ES2981369T3 - Composición y métodos que se refieren al tratamiento de enfermedades - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a una composición que comprende un subtipo de interferón alfa (IFN-α) que es un híbrido de IFN-α10 e IFN-α14 para su uso en la prevención o el tratamiento de una infección viral, así como a un método de tratamiento y/o profilaxis de una infección viral utilizando dicho híbrido de IFN-α. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Composición y métodos que se refieren al tratamiento de enfermedades
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones para prevenir o tratar una infección viral. La invención se extiende a composiciones para prevenir o tratar la infección procedente de infecciones virales induciendo la capacidad de respuesta de las células NK y T. La invención se extiende además a las composiciones y al uso de las composiciones de la invención para el tratamiento y/o la profilaxis de una infección viral para terapias humanas y veterinarias.
Antecedentes de la invención
El interferón-alfa (IFN-alfa) se ha usado clínicamente y comercialmente (p. ej., RoferonA®, IntronA®, Pegasys®, Pegintron®, etc.) para tratar con éxito diversos virus tales como síndrome respiratorio agudo grave (SARS), hepatitis B crónica, hepatitis C crónica y VIH. El IFN-alfa es una de las citoquinas más tempranas liberadas por las células presentadoras de antígenos como parte de la respuesta inmune innata. Es directamente responsable de la capacidad de respuesta de las células NK y T. Se sabe que diferentes patógenos inducen diferentes subtipos de interferón-alfa (IFN-a) in vitro y que los subtipos de IFN-a tienen diferentes actividades antivirales, antiproliferativas e inmunomoduladoras. Los mecanismos de acción de IFN-a, y en particular los subtipos individuales de IFN-a, todavía se entienden parcialmente. Se ha mostrado que la infección por medio de una variedad de rutas induce diferentes perfiles de subtipos. Los subtipos de IFN-a se unen a los mismos receptores, activan rutas de señalización comunes y se ha esperado que tengan funciones inmunológicas similares. Todos los subtipos de IFN-a tienen actividades antivirales, por definición, aunque su eficacia absoluta en este contexto puede variar considerablemente. Además, se han descrito muchas propiedades biológicas diferentes, pero con potencias variables, que incluyen las actividades inmunomoduladoras y antiproliferativas. Los efectos pleyotrópicos parecen estar debidos a la interacción diferencial con las cadenas receptoras y la señalización mediante diferentes rutas intracelulares a una variedad de moléculas efectoras. El receptor de IFN tipo I consiste en dos cadenas, IFNR1 e IFNR2. Hay un intervalo de afinidades de unión para cada uno de los 12 subtipos de IFN-a con las diferentes cadenas receptoras. El IFN-a14 tiene una de las mayores afinidades por los dos de los receptores de interferón, que es por lo cual es tan activo en comparación con los otros 11 subtipos.
Los interferones recombinantes, que consisten en solo el subtipo IFN alfa 2, dominan actualmente el mercado para indicaciones antivirales. Hay dos productos IFN alfa recombinantes principales, Intron ATM de Schering Plough (IFN-alfa 2b) y Roferon™ (IFN-alfa 2a) de Roche. En contraste con estos productos de subtipo únicos, hay varios preparados de alfa IFN que consisten en una mezcla de subtipos diferentes. Estos productos de IFN alfa multi-subtipos se producen o por leucocitos humanos en respuesta a una estimulación de un virus (tal como Multiferon™ de Viragen, Inc o sus subsidiarios, o Alferon-NTM de Interferon Sciences/Hemispherix), o en células linfoblastoides humanas, cultivadas de un paciente con linfoma de Burkitt (tal como Sumiferon™ de Sumitomo).
Compendio de la invención
La presente invención es como se define en las reivindicaciones.
En ausencia de vacunas dirigidas contra virus específicos, particularmente virus surgidos recientemente, un fármaco antiviral eficaz sería particularmente ventajoso, de manera adecuada en relación con brotes de SARS, gripe (particularmente H5N1), virus del Zika, WNV y<e>B<o>V.
Por tanto, un primer aspecto de la presente invención proporciona una composición para el tratamiento y/o la profilaxis de infección viral, comprendiendo dicho método la etapa de:
(i) administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de HÍBRIDO 2.
Después de una extensa experimentación, el inventor de la presente invención ha descubierto sorprendentemente que administrar una variante de interferón alfa 14 HÍBRIDO 2, SEQ ID NO:3 o una variante o fragmento del mismo como se describe en la presente memoria da por resultado la eliminación o inhibición de los efectos de infección viral. El inventor determinó inesperadamente que HÍBRIDO 2 puede inhibir directamente el efecto citopático que resulta de la infección viral. El efecto citopático o efecto citopatogénico se refiere a cambios estructurales en las células huésped que están provocados por invasión viral. El inventor demostró que el HÍBRIDO 2 también inhibe la formación de placa relacionada con la infección viral.
El presente inventor ha examinado la capacidad del Híbrido 2 sintético de alfa-interferón para inhibir la infección viral usando un sistema modelo basado en el efecto citopático y la formación de placa provocada como un resultado de la infección con SARS-CoV-1 y SARS-CoV-2. El inventor también ha examinado la inhibición del efecto citopático en comparación con el compuesto antiviral Ribavirina y el interferón multi-subtipo Multiferon™.
Adicionalmente el inventor ha utilizado un modelo de VIH y uno de RSV para demostrar el efecto antiviral de HÍBRIDO 2. El inventor utilizó diferentes líneas celulares adherentes para demostrar la actividad antiviral de HÍBRIDO 2 frente a VIH y HRSV. Para cada ensayo antiviral, se estableció en paralelo una prueba de viabilidad usando las mismas concentraciones de inhibidores probados en los ensayos antivirales. Los ensayos de viabilidad se usaron para determinar los efectos de citotoxicidad inducida por compuesto en ausencia de virus. Hay más de 37 millones de personas en el mundo con VIH. La infección por RSV es la causa más importante de hospitalización en bebés y una de las principales causas de mortalidad infantil. Como uno de los virus respiratorios, junto con la gripe, rinovirus y coronavirus, es tanto interesante por sí mismo y proporciona un modelo indicativo. El inventor también ha demostrado que el tratamiento de queratinocitos humanos primarios con HÍBRIDO 2 reduce la infección por virus del herpes simple tipo 1 (HSV1). De manera adecuada una infección viral puede tratarse proporcionando HÍBRIDO 2 (SEQ ID NO:3) o una variante o fragmento del mismo, mediante inyección directa o cuando sea apropiado, por ejemplo para virus que provocan problemas respiratorios mediante aerosol directamente a los pulmones. Se pueden usar dosis adecuadas en el intervalo de 104 a 107 IU por administración. De manera adecuada, el HÍBRIDO 2 (SEQ ID NO:3) puede proporcionarse como un tratamiento sublingual. La administración de HÍBRIDO 2 o una variante o fragmento del mismo como un tratamiento sublingual puede dar por resultado una mayor reducción o inhibición de la actividad viral en comparación con los medicamentos antivirales previos. Además, los inventores han determinado que pueden usarse dosis muy bajas de HÍBRIDO 2 por ejemplo hasta 104 a 5x106 IU por día.
Esto ha llevado a la identificación por el inventor de composiciones terapéuticas mejoradas que tienen utilidad en el tratamiento y/o la profilaxis de la infección viral.
De manera adecuada la infección viral puede seleccionarse de los virus seleccionados de un miembro de la familia Flaviviridae (p. ej., un miembro de los géneros Flavivirus, Pestivirus y Hepacivirus), que incluye el virus de la hepatitis C, virus de la fiebre amarilla; virus transmitidos por garrapatas, tales como el virus de Gadgets Gully, virus de Kadam, virus de la enfermedad del bosque de Kyasanur, virus de Langat, virus de la fiebre hemorrágica de Omsk, virus de Powassan, virus Royal Farm, virus Karshi, virus de encefalitis transmitidos por garrapatas, virus Neudoerfl, virus Sofjin, virus de la enfermedad de Louping y el virus de Negishi; virus transmitidos por garrapatas de aves marinas, tales como virus de Meaban, virus del arrecife de Saumarez, y el virus Tyuleniy; virus transmitidos por mosquitos, tales como el virus de Arna, virus del dengue, virus Kedougou, virus Cacipacore, virus Koutango, virus de encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de Murray Valley, virus de la encefalitis de San Luis, virus Usutu, virus del Nilo occidental, virus Yammde, virus Kokobera, virus Bagaza, virus Ilheus, virus de meningoencefalomielitis turco-israelí, virus de Ntaya, virus de Tembusu, virus del Zika, virus Barizi, virus Bouboui, virus de Edge Hill, virus Jugra, virus de Saboya, virus de Sepik, virus S de Uganda, virus de Wesselsbron, virus de la fiebre amarilla, virus del murciélago de Entebbe, virus de Yokose, virus Apoi, virus de Cowbone Ridge, virus de Jutiapa, virus de Modoc, virus de Sal Vieja, virus de San Perlita, virus del murciélago de Bukalasa, virus de la isla Carey, virus del murciélago de Dakar, virus de leucoencefalitis de Montana myotis, virus del murciélago de Phnom Penh, virus de Río Bravo, virus del murciélago de Tamana y el virus del agente de fusión celular.
En otra realización, el virus se selecciona de un miembro de la familia Arenaviridae, que incluye el virus Ippy, virus de Lassa (p. ej., la cepa Josiah, LP, o GA391), virus de coriomeningitis linfocítica (LCMV), virus de Mobala, virus de Mopeia, virus de Amapari, virus Flexal, virus de Guanarito, virus de Junin, virus latino, virus de Machupo, virus de Oliveros, virus de Paraná, virus Pichinde, virus Pirital, virus de Sabia, virus de Tacaribe, virus de Tamiami, virus del arroyo Whitewater, virus de Chapare y virus Lujo.
En otras realizaciones más, el virus puede seleccionarse de un miembro de la familia Bunyaviridae (p. ej., un miembro de los géneros Hantavirus, Nairovirus, Orthobunyavirus y Phlebovirus), que incluye el virus de Hantaan, virus sin nombre, virus Dugbe, virus de Bunyamwera, virus de la fiebre del valle del Rift, virus de La Crosse, virus Punta Toro (PTV), virus de la encefalitis de California, y el virus de la fiebre hemorrágica de Congo-Crimea (CCHF), un virus de la familia Filoviridae, que incluye el virus del Ébola (p. ej., las cepas de Zaire, Sudán, Costa de Marfil, Reston y Uganda) y el virus Marburg (p. ej., las cepas de Angola, Ci67, Musoke, Popp, Ravn y Lago Victoria);
En las realizaciones, el virus puede seleccionarse de un miembro de la familia Togaviridae (p. ej., un miembro del género Alphavirus), que incluye el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), virus de la encefalitis equina oriental (EEE), virus de la encefalitis equina occidental (WEE), virus de Sindbis, virus de la rubeola, virus del bosque de Semliki, virus del río Ross, virus del bosque de Barmah, virus de O’nyong’nyong, y el virus de chikungunya; un miembro de la familia Poxyiridae (p. ej., un miembro del género Orthopoxvirus), que incluye el virus de la viruela, viruela del ganado, virus de la viruela símica, y el virus vaccinia; un miembro de la familia Herpesviridae, que incluye el virus del herpes simple (HSV; tipos 1,2 y 6), virus del herpes humano (p. ej., tipos 7 y 8), citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (EBV), virus de la varicela-Zoster, y virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV).
En otra realización el virus puede seleccionarse de un miembro de la familia Orthomyxoviridae, que incluye el virus de la gripe (A, B y C), tal como el virus de la gripe aviar H5N1 o gripe porcina H1N1; un miembro de la familia Rhabdoviridae, que incluye el virus de la rabia y el virus de la estomatitis vesicular (VSV); un miembro de la familia Paramyxoviridae, que incluye el virus sincitial respiratorio humano (RSV), virus de la enfermedad de Newcastle, virus hendra, virus nipah, virus del sarampión, virus de la peste bovina, virus del moquillo canino, virus de Sendai, virus de la parainfluenza humana (p. ej., 1,2, 3 y 4), rinovirus, y virus de las paperas.
En las realizaciones el virus puede seleccionarse de un miembro de la familia Picornaviridae, que incluye el virus de la polio, enterovirus humano (A, B, C y D), virus de la hepatitis A, y virus de Coxsackie; un miembro de la familia Hepadnaviridae, que incluye el virus de la hepatitis B.
En realizaciones el virus puede seleccionarse de un miembro de la familia Retroviridae, que incluye el virus de inmunodeficiencia humana (VIH; p. ej., los tipos 1 y 2), y virus linfotrófico de células T humano tipos I y II (HTLV-1 y HTLV-2, respectivamente).
