ES2986026T3

ES2986026T3 - Formulación acuosa, formulación acuosa en inyector, agente desagregante de proteínas de anticuerpos y método de desagregación de proteínas de anticuerpos

Info

Publication number: ES2986026T3
Application number: ES18775644T
Authority: ES
Inventors: Arpansiree Kaya; Michinari FUJITA
Original assignee: DONG A SOCIO HOLDINGS CO Ltd; Meiji Seika Pharma Co Ltd
Current assignee: DONG A SOCIO HOLDINGS CO Ltd; Meiji Seika Pharma Co Ltd
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2018-03-30
Publication date: 2024-11-08
Anticipated expiration: 2038-03-30
Also published as: EP3603669A1; JPWO2018181876A1; US20200093927A1; KR20190129061A; KR102692727B1; TWI775827B; EP3603669B1; EP3603669C0; EP3603669A4; JP7179717B2; TW201902461A; WO2018181876A1

Abstract

Se proporciona una formulación acuosa que contiene: ustekinumab; al menos uno seleccionado entre histidina y una sal de la misma; y agua. El contenido de histidina y/o una sal de la misma es de 50 a 90 mM en términos de histidina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Formulación acuosa, formulación acuosa en inyector, agente desagregante de proteínas de anticuerpos y método de desagregación de proteínas de anticuerpos

[Campo técnico]

La presente invención se refiere a una formulación acuosa y a una formulación acuosa en jeringa, así como a un método de desagregación de proteínas de anticuerpos que utiliza las mismas. En concreto, la presente invención se refiere a una formulación acuosa que contiene ustekinumab y a una formulación acuosa en jeringa que contiene la misma, así como a un método de desagregación de proteínas de anticuerpos.

[Antecedentes de la técnica]

Ustekinumab es el nombre genérico de un anticuerpo monoclonal anti-IL-12/23 p40 humano de tipo humano, esto es, un anticuerpo monoclonal IgG1 humano contra una subunidad p40 que es una proteína constituyente común a la IL-12 (interleucina-12) y a la IL-23 (interleucina-23) humanas. Se sabe que la IL-12 humana participa en la diferenciación de linfocitos T vírgenes positivos para CD4 en linfocitos T auxiliares 1 (Th1), y la IL-23 estimula la activación de los linfocitos T auxiliares 17 (Th17). Ustekinumab, que tiene alta afinidad y selectividad por dicha subunidad p40 de IL-12 e IL-23 humanas (IL-12/23 p40), se utiliza como fármaco polipeptídico (proteína de anticuerpo) para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, tales como psoriasis vulgar y artritis psoriásica, y generalmente se administra mediante inyección. Ustekinumab se produce mediante tecnología de recombinación genética en sistemas de expresión de células de mamíferos, tal como células de ovario de hámster chino y células de mieloma de ratón (Sp2/0) descritas en, por ejemplo, la publicación internacional n.° W02009/114040 (PTL 1). Además, Janssen Pharmaceutical K.K. produce y comercializa una formulación acuosa (inyección) que contiene ustekinumab como "Stelara (marca registrada)" por ejemplo.

Por otro lado, una formulación acuosa que contiene una proteína de anticuerpo tal como ustekinumab es susceptible a cambios químicos y cambios físicos tales como agregación durante el proceso de producción y almacenamiento debido a la estructura compleja de la proteína de anticuerpo. Tal inestabilidad de la formulación no sólo reduce la acción farmacológica de la proteína de anticuerpo sino que también afecta en gran medida a la seguridad para el paciente y, por tanto, se requiere una estabilidad particularmente excelente para las formulaciones acuosas que contienen proteínas de anticuerpos.

Con el fin de estabilizar la formulación acuosa que contiene proteína de anticuerpo, se han realizado estudios sobre, por ejemplo, la adición de aditivos tales como sacáridos, aminoácidos, polímeros hidrosolubles, tensioactivos y agentes tampón, y en diversas condiciones tales como la forma de dosificación, el pH y las concentraciones de componentes. Por ejemplo,

la publicación de fase japonesa de la solicitud internacional n.° 2016-65079 (PTL 2) describe una formulación en solución que contiene anticuerpos que contiene un anticuerpo, arginina de 40 a 1000 mM y metionina de 10 a 200 mM en una solución tampón, y la publicación de solicitud de patente japonesa no examinada n.° 2016-117756 (PTL 3) describe una formulación que contiene anticuerpos que contiene aspartato de aminoácido básico o glutamato de aminoácido básico. Además, la publicación de solicitud de patente japonesa no examinada N° 2016-65091 (PTL 4) describe una formulación farmacéutica que contiene un anticuerpo monoclonal en una solución tampón de acetato de histidina (pH de 5,5 a 6,5) y la publicación de solicitud internacional en fase japonesa N° 2007-524602 (PTL 5) describe una formulación líquida que contiene de 100 a 260 mg/ml de proteína o anticuerpo, arginina-HCl de 50 a 200 mM, histidina de 10 a 100 mM y polisorbato del 0,01 al 0,1 %. Sin embargo, estas pTl 2 a 5 no describen nada sobre ustekinumab.

Además, con respecto a las proteínas de anticuerpos, también se han realizado estudios sobre métodos para solubilizar y regenerar proteínas de anticuerpos agregadas. Por ejemplo, la publicación de la fase japonesa de la solicitud internacional n.° Hei 11-514334 (PTL 6) describe un método para regenerar TFPI añadiendo una solución de polímero cargado a un TFPI (inhibidor de la vía del factor tisular) desnaturalizado, y la publicación de solicitud de patente japonesa no examinada N.° Hei 10-522270 (PTL 7) describe un método para replegarse una proteína desnaturalizada seleccionando un pH y una constante de unión de anticuerpo. Sin embargo, estas PTL 6 y 7 no describen nada sobre ustekinumab, tampoco. Por otra parte, los métodos descritos en estas literaturas son todos métodos para solubilizar y/o regenerar agregados formados por plegamiento inadecuado en el proceso de producción por ingeniería genética de una proteína de anticuerpo, y las PTL 6 y 7 no describen ningún método para desagregar una proteína de anticuerpo agregada en la formulación acuosa debido al estrés como el calor durante el proceso de producción o almacenamiento.

