ES2983665T3 - Cepa de Lactobacillus salivarus PS11610 y su uso en la prevención y el tratamiento de disbiosis del aparato urogenital - Google Patents

Abstract

Una cepa de Lactobacillus salivarius como producto probiótico y su uso en el tratamiento y/o prevención de la disbiosis del tracto urogenital. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Cepa deLactobacillus salivarusPS11610 y su uso en la prevención y el tratamiento de disbiosis del aparato urogenital

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de cepas probióticas, en particular a una nueva cepa probiótica deLactobacillus salivarius,a composiciones que comprenden dicha cepa probiótica, y su uso para la prevención y/o el tratamiento de disbiosis del aparato urogenital.

Antecedentes de la invención

El aparato urogenital contiene un microbioma activo que comprende principalmente en el aparato femenino bacterias del géneroLactobacillus,que se asocia con un estado de microbioma sano. Sin embargo, las fluctuaciones de este microbioma pueden impactar la fisiología del aparato urogenital e incluso producir estados patológicos. Disbiosis se refiere a este desequilibrio del microbioma o microbiota anómala.

Los organismos patógenos son capaces de infectar la vagina, produciendo vaginosis bacteriana y vaginitis por levadura. Tanto la vaginosis bacteriana como la vaginitis en una inflamación de la vagina que puede producir secreción, picor y dolor.

La vaginosis bacteriana representa el síndrome vaginal más común que afecta a mujeres fértiles, premenopáusicas y embarazadas. La vaginosis bacteriana no está producida por un microorganismo patógeno específico, sino más bien por un desequilibrio de la microbiota vaginal. En la vaginosis bacteriana los lactobacilos se sustituyen porGardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Prevotella, Veillonella,y otros microorganismos anaerobios. La vaginosis bacteriana con frecuencia se ignora ya que los síntomas con frecuencia están ausentes o son insignificantes. La gran mayoría de los casos de vaginosis bacteriana no producen síntomas inflamatorios, de modo que se caracteriza clínicamente por un aumento en las secreciones vaginales que las hacen más acuosas y malolientes, y que está acompañado por síntomas vulvovaginales adicionales limitados. Sin embargo, las consecuencias clínicas pueden ser importantes. En mujeres gestantes, aumenta el riesgo de nacimiento prematuro y en mujeres no gestantes aumenta el riesgo de otras enfermedades infecciosas, tal como herpes, clamidia y endometritis. También puede afectar directamente la fertilidad.

La vaginitis está causada por un sobrecrecimiento de un organismo fúngico en la vagina. La mayoría de los casos están causados porCandida albicans,pero C.glabrata, C. krusei,y C.tropicalispueden ser problemáticas. Habitualmente produce muchos síntomas; secreción vaginal blanquecina con grumos, prurito, quemazón, inflamación vulvar, mucosa vaginal enrojecida, lesiones de la piel en la vulva y el perineo, y algunas veces también molestias al orinar y cuando se tienen relaciones sexuales.

Se ha divulgado que la microbiota del aparato genital masculino tiene un impacto en la calidad del semen y, por consiguiente, está relacionado con la fertilidad [Moretti et al.,J Assist Reprod Genet2009,26, 47-56; Mandar,Pharmacol Res.,2013,69(1),32-41; y Weng et al.,PLoS One,2014, 9(10), e1101522014]

La microbiota del aparato urogenital masculino y femenino tiene un papel relevante en la infertilidad [Moreno y Simon,Reprod Med Biol,2018,18(1),40-50]. Por tanto, tratar la disbiosis del aparato urogenital masculino y/o femenino mejora la función reproductora en parejas que padecen infertilidad idiopática.

Los tratamientos actuales de disbiosis del aparato urogenital, incluyendo vaginosis bacteriana y vaginitis, implican la administración oral o local de antibióticos, tal como metronidazol o clindamicina, o antifúngicos. Sin embargo, hay varios efectos secundarios desagradables y desventajas asociadas con estas terapias, incluyendo resistencia a antibióticos, alta tasa de infecciones recurrentes después del tratamiento, y efectos secundarios derivados de la depuración de la flora inespecífica endógena en otros sitios corporales.

Otra posible estrategia para modular la microbiota del aparato urogenital es el uso de probióticos. Estos son productos bioterapéuticos vivos que contienen una o más cepas de las bacterias deseadas que se administran para colonizar el nicho mientras desplazan bacterias disbióticas potenciales. Los lactobacilos son los organismos comúnmente usados como probióticos. Sin embargo, la eficacia de una terapia probiótica no es cierta y es crítico que las cepas se seleccionen cuidadosamente [Cribby et al.,Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases,2008, Article ID 256490; y Mastromarino et al.,Indian J. Med. Res.,2014, 140 (Supl 1), S91-S97].

Vijay Prabha et al.(Indian J. of Med, Res.,2015, 142(1), 79) describen el efecto del probióticoLactobacillus plantarum2621 sobre la infertilidad e infecciones urogenitales.

El documento WO 2018/013583 A2 se refiere al efecto sinérgico de composiciones que comprenden una mezcla de L.crispatus, L. gasseriy L.jenseniien el tratamiento/prevención de infecciones bacterianas vaginales, sin embargo, este documento menciona que no todas las especies deLactobacillustienen el mismo efecto e impacto sobre el inmunobioma vaginal.

El documento WO 2017/001440 A1 divulga el uso deLactobacillus rhamnosus parael tratamiento de vaginosis bacteriana.

Por tanto, hay una necesidad para nuevos tratamientos de disbiosis del aparato urogenital, en particular, tratamientos probióticos.

Breve descripción de la invención

La invención se define solamente mediante las reivindicaciones adjuntas.

Los inventores han aislado y caracterizado una cepa probiótica deLactobacillus salivarius(PS11610) aislada de la vagina de una mujer sana, que sorprendentemente se ha encontrado que es útil para restablecer la microbiota de aparato urogenital en sujetos con disbiosis bacteriana, en particular en parejas con problemas de fertilidad.

Como se muestra en los ejemplos de la presente invención,Lactobacillus salivariusPS11610 afecta la composición bacteriana de los aparatos urogenitales masculino y femenino mejorando el estado de disbiosis y el estado inmunitario de los sujetos que padecen disbiosis bacteriana. También ha mejorado el éxito de embarazo en parejas con infertilidad idiopática que padecen disbiosis bacteriana. Como también se muestra en los ejemplos de la presente invención,Lactobacillus salivariusPS11610 tiene sorprendentemente alta actividad antimicrobiana contra patógenos relacionados con infecciones del aparato urogenital cuando se compara con otras cepas deLactobacillus salivarius.Por tanto, la cepa deLactobacillus salivariusPS11610 de la presente invención es particularmente adecuada para el tratamiento de disbiosis del aparato urogenital y enfermedades relacionadas.

Por tanto, en un aspecto, la presente invención se dirige a una cepa deLactobacillus salivariusPS11610 o una variante de la misma que tiene al menos el 99% de identidad con la secuencia de ARNr 16S de esta cepa, y en donde la cepa variante retiene o mejora más la actividad de la cepaLactobacillus salivariusPS11610 en una o más de las siguientes propiedades:

- producción de ácido láctico en caldo MRS después de 24 h a 37°C en condiciones anaerobias;

- tolerancia al pH en el intervalo de 3 a 6; y

- tolerancia de sales biliares.

Preferiblemente la cepa tiene al menos el 99,5% de identidad con la cepa deLactobacillus salivariusPS11610. En otro aspecto, la invención también se refiere a una composición que comprende la cepa como se ha definido anteriormente, en particular a una composición farmacéutica o alimenticia.

En un aspecto adicional, la invención también se refiere a la cepa, composición o composición alimenticia como se ha definido anteriormente para uso como un probiótico o para uso como un agente terapéutico.

En otro aspecto, la invención se dirige a la cepa, composición o composición alimenticia como se ha definido anteriormente, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de disbiosis urogenital.

En otro aspecto, la invención se dirige a la cepa, composición o composición alimenticia como se ha definido anteriormente, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de vaginosis bacteriana y vaginitis.

En otro aspecto, la invención se dirige a la cepa, composición o composición alimenticia como se ha definido anteriormente, para su uso en el tratamiento de infertilidad en sujetos que padecen disbiosis bacteriana urogenital. En un aspecto adicional, la invención se dirige a la cepa, composición o composición alimenticia como se ha definido anteriormente, para su uso en reducir bacterias patógenas en el aparato urogenital.

Figuras

La figura 1 muestra la curva de crecimiento deL. salivariusPS11610.

La figura 2 muestra la supervivencia deL. salivariusPS11610 en MRS acidificado a pH 6, 4, 3,5 y 3 después de 2 h de incubación a 37°C en aerobiosis. Barras con rayas (tiempo 0 h) y barras sin rayas (tiempo 2 h).

La figura 3 muestra la supervivencia deL. salivariusPS11610 en MRS con el 0,2, 0,4 y 0,5% de bilis después de 24 h de incubación a 37°C en aerobiosis. Barras con rayas (tiempo 0 h) y barras sin rayas (tiempo 24 h).

