ES2983060T3

ES2983060T3 - Variantes de ARN polimerasa

Info

Publication number: ES2983060T3
Application number: ES18845635T
Authority: ES
Inventors: Amy Rabideau; Athanasios Dousis; Kanchana Ravichandran; Elissa Hobert
Original assignee: ModernaTx Inc
Current assignee: ModernaTx Inc
Priority date: 2017-08-18
Filing date: 2018-08-17
Publication date: 2024-10-21
Anticipated expiration: 2038-08-17
Also published as: US20250197908A1; JP2020532963A; JP2025078643A; EP4397757A2; US20240102066A1; US20190309337A1; US11066686B2; EP4397757A3; WO2019036682A1; JP7637191B2; US11767548B2; MA71572A; JP2023129421A; EP3668971B1; EP3668971A1; US10526629B2; US20210395792A1; MA49913A; US12195778B2; US20200131550A1

Abstract

La presente divulgación proporciona, en algunos aspectos, polimerasas de ARN variantes, cuyo uso aumenta la eficiencia de la transcripción al tiempo que reduce la cantidad de contaminantes de ARN bicatenario y transcripciones continuas producidas durante una reacción de transcripción in vitro. En algunas realizaciones, las variantes de la polimerasa de ARN (por ejemplo, las variantes de la polimerasa de ARN T7) incluyen mutaciones en residuos que tienen una alta propensión a formar hélices (por ejemplo, alanina) o que restringen la flexibilidad de la cadena principal para que coincida específicamente con la del complejo de elongación. Se describen sustituciones de aminoácidos dentro de la hélice C, incluidas S43A y G47A, y regiones de enlace C de la polimerasa de ARN T7, así como la adición de un residuo de glicina C-terminal. También se describen métodos de co-transcripción que utilizan análogos de capuchón. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de ARN polimerasa

Antecedentes

La transcripciónin vitro(TIV) usa polimerasas de ácido ribonucleico (ARN) dependientes de ADN de bacteriófago (p. ej., SP6, T3 y T7) para sintetizar transcritos de ARNm dirigidos por molde. Los problemas en la reacción de TIV pueden dar como resultado un fallo total (p. ej., no se genera un transcrito) o transcritos de tamaño incorrecto (p. ej., más cortos o más largos de lo esperado). Los problemas específicos asociados con las reacciones de TIV incluyen, por ejemplo, transcritos abortivos (truncados), transcritos continuos, variantes de cola de poliA/heterogeneidad 3', transcritos mutados y/o contaminantes bicatenarios producidos durante las reacciones.

Las ARN polimerasas exhiben tres fases de transcripción: iniciación, elongación y terminación. Durante la fase de iniciación, la ARN polimerasa se une a una secuencia de ADN promotora específica, abre el dúplex de ADN y alimenta la hebra de molde en el sitio activo. La ARN polimerasa T7, por ejemplo, forma una estructura denominada complejo de iniciación, que incluye un subdominio de haz de seis hélices (el dominio de unión a promotor) que interactúa con el promotor para iniciar la fusión del dúplex de ADN. Mientras está unida al promotor, la polimerasa produce muchos transcritos cortos (truncados) de 2 a 12 nucleótidos (nt) de longitud, un proceso a menudo denominado síntesis/iniciación abortiva. Los transcritos de ARN truncados no pueden convertirse en transcritos de longitud completa mediante la ARN polimerasa y se vuelven subproductos que se acumulan durante la transcripción. Después de la transición a la fase de elongación y la liberación del promotor, la polimerasa avanza por el molde de ADN produciendo un transcrito de ARN de longitud completa.

Durante la fase de elongación, la ARN polimerasa a menudo continúa transcribiendo el ADN más allá del punto en el que debería iniciarse la terminación, generando transcritos de ARN más largos de lo esperado ("transcritos continuos"). La ARN polimerasa T7, por ejemplo, añade nucleótidos al final de un transcrito antes de desprenderse el molde. Los estudios sugieren que más del 70 % de los transcritos generados por la ARN polimerasa T7in vitropueden ser transcritos continuos. En algunos casos, estos productos de ARN aberrantes tienen el doble de longitud que la secuencia codificada. Debido a que la transcripción continua es estocástica, a menudo existe una gran heterogeneidad 3' entre los productos en una reacción de TIV dada. Esta heterogeneidad 3' es problemática para aplicaciones posteriores, tales como reacciones de ligación, que dependen de transcritos de ARN de una longitud y/o composición de nucleótidos definida.

Bandwar, RP et al. Journal of Biological Chemistry 282, 22879-22886 (2007) se refiere a la transición a un complejo de elongación mediante la ARN polimerasa T7 como un proceso multietapa.

Sumario

Basándose en la divulgación contenida en el presente documento, la presente invención proporciona una variante de la polimerasa de ácido ribonucleico (ARN)<t>7 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO:1 modificada para incluir una sustitución de aminoácido correspondiente a la posición G47 de SEQ ID NO:1; en donde la sustitución de aminoácido es alanina (G47A).

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para efectuar una reacción de transcripciónin vitro(TIV), que comprende poner en contacto un molde de ADN con la ARN polimerasa T7 de la invención en presencia de trifosfatos de nucleósidos y tampón en condiciones que dan como resultado la producción de transcrito de ARN.

En otros aspectos adicionales, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica la variante de ARN polimerasa T7 de la invención, así como un vector que comprende dicho ácido nucleico y una célula hospedadora que comprende dicho ácido nucleico.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un método de adición de caperuza cotranscripcional para la síntesis de ácido ribonucleico (ARN), comprendiendo el método hacer reaccionar un molde de polinucleótido con: (i) la variante de ARN polimerasa T7 de la invención, (ii) trifosfatos de nucleósidos y (iii) un análogo de caperuza, en condiciones de reacción de transcripción in vitro para producir transcritos de ARN.

La presente invención algunas realizaciones preferidas de la misma se exponen en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción detallada

La información técnica expuesta a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de la invención, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para ubicar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados.

Además, las referencias incidentales a métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia y métodos de diagnóstico practicados en el cuerpo humano o animal no deben interpretarse como una reivindicación de protección para tales métodos como tales, sino que deben interpretarse como refiriéndose a productos, en particular sustancias o composiciones, para uso en cualquiera de estos métodos.

Durante la iniciación de la transcripción, la ARN polimerasa equilibra dos fases opuestas. La polimerasa primero debe asociarse con el promotor lo suficientemente fuerte como para permitir la disociación de las dos hebras de ADN (una de las cuales es la hebra de molde) y comenzar la transcripción. Luego, la polimerasa debe liberar el promotor y entrar en una fase de elongación altamente procesiva. La competencia entre estas dos fases conduce a la producción de transcritos abortivos. La polimerasa intenta repetidamente eliminar el promotor, pero es incapaz de superar la barrera de transición y libera productos de ARN cortos (abortivos). Por el contrario, la polimerasa a menudo no logra "desprender" el molde de ADN, generando una población de transcritos de ARN con heterogeneidad 3'. En el presente documento se proporcionan variantes de ARN polimerasas, que aumentan la eficiencia de la transcripción y la homogeneidad 3', transcritos continuos, contaminantes bicatenarios o cualquier combinación de los mismos, producidos durante una reacción de transcripciónin vitro(TIV), por ejemplo.

Durante la transición de la iniciación a la elongación, la ARN polimerasa experimenta un cambio conformacional que requiere una gran reordenación del dominio amino-terminal (dominio N-terminal) (véanse, p. ej., Bandwar, RP et al. Journal of Biological Chemistry 282, 22879-22886 (2009); Guillerez, J. et al. Proc National Acad Sci 102, 5958-5963 (2005); Durniak, K. et al. Science (Nueva York, N.Y.) 322, 553 (2008); y Tahirov, TH et al. Nature 420, 43-50 (2002)). Dentro de este dominio N-terminal hay una "hélice C" (p. ej., los aminoácidos 28-71 de la ARN polimerasa T7) y un "enlazador C" (p. ej., los aminoácidos 258-266 de la ARN polimerasa T7), cada uno de los cuales contiene subregiones (aminoácidos 42-47 y 257-262, respectivamente) que experimentan un cambio conformacional de una estructura de bucle a una estructura de hélice a medida que la<a>R<n>polimerasa pasa de un complejo de iniciación a un complejo de elongación (véase, p. ej., la FIG. 10), anulando el sitio de unión al promotor, ampliando el sitio activo y creando un túnel de salida para el transcrito de ARN. Las mutaciones en subregiones en la estructura de hélice C y/o en la región del enlazador C pueden impulsar el equilibrio conformacional hacia el complejo de elongación al aumentar la estabilidad termodinámica del complejo de elongación con respecto al complejo de iniciación. Sin estar ceñido a ninguna teoría, también se cree que las mutaciones en regiones seleccionadas, tales como la estructura de hélice C y/o la región enlazadora del enlazador C, pueden cambiar la forma en que el túnel de salida de la polimerasa interactúa con el transcrito durante la elongación, causando una reducción significativa de los errores de transcripción (p. ej., transcritos continuos). Por tanto, las polimerasas variantes de la presente divulgación incluyen una (al menos una) mutación en la hélice C y/o el enlazador C para impulsar el equilibrio conformacional hacia el complejo de elongación.

Pueden mutarse otras regiones del dominio N-terminal que contienen estructuras de bucle que pasan a estructuras de hélice a medida que la polimerasa avanza desde la iniciación hasta la elongación (mutación puntual, denominada sustitución), como se divulga en el presente documento. Los ejemplos de tales regiones de bucle a hélice incluyen regiones que abarcan los aminoácidos 55-73, 164-169 o 176-187 de la ARN polimerasa T7 (p. ej., SEQ ID NO:1), o regiones de otras ARN polimerasas de subunidad única (véase, por ejemplo, Cermakian, N. et al. J Mol Evol 45, 671 681 (1997)) que son homólogas (p. ej., al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 98% idénticas) a las regiones anteriores. Los ejemplos de otras ARN polimerasas de subunidad única incluyen ARN polimerasa T3, ARN polimerasa K11 y ARN polimerasa SP6.

En el presente documento se divulgan variantes de ARN polimerasa (es decir, variantes de ARN polimerasa T7), que incluyen mutaciones en residuos que tienen una alta propensión a la hélice (es decir, alanina) o que limitan la flexibilidad de la cadena principal para coincidir específicamente con la del complejo de elongación. En la invención, la variante de ARN polimerasa T7 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO:1 modificada para incluir una sustitución de aminoácido G47A.

En el presente documento se proporcionan además variantes de ARN polimerasa que incluyen al menos un aminoácido adicional en el extremo C de la polimerasa. Por ejemplo, las variantes de ARN polimerasa T7 pueden incluir al menos un aminoácido adicional, tal como una glicina (G) adicional en el extremo C de la polimerasa. Sorprendentemente, la población de transcritos de ARN producidos usando una ARN polimerasa T7 modificada para incluir una G adicional en la región "de pie" C-terminal (p. ej., la región que comprende aminoácidos "FAFA" en las posiciones 880-883 de ARNP T7 de tipo silvestre) exhibe menos heterogeneidad 3'. Por ejemplo, como se muestra en la FIG. 23, una variante de ARN polimerasa T7 que incluye una glicina C-terminal (es decir, ...FAFAG) produce una población de transcritos de ARN en la que al menos un 85 % de los transcritos son homogéneos en el extremo 3'. Estos datos son particularmente inesperados, dado que estudios previos han mostrado que las adiciones/inserciones C-terminales daban como resultado la pérdida de función de la polimerasa T7 (Gardner LP, et al. Biochemistry 36, 2908-2918 (1997) y Gross L, et al. Journal of Molecular Biology 228, 488-505 (1992)).

También se proporcionan en el presente documento métodos para añadir caperuza a un ARNmc (p. ej., ARNm) con análogos de caperuza (p. ej., trinucleótidos) cotranscripcionalmente (métodos de adición de caperuza cotranscripcional) en un ensayo de transcripciónin vitrousando una variante de ARN polimerasa T7 descrita en el presente documento (p. ej., variante de ARN polimerasa T7 G47A o variante C-terminal G47A*). La adición de caperuza cotranscripcional eficiente típicamente incluye un molde de ADN bicatenario (ADNbc) que inicia la transcripción con 5'ATP y concentraciones equimolares de NTP y trinucleótidos. En estas condiciones, la ARN polimerasa T7 exhibe una actividad de iniciación muy reducida con 5'ATP. Inesperadamente, los datos proporcionados en este documento muestran que, en presencia de trinucleótidos GAG (p. ej., m7GpppA<2>'OMepG), por ejemplo, la actividad de iniciación limitada de la ARN polimerasa T7 con 5'ATP impulsa la iniciación con el trinucleótido en lugar de 5'ATP, generando productos de ARN con caperuza cotranscripcionalmente. Sorprendentemente, en algunas realizaciones, más de un 90 % del ARN producido comprende transcritos monocatenarios de longitud completa, al menos un 90 % del ARN producido incluye una caperuza funcional y el ARN producido no desencadena una respuesta sustancial de citocinas, incluso en ausencia de purificación post-TIV.

La presente invención se define como se expone en las reivindicaciones adjuntas.

La presente divulgación proporciona variantes de ARN polimerasa que comprenden al menos una sustitución de aminoácido, con respecto a la polimerasa de tipo silvestre, que causa que al menos una estructura de bucle de la variante de ARN polimerasa experimente un cambio conformacional a una estructura de hélice a medida que la variante de ARN polimerasa pasa de un complejo de iniciación a un complejo de elongación. Se puede estimar que al menos una sustitución de aminoácido tiene un cambio más negativo en la energía libre de plegamiento en el complejo de elongación que en el complejo de iniciación. Al menos una sustitución de aminoácido puede tener una alta propensión a la hélice, con respecto al aminoácido de tipo silvestre. La variante de ARN polimerasa puede comprender un residuo (al menos uno) de aminoácido adicional en el extremo C. Por ejemplo, una variante de ARN polimerasa (es decir, una variante de ARN polimerasa T7) puede comprender una glicina (G) en el extremo C.

En la invención, la ARN polimerasa es ARN polimerasa T7.

La al menos una estructura de bucle puede estar en la estructura de hélice C. La al menos una estructura de bucle puede estar en la estructura del enlazador C. En la invención, la variante de ARN polimerasa T7 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la<s>E<q>ID NO:1 modificada para incluir una sustitución de aminoácido G47A.

Se divulga en el presente documento, en algunos casos, al menos una sustitución de aminoácido que es al menos una sustitución de aminoácido de alta propensión a hélice. Por ejemplo, al menos una sustitución de aminoácido con alta propensión a hélice puede seleccionarse de alanina, isoleucina, leucina, arginina, metionina, lisina, glutamina y/o glutamato. En la invención, la al menos una sustitución de aminoácido con alta propensión a hélice es alanina. En la invención, la variante de ARN polimerasa T7 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO:1 modificada para incluir una sustitución de aminoácido G47A.

La ARN polimerasa T7 puede comprender además, en algunas realizaciones, una o más sustituciones de aminoácidos adicionales (además de al menos una sustitución de aminoácido con alta propensión a hélice). Por tanto, la presente divulgación abarca la modificación adicional de variantes de ARN polimerasa T7 existentes (p. ej., actualmente disponibles y/o comercialmente disponibles) con una o más sustituciones de aminoácidos con alta propensión a hélice como se proporciona en el presente documento.

En algunas realizaciones, una ARN polimerasa T7 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 modificada para incluir al menos una sustitución de aminoácido de un aminoácido con alta propensión a hélice, en donde la al menos una sustitución de aminoácido comprende G47A.

En algunas realizaciones, una ARN polimerasa T7 comprende al menos un aminoácido C-terminal adicional. En algunas realizaciones, una ARN polimerasa T7 comprende al menos dos aminoácidos C-terminales adicionales.

En algunas realizaciones, los al menos dos aminoácidos C-terminales adicionales comprenden el mismo tipo de aminoácido (p. ej., todos Gly, todos Ala). En algunas realizaciones, los al menos dos aminoácidos C-terminales adicionales comprenden al menos dos tipos diferentes de aminoácidos (p. ej., GlyAla, AlaGly).

En algunas realizaciones, una ARN polimerasa T7 comprende al menos tres aminoácidos C-terminales adicionales. En algunas realizaciones, los al menos tres aminoácidos C-terminales adicionales comprenden al menos dos o al menos tres del mismo tipo o tipos diferentes de aminoácidos (p. ej., GlyGlyGly, AlaAlaAla).

En algunas realizaciones, una ARN polimerasa T7 comprende de 1 a 10 (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) aminoácidos C-terminales adicionales. En algunas realizaciones, una ARN polimerasa T7 comprende 1 a 5 aminoácidos C-terminales adicionales.

En algunas realizaciones, una ARN polimerasa T7 comprende un extremo C que comprende un motivo FAFAXn, en donde X es cualquier aminoácido y n es cualquier número entero mayor de cero. En algunas realizaciones, X es glicina (G). En algunas realizaciones, n es 1, 2, 3, 4 o 5. Debe entenderse que, en realizaciones donde n es mayor de 1, de tal modo que el motivo C terminal es FAFXX, FAFAXXX, FAFAXXXX o FAFAXXXXX, por ejemplo, las X pueden ser el mismo aminoácido o pueden ser aminoácidos diferentes. Por ejemplo, el motivo C-terminal puede ser FAFAGG o FAFAGGG, o el motivo C-terminal puede ser FAFAGA, FAFAg C, FAFAGAA, FAFAGAG, FAFAGAC, etc. Pueden usarse otras combinaciones de aminoácidos C-terminales.

En algunas realizaciones, una ARN polimerasa T7 comprende un extremo C que comprende un motivo FAFAG.

En algunas realizaciones, una ARN polimerasa T7 comprende un motivo XAFAXn, un motivo FXFAXn, un motivo FAXAXno un motivo FAFXXn, en donde cada X es cualquier aminoácido y n es cualquier número entero mayor de cero. Por tanto, la presente divulgación comprende diversos motivos C-terminales f880A881F882A883, en donde el aminoácido en una o más de las posiciones 880, 881, 882 u 883 (p. ej., con respecto a la ARNP T7 de tipo silvestre, p. ej., de SEQ ID NO:1) se modifica para incluir al menos una sustitución de aminoácido, con o sin un aminoácido C-terminal adicional (Xn).

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona ARN polimerasas que comprenden al menos un aminoácido C-terminal adicional con respecto a una ARN polimerasa de tipo silvestre correspondiente.

La presente divulgación también proporciona métodos para producir ARN que comprenden poner en contacto un molde de ADN con una variante de a Rn polimerasa como se describe en el presente documento en condiciones que dan como resultado la producción de un transcrito de ARN (p. ej., en condiciones de TIV).

La presente divulgación proporciona además métodos para realizar una reacción de TIV, que comprende poner en contacto un molde de ADN con una variante de ARN polimerasa como se proporciona en el presente documento en presencia de trifosfatos de nucleósidos (NTP) y tampón en condiciones que dan como resultado la producción de transcritos de ARN.

En la invención, el método para efectuar una reacción de TIV comprende poner en contacto un molde de ADN con la ARN polimerasa ARN polimerasa T7 como se define en las reivindicaciones adjuntas en presencia de trifosfatos de nucleósidos y tampón en condiciones que dan como resultado la producción de transcrito de ARN.

En algunas realizaciones, el transcrito de ARN producido, cuando se suministra a las células, opcionalmente en forma no purificada, estimula una respuesta de citocinas que es al menos un 50 % (p. ej., al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 95 % o al menos un 98 %) menor con respecto al ARN producido usando ARN polimerasa de tipo silvestre en las mismas condiciones de TIV.

En algunas realizaciones, la concentración de transcrito de ARNbc producido por TIV es al menos un 50 % (p. ej., al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 95 % o al menos un 98 %) menor con respecto al transcrito de ARNbc producido usando polimerasa de tipo silvestre.