El prospecto de STELARA® 45 mg (Janssen®) (URL:https://www.praxiskiedrowski.de/files/fachinformation_stelara.pdf) (1 de julio de 2011 (2011-07-01), páginas 1-5) (No -PTL 1) describe una solución inyectable de 45 mg de STELARA en una jeringa precargada.

Jacqueline M. Bensonet al.(mAbs, vol. 3, n.° 6, 1 de noviembre de 2011 (2011 -11 -01), páginas 535-545) (No-PTL 2) informa el descubrimiento y el mecanismo de ustekinumab como un anticuerpo monoclonal humano dirigido a la interleucina-12 y la interleucina-23 para el tratamiento de trastornos mediados por el sistema inmunitario.

El documento WO 2009/114040 A2 (PTL 8) divulga anticuerpos ANTI-IL-12/23P40, epítopos, formulaciones, composiciones, métodos y usos de los mismos.

CHEN BEIet al.(PHARMACEUTICAL RESEARCH, SPRINGER NEW YORK LLC, Estados Unidos, vol. 20, n.°12, 1 de diciembre de 2003 (2003-12-01), páginas 1952-1960) (No-PTL 3) informan sobre la influencia de la histidina sobre la estabilidad y las propiedades físicas de un anticuerpo completamente humano en formas acuosas y sólidas. El documento WO 2007/076062 A2 (PTL 9) divulga formulaciones de proteínas con viscosidad reducida y usos de las mismas.

DING Cet al.(CURRENT OPINION IN INVESTIGATIONAL DRUGS, CURRENT DRUGS, LONDRES, Reino Unido, vol. 9, n.° 5, 1 de enero de 2008 (2008-01-01), páginas 515-522) (No-PTL 4) informan que ABT-874 es un anticuerpo monoclonal anti-IL-12/IL-23 totalmente humano para el tratamiento potencial de enfermedades autoinmunitarias.

[Lista de citas]

[Bibliografía de patentes]

[PTL 1] Publicación internacional N.° WO2009/114040

[PTL 2] Publicación de Fase japonesa de solicitud internacional n.° 2016-65079

[PTL 3] Publicación de solicitud de patente japonesa sin examinar n.° 2016-117756

[PTL 4] Publicación de solicitud de patente japonesa sin examinar n.° 2016-65091

[PTL 5] Publicación de Fase japonesa de solicitud internacional n.° 2007-524602

[PTL 6] Publicación de Fase japonesa de solicitud internacional n.° 11-514334

[PTL 7] Publicación de solicitud de patente japonesa sin examinar n.° Hei 10-522270

[PTL 8] Publicación internacional n.° WO 2009/114040

[PTL 9] Publicación internacional n.° WO 2007/076062 [Literatura no relacionada con patentes]

[No PTL 1] Prospecto de STELARA® 45 mg (https: //www.praxiskiedrowski.de/files/fachinformation_stelara. pdf) [No PTL 2] Jacqueline M. Bensonet al.,mAb, vol. 3, n.° 6, 1 de noviembre de 2001 (01/11/2011), páginas 535-545 [No PTL 3] CHEN BEIet al.,PHARMACEUTICAL RESEARCH, SPRINGER NEW YORK LLC, Estados Unidos, vol. 20, n.° 12, 1 de diciembre de 2003 (1-12-2003), páginas 1952-1960

[Non-PTL 4] DING Cet al.,CURRENT OPINION IN INVESTIGATIONAL DRUGS, CURRENT DRUGS, LONDRES, Reino Unido, vol. 9, n.° 5, 1 de enero de 2008 (01-01-2008), páginas 515-522

[Problema técnico]

La presente invención se ha realizado a la luz de los problemas anteriores y un objetivo de la misma es proporcionar una formulación acuosa que contiene ustekinumab de excelente estabilidad y una formulación acuosa en jeringa que contiene la misma, y un método de desagregación de proteínas de anticuerpos.

[Solución al problema]

Los presentes inventores han realizado estudios serios para lograr el objetivo anterior y han encontrado como resultado que la generación de agregados de ustekinumab (ustekinumab agregado) se suprime suficientemente cuando ustekinumab se formula con una solución tampón de histidina de alta concentración para formar una formulación acuosa que contiene ustekinumab, al menos uno seleccionado entre histidina y sus sales, y agua en combinación. Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto además que, cuando la solución tampón de histidina de alta concentración se mezcla con ustekinumab agregado que se ha agregado debido al estrés, como el calor, después de la producción de ingeniería genética, el ustekinumab agregado se desagrega, permitiendo obtener la formulación acuosa que contiene ustekinumab en la que se suprime suficientemente la generación de ustekinumab agregado.

[Sumario de la invención]

La invención se define en las reivindicaciones independientes. En las reivindicaciones dependientes se definen aspectos y realizaciones preferidas adicionales. Cualquier aspecto, realización y ejemplos de la presente divulgación que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención y se proporciona únicamente con fines ilustrativos.

Los aspectos de la presente invención obtenidos mediante los conocimientos anteriores son los siguientes.

(1) Una formulación acuosa que comprende: ustekinumab; al menos uno seleccionado entre histidina y sales de la misma; y agua, en donde un contenido de ustekinumab es de 80 a 100 mg/ml, un contenido de histidina y/o sus sales es de 50 a 90 mM en términos de histidina, y su pH es de 5,7 a 6,3.

(2) La formulación acuosa según (1), que comprende además metionina, en donde el contenido de metionina es de 10 a 50 mM.

(3) La formulación acuosa según (1) o (2), que comprende además sacarosa.

(4) La formulación acuosa según una cualquiera de (1) a (3), formada mezclando ustekinumab y una solución tampón de histidina.

(5) Una formulación acuosa en jeringa que comprende una jeringa y la formulación acuosa según cualquiera de (1) a (4) cargada en la jeringa.

(6) Un método de desagregación de proteínas de anticuerpos para desagregar ustekinumab agregado, que comprende la etapa de: añadir un agente de desagregación de proteínas de anticuerpo al ustekinumab agregado para obtener una formulación acuosa según la invención, en donde el agente de desagregación de proteínas de anticuerpo desagrega ustekinumab agregado y comprende: al menos uno seleccionado entre histidina y sales de la misma; y agua, en donde un contenido de histidina y/o sus sales es de 50 a 90 mM en términos de histidina, y su pH es de 5,7 a 6,3.

