ES2985387T3

ES2985387T3 - Proteína de fusión que comprende proteína IL-2 y proteína CD80, y uso de las mismas

Info

Publication number: ES2985387T3
Application number: ES19862449T
Authority: ES
Inventors: Myung Ho Jang
Original assignee: GI Innovation Inc
Current assignee: GI Innovation Inc
Priority date: 2018-09-17
Filing date: 2019-09-16
Publication date: 2024-11-05
Anticipated expiration: 2039-09-16
Also published as: CN111971295A; US12286464B2; US11492384B2; EP4403635A2; US20250230212A1; BR112020015030A2; TWI755630B; TW202028227A; KR102558191B1; CN111971295B; MX2020007072A; SG11202005873QA; JP2022115876A; HUE068059T2; EP4403635A3; ZA202003645B; CA3086486A1; KR102201086B1; TWI824258B; PT3715367T

Abstract

La presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende una proteína IL-2 y una proteína CD80. Una proteína de fusión que comprende un fragmento CD80, un Fc de inmunoglobulina y una variante IL-2, en una realización, puede activar células inmunitarias, como las células asesinas naturales, y, al mismo tiempo, puede controlar la actividad reguladora de las células inmunitarias de las células T reguladoras. Por lo tanto, una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión como ingrediente activo puede aumentar la actividad inmunitaria in vivo y puede usarse de manera eficaz no solo para el cáncer sino también para enfermedades infecciosas, y por lo tanto es altamente aplicable industrialmente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteína de fusión que comprende proteína IL-2 y proteína CD80, y uso de las mismas

Campo técnico

La presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende una proteína variante de IL-2 y un fragmento de CD80, un dímero del mismo, un polinucleótido que codifica dicha proteína de fusión, un vector que comprende el polinucleótido, una célula transformada en la que se ha introducido el vector y una composición farmacéutica de la misma o proteína de fusión o dímero de la misma para uso en la prevención o el tratamiento del cáncer o una enfermedad infecciosa.

Técnica antecedente

La interleucina 2 (IL-2), también llamada factor de crecimiento de células T (TCGF), es una glicoproteína globular que desempeña un papel central en la producción, supervivencia y homeostasis de los linfocitos. IL-2 tiene un tamaño de proteína de 15.5 kDa a 16 kDa y consiste en 133 aminoácidos. La IL-2 media varias acciones inmunitarias uniéndose a un receptor de IL-2 compuesto por tres subunidades distintas.

Además, la IL-2 es sintetizada principalmente por células T activadas, en particular por células T auxiliares CD4+. La IL-2 estimula la proliferación y diferenciación de células T e induce la producción de linfocitos T citotóxicos (CTL) y la diferenciación de linfocitos de sangre periférica en células citotóxicas y células asesinas activadas por linfocinas (células LAK).

Además, la IL-2 participa en la proliferación y diferenciación de las células B, promueve la síntesis de inmunoglobulinas por parte de las células B y estimula la producción, proliferación y activación de las células asesinas naturales (células NK). Por lo tanto, la IL-2 se utiliza como agente anticancerígeno, porque puede aumentar las poblaciones de linfocitos y aumentar la función de las células inmunitarias en el cuerpo vivo. Actualmente, la terapia con IL-2 ha sido aprobada y utilizada para pacientes con carcinoma de células renales metastásico y melanoma maligno.

Sin embargo, la IL-2 tiene una función dual en las respuestas inmunes en el sentido de que es importante no sólo para mediar en un aumento en el número de células inmunes y la actividad de las mismas, sino también para mantener la tolerancia inmune. Además, se ha informado que la IL-2 puede no ser óptima para inhibir el crecimiento tumoral. La razón es que en presencia de IL-2, puede ocurrir muerte celular inducida por activación (AICD) en los linfocitos T citotóxicos resultantes y las respuestas inmunes pueden ser inhibidas por células T reguladoras dependientes de IL-2 (células Treg) (Imai et al., Cancer Sci 98, 416-423, 2007).

Además, en pacientes que han recibido inmunoterapia con IL-2 se producen efectos secundarios cardiovasculares, pulmonares, renales, hepáticos, gastrointestinales, neuronales, cutáneos, hematológicos y sistémicos graves. Por lo tanto, se han estudiado varias mutaciones de IL-2 para mejorar la eficacia terapéutica de la IL-2 y minimizar los efectos secundarios de la misma (US 5,229,109 B). Sin embargo, todavía quedan muchos problemas por resolver para utilizar la IL-2 con fines farmacológicos.

Mientras tanto, CD80, también conocido como B7-1, es un miembro de la familia B7 de proteínas unidas a membrana que participan en la regulación inmune al unirse a su ligando mediante la administración de respuestas coestimuladoras y respuestas coinhibitorias. CD80 es una proteína transmembrana expresada en la superficie de células T, células B, células dendríticas y monocitos. Se sabe que CD80 se une a c D28, CTLA4 (CD152) y PD-L1. CD80, CD86, CTLA4 y CD28 participan en un sistema coestimulador-coinhibidor. Por ejemplo, regulan la actividad de las células T y participan en su proliferación, diferenciación y supervivencia.

Por ejemplo, cuando CD80 y CD86 interactúan con CD28, se generan señales coestimuladoras para activar las células T. Eventualmente, CD80 se une a CTLA4 y estimula CTLA4 para ser sobrerregulada. Como resultado, CD80 inhibe las respuestas de las células T antes de la activación de la respuesta inmune causada por la interacción CD80/CD28. Este circuito de retroalimentación permite una regulación fina de las respuestas inmunitarias.

Además, se sabe que CD80 se une a PD-L1, otro miembro de la familia B7, con una afinidad similar a la que CD28 se une a PD-L1. PD-L1 es conocido como uno de los dos ligandos de la proteína de muerte programada-1 (PD-1), y se sabe que PD-L1 participa en la regulación de las células T. La unión de CD80 a PD-L1 es otro mecanismo que puede bloquear la interacción PD-1/PD-L1, lo que puede prevenir la inhibición de las respuestas de las células T en los tumores. Al mismo tiempo, sin embargo, un aumento en los niveles de CD80 hace que CD80 se una a CD28 de modo que se induce CTLA4, induciendo o inhibiendo así las respuestas de las células T.

KONG LINGHONG ET AL: "Expression of fusion IL2-B7.1(IgV+C) and effects on T lymphocytes", BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY BIOCHIMIE ET BIOLOGIE CELLULAIRE., vol. 85, no. 6, 1 de diciembre de 2007 (2007-12-01), páginas 685-695 divulgan una proteína de fusión que comprende IL-2 y la región extracelular completa de CD80 (B7.1) (IgV+C) con una región espadadora flexible.

CHAN ET AL: "1131. Generation of Whole Cell Vaccines for Acute Myeloid Leukaemia by Lentivirus Mediated IL-2/CD80 Transduction", MOLECULAR THERAPY, NO LONGER PUBLISHED BY ELSEVIER, vol. 11, 15 de agosto de 2005 (2005-08-15), página 436 informa el uso de una columna vertebral lentiviral autoinactivante para coexpresar eficientemente CD80 e IL-2 como una única proteína de fusión en blastos de AML primaria. WO 2017/220989 A1 (KYMAB LIMITED) y su solicitud relacionada US 9567399 B1 divulgan una proteína de fusión que comprende una región Fc y una citoquina IL-2.

BARBEE, S. D. et al.: "Abstract B005: FPT155, a novel therapeutic CD 80-Fc fusion protein with potent antitumor activity in preclinical models", AACR-NCI-EORTC International Conference. Molecular Targets and Cancer Therapeutics, 26 de octubre de 2017 (2017-10-26), Filadelfia, PA informa una proteína de fusión CD80 (B7.1) dominio extracelular (ECD)-Fc (FPT155).

XIAOYING CHEN et al: "Fusion protein linkers: Property, design and functionality", NIH PUBLIC ACCESS AUTHOR MANUSCRIPT, 1 de octubre de 2013, páginas 1-32 describe el uso de dominios Fc como enlazadores en proteínas de fusión.

Divulgación de la invención

Problema técnico

Los presentes inventores han estudiado para desarrollar IL-2 que sea segura y eficaz. Como resultado, los presentes inventores han descubierto que una nueva proteína de fusión que comprende, en una molécula, una proteína variante de IL-2 y un fragmento de CD80 puede activar células inmunitarias y regular eficazmente las células Treg.

Solución al problema

Para lograr el objetivo anterior, en un aspecto de la presente invención, se proporciona una proteína de fusión que comprende una proteína variante de IL-2 y un fragmento de CD80, en la que la proteína de fusión consiste en la siguiente fórmula estructural (I):

N'-X-[enlazador (1)]n-dominio Fc-[enlazador (2)]m-Y-C' (I)

en la fórmula estructural (I),

N' es el N-terminal de la proteína de fusión,

C' es el C-terminal de la proteína de fusión,

X es el fragmento CD80, en el que el fragmento CD80 consiste enl aminoácido 35° al aminoácido 242° en la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 11,

Y es la proteína variante de IL-2, en la que la variante de IL-2 se obtiene mediante sustitución de al menos uno seleccionado entre los aminoácidos 38°, 42°, 45°, 61° y 72° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10,

los enlazadores (1 ) y (2) son enlazadores peptídicos,

y n y m son cada uno independientemente 0 o 1.

En una realización, la variante de IL-2 se obtiene mediante al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en R38A, F42A, Y45A, E61R y L72G en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

En una realización, la variante de IL-2 contiene una cualquiera seleccionada de las siguientes combinaciones de sustitución (a) a (d) en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10:

(a) R38A/F42A

(b) R38A/F42A/Y45A

(c) R38A/F42A/E61R

(d) R38A/F42A/L72G.

En una realización, la variante de IL-2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 22, 23 o 24.

En una realización, el dominio Fc es un tipo salvaje o una variante, preferiblemente en donde la variante del dominio Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

En una realización, el dominio Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

En una realización, el enlazador (1) consiste en 5 a 80 aminoácidos contiguos y el enlazador (2) consiste en 1 a 50 aminoácidos contiguos.

En una realización, el enlazador (1) es un enlazador peptídico que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y/o el enlazador (2) es un enlazador peptídico que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

En una realización, la proteína de fusión tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, 26, 28 o 30. En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un dímero de proteína de fusión obtenido uniendo las dos proteínas de fusión entre sí, preferiblemente en el que el dímero de proteína de fusión es un homodímero. En aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido que codifica la proteína de fusión de cualquiera de los aspectos o realizaciones anteriores.

En una realización, el polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8, 25, 27 o 29.

En todavía otro aspecto de la presente invención, se proporciona un vector que comprende el polinucleótido del aspecto anterior.

En todavía otro aspecto de la presente invención, se proporciona una célula transformada en la que se ha introducido el vector del aspecto anterior.

En todavía otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para uso en la prevención o el tratamiento del cáncer o una enfermedad infecciosa, en la que la composición farmacéutica comprende como ingrediente activo la proteína de fusión o el dímero de proteína de fusión de cualquiera de los aspectos o realizaciones anteriores.

En una realización, la composición farmacéutica para uso según el aspecto anterior comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización, la composición farmacéutica se utiliza para prevenir o tratar cualquier cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer cervical, cáncer de tiroides, cáncer de laringe, leucemia mieloide aguda, tumor cerebral, neuroblastoma, retinoblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de glándulas salivales y linfoma.

En una realización, la composición farmacéutica se utiliza para prevenir o tratar cualquier enfermedad infecciosa seleccionada del grupo que consiste en hepatitis B, hepatitis C, infección por el virus del papiloma humano, infección por citomegalovirus, enfermedad respiratoria viral, e influenza.

En todavía otro aspecto de la presente invención, se proporciona la proteína de fusión o el dímero de proteína de fusión de cualquiera de los aspectos o realizaciones anteriores para uso en el tratamiento del cáncer o una enfermedad infecciosa.

El asunto objeto al que se hace referencia a continuación como "descrito en el presente documento" o como "un ejemplo" no forma parte de la invención reivindicada como tal, que se define en las reivindicaciones, pero se considera útil para comprender o interpretar la invención. En el presente documento se describe además un uso de la proteína de fusión para la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer o una enfermedad infecciosa.

Efectos ventajosos de la invención

Una proteína de fusión que comprende una proteína IL-2 y una proteína CD80 no sólo puede activar las células inmunitarias gracias a la IL-2, sino que también regula eficazmente las células Treg gracias a la CD80. Por lo tanto, la proteína de fusión puede atacar las células cancerosas de una manera eficaz y, por tanto, puede emplearse útilmente para el tratamiento del cáncer o de una enfermedad infecciosa.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra un ejemplo esquemático de una proteína de fusión.

La figura 2 ilustra un mecanismo mediante el cual la proteína de fusión regula dos tipos diferentes de células inmunitarias; sin embargo, debe entenderse que el mecanismo por el cual se expresa la acción de la proteína de fusión no se limita a éste.

La Fig. 3 ilustra un mecanismo por el cual la proteína de fusión exhibe un efecto anticancerígeno.

La Fig. 4 ilustra una vista esquemática de la estructura de la proteína de fusión. Aquí, cada uno de GI101 y mGI101 es un ejemplo de la proteína de fusión en este documento, y GI101C1, GM01C2 y mGI101C1 son ejemplos comparativos para comparar con la actividad de la proteína de fusión.

La Fig. 5 ilustra varios ejemplos de la proteína de fusión del presente documento. Se pueden combinar proteínas derivadas de humanos y de ratón para preparar una proteína de fusión. La proteína CD80 y la proteína IL-2 pueden unirse entre sí mediante diversos enlazadores distintos de Fc.

La Fig. 6 ilustra un resultado obtenido identificando la proteína de fusión obtenida (GI101) con SDS-PAGE. La Fig. 7 ilustra cantidades de la proteína de fusión (GI101) dependiendo de la absorbancia.

La Fig. 8 ilustra un resultado obtenido analizando la proteína de fusión obtenida (GI101) mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).

La Fig. 9 ilustra un resultado obtenido identificando la proteína de fusión mGI101 obtenida con SDS-PAGE. La Fig. 10 ilustra los resultados obtenidos identificando la proteína de fusión GI101C1 obtenida con SDS-PAGE. La Fig. 11 ilustra los resultados obtenidos identificando la proteína de fusión GI101C2 obtenida con SDS-PAGE. La Fig. 12 ilustra un resultado obtenido identificando la proteína de fusión mGI101C1 obtenida con SDS-PAGE. La Fig. 13 ilustra los resultados obtenidos identificando la proteína de fusión GI102-M45 obtenida con SDS-PAGE.

La Fig. 14 ilustra los resultados obtenidos identificando la proteína de fusión GI102-M61 obtenida con SDS-PAGE.

La Fig. 15 ilustra los resultados obtenidos identificando la proteína de fusión GI102-M72 obtenida con SDS-PAGE.

La Fig. 16 ilustra la afinidad de unión entre hCTLA4 y GI101.

La Fig. 17 ilustra la afinidad de unión entre hPD-L1 y GI101.

La Fig. 18 ilustra la afinidad de unión entre hPD-L1 y hPD-1.

La Fig. 19 ilustra la afinidad de unión entre mCTLA4 y mGI101.

La Fig. 20 ilustra la afinidad de unión entre mPD-L1 y mGI101.

Las Figs. 21 y 22 ilustran los resultados obtenidos identificando la capacidad de unión entre GI-101 (hCD80-Fc-hIL-2v) y CTLA-4, y entre GI-101 (hCD80-Fc-hIL-2v) y PD-L1. Se identificó que GI-101 (hCD80-Fc-hIL-2v) tiene una alta capacidad de unión para CTLA-4 y PD-L1.

La Fig. 23 ilustra un efecto de GI101 sobre la unión de PD-1/PD-L1. GI101 inhibió eficazmente la unión de PD-1/PD-L1.

La Fig. 24 ilustra los resultados obtenidos identificando la afinidad de unión entre GI101 e IL-2Ra o IL-2Rp. La Fig. 25 ilustra los resultados obtenidos identificando la afinidad de unión entre GI101 e IL-2Ra.

La Fig. 26 ilustra los resultados obtenidos identificando la afinidad de unión entre GI101 e IL-2Rp.

La Fig. 27 ilustra los resultados obtenidos identificando la afinidad de unión entre IL-2Ra y GI102-M45.

La Fig. 28 ilustra los resultados obtenidos identificando la afinidad de unión entre IL-2Ra y GI102-M61.

La Fig. 29 ilustra los resultados obtenidos identificando la afinidad de unión entre IL-2Ra y GI102-M72.

La Fig. 30 ilustra los resultados obtenidos identificando la afinidad de unión entre IL-2RP y GI102-M45.

La Fig. 31 ilustra los resultados obtenidos identificando la afinidad de unión entre IL-2RP y GI102-M61.

La Fig. 32 ilustra los resultados obtenidos identificando la afinidad de unión entre IL-2RP y GI102-M72.

Las Figs. 33 y 34 ilustran los resultados obtenidos midiendo cantidades de IFN-y secretadas por las células cuando las células se someten a tratamiento con GI101, GI101C1, GI101C2 o IL-2 en concentraciones respectivas y se realiza la incubación.

Las Figs. 35 y 36 ilustran los resultados obtenidos identificando los efectos de GI101, GI101C1, GI101C2 e IL-2 (Proleukin) sobre la proliferación de células T CD8+.

La Fig. 37 ilustra los resultados obtenidos identificando los efectos de GI101 y GI102 sobre la proliferación de células T CD8+ y células T CD4+. Aquí, la Fig. 37A ilustra proporciones de células T CD8+ y células T CD4+, la Fig. 37B ilustra la capacidad de proliferación de células T CD8+ y la Fig. 37C ilustra una proporción de células Treg CD4+/FoxP3+.

Las Figs. 38 y 39 ilustran los resultados obtenidos identificando los efectos de GI101 y GI 101 w sobre la proliferación de células T CD8+ y células NK.

Las Figs. 40 y 41 ilustran los resultados obtenidos identificando un efecto de GI101 sobre las células T efectoras.