En las realizaciones el virus puede seleccionarse de virus eco. De forma adecuada el virus puede seleccionarse de un virus que codifica una proteína conocida por antagonizar la respuesta de IFN tipo 1:
Virus Chikungunya (CHIKV)
Virus de Coxsackie
Virus del dengue (DENV)
Virus de Epstein-Barr (EBV)
Virus de la hepatitis B (HBV)
Virus de la hepatitis C (HCV)
Citomegalovirus humano (HCMV)
Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
Virus de la parainfluenza humana (HPIV)
Virus sincitial respiratorio humano (HRSV)
Rinovirus humano (HRV)
Virus de herpes simple (HSV)
Virus de la gripe A (IAV)
Virus de la gripe B (IBV)
Virus de Lassa (LASV)
Virus del sarampión (MeV)
Virus de las paperas (MuV)
Virus Nipah (NiV)
Virus de la polio (PV)
Virus de la rabia (RABV)
Virus del Nilo occidental (WNV)
Virus de la fiebre amarilla (YFV)
Virus del Zika (ZIKV)
De manera adecuada el virus puede seleccionarse de una enfermedad viral provocada por un virus con envoltura, preferiblemente seleccionado del grupo (no todos reivindicados) que consiste en: virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1), virus de la inmunodeficiencia humana 2 (VIH-2), virus del herpes 1 (HSV-1), virus del herpes 2 (HSV-2), virus de la gripe, virus sincitial respiratorio (RSV), citomegalovirus (CMV), virus del Zika (ZKV), virus del dengue, virus del Nilo occidental, virus de Lassa, virus del ébola, virus de Lloviu, virus de Bundibugyo, virus de Reston, virus de Sudán, virus del bosque Tai, virus de Marburg, virus de Ravn (RAW), pneumovirus, virus de Junin, virus de la fiebre del valle de Rift, virus de La Crosse, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino, virus de la viruela, norovirus de la diarrea viral bovina, coronavirus SARS, virus de Chikungunya, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis B, virus de Schmallenberg, virus de la fiebre porcina africana, virus de la encefalitis equina oriental, virus de la viruela bovina, virus de la encefalitis equina occidental, virus de Nipah, virus de la fiebre hemorrágica de Omsk, virus de la encefalitis equina venezolana, virus de la parainfluenza humana, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus de encefalitis primavera-verano rusa (RSSE), virus de la fiebre amarilla, virus de Newcastle, virus (BVDV), virus de la parainfluenza tipo 5 (PIV5), virus de la enfermedad de la frontera (BDV) de la oveja, virus de la fiebre porcina clásica (CSFV), virus de la estomatitis vesicular (VSV) y HSV-2 resistente a aciclovir (HSV-2 Acy R), más preferiblemente el virus con envoltura se selecciona del grupo que consiste en: VIH-1, HSV-1, HSV-2, HCMV, RSV, VSV, H1N1, DENV-2 y ZKV.
En realizaciones, la infección viral puede seleccionarse de virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus sincitial respiratorio humano (HRSV) o virus del herpes simple (HSV).
El subtipo de interferón alfa HÍBRIDO 2 comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:3 o un fragmento funcionalmente activo o variante de la misma. En realizaciones, el método de administración es administración oral. En realizaciones, el método de administración es la inyección. En realizaciones el método de administración es mediante administración de aerosoles a los pulmones.
En realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz del subtipo de interferón alfa HÍBRIDO 2 es como una dosis baja. En realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz del subtipo de interferón alfa HÍBRIDO 2 es entre 104 a 5x106 unidades de IU/ml. En realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz del subtipo de interferón alfa HÍBRIDO 2 es menor que los actuales tratamientos sistémicos para la infección por coronavirus.
En realizaciones, el subtipo de interferón alfa HÍBRIDO 2 se administra en una dosis de 5 IU/ml, 10 IU/ml, 50 IU/ml, 1x102 IU/ml, 1x103 IU/ml, 1x104 IU/ml, 1x105 IU/ml, 1x106 IU/ml o 1x107 IU/ml.
En realizaciones, el subtipo de interferón alfa HÍBRIDO 2 se administra en una dosis de entre 0,1 mg a 1 mg, adecuadamente 1 ng - 50 microgramos. Por ejemplo, en aplicaciones humanas se pueden usar 5x104 unidades de IU/ml o menos.
En realizaciones, el subtipo de interferón alfa HÍBRIDO 2 se administra mediante administración sublingual. En realizaciones, el subtipo de interferón alfa puede administrarse una vez al día, dos veces al día, tres veces al día o cuatro veces al día. De forma adecuada, en la administración sublingual, puede proporcionarse una dosis única cada día.
En realizaciones, el subtipo de interferón alfa HÍBRIDO 2 interrumpe la actividad viral, por ejemplo inhibe el efecto citopático o la formación de placa del virus.
Normalmente, el sujeto es un mamífero, en particular un ser humano. En realizaciones, el sujeto puede ser un pájaro. En las realizaciones, el sujeto puede ser un animal.
En ciertas realizaciones, el método incluye la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente útil de un compuesto antiviral adecuado. En realizaciones, el compuesto antiviral es ribavirina. En realizaciones en combinación con el subtipo de interferón alfa, HÍBRIDO 2, puede seleccionarse un tratamiento adicional de Remdesivir, LAM-002A (apilimod - un inhibidor selectivo de PIKfyve quinasa), dexametasona, y Avigan (favilavir) u otro subtipo de interferón.
Según un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un subtipo de interferón alfa, HÍBRIDO 2, para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de una infección viral.
El subtipo de interferón alfa HÍBRIDO 2 comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:3 o un fragmento o variante funcionalmente activo de la misma. En realizaciones, el subtipo de interferón alfa, HÍBRIDO 2, es para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedad viral respiratoria, enfermedad viral gastrointestinal, enfermedad viral exantematosa, enfermedad viral hepática, enfermedad viral cutánea, enfermedad viral hemorrágica, enfermedad viral neurológica.
En las realizaciones, el subtipo de interferón alfa, HÍBRIDO 2, es para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus sincitial respiratorio humano (HRSV) y virus del herpes simple.
En realizaciones, el subtipo de interferón alfa, HÍBRIDO 2, es para el uso en el tratamiento y/o profilaxis del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus sincitial respiratorio humano (HRSV) o virus del herpes simple (HSV).
En realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz del HÍBRIDO 2 es una dosis baja. En realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz del subtipo de interferón alfa HÍBRIDO 2 es entre 104 a 5x106 unidades de IU/ml.
En realizaciones, el HÍBRIDO 2 se administra en una dosis de 5 IU/ml, 10 IU/ml, 50 IU/ml, 1x102 IU/ml, 1x103 IU/ml, 1x104 IU/ml, 1x105 IU/ml, 1x106 IU/ml o 1x107 IU/ml.
En realizaciones, el HÍBRIDO 2 se administra en una dosis de entre 0,1 mg a 1 mg, adecuadamente 1 ng -50 microgramos. Por ejemplo, en aplicaciones humanas se pueden usar 5x104 unidades de IU/ml o menos. En animales, p. ej. perros, el uso sublingual puede ser 104 IU/Kg, por ejemplo en 1 ml de PBS.
En realizaciones, el subtipo de interferón alfa puede administrarse una vez al día, dos veces al día, tres veces al día o cuatro veces al día. De manera adecuada, en la administración sublingual, puede proporcionarse una dosis única cada día.
En realizaciones en combinación con HÍBRIDO 2 puede seleccionarse un tratamiento adicional de Remdesivir, LAM-002A (apilimod - un inhibidor selectivo de PIKfyve quinasa), dexametasona y Avigan (favilavir).
Según un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de HÍBRIDO 2 o una combinación del mismo en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de la infección viral.
Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición que comprende HÍBRIDO 2, para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus sincitial respiratorio humano (HRSV) o virus herpes simple (HSV).
Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende HÍBRIDO 2, para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de la infección viral.
En realizaciones, la infección viral puede seleccionarse de virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus sincitial respiratorio humano (HRSV) o virus del herpes simple (HSV).
En realizaciones la composición farmacéutica puede proporcionar HÍBRIDO 2 en combinación con un tratamiento adicional, en donde el tratamiento adicional puede seleccionarse de Remdesivir, LAM-002A (apilimod - un inhibidor selectivo de PIKfyve quinasa), dexametasona, y Avigan (favilavir).
Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona HÍBRIDO 2 para el uso en la modulación de una respuesta inmunitaria.
En realizaciones, una combinación del subtipo de interferón alfa HÍBRIDO 2 con un tratamiento adicional seleccionado de Remdesivir, LAM-002A (apilimod - un inhibidor selectivo de PIKfyve quinasa), dexametasona y Avigan (favilavir) se puede usar para modular la respuesta inmunitaria.
Según un aspecto adicional de la presente invención se proporciona el uso de HÍBRIDO 2 o una combinación del mismo y un compuesto antiviral para el tratamiento o prevención de infección con un virus, y en virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus sincitial respiratorio humano (HRSV) o virus del herpes simple (HSV). De manera adecuada un virus puede seleccionarse de:
Virus Chikungunya (CHIKV)
Virus Coxsackie
Virus del dengue (DENV)
Virus de Epstein-Barr (EBV)
Virus de la hepatitis B (HBV)
Virus de la hepatitis C (HCV)
Citomegalovirus humano (HCMV)
Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
Virus de la parainfluenza humana (HPIV)
Virus sincitial respiratorio humano (HRSV)
Rinovirus humano (HRV)
Virus del herpes simple (HSV)
Virus de la gripe A (IAV)
Virus de la gripe B (IBV)
Virus de Lassa (LASV)
Virus del sarampión (MeV)
Virus de las paperas (MuV)
Virus Nipah (NiV)
Virus de la polio (PV)
Virus de la rabia (RABV)
Virus del Nilo occidental (WNV)
Virus de la fiebre amarilla (YFV)
Virus del Zika (ZIKV).
El subtipo de interferón alfa HÍBRIDO 2 comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:3 o un fragmento funcionalmente activo de la misma.
En realizaciones de los aspectos de la invención descritos anteriormente, la composición o composición farmacéutica se administra de manera sublingual. Esto puede ser particularmente ventajoso para los tratamientos veterinarios. En realizaciones, el método de administración es administración oral. En realizaciones, el método de administración es inyección.
En realizaciones de los aspectos de la invención descritos anteriormente, HÍBRIDO 2 se administra en una dosis de 5 IU/ml, 10 IU/ml, 50 IU/ml, 1x102 IU/ml, 1x103 IU/ml, 1x104 IU/ml, 1x105 IU/ml, 1x106 IU/ml o 1x107 IU/ml.
En realizaciones de los aspectos de la invención descritos anteriormente, el HÍBRIDO 2 se administra en una dosis de entre 0,1 mg a 1 mg, adecuadamente 1 ng a 50 microgramos. Por ejemplo, en aplicaciones humanas pueden usarse 5x104 unidades de IU/ml o menos.
En realizaciones de los aspectos de la invención descritos anteriormente, el subtipo de interferón alfa se administra una vez al día, dos veces al día, tres veces al día o cuatro veces al día. De manera adecuada, en la administración sublingual, puede proporcionarse una dosis única cada día.
En ciertas realizaciones de los aspectos de la invención descritos anteriormente, el subtipo de IFN-a comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:3 (HÍBRIDO 2) o un fragmento de la misma. En un aspecto adicional de la invención se proporciona un polipéptido recombinante que comprende o consiste en SEQ ID NO:3 o un fragmento del mismo. La invención se extiende a secuencias de ácido nucleico derivadas de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:3. En realizaciones el HÍBRIDO 2 puede estar glicosilado.
Descripción
Hay muchas diferencias entre las formas recombinantes de IFN alfa en la técnica y las formas multi-subtipo. La diferencia más obvia es el número de subtipos de IFN alfa que posee cada una. Las formas recombinantes comprenden solo el subtipo alfa 2 - la forma alfa 2b para Intron ATM (Schering Plough) y la forma alfa 2a para Roferon™ (Roche). Las formas multi-subtipo de IFN alfa comprenden muchos subtipos de IFN alfa. Las formas multi-subtipo de IFN alfa son un fármaco de amplio espectro y no hay indicación de que alguno de los subtipos de IFN alfa tenga más o menos actividad antiviral. Otra diferencia entre las formas multi-subtipo y recombinante es que el IFN alfa 2 producido por células humanas en el proceso de fabricación de las formas multi-subtipo está glicosilado, mientras que las formas recombinantes no están glicosiladas, ya que se producen a través de fermentación bacteriana. La glicosilación juega un papel principal en muchas funciones del producto de proteína, tal como la vida media, la bioactividad y su inmunogenicidad. Por lo tanto, la glicosilación de un producto es una consideración importante cuando se desarrolla un tratamiento terapéutico o profiláctico, ya que puede afectar a la duración en el cuerpo después de la administración, la actividad de una dosis terapéuticamente apropiada y la tolerabilidad del producto en sí mismo.
La SEQ ID NO:3 (HÍBRIDO 2 de la presente invención) tiene una secuencia de aminoácidos como sigue:
En particular, el inventor ha descubierto que HÍBRIDO 2 (SEQ ID NO:3) o una variante o fragmento del mismo, inhibe el efecto citopático y la formación de placa y demuestra actividad antiviral. El efecto citopático o efecto citopatogénico se refiere a cambios estructurales en las células huésped que están provocados por la invasión viral.
El inventor también ha establecido que la molécula híbrida de IFN recombinante HÍBRIDO 2 (SEQ ID NO:3) tiene una alta afinidad de unión con los receptores de interferón.
Aunque sin desear estar atado por la teoría, el inventor cree que las proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de IFN-a10 tienen una mayor afinidad al receptor de interferón 2 (IFNR2) y las proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de IFN-a14 tienen mayor afinidad al receptor de interferón 1 (IFNR1). Por tanto, la sustitución de una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de IFN-a10 con aminoácidos de IFN-a14 que permiten la unión al receptor de interferón 1 o la sustitución de una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de IFN-a14 con aminoácidos de IFN-a10 que permiten la unión al receptor de interferón 2 se considera que proporciona una proteína híbrida de IFN-a10 IFNa14 que tendría una afinidad de unión más fuerte a los receptores de interferón tanto 1 como 2 que IFN-a10 o IFN-a14 solos. Al incluir los sitios de unión al receptor de interferón primarios de IFN-a10 e IFN-a14 se entiende que el híbrido comprende aminoácidos seleccionados de IFN-a10 y sustituidos en una secuencia de aminoácidos IFN-a14 para mejorar la capacidad de un subtipo de IFN-a14 a unirse a un receptor de interferón 2 y/o que el híbrido comprende aminoácidos seleccionados de IFN-a14 y sustituidos en una secuencia de aminoácidos IFN-a10 para mejorar la capacidad de un subtipo de IFN-a10 a unirse a un receptor de interferón 1. Se considera que HÍBRIDO 2 es particularmente ventajoso en el tratamiento de virus.
