ES2986113T3 - Nuevos polinucleótidos que codifican una proteína FKRP humana - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a polinucleótidos sintéticos que codifican una proteína relacionada con fukutina humana (FKRP), en la que dichos polinucleótidos contienen al menos una transcripción suplementaria que evita la mutación generada a partir de codones de inicio de desplazamiento del marco de lectura. Dichos polinucleótidos son útiles, especialmente, para tratar una patología relacionada con una deficiencia de FKRP o inducida por un defecto en la glicosilación de α-distroglicano (α-DG), como LGMD2I. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevos polinucleótidos que codifican una proteína FKRP humana

La presente solicitud proporciona un producto de terapia génica eficaz para tratar patologías inducidas por un defecto en la glucosilación del a-distroglicano (a-DG). Se refiere a polinucleótidos que codifican una proteína humana relacionada con la fukutina (FKRP) y que contienen mutaciones que evitan las transcripciones suplementarias generadas a partir de codones de inicio con desplazamiento de marco. Con dichos polinucleótidos se observa un mayor nivel de expresión de FKRP, lo que ofrece una valiosa herramienta terapéutica para el tratamiento de diversas enfermedades relacionadas con deficiencias de FKRP, como la distrofia muscular de cinturas tipo 21 (LGMD2I).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las "distroglicanopatías" reagrupan diferentes patologías genéticas que conducen a una glicosilación secundaria aberrante del a-distroglicano (a-DG). Esta proteína, presente sobre todo en los tejidos musculares esqueléticos, cardíacos, oculares y cerebrales, es una proteína de membrana hiperglucosilada, cuyo proceso de glucosilación eleva su peso de 70 a 156 kDa en el músculo. Es parte del complejo distrofina-glicoproteína que conecta el citoesqueleto a la matriz extracelular (ECM). Su alto nivel de glicosilación permite la unión directa de la a-DG a los dominios globulares de la laminina de algunas proteínas de la ECM, como la laminina en los músculos cardíaco y esquelético, la agrina y el perlecan en la unión neuromuscular, la neurexina en el cerebro y la pikachurina en la retina. La glucosilación de la a-DG es un proceso complejo que aún no se conoce del todo. De hecho, se han identificado varios genes implicados en la glicosilación de a-DG. Estos descubrimientos se han acelerado recientemente gracias al uso de procedimientos de secuenciación de alto rendimiento para la detección de mutaciones en pacientes que presentan defectos de glicosilación a-DG. Una de estas proteínas es la Proteína Relacionada con la Fukutina (FKRP). Originalmente se clasificó como una a-DG glicosiltransferasa putativa debido a la presencia en su secuencia de un motivo DxD, común a muchas glicosiltransferasas, y a la evidencia de hipoglicosilación de a-DG en pacientes con mutaciones en el genFKRP(Breton etal.,1999; Brockingtonet al.,2001). Recientemente, FKRP y su homóloga fukutina fueron identificadas como ribitol-5-fosfato (Rbo5P) transferasas, formando un enlace di-Rbo5P necesario para la adición de la fracción de unión del ligando (Kanagawaet. al,2016).

Las mutaciones en el genFKRPpueden generar toda la gama de patologías inducidas por un defecto en la glicosilación de a-DG, desde la distrofia muscular de cinturas tipo 21 (LGMD2I; Muller et al., 2005); la distrofia muscular congénita tipo 1C (MDC1C; Brockingtonet al.,2001) hasta el síndrome de Walker-Warburg (WWS) y la enfermedad músculo-ojo-cerebro (MEB; Beltran-Valero de Bernabeet al.,2004). Existe una correlación inversa entre la gravedad de la enfermedad y el número de pacientes; cuanto más graves, más raros (prevalencia indicada en www.orphanet.fr: WWS (todos los genes): 1-9/1.000.000 y LGMD2I: 1-9/100.000). El tipo de patología parece, al menos parcialmente, correlacionado con la naturaleza de la mutaciónFKRP.En particular, la mutación homocigota L276I, que sustituye una leucina por una isoleucina en la posición 276 de la proteína, se asocia siempre con LGMD2I (Mercuriet al.,2003). La LGMD2I es una distrofia muscular autosómica recesiva que afecta preferentemente, aunque de forma heterogénea, a los músculos del hombro y de la cintura pélvica. Es una de las LGMD2 más frecuentes en Europa, especialmente debido a la alta prevalencia de la mutación L276I en el norte de Europa (Sveenet al.,2006). La gravedad de la patología es muy heterogénea. Los síntomas musculares pueden aparecer entre la primera y la tercera décadas, y varían desde una enfermedad similar a la de Duchenne hasta cursos relativamente benignos. El corazón también puede verse afectado, con consecuencias como insuficiencia cardíaca grave y muerte (Mulleret al.,2005). Las investigaciones mediante resonancia magnética cardiaca sugieren que una proporción muy elevada de pacientes con LGMD2I (60-80%) pueden presentar disfunción miocárdica, como una fracción de eyección reducida (Wahbiet al.,2008). Curiosamente, la gravedad de las anomalías cardíacas no está correlacionada con la afectación del músculo esquelético.

Gicquelet al.(Hum Mol Genet, 2017 Mar 3. doi: 10.1093/hmg/ddx066) informaron de la generación de un modelo de ratón FKRPL2761 en el que se evaluó la transferencia por virus adenoasociado recombinante (rAAV2/9) del genFkrpmurino, colocado bajo el control del promotor de la desmina y de la señal de poliadenilación (polyA) del gen de la betahemoglobina (HBB2). Tras la administración intramuscular o intravenosa, se observó una mejora de la patología muscular. Obtuvieron una fuerte expresión de FKRP, tanto a nivel de ARNm como de proteínas, y demostraron el rescate de la glicosilación adecuada de a-DG y el aumento de la unión a laminina, que condujeron al rescate histológico y funcional de la distrofia.

El documento WO2016/138387 propuso reducir el contenido de GC de la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre que codifica la FKRP entre un 5% y un 10% aproximadamente para aumentar la expresión de la FKRP. Proporciona un polinucleótido sintético denominado SEQ ID NÚM.: 1 con un contenido de GC reducido en un 9,99% en comparación con la secuencia de tipo silvestre.

Por lo tanto, la terapia de sustitución génica basada enFKRPaparece como un tratamiento prometedor de las patologías derivadas de una deficiencia de FKRP. Sin embargo, sigue siendo necesario mejorar los tratamientos.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente solicitud tiene por objeto aliviar o curar las patologías devastadoras vinculadas a una deficiencia de proteína relacionada con la fukutina (FKRP), como la distrofia muscular de cinturas tipo 21 (LGMD2I), proporcionando una proteína FKRP humana nativa codificada por un transgén modificado que permite un mayor nivel de expresión de FKRP.

La presente solicitud ofrece un producto prometedor de terapia génica basado en una secuencia optimizada porFKRP.La presente solicitud informa de un mayor nivel de FKRP en comparación con el obtenido con la secuencia de codificación nativa, cuando los polinucleótidos reivindicados encapsulados en un vector AAV9 se inyectan intramuscularmente en ratones.

Definiciones

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que comúnmente se entiende por una persona con conocimientos ordinarios en la materia. La terminología empleada en la descripción tiene por objeto describir únicamente determinadas realizaciones y no pretende ser limitativa.

Los artículos "un" y "una" se utilizan en la presente memoria para referir a uno o a más de uno (es decir, al menos a uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

"Alrededor" o "aproximadamente", tal como se utiliza en la presente memoria al referirse a un valor mensurable como una cantidad, una duración temporal, y similares, se entiende que abarca variaciones de ±20% o ±10%, más preferentemente ±5%, aún más preferentemente ±1%, y aún más preferentemente ±0,1% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para llevar a cabo los procedimientos desvelados.

Intervalos: a lo largo de esta divulgación, varios aspectos de la invención pueden presentarse en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha revelado específicamente todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo como de 1 a 6 debe considerarse que ha revelado específicamente subintervalos como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1,2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

"Aislado" significa alterado o alejado del estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido presente de forma natural en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo ácido nucleico o péptido separado parcial o totalmente de los materiales coexistentes de su estado natural sí está "aislado" Un ácido nucleico o una proteína aislados pueden existir en forma sustancialmente purificada, o pueden existir en un entorno no nativo como, por ejemplo, una célula huésped.

En el contexto de la presente invención, se utilizan las siguientes abreviaturas para las bases de ácidos nucleicos más comunes. "A" se refiere a la adenosina, "C" a la citosina, "G" a la guanosina, "T" a la timidina y "U" a la uridina.

Una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas unas de otras y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos de la frase que codifica una proteína o un ARN o un ADNc también puede incluir intrones en la medida en que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede contener en alguna versión un intrón o intrones.

"Codificación" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, como un gen, un ADNc o un ARNm, de servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos(es decir,ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes. Por lo tanto, un gen codifica una proteína si la transcripción y traducción del ARNm correspondiente a ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena de codificación, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia del ARNm y suele proporcionarse en listados de secuencias, como la cadena no de codificación, utilizada como molde para la transcripción de un gen o ADNc, pueden denominarse de codificación de la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.