La figura 4 muestra la evolución en cuentas bacterianas en muestras vaginales debido a la ingesta deL. salivariusPS11610.

Descripción detallada de la invención

Cepa PS11610 deLactobacillus salivarius

La cepa deLactobacillus salivariussegún la invención se denominaLactobacillus salivariusPS11610 oL. salivariusPS1l6l0. La cepaL. salivariusPS11610 ha sido depositada por Probisearch SLU, Calle Santiago Grisolía 2, Tres Cantos, España según el tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines de Procedimiento de Patentes en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) el 13 de diciembre 2017 y se le ha dado el número de registro CECT 9526.

El término “cepa” es bien conocido en el campo y significa una variante genética o subtipo de un microorganismo. Una “variante” o “mutante” de una cepa se refiere a cualquier cepa natural o específicamente desarrollada obtenida a partir de la cepa de referenciaL. salivariusPS11610, principalmente por mutación, que mantiene o aumenta las propiedades de la cepa de referencia. Las cepas variantes se pueden obtener usando la cepa depositada como material de partida. Por tanto, en el caso presente, la invención se refiere a variantes de la cepa de referencia en las que la actividad antimicrobiana contra una o más deCandida albicans, Actinomyces neuii, Aerococcus urinae, Actinomyces urogenitalis, Gardnerella vaginalis, Klebsiella oxytoca, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Cronobacter sakazakii, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidisyListeria innocua;y en la que una o más de las siguiente propiedades asociadas a la cepaL. salivariusPS11610 se conservan o aumentan:

- producción de ácido láctico en caldo MRS después de 24 h a 37°C en condiciones anaerobias;

- tolerancia al pH en el intervalo de 3 a 6; y

- tolerancia a sales biliares.

Como se usa en el presente documento, la referencia a que la cepa variante mantiene o conserva las propiedades de la cepa de referenciaL. salivariusPS11610 significa que, mientras no muestra una actividad del 100% de la propiedad de la cepa de referenciaL. salivariusPS11610 de la que deriva, la propiedad sustancialmente se conserva de modo que la variante muestra al menos el 99%, al menos el 98%, al menos el 97%, al menos el 96%, al menos el 95%, al menos el 94%, al menos el 93%, al menos el 92%, al menos el 91%, al menos el 90%, al menos el 80%, al menos el 70%, al menos el 60%, al menos el 50% de la propiedades de la cepaL. salivariusPS11610 de la que deriva.

El experto en la materia decidirá sobre el método adecuado que se va a emplear para determinar cada una de las propiedades mencionadas anteriormente para las cepas, en particular usando los métodos descritos en los ejemplos de la presente solicitud.

La presente invención también se refiere a cepas deL. salivariusque tienen al menos el 99% de identidad con la secuencia de ARNr 16S de la cepaL. salivariusPS11610, que se describe en los ejemplos [referencia Stackebrandt & Goebel, 1994: "Taxonomic Note: A Place for DNA-DNA Reassociation and 16s rRNA Sequence Analysis in the Present Species Definition in Bacteriology" Int. J. Syst. Bacteriol. 44:846-849].

En una forma de realización preferida, la cepa según la presente invención tiene al menos el 99,5% de identidad con la secuencia de ARNr 16S de la cepaL. salivariusPS11610, más preferiblemente al menos el 99,9% de identidad. En otra forma de realización preferida, la cepa según la presente invención tiene el 100% de identidad con la secuencia de ARNr 16S de la cepaL. salivariusPS11610, es decir, la cepa según la presente invención es la cepaLactobacillus salivariusPS11610.

La identidad de la cepa variante con respecto a la cepaL. salivariusPS11610 se puede determinar como “identidad de nucleótidos media” o “ANI”, que se refiere a una medida de la similitud genómica a nivel de nucleótido entre las regiones codificantes de dos genomas. El término ANI incluye:

- Identidad de nucleótidos media basada en BLAST+ (ANIb), descrita por Richter M, Rosselló-Móra R, Glockner FO, y Peplies J (2015) JSpeciesWS: a web server for prokaryotic species circumscription based on pairwise genome comparison. Bioinformatics. 16 Nov2015. pii: btv681.

- Identidad de nucleótidos media basada en MUMmer (ANIm), también descrita por Richter M, Rosselló-Móra R, Glockner FO, y Peplies J (2015) JSpeciesWS: a web server for prokaryotic species circumscription based on pairwise genome comparison. Bioinformatics. 16 Nov2015. pii: btv681.

- Orto ANI usando BLAST (ortoANIb) y ortoANI usando USEARCH (ortoANIu) descrita por Yoon, S. H., Ha, S. M., Lim, J. M., Kwon, S.J. & Chun, J. (2017). A large-scale evaluation of algorithms to calculate average nucleotide identity. Antonie van Leeuwenhoek. 110:1281-1286.

La cepa de la presente invención puede estar viva o inactivada.

Los microorganismos vivos producen una colección completa de antígenos, se reproducen para aumentar el número de tales organismos en el medio urogenital para estimular mejor una respuesta inmunitaria. Por tanto, en una forma de realización preferida, la cepa de la invención está viva.

Como se usa en el presente documento, el término “inactivada” se refiere a una célula muerta o inactivada de un microorganismo que ya no es capaz de formar una colonia individual en una placa que tiene un medio específico para dicho microorganismo, y también abarca lisados, fracciones o extractos del microorganismo. La inactivación de una célula se refiere a un proceso de transformar una célula de viable a no viable. Los términos “viable”, “viva” o “viabilidad”, como se usan en el presente documento, se refieren a la capacidad de una célula para mantenerse o recuperar sus potencialidades y sobrevivir hasta que son capaces de dividirse. Por tanto, una célula que es viable o viva indica que la célula es capaz de sobrevivir y dividirse; al contrario, una célula que es no viable indica que la célula no es capaz de sobrevivir y dividirse. Se apreciará que las células no viables incluyen células muertas. Por tanto, en otra forma de realización, la cepa de la invención está inactivada.

La viabilidad se puede determinar por un número de ensayos que son convencionales en la técnica. Estos incluyen citólisis o ensayos de fuga de membrana, tal como el ensayo de lactato deshidrogenasa, el ensayo de yoduro de propidio, el ensayo de azul de tripán y el ensayo de 7-aminoactinomicina D, así como ensayos genómicos y proteómicos que prueban la activación de rutas de estrés usando micromatrices de ADN y chips de proteínas. La viabilidad también se puede determinar comprobando la ausencia de células después de su cultivo en un medio de cultivo apropiado.

Composiciones

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende la cepaL. salivariusPS11610 de la invención, o variante de la misma.

Preferiblemente, las composiciones de la invención comprenden la cepaL. salivariusPS11610 de la invención o variante de la misma y un soporte o excipiente fisiológicamente aceptable y/o ingredientes adicionales como se describe posteriormente. Preferiblemente, la cepa deL. salivariussegún la invención está presente en forma liofilizada.

El término “composición”, como se usa en la presente invención se refiere a cualquier composición de materia que comprende la cepa de la invención, es decir, la cepaL. salivariusPS11610 o variante de la misma.

En una forma de realización preferida, la composición de la invención comprende la cepaL. salivariusPS11610 o variante de la misma y excipientes farmacéuticamente aceptables. Estas composiciones también se pueden nombrar como “composición farmacéutica” o “producto farmacéutico”.

Como se usa en la presente invención, las expresiones “composición farmacéutica” o “producto farmacéutico” se usan en el presente documento de forma intercambiable y se refieren a una formulación que se ha adaptado para administrar una dosis predeterminada de uno o varios agentes terapéuticamente útiles a un sujeto, preferiblemente un ser humano. La composición farmacéutica de la invención contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de la cepaLactobacillus salivariusPS11610 de la invención o una variante de la misma, que se entiende en el presente documento como una cantidad capaz de proporcionar un efecto terapéutico, y que puede determinar el experto en la materia por medios comúnmente usados.

El “excipiente farmacéuticamente aceptable” se refiere a un diluyente o soporte con el que el principio activo, es decir, las cepas de la invención, se administra. Los excipientes aceptables para uso terapéutico se conocen bien en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams and Wilkins (22a Ed., 2012). La elección del excipiente farmacéutico se puede seleccionar con respecto a la ruta pretendida de administración y la práctica farmacéutica estándar. Por ejemplo, tales excipientes farmacéuticos incluyen, pero no están limitados a, maltodextrina, agua, glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, almidón, celulosa o derivados de celulosa, por ejemplo, metilcelulosa, estearato de magnesio, ácido esteárico, sacarina sódica, talco, carbonato de magnesio y similares; preferiblemente maltodextrina. Agua o soluciones acuosas de solución salina y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol se usan preferiblemente como excipientes. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender como -o además de- los excipientes mencionados anteriormente cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento, agente solubilizante adecuado. Conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso agentes saborizantes se pueden proporcionar en las composiciones farmacéuticas. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido phidroxibenzoico. También se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión. Puede haber diferentes requisitos de composición/formulación dependiendo de los sistemas de administración diferentes.