El híbrido IFN-a10-IFN-a14 puede tener sustancialmente la secuencia de aminoácidos de IFN-a10, pero estar modificado en una región entre los residuos de aminoácidos 80 a 150, o adecuadamente entre los residuos de aminoácidos 84 a 144, o adecuadamente los residuos de aminoácidos 92 a 115 o adecuadamente entre los residuos de aminoácidos 90 a 110, (utilizando la numeración de la secuencia de IFN-a10) para proporcionar los aminoácidos proporcionados por la secuencia de IFN-a14. Se considera que los residuos de aminoácidos en estas regiones o partes de estas regiones proporcionan la unión de IFN-a14 al receptor de interferón 1. En particular, la secuencia híbrida puede incluir al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10 o al menos 11 modificaciones de la secuencia de IFN-a10 para proporcionar los residuos correspondientes de la secuencia de IFN-a14 o una mutación conservada de los mismos. En realizaciones, se proporcionan once modificaciones como se indica por los aminoácidos indicados en negrita.
(HÍBRIDO 2: SEQ ID NO:3)
Por funcionalmente activo se entiende un polipéptido híbrido IFN-a10- IFN-a14 que comprende los sitios de unión al interferón primarios de IFN-a10 e IFN-a14 en donde la administración del péptido a un sujeto o expresión del péptido en un sujeto promueve la eliminación de una respuesta inmunitaria a una infección viral. Además, la actividad funcional puede indicarse por la capacidad de un péptido híbrido para suprimir una respuesta inmunitaria a una infección viral.
Un fragmento puede comprender al menos 50, preferiblemente 100 y más preferiblemente 150 o más aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:3 y que es funcionalmente activo. De manera adecuada, un fragmento puede determinarse usando, por ejemplo, la eliminación en serie del extremo C de ADNc. Dicho constructo de eliminación pueden entonces clonarse en plásmidos adecuados. La actividad de estos mutantes de eliminación pueden probarse entonces para la actividad biológica como se describe en la presente memoria.
Por variante se entiende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % homóloga a la SEQ ID NO:3, más preferiblemente al menos 95 % homóloga a la SEQ ID NO:3, más preferiblemente al menos 97 % homóloga a la SEQ ID NO:3, incluso más preferiblemente al menos 98 % homóloga a la SEQ ID NO:3, incluso más preferiblemente al menos 99 % homóloga a la SEQ ID NO:3. Una variante abarca una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:3 que incluye la sustitución de aminoácidos, especialmente una(s) sustitución(ones) que se conoce(n) por tener una alta probabilidad de no llevar a ninguna modificación significativa de la actividad o configuración biológica, o plegado, de la proteína. Estas sustituciones, normalmente conocidas como sustituciones conservadas, se conocen en la técnica. Por ejemplo el grupo de arginina, lisina e histidina son aminoácidos básicos intercambiables conocidos. De manera adecuada, en las realizaciones los aminoácidos de la misma carga, tamaño o hidrofobicidad pueden sustituirse entre sí. De manera adecuada, cualquier sustitución puede seleccionarse en base al análisis de los alineamientos de la secuencia de aminoácidos de los subtipos de interferón alfa para proporcionar sustituciones de aminoácidos a aminoácidos que están presentes en otros subtipos alfa en posiciones similares o idénticas cuando las secuencias están alineadas. Los híbridos, y variantes y fragmentos de los mismos pueden generarse usando métodos de biología molecular adecuados como se conocen en la técnica. Adecuadamente, la homología puede describirse mediante la identidad de secuencia. La identidad de secuencia puede determinarse por métodos como se conocen en la técnica, por ejemplo BLAST.
El inventor ha descubierto que la administración de HÍBRIDO 2 (SEQ ID NO:3) o una variante o fragmento del mismo, da por resultado un 10 %, preferiblemente un 20 %, preferiblemente un 30 %, preferiblemente un 40 %, preferiblemente un 50 %, preferiblemente un 60 %, preferiblemente un 70 %, preferiblemente un 80 % y más preferiblemente un 90 % más de reducción de la actividad viral, tal como el efecto citopático o la formación de placa o en ensayos antivirales, en comparación con los controles a los que no se ha administrado HÍBRIDO 2 (SEQ ID NO:3) o una variante o fragmento del mismo.
El inventor ha descubierto que la administración de HÍBRIDO 2 (SEQ ID NO:3) o una variante o fragmento del mismo, da por resultado un 10 %, preferiblemente un 20 %, preferiblemente un 30 %, preferiblemente un 40 %, preferiblemente un 50 %, preferiblemente un 60 %, preferiblemente un 70 %, preferiblemente un 80 % y más preferiblemente un 90 % más de reducción de actividad viral, tal como el efecto citopático o la formación de placa o en ensayos antivirales, en comparación con las medicaciones antivirales previas.
La administración de HÍBRIDO 2 puede reducir el efecto citopático o la formación de placa en un 50 %, preferiblemente un 60 %, preferiblemente un 70 %, preferiblemente un 80 %, preferiblemente un 90 %, preferiblemente un 91 %, preferiblemente un 92 %, preferiblemente un 93 %, preferiblemente un 94 %, preferiblemente un 95 %, preferiblemente un 96 %, preferiblemente un 97 % y más preferiblemente un 98 %.
Definiciones
Fragmento
Un fragmento puede comprender al menos 50, preferiblemente 100 y más preferiblemente 150 o más aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3 y que sea funcionalmente activo. Adecuadamente, un fragmento puede determinarse usando, por ejemplo, eliminación en serie C-terminal de ADNc. Dichos constructos de eliminación pueden clonarse entonces en plásmidos adecuados. La actividad de estos mutantes de eliminación pueden probarse entonces por la actividad biológica como se describe en la presente memoria. Los fragmentos pueden generarse usando métodos adecuados de biología molecular como se conocen en la técnica.
Variante
Por variante se entiende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % homóloga a la SEQ ID NO:3, incluso más preferiblemente al menos 95 % homóloga a la SEQ ID NO:3, incluso más preferiblemente al menos 96 % homóloga a la SEQ ID NO:3, incluso más preferiblemente al menos 97 % homóloga a la SEQ ID NO:3 y lo más preferiblemente al menos 98 % homóloga a la SEQ ID NO:3. Una variante abarca una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:3, que incluye la sustitución de aminoácidos, especialmente una(s) sustitución(ones) que es/son conocidas por tener una alta probabilidad de no llevar a ninguna modificación significativa de la actividad o configuración biológica, o plegado, de la proteína. Estas sustituciones, normalmente conocidas como sustituciones conservadas, se conocen en la técnica. Por ejemplo el grupo de arginina, lisina e histidina son aminoácidos básicos intercambiables conocidos. De manera adecuada, en las realizaciones los aminoácidos de la misma carga, tamaño o hidrofobicidad puede sustituirse entre sí. Adecuadamente, cualquier sustitución puede seleccionarse en base al análisis de los alineamientos de la secuencia de aminoácidos de los subtipos de interferón alfa para proporcionar sustituciones de aminoácidos a aminoácidos que están presentes en otros subtipos alfa en posiciones similares o idénticas cuando as secuencias están alineadas. Las variantes pueden generarse usando métodos adecuados de biología molecular como se conocen en la técnica.
Sujeto
Como se define en la presente memoria, un “sujeto” incluye y abarca mamíferos tales como seres humanos, primates y animales de granja (p. ej., ovejas, cerdos, terneras, caballos, burros); animales de prueba de laboratorio tales como ratones, conejos, ratas y cobayas; y animales de compañía tales como perros y gatos.
Tratamiento / terapia
El término “tratamiento” se usa en la presente memoria para referirse a cualquier régimen que pueda beneficiar a un animal humano o no humano. El tratamiento puede ser respecto a una infección viral y el tratamiento puede ser profiláctico (tratamiento preventivo). El tratamiento puede incluir efectos curativos o calmantes. La referencia en la presente memoria a tratamiento “terapéutico” y “profiláctico” se va a considerar en su contexto más amplio. El término “terapéutico” no implica necesariamente que un sujeto se trate hasta la recuperación total. De manera similar, “profiláctico” no significa necesariamente que el sujeto no contraerá eventualmente una condición de enfermedad. Por tanto, tratamiento terapéutico y/o profiláctico incluye la mejora de los síntomas de una infección viral o la prevención o reducción de otra forma del riesgo de desarrollar una infección viral. El término “profiláctico” puede considerarse como que reduce la gravedad o el comienzo de una condición particular. “Terapéutico” puede reducir además la gravedad de una condición existente.
Administración
El HÍBRIDO 2 (SEQ ID NO:3), como se describe en la presente memoria puede administrarse separadamente al mismo sujeto, opcionalmente secuencialmente, o puede coadministrarse simultáneamente como una composición farmacéutica o inmunogénica.
Los ingredientes activos pueden administrarse a un paciente que necesita tratamiento por medio de cualquier ruta adecuada. La dosis precisa dependerá de un número de factores, como se trata a continuación en más detalle.
Algunas rutas adecuadas de administración incluyen (pero no se limitan a) administración oral, rectal, nasal, tópica (que incluye bucal y sublingual), vaginal o parenteral (que incluye subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y epidural), o administración por vial oral o inhalación nasal.
La composición es administrable como una composición inyectable, se administra oralmente, se administra a los pulmones como un aerosol, vial oral o inhalación nasal.
Una ruta adecuada de administración es sublingualmente, p. ej., aplicado bajo la lengua del sujeto.
Para la administración por medio de rutas orales o inhalación nasal, preferiblemente el ingrediente activo estará en una formulación farmacéutica adecuada y puede administrarse usando una forma mecánica que incluye, pero no estar restringida a un inhalador o dispositivo nebulizador.
Además, cuando se usan las rutas oral o de inhalación nasal, puede usarse la administración mediante un SPAG (generador de aerosol de partículas pequeñas).
Para la inyección intravenosa, el ingrediente activo estará en forma de una disolución acuosa parenteralmente aceptable que está libre de pirógenos y tiene pH, isotonicidad y estabilidad adecuadas. Los expertos en la técnica serán bien capaces de preparar disoluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro sódico, inyección de Ringer, inyección de Ringer lactada. Pueden incluirse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según se necesite.
Las composiciones farmacéuticas para la administración oral pueden estar en forma de comprimido, cápsula, polvo o líquido. Un comprimido puede comprender un vehículo sólido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente comprenden un vehículo líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Puede incluirse disolución salina fisiológica, dextrosa u otra disolución de sacáridos o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.
La composición también puede administrarse por medio de microesferas, liposomas, otros sistemas de administración de micropartículas o formulaciones de liberación sostenida situados en ciertos tejidos que incluye la sangre. Ejemplos adecuados de vehículos de liberación sostenida incluyen las matrices de polímeros semipermeables en forma de objetos compartidos, p. ej., supositorios o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida implantables o microcapsulares incluyen polilactidas de copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato, poli(2-hidroxietilmetacrilato) o etileno acetato de vinilo.
Ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente y otras técnicas y protocolos que pueden usarse de acuerdo con la invención pueden encontrarse en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A. (ed), 1980.
Composiciones farmacéuticas
Como se describe anteriormente, la presente invención se extiende a una composición farmacéutica para el tratamiento de una infección por coronavirus.
Las composiciones farmacéuticas según la presente invención, y para el uso de acuerdo con la presente invención, puede comprender, además de un ingrediente activo, un excipiente, vehículo, tampón estabilizante, farmacéuticamente aceptables, u otros materiales bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichos materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material dependerá de la ruta de administración, que puede ser, por ejemplo, oral, intravenosa, intranasal o por vía oral o inhalación nasal. La formulación puede ser un líquido, por ejemplo, una disolución salina fisiológica que contiene un tampón que no es fosfato a pH 6,8-7,6, o un polvo liofilizado o seco por congelación.
Dosis
La composición se administra preferiblemente a un individuo en una “cantidad terapéuticamente eficaz” o una “cantidad deseada”, siendo esta suficiente para mostrar beneficio al individuo. Como se define en la presente memoria, el término una “cantidad eficaz” significa una cantidad necesaria para obtener al menos parcialmente la respuesta deseada, o para retrasar el comienzo o inhibir la progresión o detener totalmente el comienzo o la progresión de una condición particular que se trata. La cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del sujeto a tratar, el grupo taxonómico del sujeto a tratar, el grado de protección deseado, la formulación de la composición, la evaluación de la situación médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio, lo que puede determinarse a través de ensayos rutinarios. La prescripción del tratamiento, p. ej., decisiones en la dosificación, etc., está en última instancia dentro de la responsabilidad y a la discreción de los médicos de familia, médicos u otros doctores en medicina, y normalmente tiene en cuenta el trastorno a tratar, la condición del paciente individual, el sitio de administración, el método de administración y otros factores conocidos por los médicos. La dosis óptima puede determinarse por los médicos en base a un número de parámetros que incluyen, por ejemplo, edad, sexo, peso, gravedad de la condición a tratar, el ingrediente activo que se administra y la ruta de administración. Puede ser aplicable una amplia variedad de dosis. Considerando la administración oral a un paciente humano, por ejemplo, de aproximadamente 10 gg a aproximadamente 1000 gg de agente puede administrarse por dosis humana, opcionalmente durante 3 a 4 dosis. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima y reducir los efectos secundarios. Por ejemplo, se pueden administrar varias dosis divididas diariamente, semanalmente, mensualmente o a otros intervalos de tiempo adecuados o la dosis puede reducirse proporcionalmente según se indique debido a las exigencias de la situación.