En algunas realizaciones, menos de un 20 % (p. ej., menos de un 15 %, menos de un 10 %, menos de un 5 %) de los transcritos de ARN producidos exhiben heterogeneidad 3'.

En algunas realizaciones, menos de un 50 % (p. ej., menos de un 40 %, menos de un 30 %, menos de un 20 %, menos de un 10 %) del transcrito de ARN producido es un transcrito de ARN truncado.

En algunas realizaciones, menos de un 50 % (p. ej., menos de un 40 %, menos de un 30 %, menos de un 20 %, menos de un 10 %) del transcrito de ARN producido es un transcrito continuo.

En algunas realizaciones, la cantidad de transcrito de ARN de longitud completa producido es al menos 15 veces mayor que la cantidad de molde de ADN.

En algunas realizaciones, la relación de transcrito de ARN truncado:transcrito de ARN de longitud completa producido es menor de 1:1.

En algunas realizaciones, el transcrito de ARN producido tiene menos de 1 mutación por 100 nucleótidos con respecto al molde de ADN.

La presente divulgación, en algunos aspectos, proporciona ácidos nucleicos que codifican variantes de ARN polimerasa y, en algunas realizaciones, vectores (p. ej., plásmidos) y/o células hospedadoras (p. ej., células de mamífero, p. ej., células humanas) que comprenden los ácidos nucleicos.

También se proporcionan los transcritos de ARN producidos mediante los métodos de la presente divulgación. En algunas realizaciones, los transcritos de ARN (p. ej., ARNm) se formulan en una nanopartícula lipídica. La nanopartícula lipídica puede comprender, por ejemplo, una relación molar de 20-60 % de lípido catiónico ionizable, 5 25 % de lípido no catiónico, 25-55 % de esterol y 0,5-15 % de lípido modificado con PEG. Véase, por ejemplo, el documento WO 2017/070624, publicado el 27 de abril de 2017.

En el presente documento se divulgan otras composiciones y kits que comprenden las variantes de ARN polimerasa.

También se proporcionan en el presente documento métodos de adición de caperuza cotranscripcional para la síntesis de ácido ribonucleico (ARN), comprendiendo los métodos hacer reaccionar un molde de polinucleótido con una variante de ARN polimerasa T7, trifosfatos de nucleósidos y un análogo de caperuza en condiciones de reacción de transcripciónin vitropara producir transcrito de ARN.

En algunas realizaciones, más de un 80 %, más de un 85 % o más de un 90 % del transcrito de ARN producido incluye una caperuza funcional. En algunas realizaciones,

más de un 95 % del transcrito de ARN producido incluye una caperuza funcional.

En algunas realizaciones, los trifosfatos de nucleósidos comprenden ATP modificado o no modificado, UTP modificado o no modificado, GTP modificado o no modificado y/o CTP modificado o no modificado.

En la invención, la variante de polimerasa T7 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 (o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % %, o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO:1) modificada para incluir la sustitución de aminoácido G47A.

En algunas realizaciones, los trifosfatos de nucleósidos y el análogo de caperuza están presentes en la reacción en concentraciones equimolares. En algunas realizaciones, la relación molar de análogo de caperuza a trifosfatos de nucleósidos en la reacción es mayor de 1:1. En algunas realizaciones, la relación molar de análogo de caperuza a trifosfatos de nucleósidos en la reacción es menor de 1:1.

En algunas realizaciones, el análogo de caperuza es una caperuza de dinucleótido, una caperuza de trinucleótido o una caperuza de tetranucleótido. En algunas realizaciones, el análogo de caperuza es una caperuza de trinucleótido.

En algunas realizaciones, la caperuza de trinucleótido comprende una secuencia seleccionada de las siguientes secuencias: GAA, GAC, GAG, GAU, GCA, GCC, GCG, GCU, GGA, GGC, GGG, GGU, GUA, GUC, GUG y GUU.

En algunas realizaciones, la caperuza de trinucleótido comprende una secuencia seleccionada de las siguientes secuencias: m7GpppApA, m7GpppApC, m7GpppApG, m7GpppApU, m7GpppCpA, m7GpppCpC, m7GpppCpG, m7GpppCpU, m7GpppGpA, m7GpppGpC, m7GpppGpG, m7GpppGpU, m7GpppUpA, m7GpppUpC, m7GpppUpG, y m7GpppUpU.

En algunas realizaciones, la caperuza de trinucleótido comprende una secuencia seleccionada de las siguientes secuencias: m7G3'OMepppApA, m7G3'OMepppApC, m7G3'OMepppApG, m7G3'OMepppApU, m7G3'OMepppCpA, m7G3'OMepppCpC, m7G3'OMepppCpG, m7G3'OMepppCpU, m7G3'OMepppGpA, m7G3'OMepppGpC, m7G3'OMepppGpG, m7G3'OMepppGpU, m7G3'OMepppUpA, m7G3'OMepppUpC, m7G3'OMepppUpG y m7G3'OMepppUpU.

En algunas realizaciones, la caperuza de trinucleótido comprende una secuencia seleccionada de las siguientes secuencias: m7G3'OMepppA2'OMepA, m7G3'OMepppA2'OMepC, m7G3'OMepppA2'OMepG, m7G3'OMepppA2'OMepU, m7G3'OMepppC2'OMepA, m7G3'OMepppC2'OMepC, m7G3'OMpppC2'OMepG, m7G3'OMepppC2'OMepU, m7G3'OMepppG2'OMepA, m7G3'OMepppG2'OMepC, m7G3'OMepppG2'OMepG, m7G3'OMepppG2'OMepU, m7G3'OMepppU2'OMepA, m7G3'OMeppU2'OMepC, m7G3'OMepppU2'OMepG y m7G3'OMepppU2'OMepU.

En algunas realizaciones, la caperuza de trinucleótido comprende una secuencia seleccionada de las siguientes secuencias: m7GpppA<2>'OMepA, m7GpppA<2>'OMepC, m7GpppA<2>'OMepG, m7GpppA<2>'OMepU, m7GpppC<2>'OMepA, m7GpppC<2>'OMepC, m7GpppC<2>'OMepG, m7GpppC<2>'OMepU, m7GpppG<2>'OMepA, m7GpppG<2>'OMepC, m7GpppG<2>'OMepG, m7GpppG<2>'OMepU, m7GpppU<2>'OMepA, m7GpppU<2>'OMepC, m7GpppU<2>'OMepG y m7GpppU<2>'OMepU.

En algunas realizaciones, la caperuza de trinucleótido comprende una secuencia seleccionada de las siguientes secuencias: GAG, GCG, GUG y GGG. En algunas realizaciones, la caperuza de trinucleótido comprende la secuencia GAG. En algunas realizaciones, la caperuza de trinucleótido comprende m7GpppA<2>OmepG.

En algunas realizaciones, el molde de polinucleótido incluye un residuo de 2'-desoxitimidina en la posición del molde 1. En algunas realizaciones, el molde de polinucleótido incluye un residuo de 2'-desoxicitidina en la posición del molde 1. En algunas realizaciones, el molde de polinucleótido incluye un residuo de 2'-desoxiadenosina en la posición del molde 1. En algunas realizaciones, el molde de polinucleótido incluye un residuo de 2'-desoxiguanosina en la posición del molde 1.

También se proporcionan en el presente documento métodos de adición de caperuza cotranscripcional para la síntesis de ARN, comprendiendo los métodos hacer reaccionar un molde de polinucleótido con (a) una variante de ARN polimerasa T7 que comprende al menos una sustitución de aminoácido, con respecto a la ARN polimerasa de tipo silvestre, que causa que al menos una estructura de bucle de la variante de ARN polimerasa experimente un cambio conformacional a una estructura de hélice a medida que la variante de ARN polimerasa pasa de un complejo de iniciación a un complejo de elongación, (b) trifosfatos de nucleósidos, y (c) una caperuza de trinucleótido que comprende la secuencia GpppA<2>OmepG, en condiciones de reacción de transcripciónin vitropara producir un transcrito de ARN, en donde el molde de polinucleótido incluye un residuo de 2'-desoxitimidina en la posición del molde 1. En la invención, la ARN polimerasa T7 se modifica para incluir una sustitución de aminoácido G47A como se define en las reivindicaciones adjuntas.

En algunas realizaciones, el transcrito de ARN producido, cuando se suministra a las células, opcionalmente en forma no purificada, no estimula una respuesta de citocina detectable.

En el presente documento se divulgan además composiciones que comprenden un ARN transcrito in vitro (TIV) y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición está sustancialmente libre de ARN contaminante inductor de citocinas en ausencia de purificación post-TIV.

Una composición puede comprender un ARN de TIV y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición tiene menos de un 5 % de especies de ARN sin caperuza.

Más de un 80 %, 85 % o 90 % del ARN de TIV puede incluir una caperuza funcional. Más de un 95 % del ARN de TIV puede incluir una caperuza funcional.

En algunos casos, el ARN de TIV no se modifica químicamente. En otros casos, el ARN de TIV se modifica químicamente.

Más de un 95 % del ARN de TIV puede comprender transcritos monocatenarios de longitud completa.

El ARN se puede producir mediante un proceso que comprende: hacer reaccionar un molde de polinucleótido con (a) una variante de ARN polimerasa T7 que comprende al menos una sustitución de aminoácido, con respecto a la ARN polimerasa de tipo silvestre, que causa que al menos una estructura de bucle de la variante de ARN polimerasa experimente un cambio conformacional a una estructura de hélice a medida que la variante de ARN polimerasa pasa de un complejo de iniciación a un complejo de elongación, (b) trifosfatos de nucleósidos, y (c) una caperuza de trinucleótido que comprende la secuencia GpppA<2>'OmepG, en condiciones de reacción de transcripciónin vitropara producir un transcrito de ARN, en donde el molde de polinucleótido incluye un residuo de 2'-desoxitimidina en la posición del molde 1.

En algunos aspectos, la divulgación proporciona un método para efectuar una reacción de TIV, que comprende poner en contacto un molde de ADN con una variante de ARN polimerasa de la divulgación en presencia de trifosfato de nucleósido y tampón en condiciones que dan como resultado la producción de transcritos de ARN. En algunas realizaciones, el ARN producido, cuando se suministra a las células, opcionalmente en forma no purificada, estimula una respuesta de citocinas que es al menos un 50 % menor con respecto al transcrito de ARNbc producido usando una WT. En algunas realizaciones, menos de un 30 % de los transcritos de ARN producidos por la reacción de TIV exhiben heterogeneidad 3'.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra cromatogramas de HPLC a 260 nm de ARNm de eritropoyetina humana (hEPO) generado usando polimerasa T7 de tipo silvestre (WT) o variantes de polimerasa T7, G47<a>* (con G C-terminal) y S43A* (con G C-terminal).

La FIG 2, panel izquierdo, muestra un gráfico que representa la respuesta de IFNp en fibroblastos BJ transfectados con transcrito de ARN de hEPO químicamente no modificado producido usando ARN polimerasa WTT7 o una de las variantes de ARN polimerasa T7, S43A* (con G C-terminal) o G47A* (con G C-terminal), con o sin purificación en fase inversa (RP). la FIG. 2, panel derecho, muestra un gráfico que representa la expresión de hEPO en células transfectadas.

La FIG. 3, panel superior, muestra un gráfico que representa la respuesta de IFNp en fibroblastos BJ transfectados con transcritos de ARN de hEPO químicamente modificados (modificaciones de Nl-metilpseudouracilo (m1^ )) producidos usando ARN polimerasa WTT7 o una de las variantes de ARN polimerasa T7, S43A* (con G C-terminal) o G47A* (con G C-terminal), con o sin purificación en fase inversa (RP). La FIG. 3, panel inferior, muestra un gráfico que representa la respuesta de IFNp en fibroblastos BJ transfectados con transcrito de ARN de hEPO químicamente modificados (modificaciones de 5-metoxiuridina (mo5U)) producidos usando ARN polimerasa WTT7 o una de las variantes de ARN polimerasa T7, S43A* (con G C-terminal) o G47A* (con G C-terminal), con o sin purificación en fase inversa (RP).

La FIG. 4, paneles superior e inferior, muestran gráficos que representan la expresión de hEPO en células transfectadas con los transcritos de ARN de hEPO usados para la FIG. 3. La expresión de hEPO modificada con N1-metilpseudouracilo (m1^ ) se muestra en el gráfico superior y la expresión de hEPO modificada con 5-metoxiuridina (mo5U) se muestra en el gráfico inferior.

La FIG. 5 muestra un gráfico de la respuesta de IP10 en macrófagos derivados de monocitos transfectados con transcrito de ARN de hEPO químicamente no modificado producido usando ARN polimerasa T7 WT o variantes de ARN polimerasa T7, S43A* (con G C-terminal) o G47A* (con G C-terminal).

La FIG. 6, panel superior, muestra un gráfico que representa la respuesta de IP10 en macrófagos derivados de monocitos transfectados con transcrito de ARN de hEPO químicamente modificado (Nl-metilpseudouracilo (m'V)) producido usando ARN polimerasa WTT7 o una de las variantes de ARN polimerasa T7, S43A* (con G C-terminal) o G47A* (con G C-terminal). La FIG. 6, panel inferior, muestra un gráfico que representa la respuesta de IP10 en macrófagos derivados de monocitos transfectados con transcrito de ARN de hEPO químicamente modificado (5-metoxiuridina (mo5U)) producido usando ARN polimerasa WTT7 o una de las variantes de ARN polimerasa T7, S43A* (con G C-terminal) o G47A* (con G C-terminal).

La FIG. 7 muestra gráficos que representan la concentración de ARN bicatenario (bc) contaminante detectado usando un ELISA de ARNbc con 1 |jg de transcrito de ARN de hEPO químicamente no modificado (izquierda) o 5 |jg de transcrito de ARN de hEPO químicamente no modificado producido mediante reacción de TIV usando ARN polimerasa T7 WT o variantes de ARN polimerasa T7, S43A* (con G C-terminal) o G47A* (con G C-terminal).

La FIG. 8 muestra gráficos que representan la concentración de ARNbc contaminante detectado usando un ELISA de ARNbc con transcrito de ARN de hEPO modificado químicamente (modificación Nl-metilpseudouracilo (m1^ ), superior; modificación 5-metoxiuridina (mo5U), inferior).

Las FIG. 9A-9B muestran resultados de cromatograma de masas de una digestión de cola de ARNasa T1 de un transcrito de ARN de hEPO producido usando ARN polimerasa T7 WT o variantes de ARN polimerasa T7, S43A* (con G C-terminal) o G47A* (con G C-terminal). La FIG. 9A muestra los resultados de un análisis de LCMS. La FIG. 9B muestra la cuantificación de la distribución de la población del extremo 3' de la FIG. 9A.

La FIG.10 muestra un esquema de las estructuras de hélice C y bucle de enlazador C que cambian su conformación a estructuras de hélice C y hélice de bucle C a medida que la ARN polimerasa T7 pasa del complejo de iniciación al complejo de elongación.

La FIG. 10 se generó a partir de las estructuras cristalinas de PDB 1MSW y 1QLN y se representó en Molecular Operating Environment [Chemical Computing Group ULC].

La FIG. 11A muestra un esquema del uso de un puente de ADN en presencia de ligasa para ligar un transcrito de ARN "de lado izquierdo" producido por TIV a una señal poliA marcada fluorescentemente "de lado derecho". Incluso un solo nucleótido protuberante en el sitio de ligación anula la ligación de manera eficiente. La FIG. 11B es un gel de PAGE-D que muestra la eficacia de ligación para los lados derechos producidos con variantes de ARN polimerasa T7 WT y ARN polimerasa T7, G47A* (con G C-terminal) o S43A* (con G C-terminal).

La FIG. 12 muestra un gel radiactivo que usa 32P-GTP para marcar transcritos abortivos o 32P-CTP para marcar complementos inversos. Las TIV se efectuaron usando un transcrito modelo corto. Estos datos demuestran que las variantes de la ARN polimerasa T7 S43A* (con G C-terminal) y G47A* (con G C-terminal) reducen la formación de complemento inverso.

La FIG. 13 es un esquema de un método convencional para producir un ARNm con caperuza mediante transcripciónin vitro.

Las FIG. 14A-14E son gráficos que muestran los resultados de un ensayo de adición de caperuza cotranscripcional usando ARN polimerasa T7 de tipo silvestre o una variante de ARN polimerasa T7 de la presente divulgación (G47A*). La FIG. 14A muestra ejemplos de caperuzas de dinucleótido (cap1 de Vaccinia) o de trinucleótido (GAG o GmAG). Se usaron caperuzas de trinucleótidos en el ensayo de adición de caperuza cotranscripcional. La FIG. 14B muestra los rendimientos de ARNm del ensayo de adición de caperuza cotranscripcional. La FIG 14C muestra que los ARNm producidos en el ensayo de adición de caperuza cotranscripcional tenían una alta integridad. La FIG. 14D muestra que los ARNm con caperuza producidos por la ARN polimerasa T7 WT inducían la producción de citocinas en fibroblastos BJ, mientras que los ARNm con caperuza producidos por la variante G47A* de la ARN polimerasa T7 (con G C-terminal), sorprendentemente, no inducían la producción de citocinas. La FIG. 14E muestra que los ARNm con caperuza producidos por la ARN polimerasa T7 WT no expresaban la proteína codificada (hEPO) en fibroblastos BJ, mientras que los ARNm con caperuza producidos por la variante G47A* de la ARN polimerasa T7 (con G C-terminal) conducen a un nivel de expresión de hEPO comparable al control. El control es un ARNm producido por la ARN polimerasa WTT7 y con caperuza cap1 de Vaccinia.

La FIG. 15 muestra los resultados del análisis de espectrometría de masas por LC del ARNm producido en el ensayo de adición de caperuza cotranscripcional. El resultado muestra inesperadamente que la variante G47A* de la ARN polimerasa T7 (con G C-terminal) producía un ARNm más limpio que la ARN polimerasa T7 WT. Las tasas de incorporación de trinucleótidos parecían equivalentes para ambas enzimas.

Las FIG. 16A y 16B son gráficos que comparan la respuesta de citocinas (FIG. 16A) o expresión (FIG. 16B) de ARNm producidos y con caperuza de trinucleótido GAG en el ensayo de adición de caperuza cotranscripcional o con caperuza de un ensayo de adición de caperuza estándar con capí de Vaccinia.

La FIG. 17 es un esquema que muestra el ensayo de adición de caperuza cotranscripcional descrito en el presente documento usando la variante G47A* de la ARN polimerasa T7 y una caperuza de trinucleótido m7GpppA<2>'OmepG.

Las FIG. 18A y 18B son resultados de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LCMS) que muestran la comparación de la eficacia de adición de caperuza para ARNm que comienzan con 5'ATP o 5'GTP. La FIG. 18A muestra el análisis de ARNm intactos. La FIG. 18B muestra el análisis de los extremos 5' de los ARNm escindidos por la ARNasa H.

Las FIG. 19A-19C son gráficos que muestran el análisis de ARNm modificado químicamente con 1-metilpseudouridina producido a partir de moldes de fragmentos de PCR para tres constructos modelo (hEPO, luciferasa y eGFP). La FIG.

19A muestra que los ARNm tienen la misma secuencia, según se analiza mediante el ensayo de huella genética de ARNasa T1. La FIG. 19B muestra que los ARNm tienen un alto grado de integridad. La FIG. 19C muestra que los ARNm no inducían respuesta de citocinas en fibroblastos BJ.