(7) El método de desagregación de proteínas de anticuerpos de (6), en donde el agente de desagregación de proteínas de anticuerpos comprende además metionina, en donde un contenido de la metionina es de 5 a 50 mM.

(8) El método de desagregación de proteínas de anticuerpos de (6) o (7), en donde el agente de desagregación de proteínas de anticuerpos comprende además sacarosa.

[Efectos ventajosos de la invención]

La presente invención hace posible proporcionar una formulación acuosa que contiene ustekinumab de excelente estabilidad y una formulación acuosa en jeringa que contiene la misma, y un método de desagregación de proteínas de anticuerpos.

[Breve descripción de las figuras]

[Fig. 1] La Figura 1 es un gráfico que ilustra las cantidades relativas de agregados después de almacenar las formulaciones acuosas obtenidas en el Ejemplo 1 y los Ejemplos Comparativos 1 a 9 a 40 °C durante 2 semanas.

[Fig. 2] La Figura 2 es un gráfico que ilustra cantidades relativas de agregados después de almacenar formulaciones acuosas

obtenidas en los Ejemplos Comparativos 10 y 11 a 40 °C durante 2 semanas.

[Fig. 3] La Figura 3 es un gráfico que ilustra el agregado después de que cada una de las formulaciones acuosas obtenidas en los Ejemplos 1 a 3 y los Ejemplos Comparativos 2 y 12 a 14 se almacenaron a 40 °C durante 2 semanas.

[Fig. 4] La Fig. 4 es un gráfico que ilustra la relación entre la concentración de % del agregado y metionina después del almacenamiento a 40 °C durante 2 semanas en las formulaciones acuosas obtenidas en los Ejemplos 1 a 3.

[Fig. 5] La Figura 5 es un gráfico que ilustra la relación entre el % del agregado y el tiempo de almacenamiento a 40 °C en las formulaciones acuosas obtenidas en los Ejemplos 4 y 5 y el Ejemplo Comparativo 1.

[Fig. 6] La Figura 6 es un gráfico que ilustra la relación entre el % del agregado y el tiempo de almacenamiento a 40 °C en las formulaciones acuosas obtenidas en los Ejemplos 6 a 9 y el Ejemplo Comparativo 15.

[Fig. 7] La Figura 7 es un gráfico que ilustra la relación entre el /monómero y el tiempo de almacenamiento a 40 °C en las formulaciones acuosas obtenidas en los Ejemplos 6 a 9 y el Ejemplo Comparativo 15.

[Descripción detallada]

Una formulación acuosa de la presente invención comprende ustekinumab, al menos uno seleccionado entre histidina y sus sales, y agua, en donde un contenido de ustekinumab es de 80 a 100 mg/ml, un contenido de histidina y/o sus sales es de 50 a 90 mM en términos de histidina, y su pH es de 5,7 a 6,3.

Además, un agente de desagregación de proteínas de anticuerpos de la divulgación es un agente de desagregación de proteínas de anticuerpos que desagrega ustekinumab agregado, que comprende al menos uno seleccionado entre histidina y sales de la misma, y agua, en donde un contenido de histidina y/o sus sales es de 50 a 90 mM en términos de histidina.

Por otra parte, un método de desagregación de proteínas de anticuerpos de la presente invención comprende la etapa de agregar el agente de desagregación de proteínas de anticuerpos al ustekinumab agregado.

La "formulación acuosa" en la presente invención se refiere a una formulación que contiene agua como disolvente, entre las formulaciones (formulaciones farmacéuticas) preparadas para ser adecuadas para la administración a un paciente que necesita tratamiento. El agua no está particularmente limitada siempre que sea agua farmacéuticamente aceptable. La formulación acuosa de la presente invención es, preferentemente, un fluido para inyección o para infusión. Además, la "formulación acuosa que contiene ustekinumab" en la divulgación se refiere a una formulación que contiene al menos agua y ustekinumab, entre las formulaciones acuosas.

El "anticuerpo" en la presente invención no está particularmente limitado siempre que se una a un antígeno deseado y puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal, pero es, preferentemente, un anticuerpo monoclonal desde el punto de vista de la homogeneidad y la estabilidad. Además, la "proteína de anticuerpo" en la presente invención se refiere a una proteína que funciona como un anticuerpo, y también incluye, además de los anticuerpos en general, fragmentos de anticuerpos y anticuerpos despolimerizados unidos con regiones variables de anticuerpos.

En la presente invención, la proteína de anticuerpo incluye ustekinumab. El "ustekinumab" en la presente invención es un nombre genérico para un anticuerpo monoclonal IgG1 humano (anticuerpo monoclonal p40 anti-IL-12/23 humano de tipo humano) contra una subunidad p40 que es una proteína constituyente común de la IL-12 humana (interleucina -12) e IL-23 (interleucina-23), y siendo el monómero su forma activa, está compuesto por 2 moléculas de cadenas H (cadena<y>I), cada una compuesta por 449 restos de aminoácidos y 2 moléculas de cadenas L (<k>cadena) cada uno compuesto por 214 restos de aminoácidos y tiene un peso molecular de aproximadamente 148 a 149,7 kDa. Ustekinumab se conoce convencionalmente y también se conoce como principio activo de "Stelara (marca registrada)" disponible comercialmente en forma de inyección. El "ustekinumab" en la presente invención incluye proteínas farmacéuticamente equivalentes al anticuerpo monoclonal antihumano IL-12/23 p40 de tipo humano que es el principio activo de "Stelara (marca registrada)", y los principios activos de los biosimilares de "Stelara (marca registrada)" y proteínas farmacéuticamente equivalentes de los mismos.

Ustekinumab se puede producir empleando y mejorando adecuadamente métodos convencionalmente conocidos, y se puede producir mediante tecnología de recombinación genética en sistemas de expresión de células de mamíferos tales como células de ovario de hámster chino de acuerdo con el método descrito en, por ejemplo, el documento WO 2009/114040 (PTL 1).

