ES2982395T3

ES2982395T3 - Membrana placentaria descelularizada y procedimientos de preparación y uso de la misma

Info

Publication number: ES2982395T3
Application number: ES16880147T
Authority: ES
Inventors: Xiaofei Qin; Silvia Chen; Lindsey Aschenbach; Jingsong Chen
Original assignee: Lifenet Health
Current assignee: Lifenet Health
Priority date: 2015-12-23
Filing date: 2016-12-23
Publication date: 2024-10-15
Anticipated expiration: 2036-12-23
Also published as: EP3393536A1; KR20180095913A; EP3393536B1; US11207446B2; CA3009178A1; WO2017112934A1; EP3393536A4; US20180361026A1; US20220184279A1

Abstract

Se proporciona un método para preparar una membrana placentaria descelularizada. El método comprende la extracción de células de una membrana placentaria pre-descelularizada que comprende una capa de amnios y una capa de corion para producir una membrana placentaria descelularizada sin separar la capa de amnios de la capa de corion. La membrana placentaria pre-descelularizada se obtiene de un saco amniótico, y la membrana placentaria descelularizada comprende la capa de amnios y la capa de corion. También se proporciona una membrana placentaria descelularizada y un injerto derivado de placenta que comprende la membrana placentaria descelularizada. Además, se proporcionan los usos de la membrana placentaria descelularizada o del injerto derivado de placenta. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Membrana placentaria descelularizada y procedimientos de preparación y uso de la misma

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a una membrana placentaria descelularizada, procedimientos de preparación de la membrana placentaria descelularizada a partir de un saco amniótico y procedimientos de uso de la misma.

El documento US2008/044848 A divulga un biotejido de colágeno para el cultivo de células madre. El biotejido se obtiene de la membrana amniótica de la placenta humana y las capas de amnios y corion pueden separarse opcionalmente durante la preparación. El biotejido de colágeno puede estar impregnado de sustancias bioactivas, como factores de crecimiento,

Sumario de la invención

La invención se refiere a una membrana placentaria descelularizada que comprende capas de amnios y corion, y a procedimientos de preparación o uso de la misma como se indica en las reivindicaciones 1 a 13.

Las referencias a los procedimientos de tratamiento mediante terapia o cirugía o procedimientos de diagnóstico in vivo en esta descripción deben interpretarse como referencias a compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en dichos procedimientos,

Se proporciona un procedimiento para preparar una membrana placentaria descelularizada. El procedimiento comprende la eliminación de células de una membrana placentaria predescelularizada que comprende una capa de amnios y una capa de corion para producir una membrana placentaria descelularizada sin separar la capa de amnios de la capa de corion. La membrana placentaria predescelularizada se obtiene de un saco amniótico, y la membrana placentaria descelularizada comprende la capa de amnios y la capa de corion.

De acuerdo con el procedimiento de preparación, la membrana placentaria descelularizada puede comprender uno o más factores de crecimiento en una cantidad que sea al menos un 10% mayor que la suma de la cantidad de uno o más factores de crecimiento en una membrana amniótica aislada de control descelularizada y la cantidad de uno o más factores de crecimiento en una membrana coriónica aislada de control descelularizada que tenga un tamaño de área sustancialmente idéntico; la membrana placentaria descelularizada puede comprender uno o más factores de crecimiento en una cantidad que sea al menos el 20% de la cantidad de uno o más factores de crecimiento en la membrana placentaria predescelularizada; o la membrana placentaria descelularizada puede comprender menos de 100 ng de dsADN por mg de peso seco de la membrana placentaria descelularizada. La membrana placentaria descelularizada comprende ADN en una cantidad inferior al 10% del ADN de la membrana placentaria predescelularizada.

De acuerdo con el procedimiento de preparación, la capa de amnios en la membrana placentaria descelularizada puede comprender una capa de fibroblastos y la capa de corion en la membrana placentaria descelularizada puede comprender una capa reticular; o la capa de amnios de la membrana placentaria descelularizada puede comprender epitelio, una membrana basal, una capa compacta, una capa de fibroblastos y una capa esponjosa, mientras que la capa de corion de la membrana placentaria descelularizada puede comprender una capa celular, una capa reticular, una pseudomembrana basal y una capa de trofoblastos.

El procedimiento de preparación puede comprender además la extracción del saco amniótico de un donante.

El procedimiento de preparación puede comprender además la limpieza y desinfección de la membrana placentaria predescelularizada.

El procedimiento de preparación puede comprender además tratar la membrana placentaria predescelularizada con un reactivo que comprende uno o más detergentes desnaturalizantes.

El procedimiento de preparación puede comprender además tratar la membrana placentaria predescelularizada con un reactivo que comprende uno o más detergentes no desnaturalizantes.

El procedimiento de preparación puede comprender además la congelación o liofilización de la membrana placentaria descelularizada.

El procedimiento de preparación puede comprender además la esterilización de la membrana placentaria descelularizada.

El procedimiento de preparación puede comprender además el almacenamiento de la membrana placentaria descelularizada a temperatura ambiente, temperatura de 10°C o inferior, congelación o crioconservación. La membrana placentaria descelularizada almacenada puede tener un contenido de agua inferior al 0,5% en peso basado en el peso total de la membrana placentaria descelularizada. La membrana placentaria descelularizada almacenada puede tener un contenido de agua del5-95%en peso basado en el peso total de la membrana placentaria descelularizada.

El procedimiento de preparación puede comprender además el tratamiento de la membrana placentaria descelularizada con un agente sustitutivo del agua. El agente sustitutivo del agua puede comprender uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en glicerol (glicerina USP), adonitol, sorbitol, ribitol, galactitol, D-galactosa, 1,3-dihidroxipropanol, etilenglicol, trietilenglicol, propilenglicol, glucosa, sacarosa, manitol, xilitol, mesoeritritol, ácido adípico, prolina, hidroxiprolina, polietilenglicol, alcohol y lípidos.

El procedimiento de preparación puede comprender además inmovilizar la membrana placentaria predescelularizada sobre un sustrato antes de retirar las células, de manera que la membrana placentaria descelularizada quede inmovilizada sobre el sustrato, y almacenar la membrana placentaria descelularizada inmovilizada. El procedimiento de preparación puede comprender además la congelación o liofilización de la membrana placentaria descelularizada inmovilizada.

También se proporciona una membrana placentaria descelularizada preparada por el procedimiento de preparación.

Se proporciona además una membrana placentaria descelularizada que comprende una capa de amnios y una capa de corion. La capa de amnios y la capa de corion se derivan de una membrana placentaria sin separación de la capa de amnios de la capa de corion.

La membrana placentaria descelularizada de la presente invención puede comprender uno o más factores de crecimiento en una cantidad que sea al menos un 10% mayor que la suma de la cantidad de uno o más factores de crecimiento en una membrana amniótica aislada de control descelularizada y la cantidad de uno o más factores de crecimiento en una membrana coriónica aislada de control descelularizada tienen un tamaño de área sustancialmente idéntico; la membrana placentaria descelularizada puede comprender uno o más factores de crecimiento en una cantidad que sea al menos el 20% de la cantidad de uno o más factores de crecimiento en la membrana placentaria predescelularizada; la membrana placentaria descelularizada puede comprender factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una cantidad que sea al menos el 20% de la cantidad de PDGF en la membrana placentaria predescelularizada; la membrana placentaria descelularizada puede contener factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) en una cantidad que sea al menos el 20% de la cantidad de bFGF en la membrana placentaria predescelularizada; o la membrana placentaria descelularizada puede contener ADN en una cantidad que sea inferior al 20% del ADN en la membrana placentaria predescelularizada.

Se proporciona un injerto derivado de placenta que comprende la membrana placentaria descelularizada de la presente invención y uno o más agentes. Uno o más agentes pueden seleccionarse del grupo formado por conservantes, agentes sustitutivos del agua, otros tejidos blandos, materiales sintéticos y combinaciones de los mismos.

Se proporciona un procedimiento que comprende el cultivo de células en presencia de la membrana placentaria descelularizada o del injerto derivado de placenta de la presente invención. Las células pueden seleccionarse del grupo formado por células madre, células madre derivadas de tejido adiposo, células ganglionares de la raíz dorsal, células de islotes pancreáticos, cardiomiocitos, hepatocitos, iPSCs, células cancerosas y células endoteliales de la vena umbilical. El procedimiento de cultivo puede comprender además el almacenamiento de las células cultivadas en presencia de la membrana placentaria descelularizada o del injerto derivado de la placenta. Las células pueden almacenarse mediante criopreservación.

Se proporciona un procedimiento para promover la diferenciación de células madre pluripotentes o células progenitoras específicas de tejido. El procedimiento comprende el cultivo de las células madre pluripotentes o de las células progenitoras específicas de tejido en presencia de una cantidad eficaz de la membrana placentaria descelularizada o del injerto derivado de placenta de la presente invención.

Se proporciona un procedimiento para reparar un defecto en un tejido. El procedimiento comprende poner en contacto el lugar del defecto con una cantidad eficaz de la membrana placentaria descelularizada o del injerto derivado de placenta de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra ejemplos de membranas placentarias predescelularizadas suturadas en dos marcos de formas diferentes sin limpieza ni extracción de células.

La FIG. 2 muestra ejemplos de membranas placentarias descelularizadas suturadas en el soporte tras la limpieza y la eliminación de células (A) y la liofilización (B).

La FIG. 3 muestra ejemplos de membranas placentarias predescelularización (A) y descelularización (B) teñidas con H&E (10x).

La FIG. 4 representa la cuantificación de PDGF-AA en membranas placentarias ejemplares predescelularizadas y descelularizadas.

La FIG. 5 representa la cuantificación de bFGF en membranas placentarias ejemplares predescelularizadas y descelularizadas.

La FIG. 6 representa un esquema ejemplar de fijación de una membrana placentaria predescelularizada sobre un sustrato (A: preparación de una membrana placentaria predescelularizada ejemplar con membrana amniótica y membrana coriónica; B: colocación de diferentes tamaños de marcos de malla sobre la membrana; C: corte de la membrana alrededor de los marcos correspondientes; D: fijación de la membrana con el marco con grapas cutáneas; y E: lavado de la pieza de membrana placentaria predescelularizada con el marco y las grapas). La FIG. 7 representa un esquema ejemplar de fijación de una membrana placentaria predescelularizada sobre un sustrato.

La FIG. 8 representa otro esquema ejemplar de fijación de una membrana placentaria predescelularizada sobre un sustrato.

La FIG. 9 representa la membrana amniótica predescelularizada (AM) aislada de la membrana coriónica predescelularizada (CM).

La FIG. 10 representa la comparación de la cantidad de PDGF-AA (A) y bFGF (B) en la membrana placentaria intacta (WM), la membrana amniótica aislada (AM) y la membrana coriónica aislada (CM) del mismo tamaño tras la descelularización. La cantidad de PDGF-AA de la membrana amniótica (AM) aislada estaba por debajo del límite de detección del kit ELISA.

La FIG. 11 representa la cuantificación del ADN en células de fibroblastos dérmicos humanos (HDF) que se cultivaron en medios de control o medios con una extracción de membrana placentaria descelularizada.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a un procedimiento de preparación de una membrana placentaria descelularizada a partir de una membrana placentaria predescelularizada que comprende una capa de amnios y una capa de corion mediante la eliminación de células sin separar la capa de amnios y la capa de corion. La membrana placentaria descelularizada puede utilizarse para preparar injertos derivados de la placenta, cultivar células, promover la diferenciación y/o aumentar el mantenimiento de la capacidad de autorrenovación de células madre pluripotentes o células progenitoras específicas de un tejido, y reparar un defecto en un tejido.

El término "saco amniótico", tal como se utiliza aquí, se refiere a una membrana placentaria fina pero resistente que contiene líquido amniótico en el que se desarrolla un embrión y, posteriormente, un feto. La bolsa amniótica consta de una capa interna (amnios) y una capa externa (corion). La capa de amnios comprende varias subcapas, por ejemplo, epitelio, una membrana basal, una capa compacta, una capa de fibroblastos y una capa esponjosa (de dentro a fuera). Del mismo modo, la capa del corion comprende varias subcapas, por ejemplo, una capa celular, una capa reticular, una pseudomembrana basal y una capa de trofoblastos (de dentro a fuera). La capa de amnios y la capa de corion están formadas por células y moléculas celulares y extracelulares (por ejemplo, factores de crecimiento, enzimas y moléculas de matriz extracelular). La bolsa amniótica puede obtenerse de un donante. El donante puede ser un mamífero, por ejemplo, humano, bovino, porcino, murino, ovino, equino, canino, caprino y felino, preferiblemente un humano.

