ES2978921T3 - Formulaciones para administración en el intestino delgado - Google Patents

Abstract

En el presente documento se proporcionan composiciones y métodos para generar una respuesta inmunogénica en seres humanos. Dichas composiciones incluyen un agente biológico inmunogénico que comprende (ii) un agente que dirige la administración del agente biológico inmunogénico al íleon del ser humano, en donde el agente (ii) es un recubrimiento entérico (por ejemplo, Eudragit®) que tiene un pH umbral de 5,8-6,8. Además, se proporcionan métodos para diseñar dichas composiciones, por ejemplo, para vacunas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones para administración en el intestino delgado

Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos n.° 61/942.386, presentada el 20 de febrero de 2014.

Antecedentes de la invención

Las vacunas son un medio importante para prevenir y/o tratar una serie de enfermedades y trastornos (por ejemplo, infección vírica, infección bacteriana y cáncer). La vacunación se realiza normalmente mediante inyección, lo que reduce la participación debido a la inconveniencia de viajar a un sitio de vacunación y la aversión a las inyecciones. Además, la inyección de vacunas requiere el uso de un kit estéril, tal como jeringas y agujas, y un médico capacitado para la administración.

Para la vacuna contra la gripe, se realizan campañas anuales a gran escala para recolectar suficientes huevos fecundados para cosechar y procesar suficientes virus para satisfacer las necesidades del mercado. La hemaglutinina (HA) procedente de cultivo celular o plantas pueden reducir la carga de la adquisición y el procesamiento de huevos, pero estos enfoques aún requieren un llenado y un acabado estériles costosos para producir agujas de jeringa individuales, que deben eliminarse como peligro biológico. Durante una pandemia, las escuelas pueden cerrarse y el distanciamiento social es obligatorio, sin embargo, la inmunización masiva contra la gripe generalmente requiere alinear a los sujetos en las clínicas para recibir inyecciones. Vacunas orales, para la gripe u otros patógenos, podrían enviarse por correo, evitando así la mayoría de los contactos humanos. Adicionalmente, la formación de comprimidos es rápida, proceso sanitario que no requiere el costoso proceso de llenado y acabado estéril que requieren las vacunas inyectadas.

Las vacunas que se pueden administrar de manera no parenteral, por ejemplo, por vía oral o mucosa, se describen en la patente de Estados Unidos n.° 8.222.224.

El documento WO 2013/148258 A1 divulga una formulación de vacuna oral que administra un antígeno en las proximidades del íleon distal del tubo gastrointestinal que comprende un recubrimiento entérico que encapsula el antígeno, que es sustancialmente insoluble a un pH inferior a un intervalo de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,6.

Breve sumario de la invención

Las referencias a métodos de tratamiento en el sumario y ladescripción de la invencióndetallada de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

En el presente documento se proporcionan composiciones y composiciones para su uso para una vacunación más eficaz de un sujeto (ser humano o no humano) que implica la administración de un agente biológico inmunogénico específicamente al íleon del sujeto. Por tanto, la presente divulgación proporciona vacunas más eficientes y eficaces y demuestra su eficacia en seres humanos.

En el presente documento se proporcionan composiciones inmunogénicas para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprenden: (i) un vector adenovírico, que codifica un polipéptido inmunogénico abarcado por (ii) un agente que dirige la administración del vector adenovírico al íleon del ser humano, en donde el agente (ii) es un recubrimiento entérico que tiene un pH liminar de 5,8, 5,9, 6 o 6,1.

En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal no humano, por ejemplo, primate, ratón, rata, conejo, caballo, perro, gato o ave de corral.

