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ES2980055T3 - Polipéptidos quiméricos y usos de los mismos - Google Patents

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ES2980055T3
ES2980055T3 ES18788941T ES18788941T ES2980055T3 ES 2980055 T3 ES2980055 T3 ES 2980055T3 ES 18788941 T ES18788941 T ES 18788941T ES 18788941 T ES18788941 T ES 18788941T ES 2980055 T3 ES2980055 T3 ES 2980055T3
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cell
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Jed Wiltzius
Stuart A Sievers
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Kite Pharma Inc
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Abstract

La invención proporciona nuevos péptidos (por ejemplo, enlazadores) y composiciones polipeptídicas que comprenden los enlazadores (por ejemplo, proteínas de fusión) y métodos para utilizar las composiciones polipeptídicas. Los péptidos (por ejemplo, enlazadores) son útiles como etiquetas y para diseñar proteínas de fusión (por ejemplo, moléculas de unión a antígeno, scFv). Los enlazadores polipeptídicos descritos en este documento facilitan la flexibilidad de los péptidos enlazados, lo que permite un plegamiento y una conformación adecuados y una inmunogenicidad reducida. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos quiméricos y usos de los mismos
CAMPO TÉCNICO
[0001]La presente divulgación se refiere a nuevos péptidos y composiciones polipeptídicas que comprenden dichos péptidos (por ejemplo, enlazadores, polipéptidos quiméricos, moléculas de unión a antígeno) y métodos de uso y preparación de los mismos.
ANTECEDENTES
[0002]Las moléculas de unión a antígeno, incluidos los anticuerpos, se utilizan en inmunoterapia y aplicaciones basadas en fase sólida, como biosensores, cromatografía de afinidad e inmunoensayos. Estos anticuerpos y moléculas de unión a antígeno ganan su utilidad en virtud de su capacidad para unirse específicamente a sus dianas.
[0003]Las proteínas de fusión pueden requerir secuencias enlazadoras, que a menudo se basan en péptidos cuando se emplean en aplicaciones biotecnológicas y bioterapéuticas, que pueden servir para una gama de aplicaciones científicamente relevantes. Por ejemplo, un enlazador puede usarse como resto espaciador para impartir una propiedad estructural y/o funcional deseada a una molécula más grande. En otro ejemplo, un enlazador puede impartir pocas o ninguna propiedad estructural o funcional a una molécula más grande, pero puede usarse simplemente como una característica distintiva (por ejemplo, un “marcador” o “biomarcador” o “etiqueta”), identificando de forma única una molécula más grande. En otro ejemplo más, se puede usar un enlazador para impartir una característica reconocible que puede servir como sitio de unión para un anticuerpo dirigido contra una molécula más grande que comprende la secuencia peptídica.
[0004]Documentos de la técnica anterior WO2012/138475A1, WO2017/076916A1, Gorawit Yusakul et al. 2016 (Biosci. Biotech. Biochem. 80:1306-1312), W02004/044168A2 y el documento WO 2012/106281A2 describe varios conectores de moléculas más grandes. Sin embargo, ninguno de estos documentos describe un enlazador que tenga la secuencia y propiedades de los enlazadores de la presente invención.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN REIVINDICADA
[0005]La presente invención está limitada por las reivindicaciones adjuntas.
[0006]Por consiguiente, la presente invención se refiere a un péptido, en el que el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de
(i) GGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 7);
(ii) GGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 8);
(iii) GGGGSGKPGSGGGGS (SEQ ID NO: 9);
(iv) GGGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 11); o
(v) GGGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 12).
[0007]En una realización, el péptido de la invención comprende no más de 20 aminoácidos.
[0008]La presente invención también se refiere a una proteína de fusión que comprende:
a) un primer polipéptido; y
b) un péptido de la invención.
[0009]La presente invención también se refiere a una proteína de fusión que comprende:
a) un primer polipéptido;
b) un segundo polipéptido; y
c) un péptido de la invención.
[0010]En una realización, la proteína de fusión es una molécula de unión a antígeno.
[0011]En una realización, la proteína de fusión que es una molécula de unión a antígeno es un scFv.
[0012]En una realización, el primer polipéptido de la proteína de fusión es un dominio variable de cadena ligera y el segundo polipéptido de dicha proteína de fusión es un dominio variable de cadena pesada.
[0013]La presente invención también se refiere a un polinucleótido que codifica (i) un péptido de la invención o (ii) una proteína de fusión de la presente invención.
[0014]La presente invención también se refiere a un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención.
[0015]La presente invención también se refiere a una célula recombinante que comprende un polinucleótido de la presente invención o el vector de expresión de la presente invención.
RESUMEN
[0016]La presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas. La presente divulgación proporciona enseñanzas que en algunos aspectos van más allá de la divulgación de la invención como tal, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. Las enseñanzas se proporcionan para situar la invención real en un contexto técnico más amplio e ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Dicha información técnica adicional que no cae dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención. En particular, los términos "realización" y "aspecto" no deben interpretarse como necesariamente referidos a la invención reivindicada, a menos que el objeto en cuestión caiga dentro del alcance de las reivindicaciones.
[0017]La presente invención proporciona, entre otras cosas, nuevas secuencias peptídicas que permiten la expresión, plegamiento, identificación y actividad adecuados de una proteína de fusión. Los nuevos péptidos descritos en el presente documento pueden usarse para conectar dominios dentro de una proteína de fusión (por ejemplo, scFv) facilitando la flexibilidad de los dominios peptídicos individuales. Los ScFv comprenden el dominio de unión de la mayoría de las construcciones CAR. Un scFv comprende cadenas ligeras y pesadas variables de IgG y un péptido flexible (por ejemplo, enlazador) que conecta estos dos dominios. Un enlazador debe ser lo suficientemente largo como para conectar los dominios en una sola construcción de proteína. Además, es deseable que un enlazador o construcción de etiqueta no sea una causa potencial de inmunogenicidad.
[0018]Los enlazadores de uso común incluyen repeticiones de glicina-glicina-glicina-glicina-glicina-serina (G4S) (SEQ ID NO: 32) debido a su flexibilidad intrínseca y simplicidad de las cadenas laterales, que pueden ser menos inmunogénicas en aplicaciones terapéuticas. El conector Whitlow de 18 residuos GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), fue descrita por primera vez por Whitlow et al. en 1993. Los péptidos descritos en el presente documento también pueden usarse como etiqueta peptídica. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende un polipéptido fusionado a un péptido (por ejemplo, un enlazador) descrito en el presente documento.
[0019]Los nuevos polipéptidos quiméricos descritos en el presente documento que comprenden una secuencia consenso BPXXXZ combinan atributos deseables (por ejemplo, flexibilidad e inmunogenicidad reducida) adecuados para su incorporación en proteínas de fusión útiles para la intervención terapéutica.
[0020]En un aspecto, la presente enseñanza proporciona un péptido que comprende 6-20 aminoácidos y una secuencia consenso BPXXXZ, en la que X es una glicina (G) o serina (S), B es un aminoácido cargado positivamente y Z es glicina (G) o un aminoácido cargado negativamente. En una realización, la presente enseñanza proporciona un péptido, en el que la secuencia consenso es KPGSGE (SEQ ID NO: 4). En otra realización, la secuencia consenso es GKPGSGE (SEQ ID NO: 5) o GKPGSGG (SEQ ID NO: 6).
[0021]En un aspecto, la presente enseñanza proporciona un péptido que comprende 6-20 aminoácidos y una secuencia consenso BPXXXZ, en donde X es una glicina (G) o serina (S), B es un aminoácido cargado positivamente y Z es glicina (G) o un aminoácido cargado negativamente, y en donde el péptido no es GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 13), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 14), o SGKPGSGE (SEQ ID NO: 15).
[0022]En un aspecto, la presente enseñanza proporciona un péptido que comprende 8-20 aminoácidos y una secuencia consenso XBPXXXZX, en donde cada X es independientemente una glicina (G) o serina (S), B es un aminoácido cargado positivamente y Z es glicina (G) o un aminoácido cargado negativamente y P es prolina.
[0023]En un aspecto, la presente enseñanza proporciona un péptido que comprende 8-20 aminoácidos y una secuencia consenso XBPXXXZX, en donde cada X es independientemente una glicina (G) o serina (S), B es un aminoácido cargado positivamente y Z es glicina (G) o un aminoácido cargado negativamente y P es prolina, y en el que el péptido no es GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 13), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 14), o SGKPGSGE (SEQ ID NO: 15).
[0024]En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un péptido que comprende 8-20 aminoácidos y una secuencia consenso XBPXXXZX, en donde cada X es independientemente una glicina (G) o serina (S), B es lisina (K) o arginina (R), y Z es glicina (G) o un aminoácido cargado negativamente, y P es prolina.
[0025]En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un péptido que comprende 8-20 aminoácidos y una secuencia consenso XBPXXXZX, en la que X es independientemente una glicina (G) o serina (S), B es lisina (K), y Z es glicina (G) o un aminoácido cargado negativamente, y P es prolina.
[0026]En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un péptido que comprende 8-20 aminoácidos y una secuencia consenso XBPXXXZX, en donde cada X es independientemente una glicina (G) o serina (S), B es un aminoácido cargado positivamente y Z es glicina (G) y P es prolina.
[0027]En algunas realizaciones, Z es un aminoácido cargado negativamente seleccionado de ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D). En algunas realizaciones, Z es ácido glutámico (E).
[0028]En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un péptido, en el que la secuencia consenso es GKPGSGE (SEQ ID NO: 5) o GKPG<s>G<g>(SEQ ID NO: 6). En algunas realizaciones, la secuencia consenso es GKPGSGE (SEQ ID NO: 5). En algunas realizaciones, el péptido comprende la secuencia consenso GSGKPGSGEGG (SEQ ID NO: 31).
[0029]En algunas realizaciones, el péptido comprende una o más repeticiones de la secuencia consenso. En algunas realizaciones, las repeticiones son contiguas. En algunas realizaciones, las repeticiones peptídicas están separadas por 1-4 aminoácidos. En algunas realizaciones, el péptido es xxxGKPGSGExxxGKPGSGExxx (SEQ ID NO: 3), donde X es una glicina (G) o serina (S).