El término "membrana placentaria predescelularizada" utilizado aquí se refiere a un trozo de membrana de un saco amniótico. La membrana placentaria predescelularizada puede ser entera, completa o una parte de una membrana placentaria que tenga la capa de amnios y la capa de corion en el saco amniótico. La membrana placentaria predescelularizada puede obtenerse del saco amniótico por cualquier procedimiento y puede tener cualquier tamaño o forma. La capa de amnios en la membrana placentaria predescelularizada puede comprender varias subcapas, por ejemplo, epitelio, una membrana basal, una capa compacta, una capa de fibroblastos y una capa esponjosa (de dentro a fuera). La capa de amnios en la membrana placentaria predescelularizada puede comprender al menos la capa de fibroblastos. La capa de corion en la membrana placentaria predescelularizada puede comprender varias subcapas, por ejemplo, una capa celular, una capa reticular, una pseudomembrana basal y una capa de trofoblasto (de dentro a fuera). La capa de corion en la membrana placentaria predescelularizada puede comprender al menos la capa reticular. La capa de amnios y la capa de corion en la membrana placentaria predescelularizada comprenden cada una células, así como moléculas celulares y extracelulares (por ejemplo, factores de crecimiento, enzimas y moléculas de matriz extracelular).

El término "membrana placentaria descelularizada", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una membrana placentaria obtenida mediante la eliminación de una cantidad sustancial, por ejemplo, al menos el 70, 80, 90, 95, 99, 99,9 o 99,999% de las células de una membrana placentaria predescelularizada. La membrana placentaria descelularizada de la presente invención comprende la capa de amnios y la capa de corion en la membrana placentaria predescelularizada. La membrana placentaria del amnios puede comprender epitelio, una membrana basal, una capa compacta, una capa de fibroblastos y/o una capa esponjosa, mientras que el corion la membrana placentaria descelularizada puede comprender una capa celular, una capa reticular, una pseudomembrana basal y/o una capa de trofoblastos.

El término "membrana amniótica aislada", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una membrana de la capa de amnios separada de la capa de corion en la membrana placentaria predescelularizada. La separación puede lograrse por cualquier procedimiento. Por ejemplo, la capa de amnios puede pelarse o arrancarse de la capa de corion o desprenderse de la capa de corion mediante un tratamiento químico que comprenda una solución altamente salina. La membrana amniótica aislada puede comprender epitelio, una membrana basal, una capa compacta, una capa de fibroblastos y/o una capa esponjosa. La membrana amniótica aislada puede descelularizarse eliminando una cantidad sustancial, por ejemplo, al menos el 70, 80, 90, 95, 99, 99,9 o 99,999% de las células de la membrana amniótica.

El término "membrana coriónica aislada", tal como se utiliza aquí, se refiere a una membrana de la capa coriónica separada de la capa amniótica en la membrana placentaria predescelularizada. La separación puede lograrse por cualquier procedimiento. Por ejemplo, la capa de corion puede pelarse o arrancarse de la capa de amnios o desprenderse de la capa de amnios mediante un tratamiento químico que comprenda una solución altamente salina. La membrana coriónica aislada puede comprender una capa celular, una capa reticular, una pseudomembrana basal y/o una capa de trofoblasto. La membrana coriónica aislada puede descelularizarse eliminando una cantidad sustancial, por ejemplo, al menos el 70, 80, 90, 95, 99, 99,9 o 99,999% de las células de la membrana coriónica.

La presente invención proporciona un procedimiento para preparar una membrana placentaria descelularizada. El procedimiento comprende la eliminación de células de una membrana placentaria predescelularizada que comprende una capa de amnios y una capa de corion para producir una membrana placentaria descelularizada sin separar la capa de amnios de la capa de corion. La membrana placentaria predescelularizada se obtiene de un saco amniótico. La membrana placentaria descelularizada comprende la capa de amnios y la capa de corion.

El término "sin separación", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a que la capa de amnios y la capa de corion permanecen en contacto entre sí con una superficie de contacto de, por ejemplo, al menos 1, 10, 100, 1.000 o 10.000 mm2 durante la etapa de eliminación de células de una membrana placentaria predescelularizada para producir una membrana placentaria descelularizada. La superficie de contacto entre la capa de amnios y la capa de corion puede solaparse con al menos el 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 o 99 % de la superficie de la capa de amnios orientada hacia la capa de corion. La superficie de contacto puede solaparse con al menos el 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 o 99 % de la superficie de la capa de corion que da a la capa de amnios.

El procedimiento de eliminación de células o descelularización descrito en el presente documento puede realizarse de acuerdo con los procedimientos descritos en las Patentes de EE.UU. N.° 6.734.018, 7,338,757, 8,574,826, 6,743,574y 8,563,232 y la Publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2014/0065238A1 y 2014/0154663A1. El procedimiento de descelularización puede realizarse sin dañar la matriz y/o la estructura tisular de la membrana placentaria y puede emplear sarcosinatos y agentes descontaminantes. En algunas realizaciones, el procedimiento de descelularización puede o no incluir el uso de detergente, endonucleasa y/o proteasa. La membrana placentaria descelularizada o un injerto derivado de la placenta puede incluir colágenos, hialuroninas, elastinas, mucopolisacáridos y proteoglicanos, entre otros componentes. En algunas realizaciones, la membrana placentaria descelularizada o un injerto derivado de placenta puede comprender más de un tipo de colágeno y/o más de una proteína, además de colágeno, colágeno tipo I y/o colágeno tipo IV.

En algunas realizaciones, la membrana placentaria descelularizada comprende menos de 1000, 500, 100, 80, 50 o 10 ng de ADN de doble cadena (dsADN) por mg de peso seco de la membrana placentaria descelularizada. En otras realizaciones, la cantidad de ADN en la membrana placentaria descelularizada se reduce en un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 % o más; en un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99, 100 % o menos; y/o entre un 50 y un 100 %, entre un 70 y un 100 %, entre un 90 y un 100 %, entre un 90 y un 95 % en comparación con la cantidad de ADN en la membrana placentaria predescelularizada. La membrana placentaria descelularizada puede contener ADN en una cantidad inferior al 50, 40, 30, 20, 10, 5 o 1 % del ADN de la membrana placentaria predescelularizada.

La membrana placentaria descelularizada puede comprender uno o más factores de crecimiento y/o citoquinas (por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF), factor de crecimiento placentario (PIGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento transformante (TGF), proteína inflamatoria de macrófagos, interleuquinas, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) y proteína de unión del factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP)) en una cantidad que es al menos 1, 5, 10, 15, 20, 25 o 30 % mayor que la suma de la cantidad de uno o más factores de crecimiento en una membrana amniótica aislada de control descelularizada y la cantidad de uno o más factores de crecimiento en una membrana coriónica aislada de control descelularizada que tiene un tamaño de área sustancialmente idéntico. El término "tamaño de área sustancialmente idéntico", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un tamaño de área, por ejemplo, el tamaño de un área de sección de una membrana placentaria descelularizada, que es menos del 20, 15, 10, 5 o 1 % diferente de un tamaño de área de control, por ejemplo, el tamaño de área de una membrana amniótica o coriónica aislada descelularizada. La membrana amniótica aislada de control descelularizada y la membrana coriónica aislada de control descelularizada pueden prepararse a partir del saco amniótico utilizado para preparar la membrana placentaria descelularizada.

La membrana placentaria descelularizada puede comprender uno o más factores de crecimiento y/o citoquinas (por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF), factor de crecimiento placentario (PIGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento transformante (TGF), proteína inflamatoria de macrófagos, interleucinas, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) y proteína de unión del factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP)) en una cantidad que sea al menos el 1, 5, 10, 15, 20, 25 o 30%de la cantidad de uno o más factores de crecimiento en la membrana placentaria predescelularizada.

El procedimiento de preparación puede comprender además la extracción del saco amniótico de un donante. El donante puede ser un mamífero, por ejemplo, humano, bovino, porcino, murino, ovino, equino, canino, caprino y felino, preferiblemente un ser humano.

El procedimiento de preparación puede comprender además separar la membrana placentaria predescelularizada de una placenta, por ejemplo, cortando el saco amniótico de la placenta alrededor de la falda placentaria.

El procedimiento de preparación puede comprender la limpieza y desinfección de la membrana placentaria predescelularizada. El procedimiento puede comprender además la eliminación de tejidos extraños asociados a la membrana placentaria predescelularizada. La membrana placentaria predescelularizada puede cortarse y lavarse con agua destilada/desionizada libre de endotoxinas y/o una solución acuosa, como solución salina isotónica, entre otras. En el procesamiento, se pueden realizar múltiples "lavados" o "limpiezas" utilizando volúmenes de solución acuosa que sean 2, 5 o 10 veces el volumen aproximado del tejido que se está procesando, en algunas realizaciones. El uso de tres de estas etapas de procesamiento puede afectar a una dilución aproximada de 1:100, 1:500 o 1:1000 de los elementos solubilizables asociados, haciendo que el tejido esté esencialmente libre de dichos elementos solubilizables. La membrana placentaria predescelularizada y las piezas de membrana placentaria descelularizada pueden tener un grosor de 30, 20, 15, 10, 8, 5, 3, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05 mm o menos, en ciertas realizaciones. La membrana placentaria predescelularizada y las piezas de membrana placentaria descelularizada también pueden tener un grosor de 30, 20, 10, 8, 5, 3, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05 mm o más. En otro aspecto, el procedimiento aquí descrito también puede comprender la esterilización de la membrana placentaria descelularizada, y/o del injerto derivado de placenta. La esterilización puede implicar el uso de radiación ionizante, en algunas realizaciones. En otras realizaciones, la dosis absorbida de radiación ionizante puede estar comprendida entre 1,0 KGy y 50 KGy, entre 8,0 KGy y 50 KGy, entre 8,0 KGy y 25 KGy, o entre 8,0 KGy y 18 KGy. En algunas realizaciones, la etapa de esterilización puede incluir la colocación de los implantes de reparación tisular empaquetados que comprenden la membrana placentaria descelularizada en hielo seco y la irradiación de la composición empaquetada. En ciertas realizaciones, la esterilización puede llevarse a cabo a una temperatura de entre -20 °C y -50 °C. Los implantes de la presente invención pueden esterilizarse mediante irradiación gamma, dióxido de carbono supercrítico, óxido de etileno, plasma o haz electrónico.

Los procedimientos de preparación pueden comprender además el almacenamiento de la membrana placentaria descelularizada, por ejemplo, a temperatura ambiente, a baja temperatura o en crioconservación. La membrana placentaria descelularizada puede almacenarse en estado húmedo o seco. La membrana placentaria descelularizada almacenada puede tener un contenido de agua inferior al 0,5% (por ejemplo, 0,01-5%) o 5-95% en peso basado en el peso total de la membrana placentaria descelularizada. El procedimiento puede comprender además el tratamiento de la membrana placentaria descelularizada con un agente sustitutivo del agua. El agente sustitutivo del agua puede seleccionarse del grupo formado por glicerol (glicerina USP), adonitol, sorbitol, ribitol, galactitol, D-galactosa, 1,3-dihidroxipropanol, etilenglicol, trietilenglicol, propilenglicol, glucosa, sacarosa, manitol, xilitol, mesoeritritol, ácido adípico, prolina, hidroxiprolina, polietilenglicol, alcohol y lípidos.

El procedimiento puede comprender además la congelación o liofilización de la membrana placentaria descelularizada. La membrana placentaria descelularizada puede liofilizarse hasta un punto tal que los fragmentos liofilizados tengan una humedad residual media inferior al 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 o 0,1 % en peso.

El procedimiento puede comprender además tratar la membrana placentaria predescelularizada con un reactivo que comprende uno o más detergentes. Algunos ejemplos de detergentes son el detergente aniónico que comprende sales de ácido biliar y/o dodecil sulfato sódico (SDS); el detergente catiónico que comprende bromuro de cetil-trimetil-amonio (CTAB), y los detergentes no iónicos o zwitteriónicos que comprenden BRIJ®,TRITON® y CHAPS.

