ES2983923T3

ES2983923T3 - Análogos de la pro-coelenterazina estables en suero

Info

Publication number: ES2983923T3
Application number: ES18743348T
Authority: ES
Inventors: Wenhui Zhou; Brock Binkowski; Poncho Meisenheimer; Andrew Niles; Kevin Kupcho; James Unch
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 2017-07-06
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2024-10-28
Anticipated expiration: 2038-06-29
Also published as: EP3649130C0; WO2019010094A1; JP7204728B2; US20190010157A1; EP3649130B1; EP3649130A1; US10836767B2; JP2020526521A

Abstract

Se describen análogos de pro-coelenterazina de fórmulas (I)-(III), métodos para preparar los análogos, kits que comprenden los análogos y métodos para usar los compuestos para la detección de luminiscencia en ensayos basados en luciferasa o fragmentos de luciferasa complementaria. Los análogos de pro-coelenterazina descritos proporcionan una mayor estabilidad del suero para ensayos de células vivas y son capaces de ajustar el brillo y las ventanas de ensayo según sea necesario para las aplicaciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Análogos de la pro-coelenterazina estables en suero

La presente divulgación se refiere a análogos de la pro-coelenterazina, métodos para fabricar análogos de la procoelenterazina y métodos para utilizar análogos de la pro-coelenterazina en ensayos de células vivas basados en luciferasa.

Antecedentes

Los ensayos bioluminiscentes se utilizan ampliamente en la investigación de la fisiología celular, especialmente en los procesos asociados a la expresión génica. En particular, las enzimas reporteras luciferasa son herramientas muy valiosas en este campo y, hasta la fecha, ha habido una intensa ingeniería de proteínas para obtener luciferasas pequeñas e insensibles al medio ambiente que puedan ser útiles en ensayos bioluminiscentes. Existen varios reporteros de luciferasa eficientes o luciferasas complementadas con fragmentos que permiten realizar mediciones de biosensores en células enteras, descubrir fármacos mediante cribado de alto rendimiento y obtener imágenes in vivo que también permiten estudiar las interacciones proteína-proteína en células vivas, la apoptosis y la viabilidad celular. Las luciferasas que utilizan coelenterazina y análogos de la coelenterazina como sustratos se encuentran entre los sistemas más utilizados debido a su brillo y aceptación en aplicaciones de células enteras.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Muchos análogos conocidos de la coelenterazina se degradan rápidamente en medios o medios con suero, lo que limita su eficacia como sustratos de luciferasa. La sensibilidad del ensayo y el tiempo de duración suelen estar limitados por los antecedentes debido a la inestabilidad de la coelenterazina activa o de los análogos de la coelenterazina. Los análogos de la procoelenterazina, como los compuestos de coelenterazina o furimazina protegidos con ésteres, se introdujeron en los ensayos con células vivas para mejorar el rendimiento del ensayo mediante el uso de esterasas presentes en las células para eliminar el grupo éster o carbonato del análogo de la procoelenterazina y liberar, con el tiempo, un sustrato activo de coelenterazina o furimazina. Sin embargo, entre estos análogos de la pro-coelenterazina, la estabilidad de la señal, que es necesaria para algunos ensayos con células vivas, a lo largo de un tiempo determinado sigue siendo un gran reto.

Los periodos de detección cortos a menudo limitan las aplicaciones prácticas de los ensayos de células vivas, como los ensayos de genes reporteros, los ensayos de células vivas-muertas, la apoptosis celular, las interacciones proteínaproteína, las detecciones de bacterias, hongos o moho, o la detección de la actividad de cualquier enzima diana de interés in vitro o en células. En consecuencia, existe la necesidad de análogos de la pro-coelenterazina con una estabilidad mejorada, manteniendo al mismo tiempo un brillo razonable necesario para los ensayos con células vivas. Yuang et al., Org. Biomol. Química. 2017, 15, 10238-10244 divulga compuestos heterocíclicos útiles en ensayos de bioluminiscencia.

Se divulgan pero no se reivindican compuestos de fórmula (I),

o un tautómero, o una sal de los mismos, en los que Ar1, Ar2 y Ar3 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en arilo y heteroarilo, en los que Ar1, Ar2 y Ar3 están cada uno opcionalmente sustituidos; RA se selecciona del grupo formado por alquilo lineal o ramificado C<2>-C<10>, alcoxi, alcoxialquilo, amido, acetoxi, polietilenglicoxi éter metílico, polietilenglicoxialquilo éter metílico, haloalquilo, haloalcoxi, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, alquilo hidroxilo, polietilenglicoxilo hidroxilo, carboxialquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo y alquilo heterociclo;Rx1, Rx2, en cada aparición, se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en alquilo lineal o ramificado C<1>-C<6>, opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alcoxi, arilo, cicloalquilo, heteroarilo y heterociclo.

En un aspecto de la invención se divulgan compuestos de fórmula (II),

o un tautómero, o una sal de los mismos, en los que Ar1, Ar2 y Ar3 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en arilo y heteroarilo, en los que Ar1, Ar2 y Ar3 están cada uno opcionalmente sustituido; Ar4 es arilo, furano o tiofeno, opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alquilo, alcoxi, arilo, cicloalquilo, heteroarilo y heterociclo.

Se divulgan también compuestos de fórmula (III),

En el que Ar1, Ar2 y Ar3 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en arilo y heteroarilo, en el que Ar1, Ar2 y Ar3 están cada uno opcionalmente sustituidos; RC se selecciona del grupo que consiste en alquilo lineal o ramificado C<1>-C<9>, alcoxialquilo, polietilenglicoxialquilo de éter metílico, haloalquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, polietilenglicoxialquilo de hidroxilo, carboxialquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo y alquilo heterociclo.

También se divulgan métodos para fabricar los compuestos, kits que comprenden los compuestos y métodos para utilizar los compuestos como sustratos de luciferasa en ensayos basados en luciferasa.

Breve descripción de los dibujos

FIGS. 1A-1H muestran los cambios de pureza a lo largo del tiempo para los compuestos inestables en suero WZ-0308 (FIG. 1A), WZ-0310 (FIG. 1B), WZ-0315 (FIG. 1C), WZ-0415 (FIG. 1D), WZ-0429 (FIG. 1E), WZ-0439 (FIG. 1F), WZ-0454 (FIG.1G) y WZ-0441 (FIG. 1H) a 40 pM en (1) DMSO,

(2) medio DMEM, o (3) DMEM/FBS (10%).

FIGS. 2A-2I muestran los cambios de pureza en el tiempo para los compuestos estables en suero divulgados WZ-0323 (FIG. 2A), WZ-0324 (FIG. 2B) y WZ-0336 (FIG. 2C), WZ-0451 (FIG. 2D), WZ-0467 (FIG. 2E), WZ-0420 (FIG. 2F), WZ-0461 (FIG. 2G), WZ-0416 (FIG. 2H) y WZ-0419 (FIG. 2I) a 40 pM en (1) DMSO, (2) medio DMEM, o (3) DMEM/FBS (10%).

FIGS. 3A-3M muestran el decaimiento de la señal luminiscente a lo largo del tiempo en 10 ng/pocillo de células HEK293 transfectadas con promotor CMV y gen NanoLuc® (Nluc) en medio DMEM con 10% FBS con/sin adición de esterasa exógena de hígado porcino (PLE) (FIGS. 3A-3C) o células HEK293 que expresan el par de control positivo PKA NanoBiT™ a Nluc en medio DMEM con 4% de FBS (FIGS. 3D-3M). Estos incluyen los resultados de los compuestos inestables o menos estables del suero, WZ- 0308 (FIG. 3A), WZ-0415 (FIG. 3D), WZ-0429 (FIG. 3E), WZ-0439 (FIG. 3F), WZ-0454 (FIG. 3G), y WZ-0441 (FIG. 3H); resultados para el pro-sustrato tradicional de células vivas PBI-4377 (FiG. 3B); y resultados para los compuestos estables en suero divulgados WZ-0324 (FIG. 3C), WZ-0451 (FIG. 3I), WZ-00416 (FIG.

3J), WZ-0420 (FIG. 3K), WZ-0461 (FIG. 3L), y WZ-0419 (FIG. 3M).

FIGS. 4A-4D muestran que TRAIL (un inductor extrínseco de la apoptosis) produjo aumentos dependientes de la dosis en la luminiscencia con el compuesto WZ-0336 a diferentes tiempos de tratamiento: 3.5 horas (FIG. 4A), 7.0 horas (FIG. 4B), 24 horas (FIG. 4C), y 30 horas (FIG. 4D).

FIGS. 5A-5D muestran la detección de apoptosis y necrosis por Annexin V en tiempo real en 10.000 células DLD-1 con tratamiento dependiente de la dosis de rhTRAIL durante 24 horas: RLU de PBI-4377 lecturas (FIG. 5A), PBI-4377 CytotoxGreen RFU lecturas (FIG. 5B), WZ-0461 RLU lecturas (FIG. 5C), y WZ-0461 CytotoxGreen RFU lecturas (FIG.

5D).

Descripción detallada

En el presente documento se dan a conocer derivados de éster o carbonato de análogos de pro-coelenterazina. Estos compuestos pueden ser sustratos para una enzima no luminiscente y pro-sustratos para una proteína luminiscente. Una vez que actúa la enzima no luminiscente de interés, el derivado puede convertirse en sustrato de una proteína luminiscente. Los compuestos divulgados pueden ser pro-sustratos útiles para las proteínas que utilizan la celenterazina ("enzimas que utilizan la celenterazina") para producir luminiscencia, incluyendo, pero no limitado, a luciferasas y fotoproteínas que se encuentran en diversos organismos marinos como cnidarios (por ejemplo,Renillaluciferase), medusas (por ejemplo, la aequorina de la medusaAequorea)y luciferasas de decápodos (por ejemplo, el complejo de luciferasa deOplophorus gracilirostris).

Los compuestos divulgados pueden exhibir una estabilidad inesperada en suero. Los compuestos estables en suero divulgados pueden proporcionar una señal luminiscente durante un tiempo de duración de hasta 24 horas en muchos ensayos bioluminiscentes de células vivas, formación de imágenes de células vivas o métodos de clasificación celular por bioluminiscencia. Los compuestos divulgados ofrecen un gran potencial al permitir nuevos ensayos debido a la mejora significativa de la estabilidad sérica. Este beneficio inesperado proporciona un gran potencial para futuras mejoras con el rendimiento del ensayo bioluminiscente, mediante el ajuste fino de la sensibilidad del suero y/o la actividad de la esterasa relacionada mejorando el brillo, la solubilidad y/o la permeabilidad celular según sea necesario.

1. Definiciones

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la materia. En caso de conflicto, prevalecerá el presente documento, incluidas las definiciones. A continuación se describen los métodos y materiales preferidos, aunque en la práctica o ensayo de la presente invención pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otras referencias mencionadas aquí se incorporan por referencia en su totalidad. Los materiales, métodos y ejemplos aquí expuestos son meramente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Los términos "comprende(n)", "incluye(n)", "tiene(n)", "puede(n)", "contiene(n)" y sus variantes, tal como se utilizan en el presente documento, pretenden ser frases, términos o palabras transitorias abiertas que no excluyen la posibilidad de actos o estructuras adicionales. Las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. La presente divulgación también contempla otras realizaciones que "comprenden", "consisten en" y "consisten esencialmente en" las realizaciones o elementos presentados en el presente documento, tanto si se exponen explícitamente como si no.

El modificador "aproximadamente" utilizado en relación con una cantidad incluye el valor declarado y tiene el significado dictado por el contexto (por ejemplo, incluye al menos el grado de error asociado con la medición de la cantidad particular). También debe considerarse que el modificador "aproximadamente" revela el intervalo definido por los valores absolutos de los dos puntos finales. Por ejemplo, la expresión "de aproximadamente 2 a aproximadamente 4" también revela el rango "de 2 a 4" El término "aproximadamente" puede referirse a más o menos un 10% de la cifra indicada. Por ejemplo, "aproximadamente 10%" puede indicar un rango de 9% a 11%, y "aproximadamente 1" puede significar de 0.9-1.1. Otros significados de "aproximadamente" pueden desprenderse del contexto, como el redondeo, por lo que, por ejemplo, "aproximadamente 1" también puede significar de 0,5 a 1,4.

Las definiciones de grupos funcionales específicos y términos químicos se describen con más detalle a continuación. A efectos de la presente divulgación, los elementos químicos se identifican de acuerdo con la Tabla Periódica de los Elementos, versión CAS, Handbook of Chemistry y Physics, 75a Ed., cubierta interior, y los grupos funcionales específicos se definen en general como se describe en el presente documento. Además, los principios generales de la química orgánica, así como las moléculas funcionales específicas y la reactividad, se describen en Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith y March March's Advanced Organic Chemistry, 5a Edición, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., Nueva York, 1989; Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3a edición, Cambridge University Press, Cambridge.

El término "acetoxi", tal como se utiliza en el presente documento, significa alcohol cuando se une a través de un grupo carbonilo.

El término "alcoxi", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo, tal como se define en el presente documento, unido a la molécula madre a través de un átomo de oxígeno. Ejemplos representativos de alcoxi incluyen, pero no se limitan a, metoxi, etoxi, propoxi, 2-propoxi, butoxi y terc-butoxi.