A menos que se definan de otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el significado entendido normalmente por una persona que es experta en la técnica en el campo de la presente invención.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra los resultados de los ensayos de inhibición de placa usando células Vero de estudios que comparan tres interferones - HÍBRIDO 2, interferón-beta 1a e interferón -alfa 2a - esto da una comparación basada de nuevo en alfa-2a de los demás “interferones” de 20X, 10X, 5X más potentes que alfa-2a.
La Figura 2 muestra la eliminación de la síntesis de IL-17A por HÍBRIDO 2.
La Figura 3 muestra la eliminación de IL 17F con HÍBRIDO 2.
La Figura 4 muestra el efecto de Híbrido 2 en la producción de CXCL 10 a partir de leucocitos humanos.
La Figura 5 muestra imágenes de células inmunitarias e HÍBRIDO 2.
La Figura 6 muestra que HÍBRIDO 2 puede inducir la apoptosis.
La Figura 7 muestra agrupamientos de células NK.
La Figura 8 muestra la activación directa de células NK por HÍBRIDO 2.
La Figura 9 muestra la inhibición de HÍBRIDO 2 de un ensayo de placa con RSV humano.
La Figura 10A muestra la infectividad de VIH-1 LAI mediante interferón-alfa 2a (muestra A) e HÍBRIDO 2 (muestra B) e inhibidores de control (RLU).
La Figura 10B muestra el ensayo de infectividad de VIH-1 LAI (valores en porcentaje).
La Figura 11A y la Figura 11B muestran la determinación de los valores de IC50 para la infectividad de VIH-1 para la muestra A (Figura 11A) y la muestra B (Figura 11B).
La Figura 12A y la Figura 12B muestran la determinación de los valores de IC50 para la infectividad de VIH-1 por antivirales de control.
La Figura 13 muestra el ensayo de viabilidad con células HeLa-CD4-pgal (valores en porcentaje).
La Figura 14A y la Figura 14B muestran la determinación de los valores de CC50 para la muestra A (Figura 14A) y la muestra B (Figura 14B) en células HeLa-CD4-pgal (valores en porcentaje).
La Figura 15A y la Figura 15B muestran la determinación de los valores de CC50 para antivirales de control con células HeLa-CD4-pgal (valores en porcentaje).
La Figura 16 muestra la inhibición de HRSV mediante interferón-alfa 2a (muestra A) e HÍBRIDO 2 (muestra B) (A490).
La Figura 17 muestra el ensayo de infectividad de HRSV (valores en porcentaje).
La Figura 18A y la Figura 18B muestran la determinación de los valores de IC50 para la muestra A (Figura 18A) y la muestra B (Figura 18B) en la infectividad de HRSV (valores en porcentaje).
La Figura 19A y la Figura 19B muestran la determinación de los valores de CC50 para la muestra A (Figura 19A) y la muestra B (Figura 19B) con células HEp-2 (valores en porcentaje).
La Figura 20 muestra la infectividad de VIH-1 LAI mediante los objetos de prueba interferón-alfa 14 (muestra A), HÍBRIDO 2 (muestra B) e interferón-beta 1a (muestra C) e inhibidores de control (RLU).
La Figura 21 muestra el ensayo ele infectividad de VIH-1 LAI (valores en porcentaje) para los objetos de prueba interferón-alfa 14 (muestra A), HÍBRIDO 2 (muestra B) e interferón-beta 1a (muestra C).
La Figura 22A (interferón-alfa 14), la figura 22B (HÍBRIDO 2) y la Figura 22C (interferón-beta 1a) muestran la determinación de los valores de IC50 para la infectividad de VIH-1.
La Figura 23 muestra el ensayo de viabilidad con células HeLa-CD4-pgal (valores en porcentaje) para los objetos de prueba interferón-alfa 14 (muestra A), HÍBRIDO 2 (muestra B) e interferón-beta 1a (muestra C).
La Figura 24 muestra la determinación de los valores de CC50 para para la muestra A (Figura 24A), muestra B (Figura 25B) y la muestra C (Figura 24C) en células HeLa-CD4-pgal (valores en porcentaje).
La Figura 25 muestra la dosjs infecciosa de cultivo tisular del virus del herpes simple 1 en células VERO cuando se tratan con HÍBRIDO 1, HÍBRIDO 2, interferón alfa-14, interferón alfa-2a e interferón beta-1a.
La Figura 26 muestra el TCID medio convertido en unidades formadoras de placa (PFU).
Datos experimentales
Experimento 1: El efecto de IFNa-14 y los híbridos en el efecto citopático después de la infección por coronavirus SARS-CoV-1.
La eficacia de los híbridos para inhibir el efecto citopático después de la infección por SARS-CoV-1 se probó en un ensayo de punto final citopático. Todos los ensayos de punto final se llevaron a cabo usando Multiferon multi-subtipo e IFN-a14 además de la Ribavirina antiviral para la comparación.
Preparación de tratamientos antivirales
Se probó un amplio intervalo de concentraciones (obtenidas mediante diluciones de diez veces) que abarcaban las dosis inhibidoras usadas normalmente para otras combinaciones de virus-huésped. Los compuestos se disolvieron con disolución salina tamponada de Hank.
Para ensayos de placas, se prepararon diluciones de fármaco de cinco veces usando medio de crecimiento como se especifica a continuación. La producción de SARS-CoV-1 y la infección de células de mono verde africano (Vero E6) (Colección americana de cultivos tipo, Manassas, VA, EE.UU.) se propagaron en matraces de cultivo celular de 75 cm que contenían medio de crecimiento que consistía en Medio 199 (Sigma, San Luis, EE.UU.) suplementado con suero de ternera fetal al 10 % (FCS; Biological Industries, Israel). El SARS-HCoV2003VA2774 (un aislado de un paciente de SARS en Singapur) se propagó en células Vero E6. Brevemente, se añadieron 2 ml de las existencias de virus a una monocapa confluyente de células Vero E6 y se incubaron a 37 °C en CO<2>al 5 % durante una hora. Luego se añadieron 13 ml de Medio 199, suplementado con FCS al 5 %. Los cultivos se incubaron a 37 °C en CO<2>al 5 % y la inhibición del efecto citopático se estimó observando cada pocillo a través de un microscopio invertido. Cuando se observó el 75 % o más de inhibición después de 48 horas, se cosechó el sobrenadante. El sobrenadante se clarificó a 2500 rpm y luego de hicieron alícuotas en crioviales y se almacenaron a -80 °C hasta el uso.
Manejo y titulación del virus
El título del virus en el sobrenadante de cultivo congelado se determinó usando un ensayo en placa llevado a cabo por duplicado. Brevemente, se añadieron 100 microlitros de virus en una dilución en serie de 10 veces a una monocapa de células Vero E6 en una placa de 24 pocillos. Después de la incubación durante una hora a 37 °C en CO<2>al 5 %, se añadió el Medio 199 viral suplementado con FCS al 5 %. Las células se fijaron con formalina al 10 % (v/v) y se tiñeron con violeta de cristal al 2 % (p/v). Las placas se contaron visualmente y se calculó el título del virus en unidades formadoras de placa por ml (pfu/ml).
Ensayo de punto final citopático
El efecto de cada tratamiento antiviral se probó por cuadruplicado. Brevemente, se incubaron 100 microlitros de diluciones de 10 veces en serie de cada tratamiento con 100 microlitros de células Vero E6 que dan un recuento celular final de 20.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos. La incubación fue a 37 °C en CO<2>al 5 % durante la noche para las preparaciones de interferón y durante una hora para las de infección (MOI) (partículas de virus por célula) de 0,5. Las placas se incubaron a 37 °C en CO<2>al 5 % durante tres días y las placas se observaron diariamente por los efectos citopáticos. El punto final fue la concentración diluida que inhibió el efecto citopático en las cuatro configuraciones.
Para determinar la citotoxicidad, se incubaron 100 microlitros de diluciones de 10 veces en serie de cada uno de los tratamientos con 100 microlitros de células Vero E6 dando un recuento de células finales de 20.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos, sin desafío viral. Las placas se incubaron entonces a 37 °C en CO<2>al 5 % durante tres días y se observaron efectos de toxicidad usando un microscopio invertido.
Luego se añadieron 10 microlitros de virus a una concentración de 10.000 pfu/pocillo a cada pocillo de prueba. Esto equivale a una multiplicidad de infección (MOI) (partículas de virus por célula) de 0,5. Las placas se incubaron a 37 °C en CO<2>al 5 % durante tres días y las placas se observaron diariamente para los efectos citopáticos. El punto final fue la concentración diluida que inhibió el efecto citopático en las cuatro configuraciones (CIA100).
Para determinar la citotoxicidad, se incubaron 100 microlitros de diluciones de 10 veces en serie de cada tratamiento con 100 microlitros de células Vero E6 que dan un recuento de células finales de 20.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos, sin desafío viral. Las placas se incubaron entonces a 37 °C en CO<2>al 5 % durante tres días y los efectos de toxicidad se observaron usando un microscopio invertido. Los interferones que mostraron una inhibición completa se probaron adicionalmente en los títulos virales inferiores de 103 y 102 pfu/pocillo.
Experimento 2: El efecto de los híbridos en la formación de placas después de una infección de coronavirus SARS-CoV-1.
La eficacia de los híbridos para inhibir la formación de placa después de la infección con SARS-CoV-1 se probó en un ensayo de reducción de placa.
El ensayo de placa se realizó usando diluciones de 10 veces de unas existencias de virus, y se inocularon alícuotas de 0,1 ml en monocapas de células susceptibles. Después de un periodo de incubación, que permitió a los virus unirse a las células, las monocapas se cubrieron con un medio nutritivo que contenía una sustancia, normalmente agar, que provoca la formación de un gel. Después de la incubación en placas, las células infectadas originales liberaron progenie viral. La expansión de los nuevos virus se restringe a células vecinas mediante el gel. Por tanto, cada partícula infecciosa produjo una zona circular de células infectadas denominada placa. Eventualmente la placa se volvió suficientemente grande para ser visible a simple vista. Se usaron tintes para teñir las células vivas para potenciar el contraste entre las células vivas y las placas. Solo los virus que provocaron daños visibles a las células se ensayaron de esta manera es decir, SARS-CoV-1.
Estos resultados demuestran claramente la capacidad de HÍBRIDO 2 para inhibir el efecto citopático y la formación de placa provocados como resultado de la infección con SARS-CoV-1. Los resultados demuestran la inhibición del efecto citopático en comparación con el compuesto antiviral Ribavirina y el interferón multi-subtipo Multiferon™.
Experimento 3: Ensayos en relación con IL-17, Granzima B, interferón gamma, interferón-alfa, células NK.
Los ensayos que utilizan interferón alfa 14 e híbrido 2 en relación a moduladores inmunitarios clave se comenzaron como puede entenderse en la técnica.
Efecto en HÍBRIDO 2 en la muerte por células inmunitarias
Se probó el efecto de un interferón recombinante híbrido en un ensayo de formación de imágenes de células vivas de la muerte por células inmunitarias en una plataforma ZOOM IncuCyte.
Se usaron células de cáncer de ovario SK-OV-3 con núcleos marcados en rojo (SK-OV-3NucLight Red) como células diana en el estudio. Para matar células inmunitarias, las células se cocultivaron con células asesinas naturales (NK) y controles positivos que consistían en células tratadas con IL-2 e IL-12. La apoptosis se detectó tiñendo objetos positivos a la caspasa 3/7 mientras que el número de células se determinó contando los núcleos rojos. Los resultados del modelo de cocultivo se compararon con aquellos de un modelo de monocultivo que consistía en células SK-OV-3 NucLight Red solas.
Se llevó a cabo un experimento de optimización inicial que probó 4 relaciones de células diana y efectoras. Estos resultados determinaron que 5.000 células asesinas naturales y 2.000 células KS-OV-3 NuclLight Red por pocillo de una placa de 96 pocillos dieron una ventana de ensayo adecuado para detectar la muerte por células inmunitarias.
Se probaron ocho dosis de interferón recombinante híbrido que oscilaban de 10 IU/ml a 3x106 IU/ml para los efectos en la muerte por células inmunitarias. Los resultados se compararon con controles sin tratamiento, controles tratados con vehículo y células tratadas con IL-2/IL-12. Todas las condiciones se probaron usando células en cocultivo (células SK-OV-3 NucLight y NK) y monocultivo (SK-OV-3 NucLight Red).
Las células se monitorizaron durante 4 días usando un ZOOM IncuCyte, y se usó software IncuCyte para medir el recuento de objetos verdes (apoptosis) y rojos (número de células) con el tiempo. El análisis del área bajo la curva (ABC) se usó para cuantificar la apoptosis y el número de células con el paso del tiempo.
Se ha determinado que IL-17, IL-6, CCL-5 y la respuesta inmune se modula después de la infección por Covid-19, en particular el síndrome de distrés respiratorio agudo inducido por Covid-19 donde se ha indicado que la inflamación por IL-17 es significativa.
El interferón recombinante híbrido provocó una fuerte inducción de la apoptosis en el modelo de cocultivo, con un aumento en el ABC de 200 en los controles con vehículo a 1174 a la dosis máxima de interferón recombinante híbrido. Una EC50 de 1,5x106 IU/ml derivó de la inducción a la apoptosis. En contraste, las células en monocultivo presentaron solo una respuesta marginal al rIFN híbrido.