El procedimiento puede comprender además tratar la membrana placentaria predescelularizada con un reactivo que comprende uno o más detergentes desnaturalizantes. Un ejemplo de detergente desnaturalizante es el dodecil sulfato sódico (SDS). El procedimiento puede comprender además tratar la membrana placentaria predescelularizada con un reactivo que comprenda uno o más detergentes no desnaturalizantes. Algunos ejemplos de detergentes no desnaturalizantes son el N-lauroilsarcosinato, el n-octil-b-D-glucopiranósido, un alcohol polioxietilenado, un isoalcohol polioxietilenado, un p-t-octil fenol polioxietilenado, un nonifenol polioxietilenado, un éster polioxietilenado de un ácido graso y un éster polioxietilenado de sorbitol.

El procedimiento puede comprender además inmovilizar la membrana placentaria predescelularizada sobre un sustrato antes de retirar las células, de manera que la membrana placentaria descelularizada quede inmovilizada sobre el sustrato y almacenar la membrana placentaria descelularizada inmovilizada (véanse las FIG. 6-8). La membrana placentaria descelularizada puede almacenarse en el sustrato. El sustrato puede estar hecho de varios componentes incluyendo, pero no limitado a, polímero, plástico, polipropileno, poliéster, metal y madera. El sustrato puede ser hueco para maximizar el área de superficie de la membrana placentaria predescelularizada o de la membrana placentaria descelularizada expuesta a un líquido (por ejemplo, una solución) utilizado para la extracción o el almacenamiento de células, respectivamente. Por ejemplo, el sustrato puede ser un marco (véanse las FIG. 6-8). Los procedimientos pueden comprender además la congelación, liofilización o liofilización de la membrana placentaria descelularizada que está inmovilizada en el sustrato.

El procedimiento puede no incluir la digestión de la membrana placentaria predescelularizada o de la membrana placentaria descelularizada en una solución de digestión. La solución de digestión aquí descrita puede incluir una enzima para digerir al menos una parte de las proteínas de la membrana placentaria predescelularizada. Por ejemplo, la solución de digestión puede comprender un ácido, como HCl y otros ácidos fuertes y débiles, y una proteasa que incluya, entre otras, papaína, pepsina, pepsinógeno, tripsina, colagenasas y/o dispasa. Tal y como se utiliza aquí, el término "y/o" incluye todas y cada una de las combinaciones de uno o más de los elementos enumerados asociados.

La presente invención también proporciona una membrana placentaria descelularizada preparada según el procedimiento de preparación de la presente invención.

La presente invención también proporciona una membrana placentaria descelularizada que comprende una capa de amnios y una capa de corion. La capa de amnios y la capa de corion se derivan de una membrana placentaria sin separación de la capa de amnios de la capa de corion. La capa de amnios en la membrana placentaria descelularizada puede comprender epitelio, una membrana basal, una capa compacta, una capa de fibroblastos y/o una capa esponjosa. La capa de corion en la membrana placentaria descelularizada puede comprender una capa celular, una capa reticular, una pseudomembrana basal y/o una capa de trofoblasto.

La membrana placentaria descelularizada de la presente invención puede comprender uno o más factores de crecimiento y/o citoquinas (por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF), factor de crecimiento placentario (PIGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento transformante (TGF), proteína inflamatoria de macrófagos, interleuquinas, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) y proteína de unión del factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP)) en una cantidad que es al menos 1, 5, 10, 15, 20, 25 o 30 % mayor que la suma de la cantidad de uno o más factores de crecimiento y/o citoquinas en una membrana amniótica aislada de control descelularizada y la cantidad de uno o más factores de crecimiento y/o citoquinas en una membrana coriónica aislada de control descelularizada que tiene un tamaño de área sustancialmente idéntico. El término "tamaño de área sustancialmente idéntica", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un tamaño de área, por ejemplo, el tamaño de un área de sección de una membrana placentaria descelularizada, que es menos del 20, 15, 10, 5 o 1 % diferente de un tamaño de área de control, por ejemplo, el tamaño de área de una membrana amniótica o coriónica aislada de control descelularizada. La membrana amniótica aislada de control descelularizada y la membrana coriónica aislada de control descelularizada pueden prepararse a partir del saco amniótico utilizado para preparar la membrana placentaria descelularizada.

La membrana placentaria descelularizada de la presente invención puede comprender uno o más factores de crecimiento y/o citoquinas (por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF), factor de crecimiento placentario (PIGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento transformante (TGF), proteína inflamatoria de macrófagos, interleucinas, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) y proteína de unión del factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP) en una cantidad que sea al menos el 1, 5, 10, 15, 20, 25 o 30 % de la cantidad de uno o más factores de crecimiento en la membrana placentaria predescelularizada.

La membrana placentaria descelularizada de la presente invención puede comprender menos de 1000, 500, 100, 80, 50 o 10 ng de ADN de doble cadena (dsADN) por mg de peso seco de la membrana placentaria descelularizada. La cantidad de ADN en la membrana placentaria descelularizada puede reducirse en un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 % o más; en un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99, 100 % o menos; y/o entre un 50 y un 100 %, entre un 70 y un 100 %, entre un 90 y un 100 %, entre un 90 y un 95 % en comparación con la cantidad de ADN en la membrana placentaria predescelularizada. La membrana placentaria descelularizada comprende ADN en una cantidad inferior al 10, 5 o 1 % del ADN de la membrana placentaria predescelularizada.

La presente invención proporciona además un injerto derivado de placenta. El injerto derivado de placenta comprende la membrana placentaria descelularizada de la presente invención y uno o más agentes. El uno o más agentes pueden ser cualquier agente adecuado para la implantación de injertos, y pueden ser seleccionados del grupo que consiste en conservantes, agentes de sustitución de agua, otros tejidos blandos, material sintético, y combinaciones de los mismos.

El injerto derivado de placenta puede ser un autoinjerto, un aloinjerto o un xenoinjerto.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente" que modifica, por ejemplo, las dimensiones, volúmenes, cantidad de un ingrediente en una composición, concentraciones, temperatura de procedimiento, tiempo de procedimiento, rendimientos, caudales, presiones y valores similares, y rangos de los mismos, se refiere a la variación en la cantidad numérica que puede ocurrir, por ejemplo, a través de procedimientos típicos de medición y manipulación utilizados para hacer compuestos, composiciones, concentrados o formulaciones de uso; por errores involuntarios en estos procedimientos; por diferencias en la fabricación, fuente o pureza de los materiales de partida o ingredientes utilizados para llevar a cabo los procedimientos; y consideraciones similares. El término "aproximadamente" también abarca las cantidades que difieren debido al envejecimiento de, por ejemplo, una composición, formulación o cultivo celular con una concentración o mezcla inicial particular, y las cantidades que difieren debido a la mezcla o procesamiento de una composición o formulación con una concentración o mezcla inicial particular. Modificadas por el término "aproximadamente", las reivindicaciones adjuntas incluyen equivalentes a estas cantidades. El término "aproximadamente" puede referirse además a un rango de valores similares al valor de referencia indicado. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente" se refiere a un rango de valores que se encuentran dentro del 10, 9, 8,7, 6, 5,4, 3, 2, 1 por ciento o menos del valor de referencia indicado.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además (i) recoger la placenta junto con el saco amniótico de la cesárea, (ii) cortar el saco amniótico que comprende la membrana placentaria predescelularizada de la placenta, en la que las capas de amnios y corion permanecen en contacto entre sí antes y/o durante el procedimiento de descelularización, y/o (iii) cortar la membrana placentaria predescelularizada antes de la descelularización. En otras realizaciones, el corte produce trozos de membrana placentaria predescelularizada con un tamaño medio de 1000, 500, 300, 100, 50, 30 o 10 cm2 y/o una dimensión media de 0,5, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 mm o más. En otras realizaciones, el procedimiento descrito en el presente documento también puede comprender el corte de la membrana placentaria predescelularizada o la membrana placentaria descelularizada para tener una dimensión de 1 mm a 60 cm, de 1 mm a 50 cm, de 1 cm a 60 cm, de 1 cm a 50 cm, o de 1 cm a 10 cm en promedio. En otras realizaciones, el procedimiento excluye la homogeneización de las capas de amnios y corion para que tengan un diámetro medio inferior a 1000, 500 o 100 micras.

En algunas realizaciones, el injerto derivado de placenta puede o no ser un hidrogel. Tal como se utiliza en el presente documento, el término hidrogel tiene el significado que se entiende en la materia y se refiere a una matriz polimérica que puede absorber agua para hincharse y formar geles de elasticidad variable.

En otro aspecto, los procedimientos aquí descritos pueden o no incluir la adición de (i) un reticulante adicional además del reticulante natural de la membrana placentaria predescelularizada, (ii) un portador adicional además del portador natural de la membrana placentaria predescelularizada, y/o (iii) un agente fotoactivo a la membrana placentaria descelularizada o al injerto derivado de placenta. En otro aspecto, la membrana placentaria descelularizada y/o el injerto derivado de placenta pueden o no comprender un reticulante o portador adicional además de un reticulante(s) natural(es) y un portador(es) natural(es) de la(s) membrana(s) placentaria(s).

La membrana placentaria predescelularizada descrita en el presente documento puede comprender un reticulante natural que está configurado para crear un enlace físico y/o químico al menos entre dos partes (por ejemplo, las capas de amnios y corion) de la membrana placentaria predescelularizada, por ejemplo, antes o después de cosechar la membrana placentaria predescelularizada, congelar y/o liofilizar la membrana placentaria predescelularizada. Los enlaces químicos pueden ser iónicos, covalentes y/o metálicos. Por ejemplo, los agentes de reticulación naturales de la membrana de placenta predescelularizada pueden reticularse para formar un enlace físico y/o químico mediante un tratamiento químico, físico y/o de temperatura antes o después de la descelularización. En algunas realizaciones, los procedimientos descritos en el presente documento no incluyen la reticulación de la membrana placentaria descelularizada y/o el injerto derivado de placenta mediante enlaces no naturales utilizando agentes de reticulación no naturales.

En algunas realizaciones, la membrana placentaria descelularizada y/o el injerto derivado de placenta descritos en el presente documento pueden excluir un reticulante no natural, también denominado agente reticulante en el presente documento. En otras realizaciones, la membrana placentaria descelularizada descrita en el presente documento no contiene un reticulante no natural. Por ejemplo, la membrana placentaria descelularizada y/o el injerto derivado de placenta aquí descritos pueden excluir un reticulante no natural seleccionado del grupo formado por alginato de propilenglicol, glicerol, octasulfato de sacarosa, polietilenglicol, polimetilmetacrilato, poliuretano, acriloilmorfolina, N,N-dimetilacrilamida, N-vinilpirrolidona y metacrilato de tetrahidrofurfurilo, hidroxiapatita, poliuretano y ácido poliláctico, glutaraldehído, gliceraldehído, reticulante dióxido de poli(etilenglicol), éter diglicidílico de poli(etilenglicol), EDC y NHS, transglutaminasa, etilendiamina, familia de la lisiloxidasa, diisocianato de hexametileno (HMDIC), suberimidato de dimetilo (DMS), dimetil-3-3'-ditiobispropionimidato (DTBP), azida de acrilo, y una combinación de los mismos. En realizaciones adicionales, el injerto derivado de placenta aquí descrito puede excluir un agente fotoactivo seleccionado del grupo que consiste en un tinte de xanteno, compuestos de naftalimida, riboflavina-5-fosfato, N-hidroxipiridina-2-(1H)-tiona, N-(20-etilaminoetil)-4-amino-1,8-naftalimida, bis-diazopiruvamida-N,N9-bis(3-diazopiruvoyl)-2,29-(etilendioxi)bis-(etilamina) (DPD), diazopiruvoyl (DAP), azul de metileno, eritrosina, floxima, tionina, verde de metileno, rosa de Bengala, naranja de acridina, colorante de xantina, colorante de tioxantina, etil eosina, eosina Y, y una combinación de los mismos.