La Fig. 42 ilustra los resultados obtenidos identificando los efectos de mGI101 y mGI102-M61 en células inmunes de ratón.

Las Figs. 43 y 44 ilustran los resultados obtenidos identificando un efecto de GI101 en células cancerosas que sobreexpresan PD-L1.

Las Figs. 45 y 46 ilustran los resultados obtenidos identificando un efecto inhibidor tumoral de GI101 en ratones trasplantados de células de cáncer colorrectal derivadas de ratón.

La Fig. 47 ilustra los resultados obtenidos identificando un efecto inhibidor de tumores de mGI101 en ratones trasplantados de melanoma derivado de ratón.

La Fig. 48 ilustra la inhibición tumoral de mGI101 en ratones trasplantados de melanoma derivado de ratón. La Fig. 49 ilustra los resultados obtenidos identificando un efecto inhibidor tumoral de mGI101, dependiendo de su dosis, en ratones trasplantados de células de cáncer colorrectal derivadas de ratón.

La Fig. 50 ilustra los resultados obtenidos analizando la tasa de supervivencia de ratones trasplantados de células de cáncer colorrectal derivadas de ratón que recibieron mGI101.

La Fig. 51 ilustra los resultados obtenidos identificando un efecto inhibidor de tumores de GI101 en ratones trasplantados de células de cáncer colorrectal derivadas de ratón.

La Fig. 52 ilustra los resultados obtenidos sometiendo ratones trasplantados de células de cáncer colorrectal derivadas de ratón a tratamiento con hIgG4, anticuerpo anti-PD-1 o GI101, y luego analizando, con FACS, células T CD8+, células T IFN-y, células T CD4+ y células Treg en tejidos cancerosos.

La Fig. 53 ilustra gráficamente los resultados obtenidos sometiendo ratones trasplantados de células de cáncer colorrectal derivadas de ratón a tratamiento con hIgG4, anticuerpo anti-PD-1 o GI101, y luego analizando, con FACS, células T CD8+, células T IFN-y, células T CD4+ y células Treg en tejidos cancerosos.

La Fig. 54 ilustra los resultados obtenidos sometiendo ratones trasplantados de células de cáncer colorrectal derivadas de ratón a tratamiento con hIgG4, anticuerpo anti-PD-1 o GI101, y luego analizando, con FACS, macrófagos en tejidos cancerosos.

La Fig. 55 ilustra gráficamente los resultados obtenidos sometiendo ratones trasplantados de células de cáncer colorrectal derivadas de ratón a tratamiento con hIgG4, anticuerpo anti-PD-1 o GI101, y luego analizando, con FACS, macrófagos en tejidos cancerosos.

La Fig. 56 ilustra los resultados obtenidos sometiendo ratones trasplantados de células de cáncer colorrectal derivadas de ratón a tratamiento con hIgG4, anticuerpo anti-PD-1 o GI101, y luego analizando, con FACS, células dendríticas en tejidos cancerosos.

La Fig. 57 ilustra gráficamente los resultados obtenidos sometiendo ratones trasplantados de células de cáncer colorrectal derivadas de ratón a tratamiento con hIgG4, anticuerpo anti-PD-1 o GI101, y luego analizando, con FACS, células dendríticas en tejidos cancerosos.

La Fig. 58 ilustra los resultados obtenidos identificando un efecto inhibidor de tumores de GI101 en ratones trasplantados con células de cáncer de pulmón derivadas de ratón.

La Fig. 59 ilustra gráficamente los resultados obtenidos sometiendo ratones trasplantados con células de cáncer de pulmón derivadas de ratón a tratamiento con hIgG4, anticuerpo anti-PD-1 o GI101, y luego analizando, con FACS, células T CD8+, células T IFN-y, células T CD4+ y células Treg en tejidos cancerosos. La Fig. 60 ilustra gráficamente los resultados obtenidos sometiendo ratones trasplantados de células de cáncer de pulmón derivadas de ratón a tratamiento con hIgG4, anticuerpo anti-PD-1 o GI101, y luego analizando, con FAC<s>, macrófagos en tejidos cancerosos.

La Fig. 61 ilustra gráficamente los resultados obtenidos sometiendo ratones trasplantados de células de cáncer de pulmón derivadas de ratón a tratamiento con hIgG4, anticuerpo anti-PD-1 o GI101, y luego analizando, con FACS, células dendríticas en tejidos cancerosos.

La Fig. 62 ilustra los resultados obtenidos identificando un efecto inhibidor de tumores de mGI102-M61 en ratones trasplantados de células de cáncer colorrectal derivadas de ratón.

La Fig. 63 ilustra los resultados obtenidos analizando la tasa de supervivencia de ratones trasplantados de células de cáncer colorrectal derivadas de ratón que recibieron mGIl02-M61.

La Fig. 64 ilustra los resultados obtenidos identificando un efecto inhibidor de tumores de mGI101 en ratones trasplantados de células de cáncer colorrectal derivadas de ratón.

La Fig. 65 ilustra la inhibición tumoral de mGI101 en ratones trasplantados de células de cáncer colorrectal derivadas de ratón.

La Fig. 66 ilustra los resultados obtenidos realizando observaciones clínicas de 15 días para monos que recibieron PBS o GI101.

Las Figs. 67 y 68 ilustran los resultados obtenidos midiendo los pesos corporales en los días -1 , 1, 8 y 15 para monos que recibieron PBS o GI101.

La Fig. 69 ilustra el consumo de alimentos durante 15 días para monos que recibieron PBS o GI101.

Las Figs. 70 a 72 ilustran los resultados obtenidos analizando la sangre los días -1, 1, 8 y 15 para monos que recibieron PBS o GI101.

Las Figs. 73 a 79 ilustran los resultados obtenidos realizando análisis clínicos y químicos los días -1, 1, 8 y 15 para monos que recibieron PBS o GI101.

Las Figs. 80 y 81 ilustran los resultados obtenidos analizando citoquinas en los días -1, 1, 8 y 15 para monos que recibieron PBS o GI101.

Las Figs. 82 a 87 ilustran los resultados obtenidos analizando células inmunes en los días -1, 1, 8 y 15 para monos que recibieron PBS o GI101.

La Fig. 88 ilustra los resultados obtenidos sacrificando, el día 16, monos que habían recibido PBS o GI101 para obtener tejidos del bazo, y analizando patológicamente los tejidos del bazo.

La Fig. 89 ilustra proteínas de fusión, en cada una de las cuales la proteína CD80 y la proteína IL-2 están unidas a una proteína transportadora. Específicamente, la Fig. 89A ilustra la proteína de fusión en la que la proteína CD80 y la proteína IL-2 están unidas al N-terminal y al C-terminal de la proteína portadora, respectivamente. Además, la Fig. 89B ilustra la proteína de fusión en la que la proteína c D80 y la proteína IL-2 están unidas al C-terminal y al N-terminal de la proteína portadora, respectivamente.

Las referencias aquí a métodos de tratamiento deben interpretarse como referencias a los agentes de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

Proteína de fusión que comprende proteína IL-2 y proteína CD80.

En el presente documento se describe una proteína de fusión que comprende una proteína IL-2 y una proteína CD80.

Como se usa en el presente documento, el término "IL-2" o "interleucina-2", a menos que se indique lo contrario, se refiere a cualquier IL-2 de tipo salvaje obtenida de cualquier fuente de vertebrados, incluidos mamíferos, por ejemplo, primates (tales como humanos) y roedores (como ratones y ratas). La IL-2 se puede obtener a partir de células animales y también incluye una obtenida a partir de células recombinantes capaces de producir IL-2. Además, la IL-2 puede ser IL-2 de tipo salvaje o una variante de la misma.

En la presente memoria descriptiva, la IL-2 o una variante de la misma se puede expresar colectivamente mediante el término "proteína iL-2" o "polipéptido de IL-2". La IL-2, una proteína IL-2, un polipéptido de IL-2 y una variante de IL-2 se unen específicamente, por ejemplo, a un receptor de IL-2. Esta unión específica puede identificarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica.

IL-2 puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 o SEQ ID NO: 36. En este caso, la IL-2 también puede estar en una forma madura. Específicamente, la IL-2 madura puede no contener una secuencia señal y puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. En este caso, la IL-2 puede usarse bajo un concepto que abarca un fragmento de IL-2 de tipo salvaje en el que una porción del N-terminal o del C-terminal de la IL-2 de tipo salvaje está truncada.

Además, el fragmento de IL-2 puede estar en una forma en la que 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos contiguos están truncados desde el N-terminal de una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 o SEQ ID NO: 36. Además, el fragmento de IL-2 puede estar en una forma en la que 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos contiguos están truncados desde el C-terminal de una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 o SEQ ID NO: 36.

Como se usa en el presente documento, el término "variante de IL-2" se refiere a una forma en la que una porción de aminoácidos en la IL-2 de longitud completa o el fragmento de IL-2 descrito anteriormente está sustituido. Es decir, una variante de IL-2 puede tener una secuencia de aminoácidos diferente de la IL-2 de tipo salvaje o un fragmento de la misma. Sin embargo, una variante de IL-2 puede tener una actividad equivalente o similar a la IL-2 de tipo salvaje. En el presente documento, "actividad de IL-2" puede, por ejemplo, referirse a la unión específica a un receptor de IL-2, unión específica que puede medirse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Específicamente, se puede obtener una variante de IL-2 mediante la sustitución de una porción de aminoácidos en la IL-2 de tipo salvaje. Un ejemplo de la variante de IL-2 obtenida mediante sustitución de aminoácidos se puede obtener mediante sustitución de al menos uno de los aminoácidos 38°, 42°, 45°, 61°, y 72° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

Específicamente, la variante de IL-2 puede obtenerse mediante sustitución de al menos uno del 38°, 42°, 45°, 61°, o 72° aminoácido en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 con otro aminoácido. Además, cuando la IL-2 está en una forma en la que una porción del N-terminal en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 está truncado, el aminoácido en una posición correspondiente complementariamente a la de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 puede sustituirse con otro aminoácido. Por ejemplo, cuando IL-2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, su variante IL-2 se puede obtener mediante sustitución de al menos uno del 58°, 62°, 65°, 81°, o el 92° aminoácido en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 con otro aminoácido. Estos residuos de aminoácidos corresponden a los residuos de aminoácidos 38°, 42°, 45°, 61°, y 72° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, respectivamente. Se pueden sustituir uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoácidos siempre que dicha variante de IL-2 mantenga la actividad de IL-2. Pueden sustituirse de uno a cinco aminoácidos.

Una variante de IL-2 puede estar en una forma en la que dos aminoácidos estén sustituidos. Específicamente, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 38° y 42° aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Además, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 38° y 45° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Además, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 38° y 61° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Además, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los<aminoácidos 38° y 72° en la secuencia de aminoácidos de SEQ>I<d NO: 10. Además, la variante de IL-2 se>puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 42° y 45° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Además, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 42° y 61° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Además, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 42° y 72° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Además, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 45° y 61° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Además, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los<aminoácidos 45° y 72° en la secuencia de aminoácidos de SEQ>I<d NO: 10. Además, la variante de IL-2 se>puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 61° y 72° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

Además, una variante de IL-2 puede estar en una forma en la que tres aminoácidos estén sustituidos. Específicamente, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 38°, 42° y 45° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Además, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 38°, 42°, y 61° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Además, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 38°, 42°, y 72° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Además, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 38°, 45°, y 61° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Además, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 38°, 45°, y 72° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Además, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 38°, 61°, y 72° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Además, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 42, 45°, y 61° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Además, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 42°, 45°, y 72° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Además, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 45°, 61°, y 72° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

Además, una variante de IL-2 puede estar en una forma en la que cuatro aminoácidos estén sustituidos. Específicamente, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 38°, 42°, 45°, y 61° aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Además, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 38°, 42°, 45°, y 72° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Además, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 38°, 45°, 61°, y 72° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Además, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 38°, 42°, 61°, y 72° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Además, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de los aminoácidos 42°, 45°, 61°, y 72° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

Además, una variante de IL-2 puede estar en una forma en la que cinco aminoácidos estén sustituidos. Específicamente, la variante de IL-2 se puede obtener mediante sustitución de cada uno de los aminoácidos 38°, 42°, 45°, 61°, y 72° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 con otro aminoácido.

Aquí, el "otro aminoácido" introducido mediante la sustitución puede ser cualquiera seleccionado del grupo que consiste en alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina. Sin embargo, con respecto a la sustitución de aminoácidos por la variante de IL-2, en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, el aminoácido 38° no puede sustituirse por arginina, el aminoácido 42° no puede sustituirse por fenilalanina, el aminoácido 45° no puede sustituirse por tirosina, el 61° aminoácido no puede sustituirse por ácido glutámico y el aminoácido 72° no se puede sustituir por leucina.

Respecto a la sustitución de aminoácidos por una variante de IL-2, en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, el aminoácido 38°, arginina puede sustituirse por un aminoácido distinto de arginina. Preferiblemente, con respecto a la sustitución de aminoácidos por una variante de IL-2, en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, el aminoácido 38°, arginina puede sustituirse por alanina (R38A).

Respecto a la sustitución de aminoácidos por una variante de IL-2, en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, el aminoácido 42°, fenilalanina puede sustituirse por un aminoácido distinto de la fenilalanina. Preferiblemente, con respecto a la sustitución de aminoácidos por una variante de IL-2, en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, el aminoácido 42°, fenilalanina puede sustituirse por alanina (F42A).

Respecto a la sustitución de aminoácidos por una variante de IL-2, en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, el aminoácido 45°, tirosina puede sustituirse por un aminoácido distinto de tirosina. Preferiblemente, con respecto a la sustitución de aminoácidos por una variante de IL-2, en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, el aminoácido 45°, tirosina puede sustituirse por alanina (Y45A).

Respecto a la sustitución de aminoácidos por una variante de IL-2, en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, el aminoácido 61°, ácido glutámico puede sustituirse por un aminoácido distinto del ácido glutámico. Preferiblemente, con respecto a la sustitución de aminoácidos por una variante de IL-2, en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, el aminoácido 61°, ácido glutámico puede sustituirse por arginina (E61R).

Respecto a la sustitución de aminoácidos por una variante de IL-2, en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, el aminoácido 72°, leucina puede sustituirse por un aminoácido distinto de leucina. Preferiblemente, con respecto a la sustitución de aminoácidos por una variante de IL-2, en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, el aminoácido 72°, leucina puede sustituirse por glicina (L72G).

Específicamente, se puede obtener una variante de IL-2 mediante al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en R38A, F42A, Y45A, E61R y L72G, en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

Específicamente, se puede obtener una variante de IL-2 mediante sustituciones de aminoácidos en dos, tres, cuatro o cinco posiciones entre las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en R38A, F42A, Y45A, E61R y L72G.

Además, una variante de IL-2 puede estar en una forma en la que dos aminoácidos estén sustituidos. Específicamente, se puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones, R38A e F42A. Además, se puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones, R38A e Y45A. Además, se puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones, R38A y E61R. Además, se puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones, R38A y L72G. Además, se puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones, F42A e Y45A. Además, se puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones, F42A y E61R. Además, se puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones, F42A y L72G. Además, se puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones, E61R y L72G.

Además, una variante de IL-2 puede estar en una forma en la que tres aminoácidos estén sustituidos.

Específicamente, se puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones, R38A, F42A e Y45A.

Además, se puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones, R38A, F42A y E61R. Además, se

puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones, R38A, F42A y L72G. Además, se puede obtener

una variante de IL-2 mediante las sustituciones, R38A, Y45A y E61R. Además, se puede obtener una variante

de IL-2 mediante las sustituciones, R38A, Y45A y L72G. Además, se puede obtener una variante de IL-2

mediante las sustituciones, F42A, Y45A y E61R. Además, se puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones, F42A, Y45A y L72G. Además, se puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones,

F42A, E61R y L72G. Además, se puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones, Y45A, E61R

y L72G.

Además, una variante de IL-2 puede estar en una forma en la que cuatro aminoácidos estén sustituidos.

Específicamente, se puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones, R38A, F42A, Y45A y E61R.

Además, se puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones, R38A, F42A, Y45A y Además, se puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones, R38A, F42A, E61R y L72G.

Además, se puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones, R38A, Y45A, E61R y L72G.

Además, se puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones, F42A, Y45A, E61R y L72G.

Además, se puede obtener una variante de IL-2 mediante las sustituciones, R38A, F42A, Y45A, E61R y L72G.

Preferiblemente, la variante de IL-2 puede contener cualquiera de las siguientes combinaciones de sustitución

(a) a (d) en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10:

(a) R38A/F42A

(b) R38A/F42A/Y45A

(c) R38A/F42A/E61R

(d) R38A/F42A/L72G

Aquí, cuando IL-2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, puede estar presente una sustitución

de aminoácidos en una posición que corresponde complementariamente a la de la secuencia de aminoácidos

de SEQ ID NO: 10. Además, incluso cuando IL-2 es un fragmento de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID

NO: 35, puede estar presente una sustitución de aminoácidos en una posición que corresponde complementariamente a la de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

Específicamente, una variante de IL-2 puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 22, 23 o 24.

Además, una variante de IL-2 puede caracterizarse por tener baja toxicidadin vivo.Aquí, la baja toxicidadin

vivopuede ser un efecto secundario causado por la unión de IL-2 a la cadena alfa del receptor de IL-2 (IL-2Ra).

Se han desarrollado diversas variantes de IL-2 para mejorar el efecto secundario causado por la unión de IL-2

a IL-2Ra, y dichas variantes de IL-2 pueden ser las divulgadas en la Patente US No. 5,229,109 y la Patente

coreana N° 1667096. En particular, las variantes de IL-2 descritas en la presente solicitud tienen una baja

capacidad de unión para la cadena alfa del receptor de IL-2 (IL-2Ra) y por tanto tienen toxicidadin vivomenor

que la IL-2 de tipo salvaje.