Las FIG. 20A-20F son gráficos que muestran el análisis de ARNm modificados químicamente con 1-metilpseudouridina producidos a partir de moldes de fragmentos de plásmidos para tres constructos modelo (hEPO, luciferasa y eGFP). Se muestra el consumo de NTP en los ensayos de adición de caperuza cotranscripcional usando plásmidos de hEPO (FIG. 20A) o plásmidos de eGFP (FIG. 20B) como moldes. La FIG. 20C muestra que los productos de ARNm tienen una alta integridad. La FIG 20D muestra la respuesta de citocinas de los productos de ARNm. La FIG. 20E muestra la expresión de ARNm que codifica hEPO en fibroblastos BJ. La FIG. 20F muestra la expresión de ARNm que codifica luciferasa (Luc) en fibroblastos BJ. La FIG. 20G muestra la expresión de ARNm que codifica eGFP en fibroblastos BJ.

La FIG. 21 es un gráfico que muestra que más de un 85 % (p. ej. -90 %) de los transcritos de ARNm producidos usando la variante G47A* de ARNP T7 que comprende una glicina C-terminal (G) tienen un grupo hidroxilo en el extremo 3'.

La FIG. 22 muestra la producción de ARNm de hEPO no modificado a partir de reacciones de TIV que contienen variantes de ARNP WT o G47A T7, algunas de las cuales tienen aminoácidos adicionales en el extremo C (p. ej., una o dos glicinas o dos alaninas).

La FIG. 23 muestra la producción de ARNm de hEPO modificado con 1-metilpseudouridina a partir de reacciones de TIV que contienen variantes de ARNP T7 WT, G47A o S43A/G47A como se indica, algunas de las cuales tienen aminoácidos adicionales en el extremo C (p. ej., una o dos glicinas o dos alaninas).

Las FIG. 24A-24D muestran resultados de una digestión de cola de ARNasa T1 del transcrito de ARNm de hEPO producido usando variantes de ARNP T7 WT, G47A o S43A/G47A como se indica, algunas de las cuales tienen aminoácidos adicionales en el extremo C terminal (p. ej., una o dos glicinas o dos alaninas). La FIG. 24A muestra los resultados de un análisis de LCMS de ARNm de hEPO producido a partir de reacciones de TIV usando ARNP T7 WT con concentraciones equimolares de NTP (WT EQ), ARNP T7 WT con exceso de GTP y ATP (WT alfa), o ARNP T7 G47A* con una glicina C-terminal adicional con concentraciones equimolares de NTP (G47A* EQ). La FIG. 24B muestra la cuantificación de la distribución de la población del extremo 3' de la FIG. 24A. La FIG. 24C muestra el porcentaje de poblaciones de extremo 3' limpio producidas en reacciones de TIV usando ARNm no modificado. La FIG. 24D muestra el porcentaje de poblaciones de extremo 3' limpio producidas en reacciones de TIV usando ARNm modificado con 1-metilpseudouridina.

Las FIG. 25A-25B son gráficos que comparan la respuesta de citocinas de fibroblastos BJ con ARNm no modificados (FIG. 25A) y modificados con 1-metilpseudouridina (FIG. 25B) producidos a partir de reacciones de TIV que contienen variantes de ARNP T7 WT, G47A o S43A/G47A como se indica, algunas de las cuales tienen sustituciones en el extremo C.

Las FIG. 26A-26B muestran ARNm radiomarcados producidos a partir de reacciones de TIV que contienen variantes de ARNP T7 WT o G47A como se indica, algunas de las cuales tienen aminoácidos adicionales en el extremo C-terminal. Los productos de ARNm de TIV se separan por tamaño en un gel desnaturalizante de poliacrilamida. En la FIG. 26A, el ARNm no modificado o modificado con 1-metilpseudouridina está radiomarcado con 32P-CTP. En la FIG.

26B, el ARNm del complemento inverso está radiomarcado con 32P-CTP.

Las FIG. 27A y 27B muestran gráficos de datos que demuestran que los ARNm de G47A* con caperuza trinuc que codifican la luciferasa de luciérnaga (ffLuc) inducen niveles de citocina sérica IP-10in vivoen el día 1 (FIG. 27A) y el día 29 (FIG. 27B) que son similares a los controles de ARNm.

Las FIG. 28A y 28B muestran gráficos de datos que demuestran que los ARNm de G47A* con caperuza trinuc que codifican ffLuc inducen niveles basales de citocinasin vitroen fibroblastos BJ (BJF) (FIG. 28A) y en macrófagos derivados de monocitos (MDM) (FIG. 28B) que son similar a los controles de ARNm.

La FIG. 29 muestra un gráfico de datos que demuestra que los ARNm de G47A* con caperuza trinuc que codifican ffLuc mantienen una alta expresiónin vivodespués de seis (6) dosis semanales.

La FIG. 30 muestra un gráfico de datos que demuestran que los ARNm de G47A* con caperuza trinuc que codifican ffLuc inducen niveles bajos de IgM anti-PEG después de seis (6) dosis semanales.

La FIG. 31 muestra un gráfico de datos que demuestra que los ARNm de G47A* con caperuza trinuc que codifican ffLuc exhiben una baja activación de células B, similar a los controles de ARNm.

Las FIG. 32A y 32B muestran gráficos de datos que demuestran que los ARNm de G47A* con caperuza trinuc que codifican la eritropoyetina humana (hEPO) inducen niveles de citocina sérica IP-10in vivoen el día 1 (FIG. 32A) y el día 22 (FIG. 32B) que son similares a los controles de ARNm.

Las FIG. 33A y 33B muestran gráficos de datos que demuestran que los ARNm de G47A* con caperuza trinuc que codifican hEPO inducen niveles basales de citocinasin vitroen fibroblastos BJ (BJF) (FIG. 33A) y en macrófagos derivados de monocitos (MDM) (FIG. 33B) que son similares a los controles de ARNm.

La FIG. 34 muestra un gráfico de datos que demuestra que los ARNm de G47A* con caperuza trinuc que codifican hEPO mantienen una alta expresiónin vivodespués de seis (6) dosis semanales.

La FIG. 35 muestra un gráfico de datos que demuestran que los ARNm de G47A* con caperuza trinuc que codifican hEPO inducen niveles bajos de IgM anti-PEG después de seis (6) dosis semanales.

La FIG. 36 muestra un gráfico de datos que demuestra que los ARNm de G47A* con caperuza trinuc que codifican hEPO exhiben una baja activación de células B, similar a los controles de ARNm.

Las FIG. 37A y 37B muestran que la variante de ARN polimerasa T7 G47A* no afecta la frecuencia de indeles (FIG.

37A) o la frecuencia de mutación puntual (FIG. 37B).

Descripción detallada adicional

La presente divulgación proporciona variantes de ARN polimerasa (ARNP) que aumentan la eficiencia de la transcripción y la homogeneidad 3' al tiempo que reducen el número de transcritos continuos y/o contaminantes bicatenarios producidos durante una reacción de transcripciónin vitro(TIV), por ejemplo. Estas variantes de ARNP, que pueden incluir una sustitución de un solo aminoácido, facilitan la transición conformacional de ARNP del complejo de iniciación al complejo de elongación, reduciendo así muchos de los problemas asociados con la fase de iniciación de la transcripción.

En el presente documento se proporcionan resultados experimentales inesperados que demuestran que la modificación o modificaciones de la hélice C N-terminal y/o de la estructura o estructuras del enlazador C de la ARN polimerasa dependiente de ADN (es decir, ARN polimerasa T7) impulsan el equilibrio de conformación de la polimerasa hacia el complejo de elongación, facilitando la liberación del promotor del molde de ADN y el comienzo de una fase de elongación altamente procesiva. Sorprendentemente, el uso de las variantes de polimerasa proporcionadas en el presente documento en reacciones de VIT reduce la heterogeneidad 3' entre los transcritos producidos y también reduce (o elimina) la producción de contaminantes bicatenarios. Además, los resultados muestran que los niveles de pureza y expresión de los transcritos producidos usando las variantes de polimerasa son comparables a los de los transcritos producidos usando polimerasa de tipo silvestre.

Por tanto, el uso de las variantes de ARN polimerasa de la presente divulgación reduce muchos de los problemas asociados con los productos de reacción de VIT. Aunque la ARN polimerasa T7 (ARNP) de tipo silvestre se usa comúnmente tanto en la industria como en el mundo académico, varias de sus actividades comprometen significativamente la pureza de los transcritos de ARN resultantes. En particular, el uso de esta enzima ARNP T7 de tipo silvestre da como resultado la adición sin molde de nucleótidos al extremo 3' de los transcritos de ARN. Por ejemplo, la ARNP T7 de tipo silvestre coloca al menos 1, y a menudo 2 o más, nucleótidos sin molde en el extremo 3' con aparentemente poca preferencia por la identidad de las nucleobases. Sorprendentemente, las variantes de ARNP T7 proporcionadas en el presente documento reducen la aparición de heterogeneidad 3'. En la presente invención, la variante de ARN polimerasa T7 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO:1 modificada para incluir una sustitución de aminoácido G47A.

En algunas realizaciones, menos de un 30 % de los transcritos de ARN producidos por VIT usando una variante de ARN polimerasa de la presente divulgación exhiben heterogeneidad 3'. En algunas realizaciones, menos de un 20 % (p. ej., menos de un 15 %, 10 % o 5 %) de los transcritos de ARN producidos por VIT usando una variante de ARN polimerasa de la presente divulgación exhiben heterogeneidad 3'. En algunas realizaciones, 1-20 %, 1-15 %, 1-10%o 1-5 % de los transcritos de ARN producidos por VIT exhiben heterogeneidad 3'. En algunas realizaciones, menos de un 1 % de los transcritos de<a>R<n>producidos por VIT usando una variante de ARN polimerasa de la presente divulgación exhiben heterogeneidad 3'.

Por tanto, el uso de las variantes de ARN polimerasa de la presente divulgación, por ejemplo, en una reacción de VIT, da como resultado la producción de un transcrito de ARN "más limpio" (una población de transcritos de ARN con heterogeneidad reducida/homogeneidad aumentada en el extremo 3'). En algunas realizaciones, al menos un 70 % de los transcritos de ARN producidos usando las variantes de ARN polimerasa de la presente divulgación exhiben homogeneidad 3'. En algunas realizaciones, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de los transcritos de ARN producidos usando las variantes de ARN polimerasa de la presente divulgación exhiben homogeneidad 3'. En algunas realizaciones, al menos un 90 % de los transcritos de ARN producidos usando las variantes de ARN polimerasa de la presente divulgación exhiben homogeneidad 3'. En algunas realizaciones, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o al menos al menos un 99% de los transcritos de ARN producidos usando las variantes de ARN polimerasa de la presente divulgación exhiben homogeneidad 3'.

Además, en el presente documento fueron sorprendentes los resultados que demuestran que los transcritos de ARN producidos usando variantes de ARN polimerasa T7 con sustituciones de aminoácidos (p. ej., S43A y/o G47A de SEQ ID NO:1) o adiciones C-terminales (p. ej., WT, S43A*, y/o G47A* con una o más adiciones de aminoácidos), cuando se suministran a las células, opcionalmente en forma no purificada (p. ej., no purificada mediante cromatografía de fase inversa), estimulan una respuesta de citocinas que es menor con respecto al ARN producido usando ARN polimerasa de tipo silvestre. En la invención, la variante de ARN polimerasa T7 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO:1 modificada para incluir una sustitución de aminoácido G47A.

En algunas realizaciones, no hay respuesta de citocina detectable de las células que han recibido un transcrito de ARN producido usando una polimerasa variante de ARN T7 de la presente divulgación. En algunas realizaciones, el ARN producido usando una variante de ARN polimerasa estimula una respuesta de citocinas que es al menos un 50 % (p. ej., 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %) menor con respecto al ARN producido usando ARN polimerasa de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el ARN producido usando una variante de ARN polimerasa estimula una respuesta de citocinas que es un 50-60 %, 50-70 %, 50-80 %, 50-90 %, 50-100 %, 60-70 %, 60-80 %, 60-90 %, 60-100 %, 70-80 %, 70-90 %, 70-100 %, 80-90 %, 80-100 % o 90-100 % menor con respecto al ARN producido usando ARN polimerasa de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el ARN producido usando una variante de ARN polimerasa estimula una respuesta de citocinas que es al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces menor con respecto al ARN producido usando ARN polimerasa de tipo silvestre. En algunas realizaciones, las células usadas para probar una respuesta de citocinas son células de fibroblastos humanos (p. ej., células BJ (ATCC® CRL-2522™)). En algunas realizaciones, las células usadas para probar una respuesta de citocinas son macrófagos derivados de monocitos (MDM).

En algunas realizaciones, la concentración de transcrito de ARNbc producido usando una variante de ARN polimerasa es al menos un 50 % (por ejemplo, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %) menor con respecto al transcrito de ARNbc producido usando polimerasa de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la concentración de transcrito de ARNbc producido es un 50-60 %, 50-70 %, 50-80 %, 50-90 %, 50-100 %, 60-70 %, 60 80 %, 60-90 %., 60-100 %, 70-80 %, 70-90 %, 70-100 %, 80-90 %, 80-100 % o 90-100 % menor con respecto al transcrito de ARNbc producido usando polimerasa de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la concentración de transcrito de ARNbc producido es al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces menor con respecto al transcrito de ARNbc producido usando polimerasa de tipo silvestre.

El uso de las variantes de ARN polimerasa de la presente divulgación también daba como resultado inesperadamente la producción de contaminantes bicatenarios y menos transcritos continuos.

En algunas realizaciones, menos de un 50 % (por ejemplo, menos de un 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % o 1 %) del transcrito de ARN producido, por ejemplo, mediante VIT, usando una variante de ARN polimerasa es un contaminante bicatenario. En algunas realizaciones, un 1-50 %, 1-40 %, 1-30 %, 1-20 %, 1-10 %, 1-5 %, 5-50 %, 5-40 %, 5-30 %, 5 -20 %, 5-10 %, 10-50 %, 10-40 %, 10-30 % o 10-20 % del transcrito de ARN producido es contaminante bicatenario.

En algunas realizaciones, menos de un 50% (por ejemplo, menos de un 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % o 1 %) del transcrito de ARN producido usando una variante de ARN polimerasa es transcrito de ARN continuo. En algunas realizaciones, un 1-50 %, 1-40 %, 1-30 %, 1-20 %, 1-10 %, 1-5 %, 5-50 %, 5-40 %, 5-30 %, 5 -20 %, 5-10 %, 10-50 %, 10-40 %, 10-30 % o 10-20 % del transcrito de ARN producido es transcrito de ARN continuo.

En algunas realizaciones, la cantidad de transcrito de ARN de longitud completa producido usando una variante de ARN polimerasa es al menos 15 veces mayor que la cantidad de molde de ADN. Por ejemplo, la cantidad de transcrito de ARN de longitud completa producida puede ser al menos 20, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces mayor que la cantidad de molde de ADN. En algunas realizaciones, la cantidad de transcrito de ARN de longitud completa producido es 15-100, 15-90, 15-80, 15-70, 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-20, 20-100, 20-90, 20-80, 20-70, 20-60, 20 50, 20-40 o 20-30 veces mayor que la cantidad de molde de ADN. En algunas realizaciones, la cantidad de transcrito de ARN de longitud completa producido es 2 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces mayor que la cantidad de molde de ADN.

En algunas realizaciones, la relación de contaminante bicatenario:transcrito de ARN de longitud completa producido usando una variante de ARN polimerasa es menor de 1:1. Por ejemplo, la relación de contaminante bicatenario:transcrito de ARN de longitud completa producido puede ser 0,9:1, 0,8:1, 0,7:1, 0,6:1, 0,5:1, 0,4:1, 0,3:1, 0,2:1 o 0,1:1.

En algunas realizaciones, el transcrito de ARN producido utilizando una variante de ARN polimerasa tiene menos de 1 mutación por cada 100 nucleótidos con respecto al molde de ADN. Por ejemplo, el transcrito de ARN producido puede tener menos de 1 mutación por 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 nucleótidos con respecto al molde de ADN.

ARN polimerasas

La ARN polimerasa (ARN polimerasa dependiente de ADN) es una enzima que cataliza la adición secuencial de un ribonucleótido al extremo 3' de una cadena de ARN en crecimiento (transcripción de ARN en la dirección 5' ^ 3'), con trifosfatos de nucleósidos (NTP) actuando como sustratos de la enzima y con la secuencia de nucleótidos especificada por un molde de ADN. La transcripción se basa en el emparejamiento complementario de bases. Las dos hebras de una doble hélice se separan localmente y una de las hebras separadas sirve como molde (molde de ADN). Luego, la ARN polimerasa cataliza el alineamiento de los nucleótidos libres en el molde de ADN mediante sus bases complementarias en el molde. Por tanto, se considera que una ARN polimerasa tiene actividad de ARN polimerasa si la polimerasa cataliza la adición secuencial de un ribonucleótido al extremo 3' de una cadena de ARN en crecimiento.

La ARN polimerasa T7 (ARNP T7) es una ARN polimerasa dependiente de ADN de 99 kDa codificada por el genoma del bacteriófago T7 y es altamente específica para los promotores del fago T7. Los estudios estructurales de ARNP T7 han mostrado que la conformación del dominio N-terminal cambia sustancialmente entre la fase de iniciación y la fase de elongación de la transcripción. El dominio N-terminal comprende un subdominio de hélice C y el dominio de unión al promotor, que incluye dos segmentos separados por el subdominio H. El dominio de unión al promotor y el promotor unido giran aproximadamente 45 grados tras la síntesis de un transcrito de ARN de 8 nt, lo que permite mantener los contactos del promotor mientras el sitio activo se expande para dar cabida a un heterodúplex en crecimiento. El subdominio de hélice C se mueve moderadamente hacia su conformación de elongación, mientras que el subdominio H permanece en su localización de fase de iniciación, en lugar de elongación, a más de 70 angstroms de distancia. La comparación de las estructuras de los complejos de iniciación y elongación de la ARNP T7 revela cambios conformacionales extensos dentro de los 267 residuos N-terminales (dominio N-terminal) y pocos cambios en el resto de la ARNP. Una rotación del cuerpo rígido del dominio de unión al promotor, así como el replegamiento de los subdominios de hélice C N-terminal (residuos 28-71) y H (residuos 151-190) son responsables de la anulación del sitio de unión al promotor, la ampliación del sitio activo y la creación de un túnel de salida para el transcrito de ARN. Los cambios estructurales dentro del dominio N-terminal dan cuenta del aumento de estabilidad y procesividad del complejo de elongación (véase, p. ej., Durniak, KJ et al., Science 322(5901): 553-557, 2008).

En el presente documento, en algunos aspectos, se proporcionan variantes de ARN polimerasa (es decir, variantes de ARNP T7) que facilitan el cambio conformacional del complejo de iniciación de ARNP al complejo de elongación de ARNP. Una variante de ARN polimerasa es una enzima que tiene actividad de ARN polimerasa y al menos una sustitución con respecto a la contrapartida de ARN polimerasa de tipo silvestre. Como se indica anteriormente, se considera que una ARN polimerasa tiene actividad de ARN polimerasa si la polimerasa cataliza la adición secuencial de un ribonucleótido al extremo 3' de una cadena de ARN en crecimiento. Por ejemplo, una enzima que incluye la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 con una sustitución de aminoácido en la posición S43 (p. ej., S43A) o G47 (p. ej., G47A) y mantiene la actividad de ARN polimerasa se considera una variante de ARNP T7 de la ARNP T7 de tipo silvestre<( S e Q>ID NO:1).

Una variante de ARN polimerasa puede comprender al menos una modificación de aminoácido, con respecto a la ARN polimerasa de tipo silvestre, que causa que al menos una estructura de bucle tridimensional de la variante de ARN polimerasa experimente un cambio conformacional a una estructura de hélice a medida que la variante de ARN polimerasa pasa de un complejo de iniciación a un complejo de elongación. Por tanto, al menos una modificación de aminoácido puede tener una alta propensión a la hélice, con respecto al aminoácido de tipo silvestre.