El término "codón de inicio" designa el primer codón de un transcrito de ARN mensajero (ARNm) traducido por un ribosoma. El codón de inicio siempre codifica metionina en eucariotas. El codón de inicio más común es AUG. En consecuencia, en la cadena de codificación (o cadena de sentido o cadena no de codificación) del ADN, la secuencia del codón de inicio es ATG. El anticodón correspondiente en la cadena no de codificación (o cadena antisentido o cadena antide codificación o cadena molde o cadena transcrita) es CAT. En el resto de la descripción, el término "codón de inicio" también se utiliza en relación con el ADN.

El término "polinucleótido", tal y como se utiliza en la presente memoria, se define como una cadena de nucleótidos que puede ser monocatenaria (ss) o bicatenaria (ds). Además, los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. Por lo tanto, los ácidos nucleicos y los polinucleótidos utilizados en la presente memoria son intercambiables. Un experto en la técnica sabe que los ácidos nucleicos son polinucleótidos que pueden hidrolizarse en "nudeótidos" monoméricos Los nudeótidos monoméricos pueden hidrolizarse en nucleósidos. Tal como se utilizan en la presente memoria, los polinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, todas las secuencias de ácido nucleico que se obtienen por cualquier medio disponible en la técnica, incluyendo, sin limitación, medios recombinantes, es decir, la clonación de secuencias de ácido nucleico a partir de una biblioteca recombinante o un genoma celular, utilizando tecnología de clonación ordinaria y PCR y similares, y por medios sintéticos.

En la presente memoria, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente y se refieren a un compuesto formado por residuos de aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. Una proteína o un péptido deben contener al menos dos aminoácidos, y no se impone ninguna limitación al número máximo de aminoácidos que pueden componer la secuencia de una proteína o un péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término se refiere tanto a cadenas cortas, que también se denominan comúnmente en la técnica péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, que generalmente se denominan en la técnica proteínas, de las que hay muchos tipos. "Polipéptidos" incluye, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos o una combinación de los mismos.

Una proteína puede estar "alterada" y contener deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que produzcan un cambio silencioso y den lugar a un equivalente funcional. Se pueden realizar sustituciones deliberadas de aminoácidos con base en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos, a condición de que se mantenga la actividad biológica. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente pueden incluir el ácido aspártico y el ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente pueden incluir la lisina y la arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polares no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares pueden incluir la leucina, la isoleucina y la valina, la glicina y la alanina, la asparagina y la glutamina, la serina y la treonina, y la fenilalanina y la tirosina.

Una "variante", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una secuencia de aminoácidos que está alterada por uno o más aminoácidos. La variante puede tener cambios "conservadores", en los que un aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares, por ejemplo, la sustitución de leucina por isoleucina. Una variante también puede tener cambios "no conservadores", por ejemplo, la sustitución de una glicina por un triptófano. Las variaciones menores análogas también pueden incluir deleciones o inserciones de aminoácidos, o ambas. Para determinar qué residuos de aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o eliminarse sin suprimir la actividad biológica o inmunológica, pueden utilizarse programas informáticos bien conocidos en la técnica.

"Idéntico" u "homólogo" se refiere a la identidad de secuencia o similitud de secuencia entre dos polipéptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. Cuando una posición en las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma base o subunidad monomérica de aminoácidos, por ejemplo, si una posición en cada una de dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces las moléculas son homólogas o idénticas en esa posición. El porcentaje de homología/identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones coincidentes compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas X 100. Por ejemplo, si 6 de cada 10 posiciones de dos secuencias coinciden, entonces las dos secuencias son idénticas en un 60%. Por lo general, la comparación se realiza cuando dos secuencias se alinean para obtener la máxima homología/identidad.

Un "vector" es una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que puede utilizarse para administrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. En la técnica se conocen numerosos vectores, entre los que se incluyen polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados a compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Por lo tanto, el término "vector" incluye un plásmido de replicación autónoma o un virus. El término también debe interpretarse para incluir compuestos no plasmídicos y no virales que facilitan la transferencia de ácido nucleico a las células, como, por ejemplo, compuestos de polilisina, liposomas y similares. Los ejemplos de vectores virales incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociados, vectores retrovirales y similares.

"Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante con secuencias de control de la expresión enlazadas operativamente a una secuencia de nucleótidos que debe expresarse. Un vector de expresión comprende suficientes elementos de acción cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula huésped o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.

El término "promotor", tal como se utiliza en la presente memoria, se define como una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, necesaria para iniciar la transcripción específica de una secuencia polinucleotídica.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "secuencia promotora/reguladora" hace referencia a una secuencia de ácido nucleico necesaria para la expresión de un producto génico vinculado de forma operativa a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora central y, en otros casos, esta secuencia también puede incluir una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores, que son necesarios para la expresión del producto génico. La secuencia promotora/reguladora puede ser, por ejemplo, una que exprese el producto génico de forma específica para un tejido.

Un promotor "constitutivo" es una secuencia de nucleótidos que, cuando se une de forma operativa a un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula en la mayoría o en todas las condiciones fisiológicas de la célula.

Un promotor "inducible" es una secuencia de nucleótidos que, cuando se enlaza de forma operativa con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente sólo cuando un inductor que corresponde al promotor está presente en la célula.

Un promotor "específico de un tejido" es una secuencia de nucleótidos que, cuando se enlaza de forma operativa con un polinucleótido que codifica o especifica un gen, hace que el producto génico se produzca en una célula preferentemente si ésta es una célula del tipo de tejido correspondiente al promotor.

El término "anormal", cuando se utiliza en el contexto de organismos, tejidos, células o componentes de los mismos, se refiere a aquellos organismos, tejidos, células o componentes de los mismos que difieren en al menos una característica observable o detectable (por ejemplo, edad, tratamiento, hora del día, etc.) de aquellos organismos, tejidos, células o componentes de los mismos que muestran la característica respectiva "normal" (esperada). Las características que son normales o esperadas para un tipo de célula o tejido pueden ser anormales para otro tipo de célula o tejido.

Los términos "paciente", "sujeto", "individuo" y similares se utilizan indistintamente en la presente memoria y se refieren a cualquier animal, o células del mismo, ya seain vitrooin situ,susceptible de ser sometido a los procedimientos descritos en la presente memoria. Un individuo puede ser un mamífero, por ejemplo un ser humano, un perro, pero también un ratón, una rata o un primate no humano. En ciertas realizaciones no limitantes, el paciente, sujeto o individuo es un ser humano.

Una "enfermedad" o una "patología" es un estado de salud de un individuo en el que éste no puede mantener la homeostasis y en el que, si no se mejora la enfermedad, la salud del individuo sigue deteriorándose. Por el contrario, un "trastorno" en un individuo es un estado de salud en el que el individuo es capaz de mantener la homeostasis, pero en el que el estado de salud del individuo es menos favorable de lo que sería en ausencia del trastorno. Si no se trata, un trastorno no provoca necesariamente una mayor disminución del estado de salud del individuo.

Una enfermedad o trastorno se "alivia" o "mejora" si se reduce la gravedad de un síntoma de la enfermedad o trastorno, la frecuencia con la que el paciente experimenta dicho síntoma, o ambas cosas. Esto incluye también detener la progresión de la enfermedad o trastorno. Una enfermedad o trastorno se "cura" si se elimina la gravedad de un síntoma de la enfermedad o trastorno, la frecuencia con la que el paciente experimenta dicho síntoma, o ambas cosas.

Un tratamiento "terapéutico" es un tratamiento administrado a un individuo que presenta signos de patología, con el fin de disminuir o eliminar dichos signos. Un tratamiento "profiláctico" es un tratamiento administrado a un individuo que no presenta signos de patología o al que aún no se le ha diagnosticado la patología, con el fin de prevenir o posponer la aparición de dichos signos.

Como se utiliza en la presente memoria, "tratar una enfermedad o trastorno" significa reducir la frecuencia o gravedad de al menos un signo o síntoma de una enfermedad o trastorno experimentado por un individuo. Enfermedad y trastorno se utilizan indistintamente aquí en el contexto del tratamiento.

Una "cantidad eficaz" de un compuesto es aquella cantidad de compuesto que es suficiente para proporcionar un efecto beneficioso al individuo al que se administra el compuesto. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una cantidad que es suficiente o eficaz para prevenir o tratar (retrasar o impedir la aparición, impedir la progresión, inhibir, disminuir o invertir) una enfermedad o afección, incluido el alivio de los síntomas de dichas enfermedades. Una "cantidad eficaz" de un vehículo de administración es la cantidad suficiente para unir o administrar eficazmente un compuesto.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en el descubrimiento de que la supresión de codones de inicio de cambio de marco suplementarios contenidos en la región de codificación de la proteína relacionada con Fukutina (FKRP) aumenta la expresión de FKRP.