Como se usa en el presente documento, el término "CD80", también llamado "B7-1", es una proteína de membrana presente en células dendríticas, células B activadas y monocitos. CD80 proporciona señales coestimuladoras esenciales para la activación y supervivencia de las células T CD80 se conoce como ligando

de dos proteínas diferentes, CD28 y CTLA-4, presentes en la superficie de las células T CD80 está compuesto

por 288 aminoácidos y puede tener específicamente la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. Además,

como se utiliza en el presente documento, el término "proteína CD80" se refiere a la CD80 de longitud completa

o a un fragmento de CD80.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "fragmento de CD80" se refiere a una forma escindida

de CD80. Además, el fragmento CD80 puede ser un dominio extracelular de CD80. Se puede obtener un

ejemplo del fragmento CD80 mediante la eliminación de los aminoácidos 1° a 34° del N-terminal que son una

secuencia señal de CD80. Específicamente, el fragmento CD80 puede ser una proteína compuesta por los aminoácidos 35° a 288° aminoácidos en SEQ ID NO: 11. Además, el fragmento CD80 puede ser una proteína compuesta por los 35° a 242° aminoácidos en SEQ ID NO: 11. Además, el fragmento CD80 puede ser una

proteína compuesta por los 35° a 232° aminoácidos en SEQ ID NO: 11. Además, el fragmento CD80 puede ser

una proteína compuesta por los aminoácidos 35° al 139° en SEQ ID NO: 11. Además, el fragmento CD80 puede

ser una proteína compuesta por los aminoácidos 142° a 242° en SEQ ID NO: 11. El fragmento CD80 puede

tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Además, la proteína IL-2 y la proteína CD80 pueden unirse entre sí mediante un enlazador o un vehículo.

Específicamente, la IL-2 o una variante de la misma y la CD80 (B7-1) o un fragmento de la misma pueden

unirse entre sí mediante un enlazador o un portador. En la presente descripción, el enlazador y el portador se pueden usar indistintamente.

El enlazador enlaza dos proteínas. El enlazador puede incluir de 1 a 50 aminoácidos, albúmina o un fragmento de la misma, un dominio Fc de una inmunoglobulina o similares. Aquí, el dominio Fc de inmunoglobulina se refiere a una proteína que contiene la región constante 2 de la cadena pesada (CH2) y la región constante 3 de la cadena pesada (CH3) de una inmunoglobulina, y no contiene regiones variables de las cadenas pesada y ligera ni la región constante 1 de la cadena ligera (CH1) de una inmunoglobulina. La inmunoglobulina puede ser IgG, IgA, IgE, IgD o IgM, y preferiblemente puede ser IgG4. Aquí, el dominio Fc de la inmunoglobulina G4 de tipo salvaje puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

Además, el dominio Fc de una inmunoglobulina puede ser una variante del dominio Fc así como un dominio Fc de tipo salvaje. Además, como se usa en el presente documento, el término "variante del dominio Fc" puede referirse a una forma que es diferente del dominio Fc de tipo salvaje en términos de patrón de glicosilación, tiene una alta glicosilación en comparación con el dominio Fc de tipo salvaje, o tiene una glicosilación baja en comparación con el dominio Fc de tipo salvaje, o una forma desglicosilada. Además, se incluye en el mismo un dominio Fc aglicosilado. El dominio Fc o una variante del mismo puede adaptarse para tener un número ajustado de ácidos siálicos, fucosilaciones o glicosilaciones, mediante condiciones de cultivo o manipulación genética de un huésped.

Además, la glicosilación del dominio Fc de una inmunoglobulina puede modificarse mediante métodos convencionales tales como métodos químicos, métodos enzimáticos y métodos de ingeniería genética que utilizan microorganismos. Además, la variante del dominio Fc puede estar en una forma mixta de regiones Fc respectivas de inmunoglobulinas, IgG, IgA, IgE, IgD e IgM. Además, la variante del dominio Fc puede estar en una forma en la que algunos aminoácidos del dominio Fc están sustituidos por otros aminoácidos. La variante del dominio Fc puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

La proteína de fusión puede tener una estructura en la que, usando un dominio Fc como enlazador (o portador), una proteína CD80 y una proteína IL-2, o una proteína IL-2 y una proteína CD80 están unidas al N-terminal y C-terminal del enlazador o portador, respectivamente (Fig. 89). El enlace entre el N-terminal o el C-terminal del dominio Fc y CD-80 o IL-2 puede lograrse opcionalmente mediante un péptido enlazador.

Específicamente, una proteína de fusión puede consistir en la siguiente fórmula estructural (I) o (II):

N'-X-[enlazador (1)]n-dominio Fc-[enlazador (2)]m-Y-C' (I)

N'-Y-[enlazador (1)]n-dominio Fc-[enlazador (2)]m-X-C' (II)

Aquí, en las fórmulas estructurales (I) y (II),

N' es el N-terminal de la proteína de fusión,

C' es el C-terminal de la proteína de fusión,

X es una proteína CD80,

Y es una proteína IL-2,

los enlazadores (1 ) y (2) son enlazadores peptídicos, y

n y m son cada uno independientemente 0 o 1.

Preferiblemente, la proteína de fusión puede consistir en la fórmula estructural (I). La proteína IL-2 es como se describió anteriormente. Además, la proteína CD80 es como se describió anteriormente. La proteína IL-2 puede ser una variante de IL-2 con una a cinco sustituciones de aminoácidos en comparación con la IL-2 de tipo salvaje. La proteína CD80 puede ser un fragmento obtenido mediante truncamiento de hasta aproximadamente 34 residuos de aminoácidos contiguos del N-terminal o C-terminal de la CD80 de tipo salvaje. Alternativamente, la proteína CD puede ser un dominio extracelular similar a una inmunoglobulina que tiene la actividad de unirse a los receptores de superficie de células T CTLA-4 y CD28.

Específicamente, la proteína de fusión puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, 26, 28 o 30. La proteína de fusión puede incluir un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, 26, 28 o 30. En este caso, la identidad es, por ejemplo, el porcentaje de homología y puede determinarse mediante un software de comparación de homologías tal como el software BlastN del National Center of Biotechnology Information (NCBI).

El enlazador peptídico (1) puede incluirse entre la proteína CD80 y el dominio Fc. El enlazador peptídico (1) puede consistir en 5 a 80 aminoácidos contiguos, de 20 a 60 aminoácidos contiguos, de 25 a 50 aminoácidos contiguos o de 30 a 40 aminoácidos contiguos. El enlazador peptídico (1) puede consistir en 30 aminoácidos. Además, el enlazador peptídico (1) puede contener al menos una cisteína. Específicamente, el enlazador peptídico (1) puede contener una, dos o tres cisteínas. Además, el enlazador peptídico (1) puede derivar de la bisagra de una inmunoglobulina. El enlazador peptídico (1) puede ser un enlazador peptídico que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

El enlazador peptídico (2) puede consistir en 1 a 50 aminoácidos contiguos, de 3 a 30 aminoácidos contiguos o de 5 a 15 aminoácidos contiguos. El enlazador peptídico (2) puede ser (G4S)n (donde n es un número entero de 1 a 10). Aquí, en (G4S)n, n puede ser 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. El enlazador peptídico (2) puede ser un enlazador peptídico que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

En el presente documento se describe además un dímero obtenido mediante la unión de dos proteínas de fusión, cada una de las cuales comprende una proteína IL-2 y una proteína CD80. La proteína de fusión que comprende IL-2 o una variante de la misma y CD80 o un fragmento de la misma es como se describió anteriormente.

Aquí, la unión entre las proteínas de fusión que constituyen el dímero se puede lograr mediante, pero no se limita a, un enlace disulfuro formado por cisteínas presentes en el enlazador. Las proteínas de fusión que constituyen el dímero pueden ser proteínas de fusión iguales o diferentes entre sí. Preferiblemente, el dímero puede ser un homodímero. La proteína de fusión que constituye el dímero puede ser una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

Proteína de fusión que codifica polinucleótidos

En el presente documento se describe además un polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende una proteína IL-2 y una proteína CD80. Específicamente, el polinucleótido puede contener la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8, 25, 27 o 29. La proteína de fusión que comprende una proteína IL-2 y una proteína CD80 es como se describió anteriormente. En el polinucleótido, uno o más nucleótidos pueden alterarse mediante sustitución, deleción, inserción o una combinación de los mismos. Cuando se prepara una secuencia de nucleótidos mediante síntesis química, se pueden usar métodos sintéticos bien conocidos en la técnica, como los descritos en Engels y Uhlmann (Angew Chem IntEd Eng., 37: 73-127, 1988). Dichos métodos pueden incluir métodos de triéster, fosfito, fosforamidita y H-fosfato, PCR y otros métodos de autocebadores, síntesis de oligonucleótidos sobre soportes sólidos y similares.

El polipéptido puede contener una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad con la SEQ ID NO: 8, 25, 27 o 29, de al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 86 %, al menos aproximadamente 87 %, al menos aproximadamente 88 %, al menos aproximadamente 89 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 91 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 %.

El polinucleótido puede contener además un ácido nucleico que codifica una secuencia señal o una secuencia líder. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "secuencia señal" se refiere a un péptido señal que dirige la secreción de una proteína diana. El péptido señal se traduce y luego se escinde en una célula huésped. Específicamente, la secuencia señal es una secuencia de aminoácidos que inicia la migración de una proteína a través de la membrana del retículo endoplásmico (ER). La secuencia señal puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Las secuencias señal son bien conocidas en la técnica por sus características. Dichas secuencias señal contienen típicamente de 16 a 30 residuos de aminoácidos y pueden contener más o menos residuos de aminoácidos que dichos residuos de aminoácidos. Un péptido señal típico se compone de tres regiones, es decir, una región N-terminal básica, una región hidrófoba central y una región C-terminal más polar. La región hidrófoba a central contiene de 4 a 12 residuos hidrófobos que hacen que la secuencia señal se inmovilice durante la migración de un polipéptido inmaduro a través de la bicapa lipídica de la membrana.

Después del inicio, las secuencias señal se escinden en el lumen del ER mediante enzimas celulares, comúnmente conocidas como peptidasas señal. Aquí, la secuencia señal puede ser una secuencia señal secretora de tPa (activador del plasminógeno tisular), gDs del HSV (secuencia señal de la glicoproteína D del virus del herpes simple) o una hormona del crecimiento. Preferiblemente, se puede usar una secuencia señal secretora utilizada en células eucariotas superiores, incluidos mamíferos y similares. Además, se puede usar una secuencia señal incluida en la IL-2 y/o CD-80 de tipo salvaje, o se puede usar una secuencia señal que ha sido sustituida con un codón que tiene una alta frecuencia de expresión en una célula huésped.

Vector con polinucleótido que codifica la proteína de fusión

En el presente documento se describe además un vector que comprende el polinucleótido.

El vector puede introducirse en una célula huésped para ser recombinado e insertado en el genoma de la célula huésped. O bien, se entiende por vector un ácido nucleico que contiene una secuencia de polinucleótidos que es replicable de forma autónoma como un episoma. Los vectores incluyen ácidos nucleicos lineales, plásmidos, fagémidos, cósmidos, vectores de ARN, vectores virales y análogos de los mismos. Los ejemplos del vector viral incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados.

Específicamente, el vector puede incluir ADN plasmídico, ADN de fago y similares; y plásmidos desarrollados comercialmente (pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP y similares), plásmidos derivados de E. coli (pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 y similares), plásmidos derivados de Bacillus subtilis (pUB 110, pTP5 y similares), plásmidos derivados de levadura (YEp13, YEp24, YCp50 y similares), ADN de fagos (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, A gt10, A gt11, A ZAP y similares), vectores virales animales (retrovirus, adenovirus, virus vaccinia y similares), vectores virales de insectos (baculovirus y similares). Dado que el vector presenta diferentes niveles de expresión y modificación de una proteína dependiendo de la célula huésped, se prefiere seleccionar y utilizar una célula huésped que sea más adecuada para el propósito.

Como se usa en el presente documento, se entiende que el término "expresión génica" o "expresión" de una proteína diana significa transcripción de secuencias de ADN, traducción de transcritos de ARNm y secreción de productos de proteínas de fusión o fragmentos de los mismos. Un vector de expresión útil puede ser RcCMV (Invitrogen, Carlsbad) o una variante del mismo. Los vectores de expresión pueden contener además un promotor del citomegalovirus humano (CMV) para promover la transcripción continua de un gen diana en células de mamífero, y una secuencia señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina para aumentar el nivel de estabilidad del ARN después de la transcripción.

Célula transformada que expresa proteína de fusión.

En el presente documento se describe además una célula transformada en la que se ha introducido el vector.

Las células huésped para la célula transformada pueden incluir, pero no se limitan a, células procariotas, células eucariotas y células de origen de mamífero, vegetal, insecto, fúngico o bacteriano. Como ejemplo de células procariotas, se puede utilizar E. coli. Además, como ejemplo de células eucariotas, se puede utilizar levadura. Además, para las células de mamífero, se pueden usar células CHO, células F2N, células CSO, células BHK, células de melanoma de Bowes, células HeLa, células 911, células AT1080, células A549, células HEK 293, células HEK293T o similares. Sin embargo, las células de mamífero no se limitan a ellas, y se puede utilizar cualquier célula que los expertos en la técnica conozcan como utilizable como célula huésped de mamífero.

Además, se puede usar para la introducción de un vector de expresión en la célula huésped, la precipitación de CaCh, método de Hanahan cuya eficiencia se ha incrementado mediante el uso de un agente reductor tal como el dimetilsulfóxido (DMSO) en precipitación de CaCh, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, fusión de protoplastos, agitación usando fibra de carburo de silicio, transformación mediada por Agrobacterias, transformación usando PEG, sulfato de dextrano, lipofectamina, o transformación seca/mediada por inhibición, o similares.

Como se describió anteriormente, para optimizar las propiedades de una proteína de fusión como agente terapéutico o para cualquier otro propósito, el patrón de glicosilación de la proteína de fusión (por ejemplo, ácidos siálicos, fucosilaciones, glicosilaciones) se puede ajustar manipulando, mediante métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, genes relacionados con la glicosilación que poseen las células huésped.

Método para producir una proteína de fusión

En el presente documento se describe además un método para producir una proteína de fusión que comprende una proteína IL-2 y una proteína CD80, comprendiendo el método cultivar las células transformadas. Específicamente, el método de producción puede comprender i) cultivar las células transformadas para obtener un cultivo; y ii) recolectar la proteína de fusión del cultivo.

El cultivo de las células transformadas se puede llevar a cabo usando métodos bien conocidos en la técnica. Específicamente, el cultivo puede llevarse a cabo en un proceso discontinuo, o realizarse de forma continua en un proceso discontinuo alimentado o en un proceso discontinuo alimentado repetidamente.

Uso de proteína de fusión o dímero de la misma

Se describe además en el presente documento una composición farmacéutica para tratar o prevenir el cáncer o una enfermedad infecciosa, y/o para aumentar la eficacia en el tratamiento del cáncer o una enfermedad infecciosa, comprendiendo la composición, como ingrediente activo, una proteína de fusión que comprende una proteína IL-2 y una proteína<c>D80 o un dímero de proteína de fusión donde están unidas las dos proteínas de fusión.

La proteína de fusión que comprende una proteína IL-2 y una proteína CD80, o el dímero de proteína de fusión donde están unidas las dos proteínas de fusión es como se describió anteriormente.

El cáncer puede seleccionarse del grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer cervical, cáncer de tiroides, cáncer de laringe, leucemia mieloide aguda, tumor cerebral, neuroblastoma, retinoblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de glándulas salivales y linfoma. Además, la enfermedad infecciosa puede ser cualquiera seleccionada del grupo que consiste en hepatitis B, hepatitis C, infección por el virus del papiloma humano (HPV), infección por citomegalovirus, enfermedad respiratoria viral e influenza.

Una dosis preferida de la composición farmacéutica varía dependiendo del estado y peso corporal del paciente, gravedad de la enfermedad, forma del fármaco, vía y duración de la administración y puede ser seleccionada apropiadamente por los expertos en la técnica. En la composición farmacéutica para tratar o prevenir el cáncer o una enfermedad infecciosa de la presente invención, el ingrediente activo puede estar contenido en cualquier cantidad (cantidad eficaz) dependiendo de la aplicación, la forma de dosificación, el propósito de la mezcla y similares, siempre que el ingrediente activo puede exhibir actividad anticancerígena o un efecto terapéutico sobre una enfermedad infecciosa. Una cantidad eficaz convencional del mismo se determinará dentro de un rango de 0.001 % a 20.0 % en peso, basado en el peso total de la composición. Aquí, el término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un ingrediente activo capaz de inducir un efecto anticancerígeno o un efecto de tratamiento de enfermedades infecciosas. Dicha cantidad eficaz puede determinarse experimentalmente dentro del alcance del conocimiento común de los expertos en la técnica.

Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" puede usarse para significar tratamiento tanto terapéutico como profiláctico. Aquí, profilaxis puede usarse para significar que se alivia o mitiga una condición o enfermedad patológica de un individuo. El término "tratamiento" puede incluir tanto la aplicación como cualquier forma de administración para tratar una enfermedad en un mamífero, incluido un ser humano. Además, el término incluye inhibir o ralentizar una enfermedad o la progresión de una enfermedad; e incluye significados de restaurar o reparar una función deteriorada o perdida de modo que una enfermedad se alivie parcial o completamente; estimular procesos ineficientes; o aliviar una enfermedad grave.

Como se usa en el presente documento, el término "eficacia" se refiere a la capacidad que puede determinarse mediante uno o parámetros, por ejemplo, supervivencia o supervivencia libre de enfermedad durante un cierto período de tiempo tal como un año, cinco años o diez años. Además, el parámetro puede incluir la inhibición del tamaño de al menos un tumor en un individuo.