El término "alquilo", tal como se utiliza en el presente documento, significa una cadena hidrocarbonada saturada, recta o ramificada, que contiene de 1 a 10 átomos de carbono. El término "alquilo inferior" o "C<1>.C<6>-alquilo" significa un hidrocarburo de cadena recta o ramificada que contiene de 1 a 6 átomos de carbono. El término "C<1>-C<3>-alquilo" significa un hidrocarburo de cadena recta o ramificada que contiene de 1 a 3 átomos de carbono. Ejemplos representativos de alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo,n-propilo, iso-propilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo, terc-butilo, npentilo,isopentilo, neopentilo,n-hexilo,3-metilhexilo, 2,2-dimetilpentilo, 2,3-dimetilpentilo,n-heptilo, n-octilo, n-nonilo ndecilo.

El término "alquenilo", tal como se utiliza en el presente documento, significa una cadena de hidrocarburos que contiene de 2 a 10 átomos de carbono con al menos un doble enlace carbono-carbono. El grupo alquenilo puede estar sustituido o sin sustituir. Por ejemplo, el grupo alquenilo puede estar sustituido con un grupo arilo, como un fenilo.

El término "alquinilo", tal como se utiliza en el presente documento, significa una cadena de hidrocarburos que contiene de 2 a 10 átomos de carbono con al menos un triple enlace carbono-carbono. El grupo alquinilo puede estar sustituido o no sustituido. Por ejemplo, el grupo alquinilo puede estar sustituido con un grupo arilo, como un fenilo.

El término "alcoxialquilo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo alcoxi, tal como se define en el presente documento, unido a la molécula madre a través de un grupo alquilo, tal como se define en el presente documento.

El término "alquileno", tal como se utiliza aquí, se refiere a un grupo divalente derivado de un hidrocarburo de cadena recta o ramificada de 1 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, de 2 a 5 átomos de carbono. Ejemplos representativos de alquileno incluyen, pero no se limitan a, -CH<2>CH<2>-, -CH<2>CH<2>CH<2>-, -CH<2>CH<2>CH<2>CH<2>-, y-CH<2>CH<2>CH<2>CH<2>CH<2>-.

El término "amido", tal como se utiliza en el presente documento, significa -NH- cuando se une a través de un grupo carbonilo, como CH<3>C(O)NH- o CH<3>CH<2>CONH-.

El término "aminoácido" se refiere tanto a los aminoácidos naturales como a los no naturales. También incluye aminoácidos naturales y no naturales protegidos.

El término "arilo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo fenilo o a sistemas de anillos fusionados de arilo bicíclico o arilo tricíclico. Los sistemas de anillos bicíclicos fusionados se ejemplifican mediante un grupo fenilo añadido a la molécula madre y fusionado a un grupo fenilo. Los sistemas de anillos tricíclicos fusionados se ejemplifican mediante un grupo fenilo añadido a la molécula principal y fusionado a otros dos grupos fenilo. Ejemplos representativos de arilos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a, naftilo. Ejemplos representativos de arilos tricíclicos incluyen, pero no se limitan a, antracenilo. Los arilos monocíclicos, bicíclicos y tricíclicos están conectados a la molécula madre a través de cualquier átomo de carbono contenido en los anillos, y pueden estar sin sustituir o sustituidos.

El término "arilalquilo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo arilo, tal como se define en el presente documento, unido a la molécula parental a través de un grupo alquilo, tal como se define en el presente documento. En algunas opciones, el grupo alquilo puede ser alquilo C<1>-C<6>.

El término "carbonato", tal como se utiliza aquí, significa -OC(O)O-.

El término "carboxialquilo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo carboxi (-COOH), añadido a la molécula madre a través de un grupo alquilo, tal como se define en el presente documento. En algunas opciones, el grupo alquilo puede ser alquilo C<1>-C<6>.

El término "cicloalquilo", tal como se utiliza aquí, se refiere a un sistema de anillo carbocíclico que contiene de tres a diez átomos de carbono, cero heteroátomos y cero dobles enlaces. Ejemplos representativos de cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo, ciclononilo y ciclodecilo.

El término "carboxialquilo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo carboxi, tal como se define en el presente documento, añadido a la molécula madre a través de un grupo alquilo, tal como se define en el presente documento. En algunas opciones, el grupo alquilo puede ser alquilo C<1>-C<6>.

El término "cicloalquenilo", tal como se utiliza en el presente documento, significa un sistema de anillos monocíclicos o multicíclicos no aromáticos que contienen al menos un doble enlace carbono-carbono y que tienen preferentemente entre 5 y 10 átomos de carbono por anillo. Los anillos de cicloalquenilo monocíclicos ejemplares incluyen el ciclopentenilo, el ciclohexenilo o el cicloheptenilo.

El término "fluoroalquilo", tal como se utiliza en el presente documento, significa un grupo alquilo, tal como se define en el presente documento, en el que uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho átomos de hidrógeno se sustituyen por flúor.

Ejemplos representativos de fluoroalquilo incluyen, pero no se limitan a, 2-fluoroetilo, 2,2,2-trifluoroetilo, trifluorometilo, difluorometilo, pentafluoroetilo y trifluoropropilo como 3,3,3-trifluoropropilo.

El término "alcoxifluoroalquilo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo alcoxi, tal como se define en el presente documento, unido a la molécula principal a través de un grupo fluoroalquilo, tal como se define en el presente documento.

El término "fluoroalcoxi", tal como se utiliza en el presente documento, significa que al menos un grupo fluoroalquilo, tal como se define en el presente documento, se añade a la molécula madre a través de un átomo de oxígeno. Ejemplos representativos de fluoroalquiloxi incluyen, pero no se limitan a, difluorometoxi, trifluorometoxi y 2,2,2-trifluoroetoxi.

El término "halógeno" o "halo", tal como se utiliza en el presente documento, significa Cl, Br, I o F.

El término "haloalquilo", tal como se utiliza en el presente documento, significa un grupo alquilo, tal como se define en el presente documento, en el que uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho átomos de hidrógeno se sustituyen por un halógeno.

El término "haloalcoxi", tal como se utiliza en el presente documento, significa que al menos un grupo haloalquilo, tal como se define en el presente documento, se añade a la molécula madre a través de un átomo de oxígeno.

El término "heteroalquilo", tal como se utiliza en el presente documento, significa un grupo alquilo, tal como se define en el presente documento, en el que uno o más de los átomos de carbono han sido sustituidos por un heteroátomo seleccionado entre S, Si, O, P y N. El heteroátomo puede estar oxidado. Ejemplos representativos de heteroalquilos incluyen, pero no se limitan a, éteres de alquilo, aminas de alquilo secundarias y terciarias, amidas y sulfuros de alquilo.

El término "heteroarilo", tal como se utiliza aquí, se refiere a un anillo monocíclico aromático o a un sistema de anillos bicíclicos aromáticos o a un sistema de anillos tricíclicos aromáticos. Los anillos monocíclicos aromáticos son anillos de cinco o seis miembros que contienen al menos un heteroátomo seleccionado independientemente del grupo formado por N, O y S (por ejemplo, 1,2, 3 o 4 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S y N). Los anillos monocíclicos aromáticos de cinco miembros tienen dos dobles enlaces y los anillos monocíclicos aromáticos de seis miembros tienen tres dobles enlaces. Los grupos heteroarilo bicíclicos se ejemplifican mediante un anillo heteroarilo monocíclico anexado a la molécula madre y fusionado a un grupo cicloalquilo monocíclico, tal como se define en el presente documento, un grupo arilo monocíclico, tal como se define en el presente documento, un grupo heteroarilo monocíclico, tal como se define en el presente documento, o un heterociclo monocíclico, tal como se define en el presente documento. Los grupos heteroarilo tricíclicos se ejemplifican mediante un anillo heteroarilo monocíclico anexado a la molécula madre y fusionado a dos de un grupo cicloalquilo monocíclico, tal como se define en el presente documento, un grupo arilo monocíclico, tal como se define en el presente documento, un grupo heteroarilo monocíclico, tal como se define en el presente documento, o un heterociclo monocíclico, tal como se define en el presente documento. Ejemplos representativos de heteroarilo monocíclico incluyen, pero no se limitan a, piridinilo (incluyendo piridin-2-ilo, piridin-3-ilo, piridin-4-ilo), pirimidinilo, pirazinilo, tienilo, furilo, tiazolilo, tiadiazolilo, isoxazolilo, pirazolilo y 2-oxo-1,2-dihidropiridinilo. Ejemplos representativos de heteroarilo bicíclico incluyen, pero no se limitan a, cromenilo, benzotienilo, benzodioxolilo, benzotriazolilo, quinolinilo, tienopirrolilo, tienotienilo, imidazotiazolilo, benzotiazolilo, benzofuranoilo, indolilo, quinolinilo, imidazopiridina, benzooxadiazolilo y benzopirazolilo. Ejemplos representativos de heteroarilo tricíclico incluyen, pero no se limitan a, dibenzofuranoilo y dibenzotienilo. Los heteroarilos monocíclicos, bicíclicos y tricíclicos están conectados a la molécula madre a través de cualquier átomo de carbono o de nitrógeno contenido en los anillos, y pueden estar sin sustituir o sustituidos.

El término "heteroarilalquilo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo heterarilo, tal como se define en el presente documento, unido a la molécula parental a través de un grupo alquilo, tal como se define en el presente documento. En algunas opciones, el grupo alquilo puede ser alquilo C<1>-C<6>.

El término "heterociclo" o "heterocíclico", tal como se utiliza aquí, significa un heterociclo monocíclico, un heterociclo bicíclico o un heterociclo tricíclico. El heterociclo monocíclico es un anillo de tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho miembros que contiene al menos un heteroátomo seleccionado independientemente del grupo formado por O, N y S. El anillo de tres o cuatro miembros contiene cero o un doble enlace y un heteroátomo seleccionado del grupo formado por O, N y S. El anillo de cinco miembros contiene cero o un doble enlace y uno, dos o tres heteroátomos seleccionados del grupo formado por O, N y S. El anillo de seis miembros contiene cero, uno o dos dobles enlaces y uno, dos o tres heteroátomos seleccionados del grupo formado por O, N y S. Los anillos de siete y ocho miembros contienen cero, uno, dos o tres dobles enlaces y uno, dos o tres heteroátomos seleccionados del grupo formado por O, N y S. Ejemplos representativos de heterociclos monocíclicos incluyen, pero no se limitan a, azetidinilo, azepanilo, aziridinilo, diazepanilo, 1,3-dioxanilo, 1,3-dioxolanilo, 1,3-ditiolanilo, 1,3-ditianilo, 1,3-dimetilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona, imidazolinilo,imidazolidinilo,i sotiazolinilo, isotiazolidinilo, isoxazolinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, oxadiazolinilo, oxadiazolidinilo, oxazolinilo, oxazolidinilo, oxetanilo, piperazinilo, piperidinilo, piranilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, tetrahidrofururanilo, tetrahidropiranilo, tetrahidropiridinilo, tetrahidrotienilo, tiadiazolinilo, tiadiazolidinilo, 1,2-tiazinanilo, 1,3-tiazinanilo, tiazolinilo, tiazolidinilo, tiomorfolinilo, 1,1-dioxidotiomorfolinilo (tiomorfolina sulfona), tiopiranilo y tritianilo. El heterociclo bicíclico es un heterociclo monocíclico fusionado a un grupo fenilo, o un heterociclo monocíclico fusionado a un cicloalquilo monocíclico, o un heterociclo monocíclico fusionado a un cicloalquenilo monocíclico, o un heterociclo monocíclico fusionado a un heterociclo monocíclico, o un grupo espiroheterociclo, o un sistema de anillo heterocíclico monocíclico con puente, en el que dos átomos no adyacentes del anillo están unidos por un puente de alquileno de 1, 2, 3 o 4 átomos de carbono, o un puente de alquileno de dos, tres o cuatro átomos de carbono. Ejemplos representativos de heterociclos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a, benzopiranilo, benzotiopiranilo, cromanilo, 2,3-dihidrobenzofuranoilo, 2,3-dihidrobenzotienilo, 2,3-dihidroisoquinolina, 2-azaspiro[3.3]heptan-2-ilo, azabiciclo[2.2.1]heptilo (incluido 2-azabiciclo[2.2.1]hept-2-ilo), 2,3-dihidro-1H-indolilo,isoindolinilo, octahidrociclopenta[c]pirrolilo, octahidropirrolopiridinilo y tetrahidroisoquinolinilo. Los heterociclos tricíclicos se ejemplifican mediante un heterociclo bicíclico fusionado a un grupo fenilo, o un heterociclo bicíclico fusionado a un cicloalquilo monocíclico, o un heterociclo bicíclico fusionado a un cicloalquenilo monocíclico, o un heterociclo bicíclico fusionado a un heterociclo monocíclico, o un heterociclo bicíclico en el que dos átomos no adyacentes del anillo bicíclico están unidos por un puente de alquileno de 1, 2, 3 o 4 átomos de carbono, o un puente de alquenileno de dos, tres o cuatro átomos de carbono. Algunos ejemplos de heterociclos tricíclicos son, entre otros, el octahidro-2,5-epoxipentaleno, el hexahidro-2H-2,5-metanociclopenta[b]furano, elhexahidro-1H-1,4-metanociclopenta[c]furano, el aza-adamantano (1-azatricciclo[3.3.1.137]decano) y oxaadamantano (2-oxatriciclo[3.3.1.137]decano). Los heterociclos monocíclicos, bicíclicos y tricíclicos están conectados a la molécula madre a través de cualquier átomo de carbono o de nitrógeno contenido en los anillos, y pueden estar sin sustituir o sustituidos.