En otro aspecto, la membrana placentaria predescelularizada descrita en el presente documento también puede comprender un portador natural. Los portadores aquí descritos están configurados para formar una estructura tridimensional para ser inyectados o implantados en heridas, defectos y/o sitios quirúrgicos. En algunas realizaciones, la herida puede ser una herida abierta o una herida en túnel. Los portadores naturales son portadores que se encuentran de forma natural en una membrana placentaria y, por ejemplo, incluyen matrices extracelulares, como el colágeno y el ácido hialurónico o la elastina. En algunas realizaciones, la membrana placentaria descelularizada puede excluir un soporte no natural seleccionado del grupo que consiste en gelatina, agarosa, ácido hialurónico modificado, alginato de propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, polimetilmetacrilato, poliuretano, acriloilmorfolina, N,N-dimetilacrilamida, N-vinilpirrolidona y metacrilato de tetrahidrofurfurilo, hidroxiapatita, colágeno y alginato a base de hialuronano reticulado o funcionalizado, poliuretano, ácido poliláctico, o una combinación que comprenda al menos uno de los polímeros anteriores. En otras realizaciones, la membrana placentaria descelularizada y/o el injerto derivado de placenta aquí descritos pueden excluir sales de calcio, bario, aluminio, estroncio, cobre, zinc, magnesio, manganeso, cobalto o hierro, glutaraldehído, gliceraldehído, reticulante diepóxido de poli(etilenglicol), éter diglicidílico de poli(etilenglicol), EDC y NHS, transglutaminasa, etilendiamina, familia de la lisiloxidasa, diisocianato de hexametileno (HMDIC); suberimidato de dimetilo (DMS), dimetil-3-3'-ditiobispropionimidato (DTBP), acril azida, y una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, la membrana placentaria descelularizada y/o el injerto derivado de placenta aquí descritos no comprenden un reticulante adicional además de un portador o portadores naturales de la membrana placentaria. En otras realizaciones, la membrana placentaria descelularizada y/o el injerto derivado de placenta descritos en el presente documento no comprenden un portador adicional además del portador o portadores naturales de la membrana placentaria. Por ejemplo, la membrana placentaria descelularizada y/o el injerto derivado de placenta aquí descritos no pueden comprender alginato, alginato de propilenglicol, quitosano nativo o reticulado, almidón, polietilenglicol, celulosa y sus derivados (como acetato de celulosa, carboximetilcelulosa y metilcelulosa), goma xantana, dextrano, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, goma garrofín, goma tragacanto, goma arábiga, curdlan, pullulan, escleroglucano, metoxilpectina inferior o carragenano.

La membrana placentaria descelularizada y/o el injerto derivado de placenta pueden o no incluir una solución portadora. La solución portadora puede comprender sales de calcio, bario, aluminio, estroncio, cobre, zinc, magnesio, manganeso, cobalto o hierro; glutaraldehído, gliceraldehído, genipina, glucosa o ribosa, reticulante de diepóxido de poli(etilenglicol), éter diglicidílico de poli(etilenglicol), EDC y n Hs , transglutaminasa, etilendiamina, familia de la lisiloxidasa, diisocianato de hexametileno (HMDIC) suberimidato de dimetilo (DMS), dimetil-3-3'-ditiobispropionimidato (DTBP), o acril azida. La solución portadora también puede comprender polímeros naturales y/o sintéticos seleccionados del grupo que comprende colágeno nativo o modificado, gelatina, agarosa, ácido hialurónico modificado, fibrina, quitina, biotina, avidina, MATRIGEL®, proteoglicanos, laminina, fibronectina, elastina, heparina, glicerol, polimetilmetacrilato, poliuretano, acriloilmorfolina, N,N-dimetil acrilamida, N-vinil pirrolidona y tetrahidrofurfuril metacrilato, hidroxiapatita, reticulación o funcionalización de colágeno a base de hialuronano y alginato, poliuretano, ácido poliláctico, o una combinación que comprenda al menos uno de los polímeros anteriores además de un portador o portadores naturales de la membrana placentaria. En realizaciones adicionales, por ejemplo, la membrana placentaria descelularizada y/o el injerto derivado de placenta descritos aquí pueden o no incluir un portador además de un portador(es) natural(es) de la membrana placentaria, donde el portador se selecciona del grupo que consiste en colágeno nativo, ácido hialurónico, fibrina, quitina, biotina, avidina, MATRIGEL®, proteoglicanos, laminina, fibronectina, elastina, heparina, alginato, genipina, quitosano, almidón, glucosa o ribosa, celulosa y sus derivados (como acetato de celulosa, carboximetilcelulosa y metilcelulosa), goma xantana, dextrano, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, goma garrofín, goma tragacanto, goma arábiga, curdlan, pullulan, escleroglucano, pectina de metoxilo inferior, carragenano y una combinación de los mismos. Además, en otras realizaciones, la membrana placentaria descelularizada y/o el injerto derivado de placenta descritos en el presente documento pueden o no incluir un reticulante además de un reticulante(s) natural(es) de la membrana placentaria, en el que el reticulante se selecciona del grupo que consiste en alginato, almidón, celulosa y sus derivados (como acetato de celulosa, carboximetilcelulosa y metilcelulosa), goma xantana, dextrano, carragenano, genipina, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, goma garrofín, goma tragacanto, goma arábiga, curdlan, pullulano, escleroglucano y metoxilpectina inferior. glucosa o ribosa, colágeno nativo, ácido hialurónico, fibrina, quitina, biotina, avidina, MATRIGEL®, proteoglicanos, laminina, fibronectina, elastina, heparina, quitosano y una combinación de los mismos.

En otro aspecto, el injerto derivado de placenta aquí descrito consiste esencialmente y/o consiste en la membrana placentaria descelularizada. El término "compuesto esencialmente de" define el alcance del injerto para incluir elementos o agentes adicionales que no afectan materialmente a la composición proteica y/o gelificación del injerto derivado de placenta sin los elementos o agentes. Por ejemplo, el injerto derivado de placenta consistente esencialmente en membrana placentaria descelularizada puede incluir elementos adicionales a la membrana placentaria descelularizada que no afecten materialmente a la composición proteica y/o gelificación del injerto derivado de placenta consistente en membrana placentaria descelularizada. Por alterar materialmente la composición proteica se entiende modificar la composición proteica al menos en un 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30 o 40 %. Afectar materialmente a la gelificación del injerto significa cambiar la viscosidad del injerto al menos en un 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30 o 40 %.

En otro aspecto, los procedimientos aquí descritos comprenden tratar la membrana placentaria predescelularizada, la membrana placentaria descelularizada y/o el injerto derivado de placenta con una o más soluciones de tratamiento. En algunas realizaciones, el procedimiento aquí descrito puede comprender el tratamiento de la membrana placentaria descelularizada y/o del injerto derivado de placenta con una o más soluciones de tratamiento después de la congelación y/o liofilización antes de la implantación. En algunas realizaciones, la solución de tratamiento comprende un agente reticulante iónico, enzimático o químico, un agente fotoactivo, un polímero o una combinación de los mismos. El agente reticulante iónico puede comprender uno o más seleccionados del grupo que consiste en calcio, bario, aluminio, estroncio, cobre, zinc, magnesio, manganeso, cobalto y hierro. El agente reticulante enzimático puede comprender uno o más seleccionados del grupo que consiste en transglutaminasa, etilendiamina, familia de la lisiloxidasa, diisocianato de hexametileno (HMDIC), suberimidato de dimetilo (DMS) y dimetil-3-3'-ditiobispropionimidato (DTBP). El agente reticulante químico comprende uno o más seleccionados del grupo que consiste en glutaraldehído, gliceraldehído, genipina, glucosa o ribosa, reticulante de diepóxido de poli(etilenglicol), éter diglicidílico de polietilenglicol), EDC y NHS, y azida de acrilo. El polímero puede comprender uno o más seleccionados del grupo que consiste en colágeno nativo o modificado, gelatina, agarosa, ácido hialurónico modificado, fibrina, quitina, biotina, avidina, matriz ósea desmineralizada, MATRIGEL®, proteoglicanos, laminina, fibronectina, elastina, heparina, glicerol, octasulfato de sacarosa, polietilenglicol, polimetilmetacrilato, poliuretano, acriloilmorfolina, N,N-dimetilacrilamida, N-vinilpirrolidona y tetrahidrofurfurilmetacrilato, hidroxiapatita, poliuretano y ácido poliláctico.

En otro aspecto, el procedimiento descrito en el presente documento también puede comprender la adición de uno o más suplemento(s) bioactivo(s) a la membrana placentaria predescelularizada, la membrana placentaria descelularizada y/o el injerto derivado de placenta. En algunas realizaciones, el suplemento o suplementos bioactivos se seleccionan de un grupo que consiste en un factor de crecimiento o diferenciación de la familia FGF, familia TGF, IGF-1, PDGF, EGF, VEGF, Hg F, PTHrP, Ihh, dexametasona, insulina, transferrina, selenio, ITS o ascorbato. Los suplementos bioactivos pueden ser factores de crecimiento, factores de diferenciación, citoquinas, agentes antimicrobianos o agentes antiinflamatorios. Los factores de crecimiento o diferenciación pueden ser, por ejemplo, un factor de crecimiento de la familia FGF o de la familia TGF, IGF-1, PDGF, EGF, VEGF, HGF, PTHrP, Ihh (Indian Hedgehog Homolog), dexametasona, insulina, transferrina, selenio, suplemento ITS, ascorbato, o una combinación de los mismos. Las citocinas pueden incluir GM-CSF, G-CSF, TNF-o, IL-1p, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, SLP1, MCP1, MIP-1a, MIP-2, IL-18, angiopoyetina, KGF, endotelina, IFN-o o IFN-p. Los ejemplos de agentes antiinflamatorios pueden incluir un anticuerpo iL-1 pR, un antagonista del receptor TNF-o, inhibidores específicos de la ciclooxigenasa-2, inhibidores de la MAP quinasa, inhibidores de la NO sintasa, inhibidores de NF-<k>B o inhibidores de MMP Existen varios factores de crecimiento de fibroblastos. Por ejemplo, la familia FGF humana incluye 22 miembros, del FGF-1 al FGF-23. (No existe el FGF-15 humano porque el FGF-15 es el ortólogo de ratón del FGF-19 humano) Ejemplos de miembros de la familia TGF pueden incluir la superfamilia TGF-o y TGF-p. La superfamilia TGF-p incluye TGF-ps (como TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3), activinas, inhibinas, factores morfogénicos óseos (BMPs), BMPs modificados, hormona antimülleriana (AMH), miostatinas y otros. Existen 20 isotipos de BMP. Pueden dividirse en cuatro subfamilias, por ejemplo, (1) BMP2 y<b>M<p>4; (2) BMP3 y BMP3B (también conocido como factor de crecimiento/diferenciación 10 (GDF10)); (3) BMPs 5, 6, 7 y 8; y (4) GDFs 5, 6 y 7. En otras realizaciones, el procedimiento descrito en el presente documento también puede comprender la adición de uno o más suplementos bioactivos extraídos de tejido que comprenda matriz ósea desmineralizada, membrana basal o matriz submucosa. En otras realizaciones, el procedimiento descrito en el presente documento también puede comprender la adición de uno o más antioxidantes, incluyendo, por ejemplo, nitroprusiato de sodio, glicoproteína de la matriz del cartílago (CMGP), vitaminas C, vitamina E, selenio, N-acetilcisteína (NAC) estradiol, glutatión, melatonina, resveratrol, flavonoides, caroteno, aminoguanidina o licopeno para proteger los componentes bioactivos de los antioxidantes del daño inducido por radicales de oxígeno.

En otro aspecto, el procedimiento descrito en el presente documento también puede comprender la adición de uno o más agente(s) que tiene(n) sitio(s) de unión de suplemento bioactivo a la membrana placentaria predescelularizada, la membrana placentaria descelularizada y/o el injerto derivado de placenta. En algunas realizaciones, los agentes que tienen sitio(s) de unión a suplemento(s) bioactivo(s) pueden comprender hialuronano, heparina, sulfato de heparina, sulfato de queratina, dermatán sulfato, condroitín sulfato, betaglicano, proteoglicano de heparán sulfato, sindecán, biglicano o decorina. En otras realizaciones, los agentes que tienen sitios de unión a suplementos bioactivos aumentan la afinidad de los factores de crecimiento, factores de diferenciación, citoquinas, agentes antimicrobianos o agentes antiinflamatorios a la membrana placentaria predescelularizada, la membrana placentaria descelularizada y/o el injerto derivado de placenta.

En algunas realizaciones, el porcentaje en peso de la membrana placentaria descelularizada en el injerto derivado de placenta es del 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 92, 94, 96, 98, 100 % o más en estado seco basado en el peso total del injerto derivado de placenta. En otras realizaciones, el porcentaje en peso de la membrana placentaria descelularizada en el injerto derivado de placenta es de 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 93, 95, 97, 99, 100% o menos en estado seco basado en el peso total del injerto derivado de placenta. En otras realizaciones, el porcentaje en peso de la membrana placentaria descelularizada en el injerto derivado de placenta es del 2 % al 100 %, del 50 % al 90 %, del 50 % al 80 %, del 60 % al 100 %, del 80 % al 100 %, o del 90 % al 100 % en estado seco basado en el peso total del injerto derivado de placenta.