En consecuencia, en un aspecto, la solicitud desvelad un polinucleótido sintético que codifica un FKRP humano, en el que dicho polinucleótido contiene al menos una mutación que evita transcripciones suplementarias generadas a partir de codones de inicio con desplazamiento de marco.

De acuerdo con la divulgación, el polinucleótido sintético comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica un FKRP humano funcional.

En una realización, el polinucleótido que codifica el FKRP humano, también denominado ORF por "marco de lectura abierto (open reading frame)", es un ADNc. No obstante, pueden utilizarse, por ejemplo, ADN o ARN monocatenario o bicatenario.

En el marco de la invención, una proteína FKRP humana es una proteína que consiste en o comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NÚM.: 1 (correspondiente a una proteína de 495 aa).

De acuerdo con realizaciones específicas de la divulgación, una FKRP humana funcional es una proteína que tiene las mismas funciones que la FKRP humana nativa codificada por SEQ ID NÚM.: 1, especialmente la capacidad de glicosilar a-distroglicano (a-DG) y/o aliviar, al menos parcialmente, uno o más de los síntomas asociados con un defecto en FKRP, especialmente el fenotipo LGMD2I como se ha descrito anteriormente. Puede ser un fragmento y/o un derivado del mismo. De acuerdo con una realización, dicha secuencia FKRP tiene una identidad mayor o igual al 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 99% con la secuencia SEQ ID NÚM.: 1.

Como es conocido en la técnica, la secuencia humana nativa que codifica la proteína humana FKRP de secuencia SEQ ID NÚM.: 1 tiene la secuencia SEQ ID NÚM.: 2.

La presente divulgación excluye la secuencia nativa SEQ ID NÚM.: 2 y se centra en las secuencias que codifican SEQ ID NÚM.: 1 pero diferente de SEQ ID NÚM.: 2. Más precisamente, el polinucleótido nativo (SEQ ID NÚM.: 2) se ha modificado u optimizado: Con base en la degeneración del código genético, una o más bases de la secuencia nativa (SEQ ID NÚM.: 2) se han sustituido por otras bases sin modificar la secuencia de aminoácidos resultante (SEQ ID NÚM.: 1). En otras palabras, la presente divulgación proporciona un polinucleótido sintético, es decir, un polinucleótido que no es de origen natural, ventajosamente optimizado.

De acuerdo con otra realización específica, un polinucleótido sintético de acuerdo con la divulgación no consiste en o comprende la secuencia SEQ ID NÚM.: 20, o cualquier secuencia que tenga al menos un 90% de identidad con ella.

Preferentemente, el polinucleótido sintético que codifica un FKRP humano es aproximadamente un 60% homólogo/idéntico, más preferentemente aproximadamente un 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 88%, 89% o aproximadamente un 90%, 91%, 92%, 93%, 94% homólogo/idéntico, aún más preferentemente, alrededor del 95% homóloga/idéntica, y aún más preferentemente alrededor del 96%, 97%, 98% o incluso 99% homóloga/idéntica a una secuencia nucleotídica de un ácido nucleico aislado que codifica un FKRP humano funcional (preferentemente de secuencia SEQ ID NÚM.: 1), especialmente de la secuencia SEQ ID NÚM.: 2. Como se ha mencionado anteriormente, dicho polinucleótido no comprende o no consiste en la secuencia SEQ ID NÚM.: 2.

Como se sabe en la técnica, una secuencia de codificación puede contener codones de inicio de cambio de marco en sentido o antisentido, lo que puede generar productos de transcripción alternativos o suplementarios. Por ejemplo, la secuencia de codificación puede contener más ATG en el caso de codones de inicio en sentido, o CAT en el caso de un codón de inicio en antisentido. De acuerdo con una realización específica, estos codones de inicio están desplazados, es decir, generan Marcos de Lectura Abiertos (ORF) alternativos que no están en fase/marco con la secuencia de codificación del FKRP humano, sino desplazados un nucleótido ("fase/marco 1") o 2 nucleótidos ("fase/marco 2"). En otras palabras, el codón o codones de inicio denominados "frameshiff ' se encuentran en uno de los marcos alternativos de la secuencia de codificación FKRP.

En el caso específico de SEQ ID NÚM.: 2:

El ORF principal comienza en la posición 1 con un ATG (nucleótidos 1 a 3 de SEQ ID NÚM.: 2) que codifica una Metionina (M o Met); el ORF correspondiente está compuesto por 1488 bases o nucleótidos, codifica una proteína de 495 aa y termina por un codón de parada TGA. Otros ORF en fase, es decir, en marco, comienzan en las posiciones 430 (nucleótidos 430 a 432 de SEQ ID NÚM.: 2) y 1279 (nucleótidos 1279 a 1281 de SEQ ID NÚM.: 2) con un ATG que codifica una metionina

(M o Met). Sin embargo, no es posible cambiarlos ya que ningún otro codón que no sea ATG codifica para una metionina de forma clásica.

En la fase 1, hay 4 codones de inicio capaces de generar transcritos suplementarios:

- CAT en la posición 429 (nucleótidos 429 a 431 de SEQ ID NÚM.: 2), 819 (nucleótidos 819 a 821 de SEQ ID NÚM.: 2) y 1431 (nucleótidos 1431 a 1433 de SEQ ID NÚM.: 2) correspondiente a ATG en la dirección antisentido;

- ATG en la posición 545 (nucleótidos 545 a 547 de SEQ ID NÚM.: 2), en la dirección del sentido.

No hay ningún codón de inicio potencial (sentido o antisentido) en la fase/trama 2.

De acuerdo con la invención, se introduce al menos un cambio de base para mutar el codón de inicio pero sin cambiar los aminoácidos codificados.

De acuerdo con una realización de la divulgación, el polinucleótido tiene un codón de inicio mutado, estando dicho codón de inicio situado en la posición 429 ("429-431"), o 545 ("545-547"), o 819 ("819-821"), o 1431 ("1431-1433") de la secuencia SEQ ID NÚM.: 2.

En una realización preferente de la divulgación, el polinucleótido tiene al menos un codón de inicio mutado, estando dicho codón de inicio situado en la posición 819 ("819-821") de la secuencia SEQ ID NÚM.: 2.

De acuerdo con otra realización de la divulgación, el polinucleótido tiene al menos dos (2) codones de inicio mutados, estando dichos codones de inicio situados en la posición 429 y 545, o 429 y 819, o 429 y 1431, o 545 y 819 o 545 y 1431, o 819 y 1431 de la secuencia SEQ ID NÚM.: 2. Ventajosamente, los codones de inicio mutados se localizan en las posiciones 429 y 819, 545 y 819, u 819 y 1431 de la secuencia SEQ ID NÚM.: 2.

De acuerdo con otra realización de la divulgación, el polinucleótido tiene al menos tres (3) codones de inicio mutados, estando dichos codones de inicio situados en la posición 429 y 545 y 819, o 429 y 545 y 1431, o 429 y 819 y 1431, o 545 y 819 y 1431 de la secuencia SEQ ID NÚM.: 2, ventajosamente en las posiciones 429, 819 y 1431 de la secuencia SEQ ID NÚM.: 2. Más ventajosamente, el polinucleótido consiste o comprende la secuencia<s>E<q>ID NÚM.: 4, o SEQ ID NÚM.: 7, o SEQ ID NÚM.: 8.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido sintético que codifica una proteína humana relacionada con la fukutina (FKRP) que consiste en o comprende la secuencia SEQ ID NÚM.: 1, que tiene mutaciones que evitan transcritos suplementarios generados a partir de codones de inicio con desplazamiento de marco, en el que el polinucleótido tiene al menos 3 codones de inicio mutados, estando dichos codones de inicio situados en la posición 429, 819 y 1431 de la secuencia SEQ ID NÚM.: 2.

De acuerdo con una realización específica de la invención, el polinucleótido consiste o comprende la secuencia SEQ ID NÚM.: 4, o una secuencia que tenga al menos un 90% de identidad con SEQ ID NÚM.: 4, ventajosamente SEQ ID NÚM.: 7 o SEQ ID NÚM.: 8.

De acuerdo con otra realización de la invención, el polinucleótido tiene cuatro (4) codones de inicio mutados, estando dichos codones de inicio situados en las posiciones 429 y 545 y 819 y 1431 de la secuencia SEQ ID NÚM.: 2. Ventajosamente, el polinucleótido consiste o comprende la secuencia SEQ ID NÚM.: 6, o una secuencia que tenga al menos un 90% de identidad con SEQ ID NÚM.: 6, como SEQ ID NÚM.: 3 o SEQ ID NÚM.: 5.

La modificación del codón de inicio puede resultar de 1, 2 o 3 mutaciones en dicho codón. Como ya se ha mencionado, dichas mutaciones no deben cambiar la secuencia codificada.