Además, el "ustekinumab" según la presente invención incluye tanto ustekinumab no agregado como ustekinumab agregado a menos que se especifique lo contrario. En la divulgación, el "ustekinumab no agregado" se refiere a una molécula de anticuerpo compuesta por dos moléculas de cadena pesada y dos moléculas de cadena ligera, y se describe como un monómero. Además, el "ustekinumab agregado" en la presente invención se refiere a un agregado de ustekinumab, y ejemplos del mismo incluyen ustekinumab que se produce mediante la tecnología de recombinación genética (ustekinumab no agregado) y luego se desnaturaliza y agrega debido a la exposición a un entorno inadecuado tal como alta temperatura, baja temperatura, presión, ácido o base, o por ejemplo un ambiente con una temperatura de 25 a 40 °C seguido de la formación de un dímero o un trímero.

Por otra parte, el "agente de desagregación de proteínas de anticuerpos" y el "método de desagregación de proteínas de anticuerpos" en la presente invención se refieren a un agente que tiene la función de desagregar una proteína de anticuerpo agregada y que se usa para ese fin, y un método capaz de desagregar una proteína de anticuerpo agregada, respectivamente. La "desagregación" se refiere a un fenómeno en el que una proteína de anticuerpo, que ha sido desnaturalizada y agregada debido a la exposición al ambiente inapropiado anterior y formado en un dímero o trímero (en la presente invención, el ustekinumab agregado), se disocia para regresar a un estado no agregado (en la divulgación, el ustekinumab no agregado). Obsérvese que, el ustekinumab no agregado y el ustekinumab agregado se pueden distinguir mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). En la formulación acuosa, el ustekinumab descrito anteriormente es preferentemente ustekinumab no agregado desde el punto de vista de la seguridad. Sin embargo, dado que la formulación acuosa de la presente invención puede suprimir la agregación de ustekinumab no agregado y ustekinumab desagregado agregado, es posible reducir suficientemente el contenido de ustekinumab agregado en el ustekinumab completo (preferentemente menos del 1,0 % en masa).

En la formulación acuosa de la presente invención, el contenido del ustekinumab (el contenido del ustekinumab no agregado o el contenido del ustekinumab agregado, o el contenido total de ellos si ambos están contenidos, en adelante lo mismo) es de 80 a 100 mg/ml. En la presente invención, la generación de agregados se suprime suficientemente incluso cuando la concentración de ustekinumab en la formulación acuosa es alta como anteriormente. El contenido de ustekinumab puede ser de 80 mg/ml, 90 mg/ml o 100 g/ml y de manera especialmente preferida 90 mg/ml.

Además, en el agente de desagregación de proteínas de anticuerpos de la divulgación y el método de desagregación de proteínas de anticuerpos de la presente invención, es más preferible que el agente de desagregación de proteínas del anticuerpo se agregue al ustekinumab agregado de manera que el contenido de ustekinumab en la formulación acuosa obtenida esté en el intervalo anterior.

La formulación acuosa de la presente invención y el agente de desagregación de proteínas anticuerpo de la divulgación contienen al menos uno seleccionado entre histidina y sus sales. Ejemplos de histidina incluyen la forma D, la forma L y la forma DL, y entre estas se prefiere la forma L. Además, la sal de histidina (sal de histidina) es preferentemente una sal farmacéuticamente aceptable, y ejemplos de la misma incluyen clorhidrato de histidina e hidratos del mismo.

En la formulación acuosa de la presente invención y el agente de desagregación de proteínas de anticuerpos de la divulgación, el contenido de histidina y/o la sal de la misma (el contenido de la histidina o el contenido de la sal de histidina, o el contenido total de los mismos si están contenidos tanto la histidina como la sal de la misma, en lo sucesivo lo mismo) debe ser de 50 a 90 mM en términos de histidina. Los presentes inventores han descubierto que la combinación de histidina y/o una sal de la misma en una alta concentración con ustekinumab suprime particularmente la agregación de ustekinumab y desagrega aún más ustekinumab cuando ustekinumab se agrega a ustekinumab.

El contenido de histidina y/o su sal es más preferentemente de 60 a 80 mM y aún más preferentemente de 60 a 70 mM. Además, el contenido de histidina y/o su sal es más preferentemente de 60 a 80 mM y aún más preferentemente de 60 a 70 mM también en el caso en que la formulación acuosa de la presente invención y el agente de desagregación de proteínas de anticuerpo de la divulgación contienen además la metionina. que se describirá más adelante. Cuando el contenido de histidina y/o de su sal sea inferior al límite inferior, el efecto de suprimir la agregación de ustekinumab no agregado (en lo sucesivo, simplemente denominado "efecto de supresión de la agregación" en algunos casos) y el efecto de desagregación de ustekinumab agregado (en lo sucesivo, simplemente denominado "efecto de desagregación" en algunos casos) tienden a disminuir. Por otra parte, cuando se excede el límite superior, la idoneidad como formulación farmacéutica tiende a disminuir debido a la coloración provocada por la oxidación de la histidina, un aumento de la presión osmótica, y similares.

Además, en el agente de desagregación de proteínas de anticuerpos de la divulgación y el método de desagregación de proteínas de anticuerpos de la presente invención, el agente de desagregación de proteínas del anticuerpo se añade al ustekinumab agregado de manera que el contenido de histidina y/o su sal en la formulación acuosa obtenida esté en el intervalo anterior.

Por otra parte, la formulación acuosa de la presente invención y el agente de desagregación de proteínas de anticuerpo de la divulgación contienen preferentemente además metionina desde el punto de vista de mejorar aún más el efecto de supresión de la agregación y el efecto de desagregación. Ejemplos de metionina incluyen la forma D, la forma L y la forma DL, y entre estas se prefiere la forma L.

En la formulación acuosa de la presente invención y el agente de desagregación de proteínas de anticuerpos de la divulgación, el contenido en metionina es, preferentemente, de 5 a 50 mM, más preferentemente de 20 a 30 mM, y aún más preferentemente 25 mM. Cuando el contenido de metionina es menor que el límite inferior, existe una tendencia a que no se pueda esperar una mejora adicional del efecto de supresión de agregación y del efecto de desagregación. Por otra parte, cuando se excede el límite superior, la idoneidad como formulación farmacéutica tiende a disminuir debido a un aumento de la presión osmótica y similares.

Además, en el agente de desagregación de proteínas de anticuerpos de la divulgación y el método de desagregación de proteínas de anticuerpos de la presente invención, es más preferible que el agente de desagregación de proteínas del anticuerpo se agregue al ustekinumab agregado de manera que el contenido de metionina en la formulación acuosa obtenida esté en el intervalo anterior.

