres proteínas estructurales transmembrana, F, G, y SH, dos proteínas de matriz, M y M2, tres proteínas de nucleocápsida N, P, y L, y dos proteínas no estructurales, NS1 y NS2.

Se cree que la fusión del HRSV y de las membranas celulares sucede en la superficie celular y es una etapa necesaria para la transferencia de ribonucleoproteína vírica al citoplasma celular durante las fases prematuras de la infección. Este proceso está mediado por la proteína de fusión (F), que también promueve la fusión de la membrana de células infectadas con la de células adyacentes para formar un sincitio característico, que es tanto un efecto citopático prominente como un mecanismo adicional de propagación vírica. Por consiguiente, la neutralización de la actividad de fusión es importante en la inmunidad del hospedador. De hecho, anticuerpos monoclonales desarrollados contra la proteína F han demostrado neutralizar la infectividad del virus e inhibir la fusión de la membrana (Calder et al., 2000, Virology 271:122-131).

La proteína F del RSV comparte características estructurales e identidad limitada, aunque significativa, de secuencia de aminoácidos con glucoproteínas F de otros paramixovirus. Se sintetiza como un precursor inactivo de 574 aminoácidos (F0) que se glucosila de forma cotraduccional en asparaginas en el retículo endoplasmático, donde se ensambla en homo-oligómeros. Antes de alcanzar la superficie celular, el precursor F0 se escinde por una proteasa en F2 desde el extremo N-terminal y Fl desde el extremo C-terminal. Las cadenas Fl y F2 permanecen unidas covalentemente por uno o más enlaces disulfuro.

Se ha descubierto que se acumulan proteínas F de longitud completa purificadas por inmunoafinidad en forma de micelas (también caracterizadas como rosetas) similares a las observadas con otras glicoproteínas de membrana víricas de longitud completa (Wrigley et al., 1986, en Electron Microscopy of Proteins, Vol. 5, pág.

103-163, Academic Press, Londres). Bajo microscopia electrónica, las moléculas en las rosetas aparecen como varillas con forma de cono invertido (~70 %) o estructuras con forma de piruleta (~30 %) con sus extremos más anchos proyectándose desde los centros de las rosetas. El estado conformacional de varilla está asociado con una glucoproteína F en el estado inactivado prefusión mientras que el estado conformacional de piruleta está asociado con una glucoproteína F en el estado activo postfusión.

Puede usarse micrografía electrónica para distinguir entre las conformaciones prefusión y postfusión (denominadas de forma alternativa prefusogénica y fusogénica), como se demuestra por Calder et al., 2000, Virology 271:122-131. La conformación prefusión también puede distinguirse de la conformación fusogénica (postfusión) por ensayos de asociación de liposomas. Adicionalmente, las conformaciones prefusión y fusogénicas pueden distinguirse usando anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) que reconocen específicamente epítopos conformacionales presentes en una u otra de las formas prefusión o fusogénica de<la proteína F del r>S<v>,<pero no en la otra forma. Dichos epítopos conformacionales pueden deberse a exposición>preferente de un determinante antigénico sobre la superficie de la molécula. Como alternativa, pueden surgir epítopos conformacionales de la yuxtaposición de aminoácidos que no están contiguos en el polipéptido lineal.

Se ha demostrado previamente que el precursor F se escinde en dos sitios (sitio I, después del resto 109 y sitio II, después del resto 136), ambos precedidos por motivos reconocidos por proteasas tipo furina. El sitio II está adyacente a un péptido de fusión, y la escisión de la proteína F en ambos lados es necesaria para la fusión de la membrana (Gonzalez-Reyes et al., 2001, PNAS 98(17): 9859-9864). Cuando se completa la escisión en ambos lados, se cree que hay una transición de varillas con forma de cono a varillas con forma de piruleta.

El documento WO91/00104 describe métodos para aislar una glicoproteína inmunogénica, en los que la glicoproteína se cultiva en un virus envuelto. Por ejemplo, analiza la purificación de la proteína F de FSV a partir de células MRC-5 humanas utilizando Tritón X-100. El documento WO2005/021713 se refiere a inmunógenos, antígenos o epítopos del SARS y a sus usos inmunogénicos. Describe el aislamiento de proteínas virales recombinantes, en particular la proteína S del virus del SARS, después de la inyección de células de insecto con vectores de baculovirus que codifican la proteína.

Las proteínas F de RSV mutadas se describen en Ruiz-Arguello M B et al., J. Gen. Virol., vol. 85, pp.3677-3687 (2004), WO2008/133663, Anderson K et al., J. Gen. Virol., vol. 73, pp 1177-1188 (1992) y WO2008/114149.

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualquier otro caso, aspecto, configuración o instancia que se exponga en el presente documento y que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones se ofrece únicamente a título informativo. Cualquier referencia a métodos de tratamiento debe interpretarse como una referencia a la divulgación para su uso en dicho método de tratamiento.

Como se describe en este documento, los presentes inventores han descubierto que pueden conseguirse niveles sorprendentemente altos de expresión de la proteína de fusión (F) cuando se hacen ciertas modificaciones en la estructura de la proteína F del RSV. Dichas modificaciones también reducen inesperadamente la toxicidad celular de la proteína F del RSV en una célula hospedadora. Además, las proteínas F modificadas hechas de acuerdo con la invención muestran una capacidad mejorada de mostrar la morfología de "piruleta" postfusión en oposición a la morfología de "varilla" prefusión. Por tanto, las proteínas F modificadas hechas de acuerdo con la invención también pueden mostrar inmunogenicidad mejorada en comparación con proteínas F de tipo silvestre. Estas modificaciones tienen aplicaciones significativas al desarrollo de vacunas y métodos de uso de dichas vacunas para el tratamiento o prevención del RSV. Como se cita por las reivindicaciones, la presente invención proporciona un método para producir proteínas F recombinantes del RSV que muestran expresión aumentada, toxicidad celular reducida, y/o propiedades inmunogénicas potenciadas en comparación con proteínas F de tipo silvestre del RSV.

En un aspecto, la invención proporciona un método para producir proteínas F recombinantes del RSV que comprenden secuencias modificadas o mutadas de aminoácidos en comparación con proteínas F de tipo silvestre del RSV como se cita por las reivindicaciones. En general, estas modificaciones o mutaciones aumentan la expresión, reducen la toxicidad celular, y/o potencian las propiedades inmunogénicas de las proteínas F del RSV en comparación con proteínas F de tipo silvestre del RSV. En ciertas realizaciones de ejemplo, las proteínas F del RSV son proteínas F del RSV humano.

La proteína F de RSV elaborada de acuerdo con el método reivindicado comprende SEQ ID NO: 8. Por lo tanto, comprende una secuencia de aminoácidos modificada o mutada en comparación con la proteína F de RSV de tipo salvaje (por ejemplo, como se ejemplifica en SEQ ID NO: 2). En casos relacionados proporcionados para fines ilustrativos, se describe una proteína F de RSV que contiene una modificación o mutación en el aminoácido correspondiente a la posición P102, 1379 o M447 de la proteína F de RSV de tipo salvaje (SEQ ID NO: 2), que contiene opcionalmente dos o más de dichas modificaciones o mutaciones, o que contiene tres de dichas modificaciones o mutaciones.

En casos relacionados proporcionados para fines ilustrativos, se describe una proteína F de RSV en la que la prolina en la posición 102 se reemplaza con alanina, o la isoleucina en la posición 379 se reemplaza con valina, o la metionina en la posición 447 se reemplaza con valina. La proteína F del RSV puede contener dos o más de estas modificaciones o mutaciones, o tres de estas modificaciones o mutaciones. En un ejemplo proporcionado únicamente con fines ilustrativos, la proteína del RSV tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 4.

De acuerdo con el método reivindicado, la secuencia codificante de la proteína F del RSV se optimiza para mejorar su expresión en una célula huésped adecuada. La célula huésped es una célula de insecto. En una realización ejemplar, la célula de insecto es una célula Sf9.

En un ejemplo proporcionado con fines ilustrativos, la secuencia codificante del gen F del RSV optimizado por codones es la SEQ ID NO: 3. En otro ejemplo proporcionado con fines ilustrativos, la proteína F del RSV optimizada por codones tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 4.

La proteína F de RSV elaborada de acuerdo con el método reivindicado comprende SEQ ID NO: 8. En ejemplos relacionados proporcionados con fines ilustrativos, se describe una proteína F de RSV que comprende además al menos una modificación en el sitio poli(A) críptico de F2; una proteína F de RSV que comprende además una o más mutaciones de aminoácidos en el sitio de escisión primaria (CS); y una proteína F de RSV que contiene una modificación o mutación en el aminoácido correspondiente a la posición R133, R135 o R136 de la proteína F de RSV de tipo salvaje (SEQ ID NO: 2) o la proteína F de RSV optimizada por codones (SEQ ID NO: 4).

En una instancia proporcionada con fines ilustrativos, la descripción proporciona proteínas F de RSV en las que la arginina en la posición 133 se reemplaza con glutamina, la arginina en la posición 135 se reemplaza con glutamina o la arginina en la posición 136 se reemplaza con glutamina. Opcionalmente, la proteína F de RSV puede contener dos o más, o tres, de dichas modificaciones o mutaciones. En una instancia de ejemplo proporcionada con fines ilustrativos que no se reivindica, la proteína RSV tiene la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 6.

La proteína F de RSV comprende además una deleción en la mitad N-terminal del dominio de fusión correspondiente a los aminoácidos 137-146 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6. De acuerdo con el método reivindicado de la invención, la proteína F de RSV tiene la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 8. En una instancia alternativa proporcionada únicamente con fines ilustrativos, la proteína F de RSV tiene la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 10.

En una instancia relacionada proporcionado con fines ilustrativos, se describen en el presente documento proteínas F de RSV, distintas de la proteína F de RSV humana (SEQ ID NO: 2), que contienen alteraciones correspondientes a las establecidas anteriormente. Estas proteínas F del RSV pueden incluir, entre otras, las proteínas F del RSV de cepas A del RSV humano, cepas B del RSV humano, cepas del RSV bovino y cepas del RSV aviar.

La invención está dirigida a la fabricación de proteínas F de RSV modificadas o mutadas que demuestran una mayor expresión en una célula huésped en comparación con las proteínas F de RSV de tipo salvaje, como la que se muestra en SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones, la invención está dirigida a la fabricación de proteínas F de RSV modificadas o mutadas que demuestran una toxicidad celular reducida en una célula huésped en comparación con las proteínas F de RSV de tipo salvaje, como la que se muestra en SEQ ID NO: 2. En otras realizaciones más, la invención está dirigida a la fabricación de proteínas F de RSV modificadas o mutadas que demuestran propiedades inmunogénicas mejoradas en comparación con las proteínas F de RSV de tipo salvaje, como la que se muestra en SEQ ID NO: 2.

En aspectos adicionales proporcionados con fines ilustrativos que no se reivindican, se proporcionan en el presente documento composiciones inmunogénicas que comprenden una o más proteínas F de RSV modificadas o mutadas como se describe en el presente documento. En un aspecto (no reivindicado), se proporciona una micela que comprende una o más proteínas F de RSV modificadas o mutadas (por ejemplo, una micela F de RSV).

En una instancia relacionada proporcionada con fines ilustrativos que no se reivindica, se describe una partícula similar a un virus (VLP) que comprende una proteína F de RSV modificada o mutada. En algunos casos, la VLP comprende además una o más proteínas adicionales.

En una instancia relacionada proporcionada con fines ilustrativos, la VLP comprende además una proteína matriz (M). La proteína M puede derivarse de una cepa humana de RSV. Alternativamente, la proteína M se deriva de una cepa bovina de RSV. En otras instancias, la proteína matriz puede ser una proteína M1 de una cepa del virus de la gripe. Por ejemplo, la cepa del virus de la gripe puede ser una cepa del virus de la gripe aviar. En otras instancias, la proteína M puede derivarse de una cepa del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV).

En instancias adicionales proporcionadas con fines ilustrativos que no se reivindican, la VLP comprende además la glicoproteína G del RSV, o la glicoproteína SH del RSV, o la proteína N de la nucleocápside del RSV.

Las proteínas F del RSV modificadas o mutadas pueden usarse para la prevención y/o el tratamiento de la infección por RSV. Por lo tanto, en una instancia relacionada proporcionado con fines ilustrativos que no se reivindica, se proporciona un método para provocar una respuesta inmunitaria contra el RSV. El método implica administrar una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición que contiene una proteína F del RSV modificada o mutada a un sujeto, tal como un sujeto humano o animal.

En otra instancia relacionada proporcionada con fines ilustrativos que no se reivindica, se proporcionan composiciones de vacuna farmacéuticamente aceptables que comprenden una proteína F del RSV modificada o mutada, una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada.

En una instancia relacionado proporcionado con fines ilustrativos, se proporciona una formulación inmunogénica que comprende al menos una dosis eficaz de una proteína F del RSV modificada o mutada. En otra instancia, se proporciona una formulación inmunogénica que comprende al menos una dosis eficaz de una micela F del RSV que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada. En otra instancias, se proporciona una formulación inmunogénica que comprende al menos una dosis eficaz de una VLP que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada.

En una instancia relacionada proporcionada con fines ilustrativos que no se reivindica, se proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos de uno o más de los ingredientes de las formulaciones de vacunas de la divulgación.

En una instancia relacionada proporcionada con fines ilustrativos que no se reivindica, se proporciona un método para formular una vacuna o composición antigénica que induce inmunidad a una infección o al menos un síntoma de enfermedad de la misma a un mamífero, que comprende agregar a la formulación una dosis efectiva de una proteína F de RSV modificada o mutada, una micela de RSV F que comprende una proteína F de RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F de RSV modificada o mutada. En una instancia preferida, la infección es una infección por RSV.

Las proteínas F de RSV modificadas o mutadas elaboradas de acuerdo con la invención son útiles para preparar composiciones que estimulan una respuesta inmunitaria que confiere inmunidad o inmunidad sustancial a agentes infecciosos. Por lo tanto, en una instancia proporcionada con fines ilustrativos que no se reivindica, se proporciona un método para inducir inmunidad a infecciones o al menos un síntoma de enfermedad de las mismas en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F de RSV modificada o mutada, una micela de RSV F que comprende una proteína F de RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F de RSV modificada o mutada.

En otro aspecto proporcionado con fines ilustrativos que no se reivindica, se proporciona un método para inducir inmunidad sustancial a la infección por el virus RSV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F de RSV modificada o mutada, una micela de RSV F que comprende una proteína F de RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F de RSV modificada o mutada.

Las composiciones de la divulgación (no reivindicadas) pueden inducir inmunidad sustancial en un vertebrado (por ejemplo, un ser humano) cuando se administran al vertebrado. Por lo tanto, en una instancia relacionado proporcionado solo con fines ilustrativos, se proporciona un método para inducir inmunidad sustancial a la infección por el virus RSV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F de RSV modificada o mutada, una micela de RSV F que comprende una proteína F de RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F de RSV modificada o mutada. En otro caso, se proporciona un método para vacunar a un mamífero contra el RSV que comprende administrar al mamífero una cantidad inductora de protección de una proteína F de RSV modificada o mutada, una micela de RSV F que comprende una proteína F de RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F de<r>S<v>modificada o mutada. [0033] En otro caso relacionado proporcionado con fines ilustrativos que no se reivindica, se proporciona un método para inducir una respuesta de anticuerpos protectores a una infección o al menos un síntoma de la misma en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F de RSV modificada o mutada, una micela de RSV F que comprende una proteína F de RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F de RSV modificada o mutada.

En otra instancia relacionada se proporcionan con fines ilustrativos que no se reivindica, se proporciona un método para inducir una respuesta de anticuerpos protectores a una infección o al menos un síntoma de la misma en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F de RSV modificada o mutada, una micela F de RSV que comprende una proteína F de RSV modificada o mutada, o una VLP que comprende una proteína F de RSV modificada o mutada.

En otra instancia relacionada proporcionada con fines ilustrativos que no se reivindica, se proporciona un método para inducir una respuesta celular protectora a una infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F de RSV modificada o mutada. En otra instancia, se proporciona un método para inducir una respuesta celular protectora a una infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una micela de RSV F que comprende una proteína F de RSV modificada o mutada. En otra instancia más, se proporciona un método para inducir una respuesta celular protectora a la infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis eficaz de una VLP, en donde la VLP comprende una proteína F de RSV modificada o mutada.

En aún otra instancia relacionada proporcionada con fines ilustrativos, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una proteína F de RSV modificada o mutada. En una instancia ejemplar, el ácido nucleico aislado que codifica una proteína F de RSV modificada o mutada se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9.

En aún otra intancia relacionada proporcionada con fines ilustrativos, se proporciona una célula aislada que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína F de RSV modificada o mutada. En una intancia de ejemplo, el ácido nucleico aislado que codifica una proteína F de RSV modificada o mutada se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9.

En aún otra instancia relacionada proporcionada con fines ilustrativos, se proporciona un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína F de RSV modificada o mutada. En una instancia relacionada, el ácido nucleico aislado que codifica una proteína F de RSV modificada o mutada se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9. En una instancia, el vector es un vector de baculovirus.

De acuerdo con la invención, que se define en las reivindicaciones, se proporciona un método para preparar una proteína F de RSV, que comprende (a) transformar una célula huésped para expresar un ácido nucleico<que codifica una proteína F de r>S<v modificada o mutada; y (b) cultivar dicha célula huésped en condiciones>propicias para la producción de dicha proteína F de RSV. El ácido nucleico que codifica una proteína F de RSV modificada o mutada es SEQ ID NO: 7. La célula huésped es una célula de insecto transfectada con un vector de baculovirus que comprende una proteína F de RSV modificada o mutada que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 8.

En otra instancia relacionada proporcionada con fines ilustrativos, se proporciona un método para preparar una micela de proteína F de RSV, que comprende (a) transformar una célula huésped para expresar un ácido nucleico que codifica una proteína F de RSV modificada o mutada; y (b) cultivar dicha célula huésped en condiciones propicias para la producción de dicha micela de proteína F de RSV. En una instancia, el ácido nucleico que codifica una proteína F del RSV modificada o mutada se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9. En una instancia, la célula huésped es una célula de insecto. En una instancia ejemplar, la célula huésped es una célula de insecto transfectada con un vector de baculovirus que comprende una proteína F del RSV modificada o mutada de la divulgación.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa la estructura de la proteína F0 de tipo silvestre de HRSV.

La Figura 2 representa estructuras de proteínas F0 modificadas del RSV con mutaciones en el sitio de escisión como se describe en el Ejemplo 3.

La Figura 3 representa sustituciones conservativas (R133Q, R135Q y R136Q) en el sitio de escisión principal de la proteína F modificada BV n.° 541 de HRSV (SEQ ID NO: 6).

La Figura 4 representa la secuencia y estructura de la proteína F modificada BV n.° 541 de HRSV (SEQ ID NO: 6).

La Figura 5 representa la secuencia y estructura de la proteína F modificada BV n.° 622 de HRSV (SEQ ID NO: 10).