El agente biológico inmunogénico es un vector de expresión que codifica un polipéptido inmunogénico. El vector de expresión es un vector adenovírico. En algunas realizaciones, el vector vírico está atenuado o la replicación es incompetente. En algunas realizaciones, el vector de expresión comprende un promotor (por ejemplo, CMV, SV40 temprano o tardío, p-actina, etc.) unido operativamente a la secuencia que codifica el polipéptido inmunogénico. En algunas realizaciones, el vector de expresión además codifica bicatenario (ARNbc). En algunas realizaciones, la secuencia que codifica ARNbc está unida operativamente a un promotor, por ejemplo, ya sea el mismo promotor (usando un sitio de entrada ribosómico interno (IRES, por sus siglas en inglés)) o un promotor diferente como el promotor unido operativamente a la secuencia codificante del polipéptido inmunogénico.

En algunas realizaciones, la composición inmunogénica comprende además al menos un adyuvante, por ejemplo, un agonista de TLR3. En algunas realizaciones, el agonista de TLR3 es ARNbc o un mimético de ARNbc.

En algunas realizaciones, al menos un 50 % del agente biológico inmunogénico se administra (libera) en el íleon, por ejemplo, al menos un 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 % o más del agente biológico inmunogénico presente en la composición administrada. En algunas realizaciones, el agente que dirige la administración (por ejemplo, la matriz o recubrimiento entérico) comienza a disolverse antes de que la composición inmunogénica llegue al íleon, pero conserva al menos un 50 % del agente biológico inmunogénico hasta que la composición inmunogénica alcanza el íleon. En algunas realizaciones, el agente que dirige la administración retiene el agente biológico inmunogénico a través del estómago, duodeno y yeyuno, pero libera el agente biológico inmunogénico en el íleon.

El agente que dirige la administración es un recubrimiento entérico. Es decir, el agente biológico inmunogénico está cubierto por un recubrimiento entérico. El recubrimiento entérico se desintegra a pH 5,8, 5,9, 6 o 6,1. En algunas realizaciones, el recubrimiento entérico no incluye ftalato acetato de celulosa (FAC). El recubrimiento entérico es de un grosor que da como resultado la liberación del agente biológico inmunogénico en el íleon. En algunas realizaciones, el recubrimiento entérico está basado en un copolímero de ácido metacrílico con una cobertura de 5,5 a 10 miligramos por centímetro cuadrado. En algunas realizaciones, el agente que dirige la administración es una cápsula radiocontrolada.

En algunas realizaciones, el recubrimiento entérico comprende poli(metilmetacrilato-co-ácido metacrílico) 1:1. En algunas realizaciones, el recubrimiento entérico comprende Eudragit® L-100. En algunas realizaciones, el recubrimiento entérico comprende Eudragit® L-100, citrato de trietilo y talco, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 1-4 partes de Eudragit® L-100, 1-2 partes de citrato de trietilo y 1-2 partes de talco.

En algunas realizaciones, la composición inmunogénica está en forma de un comprimido o cápsula, por ejemplo, en forma de comprimido cubierto por un recubrimiento entérico. En algunas realizaciones, la composición inmunogénica está encapsulada en una cápsula polimérica que comprende gelatina, hidroxipropilmetilcelulosa, almidón o pululano. En algunas realizaciones, la composición inmunogénica está en forma de micropartículas de menos de 2 mm de diámetro, por ejemplo, cada micropartícula cubierta con recubrimiento entérico como se describe en el presente documento.

Se proporciona además un método para administrar una composición inmunogénica al íleon de un sujeto que comprende administrar por vía oral la composición inmunogénica como se describió anteriormente (es decir, un agente biológico inmunogénico abarcado por un agente que dirige la administración del agente biológico inmunogénico al íleon, incluyendo opcionalmente un adyuvante) al sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal no humano. En algunas realizaciones, el método da como resultado una respuesta inmunitaria en el sujeto que es al menos un 10 % mayor, por ejemplo, al menos un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 100 % o más, que la respuesta inmunitaria en un sujeto (ya sea el mismo sujeto en un momento diferente, o un sujeto diferente) que recibe la misma composición inmunogénica no dirigida al íleon. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria en el sujeto es al menos 1,5 veces mayor (por ejemplo, 2 veces, 2,5 veces, 5 veces o más) que la respuesta inmunitaria en un sujeto (ya sea el mismo sujeto en un momento diferente, o un sujeto diferente) que recibe la misma composición inmunogénica no dirigida al íleon. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria es un aumento de anticuerpos específicos para el agente biológico inmunogénico. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria celular, por ejemplo, un aumento de citocinas tales como IFN-y. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria es inmunización (por ejemplo, el sujeto es resistente a una infección por el virus, bacterias, etc. de los que procedía el agente biológico inmunogénico).