En otro aspecto, la invención se refiere a un injerto derivado de placenta que comprende una membrana placentaria descelularizada con capas de amnios y corion separadas o en contacto. En otro aspecto, la invención también se refiere a injertos derivados de placenta preparados por los procedimientos aquí descritos. En otro aspecto, la invención se refiere a andamios que comprenden el injerto derivado de placenta aquí descrito. El andamio puede incluir un implante, que es un andamio configurado para ser implantado in vivo.

En otro aspecto, la membrana placentaria descelularizada se produce retirando menos de 1, 5, 10, 15, 20, 25. 30, 40, 50, 60, 70 u 80% de PDGF y/o bFGF de la membrana placentaria predescelularizada en la(s) zona(s) en la(s) que las capas de amnios y corion permanecen en contacto. En algunas realizaciones, la concentración de PDGF y/o bFGF permanece al menos en el 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 o 99% de las concentraciones iniciales de PDGF y/o bFGF antes de la descelularización, respectivamente, en la(s) zona(s) en la(s) que las capas de amnios y corion permanecen en contacto. En algunas realizaciones, el nivel de PDGF y/o bFGF en la membrana placentaria descelularizada es al menos 10% a 300%, 10% a 200%, 10% -150%, o 10% -100% más que la suma de los niveles de PDGF y/o bFGF en la membrana amniótica aislada de control descelularizada y la membrana coriónica aislada de control descelularizada que tienen el tamaño de área sustancialmente idéntico después de la descelularización. En otras realizaciones, el injerto derivado de placenta aquí descrito puede comprender colágeno de tipo I, colágeno de tipo IV, laminina gamma-1, fibronectina, somatomammotropina coriónica, FGF-12, FGF-13, IGF-2, eGf L-7, PDGF-AA, EGF, PIGF, GCSF y bFGF. En algunas realizaciones, la concentración del colágeno de tipo I en el injerto derivado de placenta es del 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45 % o más; del 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45 % o menos; y/o entre el 20 y el 50 %, entre el 25 y el 45 %, entre el 30 y el 40 %, o entre el 33 y el 38 %, basándose en el peso total del injerto.

El injerto derivado de placenta descrito aquí puede ser rico en proteínas ECM y glicoproteínas que se encuentran en todo el cuerpo, que desempeñan un papel vital en la conducción de eventos celulares clave como la migración celular, la adhesión, la diferenciación, la proliferación y la supervivencia. Las proteínas presentes en el injerto derivado de la placenta, como el colágeno IV, el tipo más común de colágeno que se encuentra en la membrana basal humana, las lamininas, la fibronectina y los proteoglicanos (por ejemplo, el heparán sulfato), pueden proporcionar a la membrana basal una resistencia a la tracción capaz de soportar las células, unir las células a la matriz colágena subyacente y separar los epitelios del mesénquima/tejido conjuntivo subyacente. En algunas realizaciones, la membrana placentaria descelularizada tiene al menos un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 % o más de porosidad que la membrana placentaria predescelularizada. En un aspecto, el injerto derivado de placenta liofilizado, deshidratado o liofilizado o la membrana placentaria descelularizada tiene una densidad en el rango de 0,001 a 0,1 mg/mm2, 0,005 a 0,1 mg/mm2, o 0,01 a 0,1 mg/mm2. En otra realización, el injerto liofilizado, deshidratado o liofilizado derivado de placenta tiene una densidad en el rango de 0,005 a 0,2 mg/mm3, 0,01 a 0,2 mg/mm3, 0,05 a 0,2 mg/mm3, o 0,05 a 0,15 mg/mm3.

En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos de cultivo celular que comprenden el cultivo de células en presencia del injerto derivado de placenta o la membrana placentaria descelularizada de la presente invención. El injerto derivado de placenta o la membrana placentaria descelularizada pueden proporcionar andamios bidimensionales o tridimensionales. Las células cultivadas pueden estar en el injerto derivado de la placenta o en la membrana placentaria descelularizada. Tal y como se utiliza aquí, el cultivo celular se refiere al mantenimiento de células en un entorno artificial, comúnmente denominado entornoin v itro. El término cultivo celular es un término genérico y puede utilizarse para abarcar el cultivo no sólo de células individuales, sino también de tejidos, órganos, sistemas de órganos u organismos enteros. Las células utilizadas en los procedimientos de cultivo aquí divulgados pueden ser cualquier célula procariota o eucariota. No es necesario que el tipo celular utilizado en los procedimientos de cultivo aquí divulgados sea de la misma especie de la que derivan las composiciones de soporte celular. Además, las células pueden proceder de una línea celular establecida, o pueden ser células primarias o células modificadas genéticamente. Por ejemplo, las células pueden seleccionarse del grupo formado por células madre, células madre derivadas del tejido adiposo, células del ganglio de la raíz dorsal, células de los islotes beta pancreáticos, cardiomiocitos, hepatocitos, iPSC, células cancerosas y células endoteliales de la vena umbilical.

Por ejemplo, la invención permite cultivar células sobre o dentro del injerto derivado de placenta o la membrana placentaria descelularizada descrita en el presente documento. "Cultivar y/o cultivar células sobre o en el injerto derivado de placenta descrito en el presente documento" incluye procedimientos tradicionales de cultivo celular, así como la colocación sobre una superficie del injerto derivado de placenta descrito en el presente documento en cualquier entorno, como en matrices o tejidos biocompatibles naturales o sintéticos. Las células pueden ser de mamíferos, como por ejemplo, entre otros, humanos, bovinos, porcinos, murinos, ovinos, equinos, caninos y felinos. En algunas realizaciones, las células que se cultivan en o sobre el injerto derivado de placenta o la membrana placentaria descelularizada descrita en el presente documento son células madre. Tal y como se utiliza en el presente documento, una célula madre se utiliza tal y como se hace en la técnica y significa una célula que tiene la capacidad de dividirse y dar lugar a una célula hija que puede estar al menos parcialmente diferenciada y a otra célula hija que conserva el potencial de desarrollo de la célula madre. Tal como se utilizan en el presente documento, las células madre pueden ser células madre derivadas de tejido adiposo, células madre de la pulpa dental, células madre adultas (ASC), células madre embrionarias (ESC), células progenitoras específicas de tejido y/o células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Las ASC pueden incluir, entre otras, células madre hematopoyéticas, células madre mamarias, células madre intestinales, células madre mesenquimales, células madre endoteliales, células madre neurales, células madre adultas olfatorias, células madre de la cresta neural y células testiculares. En otras realizaciones, el injerto derivado de placenta descrito en el presente documento puede utilizarse en procedimientosin vitropara favorecer el crecimiento y la proliferación celular, así como para aumentar el mantenimiento o facilitar la diferenciación, como la osteogénesis, la condrogénesis o la génesis de ligamentos/tendones, en las células madre cultivadas sobre o en el injerto derivado de placenta descrito en el presente documento.

En algunas realizaciones, las células que se cultivan en o sobre el injerto derivado de placenta o la membrana placentaria descelularizada descrita en el presente documento pueden ser cardiomiocitos, células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), células madre pluripotentes inducidas (iPSC) hepatocitos, osteoblastos, condrocitos, células de los ganglios de la raíz dorsal (DRG), células madre mesenquimales, células madre derivadas de tejido adiposo, células madre embrionarias, células progenitoras, células diferenciadas, células indiferenciadas y/o células madre -pluripotentes. Las células apropiadas también pueden incluir, entre otras, células del linaje ectodérmico, células del linaje mesodérmico y células del linaje endodérmico. Ejemplos de células del linaje ectodérmico incluyen, pero no se limitan a, queratinocitos, neuronas. Ejemplos de células de linaje mesodérmico incluyen, entre otras, mioblastos, adipocitos, fibroblastos, células endoteliales, osteoblastos, condrocitos o células estromales. Algunos ejemplos de células de linaje endodérmico son, entre otros, las células epiteliales de la trompa de Eustaquio, el tracto respiratorio, como la tráquea, los bronquios y los alvéolos pulmonares, el tracto gastrointestinal, la vejiga urinaria y las células epiteliales que recubren todas las glándulas. Las células también pueden ser células primarias derivadas de tejidos u órganos. Las líneas celulares apropiadas utilizadas en la presente invención pueden incluir, entre otras, líneas celulares mesenquimales, líneas celulares preosteoblásticas, líneas celulares osteoblásticas y líneas celulares condroblásticas.

En algunas realizaciones, las células pueden derivarse de fuentes autólogas o alogénicas. Las células pueden ser células diferenciadas, incluidos condrocitos, osteoblastos, osteoclastos, células endoteliales, células epiteliales, fibroblastos y células del periostio. Además, las células pueden ser pluripotentes, multipotentes, progenitoras, progenitoras de tejidos específicos o células madre somáticas adultas. Las células madre pueden proceder de embriones, placenta, médula ósea, tejido adiposo, vaso sanguíneo, líquido amniótico, líquido sinovial, membrana sinovial, pericardio, periostio, duramadre, sangre periférica, sangre umbilical, membrana placentaria, sangre menstrual, dientes, núcleo pulposo, cerebro, prepucio neonatal, piel, folículo piloso, cripta intestinal, tejido neural, hígado, páncreas o músculo. Las células pueden proceder de músculo esquelético, músculo liso y músculo cardíaco. Las células madre pueden derivarse de la reprogramación genética de células maduras, como las células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Además, todas las células pueden proceder de donantes vivos o fallecidos recientemente.

Cualquier célula descrita en el presente documento puede cultivarse en o sobre el injerto derivado de placenta o la membrana placentaria descelularizada descrita en el presente documento durante un periodo comprendido entre 15 minutos y un año, 15 minutos y 6 meses, 15 minutos y 3 meses, 15 minutos y 4 semanas, 2 horas y 2 semanas, 2 horas y 1 semana, 2 horas y 72 horas, 24 horas y 72 horas, o 24 horas y 96 horas, a una temperatura comprendida entre 20 °C y 40 °C o 30 °C y 37 °C, en una atmósfera que contenga entre 1% CO<2>y 10% CO<2>o 4% CO<2>y 6% CO<2>, en determinadas realizaciones. En algunas realizaciones de la presente invención, las células pueden cultivarse en ausencia o presencia de uno o más factores de crecimiento descritos en el presente documento y (1) un tejido o un órgano, (2) una matriz, o (3) una combinación de los mismos. Las células que se han cultivado en ausencia o presencia de uno o más factores de crecimiento descritos en el presente documento en un medio de cultivo celular pueden aplicarse posteriormente a una matriz, un tejido, un órgano o una combinación de los mismos, en determinadas realizaciones.

El procedimiento de cultivo celular puede comprender además el almacenamiento de las células sobre o dentro del injerto derivado de placenta o la membrana placentaria descelularizada. En algunas realizaciones, las células sobre o en el injerto derivado de placenta se almacenan a temperatura ambiente (es decir, 24 °C), a 4 °C, a -20 °C o en crioconservación. En otras realizaciones, las células sobre o en el injerto derivado de placenta se almacenan a una temperatura de -200, -180, -100, -50, -45, -40, -35, -30, -25, -20, -10, -5, 0, 1,2, 3, 4, 5, 10, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 36, 37, 38, o 39 °C a -150, -140, -130, -90, -40, -35, -30, -25, -20, -15, -10, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 25, 30, 35, 36, 37, 38, o 40 °C. En otras realizaciones, las células sobre o en el injerto derivado de placenta o la membrana placentaria descelularizada se almacenan a una temperatura de -200 a 50 °C, de -160 a 36 °C, de -160 a 25 °C, de -160 a 5 °C, de -5 a 23 °C, de 0 a 30 °C, o de 15 a 40 °C.

En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para promover la diferenciación de las células madre (por ejemplo, células madre pluripotentes) o células progenitoras específicas de tejido descritas en el presente documento, el procedimiento comprende cultivar las células madre o células progenitoras específicas de tejido en presencia de una cantidad eficaz del injerto derivado de placenta o membrana placentaria descelularizada preparada por el procedimiento descrito en el presente documento. Las células madre (por ejemplo, células madre pluripotentes) o las células progenitoras específicas de tejido pueden estar sobre o dentro del injerto derivado de placenta o de la membrana placentaria descelularizada. Por ejemplo, las células madre (por ejemplo, células madre pluripotentes) o las células progenitoras específicas de tejido pueden diferenciarse en osteoblastos, condrocitos, cardiomiocitos, células pancreáticas, células neuronales, ligamento o tendón. En algunas realizaciones, las células progenitoras específicas de tejido se diferencian en un tejido de interés sin añadir un factor de crecimiento. En otro aspecto, la invención también se refiere a procedimientos para promover la diferenciación vascular, miogénica o neurogénica de las células madre o células progenitoras específicas de tejido, el procedimiento comprende cultivar las células madre o células progenitoras específicas de tejido sobre o en el injerto derivado de placenta o membrana placentaria descelularizada descrita en el presente documento.