La Figura 6 representa gel teñido con Coomassie de SDS-PAGE de la proteína F recombinante purificada BV<n.°622 de>H<r>S<v con o sin la presencia de pME.>

La Figura 7 representa la estructura de la proteína F modificada BV n.° 683 de HRSV (SEQ ID NO: 8).

La Figura 8 representa geles teñidos con Coomassie de SDS-PAGE de proteínas F recombinantes purificadas BV n.° 622 y BV n.° 683 de HRSV con o sin la presencia de pME (en la izquierda), y susestructuras.

La Figura 9 representa un gel teñido con Coomassie de SDS-PAGE (en la izquierda) y análisis de transferencia<de Western (en la derecha) de la proteína F recombinante BV n.° 683 de>H<r>S<v con o sin la presencia de pME.>

La Figura 10 representa un gel teñido con Coomassie de SDS-PAGE usado en análisis de pureza por densitometría de exploración (en la izquierda) y transferencia de Western (en la derecha) de la proteína F<recombinante purificada BV n.° 683 de>H<r>SV.

La Figura 11 representa imágenes de micelas (rosetas) de la proteína F recombinante purificada BV n.° 683 de HRSV tomadas en microscopia electrónica con tinción negativa.

La Figura 12 representa el análisis de tamaño de partículas de micelas de proteína F BV n.° 683 de HRSV.

La Figura 13 representa un gel teñido con Coomassie de SDS-PAGE (en la izquierda) y análisis de transferencia<de Western (en la derecha) de proteínas F modificadas BV n.° 622 y>B<v n.° 623>(S<e>Q<ID NO: 21) de HRSV con>o sin co-expresión con las proteínas N de HRSV y M de BRSV en las recolecciones de cultivo celular en bruto (intracelulares) o muestras sedimentadas por separación en gradiente de sacarosa al 30 %, y las estructuras de BV n.° 622 y BV n.° 623.

La Figura 14 representa un gel teñido con Coomassie de SDS-PAGE (en la izquierda) y análisis de transferencia de Western (en la derecha) de la proteína F modificada BV n.° 622 de HRSV, BV n.° 636 quimérica en tándem doble (BV n.° 541 BRSV M), BV n.° 683, BV n.° 684 (BV n.° 541 con el dominio L de YIAL), y BV n.° 685 (BV n.° 541 con el dominio L de YKKL) con o sin co-expresión con las proteínas N de HRSV y M de BRSV en las muestras de recolección de cultivo celular en bruto (intracelulares), y la estructura de cada proteína F modificada de HRSV analizada.

La Figura 15 representa un gel teñido con Coomassie de SDS-PAGE (en la izquierda) y análisis de transferencia<de Western (en la derecha) de la proteína F modificada BV n.° 622 del r>S<v (SEQ ID NO: 10), BV n.° 636>quimérica en tándem doble (BV n.° 541 M de BRSV), BV n.° 683 (SEQ ID NO: 8), BV n.° 684 (BV n.° 541 con el dominio L de YIAL), y BV n.° 685 (BV n.° 541 con el dominio L de YKKL) con o sin co-expresión con las proteínas N de HRSV y M de BRSV en las muestras sedimentadas por separación en gradiente de sacarosa al 30 %, y la estructura de cada proteína F modificada de HRSV analizada.

La Figura 16 representa la estructura, nombre del clon, descripción, resultados de transferencia de Western y SDS-PAGE con Coomassie, y la conclusión de cada proteína F modificada del RSV como se describe en el Ejemplo 9.

La Figura 17 representa los procedimientos experimentales del estudio de exposición a RSV como se describe en el Ejemplo 10.

La Figura 18 representa los resultados del ensayo de neutralización del RSV en el día 31 y en el día 46 de ratones inmunizados con PBS, RSV vivo, FI-RSV, 1 ug de PFP, 1 ug de PFP Alumbre, 10 ug de PFP, 10 ug de PFP Alumbre, 30 ug de PFP, y control positivo (anticuerpo de ovejaanti-F).

La Figura 19 representa los títulos del RSV en tejidos pulmonares de ratones inmunizados con PBS, RSV vivo, FI-RSV, 1 ug de PFP, 1 ug de PFP Alumbre, 10 ug de PFP, 10 ug de PFP Alumbre, y 30 ug de PFP, 4 días después de la exposición del RSV infeccioso.

La Figura 20 representa un gel de SDS-PAGE teñido con Coomassie de proteína F recombinante purificada<BV n.° 683 del>R<s>V<almacenada a 2 - 8 °C durante 0, 1, 2, 4, y 5 semanas.>

La Figura 21 representa las respuestas de anticuerpo neutralizante del RSVA y del RSVB después de inmunización con RSV vivo (RSV), RSV inactivado con formalina (FI-RSV), proteína F BV n.° 683 del RSV con o sin aluminio (PFP y PFP adyuvante de aluminio), y controles dePBS.

La Figura 22 representa la patología pulmonar después de exposición con RSV en ratas inmunizadas con RSV vivo, RSV inactivado con formalina (FI-RSV), proteína F BV n.° 683 del RSV con o sin aluminio (micela F (30 ug) y micela F (30ug) adyuvante de aluminio), y controles de PBS.

Descripción detallada

Definiciones

Como se usa en este documento, el término "adyuvante" se refiere a un compuesto que, cuando se usa en combinación con un inmunógeno específico (por ejemplo, una proteína F modificada o mutada del RSV, una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV) en una formulación, aumentará o alterará de otro modo o modificará la respuesta inmunitaria resultante. La modificación de la respuesta inmunitaria incluye, intensificación o ampliación de la especificidad de cualquiera de o ambas de las respuestas inmunitarias de anticuerpo y celulares. La modificación de la respuesta inmunitaria también puede significar disminuir o suprimir ciertas respuestas inmunitarias específicas de antígeno.

Como se usa en este documento, la expresión "formulación antigénica" o "composición antigénica" se refiere a una preparación que, cuando se administra a un vertebrado, especialmente un ave o un mamífero, inducirá una respuesta inmunitaria.

Como se usa en este documento, la expresión "virus de la gripe aviar" se refiere a virus de la gripe encontrados principalmente en aves pero que también pueden infectar a seres humanos u otros animales. En algunos casos, los virus de la gripe aviar pueden transmitirse o propagarse de un ser humano a otro. Un virus de la gripe aviar que infecta a seres humanos tiene el potencial de causar una gripe pandémica, es decir, morbilidad y/o mortalidad en seres humanos. Una pandemia sucede cuando una nueva cepa de virus de la gripe (un virus en que el ser humano no tiene inmunidad natural) surge, propagándose más allá de las localidades individuales, posiblemente alrededor del mundo, e infectando a muchos seres humanos a la vez.

Como se usa en este documento, una "dosis eficaz", en líneas generales, se refiere a esa cantidad de una proteína F modificada o mutada del RSV , una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV , o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV suficiente para inducir inmunidad, para prevenir y/o mejorar una infección o para reducir al menos un síntoma de una infección o enfermedad, y/o para potenciar la eficacia de otra dosis de una proteína F modificada o mutada del RSV , una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV , o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV . Una dosis eficaz puede referirse a la cantidad de una proteína F modificada o mutada del RSV , una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV , o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV suficiente para retardar o minimizar la aparición de una infección o enfermedad. Una dosis eficaz también puede referirse a la cantidad de una proteína F modificada o mutada del RSV, una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo de una infección o enfermedad. Adicionalmente, una dosis eficaz es la cantidad con respecto a una proteína F modificada o mutada del RSV, una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV en solitario, o en combinación con otras terapias, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo de una infección o enfermedad. Una dosis eficaz también puede ser la cantidad suficiente para potenciar la propia respuesta inmunitaria del sujeto (por ejemplo, de un ser humano) contra una posterior exposición a un agente infeccioso o enfermedad. Los niveles de inmunidad pueden controlarse, por ejemplo, midiendo las cantidades de anticuerpos neutralizantes de secreción y/o en suero, por ejemplo, por neutralización de placas, fijación del complemento, en ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, o microneutralización, o midiendo las respuestas celulares, tales como, aunque sin limitación, células T citotóxicas, células presentadoras de antígeno, células T auxiliares, células dendríticas y/u otras respuestas celulares. Las respuestas de células T pueden controlarse, por ejemplo, midiendo, por ejemplo, la cantidad de células CD4+ y CD8+ presentes usando marcadores específicos por citometría de flujo fluorescente o ensayos de células T, tales como, aunque sin limitación, ensayo de proliferación de células T, ensayos citotóxicos de células T, ensayo TETRAMER, y/o ensayo ELISPOT. En el caso de una vacuna, una "dosis eficaz" es una que previene la enfermedad y/o reduce la gravedad de los síntomas.

Como se usa en este documento, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de una proteína F modificada o mutada del RSV, una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV necesaria o suficiente para lograr un efecto biológico deseado. Una cantidad eficaz de la composición sería la cantidad que consigue un resultado seleccionado, y dicha cantidad podría determinarse como una cuestión de experimentación rutinaria por un experto en la materia. Por ejemplo, una cantidad eficaz para prevenir, tratar y/o mejorar una infección podría ser esa cantidad necesaria para causar la activación del sistema inmunitario, provocando el desarrollo de una respuesta inmunitaria específica de antígeno tras la exposición a una proteína F modificada o mutada del RSV, una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV. La expresión también es sinónima de "cantidad suficiente".

Como se usa en este documento, el término "expresión" se refiere al proceso por el cual los poli(ácidos nucleicos) se transcriben en ARNm y se traducen en péptidos, polipéptidos, o proteínas. Si el poli(ácido nucleico) se obtiene de ADN genómico, la expresión puede incluir, si se selecciona una célula u organismo hospedador eucariota apropiado, corte y empalme del ARNm. En el contexto en el presente documento, el término también abarca la producción de ARNm del gen de F RSV y proteínas F del RSV obtenidas después de la expresión del mismo.

Como se usa en este documento, la expresión "proteína F" o "proteína de fusión" o "polipéptido de la proteína F" o "polipéptido de la proteína de fusión" se refiere a un polipéptido o proteína que tiene todo o parte de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la proteína de fusión del RSV . Asimismo, la expresión "proteína G" o "polipéptido de la proteína G" se refiere a un polipéptido o proteína que tiene todo o parte de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la proteína de unión del RSV. Se han descrito numerosas proteínas de fusión y unión del RSV y son conocidas para los expertos en la materia. El documento WO/2008/114149, establece variantes de ejemplo de la proteína F y G (por ejemplo, variantes de origennatural).

Como se usa en este documento, los términos "inmunógenos" o "antígenos" se refieren a sustancias tales como proteínas, péptidos, ácidos nucleicos que son capaces de provocar una respuesta inmunitaria. Ambos términos también abarcan epítopos, y se usan de forma intercambiable.

Como se usa en este documento, el término "inmunoestimulador" se refiere a un compuesto que potencia una respuesta inmunitaria mediante los propios mensajeros químicos del organismo (citoquinas). Estas moléculas comprenden diversas citoquinas, linfoquinas y quimioquinas con actividades inmunoestimuladoras, inmunopotenciadoras, y proinflamatorias, tales como interferones (IFN-y), interleuquinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL -3, IL-4, IL-12, IL-13); factores del crecimiento (por ejemplo, factor estimulador de colonias (CSF) de granulocitos- macrófagos (GM)); y otras moléculas inmunoestimuladoras, tales como factor inflamatorio de macrófagos, ligando Flt3, B7.1; B7.2, etc. Las moléculas inmunoestimuladoras pueden administrarse en la misma formulación que las VLP aquí, o pueden administrarse por separado. La proteína o un vector de expresión que codifica la proteína pueden administrarse para producir un efecto inmunoestimulador.

Como se usa en este documento, la expresión "formulación inmunogénica" se refiere a una preparación que, cuando se administra a un vertebrado, por ejemplo, un mamífero, inducirá una respuesta inmunitaria.

Como se usa en este documento, la expresión "agente infeccioso" se refiere a microorganismos que causan una infección en un vertebrado. Habitualmente, los organismos son virus, bacterias, parásitos, protozoos y/u hongos.

Como se usa en este documento, los términos "mutado", "modificado", "mutación", o "modificación" indican cualquier modificación de un ácido nucleico y/o polipéptido que produzca un ácido nucleico o polipéptido alterado. Las mutaciones incluyen, por ejemplo, mutaciones puntuales, deleciones o inserciones de un único resto o múltiples restos en un polinucleótido, que incluye alteraciones que surgen dentro de una región codificante de la proteína de un gen, así como alteraciones en regiones fuera de una secuencia codificante de la proteína, tales como, aunque sin limitación, secuencias reguladoras o promotoras. Una alteración genética puede ser una mutación de cualquier tipo. Por ejemplo, la mutación puede constituir una mutación puntual, una mutación de desplazamiento de fase, una inserción, o una deleción de parte o todo un gen. En algunos casos, las mutaciones son de origen natural. En otros casos, las mutaciones son los resultados de presión artificial de mutación. En otros casos más, las mutaciones en las proteínas F del RSV son el resultado de ingeniería genética.

Como se usa en este documento, el término "multivalente" se refiere a composiciones que tienen una o más proteínas/péptidos antigénicos o inmunógenos contra múltiples tipos o cepas de agentes infecciosos o enfermedades.

Como se usa en este documento, la expresión "vacuna farmacéuticamente aceptable" se refiere a una formulación que contiene una proteína F modificada o mutada del RSV , una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV , o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, que está en una forma que se puede administrar a un vertebrado y que induce una respuesta inmunitaria protectora suficiente para inducir inmunidad para prevenir y/o mejorar una infección o enfermedad, y/o para reducir al menos un síntoma de una infección o enfermedad, y/o para potenciar la eficacia de otra dosis de una proteína F modificada o mutada del RSV , una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV , o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV . Normalmente, la vacuna comprende un medio convencional de solución salina o de solución acuosa tamponada en que la composición se suspende o disuelve. En esta forma, la composición puede usarse de forma conveniente para prevenir, mejorar, o tratar de otro modo una infección. Tras la introducción en un hospedador, la vacuna es capaz de provocar una respuesta inmunitaria que incluye, aunque sin limitación, la producción de anticuerpos y/o citoquinas y/o la activación de células T citotóxicas, células presentadoras de antígeno, células T auxiliares, células dendríticas y/u otras respuestascelulares.

Como se usa en este documento, la expresión "respuesta inmunitaria protectora" o "respuesta protectora" se refiere a una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos contra un agente infeccioso o enfermedad, que se muestra por un vertebrado (por ejemplo, un ser humano) que previene o mejora una infección o reduce al menos un síntoma de enfermedad de la misma. Las proteínas F modificadas o mutadas del RSV, micelas F del RSV que comprenden una proteína F modificada o mutada del RSV, o VLP que comprenden una proteína F modificada o mutada del RSV pueden estimular la producción de anticuerpos que, por ejemplo, neutralicen agentes infecciosos, bloquean la entrada de agentes infecciosos en las células, bloquean la replicación de los agentes infecciosos, y/o protegen las células hospedadoras de infección y destrucción. La expresión también puede referirse a una respuesta inmunitaria que está mediada por linfocitos T y/u otros glóbulos blancos contra un agente infeccioso o enfermedad, mostrada por un vertebrado (por ejemplo, un ser humano), que previene o mejora la infección o enfermedad, o reduce al menos un síntoma de la misma.

Como se usa en este documento, el término "vertebrado" o "sujeto" o "paciente" se refiere a cualquier miembro del subfiloCordata,incluyendo, sin limitación, seres humanos y otros primates, incluyendo primates no humanos tales como chimpancés y otros simios y especies de monos. Los animales de granja tales como ganado bovino, ovejas, cerdos, cabras y caballos; los mamíferos domésticos tales como perros y gatos; los animales de laboratorio incluyendo roedores tales como ratones, ratas (incluyendo ratas del algodón) y cobayas; las aves, incluyendo aves domésticas, salvajes y de caza tales como gallinas, pavos y otras aves gallináceas, patos, gansos, y similares también son ejemplos no limitantes. Los términos "mamíferos" y "animales" se incluyen en esta definición. Se pretende que estén cubiertos tantos individuos adultos como recién nacidos. En particular, los bebés y niños pequeños son sujetos o pacientes apropiados para una vacuna contra RSV.

Como se usa en este documento, la expresión "partícula de tipo virus" (VLP,virus-like partióle)se refiere a una estructura que en al menos un atributo se parece a un virus pero que no se ha demostrado que sea infecciosa. Las partículas de tipo virus no transportan información genética que codifique las proteínas de las partículas de tipo virus. En general, las partículas de tipo virus carecen de un genoma vírico y, por lo tanto, son no infecciosas. Además, las partículas de tipo virus a menudo pueden producirse en grandes cantidades por expresión heteróloga y pueden purificarse fácilmente.

Como se usa en este documento, la expresión "VLP quimérica" se refiere a VLP que contienen proteínas, o partes de las mismas, a partir de al menos dos agentes infecciosos diferentes (proteínas heterólogas). Habitualmente, una de las proteínas se obtiene de un virus que puede dirigir la formación de las VLP a partir de células hospedadoras. Ejemplos, con fines ilustrativos, son la proteína M del BRSV y/o las proteínas G o F del HRSV. Las expresiones VLP del RSV y VLP quiméricas pueden usarse de forma intercambiable cuando seaapropiado.

Como se usa en este documento, el término "vacuna" se refiere a una preparación de patógenos destruidos o debilitados, o de determinantes antigénicos derivados, que se usa para inducir la formación de anticuerpos o inmunidad contra el patógeno. Una vacuna se administra para proporcionar inmunidad contra la enfermedad, por ejemplo, gripe, que está causada por virus de la gripe. Además, el término "vacuna" también se refiere a una suspensión o solución de un inmunógeno (por ejemplo, una proteína F modificada o mutada del RSV, una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV) que se administra a un vertebrado para producir inmunidad protectora, es decir, inmunidad que previene o reduce la gravedad de la enfermedad asociada con la infección. La presente divulgación proporciona composiciones de vacuna (no reivindicadas) que son inmunogénicas y pueden proporcionar protección contra una enfermedad asociada con la infección.

Proteínas F del RSV

Se expresan dos proteínas estructurales de membrana, las proteínas F y G, sobre la superficie del RSV, y han demostrado ser dianas de anticuerpos neutralizantes (Sullender, W., 2000, Clinical Microbiology Review 13, 1 15). Estas dos proteínas son también principalmente responsables del reconocimiento vírico y la entrada en células diana; la proteína G se une a un receptor celular específico y la proteína F promueve la fusión del virus con la célula. La proteína F también se expresa sobre la superficie de células infectadas y es responsable de la posterior fusión con otras células que conduce a formación de sincitios. Por tanto, anticuerpos contra la proteína F pueden neutralizar el virus o bloquear la entrada del virus en la célula o prevenir la formación de sincitios. Aunque se han descrito diferencias antigénicas y estructurales entre los subtipos A y B para ambas proteínas G y F, las diferencias antigénicas más significativas residen en la proteína G, donde las secuencias de aminoácidos son solamente un 53 % homólogas y la relación antigénica es del 5 % (Walsh et al. (1987) J. Infect. Dis. 155, 1198-1204; y Johnson et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,5625-5629). A la inversa, anticuerpos creados contra la proteína F muestran un alto grado de reactividad cruzada entre virus del subtipo A y B.