El término "alquilo heterocíclico", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un heterociclo, tal como se define en el presente documento, unido a la molécula madre a través de un grupo alquilo, tal como se define en el presente documento. En algunas opciones, el grupo alquilo puede ser alquilo C<1>-C<6>.

El término "hidroxilo", tal como se utiliza aquí, significa un grupo -OH.

El término "hidroxi polietileno glicoxialquilo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la fracción H(OCH<2>CH<2>)nO- añadida a la fracción de la molécula madre a través de un grupo alquilo; donde n=1-100. En algunas opciones, n es 1-10, 1-20 o 1-50.

El término "metil éter polietileno glicoxialquilo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la fracción CH3(0CH2CH2)nO- añadida a la fracción de la molécula madre a través de un grupo alquilo; donde n=1-100. En algunas opciones, n es 1-10, 1-20 o 1-50.

En algunos casos, el número de átomos de carbono en un sustituyente hidrocarbilo (por ejemplo, alquilo o cicloalquilo) se indica mediante el prefijo "Cx-Cy-", donde x es el número mínimo e y es el número máximo de átomos de carbono en el sustituyente. Así, por ejemplo, "C<1>-C<3>-alquilo" se refiere a un sustituyente alquilo que contiene de 1 a 3 átomos de carbono.

El término "sustituido" se refiere a un grupo que puede estar además sustituido con uno o más grupos sustituyentes no hidrógeno. Los grupos sustituyentes incluyen, pero no se limitan a, halógeno, =O, =S, ciano, nitro, fluoroalquilo, alcoxifluoroalquilo, fluoroalquilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, haloalcoxi, heteroalquilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclo, cicloalquilo, heteroarilalquilo, arilalquilo, hidroxi, hidroxialquilo, alcoxi, alcoxialquilo, alquileno, ariloxi, fenoxi, benciloxi, amino, alquilamino, acilamino, aminoalquilo, arilamino, sulfonilamino, sulfinilamino, sulfonilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, aminosulfonilo, sulfinilo, -COOH, cetona, amida, carbamato y acilo.

Para los compuestos descritos en el presente documento, los grupos y sustituyentes de los mismos pueden seleccionarse de acuerdo con la valencia permitida de los átomos y los sustituyentes, de manera que las selecciones y sustituciones den como resultado un compuesto estable, por ejemplo, que no sufra espontáneamente transformaciones como por reordenación, ciclación, eliminación, etc.

Para la recitación de rangos numéricos en el presente documento, se contempla explícitamente cada número intermedio con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el intervalo de 6-9, se contemplan los números 7 y 8 además de 6 y 9, y para el intervalo de 6.0-7.0, se contemplan explícitamente los números 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 y 7.0.

2. Compuestos

Se divulgan (pero no se reivindican) compuestos de fórmula (I):

o un tautómero, o una sal del mismo, en el que Ar1, Ar2 y Ar3 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en arilo y heteroarilo, en el que Ar1, Ar2 y Ar3 están cada uno opcionalmente sustituidos; RA se selecciona del grupo formado por alquilo lineal o ramificado C<2>-C<10>, alcoxi, alcoxialquilo, amido, acetoxi, polietilenglicoxi éter metílico, polietilenglicoxialquilo éter metílico, haloalquilo, haloalcoxi, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, alquilo hidroxilo, polietilenglicoxilo hidroxilo, carboxialquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo y alquilo heterociclo;Rx1, Rx2, en cada aparición, se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en alquilo lineal o ramificado C<1>-C<6>, opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alcoxi, arilo, cicloalquilo, heteroarilo y heterociclo.

Se divulgan como parte de la invención compuestos de fórmula (II):

o un tautómero, o una sal del mismo, en el que Ar1, Ar2 y Ar3 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en arilo y heteroarilo, en el que Ar1, Ar2 y Ar3 están cada uno opcionalmente sustituidos; Ar4 es arilo, furano o tiofeno, opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alquilo, alcoxi, arilo, cicloalquilo, heteroarilo y heterociclo.

También se divulgan compuestos de fórmula (III):

o un tautómero, o una sal del mismo, en el que,Ar1, Ar2 y Ar3 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en arilo y heteroarilo, en el que Ar1, Ar2 y Ar3 están cada uno opcionalmente sustituidos; RC se selecciona del grupo que consiste en alquilo lineal o ramificado C<1>-C<9>, alcoxialquilo, polietilenglicoxialquilo de éter metílico, haloalquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, polietilenglicoxialquilo de hidroxilo, carboxialquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo y alquilo heterociclo.

En ciertas opciones, Ar1 es fenilo, Ar2 es furilo y es fenilo.

En ciertas opciones, Rx1 es metilo. En ciertas opciones, Rx2 es metilo. En determinadas opciones, tanto Rx1 como Rx2 son metilos.

En ciertas opciones, RA es RBCH<2>-; en el que RB se selecciona del grupo que consiste en alquilo lineal o ramificado Ci-Cg, alcoxi, alcoxialquilo, amido, acetoxi, polietilenglicoxi éter metílico, polietilenglicoxialquilo éter metílico, haloalquilo, haloalcoxi, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, polietilenglicoxilo hidroxílico, carboxialquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo y alquilo heterociclo.

En ciertas opciones, RA es RCO-; en el que RC se selecciona del grupo que consiste en alquilo lineal o ramificado Ci-Cg, alcoxialquilo, metil éter polietilenglicoxialquilo, haloalquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, hidroxialquilo polietilenglicoxialquilo, carboxialquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo y alquilo heterociclo.

En ciertas opciones, RA es RCC(O)NH-; en el que RC se selecciona del grupo que consiste en alquilo lineal o ramificado Ci-Cg, alcoxialquilo, metil éter polietilenglicoxialquilo, haloalquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, hidroxialquilo polietilenglicoxialquilo, carboxialquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo y alquilo heterociclo.

En ciertas opciones, RA es RCC(O)O-; en el que RC se selecciona del grupo que consiste en alquilo lineal o ramificado Ci-Cg, alcoxialquilo, metil éter polietilenglicoxialquilo, haloalquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, hidroxialquilo polietilenglicoxialquilo, carboxialquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo y alquilo heterociclo;

En ciertas opciones, RA es CH<3>(OCH<2>CH<2>)nO-; en el que n es cualquier número entre 0-10.

En ciertas opciones, RA es CH<3>(OCH<2>CH<2>)nO-; en el que n es cualquier número de 0-10; Ar1 es fenilo, Ar2 es furilo, y Ar3 es fenilo.

En ciertas opciones, RA es CH<3>(OCH<2>CH<2>)nOCH<2>-; en el que n es cualquier número de 0-10; Ar1 es fenilo, Ar2 es furilo, y Ar3 es fenilo.

En ciertas opciones, Rx1 y Rx2 son metilo, y RA es RBCH<2>-, RCO, RCC(O)NH-, RCC(O)O-, CH<3>(OCH<2>CH<2>)nO-, o CH<3>(OCH<2>CH<2>)nOCH<2>- como se ha definido anteriormente.

En ciertas opciones, RA-(Rx1Rx2)- tiene fórmula:

en la que Ry1, Ry2, Rz1, y Rz2, en cada ocurrencia, se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C<1>-C<6>-alquilo, opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados del grupo, que consiste en halo, alcoxi, haloalcoxi, arilo, cicloalquilo, heteroarilo, y heterociclo; y n es cualquier número entre 0-10; y en el que RC se selecciona del grupo formado por alquilo lineal o ramificado C<1>-Cg, alcoxialquilo, polietilenglicoxialquilo, haloalquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, polietilenglicoxialquilo, carboxialquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo y alquilo heterociclo.

En ciertas opciones, RA-C(Rx1Rx2)- tiene fórmula:

CH3(QCRy1RíZ-C R z1R zí--)l

en la que Ry1, Ry2, Rz1, y Rz2, son como se han definido anteriormente.

En ciertas opciones, RA-C(Rx1Rx2)- tiene fórmula:

/

CH3(OCHsCH2)flO

en la que n es 0-10.

En ciertas opciones, RA-C(Rx1Rx2) tiene fórmula:

en la que Ry1, Ry2, Rz1 y Rz2 son como se han definido anteriormente, y n es 0-10.

En ciertas opciones RA-C(Rx1Rx2)- tiene fórmula:

en la que n es 0-10.

En ciertas opciones, RA-C(Rx1Rx2)- se selecciona del grupo que consiste en:

En ciertas opciones, el compuesto no reivindicado de fórmula (I) tiene fórmula (I-a):

en la que RA, Rx1, Rx2, Ar1, y Ar2 son como se han definido anteriormente.

En ciertas opciones, el compuesto no reivindicado de fórmula (I) tiene fórmula (I-b):

en la que RA, Rx1, Rx2, Ar1, y Ar2 son como se han definido anteriormente.

En ciertas opciones, el compuesto no reivindicado de fórmula (I) tiene fórmula (I-c):

en la que RA, Rx1, y Rx2, son como se han definido anteriormente.

En ciertas opciones, el compuesto no reivindicado de fórmula (I) tiene fórmula (I-d):

en la que Ar1, Ar2, Ar3 y n son como se han definido anteriormente.

En ciertas opciones, el compuesto no reivindicado de fórmula (I) tiene fórmula (I-e):

en la que n es como se ha definido anteriormente. En algunas opciones, n es cualquier número del 0 al 10. En ciertas opciones, el compuesto no reivindicado de fórmula (I) tiene fórmula (I-f):

en la que Ar1, Ar2, Ar3 y n son como se han definido anteriormente.

En ciertas opciones, el compuesto no reivindicado de fórmula (I) tiene fórmula (I-g):

en la que n es como se ha definido anteriormente. En algunas opciones, n es cualquier número del 0 al 10. En ciertas opciones, el compuesto no reivindicado de fórmula (I) tiene fórmula (I-h):

en la que Ar1, Ar2, y Ar3, son como se han definido anteriormente.

En ciertas opciones, el compuesto no reivindicado de fórmula (I) tiene fórmula (I-i):

En ciertas opciones, el compuesto no reivindicado de fórmula (I) tiene fórmula (I-j):

en la que Ar1, Ar2, y Ar3 son como se han definido anteriormente.

En ciertas opciones, el compuesto no reivindicado de fórmula (I) tiene fórmula (I-k):

En ciertas opciones, Ar4 es fenilo, furano o tiofeno, opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes alcoxi.

En ciertas opciones, Ar4 es fenilo, furano o tiofeno, opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes alcoxijAr1 es fenilo, Ar2 es furilo, y Ar3 es fenilo.

En ciertas opciones, el compuesto de fórmula (II) tiene la fórmula (II-a):

en la que Ar1, Ar2, y Ar4 son como se han definido anteriormente.

En ciertas opciones, el compuesto de fórmula (II) tiene la fórmula (II-b):

en la que Ar-1- y Ar-4- son como se han definido anteriormente.

En ciertas opciones, el compuesto de fórmula (II) tiene la fórmula (II-c):

en la que Ar4 es como se ha definido anteriormente.

En ciertas opciones, el compuesto de fórmula (III) es carbonato, en el que RC se selecciona del grupo que consiste en alquilo lineal o ramificado C<1>-C<9>, alcoxialquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo y alquilo heterociclo.

En ciertas opciones, el compuesto de fórmula (III) es carbonato, en el que RC se selecciona del grupo que consiste en alquilo lineal o ramificado C<1>-C<9>, alcoxialquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo y alquilo heterociclo; en el que Ar1 es fenilo, Ar2 es furilo y Ar3 es fenilo.

En ciertas opciones, el compuesto de fórmula (III) tiene la fórmula (III-a):

en la que Ar1, Ar2 y RC son como se han definido anteriormente.

En ciertas opciones, el compuesto de fórmula (III) tiene la fórmula (III-b):

en la que Ar2 y RC son como se han definido anteriormente.

En ciertas opciones, el compuesto de fórmula (III) tiene la fórmula (III-c):

en la que RC es como se ha definido anteriormente.

Compuestos representativos pero no reivindicados de fórmula (I) incluyen, pero no se limitan a:

((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil 3- metoxi-2,2-dimetilpropanoato (WZ 0323);

((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil 3-(2-(2- metoxietoxi )etoxi)-2,2-dimetilpropanoato (WZ-0324

((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil 3-(2- metoxietoxi )-2,2-dimetilpropanoato (WZ-0333);

((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil 13,13- dimetil-2,5,8,11 -tetraoxatetradecan-14-oato (WZ-0336);

((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil 16,16- dimetil-2,5,8,11,14-pentaoxaheptadecan-17-oato (WZ-0364);

((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil 2-metoxi-2-metilpropanoato (WZ-0451); y ((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil 2- acetami do2-metilpropanoato (WZ-0467).

Los compuestos representativos de fórmula (II) incluyen, pero no se limitan a:

((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil furano- 2-carboxilato (WZ-0420);

((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil furano- 3-carboxilato (WZ-0461); y ((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil benzoato (WZ-0416);

Los compuestos representativos de fórmula (III) incluyen, pero no se limitan a:

((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil metil carbonato(WZ-0419).