Los ejemplos de estructuras de bucle incluyen, pero sin limitación, los aminoácidos (aa) 42-47 en la estructura de hélice C (p. ej., aa 28-71 de SEQ ID NO:1) de la conformación del complejo de iniciación (CI) de la ARN polimerasa T7 y los aa 257-262 en la estructura del enlazador C (p. ej., aa 258-266 de SEQ ID NO:1) del CI. En la invención, la variante de ARN polimerasa T7 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO:1 modificada para incluir una sustitución de aminoácido G47A.

También se proporcionan en el presente documento variantes de ARN polimerasa (es decir, variantes de ARNP T7) que incluyen al menos un aminoácido adicional en el extremo C terminal. El al menos un aminoácido adicional, en algunas realizaciones, se selecciona de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina. En algunas realizaciones, el al menos un aminoácido adicional es un aminoácido polar. En algunas realizaciones, el al menos un aminoácido adicional es un aminoácido no polar. En algunas realizaciones, el al menos un aminoácido adicional es glicina. En algunas realizaciones, el al menos un aminoácido adicional es alanina. En algunas realizaciones, el al menos un aminoácido adicional es serina.

En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFAXn (SEQ ID NO:294), en donde x es cualquier aminoácido yn es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5 (p. ej., 1, 2, 3, 4 o 5). En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFAGn (SEQ ID NO:295), en donde n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5. En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFAAn (SEQ ID NO: 296), en donde n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5. En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFARn ( SEQ ID NO:297), en donde n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5. En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFANn (SEQ ID NO:298), en donde n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5. En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFADn (SEQ ID NO: 299), en donde n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5. En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFACn (SEQ ID NO:300), en donde n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5. En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFAEn (SEQ ID NO: 301), en donde n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5. En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFAQn ( SEQ ID NO:302), en donde n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5. En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFAHn (SEQ ID NO:303), en donde n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5. En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFAIn (SEQ ID NO: 304), en donde n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5. En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFALn (SEQ ID NO:305), n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5. En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFAKn (SEQ ID NO: 306), en donde n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5. En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFAMn (SEQ ID NO:307), en donde n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5. En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFAFn (SEQ ID NO:308), en donde n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5. En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFAPn (SEQ ID NO:309), en donde n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5. En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFASn (SEQ ID NO:310), en donde n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5. En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFATn (SEQ ID NO:311), en donde n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5. En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFAWn (SEQ ID NO:312), en donde n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5. En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFAYn (SEQ ID NO:313), n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5. En algunas realizaciones, el extremo C de una ARN polimerasa comprende la siguiente secuencia consenso: FAFAVn (SEQ ID NO: 314), en donde n es cualquier número entero, p. ej., entre 1 y 5.

En algunas realizaciones, el motivo C-terminal (FAFA o FAFAXn) comprende una sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones 880, 881, 882 u 883, con respecto a la ARNP de T7 de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NO:1). Por tanto, la presente divulgación comprende diversos motivos C-terminales f880A881F882A883, en donde el aminoácido en una o más de las posiciones 880, 881,882 u 883 con respecto a la ARNP T7 de tipo silvestre, (p. ej., de SEQ ID NO:1) se modifica para incluir al menos una sustitución de aminoácido, con o sin un aminoácido C-terminal adicional (Xn).

Sustituciones de aminoácidos

Las variantes de ARN polimerasa de la presente divulgación incluyen al menos una sustitución de aminoácido, con respecto a la ARN polimerasa WT. Por ejemplo, con referencia a la ARN polimerasa T7 WT que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, la serina en la posición 43 se considera un "aminoácido de tipo silvestre", mientras que una sustitución de la serina por alanina en la posición 43 se considera una "sustitución de aminoácido" que tiene una alta propensión a la hélice. En la invención, la variante de ARN polimerasa T7 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO:1 modificada para incluir una sustitución de aminoácido G47A.

La proteína globular promedio contiene un 30 % de a-hélice, el tipo más común de estructura secundaria. Algunos aminoácidos aparecen con más frecuencia en las hélices a que otros; esta tendencia se conoce como propensión a la hélice. Véase, por ejemplo, Pace, NC y Scholtz, JM Biophysical Journal, 75:422-427 (1998). Al menos una sustitución de aminoácido puede tener una alta propensión a la hélice, con respecto al aminoácido de tipo silvestre. En general, las sustituciones de aminoácidos con alta propensión a la hélice se seleccionan para sesgar termodinámicamente la población de confórmeros de polimerasa hacia el complejo de elongación. Las AAG (energías libres) relativas se calculan para sustituciones en las estructuras de CI y del complejo de elongación (CE) usando software disponible públicamente (p. ej., Rosetta de la Universidad de Washington y Maestro de Schrodinger). Luego se seleccionan las sustituciones basándose en los cálculos y en conocimientos adicionales, incluyendo, por ejemplo, la propensión a la hélice de los aminoácidos y/o la compatibilidad phi-psi de la cadena principal del polipéptido.

En el presente documento se divulga una variante de ARN polimerasa que es una variante de ARN polimerasa T7 que comprende al menos una (una o más) sustitución de aminoácido con respecto a la ARN polimerasa T7 WT (por ejemplo, la ARN polimerasa T7 WT que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1). La sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución de aminoácidos con alta propensión a la hélice. Los ejemplos de aminoácidos con alta propensión a la hélice incluyen alanina, isoleucina, leucina, arginina, metionina, lisina, glutamina y/o glutamato.

La variante de ARN polimerasa puede ser una variante de ARN polimerasa T7 que comprende al menos un aminoácido adicional en el extremo C (p. ej., de SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:294, SEQ ID NO:295, o SEQ ID NO:296, o una secuencia de aminoácidos que comparte un 90%-99 %, p. ej., al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de identidad con las SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:294, SEQ ID NO:295 o SEQ ID NO:296). La variante de ARN polimerasa puede ser una variante de ARN polimerasa T7 que comprende al menos un aminoácido adicional en el extremo C terminal y una sustitución de aminoácido con respecto a la ARN polimerasa T7 WT. La sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución de aminoácidos con alta propensión a la hélice. En la invención, la variante de ARN polimerasa T7 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO:1 modificada para incluir una sustitución de aminoácido G47A.

En el presente documento se proporcionan dos enfoques que pueden usarse para identificar sustituciones de aminoácidos con propensión a la hélice alta o superior que favorecen/sesgan termodinámicamente el equilibrio conformacional hacia el CE. En ambos enfoques, se tiene cuidado de evitar realizar sustituciones de aminoácidos en cualquier posición que esté directamente implicada en la unión o catálisis del promotor (basándose en la revisión de las estructuras y búsquedas bibliográficas). En el Método A, se usa un software especializado para calcular el cambio en la energía libre del plegamiento de proteínas debido a la mutación(AAGmut)en CE y CI. Mediante este método se evalúan todas las posibles sustituciones de aminoácidos en las posiciones de secuencia deseadas. Las sustituciones de aminoácidos deseadas (es decir, aquellas que favorecen al CE sobre el CI) son aquellas para las cuales la diferenciaAAGmut (ááG<¡^ u t - ááG<^ut)es negativa. En el Método B, las anotaciones de las estructuras secundarias de CI y CE (p. ej., según lo determinado a partir de modelos 3D de estructuras terciarias de CI y CE usando el software DSSP (Dictionary of protein secondary structure: pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features. Kabsch W, Sander C, Biopolymers. 198322 2577-2637)) se inspeccionan para identificar regiones con un bucle en el CI y una hélice en el CE. Las posiciones de secuencia con residuos de baja propensión a la hélice (p. ej., Gly) se sustituyen después por aminoácidos con alta propensión a la hélice (p. ej., Ala). Para ARNP T7, por ejemplo, se identificó la superposición mutacional (p. ej., sustitucional) de los Métodos A y B, así como la variante superior del Método B.

En el presente documento se divulga una sustitución de aminoácido que es una sustitución de un aminoácido con alta propensión a la hélice (p. ej., alanina, isoleucina, leucina, arginina, metionina, lisina, glutamina y/o glutamato) en una cualquiera de las posiciones de aminoácidos 42-47 (E42, S43, Y44, E45, M46 y/o G47) de SEQ<i>D NO:1. La sustitución de aminoácido puede ser una sustitución de un aminoácido con alta propensión a la hélice (p. ej., alanina, isoleucina, leucina, arginina, metionina, lisina, glutamina y/o glutamato) en cualquiera de las posiciones de aminoácidos 42-47 (E42, S43, Y44, E45, M46 y/o G47) de una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO:1. La sustitución de aminoácido puede ser una sustitución de aminoácido con alta propensión a la hélice en la posición de aminoácido 47 de SEQ ID NO:1. En la invención, la variante de ARN polimerasa T7 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO:1 modificada para incluir una sustitución de aminoácido G47A.

En el presente documento se describe una sustitución de aminoácido que es una alanina en una cualquiera de las posiciones de aminoácidos 42-47 de SEQ ID NO:1. La sustitución de aminoácido puede ser una alanina en una cualquiera de las posiciones de aminoácidos 42-47 de una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO:1. La sustitución de aminoácido puede ser una alanina en la posición 47 de SEQ ID NO:1. En la invención, la variante de ARN polimerasa T7 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO:1 modificada para incluir una sustitución de aminoácido G47A. En algunas realizaciones, una variante de ARN polimerasa T7 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3. En algunas realizaciones, una variante de ARN polimerasa T7 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 o 110.

También se proporcionan en el presente documento variantes de ARN polimerasa con al menos 2 (2 o más) sustituciones. Como se divulga en el presente documento, una ARN polimerasa puede comprender al menos 2 sustituciones de aminoácidos con alta propensión a la hélice (p. ej., alanina, isoleucina, leucina, arginina, metionina, lisina, glutamina y/o glutamato) en cualquiera de las posiciones de aminoácidos 42-47 (E42, S43, Y44, E45, M46 y/o G47) y/o las posiciones de aminoácidos 257-262 (<r>257, A258, G259, A260, L261 y/o A262) de SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO:1. En la invención, la variante de ARN polimerasa T7 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO:1 modificada para incluir una sustitución de aminoácido G47A.

Por ejemplo, una variante de ARN polimerasa puede comprender una sustitución de aminoácido (p. ej., alanina, isoleucina, leucina, arginina, metionina, lisina, glutamina y/o glutamato) en las posiciones E42 y G47, S43 y G47, Y44 y G47, E45 y G47, o M46 y G47 de SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % identidad con la SEQ ID NO:1. En la invención, la variante de ARN polimerasa T7 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO:1 modificada para incluir una sustitución de aminoácido G47A.

Una variante de ARN polimerasa puede comprender una sustitución de aminoácido (p. ej., alanina, isoleucina, leucina, arginina, metionina, lisina, glutamina y/o glutamato) en las posiciones G47 y R257, G47 y A258, G47 y G259, G47 y A260, G47 y L261 o G47 y A262 de SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO:1. En la invención, la variante de ARN polimerasa T7 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO:1 modificada para incluir una sustitución de aminoácido G47A.

En algunas realizaciones, una ARN polimerasa comprende las sustituciones de aminoácidos S43A y G47A de SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, una ARN polimerasa comprende las sustituciones de aminoácidos G47A y R257A de SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99% de identidad con la SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, una ARN polimerasa comprende las sustituciones de aminoácidos G47A y R257A de SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99% de identidad con la SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, una ARN polimerasa comprende las sustituciones de aminoácidos G47A y G259A de SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99% de identidad con la SEQ ID NO:1.

Como se divulga en el presente documento, una variante de ARN polimerasa puede comprender al menos 3 (o al menos 4 o al menos 5) sustituciones de aminoácidos con alta propensión a la hélice (p. ej., alanina, isoleucina, leucina, arginina, metionina, lisina, glutamina y/o glutamato) en una cualquiera de las posiciones de aminoácidos 42-47 (E42, S43, Y44, E45, M46 y/o G47) y/o las posiciones de aminoácidos 257-262 (R257, A258, G259, A260, L261 y/o A262) de SEQ ID NO:1 o una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO:1. En la invención, la variante de ARN polimerasa T7 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO:1 modificada para incluir una sustitución de aminoácido G47A.

El término "identidad" se refiere a la relación entre las secuencias de dos o más polipéptidos (p. ej., enzimas) o polinucleótidos, (ácidos nucleicos) según se determina comparando las secuencias. Identidad también significa el grado de similitud de secuencia entre secuencias según lo determinado por el número de coincidencias entre cadenas de dos o más residuos de aminoácidos o residuos de ácidos nucleicos. La identidad mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la menor de dos o más secuencias con alineamientos de huecos (si los hubiera) conforme a un modelo matemático o programa informático particular (p. ej., "algoritmos"). La identidad de las proteínas o ácidos nucleicos relacionados se puede calcular fácilmente mediante métodos conocidos. "Porcentaje de identidad", como se aplica a las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, se define como el porcentaje de residuos (residuos de aminoácidos o residuos de ácido nucleico) en la secuencia de aminoácidos o ácido nucleico candidata que son idénticos a los residuos en la secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico de una segunda secuencia después de alinear las secuencias e introducir huecos, de ser necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad. Los métodos y programas informáticos para el alineamiento son bien conocidos en la materia. Se entiende que la identidad depende del cálculo del porcentaje de identidad, pero puede diferir en valor debido a los huecos y las penalizaciones introducidas en el cálculo. En general, las variantes de un polinucleótido o polipéptido particular (p. ej., antígeno) tienen al menos un 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, pero menos de 100 % de identidad de secuencia con ese polinucleótido o polipéptido de referencia particular, según se determina mediante parámetros y programas de alineamiento de secuencia descritos en el presente documento y conocidos por los expertos en la materia. Tales herramientas para el alineamiento incluyen las del paquete BLAST (Stephen F. Altschul, et al. (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402"). Otra técnica popular de alineamiento local se basa en el algoritmo de Smith-Waterman (Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) "Identification of common molecular subsequences." J. Mol. Biol. 147:195-197). Una técnica general de alineación global basada en la programación dinámica es el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman, S.B. & Wunsch, C.D. (1970) "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins." J. Mol. Biol. 48: 443-453). Más recientemente, se ha desarrollado un algoritmo de alineamiento de secuencia global óptima rápida (FOGSAA en inglés) que supuestamente produce un alineamiento global de secuencias de nucleótidos y proteínas más rápidamente que con otros métodos de alineamiento global óptimo, incluyendo el algoritmo de Needleman-Wunsch.

Caperuzas de trinucleótidos

También se proporcionan en el presente documento métodos de adición de caperuza cotranscripcional para la síntesis de ácido ribonucleico (ARN). Es decir, el ARN se produce en una reacción de "un solo recipiente", sin necesidad de una reacción de adición de caperuza separada. Por tanto, los métodos de la invención comprenden hacer reaccionar un molde de polinucleótido con una variante de ARN polimerasa T7 como se expone en las reivindicaciones adjuntas, trifosfatos de nucleósidos y un análogo de caperuza en condiciones de reacción de transcripciónin vitropara producir un transcrito de ARN.

Un análogo de caperuza puede ser, por ejemplo, una caperuza de dinucleótido, una caperuza de trinucleótido o una caperuza de tetranucleótido. En algunas realizaciones, el análogo de caperuza es una caperuza de dinucleótido. En algunas realizaciones, el análogo de caperuza es una caperuza de trinucleótido. En algunas realizaciones, el análogo de caperuza es una caperuza de tetranucleótido.

Una caperuza de trinucleótido, en algunas realizaciones, comprende un compuesto de fórmula (I)

o un estereoisómero, tautómero o sal del mismo, en donde

el anillo B<1>es una guanina modificada o no modificada;

el anillo B<2>y el anillo B<3>son cada uno independientemente una nucleobase o una nucleobase modificada;

X<2>es O, S(O)p, NR<24>o CR<25>R<26>en que p es 0, 1 o 2;

Y<0>es O o CR<6>R<7>;

Y1 es O, S(O)n, CR<6>R<7>, o NR8, en que n es 0, 1 o 2;

cada — es un enlace sencillo o está ausente, en donde cuando cada — es un enlace sencillo, Yi es O, S(O)n, CR<6>R<7>, o NR8 y cuando cada — está ausente, Yi es nulo;

Y<2>es (OP(O)R4)m en que m es 0, 1 o 2, o-O-(CR4oR4i)u-Qo-(CR42R43)v-, en que Qo es un enlace, O, S(O)r, NR<44>, o CR<45>R<46>, r es 0, 1 o 2, y cada u y v es independientemente 1,2, 3 o 4;

cada R<2>y R<2>' es independientemente halógeno, LNA u OR<3>;

cada R<3>es independientemente H, alquilo C<1>-C<6>, alquenilo C<2>-C<6>, o alquinilo C<2>-C<6>y R<3>, cuando es alquilo C<1>-C<6>, alquenilo C<2>-C<6>o alquinilo C<2>-C<6>, está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, OH y alcoxilo C<1>-C<6>que está opcionalmente sustituido con uno o más de OH u OC(O)-alquilo C<1>-C<6>;

cada R<4>y R<4>' es independientemente H, halógeno, alquilo C<1>-C<6>, OH, SH, SeH o BH<3>-;

cada uno de R6, R<7>y R8, es independientemente -Q<1>-T<1>, en que Q<1>es un enlace o un enlazador alquilo C<1>-C<3>opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, ciano, OH y alcoxi C<1>-C<6>, y T<1>es H, halógeno, OH, COOH, ciano, o Rs<1>, en que Rs<1>es alquilo C<1>-C<3>, alquenilo C<2>-C<6>, alquinilo C<2>-C<6>, alcoxilo C<1>-C<6>, C(O)O-alquilo C<1>-C<6>, cicloalquilo C<3>-C<8>, arilo C<6>-C<10>, NR<31>R<32>, (NR31R32R33)+, heterocicloalquilo de 4 a 12 miembros, o heteroarilo de 5 o 6 miembros, y Rs1 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo consistente en halógeno, OH, oxo, alquilo C<1>-C<6>, COOH, C(O)O-alquilo C<1>-C<6>, ciano, alcoxilo C<1>-C<6>, NR<31>R<32>, (NR31R32R33)+, cicloalquilo C<3>-C<8>, arilo C<6>-C<10>, heterocicloalquilo de 4 a 12 miembros y heteroarilo de 5 o 6 miembros;

cada uno de R<10>, R<11>, R<12>, R<13>R<14>y R<15>es, independientemente, -Q<2>-T<2>, en que Q<2>es un enlace o un enlazador alquilo C<1>-C<3>opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, ciano, OH y alcoxi C<1>-C<6>y T<2>es H, halógeno, OH, NH<2>, ciano, NO<2>, N<3>, Rs<2>, o ORs<2>, en que Rs<2>es alquilo C<1>-C<6>, alquenilo C<2>-C<6>, alquinilo C<2>-C<6>, cicloalquilo C<3>-C<8>, arilo C<6>-C<10>, NHC(O)-C<1>-alquilo C6, NR<31>R<32>, (NR31R32R33)+, heterocicloalquilo de 4 a 12 miembros, o heteroarilo de 5 o 6 miembros,

y Rs<2>está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo consistente en halógeno, OH, oxo, alquilo C<1>-C<6>, COOH, C(O)O-alquilo C<1>-C<6>, ciano, alcoxilo C<1>- C6, NR<31>R<32>, (NR31R32R33)+, cicloalquilo C<3>-C8, arilo C<6>-C<10>, heterocicloalquilo de 4 a 12 miembros

y heteroarilo de 5 o 6 miembros; o como alternativa R<12>junto con R<14>es oxo, o R<13>junto con R<15>es oxo,

cada uno de R<20>, R<21>, R<22>y R<23>es independientemente -Q<3>-T<3>, en que Q<3>es un enlace o un enlazador alquilo C<1>-C<3>opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, ciano, OH y alcoxi C<1>-C<6>, y T<3>es H, halógeno, OH, NH<2>, ciano, NO<2>, N<3>, Rs3, o ORs3, en que Rss es alquilo C<1>-C<6>, alquenilo C<2>-C<6>, alquinilo C<2>-C<6>, cicloalquilo C<3>-C<8>, arilo C<6>-C<10>, NHC(O)-C<1>-alquilo C6, monoalquil C<1>-C<6>-amino, dialquil C<1>-C<6>-amino, heterocicloalquilo de 4 a 12 miembros, o heteroarilo de 5 o 6 miembros, y R<s>3 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo consistente en halógeno, OH, oxo, alquilo C<1>-C<6>, COOH, C(O)O-alquilo C<1>-C<6>, ciano, alcoxilo C<1>-C<6>, amino, monoalquil C<1>-C<6>-amino, dialquil C<1>-C<6>-amino, cicloalquilo C<3>-C<8>, arilo C<6>-C<10>, heterocicloalquilo de 4 a 12 miembros, y heteroarilo de 5 o 6 miembros; cada uno de R<24>, R<25>y R<26>es independientemente H o alquilo C<1>-C<6>;

cada uno de R<27>y R<28>es independientemente H u OR<29>; o R<27>y R<28>forman conjuntamente O-R<30>-O; cada R<29>es independientemente H, alquilo C<1>-C<6>, alquenilo C<2>-C<6>o alquinilo C<2>-C<6>y R<29>, cuando es alquilo C<1>-C<6>, alquenilo C<2>-C<6>o alquinilo C<2>-C<6>, está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, OH y alcoxilo C<1>-C<6>que está opcionalmente sustituido con uno o más de OH u OC(O)-alquilo C<1>-C<6>;