[0030]En algunas realizaciones, el péptido no es GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 13), GKPGSGEG (SEQ ID NO: 14), o SGKPGSGE (SEQ ID NO: 15). En ciertas realizaciones, el péptido no es GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1). En ciertas realizaciones, el enlazador no es GSGKPGSGEG (SEQ ID NO: 13). En ciertas realizaciones, el péptido no es GKPGSGEG (SEQ ID NO: 14). En ciertas realizaciones, el péptido no es SGKPGSGE (SEQ ID NO: 15).
[0031]En algunas realizaciones, el péptido comprende 6-20 aminoácidos. En algunas realizaciones, el péptido comprende 10-20 aminoácidos. En algunas realizaciones, el péptido comprende 14-19 aminoácidos. En algunas realizaciones, el péptido comprende 15-17 aminoácidos. En algunas realizaciones, el péptido comprende 15-16 aminoácidos. En algunas realizaciones, el péptido comprende 16 aminoácidos.
[0032]En algunas realizaciones, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de GGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 7). En algunas realizaciones, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de GGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 8). En algunas realizaciones, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de GGGGSGKPGSGGGGS (SEQ ID NO: 9). En algunas realizaciones, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de GGGGSGKPGSGEGGS (SEQ ID NO: 10). En algunas realizaciones, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de GGGGSGKPGSGEGGGS (s Eq ID NO: 11). En algunas realizaciones, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de GGGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 12). En algunas realizaciones, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de STSGSGKPGSGEGST (SEQ ID NO: 17). En algunas realizaciones, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de GGGGSGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 18). En algunas realizaciones, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de GGGGGSGGGGSGGGGGGS (SEQ ID NO: 19). En algunas realizaciones, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de GGGGSGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 20).
[0033]En un aspecto, la presente enseñanza proporciona un péptido que comprende 8-20 aminoácidos y una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a una cualquiera de GGGSGKPGSGEGGGS (S<e>Q ID NO: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 8), GGGGSGKPGSGGGGS (SEQ ID NO: 9), GGGGSGKPGSGEGGS (SEQ ID NO: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 11), GGGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 12), STSGSGKPGSGEGST (SEQ ID NO: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 19), o GGGGSGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 20).
[0034]En algunas realizaciones, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a una cualquiera de GGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO:8), GGGGSGKPGSGGGGS (SEQ ID NO:9), GGGGSGKPGSGEGGS (SEQ ID NO: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 11), GGGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 12), STSGSGKPGSGEGST (SEQ ID NO: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 19), o GGGGSGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 20).
[0035]En un aspecto, la presente enseñanza proporciona un péptido que comprende 8-20 aminoácidos y una secuencia de aminoácidos que contiene al menos seis (6) aminoácidos idénticos de diez (10) aminoácidos contiguos encontrados en uno cualquiera de GGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 8), GGGGSGKPGSGGGGS (SEQ ID NO: 9), GGGGSGKPGSGEGGS (SEQ ID NO: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 11), GGGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 12), STSGSGKPGSGEGST (SEQ ID NO: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 19), o GGGGSGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 20).
[0036]En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del péptido contiene al menos siete (7), al menos ocho (8) o al menos nueve (9) aminoácidos idénticos de diez (10) aminoácidos contiguos encontrados en uno cualquiera de GGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 8), GGGGSGKPGSGGGGS (SEQ ID NO: 9), GGGGSGKPGSGEGGS (SEQ ID NO: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 11), GGGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 12), STSGSGKPGSGEGST (SEQ ID NO: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 19), o GGGGSGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 20).
[0037] En algunas realizaciones, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de GGGGSGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 19), o GGGGSGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 20).
[0038] En un aspecto, la presente enseñanza proporciona una proteína de fusión que comprende un primero polipéptido; un segundo polipéptido; y un enlazador peptídico como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, la proteína de fusión es una molécula de unión a antígeno. En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno es un scFv. En algunas realizaciones, el primer polipéptido es un dominio variable de cadena ligera y el segundo polipéptido es un dominio variable de cadena pesada. En algunas realizaciones, la proteína de fusión es un receptor de antígeno quimérico.
[0039] En un aspecto, la presente enseñanza proporciona un polinucleótido que codifica un péptido (por ejemplo, enlazador, etiqueta) como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica una proteína de fusión como se describe en el presente documento.
[0040] En un aspecto, la presente enseñanza proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un péptido (por ejemplo, un enlazador o proteína de fusión) como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona una célula recombinante que comprende un polinucleótido que codifica un péptido (por ejemplo, un enlazador o proteína de fusión) como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la célula recombinante comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un péptido (por ejemplo, un enlazador o proteína de fusión) como se describe en el presente documento.
[0041] Cualquier aspecto o realización descrita en el presente documento puede combinarse con cualquier otro aspecto o realización como se divulga en el presente documento. Si bien la presente enseñanza se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la presente enseñanza, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
[0042] La literatura científica y de patentes a la que se hace referencia en el presente documento establece el conocimiento que está disponible para los expertos en la técnica.
[0043] Otras características y ventajas de la enseñanza serán evidentes a partir de los dibujos y la siguiente descripción detallada, incluidos los ejemplos y las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO
[0044] Las características anteriores y posteriores se apreciarán más claramente a partir de la siguiente descripción detallada cuando se considere junto con los dibujos adjuntos. Los dibujos, sin embargo, son solo para fines ilustrativos, no para limitación.
La Figura 1 muestra un alineamiento de secuencias de aminoácidos de secuencias peptídicas ejemplares (por ejemplo, enlazadoras).
La Figura 2 muestra un gráfico de barras de los resultados de un experimento ELISA de mapeo de epítopos de péptidos que comprenden las SEQ ID N.° 1, 21-25, 1 y 26-30, respectivamente.
La Figura 3 muestra un gráfico de barras de los resultados de los perfiles de unión a anticuerpos de los enlazadores polipeptídicos que comprenden las SEQ ID Nos. 32, 9-11 y 17, respectivamente.
La Figura 4 es una serie de gráficos que muestran los resultados de experimentos de citometría de flujo realizados utilizando células que presentan un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende el péptido KL2 (SEQ ID NO: 10), KL3 (SEQ ID NO: 11), KL4 (SEQ ID NO: 7), KL5 (SEQ ID NO: 12), KL6 (SEQ ID NO: 8), y G4S2 (SEQ ID NO: 18).
DEFINICIONES
[0045] Para que la presente invención se entienda más fácilmente, a continuación, se definen en primer lugar ciertos términos. Definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos se establecen a lo largo de la especificación.
[0046] Como se usa en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el” incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
[0047] A menos que se indique específicamente o sea obvio a partir del contexto, como se usa en el presente documento, el término “o” se entiende que es inclusivo y abarca tanto “o” como “y”.
[0048]El término “y/o”, cuando se utilice en el presente documento, debe entenderse como divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por lo tanto, el término “y/o” tal como se usa en una frase como “A y/o B” en el presente documento pretende incluir A y B, A o B, A (solo) y B (solo). Asimismo, el término “y/o” tal como se utiliza en una frase como “A, B y/o C” pretende abarcar cada uno de los siguientes aspectos:
A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).
[0049]Los términos “por ejemplo” y “es decir”, tal como se utilizan en el presente documento, se utilizan meramente a modo de ejemplo, sin pretender limitación alguna, y no deben interpretarse en el sentido de que se refieren únicamente a los elementos enumerados explícitamente en la especificación.
[0050]Se entiende que los términos “o más”, “al menos”, “más de” y similares, por ejemplo, “al menos uno” incluyen, pero no se limitan a, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,
28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117,
118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141,
142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150, 200, 300, 400, 500, 600,700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 o más que el valor indicado. También se incluye cualquier número mayor o fracción intermedia.
[0051]Por el contrario, el término “no más de” incluye cada valor inferior al valor indicado. Por ejemplo, “no más de 100 nucleótidos” incluye 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75,
74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46 42, 41,40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, y 0 nucleótidos. También se incluye cualquier número menor o fracción intermedia.
[0052]Se entiende que los términos “pluralidad”, “al menos dos”, “dos o más”, “al menos segundo” y similares incluyen, entre otros, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,
31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62,
63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94,
95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119,
120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143,
144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 o más. También se incluye cualquier mayor número o fracción intermedia.
[0053]A lo largo de la especificación, se entenderá que la palabra “que comprende” o variaciones como “comprende” o
“que comprende” implican la inclusión de un elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas. Se entiende que siempre que se describan aspectos en el presente documento con el lenguaje “que comprende”, también se proporcionan aspectos análogos descritos en términos de “que consiste en” y/o “que consiste esencialmente en”.
[0054]A menos que se indique específicamente o sea evidente a partir del contexto, como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” se refiere a un valor o composición que está dentro de un intervalo de error aceptable para el determinado valor o composición determinada por un experto en la técnica, que dependerá en parte de cómo se mida o determine el valor o composición, es decir, las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "alrededor de" o "que comprende esencialmente de" puede significar dentro de una o más de una desviación estándar por la práctica en la técnica. «Aproximadamente» o «que comprende esencialmente» puede significar un intervalo de hasta el 10 % (es decir, ±10 %). Por lo tanto, “aproximadamente” puede entenderse como dentro de un 10%, 9%, 8%,
7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05%, 0,01% o 0,001% mayor o menor que el valor establecido. Por ejemplo, aproximadamente 5 mg pueden incluir cualquier cantidad entre 4,5 mg y 5,5 mg. Además, en particular con respecto a los sistemas o procesos biológicos, los términos pueden significar hasta un orden de magnitud o hasta cinco veces un valor. Cuando se proporcionen valores o composiciones particulares en la presente divulgación, a menos que se indique lo contrario, debe suponerse que el significado de «aproximadamente» o «que comprende esencialmente» está dentro de un intervalo de error aceptable para ese valor o composición particular.
[0055]Como se describe en el presente documento, debe entenderse que cualquier intervalo de concentración, intervalo porcentual, intervalo de relaciones o intervalo de números enteros incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo mencionado y, cuando proceda, fracciones del mismo (como una décima y una centésima parte de un número entero), a menos que se indique lo contrario.