Se proporcionan además métodos para provocar una respuesta inmunitaria aumentada en un sujeto que comprende administrar por vía oral la composición inmunogénica como se describió anteriormente (es decir, un agente biológico inmunogénico abarcado por un agente que dirige la administración del agente biológico inmunogénico al íleon, incluyendo opcionalmente un adyuvante) al sujeto, por ejemplo, un sujeto humano. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria aumenta en al menos un 10 %, por ejemplo, al menos un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 100 % o más, en comparación con la respuesta inmunitaria en un sujeto (ya sea el mismo sujeto en un momento diferente, o un sujeto diferente) que recibe la misma composición inmunogénica no dirigida al íleon. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria en el sujeto aumenta al menos 1,5 veces (por ejemplo, 2 veces, 2,5 veces, 5 veces o más) en comparación con la respuesta inmunitaria en un sujeto (ya sea el mismo sujeto en un momento diferente, o un sujeto diferente) que recibe la misma composición inmunogénica no dirigida al íleon. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria es un aumento de anticuerpos específicos para el agente biológico inmunogénico. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria celular, por ejemplo, un aumento de citocinas tales como IFN-<y>. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria es inmunización (por ejemplo, el sujeto es resistente a una infección por el virus, bacterias, etc. de los que procedía el agente biológico inmunogénico).

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Se midieron células secretoras de anticuerpos (ASC, por sus siglas en inglés) específicas para HA en la sangre periférica 7 días después de que los sujetos recibieron una cápsula radiocontrolada que contenía rAd-HAARNbc. Los sujetos se asignaron al azar para que se les liberara la vacuna en el íleon o en el yeyuno. (N = 12 por grupo). Los resultados muestran que 12 de los 12 sujetos a los que se les administró la vacuna en el íleon fueron capaces de generar linfocitos B secretores de anticuerpos que reconocen HA, mientras que solo 9 de los 12 sujetos que recibieron la vacuna en el yeyuno fueron capaces de generar linfocitos B específicos de antígeno. El número medio de ASC IgA e IgG fue significativamente mayor para el íleon que para el yeyuno.

Figura 2. La respuesta de los linfocitos T a rAd-HA-ARNbc se determinó mediante la detección de los niveles de IFN-y 7 días después de la administración. Todos los individuos del grupo de administración en el íleon mostraron niveles más altos de IFN-<y>, en comparación con un 75 % del grupo de administración en el yeyuno. El nivel medio de IFN-<y>también fue significativamente más alto en el grupo de administración en el íleon.

Figura 3. Se midieron las respuestas de anticuerpos microneutralizantes (MN) a la gripe A/CA/07/2009 el día 0 y el día 28 después de la inmunización. El aumento de veces en los valores de MN se representó para sujetos individuales que tenían un valor de MN inicial menor o igual a 40. Los resultados mostraron que la administración en el íleon dio como resultado una alta proporción de sujetos (9 de 10) con valores aumentados de MN después de la inmunización en comparación con la administración en el yeyuno (6 de 10).

Figura 4. Se elaboraron comprimidos con celulosa microcristalina y almidón, con sulfato de bario al 10 % como material radiopaco. Estos comprimidos se recubrieron entéricamente con Eudragit L100® y se administraron a macacos cangrejeros hembra mediante sonda gástrica oral. Se tomaron radiografías a lo largo del tiempo posterior a la administración. A. Comprimido en el estómago con la flecha apuntando hacia el comprimido. B. Una hora después, el comprimido se puede ver en el intestino, la mancha blanca a la izquierda de la columna vertebral con una flecha apuntando hacia ella. Se disolvió en el intestino en las siguientes dos horas y no se puede ver.