La proteína F del RSV dirige la penetración del RSV por fusión entre la proteína de envuelta del virión y la membrana plasmática de la célula hospedadora. Posteriormente a la infección, la proteína F expresada sobre la superficie celular puede mediar la fusión con células vecinas para formar sincitios. La proteína F es una proteína superficial transmembrana de tipo I que tiene un péptido señal escindido N-terminal y un anclaje de membrana cerca del extremo C-terminal. La proteína F del RSV se sintetiza como un precursor F0 inactivo que se ensambla en un homotrímero y se activa por escisión en el complejo trans-Golgi por una endoproteasa celular para producir dos subunidades unidas por disulfuro, las subunidades F1 y F2. El extremo N-terminal de la subunidad F1 que se crea por escisión contiene un dominio hidrófobo (el péptido de fusión) que se inserta directamente en la membrana diana para iniciar la fusión. La subunidad F1 también contiene repeticiones de siete unidades que se asocian durante la fusión, dirigiendo un desplazamiento conformacional que pone las membranas vírica y celular en cercana proximidad (Collins y Crowe, 2007, Fields Virology, 5a ed., D.M Kipe et al., Lipincott, Williams and Wilkons, pág. 1604). La SEQ ID NO: 2 (N.° de acceso a GenBank AAB59858) representa una proteína F RSV representativa, que está codificada por el gen mostrado en la SEQ ID NO: 1 (N.° de acceso a GenBankM1 1486).

En la naturaleza, la proteína F del RSV se expresa como un único precursor polipeptídico, de 574 aminoácidos de longitud, denominado FO.In vivo,FO se oligomeriza en el retículo endoplasmático y se procesa proteolíticamente por una furina proteasa en dos secuencias consenso de furina conservadas (sitios de escisión de furina), RARR (SEQ ID NO: 23) (secundaria) y KKRKRR (SEQ ID NO: 24) (primaria) para generar un oligómero que consiste en dos fragmentos unidos por disulfuro.

El más pequeño de estos fragmentos se llama F2 y se origina a partir de la parte N-terminal del precursor FO. Se reconocerá por los expertos en la materia que las abreviaturas FO, Fl y F2 se denominan habitualmente Fa, F1 y F2 en la bibliografía científica. El más grande, el fragmento F1 C-terminal ancla la proteína F en la membrana mediante una secuencia de aminoácidos hidrófobos, que están adyacentes a una cola citoplasmática de 24 aminoácidos. Tres dímeros F2-Fl se asocian para formar una proteína F madura, que adopta una conformación prefusogénica ("prefusión") metaestable que se activa para experimentar un cambio conformacional tras contacto con una membrana celular diana. Este cambio conformacional expone una secuencia hidrófoba, conocida como el péptido de fusión, que se asocia con la membrana de la célula hospedadora y promueve la fusión de la membrana del virus, o una célula infectada, con la membrana celular diana.

El fragmento F1 contiene al menos dos dominios de repetición de siete unidades, denominados HRA y HRB, y se sitúa en proximidad al péptido de fusión y los dominios de anclaje transmembrana, respectivamente. En la conformación prefusión, el dímero F2-F1 forma una estructura de cabeza globular y tallo, en que los dominios HRA están en una conformación segmentada (ampliada) en la cabeza globular. En contraste, los dominios HRB forman un tallo súper-enrollado de tres hebras que se extiende desde la región de cabeza. Durante la transición de las conformaciones prefusión a postfusión, los dominios HRA colapsan y se ponen en proximidad a los dominios HRB para formar un haz de seis hélices anti-paralelo. En el estado postfusión, el péptido de fusión y los dominios transmembrana se yuxtaponen para facilitar la fusión de membrana.

Aunque la descripción conformacional proporcionada anteriormente se basa en el modelado molecular de datos cristalográficos, las distinciones estructurales entre las conformaciones prefusión y postfusión pueden controlarse sin recurrir a cristalografía. Por ejemplo, puede usarse micrografía electrónica para distinguir entre las conformaciones prefusión y postfusión (denominadas alternativamente prefusogénica y fusogénica, como se demuestra por Calder et al., Virology, 271:122-131 (2000) y Morton et al., Virology, 311:275-288. La conformación prefusión también puede distinguirse de la conformación fusogénica (postfusión) por ensayos de asociación de liposomas como se describe por Connolly et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:1 7903-17908 (2006). Adicionalmente, las conformaciones prefusión y fusogénica pueden distinguirse usando anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) que reconocen específicamente epítopos conformacionales presentes en una con la otra forma prefusión o fusogénica de la proteína F del RSV, pero no en la otra forma. Dichos epítopos conformacionales pueden deberse a exposición preferente de un determinante antigénico sobre la superficie de la molécula. Como alternativa, pueden surgir epítopos conformacionales de la yuxtaposición de aminoácidos que no están contiguos en el polipéptido lineal.

Proteínas F modificadas o mutadas del RSV

Los presentes inventores han descubierto que, pueden conseguirse niveles sorprendentemente altos de expresión de la proteína de fusión (F) cuando se hacen modificaciones específicas a la estructura de la proteína F del RSV. Dichas modificaciones también reducen inesperadamente la toxicidad celular de la proteína F del RSV en una célula hospedadora. Además, las proteínas F modificadas muestran una capacidad mejorada de mostrar la morfología de "piruleta" postfusión en oposición a la homología de "varilla" prefusión. Por tanto, en un aspecto, las proteínas F modificadas también pueden mostrar inmunogenicidad mejorada (por ejemplo, potenciada) en comparación con proteínas F de tipo silvestre (por ejemplo, ejemplificadas por la SEQ ID NO: 2, que corresponde con el n.° de acceso a GenBank AAB59858). Estas modificaciones tienen aplicaciones significativas para el desarrollo de vacunas y métodos de uso de dichas vacunas para el tratamiento y/o prevención del RSV.

Se puede hacer cualquier número de mutaciones en proteínas F de RSV nativas o de tipo silvestre, y aspecto preferible, se pueden hacer mutaciones múltiples para dar como resultado una expresión mejorada y/o propiedades inmunogénicas en comparación con las proteína F del F del RSV nativas o de tipo silvestre. Tales mutaciones incluyen mutaciones puntuales, mutaciones de desplazamiento de marco, deleciones e inserciones, prefiriéndose una o más (por ejemplo, una, dos, tres o cuatro, etc.) mutaciones.

El polipéptido de proteína F nativo se puede seleccionar de cualquier proteína F de una cepa A del RSV, cepa B del RSV, cepa A del HRSV, cepa B del HRSV, cepa del BRSV o cepa aviar del RSV, o de sus variantes (como se definió anteriormente). Por ejemplo, el polipéptido de proteína F nativo es la proteína F representada por la SEQ ID NO: 2 (N° de acceso a GenBank AAB59858). Para facilitar la comprensión de esta descripción, todas las posiciones de restos de aminoácido, independientemente de la cepa, se dan con respecto a (es decir, la posición del resto de aminoácido corresponde a) la posición de aminoácido de la proteína F de ejemplo. Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente posiciones comparables de aminoácido de la proteína F a partir de otras cepas del RSV alineando las secuencias de aminoácidos de la cepa seleccionada del RSV con la de la secuencia de ejemplo usando algoritmos fácilmente disponibles y bien conocidos de alineación (tales como BLAST, por ejemplo, usando parámetros por defecto). Se describen numerosos ejemplos adicionales de polipéptidos de proteína F a partir de diferentes cepas del RSV en el documentoWO/2008/114149. Pueden surgir variantes adicionales a través de la deriva genética, o pueden producirse de forma artificial usando mutagénesis dirigida al sitio o aleatoria, o por recombinación de dos o más variantespreexistentes.

Pueden introducirse mutaciones en las proteínas F del RSV usando cualquier metodología conocida para los expertos en la materia. Pueden introducirse mutaciones aleatoriamente, por ejemplo, realizando una reacción de PCR en presencia de manganeso como cofactor de ion metálico divalente. Como alternativa, puede usarse mutagénesis dirigida por oligonucleótido para crear las proteínas F mutantes o modificadas del RSV , que permite todas las posibles clases de cambios de pares de bases en cualquier sitio determinado a lo largo de la molécula de ADN codificante. En general, esta técnica implica hibridar un oligonucleótido complementario (excepto por uno o más desapareamientos) con una secuencia monocatenaria de nucleótidos que codifica la proteína F del RSV de interés. El oligonucleótido desapareado después se amplía por ADN polimerasa, generando una molécula de ADN bicatenaria que contiene el cambio deseado en la secuencia en una hebra. Los cambios en secuencia pueden provocar, por ejemplo, la deleción, sustitución, o inserción de un aminoácido. El polinucleótido bicatenario después puede insertarse en un vector de expresión apropiado, y por tanto puede producirse un polipéptido mutante o modificado. La mutagénesis dirigida por oligonucleótido descrita anteriormente puede realizarse, por ejemplo, mediante PCR.

Proteínas adicionales del RSV

La divulgación también describe partículas de tipo virus (VLP) del RSV ( que no son reivindicadas) que comprenden una proteína F modificada o mutada del RSV que puede formularse en vacunas o formulaciones antigénicas para proteger a vertebrados (por ejemplo, seres humanos) contra infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad de la misma. En algunos casos, la VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV comprende adicionalmente proteínas adicionales del RSV, tales como M, N, G, y SH. En otros casos, la VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV de la invención comprende adicionalmente proteínas de cepas heterólogas de virus, tales como las proteínas HA, NA, y M1 del virus de la gripe. En una instancia, la proteína M1 del virus de la gripe se obtiene de una cepa del virus de la gripe aviar.

La proteína N del RSV se une estrechamente tanto a ARN genómico como al ARN antigenómico intermedio replicativo para formar nucleocápsida resistente a RNasa. Las SEQ ID NO: 16 (de tipo silvestre) y 18 (de codones optimizados) representan secuencias de aminoácidos representativas de la proteína N del RSV y las SEQ ID NO: 15 (de tipo silvestre) y 17 (de codones optimizados) representan secuencias de ácidos nucleicos representativas que codifican la proteína N del RSV. Se abarcan en esta divulgación pero no se reivindican proteínas N del RSV que son al menos aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 % o aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, o aproximadamente un 99 %, idénticas a la SEQ ID NO: 18, y todos los fragmentos y variantes (incluyendo proteínas quiméricas) de las mismas.

La proteína M del RSV es una proteína de virión interna no glucosilada que se acumula en la membrana plasmática que interacciona con la proteína F del RSV y otros factores durante la morfogénesis del virus. En ciertos casos preferentes proporcionados sólo con fines ilustrativos, la proteína M del RSV es una proteína M del RSV bovino (BRSV). Las SEQ ID NO: 12 (de tipo silvestre) y 14 (de codones optimizados) representan secuencias de aminoácidos representativas de la proteína M de BRSV y las SEQ ID NO: 11 (de tipo silvestre) y 13 (de codones optimizados) representan secuencias de ácidos nucleicos representativas que codifican la proteína M de BRSV. Se abarcan en esta divulgación pero no se reivindican proteínas M del RSV (incluyendo, aunque sin limitación BRSV) que son al menos aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 % o aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, o aproximadamente un 99 %, idénticas a las SEQ ID NO: 12 y 14, y todos los fragmentos y variantes (incluyendo proteínas quiméricas) de las mismas.

La proteína G del RSV es una glucoproteína transmembrana de tipo H con una única región hidrófoba cerca del extremo N-terminal que sirve tanto como péptido señal no escindido y como anclaje de membrana, que conduce a dos tercios C-terminales de la molécula orientados de forma externa. La proteína G del RSV también se expresa como proteína secretada que surge del inicio de la traducción en el segundo AUG en la ORF (en aproximadamente el aminoácido 48), que recae dentro de la señal/anclaje. La mayor parte del ectodominio de la proteína G del RSV es muy divergente entre cepas l RSV(Id.,pág. 1607). La SEQ ID NO: 26 representa una proteína G del RSV representativa, que está codiciada por la secuencia génica mostrada en la SEQ ID NO: 25. Se abarcan en esta divulgación pero no se reivindican proteínas G del RSV que son al menos aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 % o aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, o aproximadamente un 99 %, idénticas a la SEQ ID NO: 26, y todos los fragmentos y variantes (incluyendo proteínas quiméricas) de las mismas.

La proteína SH del RSV es una proteína transmembrana de tipo II que contiene 64 (subgrupo A del RSV) o 65 restos de aminoácido (subgrupo B del RSV). Algunos estudios han sugerido que la proteína SH del RSV puede tener un papel en la fusión vírica o en el cambio de la permeabilidad de la membrana. Sin embargo, los RSV que carecen del gen SH son viables, causan formación de sincitios y crecen igual de bien que el virus de tipo silvestre, lo que indica que la proteína SH no es necesaria para que el virus entre en las células hospedadoras o para la formación de sincitios. La proteína SH del RSV ha demostrado la capacidad de inhibir la señalización de TNF-a. La SEQ ID NO: 27 representa una secuencia de aminoácidos representativa de la proteína SH del RSV. Se abarcan en esta divulgación pero no se reivindican proteínas SH del RSV que son al menos aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 40 %, aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 % o aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, o aproximadamente un 99 %, idénticas a la SEQ ID NO: 27, y todos los fragmentos y variantes (incluyendo proteínas quiméricas) de las mismas.

Vacunas contra RSV

Actualmente, el único enfoque apropiado para la profilaxis de enfermedad por RSV es inmunización pasiva. Se obtuvieron evidencias iniciales que sugieren un papel protector para IgG a partir de observaciones que implican anticuerpos maternos en hurones (Prince, G.A., Ph.D. diss., University of California, Los Angeles, 1975) y seres humanos (Lambrechtet al.,(1976) J. Infect. Dis. 134,211-217; y Glezenet al.(1981) J. Pediatr.

98,708-715). Hemminget al.(Morellet al.,eds., 1986, Clinical Use of Intravenous Immunoglobulins, Academic Press, London en las páginas 285-294) reconocieron la posible utilidad de anticuerpos contra RSV en el tratamiento o prevención de infección por RSV durante estudios que implicaban la farmacocinética de una inmunoglobulina intravenosa (IVIG) en recién nacidos sospechosos de tener sepsis neonatal. Apreciaron que un bebé, cuyas secreciones respiratorias producían RSV, se recuperaba rápidamente después de infusión con IVIG. El análisis posterior del lote de IVIG reveló un título inusualmente alto de anticuerpo neutralizante del RSV. Este mismo grupo de investigadores después examinó la capacidad de suero hiperinmune o inmunoglobulina, enriquecida para anticuerpo neutralizante del RSV, de proteger ratas del algodón y primates contra infección por RSV (Princeet al.(1985) Virus Res. 3, 193-206; Princeet al.(1990) J. Virol. 64, 3091 3092). Los resultados de estos estudios sugirieron que anticuerpos neutralizantes del RSV dados de forma profiláctica inhibían la replicación en el tracto respiratorio del RSV en ratas del algodón. Cuando se administran terapéuticamente, los anticuerpos contra RSV reducían la replicación vírica pulmonar tanto en ratas del algodón como en un modelo de primate no humano. Además, la infusión pasiva de suero inmune o inmunoglobulina no producía patología pulmonar potenciada en ratas del algodón posteriormente expuestas con RSV.

Como la infección por RSV puede prevenirse proporcionando anticuerpos neutralizantes a un vertebrado, una vacuna que comprenda una proteína F modificada o mutada del RSV puede inducir, cuando se administra a un vertebrado, anticuerpos neutralizantesin vivo.Las proteínas F modificadas o mutadas del RSV se usan favorablemente para la prevención y/o tratamiento de infección por RSV. Por tanto, otro aspecto de esta divulgación, que se proporciona con fines ilustrativos y no se reivindica, se refiere a un método para provocar una respuesta inmunitaria contra el RSV. El método implica administrar una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición que contiene una proteína F modifica o mutada del RSV a un sujeto (tal como un sujeto humano o animal). La administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición provoca una respuesta inmunitaria específica para epítopos presentes en la proteína F modifica o mutada del RSV. Dicha respuesta inmunitaria puede incluir respuestas de células B (por ejemplo, la producción de anticuerpos neutralizantes) y/o respuestas de células T (por ejemplo, la producción de citoquinas). Preferiblemente, la respuesta inmunitaria provocada por la proteína F modificada o mutada del RSV incluye elementos que son específicos para al menos un epítopo conformacional presente en la proteína F modificada o mutada del RSV. En una instancia, la respuesta inmunitaria se especifica para un epítopo presente en una proteína F del RSV encontrada en el estado activo postfusión de "piruleta". Las proteínas F del RSV y composiciones pueden administrarse a un sujeto sin potenciar la enfermedad vírica después del contacto con el RSV. Preferiblemente, las proteínas F modificadas o mutadas del RSV descritas en este documento y composiciones inmunogénicas formuladas adecuadamente provocan una respuesta inmunitaria desviada a Thl que reduce o previene la infección con un RSV y/o reduce o previene una respuesta patológica después de infección con un RSV.

En una instancia proporcionada con fines ilustrativos que no se reivindica, las proteínas F del RSV hechas de acuerdo con el método de la presente invención, o aquellas descritas aquí con fines ilustrativos, se encuentran en forma de micelas (por ejemplo, rosetas). Las micelas que se pueden obtener consisten en agregados de las proteínas en espiga F, inmunológicamente activas, que tienen una estructura de tipo roseta. Las rosetas son visibles con el microscopio electrónico (Calderet al.,2000, Virology 271: 122-131). Preferiblemente, las micelas, que comprenden proteínas F modificadas o mutadas del RSV, muestran la morfología de "piruleta" indicativa del estado activo postfusión. En una instancia, las micelas se purifican después de la expresión en una célula hospedadora. Cuando se administran a un sujeto, las micelas inducen preferiblemente anticuerpos neutralizantes. En algunas instancias, las micelas pueden ser administradas con un adyuvante. En otras instancias, las micelas pueden ser administradas sin un adyuvante.

En una isntancia relacionada proporcionada con fines ilustrativos, se divulga partículas de tipo virus (VLP) del RSV que comprenden una proteína F modifica o mutada del RSV que puede formularse en vacunas o formulaciones antigénicas para proteger a los vertebrados (por ejemplo, seres humanos) contra infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad de la misma. La presente divulgación también se refiere a VLP del RSV y vectores que comprenden genes de tipo silvestre y mutados del RSV o una combinación de los mismos derivados de diferentes cepas de virus RSV, que cuando se transfectan en células hospedadoras, producirán partículas de tipo virus (VLP) que comprenden proteínas del RSV.