Los parámetros farmacocinéticos como la biodisponibilidad y los parámetros subyacentes como la tasa de eliminación también pueden afectar la eficacia. Por lo tanto, la "eficacia potenciada" (por ejemplo, mejora en la eficacia) puede deberse a parámetros farmacocinéticos potenciados y eficacia mejorada, que pueden medirse comparando la tasa de eliminación y el crecimiento tumoral en animales de prueba o sujetos humanos, o comparando parámetros tales como la supervivencia, recurrencia o supervivencia libre de enfermedad.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto o composición eficaz para prevenir o tratar la enfermedad en cuestión, que es suficiente para tratar la enfermedad con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable al tratamiento médico y no causa efectos adversos. Se puede determinar un nivel de la cantidad eficaz dependiendo de factores que incluyen el estado de salud del paciente, el tipo y la gravedad de la enfermedad, la actividad del fármaco, la sensibilidad del paciente al fármaco, el modo de administración, el tiempo de administración, la vía de administración y la tasa de excreción, la duración del tratamiento, formulación o fármacos utilizados simultáneamente, y otros factores bien conocidos en el campo médico. La cantidad terapéuticamente eficaz puede significar una cantidad de fármaco eficaz para tratar el cáncer.

Aquí, la composición farmacéutica puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser cualquier vehículo siempre que sea una sustancia no tóxica adecuada para su administración a un paciente. Como vehículo pueden contener agua destilada, alcohol, grasa, cera y un sólido inerte. La composición farmacéutica también puede contener un adyuvante farmacéuticamente aceptable (tampón, dispersante).

Específicamente, al incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable además del ingrediente activo, la composición farmacéutica se puede preparar en una formulación parenteral dependiendo de su vía de administración usando métodos convencionales conocidos en la técnica. Aquí, el término "farmacéuticamente aceptable" significa que el vehículo no tiene más toxicidad de la que el sujeto al que se va a aplicar (recetar) puede adaptar sin inhibir la actividad del ingrediente activo.

Cuando la composición farmacéutica se prepara en una formulación parenteral, se puede preparar en forma de inyecciones, parches transdérmicos, inhaladores nasales o supositorios con vehículos adecuados según métodos conocidos en la técnica. En caso de preparación para inyecciones, se puede utilizar como vehículo adecuado agua esterilizada, etanol, poliol tal como glicerol o propilenglicol, o una mezcla de los mismos; y preferiblemente se puede usar una solución isotónica, tal como solución de Ringer, solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene trietanolamina o agua estéril para inyección y dextrosa al 5%, o similar. La formulación de composiciones farmacéuticas se conoce en la técnica y se puede hacer referencia específicamente a Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995) y similares. Este documento se considera parte de la presente descripción.

Una dosis preferida de la composición farmacéutica puede oscilar entre 0.01 pg/kg y 10 g/kg, o entre 0.01 mg/kg y 1 g/kg, por día, dependiendo del estado del paciente, peso corporal, sexo, edad, gravedad del paciente y vía de administración. La dosis puede administrarse una vez al día o dividirse en varias veces al día. Dicha dosis no debe interpretarse como limitante del alcance de la presente invención en ningún aspecto.

Los sujetos a los que se puede aplicar (prescribir) la composición farmacéutica son mamíferos y humanos, siendo particularmente preferidos los seres humanos. Además del ingrediente activo, la composición farmacéutica de la presente solicitud puede contener además cualquier compuesto o extracto natural, cuya seguridad ya haya sido validada y se sepa que tiene actividad anticancerígena o un efecto terapéutico sobre una enfermedad infecciosa, para potenciar o reforzar la actividad anticancerígena.

En el presente documento se describe además el uso de una proteína de fusión que comprende una proteína IL-2 y una proteína CD80 para tratar el cáncer o una enfermedad infecciosa.

En el presente documento se describe además el uso de una proteína de fusión que comprende una proteína IL-2 y una proteína CD80 para potenciar un efecto terapéutico sobre el cáncer o una enfermedad infecciosa.

En el presente documento se describe además el uso de una proteína de fusión que comprende una proteína IL-2 y una proteína CD80 para la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer o una enfermedad infecciosa.

Se describe además en el presente documento un método para tratar el cáncer o una enfermedad infecciosa, y/o un método para mejorar un efecto terapéutico sobre el cáncer o una enfermedad infecciosa, que comprende administrar, a un sujeto, una proteína de fusión que comprende una proteína IL-2 y una proteína CD80 o un dímero de proteína de fusión donde se unen las dos proteínas de fusión.

El sujeto puede ser un individuo que padece cáncer o una enfermedad infecciosa. Además, el sujeto puede ser un mamífero, preferiblemente un humano. La proteína de fusión que comprende una proteína lL-2 y una proteína CD80, o el dímero de proteína de fusión donde están unidas las dos proteínas de fusión es como se describió anteriormente.

La vía de administración, la dosis y la frecuencia de administración de la proteína de fusión o del dímero de proteína de fusión pueden variar dependiendo del estado del paciente y de la presencia o ausencia de efectos secundarios, y por tanto la proteína de fusión o el dímero de proteína de fusión se pueden administrar a un sujeto en diversas formas y cantidades. Los expertos en la técnica pueden seleccionar el método de administración, la dosis y la frecuencia de administración óptimos en un rango apropiado. Además, la proteína de fusión o el dímero de proteína de fusión se pueden administrar en combinación con otros fármacos o sustancias fisiológicamente activas cuyo efecto terapéutico se conoce con respecto a una enfermedad a tratar, o se pueden formular en forma de preparaciones de combinación con otros fármacos.

Debido a la actividad de IL-2, la proteína de fusión descrita en el presente documento puede activar células inmunitarias tales como las células asesinas naturales. Por tanto, la proteína de fusión se puede utilizar eficazmente para el cáncer y las enfermedades infecciosas. En particular, se identificó que, en comparación con el tipo salvaje, una variante de IL-2 con dos a cinco sustituciones de aminoácidos, en particular, una variante de IL-2 que contiene sustituciones de aminoácidos en dos, tres, cuatro o cinco posiciones entre las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en R38A, F42A, Y45A, E61R y L72G, tiene una baja capacidad de unión para la cadena alfa del receptor de IL-2 y por lo tanto exhibe características mejoradas con respecto a los efectos secundarios farmacológicos de la IL-2 convencional. Por lo tanto, dicha variante de IL-2, cuando se usa sola o en forma de una proteína de fusión, puede disminuir la incidencia del síndrome de fuga vascular (o capilar) (VLS), un problema con la IL-2 convencionalmente conocido.

Modo para la invención

En lo sucesivo, la presente invención se describirá con más detalle mediante los siguientes ejemplos. Sin embargo, los siguientes ejemplos son sólo para ilustrar la presente invención.

I. Preparación de proteína de fusión.

Ejemplo de preparación 1. Preparación de la variante hCD80-Fc-IL-2 (2M): GI101

Para producir una proteína de fusión que comprende un fragmento de CD80 humano, un dominio Fc y una variante de IL-2, se sintetizó un polinucleótido a través del servicio de síntesis de genes Invitrogen GeneArt de ThermoFisher Scientific. Específicamente, el polinucleótido contiene una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 8) que codifica una proteína de fusión que contiene un péptido señal (SEQ ID NO: 1), un fragmento de CD80 (SEQ ID NO: 2), una bisagra Ig (SEQ ID NO: 3), un dominio Fc (SEQ ID NO: 4), un enlazador (SEQ ID NO: 5), y una variante de IL-2 (2M) (R38A, F42A) (SEQ ID NO: 6) que tiene dos sustituciones de aminoácidos, en este orden, desde el N-terminal. El polinucleótido se insertó en el vector pcDNA3_4. Además, el vector se introdujo en células CHO (Expi-CHO™) para expresar la proteína de fusión de SEQ ID NO: 9. Después de la introducción del vector, el cultivo se realizó durante 7 días en un ambiente de 37 °C, 125 RPM y concentración de 8 % de CO2. Luego, se recolectó el cultivo y se purificó la proteína de fusión del mismo. La proteína de fusión purificada se denominó "GI101".

La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía que contenía resina de proteína AMabSelect SuRe. La proteína de fusión se unió al mismo en condiciones de Tris 25 mM, NaCl 25 mM, pH 7.4. Luego, se realizó la elución con NaCl 100 mM, ácido acético 100 mM, pH 3. Se colocó Tris-HCl 1 M al 20 % a pH 9 en un tubo de recolección y luego se recolectó la proteína de fusión. Para la proteína de fusión recolectada, el tampón se intercambió mediante diálisis con tampón PBS durante 16 horas.

Posteriormente, se midió la absorbancia a una longitud de onda de 280 nm, a lo largo del tiempo, con cromatografía de exclusión por tamaño utilizando una columna TSKgel G3000SWXL (TOSOH Bioscience), para obtener una proteína de fusión altamente concentrada. Aquí, la proteína de fusión aislada y purificada se<sometió a SDS-PAGE en condiciones reducidas (R) o no reducidas>(N<r>)<y se tiñó con azul de Coomassie para>comprobar su pureza (Fig. 6). Se identificó que la proteína de fusión estaba contenida en una concentración de 2.78 mg/ml cuando se detectó con NanoDrop (Fig. 7). Además, en la Fig. 8 se proporcionan los resultados obtenidos mediante análisis usando cromatografía de exclusión por tamaño.

Ejemplo de preparación 2. Preparación de la variante mCD80-Fc-IL-2 (2M): mGI101

Para producir una proteína de fusión que comprende un CD80 de ratón, un dominio Fc y una variante de IL-2, se sintetizó un polinucleótido a través del servicio de síntesis genética Invitrogen GeneArt de ThermoFisher Scientific. Específicamente, el polinucleótido contiene una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 14) que codifica una proteína de fusión que contiene un péptido señal (SEQ ID NO: 1), un mCD80 (SEQ ID NO: 13),<una bisagra Ig (SEQ ID NO: 3), un dominio Fc>(S<e>Q<ID NO: 4), un enlazador (SEQ ID NO: 5), y una variante de IL-2 (2M) (R38A, F42A)>(<s>E<q ID NO: 6) con dos sustituciones de aminoácidos, en este orden, desde el N->terminal. El polinucleótido se insertó en el vector pcDNA3_4. Además, el vector se introdujo en células CHO (Expi-CHO™) para expresar la proteína de fusión de SEQ ID NO: 15. Después de la introducción del vector, el cultivo se realizó durante 7 días en un ambiente de 37 °C, 125 RPM y concentración de 8 % de CO2. Luego, se recolectó el cultivo y se purificó la proteína de fusión del mismo. La proteína de fusión purificada se denominó "mGI101".

La purificación y recolección de la proteína de fusión se llevaron a cabo de la misma manera que en el Ejemplo de preparación 1. La proteína de fusión aislada y purificada se sometió a SDS-PAGE en condiciones reducidas (R) o no reducidas (NR) y se tiñó con azul de Coomassie para comprobar su pureza (Fig. 9). Se descubrió que la proteína de fusión estaba contenida en una concentración de 1.95 mg/ml cuando se detectó mediante absorbancia a 280 nm usando NanoDrop.

Ejemplo de preparación 3. Preparación de hCD80-Fc: GI101C1

Para producir una proteína de fusión que comprende un fragmento de CD80 humano y un dominio Fc, se sintetizó un polinucleótido a través del servicio de síntesis de genes Invitrogen GeneArt de ThermoFisher Scientific. Específicamente, el polinucleótido contiene una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 16) que codifica una proteína de fusión que contiene un péptido señal (SEQ ID NO: 1), un fragmento de CD80 (SEQ ID NO: 2), una bisagra Ig (SEQ ID NO: 3), y un dominio Fc (SEQ ID NO: 4). El polinucleótido se insertó en el vector pcDNA3_4. Además, el vector se introdujo en células CHO (Expi-CHO™) para expresar la proteína de fusión de SEQ ID NO: 17. Después de la introducción del vector, el cultivo se realizó durante 7 días en un ambiente de 37 °C, 125 RPM y concentración de 8 % de CO2. Luego, se recolectó el cultivo y se purificó la proteína de fusión del mismo. La proteína de fusión purificada se denominó "GI101C1".

La purificación y recolección de la proteína de fusión se llevaron a cabo de la misma manera que en el Ejemplo de preparación 1. La proteína de fusión aislada y purificada se sometió a SDS-PAGE en condiciones reducidas (R) o no reducidas (NR) y se tiñó con azul de Coomassie para comprobar su pureza (Fig. 10). Se observó que la proteína de fusión estaba contenida en una concentración de 3.61 mg/ml cuando se detectó mediante absorbancia a 280 nm usando NanoDrop.

Ejemplo de preparación 4. Preparación de la variante Fc-IL-2 (2M): GI101C2

Para producir una proteína de fusión que comprende un dominio Fc y una variante de IL-2, se sintetizó un polinucleótido a través del servicio de síntesis genética Invitrogen GeneArt de ThermoFisher Scientific. Específicamente, el polinucleótido contiene una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 18) que codifica una proteína de fusión que contiene un péptido señal (SEQ ID NO: 1), un dominio Fc (SEQ ID NO: 4), un enlazador (SEQ ID NO: 5), y una variante de IL-2 (2M) (R38A, F42A) (SEQ ID NO: 6) con dos sustituciones de aminoácidos, en este orden, desde el N-terminal. El polinucleótido se insertó en el vector pcDNA3_4. Además, el vector se introdujo en células CHO (Expi-CHO™) para expresar la proteína de fusión de SEQ ID NO: 19.

Después de la introducción del vector, el cultivo se realizó durante 7 días en un ambiente de 37 °C, 125 RPM y concentración de 8 % de CO2. Luego, se recolectó el cultivo y se purificó la proteína de fusión del mismo. La proteína de fusión purificada se denominó "GI101C2".

La purificación y recolección de la proteína de fusión se llevaron a cabo de la misma manera que en el Ejemplo de preparación 1. La proteína de fusión aislada y purificada se sometió a SDS-PAGE en condiciones reducidas<(R) o no reducidas>(N<r>)<y se tiñó con azul de Coomassie para comprobar su pureza (Fig. 11). Se descubrió>que la proteína de fusión estaba contenida en una concentración de 4.79 mg/ml cuando se detectó mediante absorbancia a 280 nm usando NanoDrop.

Ejemplo de preparación 5. Preparación de mCD80-Fc: mGI01C1

Para producir una proteína de fusión que comprende un CD80 de ratón y un dominio Fc, se sintetizó un polinucleótido a través del servicio de síntesis de genes Invitrogen GeneArt de ThermoFisher Scientific. Específicamente, el polinucleótido contiene una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 20) que codifica una proteína de fusión que contiene un péptido señal (SEQ ID NO: 1), un mCD80 (SEQ ID NO: 13), una bisagra Ig<(SEQ ID NO: 3), y un dominio Fc>(<s>E<q ID NO: 4), en este orden, desde el N-terminal. El polinucleótido se>insertó en el vector pcDNA3_4. Además, el vector se introdujo en células CHO (Expi-CHO™) para expresar la proteína de fusión de SEQ ID NO: 21. Después de la introducción del vector, el cultivo se realizó durante 7 días en un ambiente de 37 °C, 125 RPM y concentración de 8 % de CO2. Luego, se recolectó el cultivo y se purificó la proteína de fusión del mismo. La proteína de fusión purificada se denominó "mGI101C1".

La purificación y recolección de la proteína de fusión se llevaron a cabo de la misma manera que en el Ejemplo de preparación 1. La proteína de fusión aislada y purificada se sometió a SDS-PAGE en condiciones reducidas (R) o no reducidas (NR) y se tiñó con azul de Coomassie para comprobar su pureza (Fig. 12). Se observó que la proteína de fusión estaba contenida en una concentración de 2.49 mg/ml cuando se detectó mediante absorbancia a 280 nm usando NanoDrop.

Las proteínas de fusión preparadas en los Ejemplos de preparación 1 a 5 se resumen en la Tabla 1 a continuación.

[Tabla 1]

Ejemplo de preparación 6. Preparación de CD80-Fc-IL-2: GI101w

Para producir una proteína de fusión que comprende un fragmento de CD80 humano, un dominio Fc y una IL-2 humana, se sintetizó un polinucleótido a través del servicio de síntesis de genes Invitrogen GeneArt de ThermoFisher Scientific. Específicamente, el polinucleótido contiene una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 31) que codifica una proteína de fusión que contiene un péptido señal (SEQ ID NO: 1), un fragmento de CD80 (<s>E<q>ID NO: 2), una bisagra Ig (SEQ ID NO: 3), un dominio Fc (SEQ ID NO: 4), un enlazador (SEQ ID NO: 5), e IL-2 humana madura (SEQ ID NO: 10), en este orden, desde el N-terminal. El polinucleótido se insertó en el vector pcDNA3_4. Además, el vector se introdujo en células CHO (Expi-CHO™) para expresar la proteína de fusión de SEQ ID NO: 32. Después de la introducción del vector, el cultivo se realizó durante 7 días en un ambiente de 37 °C, 125 RPM y concentración de 8 % de CO2. Luego, se recolectó el cultivo y se purificó la proteína de fusión del mismo. La proteína de fusión purificada se denominó "GI101w". La purificación y recolección de la proteína de fusión se llevaron a cabo de la misma manera que en el Ejemplo de preparación 1.

Ejemplo de preparación 7. Preparación de la variante hCD80-Fc-IL-2 (3M): GI102-M45

Para producir una proteína de fusión que comprende un fragmento de CD80 humano, un dominio Fc y una<variante de IL-2 (3M) (R38A, F42A,>Y45<a>)<(GI102-M45) con tres sustituciones de aminoácidos, se sintetizó un>polinucleótido a través del Servicio de síntesis de genes Invitrogen GeneArt de ThermoFisher Scientific. Específicamente, el polinucleótido contiene una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 25) que codifica una proteína de fusión que contiene un péptido señal (SEQ ID NO: 1), un fragmento de CD80 (SEQ ID NO: 2), una<bisagra Ig (SEQ ID NO: 3), un dominio Fc (SEQ i>D<NO: 4), un enlazador (SEQ ID NO: 5), y una variante de IL->2 (SEQ ID NO: 22), en este orden, desde el N-terminal. El polinucleótido se insertó en el vector pcDNA3_4. Además, el vector se introdujo en células CHO (Expi-CHO™) para expresar la proteína de fusión de SEQ ID NO: 26. Después de la introducción del vector, el cultivo se realizó durante 7 días en un ambiente de 37 °C, 125 RPM y concentración de 8 % de CO2. Luego, se recolectó el cultivo y se purificó la proteína de fusión del mismo. La proteína de fusión purificada se denominó "GI102-M45".