Figura 5. Los números de ASC se informan los días 7 y 35, 7 días después de cada inmunización. Las ASC de base en los días 0 y 28 eran minúsculas y no estaban representadas. Las respuestas promedio para el día 7 se muestran para cada grupo tratado con una línea horizontal.

Figura 6. Aumento de veces en los valores de MN para sujetos individuales. Las columnas sombreadas oscuras indican dónde aumentaron los valores entre los días 28 y 56, mientras que las columnas sombreadas claras muestran la respuesta después de la inmunización inicial. Se trazó una línea con aumentos de dos veces en MN para mostrar qué sujetos tenían una respuesta de anticuerpos neutralizantes detectable. Ningún sujeto del grupo placebo respondió, mientras que 3 sujetos en el grupo de dosis baja y 7 sujetos en el grupo de dosis alta tuvieron una respuesta de anticuerpos neutralizantes de 2 veces o más a la gripe después de la inmunización. Placebo N = 10, dosis baja y dosis alta N = 11.

Figura 7. Respuestas de anticuerpos después de una única inmunización oral. A. Los valores de anticuerpos HAI antes y después de la inmunización (días 0 y 28 respectivamente) se muestran para sujetos individuales. B. Valores de la media geométrica (GMT, por sus siglas en inglés) de HAI frente al tiempo. Los valores de HAI se midieron a los 0, 1 y 6 meses después de la inmunización para evaluar la durabilidad de la respuesta de anticuerpos. C. Se muestran valores de MN antes y después de la inmunización para sujetos individuales. D. Respuestas de ASC después de la inmunización. Se informan las cantidades de ASC IgG e IgA (por 106 PMBC) 7 días después de la inmunización.

Descripción detallada de la invención

Los inventores han descubierto que la administración de un agente biológico inmunogénico a una parte particular del intestino delgado, es decir, el íleon, da como resultado una respuesta terapéutica mucho mayor que cuando el agente no se dirige o se dirige a un sitio diferente. Esto permite diseñar vacunas más eficaces, costes reducidos de materiales y efectos secundarios reducidos para el receptor.

I. Definiciones

El término "inmunogénico" se refiere a la capacidad de un agente para dar lugar a una respuesta inmunitaria en un hospedador, ya sea humoral o mediada por células. Los agentes inmunogénicos son normalmente "extraños" para el hospedador, por ejemplo, de una especie diferente, o de una bacteria, virus u hongos. Un agente no extraño puede ser inmunogénico, por ejemplo, en el caso de una respuesta autoinmunitaria. Determinados agentes específicos de células cancerosas se pueden explotar como agentes inmunogénicos, permitiendo que el sistema inmunitario del hospedador ataque el cáncer.

La expresión "agente biológico" se refiere a un ácido nucleico, polipéptido, glucoproteína, hidrato de carbono, lípido, o una forma modificada de los mismos (por ejemplo, metilado, glucosilado, marcado de forma detectable). Los agentes biológicos se distinguen de los fármacos de moléculas pequeñas en que se pueden crear mediante procesos biológicos (incluyendo técnicas recombinantes) en lugar de síntesis química. Los agentes biológicos se pueden, sin embargo, modificar químicamente o incluir nucleótidos o aminoácidos no naturales. Los agentes biológicos también pueden ser de origen no natural, por ejemplo, entidades recombinantes o quiméricas.

Como se utiliza en el presente documento, un "agente biológico inmunogénico" se refiere a un agente que actúa directamente como un antígeno (por ejemplo, es reconocido por un receptor de linfocitos T o un anticuerpo), o un agente que, una vez expresado en una célula, actúa como un antígeno. Por ejemplo, un agente biológico inmunogénico puede incluir un vector de expresión que codifica un polipéptido inmunogénico.