En algunas instancias, las partículas de tipo virus del RSV pueden comprender adicionalmente al menos una proteína de matriz vírica (por ejemplo, una proteína M del RSV). En una instancia, la proteína M se obtiene de una cepa humana del RSV. En otra instancia, la proteína M se obtiene de una cepa bovina del RSV. En otras instancias, la proteína de matriz puede ser una proteína M1 de una cepa del virus de la gripe. En una instancia, la cepa del virus de la gripe es una cepa de la gripe aviar. En una instancia preferida, la cepa de gripe aviar es la cepa H5N1 A/Indonesia/5/05. En otras instancias, la proteína de matriz puede ser del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV).

En algunas instancias, que se proporcionan únicamente con fines ilustrativos, las VLP pueden comprender adicionalmente una proteína G del RSV. En una instancia, la proteína G puede ser del grupo A de HRSV. En otra instancia, la proteína G puede ser del grupo B de HRSV. En otra instancia más, la proteína G del RSV puede obtenerse del grupo A y/o grupo B deHRSV.

En algunas instancias, que se proporcionan únicamente con fines ilustrativos, las VLP pueden comprender adicionalmente una proteína SH del RSV. En una instancia, la proteína SH puede ser del grupo A de HRSV. En otras instancias, la proteína SH puede ser del grupo B de HRSV. En otra instancia más, la proteína SH del RSV puede obtenerse del grupo A y/o grupo B de HRSv .

En algunas instancias, que se proporcionan únicamente con fines ilustrativos, las VLP pueden comprender adicionalmente una proteína N del RSV. En una instancia, la proteína N puede ser del grupo A de HRSV. En otra instancia, la proteína N puede ser del grupo B de HRSV. En otra instancia más, la proteína N del RSV puede obtenerse del grupo A y/o grupo B deHRSV.

En instancias adicionales, que se proporcionan únicamente con fines ilustrativos, las VLP pueden comprender uno o más inmunógenos heterólogos, tales como hemaglutinina (HA) y/o neuraminidasa (NA) de la gripe.

En algunas instancias, que se proporcionan únicamente con fines ilustrativos, la divulgación comprende combinaciones de diferentes proteínas M, F, N, SH, y/o G del RSV de las mismas y/o diferentes cepas en una o más VLP (no reivindicadas). Además, las VLP pueden incluir una o más moléculas adicionales para la potenciación de una respuesta inmunitaria.

En otra instancia, que se proporciona únicamente con fines ilustrativos, las VLP del RSV pueden portar agentes tales como ácidos nucleicos, ARNip, microARN, agentes quimioterapéuticos, agentes de imágenes y/u otros agentes que tienen que suministrarse a un paciente.

Las VLP son útiles para preparar vacunas y composiciones inmunogénicas. Una característica importante de las VLP es la capacidad de expresar proteínas de superficie de interés de modo que el sistema inmunológico de un vertebrado induzca una respuesta inmunitaria contra la proteína de interés. Sin embargo, no todas las proteínas pueden expresarse sobre la superficie de VLP. Puede haber muchas razones por las que no se expresan ciertas proteínas, o se expresan pobremente, sobre la superficie de VLP. Una razón es que la proteína no se dirige a la membrana de una célula hospedadora o que la proteína no tiene un dominio transmembrana. Como un ejemplo, secuencias cercanas al extremo carboxilo terminal de hemaglutinina de la gripe pueden ser importantes para la incorporación de HA a la bicapa lipídica de las nucleocápsidas con envuelta de la gripe maduras y para la interacción del ensamblaje de trímero HA con la proteína M1 de matriz de la gripe (Ali,et al.,(2000) J. Viral. 74, 8709-19).

Por tanto, una instancia relacionada proporcionada con fines ilustrativos divulga VLP quiméricas que comprenden una proteína F modificada o mutada del RSV y al menos un inmunógeno que normalmente no se expresa de forma eficaz sobre la superficie celular y no es una proteína normal del RSV. En una instancia, la proteína F modificada o mutada del RSV puede fusionarse con un inmunógeno de interés. En otra instancia, la proteína F modificada o mutada del RSV se asocia con el inmunógeno mediante el dominio transmembrana y la cola citoplasmática de una proteína de membrana de superficie vírica heteróloga, por ejemplo, la proteína de envuelta de MMTV.

Otras VLP quiméricas (no reivindocadas) comprenden VLP que comprenden una proteína F modificada o mutada del RSV y al menos una proteína de un agente infeccioso heterólogo. Ejemplos de agentes infecciosos heterólogos incluyen, aunque sin limitación, un virus, una bacteria, un protozoo, un hongo y/o un parásito. En una instancia, el inmunógeno de otro agente infeccioso es una proteína vírica heteróloga. En otra instancia, la proteína de un agente infeccioso heterólogo es una proteína asociada a envuelta. En otra instancia, la proteína de otro agente infeccioso heterólogo se expresa sobre la superficie de VLP. En otra instancia, la proteína de un agente infeccioso comprende un epítopo que generará una respuesta inmunitaria protectora en un vertebrado. En una instancia, la proteína de otro agente infeccioso se co-expresa con una proteína F modificada o mutada del RSV. En otra instancia, la proteína de otro agente infeccioso se fusiona a una proteína F modificada o mutada del RSV. En otra instancia, solamente una parte de una proteína de otro agente infeccioso se fusiona a una proteína F modifica o mutada del RSV. En otra instancia, solamente una parte de una proteína de otro agente infeccioso se fusiona a una parte de una proteína F modificada o mutada del RSV. En otra instancia, la parte de la proteína de otro agente infeccioso fusionada a la proteína F modificada o mutada del RSV se expresa sobre la superficie de VLP.

La divulgación también abarca variantes de las proteínas expresadas sobre o en las VLP (no reivindicadas). Las variantes pueden contener alteraciones en las secuencias de aminoácidos de las proteínas constituyentes. El término "variante" con respecto a una proteína se refiera a una secuencia de aminoácidos que está alterada por uno o más aminoácido con respecto a una secuencia de referencia. La variante puede tener cambios "conservativos", donde un aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares, por ejemplo, remplazo de leucina con isoleucina. Como alternativa, una variante puede tener cambios "no conservativos", por ejemplo, remplazo de una glicina con un triptófano. Variaciones minoritarias análogas también pueden incluir deleción o inserción de aminoácido, o ambas. Pueden encontrarse directrices en la determinación de qué restos de aminoácido pueden sustituirse, insertarse, o delecionarse sin eliminar actividad biológica o inmunológica, usando programas informáticos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el software DNASTAR.

Pueden aparecer variantes naturales debido a mutaciones en las proteínas. Estas mutaciones pueden conducir a variabilidad antigénica en grupos individuales de agentes infecciosos, por ejemplo, gripe. Por tanto, una persona infectada con, por ejemplo, una cepa de la gripe desarrolla anticuerpos contra ese virus, según aparecen cepas más nuevas del virus, los anticuerpos contra las cepas más antiguas ya no reconocen el virus más nuevo y puede suceder reinfección.

Textos generales que describen técnicas de biología molecular, tales como clonación, mutación, cultivo celular, y similares, incluyen Bergery Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrooket al.,Molecular Cloning--A Laboratory Manual (3a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 ("Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubelet al.,eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., ("Ausubel"). Estos textos describen la mutagénesis, el uso de vectores, promotores y muchos otros tópicos relevantes relacionados con, por ejemplo, la clonación y mutación de moléculas F y/o G del RSV, etc. Por tanto, se pueden utilizar métodos conocidos de ingeniería de proteínas y tecnología de ADN recombinante para mejorar o alterar las características de las proteínas expresadas sobre o en las VLP descritas. Pueden usarse diversos tipos de mutagénesis para producir y/o aislar ácidos nucleicos variantes que codifican moléculas proteicas y/o para modificar/mutar adicionalmente las proteínas en o sobre las VLP. Incluyen, aunque sin limitación, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis puntual aleatoria, recombinación homóloga (reordenamiento de ADN), mutagénesis usando moldes que contienen uracilo, mutagénesis dirigida por oligonucleótido, mutagénesis de ADN modificado por fosforotioato, mutagénesis usando ADN dúplex con huecos o similares. Métodos adecuados adicionales incluyen reparación de desapareamientos puntuales, mutagénesis usando cepas hospedadoras deficientes en reparación, restricción-selección y restricción-purificación, mutagénesis por deleción, mutagénesis por síntesis génica total, reparación de roturas bicatenarias, y similares. También se analiza en este documento la mutagénesis, por ejemplo, que implica construcciones quiméricas. En un caso, la mutagénesis puede guiarse por información conocida de la molécula natural o de la molécula natural alterada o mutada, por ejemplo, secuencia, comparaciones de secuencias, propiedades físicas, estructuras cristalinas o similares.

La divulgación comprende adicionalmente variantes proteicas (no reivindicaadas) que muestran actividad biológica sustancial, por ejemplo, capaces de provocar una respuesta eficaz de anticuerpos cuando se expresan sobre o en VLP. Dichas variantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones, y sustituciones seleccionadas de acuerdo con normas generales conocidas en la técnica para tener poco efecto sobre la actividad.

En la técnica se conocen métodos de clonación de proteínas. Por ejemplo, el gen que codifica una proteína específica del RSV puede aislarse por RT-PCR a partir de ARNm poliadenilado extraído de células que se habían infectado con un virus RSV. El producto génico resultando puede clonarse como un inserto de ADN en un vector. El término "vector" se refiere al medio por el cual un ácido nucleico puede propagarse y/o transferirse entre organismos, células, o componentes celulares. Los vectores incluyen plásmidos, virus, bacteriófagos, provirus, fagémidos, transposones, cromosomas artificiales, y similares, que se replican de forma autónoma o pueden integrarse en un cromosoma de una célula hospedadora. Un vector también puede ser un polinucleótido de ARN desnudo, un polinucleótido de ADN desnudo, un polinucleótido compuesto tanto por ADN como por ARN dentro de la misma hebra, un ADN o ARN conjugado con polilisina, un ADN o ARN conjugado con péptido, un ADN conjugado con liposoma, o similares, es decir, sin replicación autónoma. En muchas realizaciones habituales, pero no todas, los vectores son plásmidos o bácmidos.

Por tanto, la divulgación comprende nucleótidos (que no se reivindican) que codifican proteínas, incluyendo moléculas quiméricas, clonadas en un vector de expresión que puede expresarse en una célula que induce la formación de VLP. Un "vector de expresión" es un vector, tal como un plásmido que es capaz de promover la expresión, así como la replicación de un ácido nucleico incorporado en el mismo. Normalmente, el ácido nucleico a expresarse está "unido de forma funcional" a un promotor y/o potenciador, y está sujeto a control regulador de la transcripción por el promotor y/o potenciador. En una instancia, los nucleótidos codifican una proteína F modificada o mutada del RSV (como se discute anteriormente). En ota instancia, el vector comprende adicionalmente nucleótidos que codifican las proteínas M y/o G del RSV. En otra instancia, el vector comprende adicionalmente nucleótidos que codifican las proteínas M y/o N del RSV. En otra instancia, el vector comprende adicionalmente nucleótidos que codifican las proteínas M, G, y/o N del RSV. En otra instancia, el vector comprende adicionalmente nucleótidos que codifican una proteína M de BRSV y/o proteínas N del RSV. En otra instancia, el vector comprende adicionalmente nucleótidos que codifican una proteína M y/o G de BRSV, o una proteína HA y/o NA de la gripe. En un ejemplo, los nucleótidos codifican una proteína F del RSV y/o G del RSV modifica o mutada con una proteína hA y/o NA de la gripe. En otra instancia, el vector de expresión es un vector de baculovirus.

En algunas instancias, las proteínas pueden comprender mutaciones que contienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones, o deleciones silenciosas, pero no alteran las propiedades o actividades de la proteína codificada o el modo en que se fabrican las proteínas. Pueden producirse variantes nucleotídicas por una diversidad de razones, por ejemplo, para optimizar la expresión de codones para un hospedador particular (cambio de codones en el ARNm humano por aquellos preferidos por células de insecto tales como células Sf9. Véase la publicación de patente de Estados Unidos 2005/0118191).

Además, los nucleótidos pueden secuenciarse para asegurar que se clonaron las regiones codificantes correctas y no contienen ninguna mutación indeseada. Los nucleótidos pueden subclonarse en un vector de expresión (por ejemplo, baculovirus) para su expresión en cualquier célula. Lo anterior es solamente un ejemplo del modo en que pueden clonarse proteínas víricas del RSV. Un experto en la materia entiende que están disponibles y son posibles métodos adicionales.

La divulgación también proporciona construcciones y/o vectores (no reivindicados) que comprenden nucleótidos del RSV que codifican genes estructurales del RSV, incluyendo F, M, G, N, SH, o partes de las mismas y/o cualquier molécula quimérica descrita anteriormente. El vector puede ser, por ejemplo, un fago, plásmido, vector vírico, o retrovírico. Las construcciones y/o vectores que comprenden genes estructurales del RSV , incluyendo F, M, G, N, SH, o partes de los mismos y/o cualquier molécula quimérica descrita anteriormente, deben unirse de forma funcional a un promotor apropiado, tal como el promotor de la polihedrina de AcMNPV (u otro baculovirus), el promotor PL del fago lambda, los promotores lac. phoA y tac deE. coli,los promotores tempranos y tardíos de SV40, y promotores de LTR retrovíricas que son ejemplos no limitantes. Otros promotores adecuados serán conocidos para los expertos en la materia dependiendo de la célula hospedadora y/o la tasa de expresión deseada. Las construcciones de expresión contendrán adicionalmente sitios para el inicio de la transcripción, la terminación, y, en la región transcrita, un sitio de unión al ribosoma para la traducción. La parte codificante de los transcritos expresada por las construcciones incluirá preferiblemente un codón de inicio de la traducción al inicio y un codón de terminación apropiadamente posicionado al final del polipéptido a traducir.

Los vectores de expresión incluirán preferiblemente al menos un marcador de selección. Dichos marcadores incluyen resistencia a dihidrofolato reductasa, 0418 o neomicina para cultivo de células eucariotas y genes de resistencia a tetraciclina, kanamicina o ampicilina para cultivo enF. coliy otras bacterias. Entre los vectores preferidos están los vectores víricos, tales como baculovirus, poxvirus (por ejemplo, virus vaccinia, virus de la viruela aviar, virus de la viruela del canario, virus de la viruela de las aves de corral, virus de la viruela del mapache, virus de la viruela porcina, etc.), adenovirus (por ejemplo, adenovirus canino), herpesvirus, y retrovirus. Otros vectores que pueden usarse comprenden vectores para su uso en bacterias que comprenden pQE70, pQE60 y pQE-9, vectores pBluescript, vectores Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK.223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5. Entre los vectores eucariotas preferidos están pFastBac1 pW INEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG, pSVK3, pBPV, pMSG, y pSVL. Otros vectores adecuados serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia. En una instancia, el vector que comprende nucleótidos que codifican genes del RSV incluyendo genes F modificados o mutados del RSV, así como genes para M, G, N, SH o partes de las mismas, y/o cualquier molécula quimérica descrita anteriormente, espFastBac.

Las construcciones recombinantes mencionadas anteriormente podrían usarse para transfectar, infectar, o transformar y pueden expresar proteínas del RSV, incluyendo una proteína F modificada o mutada del RSV y al menos un inmunógeno. En una instancia, la construcción recombinante comprende una proteína F, M, G, N, SH, modifica o mutada del RSV, o partes de las mismas, y/o cualquier molécula descrita anteriormente, en células eucariotas y/o células procariotas. Por tanto, la divulgación proporciona células hospedadoras que comprenden un vector (o vectores) que contiene ácidos nucleicos que codifican genes estructurales del<r>S<v>, incluyendo una proteína F modificada o mutada del RSV; y al menos un inmunógeno tal como, aunque sin limitación, proteína G, N, y SH del RSV, o partes de las mismas y/o cualquier molécula descrita anteriormente, y que permite la expresión de genes, incluyendo F, G, N, M, o SH del RSV o partes de los mismos, y/o cualquier molécula descrita anteriormente en la célula hospedadora en condiciones que permitan la formación deVLP.

Entre las células hospedadores eucariotas están células hospedadoras de levadura, insecto, aviar, vegetales, deC. elegans(o nemátodos) y de mamífero. Ejemplos no limitantes de células de insectos son células deSpodoptera frugiperda(Sf), por ejemplo, Sf9, Sf21, células deTrichoplusia ni,por ejemplo, células High Five, y células S2 deDrosophila.Ejemplos de células hospedadoras de hongos (incluyendo levaduras) son S.cerevisiae, Kluyveromyces lactis (K. lactis),especies de Cándida incluyendoC. albicansyC. glabrata,Aspergillus nidulans, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), Pichia pastoris,yYarrowia lipolytica.Ejemplos de células de mamífero son células COS, células renales de cría de hámster, células L de ratón, células LNCaP, células de ovario de hámster chino (CHO), células renales embrionarias humanas (HEK), y células de mono verde africano, células CV1, células HeLa, células MDCK, células Vero y Hep-2. También pueden usarse ovocitos deXenopus laevis,u otras células de origen anfibio. Ejemplos de células hospedadoras procariotas incluyen células bacterianas, por ejemplo,E. coli, B. subtilis, Salmonella typhiy micobacterias.

Los vectores, por ejemplo, vectores que comprenden polinucleótidos de una proteína F modificada o mutada del RSV; y al menos un inmunógeno incluyendo, aunque sin limitación, proteína G, N o SH del RSV o partes de las mismas, y/o cualquier molécula quimérica descrita anteriormente, pueden transfectarse en células hospedadoras de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la introducción de ácidos nucleicos en células eucariotas puede ser por coprecipitación con fosfato cálcico, electroporación, microinyección, lipofección, y transfección empleando reactivos de transfección de poliamina. En una instancia, el vector es un Baculovirus recombinante. En otra instancia, el baculovirus recombinante se transfecta en una célula eucariota. En una instancia preferida, la célula es una célula de insecto. En otra instancia, la célula de insecto es una célula Sf9.

Esta divulgación también proporciona construcciones y métodos que aumentarán la eficacia de la producción de VLP. Por ejemplo, la adición de secuencia líder a la proteína F, M, G, N, SH, del RSV o partes de las mismas y/o cualquier molécula quimérica o heteróloga descrita anteriormente, puede mejorar la eficacia del transporte de proteínas dentro de la célula. Por ejemplo, puede fusionarse una secuencia señal heteróloga a la proteína F, M, G, N, SH o partes de las mismas y/o cualquier molécula quimérica o heteróloga descrita anteriormente. En una instancia, la secuencia señal puede obtenerse del gen de una célula de insecto y fusionarse a la proteína F, M, G, N, SH o partes de las mismas, y/o cualquier molécula quimérica o heteróloga descrita anteriormente. En otra instancia, el péptido señal es la secuencia señal de quitinasa, que trabaja de forma eficaz en sistemas de expresión de baculovirus.

Otro método para aumentar la eficacia de la producción de VLP es optimizar los codones de los nucleótidos que codifican RSV incluyendo una proteína F modificada o mutada, M, G, N, SH del RSV o partes de las mismas y/o cualquier molécula quimérica o heteróloga descrita anteriormente para un tipo celular específico. Para ejemplos de optimización de codones de ácidos nucleicos para la expresión en células S£9 véanse las SEQ ID No: 3, 5, 7, 9, 13, 17, 19, y25.