El interferón recombinante híbrido también provocó una reducción en el número de células. Los valores de ABC para el número de células cayeron de 39921 en los controles con vehículo a 19501 para la dosis máxima de rIFN híbrido. Se determinó un valor de IC50 de 1,3x106 IU/ml para la reducción del número de células.
Hubo una evidencia de activación directa muy fuerte de las células asesinas naturales por el rIFN híbrido, y se observó un agrupamiento celular de células NK en respuesta al tratamiento con interferón recombinante híbrido en el modelo de monocultivo de células NK.
Se ha demostrado que el híbrido 2 modula IL-17 (inhibe tanto el 17A como el F muy fuertemente), IL-6, CCL-5 y CCL-2 y proporciona una respuesta NK antiviral.
Experimento 4: Evaluación de la actividad antiviral del interferón-alfa 2a (muestra A) e HÍBRIDO 2 (muestra B) frente a VIH y HRSV
Se llevó a cabo una prueba antiviral a dosis completa en los objetos de prueba interferón-alfa 2a (muestra A) e HÍBRIDO 2 (muestra B). Estos objetos se probaron con la cepa LAI del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) y la cepa Long del virus sincitial respiratorio humano (HRSV). Todos los objetos de prueba se proporcionaron en forma sólida desde los que se prepararon 0,25 mg/mL (muestra A) y 0,10 mg/mL (muestra B) en ddH2O, se hicieron alícuotas, y se almacenaron a -80 C para evitar ciclos de congelación descongelación repetidos.
El proyecto utilizó diferentes líneas celulares adherentes para evaluar la actividad antiviral de los objetos de prueba frente a diferentes virus. Los ensayos estándar realizados en RVX se usaron para cada virus. En resumen, los objetos de prueba se preincubaron ambos con las células diana (ensayo con VIH), y para el ensayo con HRSV, los inhibidores putativos se preincubaron con virus durante 30 min antes de añadir el virus y la mezcla inhibidora a las células. Los inhibidores estuvieron presentes en el medio de cultivo celular durante la duración de la infección (véase a continuación). Para cada ensayo antiviral, se realizó una prueba de viabilidad en paralelo usando las mismas concentraciones de inhibidores probados en los ensayos antivirales. Los ensayos de viabilidad se usaron para determinar los efectos de citotoxicidad inducidos por el compuesto en ausencia de virus. La viabilidad celular se determinó por el método XTT. Los ensayos de viabilidad se llevaron a cabo durante los mismos periodos de tiempo evaluados en los correspondientes ensayos antivirales. Se evaluaron nueve concentraciones para el VIH-1 y ocho concentraciones para HRSV de los objetos de prueba por duplicado. Se evaluaron diluciones en serie de diez veces partiendo de 10 pg/ml. Cuando fue posible, se determinaron los valores de IC50 y CC50 para los inhibidores para cada ensayo usando el software GraphPad Prism.
Ensayo con VIH-1:
Se evaluó la actividad antiviral frente a VIH usando la luminiscencia relativa generada con un kit para revelar la actividad de la beta-galactosidasa. Para determinar la actividad frente a VIH se usaron células HeLa-CD4-betagal en las que la infección con VIH induce la expresión de beta-galactosidasa. La extensión de la infección se monitorizó después de 2 días de infección.
Ensayo con HRSV:
Se evaluó la actividad antiviral frente a HRSV usando células Hep-2 con un inmunoensayo para monitorizar la expresión de antígenos virales en las células infectadas con el virus. Las células se desafiaron con virus en presencia de diferentes concentraciones de control o inhibidores de prueba. La extensión de la infección se monitorizó después de 3 días de infección cuantificando los niveles de antígenos virales con un lector colorimétrico.
Actividades antivirales de los objetos de prueba A (interferón-alfa 2a) y B (HÍBRIDO 2)
En general, los objetos de prueba A y B presentaron actividad antiviral frente a VIH-LAI y HRSV-Long. Los valores de IC50 frente al VIH fueron de 0,3 ng/ml y 0,009 ng/ml, para A y B, respectivamente, mientras que los valores de IC50 frente a HRSV fueron de 0,2 ng/ml y 0,03 ng/ml, respectivamente (Tabla 1).
Se observó una pérdida de viabilidad celular en las células HeLa-CD4-beta-gal tratadas con ambos objetos de prueba. La mayor inhibición de la viabilidad celular (observada a 10 pg/ml) no afectó a más del 30-33 % del cultivo celular (Figura 6, página 15), y los índices de selectividad para la actividad anti-VIH fueron extremadamente altos en ambos casos. Digno de mención, es importante indicar que ninguno de los inhibidores bloqueó completamente la infección de VIH. Es posible que una fracción del cultivo (estimada en aproximadamente 25 %) no fuera sensible a la actividad de los inhibidores. Sin embargo, los inhibidores de control evaluados en paralelo bloquearon completamente la infección por VIH. Se observó también un perfil similar (falta de inhibición completa) en los ensayos anti-HRSV, pero esta vez los inhibidores bloquearon aproximadamente el 94 %. También es importante indicar que debido a la falta de inhibición completa, los valores de IC50 generados por GraphPad Prism pueden diferir de las concentraciones a las que se observa un 50 % de efecto inhibidor.
La citotoxicidad inducida por el compuesto también se observó con las células HEp-2, pero la pérdida de viabilidad celular nunca alcanzó el 50 por ciento del cultivo incluso a la mayor concentración probada (10 pg/ml) (Figura 12, página 23). También se observaron unos índices de selectividad excelentes con HRSV.
Como se muestra a continuación, se usaron múltiples inhibidores antivirales como controles y se ensayaron en paralelo con objetos de prueba A y B. Los controles de inhibidor incluidos en los estudios fueron<t>A<f>(tenofovir alafenamida) un inhibidor de la transcriptasa inversa de nucleótidos de VIH, T20 (enfuvirtida) un péptido inhibidor de la fusión que bloquea la entrada de VIH, y ribavirina, un análogo de guanosina con amplia actividad antiviral, incluido contra HRSV. Todos los inhibidores bloquearon los respectivos virus diana como se esperaba, y validaron la sensibilidad de los ensayos usados en este estudio.
Inhibidores de control y controles de calidad
Los controles de calidad para los ensayos de infectividad se realizaron en todas las placas para determinar: i) valores de señal a base (S/B), ii) inhibición mediante inhibidores conocidos, y iii) variación del ensayo, como se mide por el coeficiente de variación (C.V.) de todos los puntos de datos del objeto de prueba. Todos los controles funcionaron como se anticipó para cada ensayo. Los antivirales conocidos para VIH (TAF y T20) bloquearon la infección en más del 99 % en algunas de las concentraciones probadas, y cuando se evaluaron en las curvas de respuesta a la dosis completa bloquearon la replicación viral como se presenta en la bibliografía. El control antiviral usado en el ensayo de HRSV, ribavirina, un agente antiviral de amplio espectro bloqueó la infección en más del 99 % a 50 pM. El control de viabilidad (emetina) usado en los ensayos de citotoxicidad XTT presentó una inhibición mayor al 85 % para todos los tipos de células probadas.
La variación total en los ensayos de infección fue 4,4 % (VIH) y 4,9 % (HRSV), y la variación total en los ensayos de viabilidad fue 3,7 % (VIH) y 4,6 % (HRSV). El valor de señal a base (S/B) en los ensayos de infección fue 366 veces y 3,4 veces, respectivamente, en los ensayos de VIH y HRSV. La señal a la base (S/B) para los ensayos de viabilidad fue 10 veces para ambos ensayos.
1 Los niveles de señal a base se calcularon dividiendo la señal en células infectadas en presencia de vehículo solo, dividido por la señal en células no infectadas (“infectadas en simulación”) para los ensayos de infectividad. El nivel de señal a base para los ensayos de citotoxicidad se calculó dividiendo la señal en las células en presencia de vehículo solo (solo medio), dividido por la señal en pocillos sin células (“sin células”).
2 C.V. para los ensayos se calcula como la media de los valores C.V. determinados para todos los puntos de dato de objetos de prueba replicados 3 El índice de selectividad (S.I.) se calcula dividiendo el valor de CC50 por el valor de IC50.
Tabla 1. Resumen de los resultados. Los valores de IC50 (infectividad), CC50 (viabilidad celular) e índice de selectividad (S.I.) se muestran para cada objeto de prueba con cada virus. Los controles de calidad para cada ensayo también se muestran, incluyendo las relaciones de señal a base (S/B), y los coeficientes de variación medios (C.V.) para todos los puntos de datos del objeto de prueba replicados. Los valores de viabilidad (CC50) e infectividad (IC50) en los ensayos donde la extensión de la inhibición no alcanzó el 50 % a la mayor concentración probada, se muestran con >10 pg/ml (viabilidad o infectividad). En algunos ejemplos, se evaluaron controles antivirales conocidos en paralelo con curvas de respuesta a la dosis completa, y se muestran los valores de IC50 y CC50 obtenidos.
Procedimientos experimentales - Ensayo antiviral con lectura de p-galactosidasa
Ensayo de infectividad de VIH-1
Los ensayos de infectividad se realizaron desafiando a las células HeLa-CD4-pgal con VIH-1 LAI en presencia o ausencia de objetos de ensayo. Las células HeLa-CD4-pgal expresan beta-galactosidasa bajo el control del promotor de VIH-1 LTR. Tras la infección con VIH y la expresión de la proteína Tat viral se indujo la expresión de betagalactosidasa. Las células HeLa-CD4-pgal se sembraron en 12.000 células por pocillo en una placa blanca de fondo plano de 96 pocillos tratada con TC y se mantuvieron en DMEM suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 %, por la presente denominado DMEM10. Se diluyeron objetos de prueba 10 veces en placas de fondo en U usando DMEM10. Las diluciones del material de prueba se prepararon a 1,25X de la concentración final. Las células se incubaron con el material de prueba diluido a 1,25X (80 pl por pocillo) durante 30 minutos a 37 °C en CO<2>al 5 %. Después de la preincubación del material de prueba, se añadió virus VIH-LAI preparado en DMEM10 a las células (20 pl por pocillo) y las placas se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada con CO<2>al 5 % durante 48 horas. Cada pocillo contenía 100 pl de volumen final. El volumen del virus usado en el ensayo se determinó previamente para producir una señal en el intervalo lineal inhibido por TAF y T20, inhibidores conocidos de VIH-1. Las infecciones se realizaron en reacciones por duplicado. Después de dos días de infección, las células se monitorizaron para la actividad de beta-galactosidasa usando el kit Galacton-Star® (ThermoFisher). La prueba de Galacto-Star es un ensayo quimioluminiscente sensible que detecta beta-galactosidasa en lisatos de células de mamífero. La luminiscencia se midió con una lectura de 1 segundo. Se evaluaron nueve puntos de datos a partir de duplicados de diluciones de diez veces en serie de los objetos de prueba que oscilaban de 0,0001 ng/ml a 10 pg/ml. Los controles incluyeron células incubadas sin virus (“infectadas en simulación”), infectadas e incubadas con vehículo solo (DMEM10), o infectadas en presencia de TAF y T20 (inhibidores conocidos de la infección por VIH) en una respuesta a la dosis completa partiendo de 20 pM (puntos de datos individuales) o a 0,5 pM.
Ensayo de infectividad de VIH-1 QC
La S/B media en el ensayo fue 366 (base determinada con células “infectadas en simulación”), mientras que la variación media para todos los puntos de datos fue 4,4 % (valores de C.V.) y 3,6 % (valores de C.V. para todos los pocillos que presentan más del 50 % de infección). Los niveles base observados en células infectadas en simulación en ausencia de virus se restaron de todas las muestras. Los antivirales de control usados en este ensayo (TAF 0,5 pM y T-20 0,5 pM) bloquearon la infección cerca del 100 %.
Procedimientos experimentales - Ensayo antiviral (procedimiento de inmunotinción)
Para determinar la actividad antiviral contra el virus sincitial respiratorio humano (HRSV) se usó un ensayo de inmunotinción para monitorizar la extensión de la infección. En este tipo de ensayo, las células infectadas se fijan y después se usa un cóctel de anticuerpos anti-RSV para cuantificar la cantidad de antígeno viral usando una lectura colorimétrica.
Ensayo de infectividad de HRSV
Para el ensayo de infectividad de HRSV usamos la cepa Long de HRSV para infectar células HEp-2 (adenocarcinoma epitelial de cuello de útero humano). Las células se mantuvieron en MEM con suero bovino fetal (FBS) al 10 % para el procedimiento de siembra. El día antes de la infección, las células se sembraron a 12.000 células por pocillo en una placa de fondo plano transparente de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C durante 24 horas. El día de la infección, los objetos de prueba se diluyeron en serie (10 veces) en una placa de fondo en U usando MEM con suero bovino fetal (FBS) al 2 %, por la presente denominado MEM2. Las diluciones se prepararon a 2X de la concentración final. Un volumen igual (30 pl) de virus Long diluido en MEM2 se incubó con 30 pl de objetos de prueba concentrados a 2X durante 30 minutos a temperatura ambiente. El volumen de virus usado en el ensayo se determinó previamente para producir una señal en el intervalo lineal inhibida por ribavirina, un profármaco que se metaboliza en análogos de nucleósido que bloquea la síntesis de ARN viral y la adición de caperuza de ARNm viral. Después de la preincubación de 30 minutos, las células se lavaron con MEM2, después se añadieron 50 pl de la mezcla de virus/muestra a las células y la placa se incubó a 37 °C en una incubadora humidificada con CO<2>al 5 % durante 1 hora. Después de permitir la entrada viral, se añadió un volumen adicional de los correspondientes objetos de prueba o inhibidor de control en MEM2 a cada pocillo. La incubación se llevó a cabo durante 3 días a 37 °C en una incubadora humidificada con CO<2>al 5 %.