El término "antígeno" se refiere a un polipéptido, glucoproteína, lipoproteína, lípido, hidrato de carbono u otro agente que está unido (por ejemplo, reconocido como "extraño") por un receptor de linfocitos T y/o un anticuerpo. Los antígenos proceden comúnmente de fuentes bacterianas, víricas o fúngicas. La expresión "procede de" indica que el antígeno es esencialmente como existe en su contexto antigénico natural, o que ha sido modificado para expresarse en determinadas condiciones, para incluir solo la parte más inmunogénica, o para eliminar otros componentes asociados posiblemente dañinos, etc.

Una "dosis o cantidad inmunogénicamente eficaz" de una composición como se describe en el presente documento es una cantidad que provoca o modula una respuesta inmunitaria específica para un antígeno seleccionado para vacunación. Respuestas inmunitarias incluyen respuestas inmunitarias humorales y respuestas inmunitarias mediadas por células. Una composición inmunogénica se puede usar terapéutica o profilácticamente para tratar o evitar una enfermedad en cualquier etapa.

Las "respuestas inmunitarias humorales" están mediadas por componentes libres de células de la sangre, por ejemplo, plasma o suero; la transferencia del suero o plasma de un individuo a otro transfiere inmunidad humoral. Las respuestas inmunitarias humorales normalmente están mediadas por linfocitos B, por ejemplo, producción de anticuerpos.

Las "respuestas inmunitarias mediadas por células" están mediadas por linfocitos específicos de antígeno; la transferencia de linfocitos específicos de antígeno de un individuo a otro transfiere inmunidad. Las respuestas inmunitarias mediadas por células están mediadas al menos en parte por linfocitos T, y se pueden detectar, por ejemplo, mediante la detección de citocinas específicas de linfocitos T o el aumento del crecimiento de linfocitos T.

El "íleon" es el más largo de los tres segmentos que forman el intestino delgado, junto con el duodeno y el yeyuno. Constituye la parte terminal, entre el yeyuno y el ciego.

Un recubrimiento entérico es una barrera aplicada a los medicamentos orales que evita que el agente terapéutico en el interior sea digerido en el ambiente de pH bajo del estómago y el duodeno (~ pH 3).

Un agente, tal como un recubrimiento entérico, matriz, o cápsula, se dice que conserva un agente terapéutico incluido o integrado cuando al menos un 60 %, por ejemplo, al menos aproximadamente un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de la cantidad original administrada de agente terapéutico permanece incluida o integrada dentro del agente. El agente, por ejemplo, matriz o recubrimiento entérico, está diseñado normalmente para desintegrarse bajo determinadas condiciones y liberar el agente terapéutico. La desintegración puede ser gradual, por ejemplo, en el caso de un recubrimiento más grueso o químicamente más complejo. Se dice que el recubrimiento entérico se "desintegra" una vez que el espesor del recubrimiento se reduce al menos en un 10 %, por ejemplo, al menos un 25 %, 50 % o 75 % en comparación con el espesor original administrado. La desintegración no es un término absoluto, ya que puede ocurrir en un transcurso de tiempo diferente dependiendo de las condiciones. Por ejemplo, un recubrimiento diseñado para desintegrarse en 5 minutos a pH 6,5 puede desintegrarse, aunque lentamente, a pH 6 (por ejemplo, en 1 hora). La desintegración no indica necesariamente que se libere el agente terapéutico incluido o integrado. El agente terapéutico puede, sin embargo, comenzar a liberarse antes de que la matriz o recubrimiento entérico se desintegre por completo.

El término "quimérico" o "recombinante" como se usa en el presente documento con referencia, por ejemplo, a un ácido nucleico, proteína, o vector, indica que el ácido nucleico, proteína o vector, se ha modificado mediante la introducción de un ácido nucleico o proteína heteróloga o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativa. Por tanto, por ejemplo, vectores quiméricos y recombinantes incluyen secuencias de ácido nucleico que no se encuentran dentro de la forma nativa (no quimérica o no recombinante) del vector. Un vector de expresión vírico quimérico se refiere a un vector de expresión vírico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo (por ejemplo, inmunogénico).