Las composiciones de la invención, en particular composiciones farmacéuticas, están preferiblemente en forma de una formulación oral, tal como cápsulas, bolsitas, comprimidos, gránulos, polvos, pellas, jarabes, y suspensiones, preferiblemente cápsulas o bolsitas, más preferiblemente cápsulas.

En una forma de realización preferida, la composición de la invención comprende maltodextrina como el excipiente farmacéuticamente aceptable.

En otra forma de realización preferida, la composición de la invención comprende maltodextrina como el único excipiente. Por tanto, preferiblemente, la composición de la invención consiste en la cepa de la invención y maltodextrina.

En una forma de realización particular, la composición de la invención es una forma sólida que tiene un peso en el intervalo de desde 200 mg a 400 mg, preferiblemente de 250 mg a 350, más preferiblemente de 290 mg a 310 mg, incluso más preferiblemente aproximadamente 300 mg. Preferiblemente, dicha composición está en forma de una cápsula o bolsita, incluso más preferiblemente una cápsula. También preferiblemente, dicha composición comprende la cepa de la invención y maltodextrina como el excipiente farmacéuticamente aceptable.

En una forma de realización particular la cepa de la invención está presente en un alimento. Estas composiciones también se nombran como términos “producto alimenticio” o “composición alimenticia”. Estas composiciones se refieren a un alimento que afecta beneficiosamente una o más funciones del cuerpo, de modo que proporcione mejor salud y bienestar. Según esto, tal producto alimenticio se puede pretender para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad o un factor causante de enfermedad. Por tanto, estas composiciones también se pueden nombrar como alimento funcional para fines nutricionales particulares.

Los ejemplos no limitantes de productos alimenticios adecuados que se pueden usar en la presente invención son productos lácteos, pan, tartas, formulaciones de dieta semi- o sintéticas, leches infantiles, fórmulas de nutrición clínica, harinas.

La cantidad eficaz de unidades formadoras de colonias (UFC) para cada cepa en la composición de la invención la determinará el experto en la materia y dependerá de la formulación final y las veces al día que se administrará. Preferiblemente, la cepa de la invención está presente en las composiciones de la invención en una cantidad desde aproximadamente 106 UFC hasta aproximadamente 1012 UFC, preferiblemente en una cantidad desde aproximadamente 107 UFC hasta aproximadamente 1011 UFC, más preferiblemente en una cantidad desde aproximadamente 108 UFC hasta aproximadamente 1010 UFC, incluso más preferiblemente aproximadamente 109 UFC.

En el contexto de la presente invención, el término “aproximadamente” se refiere al valor que define ± 10% de dicho valor, preferiblemente ± 5% de dicho valor, más preferiblemente ± 1% de dicho valor.

El término UFC se refiere a “unidades formadoras de colonias”. La cuantificación de las bacterias en una muestra determinada se logra rutinariamente contando el número total de unidades formadoras de colonias (UFC) crecidas en una placa de agar a partir de diluciones en serie, expresado como UFC por gramo o ml de la muestra original. Esto da una estimación del número de células presentes basado en una interpretación cualificada del número de colonias en una placa.

Una composición particularmente preferida de la invención comprende la cepaLactobacillus salivariusPS11610 de la invención y maltodextrina. Preferiblemente, la composición comprende la cepaLactobacillus salivariusPS11610 de la invención y maltodextrina, en donde la cantidad de la cepaLactobacillus salivariusPS11610 de la invención es desde aproximadamente 106 UFC hasta aproximadamente 1012 UFC, preferiblemente en una cantidad desde aproximadamente 107 UFC hasta aproximadamente 1011 UFC, más preferiblemente en una cantidad desde aproximadamente 108 UFC hasta aproximadamente 1010 UFC, incluso más preferiblemente aproximadamente 109 UFC.

La composición según la invención puede comprender probióticos adicionales, aparte de la cepaL. salivariusPS11610 de la invención o una variante de la misma como se ha descrito anteriormente. Los probióticos tienen efectos beneficiosos en el sistema inmunitario, por tanto, la combinación con probióticos tendrá un efecto superior en el sistema inmunitario. Los ejemplos de probióticos adicionales sonLactobacillusyBifidobacterium.

La composición de la presente invención puede además contener prebióticos. Los prebióticos pueden apoyar el crecimiento de probióticos antes de que se vuelvan no replicantes. “Prebiótico” significa sustancias alimenticias no digeribles que fomentan el crecimiento de microorganismos beneficiosos para la salud y/o probióticos en los intestinos. No se degradan en el estómago y/o el intestino superior o absorben en el aparato GI de la persona que los ingiere, pero son fermentados por la microbiota gastrointestinal y/o por probióticos. Preferiblemente, se pueden seleccionar del grupo que consiste en oligosacáridos, que opcionalmente contienen fructosa, galactosa, manosa; fibras alimentarias, en particular fibras solubles, fibras de soja; inulina; o mezclas de las mismas. Los prebióticos preferidos son fructooligosacáridos, galactooligosacáridos, isomaltooligosacáridos, xilooligosacáridos, arabinoxilooligosacáridos, mananoligosacáridos, oligosacáridos de soja, glucosilsacarosa, lactosacarosa, lactulosa, palatinosa-oligosacáridos, maltooligosacáridos, gomas y/o hidrolizados de las mismas, pectinas y/o hidrolizados de las mismas.

Usos de la cepa y composición de la invención

Como se evidencia mediante los ejemplos posteriormente, las cepas y composiciones de la invención son seguras y tienen un efecto beneficioso importante. En un estudio humanoin vivo,la cepa de la invención ha mejorado el estado de disbiosis y el estado inmunitario del aparato urogenital tanto en mujeres como hombres. En particular, la cepa de la invención ha mejorado el éxito de embarazo en parejas con infertilidad idiopática que padecen disbiosis bacteriana.

Por tanto, en un aspecto, la presente invención se dirige a una cepa deLactobacillus salivariusPS11610 o una variante de la misma que tiene al menos el 99% de identidad con esta cepa, y en donde las cepas variantes retienen o mejoran más la actividad de la cepaLactobacillus salivariusPS11610. Preferiblemente, la cepa tiene al menos el 99,5% de identidad con la cepa deLactobacillus salivariusPS11610.

Por tanto, en un aspecto adicional, la invención también se refiere a la cepa, la composición o el producto alimenticio como se ha definido anteriormente para uso como un probiótico o para uso como un agente terapéutico.

Este aspecto también se puede formular como el uso de la cepa, la composición o el producto alimenticio como se ha definido anteriormente en la fabricación de un probiótico o de un medicamento.

En la presente invención, el término “probiótico” significa un microorganismo que ejerce efectos beneficiosos sobre la salud del huésped. Puede ser un suplemento de alimentación microbiano vivo o un medicamento que afecta beneficiosamente al huésped al mejorar su equilibrio microbiano, una preparación microbiana que contiene bacterias vivas o muertas, o una combinación de ambos. Los huéspedes adecuados en el contexto de la invención incluyen seres humanos.

Como se usan en el presente documento los términos “tratar”, “tratamiento” o “tratamiento de” se refieren a reducir el potencial para una cierta enfermedad o trastorno, reduciendo la aparición de una cierta enfermedad o trastorno, y/o una reducción en la gravedad de una cierta enfermedad o trastorno, preferiblemente, a un grado que el sujeto ya no padece malestar y/o función alterada debido a ello. También se refiere mitigar o disminuir al menos un síntoma clínico y/o la inhibición o retraso en la evolución de la afección y/o la prevención o retraso del inicio de una enfermedad o dolencia.

El término “prevención”, “que previene” o “prevenir”, como se usan en el presente documento, se refiere a evitar la aparición de una cierta enfermedad o trastorno. La prevención puede ser completa (por ejemplo, la ausencia total de una enfermedad). La prevención también puede ser parcial, de modo que, por ejemplo, la aparición de una enfermedad en un sujeto es menor que la que habría ocurrido sin la administración de la combinación o composición de la presente invención. Prevención también se refiere a una susceptibilidad reducida a una afección clínica. La prevención también incluye reducir el riesgo de padecer la enfermedad.

En otro aspecto, la invención se dirige a la cepa, la composición o el producto alimenticio como se ha definido anteriormente, para uso en la prevención y/o el tratamiento de disbiosis urogenital.

Este aspecto también se puede formular como el uso de la cepa, la composición o el producto alimenticio como se ha definido anteriormente, para uso en la fabricación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de disbiosis urogenital.

Este aspecto también se puede formular como un método de prevención y/o tratamiento de disbiosis urogenital que comprende administrar la cepa, la composición o el producto alimenticio como se ha definido anteriormente a un sujeto en necesidad de ello.

En particular, la disbiosis urogenital se refiere a disbiosis en la vagina, útero, glande y/o semen, preferiblemente disbiosis vaginal.