Los objetos de prueba se evaluaron por duplicado usando diluciones de 10 veces en serie en MEM2. Los controles incluyeron células incubadas sin virus (“infectadas en simulación”), infectadas e incubadas con vehículo solo (MEM2), e infectadas en presencia de ribavirina (antiviral de amplio espectro) a 50 pM. Después de 3 días de infección, las células se tiñeron con un protocolo de inmunotinción usando un cóctel de diferentes anticuerpos anti-HRSV para cuantificar los niveles de infección. Las células se lavaron después y se fijaron y la cantidad de antígeno viral se estimó con un ensayo de inmunotinción específico de HRSV utilizando un cóctel de anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos contra varios antígenos virales. Un conjunto de controles se hicieron reaccionar en cada placa de 96 pocillos, que incluyen células incubadas con virus en presencia de vehículo solo, en presencia de un inhibidor de control, ribavirina, o células incubadas en ausencia de virus (control “infectado en simulación”) para determinar los niveles base del ensayo. La base se restó de todos los puntos de datos antes de calcular el porcentaje de actividad en comparación con el vehículo solo.
Ensayo de infectividad de HRSV QC
La infectividad se determinó monitorizando la absorbancia a 490 nm. La relación de señal a base (S/B) en el ensayo fue 3,4, determinada como el porcentaje de células infectadas tratadas con MEM2 solo comparado con el de células “infectadas en simulación”. La variación media para todos los puntos de datos del objeto de prueba replicado fue 4,9 % (media de todos los valores de C.V.), y 6,3 % (valores de C.V. para todos los pocillos de objeto de prueba que presentan más del 50 % de infección).
Procedimiento experimental - ensayos de citotoxicidad
Ensayo de viabilidad (XTT) para evaluar la citotoxicidad inducida por el compuesto
Las células no infectadas se incubaron con objetos de prueba o diluciones del inhibidor de viabilidad de control usando una dosis de concentraciones de objeto de prueba mayores que las usadas en el ensayo de infectividad. La temperatura de incubación y la duración del periodo de incubación reflejaron las condiciones del correspondiente ensayo de infectividad. La viabilidad celular se evaluó con el método XTT. La sal de tetrazolio (XTT) se escindió a un tinte de formazano naranja a lo largo de la reacción que ocurre solo en células viables con mitocondria activa. El tinte de formazano se cuantifica directamente usando un espectrofotómetro multipocillo de barrido. Los niveles base obtenidos de los pocillos sin células se restaron de todos los puntos de datos. La extensión de la viabilidad se monitorizó midiendo la absorbancia a 490 nm.
Datos de QC y análisis de citotoxicidad
La señal media obtenida en pocillos sin células se restó de todas las muestras. Los valores de lectura se dieron como un porcentaje de la señal media observada en células no infectadas tratadas con vehículo solo (medio solo). Los valores de señal a base (S/B) obtenidos fueron 10,2 (células HeLa-CD4-pgal incubadas 48 horas), 10,4 (células HEp-2 incubadas 3 días). La emetina se usó como un control de compuesto citotóxico en los ensayos de viabilidad e inhibió la viabilidad celular más del 90 % a 1 pM.
Resultados - actividad antiviral del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1)
Tabla 2. Ensayo de infectividad de VIH-1 LAI (RLU). Los valores individuales de RLU de luminiscencia de pgalactosidasa se muestran para cada punto de dato evaluado. Todas las muestras se infectaron excepto aquellas indicadas como “simulación”. Las muestras tratadas con TAF y T20 también se muestran. También se evaluaron concentraciones variables de TAF y T20. Las concentraciones de objetos de prueba se muestran en nanogramo por mililitro y los antivirales de control en micromolar.
La Figura 10A muestra la infectividad de VIH-1 LAI mediante la muestra A (interferón-alfa 2a) y la muestra B (HÍBRIDO 2) e inhibidores de control (RLU). Se muestran los datos como valores de unidades de luminiscencia relativa (RLU) en pocillos que contienen células HeLa-CD4-pgal infectadas en presencia de vehículo solo o concentraciones variables de objetos de prueba (media de duplicados con desviación estándar). Las células no infectadas se muestran como “simuladas”. TAF y T20 se incluyen como controles antivirales (puntos de datos individuales en respuesta a la dosis completa o media de puntos de datos duplicados a 0,5 |uM).
Tabla 3. Ensayo de infectividad de VIH-1 LAI (porcentaje de vehículo). El dato representa el porcentaje de infección de VIH (como se mide mediante la luminiscencia de beta-galactosidasa) como un porcentaje de valores obtenidos de los pocillos tratados con vehículo solo (DMEM10). El valor medio obtenido de células no infectadas en cada placa se restó de todos los valores en bruto antes de la normalización al vehículo solo. La media de duplicados o seis réplicas con su desviación estándar se muestran para los objetos de prueba y el vehículo, respectivamente. Los puntos de datos individuales se muestran para las curvas de respuesta a la dosis de TAF y T20, y los puntos de datos duplicados para concentraciones de 0,5 |uM.
La Figura 10B muestra el ensayo de infectividad de VIH-1 LAI (valores en porcentaje). Los resultados muestran la extensión de la infección de VIH-1 LAI, como se determina mediante un ensayo de beta-galactosidasa (lectura de luminiscencia) a las 48 horas. El dato se normaliza a la actividad observada en células en ausencia del objeto de prueba (vehículo solo). Los resultados del objeto de prueba muestran la media de los puntos de datos duplicados con la desviación estándar (d.e.). También se incluye, la respuesta a la dosis observada con TAF y T20 (puntos de datos individuales).
La Figura 11A y la Figura 11B muestran la determinación de los valores de IC50 para la infectividad de VIH-1 para la muestra A (Figura 11A) y la muestra B (Figura 11B). Los valores indican el porcentaje de infectividad de VIH comparado con las muestras incubadas con vehículo solo. Los resultados muestran la media de los puntos de datos duplicados con la desviación estándar (d.e.). El dato se ajustó a una función sigmoidea y los valores de IC50 se calcularon usando software GraphPad Prism ajustando una curva de respuesta a la dosis con una pendiente variable (cuatro parámetros). Los valores de IC50 se resumen en la tabla 1.
La Figura 12A y la Figura 12B muestran la determinación de los valores de IC50 para la infectividad de VIH-1 para antivirales de control. Los valores indican el porcentaje de infectividad de VIH-1 comparado con las muestras incubadas solo con vehículo. Los resultados muestran los puntos de datos individuales para antivirales de control. El dato se ajustó a una función sigmoidea y los valores de IC50 se calcularon usando software GraphPad Prism ajustando una curva de respuesta a la dosis con una pendiente variable (cuatro parámetros). Los valores de IC50 se resumen en la tabla 1.
Resultados - Citotoxicidad para el ensayo del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1)
Tabla 4. Viabilidad de células HeLa-CD4-pgal en presencia de objeto de prueba como se determina por el ensayo XTT (A490). Las células HeLa-CD4-pgal se incubaron en presencia de diferentes concentraciones de objetos de prueba, o con vehículo solo (solo medio). Para cada punto de dato se muestra el dato en bruto individual (valores de absorbancia a 490 nm). La tabla inferior muestra los valores de los datos en bruto para las muestras de control.
Tabla 5. Viabilidad de células HeLa-CD4-pgal en el ensayo XTT (valores en porcentaje). Los datos representan la viabilidad como un porcentaje de valores obtenidos de células HeLa-CD4-beta-gal tratadas con vehículo (solo medio) después de 48 horas. El valor medio obtenido de los pocillos base se restó de todos los valores en bruto antes de la normalización al vehículo. El dato representa la media y la desviación estándar de duplicados donde sea aplicable.
La Figura 13 muestra el ensayo de viabilidad con células HeLa-CD4-pgal (valores en porcentaje). Los resultados muestran la extensión de la citotoxicidad inducida por el compuesto en células HeLa-CD4-pgal incubadas durante 48 horas, como se determina por una lectura XTT para la viabilidad (lectura de absorbancia a 490 nm). El dato se normaliza a los valores observados en las células en ausencia de vehículo de objeto de ensayo solo (solo medio). Los resultados muestran la media de puntos de dato duplicados con la desviación estándar (d.e.) para objetos de prueba. También se incluye la respuesta a la dosis observada con TAF y T20 (puntos de dato individuales).
La Figura 14A y la Figura 14B muestran la determinación de los valores CC50 para la muestra A (Figura 14A) y la muestra B (Figura 14B) en células HeLa-CD4-pgal (valores en porcentaje). Los resultados muestran la extensión de la citotoxicidad inducida por el objeto de prueba en células HeLa-CD4-pgal incubadas durante 48 horas, como se determina por una lectura XTT para la viabilidad (lectura de absorbancia a 490 nm). Los valores indican el porcentaje de viabilidad estimado como porcentaje de la observada en muestras incubadas con vehículo solo (solo medio). Los resultados muestran la media de puntos de dato duplicados. El dato se ajustó a una función sigmoidea y los valores de CC50 se calcularon usando software GraphPad Prism ajustando una curva de respuesta a la dosis con una pendiente variable (cuatro parámetros). Cuando la viabilidad no alcanzó el 50 %, el valor de CC50 presentado fue mayor que 10 pg/ml. Los valores de CC50 se indican en la tabla 1.
La Figura 15A y la Figura 15B muestran la determinación de valores de CC50 para antivirales de control con células HeLa-CD4-pgal (valores en porcentaje). Los resultados muestran la extensión de la citotoxicidad inducida por el objeto de prueba en células HeLa-CD4-beta-gal incubadas durante 48 horas, como se determina mediante una lectura XTT para la viabilidad (lectura de absorbancia a 490 nm). Los valores indican el porcentaje de viabilidad estimada como porcentaje de la observada en muestras incubadas con vehículo solo (solo medio). Los resultados muestran puntos de datos individuales. El dato se ajustó a una función sigmoidea y los valores de CC50 se calcularon usando software GraphPad Prism ajustando una curva de respuesta a la dosis con una pendiente variable (cuatro parámetros). Cuando la viabilidad no alcanzó el 50 %, el valor de CC50 presentado fue mayor que 20 pM. Los valores de CC50 se indican en la tabla 1.
Resultados - Actividad antiviral del virus sincitial respiratorio humano (HRSV)
Tabla 6. Ensayo de infectividad de HRSV (A490). Los valores individuales de viabilidad (como se cuantifica por la absorbancia medida a 490 nm) se muestran para cada condición de prueba. Las células infectadas presentan niveles aumentados de absorbancia. Los valores de A490 duplicados se muestran para cada concentración de objeto de prueba. Todas las muestras se infectaron excepto aquellas indicadas como “simulación”. Las muestras tratadas con ribavirina (Rib) 50 pM también se muestran. Las concentraciones del objeto de prueba se muestran en nanogramos por mililitro y Rib en micromolar.
La Figura 16 muestra la inhibición de HRSV mediante objetos de prueba (A490). Se muestran los datos como valores a A490 en pocillos que contienen células HEp-2 infectadas en presencia de vehículo solo o concentraciones variables de objetos de prueba (media de duplicado con desviación estándar). Las células no infectadas se muestran como “simulación”. Los niveles base se muestran en pocillos sin células (“sin células”). Rib 50 pM se muestra como el antiviral de control.
Tabla 7. Ensayo de infectividad de HRSV (valores en porcentaje). El dato representa la infectividad como un porcentaje de valores obtenidos de pocillos infectados tratados solo con vehículo (solo medio). Todas las muestras mostradas debajo estaban infectadas excepto aquellas indicadas como “simulación”. Algunas muestras se tratan con el antiviral de control, ribavirina (Rib a 50 pM). Las concentraciones del objeto de prueba se muestran en nanogramos por mililitro y el antiviral en micromolar. El dato mostrado para el objeto de prueba representa la media y la desviación estándar de los duplicados. Para las células no infectadas (“simulación”) y el “vehículo” la media y la desviación estándar se derivó de cuatro réplicas cada uno.
La Figura 17 muestra el ensayo de infectividad de HRSV (valores en porcentaje). Los resultados muestran la extensión de la infección de HRSV, como una lectura de inmunotinción a 490 nm para la infectividad después de 72 horas. El dato se normaliza a la actividad observada en células en ausencia de objeto de prueba (solo vehículo). Los resultados del objeto de prueba muestran la media de los puntos de dato duplicados con la desviación estándar.
La Figura 18A y la Figura 18B muestran la determinación de los valores de IC50 para la muestra A (Figura 18A) y la muestra B (Figura 18B) en la infectividad de HRSV (valores en porcentaje). Los resultados indican la extensión de la infección por HRSV a las 72 horas en comparación con las muestras incubadas con vehículo solo (solo medio). Los resultados muestran la media de los puntos de datos duplicados. Cuando fue posible, el dato se ajustó a una función sigmoidea y los valores de IC50 se calcularon usando software GraphPad Prism ajustando una curva de respuesta a la dosis con una pendiente variable (cuatro parámetros). Los valores de IC50 se resumen en la tabla 1.
Resultados - Citotoxicidad para el ensayo del virus sincitial respiratorio humano (HRSV)
Tabla 8. Viabilidad de células HEp-2 en presencia de objetos de prueba como se determina por el ensayo XTT (A490). Las células HEp-2 se incubaron en presencia de concentraciones diferentes de objetos de prueba o con vehículo solo (solo medio). Los puntos de datos duplicados se muestran para cada objeto de prueba. El dato en bruto individual se muestra (valores de absorbancia a 490 nm). La tabla de abajo muestra los valores de datos en bruto para las muestras de control.