El pH de la formulación acuosa de la presente invención y el agente de desagregación de proteínas del anticuerpo de la divulgación es de 5,7 a 6,3, y preferentemente 6,0.

Un pH en el intervalo anterior tiende a proporcionar un mejor efecto de supresión de la agregación y efecto de desagregación. Por otra parte, el dolor en el momento de la inyección tiende a ocurrir fácilmente cuando el pH es menor que el límite inferior anterior, y el efecto de supresión de agregación y el efecto de desagregación tienden a disminuir cuando se excede el límite superior.

Además, en el agente de desagregación de proteínas de anticuerpos de la divulgación y el método de desagregación de proteínas de anticuerpos de la presente invención, es más preferible que el agente de desagregación de proteínas del anticuerpo se agregue al ustekinumab agregado de manera que el pH de la formulación acuosa obtenida esté en el intervalo anterior.

La formulación acuosa de la presente invención y el agente de desagregación de proteínas de anticuerpos de la divulgación pueden ser un agente formado mezclando ustekinumab, al menos uno seleccionado entre histidina y sales de la misma, agua y metionina según sea necesario, y puede ser un agente formado mezclando ustekinumab, una solución tampón de histidina y metionina según sea necesario desde el punto de vista de que tienden a proporcionarse un mejor efecto de supresión de la agregación y un mejor efecto de desagregación. De manera específica, es preferible que la histidina y su sal deriven de la solución tampón de histidina.

La "solución tampón" en la presente invención es una solución capaz de mantener el pH de la solución en un intervalo aceptable mediante la acción de sus componentes conjugados ácido-base. La "solución tampón de histidina" en la presente invención es una solución tampón formada mezclando al menos dos seleccionados del grupo que consiste en histidina y sus sales (incluyendo dos tipos de sales de histidina) y agua. La histidina y sus sales son como se han descrito anteriormente. El pH de la solución tampón de histidina es preferentemente un pH en el que el pH de cada una de las formulaciones acuosas de la presente invención y el agente de desagregación de la divulgación está en el intervalo preferible descrito anteriormente.

La formulación acuosa de la presente invención y el agente de desagregación de proteínas de anticuerpo de la divulgación pueden contener además histidina y una sal de la misma, y un compuesto que tiene una función tampón de pH distinta de metionina (en lo sucesivo denominado "agente tampón adicional").

Ejemplos del agente tampón adicional incluyen ácido fosfórico, fosfato de sodio, dihidrogenofosfato de sodio, hidrogenofosfato de disodio, fosfato de potasio, dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato de dipotasio, ácido acético, acetato de sodio, acetato de potasio, acetato de amonio, ácido succínico, succinato de sodio, ácido cítrico, citrato de sodio, citrato de potasio, ácido maleico, ácido tartárico, tartrato de sodio, ácido láctico, lactato de sodio, ácido málico, ácido bórico, ácido ascórbico, ácido glutámico, glutamato de sodio, arginina, clorhidrato de arginina, tris-(hidroximetil)-aminometano(tris) y dietanolamina, y estos pueden usarse solos o en combinación de dos o más tipos. Además, estos pueden ser los que se mezclan como una solución tampón (solución tampón fosfato, soluciones de tampón acetato, solución de tampón succinato, solución tampón citrato, solución tampón de arginina, otras soluciones tampón de ácidos orgánicos y similares).

Además, la formulación acuosa de la presente invención y el agente de desagregación de proteínas de anticuerpos de la divulgación pueden contener además un aditivo tal como un agente de ajuste de la tonicidad o un excipiente siempre que sus efectos no se vean afectados. Entre estos, la formulación acuosa de la presente invención y el agente de desagregación de proteínas de anticuerpos de la divulgación contienen preferentemente además el agente de ajuste de la tonicidad descrito anteriormente.

El "agente de ajuste de la tonicidad" en la divulgación es un compuesto que tiene la función de ajustar la presión osmótica en un intervalo aceptable como formulación, y ejemplos del mismo incluyen cloruro de sodio, cloruro potásico, sorbitol, manitol, sacarosa, xilitol, trehalosa, glucosa, glicina, prolina y cisteína, y estos pueden usarse solos o en combinación de dos o más tipos. Entre estos, el agente de ajuste de la tonicidad es particularmente preferible sacarosa desde el punto de vista de que tiende a proporcionarse un mejor efecto de supresión de la agregación y efecto de desagregación.

Ejemplos del "excipiente" en la divulgación incluyen lactosa, glicerol, maltosa, inositol, seroalbúmina bovina (BSA), dextrano, alcohol de polivinilo (PVA), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), polietilenimina, gelatina, polivinilpirrolidona (PVP), hidroxietilcelulosa (HEC), polietilenglicol, etilenglicol, sulfóxido de dimetilo (DMSO), dimetilformamida (DMF), glutamato sódico de L-serina, glutamato de potasio, alanina, clorhidrato de lisina, sarcosina, ácido Y-aminobutírico, Polisorbato 20, Polisorbato 80, SDS, copolímeros de polioxietileno, acetato de sodio, sulfato de amonio, sulfato de magnesio, sulfato de sodio, N-óxido de trimetilamina, betaína, iones de cinc, iones de cobre, iones calcio, iones de manganeso, iones magnesio, CHAPS, monolaurato de sacarosa y 2-O-p-manoglicerato, y estos pueden usarse solos o en combinación de dos o más tipos. Entre estos, el excipiente preferentemente tiene una función como tensioactivo y más preferentemente un polisorbato tal como Polisorbato 20 o Polisorbato 80 desde el punto de vista de que ustekinumab puede protegerse contra el estrés que ocurre en la interfaz aire-líquido para suprimir aún más su agregación.

Obsérvese que, por ejemplo, arginina, citrato de sodio y similares entre los agentes tampón adicionales también pueden funcionar como el agente de ajuste de la tonicidad descrito anteriormente y dichos sorbitol, manitol, sacarosa, xilitol, trehalosa, glucosa, prolina y similares entre los agentes de ajuste de la tonicidad también pueden funcionar como excipientes descritos anteriormente.