Los nombres de los compuestos se asignan utilizando el algoritmo de nomenclatura Struct=Name como parte de CHEMDRAW®ULTRA v. 12.0.

Los compuestos pueden existir como estereoisómeros en los que están presentes centros asimétricos o quirales. Los estereoisómeros son'W o "S''en función de la configuración de los sustituyentes alrededor del átomo de carbono quiral. Los términos''^" y'S'litNizados en el presente documento son configuraciones tal como se definen en Recomendaciones de 1974 de la IUPAC para la Sección E, Estereoquímica fundamental, en Pure Appl. 1976, 45: 13-30. La divulgación contempla diversos estereoisómeros y mezclas de los mismos. Los estereoisómeros incluyen enantiómeros y diastereómeros y mezclas de enantiómeros o diastereómeros. Los estereoisómeros individuales de los compuestos pueden prepararse sintéticamente a partir de materiales de partida comercialmente disponibles, que contienen centros asimétricos o quirales, o mediante la preparación de mezclas racémicas seguidas de métodos de resolución bien conocidos por los expertos en la materia. Estos métodos de resolución se ejemplifican mediante (1) la unión de una mezcla de enantiómeros a un auxiliar quiral, la separación de la mezcla resultante de diastereómeros por recristalización o cromatografía, y la liberación opcional del producto ópticamente puro del auxiliar, como se describe en Furniss, Hannaford, Smith y Tatchell, "Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry", 5a edición (1989), Longman Scientific & Technical, Essex CM20 2JE, Inglaterra, y, o (2) separación directa de la mezcla de enantiómeros ópticos en columnas cromatográficas quirales, o (3) métodos de recristalización fraccionada.

Debe entenderse que los compuestos pueden poseer formas tautoméricas así como isómeros geométricos, y que éstos también constituyen un aspecto de la invención.

La presente divulgación también incluye compuestos marcados isotópicamente, que son idénticos a los recitados en la fórmula (I), pero por el hecho de que uno o más átomos se sustituyen por un átomo que tiene una masa atómica o número másico diferente de la masa atómica o número másico que se encuentra normalmente en la naturaleza. Ejemplos de isótopos adecuados para su inclusión en los compuestos de la invención son hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, flúor y cloro, tales como, pero no limitados a, 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 31P, respectivamente. La sustitución con isótopos más pesados como el deuterio, es decir, 2H, puede ofrecer ciertas ventajas terapéuticas derivadas de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, una mayor vida media in vivo o menores requisitos de dosificación, y por lo tanto, puede ser preferible en algunas circunstancias. El compuesto puede incorporar isótopos emisores de positrones para la obtención de imágenes médicas y estudios de tomografía por emisión de positrones (PET) para determinar la distribución de los receptores. Los isótopos emisores de positrones adecuados que pueden incorporarse a los compuestos de fórmula (I) son 11C, 13N, 15O, y 18F. Los compuestos de fórmula (I) etiquetados isotópicamente pueden prepararse generalmente mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia o mediante procesos análogos a los descritos en los Ejemplos adjuntos, utilizando el reactivo etiquetado isotópicamente apropiado en lugar del reactivo no etiquetado isotópicamente.

A. Propiedades de los Compuestos

Los compuestos de fórmula (I), fórmula (II), y (III) pueden ser pro-sustratos de luciferasas para producir luminiscencia sobre acciones de enzimas no luciferasas presentes en células, añadidas en medios extracelulares, o en la muestra para liberar el sustrato de luciferasa (tal como coelenterazina o furimazina) durante un cierto periodo de tiempo. En algunas opciones, los compuestos pueden reaccionar con una enzima de desprotección (como una esterasa) para liberar el sustrato de luciferasa. Los compuestos pueden tener estabilidad mejorada, solubilidad en agua mejorada, permeabilidad celular mejorada, autoluminiscencia reducida y/o toxicidad reducida. En algunas opciones, los compuestos divulgados pueden exhibir una estabilidad sérica inesperadamente superior en comparación con otros análogos de ésteres de coelenterzina y furimazina. En opciones particulares, los compuestos divulgados son estables en un medio que contiene un suero, lo que permite una señal estable en varios ensayos de células vivas hasta 24 horas y más.

Los análogos de pro-coelenterazina, como se usan aquí, incluyen compuestos de pro-coelenterazina y pro-furimazina, que han sido modificados estructuralmente a partir de coelenterazina y furimazina, respectivamente, de tal manera que ya no interactúan con una proteína luminogénica para luminiscencia. En algunas opciones, la modificación de la estructura puede consistir en la adición de un grupo enzimático (como la formación de un grupo éster). La interacción de los análogos de la pro-coelenterazina con una enzima apropiada (como una esterasa) puede dar lugar a un compuesto luminóforo activo, incluida la coelenterazina, la furimazina o sus derivados. La enzima que convierte el análogo de la procoelenterazina en un luminóforo es preferentemente una enzima no luminogénica. En algunas opciones, los compuestos de fórmula (I) divulgados incluyen compuestos pro- coelenterazinas o pro-furimazinas, que pueden convertirse en luminóforos protegidos con ésteres.

En general, "realzada" o "mejorada" significa que la propiedad particular (como la luminiscencia y la estabilidad de la señal) aumenta, en relación con la de la combinación de referencia de luciferasa más análogo de la coelenterazina o el análogo de la coelenterazina en consideración, donde el aumento es de al menos 1%, al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 50%, al menos un 75%, al menos un 90%, al menos un 100%, al menos un 200%, al menos un 500%, o al menos un 1000% mayor que el de la combinación de referencia de luciferasa más coelenterazina o el análogo de coelenterazina considerado; o el éster acetilado no sustituido de referencia unido a la coelenterazina mediante un enlace de éter de metileno.

"Luminiscencia" se refiere a la producción de luz de una luciferasa en condiciones apropiadas, por ejemplo, en presencia de un sustrato adecuado como un análogo de la coelenterazina. La salida de luz puede medirse como una medida instantánea o casi instantánea de la salida de luz (que a veces se denomina luminiscencia "T=0" o "flash") al comienzo de la reacción de luminiscencia, que puede iniciarse al añadir el sustrato de pro-coelenterazina. La reacción de luminiscencia puede llevarse a cabo en una solución. La reacción de luminiscencia puede llevarse a cabo sobre un soporte sólido. En algunas opciones, la solución puede contener células vivas en un sistema de expresión procariota o eucariota.

En otras opciones, la expresión se produce en un sistema libre de células, o la proteína luciferasa se secreta en un medio extracelular, de modo que, en este último caso, no es necesario producir un lisado. En algunas opciones, la reacción se inicia inyectando materiales apropiados, por ejemplo, análogo de pro-coelenterazina, tampón, etc., en una cámara de reacción (por ejemplo, un pocillo de una placa de múltiples pocillos, como una placa de 96 pocillos) que contiene la enzima de desprotección de ésteres y la proteína luminiscente. En otras opciones, la luciferasa y/o los análogos de procoelenterazina (por ejemplo, compuestos de fórmula (I)) se introducen en un huésped, y las mediciones de luminiscencia se realizan en el huésped o en una porción del mismo, que puede incluir un organismo entero o células, tejidos, explantes o extractos del mismo. La cámara de reacción puede estar situada en un dispositivo de lectura que pueda medir la salida de luz, por ejemplo, utilizando un luminómetro o un fotomultiplicador. La producción de luz o luminiscencia también puede medirse a lo largo del tiempo, por ejemplo en la misma cámara de reacción durante un periodo de segundos, minutos, horas, etc. La salida de luz o luminiscencia puede ser reportada como el promedio en el tiempo, la vida media de decaimiento de la señal, la suma de la señal durante un período de tiempo, o el pico de salida. La luminiscencia puede medirse en Unidades Relativas de Luz (RLUs).

Los compuestos divulgados pueden incluir propiedades tales como estabilidad física mejorada o autoluminiscencia reducida. La estabilidad física de los presentes compuestos se refiere a lo estable que es un compuesto en determinadas condiciones, de manera que mantiene la capacidad de luminiscencia cuando es utilizado como sustrato por una luciferasa.

La luminiscencia que no depende de la actividad de una luciferasa o fotoproteína se denomina autoluminiscencia. La autoluminiscencia es la luminiscencia de una sustancia producida por la energía liberada en forma de luz durante su descomposición. Por ejemplo, la autoluminiscencia puede deberse a la oxidación espontánea del sustrato luminógeno coelenterazina.

Para un compuesto de pro-coelenterazina, "estabilidad" también puede referirse a cuán estable es el compuesto en ciertas condiciones, de tal manera que mantiene la capacidad de liberar el sustrato de coelenterazina gradualmente durante cierto período de tiempo (por ejemplo, por las acciones de enzimas de células vivas) cuando se utiliza para ensayos de células vivas por una luciferasa. La estabilidad de los compuestos de pro-coelenterazina divulgados puede demostrarse por el porcentaje de degradación del compuesto concreto en un entorno específico a lo largo del tiempo. El porcentaje de pureza de un compuesto concreto puede determinarse mediante diversas técnicas conocidas por los expertos en la materia. Estas técnicas incluyen, por ejemplo, la resonancia magnética nuclear (RMN) y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

"Estabilidad en suero" se refiere a la estabilidad de un compuesto en medios o cultivos que incluyen suero. El suero aquí utilizado puede incluir, entre otros, suero fetal bovino (FBS). La estabilidad sérica de un compuesto, tal como se utiliza en el presente documento, puede caracterizarse generalmente por el grado de degradación de dicho compuesto en un suero a lo largo de un periodo de tiempo. Por ejemplo, un compuesto puede degradarse menos del 25%, menos del 20%, menos del 15% o incluso menos del 10% en f Bs durante un periodo de 24 horas o más. Para los ensayos con células vivas, el suero (como FBS) es un componente para mantener la salud celular. El grado de degradación de los compuestos divulgados o de los otros análogos de la pro-coelenterazina en control DMSO, o en medio DMEM con/sin FBS, puede monitorizarse por HPLC, utilizando disolvente/amortiguador de elución específico (por ejemplo, TFA al 0,1% y acetonitrilo) en las mismas condiciones en determinados momentos puntuales. El porcentaje de pureza puede calcularse dividiendo el área de pico del compuesto analizado por las áreas de pico totales, incluidos el compuesto analizado y los compuestos de degradación, en su correspondiente tiempo de retención a una determinada longitud de onda de absorbancia (por ejemplo, 260 nm) en un determinado punto temporal en un medio con/sin FBS. Los cambios de pureza de un compuesto determinado a lo largo del tiempo indican el grado de inestabilidad del compuesto en medios/cultivos con/sin suero. Por ejemplo, las degradaciones de los compuestos divulgados enumerados en el Esquema 1a son significativamente más lentas que las de otros análogos del éster de pro-coelenterazina enumerados en el Esquema 1b.

E sq u em a l a Ejemplos de esteres de pro-furimazina estables en suero

Los compuestos divulgados demuestran una estabilidad sérica inesperada y superior en comparación con otros compuestos de éster de pro-coelenterazina. En algunas opciones, los presentes compuestos pueden tener una estabilidad sérica mejorada (por ejemplo, <20% degradados en medio DMEM con 10% de FBS durante 12 horas o más, FIGS. 2A-2I). Por el contrario, los otros compuestos de éster (como WZ-0308, WZ-0310, WZ-0315, WZ-0429, WZ-0439, WZ-0454 y WZ-0441) muestran una pobre estabilidad en suero (> 80% degradados en medio DMEM con 10% FBS incluso durante 12 horas, FIGS. 1A-1H). La notable estabilidad de los presentes compuestos ofrece una variedad de mejoras para los ensayos con células vivas. En algunas opciones, los compuestos divulgados pueden proporcionar una señal luminiscente estable que dura al menos 12 horas, al menos 16 horas, al menos 24 horas, al menos 36 horas, o al menos 48 horas para células vivas que expresan luciferasa o fragmento complementario de luciferasa en medios que contienen FBS. Debido a su mayor estabilidad sérica, los presentes compuestos pueden permitir la liberación continua de moléculas activas de furimazina o coelenterazina, disponibles para ensayos luminiscentes durante un largo periodo de tiempo, mejorando así la duración de la señal de los ensayos.

Los compuestos estables en suero divulgados, también exhiben reactividad ajustable, intensidad de señal ajustable y ventanas de ensayo ajustable, que dependen de la concentración y las necesidades de un ensayo. Por ejemplo, los compuestos WZ-0451 y WZ-0420 muestran una señal estable en 15 horas cuando la concentración es superior a 20uM, y la intensidad de la señal es 10 veces más brillante que el pro-sustrato tradicional PBI-4377 (FIG. 3I y FIG. 3K). Sin embargo, los otros compuestos divulgados WZ-0416 y WZ-0461 exhiben una señal estable durante 24 horas de manera menos dependiente de la concentración, pero con brillo disminuido, que es comparable o ligeramente mejor que el compuesto PBI-4377 (FIG. 3J, FIG. 3L, F iG. 5C y FIG. 5D). En cambio, los compuestos inestables en suero, WZ-0308, WZ-0429. WZ-0439, WZ-0454 y WZ-0441 (FiG. 1A-FIG. 1H), mostraron un rápido decaimiento de la señal casi independiente de la concentración (FIG. 3A, FIG. 3E-FIG 3H). Por lo tanto, los pro-sustratos estables en suero divulgados son capaces de mantener una señal luminiscente sostenible a lo largo de una ventana de tiempo de incubación deseada, que puede o no depender totalmente de la actividad de la esterasa dentro de una célula, y que también puede ser contraria a las expectativas tradicionales de que una ventana de ensayo y/o señal puede depender únicamente de la actividad de la esterasa dentro de una célula.