Los criterios para determinar el estado de disbiosis urogenital bacteriana son:

- concentración bacteriana < 50 UFC en exudados vaginales;

- concentración de lactobacilos en ovulación < 102 UFC en mucosa vaginal;

- concentración de corinebacterias, enterococos y/oStaphylococcus aureus> 105 UFC en muestras masculinas (en particular glande y/o semen); y/o

- presencia deActinomyces neuii, Gardnerella vaginalisy/oEnterobactericeaeen cualquier tipo de muestra urogenital.

Un sujeto que cumple al menos uno de los cuatro criterios anteriores se considera que tiene disbiosis.

En particular, la disbiosis vaginal está relacionada con vaginosis bacteriana y vaginitis. Por tanto, la cepa o composición de la invención es para uso en la prevención y/o el tratamiento de vaginosis bacteriana y/o vaginitis.

Este aspecto también se puede formular como el uso de la cepa, la composición o el producto alimenticio como se ha definido anteriormente, para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de vaginosis bacteriana y/o vaginitis.

Este aspecto también se puede formular como un método de prevención y/o tratamiento de vaginosis bacteriana y/o vaginitis que comprende administrar la cepa, la composición o el producto alimenticio como se ha definido anteriormente a un sujeto en necesidad de ello.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a la cepa, la composición o el producto alimenticio como se ha definido anteriormente para uso en la prevención de aborto espontáneo en el primer trimestre del embarazo en fertilizaciónin vitro.

Este aspecto también se puede formular como el uso de la cepa, la composición o el producto alimenticio como se ha definido anteriormente en la fabricación de un medicamento para la prevención de aborto espontaneo en el primer trimestre del embarazo en fertilizaciónin vitro.

Este aspecto también se puede formular como para la prevención de aborto espontaneo en el primer trimestre del embarazo en fertilizaciónin vitro,que comprende administrar la cepa, la composición o el producto alimenticio como se ha definido anteriormente a un sujeto en necesidad de ello.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a la cepa, la composición o el producto alimenticio como se ha definido anteriormente para uso en el tratamiento de infertilidad en un sujeto que padece disbiosis bacteriana urogenital.

Este aspecto también se puede formular como el uso de la cepa, la composición o el producto alimenticio como se ha definido anteriormente en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infertilidad en un sujeto que padece disbiosis bacteriana urogenital.

Este aspecto también se puede formular como un método de tratamiento de infertilidad que comprende administrar la cepa, la composición o el producto alimenticio como se ha definido anteriormente a un sujeto en necesidad de ello y que padece disbiosis bacteriana urogenital.

El término “ infertilidad” se define por la Organización Mundial de la Salud como una enfermedad del sistema reproductor definida por el fracaso para lograr un embarazo clínico después de 12 meses o más de relaciones sexuales sin protección regulares. La infertilidad puede referirse al hombre, la mujer o ambos miembros de una pareja. En particular, la infertilidad se refiere a infertilidad idiopática, es decir, infertilidad inexplicada en el sentido de que la causa de que una pareja no pueda concebir permanece desconocida.

El sujeto se refiere a una mujer, un hombre o ambos de una pareja, preferiblemente una mujer.

En un aspecto adicional, la invención se dirige a la cepa, la composición o el producto alimenticio como se ha definido anteriormente para uso en reducir las bacterias patógenas en el aparato urogenital.

Este aspecto también se puede formular como el uso de la cepa, la composición o el producto alimenticio como se ha definido anteriormente en la fabricación de un medicamento para reducir las bacterias patógenas en el aparato urogenital.

Este aspecto también se puede formular como un método de reducir las bacterias patógenas en el aparato urogenital que comprende administrar la cepa, la composición o el producto alimenticio como se ha definido anteriormente a un sujeto en necesidad de ello.

En particular, las bacterias patógenas pueden estar presentes en la vagina, el glande y/o el semen, preferiblemente la vagina.

La expresión “bacterias patógenas” se refiere a cualquier bacteria que pueda producir una enfermedad. Los ejemplos de bacterias patógenas sonCorynebacterium, Enterococcus, S. aureus, Actinomyces neuii, Gardnerella vaginalisoEnterobactericeae.

El término “reducir las bacterias patógenas” significa que las cuentas bacterianas patógenas son menores que antes de administrar la cepa, la composición o el producto alimenticio de la invención. Preferiblemente, las cuentas bacterianas patógenas se reducen en al menos el 50%, preferiblemente al menos el 55%, preferiblemente al menos el 60%, preferiblemente al menos el 65%, preferiblemente al menos el 70%, preferiblemente al menos el 75%, preferiblemente al menos el 80%, preferiblemente al menos el 85%, preferiblemente al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, con respecto a las cuentas bacterianas patógenas antes de administrar la cepa, la composición o el producto alimenticio de la invención. Se puede usar cualquier método adecuado conocido en la técnica para determinar las cuentas bacterianas.

La cepa, la composición y el producto alimenticio para uso en la presente invención descritas anteriormente preferiblemente se administran por vía entérica, más preferiblemente por vía oral. La cepa y la composición para uso según la invención se pueden administrar en una única dosis diaria o múltiples dosis al día, tal como al menos 2 dosis al día, al menos 3 dosis al día, al menos 4 dosis al día. Preferiblemente, la cepa y la composición según la invención se administran 1 o 2 dosis al día. El experto en la materia será capaz de ajustar la dosis terapéuticamente eficaz y/o la dosis profilácticamente eficaz de forma adecuada. La dosis precisa depende de un número de factores tales como la salud y peso del mamífero. Preferiblemente la cepa y la composición de la invención se administran en una cantidad que proporciona la dosis de la cepa desde aproximadamente 106 UFC/día hasta aproximadamente 1012 UFC/día, preferiblemente en una cantidad desde aproximadamente 107 UFC/día hasta aproximadamente 1011 UFC/día, más preferiblemente en una cantidad desde aproximadamente 108 UFC/día hasta aproximadamente 1010 UFC/día, incluso más preferiblemente aproximadamente 109 UFC/día o aproximadamente 2109 UFC/día al sujeto que recibe dicha cepa, composición de producto alimenticio. Preferiblemente, cuando el sujeto es una mujer, se le administra una de las dosis anteriores dos veces al día. Preferiblemente, cuando el sujeto es un hombre, se le administra una de las dosis previamente mencionadas una vez al día o dos veces al día. En una forma de realización particular, cuando el sujeto es un hombre, se le administra una de las dosis previamente mencionadas una vez al día. En otra forma de realización particular, cuando el sujeto es un hombre, se le administra una de las dosis previamente mencionadas dos veces al día.

Preferiblemente, la cepa, composición y producto alimenticio de la invención se administra durante de aproximadamente 12 semanas hasta aproximadamente 1 año, más preferiblemente durante de aproximadamente 12 semanas hasta aproximadamente 9 meses, aún más preferiblemente durante de aproximadamente 12 semanas hasta aproximadamente 7 meses, incluso más preferiblemente durante aproximadamente 6 meses.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación y caracterización de la cepa PS11610

1.1. Aislamiento deLactobacillus salivariusPS11610 e identificación (especie y cepa)

Lactobacillus salivariusPS11610 se aisló de la vagina de una mujer sana. Se recogió asépticamente un frotis vaginal en un tubo estéril y se mantuvo a 4°C hasta la entrega al laboratorio. El material biológico contenido en el frotis vaginal se resuspendió en 1 ml de agua de peptona. Se sembraron diluciones de la muestra con agua de peptona en triplicado en placas de agar de Man, Rogosa y Sharpe (MRS, Oxoid, Basingstoke, UK) suplementado con L-cisteína (0,5 g l-1) (MRS-C), que se incubaron de forma anaerobia (85% de nitrógeno, 10% de hidrógeno, 5% de dióxido de carbono) en una estación anaerobia (MINI-MACS, DW Scientific, Shipley, UK) a 37°C durante 48 h.