Por tanto, cuando la formulación acuosa de la presente invención y el agente de desagregación de proteínas de anticuerpos de la divulgación contienen además el agente tampón adicional, el agente de ajuste de la tonicidad y el excipiente, el contenido de cada uno de ellos se puede ajustar según sea apropiado siempre que los efectos de los mismos no se vean perjudicados, y el contenido total es una cantidad tal que la relación de presión osmótica de la formulación acuosa de la presente invención (incluida la formulación acuosa obtenida añadiendo el anticuerpo (agente de desagregación de proteínas frente al ustekinumab agregado) frente a solución salina fisiológica es preferentemente de 0,8 a 1,2 y de forma especialmente preferente 1,0.

Por ejemplo, cuando la formulación acuosa de la presente invención y el agente de desagregación de proteínas de anticuerpo de la divulgación contienen además sacarosa, su contenido en la formulación acuosa y el agente de desagregación de proteínas del anticuerpo es preferentemente de 20 a 75 mg/ml, más preferentemente de 40 a 55 mg/ml, y aún más preferentemente de 44,7 a 51,8 mg/ml. El contenido de sacarosa en el intervalo anterior tiende a proporcionar un mejor efecto de supresión de la agregación y efecto de desagregación. Por otra parte, la estabilidad de la formulación acuosa tiende a disminuir cuando el contenido de sacarosa es menor que el límite inferior, y la presión osmótica de la formulación acuosa tiende a ser demasiado alta cuando se excede el límite superior.

Además, por ejemplo, cuando la formulación acuosa de la presente invención y el agente de desagregación de proteínas de anticuerpo de la divulgación contienen además un polisorbato, su contenido (contenido total en el caso de una mezcla) en la formulación acuosa y el agente de desagregación de proteínas del anticuerpo es preferentemente de 0,01 a 1 mg/ml, más preferentemente de 0,01 a 0,1 mg/ml, y aún más preferentemente de 0,04 mg/ml. El contenido de polisorbato en el intervalo anterior tiende a proporcionar un mejor efecto de supresión de la agregación y efecto de desagregación. Por otra parte, la estabilidad de ustekinumab tiende a disminuir fuera del intervalo anterior.

Obsérvese que, en el agente de desagregación de proteínas de anticuerpos de la divulgación y el método de desagregación de proteínas de anticuerpos de la presente invención, es más preferible que el agente de desagregación de proteínas del anticuerpo se agregue al ustekinumab agregado de manera que los contenidos de sacarosa y polisorbato en la formulación acuosa obtenida estén en los intervalos anteriores.

El método para producir la formulación acuosa de la presente invención y el agente de desagregación de proteínas de anticuerpos de la divulgación no está particularmente limitado, y es preferible obtener la formulación acuosa de la presente invención y el agente de desagregación de proteínas de anticuerpos de la divulgación mezclando ustekinumab, la solución tampón de histidina y metionina según sea necesario en el caso de la formulación acuosa y mezclando la solución tampón de histidina y metionina según sea necesario en el caso del agente de desagregación de proteínas del anticuerpo hasta la concentración descrita anteriormente.

La formulación acuosa de la presente invención se usa preferentemente como una inyección o un fluido de infusión, y preferentemente se almacena en una jeringa tal como una jeringa estéril precargada o en un paquete de infusión. La formulación acuosa en jeringa de la presente invención comprende preferentemente una jeringa y la formulación acuosa cargada en la jeringa.

Además, la formulación acuosa de la presente invención también puede ser una formulación en kit con el manual de especificaciones de la formulación acuosa. La formulación del kit de la divulgación incluye preferentemente al menos una de la formulación acuosa y la formulación acuosa en jeringa, y un manual de especificaciones de la formulación acuosa.

El método de desagregación de proteínas de anticuerpos de la presente invención incluye agregar el agente de desagregación de proteínas de anticuerpos a ustekinumab agregado de manera que las concentraciones de ustekinumab agregado, la histidina y/o su sal y la metionina según sea necesario son las concentraciones descritas anteriormente. Además, el ustekinumab agregado se puede añadir con la solución tampón de histidina y metionina según sea necesario de modo que sus concentraciones sean las concentraciones descritas anteriormente. El agente de desagregación de proteínas de anticuerpos de la divulgación y el método de desagregación de proteínas de anticuerpos de la presente invención hacen posible desagregar suficientemente el ustekinumab agregado. Por esta razón, la composición (formulación acuosa) obtenida añadiendo el agente de desagregación de proteínas del anticuerpo o la solución tampón de histidina al ustekinumab agregado puede ser la formulación acuosa de la presente invención tal como está.

[Ejemplos]

Las formulaciones acuosas obtenidas en los ejemplos y ejemplos comparativos se sometieron a cromatografía de exclusión molecular (SEC, columna: TSKgel G3000SWXL 7,8 * 300 mm, fabricada por Tosoh Corporation, temperatura de la columna: 25 °C, eluyente: Na2HPO4 20 mM NaCl 150 mM (pH 7,3), caudal: 0,5 ml/min)) inmediatamente después de la producción y después del almacenamiento durante 2 semanas, 1 mes y 2 meses a 40 °C, para medir de ese modo el % de agregado (proporción de la masa de agregado a la masa de proteína total [% de agregado]) y el /monómero (proporción de la masa de monómero a la masa de proteína total [% de monómero]) en cada formulación acuosa. Obsérvese que cuanto menor sea el valor del % del agregado o mayor sea el valor del % del monómero, se puede evaluar que la formulación acuosa tiene una excelente estabilidad en almacenamiento.

(Ejemplo 1)

En primer lugar, se preparó una solución tampón de histidina (pH 6,0) a partir de histidina y clorhidrato de histidina monohidrato. Posteriormente, se mezclaron ustekinumab y la solución tampón de histidina con una composición de ustekinumab: 90 mg/ml e histidina y/o una sal de la misma (en términos de histidina): 50 mM, para obtener de este modo 500 |jl de formulación acuosa. La muestra de ustekinumab utilizada se obtuvo purificando ustekinumab, expresado usando una cepa de expresión estable de células de ovario de hámster chino de acuerdo con el método descrito en el documento WO 2009/114040, mediante cromatografía tal como la cromatografía de proteína A.

(Ejemplo comparativo 1)

En primer lugar, se preparó una solución tampón de histidina (pH 6,0) de la misma manera que en el Ejemplo 1. Posteriormente, se preparó una formulación acuosa para que tuviera la misma composición que Stelara (marca registrada). De manera específica, ustekinumab, la solución tampón de histidina, polisorbato 80 y sacarosa se mezclaron para obtener una composición de ustekinumab: 90 mg/ml, histidina y/o una sal de la misma (en términos de histidina): 6,4 mM (1 mg/ml), Polisorbato 80: 0,04 mg/ml y sacarosa: 76 mg/ml, para obtener de este modo 500 j l de formulación acuosa.