R<30>es alquileno C<1>-C<6>opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, OH y alcoxilo C<1>-C<6>;

cada uno de R<31>, R<32>y R<33>, es independientemente H, alquilo C<1>-C<6>, cicloalquilo C<3>-C<8>, arilo C<6>-C<10>, heterocicloalquilo de 4 a 12 miembros o heteroarilo de 5 o 6 miembros;

cada uno de R<40>, R<41>, R<42>y R<43>es independientemente H, halógeno, OH, ciano, N<3>, OP(O)R47R48, o alquilo C<1>-C<6>opcionalmente sustituido con uno o más de OP(O)R47R48, o un R<41>y un R<43>, junto con los átomos de carbono a los que están conectados y Q<0>, forman cicloalquilo C<4>-C<10>, heterocicloalquilo de 4 a 14 miembros, arilo C<6>-C<10>, o heteroarilo de 5 a 14 miembros, y cada uno de cicloalquilo, heterocicloalquilo, fenilo o heteroarilo de 5 o 6 miembros está opcionalmente sustituido con uno o más de OH, halógeno, ciano, N<3>, oxo, OP(O)R47R48, C<1>-alquilo C6, halogenoalquilo C<1>-C<6>, COOH, C(O)O-alquilo C<1>-C<6>, alcoxilo C<1>-C<6>, halogenoalcoxilo C<1>-C<6>, amino, monoalquil C<1>-C<6>-amino y dialquil C<1>-C<6>-amino;

R<44>es H, alquilo C<1>-C<6>o un grupo protector de amina;

cada uno de R<45>y R<46>es independientemente H, OP(O)R47R48, o alquilo Ci-C6opcionalmente sustituido con uno o más OP(O)R47R48, y

cada R<47>y R<48>es independientemente H, halógeno, alquilo C<1>-C<6>, OH, SH, SeH o BH<3>-.

Debe entenderse que un análogo de caperuza, como se proporciona en el presente documento, puede incluir cualquiera de los análogos de caperuza descritos en la publicación internacional WO 2017/066797, publicada el 20 de abril de 2017.

En algunas realizaciones, la posición media B<2>puede ser una molécula que no es ribosa, tal como arabinosa.

En algunas realizaciones, R<2>tiene una base de etilo.

Por tanto, en algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende la siguiente estructura:

En otras realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende la siguiente estructura:

En aún otras realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende la siguiente estructura:

En todavía otras realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende la siguiente estructura:

En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende una secuencia seleccionada de las siguientes secuencias: GAA, GAC, GAG, GAU, GCA, GCC, GCG, GCU, GGA, GGC, GGG, GGU, GUA, GUC, GUG y GUU. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GAA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GAC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GAG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GAU. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GCA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GCC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GCG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GCU. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GGA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GGC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GGG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GGU. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GUA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GUC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GUG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GUU.

En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende una secuencia selecciona de las siguientes secuencias: m7GpppApA, m7GpppApC, m7GpppApG, m7GpppApU, m7GpppCpA, m7GpppCpC, m7GpppCpG, m7GpppCpU, m7GpppGpA, m7GpppGpC, m7GpppGpG, m7GpppGpU, m7GpppUpA, m7GpppUpC, m7GpppUpG y m7GpppUpU.

En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppApA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppApC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppApG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppApU. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppCpA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppCpC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppCpG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppCpU. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppGpA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppGpC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppGpG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppGpU. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppUpA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppUpC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppUpG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppUpU.

Una caperuza de trinucleótido, en algunas realizaciones, comprende una secuencia seleccionada de las siguientes secuencias: m7G3'OMepppApA, m7G3'OMepppApC, m7G3'OMepppApG, m7G3'OMepppApU, m7G3'OMepppCpA, m7G3'OMePPpCpC, m7G3'OMepppCpG, m7G3'OMepppCpU, m7G3'OMepppGpA, m7G3'OMepppGpC, m7G3'OMepppGpG, m7G3'OMepppGpU, m7G3'OMepppUpA, m7G3'OMepppUpC, m7G3'OMepppUpG, y m7G3'OMepppUpU.

En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppApA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppApC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppApG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppApU. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppCpA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppCpC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppCpG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppCpU. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppGpA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppGpC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppGpG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppGpU. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppUpA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3OMepppUpC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3OMepppUpG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3OMepppUpU.

Una caperuza de trinucleótido, en otras realizaciones, comprende una secuencia seleccionada de las siguientes secuencias: m7G3'OMepppA2'OMepA, m7G3'OMepppA2'OMepC, m7G3'OMepppA2'OMepG, m7G3'OMepppA2'OMepU, m7G3'OMepppC2'OMepA, m7G3'OMepppC2'OMepC, m7G3OMepppC2'OMepG, m7G3'OMepppC2'OMepU, m7G3'OMepppG2'OMepA, m7G3'OMepppG2OMepC, m7G3OMepppG2'OMepG, m7G3'OMepppG2'OMepU, m7G3'OMepppU2'OMepA, m7G3'OMepppU2'OMepC, m7G3'OMepppU2'OMepG y m7G3OMepppU2'OMepU.

En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3OMepppA2'OMepA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3OMepppA2OMepC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3OMepppA2OMepG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppA2'OMepU. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppC2'OMepA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3OMepppC2OMepC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3OMepppC2OMepG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3OMepppC2OMepU. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppG2OMepA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppG2'OMepC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3OMepppG2OMepG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3OMepppG2OMepU. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3OMepppU2OMepA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppU2'OMepC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppU2'OMepG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7G3'OMepppU2'OMepU.

Una caperuza de trinucleótido, en aún otras realizaciones, comprende una secuencia seleccionada de las siguientes secuencias: m7GpppA<2>'OMepA, m7GpppA<2>'OMepC, m7GpppA<2>;OMepG, m7GpppA<2>'OMepU, m7GpppC<2>'OMepA, m7GpppC<2>'OMepC, m7GpppC<2>'OMepG, m7GpppC<2>'OMepU, m7GpppG<2>'OMepA, m7GpppG<2>'OMepC, m7GpppG<2>'OMepG, m7GpppG<2>'OMepU, m7GpppU<2>'OMepA, m7GpppU<2>'OMepC, m7GpppU<2>'OMepG y m7GpppU<2>'OMepU.

En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppA<2>OMepA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppA<2>OMepC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppA<2>OMepG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppA<2>OMepU. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppC<2>OMepA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppC<2>OMepC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppC<2>OMepG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppC<2>OMepU. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppG<2>OMepA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppG<2>OMepC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppG<2>OMepG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppG<2>OMepU. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppU<2>OMepA. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppU<2>OMepC. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppU<2>OMepG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende m7GpppU<2>OMepU.

En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GAG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GCG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GUG. En algunas realizaciones, una caperuza de trinucleótido comprende GGG.

Métodos de transcripción in vitro

Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan métodos para producir (sintetizar) un transcrito de ARN (p. ej., transcrito de ARNm) que comprende poner en contacto un molde de ADN con una ARN polimerasa (es decir, una variante de ARN polimerasa T7) en condiciones que dan como resultado la producción de transcrito de ARN.

Los métodos pueden comprender poner en contacto un molde de ADN con una variante de ARN polimerasa T7 que tiene una sustitución G47A (p. ej., una variante de ARNP T7 G47A o una variante de ARNP T7 G47A*) en condiciones que dan como resultado la producción de transcrito de ARN. La presente invención proporciona un método para efectuar una reacción de transcripción in vitro (TIV), que comprende poner en contacto un molde de ADN con la ARN polimerasa T7 de la invención en presencia de trifosfatos de nucleósidos y tampón en condiciones que dan como resultado la producción de transcrito de ARN.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden poner en contacto un molde de ADN con una variante de ARN polimerasa T7 que comprende un (al menos un) aminoácido C terminal adicional (p. ej., Gly, Ala, GlyGly, AlaAla, GlyAla o AlaGly).

En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona métodos para efectuar una reacción de TIV, que comprende poner en contacto un molde de ADN con una variante de ARN polimerasa (es decir, una variante de ARN polimerasa T7) en presencia de trifosfato de nucleósido y tampón en condiciones que dan como resultado la producción de transcritos de ARN.

Otros aspectos de la presente divulgación proporcionan métodos de adición de caperuza cotranscripcional que comprenden hacer reaccionar un molde de polinucleótido con una variante de ARN polimerasa T7, trifosfatos de nucleósidos y un análogo de caperuza en condiciones de reacción de transcripciónin vitropara producir un transcrito de ARN.

Un método de adición de caperuza cotranscripcional para la síntesis de ARN puede comprender hacer reaccionar un molde de polinucleótido con (a) una variante de ARN polimerasa T7 que comprende al menos una sustitución de aminoácido, con respecto a la ARN polimerasa de tipo silvestre, que causa que al menos una estructura de bucle de la variante de ARN polimerasa experimente un cambio conformacional a una estructura de hélice a medida que la variante de ARN polimerasa pasa de un complejo de iniciación a un complejo de elongación, (b) trifosfatos de nucleósidos, y (c) una caperuza de trinucleótido que comprende la secuencia GpppA<2>OmepG, en condiciones de reacción de transcripciónin vitropara producir un transcrito de ARN, en donde el molde de polinucleótido incluye un residuo de 2'-desoxitimidina en la posición del molde 1. La presente invención proporciona un método de adición de caperuza cotranscripcional para la síntesis de ARN, comprendiendo el método hacer reaccionar un molde de polinucleótido con: (i) la variante de ARN polimerasa T7 expuesta en las reivindicaciones adjuntas, (ii) trifosfatos de nucleósidos y (iii) un análogo de caperuza, en condiciones de reacción de transcripción in vitro para producir transcritos de ARN.

Las condiciones de VIT típicamente requieren un molde de ADN lineal purificado que contiene un promotor, trifosfatos de nucleósidos, un sistema tampón que incluye ditiotreitol (DTT) e iones de magnesio, y una ARN polimerasa. Las condiciones exactas usadas en la reacción de transcripción dependen de la cantidad de ARN necesaria para una aplicación específica. Las reacciones típicas de VIT se efectúan incubando un molde de ADN con una ARN polimerasa y trifosfatos de nucleósidos, incluyendo GTP, ATP, CTP y UTP (o análogos nucleotídicos) en un tampón de transcripción. A partir de esta reacción se produce un transcrito de ARN que tiene un trifosfato de guanosina 5' terminal.

Un ácido desoxirribonucleico (ADN) es simplemente un molde de ácido nucleico para la ARN polimerasa. Un molde de ADN puede incluir un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés (p. ej., un polipéptido antigénico). En algunas realizaciones, el molde de ADN incluye un promotor de ARN polimerasa (p. ej., un promotor de ARN polimerasa T7) localizado en 5 ' y ligado operativamente al polinucleótido que codifica un polipéptido de interés. Un molde de ADN también puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una cola de poliadenilación (poliA) localizada en el extremo 3' del gen de interés.

Los polipéptidos de interés incluyen, pero sin limitación, productos biológicos, anticuerpos, antígenos (vacunas) y proteínas terapéuticas. El término "proteína" abarca péptidos.

Un transcrito de ARN, en algunas realizaciones, es el producto de una reacción de VIT. Un transcrito de ARN, en algunas realizaciones, es un ARN mensajero (ARNm) que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de interés ligado a una cola poliA. En algunas realizaciones, el ARNm es ARNm modificado (ARNmm), que incluye al menos un nucleótido modificado.

Un nucleótido incluye una base nitrogenada, un azúcar de cinco carbonos (ribosa o desoxirribosa) y al menos un grupo fosfato. Los nucleótidos incluyen monofosfatos de nucleósidos, difosfatos de nucleósidos y trifosfatos de nucleósidos. Un monofosfato de nucleósido (NMP) incluye una nucleobase ligada a una ribosa y un solo fosfato; un difosfato de nucleósido (NDP) incluye una nucleobase ligada a una ribosa y dos fosfatos; y un trifosfato de nucleósido (NTP) incluye una nucleobase ligada a una ribosa y tres fosfatos. Los análogos de nucleótidos son compuestos que tienen la estructura general de un nucleótido o son estructuralmente similares a un nucleótido. Los análogos de nucleótidos, por ejemplo, incluyen un análogo de la nucleobase, un análogo del azúcar y/o un análogo del grupo o grupos fosfato de un nucleótido.

Un nucleósido incluye una base nitrogenada y un azúcar de 5 carbonos. Por tanto, un nucleósido más un grupo fosfato procura un nucleótido. Los análogos de nucleósidos son compuestos que tienen la estructura general de un nucleósido o son estructuralmente similares a un nucleósido. Los análogos de nucleósidos, por ejemplo, incluyen un análogo de la nucleobase y/o un análogo del azúcar de un nucleósido.

Debe entenderse que el término "nucleótido" incluye nucleótidos de origen natural, nucleótidos sintéticos y nucleótidos modificados, a menos que se indique lo contrario. Los ejemplos de nucleótidos de origen natural usados para la producción de ARN, p. ej., en una reacción de VIT, como se proporciona en el presente documento, incluyen trifosfato de adenosina (ATP), trifosfato de guanosina (GTP), trifosfato de citidina (CTP), trifosfato de uridina (UTP) y trifosfato de 5-metiluridina (m5UTP). En algunas realizaciones, se usan difosfato de adenosina (ADP), difosfato de guanosina (GDP), difosfato de citidina (CDP) y/o difosfato de uridina (UDP).

Los ejemplos de análogos de nucleótidos incluyen, pero sin limitación, análogos de nucleótidos antivíricos, análogos de fosfato (solubles o inmovilizados, hidrolizables o no hidrolizables), dinucleótidos, trinucleótidos, tetranucleótidos, p. ej., un análogo de caperuza, o un precursor/sustrato para la adición enzimática de caperuza (Vaccinia o ligasa), un nucleótido marcado con un grupo funcional para facilitar la ligación/conjugación de la caperuza o resto 5' (IRES), un nucleótido marcado con 5' PO<4>para facilitar la ligación de la caperuza o resto 5', o un nucleótido marcado con un grupo funcional/grupo protector que se puede escindir química o enzimáticamente. Los ejemplos de nucleótidos/nucleósidos antivíricos incluyen, pero sin limitación, ganciclovir, entecavir, telbivudina, vidarabina y cidofovir.

Los nucleótidos modificados pueden incluir nucleobases modificadas. Por ejemplo, un transcrito de ARN (p. ej., un transcrito de ARNm) de la presente divulgación puede incluir una nucleobase modificada seleccionada de pseudouridina (<y>), 1-metilpseudouridina (m1Y), 1-etilpseudouridina, 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 2-tio-1-metil-1-desazapseudouridina, 2-tio-1-metilpseudouridina, 2-tio-5-azauridina, 2-tiodihidropseudouridina, 2-tiodihidrouridina, 2-tiopseudouridina, 4-metoxi-2-tiopseudouridina, 4-metoxipseudouridina, 4-tio-1-metilpseudouridina, 4-tiopseudouridina, 5-azauridina, dihidropseudouridina, 5-metiluridina, 5-metoxiuridina (mo5U) o 2'-O-metiluridina. En algunas realizaciones, un transcrito de ARN (p. ej., transcrito de ARNm) incluye una combinación de al menos dos (p. ej., 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas anteriores.

Los trifosfatos de nucleósidos (NTP) como se proporcionan en el presente documento pueden comprender ATP modificado o no modificado, UTP modificado o no modificado, GTP modificado o no modificado y/o CTP modificado o no modificado. En algunas realizaciones, los NTP de una reacción de VIT comprenden ATP no modificado. En algunas realizaciones, los NTP de una reacción de VIT comprenden ATP modificado. En algunas realizaciones, los NTP de una reacción de VIT comprenden UTP no modificado. En algunas realizaciones, los NTP de una reacción de VIT comprenden UTP modificado. En algunas realizaciones, los NTP de una reacción de VIT comprenden GTP no modificado. En algunas realizaciones, los NTP de una reacción de VIT comprenden GTP modificado. En algunas realizaciones, los NTP de una reacción de VIT comprenden CTP no modificado. En algunas realizaciones, los NTP de una reacción de VIT comprenden CTP modificado.

La concentración de trifosfatos de nucleósidos y análogo de caperuza presentes en una reacción de VIT puede variar. En algunas realizaciones, los NTP y el análogo de caperuza están presentes en la reacción en concentraciones equimolares. En algunas realizaciones, la relación molar de análogo de caperuza (p. ej., caperuza de trinucleótido) a trifosfatos de nucleósidos en la reacción es mayor de 1:1. Por ejemplo, la relación molar de análogo de caperuza a trifosfatos de nucleósido en la reacción puede ser 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 50:1 o 100:1. En algunas realizaciones, la relación molar de análogo de caperuza (p. ej., caperuza de trinucleótido) a trifosfatos de nucleósidos en la reacción es menor de 1:1. Por ejemplo, la relación molar de análogo de caperuza (p. ej., caperuza de trinucleótido) a trifosfatos de nucleósidos en la reacción puede ser 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:50 o 1:100.

La composición de NTP en una reacción de VIT también puede variar. Por ejemplo, se puede usar ATP en exceso de GTP, CTP y UTP. Como ejemplo no limitante, una reacción de VIT puede incluir GTP 7,5 milimolar, CTP 7,5 milimolar, UTP 7,5 milimolar y ATP 3,75 milimolar. La misma reacción de VIT puede incluir un análogo de caperuza 3,75 milimolar (p. ej., caperuza de trinucleótido). En algunas realizaciones, la relación molar de G:C:U:A:caperuza es 1:1:1:0,5:0,5. En algunas realizaciones, la relación molar de G:C:U:A:caperuza es 1:1:0,5:1:0,5. En algunas realizaciones, la relación molar de G:C:U:A:caperuza es 1:0,5:1:1:0,5. En algunas realizaciones, la relación molar de G:C:U:A:caperuza es 0,5:1:1:1:0,5.