La purificación y recolección de la proteína de fusión se llevaron a cabo de la misma manera que en el Ejemplo de preparación 1. La proteína de fusión aislada y purificada se sometió a SDS-PAGE en condiciones reducidas (R) o no reducidas (NR) y se tiñó con azul de Coomassie para comprobar su pureza (Fig. 13).

Ejemplo de preparación 8. Preparación de la variante hCD80-Fc-IL-2 (3M): GI102-M61

Para producir una proteína de fusión que comprende un fragmento de CD80 humano, un dominio Fc y una variante de IL-2 (3M) (R38A, F42A, E61R) (GI102-M61) con tres sustituciones de aminoácidos, se sintetizó un polinucleótido a través del Servicio de síntesis de genes Invitrogen GeneArt de ThermoFisher Scientific. Específicamente, el polinucleótido contiene una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 27) que codifica una proteína de fusión que contiene un péptido señal (SEQ ID NO: 1), un fragmento de CD80 (SEQ ID NO: 2), una bisagra Ig (SEQ ID NO: 3), un dominio Fc (SEQ iD NO: 4), un enlazador (SEQ ID NO: 5), y una variante de IL-2 (SEQ ID NO: 23), en este orden, desde el N-terminal. El polinucleótido se insertó en el vector pcDNA3_4. Además, el vector se introdujo en células CHO (Expi-CHO™) para expresar la proteína de fusión de SEQ ID NO: 28. Después de la introducción del vector, el cultivo se realizó durante 7 días en un ambiente de 37 °C, 125 RPM y concentración de 8 % de CO2. Luego, se recolectó el cultivo y se purificó la proteína de fusión del mismo. La proteína de fusión purificada se denominó "GI102-M61".

La purificación y recolección de la proteína de fusión se llevaron a cabo de la misma manera que en el Ejemplo de preparación 1. La proteína de fusión aislada y purificada se sometió a SDS-PAGE en condiciones reducidas (R) o no reducidas (NR) y se tiñó con azul de Coomassie para comprobar su pureza (Fig. 14).

Ejemplo de preparación 9. Preparación de hCD80-Fc-IL-3M: GI102-M72

Para producir una proteína de fusión que comprende un fragmento de CD80 humano, un dominio Fc y una variante de IL-2 (3M) (R38A, F42A, L72G) (GI102-M72) con tres sustituciones de aminoácidos, se sintetizó un polinucleótido a través del Servicio de síntesis de genes Invitrogen GeneArt de ThermoFisher Scientific. Específicamente, el polinucleótido contiene una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 29) que codifica una proteína de fusión que contiene un péptido señal (SEQ ID NO: 1), un fragmento de CD80 (SEQ ID NO: 2), una<bisagra Ig (SEQ ID NO: 3), un dominio Fc (SEQ i>D<NO: 4), un enlazador (SEQ ID NO: 5), y una variante de IL->2 (SEQ ID NO: 24), en este orden, desde el N-terminal. El polinucleótido se insertó en el vector pcDNA3_4. Además, el vector se introdujo en células CHO (Expi-CHO™) para expresar la proteína de fusión de SEQ ID NO: 30. Después de la introducción del vector, el cultivo se realizó durante 7 días en un ambiente de 37 °C, 125 RPM y concentración de 8 % de CO2. Luego, se recolectó el cultivo y se purificó la proteína de fusión del mismo. La proteína de fusión purificada se denominó "GI102-M72".

La purificación y recolección de la proteína de fusión se llevaron a cabo de la misma manera que en el Ejemplo de preparación 1. La proteína de fusión aislada y purificada se sometió a SDS-PAGE en condiciones reducidas (R) o no reducidas (NR) y se tiñó con azul de Coomassie para comprobar su pureza (Fig. 15).

Ejemplo de preparación 10. Preparación de mCD80-Fc-IL-3M: mGI102-M61

Para producir una proteína de fusión que comprende un fragmento CD80 de ratón, un dominio Fc y una variante de IL-2 (3M) (R38A, F42A, E61R) (GI102-M61) con tres sustituciones de aminoácidos, se sintetizó un polinucleótido a través del Servicio de síntesis de genes Invitrogen GeneArt de ThermoFisher Scientific. Específicamente, el polinucleótido contiene una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 33) que codifica una proteína de fusión que contiene un péptido señal (SEQ ID NO: 1), un fragmento de mCD80 (SEQ ID NO: 13),<una bisagra Ig>(S<e>Q<ID NO: 3), un dominio Fc (SEQ ID NO: 4), un enlazador (SEQ ID NO: 5), y una variante>de IL-2 (SEQ ID NO: 23), en este orden, desde el N-terminal. El polinucleótido se insertó en el vector pcDNA3_4. Además, el vector se introdujo en células CHO (Expi-CHO™) para expresar la proteína de fusión de SEQ ID NO: 34. Después de la introducción del vector, el cultivo se realizó durante 7 días en un ambiente de 37 °C, 125 RPM y concentración de 8 % de CO2. Luego, se recolectó el cultivo y se purificó la proteína de fusión del mismo. La proteína de fusión purificada se denominó "mGI102-M61".

La purificación y recolección de la proteína de fusión se llevaron a cabo de la misma manera que en el Ejemplo de preparación 1.

II. Identificación de la afinidad de unión entre la proteína de fusión y su ligando

Para identificar la afinidad de unión entre la proteína de fusión y su ligando, la afinidad de unión se midió usando Octet RED 384.

Ejemplo experimental 1. Identificación de afinidad de unión entre hCTLA-4 y GI101

Biosensor AR2G (Amina Reactiva 2do gen, ForteBio, Cat: 18-5092) se hidrató previamente con 200 j l de agua destilada en una microplaca de 96 pocillos (GreinerBio-one, Cat: 655209). Un ligando (CTLA-4, CTLA-4 humano/CD152, etiqueta His, Sino Biological, Cat: 11159-H08H) que se unirá al biosensor AR2G se diluyó con tampón acetato 10 mM (pH 5, kit de reactivos AR2G, ForteBio, Cat: 18-5095) hasta una concentración de 5 jg/ml. Además, el GI101 que se unirá al ligando se diluyó con tampón cinético AR2G 1X (kit de reactivos AR2G, ForteBio, Cat: 18-5095) a una concentración de 1,000 nM, 500 nM, 250 nM, 125 nM o 62.5 nM. El tampón de activación se preparó mezclando EDC 20 mM y s-NHS 10 mM (kit de reactivos AR2G, ForteBio, Cat: 18-5095) en agua destilada. Se colocaron 80 j l de cada reactivo en una microplaca de 384 pocillos (Greiner Bio-one, Cat: 781209) y se configuró el programa.

Como resultado, se midió la afinidad de unión entre hCTLA-4 y GI101 como se ilustra en la Fig. 16.

Ejemplo experimental 2. Identificación de la afinidad de unión entre hPD-L1/GI101 y hPD-L1/PD-1

Ni-NTA (Tris-NTA cargado con níquel, Ni-NTA Biosensors, ForteBio, 18-5101) se hidrató previamente con 200 j l de tampón cinético Ni-NTA 1X (tampón cinético 10X, ForteBio, 18-1042) en una microplaca de 96 pocillos (GreinerBio-one, Cat: 655209). Un ligando (proteína humana PD-L1/B7-H1, etiqueta His, Sino Biological, Cat: 10084-H08H) que se unirá a los biosensores de Ni-NTA se diluyó con tampón cinético de Ni-NTA 1X hasta una concentración de 5 jg/ml. GI101 que se unirá al ligando se diluyó con tampón cinético Ni-NTA 1X a 1,000 nM, 500 nM, 250 nM, 125 nM o 62.5 nM. Además, PD-1/PDCD1 humano (PD-1/PDCD1 humano, etiqueta Fc, Sino Biological, Cat: 10377-H02H) que se unirá al ligando se diluyó con tampón cinético Ni-NTA 1<x>hasta una concentración de 2000 nM, 1000 nM, 500 nM, 250 nM o 125 nM. Luego, se colocaron 80 j l de cada reactivo en una microplaca de 384 pocillos y se configuró el programa.

Como resultado, se midió la afinidad de unión entre hPD-L1 y GI101 como se ilustra en la Fig. 17. Además, se midió la afinidad de unión entre hPD-L1 y hPD-1 como se ilustra en la Fig. 18.

Ejemplo experimental 3. Identificación de la afinidad de unión entre mCTLA-4 y mGI101

La afinidad de unión entre mCTLA-4 y mGI1Ol se examinó de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 1. En este caso, el equipo utilizado es el siguiente: Biosensor: AR2G, Ligando: mCTLA-4 (quimera CTLA-4 Fc de ratón recombinante, R&D Systems, Cat: 434-CT-200), Analito: mGI101 (500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM, 31.3 nM).

Como resultado, se midió la afinidad de unión entre mCTLA-4 y mGI101 como se ilustra en la Fig. 19.

Ejemplo experimental 4. Identificación de la afinidad de unión entre mPD-L1 y mGI101

La afinidad de unión entre mPD-L1 y mGI 101 se identificó de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 1. Aquí, el equipo utilizado es el siguiente. Biosensor: AR2G, Ligando: mPD-L1 (quimera recombinante de ratón B7-H1/PD-L1 Fc, R&D Systems, Cat: 434-CT-200), Analito: mGI101 (500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM, 31.3 nM).

Como resultado, se midió la afinidad de unión entre mPD-L1 y mGI 101 como se ilustra en la Fig. 20.

Ejemplo experimental 5. Identificación de la capacidad de unión de GI-101 (hCD80-Fc-hIL-2v) a CTLA-4 y PD-L1

Las mediciones de la cinética de unión se realizaron utilizando el instrumento Octet RED 384 (ForteBio, Pall Life Science) con agitación a 30 °C y 1,000 rpm. La capacidad de unión de CTLA-4 se midió utilizando el chip biosensor Amine Reactive 2 generación (AR2G), y la capacidad de unión de PD-L1 se midió utilizando el chip biosensor Tris-NTA (Ni-NTA) cargado con níquel. El chip biosensor AR2G se activó con una combinación de EDC 400 mM y sulfo-NHS 100 mM. Luego, CTLA-4-His Tag humana (Sino Biological, Cat: 11159-H08H) se diluyó con tampón acetato 10 mM (pH 5) a 5 jg/ml, se cargó en el chip biosensor AR2G durante 300 segundos y se fijó.

Luego, la unión de CTLA-4 a GI-101 (hCD80-Fc-hIL-2v), GI-101C1 (hCD80-Fc), Ipilimumab (Bristol-Myers Squibb) y GI-101C2 (Fc-hIL-2v) en diversas concentraciones se midieron durante 300 segundos y también se midió su disociación durante 300 segundos. Por otro lado, la PD-L 1 -His Tag Humana (Sino biological, Cat: 10084-H08H) se diluyó con tampón cinético 1XNi-NTA hasta una concentración de 5 jg/ml, se cargó en el chip biosensor Ni-NTA durante 600 segundos y se fijó. Luego, la unión de PD-L1 a GI-101, GI-101C1, hPD-1-Fc (Sino biological, Cat: 10377-H02H), y GI101C2 en diversas concentraciones se midió durante 300 segundos y también se midió la disociación de los mismos durante 300 segundos. El análisis de la cinética de unión se realizó utilizando el software Octet Data Analysis HT ver. 10 proporcionado por Pall Corporation. Los resultados se ilustran en las Figs. 21 y 22.

Ejemplo experimental 6. Identificación del efecto de GI-101 (hCD80-Fc-hIL-2v) sobre la unión de PD-1/PD-L1

Se realizó un experimento de bloqueo utilizando el instrumento Octet RED 384 (ForteBio, Pall Life Science) con agitación a 30 °C y 1,000 rpm. La PD-L1-His Tag Humana (Sino biological, Gato: 10084-H08H) se diluyó con tampón cinético 1XNi-NTA hasta una concentración de 5 pg/ml, se cargó en el chip biosensor Ni-NTA durante 600 segundos y se fijó. Para continuar con el experimento de bloqueo, se permitió que hPD-L1 fijado en el chip biosensor se uniera a GI-101 en varias concentraciones (300 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM y 0 nM) durante 600 segundos, y luego nuevamente se le permitió unirse al PD-1 humano competidor (100 nM) durante 600 segundos para medir cuánto más hPD-1 se puede unir al mismo. Por el contrario, se permitió que hPD-L1 se uniera a hPD-1 en diversas concentraciones (300 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM y 0 nM) durante 600 segundos, y luego se le permitió nuevamente unirse al competidor GI-101 (100 nM) durante 600 segundos para medir cuánto más Gl-101 puede unirse al mismo. El experimento de bloqueo se analizó utilizando el menú de agrupación de epítopos del software Octet Data Analysis HT ver. 10 proporcionado por Pall Corporation. Los resultados se ilustran en la Fig. 23.

Ejemplo experimental 7. Identificación de la afinidad de unión entre IL-2Ra o IL-2Rp y GI101

La capacidad de unión de IL-2Ra se midió utilizando el biosensor AR2G, y la capacidad de unión de IL-2Rp se midió utilizando los biosensores Ni-NTA (Tris-NTA cargado con níquel, Ni-NTA Biosensors, ForteBio, 18-5101).

Un ligando (IL-2Ra-His Tag, Acro, Cat: ILA-H52H9) que se unirá al biosensor AR2G se diluyó con tampón acetato 10 mM (pH 5, kit de reactivos AR2G, ForteBio, Cat: 18-5095) hasta una concentración de 5 pg/ml. El biosensor AR2G se activó con un tampón preparado mezclando EDC 400 mM y sulfo-NHS 100 mM, y luego el ligando diluido se cargó en el biosensor AR2G durante 300 segundos y se fijó.

Mientras tanto, un ligando (IL-2Rp-His Tag, Aero, Cat: CD2-H5221) que se unirá al biosensor de Ni-NTA se diluyó con tampón cinético de Ni-NTA 1X hasta una concentración de 5 pg/ml. El ligando diluido se cargó en el biosensor Ni-NTA durante 600 segundos y se fijó.

A continuación, se cargó GI101, GI101w, o Proleukin (Novartis, hIL-2), en diversas concentraciones, para unirse al ligando durante 300 segundos. Luego, se midió su unión y también se midió su disociación durante 300 segundos. El análisis de la cinética de unión se realizó utilizando el software Octet Data Analysis HT ver. 10 proporcionado por Pall Corporation. Los resultados se ilustran en las Figs. 24 al 26.

Como resultado, se identificó que GI101 tiene una baja capacidad de unión para la cadena alfa del receptor de IL-2, IL-2Ra, y una alta capacidad de unión para IL-2Rp, en comparación con GllOlw y Proleukin.

Ejemplo experimental 8. Medición de la afinidad de unión entre la proteína de fusión y el ligando

Para identificar la afinidad de unión entre la proteína de fusión y su ligando, se midió la afinidad de unión usando Octet RED 384.

Ejemplo experimental 8.1. Identificación de la afinidad de unión entre el receptor alfa IL2 y GI101-M45, GI101-M61 o GI101-M72

El biosensor AR2G (Amine Reactive 2nd gen, ForteBio, Cat: 18-5092) se hidrató previamente con 200 pl de agua destilada (DW) en una microplaca de 96 pocillos (GreinerBio-one, Cat: 655209). Un ligando (proteína alfa IL-2 R humana, His Tag, Aero, ILA-H52H9) que se unirá al biosensor se diluyó con tampón acetato 10 mM (pH 5) (kit de reactivos AR2G, ForteBio, Cat: 18-5095) hasta una concentración de 5 pg/ml. Un analito (GI101-M45, GM01-M61, GI101-M72) que se unirá al ligando se diluyó con tampón cinético AR2G 1X (kit de reactivos AR2G, ForteBio, Cat: 18-5095) a 500 nM, 250 nM, 125 nM y 62.5 nM, respectivamente. El tampón de activación se preparó mezclando EDC 20 mM y s-NHS 10 mM (kit de reactivos Ar 2G, ForteBio, Cat: 18-5095) en DW. Se colocaron 80 pl de cada reactivo en una microplaca de 384 pocillos (Greiner Bio-one, Cat: 781209) y se configuró el programa.

Como resultado, la afinidad de unión entre el receptor IL2 alfa y GI101-M45 se ilustra en la Fig. 27. Además, la afinidad de unión entre el receptor IL2 alfa y GI101-M61 se ilustra en la Fig. 28, y la afinidad de unión entre el receptor IL2 alfa y GI101-M72 se ilustra en la Fig. 29.

Ejemplo experimental 8.2. Identificación de la afinidad de unión de GI102-M45, GI102-M61 y GI102-M72 a IL-2RP

Los biosensores Ni-NTA se hidrataron previamente con 200 pl de tampón cinético Ni-NTA 1X (tampón cinético 10X, ForteBio, 18-1042) en una microplaca de 96 pocillos. Un ligando (proteína beta IL-2 R humana, His-Tag, Acro, CD2-H5221) que se unirá al biosensor se diluyó con tampón cinético Ni-NTA 1X hasta una concentración de 2 |jg/ml. GI102-M45, GI102-M61 o GI102-M72 que se unirán al ligando se diluyeron con tampón cinético Ni-NTA 1X hasta una concentración de 500 nM, 250 nM, 125 nM o 62.5 nM. Se colocaron 80 j l de cada reactivo en una microplaca de 384 pocillos y se configuró el programa.

Como resultado, la afinidad de unión entre IL-2Rp y GI102-M45 se midió como se ilustra en la Fig. 30, y la afinidad de unión entre IL-2Rp y GI102-M61 se midió como se ilustra en la Fig. 31. Además, se midió la afinidad de unión entre IL-2Rp y GI102-M72 como se ilustra en la Fig. 32.