[0056]Las unidades, prefijos y símbolos utilizados en este documento se proporcionan utilizando su forma aceptada Systéme International de Unites (SI). Los rangos numéricos incluyen los números que definen el rango.
[0057]A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que se relaciona esta divulgación. Por ejemplo, Juo, “The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology”, 2a ed., (2001), CRC Press; “The Dictionary
of Cell & Molecular Biology”, 5a ed., (2013), Academic Press; y “The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology”, Cammack et al. eds., 2a ed., (2006), Oxford University Press, proporcionan a los expertos en la técnica un diccionario general para muchos de los términos utilizados en esta divulgación.
[0058]“Administrar” se refiere a la introducción física de un agente en un sujeto, utilizando cualquiera de los diversos métodos y sistemas de administración conocidos por los expertos en la técnica. Las vías de administración ejemplares para las formulaciones descritas en el presente documento incluyen intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, espinal u otras vías parenterales de administración, por ejemplo, por inyección o perfusión. La expresión “administración parenteral”, tal como se usa en el presente documento, significa modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, generalmente por inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal, así como electroporación in vivo. En algunas realizaciones, la formulación se administra por vía no parenteral, por ejemplo, por vía oral. Otras vías no parenterales incluyen una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, intranasal, vaginal, rectal, sublingual o tópica. La administración también puede realizarse, por ejemplo, una vez, una pluralidad de veces y/o durante uno o más períodos prolongados.
[0059]Como se usa en el presente documento, una molécula de unión a antígeno, un anticuerpo o una molécula de unión a antígeno del mismo "compite" con un anticuerpo de referencia o una molécula de unión a antígeno del mismo si la interacción entre un antígeno y la primera molécula de unión, un anticuerpo o una molécula de unión a antígeno del mismo bloquea, limita, inhibe o reduce de otro modo la capacidad de la molécula de unión de referencia, anticuerpo de referencia o una molécula de unión a antígeno del mismo para interactuar con el antígeno. La competición cruzada puede ser completa, por ejemplo, la unión de la molécula de unión al antígeno bloquea completamente la capacidad de la molécula de unión de referencia para unirse al antígeno, o puede ser parcial, por ejemplo, la unión de la molécula de unión al antígeno reduce la capacidad de la molécula de unión de referencia para unirse al antígeno. En ciertas realizaciones, una molécula de unión a antígeno que compite de forma cruzada con una molécula de unión a antígeno de referencia se une al mismo epítopo o a un epítopo solapante que la molécula de unión a antígeno de referencia. En otras realizaciones, la molécula de unión a antígeno que compite de forma cruzada con una molécula de unión a antígeno de referencia se une a un epítopo diferente como molécula de unión a antígeno de referencia. Pueden usarse numerosos tipos de ensayos de unión competitiva para determinar si una molécula de unión a antígeno compite con otra, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto (RIA) en fase sólida; inmunoensayo enzimático directo o indirecto (EIA) en fase sólida; ensayo de competición en sándwich (Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619); ensayo marcado directo en fase sólida, ensayo sándwich marcado directo en fase sólida (Harlow y Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA marcador directo en fase sólida usando marcador 1-125 (Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15), EIA de biotina-avidina directa en fase sólida (Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552), y RIA marcado directamente (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82).
[0060]Un “antígeno” se refiere a cualquier molécula que provoca una respuesta inmune o es capaz de unirse a un anticuerpo o una molécula de unión a antígeno. La respuesta inmune puede implicar la producción de anticuerpos o la activación de células inmunológicamente competentes específicas, o ambas. Un experto en la técnica entendería fácilmente que cualquier macromolécula, incluyendo prácticamente todas las proteínas o péptidos, podría servir como antígeno. Un antígeno puede expresarse endógenamente, es decir, expresarse por ADN genómico, o puede expresarse recombinantemente. Un antígeno puede ser específico para un determinado tejido, como una célula cancerosa, o puede expresarse ampliamente. Además, fragmentos de moléculas más grandes pueden actuar como antígenos. En una realización, los antígenos son antígenos tumorales.
[0061]El término “alogénico” se refiere a cualquier material derivado de un individuo, que luego se introduce a otro individuo de la misma especie, por ejemplo, trasplante alogénico de células T.
[0062]Los términos “transducción” y “transducido” se refieren al proceso mediante el cual se introduce ADN extraño en una célula a través de un vector viral (véase Jones et al., “Genetics: principles and analysis”, Boston: Jones & Bartlett Publ. (1998)). En algunas realizaciones, el vector es un vector retroviral, un vector de ADN, un vector de ARN, un vector adenoviral, un vector baculoviral, un vector viral de Epstein Barr, un vector papovaviral, un vector viral vaccinia, un vector viral del herpes simple, un vector asociado a adenovirus, un vector lentiviral o cualquier combinación de los mismos.
[0063]Un “cáncer” se refiere a un amplio grupo de diversas enfermedades caracterizadas por el crecimiento incontrolado de células anormales en el cuerpo. La división y el crecimiento celular no regulados resultan en la formación de tumores malignos que invaden los tejidos vecinos y pueden hacer metástasis en partes distantes del cuerpo a través del sistema linfático o el torrente sanguíneo. Un “cáncer” o “tejido canceroso” puede incluir un tumor. Ejemplos de cánceres que pueden tratarse mediante los métodos de la presente enseñanza incluyen, pero no se limitan a, cánceres del sistema inmunitario, incluyendo linfoma, leucemia, mieloma y otras neoplasias leucocitarias. En algunas realizaciones, los métodos de la presente enseñanza pueden usarse para reducir el tamaño tumoral de un tumor derivado de, por ejemplo, cáncer óseo, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma mediastínico primario de células B grandes (PMBC), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma folicular (FL), linfoma folicular transformado, linfoma de la zona marginal esplénica (SMZL), cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del pene, leucemia crónica o aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda (ALL) (incluyendo ALL de células T), leucemia linfocítica crónica (CLL), tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de vejiga, cáncer del riñón o uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasia del sistema nervioso central (CNS), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de células T, cáncer ambientalmente inducido incluyendo los inducidos por amianto, otras células malignas y dichas combinaciones de cánceres. En una realización particular, el cáncer es mieloma múltiple. El cáncer en particular puede ser sensible a la quimioterapia o radioterapia o el cáncer puede ser refractario. Un cáncer refractario se refiere a un cáncer que no es susceptible de intervención quirúrgica y el cáncer no responde inicialmente a la quimioterapia o a la radioterapia o el cáncer deja de responder con el tiempo.
[0064]Un “efecto antitumoral” como se usa en el presente documento, se refiere a un efecto biológico que puede presentarse como una disminución en el volumen tumoral, una disminución en el número de células tumorales, una disminución en la proliferación de células tumorales, una disminución en el número de metástasis, un aumento en la supervivencia general o libre de progresión, un aumento en la esperanza de vida o mejora de varios síntomas fisiológicos asociados con el tumor. Un efecto antitumoral también puede referirse a la prevención de la aparición de un tumor, por ejemplo, una vacuna.
[0065]Una “citoquina”, como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína no anticuerpo que es liberada por una célula en respuesta al contacto con un antígeno específico, en donde la citoquina interactúa con una segunda célula para mediar una respuesta en la segunda célula. Una citoquina puede ser expresada endógenamente por una célula o administrada a un sujeto. Las citoquinas pueden ser liberadas por las células inmunes, incluyendo macrófagos, células B, células T y mastocitos para propagar una respuesta inmune. Las citoquinas pueden inducir diversas respuestas en la célula receptora. Las citoquinas pueden incluir citoquinas homeostáticas, quimioquinas, citoquinas proinflamatorias, efectoras y proteínas de fase aguda. Por ejemplo, citocinas homeostáticas, incluidas la interleucina (IL) 7 y la IL-15, promueven la supervivencia y proliferación de las células inmunes, y las citocinas proinflamatorias pueden promover una respuesta inflamatoria. Ejemplos de citoquinas homeostáticas incluyen, pero no se limitan a, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-15 e interferón (IFN) gamma. Ejemplos de citoquinas proinflamatorias incluyen, pero no se limitan a, IL-1 a, IL-1 b, IL-6, IL-13, IL-17a, factor de necrosis tumoral (TNF)-alfa, TNF-beta, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 2, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), molécula de adhesión intercelular soluble 1 (sICAM-1), molécula de adhesión vascular soluble 1 (sVCAM-1), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), VEGF-C, VEGF-D y factor de crecimiento placentario (PLGF). Ejemplos de efectores incluyen, pero no se limitan a, granzima A, granzima B, ligando Fas soluble (sFasL) y perforina. Ejemplos de proteínas de fase aguda incluyen, pero no se limitan a, proteína C reactiva (CRP) y amiloide A sérico (SAA).
[0066]Las 'quimiocinas' son un tipo de citocina que media la quimiotaxis celular, o movimiento direccional. Ejemplos de quimiocinas incluyen, pero no se limitan a, IL-8, IL-16, eotaxina, eotaxina-3, quimiocina derivada de macrófagos (MDC o CCL22), proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1 o CCL2), MCP-4, proteína inflamatoria de macrófagos la (MIP-1a, MIP-1a), MIP-1p (MIP-1b), proteína gamma inducida 10 (IP-10), y quimiocina regulada por timo y activación (TARC o CCL17).
[0067]Una “cantidad terapéuticamente eficaz”, “dosis eficaz”, “cantidad eficaz” o “dosificación terapéuticamente eficaz” de un agente terapéutico, por ejemplo, células T CAR modificadas genéticamente, es cualquier cantidad que, cuando se usa sola o en combinación con otro agente terapéutico, protege a un sujeto contra la aparición de una enfermedad o promueve la regresión de la enfermedad evidenciada por una disminución en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos libres de síntomas de la enfermedad o una prevención de deterioro o discapacidad debido a la aflicción de la enfermedad. La capacidad de un agente terapéutico para promover la regresión de la enfermedad puede evaluarse utilizando una variedad de métodos conocidos por el profesional experto, como en sujetos humanos durante ensayos clínicos, en sistemas de modelos animales predictivos de la eficacia en seres humanos o analizando la actividad del agente en ensayos in vitro.