La supresión del codón de inicio antisentido situado en la posición 429 ("429-431") puede resultar, por ejemplo, del cambio de la base C situada en la posición 429 en G o A. Como consecuencia, el "CAT" (ATG en la dirección antisentido) se convierte en "GAT" (ATC en la dirección antisentido) o "AAT" (ATT en la dirección antisentido), lo que ya no corresponde a un codón de inicio en la dirección antisentido pero no cambia la secuencia de aminoácidos correspondiente.

La supresión del codón de inicio en el sentido situado en la posición 545 ("545-547") puede resultar, por ejemplo, del cambio de la base T situada en la posición 546 en C. Como consecuencia, la "ATG" se convierte en "ACG", que ya no corresponde a un codón de inicio en el sentido pero no cambia la secuencia de aminoácidos correspondiente.

La supresión del codón de inicio antisentido situado en la posición 819 ("819-821") puede resultar, por ejemplo, del cambio de la base C situada en la posición 819 en G o A. Como consecuencia, el "CAT" (ATG en la dirección antisentido) se convierte en "GAT" (ATC en la dirección antisentido) o "AAT" (ATT en la dirección antisentido), lo que ya no corresponde a un codón de inicio en la dirección antisentido pero no cambia la secuencia de aminoácidos correspondiente.

La supresión del codón de inicio antisentido situado en la posición 1431 ("1431-1433") puede resultar, por ejemplo, del cambio de la base C situada en la posición 1431 en G. Como consecuencia, el "CAT" (ATG en la dirección antisentido) se convierte en "GAT" (ATC en la dirección antisentido), que ya no corresponde a un codón de inicio en la dirección antisentido pero no cambia la secuencia de aminoácidos correspondiente.

El polinucleótido de la invención puede optimizarse aún más de la siguiente manera:

De acuerdo con una realización, se modifica el contenido de GC, ventajosamente disminuido. preferentemente, el contenido de GC del polinucleótido se reduce en menos de un 5% con respecto al contenido de GC de SEQ ID NÚM.: 2 o en más de un 10% con respecto al contenido de GC de SEQ ID NÚM.: 2. Al sustituir las bases G y C por A o T, la secuencia de aminoácidos debe conservarse y, preferentemente, no se introduce ningún codón de inicio adicional.

De acuerdo con otra realización, los motivos CG se sustituyen para evitar la formación de islotes CpG, preferentemente con las mismas precauciones que las descritas anteriormente (la secuencia de aminoácidos se conserva y no se introduce ningún codón de inicio adicional).

De acuerdo con otra realización, la secuencia se optimiza con base en las frecuencias de ARN de transferencia en humanos, por ejemplo, siguiendo la tabla de frecuencias de codones desvelada en Sharpet al.(1988), preferentemente con las mismas precauciones que las indicadas anteriormente.

De acuerdo con otra realización, el polinucleótido puede tener además al menos una mutación en la región 553-559 de SEQ ID NÚM.: 2 (GCCCCCG), que corresponde a un bucle de tallo. Ventajosamente, la estructura de bucle de tallo se modifica o incluso se destruye debido a la mutación o mutaciones. Como ejemplo, el nucleótido C en la posición 558 de SEQ ID NÚM.: 2 se convierte en T.

De acuerdo con una realización específica de la divulgación, el polinucleótido consiste o comprende una secuencia seleccionada entre SEQ ID NÚM.: 3, SEQ ID NÚM.: 4, SEQ ID NÚM.: 5, SEQ ID NÚM.: 6, SEQ ID NÚM.: 7 y SEQ ID NÚM.: 8, o una secuencia que sea aproximadamente 60% homóloga/idéntica, más preferentemente aproximadamente 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 88%, 89% o aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94% homóloga/idéntica, aún más preferentemente, aproximadamente 95% homóloga/idéntica, y aún más preferentemente aproximadamente 96%, 97%, 98% o incluso 99% homóloga/idéntica.

De acuerdo con una realización preferente, dicha secuencia homóloga tiene los mismos codones de inicio mutados.

En consecuencia y a modo de ejemplo, la presente invención también se refiere a una secuencia que tiene 90%, 91%, 92%, 93%, 94% de identidad, aún más preferentemente, alrededor de 95% de identidad, y aún más preferentemente aproximadamente 96%, 97%, 98% o incluso 99% de identidad con SEQ ID NÚM.: 4 y con 3 codones de inicio mutados en las posiciones 429, 819 y 1431 de la secuencia SEQ ID NÚM.: 2. De acuerdo con una realización específica, dicha secuencia es SEQ ID NÚM.: 7 o SEQ ID NÚM.: 8.

De acuerdo con otro ejemplo, la presente invención también se refiere a una secuencia que tiene 90%, 91%, 92%, 93%, 94% de identidad, aún más preferentemente, alrededor de 95% de identidad, y aún más preferentemente aproximadamente 96%, 97%, 98% o incluso 99% de identidad con SEQ ID NÚM.: 6 y con 4 codones de inicio mutados en las posiciones 429, 545, 819 y 1431 de la secuencia SEQ ID NÚM.: 2. De acuerdo con una realización específica, dicha secuencia es SEQ ID NÚM.: 5 o SEQ ID NÚM.: 3.

De acuerdo con una realización específica, el polinucleótido aislado se inserta en un vector. En resumen, la expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos se consigue normalmente uniendo de forma operable un ácido nucleico o partes del mismo a un promotor, e incorporando la construcción a un vector de expresión. Los vectores que se utilicen son adecuados para la replicación y, opcionalmente, la integración en células eucariotas. Los vectores típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para regular la expresión de la secuencia de ácido nucleico deseada.

En una realización, el vector es un vector de expresión, ventajosamente un vector viral.

En una realización, el vector viral se selecciona del grupo que consiste en un vector baculoviral, un vector viral herpes, un vector lentiviral, un vector retroviral, un vector adenoviral y un vector viral adenoasociado (AAV).

De acuerdo con una realización específica de la invención, el vector viral que contiene el polinucleótido es un vector viral adenoasociado (AAV).

Los vectores virales adenoasociados (AAV) se han convertido en potentes herramientas de administración de genes para el tratamiento de diversos trastornos. Los vectores AAV poseen una serie de características que los hacen idóneos para la terapia génica, como la ausencia de patogenicidad, una inmunogenicidad moderada y la capacidad de transducir células y tejidos postmitóticos de forma estable y eficaz. La expresión de un gen específico contenido en un vector AAV puede dirigirse específicamente a uno o más tipos de células eligiendo la combinación adecuada de serotipo AAV, promotor y procedimiento de administración.

En una realización, la secuencia de codificación está contenida en un vector AAV. Se conocen más de 100 serotipos naturales de AAV. Existen numerosas variantes naturales de la cápside del AAV, lo que permite identificar y utilizar un AAV con propiedades específicamente adaptadas a las patologías distróficas. Los virus AAV pueden modificarse mediante técnicas convencionales de biología molecular, lo que permite optimizar estas partículas para la administración de secuencias de ácido nucleico a células específicas, para minimizar la inmunogenicidad, para ajustar la estabilidad y la vida útil de las partículas, para una degradación eficaz, para una administración precisa al núcleo.

Como ya se ha mencionado, el uso de vectores AAV es un modo habitual de administración exógena de ADN, ya que es relativamente atóxico, proporciona una transferencia génica eficaz y puede optimizarse fácilmente para fines específicos. Entre los serotipos de AAV aislados de humanos o primates no humanos (NHP) y bien caracterizados, el serotipo humano 2 es el primer AAV que se desarrolló como vector de transferencia de genes. Otros serotipos de AAV utilizados actualmente son AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrhlO, AAV11 y AAV12. Además, también pueden ser útiles las variantes de ingeniería no naturales y los AAV quiméricos.

Los fragmentos de AAV deseables para ensamblar en vectores incluyen las proteínas cap, incluidas las regiones vpl, vp2, vp3 e hipervariable, las proteínas rep, incluidas rep 78, rep 68, rep 52 y rep 40, y las secuencias que codifican estas proteínas. Estos fragmentos pueden utilizarse fácilmente en diversos sistemas de vectores y células huésped.