En algunas realizaciones, el injerto derivado de placenta descrito en el presente documento puede utilizarse en procedimientosin vitropara ampliar el mantenimiento de la esterilidad en células progenitoras específicas de tejido (es decir, la capacidad de proliferar y/o diferenciarse en un tejido específico a través de un cultivo prolongado) y/o la capacidad de autorrenovación de las células progenitoras específicas de tejido, comprendiendo el procedimiento el cultivo de las células progenitoras específicas de tejido sobre o en el injerto derivado de placenta, opcionalmente sin añadir un factor de crecimiento u otro factor secundario para inducir el mantenimiento de las células. En otras realizaciones, el injerto derivado de placenta aquí descrito también puede utilizarse en procedimientosin vitrooin vivopara promover la diferenciación de células madre pluripotentes sin añadir factores de crecimiento adicionales u otro factor secundario para inducir la diferenciación de las células. En otras realizaciones, el injerto derivado de placenta aquí descrito también puede utilizarse en procedimientosin vitrooin vivopara promover la diferenciación de células madre pluripotentes y/o células progenitoras específicas de tejido con una adición de uno o más factores de crecimiento u otros factores secundarios para inducir el mantenimiento o la diferenciación de las células. En realizaciones adicionales, el injerto derivado de placenta descrito en el presente documento también puede utilizarse en procedimientosin vitrooin vivopara potenciar el efecto de uno o más factores de crecimiento u otros factores secundarios para inducir el mantenimiento o la diferenciación de las células en la promoción de la diferenciación de células madre pluripotentes y/o células progenitoras específicas de tejido.

Por ejemplo, la invención también se refiere a procedimientos de promoción de la osteoinductividad, con los procedimientos que comprenden el cultivo de células sobre o en el injerto derivado de placenta descrito en el presente documento. Tal como se utiliza aquí, "osteoinductividad" puede referirse a hacer que las células se diferencien en células con un fenotipo más parecido a los osteoblastos o a las células del periostio, o el término puede referirse a aumentar la proliferación de osteoblastos, células del periostio, o ambos. Las células, antes del cultivo sobre o en el injerto derivado de placenta, pueden ser células indiferenciadas o parcialmente diferenciadas. Las células pueden estar presentes en cultivo o en un tejido, órgano o porción del mismo o en un organismo. La actividad osteoinductora del injerto derivado de placenta puede o no estar alterada, incluyendo, pero sin limitarse a, una mayor actividad, en relación con una superficie de control.

En un aspecto, la invención también se relaciona con procedimientos de reparación de un defecto en o sobre un tejido que comprende cubrir o contactar el sitio del defecto con una cantidad efectiva del injerto derivado de placenta o membrana placentaria descelularizada descrita aquí. Los procedimientos de reparación pueden comprender la implantación del injerto derivado de placenta descrito en el presente documento en el lugar del defecto. Los tejidos con el defecto pueden ser tejidos óseos, cartílagos, tejidos blandos, médula espinal, duramadre, membrana y mucosa. Algunos ejemplos de tejidos blandos con el defecto pueden ser tendón, ligamento, dermis, piel, cuerda vocal, nervio, vejiga, vagina, uretra, corazón, tejido subcutáneo, fascia, mama, músculo, membrana placentaria, placenta y manguito rotador. En otro aspecto, los tejidos con el defecto pueden estar en el sistema musculoesquelético, el sistema digestivo, el sistema cardiovascular, el sistema respiratorio, el sistema urinario, el sistema reproductor, el sistema nervioso y/o el sistema inmunitario. En algunas realizaciones, el procedimiento excluye la rehidratación del injerto derivado de placenta antes de implantarlo para permitir que dicho injerto derivado de placenta absorba sangre, fluidos y/o células autólogas in situ. Alternativamente, la implantación de un injerto derivado de placenta en un ser humano o animal puede llevarse a cabo rehidratando el injerto derivado de placenta con una solución rehidratante; opcionalmente sembrando células vitales en el injerto derivado de placenta para hacer que el injerto derivado de placenta sea vital; opcionalmente cultivando el injerto derivado de placenta sembrado de células antes de la implantación; e implantando el injerto derivado de placenta en el defecto. En algunas realizaciones, la solución rehidratante comprende uno o más seleccionados del grupo que consiste en sangre o aspirado de médula ósea, plasma rico en plaquetas, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, enzimas, suplementos bioactivos, polímeros naturales, polímeros sintéticos, agentes fotoactivos, antioxidantes, agentes de reticulación, agentes antimicrobianos, células vitales, y uno o más agentes que tienen sitio(s) de unión de suplementos bioactivos. En realizaciones adicionales, las células vitales comprenden una o más seleccionadas del grupo que consiste en células de aspirado de médula ósea autóloga o de aloinjerto; células estromales de médula ósea; células estromales de grasa, sinovio, periostio, pericondrio, músculo, dermis, sangre de cordón umbilical, placenta, membrana placentaria y gelatina de Warton; y pericitos. La invención también se refiere a procedimientos de promoción de la angiogénesis, hemostática, biocompatibilidad, resistencia a la infección, antiinflamatoria, anticicatrizaciones, adhesión, proliferación o mantenimiento del estado diferenciado o prevención de la desdiferenciación de osteoblastos, condrocitos, células de ligamento, células de tendón, fibroblastos, adipocitos y/o cualquier tipo celular descrito en el presente documento, con los procedimientos que comprenden la colocación del injerto derivado de placenta descrito en el presente documento en el lugar del defecto.

La invención también se refiere a procedimientos para promover la condroinductividad, que comprenden el cultivo de células en presencia de una cantidad eficaz de un injerto derivado de placenta o de una membrana placentaria descelularizada descrita en el presente documento. Tal y como se utiliza en el presente documento, "condroinductividad" puede referirse a hacer que las células se diferencien en células con un fenotipo más parecido al de los condrocitos, o el término puede referirse a aumentar la proliferación de condrocitos, o ambas cosas. Las células, antes del cultivo sobre o en el injerto derivado de placenta, pueden ser células indiferenciadas o parcialmente diferenciadas. Las células pueden estar presentes en cultivo o en un tejido, órgano o porción del mismo o en un organismo. La actividad condroinductora del injerto derivado de placenta o de la membrana placentaria descelularizada puede o no estar alterada, incluyendo, pero sin limitarse a, una actividad mejorada, en relación con una superficie de control.

La invención también se refiere a procedimientos para promover la diferenciación de ligamentos/tendones, que comprenden el cultivo de células en presencia de una cantidad eficaz de un injerto derivado de placenta o de una membrana placentaria descelularizada descrita en el presente documento. Tal y como se utiliza aquí, "diferenciación de ligamento/tendón" puede referirse a hacer que las células se diferencien en células con un fenotipo más parecido al ligamento y/o tendón, o el término puede referirse a aumentar la proliferación de ligamento y/o tendón, o ambos. Las células, antes del cultivo sobre o en el injerto derivado de placenta, pueden ser células indiferenciadas o parcialmente diferenciadas. Las células pueden estar presentes en cultivo o en un tejido, órgano o porción del mismo 0 en un organismo. La actividad de diferenciación ligamento-tendón del injerto derivado de placenta o de la membrana placentaria descelularizada puede o no estar alterada, incluyendo pero no limitándose a, una mayor actividad, en relación con una superficie de control.

Existen variedades de marcadores de diferenciación de osteoblastos, condrocitos y ligamentos/tendones que pueden medirse para evaluar la osteoinductividad, la condroinductividad o la diferenciación de ligamentos/tendones, respectivamente. Por ejemplo, las células expresan fosfatasas alcalinas durante las primeras fases de diferenciación hacia linajes de osteoblastos. Por lo tanto, pueden utilizarse ensayos de fosfatasa alcalinain vitropara evaluar la osteoinductividad en células cultivadas en presencia de una cantidad eficaz de un injerto derivado de placenta o de una membrana placentaria descelularizada descrita en el presente documento. La capacidad del injerto derivado de placenta para estimular o inducir la expresión de la fosfatasa alcalina en células que de otro modo no formarían hueso, como los mioblastos (células C2C12), indicaría que el injerto derivado de placenta tiene actividad osteoinductora. En estos ensayos, las células cultivadas sobre o dentro del injerto derivado de la placenta y sobre una superficie de control se utilizan como controles negativos para demostrar que la expresión basal de la fosfatasa alcalina en células no formadoras de hueso. La línea de base de los marcadores osteoblásticos en el control negativo no tiene por qué ser cero, lo que significa que las células del grupo de control negativo pueden tener al menos algún nivel de marcador(es) fenotípico(s). En consecuencia, una superficie "osteoinductora" del injerto derivado de la placenta simplemente provocaría un aumento de los marcadores osteoblásticos en las células experimentales. Del mismo modo, los marcadores de condrocitos, incluyendo pero no limitado a colágeno tipo X, colágeno tipo II, Sox 9, Aggrecan. Matrilin-1 y CEP-68, por nombrar algunos, pueden utilizarse para evaluar el potencial condroinductor. Además, los marcadores de ligamento/tendón, incluyendo pero no limitándose a la escleraxis, pueden utilizarse para evaluar el potencial de diferenciación ligamento/tendón.

Además, la osteoinductividad, la condroinductividad y la diferenciación ligamento/tendón pueden determinarse en cultivo tisular investigando la capacidad del injerto derivado de placenta o de la membrana placentaria descelularizada para diferenciar o inducir el fenotipo de osteoblasto, el fenotipo de condrocito y el fenotipo de célula ligamento/tendón en células cultivadas, como células primarias, líneas celulares o explantes. Por ejemplo, las células pueden mostrar una mayor producción de un marcador característico de los osteoblastos, como la fosfatasa alcalina, etc. Por ejemplo, los potenciales de diferenciación osteoinductiva, condroinductiva, ligamento/tendón del injerto derivado de placenta o de la membrana placentaria descelularizada pueden ser más de 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces mayores que un control. En otro ejemplo, los potenciales de diferenciación osteoinductiva, condroinductiva, ligamento/tendón del injerto derivado de placenta o de la membrana placentaria descelularizada aquí descritos pueden ser más de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500 o incluso 1000 veces mayores que los de un andamio de control.

La osteoinductividad, condroinductividad, diferenciación de ligamento/tendón, para evaluar el potencial de formación de hueso, cartílago, ligamento o tendón inducido por el injerto derivado de placenta o la membrana descelularizada de placenta en una localización como el músculo, también puede evaluarse utilizando un modelo animal adecuado. Por ejemplo, la implantación intramuscular en un roedor se ha utilizado como modelo para evaluar la actividad osteoinductora del injerto derivado de la placenta o de la membrana placentaria descelularizada.

La invención también se refiere a procedimientos para promover la angiogénesis celular, hemostática, biocompatibilidad, resistencia a la infección, antiinflamatoria, anticicatrizaciones, adhesión, proliferación o mantenimiento del estado diferenciado o prevención de la desdiferenciación de osteoblastos, condrocitos, células de ligamentos, células de tendones, fibroblastos, adipocitos y/o cualquier tipo celular descrito en el presente documento, con los procedimientos que comprenden el cultivo de las células en presencia de un injerto derivado de placenta o una membrana placentaria descelularizada descrita en el presente documento. La actividad proliferativa del injerto derivado de placenta o de la membrana placentaria descelularizada puede o no verse alterada, incluyendo, pero sin limitarse a, una mayor actividad, en relación con una superficie de control. La invención se refiere además a procedimientos para promover la formación de tejido adiposo de adipocitos, fibroblastos, células epiteliales y/o células endoteliales vasculares. La invención también se refiere a procedimientos para aumentar o promover la angiogénesis, la función hemostática, la biocompatibilidad, las anticicatrizaciones, la antiinflamación y/o la resistencia a las infecciones,

La mitogenicidad puede evaluarse investigando la proliferación celular inducida por el injerto derivado de placenta o la membrana placentaria descelularizada mediante diversos ensayos in vitro que miden la actividad metabólica, como el ensayo MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro, el ensayo alamarBlue®y otros. El ensayo alamarBlue® utiliza un indicador de reducción-oxidación no citotóxico para medir la actividad metabólica celular, lo que lo convierte en un ensayo no destructivo para evaluar la actividad mitogénica del injerto derivado de placenta aquí descrito. La proliferación también puede evaluarse midiendo la cuantificación del ADN, por ejemplo utilizando un ensayo de ADN PicoGreen™ , el etiquetado radiactivo de la síntesis de ADN, como el etiquetado con [3H] timidina o la incorporación de BrdU. La proliferación también puede evaluarse mediante el recuento manual de células, por ejemplo tiñéndolas con azul tripán y contándolas con un hemocitómetro.