III. Identificación de la actividad inmune de la proteína de fusión

Ejemplo experimental 9. Identificación de la producción de IFN-y causada por la proteína de fusión

Ejemplo experimental 9.1. Cultivo de PBMCs marcadas con CFSE

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) aisladas de un humano se marcaron con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) haciéndolas reaccionar con colorante CellTrace CFSE 1 jM a 37 °C durante 20 minutos. El CFSE no unido a las células se eliminó haciéndolo reaccionar durante 5 minutos con un medio de cultivo que tenía un volumen 5 veces mayor de la solución de reacción de tinción y luego centrifugándolo a 1,300 rpm durante 5 minutos. Las PBMC marcadas con CFB se resuspendieron en el medio de cultivo (medio RPMI1640 que contenía FBS al 10 %, HEPES 10 mM, penicilina/estreptomicina 100 U/ml, piruvato de sodio 1 mM, 2-mercaptoetanol 55 jM , aminoácidos no esenciales 1 mM, y L-glutamina 2 mM), y luego se añadió a una placa de 96 pocillos a 1*105 células por pocillo. Se realizó el tratamiento con 5 jg/m l de PHA (lactina de Phaseolus vulgaris, frijol riñón rojo, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, Cat. No. L1668-5MG), y GI101, GI101C1, GI101C2 o IL-2 (Aldesleukin; IL-2 recombinante humana, Novartis) y la incubación se realizó en una incubadora de CO2 al 5 % a 37°C durante 6 días.

Aquí, el tratamiento con GI101, GI101C1, GI101C2 e IL-2 se realizó a una concentración de 1 nM, 10 nM o 100 nM. Las células se analizaron mediante FACS y se midió el IFN-y humano presente en el medio de cultivo utilizando un kit ELISA (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat. No. 430103).

Ejemplo experimental 9.2. Análisis FACS

Los sedimentos celulares obtenidos eliminando el sobrenadante se lavaron con tampón FACS (3% FBS, EDTA 10 mM, HEPES 1 M, penicilina estreptomicina 100 unidades/ml, 10 jg/ml, piruvato de sodio 1 mM) y luego reaccionaron con bloqueador de Fc (Bioleyenda, Cat. No. 422302) a 4°C durante 5 minutos. Luego, el tratamiento con Ab ApC anti-CD3 (Biolegend, Cat. No. 300412) y Ab PE anti-CD8a (Biolegend, Cat. No.

300908) y se dejó que la reacción prosiguiera a 4°C durante 20 minutos. Luego, el resultado se lavó con tampón FACS. Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón FACS y luego se analizaron utilizando BD LSR Fortessa (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) y el software FlowJo.

Ejemplo experimental 9.3. ELISA de IFN-y humano

La cantidad de IFN-y humano secretada en el sobrenadante de cada muestra en la que se habían cultivado las células se midió usando un kit ELISA de IFN-<y>humano (Biolegend, Cat. No. 430103). En resumen, se añadieron anticuerpos anti-IFN-Y humano a una placa de ELISA y se dejó que la reacción transcurriera durante la noche a 4°C para que estos anticuerpos quedaran recubiertos sobre la misma. Luego, se realizó el bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hora con una solución de PBS a la que se había añadido BSA al 1%. Se realizó un lavado con un tampón de lavado (Tween-20 al 0.05 % en PBS) y luego se diluyeron adecuadamente y se añadieron a la misma una solución estándar y cada muestra. Luego, se dejó que la reacción prosiguiera a temperatura ambiente durante 2 horas.

Una vez completada la reacción, se lavó la placa y se le añadieron anticuerpos secundarios (anticuerpos de detección). Se dejó que la reacción prosiguiera a temperatura ambiente durante 1 hora. Se realizó un lavado con un tampón de lavado y luego se le añadió una solución de Avidina-HRP. Se dejó que la reacción prosiguiera a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se le añadió una solución de sustrato y se indujo la reacción de desarrollo de color en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos. Finalmente, se añadió H2SO4 al mismo para detener la reacción de desarrollo de color y se midió la absorbancia a 450 nm con un espectrofotómetro de microplacas Epoch (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA).

Como resultado, se encontró que las células tratadas con GI101 exhibieron un aumento notable en la secreción de IFN-y, en comparación con las células tratadas con GI101C1, GI101C2 o IL-2 (Figs. 33 y 34).

Ejemplo experimental 10. Identificación del efecto de GI101 sobre la proliferación de células T CD8+.

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de un humano se marcaron con CFSE haciéndolas reaccionar con colorante CellTrace CFSE 1 jM a 37 °C durante 20 minutos. El CFSE no unido a las células se eliminó haciéndolo reaccionar durante 5 minutos con un medio de cultivo que tenía un volumen 5 veces mayor de la solución de reacción de tinción y luego centrifugándolo a 1,300 rpm durante 5 minutos. Las PBMC marcadas con CFB se resuspendieron en el medio de cultivo (medio RPMI1640 que contenía FBS al 10 %, HEPES 10 mM, penicilina/estreptomicina 100 U/ml, piruvato de sodio 1 mM, 2-mercaptoetanol 55 jM , aminoácidos no esenciales 1 mM, y L-glutamina 2 mM), y luego se añadió a una placa de 96 pocillos a 1*105 células por pocillo.

Posteriormente, se realizó el tratamiento con 1 jg/m l de anticuerpo anti-CD3£ (Biolegend Cat. No. L1668-5MG), y GI101, GI101C1, GI101C2 o Proleukin (Novartis) y la incubación se realizó en una incubadora de CO2 al 5% a 37°C durante 6 días. Aquí, las células se trataron con GI101, GI101C1, GI101C2 e IL-2 a una concentración de 100 nM. Se examinó el grado de proliferación de las células incubadas midiendo, con análisis FACS usando anticuerpos APC-TCRap y PE-CD8a, una proporción de células T CD8+ que no habían sido marcadas con CFSE.

Como resultado, se descubrió que GI101 activaba la proliferación de células T CD8+in vitroen un grado similar a la Proleukin IL-2 de tipo salvaje (Figs. 35 y 36).

Ejemplo experimental 11. Identificación del efecto de GI101 y GI102 sobre la proliferación de células T CD8+

Las PBMC humanas se adquirieron de Allcells (lote # 3014928, USA). Se utilizó colorante CellTrace CFSE 1 M, que se hizo reaccionar con las PBMC humanas en condiciones de bloqueo de la luz a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las células se marcaron con CFSE haciéndolas reaccionar con colorante CellTrace CFSE 1 jM a 37°C durante 20 minutos. El CFSE no unido a las células se eliminó haciéndolo reaccionar durante 5 minutos con un medio de cultivo que tenía un volumen 5 veces mayor de la solución de reacción de tinción y luego centrifugándolo a 1,300 rpm durante 5 minutos. Las PBMC marcadas con CFB se resuspendieron en el medio de cultivo (medio RPMI1640 que contenía FBS al 10 %, HEPES 10 mM, penicilina/estreptomicina 100 U/ml, piruvato de sodio 1 mM, 2-mercaptoetanol 55 jM , aminoácidos no esenciales 1 mM, y L-glutamina 2 mM), y luego se añadió a una placa de 96 pocillos a 1*105 células por pocillo.

Posteriormente, las PBMC marcadas con CFB se sometieron a tratamiento con 1 jg/m l de anticuerpo anti-CD3e (OKT3, eBioscience, USA) y GI101, GI101C1, GI101C2 o Proleukin (Novartis), y la incubación se realizó en una incubadora de CO2 al 5 % a 37°C durante 7 días. Aquí, las células se sometieron a tratamiento con GI101, GI101C1, GI101C2 e IL-2 a una concentración de 10 jM .

Las células incubadas se examinaron para determinar su grado de proliferación midiendo, con análisis FACS usando anticuerpo anti-CD4-PE humano (BioLegend, USA), anticuerpo anti-CD8-PE/Cy7 humano (BioLegend, USA) y anticuerpo anti-FoxP3-APC humano (BioLegend, USA), una proporción de células T CD8+ que no habían sido marcadas con CFSE.

Como resultado, los grupos de tratamiento GI101, GI102M61, GI101C2 y Proleukin exhibieron un aumento significativo en la proporción de células T CD8+, en comparación con el grupo de control (sin estímulo), el grupo de tratamiento con anticuerpo anti-CD3 solo y el grupo de tratamiento GI101C1. Además, en comparación con el grupo de control negativo (sin estímulo) y el grupo de tratamiento anti-CD3 solo, los grupos de tratamiento GI101, GI101C2 y Proleukin exhibieron un aumento significativo en la proliferación de células Treg CD4+/FoxP3+, mientras que los grupos de tratamiento GI102 y GI101C1 no mostraron un aumento significativo en la proliferación de células Treg CD4+/FoxP3+ (Fig. 37).

Ejemplo experimental 12. Identificación del efecto de GI101 o GI101w sobre la proliferación de células T CD8+ y células NK

Se dividieron ratones C57BL/6 de 7 semanas de edad adquiridos en Orient Bio (Busan, Corea) en 3 grupos, cada grupo contenía 3 ratones, y se les inyectó por vía intraperitoneal PBS, GI101 o GI101w. Aquí, se prepararon GI101 y GI101w respectivamente a 40.5 jg en 200 j l de PBS y se inyectaron por vía intraperitoneal. Cinco días después de la inyección, se extrajeron los bazos de los ratones de cada grupo. Las células se aislaron a partir de allí y se midió el número total de células usando un hematocitómetro. Se examinaron los esplenocitos para determinar las proporciones de células T CD8+ y células NK en ellos, con análisis FACS mediante tinción con anticuerpo APC-CD3<e>(Biolegend; 145-2C11), anticuerpo PE-NK1.1 (Biolegend; PK136) y anticuerpo Pacific blue-CD8a (BD; 53-6.7). Como tal, se calculó el número de células T CD8+ y células NK presentes en el bazo.

Como resultado, se identificó que GI101 activaba la proliferación de células T CD8+ y células NKin vivoen comparación con GllOlw (Figs. 38 y 39).

Ejemplo experimental 13. Identificación del efecto de GI101 sobre la función de las células T

Se realizó un experimento utilizando un kit de bioensayo de bloqueo CTLA-4 (Promega Cat. No. JA4005). El experimento se describe brevemente a continuación. Las células efectoras CTLA-4 mantenidas en nitrógeno líquido se descongelaron en un baño de agua a temperatura constante de 37 °C durante 3 minutos, y se mezclaron bien 0.8 ml de células efectoras CTLA-4 con 3.2 ml de tampón de ensayo precalentado (90%RPMI 10 % FBS). Luego, la mezcla se añadió a una placa de cultivo de glóbulos blancos de 96 pocillos (SPL, Cat. No. 30196) a 25 |jl por pocillo. Luego, se le añadieron 25 j l de GI101 en diversas concentraciones. Para un control negativo, se le añadieron 25 j l de tampón de ensayo. Luego, la placa de cultivo celular white plat se cubrió y se colocó a temperatura ambiente hasta que se prepararon células aAPC/Raji.

Las células aAPC/Raji mantenidas en nitrógeno líquido se descongelaron en un baño de agua a temperatura constante de 37 °C durante 3 minutos, y se mezclaron bien 0.8 ml de células aAPC/Raji con 3.2 ml de tampón de ensayo precalentado. Luego, se añadieron 25 j l de la mezcla a la placa por pocillo y se dejó que la reacción prosiguiera en una incubadora de CO2 al 5% a 37°C durante 16 horas. Una vez completada la reacción, se dejó reposar el resultante a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego se le añadió el reactivo Bio-Glo teniendo cuidado de evitar burbujas. También se añadió el reactivo Bio-Glo a tres de los pocillos más externos y los pocillos se utilizaron como blancos para corregir la señal de fondo. Se dejó que la reacción se desarrollara a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego se midió la luminiscencia con Cytation 3 (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA). El análisis de los datos finales se realizó calculando RLU (GI101-antecedentes)/RLU (sin tratamiento-antecedentes).

Como resultado, se encontró que GI101 unido a CTLA-4 se expresaba en células T efectoras y activaba la función de las células T en lugar de inhibirlas (Figs. 40 y 41).

Ejemplo experimental 14. Identificación del efecto de mGI101 y mGI102 sobre las células inmunes

Se dividieron ratones C57BL/6 de 7 semanas de edad adquiridos en Orient Bio (Corea) en 3 grupos, cada grupo que contenía 3 ratones y se administró por vía intravenosa PBS, 3 mg/kg, 6 mg/kg o 12 mg/kg de GI101, o 3 mg/kg, 6 mg/kg o 12 mg/kg de mGI102 (mGI102-M61). Los días 1, 3, 5, 7 y 14 después de la inyección, se extrajeron los bazos de los ratones de cada grupo. A partir de entonces, para el tejido del bazo, se calcularon los números de células T CD8+ efectoras, células NK y células Treg con análisis FACs utilizando los respectivos anticuerpos, y se calcularon respectivamente las proporciones de células T CD8+ efectoras y células NK con respecto a las células Treg. La información sobre los anticuerpos utilizados en cada ensayo celular es la siguiente:

Células T CD8+ efectoras: Anticuerpo PB anti-CD3£ de ratón (Biolegend, # 155612; KT3.1.1), anticuerpo FITC anti-CD8a de ratón (BD, # 553031, 53-6.7), anticuerpo PE/Cy7 anti-CD44 de ratón (Biolegend, # 103030; IM7), anticuerpo CD122 anti-ratón APC (Biolegend, # 123214; TM-p1)

Células NK: Anticuerpo PB anti-ratón CD3<e>(Biolegend, # 155612; KT3.1.1), PE anti-ratón NK-1.1 (Biolegend, # 108708; PK136)

Células Treg: Anticuerpo CD3 anti-ratón FITC (Biolegend, # 100204; 17A2), anticuerpo CD4 anti-ratón PB (Biolegend, # 100531; RM4-5), anticuerpo CD25 anti-ratón PE (Biolegend, # 102008; PC61), anticuerpo anti-CD3 APC anticuerpo Foxp3 de ratón (Invitrogen, No. FJK-16s, 17-5773-82).

Como resultado, el grupo que recibió mGI101 o mGI102 (mGI102-M61) mostró un aumento significativo en el número de células T CD8+ y células NK en los puntos de tiempo de 3 días a 14 días después de la administración, en comparación con el grupo de administración de PBS. Además, se encontró que el grupo que recibió mGI102 exhibió un aumento significativo en las proporciones de células T CD8+ activadas/células Treg y células NK/células Treg en los puntos de tiempo de 3 días a 14 días después de la administración, en comparación con el grupo de administración de PBS (Fig. 42).

IV. Identificación del efecto anticancerígeno de la proteína de fusión

Ejemplo experimental 15. Identificación del efecto de GI101 sobre células cancerosas que sobreexpresan PD-L1

La línea celular cancerosa NC1-H292 que sobreexpresa PD-L1 se cultivó durante 3 horas en un medio de cultivo que contenía 10 jg/m l de Mitomicina C (Sigma) y luego se eliminó la Mitomicina C lavando con el medio de cultivo. A partir de entonces, 5 * 104 células de la línea celular cancerosa NC1-H292 tratada con Mitomicina C se incubaron con 1 * 105 células de PBMC humanas en una placa de 96 pocillos. Aquí, se realizó un tratamiento con 5 jg/m l de PHA (Sigma) para la actividad de las células T. Además, se hicieron reaccionar GI101C1 y GI101 a una concentración de 50 nM con IgG1-Fc (Biolegend) o abatacept (= Orencia; Bristol-Myers Squibb) a una concentración de 50 nM durante 30 minutos a 4°C, y luego el resultante se utilizó para tratar las células cancerosas NC1-H292. Después de 3 días, se recolectó el sobrenadante de la célula incubada y se cuantificó la cantidad de IFN-y usando un kit ELISA (Biolegend).

Como grupo de control positivo, se utilizaron PBMC humanas estimuladas con PHA en ausencia de la línea celular cancerosa NC1-H292 tratada con Mitomicina C; y como grupo de control negativo, se utilizaron PBMC humanas estimuladas con PHA en presencia de la línea celular cancerosa NC1-H292 tratada con Mitomicina C. Se llevó a cabo un método experimental utilizando el kit ELISA de IFN-<y>de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 9.3.

Como resultado, GI101 activó eficazmente la respuesta inmune que había sido inhibida por la línea celular cancerosa que sobreexpresaba PD-L1. Además, se descubrió que GI101 inhibía la señalización de CTLA-4 expresada en células T efectoras (Figs. 43 y 44).

Ejemplo experimental 16. Identificación del efecto anticancerígeno de GI101 en ratones trasplantados de células de cáncer colorrectal derivadas de ratón

Se mezclaron 5*10® células/0.05 ml de línea celular cancerosa CT-26 derivada de ratón con 0.05 ml de matriz Matrigel libre de rojo fenol (BD), y se realizó el trasplante de 0.1 ml de la mezcla mediante administración subcutánea en la región dorsal derecha de ratones BALB/c hembra de 6 semana de edad (Orient Bio). Un cierto período de tiempo después del trasplante de células cancerosas, se midió el volumen del tumor y se separaron los sujetos que alcanzaron aproximadamente 80 mm3 a 120 mm3. Luego, a los sujetos se les administró por vía intravenosa 0.1 ml de GI101. Se realizaron un total de tres administraciones una vez cada tres días después de la primera administración, y se administró PBS a un grupo de control negativo. El tamaño del tumor se midió diariamente para identificar un efecto anticancerígeno.

Como resultado, se observó que los ratones trasplantados con la línea celular cancerosa CT-26 tratados con GI101 exhibieron una disminución notable en el tamaño del tumor en comparación con el grupo de control negativo (Figs. 45 y 46).

Ejemplo experimental 17. Identificación del efecto anticancerígeno de mGI101 en ratones trasplantados de melanoma derivado de ratón

Se sometieron ratones C57BL/6 (hembras, 7 semanas de edad) adquiridos de Orient Bio a un período de aclimatación de 7 días. Entonces, se mezclaron 5*106 células de la línea celular cancerosa B16F10 (ATCC, USA) con 0.05 ml de matriz Matrigel libre de rojo fenol (BD), y el alotrasplante de la mezcla se realizó mediante administración subcutánea a 0.1 ml en la región dorsal derecha de los ratones. Un cierto período de tiempo después del trasplante de células cancerosas, se midió el volumen del tumor y se seleccionaron los sujetos que alcanzaron aproximadamente 50 mm3 a 120 mm3, y luego los ratones seleccionados se agruparon uniformemente según el tamaño del tumor y el peso corporal, cada grupo contenía 10 ratones.