La cepa se identificó a nivel de especie comoLactobacillus salivariuspor amplificación de PCR de una sección de una región variable del gen de ARNr 16S usando los cebadores pb116 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', SEQ ID NO: 1) y mb116 (5'-GGCTGCTGGCACGTAGTTAG-3', SEQ ID NO: 2) [Kullen et al., Journal of Applied Microbiology, 2000,89,511-518]. Las condiciones de PCR fueron como sigue: 96 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s y 72 °C durante 45 s (35 ciclos) y una extensión final a 72 °C durante 4 min. Los fragmentos amplificados se purificaron usando NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel Gmb; Düren, Alemania) y se secuenciaron usando los cebadores citados anteriormente en un secuenciador automatizado ABI 377A (Applied Biosystems, Foster City, EE UU). Las secuencias se compararon con las depositadas en la base de datos del EMBL usando el algoritmo BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

La secuencia fragmento del gen de ARNr 16S de L.salivariusPS11610 tiene SEQ ID NO: 3, que se reproduce a continuación:

AACGTCATCGATGAACAGTTACTCTCACTCGTGTTCTTCTCTAACAACAGAG

TTTTACGATCCGAAGACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTT

GCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCG

TGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAACCTCTCAGTTCGGCTACGTATCATC

ACCTTGGTAGGCCGTTACCCCACCAACTAGTTAATACGCCGCGGGTCCATCT

AAAAGCGATAGCAGAACCATCTTTCATCTAAGGATCATGCGATCCTTATAG

ATATACGGGATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTTCTTTTAGGCAGG

TTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCAACTTCTTACGGTGAATGCA

AGCATTCGGTGTAAGAAAGTTTCGTTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGC

CAGCGTTCGTCCTGAGCCAGGAGCAAACTCTCA

La identificación se confirmó por espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF) usando un instrumento Vitek-MS™ (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia) en Probisearch (Tres Cantos, España). Brevemente, una porción de una colonia bacteriana (~ 1 pl) se dejó caer directamente en una placa de muestra de MALDI. Después, se cubrió con 1 pl de una solución saturada de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico en acetonitrilo (28%) y se dejó secar a temperatura ambiente. Se construyó un espectro medio con al menos 50 perfiles de espectros m/z y se usó para la identificación por comparación con los espectros contenidos en la base de datos Myla (Biomerieux). La identificación se definió como una correspondencia del 99-100% a los valores m/z específicos de especie en la base de datos.

Esta cepa se ha genotipado por análisis de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE).

El genoma completo de la cepa L.salivariusPS11610 se ha secuenciado y analizado.

1.2. Fermentación de hidratos de carbono y patrones enzimáticos

El perfil de fermentación de hidratos de carbono se determinó usando el sistema API 50 CH (BioMérieux, Lyon, Francia) según las instrucciones del fabricante. El ensayo se llevó a cabo a partir de un cultivo puro en caldo MRS con una DO 550nm 0,5. Con el fin de obtener células, el cultivo se centrifugó a 3980 x g durante 10 min, a 4°C y se resuspendió en API 50 CHL. El perfil de actividad enzimática se ensayó usando las galerías API Zym (BioMérieux) según las instrucciones del fabricante. Las células obtenidas del cultivo de DO 550nm 1,2, se resuspendieron en NaCl al 0,85% (p/v).

L.salivariusPS11610 produjo ácido a partir de los siguientes sustratos: D-Galactosa, D-Glucosa, D-Fructosa, D-Manosa, D-Manitol, D-Sorbitol, N-Acetilglucosaminosa, Amigdalina, D-Maltosa, D-Lactosa, D-Melibiosa, D-Sacarosa, D-Trehalosa, D-Rafinosa. Además, esta cepa mostró las siguientes actividades enzimáticas: fosfatasa alcalina, esterasa (C4), esterasa lipasa (C8), lipasa (C14), leucina arilamidasa, valina arilamidasa, cistina arilamidasa, fosfatasa ácida, naftol-AS-BI-fosfohidrolasa y a-galactosidasa (Tabla 1).

Tabla 1. Características fenotípicas deL. salivariusPS11610

Prueba Reacción o Prueba Reacción o característica característicaMorfología Varilla D-Rafinosa Reacción gram Almidón -Catalasa - Glucógeno -Oxidasa - Xilitol -Fermentación dep-Gentibiosa -Glicerol - D-Turanosa -Eritritol - D-Lixosa -D-Arabinosa - D-Tagatosa -L-Arabinosa - D-Fucosa -Ribosa - L-Fucosa -D-Xilosa - D-Arabitol -L-Xilosa - Gluconato -Adonitol - 2-Cetogluconato -B-Metilxilósido - 5-Cetogluconato -Galactosa Inulina -D-GlucosaActividades enzimáticas:

D-Fructosa Fosfatasa alcalina

D-Manosa Esterasa (C4)

L-Sorbosa - Esterasa-lipasa (C8) Ramnosa - Lipasa (C14)

Dulcitol - Leucina arilamidasa

Inositol - Valina arilamidasa

Manitol Cistina arilamidasa

Sorbitol Tripsina -a-Metil-d-manósido - a-quimotripsina -a-Metil-d-glucósido - Fosfatasa ácida

N-Acetilglucosamina Naftol-AS-BI-fosfohidrolasa Amigdalina a-Galactosidasa Arbutina - p-Galactosidasa -Esculina - p-Glucuronidasa -Salicina - a-Glucosidasa -Maltosa p-Glucosidasa -Lactosa N-acetil-p-glucosaminidasa -Melibiosa a-Manosidasa -Sacarosa a-Fucosidasa

Trehalosa

Melecitosa

1.3. Antibiograma

Se determinaron las concentraciones inhibidoras mínimas (CIM) para los antibióticos ampicilina, clindamicina, cloranfenicol, eritromicina, estreptomicina, gentamicina, kanamicina, tetraciclina y vancomicina por un método de microdilución. L.salivariusPS11610 se cultivó en medio de prueba de susceptibilidad de bacterias del ácido láctico (LSM) [Klare et al.,Applied and Environmental Microbiology,2005, 71, 8982-8986] y diluida para obtener una densidad correspondiente al estándar de McFarland 1 (equivalente espectrofotométrico ~ 108 UFC ml-1). La suspensión se ajustó adicionalmente a 105 UFC ml-1 con LSM, y se inocularon 100 pl a pocillos de placas VetMIC de microtitulación para bacterias del ácido láctico (Instituto Veterinario Nacional de Suecia, Upsala, Suecia). Se definió CIM como la menor concentración a la que no se observó crecimiento después de incubar la placa a 37°C en condiciones aerobias durante 48 h. Los valores de CIM de L.salivariusPS11610 se compararon con los parámetros límite microbiológicos establecidos por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA, 2017) paraLactobacillushomofermentativo.

Según estos valores, esta cepa de lactobacilo era sensible a todos los antibióticos ensayados en este estudio con la excepción de kanamicina (un hecho que se esperaba ya que todas las cepas de la especie L.salivariusson intrínsicamente resistentes a estos dos antibióticos) (Tabla 2).

Tabla 2. Concentraciones inhibidoras mínimas (CIM) y valores límite (pg ml-1) de antibióticos contra L.salivariusPS11610

Antibióticos Valores límite* CIM (L. salivarius PS11610)Ampicilina 4 0,5 Clindamicina 4 0,5 Cloranfenicol 4 2

Eritromicina 1 0,12 Estreptomicina 64 32 Gentamicina 16 4

Kanamicina 64 128 Tetraciclina 8 2 Vancomicina n.r. >128

* EFSA (2017)

n.r.: no requerido.

1.4. Evaluación de la velocidad de crecimiento de L. salivarius PS11610

Para evaluar la capacidad de L.salivariusPS11610 de crecer en condiciones aerobias, la cepa bacteriana se cultivó en 120 ml de caldo MRS (0,1%) a 37°C durante 24 h. Cada 2 h, durante las siguientes 24 h, se registraron DO600, pH y cuentas bacterianas, en duplicado. Las cuentas bacterianas viables se determinaron sembrando diluciones adecuadas en placas de agar MRS e incubando como se menciona anteriormente.

Como se muestra en la figura 1, L.salivariusPS11610 es capaz de alcanzar la fase estacionaria después de incubación a 37°C en aerobiosis en 6 horas. También L.salivariusPS11610 mostró las máximas cuentas viables (9,38 log10 UFC ml-1) después de 8 h. Además, es capaz de acidificar rápidamente el medio, en el que crece, alcanzando valores de pH de 4,3 después de 8 horas de crecimiento.

1.5. Tolerancia ácida

La tolerancia ácida de L.salivariusPS11610 se determinó en caldo MRS ajustado a pH 6, 4, 3,5 o 3 (usando HCl, 5 N). El MRS inicial tenía un pH inicial de 6,6 y se usó como control. Después de la inoculación con un cultivo totalmente crecido (1%, v/v), las mezclas se incubaron a 37°C durante 2 h y las células viables se determinaron por conteo de placas.

L.salivariusPS11610 mostró excelente tolerancia a las condiciones de acidez ensayadas (Figura 2). Las cuentas viables aumentaron en aproximadamente 0,5 unidades logarítmicas en MRS pH 4 y pH 3,5 después de 2 h de incubación. Además, mantuvo una alta cuenta viable (7,28 log UFC ml-1) en la condición más extrema ensayada (pH 3).

1.6. Tolerancia a la bilis

La supervivencia en presencia de sales biliares de L.salivariusPS11610 se determinó en caldo MRS (24 h, aerobiosis) suplementado con sales biliares porcinas (Sigma) al 0,2, 0,4 y 0,5% (p/v). Las células viables se determinaron después de incubación durante 24 h a 37°C por conteo en placa. Los ensayos se realizaron en triplicado.

En general, L.salivariusPS11610 mostró tolerancia adecuada a las diferentes concentraciones de sales biliares analizadas (Figura 3). Las cuentas viables de L.salivariusPS11610 se redujeron en 2 LOG UFC/ml cuando se expusieron a la menor concentración de sales biliares porcinas (0,2%) añadidas al caldo MRS. El efecto fue mayor al aumentar la concentración al 0,4 y 0,5% de sales biliares.