[0068]El término “linfocitos” como se usa en el presente documento incluye linfocitos citolíticos naturales (NK), linfocitos T o linfocitos B. Las células NK son un tipo de linfocitos citotóxicos (tóxicos componente del sistema inmunológico inherente. Las células NK rechazan tumores y células infectadas por virus. Funciona a través del proceso de apoptosis o muerte celular programada. Fueron llamados “asesinos naturales” porque no requieren activación para matar células. Las células T desempeñan un papel importante en la inmunidad mediada por células (sin participación de anticuerpos). Sus receptores de células T (TCR) se diferencian de otros tipos de linfocitos. El timo, un órgano especializado del sistema inmunológico, es el principal responsable de la maduración de las células T. Existen seis tipos de células T, a saber: Las células T auxiliares (por ejemplo, células CD4+), las células T citotóxicas (también conocidas como TC, linfocitos T citotóxicos, CTL, células T asesinas, células T citolíticas, células T CD8+ o células T asesinas), las células T de memoria (i) las células TSCM de memoria madre, como las células vírgenes, son CD45RO, CCR7+, CD45RA+, CD62L+ (L-selectina), CD27+, CD28+ e IL-7Ra+, pero también expresan grandes cantidades de CD95, IL-2R0, CXCR3 y LFA-1, y muestran numerosos atributos funcionales distintivos de las células de memoria); (ii) las células TCM de memoria central expresan L-selectina y CCR7, secretan IL-2, pero no IFN<y>o IL-4, y (iii) las células TEM de memoria efectora, sin embargo, no expresan L-selectina o CCR7 sino que producen citocinas efectoras como IFNy e IL-4), las células T reguladoras (Treg, células T supresoras o células T reguladoras CD4+CD25+), las células T asesinas naturales (NKT) y las células T delta gamma. Las células B, por otro lado, desempeñan un papel principal en la inmunidad humoral (con implicación de anticuerpos). Fabrican anticuerpos y antígenos, desempeñan el papel de células presentadoras de antígenos (APC) y se convierten en células B de memoria después de la activación por interacción de antígenos. En los mamíferos, las células B inmaduras se forman en la médula ósea.
[0069]El término «manipulado genéticamente», «manipulado genéticamente» o «modificado» se refiere a un método para modificar una célula, que incluye, pero no se limita a, crear una deficiencia en un gen mediante la deleción de una región codificante o no codificante o una porción de la misma o mediante tecnología antisentido, o aumentar la expresión de una proteína que introduce una región codificante o una porción de la misma. En algunas realizaciones, la célula que se modifica es una célula madre (por ejemplo, célula madre hematopoyética (HSC), célula madre embrionaria (ES), célula madre pluripotente inducida (iPS), linfocito (por ejemplo, una célula T), que puede obtenerse de un paciente o un donante. La célula puede modificarse para expresar una construcción exógena, tal como, por ejemplo, una proteína alfa pre-TCR, un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR), que puede incorporarse en el genoma de la célula.
[0070]Una “respuesta inmune” se refiere a la acción de una célula del sistema inmune (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B, células asesinas naturales (NK), macrófagos, eosinófilos, mastocitos, células o el hígado (incluidos los Ac, las citoquinas y el complemento) que da como resultado el direccionamiento selectivo, la unión, el daño, la destrucción y/o la eliminación del cuerpo de un vertebrado de patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas u otras células anormales o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.
[0071]El término “inmunoterapia” se refiere al tratamiento de un sujeto que padece o está en riesgo de contraer o sufrir una recurrencia de una enfermedad mediante un método que comprende inducir, mejorar, suprimir o modificar de otro modo una respuesta inmune. Ejemplos de inmunoterapia incluyen, pero no se limitan a, terapias de células T. La terapia con células T puede incluir terapia con células T adoptivas, inmunoterapia con linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), terapia con células autólogas, terapia con células autólogas diseñadas (eACTTM) y trasplante alogénico de células T. Sin embargo, un experto en la técnica reconocería que los métodos de acondicionamiento descritos en el presente documento mejorarían la eficacia de cualquier terapia de células T trasplantadas. Ejemplos de terapias de células T se describen en la Pub. de patente estadounidense n.° 2014/0154228 y 2002/0006409, patente estadounidense n.° 5.728.388 y Publicación Internacional n.° WO 2008/081035.
[0072]Las células T de la inmunoterapia pueden provenir de cualquier fuente conocida en la técnica. Por ejemplo, las células T pueden diferenciarse in vitro de una población de células madre hematopoyéticas; las células madre pluripotentes inducidas (iPS), las células madre embrionarias (ES) o las células T pueden obtenerse de un sujeto. Las células T pueden obtenerse de, por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (CMSP), médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. Además, las células T pueden derivarse de una o más líneas de células T disponibles en la técnica. Las células T también se pueden obtener de una unidad de sangre extraída de un sujeto usando cualquier número de técnicas conocidas por el experto en la técnica, como la separación y/o aféresis de FICOLLTM. Métodos adicionales para aislar células T para una terapia de células T se describen en la publicación de patente estadounidense n.° 2013/0287748.
[0073]El término “terapia celular autóloga diseñada”, que puede abreviarse como “eACTTM”, también conocido como transferencia celular adoptiva, es un proceso mediante el cual las propias células T de un paciente se recolectan y posteriormente se alteran genéticamente para reconocer y dirigirse a uno o más antígenos expresados en la superficie celular de una o más células tumorales o neoplasias específicas. Un “paciente” como se usa en el presente documento incluye a cualquier ser humano que padece un cáncer (por ejemplo, un linfoma o una leucemia). Los términos “sujeto” y “paciente” se utilizan aquí indistintamente.
[0074]Como se usa en el presente documento, el término “célula in vitro” se refiere a cualquier célula que se cultiva ex vivo. En particular, una célula in vitro puede incluir una célula T.
[0075]Los términos «péptido», «polipéptido» y «proteína» se usan indistintamente y se refieren a un compuesto por residuos de aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. Una proteína o péptido contiene al menos dos aminoácidos, y no se pone ninguna limitación en el número máximo de aminoácidos que pueden comprender una secuencia de proteína o péptido. Como se usa en el presente documento, los péptidos de la presente enseñanza pueden funcionar como un enlazador (por ejemplo, uniendo dos péptidos o polipéptidos). Como se usa en el presente documento, los péptidos de la presente enseñanza pueden funcionar como un biomarcador o etiqueta. Los términos, péptido, etiqueta o enlazador se usan indistintamente. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Como se usa en el presente documento, el término se refiere tanto a cadenas cortas, que también se denominan comúnmente en la técnica péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, que generalmente se denominan en la técnica proteínas, de las que hay muchos tipos. Los "polipéptidos" incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos o una combinación de los mismos.
[0076]“Estimulación”, como se usa en el presente documento, se refiere a una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimuladora con su ligando afín, en donde la unión media un evento de transducción de señales. Una "molécula estimulante" es una molécula en una célula T, por ejemplo, el complejo receptor de células T (TCR) / CD3, que se une específicamente con un ligando estimulante afín presente en una célula presente en antígeno. Un “ligando estimulante” es un ligando que cuando está presente en una célula presentadora de antígeno (por ejemplo, una APC, una célula dendrítica, una célula B y similares) puede unirse específicamente con una molécula estimulante en una célula T, mediando así una respuesta primaria por la célula T, incluyendo, pero no limitado a, activación, inicio de una respuesta inmune, proliferación y similares. Los ligandos estimulantes incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo anti-CD3, una molécula MHC Clase I cargada con un péptido, un anticuerpo anti-CD2 superagonista y un anticuerpo anti-CD28 superagonista.
[0077]Una “señal coestimuladora”, como se usa en el presente documento, se refiere a una señal, que, en combinación con una señal primaria, como la ligadura de TCR/CD3, conduce a una respuesta de células T, como, pero no limitada a, proliferación y/o regulación positiva o regulación negativa de moléculas clave.
[0078]Un “ligando coestimulador” como se usa en el presente documento, incluye una molécula en una célula presentadora de antígeno que se une específicamente a una molécula coestimuladora afín en una célula T. La unión del ligando coestimulador proporciona una señal que media una respuesta de células T, incluyendo, pero sin limitarse a, proliferación, activación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador induce una señal que se suma a la señal primaria proporcionada por una molécula estimulante, por ejemplo, mediante la unión de un complejo receptor de células T (TCR)/CD3 con una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) cargada con péptido. Un ligando coestimulador puede incluir, pero no se limita a, 3/TR6, ligando 4-1BB, agonista o anticuerpo que se une al receptor del ligando Toll , B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), ligando CD30, CD40, CD7, CD70, CD83, mediador de entrada del virus del herpes (HVEM), antígeno leucocitario humano G (HLA-G), ILT4, transcrito similar a inmunoglobulina (ILT) 3, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM), ligando que se une específicamente con B7-H3, receptor de linfotoxina beta, proteína A relacionada con la cadena del MHC clase I (MICA), proteína B relacionada con la cadena del MHC clase I (MICB), ligando 0X40, PD-L2, o LI de muerte programada (PD). Un ligando coestimulador incluye, sin limitación, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula coestimuladora presente en una célula T, tal como, pero sin limitación, 4-1BB, B7-H3, CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, CD7, ICOS, ligando que se une específicamente con CD83, antígeno-1 asociado a la función linfocitaria (LFA-1), receptor C de células asesinas naturales (NKG2C), 0X40, PD-1 o miembro 14 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNFSF14 o LIGHT).