La divulgación también proporciona métodos de producción de VLP, comprendiendo los métodos expresar genes del RSV incluyendo una proteína F modificada o mutada del RSV, y al menos una proteína adicional, incluyendo, aunque sin limitación, la proteína M, G, N, SH del RSV o partes de las mismas y/o cualquier molécula quimérica o heteróloga descrita anteriormente en condiciones que permite la formación de VLP. Dependiendo del sistema de expresión y la célula hospedadora seleccionada, las VLP se producen cultivando células hospedadoras transformadas por un vector de expresión en condiciones mediante las cuales se expresan las proteínas recombinantes y se forman VLP. En una instancia, la divulgación comprende un método de producción de una VLP, que comprende transfectar vectores que codifican al menos una proteína F modificada o mutada del RSV en una célula hospedadora adecuada y expresar la proteína F modificada o mutada del RSV en condiciones que permiten la formación de VLP. En otra instancia, la célula eucariota se selecciona del grupo que consiste en células de levadura, insecto, anfibio, ave, o mamífero. La selección de las condiciones apropiadas de cultivo pertenece a las habilidades de los expertos en la materia.

Los métodos para cultivar células modificadas por ingeniería para producir VLP incluyen, aunque sin limitación, técnicas de cultivo celular discontinuo, semicontinuo, continuo y por perfusión. Cultivo celular significa el crecimiento y propagación de células en un biorreactor (una cámara de fermentación) donde las células se propagan y expresan proteína (por ejemplo, proteínas recombinantes) para su purificación y aislamiento. Típicamente, el cultivo celular se realiza en condiciones estériles de temperatura y atmósfera controladas en un biorreactor. Un biorreactor es una cámara usada para cultivar células en que las condiciones ambientales tales como temperatura, atmósfera, agitación y/o pH pueden controlarse. En una instancia, el biorreactor es una cámara de acero inoxidable. En otra instancia, el biorreactor es una bolsa de plástico preesterilizada (por ejemplo, Cellbag®, Wave Biotech, Bridgewater, NJ). En otra instancia, las bolsas de plástico preesterilizadas son bolsas de aproximadamente 50 l a 1000 l.

Las VLP después se aíslan usando métodos que conservan la integridad de las mismas, tal como por centrifugación en gradiante, por ejemplo, cloruro de cesio, sacarosa o iodixanol, así como técnicas convencionales de purificación incluyendo, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico y de filtración en gel.

Lo siguiente es un ejemplo del modo en que las VLP pueden prepararse, aislarse y purificarse. Habitualmente, se producen VLP a partir de líneas celulares recombinantes modificadas por ingeniería para crear VLP cuando las células se cultivan en cultivo celular (véase anteriormente). Un experto en la materia entendería que existen métodos adicionales que pueden utilizarse para preparar y purificar VLP.

La producción de VLP puede comenzar sembrando células Sf9 (no infectadas) en matraces de agitación, permitiendo que las células se expandan y aumenten en escala según crecen las células y se multiplican (por ejemplo, desde un matraz de 125 ml hasta una bolsa Wave de 50 l). El medio usado para cultivar la célula se formula para la línea celular apropiada (preferiblemente, medio sin suero, por ejemplo, medio de insecto ExCell-420, JRH). A continuación, las células se infectan con baculovirus recombinante a la multiplicidad más eficaz de infección (por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 unidades formadoras de placas por célula). Una vez ha sucedido la infección, la proteína F modificada o mutada, M, G, N, SH del RSV o partes de las mismas, y/o cualquier molécula quimérica o heteróloga descrita anteriormente, se expresa a partir del genoma del virus, se autoensambla en VLP y se secreta de las células aproximadamente 24 a 72 horas postinfección. Habitualmente, la infección es más eficaz cuando las células están en fase semi-log de crecimiento (4-8 x 106 células/ml) y son al menos aproximadamente un 90 % viables.

Las VLP pueden recogerse aproximadamente 48 a 96 horas postinfección, cuando los nivele de VLP en el medio de cultivo celular están cerca del máximo, pero antes de lisis celular extensiva. La densidad de células Sf9 y viabilidad en el tiempo de recolección puede ser de aproximadamente 0,5 x 106 células/ml hasta aproximadamente 1,5 x 106 células/ml con al menos un 20 % de viabilidad, como se muestra por el ensayo de exclusión de colorante. A continuación, el medio se retira y aclara. Puede añadirse NaCl al medio hasta una concentración de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 1,0 M, preferiblemente hasta aproximadamente 0,5 M, para evitar la agregación de VLP. La retirada de células y desechos celulares del medio de cultivo celular que contiene VLP puede conseguirse por filtración en flujo tangencial (TFF) con un cartucho de filtro de 0,5 o 1,00 |jm de fibra hueca preesterilizada de un único uso o un dispositivosimilar.

A continuación, las VLP en el medio de cultivo aclarado pueden concentrarse por ultrafiltración usando un cartucho de fibra hueca de punto de corte de peso molecular de 500.000 preesterilizado, desechable. Las VLP concentradas pueden diafiltrarse frente a 10 volúmenes de solución salina tampona con fosfato (PBS) de pH 7,0 a 8,0 que contiene NaCl 0,5 M para retirar los componentes residuales del medio.

Las VLP diafiltradas y concentradas pueden purificarse adicionalmente en un gradiente de sacarosa discontinuo del 20 % al 60 % en tampón PBS pH 7,2 con NaCl 0,5 M por centrifugación a 6.500 x g durante 18 horas a aproximadamente 4 °C hasta aproximadamente 10 °C. Habitualmente, las VLP formarán una banda visible distintiva entre sacarosa a aproximadamente el 30 % hasta aproximadamente el 40 % o en la superficie de contacto (en un gradiente por etapas del 20 % y el 60 %) que puede recogerse del gradiente y almacenarse. Este producto puede diluirse para que comprenda 200 mM de NaCl en la preparación para la siguiente etapa en el proceso de purificación. Este producto contiene VLP y puede contener partículas intactas debaculovirus.

La purificación adicional de VLP puede conseguirse por cromatografía de intercambio aniónico, o centrifugación en lecho isopícnico de sacarosa al 44 %. En cromatografía de intercambio aniónico, la muestra procedente del gradiente de sacarosa (véase anteriormente) se carga en columna que contiene un medio con un anión (por ejemplo, Matrix Fractogel EMD TMAE) y se eluye mediante un gradiente salino (desde aproximadamente 0,2 M hasta aproximadamente 1,0 M de NaCl) que puede separar las VLP de otros contaminantes (por ejemplo, baculovirus y ADN/ARN). En el método de lecho de sacarosa, la muestra que comprende las VLP se añade a un lecho de sacarosa al 44 % y se centrifuga durante aproximadamente 18 horas a 30.000 g. Las VLP forman una banda en la parte superior de la sacarosa al 44 %, mientras que el baculovirus precipita en el fondo y otras proteínas contaminantes permanecen en la capa de sacarosa al 0 % en la parte superior. Se recoge el pico o banda de VLP.

El baculovirus intacto puede inactivarse, si se desea. La inactivación puede conseguirse por métodos químicos, por ejemplo, formalina o P-propiolactona (BPL). La retirada y/o inactivación de baculovirus intacto también puede conseguirse en gran medida usando precipitación selectiva y métodos cromatográficos conocidos en la técnica, como se ha ejemplificado anteriormente. Los métodos de inactivación comprenden incubar la muestra que contiene las VLP en un 0,2 % de BPL durante 3 horas a aproximadamente 25 °C hasta aproximadamente 27 °C. El baculovirus también puede inactivarse incubando la muestra que contiene las VLP en BPL al 0,05 % a 4 °C durante 3 días, después a 37 °C durante una hora.

Después de la etapa de inactivación/retirada el producto que comprende VLP puede procesarse a través de otra etapa de diafiltración para retirar cualquier reactivo de la etapa de inactivación y/o cualquiersacarosa residual, y para colocar las VLP en el tampón deseado (por ejemplo, PBS). La solución que comprende VLP puede esterilizarse por métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, filtración estéril) y almacenarse en el refrigerador o congelador.

Las técnicas anteriores pueden ponerse en práctica a través de una diversidad de escalas. Por ejemplo, matraces en T, matraces de agitación, frascos rotativos, hasta biorreactores de tamaño industrial. Los biorreactores pueden comprender un tanque de acero inoxidable o una bolsa de plástico preesterilizada (por ejemplo, el sistema vendido por Wave Biotech, Bridgewater, NJ). Un experto en la materia sabrá lo que es más deseable para estos propósitos.

La expansión y producción de vectores de expresión de baculovirus e infección de células con baculovirus recombinante para producir VLP del RSV recombinante pueden conseguirse en células de insecto, por ejemplo, células de insecto Sf9 como se ha descrito previamente. En una instancia, las células son SF9 infectadas con baculovirus recombinante modificado por ingeniería para producir VLP del RSV.

Formulaciones farmacéuticas o de vacuna y administración

Las composiciones farmacéuticas útiles en este documento, que se proporcionan con fines ilustrativos y que no se reivindican, contienen un vehículo farmacéuticamente aceptable, incluyendo cualquier diluyente o excipiente adecuado, que incluye cualquier agente farmacéutico que no induzca por sí mismo la producción de una respuesta inmunitaria dañina para el vertebrado que recibe la composición, y que puede administrarse sin toxicidad excesiva y una proteína F modificada o mutada del RSV , una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV , o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV. Como se usa en este documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que está aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de Estados Unidos, Farmacopea Europea u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en mamíferos, y más particularmente en seres humanos. Estas composiciones pueden ser útiles como una vacuna y/o composiciones antigénicas para inducir una respuesta inmunitaria protectora en unvertebrado.

La divulgación abarca una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable (no reivindicada) que comprende VLP que comprenden al menos una proteína F modificada o mutada del RSV, y al menos una proteína adicional, incluyendo, aunque sin limitación, proteína M, G, N, SH del RSV o partes de las mismas, y/o cualquier molécula quimérica o heteróloga descrita anteriormente. En una instancia, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende VLP que comprenden al menos una proteína F modificada o mutada del RSV y al menos un inmunógeno adicional. En otra instancia, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende VLP que comprenden al menos una proteína F de RSV modificada o mutada y al menos una proteína M de RSV. En otra instancia, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende VLP que comprenden al menos una proteína F de RSV modificada o mutada y al menos una proteína M de BRSV. En otra instancia, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende VLP que comprenden al menos una proteína F de RSV modificada o mutada y al menos una proteína M1 de influenza aviar. En otra instancia, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende VLP que comprenden al menos una proteína F de RSV modificada o mutada y al menos una proteína M1 de influenza aviar.

En otra instancia, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende VLP que comprenden adicionalmente una proteína G del RSV, incluyendo, aunque sin limitación, una proteína G de HRSV, BRSV o RSV aviar. En otra instancia, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende VLP que comprenden adicionalmente la proteína N del RSV, incluyendo, aunque sin limitación, una proteína N de HRSV, BRSV o RSV aviar. En otra instancia, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende VLP que comprenden adicionalmente la proteína SH del RSV, incluyendo, aunque sin limitación, una proteína SH de HRSV, BRSV o RSV aviar.

En otra instancia, la divulgación abarca una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable (no reivindicada) que comprende VLP quiméricas tales como VLP que comprenden la proteína M de BRSV y una proteína F modificada o mutada del RSV y/o proteína G, H, o SH de un RSV y opcionalmente la proteína HA o NA obtenida de un virus de la gripe, donde la proteína HA o NA está fusionada a un dominio transmembrana y cola citoplasmática de la proteína F y/o G del RSV.

La divulgación también abarca una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable (no reivindicada) que comprende la proteína F modificada o mutada del RSV, una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV descrita anteriormente.

[01221]En una instancia, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende VLP que comprenden una proteína F modificada o mutada del RSV y al menos una proteína adicional. En otra instancia, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende VLP que comprenden adicionalmente la proteína M del RSV, tal como, aunque sin limitación, una proteína M de BRSV. En otra instancia, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende VLP que comprenden adicionalmente la proteína G del RSV, incluyendo, aunque sin limitación, una proteína G de HRSV. En otra instancia, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende VLP que comprenden adicionalmente la proteína N del RSV, incluyendo, aunque sin limitación, una proteína N de HRSV, BRSV o RSV aviar. En otra instancia, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende VLP que comprenden adicionalmente la proteína SH del RSV, incluyendo, aunque sin limitación, una proteína SH de HRSV, BRSV o RSV aviar. En otra instancia, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende VLP que comprenden la proteína M de BRSV y la proteína F y/o G del grupo A de HRSV. En otra instancia, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende VLP que comprenden la proteína M de BRSV y la proteína F y/o G del grupo B de HRSV. En otra instancia, la divulgación abarca una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable (no reivindicada) que comprende VLP quiméricas tales como VLP que comprenden proteína M quimérica de un BRSV y opcionalmente la proteína HA obtenida de un virus de la gripe, donde la proteína M está fusionada a la proteína HA de la gripe. La presente divulgación proporciona una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable que comprende VLP quiméricas tales como VLP que comprenden la proteína M de BRSV, y una proteína F y/o G quimérica de un<r>S<v>y opcionalmente la proteína HA obtenida de un virus de la gripe, donde la proteína HA de la gripe quimérica está fusionada al dominio transmembrana y la cola citoplasmática de la proteína F y/o G del<r>S<v>. En otra instancia, la divulgación abarca una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable (no reivindicada) que comprende VLP quiméricas tales como VLP que comprenden BRSV M y una proteína F y/o G quimérica de un RSV y opcionalmente proteína HA o NA derivada de un virus de influenza, en donde la proteína HA o NA está fusionada al dominio transmembrana y la cola citoplasmática de la proteína F y/o G de RSV.

La divulgación también abarca una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable (no reivindicada) que comprende una VLP quimérica que comprende al menos una proteína del RSV. En una instancia, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende VLP que comprenden una proteína F modificada o mutada del RSV y al menos un inmunógeno de un agente infeccioso heterólogo o célula enferma. En otra instancia, el inmunógeno de un agente infeccioso heterólogo es una proteína vírica. En otra instancia, la proteína vírica de un agente infeccioso heterólogo es una proteína asociada con la envuelta. En otra instancia, la proteína vírica de un agente infeccioso heterólogo se expresa sobre la superficie de las VLP. En otra instancia, la proteína de un agente infeccioso comprende un epítopo que generará una respuesta inmunitaria protectora en unvertebrado.

La divulgación también abarca un kit para inmunizar un vertebrado( no reivindicado), tal como un sujeto humano, que comprende VLP que comprenden al menos una proteína del RSV. En una instancia, el kit comprende VLP que comprenden una proteína F modificada o mutada del RSV. En una instancia, el kit comprende adicionalmente una proteína M del RSV tal como una proteína M del BRSV. En otra instancia, el kit comprende adicionalmente una proteína G del RSV. En otra instancia la divulgación abarca un kit (no reivindicado) que comprende VLP que comprenden una proteína M quimérica de un BRSV y opcionalmente una proteína HA obtenida de un virus de la gripe, donde la proteína M está fusionada a la proteína M de BRSV. En otra instancia, la divulgación abarca un kit (no reivindicado) que comprende VLP que comprenden una proteína M quimérica de un BRSV, una proteína F y/o G del RSV y un inmunógeno de un agente infeccioso heterólogo. En otra instancia, la divulgación comprende un kit (no reivindicado) que comprende VLP que comprenden una proteína M de un BRSV, una proteína quimérica F y/o G de RSV y opcionalmente una proteína HA o NA derivada de un virus de la gripe, en donde la proteína HA está fusionada al dominio transmembrana y la cola citoplasmática de la proteína F o G de RSV. En otro caso, la divulgación comprende un kit (no reivindicado) que comprende VLP que comprenden una proteína M de un BRSV, una proteína quimérica F y/o G de RSV y opcionalmente una proteína HA o NA derivada de un virus de la gripe, en donde la proteína HA está fusionada al dominio transmembrana y la cola citoplasmática de la proteína F y/o G de RSV.

En una instancia relacionada proporcionada con fines ilustrativos que no se reivindica, se proporciona una formulación inmunogénica que comprende al menos una dosis eficaz de una proteína F modificada o mutada del RSV. En otra instancia, existe una formulación inmunogénica que comprende al menos una dosis eficaz de una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV. En otra instancia, existe una formulación inmunogénica que comprende al menos una dosis eficaz de una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV como se describe más arriba.

La formulación inmunogénica comprende una proteína F modificada o mutada del RSV , una micela S del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, tampón acuoso isotónico estéril, y combinaciones de los mismos. Se presenta un análisis minucioso de vehículos, diluyentes, otros excipientes farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N.J. edición actual). La formulación debe adecuarse al modo de administración. En una instancia preferida, la formulación es adecuada para administración a seres humanos, preferiblemente es estéril, no particulada y/o no pirógena.

La composición, si se desea, también puede contener cantidades minoritarias de un agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes del pH. La composición puede ser una forma sólida, tal como un polvo liofilizado adecuado para reconstitución, una solución líquida, suspensión, emulsión, comprimido, píldora, cápsula, formulación de liberación sostenida, o polvo. La formulación oral puede incluir vehículos convencionales tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc.

La divulgación también proporciona un envase o kit farmacéutico (no reivindicado) que comprende uno o más recipientes llenados con uno o más de los ingredientes de las formulaciones de vacuna. En una instancia preferida, el kit comprende dos recipientes, uno que contiene una proteína F modificada o mutada del RSV, una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, y el otro que contiene un adyuvante. Asociado con dicho recipiente o recipientes puede haber una notificación en forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso y venta de productos farmacéuticos o biológicos, reflejando dicha notificación la aprobación por la agencia de fabricación, uso y venta para administración a seres humanos.

La formulación puede ser envasada en un recipiente sellado herméticamente tal como una ampolla o sobrecito que indica la cantidad de composición. En una instancia, la composición se suministra como un líquido, en otra instancia, como un polvo liofilizado y esterilizado seco o concentrado sin agua en un recipiente sellado herméticamente y puede reconstituirse, por ejemplo, con agua o solución salina a la concentración apropiada para administración a un sujeto.

En una instancia alternativa, la composición se suministra en forma líquida en un recipiente sellado herméticamente que indica la cantidad y concentración de la composición. Preferiblemente, la forma líquida de la composición se suministra en un recipiente sellado herméticamente de al menos aproximadamente 50 pg/ml, más preferiblemente al menos aproximadamente 100 pg/ml, al menos aproximadamente 200 pg/ml, al menos 500 pg/ml, o al menos 1 mg/ml.