Un "vector de expresión" es una construcción de ácido nucleico, generada de forma recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácidos nucleicos especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula hospedadora. El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus o fragmento de ácido nucleico. Normalmente, el vector de expresión incluye un ácido nucleico a transcribir unido operativamente a un promotor. Los vectores de expresión víricos normalmente se vuelven incompetentes o atenuados para la replicación. Un vector procedente de virus puede incluir los componentes del vector de expresión necesarios para la expresión de una secuencia deseada, pero omite a los implicados en, por ejemplo, replicación u otros efectos patogénicos.

Las expresiones "promotor" y "secuencia de control de la expresión" se utilizan en el presente documento para hacer referencia a una secuencia de control de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Las secuencias promotoras normalmente están cerca del sitio de inicio de la transcripción, tal como un elemento TATA en el caso de un promotor de tipo polimerasa II. Un promotor también puede incluir elementos potenciadores o represores distales, que pueden ubicarse hasta a varios miles de pares de bases del sitio de inicio de la transcripción. Los promotores incluyen promotores constitutivos e inducibles. Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo en la mayoría de las condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que está activo bajo regulación ambiental o de desarrollo. La expresión "unido operativamente" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia de control de la expresión de ácido nucleico (tal como un promotor o una matriz de sitios de unión a factores de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia de control de la expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.

El término "heterólogo" cuando se utiliza con referencia a las partes de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se ha producido, de forma típica, de manera recombinante, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestos para fabricar un ácido nucleico funcional nuevo, por ejemplo, un promotor procedente de una fuente y una región de codificación procedente de otra fuente. De forma similar, las porciones heterólogas de una proteína indican que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión). Un ácido nucleico o proteína heterólogo es uno que no se encuentra en un ambiente particular de la naturaleza, por ejemplo, una proteína de ratón heteróloga en una célula humana.

Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente en el presente documento para hacer referencia a polímeros de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en forma monocatenaria o bicatenaria. Los términos abarcan genes, ADNc, ARN y oligonucleótidos (polinucleótidos cortos). Los términos abarcan ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o restos o enlaces modificados de la cadena principal, que son sintéticos, de origen natural y de origen no natural, que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de forma similar a los nucleótidos de referencia. Ejemplos de dichos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforoamidatos, metil fosfonatos, metil fosfonatos quirales, 2-O-metil ribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos (ANP). El término "nucleótido" se refiere normalmente a un monómero de ácido nucleico.

A menos que se indique otra cosa, una secuencia particular de ácido nucleico también abarca variantes modificadas conservativamente de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados pueden lograrse mediante la generación de secuencias en las cuales la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con restos de base mixta y/o de desoxiinosina (Batzeret al.,Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsukaet al.,J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossoliniet al.,Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Una "dosis terapéutica" o "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" de una composición como se describe en el presente documento es una cantidad que evita, alivia, disminuye o reduce la intensidad de los síntomas de enfermedades y trastornos asociados con la fuente del antígeno seleccionado para la vacunación (por ejemplo, un virus, bacterias, un parásito o un cáncer).

El término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido codificado por un gen de inmunoglobulina o fragmentos del mismo que se unen específicamente y reconocen un antígeno. Las secuencias de inmunoglobulinas incluyen las secuencias de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como innumerables secuencias de región variable de inmunoglobulinas. Las cadenas ligeras se clasifican en kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican en gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

Los linfocitos T se refieren a una clase particular de linfocitos que expresan un receptor específico (receptor de linfocitos T) codificado por una familia de genes. Los genes receptores de linfocitos T reconocidos incluyen loci alfa, beta, delta y gamma, y los receptores de linfocitos T reconocen normalmente (pero no universalmente) una combinación de MHC más un péptido corto. Los linfocitos T normalmente se clasifican en términos generales como linfocitos T auxiliares (CD4+) y linfocitos T citotóxicos (CD8+). Los anticuerpos se producen de manera natural mediante linfocitos B, por ejemplo, células secretoras de anticuerpos (ASC). Los linfocitos B maduros pueden ser indiferenciados, linfocitos B plasmáticos (activados y productores de anticuerpos), de memoria, B-1, linfocitos B de la zona marginal, linfocitos B foliculares y linfocitos B reguladores.