[0079]Una “molécula coestimuladora” es un compañero de unión afín en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando así una respuesta coestimuladora por la célula T, tal como, pero no limitado a, la proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limitan a, Una "molécula coestimuladora" es un compañero de unión afín en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando así una respuesta coestimuladora por la célula T, tal como, pero no limitada a, proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limitan a, 4-1BB/CD137, B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD 33, CD 45, CD100 (SEMA4D), CD103, CD134, CD137, CD154, CD16, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD22, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3 (alfa; beta; delta; épsilon; gamma; zeta ), CD30, CD37, CD4, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD5, CD64, CD69, CD7, CD80, ligando de CD83, CD84, CD86, CD8alfa, CD8beta, CD9, CD96 (táctil), CDl-la, CDl-lb, CDl-lc, CDl-ld, CDS, CEACAM1, CRT AM, DAP-10, DNAM1 (CD226), receptor Fc gamma, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, ICAM-1, ICOS, Ig alfa (CD79a), IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, integrina, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, LFA-1, LIGHT, LIGHT (miembro 14 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral; TNFSF14), LTBR, Ly9 (CD229), antígeno-1 asociado a la función de linfocitos (LFA-1 (CD1la/CD18), molécula MHC de clase I, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), 0X40, PAG/Cbp, PD-1, PSGL1, SELPLG (CD162), molécula de activación linfocítica de señalización, SLAM (SLA1MF; 150; IPO-3), SLAMF4 (244B4); SLAB4 (244B4); TRLAB4 (SLAB4); TNF-676R, TNF-676R, o fragmentos o combinaciones de los mismos.
[0080]Los términos “reducir” y “disminuir” se usan indistintamente en el presente documento, e indican cualquier cambio que sea menor que el original. “Reducir” y “disminuir” son términos relativos, que requieren una comparación entre las mediciones anteriores y posteriores. “Reducir” y “disminuir” incluyen agotamientos completos.
[0081]“Tratamiento” o “tratar” a un sujeto se refiere a cualquier tipo de intervención o proceso realizado en el sujeto, o la administración de un agente activo al mismo, con el objetivo de revertir, aliviar, mejorar, inhibir, ralentizar o prevenir la aparición, progresión, desarrollo, gravedad o recurrencia de un síntoma, complicación o afección, o indicios bioquímicos asociados con una enfermedad. En una realización, "tratamiento" o "tratar" incluye una remisión parcial. En otra realización, "tratamiento" o "tratar" incluye una remisión completa.
[0082]Para calcular el porcentaje de identidad, las secuencias que se comparan generalmente se alinean de una manera que proporcione la mayor coincidencia entre las secuencias. Un ejemplo de programa informático que se puede utilizar para determinar el porcentaje de identidad es el paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Res. ácida 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.). El algoritmo informático GAP se utiliza para alinear los dos polipéptidos o polinucleótidos para los que se va a determinar el porcentaje de identidad de secuencia. Las secuencias se alinean para el apareamiento óptimo de su aminoácido o nucleótido respectivo (el “ intervalo coincidente”, según lo determinado por el algoritmo.) En ciertas realizaciones, una matriz de comparación estándar (véase, Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62) también es utilizado por el algoritmo.
[0083]Varios aspectos de la enseñanza se describen con más detalle en las siguientes subsecciones.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0084]Las composiciones se describen en el presente documento que proporcionan un medio para hacer (por ejemplo, diseñar, diseñar) polipéptidos quiméricos o de fusión. Una secuencia peptídica (por ejemplo, enlazador) como se describe en el presente documento permite la expresión, plegamiento y actividad apropiados de una proteína de fusión. La presente enseñanza proporciona, entre otras cosas, nuevos polipéptidos (por ejemplo, conectores) y proteínas de fusión que comprenden los mismos. En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona composiciones de polinucleótidos que codifican un péptido (por ejemplo, enlazador, etiqueta) o proteína de fusión descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un vector de expresión que comprende el polinucleótido que codifica un péptido (por ejemplo, enlazador, etiqueta) o proteína de fusión. En otras realizaciones, la presente enseñanza proporciona una célula que comprende el polinucleótido y/o el vector de expresión que codifica un péptido (por ejemplo, enlazador, etiqueta) o proteína de fusión. En el presente documento se describen composiciones novedosas que comprenden enlazadores peptídicos, composiciones polipeptídicas que comprenden polipéptidos unidos por los enlazadores peptídicos y polinucleótidos, vectores, células y composiciones farmacéuticas relacionados. En algunas realizaciones, el péptido (por ejemplo, enlazador, etiqueta) se fusiona a uno o más polipéptidos. Las secuencias enlazadoras descritas unen operativamente dos péptidos/polipéptidos de interés de manera que la expresión y actividad (por ejemplo, unión a antígeno) de los polipéptidos conectados por los enlazadores son duraderas y óptimas. El conector peptídico o etiqueta puede fusionarse en el extremo C-terminal, N-terminal o en cualquier lugar dentro del polipéptido para lograr la función deseada.
Conectores peptídicos
[0085]Los nuevos enlazadores polipeptídicos quiméricos descritos en el presente documento que comprenden una secuencia consenso XYPXXXZX combinan atributos deseables adecuados para su incorporación en proteínas de fusión útiles para la intervención terapéutica. En un aspecto, la presente enseñanza proporciona un enlazador que comprende 8-20 aminoácidos y una secuencia consenso XYPXXXZX, en la que X es una glicina (G) o serina (S), B es un aminoácido cargado positivamente y Z es glicina (G) o un aminoácido cargado negativamente. Los inventores han descubierto que tanto el espaciado como la carga de los residuos de aminoácidos en la secuencia consenso contribuyen a la funcionalidad del enlazador además del reconocimiento de anticuerpos de la secuencia enlazadora.
[0086]En un aspecto, la presente enseñanza proporciona un enlazador que comprende 6-20 aminoácidos y una secuencia consenso BPXXXZ, en la que X es una glicina (G) o serina (S), B es lisina (K) o arginina (R), y Z es glicina (G) o un aminoácido cargado negativamente, y P es prolina.
[0087]En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un enlazador que comprende 8-20 aminoácidos y una secuencia consenso XBPXXXZX, en la que X es una glicina (G) o serina (S), B es lisina (K) o arginina (R), y Z es glicina (G) o un aminoácido cargado negativamente, y P es prolina.
[0088]En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un enlazador que comprende 8-20 aminoácidos y una secuencia consenso XBPXXXZX, en la que X es una glicina (G) o serina (S), B es lisina (K), y Z es glicina (G) o un aminoácido cargado negativamente, y P es prolina.
[0089]En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un enlazador que comprende 8-20 aminoácidos y una secuencia consenso XBPXXXZX, en la que X es una glicina (G) o serina (S), B es un aminoácido cargado positivamente y Z es glicina (G) y P es prolina.
[0090]En algunas realizaciones, Z es un aminoácido cargado negativamente seleccionado de ácido glutámico (E) o ácido aspártico (D). En algunas realizaciones, Z es ácido glutámico (E).
[0091]En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un enlazador, en el que la secuencia consenso es GKPGSGE (SEQ ID NO: 5) o GKPGSGG (SEQ ID NO: 6). En algunas realizaciones, la secuencia consenso es GKPGSGE (SEQ ID NO: 5).
[0092]En algunas realizaciones, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de GGGGSGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 18).
[0093]La secuencia peptídica enlazadora puede ser de cualquier longitud apropiada para conectar una o más proteínas de interés y preferiblemente está diseñada para ser lo suficientemente flexible como para permitir el plegamiento apropiado y/o la función y/o actividad de uno o ambos péptidos que conecta. Así, el péptido enlazador puede tener una longitud de no más de 10, no más de 11, no más de 12, no más de 13, no más de 14, no más de 15, no más de 16, no más de 17, no más de 18, no más de 19 o no más de 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, el péptido enlazador puede tener una longitud de al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, el enlazador comprende al menos 7 y no más de 20 aminoácidos, al menos 7 y no más de 19 aminoácidos, al menos 7 y no más de 18 aminoácidos, al menos 7 y no más de 17 aminoácidos, al menos 7 y no más de 16 aminoácidos, al menos 7 y no más de 15 aminoácidos, al menos 7 y no más de 14 aminoácidos, al menos 7 y no más de 13 aminoácidos, al menos 7 y no más de 12 aminoácidos o al menos 7 y no más de 11 aminoácidos. En ciertas realizaciones, el enlazador comprende 15-17 aminoácidos, y en realizaciones particulares, comprende 16 aminoácidos. En algunas realizaciones, el enlazador comprende 10-20 aminoácidos. En algunas realizaciones, el enlazador comprende 14-19 aminoácidos. En algunas realizaciones, el enlazador comprende 15-17 aminoácidos. En algunas realizaciones, el enlazador comprende 15-16 aminoácidos. En algunas realizaciones, el enlazador comprende 16 aminoácidos. En algunas realizaciones, el enlazador comprende 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos.
[0094]Como se usa en el presente documento, una «sustitución conservadora de aminoácidos» es aquella en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas o positivamente cargadas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas o negativamente cargadas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales betaramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). En ciertas realizaciones, uno o más residuos de aminoácidos dentro de un enlazador polipeptídico, proteína de fusión, CDR(s) o dentro de una región marco de un anticuerpo o molécula de unión a antígeno proporcionados en el presente documento (o fragmento del mismo) pueden reemplazarse con un residuo de aminoácido con una cadena lateral similar.
[0095]Las sustituciones conservadoras de aminoácidos, que están abarcadas por la presente divulgación, pueden abarcar residuos de aminoácidos de origen no natural, que son típicamente incorporados por síntesis química de péptidos más que por síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas inversas o invertidas de restos de aminoácidos. Los residuos naturales pueden dividirse en clases según las propiedades comunes de la cadena lateral:
hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, Ile;
hidrófilo neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
ácido (cargado negativamente): Asp, Glu;
básico (cargado negativamente): His, Lys, Arg;
residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y
aromático: Trp, Tyr, Phe.
[0096]Las sustituciones no conservadoras pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Tales residuos sustituidos pueden introducirse, por ejemplo, en regiones de un anticuerpo humano que son homólogas con anticuerpos no humanos, o en las regiones no homólogas de la molécula. Ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoácidos se presentan en la Tabla A en seguida.