Tabla 9. Viabilidad de HEp-2 en el ensayo XTT (valores en porcentaje). El dato representa la viabilidad como un porcentaje de los valores obtenidos de células HEp-2 no infectadas tratadas con vehículo (solo medio) después de 72 horas. El valor medio obtenido de los pocillos base se restó de todos los valores en bruto antes de la normalización al vehículo. La media de duplicados con su desviación estándar se muestra para los objetos de prueba. Para el vehículo (solo medio) la media y la desviación estándar se derivó a partir de seis réplicas.
La Figura 19A y la Figura 19B muestran la determinación de valores de CC50 para la muestra A (Figura 19A) y la muestra B (Figura 19B) con las células HEp-2 (valores en porcentaje). Los resultados muestran la extensión de la citotoxicidad inducida por el objeto de prueba en células HEp-2 incubadas durante 72 horas, como se determina por una lectura XTT para la viabilidad (lectura de absorbancia a 490 nm). Los valores indican el porcentaje de viabilidad estimado como porcentaje de la observada en muestras incubadas con vehículo solo (solo medio). El dato representa los puntos de datos duplicados para cada objeto de prueba. El dato se ajustó a una función sigmoidea y los valores de CC50 se calcularon usando el software GraphPad Prism ajustando a una curva de respuesta a la dosis con una pendiente variable (4 parámetros). Cuando la pérdida de viabilidad celular no alcanzó el 50 %, el valor de CC50 presentado se indicó como mayor que 10 pg/ml. Los valores de CC50 también se muestran en la tabla 1.
Experimento 5: Evaluación de actividad antiviral de interferón-alfa 14 (muestra A), HÍBRIDO 2 (muestra B) e interferónbeta 1a (muestra C) frente a VIH
La prueba antiviral a dosis completa se llevó a cabo en objetos de prueba de interferón-alfa 1 (muestra A), HÍBRIDO 2 (muestra B) e interferón-beta 1a (muestra C). Estos objetos se probaron con la cepa LAI del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). Se proporcionaron todos los objetos de prueba en sólido desde los que se prepararon 0,25 mg/ml (muestra A), 1,0 mg/ml (muestra B) y 0,02 mg/ml (muestra C) en ddH2O, se hicieron alícuotas, y se almacenaron a -80 C para evitar los ciclos de congelación descongelación repetidos.
El ensayo antiviral de VIH utiliza células HeLa-CD4-pgal para evaluar la inhibición de infección por VIH-1. La infección con VIH induce la expresión de beta-galactosidasa. Las células HeLa-CD4-pgal se infectaron con VIH LAI en presencia de concentraciones diferentes de objetos de prueba. Las existencias de virus VIH LAI se produjeron por transfección de células 293T con ADN proviral, se recogieron después de 48 horas y se congelaron hasta la infección. En este proyecto, se preincubaron objetos de prueba con células diana durante 30 minutos a 37 °C antes de la adición del virus VIH LAI a las células. Los inhibidores estuvieron presentes en el medio de cultivo celular durante la duración de la infección. La extensión de la infección de células HeLa-CD4-pgal se monitorizó después de 48 horas evaluando la actividad de betagalactosidasa y comparando los valores con las células tratadas con vehículo solo (medio de cultivo del tejido).
Se ejecutó una prueba de viabilidad en paralelo usando las mismas concentraciones de objetos de prueba evaluados en el ensayo antiviral. Los ensayos de viabilidad se usaron para determinar los efectos de citotoxicidad inducidos por objetos de prueba en ausencia de virus. La viabilidad celular se determina por el método XTT. El ensayo de viabilidad se llevó a cabo durante el mismo periodo de tiempo evaluado en el ensayo antiviral.
Se evaluaron nueve concentraciones de los objetos de prueba en duplicados. Se evaluaron diluciones en serie de diez veces partiendo de 10 Mg/ml. Cuando fue posible, los valores de IC50 y CC50 para los inhibidores se determinaron para cada ensayo usando software GraphPad Prism.
Actividades antivirales de objetos de prueba A (interferón-alfa 14), B (HÍBRIDO 2) y C (interferón-beta 1a)
Todos los objetos de prueba, A, B y C presentaron actividad antiviral frente al VIH-LAI. Los valores de IC50 generados con software GraphPad fueron 0,04 ng/ml, 0,03 ng/ml y 113,1 ng/ml, para A, B y C, respectivamente (tabla 1). Los objetos de prueba A y B no bloquearon completamente la infectividad de VIH, y aproximadamente el 25 % de la señal de infección se observó todavía incluso a las mayores concentraciones probadas (10 Mg/ml). Las razones para esto son desconocidas, pero es posible que una fracción del cultivo no sea sensible a la actividad de los objetos de la prueba A y B. Un inhibidor de control evaluado en paralelo, T-20 (enfuvirtida), bloqueó completamente la infección de VIH con una pérdida mínima de viabilidad celular. T-20 es un péptido inhibidor de fusión que bloquea la entrada de VIH.
Es importante tener en cuenta que los perfiles de inhibición observados para los objetos de prueba A y B pueden llevar a valores de IC50 diferentes de las concentraciones que dan por resultado una inhibición del 50 % de infectividad de VIH. Los valores generados por GraphPad Prism fueron menores que las concentraciones que lograron el 50 % de inhibición.
Los tratamientos de células HeLa-CD4-beta-gal con el objeto de prueba C dieron por resultado una pequeña reducción de la viabilidad celular (~25 %) a la mayor concentración probada (10 Mg/ml) (Figura 6, página 11). Una tendencia dependiente de dosis de la citotoxicidad se observó también con el objeto de prueba A. Los índices de selectividad para la actividad anti-VIH fueron significativamente mayores para los objetos de prueba A y B, en comparación con el objeto C.
Inhibidores de control y controles de calidad
Los controles de calidad para el ensayo de infectividad se realizaron en cada placa para determinar: i) los valores de señal a base (S/B); ii) inhibición mediante un inhibidor conocido, y iii) variación del ensayo, según se mide por el coeficiente de variación (C.V.) de todos los puntos de datos del objeto de prueba replicados. Todos los controles funcionaron como se anticipó para cada ensayo. Un antiviral conocido para VIH (T20) bloqueó la infección en más del 99 % a 0,5 mM, y los controles de viabilidad (emetina y DMSO al 10 %) usados en el ensayo de citotoxicidad XTT inhibieron la viabilidad celular más del 95 %. La variación total en los ensayos de infección fue 5,7 %, y la variación total en los ensayos de viabilidad fue 6,2 %. La señal a base (S/B) en el ensayo de infección fue 255 veces y en el ensayo de viabilidad fue 7,8 veces.
1 Los niveles de señal a base se calcularon dividiendo la señal en células infectadas en presencia de vehículo solo, dividida por la señal de células no infectadas (“infectadas en simulación”) para los ensayos de infectividad. El nivel de señal a base para los ensayos de citotoxicidad se calculó dividiendo la señal en células en presencia de vehículo solo (medio solo), dividido por la señal en los pocilios sin células (“sin células”).
2 C.V. para los ensayos se calcula como la media de los valores de C.V. determinados para todos los puntos de datos de objetos de prueba replicados.
3 El índice de selectividad (S.I.) se calcula dividiendo el valor de CC50 por el valor de IC50.
Tabla 9. Resumen de los resultados. Los valores de IC50 (infectividad), CC50 (viabilidad) e índice de selectividad (S.I.) se muestran para cada objeto de prueba. Los controles de calidad para cada ensayo también se muestran, incluyendo las relaciones de señal a base (S/B) y los coeficientes de variación (C.V.) medios de todos los puntos de datos de objetos de prueba replicados. Los valores de viabilidad (CC50) en el ensayo donde la extensión de la inhibición no alcanzó el 50 % a la mayor concentración probada, se muestran como >10 qg/ml.
Procedimientos experimentales - Ensayo antiviral con lectura de p-galactosidasa
Ensayo de infectividad de VIH-1
Los ensayos de infectividad se realizaron desafiando células HeLa-CD4-pgal con VIH-1 LAI en presencia o ausencia de objetos de prueba. Las células HeLa-CD4-pgal expresan beta-galactosidasa bajo el control del promotor de VIH-1 LTR. Tras la infección con VIH y la expresión de la proteína Tat viral se indujo la expresión de beta-galactosidasa. Las células HeLa-CD4-pgal se sembraron en 12.000 células por pocillo en una placa blanca de fondo plano de 96 pocillos tratada con TC y se mantuvieron en DMEM suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 %, por la presente denominado DMEM10. Los objetos de prueba se diluyeron 10 veces en placas de fondo en U usando DMEM10. Las diluciones de material de prueba se prepararon a 1,25X de la concentración final. Las células se incubaron con el material de prueba diluido a 1,25X (80 ql por pocillo) durante 30 minutos a 37 °C en CO2 al 5 %. Después de la preincubación del material de prueba, se añadió el virus VIH-LAI preparado en DMEM10 a las células (20 ql por pocillo) y las placas se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % durante 48 horas. Cada pocillo contenía 100 ql de volumen final. El volumen del virus usado en el ensayo se determinó previamente para producir una señal en el intervalo lineal inhibido por TAF (tenofovir alafenamida) y T20 (enfuvirtida), conocidos inhibidores de VIH-1. Las infecciones se realizaron en reacciones por duplicado. Después de dos días de infección, las células se monitorizaron para la actividad de beta-galactosidasa usando el kit Galacton-Star® (ThermoFisher). La prueba Galacto-Star es un ensayo quimioluminiscente sensible que detecta la beta-galactosidasa en lisatos de células de mamíferos. La luminiscencia se midió con una lectura de 1 segundo.
Se evaluaron nueve puntos de datos a partir de duplicados de diluciones de diez veces en serie de los objetos de prueba que oscilaron de 0,0001 ng/ml a 10 qg/ml. Los controles incluyeron células incubadas sin virus (“infectadas en simulación”), infectadas e incubadas con vehículo solo (DMEM10), o infectadas en presencia de T20 (inhibidor conocido de la infección por VIH) a 0,5 qM.
Ensayo de infectividad de VIH-1 QC
La S/B media en el ensayo fue 255 (base determinada con células “infectadas en simulación”), mientras que la variación media para todos los puntos de datos fue 5,7 % (valores de C.V.) y 5,8 % (valores de C.V. para todos los pocillos que presentan más del 50 % del infección). Los niveles base observados en las células infectadas en simulación en ausencia de virus se restaron de todas las muestras. El antiviral de control usado en este ensayo (T-20 a 0,5 qM) bloqueó la infección en cerca del 100 %.
Procedimiento experimental - ensayos de citotoxicidad
Ensayo de viabilidad (XTT) para evaluar la citotoxicidad inducida por el objeto de prueba
Las células no infectadas se incubaron con objetos de prueba o diluciones de inhibidor de viabilidad de control usando las mismas concentraciones de objeto de prueba que las usadas en el ensayo de infectividad. La temperatura de incubación y la duración del periodo de incubación reflejaron las condiciones del correspondiente ensayo de infectividad. La viabilidad celular se evaluó con el método XTT. La sal de tetrazolio (XTT) se escinde a un tinte de formazano naranja a lo largo de una reacción que ocurre solo en células viables con mitocondrias activas. El tinte de formazano se cuantifica directamente usando un espectrofotómetro multipocillo de barrido. Los niveles base obtenidos de los pocillos sin células se restaron de todos los puntos de datos. La extensión de la viabilidad se monitorizó midiendo la absorbancia a 490 nm.
Datos de QC y análisis de citotoxicidad
La señal media obtenida en los pocillos sin células se restó de todas las muestras. Los valores de lectura se dieron como un porcentaje de la señal media observada en células no infectadas tratadas solo con vehículo (solo medio). La señal a base (S/B) obtenida fue 7,8. Se usó emetina (10 qM) y DMSO al 10 % como controles citotóxicos en los ensayos de viabilidad e inhibieron la viabilidad celular en más del 95 %.
Resultados - Actividad antiviral del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1)
Tabla 10. Ensayo de infectividad de VIH-1 LAI (RLU). Se muestran los valores individuales de RLU de luminiscencia de p-galactosidasa para cada punto de dato evaluado. Todas las muestras se infectaron excepto aquellas indicadas como “simulación”. Las muestras tratadas con T20 (0,5 pM) también se muestran. Las concentraciones del objeto de prueba se muestran en nanogramos por mililitro y el antiviral de control en micromolar.
La Figura 20 muestra la infectividad de VIH-1 LAI mediante los objetos de prueba de interferón-alfa 1 (muestra A), HÍBRIDO 2 (muestra B) e interferón-beta 1a (muestra C) e inhibidores de control (RLU). Se muestran los datos como valores de unidades de luminiscencia relativa (RLU) en pocillos que contienen células HeLa-CD4-pgal infectadas en presencia de vehículo solo o concentraciones variables de objetos de prueba (media de duplicados con desviación estándar). Las células no infectadas se muestran como “simulación”. T20 se incluye como el control antiviral (media de los puntos de datos duplicados a 0,5 pM).
Tabla 11. Ensayo de infectividad de VIH-1 LAI (porcentaje de vehículo). El dato representa el porcentaje de infección de VIH (como se mide por la luminiscencia de beta-galactosidasa) como un porcentaje de valores obtenidos de los pocillos tratados con vehículo solo (DMEM10). El valor medio obtenido de células no infectadas en cada placa se restó de todos los valores en bruto antes de la normalización al vehículo solo. La media de duplicados u ocho réplicas con su desviación estándar se muestran para los objetos de prueba y el vehículo, respectivamente. El control T20 (0,5 pM) se muestra como puntos de datos duplicados.