En algunas realizaciones, un transcrito de ARN (p. ej., transcrito de ARNm) incluye una nucleobase modificada seleccionada de pseudouridina (y ), 1-metil-pseudouridina (m1^ ), 5-metoxiuridina (mo5U), 5-metilcitidina (m5C), a -tioguanosina y a-tioadenosina. En algunas realizaciones, un transcrito de ARN (p. ej., transcrito de ARNm) incluye una combinación de al menos dos (p. ej., 2, 3, 4 o más) de las nucleobases modificadas anteriores.

En algunas realizaciones, un transcrito de ARN (p. ej., un transcrito de ARNm) incluye pseudouridina (<y>). En algunas realizaciones, un transcrito de ARN (p. ej., un transcrito de ARNm) incluye 1-metilpseudouridina (m1Y). En algunas realizaciones, un transcrito de ARN (p. ej., un transcrito de ARNm) incluye 5-metoxiuridina (mo5U). En algunas realizaciones, un transcrito de ARN (p. ej., un transcrito de ARNm) incluye 5-metilcitidina (m5C). En algunas realizaciones, un transcrito de ARN (p. ej., un transcrito de ARNm) incluye a-tioguanosina. En algunas realizaciones, un transcrito de ARN (p. ej., un transcrito de ARNm) incluye a-tioadenosina.

En algunas realizaciones, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) se modifica de forma uniforme (p. ej., completamente modificado, modificado a lo largo de toda la secuencia) para una modificación particular. Por ejemplo, es posible modificar de forma uniforme un polinucleótido con 1-metilpseudouridina (m1^ ), lo que significa que se reemplazan todos los residuos de uridina en la secuencia de ARNm por 1-metilpseudouridina (m1^ ). De manera similar, es posible modificar de modo uniforme un polinucleótido para cualquier tipo de residuo de nucleósido presente en la secuencia mediante el reemplazo por un residuo modificado tal como cualquiera de los expuestos anteriormente. Como alternativa, el polinucleótido (p. ej., polinucleótido de ARN, tal como polinucleótido de ARNm) puede no modificarse uniformemente (p. ej., parcialmente modificado, parte de la secuencia está modificada). Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

En algunas realizaciones, el sistema tampón contiene tris. La concentración de tris usada en una reacción de VIT, por ejemplo, puede ser fosfato al menos 10 mM, al menos 20 mM, al menos 30 mM, al menos 40 mM, al menos 50 mM, al menos 60 mM, al menos 70 mM, al menos 80 mM, al menos 90 mM, al menos 100 mM o al menos 110 mM. En algunas realizaciones, la concentración de fosfato es de 20-60 mM o de 10-100 mM.

En algunas realizaciones, el sistema tampón contiene ditiotreitol (DTT). La concentración de DTT usada en una reacción de VIT, por ejemplo, puede ser al menos 1 mM, al menos 5 mM o al menos 50 mM. En algunas realizaciones, la concentración de DTT usada en una reacción de VIT es de 1-50 mM o de 5-50 mM. En algunas realizaciones, la concentración de DTT usada en una reacción de VIT es de 5 mM.

En algunas realizaciones, el sistema tampón contiene magnesio. En algunas realizaciones, la relación molar de NTP a iones de magnesio (Mg2+; p. ej., MgCb) presentes en una reacción de VIT es de 1:1 a 1:5. Por ejemplo, la relación molar de NTP a iones de magnesio puede ser 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 o 1:5.

En algunas realizaciones, la relación molar de NTP más análogo de caperuza (p. ej., caperuza de trinucleótido, tal como GAG) a iones de magnesio (Mg2+; p. ej., MgCb) presentes en una reacción de VIT es de 1:1 a 1:5. Por ejemplo, la relación molar de NTP caperuza de trinucleótido (p. ej., GAG) a iones de magnesio puede ser 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 o 1:5.

En algunas realizaciones, el sistema tampón contiene Tris-HCl, espermidina (p. ej., a una concentración de 1-30 mM), TRITON® X-100 (p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)feniléter de polietilenglicol) y/o polietilenglicol (PEG).

La adición de trifosfatos de nucleósidos (NTP) al extremo 3' de una hebra de ARN en crecimiento está catalizada por una variante de ARN polimerasa T7 de la presente divulgación. En algunas realizaciones, la ARN polimerasa (es decir, variante de ARN polimerasa T7) está presente en una reacción (p. ej., una reacción de VIT) en una concentración de 0,01 mg/ml a 1 mg/ml. Por ejemplo, la ARN polimerasa puede estar presente en una reacción a una concentración de 0,01 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,5 mg/ml o 1,0 mg/ml.

Sorprendentemente, el uso de la combinación de una variante de ARNP T7 como se proporciona en el presente documento con un análogo de caperuza (p. ej., GpppA<2>'OmepG), en una reacción de transcripciónin vitro,por ejemplo, da como resultado la producción de un transcrito de ARN, en donde más de un 80 % del transcrito de ARN producido incluye una caperuza funcional. En algunas realizaciones, más de un 85 % del transcrito de ARN producido incluye una caperuza funcional. En algunas realizaciones, más de un 90 % del transcrito de ARN producido incluye una caperuza funcional. En algunas realizaciones, más de un 95 % del transcrito de ARN producido incluye una caperuza funcional. En algunas realizaciones, más de un 96 % del transcrito de ARN producido incluye una caperuza funcional. En algunas realizaciones, más de un 97 % del transcrito de ARN producido incluye una caperuza funcional. En algunas realizaciones, más de un 98 % del transcrito de ARN producido incluye una caperuza funcional. En algunas realizaciones, más de un 99 % del transcrito de ARN producido incluye una caperuza funcional.

También fue sorprendente el hallazgo de que el uso de un molde de polinucleótido que incluye un residuo de 2'-desoxitimidina o un residuo de 2'-desoxicitidina en la posición del molde 1 da como resultado la producción de un transcrito de ARN en donde más de un 80 % (p. ej., más de un 85 %, más de un 90 % o más de un 95 %) del transcrito de ARN producido incluye una caperuza funcional. Por tanto, en algunas realizaciones, un molde de polinucleótido (p. ej., ADN) usado, por ejemplo, en una reacción de VIT, incluye un residuo de 2'-desoxitimidina en la posición del molde 1. En otras realizaciones, un molde de polinucleótido (p. ej., ADN) usado, por ejemplo, en una reacción de VIT, incluye un residuo de 2'-desoxicitidina en la posición del molde 1.

Aplicaciones

Los transcritos de ARN producidos según la presente divulgación incluyen ARNm (incluyendo ARNm modificado y/o ARN no modificado), ARNlnc, ARN autorreplicante, ARN circular, ARN guía de CRISPR y similares. En realizaciones, el ARN es ARN (p. ej., ARNm o ARN autorreplicante) que codifica un polipéptido (p. ej., un polipéptido terapéutico). Por tanto, los transcritos de ARN producidos usando variantes de<a R n>polimerasa de la presente divulgación se pueden usar en una infinidad de aplicaciones.

Por ejemplo, los transcritos de ARN se pueden usar para producir polipéptidos de interés, p. ej., proteínas terapéuticas, antígenos de vacunas y similares. En algunas realizaciones, los transcritos de ARN son<A r N>terapéuticos. Un ARNm terapéutico es un ARNm que codifica una proteína terapéutica (el término "proteína" abarca péptidos). Las proteínas terapéuticas median una variedad de efectos en una célula hospedadora o en un sujeto para tratar una enfermedad o mejorar los signos y síntomas de una enfermedad. Por ejemplo, una proteína terapéutica puede reemplazar a una proteína que es deficiente o anormal, aumentar la función de una proteína endógena, proporcionar una función novedosa a una célula (p. ej., inhibir o activar una actividad celular endógena, o actuar como agente de suministro para otro compuesto terapéutico (p. ej., un conjugado anticuerpo-fármaco). El ARNm terapéutico puede ser útil para el tratamiento de las siguientes enfermedades y afecciones: infecciones bacterianas, infecciones víricas, infecciones parasitarias, trastornos de proliferación celular, trastornos genéticos y trastornos autoinmunes. En el presente documento se abarcan otras enfermedades y afecciones.

Una proteína de interés codificada por un ARNm como se proporciona en el presente documento puede ser esencialmente cualquier proteína. En algunas realizaciones, la proteína terapéutica es una citocina, un factor de crecimiento, un anticuerpo o una proteína de fusión. Los ejemplos no limitantes de proteínas terapéuticas incluyen factores sanguíneos (tales como Factor VIII y Factor VII), factores del complemento, receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR en inglés) y MUT1. Los ejemplos no limitantes de citocinas incluyen interleucinas, interferones, quimiocinas, linfocinas y similares. Los ejemplos no limitantes de factores de crecimiento incluyen eritropoyetina, EGF, PDGF, FGF, TGF, IGF, TNF, CSF, MCSF, GMCSF y similares. Los ejemplos no limitantes de anticuerpos incluyen adalimumab, infliximab, rituximab, ipilimumab, tocilizumab, canakinumab, itolizumab, tralokinumab. Los ejemplos no limitantes de proteínas de fusión incluyen, por ejemplo, etanercept, abatacept y belatacept.

En algunas realizaciones, la proteína de interés es eritropoyetina humana, LDLR (para usar en la inhibición del colesterol) o MUT1 (para usar en el tratamiento de la acidemia metilmalónica (MMA)). En otras realizaciones, la proteína de interés codificada por el ARNm es un anticuerpo terapéutico incluyendo, pero sin limitación, los anticuerpos enumerados anteriormente.

Un transcrito de ARN producido usando una variante de ARN polimerasa como se divulga en el presente documento puede codificar uno o más productos biológicos. Un producto biológico es una molécula basada en polipéptido que puede usarse para tratar, curar, mitigar, prevenir o diagnosticar una enfermedad o afección médica grave o potencialmente mortal. Los productos biológicos incluyen, pero sin limitación, extractos alergénicos (p. ej., para inyecciones y pruebas de alergia), componentes sanguíneos, productos de terapia génica, tejido humano o productos celulares usados en trasplantes, vacunas, anticuerpos monoclonales, citocinas, factores de crecimiento, enzimas, productos trombolíticos, e inmunomoduladores, entre otros.

Uno o más productos biológicos actualmente comercializados o en desarrollo pueden estar codificados por el ARN de la presente divulgación. Aunque no se desea ceñirse a la teoría, se cree que la incorporación de los polinucleótidos codificantes de un producto biológico conocido al ARN de la presente divulgación dará como resultado una eficacia terapéutica mejorada debido al menos en parte a la especificidad, pureza y/o selectividad de los diseños de constructo.

Un transcrito de ARN producido usando una variante de ARN polimerasa como se divulga en el presente documento puede codificar uno o más anticuerpos. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales (que incluyen anticuerpos de longitud completa que tienen una región Fc de inmunoglobulina), composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos, diacuerpos y moléculas monocatenarias), así como fragmentos de anticuerpo. El término "inmunoglobulina" (Ig) se usa de manera intercambiable con "anticuerpo" en el presente documento. Un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos con la excepción de posibles mutaciones de origen natural y/o modificaciones postraduccionales (p. ej., isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades mínimas. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, y se dirigen contra un único sitio antigénico.

Los anticuerpos monoclonales incluyen específicamente anticuerpos quiméricos (inmunoglobulinas) en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homóloga de secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico a homólogo de las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como también fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada. Los anticuerpos quiméricos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión al antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (p. ej., monos del viejo mundo, simios, etc.) y secuencias de región constante humana.

Los anticuerpos codificados en el ARN de la presente divulgación pueden usarse para tratar afecciones o enfermedades en muchas áreas terapéuticas, tales como, pero sin limitación, hematología, cardiovascular, del SNC, intoxicación (incluyendo antivenenos), dermatología, endocrinología, gastrointestinal, imagenología médica, musculoesquelética, oncología, inmunología, respiratoria, sensorial y antiinfecciosa.

Un transcrito de ARN producido usando una variante de ARN polimerasa como se divulga en el presente documento puede codificar uno o más antígenos de vacuna. Un antígeno de vacuna es una preparación biológica que mejora la inmunidad ante una enfermedad o agente infeccioso particular. El ARN de la presente divulgación puede codificar uno o más antígenos de vacunas que actualmente se comercializan o se encuentran en desarrollo. Los antígenos de vacuna codificados en el ARN se pueden utilizar para tratar afecciones o enfermedades en muchas áreas terapéuticas tales como, pero sin limitación, cáncer, alergias y enfermedades infecciosas. Por ejemplo, una vacuna contra el cáncer puede ser una vacuna contra el cáncer personalizada en forma de un concatémero o ARN individuales que codifican epítopos peptídicos o una combinación de los mismos.

Un transcrito de ARN producido usando una variante de ARN polimerasa como se divulga en el presente documento puede diseñarse para codificar uno o más péptidos antimicrobianos (PAM) o péptidos antivíricos (PAV). Se han aislado y descrito PAM y PAV de una amplia gama de animales tales como, pero sin limitación, microorganismos, invertebrados, plantas, anfibios, aves, peces y mamíferos. Los polipéptidos antimicrobianos pueden bloquear la fusión celular y/o la entrada vírica por uno o más virus envueltos (p.ej., HIV, HCV). Por ejemplo, el polipéptido antimicrobiano puede comprender o consistir en un péptido sintético correspondiente a una región, p. ej., una secuencia consecutiva de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 aminoácidos de la subunidad transmembrana de una proteína de envoltura vírica, p. ej., gp120 o gp41 del HIV-1. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de gp120 o gp41 de HIV-1 se describen en, por ejemplo, Kuiken et al., (2008). "HIV Sequence Compendium," Los Alamos National Laboratory.

Por ejemplo, se pueden usar transcritos de ARN como sondas de ARN radiomarcadas. Pueden usarse transcritos de ARN para el marcaje de ARN no isotópico. Pueden usarse transcritos de ARN como ARN guía (ARNg) para modificación genética dirigida. Pueden usarse transcritos de ARN (p. ej., ARNm) para traducción y microinyecciónin vitro.Pueden usarse transcritos de ARN para estudios de estructura, procesamiento y catálisis del ARN. Pueden usarse transcritos de ARN para la amplificación de ARN. Pueden usarse transcritos de ARN como ARN antisentido para experimentos de expresión génica. La presente divulgación abarca otras aplicaciones.

Composiciones

Las variantes de ARNP T7 de la presente divulgación, cuando se usan en combinación con un análogo de caperuza, tal como una caperuza de trinucleótido, en una reacción de VIT producen ARN que no induce una respuesta de citocinas detectable, incluso en ausencia de purificación post-TIV. Por tanto, en el presente documento se divulga una composición que comprende ARN de VIT y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición está sustancialmente libre (p. ej., no comprende, o comprende menos de un 10 %, menos de un 1 %, menos de un 0,1 % o menos de un 0,01 %) de contaminante de ARN inductor de citocinas en ausencia de purificación post-VIT.

Como se describe en otra parte del presente documento, las variantes de ARNP T7 y los métodos de la presente divulgación producen transcritos de ARN, en donde al menos un 80 % (p. ej., 80-90 %, 80-95 %, 90-95 %, 80-99 %, 90-99 % o 90-100 %) del transcrito incluye una caperuza funcional. Por tanto, también se proporciona en el presente documento una composición que comprende un ARN de VIT y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición comprende menos de un 20 % (p. ej., un 5-15 %, 5-10 %, 1-15 % o 1-10 %) de especies de ARN sin caperuza. En algunas realizaciones, la composición comprende menos de un 15 % (p. ej., 5-10 %, 1-10 % o 1-5 %) de especies de ARN sin caperuza. En algunas realizaciones, la composición comprende menos de un 10 % de especies de ARN sin caperuza. En algunas realizaciones, la composición comprende menos de un 5 % de especies de ARN sin caperuza.

En algunas realizaciones, más de un 80 % del ARN de VIT incluye una caperuza funcional. En algunas realizaciones, más de un 85 % del ARN de VIT incluye una caperuza funcional. En algunas realizaciones, más de un 90 % del ARN de VIT incluye una caperuza funcional. En algunas realizaciones, más de un 95 % del ARN de VIT incluye una caperuza funcional.

El ARN de VIT, en algunas realizaciones, no se modifica químicamente, mientras que en otras realizaciones, el ARN de VIT se modifica químicamente.

En algunas realizaciones, inesperadamente, más de un 80 % del ARN de VIT comprende transcritos monocatenarios de longitud completa. Por ejemplo, más de un 85 % del ARN de TIV puede comprender transcritos monocatenarios de longitud completa. En algunas realizaciones, más de un 90 % del ARN de VIT comprende transcritos monocatenarios de longitud completa. Más de un 95 % del ARN de VIT comprende transcritos monocatenarios de longitud completa.

Se divulga en el presente documento ARN producido mediante un proceso que comprende hacer reaccionar un molde de polinucleótido con (a) una variante de a Rn polimerasa T7 que comprende al menos una sustitución de aminoácido, con respecto a la ARN polimerasa de tipo silvestre, que causa que al menos una estructura de bucle de la variante de ARN polimerasa experimente un cambio conformacional a una estructura de hélice a medida que la variante de ARN polimerasa pasa de un complejo de iniciación a un complejo de elongación, (b) trifosfatos de nucleósidos, y (c) una caperuza de trinucleótido que comprende la secuencia GpppA<2>'OmepG, en condiciones de reacción de transcripciónin vitropara producir un transcrito de ARN, en donde el molde de polinucleótido incluye un residuo de 2'-desoxitimidina en la posición del molde 1.

Kits

También se divulgan en el presente documento kits, tales como kits de transcripciónin vitroque comprenden una variante de ARN polimerasa de la presente divulgación. Los kits pueden comprender uno cualquiera o más (al menos uno) componente de VIT descrito en el presente documento y una o más (al menos una) variante de ARN polimerasa. Por ejemplo, un kit de la presente divulgación puede incluir un sistema tampón, NTP y una variante de ARN polimerasa T7 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,99 o 100 que tiene al menos uno (o al menos dos, o al menos al menos tres) sustituciones de aminoácidos en la posición E42,<s>43, Y44, E45, M46, G47, A255, R257, A258, G259, A260, L261 y/o A262 y opcionalmente al menos una adición de aminoácido en el extremo C-terminal.

Tabla 1. Secuencias de ARN polimerasa

Tabla 2. Secuencias de variantes del extremo C de la ARN polimerasa

Ejemplos

Ejemplo 1. Producción de ARN polimerasas T7 variantes.

Se generaron variantes de ARN polimerasa T7 de hélice C y enlazador C con las sustituciones mostradas en las Tablas 3 y 4.

Tabla 3. Variantes de ARN polimerasa T7

Tabla 4. Variantes C-terminales de ARN polimerasa T7

Ejemplo 2. La pureza del ARNm de hEPO producido usando las variantes de ARN polimerasa T7 es comparable a la pureza del ARNm de hEPO producido usando una ARN polimerasa T7 de tipo silvestre.

Las reacciones de transcripciónin vitrose efectuaron usando un molde de ADN de hEPO y (1) ARN polimerasa T7 de tipo silvestre (WT) (WT n.° 1 y WT n.° 2), (2) una variante de ARN polimerasa T7 G C-terminal G47A ("G47A*") (SEQ iD NO: 110), y (3) una variante de ARN polimerasa T7 G C-terminal S43A ("S43A*") (SEQ ID NO: 108). Los análisis de HPLC con DBAA (acetato de dibutilamonio) mostraron que la pureza de todos los transcritos de hEPO era aproximadamente la misma (FIG. 1).

Ejemplo 3. El ARNm de hEPO producido usando las variantes de ARN polimerasa T7 no desencadena una respuesta de citocina celular.