Posteriormente, utilizando una jeringa desechable (31G, 1 ml), se administró hIgG4 a una dosis de 4 mg/kg a un grupo de control negativo, y se administró un anticuerpo anti-PD-1 a una dosis de 5 mg/kg a un grupo de control positivo. Para los grupos experimentales, se les administró por vía intravenosa mGI101 a una dosis de 1 mg/kg o 4 mg/kg. Además, también se establecieron como grupos experimentales los grupos que habían recibido mGI101 a una dosis de 4 mg/kg y un anticuerpo anti-PD-1 a una dosis de 5 mg/kg. Se realizaron un total de tres administraciones una vez cada tres días después de la primera administración. El tamaño del tumor se midió diariamente.

Como resultado, el volumen tumoral inicial de todos los grupos fue de 90 mm3, y el error estándar (S.E.) de cada grupo fue de 5 mm3 a 6 mm3. En el grupo de control negativo, se observó un cambio en el volumen del tumor durante el período experimental, en el que el volumen del tumor aumentó de 90 mm3 hasta 1,434 mm3 hasta 15 días después de la administración.

En el grupo que recibió mGI101 en una dosis de 1 mg/kg, se observó que el volumen del tumor aumentó de 90 mm3 hasta 885 mm3 durante el período experimental, que es el mismo período que el grupo de control negativo, y se observó una inhibición estadísticamente significativa del crecimiento del tumor en algunos momentos de medición (valor p: 0.5 el día 11, valor de p < 0.01 el día 7, valor de p < 0.001 el día 3). En el grupo que recibió mGI101 en una dosis de 4 mg/kg, se observó que el volumen del tumor aumentó de 90 mm3 hasta 748 mm3 durante el período experimental, que es el mismo período que el grupo de control negativo, y se observó una inhibición estadísticamente significativa del crecimiento del tumor en algunos momentos de medición (valor p: 0.5 el día 9, valor p <0.01 los días 7 y 11).

Además, se analizó la tasa de inhibición del crecimiento tumoral utilizando, como referencia, el grupo que había recibido mIgG a una dosis de 4 mg/kg y comparando este grupo con cada uno de los otros grupos. En el grupo que recibió mGI101 en una dosis de 1 mg/kg, se observó una tasa de inhibición del crecimiento del 36.5 % en comparación con el grupo de control negativo, y no hubo diferencias estadísticamente significativas (valor p: 0.5). En el grupo que recibió mGI101 a una dosis de 4 mg/kg, se obtuvo un resultado estadísticamente significativo (valor p: 0.5) se observó una tasa de inhibición del crecimiento tumoral en comparación con el grupo de control negativo. Se realizaron un total de dos administraciones una vez cada tres días después de la primera administración. El tamaño del tumor se midió diariamente.

A través de esto, se encontró que en la prueba de eficacia inhibidora del crecimiento tumoral para B16F10, un melanoma alotrasplantado en ratones C57BL/6, mGI101 tenía un efecto de inhibición del crecimiento tumoral de una manera dependiente de la dosis (Figs. 47 y 48).

Ejemplo experimental 18. Identificación del efecto anticancerígeno de mGI101 en ratones trasplantados de células de cáncer colorrectal derivadas de ratón

Se sometieron ratones BALB/c (hembras, 7 semanas de edad) adquiridos de Orient Bio a un período de aclimatación de 7 días. Entonces, se mezclaron 5*10® células de la línea celular cancerosa CT-26 (ATCC, USA) con 0.05 ml de matriz Matrigel libre de rojo fenol (BD), y el alotrasplante de la mezcla se realizó mediante administración subcutánea a 0.1 ml en la región dorsal derecha de los ratones. . Un cierto período de tiempo después del trasplante de células cancerosas, se midió el volumen del tumor y se seleccionaron los sujetos que alcanzaron aproximadamente 28 mm3, y luego los ratones seleccionados se agruparon uniformemente según el tamaño del tumor y el peso corporal, cada grupo contenía 10 ratones. Posteriormente, utilizando una jeringa desechable (31G, 1 ml), se administró hIgG4 a una dosis de 6 mg/kg a un grupo de control negativo. Para los grupos experimentales, se les administró por vía intravenosa mGI101 a una dosis de 3 mg/kg, 6 mg/kg 0 12 mg/kg. Se realizaron un total de tres administraciones una vez cada tres días después de la primera administración. El tamaño del tumor se midió diariamente.

Como resultado, se encontró que el grupo experimental que recibió mGI101 en una dosis de 6 mg/kg o 12 mg/kg de mGI101 exhibió una inhibición significativa del crecimiento tumoral en algunos momentos de medición y al final de la prueba, en comparación con el grupo de control negativo (Fig. 49). Además, como resultado de la medición de la tasa de supervivencia, se encontró que el grupo experimental que recibió mGI101 en una dosis de 6 mg/kg mostró una mejora significativa en algunos momentos de medición y al final de la prueba, en comparación con el grupo de control negativo (Fig. 50).

Ejemplo experimental 19. Identificación del efecto anticancerígeno de GI101 en ratones trasplantados con células de cáncer colorrectal derivadas de ratón

Ejemplo experimental 19.1. Identificación del efecto inhibidor del tumor

Se sometieron ratones BALB/c (hembras, 7 semanas de edad) adquiridos de Orient Bio a un período de aclimatación de 7 días. Entonces, se suspendieron 5*106 células de la línea celular cancerosa CT-26 (ATCC, USA) en 0.1 ml de PBS y se realizó un alotrasplante de la suspensión mediante administración subcutánea de 0.1 ml en la región dorsal derecha de los ratones. Un cierto período de tiempo después del trasplante de células cancerosas, se midió el volumen del tumor y se seleccioanron los sujetos que alcanzaron aproximadamente 50 mm3 a 200 mm3, y luego los ratones seleccionados se agruparon uniformemente según el tamaño del tumor y el peso corporal, cada grupo contenía 10 ratones. Posteriormente, utilizando una jeringa desechable (31G, 1 ml), no se administró ningún fármaco a un grupo de control negativo y se administraron un anticuerpo anti-PD-1 a una dosis de 5 mg/kg, o un anticuerpo anti-PD-1 a una dosis de 5 mg/kg por vía intravenosa una dosis de 5 mg/kg y un anticuerpo anti-CTLA-4 a una dosis de 5 mg/kg a los grupos de control positivo. Para los grupos experimentales, se les administró por vía intravenosa GI101 a una dosis de 0.1 mg/kg o 1 mg/kg. Se realizaron un total de tres administraciones una vez cada tres días después de la primera administración. El tamaño del tumor se midió diariamente.

Como resultado, en los ratones trasplantados con la línea celular cancerosa CT-26, todos los grupos recibieron anticuerpo anti-PD-1, anticuerpo anti-PD-1 y anticuerpo anti-CTLA-4, o GI101 en una dosis de 0.1 mg/kg o 1 mg/kg mostraron una inhibición significativa del crecimiento tumoral, en comparación con el control negativo. En particular, el grupo experimental que recibió GI101 a una dosis de 0.1 mg/kg mostró un efecto inhibidor del tumor significativo, en comparación con el grupo de tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 (* p < 0.05) (Fig. 51).

Ejemplo experimental 19.2. Análisis de células inmunes en tejido canceroso

Los ratones de cada grupo en el Ejemplo Experimental 19.1 se sacrificaron cuando el volumen del tumor alcanzó un promedio de 200 mm3, y se recogieron tejidos cancerosos. Posteriormente, los tejidos cancerosos se separaron a un nivel unicelular para analizar las células inmunitarias que contenían y luego se realizó un análisis FACS en las células inmunitarias de los tejidos cancerosos utilizando los siguientes anticuerpos: Antiratón-CD3 (Biolegend, Cat. No. 100320), Anti-ratón-CD4 (Biolegend, Cat. No. 100526), Anti-ratón-CD8 (Biolegend, Cat. No. 100750), Anti-ratón-FoxP3 (eBioscience, Cat. No. 12-5773-82), Anti-ratón-CD25 (Biolegend, Cat. No. 102049), Anti-ratón-CD44 (eBioscience, Cat. No. 61-0441-82), Anti-ratón-PD-1 (Biolegend, Cat. No. 135218), Anti-ratón-IFN-gamma (Biolegend, Cat. No. 505832), Anti-ratón-CD49b (Biolegend, Cat. No. 108906), Anti-ratón-H2 (Invitrogen, Cat. No. A15443), Anti-ratón-CD11c (Biolegend, Cat. No. 117343), Anti-ratón-CD80 (eBioscience, Cat. No. 47-4801-82), Anti-ratón-CD86 (Biolegend, Cat. No.

104729), Anti-ratón-F4/80 (eBioscience, Cat. No. 47-4801-82), y Anti-ratón-CD206 (eBioscience, Cat. No. 17 2061-80).

Como resultado, el grupo experimental que recibió GI101 en una dosis de 0.1 mg/kg mostró un aumento significativo en las células T CD8+, en comparación con el grupo de control positivo que recibió anticuerpo anti-PD-1 solo en una dosis de 5 mg/kg (* p < 0.05, Figs. 52 y 53). Además, todos los grupos experimentales que recibieron GI101 mostraron un nivel significativamente mayor de expresión de IFN-<y>en células T, en comparación con el grupo de control negativo (* p < 0.05, Figs. 52 y 53). Además, el grupo experimental que recibió GI101 en una dosis de 0.1 mg/kg mostró un aumento en los macrófagos M1 en comparación con el grupo de control negativo y el grupo de control positivo que recibió anticuerpo anti-PD-1 solo (Figs. 54 y 55). Además, todos los grupos experimentales que recibieron GI101 mostraron un mayor nivel de expresión de CD86 en macrófagos y células dendríticas (* p < 0.05, Figs. 54 a 57).

Ejemplo experimental 20. Identificación del efecto anticancerígeno de GI101 en ratones trasplantados con células de cáncer de pulmón derivadas de ratón. Ejemplo experimental 20.1. Identificación del efecto inhibidor del tumor

Se sometieron ratones C57BL/6 (hembras, 7 semanas de edad) adquiridos de Orient Bio a un período de aclimatación de 7 días. Entonces, se suspendieron 5*10® células de la línea celular cancerosa LLC2 (ATCC, USA) en 0.1 ml de PBS y se realizó un alotrasplante de la suspensión mediante administración subcutánea de 0.1 ml en la región dorsal derecha de los ratones. Un cierto período de tiempo después del trasplante de células cancerosas, se midió el volumen del tumor y se seleccionaron los sujetos que alcanzaron aproximadamente 50 mm3 a 200 mm3, y luego los ratones seleccionados se agruparon uniformemente según el tamaño del tumor y el peso corporal, cada grupo contenía 10 ratones. Posteriormente, utilizando una jeringa desechable (31G, 1 ml), no se administró ningún fármaco a un grupo de control negativo y se administraron un anticuerpo anti-PD-1 a una dosis de 5 mg/kg, o un anticuerpo anti-PD-1 a una dosis de 5 mg/kg por vía intravenosa una dosis de 5 mg/kg y un anticuerpo anti-CTLA-4 a una dosis de 5 mg/kg a los grupos de control positivo. Para los grupos experimentales, se les administró por vía intravenosa GI101 a una dosis de 0.1 mg/kg o 1 mg/kg. Se realizaron un total de tres administraciones una vez cada tres días después de la primera administración. El tamaño del tumor se midió diariamente.

Como resultado, todos los grupos experimentales mostraron un efecto inhibidor del tumor significativo, en comparación con el grupo de control negativo (* p < 0.05) (Fig. 58).

Ejemplo experimental 20.2. Análisis de células inmunes en tejido canceroso

Los ratones de cada grupo del Ejemplo Experimental 20.1 se sacrificaron cuando el volumen del tumor alcanzó un promedio de 200 mm.3y se recogieron tejidos cancerosos. Posteriormente, se realizó el análisis FACS de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 19.2 para analizar células inmunes en los tejidos cancerosos.

Como resultado, el grupo experimental que recibió GI101 en una dosis de 0.1 mg/kg mostró un aumento significativo en las células T CD8, en comparación con el grupo de control positivo que recibió anticuerpo anti-PD-1 solo (* p < 0.05, Fig. 59). Además, todos los grupos experimentales que recibieron GI101 mostraron un nivel significativamente mayor de expresión de IFN-<y>, en comparación con el grupo de control negativo (* p <0.05, Fig. 59). Además, todos los grupos experimentales que recibieron GI101 mostraron un mayor nivel de expresión de CD86 en macrófagos y células dendríticas (* p < 0.05, Figs. 59 a 61).

Ejemplo experimental 21. Identificación del efecto anticancerígeno de mGI102-M61 en ratones trasplantados con células de cáncer colorrectal derivadas de ratón

Se sometieron ratones BALB/c (hembras, 7 semanas de edad) adquiridos de Orient Bio a un período de aclimatación de 7 días. Entonces, se mezclaron 5*10® células de la línea celular cancerosa CT-26 (ATCC, USA) con 0.05 ml de matriz Matrigel libre de rojo fenol (BD), y el alotrasplante de la mezcla se realizó mediante administración subcutánea a 0.1 ml en la región dorsal derecha de los ratones. Un cierto período de tiempo después del trasplante de células cancerosas, se midió el volumen del tumor y se seleccionaron los sujetos que alcanzaron aproximadamente 28 mm3, y luego los ratones seleccionados se agruparon uniformemente según el tamaño del tumor y el peso corporal, cada grupo contenía 10 ratones. Posteriormente, utilizando una jeringa desechable (31G, 1 ml), se administró hIgG4 a una dosis de 6 mg/kg a un grupo de control negativo. Para los grupos experimentales, se les administró por vía intravenosa mGI102-M®1 a una dosis de 3 mg/kg, 6 mg/kg o 12 mg/kg. Se realizaron un total de tres administraciones una vez cada tres días después de la primera administración. El tamaño del tumor se midió diariamente.

Como resultado, se identificó que el grupo experimental que recibió mGI102-M®1 en una dosis de 12 mg/kg exhibió una inhibición significativa del crecimiento tumoral en algunos momentos de medición y al final de la prueba, en comparación con el grupo de control negativo. (Figura 62). Además, como resultado de medir la tasa de supervivencia, se identificó que el grupo experimental que recibió mGI102-M61 en una dosis de 12 mg/kg mostró una mejora significativa en algunos puntos de tiempo de medición y al final de la prueba, en comparación con el grupo de control negativo (Fig. 63).

Ejemplo experimental 22. Identificación del efecto anticancerígeno de mGI101 en ratones trasplantados con células de cáncer colorrectal derivadas de ratón

Se sometieron ratones BALB/c (hembras, 7 semanas de edad) adquiridos de Orient Bio a un período de aclimatación de 7 días. Entonces, se mezcalron 5*106 células de la línea celular cancerosa CT-26 (ATCC, USA) con 0.05 ml de matriz Matrigel libre de rojo fenol (BD), y el alotrasplante de la mezcla se realizó mediante administración subcutánea a 0.1 ml en la región dorsal derecha de los ratones. Un cierto período de tiempo después del trasplante de células cancerosas, se midió el volumen del tumor y se seleccionaron los sujetos que alcanzaron aproximadamente 200 mm3 a 250 mm3, y luego los ratones seleccionados se agruparon uniformemente según el tamaño del tumor y el peso corporal, cada grupo contenía 10 ratones.

Posteriormente, utilizando una jeringa desechable (31G, 1 ml), se administró hIgG4 a una dosis de 4 mg/kg a un grupo de control negativo. Para los grupos experimentales, se les administró por vía intravenosa mGI101 a una dosis de 1 mg/kg, 4 mg/kg o 6 mg/kg. Además, los grupos que recibieron mCD80 a 4.9 mg/kg o Fc-IL-2v (GI101C2) a 2.8 mg/kg se establecieron como grupos de control. Además, se estableció como grupo de control un grupo que había recibido simultáneamente mCD80 a 4.9 mg/kg y Fc-IL-2v (GI101C2) a 2.8 mg/kg.

En la medición del volumen del tumor, se identificó que el grupo que recibió mGI101 en una dosis de 6 mg/kg presentó una inhibición significativa en algunos momentos de medición y al final de la prueba, en comparación con el control negativo. Se observó una excelente tasa de inhibición del crecimiento tumoral en comparación con el grupo que recibió una combinación de mCD80 y Fc-IL-2v (GI101C2) (Figs. 64 y 65).

En conclusión, en la prueba de eficacia inhibidora del crecimiento tumoral en ratones BALB/c alotrasplantados con CT-26, una línea celular de cáncer colorrectal derivada de ratón BALB/c, se demostró que la sustancia de prueba mGI101 tenía eficacia inhibidora de tumores en esta condición de prueba en comparación con preparaciones únicas de mCD80 e IL-2v; y se identificó que mGI101 exhibió una excelente eficacia anticancerígena en comparación con el grupo que recibió una combinación de mCD80 e IL-2v (Figs. 64 y 65). En particular, el grupo que recibió mGI101 a una dosis de 6 mg/kg mostró una inhibición significativa del tamaño del tumor, en comparación con el grupo de control negativo y el grupo que recibió una combinación de mCD80 y Fc-IL2v (GI101C2).

V. Evaluación de la toxicidad de la proteína de fusión

Ejemplo experimental 23. Evaluación de toxicidad de GI101 en monos

Ejemplo experimental 23.1. Cría de monos y administración de fármacos

En el presente experimento, se utilizaron nueve monos filipinos machos (monos Cynomolgus) de 2 a 3 años de edad. El experimento se llevó a cabo de acuerdo con la "Ley sobre bienestar y manejo de animales" de Japón y la "Guía para el cuidado y uso de animales" de Ina Research Inc. El protocolo experimental fue revisado por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC ) de Ina Research Inc, y luego aprobado por AAALAC International (Unidad Acreditada No. 001107).