Como un ejemplo, se administran VLP del RSV quimérico que comprenden una proteína F modificada o mutada del RSV en una cantidad o cuantía eficaz (como se ha definido anteriormente) suficiente para estimular una respuesta inmunitaria, cada una, una respuesta contra una o más cepas del RSV. La administración de la proteína F modificada o mutada del RSV, una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, o VLP provoca inmunidad contra RSV. Normalmente, la dosis puede ajustarse dentro de este intervalo basándose en, por ejemplo, la edad, estado físico, peso corporal, sexo, dieta, tiempo de administración, y otros factores clínicos. La formulación de vacuna profiláctica se administra de forma sistémica, por ejemplo, por inyección subcutánea o intramuscular usando una aguja o jeringa, o un dispositivo de inyección sin aguja. Como alternativa, la formulación de vacuna se administra por vía intranasal, mediante gotas, aerosol de partículas grandes (mayores de 10 micrómetros), o pulverización en el tracto respiratorio superior. Aunque cualquiera de las vías anteriores de suministro provoca una respuesta inmunitaria, la administración intranasal confiere el beneficio añadido de provocar inmunidad en la mucosa en el sitio de entrada de muchos virus, incluyendo RSV y gripe .

Por tanto, en una instancia relacionada, proporcionada con fines ilustrativos que no se reivindica, se proporciona un método un método de formulación de una vacuna o composición antigénica que induce inmunidad contra una infección o al menos un síntoma de enfermedad de la misma a un mamífero, que comprende añadir a la formulación una dosis eficaz de una proteína F modificada o mutada del RSV, una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV. En una instancia, la infección es una infección por RSV.

Aunque la estimulación de la inmunidad con una única dosis es posible, pueden administrarse dosificaciones adicionales, por la misma vía o una vía diferente, para conseguir el efecto deseado. En neonatos y bebés, por ejemplo, pueden requerirse múltiples administraciones para producir niveles suficientes de inmunidad. La administración puede continuar a intervalos durante toda la infancia, según sea necesario para mantener niveles suficientes de protección contra las infecciones, por ejemplo, infección por RSV. Asimismo, los adultos que son particularmente susceptibles a infecciones repetidas o graves, tales como, por ejemplo, trabajadores sanitarios, trabajadores de guarderías, miembros de la familia de niños pequeños, los ancianos, e individuos con función cardiopulmonar comprometida pueden requerir múltiples inmunizaciones para establecer y/o mantener respuestas inmunitarias protectoras. Los niveles de inmunidad inducida pueden controlarse, por ejemplo, midiendo las cantidades de anticuerpos de secreción y séricos neutralizantes, y ajustando las dosis o vacunaciones repetidas según lo necesario para producir y mantener niveles deseados de protección.

Los métodos de administración de una composición que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV , o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV (por ejemplo, formulaciones de vacuna y/o antigénicas) incluyen, aunque sin limitación, administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intravenosa y subcutánea), epidural, y a la mucosa (por ejemplo, vías intranasal y oral o pulmonar o por supositorios). En una isntancia específica, las composiciones se administran por vía intramuscular, intravenosa, subcutánea, transdérmica o intradérmica. Las composiciones pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través del revestimiento epitelial o mucocutáneo (por ejemplo, moco oral, colon, conjuntiva, nasofaringe, orofaringe, vagina, uretra, vejiga urinaria y mucosa intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. En algunas instancias, las vías intranasales u otras vías a la mucosa de administración de una composición pueden inducir una respuesta de anticuerpos u otra respuesta inmunitaria que es sustancialmente mayor que otras vías de administración. En otra instancia, las vías intranasal u otras vías a la mucosa de administración de una composición pueden inducir una respuesta de anticuerpos u otra respuesta inmunitaria que inducirá protección cruzada contra otras cepas del RSV. La administración puede ser sistémica o local.

En otra instancia más, la vacuna y/o formulación inmunogénica se administra de tal modo que se abordan tejidos de la mucosa para provocar una respuesta inmunitaria en el sitio de inmunización. Por ejemplo, los tejidos de la mucosa tales como el tejido linfoide asociado al intestino (GALT) pueden abordarse para inmunización usando administración oral de composiciones que contienen adyuvantes con propiedades particulares de direccionamiento a la mucosa. También pueden abordarse tejidos adicionales de la mucosa, tales como tejido linfoide nasofaríngeo (NALT) y tejido linfoide asociado con los bronquios (BALT).

Las vacunas y/o formulaciones inmunogénicas también pueden administrarse en un programa de dosificación, por ejemplo, una administración inicial de la composición de vacuna con posteriores administraciones de refuerzo. En instancias particulares, se administra una segunda dosis de la composición en cualquier momento desde dos semanas a un año, preferiblemente de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5 a aproximadamente 6 meses, después de la administración inicial. Adicionalmente, puede administrarse una tercera dosis después de la segunda dosis y desde aproximadamente tres meses hasta aproximadamente dos años, incluso más, preferiblemente aproximadamente 4, aproximadamente 5, o aproximadamente 6 meses, o aproximadamente 7 meses hasta aproximadamente un año después de la administración inicial. La tercera dosis puede administrarse opcionalmente cuando no se detectan o se detectan niveles bajos de inmunoglobulinas específicas en el suero y/o la orina o secreciones de la mucosa del sujeto después de la segunda dosis. En una instancia preferida, se administra una segunda dosis aproximadamente un mes después de la primera administración y se administra una tercera dosis aproximadamente seis meses después de la primera administración. En otra instancia, la segunda dosis se administra aproximadamente seis meses después de la primera administración. En otra instancia, las composiciones pueden administrarse como parte de una terapia de combinación. Por ejemplo, las composiciones pueden formularse con otras composiciones inmunogénicas, antivíricos y/o antibióticos.

La dosificación de la composición farmacéutica puede determinarse fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, identificando primero dosis eficaces para provocar una respuesta inmunitaria profiláctica o terapéutica, por ejemplo, midiendo el título en suero de inmunoglobulinas específicas del virus o midiendo la relación inhibidora de anticuerpos en muestras de suero, o muestras de orina, o secreciones de la mucosa. Las dosificaciones pueden determinarse para estudios en animales. Una lista no limitante de animales usados para estudiar la eficacia de vacunas incluye cobaya, hámster, hurón, chinchilla, ratón y rata del algodón. La mayoría de los animales no son hospedadores naturales para los agentes infecciosos, pero aún pueden servir en los estudios de diversos aspectos de la enfermedad. Por ejemplo, a cualquiera de los animales anteriores se les puede dosificar un candidato de vacuna, por ejemplo, proteínas F modificadas o mutadas del RSV, una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, o VLP, para caracterizar parcialmente la respuesta inmunitaria inducida, y/o para determinar si se ha producido algún anticuerpo neutralizante. Por ejemplo, se han realizado muchos estudios en el modelo de ratón porque los ratones son de tamaño pequeño y su bajo coste permite a los investigadores realizar estudios a mayor escala.

Además, pueden realizarse estudios clínicos en seres humanos para determinar la dosis eficaz preferida para seres humanos por un experto en la materia. Dichos estudios clínicos son rutinarios y bien conocidos en la técnica. La dosis precisa a emplear también dependerá de la vía de administración. Las dosis eficaces pueden extrapolarse de las curvas de respuesta a dosis obtenidas sistemas de ensayoin vivoo en animales.

Como también se sabe bien en la técnica, la inmunogenicidad de una composición particular puede potenciarse mediante el uso de estimuladores no específicos de la respuesta inmunitaria, conocidos como adyuvantes. Los adyuvantes se han usado experimentalmente para promover un aumento generalizado en la inmunidad contra antígenos desconocidos (por ejemplo, patente de Estados Unidos N.° 4.877.611). Los protocolos de inmunización han usado adyuvantes para estimular respuestas durante muchos años, y por tanto, los adyuvantes son bien conocidos para los expertos en la materia. Algunos adyuvantes afectan al modo en que se presentan los antígenos. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria se aumenta cuando los antígenos proteicos se precipitan por alumbre. La emulsificación de antígenos también prolonga la duración de la presentación del antígeno. Se puede incluir cualquier adyuvante descrito en Vogel et al., "A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2a Edición)",.

Adyuvantes de ejemplos incluyen adyuvante completo de Freund (un estimulador no específico de la respuesta inmunitaria que contieneMycobacterium tuberculosisinactivado), adyuvante incompleto de Freundy adyuvante de hidróxido de aluminio. Otros adyuvantes comprenden GMCSP, BCG, hidróxido de aluminio, compuestos MDP, tales como thur-MDP y nor-MDP, CGP (<m>T<p>-PE), lípido A, y monofosforil lípido A (MPL). También se contempla RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, MPL, dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de pared celular (CWS) en una emulsión de ecualeno/Tween 80. También puede usarse MF-59, Novasomes®, antígenos MHC.

En una instancia, el adyuvante es una vesícula lipídica paucilamelar que tiene aproximadamente dos a diez bicapas dispuestas en forma de carcasas sustancialmente esféricas separadas por capas acuosas que rodean una gran cavidad central amorfa libre de bicapas lipídicas. Las vesículas lipídicas paucilamelares pueden actuar estimulando la respuesta inmunitaria de varios modos, como estimuladores no específicos, como vehículos para el antígeno, como vehículos de adyuvantes adicionales, y combinaciones de los mismos. Las vesículas lipídicas paucilamelares actúan como inmunoestimuladores no específicos cuando, por ejemplo, se prepara una vacuna entremezclando el antígeno con las vesículas preformadas de modo que el antígeno permanezca de forma extracelular a las vesículas. Por encapsulación de un antígeno dentro de la cavidad central de la vesícula, la vesícula actúa tanto como inmunoestimulador y como vehículo para el antígeno. En otra instancia, las vesículas se preparan principalmente de vesículas no fosfolipídicas. En otra instancia, las vesículas son Novasomes®. Novasomes® son vesículas no fosfolipídicas paucilamelares que varían de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 500 nm. Comprenden Brij 72, colesterol, ácido oleico y escualeno. Novasomes ha demostrado ser un adyuvante eficaz para antígenos de gripe (véanse las patentes de Estados Unidos 5.629.021, 6.387.373, y 4.911.928).

Las composiciones también pueden formularse con "inmunoestimuladores". Estos son los mensajeros químicos del propio organismo (citoquinas) para aumentar la respuesta del sistema inmunológico. Los inmunoestimuladores incluyen, aunque sin limitación, diversas citoquinas, linfoquinas y quimioquinas con actividades inmunoestimuladoras, inmunopotenciadoras y proinflamatorias, tales como interleuquinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); factores de crecimiento (por ejemplo, factor estimulador de colonias (CSF) de granulocitos- macrófagos (GM)); y otras moléculas inmunoestimuladoras, tales como factor inflamatorio de macrófagos, ligando Flt3, B7.l; 87.2, etc. Las moléculas inmunoestimuladoras pueden administrarse en la misma formulación que las composiciones, o pueden administrarse por separado. La proteína o un vector de expresión que codifica la proteína pueden administrarse para producir un efecto inmunoestimulador. Por tanto, en una instancia, la divulgación proporciona formulaciones antigénicas y de vacuna que comprenden un adyuvante y/o un inmunoestimulador ( no reivindicados).

Métodos de estimulación de una respuesta inmunitaria

Las proteínas F modificadas o mutadas del RSV, las micelas F del RSV que comprenden una proteína F modificada o mutada del RSV, o las VLP son útiles para preparar composiciones que estimulan una respuesta inmunitaria que confiere inmunidad o inmunidad sustancial contra agentes infecciosos. La inmunidad tanto de la mucosa como celular puede contribuir a inmunidad contra agentes infecciosos y enfermedades. Los anticuerpos secretados de forma local en el tracto respiratorio superior son un factor principal en la resistencia a infección natural. La inmunoglobulina A de secreción (sIgA) está implicada en la protección del tracto respiratorio superior y la IgG en suero en la protección del tracto respiratorio inferior. La respuesta inmunitaria inducida por una infección protege contra reinfección con el mismo virus o una cepa vírica antigénicamente similar. Por ejemplo, RSV experimenta cambios frecuentes e impredecibles; por lo tanto, después de infección natural, el período eficaz de protección proporcionado por la inmunidad del hospedador puede ser solamente eficaz durante unos pocos años contra las nuevas cepas de virus que circulan en lacomunidad.

Por tanto, en una instancia relacionada proporcionada con fines ilustrativos, se proporciona un método de inducción de inmunidad contra infecciones o al menos un síntoma de enfermedad de las mismas en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis eficaz de una proteína F modificada o mutada del RSV, una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV. En una instancia, el método comprende administrar<v>L<p>que comprenden una proteína F modificada o mutada del RSV y al menos una proteína adicional. En otra instancia, el método comprende administrar VLP que comprenden adicionalmente una proteína M del RSV, por ejemplo, una proteína M de BRSV. En otra instancia, el método comprende administrar VLP que comprenden adicionalmente una proteína N del RSV. En otra instancia, el método comprende administrar VLP que comprenden adicionalmente una proteína G del RSV. En otra instancia, el método comprende administrar VLP que comprenden adicionalmente una proteína SH del RSV. En otra instancia, el método comprende administrar VLP que comprenden adicionalmente proteína F y/o G del grupo y/o grupo B de HRSV. En otra instancia, el método comprende administrar VLP que comprenden proteína M de BRSV y una proteína F y/o G quimérica del RSV o proteína de envuelta de MMTV, por ejemplo, la proteína HA o NA obtenida de un virus de la gripe, donde la proteína HA y/o NA está fusionada al dominio transmembrana y cola citoplasmática de la proteína F y/o G del RSV o proteína de envuelta de MMTV. En otra instancia, el método comprende administrar VLP que comprenden proteína M de BRSV y una proteína F y/o G quimérica del RSV y opcionalmente proteína<h>A o NA obtenida de un virus de la gripe, donde la proteína HA o Na está fusionada al dominio transmembrana y cola citoplasmática de la proteína F y/o G del RSV. En otra instancia, el sujeto es un mamífero. En otra instancia, el mamífero es un ser humano. En otra instancia, las VLP del<r>S<v>se formulan con una adyuvante o inmunoestimulador.

En una instancia relacionada proporcionada con fines ilustrativos que no se reivindica, se proporciona un método para inducir inmunidad a la infección por RSV o al menos un síntoma de la enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F de RSV modificada o mutada. En otras instancia, se proporciona un método para inducir inmunidad a la infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad de la misma en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV. En aún otra instancia se proporciona un método para inducir inmunidad a la infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad de la misma en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una VLP del RSV, en donde los VLP comprenden una proteína F modificada o mutada del RSV, proteínas M, G, SH y/o N. En otra instancia, un método para inducir inmunidad a la infección por RSV o al menos un síntoma de la misma en un sujeto, comprende administrar al menos una dosis efectiva de una VLP del RSV, donde el VLP consiste esencialmente en proteínas M del BRSV (incluyendo M quimérica) y F, G y/o N del RSV. Las VLP pueden comprender proteínas del RSV adicionales y/o contaminantes proteicos en concentraciones insignificantes. En otra instancia, un método para inducir inmunidad a la infección por RSV o al menos un síntoma de la misma en un sujeto, comprende administrar al menos una dosis efectiva de los VLP del RSV, donde los VLP consisten en M del BRSV (incluyendo M quimérica), G y/o F del RSV. En otra instancia, un método para inducir inmunidad a la infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, comprende administrar al menos una dosis efectiva de los VLP del RSV que comprende proteínas del RSV, en donde las proteínas del RSV consisten en proteínas M F, G y / o N del BRSV (incluyendo M quiméricas), incluidas las proteínas quiméricas G y/o N. Estas VLP contienen proteínas M del BRSV (incluidas las proteínas quiméricas M), F, G y/o N del RSV y pueden contener constituyentes celulares adicionales tales como proteínas celulares, proteínas de baculovirus, lípidos, carbohidratos, etc., pero no contienen proteínas del RSV adicionales (diferentes de los fragmentos de las proteínas M del BRSV (incluyendo M quiméricas), F, G y/o N del BRSV/RSV. En otra instancia, el sujeto es un vertebrado. En una instancia, el vertebrado es un mamífero. En otra instancia, el mamífero es humano. En otra instancia, el método comprende inducir inmunidad a la infección por RSV o al menos un síntoma de la enfermedad mediante la administración de la formulación en una dosis. En otra instancia, el método comprende inducir inmunidad a la infección por RSV o al menos un síntoma de la enfermedad mediante la administración de la formulación en múltiples dosis.

La divulgación también abarca la inducción de inmunidad contra una infección, o al menos un síntoma de la misma en un sujeto, causada por un agente infeccioso, que comprende administrar al menos una dosis eficaz de una proteína F modificada o mutada del RSV, una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada delRSV.

En una instancia, el método comprende administrar VLP que comprenden una proteína F modificada o mutada del RSV y al menos una proteína de un agente infeccioso heterólogo. En una instancia, el método comprende administrar VLP que comprenden una proteína F modificada o mutada del RSV y al menos una proteína del mismo agente infeccioso o uno heterólogo. En otra instancia, la proteína del agente infeccioso heterólogo es una proteína vírica. En otra instancia, la proteína del agente infeccioso es una proteína asociada con envuelta. En otra instancia, la proteína del agente infeccioso se expresa sobre la superficie de VLP. En otra instancia, la proteína del agente infeccioso comprende un epítopo que generará una respuesta inmunitaria protectora en un vertebrado. En otra instancia, la proteína del agente infeccioso puede asociarse con la proteína M del RSV tal como proteína M de BRSV, proteína F, G y/o N del RSV. En otra instancia, la proteína del agente infeccioso está fusionada a una proteína del RSV tal como proteína M de BRSV, proteína F, G y/o N del RSV. En otra instancia, solamente una parte de una proteína del agente infeccioso está fusionada a una proteína del RSV tal como una proteína M de BRSV, proteína F, G y/o N del RSV. En otra instancia, solamente una parte de una proteína del agente infeccioso está fusionada a una parte de una proteína del RSV tal como una proteína M de BRSV, proteína F, G y/o N del RSV. En otra instancia, la parte de la proteína del agente infeccioso fusionada a la proteína del RSV se expresa sobre la superficie de VLP. En otra instancia, la proteína del RSV, o parte de la misma, fusionada a la proteína del agente infeccioso se asocia con la proteína M del RSV. En otra instancia, la proteína del RSV, o parte de la misma se obtiene de la proteína F, G, N y/o P del RSV. En otra instancia, las VLP quiméricas comprenden adicionalmente la proteína N y/o P del RSV. En otra instancia, las VLP quiméricas comprenden más de una proteína del mismo agente infeccioso y/o uno heterólogo. En otra instancia, las VLP quiméricas comprenden más de una proteína de agente infeccioso, creando de ese modo una VLP multivalente.

Las composiciones descritas en el presente documento (no reivindicadas) pueden inducir inmunidad sustancial en un vertebrado (por ejemplo, un ser humano) cuando se administran al vertebrado. La inmunidad sustancial resulta de una respuesta inmunitaria contra composiciones que protegen o mejoran la infección o al menos reducen un síntoma de infección en el vertebrado. En algunos casos, si el vertebrado se infecta, la infección será asintomática. La respuesta puede no ser una respuesta completamente protectora. En este caso, si el vertebrado se infecta con un agente infeccioso, el vertebrado experimentará síntomas reducidos o una duración más corta de los síntomas, en comparación con un vertebrado no inmunizado.