Se transfectaron fibroblastos BJ con ARNm de hEPO producido mediante las reacciones de VIT descritas en el Ejemplo 2. El ARNm no se purificó o se purificó mediante cromatografía de fase inversa (RP). Como se muestra en la FIG. 2 (gráfico izquierdo), el ARNm no purificado producido usando la variante de ARN polimerasa T7 S43A* o la variante de ARN polimerasa T7 G47A* estaba tan "frío" (no desencadenaba una respuesta de citocina) como el ARNm purificado producido usando polimerasa T7 WT. En la FIG. 2 se muestran niveles de expresión de ARNm aproximadamente equivalentes (gráfico derecho). El ARNm usado en estos experimentos no contenía ninguna modificación de nucleótidos.

Se repitió un ensayo de transfección celular similar usando ARNm de hEPO que contenía modificaciones de nucleótidos m'V (FIG. 3, gráfico superior) o modificaciones de nucleótidos mo5U (FlG. 3, gráfico inferior). Las células de fibroblastos BJ transfectadas con ARNm de hEPO m'V no purificado producido usando las variantes de ARN polimerasa T7 G47A* y S43A* exhibían respuestas de IFNp más bajas que las células transfectadas con ARNm de hEPO m1^ no purificado producido usando ARN polimerasa T7 WT. En la FIG. 4 se muestran niveles de expresión de ARNm aproximadamente equivalentes.

Se usaron luego macrófagos derivados de monocitos (MDM) para examinar más a fondo la respuesta de citocinas. Se midió la relación de IP10 a hipoxantina-guanina fosfororribosiltransferasa (HPRT) en MDM transfectados con ARNm de hEPO generado en las condiciones descritas en el Ejemplo 2. Los MDM son muy sensibles a la química no modificada, por lo que no se observaron diferencias drásticas entre las muestras usando ARNm de hEPO no modificado. Sin embargo, los MDM transfectados con ARNm de hEPO m1^ no purificado producido usando las variantes de ARN polimerasa T7 G47A* y S43A* exhibían respuestas de IP10 más bajas que los MDM transfectados con ARNm de hEPO m1^ purificado producido usando ARN polimerasa T7 WT (FIG. 5, gráfico superior).

Ejemplo 4. Las variantes de ARN polimerasa T7 producen ARNm asociado con menos ARNbc contaminante que la ARN polimerasa T7 WT.

Se usó un ELISA de ARNbc estándar para valorar los contaminantes de ARNbc (p. ej., de más de 40 pares de bases de nucleótidos) en reacciones de VIT usadas para producir ARNm de hEPO no modificado (FIG. 7) o ARNm de hEPO que contiene modificaciones de nucleótidos m1^ (FIG. 8, gráfico superior) o modificaciones de nucleótidos mo5U (FIG.

8, gráfico inferior). El ensayo de ARNbc demostró que la variante de ARN polimerasa T7 S43A* y la variante de ARN polimerasa T7 G47A* producían menos ARNbc que la ARN polimerasa T7 WT (FIG. 7 y 8).

Ejemplo 5. Las variantes de la ARN polimerasa T7 reducen la heterogeneidad 3' del ARNm.

La heterogeneidad 3' de los transcritos se puede medir usando una digestión con ARNasa T1. La ARNasa T1 escinde el ARNm específicamente después de un nucleótido G. La escisión endonucleolítica da como resultado una "cicatriz" de hidróxido 5' (OH) y monofosfato 3' (mP). Por tanto, se puede usar una digestión de ARNasa T1 para diferenciar entre transcritos que tienen y no adiciones sin molde en el extremo 3'. En este Ejemplo, el ARNm de hEPO producido en el Ejemplo 2 termina con una cola de poliA y un sitio de restricciónXbal(p. ej., AnUCUAG). El ARNm de hEPO producido usando ARN polimerasa T7 WT, la variante de ARN polimerasa T7 S43A* o la variante de ARN polimerasa T7 G47A* se digirieron con ARNasa T1 y se analizaron mediante LCMS para generar huellas genéticas de oligos. Se encontró que un extremo 3' limpio (5' OH/3' OH) alcanza un pico de 32780 Da, mientras que una "cicatriz" (5' OH/3' mP) alcanza un pico de 32860 Da (FIG. 9A). Una 'cicatriz' indica que el transcrito tenía adiciones sin molde en el extremo carboxi. El ARNm de hEPO producido usando las variantes de ARN polimerasa T7, S43A* o G47A*, tenía una distribución de población del extremo 3' más alta, lo que indica que tienen extremos 3' más limpios y una heterogeneidad mejorada del extremo 3' (FIG. 9B).

Ejemplo 6. Las variantes de ARN polimerasa T7 producen extremos 3' "más limpios"

Se usó un ensayo para sondear la extensión de las adiciones sin molde producidas por las variantes de ARNP T7, G47A* y S43A*. En este ensayo, los lados izquierdos de ligación se realizaron usando una polimerasa enzimática (véase, p. ej., la Figura 11A). Luego, los lados izquierdos se reasociaron con un puente de ADN totalmente complementario inmediatamente adyacente a un ARN del lado derecho 5'-monofosforilado. Un puente de ADN tiene típicamente una longitud de 40 nt y el lado derecho está típicamente guarnecido con un fluoróforo en el extremo 5'. Luego se añadió ADN ligasa I en condiciones catalíticas y se dejó que la ligación continuara durante el tiempo de reacción deseado antes de que la reacción se inactivara con EDTA. Luego se desnaturalizó la mezcla en urea 4 M a 95 °C durante 5 minutos antes de cargarla en un gel desnaturalizante de poliacrilamida (PAGE-D) (FIG. 11B). El porcentaje de acrilamida en el gel depende de la longitud del constructo esperado, pero es típicamente de 6 % de acrilamida para los lados izquierdos > 50 nt de longitud y 20 % de acrilamida para los lados izquierdos que se aproximan a la longitud del ARNm típico. Los geles de acrilamida al 6 % se corrieron durante 25 minutos a 180 V constantes y los geles de acrilamida al 20 % se corrieron durante 120 minutos a 180 V constantes. Luego se tomaron imágenes de los geles en un escáner Typhoon o similar usando longitudes de onda de excitación y emisión apropiadas para el fluoróforo presente en el lado derecho y el producto recién ligado. El lado derecho y los productos ligados migran de manera diferente en el gel según el tamaño, y la intensidad de las dos bandas corresponderá exactamente a la eficiencia de la reacción de ligación. Cuanto mayor sea la extensión de adición de nucleótidos sin molde durante la síntesis enzimática del lado izquierdo, menor será el rendimiento de ligación esperado.

El rendimiento de ligación se calculó como la relación de bandas correspondientes al lado derecho no ligado y al producto de longitud completa ligado. La reacción se terminó antes de tiempo para exagerar las diferencias en los rendimientos de la reacción. Basándose en estos resultados, la variante de ARNP T7 G47A* incorporaba la menor cantidad de nucleótidos sin molde en el extremo 3' del ARN del lado izquierdo.

Ejemplo 7. Producción de ARNm con caperuza en una única reacción de transcripción in vitro

En un ensayo de transcripciónin vitro(VIT) estándar, la ARN polimerasa T7 prefiere iniciar la transcripción con un 5'GTP. Una molécula de ARN monocatenario (ARNmc) producida mediante tales ensayos de VIT estándar requiere una etapa de adición de caperuza enzimática independiente (FIG. 13). Por ejemplo, se puede producir un ARN cap1 (7mGpppN2'-Om-ARN) en un ensayo de adición de caperuza usando una enzima de adición de caperuza de Vaccinia y una 2'-O-metil transferasa (2'OMTasa). Cap1 se usa típicamente por la traducción eficiente de proteínas y la estabilidad del ARNm en las células. Sin embargo, en algunas secuencias de ARNm es difícil la adición de caperuza y las enzimas de adición de caperuza/metilación son muy caras.

La presente divulgación proporciona, en algunas realizaciones, métodos para la adición de caperuza a un ARN monocatenario (p. ej., ARNm) con trinucleótidos cotranscripcionalmente en un ensayo de transcripciónin vitrousando una variante de ARN polimerasa T7 descrita en el presente documento (p. ej., la variante de ARN polimerasa T7 G47A*). La adición de caperuza cotranscripcional eficiente típicamente incluye un molde de ADN bicatenario (ADNbc) que inicia la transcripción con 5'ATP y concentraciones equimolares de NTP y trinucleótidos. Normalmente, la ARN polimerasa T7 tiene una actividad de iniciación muy reducida con 5'ATP. Sin embargo, en presencia de trinucleótidos XAG (donde X es cualquier nucleótido, por ejemplo, 5'mGppp), la actividad de iniciación limitada de la ARN polimerasa T7 con 5'ATP impulsa la iniciación con el trinucleótido en lugar de 5'ATP, generando productos de ARNm protegidos. cotranscripcionalmente.

Se muestran caperuzas de dinucleótido y trinucleótido ejemplares disponibles comercialmente en la FIG. 14A. Cap1 de Vaccinia es una caperuza de dinucleótido típica y no se puede añadir cotranscripcionalmente. Otra caperuza de dinucleótido que se puede añadir cotranscripcionalmente es el análogo de caperuza antirreverso (ARCA en inglés), también disponible comercialmente (p. ej., de Thermo Fisher, número de catálogo: AM8045). ARCA es un análogo de caperuza modificado en el que el grupo 3' OH (más cercano a m7G) se reemplaza por -OCH<3>. ARCA se usa como control en algunos de los ensayos de adición de caperuza cotranscripcional descritos en este estudio.

En un ensayo de adición de caperuza cotranscripcional, se usó un molde de ADN de EPO humana (hEPO). También estaban presentes en la mezcla de ensayo NTP 5 mM con o sin trinucleótidos 5 mM (mGpppAG, mGmpppAG y ARCA). Los productos de ARNm no modificados se analizaron mediante ensayo de caperuza de ARNasa H o LCMS. Como se muestra en la Tabla 5, tanto la ARN polimerasa T7 de tipo silvestre (WT) como la variante de ARN polimerasa T7 G47A* fueron capaces de producir ARNm con caperuza completa con una eficiencia igualmente alta. El rendimiento de ARN era comparable entre diferentes reacciones de VIT (FIG. 14B) y se produjeron productos de ARNm con un alto grado de integridad (FIG. 14C).

Tabla 5. Eficiencia de adición de caperuza de la ARN polimerasa T7 WT o la variante de ARN polimerasa T7 G47A*

La actividad inmunoestimulante de los productos de ARNm se valoró evaluando su capacidad para inducir la producción de citocinas (IFNp) en fibroblastos BJ. Curiosamente, la ARN polimerasa T7 WT producía ARNm no modificado que inducía una alta respuesta de citocinas, mientras que la variante de ARN polimerasa T7 G47A* producía ARNm no modificado que no estimulaba la producción de citocinas en fibroblastos BJ (FIG. 14D), minimizando la necesidad de purificar adicionalmente el ARN después el ensayo de VIT/adición de caperuza. También se evaluó la expresión de hEPO a partir de los productos de ARNm. No se observó expresión de hEPO a partir del ARNm producido por la ARN polimerasa T7 WT, mientras que el ARNm producido por la variante de ARN polimerasa T7 G47A* conducía a una expresión de hEPO comparable a la del ARNm modificado con 1-metilpseudurina con caperuza capí de Vaccinia (FIG. 14E). Los experimentos de LCMS también muestran que la variante de ARN polimerasa T7 G47A* producía un ARN más limpio que la ARN polimerasa T7 WT, aunque la eficiencia de incorporación de trinucleótidos parecía ser equivalente para las dos enzimas (FIG. 15).

En un experimento diferente, se comparó la eficacia de adición de caperuza de la variante de ARN polimerasa T7 G47A* con la eficacia lograda en un ensayo de adición de caperuza estándar usando cap1 de Vaccinia. En este experimento, la mezcla de reacción contenía un molde de ADNbc de hEPO con una desoxitimidina en la posición 1 de la hebra molde (también denominada "Astart" para el primer nucleótido con molde), la variante de ARN polimerasa T7 G47A*, y NTP y trinucleótidos GAG equimolares (7,5 mM). Los productos de ARNm resultantes se purificaron usando oligo dT y se analizó la eficacia de adición de caperuza, la respuesta de citocinasin vitroy la expresiónin vitro.Los resultados muestran que la variante de ARN polimerasa T7 G47A* producía ARNm con caperuza con una eficacia comparativamente alta como el proceso de adición de caperuza estándar (Tabla 6), que el ARNm no inducía respuesta de citocinas en fibroblastos BJ (FIG. 16A), y que el ARNm conducía a una alta expresión de hEPO en fibroblastos BJ (FIG. 16B).

Tabla 6. Eficiencia de adición de caperuza de la adición de caperuza cotranscripcional y del proceso estándar

En resumen, se demostró en el presente documento que la variante de ARN polimerasa T7 G47A* puede iniciar eficientemente la transcripción en el 3'dTTP de la hebra molde en presencia de trinucleótidos XAG (p. ej., GAG o GmAG). Los trinucleótidos, proporcionados en concentraciones equimolares como los NTP en los ensayos, se pueden añadir cotranscripcionalmente para producir ARNm con caperuza completa que no estimulan una respuesta inmune y dan como resultado una alta expresión de proteínas (FIG. 17).

Ejemplo 8. Comparación del inicio de la transcripción con 5'GTP (Gstart) o 5'ATP (Astart)

Usando los ensayos de adición de caperuza cotranscripcional descritos en el Ejemplo 7, se comparó la eficiencia de adición de caperuza en constructos modelo donde el inicio de la transcripción requiere 5'-GTP (Gstart) o 5'-ATP (Astart). Se usó como molde para VIT un constructo modelo que codifica una 5'UTR y un oligonucleótido de ARN de 47 unidades. Los productos de ARN total se valoraron mediante espectrometría de masas y los resultados muestran que los constructos Astart incorporan más eficientemente los trinucleótidos GAG o GmAG, en comparación con los constructos Gstart (FIG.18A). Aunque los datos no se muestran aquí, también se observó que los constructos Cstart y Ustart producían bajas cantidades de productos con caperuza.

Además, los productos de ARN se sometieron a escisión con ARNasa H y los extremos 5' escindidos de los productos de ARN se analizaron usando espectrometría de masas para determinar la presencia de la caperuza. Se obtuvieron resultados similares a los de los productos de ARN total (FIG. 18B).

También se efectuó un experimento de titulación de trinucleótidos usando el constructo modelo usado en las FIG. 18A y 18B. En el ensayo de adición de caperuza cotranscripcional, se usaron 5 mM de NTP (A, U modificado, G, C en relación equimolar) mientras que la concentración del trinucleótido (GAG o GmAG) variaba para evaluar la eficiencia de adición de caperuza a diferentes relaciones molares de NTP. y trinucleótido. Luego, los productos de ARN brutos se analizaron mediante LC-MS. El resultado muestra que la eficiencia de adición de caperuza es máxima cuando el NTP y el trinucleótido están a una relación equimolar tanto para GAG como para GmAG (Tabla 7).

Tabla 7. Titulación de trinucleótidos

Ejemplo 9. Adición de caperuza de ARNm modificados químicamente con 1-metilpseudouridina

También se valoró la adición de caperuza cotranscripcional de ARNm modificados químicamente con 1-metilpseudouridina. Se usaron tres constructos modelo: hEPO, Luc (que codifica luciferasa) y eGFP. Todos los moldes de VIT eran moldes Astart. Los moldes pueden ser fragmentos de PCR o plásmidos. La mezcla de reacción del ensayo de adición de caperuza contenía el molde, la variante de ARN polimerasa T7 G47A*, 7,5 mM de NTP y 7,5 mM de trinucleótidos (GAG o GmAG). Los UTP en los NTP se reemplazaron por 1-metilpseudouridina para producir ARNm químicamente modificado. Se usó cap1 de Vaccinia como control de producción en un ensayo de adición de caperuza estándar. Los productos de ARNm se analizaron usando el ensayo de caperuza de ARNasa H, huellas genéticas con T1 y un analizador de fragmentos para determinar su integridad. También se ensayaron las capacidades de los productos de ARNm para inducir la respuesta de citocinas y expresar la proteína codificada en fibroblastos BJ.

Como se muestra en la Tabla 8, al ARNm modificado químicamente con 1-metilpseudouridina para los tres constructos modelo producidos a partir de moldes de fragmentos de PCR se le añadió caperuza eficientemente, la eficiencia de adición de caperuza era comparable al control cap1 de Vaccinia. La Química A designa el uso de nucleótido de trifosfato de uridina no modificado y la Química B designa el uso de nucleótido de trifosfato de 1-metilpseudouridina. La Química C designa nucleótidos de trifosfato de 5-metilcitidina y trifosfato de 1-metilpseudouridina. Se obtuvieron resultados similares para el ARNm modificado químicamente con 1-metilpseudouridina producido a partir de moldes de plásmido (Tabla 9). Además, el análisis de huellas genéticas con ARNasa T1 mostraba que los ARNm producidos a partir de los constructos modelo usando moldes de fragmentos de PCR tenían la secuencia correcta (FIG. 19A). También se mostró que el ARNm producido a partir de moldes de fragmentos de PCR (FIG. 19B) o moldes de plásmidos (FIG. 20C) tenía un alto grado de integridad. Los ARNm con caperuza producidos a partir de moldes de fragmentos de PCR así como moldes de plásmidos no inducían ninguna expresión de citocinas en fibroblastos BJ (FIG. 19C, FIG. 20D). Además, los ARNm producidos a partir de moldes de plásmidos daban como resultado la expresión de las proteínas codificadas en fibroblastos BJ (FIG. 20E-20G). Los niveles de expresión de los ARNm con caperuza GAG eran ligeramente superiores, comparables o ligeramente inferiores a los niveles de expresión de los ARNm de control de cap1 de Vaccinia.

Tabla 8. Eficiencia de adición de caperuza del ARNm modificado químicamente con 1-metilpseudouridina--moldes de fragmentos de PCR

Tabla 9. Eficiencia de adición de caperuza del ARNm modificado químicamente con 1-metilpseudouridina--moldes de plásmido

El consumo de NTP en el ensayo de adición de caperuza cotranscripcional también se valoró para reacciones que usan moldes de plásmido para constructos modelo de hEPO (FIG. 20A) y eGFP (FIG. 20B). Los resultados muestran que los trinucleótidos GAG y GmAG apenas se consumieron durante la duración del ensayo (2 horas). Esto es consistente con el hecho de que la concentración de los trinucleótidos en el ensayo estaba en exceso extremo. Puede ser posible recuperar trinucleótidos una vez completado el ensayo.

Ejemplo 10. Las sustituciones en el extremo C de la ARN polimerasa T7 afectan los rendimientos de ARN

La polimerasa G47A* contiene una glicina adicional en el extremo C ("glicina de pie") de la proteína traducida. La presencia de esta glicina de pie se confirmó mediante digestión con tripsina y análisis de espectrometría de masas de la proteína G47A* purificada (datos no mostrados). El papel de la región de pie C-terminal de G47A* se examinó con mayor detalle debido a su proximidad al sitio activo de g 47A*.

Las reacciones de transcripciónin vitro(VIT) se efectuaron usando un molde de ADN de hEPO y (1) una ARN polimerasa T7 (WT) de tipo silvestre (WT), (2) una ARN polimerasa T7 W7 con una glicina de pie (Wt G), (3) una ARN polimerasa T7 WT con dos glicinas de pie (WT GG), (4) una ARN polimerasa de tipo silvestre con dos alaninas de pie (WT AA), (5) una variante de ARN polimerasa T7 G47A, (6) una variante de ARN polimerasa T7 G47A* con una glicina de pie (G47A G), (7) una variante de ARN polimerasa T7 G47A con dos glicinas de pie (G47A GG), (8) una variante de ARN polimerasa G47A T7 con dos alaninas de pie (G47A AA), (9) una variante de ARN polimerasa T7 S43A/G47A (S43A/G47A) y (10) una variante de ARN polimerasa T7 s 43A/G47A con una glicina de pie (S43A/G47A G). Las mezclas de reacción de VIT contenían molde de ADN de hEPO, una de las variantes de ARN polimerasa T7 enumeradas anteriormente y NTP. Las reacciones de VIT con química no modificada (FIG. 22) se efectuaron con NTP estándares (ATP, CTP, GTP, UTP), mientras que las reacciones de VIT con química modificada con pseudouridina (m1^) (FIG. 23) contenían 1-metilpseudouridina en lugar de UTP para producir ARNm modificado químicamente. El rendimiento de ARN se midió mediante absorción de UV.