Dichos fragmentos pueden utilizarse solos, en combinación con otras secuencias o fragmentos de serotipo AAV, o en combinación con elementos de otras secuencias virales AAV o no AAV. Como se utiliza en la presente memoria, los serotipos artificiales de AAV incluyen, sin limitación, AAV con una proteína de cápside no natural. Dicha cápside artificial puede generarse mediante cualquier técnica adecuada, utilizando una secuencia AAV seleccionada (por ejemplo, un fragmento de una proteína de cápside vpl) en combinación con secuencias heterólogas que pueden obtenerse de un serotipo AAV seleccionado diferente, de porciones no contiguas del mismo serotipo AAV, de una fuente viral no AAV o de una fuente no viral. Un serotipo AAV artificial puede ser, sin limitación, una cápside AAV quimérica, una cápside AAV recombinante o una cápside AAV "humanizada". Por lo tanto, entre los<a>A<v>o AAV artificiales de ejemplo se incluyen el AAV2/8 (documento US 7.282.199), el AAV2/5 (disponible en los National Institutes of Health, el AAV2/9 (documento WO2005/033321), el AAV2/6 (documento US 6.156.303) y el AAVrhlO (documento WO2003/042397), entre otros. En una realización, los vectores útiles en las composiciones y procedimientos descritos en la presente memoria contienen, como mínimo, secuencias que codifican una cápside de serotipo AAV seleccionada, por ejemplo, una cápside AAV8, o un fragmento de la misma. En otra realización, los vectores útiles contienen, como mínimo, secuencias que codifican una proteína rep de serotipo AAV seleccionado, por ejemplo, la proteína rep AAV8, o un fragmento de la misma. Opcionalmente, dichos vectores pueden contener las proteínas a Av cap y rep. En los vectores en los que se proporcionan tanto AAV rep como AAV cap, las secuencias AAV rep y AAV cap pueden ser ambas de un serotipo de origen, por ejemplo, todas de origen AAV8. Alternativamente, pueden utilizarse vectores en los que las secuencias rep procedan de un serotipo de AAV diferente del que proporciona las secuencias cap. En una realización, las secuencias rep y cap se expresan a partir de fuentes separadas (por ejemplo, vectores separados, o una célula huésped y un vector). En otra realización, estas secuencias rep se fusionan en el marco con secuencias cap de un serotipo AAV diferente para formar un vector AAV quimérico, como AAV2/8 (documento US 7.282.199).

De acuerdo con una realización, la composición comprende un AAV de serotipo 2, 5, 8 o 9. Ventajosamente, el vector reivindicado es un vector AAV8 o AAV9, especialmente un vector AAV2/8 o AAV2/9. Más ventajosamente, el vector reivindicado es un vector AAV9 o un vector AAV2/9.

En los vectores AAV utilizados en la presente invención, el genoma AAV puede ser un ácido nucleico monocatenario (ss) o una molécula de ácido nucleico bicatenario (ds) / autocomplementario (sc).

Ventajosamente, el polinucleótido que codifica el FKRP humano se inserta entre las secuencias ITR ("Inverted Terminal Repeat") del vector AAV. Las secuencias ITR típicas corresponden a SEQ ID NÚM.: 12 (secuencias 5TTR) y SEQ ID NÚM.: 16 (secuencias 3TTR).

Las partículas virales recombinantes pueden obtenerse por cualquier procedimiento conocido por el experto en la técnica, por ejemplo, por cotransfección de 293 células HEK, por el sistema del virus del herpes simple y por el sistema del baculovirus. Los títulos del vector suelen expresarse como genomas virales por ml (vg/ml).

En una realización, el vector comprende secuencias reguladoras, especialmente una secuencia promotora. Estos promotores pueden ser naturales o sintéticos (artificiales), inducibles o constitutivos.

En una realización, el promotor es un promotor ubicuo o de baja especificidad tisular. A modo de ejemplo, el vector de expresión puede albergar la fosfoglicerato quinasa 1 (PGK), EFl, P-actina, promotor CMV.

En una realización preferente, la secuencia promotora se elige para gobernar adecuadamente la expresión de la secuencia de ácido nucleico colocada bajo su control, en términos de nivel de expresión, pero también de especificidad tisular. En una realización, el vector de expresión comprende un promotor específico de músculo. Tal promotor permite una expresión robusta en los músculos esqueléticos, y posiblemente en el músculo cardíaco (corazón). Los ejemplos de promotores adecuados conocidos por el experto son, por ejemplo, el promotor de la desmina, el promotor de la creatina quinasa muscular (MCK), el promotor CK6, el promotor Syn, el promotor ACTA1 o el promotor sintético C5-12 (spC5-12). De particular interés es el promotor de la desmina humana como se muestra en la secuencia SEQ ID NÚM.: 13.

También puede utilizarse el promotorFKRP.

Una lista no exhaustiva de otras posibles secuencias reguladoras es:

-secuencias para la estabilización de la transcripción, por ejemplo, el intrón 1 de la hemoglobina (HBB2). Como se muestra en la secuencia SEQ ID NÚM.: 14, dicho intrón HBB2 es seguido ventajosamente por la secuencia Kozak consenso incluida antes del codón de inicio AUG dentro del ARNm, para mejorar la iniciación de la traducción;

- una señal de poliadenilación, por ejemplo el poliA del gen de interés, el poliA del SV40 o de la hemoglobina beta (HBB2), ventajosamente en 3' de la secuencia que codifica el FKRP humano. Como ejemplo preferente, el poli A de HBB2 se describe en la secuencia SEQ ID NÚM.: 15;

- secuencias potenciadoras;

- secuencias diana de mi-ARN, que pueden inhibir la expresión de la secuencia que codifica el FKRP humano en tejidos no diana, en los que dicha expresión no es deseada, por ejemplo donde puede ser tóxica. Preferentemente, el mi-ARN correspondiente no está presente en los músculos esqueléticos, y posiblemente tampoco en el corazón.

Típicamente, un vector de acuerdo con la invención comprende:

secuencias 5'ITR (SEQ ID NÚM.: 12) correspondiente a los nucleótidos 494 a 638 de

SEQ ID NÚM.: 10 u 11; seguido de

- el promotor de la desmina humana (SEQ ID NÚM.: 13) correspondiente a los nucleótidos 639 a 1699 de SEQ ID NÚM.: 10 u 11; seguido de

- el intrón HBB2 seguido de la secuencia Kozak de consenso (SEQ ID NÚM.: 14) correspondiente a los nucleótidos 1700 a 2151 de SEQ ID NÚM.: 10 u 11; seguido de

el polinucleótido que codifica la FKRP humana, por ejemplo SEQ ID NÚM.: 3 o 4 o 5 o 6 o 7 u 8, correspondientes a los nucleótidos 2152 a 3639 de SEQ ID Nú M.: 10 u 11 en el caso de SEQ ID NÚM.: 3 y 4; seguidos de

- la secuencia poliA de HBB2 (SEQ ID NÚM.: 15) correspondiente a los nucleótidos 3640 a 4405 de SEQ ID NÚM.: 10 u 11; seguido de

- secuencias 3'ITR (SEQ ID NÚM.: 16) correspondiente a los nucleótidos 4406 a 4550 de SEQ ID NÚM.: 10 u 11.

En relación con un polinucleótido que tiene la secuencia SEQ ID NÚM.: 3, SEQ ID NÚM.: 4 y SEQ ID NÚM.: 6, un vector de la invención comprende las secuencias mostradas en SEQ ID NÚM.: 10, SEQ ID N<ú>M.: 11, y SEQ ID NÚM.: 21 respectivamente.

De acuerdo con una realización, la invención se refiere a un vector, ventajosamente un vector de expresión, más ventajosamente un vector AAV que alberga la secuencia SEQ ID NÚM.: 10, SEQ ID NÚM.: 11 o SEQ ID NÚM.: 21. Como se ha mencionado anteriormente, la invención también abarca secuencias homólogas, es decir, que muestran un 90% de identidad, aún más preferentemente aproximadamente 95% de identidad, y aún más preferentemente aproximadamente 97%, 98% o incluso 99% de identidad con la secuencia SEQ ID NÚM.: 10, SEQ ID NÚM.: 11 o SEQ ID NÚM.: 21.

Otros aspectos de la invención se refieren a:

- Una célula que comprende el polinucleótido de la invención o un vector que comprende dicho polinucleótido, tal como se ha desvelado anteriormente.

La célula puede ser de cualquier tipo, procariota o eucariota. La célula puede utilizarse para la propagación del vector o puede introducirse posteriormente (por ejemplo, injertarse) en un huésped o individuo. El polinucleótido o vector puede introducirse en la célula por cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, por transformación, electroporación o transfección. También pueden utilizarse vesículas derivadas de células.

- También se desvela un ceU que comprende elpolinucleótido de la invención o un vector que comprenda dicho polinucleótido,

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende un polinucleótido, un vector o una célula, de acuerdo con lo desvelado anteriormente, para su uso como medicamento.

de acuerdo con una realización, la composición comprende al menos dicho producto de terapia génica (el polinucleótido, el vector o la célula), y eventualmente otras moléculas activas (otros productos de terapia génica, moléculas químicas, péptidos, proteínas...), dedicadas al tratamiento de la misma enfermedad o de otra enfermedad.

La presente invención proporciona entonces composiciones farmacéuticas que comprenden un polinucleótido, un vector o una célula de la invención. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del terapéutico (el polinucleótido o vector o célula de la invención), y un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o incluido en la farmacopea estadounidense o europea u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y seres humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra la terapéutica. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferente cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también pueden emplearse como soportes líquidos, especialmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares.

La composición, si se desea, también puede contener pequeñas cantidades de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes amortiguadores del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, formulaciones de liberación sostenida y similares. En "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin se describen ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del terapéutico, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador para proporcionar la forma de administración adecuada al individuo.