Además de la estabilidad sérica superior de los presentes compuestos, en algunas opciones, los ensayos de células vivas bioluminiscentes podrían mejorarse mejorando la solubilidad y/o permeabilidad celular de los compuestos. En algunas opciones, los presentes compuestos contienen fracciones de polietilenglicol (PEG) con varios números de unidades repetitivas. La longitud de las fracciones de PEG puede mejorar la permeabilidad celular y la solubilidad de los presentes compuestos en ensayos con células vivas. Las moléculas de PEG y otros grupos de protección de los presentes compuestos pueden escindirse mediante una enzima de desprotección (como una esterasa) en un ensayo de células vivas para liberar un sustrato de luciferasa (como la furimazina). Como ejemplo no limitativo, se realizó una comparación de tres ésteres de pro-furimazina diferentes, WZ-0308, PBI-4377 y el compuesto divulgado WZ-0324, utilizando 10 ng/pocillo del gen CMV promotor-NanoLuc® transfectado en células HEK293 en medio DMEM en presencia de 10% de FBS con/sin adición de esterasa exógena de hígado porcino (PLE). Los resultados muestran que el compuesto inestable en suero WZ-0308 liberó furimazina rápidamente en presencia de FBS, pero la señal luminiscente no fue sostenible durante un largo periodo de tiempo incluso sin la adición de PLE exógena (FIG. 3A, rápida disminución de la señal durante las 2-3 primeras horas). Por otro lado, tanto el pro-sustrato tradicional de células vivas PBI-4377 como el compuesto divulgado WZ-0324 mostraron una señal estable durante 24 horas o más en ausencia de PLE esterasa exógena (FIGS.

3B y 3C). Las señales luminiscentes de PBI-4377 y WZ- 0324 eran comparables y ambas aumentaron significativamente con la adición de esterasa exógena (FIGS. 3B y 3C). Los resultados también sugieren que WZ-0324 puede tener una actividad esterasa menor que PBI-4377, ya que la señal observada para PBI-4377 tras la adición de PLE (FIG. 3B) fue en general superior a la deWZ-0324 (FIG. 3C). Además, los resultados sugieren que WZ-0324 puede tener mayor permeabilidad celular que PBI-4377 (FIGS. 3B y 3C, mayor señal deWZ-0324 en ausencia de PLE esterasa exógena). Los resultados sugieren que el WZ-0324 puede tener una solubilidad mayor que el PBI-4377 (se observa turbidez para el PBI-4377 por encima de 50<j>M frente al WZ-0324 por encima de 70<j>M). La solubilidad o permeabilidad celular puede mejorarse aún más aumentando la longitud de los p Eg o incorporando otros grupos solubles en agua, como grupos amino o grupos hidroxilo, lo que puede mejorar aún más el rendimiento del ensayo con células vivas sin necesidad de añadir esterasa exógena.

La "biocompatibilidad" se refiere a la tolerancia de una célula (por ejemplo, procariota o eucariota) a un compuesto de procoelenterazina o pro-furimazina (por ejemplo, compuestos de fórmula (I)). La biocompatibilidad de un compuesto procoelenterazina o pro-furimazina está relacionada con el estrés que provoca en la célula huésped. La liberación lenta de furimazina o coelenterazina activa a partir de un compuesto de pro- coelenterazina o pro-furimazina (por ejemplo, compuestos de fórmula (I)) puede, en algunas opciones, reducir o eliminar la toxicidad causada por la propia molécula activa y mejorar la tolerancia de la célula a dichos compuestos.

La biocompatibilidad mejorada del análogo de pro-coelenterazina (por ejemplo, compuestos de fórmula (I), fórmula (II) y fórmula (III)), puede determinarse midiendo la viabilidad celular y/o la tasa de crecimiento de las células. Por ejemplo, la biocompatibilidad mejorada de los análogos de la pro-coelenterazina, puede determinarse midiendo la viabilidad celular en ausencia de expresión de luciferasa de las células expuestas a los análogos de la pro-coelenterazina, en comparación con las coelenterazinas nativas o conocidas, para determinar el grado de compatibilidad y/o toxicidad de los análogos de la coelenterazina para las células.

En particular, la biocompatibilidad mejorada puede determinarse utilizando un análisis de viabilidad celular (por ejemplo, utilizando el ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CELLTITER-GLO®), un ensayo de apoptosis (por ejemplo, utilizando la tecnología CASPASE-GLO®), u otro método conocido en la técnica. El efecto de los compuestos divulgados sobre la viabilidad celular o la apoptosis puede compararse con el efecto de los análogos nativos o conocidos de la coelenterazina sobre la viabilidad celular o la apoptosis.

La biocompatibilidad mejorada también puede determinarse midiendo el efecto de los compuestos divulgados (por ejemplo, compuestos de fórmula (I), fórmula (II) y fórmula (III)) sobre el crecimiento celular o la expresión génica. Por ejemplo, la biocompatibilidad mejorada de los compuestos de fórmula (I), fórmula (II) o fórmula (III) puede determinarse midiendo el número de células tras un periodo de tiempo o determinando la expresión de genes de respuesta al estrés, en una muestra de células expuestas a compuestos de fórmula (I), fórmula (II) o fórmula (III) en comparación con células expuestas a un análogo nativo o conocido de la coelenterazina o sin coelenterazina. El efecto de los compuestos divulgados sobre el crecimiento celular o la expresión génica puede compararse con un análogo nativo o conocido de la coelenterazina.

B. Métodos de Síntesis

Los compuestos de fórmula (I), fórmula (II) y fórmula (III), y otros ésteres de furimazina-O-metilcarboxilo pueden sintetizarse como se muestra en el Esquema 2a y el Esquema 2b.

Esquema 2a.Síntesis de furimazina-O-metil Me-PEGn-OCH2-dimetilpropanoatos

WZ-0323, WZ-0333, WZ-0324, WZ-0336 y WZ-0364, y furimazina-O-metil

Me-PEGn-OCH2- propanoatos WZ-0308, WZ-0310 y WZ-0315.

Como se muestra en el Esquema 2a, los furimazina-O-metil Me-PEGn-OCH<2>-dimetilpropanoatos WZ-0323, WZ-0333, WZ-0324, WZ-0336 y WZ-0364 pueden sintetizarse empleando un método similar. Los compuestos WZ-0333, WZ- 0324, WZ-0336 y WZ-0364 pueden prepararse mediante una síntesis de cuatro pasos, con la excepción del compuesto WZ-0323 debido a la disponibilidad comercial del ácido 3-metoxi-2,2-dimetilpropanoico. El 3-hidroxi-2,2-dimetilpropanoato de metilo se desprotonó con hidruro sódico en DMF seca a 0°C y luego se hizo reaccionar con compuestos de éterbromo-PEG-M-Me para generar propionatos de metilo Me-PEG-M-dimetilo(1a-4a).A continuación, los compuestos1a-4ase hidrolizaron en condiciones básicas a 65°C para producir los ácidos correspondientes. Los ácidos1b-4breaccionaron con clorosulfonato de clorometilo en condiciones ligeramente básicas en presencia de hidrogenosulfato de n-tetrabutil amonio a 0°C y produjeron los intermedios clorometil Me-PEGn-dimetil propionatos1c-4c.La furimazina se alquiló con el compuesto0c-4cpara dar las moléculas diana finales WZ-0323, WZ-0333, WZ-0324, WZ-0336 y WZ-0364. Del mismo modo, las pro-furimazinas WZ-0451, WZ-0451, WZ-0467, WZ-0420, WZ-0461, WZ-0416, WZ-0419, WZ-0415, WZ-0429, WZ-0439, WZ-0454, WZ-0441, WZ-0440 y WZ-0430 pueden sintetizarse empleando el método antes mencionado mediante la conversión de ácidos en sus ésteres clorometílicos seguida de la posterior alquilación de la furimazina.

Las condiciones de reacción y los tiempos de reacción para cada paso individual pueden variar dependiendo de los reactivos particulares empleados y de los sustituyentes presentes en los reactivos utilizados. En la sección Ejemplos se proporcionan ejemplos no limitativos de procedimientos para preparar los presentes compuestos. Las reacciones pueden elaborarse de la manera convencional, por ejemplo, eliminando el disolvente del residuo y purificándolo aún más de acuerdo con metodologías generalmente conocidas en la técnica, que incluyen entre otras, la cristalización, la destilación, la extracción, la trituración y la cromatografía. Los materiales de partida y los reactivos pueden estar disponibles en el mercado o prepararse a partir de materiales disponibles en el mercado utilizando métodos descritos en la literatura química. Los materiales de partida, si no están disponibles comercialmente, pueden prepararse mediante procedimientos seleccionados entre técnicas estándar de química orgánica, técnicas análogas a la síntesis de compuestos conocidos estructuralmente similares, o técnicas análogas a los esquemas descritos anteriormente o a los procedimientos descritos en la sección de ejemplos sintéticos.

Las sales de adición básicas pueden prepararse durante el aislamiento y purificación final de los compuestos divulgados por reacción de un grupo carboxilo con una base adecuada tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato, de un catión metálico tal como litio, sodio, potasio, calcio, magnesio o aluminio, o una amina orgánica primaria, secundaria o terciaria. Pueden prepararse sales de aminas cuaternarias, como las derivadas de metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, dietilamina, etilamina, tributilamina, piridina, N,N-dimetilanilina, N-metilpiperidina, N-metilmorfolina, diciclohexilamina, procaína, dibencilamina, N,N-dibencilfenetilamina, 1-efenamina y N,N'-dibenciltilendiamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperidina, piperazina y similares.

Las experimentaciones rutinarias, incluyendo la manipulación apropiada de las condiciones de reacción, los reactivos y la secuencia de la ruta sintética, la protección de cualquier funcionalidad química que no pueda ser compatible con las condiciones de reacción, y la desprotección en un punto adecuado de la secuencia de reacción del método están incluidas en el alcance de la divulgación. Los grupos protectores adecuados y los métodos para proteger y desproteger diferentes sustituyentes utilizando dichos grupos protectores adecuados son bien conocidos por los expertos en la materia; se pueden encontrar ejemplos de los mismos en PGM Wuts y TW Greene, en el libro de Greene titulado Protective Groups in Organic Synthesis (4th ed.), John Wiley & Sons, NY (2006). La síntesis de los compuestos aquí descritos puede llevarse a cabo por métodos análogos a los descritos en los esquemas sintéticos descritos anteriormente y en ejemplos específicos.

Cuando se requiere una forma ópticamente activa de un compuesto divulgado, puede obtenerse llevando a cabo uno de los procedimientos aquí descritos utilizando un material de partida ópticamente activo (preparado, por ejemplo, por inducción asimétrica de un paso de reacción adecuado) o por resolución de una mezcla de los estereoisómeros del compuesto o intermedios utilizando un procedimiento estándar (como separación cromatográfica, recristalización o resolución enzimática).

Del mismo modo, cuando se requiere un isómero geométrico puro de un compuesto, puede obtenerse llevando a cabo uno de los procedimientos anteriores utilizando un isómero geométrico puro como material de partida o mediante la resolución de una mezcla de los isómeros geométricos del compuesto o intermedios utilizando un procedimiento estándar como la separación cromatográfica.

Puede apreciarse que los esquemas sintéticos y los ejemplos específicos descritos son ilustrativos.

3. Métodos de Uso y Kits

Los presentes compuestos pueden utilizarse de cualquier forma en que se hayan utilizado sustratos de luciferasa, por ejemplo, análogos de la coelenterazina. En particular, el presente compuesto puede utilizarse en ensayos de células vivas, incluidos el ensayo reportero, el ensayo NanoBiT™ y el ensayo NanoBRET™, el ensayo Annexin, etc. Cuando se utiliza una pro-coelenterazina o pro-furimazina estable en ensayos de células vivas, la precisión de los ensayos aumenta considerablemente debido a la reducción de la luz producida por la desestabilización del luminóforo.

Los presentes compuestos pueden usarse en un método para detectar luminiscencia en una muestra, el método comprende: contactar una muestra con un compuesto divulgado en el presente documento; contactar la muestra con una enzima de desprotección, si no hay enzima de desprotección presente en la muestra; contactar la muestra con una luciferasa que utiliza coelenterazina, si no hay luciferasa que utiliza coelenterazina presente en la muestra; y detectar luminiscencia.

La enzima de desprotección, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a enzimas capaces de convertir compuestos de pro-coelenterazina o pro-furimazina en los compuestos luminóforos furimazina o coelenterazina. Como enzimas de desprotección pueden utilizarse diversas enzimas de desprotección. En algunas opciones, las enzimas de desprotección incluyen, entre otras, la esterasa.

En ciertas opciones, la muestra comprende células vivas. Las células vivas pueden ser de un animal (por ejemplo, un vertebrado), una planta, un hongo, un fluido fisiológico (por ejemplo, sangre, plasma, orina, secreciones mucosas) o un cultivo celular.