Tabla A
[0097]En algunas realizaciones, el enlazador comprende una secuencia de aminoácidos de GGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 7). En algunas realizaciones, el enlazador comprende una secuencia de aminoácidos de GGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 8). En algunas realizaciones, el enlazador comprende una secuencia de aminoácidos de GGGGSGKPGSGGGGS (SEQ ID NO: 9). En algunas realizaciones, el enlazador comprende una secuencia de aminoácidos de GGGGSGKPGSGEGGS (SEQ ID NO: 10). En algunas realizaciones, el enlazador comprende una secuencia de aminoácidos de GGGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 11). En algunas realizaciones, el enlazador comprende una secuencia de aminoácidos de GGGGSGKPGSGEGGGGS (S<e>Q ID NO: 12). En algunas realizaciones, el enlazador comprende una secuencia de aminoácidos de STSGSGKPGSGEGST (SEQ ID NO: 17). En algunas realizaciones, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de GGGGSGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 18). En algunas realizaciones, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de GGGGGSGGGGSGGGGGGS (SEQ ID NO: 19). En algunas realizaciones, el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de GGGGSGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 20).
[0098]En un aspecto, la presente enseñanza proporciona un enlazador que comprende 6-20 aminoácidos y una secuencia de aminoácidos al menos 80% , 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a cualquiera de GGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO:8), GGGGSGKPGSGGGGS (SEQ ID NO: 9), GGGGSGKPGSGEGGS (SEQ ID NO: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 11), GGGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 12), STSGSGKPGSGEGST (SEQ ID NO: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 19) o GGGGSGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 20).
[0099]En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del enlazador contiene al menos cinco (5), seis (6), siete (7), ocho (8) o al menos nueve (9) aminoácidos idénticos de diez (10) aminoácidos contiguos encontrados en uno cualquiera de GGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 8), GGGGSGKPGSGGGGS (SEQ ID NO: 9), GGGGSGKPGSGEGGS (SEQ ID NO: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 11), GGGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 12), STSGSGKPGSGEGST (SEQ ID NO: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 18), o GGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 19) o GGGGSGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 20).
[0100]En un aspecto, la presente enseñanza proporciona un enlazador que comprende 8-20 aminoácidos y una secuencia de aminoácidos que contiene al menos seis (6) aminoácidos idénticos de diez (10) aminoácidos contiguos encontrados en uno cualquiera de GGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 8), GGGGSGKPGSGGGGS (SEQ ID NO: 9), GGGGSGKPGSGEGGS (SEQ ID NO: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 11), GGGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 12), STSGSGKPGSGEGST (SEQ ID NO: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 19) o GGGGSGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 20).
[0101]En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del enlazador contiene al menos siete (7), al menos ocho (8) o al menos nueve (9) aminoácidos idénticos de diez (10) aminoácidos contiguos encontrados en uno cualquiera de GGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 8), GGGGSGKPGSGGGGS (SEQ ID NO: 9), GGGGSGKPGSGEGGS (SEQ ID NO: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 11), o GGGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 12), STSGSGKPGSGEGST (SEQ ID NO: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 19) o GGGGSGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 20).
Proteína de fusión
[0102]En un aspecto, la presente enseñanza proporciona una proteína de fusión que comprende un primer polipéptido; un segundo polipéptido; y un conector como se describe en el presente documento. La composición polipeptídica y los polinucleótidos que codifican las composiciones polipeptídicas se describen en el presente documento, en los que las composiciones polipeptídicas comprenden un primer y segundo péptido/polipéptido, conectados por una secuencia enlazadora descrita en el presente documento. Los inventores han encontrado sorprendentemente que un enlazador de acuerdo con la presente enseñanza proporciona flexibilidad óptima del primer y segundo péptido y longitud para evitar el impedimento estérico y permitir el plegamiento correcto.
[0103]Las composiciones polipeptídicas producidas de esta manera se refieren comúnmente a una proteína/polipéptidos de fusión o quiméricos y normalmente se producen mediante la expresión (por ejemplo, transcripción, traducción) de secuencias de ácido nucleico que codifican las composiciones polipeptídicas, en el sistema apropiado. Los medios para preparar polipéptidos de fusión y/o quiméricos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, 1992) Nueva York).
[0104]En las composiciones polipeptídicas descritas en el presente documento, los dos polipéptidos (por ejemplo, un primer polipéptido y un segundo polipéptido) pueden unirse de forma recombinante mediante cualquiera de los polipéptidos conectores descritos anteriormente, con el conector dispuesto entre los dos polipéptidos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los polipéptidos o composiciones comprenden un primer y un segundo polipéptido unidos de forma recombinante por un conector que comprende GGGSGKPGSGEGGGS (SEQ iD NO: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 8), GGGGSGKPGSGGGGS (SEQ ID NO: 9), GGGGSGKPGSGEGGS (SEQ ID NO: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 11), GGGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 12), STSGSGKPGSGEGST (SEQ ID NO: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 19) o GGGGSGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 20). Los dos polipéptidos pueden ser cualquier secuencia de aminoácidos incluyendo proteínas de longitud completa, fragmentos o porciones de proteínas, fragmentos o porciones de proteínas funcionales, dominios de proteínas funcionales y similares, de dos proteínas diferentes o la misma proteína.
[0105]Como se usa en el presente documento, el término “polipéptido” o “péptido” se refiere a un polímero de residuos de aminoácidos típicamente unidos exclusivamente por enlaces peptídicos, que pueden producirse naturalmente (por ejemplo, aislados, esencialmente purificados o purificados) o sintéticamente (por ejemplo, por síntesis química). Un polipéptido producido por la expresión de una molécula de ADN no huésped es un péptido o polipéptido "heterólogo". Un “residuo de aminoácido” que comprende el polipéptido puede ser un residuo de aminoácido natural o no natural unido por enlaces peptídicos y/o enlaces diferentes de los enlaces peptídicos. Los residuos de aminoácidos pueden estar en configuración D o configuración L. En algunos aspectos, los polipéptidos mencionados en el presente documento son proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos producidos por la expresión de ácido nucleico recombinante. En algunas realizaciones, las composiciones polipeptídicas descritas en el presente documento comprenden dos polipéptidos conectados por una secuencia enlazadora.
[0106]Como se usa en el presente documento, “fragmento funcional” o “porción” pretende referirse a menos de la proteína madura o nativa completa que es suficiente para retener una o más de las actividades biológicas deseadas de la proteína madura o nativa (por ejemplo, suficiente para retener una actividad biológica terapéutica o de mejora con respecto a un trastorno a tratar). Por lo tanto, las secuencias de aminoácidos o polipéptidos pueden modificarse, por ejemplo, secuencias de polipéptidos en las que se han insertado, eliminado y/o sustituidos aminoácidos de tal manera que las modificaciones no interfieran sustancialmente con la capacidad del polipéptido para codificar un agente funcional.
[0107]El enlazador o enlazador polipeptídico descrito en el presente documento se refiere a una secuencia peptídica diseñada para conectar (por ejemplo, unir, enlazar) dos secuencias de proteínas, en donde la secuencia peptídica enlazadora normalmente no está dispuesta entre las dos secuencias de proteínas en la naturaleza. En el contexto de la presente enseñanza, la frase "unido" o "unido" o "conectado" generalmente se refiere a un enlace funcional entre dos secuencias de aminoácidos contiguas o adyacentes para producir un polipéptido que generalmente no existe en la naturaleza. En ciertas realizaciones, la unión puede usarse para referirse a una unión covalente de, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de un primer polipéptido y el segundo polipéptido (por ejemplo, cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo). Generalmente, las proteínas unidas son contiguas o adyacentes entre sí y conservan su respectiva operatividad y función cuando se unen. Los péptidos que comprenden los polipéptidos quiméricos descritos en el presente documento se unen por medio de un enlazador peptídico interpuesto que comprende uno o más aminoácidos. Tales enlazadores pueden proporcionar flexibilidad deseable para permitir la expresión, actividad y/o posicionamiento conformacional deseados del polipéptido quimérico. Un enlazador de aminoácidos típico generalmente está diseñado para ser flexible o para interponer una estructura, como una hélice alfa, entre los dos restos proteicos. Un enlazador puede fusionarse al extremo N-terminal o C-terminal de un polipéptido, o insertarse internamente.
[0108]En una composición polipeptídica que comprende un enlazador, el extremo 5' (por ejemplo, el extremo terminal) de la secuencia peptídica enlazadora (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos) es adyacente y está unido covalentemente al extremo 3' de una secuencia proteica (primer péptido) (por ejemplo, proteína de longitud completa o dominio proteico, fragmento o variante) y, además, el extremo 3' de la secuencia de aminoácidos enlazadora es adyacente y está unido covalentemente al extremo 5' de otra secuencia proteica (segundo péptido).
Moléculas de unión a antígeno
[0109]En algunos aspectos, la proteína de fusión es una molécula de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el primer polipéptido es un dominio variable de cadena ligera y el segundo polipéptido es un dominio variable de cadena pesada. En algunas realizaciones, el uso de un enlazador como se describe en el presente documento para unir una región variable de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo proporciona el beneficio de permitir flexibilidad y longitud óptimas para evitar impedimento estérico y permitir el plegamiento correcto de los dominios de unión a antígeno. La conformación adecuada del primer y segundo péptido es esencial para el reconocimiento y la unión al antígeno.
[0110]Como se usa en el presente documento, los términos «región variable» o «dominio variable» se usan indistintamente y significan una porción de un anticuerpo, generalmente, una porción de una cadena ligera o pesada, típicamente el extremo amino terminal del anticuerpo, y que comprende aproximadamente 100-130 aminoácidos en la cadena pesada y aproximadamente 90 a 115 aminoácidos en la cadena ligera, que difieren ampliamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de un anticuerpo particular para un antígeno particular. La variabilidad en la secuencia se concentra en aquellas regiones llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), mientras que las regiones más altamente conservadas en el dominio variable se llaman regiones marco (FR). Las CDR de las cadenas ligera y pesada son las principales responsables de la interacción y especificidad del anticuerpo con el antígeno.
[0111]En ciertas realizaciones, la región variable de una molécula de unión a antígeno es una región variable humana. En realizaciones adicionales, la región variable comprende CDR de roedores, humanas o murinas y regiones estructurales humanas (FR). En realizaciones adicionales, la región variable es una región variable de primate (por ejemplo, un primate no humano). En otras realizaciones adicionales, la región variable es una región variable de conejo. En otras realizaciones, la región variable comprende CDR humanas y regiones marco no humanas (por ejemplo, conejo, murino, rata o primate no humano). En otras realizaciones, la región variable comprende CDR no humanas (por ejemplo, de conejo, murina, rata o primate no humano) y regiones estructurales humanas (Fr ).