En una realización preferente, la composición se formula de acuerdo con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local como la lidocaína para aliviar el dolor en el lugar de la inyección.

En una realización, la composición de acuerdo con la invención es adecuada para la administración en seres humanos. La composición se presenta preferentemente en forma líquida, ventajosamente una composición salina, más ventajosamente una composición salina tamponada con fosfato (PBS) o una solución de Ringer-Lactato.

La cantidad del terapéutico (es decir, un ácido nucleico o un vector o una célula) de la invención que será eficaz en el tratamiento de las enfermedades diana puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayosin vivoy/oin vitropara ayudar a predecir los intervalos de dosis óptimos. La dosis exacta a emplear en la formulación dependerá también de la vía de administración, el peso y la gravedad de la enfermedad, y deberá decidirse de acuerdo con el criterio del profesional a cargo y las circunstancias de cada paciente.

La administración adecuada debe permitir la entrega de una cantidad terapéuticamente eficaz del producto de terapia génica a los tejidos diana, especialmente los músculos esqueléticos y posiblemente el corazón. En el contexto de la invención, cuando el producto de terapia génica es un vector viral que comprende un polinucleótido que codifica un FKRP humano, la dosis terapéutica se define como la cantidad de partículas virales (vg para genomas virales) que contienen la secuencia FKRP, administrada por kilogramo (kg) del individuo.

Las vías de administración disponibles son tópica (local), enteral (efecto sistémico, pero administrado a través del tracto gastrointestinal) o parenteral (acción sistémica, pero administrada por vías distintas del tracto gastrointestinal). La vía preferente de administración de las composiciones aquí desveladas es la parenteral, que incluye la administración intramuscular (es decir, en el músculo) y la administración sistémica (es decir, en el sistema circulatorio). En este contexto, el término "inyección" (o "perfusión" o "infusión") abarca la administración intravascular, en particular intravenosa (IV), intramuscular (IM), intraocular o intracerebral. Las inyecciones suelen realizarse con jeringuillas o catéteres.

En una realización, la administración sistémica de la composición comprende la administración de la composición cerca de un lugar de tratamiento local, es decir, en una vena o arteria cercana a un músculo debilitado. En ciertas realizaciones, la invención comprende la administración local de la composición, que produce efectos sistémicos. Esta vía de administración, denominada habitualmente "infusión regional (loco-regional)", "administración mediante perfusión aislada de extremidades" o "perfusión transvenosa de extremidades a alta presión" se ha utilizado con éxito como procedimiento de administración de genes en la distrofia muscular (Fanet al.,2012).

De acuerdo con un aspecto, la composición se administra a una extremidad aislada (loco-regional) por infusión o perfusión. En otras palabras, la invención comprende la administración regional de la composición en una pierna y/o brazo por una vía de administración intravascular, es decir, una vena (transvenosa) o una arteria, bajo presión. Esto se consigue normalmente utilizando un torniquete para detener temporalmente la circulación de la sangre mientras se permite una difusión regional del producto infundido, como por ejemplo el descrito por Toromanoffet al.(2008).

En una realización, la composición se inyecta en una extremidad del individuo. Cuando el individuo es un ser humano, la extremidad puede ser el brazo o la pierna. De acuerdo con una realización, la composición se administra en la parte inferior del cuerpo del individuo, por ejemplo, por debajo de la rodilla, o en la parte superior del cuerpo del individuo, por ejemplo, por debajo del codo.

En una realización, la composición se administra en una vena periférica, por ejemplo, la vena cefálica. El volumen de la composición a infundir puede estar en un intervalo que varía entre aproximadamente el 5 y el 40% del volumen del miembro. La dosis típica puede variar entre 5 y 30 ml/kg de peso corporal. En una realización, la presión a aplicar (presión de torniquete o presión máxima de la línea) es inferior a 100000 Pa, ventajosamente inferior a 50000 Pa. En una realización preferente, la presión aplicada es de aproximadamente 300 torr (40000 Pa).

En una realización, la circulación sanguínea de la extremidad se detiene mediante un torniquete que se aprieta durante varios minutos a más de una hora, típicamente entre 1 y 80 minutos, por ejemplo aproximadamente 30 minutos. En una realización preferente, el torniquete se aplicó antes, durante y después de la administración, por ejemplo aproximadamente 10 minutos antes, aproximadamente 20 minutos durante y aproximadamente 15 minutos después de la infusión. Más generalmente, la presión se aplica durante varios minutos, típicamente entre 1 y 80 minutos, por ejemplo aproximadamente 30 minutos. En una realización preferente, la presión se aplica antes, durante y después de la administración, por ejemplo aproximadamente 10 minutos antes, aproximadamente 20 minutos durante y aproximadamente 15 minutos después de la infusión.

En una realización, el caudal promedio está comprendido entre 5 y 150 ml/min, ventajosamente entre 5 y 80 ml/min, por ejemplo 10 ml/min. Por supuesto, el caudal también determina el periodo de tiempo durante el cual se detiene la circulación sanguínea y se aplica la presión.

En el contexto de una administración loci-regional, la dosis inyectada puede variar entre 1012 y1014vg/kg del cuerpo del paciente, preferentemente entre 1012 y 1013 vg/kg.

Un procedimiento preferente de administración de acuerdo con la invención es la administración sistémica. La inyección sistémica abre el camino a una inyección de todo el cuerpo, con el fin de llegar a todos los músculos del cuerpo del individuo, incluyendo el corazón y el diafragma, y luego un tratamiento real de estas enfermedades sistémicas y todavía incurables. En ciertas realizaciones, la administración sistémica comprende la administración de la composición al individuo de forma que la composición sea accesible en todo el cuerpo del individuo.

De acuerdo con una realización preferente, la administración sistémica se produce mediante la inyección de la composición en un vaso sanguíneo, es decir, administración intravascular (intravenosa o intraarterial). De acuerdo con una realización, la composición se administra por inyección intravenosa, a través de una vena periférica.

La administración sistémica se realiza normalmente en las siguientes condiciones:

- un caudal de 1 a 10 ml/min, ventajosamente de 1 a 5 ml/min, por ejemplo 3 ml/min;

- el volumen total inyectado puede variar entre 1 y 20 ml, preferentemente 5 ml de preparación vectorial por kg del individuo. El volumen inyectado no debe representar más del 10% del volumen total de sangre, preferentemente alrededor de 6%.

Cuando se administra sistémicamente, la composición se administra preferentemente con una dosis inferior o igual a 1015 vg/kg o incluso 1014 vg/kg, ventajosamente entre 1012 vg/kg y 1014 vg/kg, más ventajosamente entre 5,1012 vg/kg y1014 vg/kg, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9,1013 vg/kg. También se puede contemplar una dosis inferior de, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9,1012 vg/kg para evitar posibles toxicidades y/o reacciones inmunitarias. Como sabe el experto, es preferente una dosis lo más baja posible que dé un resultado satisfactorio en términos de eficacia.

En una realización específica, el tratamiento comprende una única administración de la composición.

"Distroglicanopatía": enfermedad o patología ligada a una glicosilación aberrante del a-distroglicano (a-DG). Este defecto puede deberse a un defecto de FKRP. De acuerdo con una realización específica, la patología se selecciona en el grupo que consiste en: Distrofia Muscular de Cinturas Tipo 21 (LGMD2I), Distrofia Muscular Congénita tipo 1C (MDC1C), Síndrome de Walker-Warburg (WWS) y Enfermedad Músculo-Ojo-Cerebro (MEB), ventajosamente LGMD2I.

Los individuos que podrían beneficiarse de las composiciones de la invención incluyen a todos los pacientes diagnosticados con dicha enfermedad o en riesgo de desarrollarla. A continuación, puede seleccionarse un individuo a tratar con base en la identificación de mutaciones o deleciones en el gen FKRP por cualquier procedimiento conocido por el experto en la técnica, incluida, por ejemplo, la secuenciación del gen FKRP, y/o mediante la evaluación del nivel de expresión o actividad del FKRP por cualquier procedimiento conocido por el experto en la técnica. Por lo tanto, dichos individuos incluyen tanto individuos que ya presentan síntomas de dicha enfermedad como individuos en riesgo de desarrollar dicha enfermedad. En una realización, dichos individuos incluyen individuos que ya presentan síntomas de dicha enfermedad. En otra realización, dichos individuos son pacientes ambulatorios y pacientes no ambulatorios precoces.

Tales composiciones se destinan especialmente a la terapia génica, en particular para el tratamiento de la distrofia muscular de cinturas tipo 21 (LGMD2I), la distrofia muscular congénita tipo 1C (MDC1C), el síndrome de Walker-Warburg (WWS) y la enfermedad músculo-ojo-cerebro (MEB), ventajosamente LGMD2I.

de acuerdo con una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento de tratamiento de una distroglicanopatía que comprende la administración a un individuo del producto de terapia génica (polinucleótido, vector o célula), tal como se ha desvelado anteriormente.