En una instancia que no se reivindica, se proporciona un método para inducir inmunidad sustancial a la infección por el virus del RSV o al menos un síntoma de la enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F modificada o mutada del RSV, una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada proteína, o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV. En otra instancia se proporciona un método para vacunar a un mamífero contra el VSR que comprende administrar al mamífero una cantidad inductora de protección de una proteína F modificada o mutada del RSV, una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, o una VLP que comprende una proteína F modificada o proteína del RSV. En una instancia, el método comprende administrar VLP que comprende adicionalmente una proteína M del RSV, tal como proteína M del BRSV. En otra instancia, el método comprende adicionalmente administrar VLP que comprenden proteína G del RSV, por ejemplo, una proteína G del HRSV. En otra instancia, el método comprende adicionalmente administrar VLP que comprenden proteína N del grupo A del HRSV. En otra instancia, el método comprende adicionalmente administrar VLP que comprenden proteína N del grupo B del HRSV. En otra instancia, el método comprende administrar VLP que comprenden proteína M quimérica del BRSV y proteína F y/o G obtenida del RSV, donde las proteínas F y/o G están fusionadas a la cola transmembrana y citoplasmática de la proteína M. En otra instancia, el método comprende administrar VLP que comprenden proteína M del BRSV y proteína F y/o G quimérica del RSV donde la proteína F y/o G está fusionada al dominio transmembrana y a cola citoplasmática de la proteína HA y/o NA de la gripe. En otra instancia, el método comprende administrar VLP que comprenden<proteína M de>BRS<v y proteína F y/o G quimérica del RSV y opcionalmente una proteína HA y/o NA de la gripe, donde la proteína F y/o G está fusionada al dominio transmembrana y a cola citoplasmática de la proteína>H<a>. En otra instancia, el método comprende administrar VLP que comprenden proteína M del BRSV y proteína F y/o G quimérica del RSV, y opcionalmente una proteína HA y/o NA de la gripe, donde la proteína HA y/o NA está fusionada al dominio transmembrana y a cola citoplasmática de la proteína F y/o G delRSV.

La divulgación también abarca un método de inducción de inmunidad sustancial contra una infección, o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, causada por un agente infeccioso, que comprende administrar al menos una dosis eficaz de la proteína F modificada o mutada del RSV, una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada delRSV. En una instancia, el método comprende administrar VLP que comprenden adicionalmente una proteína M delRSV, tal como proteína M de BRSV, y al menos una proteína de otro agente infeccioso. En una instancia, el método comprende administrar VLP que comprenden adicionalmente una proteína M de BRSV y al menos una proteína del mismo agente infeccioso o uno heterólogo. En otra instancia, la proteína del agente infeccioso es una proteína vírica. En otra instancia, la proteína del agente infeccioso es una proteína asociada con envuelta. En otra instancia, la proteína del agente infeccioso se expresa sobre la superficie de VLP. En otra instancia, la proteína del agente infeccioso comprende un epítopo que generará una respuesta inmunitaria protectora en un vertebrado. En otra instancia, la proteína del agente infeccioso puede asociarse con la proteína M del RSV. En otra instancia, la proteína del agente infeccioso puede asociarse con la proteína M de BRSV. En otra instancia, la proteína del agente infeccioso está fusionada a una proteína del RSV. En otra instancia, solamente una parte de una proteína del agente infeccioso está fusionada a una proteína del RSV. En otra instancia, solamente una parte de una proteína del agente infeccioso está fusionada a una parte de una proteína del RSV. En otra instancia, la parte de la proteína del agente infeccioso fusionada a la proteína del RSV se expresa sobre la superficie de VLP. En otra instancia, la proteína del RSV o parte de la misma, fusionada a la proteína del agente infeccioso se asocia con la proteína M del RSV. En otra instancia, la proteína del RSV, o parte de la misma, fusionada a la proteína del agente infeccioso se asocia con la proteína M de BRSV. En otra instancia, la proteína del RSV, o parte de la misma, se obtiene de la proteína F, G, N y/o P del RSV. En otra instancia, las VLP comprenden adicionalmente la proteína N y/o P del RSV. En otra instancia las VLP comprenden más de una proteína del agente infeccioso. En otra instancia la VLP comprenden más de una proteína del agente infeccioso, creando de este modo una VLP multivalente.

En una instancia relacionada proporcionada con fines ilustrativos que no se reivindica, se divulga un método para inducir una respuesta de anticuerpos protectores a una infección o al menos un síntoma de la misma en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F modificada o mutada del RSV, una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV, o una VLP que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV como se describió anteriormente.

Como se usa en este documento, un “anticuerpo” es una proteína que comprende uno o más polipéptidos sustancial o parcialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes e inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como una miríada de genes de la región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) típica comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena “ ligera” (aproximadamente 25 kDa) y una “pesada” (aproximadamente 50-70 kDa). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígeno. Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como varios fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con diversas peptidasas.

En una instancia, la divulgación comprende un método (que no se reivindica) para inducir una respuesta celular protectora a la infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una proteína F modificada o mutada del RSV. En otra instancia, la divulgación comprende un método para inducir una respuesta celular protectora a la infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una micela F del RSV que comprende una proteína F modificada o mutada del RSV. En aún otra instancia, la divulgación comprende un método (que no se reivindica) para inducir una respuesta celular protectora a la infección por RSV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una VLP, en el que la VLP comprende una proteína F modificada o mutada del RSV como se describió anteriormente. La inmunidad mediada por células también desempeña un papel en la recuperación<a partir de una infección por RSV y puede prevenir las complicaciones asociadas con r>S<v>.<Se han detectado>linfocitos celulares específicos del RSV en la sangre y las secreciones del tracto respiratorio inferior de sujetos infectados. La citólisis de células infectadas por RSV está mediada por CTL en concierto con anticuerpos específicos del RSV y el complemento. La respuesta citotóxica principal es detectable en sangre después de 6-14 días y desaparecen el día 21 en individuos infectados o vacunados (Enniset al.,1981). La inmunidad mediada por células también desempeña un papel en la recuperación a partir de una infección por RSV y puede prevenir las complicaciones asociadas con RSV. Se han detectado linfocitos celulares específicos del RSV en la sangre y secreciones de tracto respiratorio inferior de sujetos infectados.

Como se ha mencionado anteriormente, las composiciones inmunogénicas (que no se re iv ind ican ) previenen o reducen al menos un síntoma de infección por RSV en un sujeto. Los síntomas del RSV son muy conocidos en la técnica. Incluyen rinorrea, dolor de garganta, cefalea, ronquera, tos, esputo, fiebre, estertores, sibilancias, y disnea. Por tanto, el método comprende la prevención o reducción de al menos un síntoma asociado con infección por RSV. Una reducción en un síntoma puede determinarse de forma subjetiva u objetiva, por ejemplo, autoevaluación por un sujeto, por una evaluación del médico o realizando un ensayo o medición apropiada (por ejemplo, temperatura corporal) incluyendo, por ejemplo, una evaluación de calidad de vida, una progresión ralentizada de una infección por RSV o síntomas adicionales, una gravedad reducida de los síntomas del RSV o un ensayo adecuado (por ejemplo, título de anticuerpo y/o ensayo de activación de células T). La evaluación objetiva comprende evaluaciones tanto en animales como en seres humanos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Generación de bácmidos recombinantes, transfección de células de insecto para preparar soluciones madre de virus recombinante, purificación en placa, e infección de células de insecto con solución madre de virus primario.

Para construir virus recombinante, se optimizaron los codones de los genes víricos de interés para la expresión en células de insecto Sf9 y se clonaron en vectores pFastBac™.

Una vez se confirmaron las construcciones deseadas y se purificaron, se descongeló en hielo un vial de células competentes MAX Efficiency® DH10Bac™ para cada construcción. Se añadió aproximadamente 1 ng (5 j l) del ADN plasmídico de la construcción pFastBac™ deseada a las células y se mezcló suavemente. Las células se incubaron en hielo durante 30 minutos. Esto estuvo seguido por choque térmico de las células durante 45 segundos a 42 °C sin agitación. A continuación, los tubos se transfirieron a hielo y se enfriaron durante 2 minutos. Posteriormente, se añadieron 900 ml de medio S.O.C. a temperatura ambiente a cada tubo. Los tubos se pusieron en un agitador a 37 °C a 225 rpm durante 4 horas. Para cada transformación pFastBac™, se prepararon diluciones en serie de factor 10 de las células (10-1, 10-2 y 10-3) usando medio S.O.C. A continuación, se sembraron en placa 100 ml de cada dilución en una placa de agar LB que contenía 50 jg/m l de canamicina, 7 jg/m l de gentamicina, l 0 jg/m l de tetraciclina, 100 jg/m l de Bluo-gal, y 40 jg/m l de IPTG. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37 °C. Se picaron las colonias blancas para el análisis.

Se prepararon diferentes ADN de bácmido a partir de lo anterior para cada construcción y se aislaron. Estos ADN se precipitaron y añadieron a células Sf9 durante 5 horas.

A continuación, se infectaron 30 ml de células de insecto Sf9 (2 x 106 células/ml) con baculovirus que expresaba proteínas víricas de interés con 0,3 ml de eluato de placa y se incubaron durante 48-72 horas. Se reservó aproximadamente 1 ml de cultivo en bruto (células medio) y recolecciones de cultivo aclarado para análisis de expresión y el resto se reservó con propósitos de purificación.

Ejemplo 2

Expresión, purificación, y análisis de proteínas F modificadas de HRSV

Se sintetizaron genes que codificaban proteínas F modificadas de HRSV de interésin vitrocomo oligonucleótidos solapantes, se clonaron y expresaron en células hospedadoras. La clonación y expresión de los genes F modificados del RSV se consiguieron siguiendo los métodos conocidos en latécnica.

Se picaron las placas recombinantes que contenían proteínas víricas de interés y se confirmaron. El virus recombinante después se amplificó por infección de células de insecto Sf9. En algunos casos, se co infectaron células de insecto Sf9 por un virus recombinante que expresaba proteína F modificada y otro virus recombinante que expresaba otras proteínas víricas (por ejemplo, proteína M de BRSV y/o proteína N de HRSV). Se infectó un cultivo de células de insecto a ~3 MOI (multiplicidad de infección = ffu o pfu/célula de virus) con baculovirus que portaba las diversas construcciones. El cultivo y el sobrenadante se recogieron 48-72 horas postinfección. La recolección en bruto, aproximadamente 30 ml, se aclaró por centrifugación durante 15 minutos a aproximadamente 800 x g. Las recolecciones celulares en bruto resultantes que contenían proteína F modificada de HRSV se purificaron como se describe a continuación.

Se purificaron proteínas F modificadas de HRSV de interés a partir de las recolecciones de cultivo celular de insecto Sf9 infectado. Se usó tensioactivo no iónico Tergitol® NP-9 (Etoxilato de Nonilfenol) para un protocolo de extracción de proteínas de membrana. La extracción en bruto se purificó adicionalmente por pase a través de una cromatografía de intercambio aniónico, afinidad por lectina de lenteja/HIC, y cromatografía de intercambio catiónico.

La expresión de proteínas se analizó por SDS-PAGE y se tiñó para las proteínas totales por tinción de Coomassie. Se cargaron volúmenes iguales de muestras celulares a partir de la recolección en bruto y tampón de muestra 2x que contenía pME (beta-mercaptoetanol), aproximadamente 15 a 20 pl (aproximadamente de 7,5 a 10 pl del cultivo)/carril, en un gel de SDS Laemmli.

En algunos casos, en lugar de cromatografía, las proteínas F modificadas de HRSV en las recolecciones celulares en bruto se concentraron por un método de separación en gradiente de sacarosa al 30 %, y después se analizaron por SDS-PAGE teñido con Coomassie, o transferencia de Western usando anticuerpo monoclonal anti-F del RSV.

La recolección celular en bruto que contenía proteínas F recombinantes modificadas, proteínas F recombinantes purificadas, o proteínas F recombinantes concentradas por gradiente de sacarosa puede analizarse adicionalmente por transferencia de Western usando anticuerpo monoclonal anti-F del RSV y/o anticuerpo policlonal anti-F del RSV.

Ejemplo 3

Gen de F modificado de HRSV que codifica la proteína F BV n.° 541

Los intentos iniciales por expresar la proteína F de longitud completa de HRSV demostraron ser insatisfactorios en conseguir altos niveles de expresión. La secuencia del gen de F usada en la expresión fue la SEQ ID NO: 1 (gen de F de tipo silvestre de HRSV, N.° de acceso a GenBank M1 1486). Codifica un precursor inactivo (Fa) de 574 aa. Este precursor se escinde dos veces por proteasas tipo furina durante la maduración para producir dos polipéptidos unidos por disulfuro, la subunidad F2 desde el extremo N-terminal y F1 desde el extremo C-terminal (Figura 1). Los dos sitios de escisión son en los restos 109 y 136, que están precedidos por motivos de reconocimiento de furina (RARR, aa 106-109 (SEQ ID NO: 23) y KKRKRR, aa 131-136 (SEQ ID NO: 24)). La secuencia del gen de F de la SEQ ID NO: 1 contiene un uso sub-óptimo de codones para la expresión en células de insecto Sf9 y alberga tres errores, que producen una proteína que puede mostrar plegamiento menor del óptimo (SEQ ID NO: 2, N.° de acceso a GenBank AAB59858). Además, se identificó un posible sitio de poli(A) adenilación (ATAAAA) en la región que codifica la subunidad F2. Además, la secuencia génica de F de tipo silvestre es aproximadamente un 65 % rica en AT, mientras que la relación deseada de GT-AT de una secuencia génica en un sistema de expresión de células de insecto Sf9 es aproximadamente 1:1.

En un intento por superar los malos niveles de expresión de la proteína F de HRSV, se diseñó una nueva secuencia génica de F de modo que:

(a) se corrigieran los tres errores de secuenciación de GenBank;

(b) se modificara el sitio críptico de poli(A) en la región que codifica la subunidad de F2;

(c) se optimizaran los codones para el gen de F; y

(d) el gen de F codifique una proteína F modificada con sitio de escisión primario inactivado.

Los tres errores de aminoácido corregidos fueron P102A, I379V, y M447V. El sitio críptico de poli(A) en el gen de F de HRSV se corrigió sin cambiar la secuencia de aminoácidos.

El esquema de optimización de codones se basó en los siguientes criterios: (1) abundancia de aminoacil-ARNt para un codón particular en especies de lepidópteros de células de insecto para un aminoácido dado como se describe por Levin, D.B. et al. (Journal of General Virology, 2000, vol. 81, pág. 2313-2325), (2) mantenimiento de la relación GC-AT en secuencias génicas a aproximadamente 1:1, (3) introducción mínima de estructuras de ADN palindrómicas o de tronco-lazo, y (4) introducción mínima de secuencias de elementos represores de la transcripción y posttranscripción. Se mostró un ejemplo de secuencia génica de F optimizada como la SEQ ID NO: 19 (F del RSVBV n.° 368).

Para inactivar el sitio de escisión primario (1° CS, KKRKRR, aa 131-136) de la proteína F de HRSV, se mutó el sitio de reconocimiento de furina KKQKQQ (SEQ ID NO: 28) o GRRQQR (SEQ ID NO: 29). Se evaluaron varias proteínas F modificadas con dichas mutaciones en el sitio de escisión para determinar la eficacia de la prevención de escisión. La Figura 2 muestra varias de las proteínas F modificadas que se evaluaron. Los resultados indican que el sitio de escisión primario de la proteína F de HRSV puede inactivarse portres cambios conservativos de aminoácido, R133Q, R135Q, y R136Q. estos cambios conservativos de aminoácido de arginina (R) que es una molécula cargada polar, a glutamina (Q) que es una molécula neutra polar, alteró el estado de carga en estos sitios y evitó la escisión por proteasas de tipo furina (véase la Figura 3), conservando aún al mismo tiempo la estructura 3D de la proteína F. La prevención de la escisión en el 1°CS provocó actividad reducida de fusión con la membrana de la proteína F.

Una secuencia génica de ejemplo no limitante de F modificada de HRSV diseñada para tener todas las modificaciones mencionadas anteriormente se muestra en la Figura 4. Este gen F modificado (SEQ ID NO: 5, F del RSVBV n.° 541) codifica una proteína F modificada de la SEQ ID NO: 6. La secuencia génica se sintetizóin vitrocomo oligonucleótidos solapantes, clonados y expresados en células hospedadoras. Se purificó la proteína F modificada de HRSV BV n.° 541 a partir de las recolecciones de cultivo celular de insecto Sf9 infectado, y se analizó por SDS- PAGE teñido por Coomassie. En el Ejemplo 2 se describe el método de purificación y el análisis de SDS-PAGE. El nivel de expresión de la proteína F del RSVBV n.° 541 (por ejemplo, proteína F 541) se mejoró en comparación con la proteína Fo de tipo silvestre en células de insectoSf9.

Ejemplo 4

Proteína F modificada de HRSV con deleción parcial del dominio de fusión de la subunidad F1

Para mejorar adicionalmente la expresión de la proteína F del RSV, se diseñaron genes de F adicionalmente modificados de HRSV que comprendían las siguientes modificaciones:

(a) se corrigieron los tres errores de secuenciación de GenBank;

(b) se modificó el sitio críptico poli(A) en la región que codifica la subunidad de F2;

(c) se optimizaron los codones para el gen de F; y

(d) las secuencias de nucleótidos que codifican el dominio de fusión de la subunidad F1 se delecionaron parcialmente. En un experimento, se delecionó la secuencia de nucleótidos que codifica los primeros 10 aminoácidos del dominio de fusión de la subunidad F1 (correspondiente a los aminoácidos 137-146 de la SEQ ID NO: 2).

Se muestra un gen de F modificado del RSV de ejemplo no limitante que comprende dichas modificaciones en la Figura 5, denominado SEQ ID NO: 9 (F del RSVBV n.° 622, por ejemplo, proteína F 622), que codifica una proteína F modificada de la SEQ ID NO: 10. La proteína F modificada de HRSV BV n.° 622 se purificó a partir de las recolecciones de cultivo celular de insecto Sf9 infectado, y se analizó por SDS-PAGE teñido con Coomassie. El método de purificación y análisis de SDS-PAGE se describe en el Ejemplo 2. Se observaron altos niveles de expresión de proteína F de HRSV BV n.° 622, como se presenta en la SDS-PAGE en la Figura 6.

Ejemplo 5

Proteína F modificada de HRSV con sitio de escisión primario inactivado y también deleción parcial del dominio de fusión F1

Para determinar si la combinación de sitio de escisión primario inactivado y deleción parcial del dominio de fusión F1 puede promover adicionalmente la expresión de la proteína F del RSV , particularmente en las células de insecto Sf9, se diseñó otro gen de F modificado del RSV que comprende las siguientesmodificaciones:

(a) se corrigieron los tres errores de secuenciación de GenBank;

(c) se optimizaron los codones para el gen de F; y

(d) se inactivó el sitio de escisión primario; y

(e) la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de fusión de la subunidad Fl se delecionó parcialmente. En un experimento, se delecionó la secuencia de nucleótidos que codifica los primeros 10 aminoácidos del dominio de fusión de la subunidad F1 (correspondiente a los aminoácidos 137-146 de la SEQ ID NO: 2).