La invención también se refiere a procedimientos para aumentar o promover la osteogénesis, condrogénesis o ligamento/tendón génesis en células. Los procedimientos pueden comprender el cultivo de las células en o sobre el injerto derivado de placenta o la membrana placentaria descelularizada descrita en el presente documento. Como se utiliza aquí, "osteogénesis" es la deposición de nuevo material óseo o la formación de nuevo hueso, incluyendo, pero no limitado a, la osteogénesis intramembranosa y la osteogénesis endocondral. Tal y como se utiliza aquí, la "condrogénesis" es la deposición de nuevo material cartilaginoso o la formación de nuevo cartílago. Tal como se utiliza en el presente documento, la "génesis del ligamento/tendón" es la deposición de nuevo material ligamentoso y/o tendinoso o la formación de nuevo ligamento y/o tendón. La actividad inductora osteogénica, condrogénica, ligamentosa o tendinosa del injerto derivado de placenta o de la membrana placentaria descelularizada puede o no verse alterada, incluyendo, pero sin limitarse a, una mayor actividad, en relación con una superficie de control. Las células pueden incluir células de cualquier tejido en el que se desee la formación de hueso, cartílago, ligamento o tendón, como, por ejemplo, hueso, cartílago, ligamento, músculo, tendón, etc.

Ejemplo 1. Preparación de la membrana placentaria predescelularizada tras la recuperación

La placenta humana a término y el saco amniótico con el consentimiento del donante se obtuvieron tras una cesárea y se transfirieron a la instalación de procesamiento en condiciones estériles.

El saco amniótico que comprende la membrana placentaria con ambas capas de membrana amniótica y coriónica se cortó alrededor de la falda de la placenta y se enjuagó al menos tres veces con solución isotónica como solución salina, o Ringer lactato para eliminar la sangre suelta. La membrana placentaria enjuagada con las capas de amnios y corion en contacto se colocó sobre una tabla estéril con la capa epitelial de la membrana amniótica hacia arriba. Se colocaron marcos de malla de diferentes tamaños y formas sobre la membrana placentaria. La membrana placentaria se cortó en diferentes tamaños y formas alineados con los tamaños y formas de los marcos correspondientes. Cada trozo de la membrana placentaria con las capas de membrana amniótica y coriónica se fijó con los marcos de malla mediante suturas o grapas (FIG. 1). Los trozos de membrana placentaria preparados se colocaron planos en recipientes estériles y se almacenaron en el congelador a -20 °C o -80 °C hasta su posterior procesamiento. En consecuencia, se preparó la membrana placentaria predescelularizada.

Ejemplo 2. Extracción de células de la membrana placentaria predescelularizada - Descelularización

Procedimiento 1: Los diferentes trozos de membrana placentaria junto con los marcos se descongelaron a temperatura ambiente, se pesaron asépticamente y se colocaron en frascos estériles separados. Los trozos de membrana placentaria se enjuagaron con solución salina isotónica a razón de cinco minutos cada uno durante tres veces con agitación, tras lo cual se secó el tejido con toallas absorbentes estériles y se volvieron a colocar en frascos estériles. La solución de desvitalización preparada, que contenía lauroil sarcosinato de sodio y ADNasa en tampón Tris, se añadió a los matraces en función del peso del tejido y los matraces se agitaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Se retiró la solución de desvitalización y se secó la membrana placentaria con toallas absorbentes estériles para eliminar el exceso de líquido. Los trozos de membrana placentaria se volvieron a colocar en los matraces y se enjuagaron con solución salina isotónica durante una hora, seguida de otros dos enjuagues con solución salina a 1 hora cada uno con agitación. Tras el enjuague con solución salina, las piezas de membrana placentaria se enjuagaron con agua ultrapura estéril durante quince minutos cada una, tres veces con agitación (punto A de la FIG. 2).

Procedimiento 2: Los diferentes trozos de membrana placentaria junto con los marcos se descongelaron a temperatura ambiente, se pesaron asépticamente y se colocaron en frascos estériles separados. Las piezas de membrana placentaria se enjuagaron con tampón de lisis de hematíes que contenía Tris-HCl y NH<4>Cl durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación, seguido de enjuague con solución salina isotónica a cinco minutos cada uno durante tres veces con agitación. Se añadió a los matraces una solución de desvitalización preparada que contenía lauroil sarcosinato sódico y ADNasa en tampón Tris y se agitaron los matraces durante 2 horas a temperatura ambiente. Se retiró la solución de desvitalización y se secó la membrana placentaria con toallas absorbentes estériles para eliminar el exceso de líquido. Los trozos de membrana placentaria se volvieron a colocar en los matraces y se enjuagaron con solución salina isotónica durante una hora, seguida de otro enjuague con solución salina durante toda la noche con agitación. Después del enjuague con solución salina, las piezas de membrana placentaria se enjuagaron con agua ultrapura estéril durante quince minutos cada una por tres veces con agitación.

La membrana placentaria descelularizada preparada con el procedimiento 1 o el procedimiento 2 se colocó en un recipiente estéril y se liofilizó durante 48-96 horas (elemento B de la FIG. 2).

Ejemplo 3. Caracterización de la membrana placentaria descelularizada

Las piezas de membrana placentaria descelularizada se prepararon según las etapas de procesamiento descritos en el Ejemplo 1, y el Ejemplo 2. Se troquelaron muestras representativas de membrana placentaria predescelularizada o descelularizada para la siguiente caracterización.

Histología de la membrana placentaria descelularizada: Se fijaron muestras representativas de membrana placentaria predescelularizada con o sin limpieza y descelularización en formalina tamponada neutra al 10%, seguida de deshidratación/limpieza/ infiltración en parafina. Cada muestra se dividió en dos y se incrustó con las dos caras de la sección transversal hacia abajo. El tejido se seccionó a 5 mieras para la tinción. La tinción con hematoxilina y eosina mostró la eliminación de células en el procedimiento posterior a la limpieza/descelularización (FIG. 3). En conclusión, el procedimiento de descelularización eliminó eficazmente las células de la membrana placentaria predescelularizada intacta con ambos procedimientos

ADN residual en la membrana placentaria descelularizada: Se utilizaron muestras representativas de la membrana placentaria con o sin limpieza y descelularización para la digestión con proteinasa K y la cuantificación del ADN utilizando un kit de ensayo de ADN PicoGreeen® (Invitrogen P11496) siguiendo el protocolo de funcionamiento estándar de LifeNet Health. El reactivo PicoGreen dsDNA es una tinción fluorescente ultrasensible de ácidos nucleicos para cuantificar ADN de doble cadena (dsDNA) en solución. Los resultados medidos y calculados se expresaron como porcentaje de reducción de dsADN en comparación con la membrana placentaria predescelularizada de la misma donante. El porcentaje medio de extracción de ADN de 6 donantes individuales fue del 94,7±2,34%.

Factores de crecimiento en la membrana placentaria descelularizada: Muestras representativas de la membrana placentaria con o sin limpieza y descelularización se cortaron en trozos pequeños y se incubaron con tampón HEPES que contenía colagenasa, hialuronidasa, inhibidores de la proteasa y Triton X-100 durante 20-24 horas a 37°C con agitación. Las muestras resultantes se sometieron a una breve sonicación y, a continuación, se centrifugaron a 10.000 g durante 15 minutos a 4°C. El sobrenadante se dividió en partes alícuotas y se utilizó para la cuantificación del factor de crecimiento siguiendo las instrucciones de los kits ELISA para bFGF y PDGF-AA (Ray Biotech, Inc.). Los resultados de bFGF y PDGF-AA de 6 donantes individuales se calcularon y mostraron en las FIG. 4 y 5.

Ejemplo 4. Implantación subcutánea de membrana placentaria descelularizada

La membrana placentaria descelularizada se prepara como se describe en el Ejemplo 1-2. Las muestras de implantes se obtienen tomando punciones de biopsia de 8 mm de la membrana placentaria liofilizada o no liofilizada. La mitad de las muestras se esterilizan definitivamente mediante irradiación gamma a una dosis absorbida de 10-20kGy sobre hielo seco.

Para este estudio se utilizan ratones atímicos machos (Nu/Nu Foxninu) de 6 semanas de edad. Los animales se pesan con una precisión de 0,1 g y se induce la anestesia con isoflurano (del 1 al 5% en O<2>para que surta efecto) y se mantiene del 2 al 3% en O<2>durante la cirugía. Cada animal recibe el analgésico perioperatorio Buprenorphine s R® a razón de 0,5 a 1,0 mg/kg mediante inyección subcutánea y se coloca una pomada oftálmica sobre los ojos. La región dorsal se frota dos veces con betadine y alcohol. Se realiza una incisión de aproximadamente 1 cm, una a cada lado de la línea media dorsal. A partir de estas incisiones se forman dos bolsas subcutáneas de aproximadamente 0,15 cm3 mediante disección roma. Las muestras de implante de membrana placentaria descelularizada se rehidratan con solución salina isotónica durante un mínimo de 5 minutos antes de la implantación. Los implantes se insertan en el bolsillo subcutáneo y se coloca una sutura entre un borde de la membrana placentaria implantada y el músculo del ratón adyacente para ayudar a localizar la muestra implantada. Cada animal recibe un total de 2 implantes. Las incisiones se cierran con suturas interrumpidas de prolene 4-0. Cada animal se aloja por separado en una jaula limpia y se vigila hasta que está alerta y se mueve.

Después de 2 o 4 semanas de implantación, los animales son eutanasiados por inhalación de CO<2>y se registra su peso. Las zonas del implante se expusieron cuidadosamente cortando la piel y los tejidos subcutáneos a unos 5 mm del implante. La muestra implantada y los 3-5 mm de tejido circundante se extirparon y se fijaron en formalina tamponada neutra (NBF) al 10% durante un mínimo de 4 días para lograr una fijación completa.

Cada muestra de explante se corta a lo largo de su línea media más larga para crear dos mitades. Las muestras resultantes se incrustan juntas (cortadas boca abajo) en el mismo bloque de parafina y se preparan secciones histológicas. Dos secciones de cada grupo se tiñen con hematoxilina y eosina (H&E). La sección con la mayor superficie de sección transversal de material de implante se utiliza para la clasificación. Las secciones de tejido se evalúan semicuantitativamente para determinar la infiltración de fibroblastos en el implante, el grado de neovascularización, la respuesta celular inflamatoria (macrófagos/células gigantes, neutrófilos) y el tejido fibroso/encapsulación. La infiltración de fibroblastos y la angiogénesis pueden encontrarse en la membrana placentaria implantada. No se encontrará inflamación o ésta será mínima en la membrana placentaria implantada

Ejemplo 5. Uretroplastia de conejo con membrana placentaria descelularizada

La membrana placentaria descelularizada se prepara como se describe en el Ejemplo 1-2. Las muestras de implantes se generan cortando trozos de 1 cm x 2 cm de la membrana placentaria liofilizada o no liofilizada. La mitad de las muestras se esterilizan definitivamente mediante irradiación gamma a una dosis absorbida de 10-20kGy sobre hielo seco.