Ventajosamente, la distroglicanopatía es una patología ligada a una glicosilación aberrante del a-distroglicano (a-DG) y/o a una deficiencia de FKRP. Más ventajosamente, la patología es la Distrofia Muscular de Cinturas tipo 21 (LGMD2I), la Distrofia Muscular Congénita tipo 1C (MDC1C), el Síndrome de Walker-Warburg (WWS) o la Enfermedad Músculo-Ojo-Cerebro (MEB).

En un aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento para aumentar la glicosilación del a-distroglicano (a-DG) en una célula que comprende administrar a dicha célula el polinucleótido o el vector de la invención, en el que el polinucleótido sintético se expresa en dicha célula, produciendo así FKRP y aumentando la glicosilación del a-DG. La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluidas técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que son de la competencia del experto en la técnica. Estas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía, como por ejemplo en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", cuarta edición (Sambrook, 2012); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Culture of Animal Cells" (Freshney, 2010); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1997); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Short Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 2002); "Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting", (Babar, 2011); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 2002). Estas técnicas son aplicables a la producción de los polinucleótidos y polipéptidos de la invención y, como tales, pueden tenerse en cuenta al realizar y poner en práctica la invención. En las secciones siguientes se analizarán técnicas especialmente útiles para determinadas realizaciones.

Sin mayor descripción, se cree que un experto en la técnica puede, utilizando la descripción precedente y los siguientes ejemplos ilustrativos, fabricar y utilizar los compuestos de la presente invención y practicar los procedimientos reivindicados.

EJEMPLOS EXPERIMENTALES

La invención se describe con más detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos experimentales y a las figuras adjuntas. Estos ejemplos se ofrecen a título meramente ilustrativo y no pretenden ser limitativos.

Figura 1: Esquema de los plásmidos utilizados en este estudio:

A/ pAAV-hDesmin-hFKRPwt

B/ pAAV-hDesmin-hFKRP-OPTmin

C/ pAAV-hDesmin-hFKRP-OPTcomp

Figura 2: Inyección de ratones C57BI6 sin (PBS) o con AAV9 que comprende diferentes formas del transgén FKRP humano (hFKRP): hFKRP-wt (secuencia de codificación SEQ ID NÚM.: 2), hFKRP-OPTmin (secuencia de codificación SEQ ID N<ú>M.: 3) y hFKRP-OPTcomp (secuencia de codificación SEQ iD NÚM.: 4) a 2 dosis diferentes (3E9 vg/TA y 1,5E10 vg/TA): A/ Evaluación de la expresión de FKRP mediante western-blotting

B/ Cuantificación de la proteína FKRP tras normalización con GADPH C/ Cuantificación de la proteína FKRP tras normalización con GADPH : administración de FKRP wt (SEQ ID NÚM.: 2), FKRP-OPTcomp (SEQ ID NÚM.: 4), FKRP-06 (SEQ ID NÚM.: 20), FKRP-OPT-07 (SEQ ID NÚM.: 5), FKRP-OPT-08 (SEQ ID NÚM.: 6), FKRP-OPT-10 (SEQ ID NÚM.: 7), y FKRP-OPT-11 (SEQ ID NÚM.: 8), a la dosis de 3E9 vg/TA.

Figura 3: Evaluacióninvivo de FKRP-OPTcomp (SEQ ID NÚM.: 4) tras su administración a ratones HSA-FKRPdel (un modelo de ratón deficiente en FKRP) a 2 dosis diferentes (3E9 vg/TA y 1,5E10 vg/TA):

A/ Índice de centronucleación en el músculo TA

B/ Fuerza de AT in situ

C/ Resultados de una prueba de escape.

Materiales y procedimientos:

Diseño de las nuevas secuencias FKRP humanas:

La secuencia de codificación humana FKRP SEQ ID NÚM.: 2 se ha modificado de acuerdo con las siguientes normas:

- introducción de mutaciones que suprimen el sentido y el antisentido frameshift ATG presente en la región de codificación, en las posiciones 429 (antisentido; fase 1), 546 (sentido; fase 1), 819 (antisentido; fase 1) y/o 1431 (antisentido; fase 1);

- posiblemente siguiendo la tabla de frecuencias de codones desvelada, por ejemplo, en Sharpet al.(1988); - sin generación de nuevo Marco de Lectura Abierto (ORF);

- posiblemente sustituyendo a los motivos CG para evitar la formación de islotes CpG;

- posiblemente disminuyendo el GC%;

- modificando posiblemente el bucle de tallo presente en la posición 553-559 de SEQ ID NÚM.: 2.

Todas las secuencias diseñadas resultantes (SEQ ID NÚM.: 3 a 8 que figuran en la Tabla 1) codifican una proteína FKRP cuya secuencia SEQ ID NÚM.: 1, correspondiente a la secuencia FKRP nativa humana.

Plásmidos y vectores AAV:

La secuencia de codificación del genFkrphumano (SEQ ID NÚM.: 2) se sintetizó utilizando la metodología clásica del servicio de síntesis de genes, y se insertó en un plásmido (pUC57) que contenía ITR de AAV2, el promotor de la desmina humana, el intrón de HBB2 seguido de la secuencia de Kozak, y la poliA de HBB2 (señal de poliadenilación de la subunidad P2 de la hemoglobina).

El plásmido resultante, mostrado en la Figura 1A, se denomina pAAV-hDesmin-hFKRPwt. La secuencia del inserto que incluye las secuencias ITR se muestra en SEQ ID NÚM.: 9.

Los plásmidos pAAV-hDesmina-hFKRP-OPTmin (Fig. IB) y pAAV-hDesmina-hFKRP-OPTcomp (Fig. IC), cuya secuencia de inserción se muestra en SEQ ID NÚM.: 10 y 11 respectivamente, se han obtenido sustituyendo la secuencia de codificación de la proteína FKRP humana nativa (SEQ ID NÚM.: 2) por las secuencias modificadas SEQ ID NÚM.: 3 y 4, respectivamente. Los otros plásmidos FKRP-06, FKRP-OPT-07, FKRP-OPT-08, FKRP-OPT- 10 y FKRP-OPT-11 se han obtenido de forma similar sustituyendo SEQ ID NÚM.: 2 por la secuencia SEQ ID NÚM.: 20, SEQ ID NÚM.: 5, SEQ ID NÚM.: 6, SEQ ID NÚM.: 7 y SEQ ID NÚM.: 8, respectivamente.

Las preparaciones virales rAAV2/9 libres de adenovirus se generaron empaquetando genomas recombinantes AAV2-ITR en cápsides AAV9, utilizando un protocolo de transfección de tres plásmidos como se describió previamente (Bartoliet al.,2006). En pocas palabras, las células HEK293 fueron cotransfectadas con pAAV-hDesmina-hFKRPwt (o pAAV-hDesmina-hFKRP-OPTmin o pAAV- hDesmina-hFKRP-OPTcomp), un plásmido RepCap (pAAV2.9, Dr J. Wilson, UPenn) y un plásmido auxiliar de adenoviros (pXX6; Apparaillyet al.,2005) en una proporción de 1:1:2. El lisado viral bruto se recogió 60 horas después de la transfección y se lisó mediante ciclos de congelación y descongelación. El lisado viral se purificó mediante dos rondas de ultracentrifugación con CsCl seguidas de diálisis. Los genomas virales se cuantificaron mediante un ensayo de PCR TaqMan en tiempo real utilizando cebadores y sondas correspondientes alpoliA HBB2del genoma del vector AAV. Los pares de cebadores y las sondas TaqMan utilizados para la amplificación fueron:

Directo: CCAGGCGAGGAGAAACCA (SEQ ID NÚM.: 17)

Inverso: CTTGACTCCACTCAGTTCTCTTGCT (SEQ ID NÚM.: 18); y

Sonda: CTCGCCGTAAAACATGGAAGGAACACTTC (SEQ ID NÚM.: 19).

Western-Blotting

Los microgránulos celulares y los tejidos musculares se homogeneizaron mecánicamente en tampón de lisis RIPA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, M<a>, EE. UU.), complementado con un cóctel completo de inhibidores de proteasas sin EDTA (Roche, Bale, Suiza). Los ácidos nucleicos contenidos en las muestras se degradaron incubándolos 15 minutos a 37°C con benzonasa (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.).

Las proteínas se separaron utilizando un gel de poliacrilamida prefabricado (4-15%, BioRad, Hercules, CA, EE.UU.) y luego se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa.

El anticuerpo policlonal de conejo contra FKRP se ha descrito previamente (Gicquelet al.,2017). Las membranas de nitrocelulosa se sondaron con anticuerpos contra FKRP (1:100) y GAPDH (Santa Cruz Biotechnologies, Dallas, TX, EE.UU., 1:200) para su normalización, durante 2 horas a temperatura ambiente.

Por último, las membranas se incubaron con IRDye® para su detección mediante el escáner de infrarrojos Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, EE. UU.).