1.7. Determinación del espectro antimicrobiano

Para evaluar la producción de compuestos antimicrobianos, se usó un método de superposición descrito por Magnusson y Schnürer[Applied and Environmental Microbiology,2001,67,1-5]. Después del crecimiento de la cepa deLactobacillus salivariusen la superficie de placas de agar MRS a 37°C durante 24 h en condiciones aerobias, las placas se recubrieron con el microorganismo indicador. Las placas se incubaron según la condición apropiada para cada indicador y se midieron los diámetros de las zonas de inhibición alrededor de las estrías de la cepa L.salivariusPS11610. Los ensayos se realizaron en triplicado.

Se emplearon las siguientes bacterias como organismos indicadores:Actinomyces neuii1-537-1 y 1-326-2,Actinomyces urogenitalis1-323-81,Aerococcus urinae1-278-2 y 1-265-3,Gardnerella vaginalis1-265-81 yCandida albicans1-534-2 de la colección de cultivos de Probisearch y originalmente aisladas de casos de disbiosis vaginal;Klebsiella oxitocamc151, mc153 yStreptococcus agalactiae30 de la colección de cultivos de Probisearch;Escherichia coliCECT 515,Klebsiella pneumoniaeCECT 144,Serratia marcescensCECT 977,Enterococcus faecalisCECT 481,Staphylococcus aureusCECT 86 yStaphylococcus epidermidisCECT 231 yListeria innocuaCECT 910 fueron proporcionados por la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT, Burjassot, España) yCronobacter sakazakiiLMG 2762 de las Colecciones Coordinadas Belgas de Microorganismos.

L.salivariusPS11610 mostró una buena actividad antimicrobiana contra todos los organismos indicadores usados en este estudio (Tabla 3). En este sentido, se observó que L.salivariusPS11610 produjo halos alrededor de colonias que varían de 2 mm contraCandida albicans1-534-2 hasta 50,7 mm contraActinomyces neuii1-537-1. Asimismo, la cepa mostró la mayor actividad antimicrobiana (zona de inhibición > 40 mm) contra microorganismos relacionados con infecciones del aparato genital femenino:Actinomyces neuii, Aerococcus urinae, Actinomyces urogenitalis,yGardnerella vaginalis.

Tabla 3. Actividad antimicrobiana de L.salivariusPS11610

Organismos indicadores Zona de inhibición (mm)

Actinomyces neuii1-5371 50,67

Actinomyces neuii1 -326-2 49

Aerococcus urinae1-265-3 38,3

Aerococcus urinae1-278-2 44,7

Actinomyces urogenitalis1-323-81 38

Gardnerella vaginalis1-265-81 40

Candida albicans1 -534-2 2

Klebsiella oxytocamc151 23

Klebsiella oxytocamc153 31

Streptococcus agalactiae30 12

Escherichia coliCECT 515 26

Klebsiella pneumoniaeCECT 144 26

Serratia marcescensCECT 977 30

Cronobacter sakazakiiLMG2762 11

Enterococcus faecalisCECT 481 24,7

Staphylococcus aureusCECT86 12

Staphylococcus epidermidisCECT231 27

Listeria innocuaCECT 910 29,7

1.8. Producción de ácido láctico y ácido acético

La producción de ácido láctico por L.salivariusPS11610 se determinó el caldo MRS después de 24 h a 37°C en condiciones aerobias. Las células se eliminaron por centrifugación a 19.000 x g durante 20 min, y la concentración de ácido L- y D-láctico en los sobrenadantes se cuantificó usando un kit enzimático (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. También se midió el valor de pH del sobrenadante. Estos ensayos se realizaron en triplicado y los valores se expresaron como la media ± DE.

L.salivariusPS11610 produjo una alta concentración de ácido L-láctico (9,53 ± 0,01) y disminuye el pH del medio de cultivo hasta 3,96.

1.9. Cocultivo líquido de lactobacilos y patógenos

En primer lugar, se evaluó el crecimiento correcto de indicadores en medio MRS. Los cocultivos se hicieron inoculando 1 ml del cultivo de la cepa PS11610 y 1 ml del cultivo indicador (DO ~ 1) en 20 ml de caldo MRS. Esta mezcla se incubó a 37°C en condición aerobia durante 17 horas. Usamos una concentración de inóculo inicial de 7 log10 ufc/ml para lactobacilos y microorganismo indicador. Las cuentas bacterianas de L.salivariusPS11610 y microorganismos patógenos se hicieron en placas de MRS y placas de agar BHI, respectivamente. Se emplearon diferentes bacterias como organismos indicadores, es decir:Streptococcus agalactiae30 y 41,Streptococcus pyogenesCECT 190,Staphylococcus aureusCECT 86,Staphylococcus epidermidisCECT 231,Cronobacter sakazakiiLMG 2762,Klebsiella oxytocamc151 y 153 yMorganella morganiiO149-10.

Los cocultivos con los microorganismos indicadores no afectaron la viabilidad y el crecimiento deL. salivariusPS11610. Sin embargo, esta cepa era capaz de disminuir en 6 unidades logarítmicas las cuentas bacterianas deSt. agalactiae30,St. agalactiae41 ySt. pyogenesCECT190. Además,L. salivariusPS11610 era eficaz contra S.epidermidisCECT231 y S.aureusCECT86, reduciendo sus cuentas viables en 2,35 y 1,48 LOG UFC, respectivamente. Además,L. salivariusPS11610 mostró buena actividad contra microorganismos gram negativos. InhibeM. morganiiO149-10 1,78 unidades logarítmicas y 5 unidades logarítmicas aK. oxytocamc151 yK. oxytocame 153.

1.10. Formación de aminas biógenas

Se evaluó la capacidad para formar aminas biógenas en caldo de descarboxilasa preparado y añadiendo un precursor aminoácido (tirosina, histidina, ornitina o lisina) y un indicador de pH como se describe antes [Bover-Cid y Holzapfel,International Journal of Food Microbiology1999,53,33-41].L. salivariusPS11610 se sembró en estrías en las placas y se incubó a 37°C en condiciones aerobias y anaerobias durante 4 días. Un resultado positivo se indicó por un cambio del color del medio a púrpura en respuesta del cambio de pH causado por la producción de la amina biógena más alcalina a partir del precursor aminoácido incluido en el medio de cultivo. Estos ensayos se realizaron por triplicado.

La cepa PS11610 no fue capaz de producir aminas biógenas. Por tanto, no se esperan reacciones alérgicas con esta cepa.

Ejemplo 2. Estudio piloto para evaluar el efecto de la cepaLactobacillus salivariusPS11610 en la microbiota del aparato genital femenino y masculino en parejas con problemas de fertilidad

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ético “Comité de Ético de Investigación Clínica del Hospital Universitario La Paz” el 13 de julio 2018.

2.1. Resumen del estudio

Objetivo principal del estudio

El objetivo principal de este estudio era investigar el efecto de la nueva cepa probióticaLactobacillus salivariusPS11610 en la composición microbiana de la vagina, el glande y el semen.

Obietivo(s) secundario(s) del estudio

Los objetivos secundarios de este estudio eran conocer la tasa de disbiosis bacteriana de parejas con fertilidad idiopática; la tasa de embarazo; la composición bacteriana y el perfil inmunológico del útero.

Producto de estudio

Cápsulas (300 mg) que comprendenLactobacillus salivariusPS11610 liofilizado (aproximadamente 1109 UFC) y maltodextrina como excipiente.

Resumen

Se pidió a todas las parejas que habían iniciado tratamiento de inseminación artificial (AI) o fertilización in vitro (IVF) o en lista de espera para ellas que participaran en este estudio. El estudio tenía cuatro visitas, V1 o visita de preselección donde se incorporaron las parejas; V2 que tuvo lugar 6 semanas ± 7 días después de la visita de preselección, V3 que tuvo lugar después de 3 meses ± 7 días de tratamiento y la visita 4 que tuvo lugar después de 6 meses ± 7 días de tratamiento.

En la visita 1, después de la verificación de los criterios de inclusión y exclusión y firmar el consentimiento informado, a las parejas se les suministró todo el material para la recogida de las muestras vaginales, seminales y de glande.

Se pidió a las mujeres recoger y congelar (-20°C) 1 muestra vaginal cada semana durante 4 semanas (correspondiente a 4 fases del ciclo menstrual). Se pidió a los hombres recoger el día antes del envio de las muestras a Probisearch (patrocinador de este estudio piloto), 1 muestra seminal y 1 muestra de glande, siguiendo las instrucciones proporcionadas. Una vez recogidas, se enviaron por mensajería a Probisearch para el análisis microbiológico.

Los criterios para determinar el estado de disbiosis bacteriana fueron:

- Concentración bacteriana < 50 UFC en exudados vaginales.

- Concentración de lactobacilos en ovulación < 102 UFC.

- Concentración de corinebacterias, enterococos y/oStaphylococcus aureus >105 UFC.

- Presencia deActinomyces neuii, Gardnerella vaginalisy/o enterobacterias.