En ciertas opciones, la muestra comprende una luciferasa utilizadora de coelenterazina o un fragmento complementario de luciferasa.

En ciertas opciones, las pro-coelenterazinas o pro-furimazinas pueden usarse como reactivos de ensayo. Los ensayos con luciferasas son bien conocidos en la técnica. Estos ensayos son especialmente útiles para analizar mecanismos biológicos, como la expresión y regulación de genes en células vivas. Típicamente, las células se transfectan con un ácido nucleico que codifica una luciferasa, y la presencia de luciferasa se determina mediante la adición de reactivos con las células, incluido el análogo de la pro-coelenterazina. La pro-coelenterazina puede ser desprotegida por la enzima presente en las células para liberar el luminóforo.

En algunas opciones, se utiliza una pro-coelenterazina o una pro-furimazina en un ensayo de células vivas que comprende luciferasa NanoLuc® o luciferasa Renilla. La luciferasa NanoLuc® o Renilla puede ser la única proteína productora de luz en el ensayo, y las esterasas presentes en las células vivas pueden ser la enzima de desprotección.

En algunas opciones, se utiliza una pro-coelenterazina o una pro-furimazina en ensayos de células vivas que comprenden ensayos complementarios de fragmentos de proteina-NanoLuc® para la expresión y regulación de genes reporteros en células vivas.

En algunas opciones, se utiliza una pro-coelenterazina o pro-furimazina en ensayos de células vivas, que comprenden proteína de interés fusionada con fragmentos NanoLuc® para ensayos complementarios NanoLuc®, para investigar la interacción proteína-proteína.

En algunas opciones, se utiliza una pro-coelenterazina o una pro-furimazina en un ensayo en tiempo real, que comprende fragmentos NanoLuc® complementarios de Annexin para un ensayo de apoptosis en tiempo real. Las anexinas son una familia de proteínas que se unen a fosfolípidos dependientes del calcio. En las células sanas, la fosfatidilserina se localiza predominantemente en el lado citosólico de la membrana plasmática. La fosfatidilserina se transloca activamente a la membrana extracelular como resultado de la inducción de la apoptosis. Este biomarcador temprano de la cascada apoptótica puede medirse mediante las proteínas Annexin V fusionadas con fragmentos complementarios Nanoluc, que se unen a la fosfatidilserina y pueden reaccionar con furimazina o coelenterazina para detectar células apoptóticas por luminiscencia.

En algunas opciones, se utiliza una pro-coelenterazina o una pro-furimazina en el ensayo de transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) de células vivas. BRET puede determinarse si dos moléculas son capaces de unirse entre sí o están co-localizadas en una célula. BRET implica el uso de dos moléculas bioluminiscentes o una molécula bioluminiscente y una molécula fluorescente. Las moléculas se eligen de forma que la longitud de onda de emisión del donante se encuentre dentro del espectro de excitación del aceptor. Además, los espectros de excitación y emisión de las dos moléculas deben solaparse mínimamente, si es que lo hacen. Cuando las moléculas están próximas entre sí, la excitación del donante provoca una transferencia de energía al aceptor en lugar de una emisión de luz. A continuación, el aceptor emite la energía transferida en forma de luz. De este modo, cuando las moléculas están próximas entre sí, la luz detectada por el donante es baja, mientras que la luz detectada por el aceptor es alta. Cuando las moléculas no están próximas entre sí, la luz detectada por el donante es alta, mientras que la luz detectada por el aceptor es baja. Uniendo el donante a una primera proteína y el aceptor a una segunda proteína, se puede determinar la interacción de las dos proteínas mediante la detección de BRET. En las opciones preferidas, el donante es Nanoluc luciferasa y el aceptor son colorantes fluorescentes rojos.

En algunas opciones, se utiliza una pro-coelenterazina o una pro-furimazina en un ensayo, en el que puede añadirse una enzima de desprotección como enzima exógena junto con la adición de los reactivos del ensayo. Tales ensayos pueden ser útiles en métodos de liberación rápida del luminóforo activo (por ejemplo, coelenterazina o furimazina), en una muestra para ciertos ensayos de células vivas que requieren alcanzar el brillo máximo en un corto período de tiempo, pero que aún requieren mantener una señal razonablemente estable durante un cierto período de tiempo.

En ciertas opciones, los compuestos de fórmula (I), fórmula (II) y fórmula (III) no se limitan a entornos de células vivas in vitro o in situ, sino que pueden extenderse a estudios in vivo. Las aplicaciones de la pro-coelenterazina o la pro-furimazina al análisis luminiscente in vivo serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia.

En las opciones en las que una luciferasa, luciferasa fusionada con proteína o fragmento complementario de luciferasa se expresa en células, las células se tratan con pro-furimazina o análogos de pro- coelenterazina (por ejemplo, un compuesto de fórmula (I), fórmula (II) y fórmula (III)), los pro-sustratos permeabilizarán las células en cultivo para liberar furimazina o coelenterazina, y luego reaccionarán con la luciferasa, luciferasa fusionada con proteína o luciferasa complementaria y generarán luminiscencia. El aumento de la permeabilidad celular para el pro-sustrato mediante modificación química puede mejorar el rendimiento del ensayo.

En las opciones en las que se necesitan ensayos con células vivas, el suero bovino fetal (FBS) puede ser un componente necesario para mantener la salud celular en los medios o cultivos. Los compuestos de fórmula (I), en virtud de su mayor estabilidad en medios que contienen FBS, pueden utilizarse para ensayos más robustos, basados en luciferasa en células vivas.

En otras opciones, una muestra (incluyendo células, tejidos, animales, etc.), que contiene una luciferasa o fragmento complementario de luciferasa y un compuesto de fórmula (I), fórmula (II), y fórmula (III), puede ensayarse usando varias técnicas de microscopía y formación de imágenes, por ejemplo, formación de imágenes in vivo.

En otras opciones, una luciferasa secretable, se expresa en células como parte de un sistema de ensayo de células vivas.

Además de ser permeantes a las células, los compuestos de fórmula (I), fórmula (II) y fórmula (III), pueden mostrar una biocompatibilidad comparable a la de la coelenterazina nativa en términos de viabilidad celular.

En ciertas opciones, los compuestos de fórmula (I), fórmula (II) y fórmula (III) divulgados en el presente documento pueden proporcionarse como parte de un kit. El kit puede incluir una o más luciferasas (en forma de polipéptido, polinucleótido o ambos) y un análogo de pro-furimazina o pro- coelenterazina de fórmula (I), fórmula (II) y fórmula (III), junto con reactivos e instrucciones adecuados para permitir a un usuario realizar ensayos como los aquí divulgados. El kit también puede incluir uno o más tampones como los descritos en el presente documento.

4. Ejemplos

Ejemplo 1: Síntesis de Furimazina metil Me-PEGo-OCH<2>-dimetilpropanoato (WZ-0323)

Síntesis de Me-PEG<0>-OCH<2>-Dimetil-COOCH<2>Cl (0c):El ácido Me-PEGü-OCH<2>-dimetilpropanoico (1,0 g, 7,57 mmol) se diluyó en una mezcla de 20 ml/20 ml de diclorometano/agua. La mezcla se enfrió en un baño de agua helada y se añadieron bicarbonato sódico (2,54 g, 30,27 mmol, 4 equiv) e hidrogenosulfato de n-tetrabutilamonio (0,128 g, 0,378 mmol, 0,05 equiv). Tras agitar durante 5 min, se añadió clorometilclorosulfonato (1,37 g, 8,32 mmol, 1,1 equiv) a 0 °C. La solución se agitó enérgicamente durante toda la noche. La mezcla se transfirió a un embudo de separación con más diclorometano y se lavó con solución saturada de cloruro sódico. Las capas orgánicas se secaron sobre sulfato sódico. La eliminación del disolvente generó el producto bruto en un rendimiento del 73,2% (1,37 g). El compuesto se utilizó directamente en el siguiente paso sin purificación adicional.

((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil 3-metoxi-2,2-dimetilpropanoa (WZ-0323):La mezcla de Me-PEGü-OCH<2>-Dimetil-COOCH<2>Cl (0c) (0,378 g, 2,10 mmol) y KI (0,348 g, 2,10 mmol) en 5 ml de DMF se agitó durante 30 minutos bajo argón. Se añadieron furimazina (0,20 g, 0,524 mmol) y K<2>CO<3>(0,290 g, 2,10 mmol), y la mezcla resultante se agitó durante otros 30 minutos. La mezcla se diluyó con 20 ml de DCM y se lavó con agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na<2>SO<4>. El compuesto se purificó mediante cromatografía flash ESCO utilizando heptano/acetato de etilo como eluyente para obtener el producto deseado (90 mg, 33%). 1HNMR(d6-DMSO, 5 ppm): 8,52 (s, 1H), 8,00-8,20 (m, 2H), 7,40-7,70 (m, 6H), 7,20-7,38 (m, 3H), 6,48 (d, 1H), 6,21 (d, 1H), 5,74 (s, 2H, -OCH<2>O-), 4,49 (s, 2H, -CH<2>), 4,18 (s, 2H, -CH<2>), 3,33 (s, 2H,-OCH2), 3,01 (s, 3H, -OCH<3>), 1,0 (s, 6H, -CH<3>).MS (m/e)(C<31>H<31>N<3>O<5>) calculado 525,23, observado 526,2[M+H]; pureza HPlC 100% a 260nm.

Ejemplo 2: Síntesis de Furimazina-O-metil Me-PEG<1>-OCH<2>-dimetilpropanoato (WZ-0333)

Síntesis de Me-PEG<1>-OCH<2>-dimetilpropanoatode metilo (1a):Se añadió hidruro sódico (60 % de peso en aceite) (6,28 g, mmol) a una disolución agitada de 3-hidroxi-2,2-dimetilpropanoato de metilo (10,40 g, 78,69 mmol) en DMF 20 ml a 0 °C, tras 5 min se añadió gota a gota 1-bromo-2-metoxietano (10,94 g, 78,69 mmol), y la mezcla de reacción se dejó agitar durante 3h. La reacción se apagó con NH<4>Cl (aq.) saturado frío (30 ml), la capa acuosa se extrajo con DCM (2 * 50 ml) y las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na<2>SO<4>. Tras eliminar el disolvente, el compuesto se purificó mediante cromatografía flash ESCO utilizando heptano/acetato de etilo como eluyente para obtener un 33% de producto (5,0 g).

Síntesis del ácido Me-PEG<1>-OCH<2>-dimetilpropanico (1b):Una suspensión de Me-PEG<1>-OCH<2>-dimetilpropanoato de metilo (5,0 g, 0,0284 mmol) en KOH 2 M en agua (60 ml) se agitó a 65 °C durante 7 horas. La capa acuosa se lavó con DCM (3 * 30 ml), se acidificó a pH 1-2 con HCl 6 M (ac.) y se extrajo con DCM (3 * 30 ml). Los orgánicos combinados se secaron (Na<2>SO<4>), se filtraron y se concentraron al vacío para obtener el producto deseado como un aceite amarillo claro (2,42 g, 48%).

Síntesis de Me-PEG<1>-OCH<2>-dimetilpropanoato de clorometilo (1c):El ácido Me-PEG<1>-OCH<2>-dimetil-propanico (2,42 g, 13,73 mmol) se diluyó en una mezcla de 20 ml/20 ml de diclorometano/agua. La mezcla se enfrió en un baño de agua helada y se añadieron bicarbonato sódico (4,61 g, 54,93 mmol, 4 equiv) e hidrogenosulfato de n-tetrabutilamonio (0,233 g, 0,687 mmol, 0,05 equiv). Tras agitar durante 5 min, se añadió clorometilclorosulfonato (2,49 g, 15,11 mmol, 1,1 equiv) a 0 °C. La solución se agitó enérgicamente durante toda la noche. La mezcla se transfirió a un embudo de separación con más diclorometano y se lavó con solución saturada de cloruro sódico. Las capas orgánicas se secaron sobre sulfato sódico. La eliminación del disolvente generó el producto bruto en un rendimiento del 60,9% (1,88 g). El compuesto se utilizó directamente en el siguiente paso sin purificación adicional.

Síntesis de ((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil 3-(2-metoxietoxi)-2,2-dimetilpropanoato (WZ-0333):La mezcla de clorometil Me-PEG<1>-OCH<2>-dimetilpropranoato(1c) (0,53 g, 2,36 mmol) y KI (0,391 g, 2,36 mmol) en 5 ml DMF se agitó durante 30 minutos bajo argón. Se añadieron furimazina (0,30 g, 0,786 mmol) y K<2>CO<3>(0,435 g, 3,15 mmol), y la mezcla resultante se agitó durante otros 30 minutos. La mezcla se diluyó con 20 ml de DCM y se lavó con agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na<2>SO<4>. El compuesto se purificó mediante cromatografía flash ESCO utilizando heptano/acetato de etilo como eluyente para obtener el producto deseado (120 mg, 27%).1HNMR(d6-DMSO, 5 ppm): 8,59 (s, 1H), 8,10-8,30 (m, 2H), 7,30-7,70 (m, 6H), 7,20-7,35 (m, 3H), 6,46 (d, 1H), 6,21 (d, 1H), 5,75 (s, 2H, -OCH<2>O-), 4,38 (s, 2H, -CH<2>), 4,15 (s, 2H, -CH<2>), 3,20-3,40 (m, 6H), 3,08 (s, 3H, -OCH<3>), 1,0 (s, 6H, -CH<3>).MS (m/e)(C<33>H<35>N<3>O<6>) calculado 569,25[M+H], observado 570,2; pureza HPLC 92,5% a 260 nm.