Animales e inyecciones

Se utilizaron ratones de un mes de edad. Todos los animales de este estudio se manipularon de acuerdo con las directrices europeas para el cuidado humano y el uso de animales de experimentación, y todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el comité ético de Genopole.

Para evaluar la eficacia de la transferencia génica, se inyectaron ratones C57B16 macho por vía intramuscular en el músculo TA (Tibialis Anterior) con un volumen de 25 pL, a dos dosis diferentes: 3 E9 vg/TA y 1,5 E10 vg/TA. Como control negativo, se inyectó a los ratones el tampón utilizado para la formulación del AAV, es decir, PBS. Los ratones fueron sacrificados después de 1 mes y los músculos inyectados fueron disecados y congelados en isopentano enfriado en nitrógeno líquido.

Para las pruebas funcionalesinvivo, el AAV9-FKRP que contiene la secuencia FKRP-OPTcomp (SEQ ID NÚM.: 4) se administró mediante inyección intravenosa a ratones HSA-FKRPdel, un modelo de ratón deficiente en FKRP, en 2 dosis: 2,5 E12 vg/kg y 1 E13 vg/kg. Al cabo de 3 meses, los animales fueron sometidos a diferentes pruebas funcionales.

Evaluación in vivo

Prueba de escape:

La fuerza global de los ratones se evalúa mediante la prueba de escape (Carlson and Makiejus, 1990). En pocas palabras, los ratones se colocan en una plataforma orientada hacia la entrada de un tubo de 30 cm de longitud. Un manguito enrollado alrededor de la cola se conecta a un transductor de fuerza fijo y se induce a los ratones a escapar dentro del tubo en la dirección opuesta al transductor de fuerza mediante un suave pellizco de la cola. Este vuelo hacia delante induce un breve pico de fuerza y se analiza el promedio de los cinco picos de fuerza más elevados normalizados por el peso corporal.

Material utilizado:

Transductor de fuerza AD Instrument MLT1030 serie 810.

Software ADinstrument Labchart7.

Fuerza de AT in situ:

La función del músculo esquelético se evalúa mediante la medición de la contracción muscularin situ,como se ha descrito previamente (Vignaud et al., 2005). Los animales se anestesian mediante inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) y se administran dosis suplementarias según sea necesario para mantener una anestesia profunda. La rodilla y el pie se fijan con abrazaderas y pasadores de acero inoxidable. Se expone el músculo TA, se corta el tendón distal y se fija a un transductor de fuerza (Aurora Scientific, Dublín, Irlanda). Los nervios ciáticos se aplastan proximalmente y se estimulan distalmente mediante un electrodo bipolar de plata utilizando impulsos de onda cuadrada supramáximos de 0,1 ms de duración. Las fuerzas máximas absolutas se determinan en la longitud óptima (longitud en la que se observa la tensión tetánica máxima). La fuerza máxima específica se calcula normalizando la fuerza muscular total con la masa muscular.

Material utilizado:

Aparatos Aurora Scientific.

Sensor 305C 5N Cambridge Technology Modelo 6650 n°X11271243Y.

Software ASI 610A Control dinámico del músculo.

Índice de centronucleación:

Los ratones inyectados fueron sacrificados poco después de las pruebas funcionales. Se tomaron muestras de músculos esqueléticos y se congelaron en isopentano refrigerado. Las criosecciones transversales se tiñeron con Hematoxilina-Floxina-Saffron (HPS) y se utilizaron para la numeración de las fibras centronucleadas. El número de fibras centronucleadas se relacionó con el área del corte para obtener el índice de centronucleación.

Resultados:

1/ Diseño de nuevas secuencias FKRP humanas:

Para evaluar el impacto de las modificaciones en la secuencia de codificación de la FKRP, se utilizó una serie de secuencias que codifican la proteína humana FKRP de secuencia SEQ ID NÚM.: 1, derivado de la secuencia SEQ ID NÚM.: 2, han sido diseñados y sintetizados.

Las características principales de dichas secuencias se resumen en la Tabla 1:

Tabla 1: Características de las secuencias modificadas que codifican la proteína humana FKRP

II/ Evaluación de las construccionesin vivo:

La Figura 2A muestra los resultados obtenidos mediante western-blot sobre la expresión de FKRP tras la transferencia del gen. La proteína FKRP expresada a partir de las diferentes construcciones (wt y optimizada) tiene el tamaño esperado (58 kDa). Además, los transgenes FKRP modificados permiten una mayor expresión de la proteína FKRP en comparación con la secuencia de tipo silvestre. La intensidad de las bandas obtenidas se cuantificó y normalizó mediante el normalizador GAPDH. La cuantificación indica un aumento de 5 veces para hFKRP-OPTcomp en comparación con FKRP wt (Fig. 2B).

Se repitieron los mismos experimentos con las diferentes secuencias de FKRP mostradas en la Tabla 1, incluida la secuencia desvelada en el documento WO2016/138387 (SEQ ID NÚM.: 1 en dicho documento; SEQ ID NÚM.: 20 en la presente solicitud). Como se ilustra en la Figura 2C, la secuencia desvelada en el documento WO2016/138387 (anotada FKRP-06) no permite alcanzar el nivel de expresión del transgén observado con las construcciones de acuerdo con la invención. Entre las nuevas secuencias probadas, FKRP-08 es la mejor candidata, pero en general conducen a un nivel de expresión del transgén superior al de la secuencia nativa.

PII Evaluación funcional de los constructos:

El mejor candidato, es decir, FKRP-OPTcomp (SEQ ID NÚM.: 4), se ha comprobado su eficaciain vivoen un modelo de ratón deficiente en FKRP.

Los datos de la Figura 3A revelan una reducción de la centronucleación en los animales tratados. Además, la mediciónin situde la fuerza del músculo tibial anterior (TA) (Fig. 3B) y de la fuerza global evaluada mediante la prueba de escape (Fig. 3C) revelan una mejora de la función muscular en los animales tratados.

CONCLUSIONES:

El presente estudio demuestra que la optimización de la secuencia del transgén humano FKRP permite mejorar el nivel de expresión de FKRP tras la inyección intramuscular de vectores AAV que albergan dichos transgenes en ratones. Este aumento es de interés terapéutico y clínico ya que mejora la eficacia del tratamiento y/o permite disminuir las dosis inyectadas del producto terapéutico.

REFERENCIAS

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Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido sintético que codifica una proteína humana relacionada con la fukutina (FKRP) que consiste en o comprende la secuencia SEQ ID NÚM.: 1, que tiene mutaciones que evitan transcritos suplementarios generados a partir de codones de inicio con desplazamiento de marco, en el que el polinucleótido tiene al menos 3 codones de inicio mutados, estando dichos codones de inicio situados en la posición 429, 819 y 1431 de la secuencia SEQ ID NÚM.: 2.

2. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polinucleótido consiste o comprende la secuencia SEQ ID NÚM.: 4, o una secuencia que tenga al menos un 90% de identidad con SEQ ID NÚM.: 4, ventajosamente SEQ ID NÚM.: 7 o SEQ ID NÚM.: 8.

3. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polinucleótido tiene 4 codones de inicio mutados, estando dichos codones de inicio localizados en la posición 429, 545, 819 y 1431 de la secuencia SEQ ID NÚM.: 2.

4. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el polinucleótido consiste o comprende la secuencia SEQ ID NÚM.: 6, o una secuencia que tenga al menos un 90% de identidad con SEQ ID NÚM.: 6, ventajosamente SEQ ID NÚM.: 5 o SEQ ID NÚM.: 3.

5. Un vector que comprende un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. El vector de acuerdo con la reivindicación 5, en el que es un vector viral adenoasociado (AAV), ventajosamente del serotipo 2, 8 o 9.

7. El vector de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el vector AAV es del serotipo 9, ventajosamente del serotipo 2/9.

8. El vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que comprende la secuencia SEQ ID NÚM.: 10, SEQ ID NÚM.: 11, SEQ ID NÚM.: 21 o una secuencia que tenga al menos un 90% de identidad con ella.

9. Una célula que comprende el polinucleótido de las reivindicaciones 1 a 4 o el vector de las reivindicaciones 5 a 8.

10. Una composición que comprende el polinucleótido de las reivindicaciones 1 a 4 o el vector de las reivindicaciones 5 a 8 o la célula de la reivindicación 9 para su uso como medicamento.

11. Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de las reivindicaciones 1 a 4 o el vector de las reivindicaciones 5 a 8 o la célula de la reivindicación 9.

12. La composición de la reivindicación 11 para su uso en el tratamiento de una patología ligada a una deficiencia de FKRP o inducida por un defecto en la glicosilación del a-distroglicano (a-DG).

13. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en la que la patología se selecciona en el grupo que consiste en: Distrofia Muscular de Cinturas Tipo 21 (LGMD2I), Distrofia Muscular Congénita tipo 1C (MDC1C), Síndrome de Walker-Warburg (WWS) y Enfermedad Músculo-Ojo-Cerebro (MEB), ventajosamente LGMD2I.