(Ejemplo comparativo 2)

En primer lugar, se preparó una solución tampón de histidina (pH 6,0) de la misma manera que en el Ejemplo 1. Posteriormente, se mezclaron ustekinumab y la solución tampón de histidina con una composición de ustekinumab: 90 mg/ml e histidina y/o una sal de la misma (en términos de histidina): 6,4 mM, para obtener de este modo 500 j l de formulación acuosa.

(Ejemplos comparativos 3 a 9)

Las formulaciones acuosas (ustekinumab: 90 mg/ml histidina y/o una sal de la misma (en términos de histidina): 6.4 mM varios aminoácidos) se obtuvieron de la misma manera que en el Ejemplo comparativo 2 excepto que se mezclaron adicionalmente varios aminoácidos. Los diversos aminoácidos utilizados fueron tales que en el Ejemplo comparativo 3: sal sódica de L-glutamato (50 mM), Ejemplo comparativo 4: clorhidrato de L-lisina (50 mM), Ejemplo comparativo 5: L-Prolina (50 mM), Ejemplo comparativo 6: L-leucina (30 mM (concentración límite de solubilidad en el momento de la preparación de la formulación)), Ejemplo comparativo 7: L-triptófano (10 mM (concentración límite de solubilidad en el momento de la preparación de la formulación)), Ejemplo comparativo 8: glicina (50 mM) y Ejemplo Comparativo 9: L-serina (50 mM) a las concentraciones entre paréntesis.

La prueba de evaluación de la estabilidad en almacenamiento se realizó sobre cada una de las formulaciones acuosas obtenidas en el Ejemplo 1 y los Ejemplos Comparativos 1 a 9, y la siguiente fórmula:

cantidad agregada relativa = (% de agregado después de almacenar cada formulación acuosa a 40 °C durante 2 semanas)/(% de agregado después de almacenar la formulación acuosa del Ejemplo Comparativo 2)

se utilizó para obtener la cantidad relativa de agregado después de almacenar cada formulación acuosa a 40 °C durante 2 semanas, esto es, la cantidad relativa del % de agregado de cada formulación acuosa con respecto al % del agregado de la formulación acuosa obtenida en el Ejemplo Comparativo 2 [Cantidad Relativa de Agregado]. La figura 1 ilustra un gráfico que ilustra las cantidades relativas de agregados después de almacenar las formulaciones acuosas a 40 °C durante 2 semanas. Como se desprende claramente de los resultados ilustrados en la Figura 1, se confirmó que la generación de agregados (ustekinumab agregado) se suprimió significativamente en la formulación acuosa de la presente invención (Ejemplo 1) formada añadiendo histidina de alta concentración y/o una sal de la misma a una formulación acuosa que contiene ustekinumab.

(Ejemplos Comparativos 10 y 11)

Las formulaciones acuosas (ustekinumab: 90 mg/ml histidina y/o una sal de la misma (en términos de histidina): 6.4 mM varios agentes de ajuste de la tonicidad) se obtuvieron de la misma manera que en el Ejemplo Comparativo 2 excepto que se mezclaron adicionalmente diversos agentes de ajuste de la tonicidad. Los diversos agentes de ajuste de la tonicidad usados fueron tales que el Ejemplo Comparativo 10: sacarosa (76 mg/ml) y Ejemplo Comparativo 11: manitol (30 mg/ml (concentración límite de solubilidad en el momento de la preparación de la formulación)) en las concentraciones que figuran entre paréntesis.

La prueba de evaluación de la estabilidad en almacenamiento se llevó a cabo en cada una de las formulaciones acuosas obtenidas en los Ejemplos Comparativos 10 y 11 para obtener la cantidad relativa (cantidad agregada relativa) del % de agregado de cada formulación acuosa con respecto al % del agregado de la formulación acuosa obtenida en el Ejemplo Comparativo 2, de la misma manera que en el Ejemplo 1 y los Ejemplos Comparativos 1 a 9. La figura 2 ilustra un gráfico que ilustra las cantidades relativas de agregados después de almacenar las formulaciones acuosas a 40 °C durante 2 semanas. A partir de los resultados ilustrados en la figura 2, se confirmó que se suprimió la generación de agregados en el caso de añadir sacarosa a una formulación acuosa que contenía ustekinumab.

(Ejemplos 2 a 3 y Ejemplos Comparativos 12 a 14)

Las formulaciones acuosas se obtuvieron de la misma manera que en el Ejemplo 1 excepto que las concentraciones de histidina y/o una sal de la misma se cambiaron para obtener las composiciones presentadas en la Tabla 1 a continuación. Además, en los ejemplos 1 a 3 se obtuvieron formulaciones acuosas a las que se añadió L-metionina para ajustar su concentración a 10, 25 y 50 mM. La Tabla 1 a continuación presenta las composiciones de las formulaciones acuosas obtenidas. Además, la Tabla 1 también presenta las composiciones de las formulaciones acuosas obtenidas en el Ejemplo 1 y el Ejemplo Comparativo 2. Obsérvese que, en las tablas siguientes, histidina [mM] indica el contenido de histidina y/o una sal de la misma en términos de histidina incluida debido a la solución tampón de histidina (en adelante la misma)

La prueba de evaluación de la estabilidad en almacenamiento se llevó a cabo en cada una de las formulaciones acuosas obtenidas en los Ejemplos (EJ.) 1 a 3 y los Ejemplos Comparativos (EJ. COMP.) 2 y 12 a 14. La Figura 3 ilustra un gráfico que ilustra el % de agregado después de cada una de las formulaciones acuosas (concentración de metionina: 0 mM) se almacenó a 40 °C durante 2 semanas, esto es, un gráfico que ilustra la relación entre el % de agregado (% de agregado) y la concentración de histidina (His [mM]) después del almacenamiento a 40 °C durante 2 semanas. Como se desprende claramente de los resultados ilustrados en la Figura 3, se confirmó que la generación de agregados se suprime significativamente y también se puede esperar una seguridad excelente en las formulaciones acuosas de la presente invención (Ejemplos 1 a 3) que tienen una concentración de histidina y/o una sal de la misma (His [mM]) en un intervalo específico.