En la visita 2, 6 semanas ± 7 días después de la visita 1, 15 parejas con un resultado microbiológico de disbiosis en una de las muestras recogidas empezaron el periodo de intervención. El investigador proporcionó el probiótico que se debía tomar durante los siguientes 3 meses. Las mujeres tomaron una cápsula de probiótico cada 12 horas y los hombres cada 24 horas durante los siguientes 6 meses.

A los participantes se les dio un diario e instrucciones sobre cómo registrar las dosis del producto de estudio tomadas. En esta visita, también se recogió una muestra de útero y se envió al laboratorio para el análisis microbiológico e inmunológico. El investigador dio instrucciones a los participantes de no ingerir otros suplementos probióticos durante su participación. Se dio instrucciones a los sujetos de recoger una muestra vaginal; una muestra de semen y una muestra de glande el día antes de la visita 3. Se les dio instrucciones de realizar un análisis sanguíneo el día después de la visita, antes de empezar la ingesta de probiótico.

Esas parejas sin disbiosis bacteriana terminaron su participación en el estudio después de esta visita.

En la tercera visita (visita 3, 3 meses ± 7 días de tratamiento) se entregaron las muestras vaginales, de semen y glande. Se recogió el producto restante del primer periodo de tratamiento y se entregó el producto de estudio correspondiente al segundo periodo de administración del suplemento. Se registraron los sucesos adversos que se producen durante el periodo entre la visita 2 y la visita 3. Se preguntó a los participantes respecto al cumplimiento de la ingesta de producto y recoger una muestra vaginal, una muestra de semen y una muestra de glande el día antes de la visita 4.

Durante la visita 4, después de 6 meses ± 7 días de periodo de intervención, se entregaron las muestras vaginales, de semen y glande. Se recogió una muestra de útero y se envió al laboratorio para el análisis microbiológico e inmunológico. Los participantes devolvieron el producto restante y el diario completado. Se registraron los sucesos adversos ocurridos desde la visita 3. Se les indicó que se realizaran un análisis de sangre el día después de la visita.

En caso de embarazo durante el tratamiento de intervención, se hizo una visita adicional al saber el nuevo estado. Los participantes recogieron una muestra vaginal, de glande y semen el día antes de la visita y las entregaron al hospital. Desde la confirmación del embarazo, solo la mujer siguió tomando el probiótico una vez al día durante las primeras 12 semanas de gestación. El hombre dejó de tomar el probiótico desde ese momento. Durante esta visita a ella se le proporcionó probiótico para los siguientes 3 meses y se recogió el anterior. También se les proporcionó un nuevo calendario de cumplimiento de toma de producto.

Una vez se completaron las 12 semanas de gestación, se hizo la última visita de estudio y se devolvieron el probiótico restante y el calendario completado.

Duración del estudio

El estudio se realizó en el Hospital Universitario La Paz y la incorporación se llevó a cabo entre enero 2019 y diciembre 2019.

Criterios de inclusión y exclusión

Los criterios de inclusión fueron:

- Parejas con edades entre 20 y 40

- Parejas en un tratamiento de reproducción asistida: inseminación artificial o fertilización in vitro

- Firma del consentimiento informado

Las parejas con cualquiera de las siguientes características se excluirán del estudio:

- Anovulación

- Hiperprolactinemia

- Hipergonadismo hipogonadotrópico

- Hipergonadismo hipergonadotrópico

- Hiperandrogenismos

- Síndrome de ovario poliquístico

- Endometriosis

- Adhesiones pélvicas

- Miomas, pólipos y/o sinequia uterina

- Diagnóstico de factor tubárico (hidrosalpinx, obstrucciones tubáricas)

- Reserva ovárica baja

- Azoospermia

- Motilidad de esperma (A B) <25%

- Morfología de esperma < 2

- Con enfermedades crónicas que producen mala absorción intestinal

- Con inmunodeficiencia congénita o adquirida conocida

- Obesidad (IMC > 30)

- Antecedentes actuales o diagnóstico de alcoholismo, tabaquismo y drogadicción

- Incertidumbre sobre la voluntad o capacidad de los participantes para cumplir con los requisitos del protocolo

Los criterios de inclusión para el tratamiento de intervención eran presentar disbiosis bacteriana en la mucosa vaginal y/o glande y/o semen.

Recogida de muestras y medidas de laboratorio

Las muestras recogidas en casa por los participantes se congelaron inmediatamente (de -15°C a -20°C) y se mantuvieron a esa temperatura hasta que se recogieron por el personal de Probisearch para análisis posterior. Las muestras de útero recogidas durante las visitas 2 y 4 se enviaron a Probisearch por mensajería en las siguientes horas después de la recogida.

Para caracterizar la composición bacteriana del frotis vaginal, útero, glande y semen y los posibles cambios producidos después de ingerir el probiótico, las muestras se sembraron en diferentes medios de cultivo para el aislamiento y cuantificación de bacterias. Los aislados se identificaron por espectrometría de masas de MALDI-TOF en un Vitek-MS™ (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia). El perfil inmunológico de las muestras uterinas se realizó por multiplexado en un Luminex® 200™ (Luminexcorp, Los Países Bajos). Los resultados del análisis se enviaron a los investigadores una vez se obtuvieron.

Las muestras de útero y plasma se prepararon para determinar el perfil inmunitario de inflamación usando el Panel de Inflamación Humano 1 de Bio-Plex Pro™, 37-Plex que incluye los siguientes analitos: APRIL / TNFSF13, BAFF / TNFSF13B, sCD30 / TNFRSF8, sCD163, similar a quiitinase-3 1, gp130 / sIL-6Rp, IFN-a2, IFN-p, IFN-y, IL-2, sIL-6Ra, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-19, IL-20, IL-22, IL-26, IL-27 (p28), IL-28A / IFN-A2, IL-29/IFN-A1, IL-32, IL-34, IL-35, LIGHT / TNFSF14, MMP-1, MMP-2, MMP-3, Osteocalcina, Osteopontina, Pentraxina-3, sTNF-R1, sTNF-R2, TSLP, TWEAK / TNFSF12. Y el kit MILLIPLEX® MAP TGFp1,2,3 MAGNETIC BEAD KIT para detectar y cuantificar las tres isoformas de factor de crecimiento transformante beta (TGF-p1, TGF-p2 y TGF-p3). El análisis se llevó a cabo en duplicado en un kit Luminex 200 (Luminexcorp, Los Países Bajos).

2.2. Análisis estadístico

Los datos se analizaron usando el paquete de software R (versión 3.6.0, proyecto R, http://www.R-project.org).

Las variables cualitativas se describieron usando frecuencias absolutas y relativas. Las variables cuantitativas se describieron usando parámetros de tendencia central (usando media, mediana o modo) y dispersión (usando desviación estándar, el intervalo de confianza, intervalo intercuartil, o mínimo y máximo).

Un resultado se consideró estadísticamente significativo cuando la prueba estadística da una probabilidad bilateral de 0,05 o menos.

Todos los análisis de seguridad se realizaron en la población de estudio entera, y los análisis de eficacia se llevaron a cabo en la población de intención de tratar.

El desenlace principal es la composición microbiana de la mucosa vaginal, glande y semen. Esta variable se obtuvo como una combinación de las concentraciones de cada una de las especies detectadas en las muestras de interés, de cada pareja participante. Para la comparación de estas variables en los diferentes tiempos del estudio se usó GLM.

2.3. Resultados

Sujetos

En este estudio se contactaron 15 parejas. De estas, 14 fueron elegibles para empezar con la ingesta de producto. Entre ellas 9 completaron el estudio y 5 parejas se retiraron del estudio. Ninguna de las terminaciones tempranas fue debido a un efecto adverso.

La edad mediana de los hombres y mujeres era muy similar, 36 y 35, respectivamente. La edad mínima de los hombres era 30, de las mujeres era 31, la edad máxima de los hombres era 42 y de las mujeres 38. Todos los participantes eran blancos.

Resultados de los parámetros de desenlace

Para el análisis de los datos, los resultados obtenidos para las 9 parejas que completaron el estudio se consideró como el análisis principal.

La composición bacteriana de la mucosa vaginal cambió estadísticamente significativa después de 3 y 6 meses de tratamiento con la cepaL. salivariusPS11610. Se detectó una disminución estadísticamente significativa de patógenos y estafilococos en las muestras vaginales (Figura 4). En el caso de las muestras masculinas, también se detectó una disminución de las cuentas bacterianas, aunque no era estadísticamente significativa.

Los criterios para determinar el estado de disbiosis bacteriana de las parejas para ser elegibles para empezar la ingesta de producto fueron:

- Concentración bacteriana < 50 UFC en frotis vaginales.

- Concentración de lactobacilos en ovulación < 102 UFC.

- Concentración de corinebacterias, enterococos y/oStaphylococcus aureus> 105 UFC.

- Presencia deActinomyces neuii, Gardnerella vaginalisy/oEnterobacteriaceae.