Para este estudio se utilizan conejos blancos de Nueva Zelanda machos (3-3,5 kg, 3-4 meses de edad). Los conejos se pesan con una precisión de 10 g y se anestesian con ketamina (35 mg/kg, IM) y xilacina (5 mg/kg, IM) y se les administrará isoflurano (2 a 3% en Oz) mientras dure el procedimiento quirúrgico. Tras el sondaje uretral, la uretra peneana se expone a través de una incisión cutánea ventral en la línea media y se moviliza desde los cuerpos esponjosos subyacentes. Se extirpa un área de 1 x 2 cm2 (Anchura x Longitud) de tejido uretral ventral y se anastomosa una membrana placentaria de igual tamaño al lugar del defecto utilizando suturas interrumpidas de poliglactina 6-0. Se colocan suturas no absorbibles de polipropileno 6-0 en los límites proximal, distal y lateral de la zona de implantación para identificar los bordes del injerto. Las incisiones cutáneas se cierran posteriormente con suturas corridas. Además, un grupo de control de animales (N = 3) que sólo recibieron uretrotomía fue tratado de forma similar en paralelo. Los animales recibirán 1 dosis de buprenex SR (0,12 mg/kg, SQ) después del procedimiento y un antibiótico, Baytril (5 mg/kg, IM) durante 7 días después del procedimiento. En todos los grupos experimentales, se fija a la uretra una endoprótesis uretral Firlit-Kluge de 8 French (Cook Urological, Spencer, IN) para permitir el refuerzo de la zona de reparación y el drenaje libre de orina mediante sondaje durante los 7 días siguientes a los procedimientos quirúrgicos. Tras la retirada del stent, se permite a los animales vaciar voluntariamente hasta la finalización del estudio. Al cabo de tres meses, los conejos se someten a una cistouretroscopia bajo anestesia general para evaluar la permeabilidad uretral. Los controles y los conejos que reciben implantes son eutanasiados a los 3 meses post-implante y las muestras uretrales aisladas se someten a análisis histológicos, inmunohistoquímicos e histomorfométricos. Se espera una reepitelización de la membrana placentaria hacia el lumen después de 3 meses de implantación.

Ejemplo 6. Extracción de células de la membrana amniótica aislada, la membrana coriónica y la membrana placentaria intacta - Descelularización

La placenta humana a término y el saco amniótico con el consentimiento de la donante se obtuvieron tras una cesárea y se trasladaron a las instalaciones de procesamiento en condiciones estériles.

El saco amniótico que comprende la membrana placentaria con ambas capas de membrana amniótica y coriónica se cortó alrededor de la falda de la placenta y se enjuagó al menos tres veces con solución isotónica como solución salina, o Ringer lactato para eliminar la sangre suelta. La membrana placentaria enjuagada se colocó sobre una tabla estéril y se cortó por la mitad. La membrana amniótica se aisló de la membrana coriónica adherente para una mitad de la membrana placentaria (FIG. 9). La membrana amniótica se colocó sobre la placa con las células epiteliales hacia abajo y la membrana coriónica se colocó sobre la placa con la capa de trofoblastos hacia abajo. Se colocaron marcos de malla de diferentes tamaños y formas sobre la membrana amniótica aislada o la membrana coriónica aislada. La membrana se cortó en diferentes tamaños y formas, en consonancia con los tamaños y formas de los marcos correspondientes. Cada pieza de la membrana amniótica aislada o de la membrana coriónica se fijó con los marcos de malla mediante grapas. Otra mitad de la membrana placentaria se mantuvo intacta y se colocó sobre la tabla con la capa epitelial de la membrana amniótica hacia arriba. Se colocaron marcos de malla de diferentes tamaños y formas sobre la membrana placentaria intacta. La membrana placentaria se cortó en diferentes tamaños y formas alineados con los tamaños y formas de los marcos correspondientes. Cada trozo de la membrana placentaria intacta, con las capas de membrana amniótica y coriónica, se fijó a los marcos de la malla mediante grapas. Las piezas preparadas de membrana placentaria intacta o aislada se colocaron planas en recipientes estériles y se almacenaron en el congelador a -80 °C hasta su posterior procesamiento. Los diferentes trozos de membrana placentaria intacta o aislada junto con los marcos se descongelaron a temperatura ambiente, se pesaron asépticamente y se colocaron en frascos estériles separados. Las piezas de membrana placentaria se enjuagaron con tampón de lisis de hematíes que contenía Tris-HCl y NH<4>Cl durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación, seguido de enjuague con solución salina isotónica a cinco minutos cada uno durante tres veces con agitación. Se añadió a los matraces una solución de desvitalización preparada que contenía lauroil sarcosinato sódico y ADNasa en tampón Tris y se agitaron los matraces durante 2 horas a temperatura ambiente. Se retiró la solución de desvitalización y la membrana placentaria intacta y aislada se secó con toallas absorbentes estériles para eliminar el exceso de líquido. Los trozos de membrana placentaria se volvieron a colocar en los matraces y se enjuagaron con solución salina isotónica durante media hora por tres veces con agitación. Después del enjuague con solución salina, las piezas de membrana placentaria se enjuagaron con agua ultrapura estéril durante quince minutos cada una por tres veces con agitación.

La membrana amniótica aislada descelularizada, la membrana coriónica aislada y la membrana placentaria intacta de cinco donantes diferentes preparadas como se muestra arriba se colocaron en un recipiente estéril y se liofilizaron durante 48-96 horas.

Ejemplo 7. Caracterización de la membrana amniótica descelularizada y aislada, la membrana coriónica y la membrana placentaria intacta

Las piezas de membrana placentaria descelularizada se prepararon de acuerdo con las etapas de procesamiento descritos en el Ejemplo 6. Se troquelaron muestras representativas de membrana amniótica, membrana coriónica y membrana placentaria intacta antes y después de las etapas de limpieza/descelularización para la siguiente caracterización.

ADN residual en la membrana amniótica descelularizada, la membrana coriónica y la membrana placentaria intacta: Se utilizaron muestras representativas de la membrana amniótica, la membrana coriónica y la membrana placentaria intacta con o sin limpieza y descelularización para la digestión con proteinasa K y la cuantificación del ADN mediante un kit de ensayo de ADN PicoGreeen® (Invitrogen P11496) siguiendo el protocolo de funcionamiento estándar de LifeNet Health. El reactivo PicoGreen dsDNA es una tinción fluorescente ultrasensible de ácidos nucleicos para cuantificar ADN de doble cadena (dsDNA) en solución. Los resultados medidos y calculados se expresaron como porcentaje de reducción de dsADN en comparación con la membrana amniótica no descelularizada, la membrana coriónica y la membrana placentaria intacta de la misma donante. El porcentaje medio de extracción de ADN de 5 donantes individuales fue de 95,96±2,03%, 95,79±5,56% y 93. 74±5,07% para la membrana amniótica aislada, la membrana coriónica aislada y la membrana placentaria intacta, respectivamente. No hubo diferencias significativas entre estos grupos (p>0,05).

Factores de crecimiento en la membrana placentaria descelularizada: Muestras representativas de membrana amniótica aislada, membrana coriónica aislada y membrana placentaria intacta tras su limpieza y descelularización se cortaron en trozos pequeños y se incubaron con tampón HEPES que contenía colagenasa, hialuronidasa, inhibidores de la proteasa y Tritón X-100 durante 20-24 horas a 37°C con agitación. Las muestras resultantes se sometieron a una breve sonicación y, a continuación, se centrifugaron a 10.000 g durante 15 minutos a 4°C. El sobrenadante se dividió en partes alícuotas y se utilizó para la cuantificación del factor de crecimiento siguiendo las instrucciones de los kits ELISA para bFGF y PDGF-AA (Ray Biotech, Inc.). Se midieron y calcularon los resultados de bFGF y PDGF-AA de 5 donantes individuales. Tras la descelularización, el PDGF-AA total de la membrana placentaria intacta era un 18% superior a la suma del PDGF-AA de la membrana amniótica aislada y de la membrana coriónica del mismo tamaño (FIG. 10A). El bFGF total de la membrana placentaria intacta fue un 140% superior a la suma del bFGF de la membrana amniótica aislada y de la membrana coriónica del mismo tamaño (FIG. 10B). Esto sugiere que el aislamiento de la membrana amniótica y la membrana coriónica puede reducir el contenido del factor de crecimiento en comparación con la membrana placentaria intacta. La membrana placentaria intacta con la capa de amnios y la capa de corion en contacto puede mantener mejor los factores bioactivos que la capa de amnios y la capa de corion aisladas. Asimismo, nuestros datos mostraron una cantidad significativamente mayor de PDGF-AA y bFGF en la membrana coriónica que en la membrana amniótica.

Ejemplo 8. Actividad de la membrana placentaria intacta descelularizada

Las piezas de membrana placentaria descelularizada se prepararon de acuerdo con las etapas de procesamiento descritos en el Ejemplo 6. Se extrajeron muestras representativas de la membrana placentaria intacta tras las etapas de limpieza/descelularización y se pesaron asépticamente. La membrana placentaria intacta se extrajo en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) durante 24 horas a 2mg/mL con agitación suave (75 RPM) a 37°C. También se incubó un medio de control (sólo DMEM, sin tejido placentario) junto con las extracciones de membrana placentaria. Los medios de 2 grupos diferentes se añadieron a placas de 48 pocillos de fibroblastos dérmicos humanos (HDF), sembrados a 3500 células/cm2 el día anterior.

En los días 1, 3 y 6, las células se separaron de la placa, se centrifugaron a 10000 RPM durante 5 minutos, y los pellets celulares se utilizaron para la cuantificación del ADN utilizando el kit de ensayo de ADN PicoGreen (Invitrogen Cat# P11496). La cantidad de ADN cromosómico total se utilizó como indicador del número de células HDF. Los resultados mostraron que la proliferación de células HDF desde el día 1 hasta el día 6 cultivadas con medios de extracción de membrana placentaria (FIG. 11), y el porcentaje de ADN que aumentó del día 1 al 6 fue del 240%. Las células HDF cultivadas sólo con medio de control no mostraron ninguna proliferación significativa durante el mismo periodo de cultivo, el porcentaje de aumento de ADN del día 1 al día 6 fue de aproximadamente el 18%.

La presente invención no se limita a las realizaciones descritas y ejemplificadas anteriormente, sino que es susceptible de variación y modificación dentro del alcance y la gama de equivalencias de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para preparar una membrana placentaria descelularizada, que comprende obtener un saco amniótico cortado de una placenta alrededor de una falda placentaria, en el que el saco amniótico comprende una membrana placentaria predescelularizada y la membrana placentaria predescelularizada comprende una capa de amnios y una capa de corion, eliminar células de la membrana placentaria predescelularizada sin separar la capa de amnios de la capa de corion, con lo que se prepara una membrana placentaria descelularizada, en el que la membrana placentaria descelularizada comprende ADN en una cantidad inferior al 10% del ADN de la membrana placentaria predescelularizada.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la membrana placentaria descelularizada comprende uno o más factores de crecimiento en una cantidad que es al menos un 10% mayor que la suma de la cantidad del uno o más factores de crecimiento en una membrana amniótica aislada de control descelularizada y la cantidad del uno o más factores de crecimiento en una membrana coriónica aislada de control descelularizada, y en el que la membrana placentaria descelularizada tiene un tamaño de área que es menos de un 5% diferente de la de la membrana coriónica aislada de control.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la membrana placentaria descelularizada comprende uno o más factores de crecimiento en una cantidad que es al menos el 20% de la cantidad del uno o más factores de crecimiento en la membrana placentaria predescelularizada.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la membrana placentaria descelularizada comprende menos de 100 ng de dsADN por mg de peso seco de la membrana placentaria predescelularizada.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la capa de amnios de la membrana placentaria descelularizada comprende una capa de fibroblastos, y en el que la capa de corion de la membrana placentaria descelularizada comprende una capa reticular.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la capa de amnios de la membrana placentaria descelularizada comprende epitelio, una membrana basal, una capa compacta, una capa de fibroblastos y una capa esponjosa, y en el que la capa de corion de la membrana placentaria descelularizada comprende una capa celular, una capa reticular, una pseudomembrana basal y una capa de trofoblastos.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además la extracción del saco amniótico de un donante.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, comprende además limpiar y desinfectar la membrana placentaria predescelularizada.

9. Un procedimiento que comprende el cultivo de células en presencia de la membrana placentaria descelularizada preparada por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. Un procedimiento para promover la diferenciación de células madre pluripotentes o células progenitoras específicas de tejido, que comprende cultivar las células madre pluripotentes o células progenitoras específicas de tejido en presencia de una cantidad eficaz de la membrana placentaria descelularizada preparada por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

11. Una membrana placentaria descelularizada que comprende una capa de amnios y una capa de corion, en la que la capa de amnios y la capa de corion se derivan de una membrana placentaria predescelularizada obtenida de un saco amniótico cortado de una placenta alrededor de una falda placentaria sin separación de la capa de amnios de la capa de corion en la membrana placentaria predescelularizada, y en la que la membrana placentaria descelularizada comprende ADN en una cantidad inferior al 10% del ADN de la membrana placentaria predescelularizada.

12. Un injerto derivado de placenta que comprende la membrana placentaria descelularizada de la reivindicación 11 y uno o más agentes.

13. La membrana placentaria descelularizada de las reivindicaciones 11 ó 12 para su uso en la reparación de un defecto en un tejido, que comprende poner en contacto del lugar del defecto con una cantidad eficaz de la membrana placentaria descelularizada.