El rendimiento de ARNm de hEPO disminuyó con la presencia de una glicina de pie en la ARN polimerasa T7 WT o variante G47A* (FIG. 22-23). El rendimiento de ARNm continuó disminuyendo con dos glicinas de pie o dos residuos de alanina de pie, aunque hubo menos disminución con G47A* que con la ARN polimerasa T7 WT.

Ejemplo 11. Impacto de la glicina de pie de la ARN polimerasa T7 en la heterogeneidad del ARNm 3'

El ARNm de hEPO producido usando ARNP T7 WT o G47A* con una glicina de pie se digirió con ARNAsa T1 y se analizó mediante LCMS para generar huellas genéticas de oligo como en el Ejemplo 5. Las reacciones de VIT de ARNP T7 WT se realizaron con concentraciones equimolares de NTP (WT EQ) o con exceso molar de GTP y ATP (WT alfa (A)). El análisis de LCMS reveló un pico de extremo 3' limpio (5' OH/3' OH) a 32780 Da, y un pico de "cicatriz" (5' OH/3' mP) a 32860 Da (FIG. 24A). Una "cicatriz" indica que la transcripción tenía adiciones sin molde en el extremo 3'. El ARNm de hEPO producido usando ARNP T7 WT y concentraciones equimolares de NTP (WT EQ) tenía una distribución de población del extremo 3' disminuida, lo que indica una homogeneidad 3' disminuida y más productos continuos con adiciones sin molde (FIG. 24B). Sin embargo, el ARNm de hEPO producido usando ARNP T7 G47A* con un pie de glicina tenía una distribución de población en el extremo 3' más alta, lo que indica que tienen extremos 3' más limpios y una heterogeneidad mejorada en el extremo 3' (FIG. 24B).

Para examinar directamente el efecto de la región de pie de ARNP T7 sobre la homogeneidad del ARNm de hEPO 3', se efectuaron reacciones de VIT usando un molde de ADN de hEPO y (1) una ARNP T7 de tipo silvestre (WT), (2) una ARNP T7 WT con una glicina de pie (WT G), (3) una ARNP T7 Wt con dos glicinas de pie (WT GG), (4) una ARNP T7 de tipo silvestre con dos alaninas de pie (WT AA), (5) una variante de ARNP T7 G47A, (6) una variante de ARNP T7 G47A* con una glicina de pie (G47a G), (7) una variante de ARNP T7 G47A con dos glicinas de pie (G47A GG), (8) una variante de ARn P T7 G47A con dos alaninas de pie (G47A AA), (9) una variante de ARNP T7 S43A/G47A (S43A/G47A) y (10) una variante de ARNP T7 S43A/G47A con una glicina de pie (S43A/G47A G). Las mezclas de reacción de VIT contenían molde de ADN de hEPO, una de las variantes de ARNP T7 enumeradas anteriormente y NTP equimolares. Se realizaron reacciones de VIT que produjeron ARNm no modificado (FIG. 24C) o ARNm modificado con pseudouridina (FIG. 24D). El ARNm de hEPO se digirió con ARNasa T1 como en el Ejemplo 5 y anteriores. La presencia de una glicina de pie aumentaba la homogeneidad del extremo 3' del ARNm de hEPO en un 60 % (FIG. 24C-24D). Dos glicinas de pie o dos alaninas de pie en ARNP T7 también mejoraban la homogeneidad del extremo 3' en un 60-70 % con respecto a las ARNP T7 WT o G47A (FIG. 24C-24D). Estos resultados indican que la presencia de una sola glicina de pie en ARNP T7 puede aumentar la homogeneidad del extremo 3' observada en la FIG. 24B.

Ejemplo 12. Impacto de la glicina de pie de ARNP T7 sobre la estimulación inmune

El papel de la glicina de pie de ARNP T7 sobre la estimulación de una respuesta inmune a los productos de ARNm de hEPO se valoró evaluando su capacidad para inducir la producción de citocinas (IFNp) en fibroblastos BJ como en el Ejemplo 7. Curiosamente, mientras que el ARNm de hEPO no modificado y modificado con pseudouridina producido por ARNP T7 WT inducía una respuesta alta de citocinas, el ARNm de hEPO no modificado y modificado con pseudouridina producido por ARNP T7 WT estimulaba menos producción de citocinas en fibroblastos BJ (FIG. 25). El ARNm de hEPO producido por la variante de ARNP T7 G47A* con una glicina de pie no lograba estimular la producción de citocinas en fibroblastos BJ, lo que indica un efecto aditivo entre la glicina de pie y la variante de ARN polimerasa T7 G47A para no lograr inducir una respuesta inmune (FIG. 25).

Ejemplo 13. Impacto de la glicina de pie de la ARN polimerasa T7 sobre la producción de ARNm

Se desarrolló un ensayo para sondear el efecto de un residuo de glicina de pie sobre especies de ARNm de hEPO producidas por ARNP T7 WT y variante G47A. Las enzimas ARNP T7 analizadas fueron: (1) WT G (glicina de pie), (2) variante G47A o (3) variante G47A G (variante G47A*). Las reacciones de VIT contenían una de las ARNP T7 enumeradas, molde shORFan, NTP (UTP modificado o no modificado) y32P-CTP. Las reacciones se terminaron con EDTA después del tiempo deseado. Luego se desnaturalizó la mezcla en urea 4 M a 95 °C durante 5 minutos antes de cargarla en un gel desnaturalizante de poliacrilamida (poliacrilamida al 20 %) (FIG. 26A). El gel se corrió durante 30 minutos a 20 vatios y luego 2 horas adicionales a 40 vatios. La imagen se transfirió a una pantalla de fósforo (tiempo de exposición de 1 h) antes de obtener la imagen utilizando el escáner Typhoon. El uso de 32P-CTP marca el producto de longitud completa (flecha que indica ARNm de shORFan), los productos de transcripción continua (cuadro superior) (FIG. 26A) y los productos de ARNm de complemento inverso (FIG. 26A, cuadro inferior). Los resultados se resumen también en la Tabla 10 siguiente. Estos datos demuestran que la ARNP T7 con una glicina de pie se asocia con menos ARNbc contaminante que la ARNP T7 WT o G47A (FIG. 26A (cuadro inferior) y FIG. 26B). Además, una glicina de pie se asocia con una transcripción continua reducida (FIG. 26A (cuadro superior), FIG. 26B) en comparación con ARNP T7 WT o variante G47A.

Tabla 10. Relación de ARNm de complemento inverso (RC): longitud completa (FL)

Ejemplo 14. Evaluación de la dosificación repetida de ARNm G47A * con caperuza trinuc que codifica luciferasa de luciérnaga

El ARNm transcritoin vitrotípicamente se purifica, por ejemplo, mediante cromatografía de fase inversa (RP) para retirar impurezas inductoras de citocinas (ARNbc) y procesar impurezas (p. ej., proteína/ADN), y para mejorar la pureza total del ARN. Sin embargo, este proceso de purificación a menudo da como resultado una pérdida significativa de producto de ARNm. La eliminación de la RP reduce el tiempo de proceso, elimina la complejidad operativa y de ingeniería a escala y ahorra costes. Además, debido a que las altas temperaturas usadas durante la RP pueden hidrolizar una fracción del ARNm, la eliminación de la RP aumenta los niveles de expresión del ARNm. Por tanto, se ha desarrollado una estrategia de producción y purificación de ARNm para eliminar la necesidad de RP. Los ARNm producidos mediante los métodos proporcionados en este Ejemplo se denominan "ARNm G47A* con caperuza trinuc", que son ARNm con adición de caperuza de trinucleótido GpppA<2>'OmepG cotranscripcionalmente en un ensayo de transcripciónin vitrousando la variante de ARNP T7 G47A* (que tiene una sustitución G47A y una G C-terminal adicional).

En este ejemplo, se formuló una dosis única de 0,5 mpk de ARNm que codifica luciferasa de luciérnaga (ffLuc) en nanopartículas lipídicas MC3 y se administró semanalmente a ratones C57BI/6 (n= 5) durante 6 semanas (el día 1, día 8, día 15, día 22, día 29 y día 36). Se administraron los siguientes ARNm: (1) ARNm no modificado producido usando polimerasa T7 de tipo silvestre en presencia de concentraciones equimolares de NTP y purificado mediante purificación con oligo dT (Proceso 1 Química A dT); (2) ARNm modificado con pseudouridina producido usando polimerasa T7 de tipo silvestre en presencia de una concentración en exceso de GTP/ATP, y purificado mediante cromatografía de fase inversa (Proceso 2 Química B RP); (3) ARNm modificado con pseudouridina producido usando polimerasa T7 de tipo silvestre en presencia de una concentración en exceso de GTP/ATP y purificado mediante purificación con oligo dT (Proceso 2 Química B dT); (4) ARNm modificado con pseudouridina producido usando polimerasa T7 de tipo silvestre en presencia de concentraciones equimolares de NTP y purificado mediante purificación con oligo dT (Proceso 1 Química B dT); (5) ARNm de G47A* con caperuza trinuc modificado con pseudouridina (con caperuza de trinucleótido y producido usando la variante de ARNP T7 G47A*) purificado mediante cromatografía de fase inversa (Proceso 3 Química B RP); (6) ARNm de G47A* con caperuza trinuc modificado con pseudouridina purificado mediante purificación con oligo dT (Proceso 3 Química B dT); y (7) ARNm modificado con pseudouridina sin caperuza producido usando la variante ARNP T7 G47A* y purificado mediante purificación con oligo dT (Proceso 4 Química B dT)). Seis horas después de cada dosis, se evaluó lo siguiente: niveles de citocinas séricas, expresión de ARNm y niveles de IgM anti-PEG. La activación de las células B se valoró seis horas después de la dosis del día 36. La Química A designa el uso de nucleótido de trifosfato de uridina no modificado y la Química B designa el uso de nucleótido de trifosfato de 1-metilpseudouridina.. El Proceso 1 se refiere a NTP equimolares en VIT y cap1 de Vaccinia, el Proceso 2 se refiere a una VIT que contiene 4:2:1:1 de GTP:ATP:CTP:UTP (véase el documento WO 2018/053209 A1, publicado el 22 de marzo de 2018) y cap1 de Vaccinia, el Proceso 3 se refiere a NTP equimolares y GAG en VIT, y el Proceso 4 se refiere a NTP equimolares en VIT y sin caperuza.

Los resultados de la valoración de citocinas séricas (IP-10) en ratones el día 1 y el día 29 se presentan en la FIG. 27A y FIG. 27B, que muestran que los ARNm de G47A* con caperuza trinuc inducen niveles de citocinas séricasin vivo,similares a los controles de ARNm alfa. Los resultados fueron similares para experimentosin vitroen los que los ARNm se suministraron a fibroblastos humanos BJ (FIG. 28A) y macrófagos derivados de monocitos (MDM) (FIG.

28B).

Los estudios de expresión de ARNm (FIG. 29) mostraban que los ARNm de G47A* con caperuza trinuc mantenían una alta expresiónin vivodespués de 6 dosis semanales.

La valoración de IgM anti-PEG (FIG. 30) mostraba que los ARNm de G47A* con caperuza trinuc N1U producen niveles bajos de IgM anti-PEG después de 6 dosis semanales.

El análisis de activación de células B (FIG. 31) mostraba que la activación de células B esplénicas transfectadas con ARNm de G47A* con caperuza trinuc era baja, similar a los controles de ARNm alfa.

En conjunto, estos resultados indican que los ARNm de G47A* con caperuza trinuc que codifican ffLuc, que no se someten a purificación de RP, no inducen una respuesta de citocinas por encima del valor basal, mantienen altos niveles de expresiónin vivo,mantienen bajos niveles de IgM anti-PEGin vivoy exhiben una baja activación de las células B.

Ejemplo 15. Evaluación de la dosificación repetida de ARNm G47A* con caperuza T rinuc que codifica la eritropoyetina humana

En este ejemplo, se formuló una dosis única de 0,5 mpk de ARNm que codifica eritropoyetina humana (hEPO) en nanopartículas lipídicas MC3 y se administró semanalmente a ratones C57BI/6 (n= 5) durante 6 semanas (el día 1, día 8, día 15, día 22, día 29 y día 36). Se administraron los siguientes ARNm: (1) ARNm no modificado producido usando polimerasa T7 de tipo silvestre en presencia de concentraciones equimolares de NTP y purificado mediante purificación con oligo dT (Proceso 1 Química A dT); (2) ARNm modificado con pseudouridina producido usando polimerasa T7 de tipo silvestre en presencia de una concentración en exceso de GTP/ATP, y purificado mediante cromatografía de fase inversa (Proceso 2 Química B RP); (3) ARNm modificado con pseudouridina producido usando polimerasa T7 de tipo silvestre en presencia de una concentración en exceso de GTP/ATP y purificado mediante purificación con oligo dT (Proceso 2 Química B dT); (4) ARNm modificado con pseudouridina producido usando polimerasa T7 de tipo silvestre en presencia de concentraciones equimolares de NTP y purificado mediante purificación con oligo dT (Proceso 1 Química B dT); (5) ARNm de G47A* con caperuza trinuc modificado con pseudouridina (con caperuza de trinucleótido y producido usando la variante de ARNP T7 G47A*) purificado mediante cromatografía de fase inversa (Proceso 3 Química B RP); (6) ARNm de G47A* con caperuza trinuc modificado con pseudouridina purificado mediante purificación con oligo dT (Proceso 3 Química B dT); y (7) ARNm modificado con pseudouridina sin caperuza producido usando la variante ARNP T7 G47A* y purificado mediante purificación con oligo dT (Proceso 4 Química B dT)). Seis horas después de cada dosis, se evaluó lo siguiente: niveles de citocinas séricas, expresión de ARNm y niveles de IgM anti-PEG. La activación de las células B se valoró seis horas después de la dosis del día 36. La Química A designa el uso de nucleótido de trifosfato de uridina no modificado y la Química B designa el uso de nucleótido de trifosfato de 1-metilpseudouridina. El Proceso 1 se refiere a NTP equimolares en VIT y cap1 de Vaccinia, el Proceso 2 se refiere a una VIT que contiene GTP:ATP:CTP:UTP 4:2:1:1 y cap1 de Vaccinia, el Proceso 3 se refiere a NTP equimolares y GAG en VIT, y el Proceso 4 se refiere a NTP equimolares en VIT y sin caperuza.

Los resultados de la valoración de citocinas séricas (IP-10) en ratones el día 1 y el día 22 se presentan en la FIG. 32A y FIG. 32B, que muestran que los ARNm de G47A* con caperuza trinuc inducen niveles de citocinas séricasin vivo,similares a los controles de ARNm alfa. Los resultados fueron similares para experimentosin vitroen los que los ARNm se suministraron a fibroblastos humanos BJ (FIG. 33A) y macrófagos derivados de monocitos (MDM) (FIG.

33B).

Los estudios de expresión de ARNm (FIG. 34) mostraban que los ARNm de G47A* con caperuza trinuc mantenían una alta expresiónin vivodespués de 6 dosis semanales.

La valoración de IgM anti-PEG (FIG. 35) mostraba que los ARNm de G47A* con caperuza trinuc producen niveles bajos de IgM anti-PEG después de 6 dosis semanales.

El análisis de activación de células B (FIG. 36) mostraba que la activación de células B esplénicas transfectadas con ARNm de G47A* con caperuza trinuc era baja, similar a los controles de ARNm alfa.

En conjunto, estos resultados indican que los ARNm de G47A* con caperuza trinuc que codifican hEPO, que no se someten a purificación de RP, no inducen una respuesta de citocinas por encima del valor basal, mantienen altos niveles de expresiónin vivo,mantienen bajos niveles de IgM anti-PEGin vivoy exhiben una baja activación de las células B.

Ejemplo 16. Evaluación de la frecuencia de indel y la frecuencia de mutación puntual

Se prepararon ARNm con enzimas WT o G47A* usando el Proceso 1 (NTP equimolares) o el Proceso 2 (GTP:ATP:CTP:UTP 4:2:1:1). Para la secuenciación de nueva generación (NGS), los ARNm se convirtieron en ADNc mediante transcriptasa inversa y se ligaron adaptadores para preparar la colección de secuenciación. Los datos de NGS se compararon con la secuencia principal y se tabularon los indeles observados. La frecuencia de indel era comparable para WT y G47A* (FIG. 37A). Asimismo, los datos de NGS se analizaron en busca de mutaciones puntuales. La frecuencia de mutación puntual era comparable para WT y G47A* (FIG. 37B).

Los artículos indefinidos "un" y "una", como se usan en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, deben entenderse como "al menos uno".

También debe entenderse que, a menos que se indique claramente lo contrario, en cualquier método reivindicado en el presente documento que incluya más de una etapa o acto, el orden de las etapas o actos del método no se limita necesariamente al orden en que se enumeran las etapas o actos del método.

En las reivindicaciones, así como en la memoria descriptiva anterior, todas las frases de transición tales como "que comprende", "que incluye", "que porta", "que tiene", "que contiene", "que implica", "que retiene", "compuesto de, "y similares deben entenderse como abiertas, es decir, que significan que incluyen pero sin limitación. Solo las frases de transición "que consiste en" y "que consiste esencialmente en" serán frases de transición cerradas o semicerradas, respectivamente, como se expone en el United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, sección 2111.03

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una variante de polimerasa de ácido ribonucleico (ARN) T7 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la SEQ ID NO:1 modificada para incluir una sustitución de aminoácido correspondiente a la posición G47 de SEQ ID NO:1; en donde la sustitución de aminoácido es alanina (G47A).

2. La variante de ARN polimerasa T7 de la reivindicación 1, en donde la variante de ARN polimerasa T7 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3.

3. La variante de ARN polimerasa T7 de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además un aminoácido C-terminal adicional.

4. La variante de ARN polimerasa T7 de la reivindicación 3, en donde el aminoácido C-terminal adicional es glicina (G).

5. La variante de ARN polimerasa T7 de la reivindicación 1, en donde la variante de ARN polimerasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:110 o SEQ ID NO:109.

6. Un método para efectuar una reacción de transcripciónin vitro(TIV), que comprende poner en contacto un molde de ADN con la ARN polimerasa T7 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en presencia de trifosfatos de nucleósidos y tampón en condiciones que dan como resultado la producción de transcrito de ARN.

7. Un ácido nucleico que codifica la variante de ARN polimerasa T7 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

8. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 7.

9. Una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 7.

10. Un método de adición de caperuza cotranscripcional para la síntesis de ácido ribonucleico (ARN), comprendiendo el método hacer reaccionar un molde de polinucleótido con:

(i) la variante de ARN polimerasa T7 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5,

(ii) trifosfatos de nucleósidos, y

(iii) un análogo de caperuza,

en condiciones de reacción de transcripciónin vitropara producir un transcrito de ARN.

11. El método de adición de caperuza cotranscripcional de la reivindicación 10, en donde el análogo de caperuza es una caperuza de dinucleótido, una caperuza de trinucleótido o una caperuza de tetranucleótido.

12. El método de adición de caperuza cotranscripcional de la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en donde la caperuza de trinucleótido comprende GpppA<2>'OmepG.