La Figura 21 muestra el ensayo de infectividad de VIH-1 LAI (valores en porcentaje). Los resultados muestran la extensión de la infección de VIH-1 LAI, como se determina mediante un ensayo de beta-galactosidasa (lectura de luminiscencia) a las 48 horas. El dato se normaliza a la actividad observada en las células en ausencia del objeto de prueba (vehículo solo). Los resultados del objeto de prueba y el antiviral de control muestran la media de los puntos de datos duplicados con la desviación estándar (d.e.), mientras que el vehículo muestra la media y la d.e. de ocho réplicas.
La Figura 22A (interferón-alfa 14), la Figura 22B (HÍBRIDO 2) y la Figura 22C (interferón-beta 1a) muestran la determinación de los valores de IC50 para la infectividad de VIH-1. Los valores indican el porcentaje de infectividad de VIH comparado con las muestras incubadas con vehículo solo. Los resultados muestran la media de puntos de datos duplicados con la desviación estándar (d.e.). El dato se ajustó a una función sigmoidea y los valores de IC50 se calcularon usando software GraphPad Prism ajustando una curva de respuesta a la dosis con una pendiente variable (cuatro parámetros). Los valores de IC50 se resumen en la tabla 10.
Resultados - Citotoxicidad para el ensayo del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1)
Tabla 12. Viabilidad de células HeLa-CD4-pgal en presencia de objeto de prueba como se determina por el ensayo XTT (A490). Las células HeLa-CD4-pgal se incubaron en presencia de diferentes concentraciones de objetos de prueba, o con vehículo solo (solo medio). Para cada punto de dato se muestra el dato en bruto individual (valores de absorbancia a 490 nm). La tabla inferior muestra los valores de datos en bruto para las muestras de control.
Tabla 13. Viabilidad de células HeLa-CD4-pgal en el ensayo XTT (valores en porcentaje). El dato representa la viabilidad como porcentaje de los valores obtenidos de células HeLa-CD4-beta-gal no infectadas tratadas con vehículo (solo medio) después de 48 horas. El valor medio obtenido de los pocillos base se restó de todos los valores en bruto antes de la normalización al vehículo. El dato representa la media y la desviación estándar de los duplicados donde sea aplicable.
La Figura 23 muestra el ensayo de viabilidad con células HeLa-CD4-pgal (valores en porcentaje). Los resultados muestran la extensión de la citotoxicidad inducida por el compuesto en células HeLa-CD4-beta-gal incubadas durante 48 horas, como se determina por una lectura de XTT para la viabilidad (lectura de absorbancia a 490 nm). El dato se normaliza a los valores observados en las células en ausencia del objeto de prueba solo vehículo (solo medio). Los resultados muestran la media de los puntos de datos duplicados con la desviación estándar (d.e.) para objetos de prueba y los controles T20 (0,5 pM), emetina 10 pM y DMSO al 10 %.
La Figura 24 muestra la determinación de los valores de CC50 para la muestra A (Figura 24A), muestra B (Figura 24B) y la muestra C (Figura 24C) en células HeLa-CD4-pgal (valores en porcentaje). Los resultados muestran la extensión de la citotoxicidad inducida por el objeto de prueba en células HeLa-CD4-pgal incubadas durante 48 horas, como se determina por una lectura XTT para la viabilidad (lectura de absorbancia de 490 nm). Los valores indican el porcentaje de viabilidad estimada como porcentaje de la observada en muestras incubadas con vehículo solo (solo medio). Los resultados muestran la media de los puntos de datos duplicados. El dato se ajustó a una función sigmoidea y los valores de CC50 se calcularon usando software GraphPad Prism ajustando una curva de respuesta a la dosis con una pendiente variable (cuatro parámetros). Cuando la viabilidad no alcanzó el 50 %, el valor de CC50 presentado fue mayor que la mayor concentración probada, 10 pg/ml. Los valores de CC50 se indican en la tabla 10.
Experimento 6: El efecto del híbrido de interferón alfa en el virus de herpes simple tipo 1 (HSV1)
Los experimentos se llevaron a cabo para determinar si el tratamiento de los queratinocitos humanos primarios con el interferón híbrido reduce la infección de HSV1. Los interferones usados fueron híbrido 1, híbrido 2, interferón alfa-14, interferón alfa-2a e interferón beta-1a.
La Figura 25 muestra la dosis infecciosa del cultivo tisular (TCID) del virus del herpes simple 1 en células VERO cuando se tratan con híbrido 1, híbrido 2, interferón alfa-14, interferón alfa-2a e interferón beta-1a.
La Figura 26 muestra la TCID media convertida en unidades formadoras de placa (PFU).
Materiales y métodos
1. Propagación de células Vero de existencias congeladas (1).
2. Propagación de queratinocitos epidérmicos humanos adultos primarios (células HEKa) de existencias congeladas.
3. Infección de las células HEKa con HSV1
4. Administración de interferones
5. Ensayo de placa del sobrenadante celular (2).
6. Procesado de células HEKa infectadas por FACS, ICC, RT-qPCR
7. Congelación de las células Vero
8. Congelación de los queratinocitos
Propagación de las células Vero de existencias congeladas
Materiales:
Células Vero de riñón de mono verde africano (Merck 84113001-1VL; ATCC CCL-81), incubadora de cultivo celular (37 °C, 95 % de aire, 5 % de CO<2>), 1x PBS (ni calcio ni magnesio) (Sigma D8537), tripsina-EDTA (0,25 % de tripsina, 0,02 % de EDTA) (Sigma T4049), medios de cultivo celular (glucosa alta, D<m>E<m>, FBS al 10 %, glutamina 2 mM, Pen/Strep al 1 %), matraces de cultivo celular ventilados de 25 cm2 y 75 cm2, baño de agua (37 °C), centrífuga y tubo de centrifugado de 15 ml.
Método:
Siembra de células de existencias congeladas
Se sacó el criovial del nitrógeno líquido o congelador a temperatura utrabaja y se descongeló rápidamente en un baño de agua a 37 °C. Una vez descongelado, transferir inmediatamente al tubo de centrifugado de 15 ml que contenía 10 ml de medio de cultivo celular precalentado. Centrifugar a 200 g durante 5 min a temperatura ambiente (TA). Descartar el sobrenadante. Resuspender en 5 ml de medio de cultivo celular y colocar en el matraz de cultivo celular ventilado de 25 cm2. Cambiar el medio cada 3-4 día hasta que las células sean confluentes en >90 %. Recuperar lentamente las células Vero después de la congelación y podría tardar >1 semana en volverse confluente. Puede que necesiten hacer pases 2-3 veces antes de que las células alcancen la velocidad de crecimiento normal.
Pasado de células (volúmenes para el matraz de 25 cm2, x2 para el matraz de 75 cm2)
Eliminar el medio. Lavar las células con 5 ml de 1x PBS. Añadir 2,5 ml de tripsina-EDTA, incubar a 37 °C durante 2 3 min o hasta que las células comiencen a rayarse mientras se separan. Golpear/agitar el matraz suavemente para ayudar a la separación. Se puede usar menos tripsina e incubar más tiempo si fuera necesario. Añadir 2,5 ml de medio y pipetear para lavar las células y romper los grumos. Transferir a un tubo de centrifugado de 15 ml y centrifugar a 200 g durante 5 min a TA. Descartar el sobrenadante y resuspender en 10 ml de medio. Se puede dividir entre 1:5 y 1:10 para el mantenimiento. Sembrar 2 x 10A5 células por pocillo en placas de 12 pocillos para el ensayo en placa. Ensayo en placa de los sobrenadantes celulares
Materiales:
Células Vero, medio de células Vero, sobrenadante, metilcelulosa al 1,5 % (Sigma M6385-100G) en 1x PBS, violeta de cristal al 1 % (Sigma C0775-25G) en relación 1:1 de MeOH:H<2>O
Método:
Día -2: Preparar metilcelulosa al 1,5 %
Añadir 1,5 g de metilcelulosa a 100 ml de 1x PBS. Tratar en autoclave durante 45 min en ciclo líquido. Dejar enfriar. Añadir 350 ml de medio de células Vero. Agitar durante la noche a 4 °C.
Día -1: Sembrar las células Vero
Etiquetar una placa de 12 pocillos por condición. Separar las células como se describe anteriormente. Sembrar 2 x 10A5 células Vero por pocillo de una placa de 12 pocillos. Dejar sedimentar durante 15-30 min antes de devolverlas a la incubadora.
Día 0: Infección de células Vero
Comprobar que las células Vero son confluentes. Preparar una dilución en serie de los sobrenadantes en medio de cultivo celular. Las diluciones deberían oscilar entre 10A-2 y 10A-7. Se necesitan 200 |ul de cada dilución por pocillo, realizado por duplicado. Quitar el medio de células Vero. Añadir 200 |ul de la dilución apropiada a cada pocillo. Ponerlas en la incubadora. Agitar las placas cada 15 min durante 1 h. Aspirar los virus y recubrir con 1,5 ml de metilcelulosa. Incubar 3-5 días o hasta que las placas sean visibles. Quitar el recubrimiento y añadir 2 ml de violeta de cristal. Incubar 10-20 min a TA. Aspirar la mancha y enjuagar suavemente con agua corriente. Dejar secar. (núm. de placas)/(volumen de inóculo (ml))*(dilución) = pfu/ml.
Congelación de las células Vero
Materiales:
Células Vero confluentes en 1 matraz de 75 cm2, medio de congelación (DMEM alto en glucosa, FBS al 20 %), sulfóxido de dimetilo (DMSO), DPBS sin calcio y magnesio, tripsina-EDTA, crioviales, tubos de centrifugado de 15 ml, recipiente de congelación Cryo Cell, isopropanol
Método:
Añadir 1 ml de DMSO a 9 ml de medio de congelación y dejar aparte. Etiquetar 10 crioviales con la fecha, el tipo de célula y el número de pases. Quitar el medio del matraz. Lavar con 10 ml de DPBS. Añadir 5 ml de tripsina-EDTA, incubar a 37 °C durante 2-3 min. Añadir 5 ml de medio de congelación, lavar las células, romper los grumos. Transferir las células al tubo de centrifugado de 15 ml. Centrifugar a 200 g durante 5 min. Descartar el sobrenadante y resuspender en 10 ml de DMSO-medio de congelación. Añadir 1 ml de células a cada criovial y transferir inmediatamente a la cámara de congelación que contiene isopropanol. Almacenar a -80 °C durante la noche. T ransferir a nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo.
Diversas modificaciones y variaciones a las realizaciones descritas de las invenciones serán evidentes para los expertos en la técnica sin separarse del alcance de la invención. Aunque la invención se ha descrito en conexión con realizaciones preferidas específicas, debe entenderse que la invención no estará demasiado limitada a dichas realizaciones específicas. De hecho, se pretende que diversas modificaciones de los modos descritos de realizar la invención que son obvios para los expertos en la técnica estén cubiertas por la presente invención.
Claims (6)
1. Un subtipo de interferón alfa, HÍBRIDO 2, para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de un virus o infección viral;
en donde el subtipo de interferón alfa, HÍBRIDO 2, comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o un fragmento funcionalmente activo de SEQ ID NO:3; y
en donde el virus o infección viral se selecciona de un miembro de la familia Flaviviridae, la familia Arenaviridae, la familia Bunyaviridae, la familia Togaviridae, la familia Herpesviridae, la familia Orthomyxoviridae, la familia Rhabdoviridae, la familia Paramyxoviridae, la familia Picornaviridae o la familia Retroviridae.
2. El subtipo de interferón alfa para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de una infección viral según la reivindicación 1, en donde el virus o infección viral se selecciona de
Virus Chikungunya (CHIKV)
Virus Coxsackie
Virus del dengue (DENV)
Virus de Epstein-Barr (EBV)
Virus de la hepatitis B (HBV)
Virus de la hepatitis C (HCV)
Citomegalovirus humano (HCMV)
Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
Virus de la parainfluenza humana (HPIV)
Virus sincitial respiratorio humano (HRSV)
Rinovirus humano (HRV)
Virus de herpes simple (HSV)
Virus de la gripe A (IAV)
Virus de la gripe B (IBV)
Virus de Lassa (LASV)
Virus del sarampión (MeV)
Virus de las paperas (MuV)
Virus Nipah (NiV)
Virus de la polio (PV)
Virus de la rabia (RABV)
Virus del Nilo occidental (WNV)
Virus de la fiebre amarilla (YFV)
Virus del Zika (ZIKV).
3. El subtipo de interferón alfa para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de una infección viral según la reivindicación 1, en donde la infección viral se trata proporcionando HÍBRIDO 2 (SEQ ID NO:3 o un fragmento funcionalmente activo del mismo), mediante inyección directa o cuando sea apropiado para los virus que provocan problemas respiratorios, mediante aerosol directamente a los pulmones.
4. El subtipo de interferón alfa para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de una infección viral según las reivindicación 1, en donde el virus o infección viral se selecciona del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus sincitial respiratorio humano (HRSV) y virus del herpes simple (HSV).
5. El subtipo de interferón alfa para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de una infección viral según la reivindicación 1, que comprende además una cantidad terapéuticamente útil de un tratamiento antiviral adicional.
6. El subtipo de interferón alfa para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de una infección viral según la reivindicación 5, en donde el tratamiento antiviral es ribavirina, Remdesevir, LAM-002A, dexametasona, Avigan (favilavir) u otro subtipo de interferón.
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