En la tabla 4 se muestra la evolución de los criterios relacionados con la disbiosis bacteriana en este estudio.

Tabla 4. Número de parejas con cualquiera de los criterios de disbiosis según el protocolo

Visita 2 Visita 3 Visita 4 (N = 14) (N = 10) (N = 9) < 50 UFC en frotis vaginales 2 0 1

Después de 3 meses de tratamiento el 50% de las parejas resolvió la disbiosis mientras el 62,5% de las parejas lo hizo después de 6 meses de ingesta de probiótico (p = 0,001). Ambos, el número total y el número medio de criterios de disbiosis disminuyeron estadísticamente con una significación del 95% (p < 0,030 y p < 0,0034, respectivamente).

Respecto a la tasa de disbiosis bacteriana de las parejas con infertilidad idiopática, todas las parejas contactadas que cumplieron los criterios de inclusión y exclusión mostraron disbiosis bacteriana. En 7 de 14 (50%) parejas ambos miembros mostraron disbiosis bacteriana mientras en 3 de 14 (21%) era la mujer quien cumplía al menos uno de los criterios de disbiosis y en 4 de 14 (29%) era el hombre quien mostró disbiosis, pero no las mujeres.

En este estudio, 4 de las 9 parejas (44,44%) que finalizaron el estudio se quedaron embarazadas. Una de ellas sufrió un embarazo ectópico, 1 se quedó embarazada después de 3 meses de ingesta de producto, 1 se quedó embarazada después de 3 semanas de ingesta de producto, y 1 se quedó embarazada después de 6 meses de ingesta de producto. Tres siguieron con el embarazo y dieron a luz con éxito.

En vista de los resultados anteriores se puede concluir que la ingesta durante 6 meses deLactobacillus salivariusPS11610 ejerce un fuerte efecto sobre la composición bacteriana del aparato urogenital masculino y femenino y el estado inmunitario de parejas con infertilidad causada por disbiosis bacteriana. Estos efectos mejoran el éxito del embarazo en parejas infértiles.

Respecto al perfil inmunológico del útero, no se observaron cambios estadísticamente significativos para cada uno de los 37 compuestos inmunitarios ensayados (Tabla 5). A pesar de ese hecho, el estado inmunitario del útero cambió de un perfil proinflamatorio en la visita 2 a un perfil más antiinflamatorio después de 6 meses del tratamiento con probiótico en la visita 4.

Tabla 5. Compuestos inmunitarios ensayados en muestras de úteros el inicio y al final del tratamiento

Útero

Inicial (N = 10) Final (N = 7) alor p K-W APRIL/TNFSF13* 166,20 (122,44-304,92) 207,04 (139,38-278,41) 0,558 BAFF/TNFSF13B* 11,58 (7,71-16,67) 13,55 (9,07-25,59) 0,696 sCD30/TNFRSF8* 0,37 (0,16-0,55) 0,24 (0,13-0,49) 0,696 sCD163¥ 83,37 (55,84-177,63) 89,98 (70,26-565,60) 0,637 similar a quitinase-3 1* 29,11 (18,11-31,99) 40,69 (40,57-48,35) 0,072 gp130/sIL-6Rp* 96,60 (60,28-166,33) 105,33 (79,42-148,55) 0,922

* ng/ml

¥pg/ml

Respecto al perfil inmunológico sistémico, hubo cambios estadísticamente significativos en el estado inmunitario general de las parejas. Al inicio del estudio, tanto hombres como mujeres mostraron un perfil proinflamatorio que se volvió antiinflamatorio después de 6 meses del tratamiento probiótico (Tabla 6). En muestras de plasma masculinas IFN-a2, IL-12p40, IL-22, IL-28A/IFN-A2, IL-29/IFN-A1, IL-34 y TGF-P1 disminuyeron significativamente después de 6 meses de ingesta de L. salivarius PS11610. En muestras femeninas IL-12p40, IL-12p70, IL-22, IL-27p28, IL-29/IFN-A1, IL-34, IL-35, osteocalcina, pentraxina-3, TGF-p1 y TGF-p2 disminuyeron en plasma al final del tratamiento estadísticamente significativo (Tabla 6). La comparación del perfil inmunitario de muestras femeninas (útero y plasma) mostró una alta diferencia en la concentración de los numerosos compuestos inmunitarios resaltando las diferencias entre respuesta inmunitaria sistémica y respuesta inmunitaria mucosa local (Tabla 7).

En vista de los resultados del perfil inmunitario anterior se puede concluir que la ingesta durante 6 meses deLactobacillus salivariusPS11610 produce un cambio en el perfil inmunitario del útero desde un perfil proinflamatorio a un perfil antiinflamatorio. La ingesta durante 6 meses deLactobacillus salivariusPS11610 produce un cambio en el perfil inmunitario del plasma tanto en hombres como en mujeres desde un perfil proinflamatorio a un perfil antiinflamatorio.

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Ejemplo 3: Actividad antimicrobiana de cepas deLactobacillus salivarius

Paraevaluar la producción de compuestos antimicrobianos, se usó un método de superposición descrito por Magnusson y Schnürer[Applied and Environmental Microbiology2001,67,1-5]. Después del crecimiento de las correspondientes cepas deLactobacillus salivarius (L. salivariusPS11610 de la invención,L. salivariusPS11603 yL. salivariusPS7 de la colección de cultivos de Probisearch y disponibles de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT 9526, CECT 9527 y CECT 9422, respectivamente) en la superficie de placas de agar MRS a 37°C durante 24 h en condiciones aerobias, las placas se recubrieron con el microorganismo indicador. Las placas se incubaron según la condición apropiada para cada indicador y se midieron los diámetros de las zonas de inhibición alrededor de las estrías de la cepa correspondiente de L.salivarius.Los ensayos se realizaron en triplicado.

Se emplearon las siguientes bacterias como organismos indicadores:Actinomyces neuii1-537-1 y 1-326-2,Actinomyces urogenitalis1-323-81,Aerococcus urinae1-278-2 y 1-265-3, yGardnerella vaginalis1-265-81 de la colección de cultivos de Probisearch y originalmente aisladas de casos de disbiosis vaginal; yEnterococcus faecalisCECT 481, fue proporcionado por la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT, Burjassot, España).

L. salivariusPS11610 mostró una mayor actividad antimicrobiana contra los organismos indicadores usados en este estudio (Tabla 8) que las otras cepas deL. salivariusensayadas.

Tabla 8. Actividad antimicrobiana de cepas deL. salivarius.Los resultados se expresan como la zona de inhibición en mm

Organismos indicadores L. salivarius PS11610 L. salivarius PS11603 L. salivarius PS7Actinomyces neuii1-537-1 51 31 33Actinomyces neuii1 -326-2 49 26 38Aerococcus urinae1-278-2 45 18 42Aerococcus urinae1-265-3 38 21 39Actinomyces urogenitalis1-323-81 38 22 30Gardnerella vaginalis1-265-81 40 29 35Enterococcus faecalisCECT 481 25 20 23

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una cepa deLactobacillus salivariusPS11610 o una variante de la misma que tiene al menos el 99% de identidad con la secuencia de ARNr 16S de esta cepa, en donde la cepa variante retiene o mejora más la actividad de la cepaLactobacillus salivariusPS11610 en una o más de las siguientes propiedades:

- producción de ácido láctico en caldo MRS después de 24 h a 37°C en condiciones anaerobias;

- tolerancia al pH en el intervalo de 3 a 6; y

- tolerancia a sales biliares.

2. La cepa como se define en la reivindicación 1, en donde la cepa esLactobacillus salivariusPS11610.

3. La cepa como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la cepa está viva.

4. Una composición que comprende una cepa como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. La composición según la reivindicación 4, que comprende desde aproximadamente 106 UFC hasta aproximadamente 1012 UFC de la cepa deLactobacillus salivarius.

6. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, que además comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. La composición según la reivindicación 6, en donde el excipiente farmacéuticamente aceptable es maltodextrina.

8. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, que está en forma de una formulación oral, preferiblemente una cápsula.

9. Producto alimenticio que comprende la composición según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5.

10. Una cepa como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 o un producto alimenticio como se define en la reivindicación 9, para uso como un probiótico o para uso como un agente terapéutico.

11. Una cepa como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 o un producto alimenticio como se define en la reivindicación 9, para uso en la prevención y/o el tratamiento de disbiosis urogenital.

12. Una cepa como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 o un producto alimenticio como se define en la reivindicación 9, para uso en la prevención y/o el tratamiento de vaginosis bacteriana y vaginitis.

13. Una cepa como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 o un producto alimenticio como se define en la reivindicación 9, para uso en el tratamiento de infertilidad en un sujeto que padece disbiosis bacteriana urogenital.

14. Una cepa como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 o un producto alimenticio como se define en la reivindicación 9, para uso en la prevención de aborto espontáneo en el primer trimestre del embarazo en fertilizaciónin vitro.

15. Una cepa como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 o un producto alimenticio como se define en la reivindicación 9, para uso en reducir las bacterias patógenas en el aparato urogenital.