[0112]Los términos “VH”, “dominio VH” y “cadena VH” se usan indistintamente y significan la región variable de cadena pesada de una molécula de unión a antígeno, anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Como se usa en el presente documento, el término “cadena pesada” cuando se usa en referencia a un anticuerpo puede referirse a cualquier tipo distinto, por ejemplo, alfa (a), delta (8), épsilon (s), gamma (y) y mu (p), según la secuencia de aminoácidos del dominio constante, que dan lugar a las clases de anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluidas las subclases de IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
[0113]Los términos “VL”, “dominio VL” y “cadena VL” se usan indistintamente y significan la región variable de cadena ligera de una molécula de unión a antígeno, anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Como se usa en el presente documento, el término “cadena ligera” cuando se usa en referencia a un anticuerpo puede referirse a cualquier tipo distinto, por ejemplo, kappa (K) o lambda (A) basado en la secuencia de aminoácidos de los dominios constantes. Las secuencias de aminoácidos de cadena ligera son bien conocidas en la técnica. En realizaciones específicas, la cadena ligera es una cadena ligera humana.
[0114]Una «molécula de unión a antígeno», «porción de unión a antígeno» o «fragmento de anticuerpo» se refiere a cualquier molécula que comprende las partes de unión a antígeno (por ejemplo, CDR) del anticuerpo del que deriva la molécula. Una molécula de unión a antígeno puede incluir las regiones determinantes de la complementariedad antigénica (CDR). Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')<2>y Fv, dAb, anticuerpos lineales, anticuerpos scFv y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de moléculas de unión a antígeno. Los péptidos (es decir, moléculas de fusión Fc que comprenden dominios de unión a péptidos) son otro ejemplo de moléculas de unión a antígeno adecuadas. En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno se une a un antígeno en una célula tumoral. En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno se une a un antígeno en una célula involucrada en una enfermedad hiperproliferativa o a un antígeno viral o bacteriano. En realizaciones adicionales, la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo o fragmento del mismo, incluyendo una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del mismo. En realizaciones adicionales, la molécula de unión a antígeno es un fragmento variable monocatenario (scFv).
[0115]Como se usa en el presente documento, los términos “anticuerpo monocatenario” y “fragmento monocatenario variable (scFv)” se usan indistintamente y significan una molécula de unión a antígeno en la que una región VL y una VH se unen a través de un conector para formar una cadena proteica continua en la que el conector es lo suficientemente largo como para permitir que la cadena proteica se pliegue sobre sí misma y forme un sitio de unión a antígeno monovalente (véase, por ejemplo Bird et al., (1988) Science 242:423-26 y Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-83 (1988). Fm C63 (Nicholsonet al.,(1997)Mol. Immunol.34: (16-17) 1157-65) es un ejemplo específico de un scFv, y es específico para CD19.
[0116]En algunas realizaciones, la molécula de unión a antígeno es un scFv.
[0117]En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona moléculas de unión a antígeno, incluyendo scFv, que comprenden una secuencia consenso BPXXXZ, XBPXXx Zx o secuencia conectora ejemplar como se describe en el presente documento (por ejemplo, KPGSGE (SEQ ID NO: 4), GKPGSGE (SEQ ID NO: 5), GKPGSGG (SEQ ID NO: 6), GGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 7), GGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 8), GGGGSGKPGSGGGGS (SEQ ID NO: 9), GGGGSGKPGSGEGGS (SEQ ID NO: 10), GGGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 11), GGGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 12), STSGSGKPGSGEGST (SEQ ID NO: 17), GGGGSGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 18), GGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 19) o GGGGSGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 20). En algunas realizaciones, las moléculas que comprenden estas secuencias y células que presentan dichas moléculas, polinucleótidos que codifican las moléculas de unión a antígeno, y forman un aspecto de la presente divulgación.
[0118]Como se usa en el presente documento, el término “afinidad de unión” significa la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, una molécula de unión a antígeno como un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, como se usa en el presente documento, “afinidad de unión” se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y puede representarse generalmente por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse y/o expresarse de varias maneras conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, constante de disociación en equilibrio (Kd) y constante de asociación en equilibrio (Ka). La Kd se calcula a partir del cociente koff/kon, mientras que Ka se calcula a partir del cociente kon/koff kon se refiere a la constante de velocidad de asociación de, por ejemplo, un anticuerpo a un antígeno, y koff se refiere a la disociación de, por ejemplo, un anticuerpo a un antígeno. La kon y la koff pueden determinarse mediante técnicas estándar conocidas por un experto en la técnica, como BIAcore® o KinExA o resonancia de plasmón superficial.
[0119]En ciertas realizaciones, una molécula de unión a antígeno comprende una sola cadena, en la que la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera están conectadas por un conector como se describe en el presente documento, para formar un scFv (por ejemplo, una molécula de unión a antígeno de la presente divulgación). En algunas realizaciones, el VH se encuentra en el extremo N del conector y el VL se encuentra en el extremo C del conector. En otras realizaciones, la VL se encuentra en el extremo N del conector y la VH se encuentra en el extremo C del conector. En algunas realizaciones, el conector comprende al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 11, al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 13, al menos aproximadamente 14, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 16, al menos aproximadamente 17, al menos aproximadamente 18, al menos aproximadamente 19, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 90 o al menos aproximadamente 100 aminoácidos. En algunas realizaciones, el enlazador comprende entre aproximadamente 8 aminoácidos y aproximadamente 18 aminoácidos (por ejemplo, 16 aminoácidos).
Receptores de antígenos quiméricos
[0120]Una molécula de unión a antígeno puede formar un componente de un CAR o TCR, y puede servir para dirigir el CAR o TCR para reconocer una diana de interés. Como se usa en el presente documento, en el contexto de un CAR o TCR, una molécula de unión a antígeno significa cualquier componente de un CAR o TCR que dirige el CAR o TCR a una diana deseada y se asocia con esa diana. En realizaciones específicas, un componente de molécula de unión a antígeno de un CAR o TCR comprende un scFv que comprende una región variable de cadena pesada y ligera unida por un conector descrito en el presente documento. Las regiones variables pesadas y ligeras pueden derivar del mismo anticuerpo o de dos anticuerpos diferentes. Las moléculas de unión a antígeno utilizadas en un CAR o TCR pueden derivar de un anticuerpo que se sabe o se sospecha que se une a una diana de interés.
[0121]Las células T pueden ser diseñadas para expresar, por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR). Las células T CAR positivas (CAR+) están diseñadas para expresar un CAR. Los CAR pueden comprender, por ejemplo, un fragmento variable monocatenario extracelular (scFv) con especificidad para un antígeno tumoral particular, que está directa o indirectamente unido a una parte de señalización intracelular que comprende al menos un dominio coestimulador, que está directa o indirectamente unido a al menos un dominio activador; los componentes pueden disponerse en cualquier orden. El dominio coestimulador puede derivar de, por ejemplo, CD28 o 4-IBB, y el dominio activador puede derivar de, por ejemplo, cualquier forma de CD3-zeta. En ciertas realizaciones, el CAR está diseñado para tener dos, tres, cuatro o más dominios coestimuladores. Un scFv CAR puede diseñarse para dirigirse, por ejemplo, a CD19, que es una proteína transmembrana expresada por las células del linaje de células B, incluidas todas las células B normales, y tumores malignos de células B como LNH, LLC y LLA no de células T. En algunas realizaciones, un CAR se diseña de manera que el dominio coestimulador se exprese como una cadena polipeptídica separada. Ejemplos de terapias y construcciones de células T CAR se describen en la patente de EE. de patente estadounidense n.° 2013/0287748, 2014/0227237, 2014/0099309 y 2014/0050708.
[0122]Una molécula de unión a antígeno de la presente divulgación también puede ser un anticuerpo monoclonal completamente humano, a partir del cual se puede generar un scFv, que luego puede formar un componente de un CAR o TCR proporcionado en el presente documento. Los anticuerpos monoclonales completamente humanos pueden generarse mediante cualquier número de técnicas con las que los expertos en la técnica estarán familiarizados. Dichos métodos incluyen, entre otros, la transformación por el virus de Epstein Barr (VEB) de células sanguíneas periféricas humanas (por ejemplo, que contengan linfocitos B), la inmunización in vitro de linfocitos B humanos, la fusión de células del bazo de ratones transgénicos inmunizados portadores de genes de inmunoglobulina humana insertados, el aislamiento a partir de bibliotecas de fagos de la región V de la inmunoglobulina humana, u otros procedimientos conocidos en la técnica y basados en la presente divulgación.
[0123]Se han desarrollado procedimientos para generar anticuerpos monoclonales humanos en animales no humanos. Por ejemplo, se han preparado ratones en los que uno o más genes endógenos de inmunoglobulina han sido inactivados por diversos medios. Se han introducido genes de inmunoglobulina humana en los ratones para reemplazar los genes de ratón inactivados. En esta técnica, se introducen elementos del locus de cadena pesada y ligera humana en cepas de ratones derivadas de líneas de células madre embrionarias que contienen alteraciones dirigidas de los loci endógenos de cadena pesada y cadena ligera (véase también Bruggemann et al., (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58).
[0124]Además, se apreciará que, cuando se desee, los diversos dominios y regiones descritos en el presente documento pueden expresarse en una cadena separada de la molécula de unión a antígeno (por ejemplo, scFv) y los dominios activadores, en la denominada configuración “trans”. Por lo tanto, en una realización, un dominio activador puede expresarse en una cadena, mientras que la molécula de unión a antígeno, y/o un dominio extracelular, y/o un dominio transmembrana y/o un dominio coestimulador (dependiendo de la construcción deseada del CAR o TCR) puede expresarse en una cadena separada.
[0125]Además, el orden N a C-terminal, o extracelular a intracelular, de los componentes de un CAR de la presente divulgación puede variarse según se desee. La molécula de unión al antígeno (el scFv) será extracelular para asociarse con el antígeno diana, y puede incluir un péptido líder o señal en el extremo N terminal del scFv que es más distal a la membrana celular.