Los compuestos WZ-0324, WZ-0336, WZ-0364, WZ-0451, WZ-0467, WZ-0420, WZ-0461, WZ-0416, WZ-0419, WZ-0415, WZ-0429, WZ-0439, WZ-0454, WZ-0441, WZ-0440 y WZ-0430 se sintetizaron utilizando métodos similares a los empleados para la síntesis de WZ-0333.

((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil 3-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)-2,2-dimetilpropanoato (WZ-0324). 1HNMR(d6-DMSO, 5 ppm): 8,62 (s, 1H), 8,00-8,20 (m, 2H), 7,30-7,65 (m, 6H), 7,10-7,30 (m, 3H), 6,38 (d, 1H), 6,19 (d, 1H), 5,78 (s, 2H, -OCH<2>O-), 4,45 (s, 2H, -CH<2>), 4,19 (s, 2H, -CH<2>), 3,25-3,50 (m, 10H), 3,12 (s, 3H, -OCH<3>), 1,01 (s, 6H, -CH<3>).MS (m/e)(C<35>H<39>N<3>O<7>) calculado 613,28, observado 614,2 [M+H]; pureza HPLC 100% a 260 nm.

((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil 13,13-dimetil-2,5,8,11-tetraoxatetradecan-14-oato (WZ-0336). 1HNMR(d6-DMSO, 5 ppm): 8,57 (s, 1H), 8,0-8,25 (m, 2H), 7,30-7,65 (m, 6H), 7,20-7,30 (m, 3H), 6,42 (d, 1H), 6,22 (d, 1H), 5,75 (s, 2H, -OCH<2>O-), 4,43 (s, 2H, -CH<2>), 4,20 (s, 2H, ..CH<2>), 3,20-3,50 (m, 14H), 3,11 (s, 3H,-OCH3), 1.0 (s, 6H, -CH<3>).MS (m/e)(C<37>H<43>N<3>O<8>) calculado 657,31, observado 658,3 [M+H]; pureza HPLC 99,6% a 260 nm.

((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil 16,16-dimetil-2,5,8,11,14-pentaoxaheptadecan-17-oato (WZ-0364). 1HNMR(de-DMSO, 5 ppm): 8,59 (s, 1H), 8,0-8,2 (m, 2H), 7,30-7,60 (m, 6H), 7,20-7,30 (m, 3H), 6,39 (d, 1H), 6,18 (d, 1H), 5,79 (s, 2H, -OCH<2>O-), 4,42 (s, 2H, -CH<2>), 4,19 (s, 2H, -CH<2>), 3,22-3,55 (m, 18H), 3,17 (s, 3H, -OCH<3>), 1,0 (s, 6H, -CH<3>).MS (m/e)[M+H] (C<39>H<47>N<3>O<9>) calculado 701,33, observado 702,3 [M+H]; pureza HPLC 100% a 260 nm.

((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil 2-metoxi-2-metilpropanoato (WZ-0451). 1HNMR(de-DMSO, 5 ppm): 8,63 (s, 1H), 8,0-8,2 (m, 2H), 7,35-7,60 (m, 6H), 7,15-7,35 (m, 3H), 6,37 (d, 1H), 6,19 (d, 1H), 5,85 (s, 2H, -OCH<2>O--), 4,50 (s, 2H, -CH<2>), 4,21 (s, 2H, -CH<2>), 3,00 (s, 3H, -OCH<3>), 1,25 (s, 6H, -CH<3>).MS (m/e)(C<30>H<29>N<3>O<5>) calculado 511,21, observado 512,2 [M+H]; pureza HPLC 98% a 260 nm.

((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil 2-acetamido-2-metilpropanoato (WZ-0467). 1HNMR(de-DMSO, 5 ppm): 8,70 (s, 1H), 8,38 (s, 1H, NH), 8,0-8,2 (m, 2H), 7,30-7,65 (m, 6H), 7,15-7,35 (m, 3H), 6,38 (d, 1H), 6.22 (d, 1H), 5,76 (s, 2H, -OCH<2>O-), 4,49 (s, 2H, -CH<2>), 4,23 (s, 2H, -CH<2>), 1,74 (s, 3H, CH<3>C=O), 1,25 (s, 6H, CH<3>).MS (m/e)C<31>H<30>N<4>O<5>calculado 538,22, observado 539,2 [M+H]; pureza HPlC 99% a 260 nm.

((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil furano-2-carboxilato (WZ-0420). 1HNMR(de-DMSO,5ppm): 8,60 (s, 1H), 7,85-8,05 (m, 3H), 7,1-7,6 (m, 10H), 6,61 (d, 1H), 6,36 (d, 1H), 6,18 (d, 1H), 5,93 (s, 2H, -OCH<2>O-), 4,43 (s, 2H, -CH2), 4,13 (s, 2H, -CH2).MS (m/e)C<30>H<23>N<3>O<5>calculado 505,16, observado 506.2 [M+H]; pureza HPLC 90% a 260 nm.

((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil furano-3-carboxilato (WZ-0461). 1HNMR(de-DMSO, 5 ppm): 8,73 (s, 1H), 8,41 (s, br, 1H), 7,85-8,05 (m, 2H), 7,80 (d, 1H), 7,3-7,6 (m, 6H), 7,2-7,3 (m, 3H), 6,76 (d, 1H), 6,33 (d, 1H), 6,14 (d, 1H), 5,96 (s, 2H, -OCH<2>O-), 4,49 (s, 2H, -CH<2>), 4,14 (s, 2H, .-CH<2>).MS (m/e)C<30>H<23>N<3>O<5>calculado 505,16, observado 506,3 [M+H]; pureza HPLC 98,8% a 260 nm.

((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil benzoato (WZ-0416). 1HNMR(de-DMSO, 5 ppm): 8,59 (s, 1H), 7,8-8,0 (m, 4H), 7,6-7,7 (m, 1H), 7,3-7,5 (m, 8H), 7,1-7,3 (m, 3H), 6,38 (d, 1H), 6,14 (d, 1H), 6.0 (s, 2H, -OCH<2>O-), 4,42 (s, 2H,-CH2), 4,11 (s, 2H, -CH<2>).MS (m/e)C<32>H<25>N<3>O<5>calculado 515,18, observado 516,2 [M+H]; pureza HPLC 99,8% a 260 nm.

((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil metil carbonato (WZ-0419). 1HNMR(de-DMSO, 5 ppm): 8,61 (s, 1H), 7,9-8,1 (m, 2H), 7,3-7,6 (m, 6H), 7,1-7,3 (m, 3H), 6,38 (d, 1H), 6,17 (d, 1H), 5,78 (s, 2H, -OCH<2>O-), 4,47 (s, 2H, -CH<2>), 4,16 (s, 2H, -CH<2>), 3,71(s, 3H, OCH<3>).MS (m/e)C<27>H<23>N<3>O<5>calculado 469,16, observado 470.2 [M+H]; pureza HPLC 97,8% a 260 nm.

L i i n m r r r n iliz n l r imi n n r l l E m 2 l E m 2.

Ejemplo 3: Protocolo general de las pruebas de estabilidad de las profurimazinas o procoelenterazinas en DMSO o en medios con o sin suero bovino fetal

Los compuestos ensayados se disolvieron en una reserva de DMSO a una concentración de 20 mM. La solución madre se diluyó de nuevo a 40 pM en control DMSO o medio DMEM con/sin FBS. Tres diluciones de 40 uM de cada compuesto se midieron por HPLC utilizando un disolvente/amortiguador de elución específico (por ejemplo, TFA al 0,1% y acetonitrilo) en las mismas condiciones durante 24 horas. El porcentaje de pureza en determinados puntos temporales se calculó dividiendo el área del pico del compuesto ensayado por las áreas totales de los picos de todos los compuestos, incluidos el compuesto ensayado y los compuestos de degradación, en su correspondiente tiempo de retención a 260 nm. Los cambios de pureza del compuesto ensayado a lo largo del tiempo, indicaron el grado de inestabilidad del compuesto en un entorno específico con/sin 10% de FBS. FIGS. 1A-1H muestran que los compuestos WZ-0308, WZ-0310, WZ-0315, WZ-0429, WZ-0454, WZ-0439 y WZ-0441 demostraron una pobre estabilidad en suero, con aproximadamente un 50% o más de degradación en medio DMEM con 10% de FBS después de 5 horas. WZ-0415 mostró una mayor estabilidad en suero, con aproximadamente un 50% de degradación con un 10% de FBS tras 10 horas. En comparación, los compuestos WZ-0323, WZ-0324, WZ-0336, WZ-0451, WZ-0467, WZ-0420, WZ-0461, WZ-0416 y WZ-0419 demostraron una mejor estabilidad en suero, con <20% de degradación en medios DMEM con 10% de FBS durante 10 horas o más. (FIGS. 2A-2I).

Ejemplo 4: Protocolo general para el ensayo de genes reporteros en células vivas.

Los compuestos pro-coelenterazina o pro-furimazina sintetizados se evaluaron en un ensayo de gen reportero de células vivas. Como se muestra en las FIGS. 3A-C, se monitorizaron las disminuciones de la señal luminiscente a lo largo del tiempo en células HEK293, en medio DMEM con 10% de FBS transfectadas, con 10 ng/pocillo del gen CMV promotor-NanoLuc® con/sin adición de esterasa exógena de hígado porcino (PLE), con tres análogos representativos de procoelenterazina, por ejemplo, el compuesto inestable en suero WZ-0308, el pro-sustrato tradicional de células vivas PBI-4377, y el compuesto estable en suero divulgado WZ-0324. Las evaluaciones se realizaron mediante el siguiente protocolo.

Día 1: Células en placa. Las células HEK293 se cultivaron en medio completo (DMEM 10% FBS 1X aminoácidos no esenciales (NEAA)). Las células se cosecharon en el paso 6 (-95% de confluencia), mediante un procedimiento de: lavado con DPBS, tratamiento de las células con TrypLE Express hasta que las células se desprendieran, adición de 4X volúmenes de medio completo, peletización a<1 88>xg durante 2 minutos, y suspensión de las células en medio completo hasta 7,35E4 células/ml. Las células se sembraron a 100 pl por pocillo en los 60 pocillos interiores de placas de 96 pocillos (7.350 células por pocillo): 100 pl DPBS en los 36 pocillos exteriores y 100 pl DPBS entre pocillos. A continuación, las células se incubaron durante la noche a 37 °C, 5%co2.

Día 2: Transfección. Se realizaron dos mezclas maestras (MM): MM#1: 1,63 pl prep #1; 9,5 pl prep #3; 1,9 ml OM1; y MM#2: 2,9 u, prep #2; 9,5 p, prep #3; 1,9 m, OM1. Se añadieron 35,6 pl de FuGENE HD a cada MM y se mezclaron pipeteando arriba/abajo. La mezcla se incubó durante -10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 8 pl de la mezcla por pocillo utilizando una pipeta de repetición de un solo canal; n = 3 por condición. A continuación, la mezcla se incubó durante -24 horas a 37 °C, 5% CO<2>.

Día 3: Ensayo con células vivas. Los stocks de los compuestos ensayados en DMSO (500X) se prepararon por dilución en serie del stock de 50 mM con DMSO. El Medio /- esterasa de hígado porcino (PLE) a temperatura ambiente se preparó añadiendo 1 y 0,333 ug/ml de PLE en CO2 IM 10% FBS. También se preparó CO2 IM 10 % FBS sin adición de PlE. A continuación, se prepararon soluciones de medio compuesto de prueba (a temperatura ambiente) mediante los pasos siguientes: adición de 2 ml de medio respectivo por canal, adición de 4 pl de compuesto de prueba stock respectivo por canal y mezcla mediante pipeteo arriba/abajo 10-15X. La concentración final de DMSO fue del 0,2% v/v. La solución de DMSO se dejó caer hasta el fondo del canal, mostrando precipitación para las concentraciones más altas. Tras pipetear arriba/abajo, las soluciones con WZ-0324 a una concentración final de >50 uM, estaban notablemente turbias (100 uM > 75 uM > 50 uM), en algunos casos incluso tras una incubación prolongada a 37 °C. Las soluciones se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 15-20 minutos antes de añadirlas a las células (P1->P2->P3).

Se aspiró el medio y se sustituyó por 200 pl/pocillo del medio respectivo solución del compuesto ensayado. Se añadieron 200 pl de DPBS en total fuera de los pocillos 36X. El sistema se trasladó rápidamente al GMM+ correspondiente para iniciar las mediciones de RLU a 37 °C. Las mediciones se realizaron en las siguientes condiciones: tiempo de integración de 1 segundo; medición de RLU cada 15 minutos; se retiró la tapa para las mediciones de RLU durante la noche; y la medición inicial de RLU sería <37 °C debido a la adición de medio a temperatura ambiente y al enfriamiento de la placa.

Análisis de datos: RLU media trazada para n = 3; el error representado como desviación estándar se incluyó en cada archivo Prism insertado, pero no se muestra en aras de la claridad en la interpretación de las curvas.