Se muestra un gen de F del RSV modificado de ejemplo no limitante que comprende dichas modificaciones en la Figura 7, denominado SEQ ID NO: 7 (F del RSv Bv n.° 683, por ejemplo, proteína F 683), que codifica la proteína F modificada de la SEQ ID NO: 8. La proteína F modificada del RSVBV n.° 683 (por ejemplo, proteína F 683) se purificó a partir de las recolecciones de cultivo celular de insecto Sf9 infectado y se analizó por SDS-PAGE teñido con Coomassie. El método de purificación y análisis de SDS-PAGE se describe en el Ejemplo 2. Se consiguieron potenciaciones adicionales en los niveles de expresión, como se presenta en la SDS-PAG<e>en la Figura 8.

Ejemplo 6

Expresión y purificación de proteína F modificada de HRSV BV n.° 683

Se expresó la proteína F modificada de HRSV BV n.° 683 (por ejemplo, proteína F 683, SEQ ID NO: 8) en sistema de expresión de baculovirus como se describe en el Ejemplo 1, y se picaron placas recombinantes que expresaban la proteína F de HRSV BV n.° 683 y se confirmaron. El virus recombinante después se amplificó por infección de células de insecto Sf9. Se infectó un cultivo de células de insecto a ~3 MOI (multiplicidad de infección = ffu o pfu/célula de virus) con baculovirus. El cultivo y el sobrenadante se recogieron 48-72 horas postinfección. La recolección en bruto, aproximadamente 30 ml, se aclaró por centrifugación durante 15 minutos a aproximadamente 800 x g. Las recolecciones celulares en bruto resultantes que contenían la proteína F de HRSV BV n.° 683 se purificaron como se describe a continuación.

La proteína F de HRSV BV n.° 683 se purificó a partir de las recolecciones de cultivo celular de insecto Sf9 infectado. Se usó el tensioactivo no iónico Tergitol® NP-9 (Etoxilato de Nonilfenol) para un protocolo de extracción de proteínas de membrana. La extracción en bruto se purificó adicionalmente por pase a través de una cromatografía de intercambio aniónico, afinidad por lectina de lenteja/RIC, y cromatografía de intercambio catiónico.

Se analizó la proteína F purificada de HRSV BV n.° 683 por SDS-PAGE teñido con Coomassie, y transferencia de Western usando anticuerpo monoclonal anti-F del RSV como se ha descrito en el Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la Figura 9. Se consiguieron excelentes niveles de expresión de la proteína F de HRSV BV n.° 683 (por ejemplo, proteína F 683, SEQ ID NO: 8). Se estimó que el nivel de expresión estaba por encima de<10 ml/l en cultivo celular en bruto, y la proteína F recuperada>B<v n.° 683 fue de aproximadamente 3,5 ml/l de>cultivo celular. En algunos casos, se consiguieron niveles de expresión por encima de 20 mg/l y se recuperaron aproximadamente 5 ml/l de proteína F modificada BV n.° 683 (véase la Figura 10). La pureza de la proteína F recuperada BV n.° 683 alcanzó por encima del 98 % como se determina por densitometría de exploración (véase la Figura 10).

Ejemplo 7

Micelas (rosetas) de proteína F purificada del HRSV BV n.°683

Se analizó la proteína F purificada del HRSV BV n.° 683 por microscopia electrónica con tinción negativa (véase la Figura 11). Las proteínas F se agregaron en forma de micelas (rosetas), similares a las observadas para la proteína F de tipo silvestre del HRSV (Calder et al., 2000, Virology 271, pág. 122-131), y otras glucoproteínas de membrana víricas de longitud completa (Wrigley et al., Academic Press, Londres, 1986, vol. 5, pág. 103 163). Bajo el microscopio electrónico, las espigas de F mostraron morfología de varilla con forma de piruleta con sus extremos más anchos proyectándose desde los centros de las rosetas. La longitud del único trímero fue de aproximadamente 20 nm, y el diámetro de la partícula de micela fue de aproximadamente 40 nm (véase la Figura 12). Estos resultados indicaron que la proteína F de HRSV BV n.° 683 ha corregido la estructura 3D para una proteína activa nativa.

En resumen, se ha diseñado, expresado, y purificado una proteína F de HRSV recombinante modificada (por ejemplo, BV n.° 683). Esta proteína F de longitud completa modificada está glucosilada. Las modificaciones del sitio de escisión primario y el dominio de fusión en conjunto potenciaron enormemente el nivel de expresión de proteína F. Además, esta proteína F modificada puede escindirse en las subunidades F1 y F2, que están unidas por disulfuro.

Los trímeros de las subunidades F1 y F2 forman espigas con forma de piruleta de 19,6 nm y partículas de 40,2 nm. Además, esta proteína F modificada se expresa a alto nivel en células de insecto Sf9. Se consiguió pureza de las micelas >98 % después de la purificación. El hecho de que las espigas de esta proteína modificada tuvieran una morfología de piruleta, que puede formar adicionalmente partículas de micelas de 40 nm, indica que la proteína F modificada BV n.° 683 tiene una estructura 3D correcta de una proteína nativa.

Ejemplo 8

Co-expresión de la proteína F modificada de HRSV con proteína M de BRSV y/o proteína N de HRSV en la producción de VLP

La presente divulgación también proporciona VLP que comprenden una proteína F modificada o mutada del RSV. Dichas VLP son útiles para inducir anticuerpos neutralizantes contra antígenos proteicos víricos y por tanto pueden administrarse para establecer inmunidad contra RSV. Por ejemplo, dichas VLP pueden comprender una proteína F modificada del RSV, y proteínas M de BRSV y/o N de HRSV. Los codones de los<genes que codifican proteína M de BRSV (SEQ ID>N<o>:<14) o N de HRSV (SEQ ID NO: 18) pueden optimizarse>para la expresión en células de insecto. Por ejemplo, se muestra una secuencia génica de M de BRSV optimizada en la SEQ ID NO: 13 y se muestra una secuencia génica de N del RSV optimizada en la SEQ ID NO: 17.

En un experimento, se expresaron en solitario una proteína F modificada BV n.° 622 y otra proteína F modificada BV n.° 623 (SEQ ID NO: 21, modificada de modo que estén inactivos ambos sitios de escisión), o se co expresaron con la proteína N de HRSV y la proteína M de BRSV. Ambas recolecciones celulares en bruto que contenían VLP (intracelulares) y sedimentos de VLP recogidos de la separación en gradiente de sacarosa al 30 % se analizaron por SDS-PAGE teñido con Coomassie, y transferencia de Western usando anticuerpo monoclonal anti-F del RSV. La Figura 13 muestra la estructura de las proteínas F modificadas BV n.° 622 y BV n.° 623, y los resultados de SDS-PAGE y análisis de transferencia de Western. BV n.° 622 se expresaba a alto nivel por sí misma o se co-expresaba con la proteína N de HRSV y la proteína M de BRSV, mientras que BV n.° 623 tenía muy mala expresión, lo que indica que la inactivación de ambos sitios de escisión inhibe la expresión de la proteína F.

En otro experimento, se expresaron en solitario la proteína F modificada BV n.° 622, el gen en tándem doble BV n.° 636 (BV n.° 541 M de BRSV), BV n.° 683, BV n.° 684 (BV n.° 541 con el dominio L de YIAL introducido en el extremo C-terminal), y BV n.° 685 (BV n.° 541 con el dominio L de YKKL introducido en el extremo C-terminal) o se co-expresaron con la proteína N de HRSV y la proteína M de BRSV. El dominio L (dominio tardío) es una secuencia conservada en retrovirus, y se presenta dentro de Gag que actúa junto con proteínas celulares para liberar de forma eficaz viriones de la superficie de la célula (Ott et al., 2005, Journal of Virology 79: 9038-9045). La estructura de cada proteína F modificada se muestra en la Figura 14. Ambas recolecciones celulares en bruto que contenían VLP (intracelulares) y sedimentos de VLP recogidos de la separación en gradiente de sacarosa al 30 % se analizaron por SDS-PAGE teñido con Coomassie, y transferencia de Western usando anticuerpo monoclonal anti-F del<r>S<v>. La Figura 14 muestra los resultados de SDS-PAGE y análisis de transferencia de Western de recolecciones celulares en bruto que contenían VLP (intracelulares), y la Figura 15 mostró los resultados de SDS-PAGE y el análisis de transferencia de Western de sedimentos de VLP recogidos de la separación en gradiente de sacarosa al 30 %. BV n.° 622 y BV n.° 683 se expresaron a alto nivel por sí mismas o se co-expresaron con la proteína N del HRSV y la proteína M del BRSV, mientras que BV n.° 636, BV n.° 684, y BV n.° 685 tuvieron mala expresión.

Ejemplo 9

Detección de proteínas F quiméricas de HRSV con alta expresión

Se hicieron esfuerzos por detectar proteínas F adicionales del RSV que pudieran expresarse en alto nivel en forma soluble en células de insecto y puedan formar VLP con mejor rendimiento. Se diseñaron diversos genes de F, se expresaron y analizaron. Se usaron tanto transferencia de Western como SDS-PAGE para evaluar la expresión.

La Figura 16a a Figura 16d resumen la estructura, nombre del clon, descripción, resultados de transferencia de Western/análisis de Coomassie y conclusión para cada clon de F quimérico de HRSV.

Como indicaron los resultados, la proteína F de longitud completa de tipo silvestre se expresaba poco; las proteínas F quiméricas de HRSV que contenían la subunidad F1 pero no F2 podían expresarse bien, pero los productos eran insolubles, lo que podía deberse a mal plegamiento, o no podían ensamblarse con otras proteínas víricas para formar VLP con buen rendimiento después de co-infecciones. La inactivación del sitio de escisión primario en solitario no produjo aumentos sustanciales en la expresión, pero se consiguió una mejor expresión cuando la inactivación del sitio de escisión primario se combinaba con otra modificación tal como deleción del sitio críptico poli (A) y corrección de los errores de aa de GenBank (por ejemplo, BV n.° 541). La introducción del dominio L de YKK<l>en el extremo C-terminal de BV n.° 541 potenció la secreción de VLP que contenían proteína F modificada en aproximadamente 2-3 veces en co-expresión con proteínas M de BRSV y N de HRSV. Los resultados demostraron adicionalmente que un gen quimérico en tándem doble que consistía en el gen BV n.° 541 y el gen de M de BRSV presentaba tanto rendimiento intracelular como de VLP mejorado en comparación con co-infección de BV n.° 541 y proteínas M de BRSV, lo que indica que la proteína M de BRSV puede facilitar la producción de VLP que contienen proteína F modificada de HRSV en células de insecto cuando se expresan en tándem. Un gen quimérico en tándem triple que consiste en BV n.° 541, M de BRSV, y N de HRSV tuvieron rendimiento intracelular incluso mayor y de VLP mucho mejor en comparación con el gen quimérico en tándem doble mencionado anteriormente o co-infección de BV n.° 541, proteínas M de BRSV y N de HRSV. Además, los resultados sugirieron que la proteína F quimérica de HRSV BV n.° 683 (por ejemplo, proteína F 683, SEQ ID NO: 8) tuvo la mejor expresión intracelular. La expresión de un gen quimérico en tándem doble que consistía en BV n.° 683 y genes de M de BRSV, o un gen quimérico en tándem triple que consistía en BV n.° 683, genes de M de BRSV, y N de HRSV también está incorporada en este documento. Estos genes quiméricos en tándems dobles y triples deben mejorar adicionalmente la producción de VLP en comparación con co-infección.

Ejemplo 10

Ensayo de neutralización del RSV y estudios de exposición a RSV en ratones

Para ensayar la eficacia de una vacuna que comprende proteína F modificada de HRSV BV n.° 683 en impedir la infección por HRSV, se realizó un ensayo de neutralización y estudios de exposición a RSV en ratones. Los procedimientos experimentales se muestran en la Figura 17.

Se inyectó a grupos de ratones (n=10) por vía intramuscular (excepto para RSV vivo) con placebo (solución de<p>B<s>), RSV vivo (dado por vía intranasal), vacuna del RSV inactivada con formalina (FI-RSV), 1 ug de partículas F purificadas ((PFP, proteína F modificada BV n.° 683), 1 ug de partículas F purificadas con Alumbre (PFP Alumbre), 10 ug de partículas F purificadas, 10 ug de partículas F purificadas con Alumbre (PFP Alumbre), o 30 ug de partículas F purificadas en el día 0 y el día 21. Cada grupo inmunizado se expuso a RSV vivo en el día 42 (21 días después de la segunda inmunización). Se recogió suero de ratón de cada grupo en el día 0, el día 31 (10 días después de la segunda inmunización), y el día 46 (4 días después de la exposición con RSV vivo).

Se ensayó el suero de ratón para cada grupo de tratamiento para la presencia de anticuerpos neutralizantes anti- RSV. Se incubaron diluciones de suero de ratones inmunizados con RSV infeccioso en placas de microtitulación de 96 pocillos. El suero se diluyó de 1:20 a 1:2560. Se mezclaron 50 ul de suero diluido con 50 ul de virus RSV vivo (400 pfu) en cada pocillo. La mezcla de virus/suero se incubó primero durante 60 minutos a temperatura ambiente, y después se mezcló con 100 ul de células HEp-2 y se incubaron durante 4 días. La cantidad de placas de virus infeccioso se contó entonces después de teñirse con violeta cristal. El título de neutralización para cada muestra de suero se definió como la inversa de la dilución más alta de suero que producía un 100 % de neutralización del RSV (por ejemplo, sin placas) y se determinó para cada animal. La media geométrica del título de anticuerpos neutralizantes en suero en el día 31 (10 días después del refuerzo) y el día 46 (4 días después de la exposición con RSV vivo) se representaron en gráfico para cada grupo de vacuna. La Figura 18 muestra los resultados de ensayos de neutralización. Los resultados indican que 10 ug o 30 ug de proteína F purificada producen un título de neutralización mucho mayor en comparación con RSV vivo. Además, los títulos de neutralización de PFP se potencian con coadministración de adyuvante Alumbre.

Se realizaron estudios de exposición a RSV para determinar si la inmunización podía prevenir y/o inhibir la replicación del RSV en los pulmones de animales inmunizados. Se determinó la cantidad del RSV en los pulmones de ratones inmunizados por ensayo de placa usando células HEp-2. Se infectaron grupos inmunizados de ratones mencionados anteriormente con 1 x 106 pfu de la cepa larga del RSV infecciosa por vía intranasal en el día 42 (11 días después de la segunda inmunización). En el día 46 (4 días después de la infección con RSV), se retiraron los pulmones de los ratones, se pesaron, y se homogeneizaron. Se aclaró el tejido de pulmón homogeneizado. El sobrenadante de la solución aclarada se diluyó y se sometió a ensayo de placa usando células HEp-2 para determinar el título del RSV en tejido pulmonar (calculado como puf/g de tejido pulmonar). Los resultados se muestran en la Figura 19, que indican que todos los ratones inmunizados con proteína F recombinante del RSVBV n.° 683 obtuvieron RSV indetectable en los pulmones, e incluso 1 ug de proteína F recombinante purificada de HRSV BV n.° 683 sin adyuvante mostró excelente eficacia en la inhibición de la replicación del RSV (reducida más de 1000 veces en comparación con el placebo).

Para determinar la estabilidad de la vacuna del RSVPFP usada anteriormente, la vacuna se almacenó a 2-8 °C durante 0, 1,2, 4, y 5 semanas, y después se analizó por SDS-PAGE teñida con Coomassie (Figura 20). Los resultados muestran que esta vacuna del RSVPFP es muy estable a 2-8 °C y no existe degradación detectable.

Ejemplo 11

Actividad de micela F recombinante del RSV en ratas del algodón

En este ejemplo, los grupos de animales incluían inmunización en los días 0 y 21 con RSV vivo (RSV), RSV inactivado con formalina (FI-RSV), proteína F del RSVBV n.° 683 con y sin aluminio (PPP y PFP adyuvante de aluminio), y controles de PBS.

Como se muestra en la Figura 21, la inmunización con 30 ug de vacuna de micela F (proteína F del RSVBV n.° 683, es decir proteína F 683, SEQ ID NO: 8), con y sin aluminio produjo robustas respuestas de anticuerpos neutralizantes después de exposición a RSV A y RSV B. Además, se observó que el aluminio potencia significativamente la respuesta de anticuerpos. Además, se aumentaron los anticuerpos neutralizantes después de un refuerzo en el día 46 o día 49 en RSV A y RSV B, respectivamente.

Aunque se observó patología pulmonar significativa en ratas inmunizadas con RSV inactivado con formalina (FI- RSV), no se observó potenciación de la enfermedad con la vacuna de micela F (Figura 22). El uso de la vacuna de micela F y la vacuna de micela F con adyuvante produjo valores de inflamación inferiores (4,0 y 2,8 respectivamente) que la infección primaria por RSV (exposición a PBS RSV) del grupo de control (5,8). Como se ha indicado anteriormente, el grupo tratado con FI-RSV obtuvo un valor de inflamación más alto que la infección primaria por RSV (exposición a PBS RSV) del grupo de control (9,0 frente a 5,8). Además, el grupo tratado con FI- RSV obtuvo un valor medio de inflamación significativamente más alto (9,0) que los controles de placebo no expuestos, exposición a RSV vivo RSV, exposición a micela F RSV, y exposición a micela F aluminio RSV.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una glicoproteína de fusión (F) del virus respiratorio sincitial (RSV) que comprende: (a) transformar una célula huésped de insecto con un baculovirus para expresar un ácido nucleico que codifica una glicoproteína F del RSV que consiste en la secuencia de SEQ ID NO:8; y

(b) cultivar la célula huésped bajo condiciones propicias para la producción de la glicoproteína F del RSV.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el método comprende además:

purificar la glicoproteína F del RSV.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la célula de insecto es una célula Sf9.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha célula huésped se transfecta con un vector de baculovirus que comprende un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID NO:7.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la glicoproteína F del RSV se escinde en subunidades F1 y F2 que están unidas por disulfuro.

6. El método de cualquiera una de las reivindicaciones 2 a 5, en el que la purificación de la glicoproteína F del RSV se realiza mediante cromatografía de intercambio iónico o filtración en gel.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 5, en el que el método comprende además: (c) recolectar el sobrenadante de la célula de insecto y clarificar el sobrenadante mediante centrifugación; (d) extraer la glicoproteína F del RSV utilizando etoxilato de nonilfenol (NP-9) en el que la glicoproteína F del RSV se escinde en subunidades F1 y F2 que están unidas por disulfuro; y

(e) purificar la glicoproteína F del RSV haciéndola pasar por cromatografía de intercambio aniónico, una columna de afinidad de lectina de lenteja y cromatografía de intercambio catiónico.