Polinucleótidos
[0126]En un aspecto, la presente enseñanza proporciona un polinucleótido que codifica un enlazador como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un polinucleótido que codifica una proteína de fusión como se describe en el presente documento. La presente divulgación también se refiere a polinucleótidos que codifican anticuerpos y moléculas de unión a antígeno, tales como un scFv, que comprende un enlazador como se describe en el presente documento, moléculas que comprenden esta secuencia y células que presentan dichas moléculas.
Vectores de expresión
[0127]En un aspecto, la presente enseñanza proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un enlazador o proteína de fusión como se describe en el presente documento. En ciertos aspectos, en el presente documento se proporcionan vectores que comprenden un polinucleótido de la presente divulgación. En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a un vector o un conjunto de vectores que comprenden un polinucleótido que codifica un enlazador, o proteína de fusión, como se describe en el presente documento. En otras realizaciones, la presente divulgación se refiere a un vector o un conjunto de vectores que comprenden un polinucleótido que codifica un anticuerpo o una molécula de unión a antígeno del mismo, como se divulga en el presente documento.
[0128]Cualquier vector conocido en la técnica puede ser adecuado para la presente divulgación. En algunas realizaciones, el vector es un vector viral. En algunas realizaciones, el vector es un vector retroviral, un vector de ADN, un vector del virus de la leucemia murina, un vector SFG, un plásmido, un vector de ARN, un vector adenoviral, un vector baculoviral, un vector viral de Epstein Barr, un vector papovaviral, un vector viral vaccinia, un vector viral del herpes simple, un vector asociado a adenovirus (AAV), un vector lentiviral o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones de la presente divulgación se pueden emplear uno, dos o más vectores.
Células recombinantes
[0129]En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona una célula recombinante que comprende un polinucleótido que codifica un enlazador o proteína de fusión como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la célula recombinante comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un enlazador o proteína de fusión como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan células que comprenden un polinucleótido o un vector de la presente divulgación. En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a células huésped, tales como células in vitro, que comprenden un polinucleótido que codifica un enlazador o proteína de fusión, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a células huésped, por ejemplo, células in vitro, que comprenden un polinucleótido que codifica un anticuerpo o una molécula de unión a antígeno del mismo, como se describe en el presente documento.
[0130]Las células huésped adecuadas pueden derivar de una variedad de organismos, incluidos, entre otros, mamíferos, plantas, aves (por ejemplo, sistemas aviares), insectos, levaduras y bacterias. En algunas realizaciones, las células huésped son células de mamífero. Cualquier célula de mamífero susceptible al cultivo celular, y a la expresión de polipéptidos, puede utilizarse de acuerdo con la presente enseñanza como célula huésped. Ejemplos no limitantes de células de mamífero que pueden usarse de acuerdo con la presente enseñanza incluyen células 293 de riñón embrionario humano (HEK293), células HeLa; línea de mieloma de ratón BALB/c (NSO/1, e Ca CC No: 85110503); retinoblastos humanos [PER.C6 (CruCell, Leiden, Países Bajos)]; línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea celular de fibrosarcoma humano (por ejemplo, HT-1080); línea renal embrionaria humana (293 ó 293 células subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)]; células renales de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino /-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertol de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células renales de mono (CV1 A<t>C<c>CCL 70); células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células hepáticas de rata búfala (BRL 3A, ATCC Cr L 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; una línea de hepatoma humano (Hep G2), línea celular humana CAP y AGE1.HN, y panel de Glicotopos.
[0131]Los ejemplos no limitantes de células huésped adecuadas para la presente enseñanza incluyen células y líneas celulares derivadas dePichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosacccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiaeyYarrowia lipolyticapara levaduras;Sodoptera frugiperda, Trichoplusis ni, Drosophila melangoster y Manduca sextapara insectos; yEscherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Bacillus lichenifonnis, Bacteroides fragilis, Clostridia perfringens, Clostridia difficilepara bacterias; yXenopus Laevisde anfibios.
[0132]Además, se puede utilizar cualquier número de líneas celulares de hibridoma disponibles de acuerdo con la presente enseñanza. Un experto en la técnica apreciará que las líneas celulares de hibridoma podrían tener diferentes requisitos nutricionales y/o podrían requerir diferentes condiciones de cultivo para el crecimiento óptimo y la expresión de polipéptidos o proteínas, y serán capaces de modificar las condiciones según sea necesario.
EJEMPLOS
[0133]Aunque ciertos compuestos, composiciones y métodos de la presente enseñanza se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos de la enseñanza y no pretenden limitar los mismos.
Ejemplo 1: Cartografía de epítopos para identificar la secuencia consenso del enlazador
[0134]Unión específica del anticuerpo Clon 8 y 16 producido contra un CAR que comprende la secuencia enlazadora de GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), se utilizaron para experimentos ELISA de mapeo de epítopos de la SEQ ID NO: 1 y variantes truncadas en el extremo N o C y que contienen un resto biotina en el extremo N, o un resto lisina con un resto biotina en el extremo C (SEQ ID NOs: 21-30).
[0135]Los anticuerpos se capturaron en formato de placa de 96 pocillos utilizando placas prerrecubiertas con Proteína G (Pierce). Las placas se lavaron 6x en tampón PBST seguido de incubación con péptidos diana. Se realizó un lavado adicional 6x con PBST y los anticuerpos se incubaron adicionalmente con estreptavidina-HRP. Tras un lavado final 6x en PBST, se detectó y cuantificó la señal mediante un kit de quimioluminiscencia mejorada (ECL, de GE Healthcare) y un lector de placas Varioskan Flash (Thermo Fisher). Los resultados de los experimentos ELISA de mapeo de epítopos, mostrados en la Figura 2, demuestran que, aunque ambos anticuerpos se unen al 18mero de longitud completa (SEQ ID NO: 1), el clon 8 se une específicamente a la subsecuencia 7mera GKPGSGE (SEQ ID NO: 5) y el Clon 16 se une específicamente a la subsecuencia 5mer KPGSG (SEQ ID NO: 16). Tomados en conjunto, estos datos se utilizaron para generar una secuencia consenso basada en los epítopos de unión mínima para los clones 8 y 16.
Ejemplo 2: Perfil de unión de anticuerpos de secuencias enlazadoras ejemplares
[0136]Unión específica de un panel de anticuerpos generados contra un CAR que comprende la secuencia enlazadora de GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 1), la secuencia enlazadora GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 2), o el o el clon scFv anti-CD19 FMC63 se usaron para determinar el perfil de unión al anticuerpo de secuencias conectoras ejemplares de los anticuerpos KIP-1, KIP-4 y KIP-3 respectivamente, como se describe en el presente documento. También se incluyeron en este ensayo péptidos que comprenden las secuencias enlazadoras KL1 (SEQ ID NO: 9), KL2 (SEQ ID NO: 10), KL3 (SEQ ID NO: 11), y el enlazador Whitlow truncado (SEQ ID NO: 17) descrita en la Figura 1. Los anticuerpos se capturaron en formato de placa de 96 pocillos utilizando placas prerrecubiertas con Proteína G (Pierce). Las placas se lavaron 6x en tampón PBST seguido de incubación con péptidos diana. Se realizó un lavado adicional 6x con PBST y los anticuerpos se incubaron adicionalmente con estreptavidina-HRP. Tras un lavado final 6x en PBST, se detectó y cuantificó la señal mediante un kit de quimioluminiscencia mejorada (ECL, de GE Healthcare) y un lector de placas Varioskan Flash (Thermo Fisher). Los resultados de los experimentos ELISA de perfil de anticuerpos, mostrados en la Figura 3, demuestran la amplitud de la unión de anticuerpos de los enlazadores de acuerdo con la presente enseñanza.
Ejemplo 3: Resultados de citometría de flujo de células que expresan CAR que comprenden enlazadores quiméricos
[0137]Las células T CAR se ensayaron mediante citometría de flujo usando proteína L como control para confirmar la expresión de cada construcción CAR que comprende las secuencias conectoras SEQ ID NO: 1 (FMC63 WT), o la SEQ ID NO: 2 (FMC63 G4S). Estos resultados confirman la expresión de las construcciones CAR en la superficie de las células T. Como se muestra en la Figura 4, las células T CAR se produjeron en el contexto de scFv FMC63 y 24C1 scFv. KL2 (SEQ ID NO: 10), KL3 (SEQ ID NO: 11), KL4 (SEQ ID NO: 7), KL5 (SEQ ID NO: 12), KL6 (SEQ ID NO: 8), y G4S2 (SEQ ID NO: 18) para unir los dominios VL y VH del scFv.
SECUENCIAS Y SEQ ID N°
Tabla B

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un péptido, en el que el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de
(i) GGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 7);
(ii) GGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 8);
(iii) GGGGSGKPGSGGGGS (SEQ ID NO: 9);
(iv) GGGGSGKPGSGEGGGS (SEQ ID NO: 11); o
(v) GGGGSGKPGSGEGGGGS (SEQ ID NO: 12).
2. El péptido de la reivindicación 1, en el que el péptido comprende no más de 20 aminoácidos.
3. Una proteína de fusión que comprende:
a) un primer polipéptido; y
b) un péptido de la reivindicación 1 o 2.
4. Una proteína de fusión que comprende:
a) un primer polipéptido;
b) un segundo polipéptido; y
c) un péptido de la reivindicación 1 o 2.
5. La proteína de fusión de la reivindicación 4, en la que la proteína de fusión es una molécula de unión a antígeno.
6. La proteína de fusión de la reivindicación 5, en la que la proteína de fusión es un scFv.
7. La proteína de fusión de la reivindicación 5 o 6, en la que el primer polipéptido es un dominio variable de cadena ligera y el segundo polipéptido es un dominio variable de cadena pesada.
8. Un polinucleótido que codifica (i) un péptido de la reivindicación 1 o 2 o (ii) una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7.
9. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la reivindicación 8.
10. Una célula recombinante que comprende un polinucleótido de la reivindicación 8 o el vector de expresión de la reivindicación 9.
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