El experimento se llevó a cabo desde un día antes de la administración del fármaco hasta 15 días después de la administración del fármaco. Se observó a cada mono alrededor de la jaula y además se comprobó el estado de las heces. Los pesos corporales se midieron utilizando una báscula digital (LDS-150H, Shimadzu Corporation) un día antes de la administración del fármaco y los días 1, 8 y 15 después de la administración del fármaco. Además, se midió la cantidad restante de alimento desde un día antes de la administración del fármaco hasta el sacrificio de los monos.

En este caso, se llenó una jeringa desechable (24G) con el fármaco GI101 y se administraron un total de dos administraciones por vía intravenosa, realizándose cada administración a una tasa de 0.17 ml/seg. GI101 se administró dos veces, con un intervalo de una semana, a una dosis de 5 mg/kg/día o 10 mg/kg/día. A un grupo de control se le administró PBS (pH 7.4) de la misma manera.

Ejemplo experimental 23.2. Observación clínica, identificación de cambios en el peso corporal e ingesta de alimentos

La observación clínica y la medición de los cambios en el peso corporal y la ingesta de alimentos se realizaron desde un día antes de la administración del fármaco hasta los días 1, 8 y 15 después de la administración del fármaco. Como resultado, GI101 no causó toxicidad (Figs. 66 a 69).

Ejemplo experimental 23.3. Análisis de sangre

Se recolectó sangre de los monos en el Ejemplo Experimental 23.1 un día antes de la administración del fármaco y los días 1, 8 y 15 después de la administración del fármaco. En este caso, la sangre se recolectó a través de la vena femoral con una jeringa desechable (22G). La sangre extraída se sometió a análisis de sangre utilizando el Sistema de Hematología Automatizado XN-2000 (Sysmex Corporation) y el Analizador de Coagulación de Sangre Automatizado CA-510 (Sysmex Corporation) para los elementos enumerados en la Tabla 2 a continuación.

[Tabla 2]

Parámetro Abr. Unidad Método Equipo

Como resultado, el grupo que recibió GI101 en una dosis de 5 mg/kg/día o 10 mg/kg/día mostró un aumento en el número de reticulocitos, leucocitos y linfocitos el día 15 (Figs. 70 a 72).

Ejemplo experimental 23.4. Análisis clínicos y químicos

Se recolectó sangre de los monos en el Ejemplo Experimental 23.1 un día antes de la administración del fármaco y los días 1, 8 y 15 después de la administración del fármaco. Aquí, la sangre se recolectó de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 23.3. La sangre extraída se sometió a análisis clínico y químico utilizando el analizador clínico modelo 7180 (Hitachi High-Technologies Corporation) para los elementos enumerados en la Tabla 3 a continuación.

[Tabla 3]

Como resultado, no se detectó toxicidad causada por GI101 en el análisis clínico y químico (Figs. 73 a 79).

Ejemplo experimental 23.5. Análisis de citoquinas

Se recolectó sangre de los monos en el Ejemplo Experimental 23.1 un día antes de la administración del fármaco y los días 1, 8 y 15 después de la administración del fármaco. Aquí, la sangre se recolectó de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 23.3. Utilizando el instrumento Bio-Plex 200 (Bio-Rad Laboratories, Inc.) y el Kit de Ensayo De Panel de Perlas Magnéticas de Citoquinas de Primates No Humanos (EMD Millipore), la sangre extraída se analizó para determinar TNF-a, IFN-y, IL-10, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-12. Como resultado, no se detectó toxicidad causada por GI101 con respecto al análisis de citoquinas (Figs.

80 y 81).

Ejemplo experimental 23.6. Análisis de células inmunes.

Se recolectó sangre de los monos en el Ejemplo Experimental 23.1 un día antes de la administración del fármaco y los días 1, 8 y 15 después de la administración del fármaco. Aquí, la sangre se recolectó de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 23.3. Usando un citómetro de flujo (LSRFortessa X-20, Becton, Dickinson and Company), se analizó la sangre recolectada para detectar los siguientes elementos:

1) Ki67 CD4: CD45+/CD3+/CD4+/Ki67+

2) Ki67 CD8: CD45+/CD3+/CD8+/KÍ67+

3) Ki67 Treg: CD45+/CD3+/FoxP3+/Ki67+

4) Ki67 ICOS Treg: CD45+/CD3+/FoxP3+/Ki67+/CD278+

5) ICOS Treg: CD45+/CD3+/FoxP3+/CD278+

6) Ki67 célula NK: CD45+/CD16+ y CD56+/KÍ67+.

Como resultado, en el análisis de células inmunitarias, todos los grupos que recibieron GI101 mostraron, el día 15, un aumento en el número de células T, células T CD4+, células T CD8+, células T reguladoras, células NK y células T Ki67+, células T Ki67+ CD4+, células T Ki67+ CD8+, células T reguladoras Ki67+, células T reguladoras Ki67+ ICOS+, células Ki67+ NK, células T reguladoras ICOS+.

Específicamente, en los linfocitos, las proporciones de células T, células T CD4+, células T reguladoras aumentaron y una proporción de células NK disminuyó, mientras que una proporción de células T CD8+ no cambió. Una proporción de células T reguladoras aumentó el día 3 y disminuyó los días 8 y 15. Sin embargo, la proporción seguía siendo mayor que la del grupo de control.

Además, con respecto a las proporciones de células inmunitarias, que son Ki67+, en las respectivas células inmunitarias, aumentaron las proporciones de células T Ki67+, células T Ki67+ CD4+, células T Ki67+ CD8+, células T reguladoras Ki67+, células T reguladoras Ki67+ ICOS+, células Ki67+ NK, y células T reguladoras ICOS+.

Además, las proporciones de células T Ki67+, células T Ki67+ CD8+, y células Ki67+ NK aumentaron en los días 3, 8, y 15; las proporciones de células T Ki67+ CD4+ y células T reguladoras Ki67+ aumentaron en los días 3 y 8; y las proporciones de células T reguladoras Ki67+ ICOS+ y células T reguladoras ICOS+ aumentaron solo en el día 8 (Figs. 82 a 87).

Ejemplo experimental 23.7. Análisis patológico

El día 16, se sacrificaron los monos del Ejemplo Experimental 23.1 y se fijaron todos los órganos y tejidos usando formalina al 10%. Sin embargo, los testículos se fijaron usando una solución de formalina, sacarosa y ácido acético (FSA), y los ojos y el nervio óptico se fijaron usando formaldehído al 1% y glutaraldehído al 2.5% en tampón fosfato. La tinción con hematoxilina-eosina se realizó en los órganos y tejidos de los elementos enumerados en la Tabla 4 a continuación, y las observaciones se realizaron bajo un microscopio óptico.

[Tabla 4]

Como resultado, el grupo tratado con GI101 a una dosis de 5 mg/kg/día o 10 mg/kg/día mostró un aumento en el peso del bazo (Fig. 88). No se observaron cambios significativos en los demás tejidos. En conclusión, en los grupos que recibieron GI101, se observaron algunos cambios pero no se observó toxicidad.

VI. Ejemplo experimental 24 para identificar el efecto anticancerígeno de GI102. Identificación del efecto anticancerígeno de GI102-M45.

Ejemplo experimental 24.1. Identificación del efecto anticancerígeno de GI102-M45 en ratones trasplantados con células de cáncer colorrectal derivadas de ratónSe mezclaron 5*10® células/0.05 ml de línea celular cancerosa CT-26 derivada de ratón con 0.05 ml de matriz Matrigel libre de rojo fenol (BD), y el trasplante de la mezcla se realizó mediante administración subcutánea a 0.1 ml en la región dorsal derecha de ratones BALB/c hembra de 6 semanas de edad (Orient Bio). Un cierto período de tiempo después del trasplante de células cancerosas, se midió el volumen del tumor y se separaron los sujetos que alcanzaron aproximadamente 80 mm* 3 hasta 120 mm3. Luego, a los sujetos se les administró por vía intravenosa 0.1 ml de GI102-M45. Se realizaron un total de tres administraciones una vez cada tres días después de la primera administración y se administró PBS como control negativo. El tamaño del tumor se midió diariamente para identificar un efecto anticancerígeno. La actividad de GI102-M45 se identificó de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 16.

Ejemplo experimental 24.2. Identificación del efecto anticancerígeno de G1102-M45 en ratones trasplantados con células pulmonares derivadas de ratón

Se sometieron ratones C57BL/6 (hembras, 7 semanas de edad) adquiridos de Orient Bio a un período de aclimatación de 7 días. Entonces, se suspendieron 5*106 células de la línea celular cancerosa LLC2 (ATCC, USA) en 0.1 ml de PBS y se realizó un alotrasplante de la suspensión mediante administración subcutánea de 0.1 ml en la región dorsal derecha de los ratones. Un cierto período de tiempo después del trasplante de células cancerosas, se midió el volumen del tumor y se seleccionaron los sujetos que alcanzaron aproximadamente 50 mm3 a 200 mm35, y luego los ratones seleccionados se agruparon uniformemente según el tamaño del tumor y el peso corporal, cada grupo contenía 10 ratones. Posteriormente, utilizando una jeringa desechable (31G, 1 ml), no se administró ningún fármaco a un grupo de control negativo y se administraron un anticuerpo anti-PD-1 a una dosis de 5 mg/kg, o un anticuerpo anti-PD-1 a una dosis de 5 mg/kg por vía intravenosa una dosis de 5 mg/kg y un anticuerpo anti-CTLA-4 a una dosis de 5 mg/kg a los grupos de control positivo. Para los grupos experimentales, se les administró por vía intravenosa GI102-M45 a una dosis de 0.1 mg/kg o 1 mg/kg. Se realizaron un total de tres administraciones una vez cada tres días después de la primera administración. El tamaño del tumor se midió diariamente. La actividad de GI102-M45 se identificó de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 20.1.

Ejemplo experimental 25. Identificación del efecto anticancerígeno de GI102-M61.

Ejemplo experimental 25.1. Identificación del efecto anticancerígeno de GI102-M61 en ratones trasplantados con células de cáncer colorrectal derivadas de ratón

Se mezclaron 5*106 células /0.05 ml de línea celular cancerosa CT-26 derivada de ratón con 0.05 ml de matriz Matrigel libre de rojo fenol (BD), y el trasplante de la mezcla se realizó mediante administración subcutánea a 0.1 ml en la región dorsal derecha de ratones BALB/c hembra de 6 semanas de edad (Orient Bio). Un cierto período de tiempo después del trasplante de células cancerosas, se midió el volumen del tumor y se separaron los sujetos que alcanzaron aproximadamente 80 mm3 a 120 mm3. Luego, a los sujetos se les administró por vía intravenosa 0.1 ml de GM02-M61. Se realizaron un total de tres administraciones una vez cada tres días después de la primera administración y se administró PBS a un control negativo. El tamaño del tumor se midió diariamente para identificar un efecto anticancerígeno. La actividad de GI102-M61 se identificó de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 16.

Ejemplo experimental 25.2. Identificación del efecto antitumoral de G1102-M61 en ratones trasplantados con células de cáncer de pulmón derivadas de ratón

Se sometieron ratones C57BL/6 (hembras, 7 semanas de edad) adquiridos de Orient Bio a un período de aclimatación de 7 días. Entonces, se suspendieron 5*10® células de la línea celular cancerosa LLC2 (ATCC, USA) en 0.1 ml de PBS y se realizó un alotrasplante de la suspensión mediante administración subcutánea de 0.1 ml en la región dorsal derecha de los ratones. Un cierto período de tiempo después del trasplante de células cancerosas, se midió el volumen del tumor y se seleccionaron los sujetos que alcanzaron aproximadamente 50 mm3 a 200 mm3, y luego los ratones seleccionados se agruparon uniformemente según el tamaño del tumor y el peso corporal, cada grupo contenía 10 ratones. Posteriormente, utilizando una jeringa desechable (31G, 1 ml), no se administró ningún fármaco a un grupo de control negativo, y se administraron un anticuerpo anti-PD-1 a una dosis de 5 mg/kg, o un anticuerpo anti-PD-1 a una dosis de 5 mg/kg por vía intravenosa una dosis de 5 mg/kg y un anticuerpo anti-CTLA-4 a una dosis de 5 mg/kg a los grupos de control positivo. Para los grupos experimentales, se administró a los mismos por vía intravenosa GI102-M61 a una dosis de 0.1 mg/kg o 1 mg/kg. Se realizaron un total de tres administraciones una vez cada tres días después de la primera administración. El tamaño del tumor se midió diariamente. La actividad de GI102-M61 se identificó de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 20.1.

Ejemplo experimental 26. Identificación del efecto anticancerígeno de GI102-M72.

Ejemplo experimental 26.1. Identificación del efecto antitumoral de GI102-M72 en ratones trasplantados con células de cáncer colorrectal derivadas de ratón

Se mezclaron 5*10® células/0.05 ml de línea celular cancerosa CT-26 derivada de ratón con 0.05 ml de matriz Matrigel libre de rojo fenol (BD), y el trasplante de la mezcla se realizó mediante administración subcutánea a 0.1 ml en la región dorsal derecha de ratones BALB/c hembra de 6 semanas de edad (Orient Bio). Un cierto período de tiempo después del trasplante de células cancerosas, se midió el volumen del tumor y se separaron los sujetos que alcanzaron aproximadamente 80 mm3 a 120 mm3. Luego, a los sujetos se les administró por vía intravenosa 0.1 ml de GM02-M72. Se realizaron un total de tres administraciones una vez cada tres días después de la primera administración y se administró PBS a un control negativo. El tamaño del tumor se midió diariamente para identificar un efecto anticancerígeno. La actividad de GI102-M72 se identificó de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 1®.

Ejemplo experimental 26.2. Identificación del efecto anticancerígeno de G1102-M72 en ratones trasplantados con células de cáncer de pulmón de ratón

Se sometieron ratones C57BL/6 (hembras, 7 semanas de edad) adquiridos de Orient Bio a un período de aclimatación de 7 días. Entonces, se suspendieron 5*10® células de la línea celular cancerosa LLC2 (ATCC, USA) en 0.1 ml de PBS y se realizó un alotrasplante de la suspensión mediante administración subcutánea de 0.1 ml en la región dorsal derecha de los ratones. Un cierto período de tiempo después del trasplante de células cancerosas, se midió el volumen del tumor y se seleccionaron los sujetos que alcanzaron aproximadamente 50 mm3 a 200 mm3, y luego los ratones seleccionados se agruparon uniformemente según el tamaño del tumor y el peso corporal, cada grupo contenía 10 ratones. Posteriormente, utilizando una jeringa desechable (31G, 1 ml), no se administró ningún fármaco a un grupo de control negativo, y se administraron un anticuerpo anti-PD-1 a una dosis de 5 mg/kg, o un anticuerpo anti-PD-1 a una dosis de 5 mg/kg por vía intravenosa una dosis de 5 mg/kg y un anticuerpo anti-CTLA-4 a una dosis de 5 mg/kg a los grupos de control positivo. Para los grupos experimentales, se les administró por vía intravenosa GI102-M72 a una dosis de 0.1 mg/kg o 1 mg/kg. Se realizaron un total de tres administraciones una vez cada tres días después de la primera administración. El tamaño del tumor se midió diariamente. La actividad de GI102-M72 se identificó de la misma manera que en el Ejemplo Experimental 20.1.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión que comprende una proteína variante de IL-2 y un fragmento de CD80, en la que la proteína de fusión consiste en la siguiente fórmula estructural (I):

N'-X-[enlazador (1)]n-dominio Fc-[enlazador (2)]m-Y-C' (I)

en la fórmula estructural (I),

N' es el N-terminal de la proteína de fusión,

C' es el C-terminal de la proteína de fusión,

X es el fragmento CD80,

en donde el fragmento CD80 consiste en el 35° aminoácido al 242° aminoácido en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11,

Y es la proteína variante de IL-2,

en donde la variante de IL-2 se obtiene mediante sustitución de al menos una seleccionada de los aminoácidos 38°, 42°, 45°, 61°, y 72° en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10,

los enlazadores (1 ) y (2) son enlazadores peptídicos, y

n y m son cada uno independientemente 0 o 1.

2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en donde la variante de IL-2 se obtiene mediante al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en R38A, F42A, Y45A, E61R y L72G en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

3. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en donde la variante de IL-2 contiene una cualquiera seleccionada de las siguientes combinaciones de sustitución (a) a (d) en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10:

(a) R38A/F42A

(b) R38A/F42A/Y45A

(c) R38A/F42A/E61R

(d) R38A/F42A/L72G.

4. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en donde la variante de IL-2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 , 22, 23 o 24.

5. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en donde el dominio Fc es un tipo salvaje o una variante, preferiblemente en donde la variante del dominio Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

6. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en donde el dominio Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

7. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en donde el enlazador (1) consiste en 5 a 80 aminoácidos contiguos y el enlazador (2) consiste en 1 a 50 aminoácidos contiguos.

8. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en donde el enlazador (1) es un enlazador peptídico que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y/o el enlazador (2) es un enlazador peptídico que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

9. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en donde la proteína de fusión tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, 26, 28 o 30.

10. Un dímero de proteína de fusión en donde dos proteínas de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 están unidas entre sí, preferiblemente en donde el dímero de proteína de fusión es un homodímero.

11. Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. El polinucleótido de la reivindicación 11, en donde el polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8, 25, 27 o 29.

13. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 12.

14. Una célula transformada en donde se ha introducido el vector de la reivindicación 13.

15. Una composición farmacéutica para uso en la prevención o el tratamiento del cáncer o una enfermedad infecciosa, en donde la composición farmacéutica comprende como un ingrediente activo:

la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; o

el dímero de proteína de fusión de la reivindicación 10.

16. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.

17. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el cáncer es uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer cervical, cáncer de tiroides, cáncer de laringe, leucemia mieloide aguda, tumor cerebral, neuroblastoma, retinoblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de glándulas salivales y linfoma.

18. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la enfermedad infecciosa es una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en hepatitis B, hepatitis C, infección por el virus del papiloma humano, infección por citomegalovirus, enfermedad respiratoria viral, e influenza.

19. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o el dímero de proteína de fusión de la reivindicación 10 para uso en el tratamiento del cáncer o una enfermedad infecciosa.