Como se muestra en la FIG. 3A, el compuesto inestable en suero WZ-0308 en medio DMEM conteniendo 10% de FBS mostró la señal más alta en el punto temporal inicial, pero decayó rápidamente durante las primeras 2-3 horas incluso sin añadir PLE exógena. Este resultado era coherente con el resultado de estabilidad por HPLC, lo que indicaba que WZ-0308 liberaba furimazina rápidamente con FBS, pero la señal luminiscente no era sostenible durante mucho tiempo. Como se muestra en las FIGS. 3B y 3C, tanto el pro-sustrato tradicional de células vivas PBI-4377 como el compuesto divulgado WZ-0324 exhibieron la señal estable durante 24 horas o más sin añadir PLE esterasa exógena. Tras la adición de una misma cantidad de PLE esterasa, tanto el PBI-4377 como el WZ-0324 mostraron una luminiscencia significativamente mayor que aquellos sin PLE, lo que indica que ambos son sustratos de la PLE y que la señal luminiscente puede potenciarse inmediatamente mediante la adición de esterasa exógena. La señal observada para PBI-4377 tras la adición de PLE (FIG. 3B) fue en general superior a la de WZ-0324 (FIG. 3C). Sin estar limitado por ninguna teoría, se hipotetiza que el PBI-4377 podría ser un mejor sustrato exógeno de PLE o un mejor sustrato de esterasas de células vivas que el compuesto divulgado WZ-0324. Sin embargo, la mayor señal de WZ-0324 en ausencia de PLE esterasa exógena (FIGS.

3B y 3C) sugerían que WZ-0324 podría tener mejor permeabilidad celular que PBI-4377. La turbidez observada en concentraciones superiores a 50 pM para PBI-4377 y 70 pM para WZ-324 sugiere que WZ-0324 podría tener una solubilidad mayor que PBI-4377.

Compuestos WZ-0429, WZ-0439, WZ-0454, WZ-0441, WZ-0451, WZ-0416, WZ-0420, WZ-0461 y WZ-0419 se ensayaron en células HEK 293 transfectadas transitoriamente con construcciones de ADN plasmídico para SmBiT-PRKACA y LgBiT-PRKAR2A expresadas a través del promotor HSV-TK en medio DMEM con 4% de FBS, y se monitorizó el decaimiento de la señal luminiscente a lo largo del tiempo. Como se muestra en las FIGS. 3I y 3K, los compuestos WZ-0451 y WZ-0420 mostraron una señal estable en 15 horas a una concentración superior a 20 uM, y la intensidad de la señal es 10 veces más brillante que la del pro-sustrato tradicional PBI-4377 (FIG. 3I y FIG. 3K). Sin embargo, los compuestos WZ-0416 y WZ-0461 exhibieron una señal estable durante 24 horas y más de una manera menos dependiente de la concentración, pero con una intensidad de señal disminuida, que es comparable o ligeramente mejor que la de PBI-4377 (FIGS. 3J, 3K, y FIGS. 4 y 5). En cambio, los compuestos inestables en suero, WZ-0429. WZ-0439, w Z-0454 y WZ- 0441 (FIGS. 1A-1H) mostraron un rápido decaimiento de la señal, casi independiente de la concentración (FIG. 3A, FIGS. 3E-3H). Estos resultados indican que los compuestos estables en suero, pero no los compuestos inestables en suero son capaces de ajustar la reactividad, ajustar la intensidad de la señal y ajustar las ventanas de ensayo, dependiendo de la concentración y de las necesidades de un ensayo. Las evaluaciones de los compuestos WZ-0429, WZ-0439, WZ-0454, WZ-0441, WZ-0451. WZ-0416, WZ-0420, WZ-0461 y WZ-0419 se realizaron mediante el siguiente protocolo.

Día 1, células en placa. Las células HEK293 se cultivaron en medio completo [DMEM 10% FBS 1X NEAA]. Se sembraron aproximadamente 10.000 células por pocillo (100 j l) en placas de 96 pocillos (Corning 3917).

Día 2, transfección transitoria. Las construcciones de ADN plasmídico para SmBiT-PRKACA y LgBiT-PRKAR2A expresadas a través del promotor HSV-TK se diluyeron a 6,25 ng/jl en Opti-MEM® I y se añadió FuGENE HD en una proporción 3:1 de lípidos:ADN. Tras una incubación de 5-10 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 8 j l de solución lípido:ADN por pocillo, y las células se incubaron en un incubador a 37 °C, 5% CO2 durante toda la noche.

Día 3, ensayo de células vivas. Los compuestos se disolvieron hasta 50 mM finales en DMSO. Los compuestos se diluyeron en DMSO para obtener reservas de 33,3, 16,7 y 6,7 mM. Las soluciones madre de DMSO se diluyeron 667 veces enOpti-MEM® I para obtener soluciones 1X. Se aspiró el medio completo y se sustituyó por la solución 1X respectiva que contenía 75, 50, 25 o 10 uM de los compuestos respectivos (0,15 % v/v DMSO final), como WZ-0429, WZ-0439, WZ-0454, WZ-0441WZ-0451, WZ-0416, WZ-0420 y WZ-0419, pero conteniendo 40, 30, 20 o 10 jM en lugar del compuesto WZ-0461. La luminiscencia se midió en un luminómetro GloMax Multi Plus cada 15 minutos a 37 °C utilizando un tiempo de integración de 1 segundo.

Ejemplo 5: Fragmento complementario de Nanoluc-fusionado con Anexina V uniéndose a la fosfatidilserina para detectar la apoptosis en formato de tiempo real.

Se han diseñado fragmentos pequeños y grandes de luciferasa como proteínas de fusión unidas a anexina V para detectar la apoptosis en tiempo real utilizando un luminómetro de lectura de placas. Los pares individuales de fusión anexina V-fragmento de luciferasa tienen baja afinidad intrínseca entre sí, por lo que no producen luminiscencia o ésta es baja en el medio de cultivo o en presencia de células no apoptóticas; pero, cuando las proteínas de fusión anexina V-fragmento de luciferasa se unen en estrecha proximidad a la fosfatidilserina expuesta en la superficie de las células apoptóticas, los fragmentos de luciferasa reconstituyen una enzima activa y generan una señal luminiscente. Las proteínas de fusión de fragmentos de anexina v-luciferasa y un sustrato de luciferasa se combinan para formar un reactivo que se añade directamente a las células en cultivo para crear un ensayo homogéneo que no requiere pasos de lavado celular, que se utilizan normalmente con los ensayos de unión de anexina V fluorescente. La monitorización de la luminiscencia a lo largo del tiempo muestra que el inicio de la apoptosis precede a la necrosis secundaria, medida a partir de la misma muestra mediante multiplexación con un colorante fluorogénico no permeable de unión al ADN para indicar la integridad de la membrana.

Protocolo general para la unión de fragmentos complementarios de NanoLuc® fusionados con anexina V: Se sembraron células DLD-1 (10.000/pocillo; 100 j l ) en medio 10% FBS y 2X CellTox Green en una placa de 96 pocillos de color blanco sólido. Tras dejar que las células se adhirieran, se añadieron 50 j l de TRAIL humano recombinante a una concentración final de 500 ng/ml en medio 10% FBS enriquecido con 1 mM CaCh. Inmediatamente después, se añadieron 50 j l de Annexin-LgBiT y Annexin-SmBiT concentrados 4X a una concentración final de 30 nM y 60 nM y, a continuación, se añadieron 50 j l de compuestos de ensayo concentrados 4X a una dilución en serie de 2 veces en medio+ 10% FBS enriquecido con 1 mM CaCh. La placa se incubó a 37°C/5% CO<2>en una incubadora de cultivo de tejidos, y se midió cinéticamente la luminiscencia y la fluorescencia (Ex 485/Em 520) en los puntos temporales indicados. FIGS. 4A-4D muestran que TRAIL produjo aumentos dependientes de la dosis en la luminiscencia con el compuesto WZ-0336 (t = 3,5 hr, 7 hr, 24 hr, y 30 hr, respectivamente). Los aumentos de fluorescencia de Cytotox Green precedidos cinéticamente indican la muerte celular. Este perfil indica la apoptosis temprana seguida de necrosis secundaria.

FIGS. 5A-5D muestran la detección de apoptosis y necrosis por Annexin V en tiempo real en 10.000 células DLD-1 con tratamiento dependiente de la dosis de rhTRAIL durante 24 horas. Lecturas RLU de PBI-4377 (FIG. 5A), PBI-4377 CytotoxGreen RFU lecturas (FIG. 5B); WZ-0461 RLU lecturas (FIG. 5C), y WZ-0461 CytotoxGreen RFU lecturas (FIG.

5D)

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de fórmula (II)

en el que, Ar1, Ar2, y Ar3 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en arilo y heteroarilo, en el que Ar1, Ar2, y Ar3 están cada uno opcionalmente sustituidos; Ar4 es arilo, furano o tiofeno, opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alquilo, alcoxi, arilo, cicloalquilo, heteroarilo y heterociclo.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que Ar1 es fenilo, Ar2 es furilo y Ar3 es fenilo.
3. El compuesto de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, Ar4 es fenilo, furano, tiofeno, opcionalmente sustituido por uno o más alcoxi.
4. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el compuesto de fórmula (II) tiene la fórmula (II-a)

en el que Ar1 y Ar2 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en arilo y heteroarilo; Ar4 es fenilo, furano, tiofeno, opcionalmente sustituido por uno o más alcoxi; o, en el que el compuesto de fórmula (II) tiene la fórmula (II-b)

en el que Ar2 se selecciona del grupo formado por arilo y heteroarilo; Ar4 es fenilo, furano, tiofeno, opcionalmente sustituido por uno o más alcoxi; o en el que el compuesto de fórmula (II) tiene la fórmula (II-c):

donde Ar4 es fenilo, furano, tiofeno, opcionalmente sustituido por uno o más alcoxi.
5. El compuesto de la reivindicación 1, seleccionado del grupo que consiste en: ((8-bencil-2-(furano-2-ilm etil)-6-fenilim idazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil furano- 2-carboxilato; ((8-bencil-2-(furano-2-ilm etil)-6-fenilim idazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil furano- 3-carboxilato; y ((8-bencil-2-(furano-2-ilm etil)-6-fen ilim idazo[l,2-a]p irazin-3-il)oxi)m etil benzoato.
6. Un compuesto de fórmula (III)

en la que, Ar1, Ar2, y Ar3 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en arilo y heteroarilo, en el que Ar1, Ar2, y Ar3 están cada uno opcionalmente sustituidos; RC se selecciona del grupo formado por alquilo lineal o ramificado C<1>-C<9>, alcoxialquilo, polietilenglicoxialquilo de éter metílico, haloalquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, polietilenglicoxialquilo de hidroxilo, carboxialquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo y alquilo heterociclo.
7. El compuesto de la reivindicación 6, en la que Ar1 es fenilo, Ar2 es furilo y Ar3 es fenilo y/u opcionalmente en la que RC se selecciona del grupo que consiste en alquilo lineal o ramificado C1-C9, alcoxialquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo y alquilo heterociclo.
8. El compuesto de la reivindicación 6, en la que el compuesto de fórmula (III) tiene la fórmula (III-a)

en la que Ar1 y Ar2 se seleccionan cada uno independientemente del grupo formado por arilo y heteroarilo; RC se selecciona del grupo formado por alquilo lineal o ramificado C<1>-C<9>, alcoxialquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo y alquilo heterociclo; o, en la que el compuesto de fórmula (III) tiene la fórmula (III-b)

en la que Ar2 se selecciona del grupo formado por arilo y heteroarilo; RC se selecciona del grupo formado por alquilo lineal o ramificado C<1>-C<9>, alcoxialquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo y alquilo heterociclo; o en la que el compuesto de fórmula (III) tiene la fórmula (III-c)

en la que RC se selecciona del grupo formado por alquilo lineal o ramificado C<1>-C<9>, alcoxialquilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, hidroxialquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo y alquilo heterociclo.
9. El compuesto de la reivindicación 6, seleccionado del grupo que consiste en: ((8-bencil-2-(furano-2-ilmetil)-6-fenilimidazo[1,2-a]pirazin-3-il)oxi)metil metil.
10. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que presenta una estabilidad sérica de al menos 12 horas en presencia de 10% de suero fetal bovino (FBS).
11. Un kit que comprende un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, opcionalmente en el que el kit comprende además una luciferasa o un fragmento complementario de luciferasa y/o opcionalmente en el que el kit comprende además un tampón reactivo.
12. El kit de la reivindicación 11, que comprende además una enzima de desprotección, opcionalmente en la que la enzima de desprotección comprende una esterasa.
13. Un método para detectar luminiscencia en una muestra, el método comprende: poner en contacto una muestra con un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-9; poner en contacto la muestra con una enzima de desprotección, si no hay ninguna enzima de desprotección presente en la muestra; poner en contacto la muestra con una luciferasa que utiliza coelenterazina, si no hay luciferasa que utiliza coelenterazina presente en la muestra; y detectar la luminiscencia, opcionalmente en la que la enzima de desprotección comprende una esterasa.
14. El método de la reivindicación 13, en la que la muestra comprende células vivas, opcionalmente en la que la muestra comprende una luciferasa que utiliza celenterazina o un fragmento complementario de luciferasa.