Además, la Figura 4 ilustra un gráfico que ilustra la relación entre el % del agregado (% de Agregado) y la concentración de metionina (Met [mM]) después del almacenamiento a 40 °C durante 2 semanas en las formulaciones acuosas obtenidas en los Ejemplos 1 a 3 (concentración de metionina: 0, 10, 25 y 50 mM). Como se desprende claramente de los resultados ilustrados en la Figura 4, se confirmó que la generación de agregados se suprimía aún más en el caso de añadir más metionina a las formulaciones acuosas de la presente invención (Ejemplos 1 a 3).

(Ejemplos 4 y 5)

En primer lugar, se preparó una solución tampón de histidina (pH 6,0) de la misma manera que en el Ejemplo 1. Posteriormente, ustekinumab, L-metionina, la solución tampón de histidina, polisorbato 80 y sacarosa se mezclaron con las composiciones presentadas en la Tabla 2 a continuación, para obtener de este modo 500 pl de formulación acuosa. La Tabla 2 a continuación presenta las composiciones de las formulaciones acuosas obtenidas. Además, la Tabla 2 también presenta la composición de la formulación acuosa obtenida en el Ejemplo Comparativo 1.

Tabla 2]

comp emplo emplo 5 Ustekinu 90 90 90 Histidina [

de tampó<6,4 70 70>Metionina - - 25 Polisorbat 0,04 0,04 0,04 Sacarosa 76 51,8 44,7 PH______ 6,0 6,0 6,0

La prueba de evaluación de la estabilidad en almacenamiento se llevó a cabo en cada una de las formulaciones acuosas obtenidas en los Ejemplos 4 y 5 y el Ejemplo Comparativo 1. La Figura 5 ilustra un gráfico que ilustra la relación entre el % de agregado (% de Agregado) y el tiempo de almacenamiento (Tiempo de almacenamiento [semanas]) inmediatamente después de la producción de las formulaciones acuosas y después del almacenamiento durante 2 semanas, 1 mes y 2 meses a 40 °C. Como se desprende de los resultados ilustrados en la Figura 5, se confirmó que la generación de agregados se suprimió suficientemente incluso en el caso de almacenamiento durante un largo período de tiempo en las formulaciones acuosas de la presente invención (Ejemplos 4 y 5).

(Ejemplos 6 a 9 y Ejemplo comparativo 15)

En primer lugar, se preparó una solución tampón de histidina (pH 6,0) de la misma manera que en el Ejemplo 1. Además, el ustekinumab obtenido de la misma manera que en el Ejemplo 1 se almacenó a 37 °C durante 24 horas para su agregación y se transformó en ustekinumab agregado. Posteriormente, el ustekinumab agregado, L-metionina, la solución tampón de histidina, polisorbato 80 y sacarosa se mezclaron con las composiciones presentadas en la Tabla 3 a continuación, para obtener de este modo 500 pl de formulación acuosa. La Tabla 3 a continuación presenta las composiciones de las formulaciones acuosas obtenidas.

La prueba de evaluación de la estabilidad en almacenamiento se llevó a cabo en cada una de las formulaciones acuosas obtenidas en los Ejemplos 6 a 9 y el Ejemplo Comparativo 15. La Figura 6 ilustra un gráfico que ilustra la relación entre el % de agregado (% de Agregado) y el tiempo de almacenamiento (Tiempo de almacenamiento [semanas]) inmediatamente después de la producción de las formulaciones acuosas y después del almacenamiento durante 2 semanas a 40 °C. Además, la Figura 7 ilustra un gráfico que ilustra la relación entre el % de monómero (%de Monómero) y el tiempo de almacenamiento (Tiempo de almacenamiento [semanas]) inmediatamente después de la producción de las formulaciones acuosas y después del almacenamiento durante 2 semanas a 40 °C. Como se desprende de los resultados ilustrados en las Figuras 6 y 7, se confirmó que el ustekinumab agregado se desagregó en las formulaciones acuosas de la presente invención (Ejemplos 6 a 9).

[Aplicabilidad industrial]

La presente invención hace posible proporcionar una formulación acuosa que contiene ustekinumab de excelente estabilidad y una formulación acuosa en jeringa que contiene la misma y un agente de desagregación de proteínas de anticuerpos capaz de desagregar ustekinumab agregado y un método de desagregación de proteínas de anticuerpos. Por esta razón, también se espera que mejore la estabilidad de la formulación acuosa que contiene ustekinumab, reduzca la supresión de la acción farmacológica y mejore aún más la seguridad, como por ejemplo una inmunogenicidad reducida.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una formulación acuosa que comprende:

ustekinumab;

al menos uno seleccionado entre histidina y sales de la misma; y

agua, en donde

un contenido de ustekinumab es de 80 a 100 mg/ml,

un contenido de histidina y/o sus sales es de 50 a 90 mM en términos de histidina y

su pH es de 5,7 a 6,3.

2. La formulación acuosa de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además metionina, en donde el contenido de metionina es de 10 a 50 mM.

3. La formulación acuosa de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende además sacarosa.

4. La formulación acuosa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, formada mezclando ustekinumab y una solución tampón de histidina.

5. Una formulación acuosa en jeringa que comprende una jeringa y la formulación acuosa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 cargada en la jeringa.

6. Un método de desagregación de proteínas de anticuerpos para desagregar ustekinumab agregado, que comprende la etapa de:

añadir un agente de desagregación de proteínas de anticuerpo al ustekinumab agregado para obtener una formulación acuosa de acuerdo con la reivindicación 1,

en donde el agente de desagregación de proteínas de anticuerpo desagrega ustekinumab agregado y comprende: al menos uno seleccionado entre histidina y sales de la misma; y agua,

en donde un contenido de histidina y/o sus sales es de 50 a 90 mM en términos de histidina, y su pH es de 5,7 a 6,3.

7. El método de desagregación de proteínas de anticuerpos de la reivindicación 6, en donde el agente de desagregación de proteínas de anticuerpo comprende además metionina, en donde un contenido de la metionina es de 5 a 50 mM.

8. El método de desagregación de proteínas de anticuerpos de la reivindicación 6 o 7, en donde el agente de desagregación de proteínas de anticuerpos comprende además sacarosa.