Una respuesta inmunitaria adaptativa se refiere al reconocimiento de antígeno por linfocitos T y/o linfocitos B y/o anticuerpos.

Las células presentadoras de antígenos (APC, por sus siglas en inglés) son células capaces de presentar péptidos inmunogénicos o fragmentos de los mismos a los linfocitos T para activar o mejorar una respuesta inmunitaria. Las APC incluyen células dendríticas, macrófagos, linfocitos B, monocitos y otras células que pueden genomanipularse para ser APC eficaces. Dichas células pueden, pero no necesariamente, modificarse genéticamente para aumentar la capacidad de presentar el antígeno, para mejorar la activación y/o el mantenimiento de la respuesta de linfocitos T, para tener efectos antitumorales por sí mismas y/o ser inmunológicamente compatibles con el receptor (es decir, haplotipo HLA emparejado). Las APC se pueden aislar de cualquiera de una variedad de órganos y líquidos biológicos, incluyendo la médula ósea, sangre periférica, tejidos tumorales y peritumorales, y pueden ser células autólogas, alogénicas, singénicas o xenogénicas. Las APC normalmente utilizan un receptor del locus de histocompatibilidad principal (MHC, por sus siglas en inglés) para presentar polipéptidos cortos a linfocitos T.

Un adyuvante es un potenciador de la respuesta inmunitaria no específico. Los adyuvantes adecuados incluyen, por ejemplo, toxina colérica, monofosforil lípido A (MPL, por sus siglas en inglés), adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, Quil A y Al(OH). Los adyuvantes también pueden ser aquellas sustancias que causan la activación de APC y una presentación mejorada de linfocitos T a través de moléculas de señalización secundarias como los receptores tipo Toll, por ejemplo, ARN bicatenario (ARNbc), miméticos de ARNbc, flagelos bacterianos, LPS, ADN de CpG y lipopéptido bacteriano (revisado recientemente en [Abreuet al.,J Immunol, 174(8), 4453-4460 (2005)]).

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en donde uno o más restos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y a polímeros de aminoácidos de origen no natural.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural o sintético, así como a análogos y miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son los codificados mediante el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, y O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica que la de un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, metionina metil sulfonio. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas peptídicas modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Miméticos de aminoácidos se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de manera similar a un aminoácido de origen natural.

Los aminoácidos se pueden citar en el presente documento bien por sus símbolos habitualmente conocidos de tres letras, o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura bioquímica de la IUPAC-IUB. Los nucleótidos, asimismo, se pueden citar por sus códigos de una letra habitualmente aceptados.

"Variantes modificadas de forma conservadora" se aplica a secuencias tanto de aminoácidos como de ácido nucleico. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos concretas, las variantes modificadas de forma conservadora se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o si el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias prácticamente idénticas. A causa de la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican, todos ellos, el aminoácido alanina. Por tanto, en cada posición donde una alanina se especifica mediante un codón, el codón se puede alterar a cualquiera de los correspondientes codones descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico se denominan "variaciones silenciosas", que son un tipo de variaciones modificadas de forma conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico en el presente documento que codifica un polipéptido también describe todas y cada una de las posibles variaciones silenciosas del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para metionina, y TGG, que es normalmente el único codón del triptófano) se puede modificar con el fin de conseguir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

Como secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales en un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia de proteínas que altera, añade o elimina un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos de la secuencia codificada es una "variante modificada de forma conservadora" donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la materia. Dichas variantes modificadas de forma conservadora son adicionales, y no excluyen, las variantes polimórficas, homólogos interespecíficos, y alelos de la invención.

Los ocho grupos siguientes contienen, cada uno de ellos, aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina I, Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).

La expresión "hibrida selectivamente (o específicamente) con" se refiere a la unión, duplicación o hibridación de nucleótidos complementarios (o en gran parte complementarios) en una mezcla compleja (por ejemplo, ADN o ARN celular total o de biblioteca).

Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un polipéptido individual o ARNbc o una parte del mismo) o pueden comprender una variante de dicha secuencia. Las variantes polinucleotídicas pueden contener una o más sustituciones, adiciones, eliminaciones y/o inserciones de modo que no disminuya al menos una actividad biológica del polipéptido codificado (por ejemplo, inmunogenicidad), con respecto a un polipéptido que comprende antígenos nativos. Las variantes polinucleotídicas pueden contener una o más sustituciones, adiciones, eliminaciones y/o inserciones de manera que no disminuya la actividad adyuvante de un ARNbc codificado, relativo a un ARNbc que no contiene las sustituciones, adiciones, eliminaciones y/o inserciones. Las variantes presentan preferentemente al menos aproximadamente un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido nativo o una porción del mismo o un ARNbc.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de restos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más de identidad en una región especificada), cuando se compara y alinea para correspondencia máxima en una ventana de comparación, o región designada como medida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineación manual e inspección visual. Dichas secuencias se denominan, por tanto, "prácticamente idénticas". Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia polinucleotídica de prueba. Opcionalmente, la identidad existe en una región que es de al menos aproximadamente 10 a aproximadamente 100, de aproximadamente 20 a aproximadamente 75, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos de longitud.

Una muestra o valor "de control" se refiere a una muestra que sirve como referencia, normalmente una referencia conocida, para comparación con una muestra de ensayo. Por ejemplo, una muestra de ensayo se puede tomar a partir de una condición de ensayo, por ejemplo, en presencia de un compuesto o tratamiento de ensayo, y en comparación con muestras procedentes de condiciones conocidas, por ejemplo, en ausencia del compuesto de ensayo (control negativo), o en presencia de un compuesto conocido (control positivo). En el contexto de la presente divulgación, un ejemplo de un control negativo sería una muestra biológica de un individuo sano (no infectado) conocido, y un ejemplo de un control positivo sería una muestra biológica de un paciente infectado conocido. Un control también puede representar un valor promedio o un intervalo recogido entre un número de ensayos o resultados. Un experto en la materia reconocerá que los controles se pueden diseñar para evaluar cualquier número de parámetros. Por ejemplo, se puede idear un control para comparar el beneficio terapéutico basado en datos farmacológicos (por ejemplo, semivida) o medidas terapéuticas (por ejemplo, comparación de beneficios y/o efectos secundarios). Los controles se pueden diseñar para aplicacionesin vitro.Un experto en la materia sabrá qué controles son valiosos en una situación dada, y es capaz de analizar los datos basándose en comparaciones con valores de control. Los controles también son valiosos para determinar la significación de los datos. Por ejemplo, si los valores de un parámetro dado son ampliamente variables en los controles, la variación en las muestras de ensayo no se considerará significativas.

El término "diagnóstico" se refiere a una probabilidad relativa de que un sujeto tenga un trastorno tal como una infección o cáncer. De forma similar, el término "pronóstico" se refiere a una probabilidad relativa de que un determinado resultado futuro pueda ocurrir en el sujeto. No se pretende que los términos sean absolutos, como apreciará cualquier experto en el campo del diagnóstico médico.

Los términos "terapia", "tratamiento", y "mejora" se refieren a cualquier reducción en la intensidad de los síntomas. En el contexto de una infección, el tratamiento puede referirse a una reducción del agente infeccioso, síntomas reducidos, etc. En el caso de tratar un cáncer, el tratamiento puede referirse a, por ejemplo, reducción del tamaño del tumor, número de células cancerosas, tasa de crecimiento, actividad metastásica, reducción de la muerte celular de las células no cancerosas, etc. Los términos "tratar" y "prevenir" no pretenden ser términos absolutos. El tratamiento y la prevención pueden referirse a cualquier reducción comparativa o ausencia aparente del agente infeccioso, retraso en el inicio, mejora de los síntomas, mejora en la supervivencia del paciente, aumento del tiempo o tasa de supervivencia, etc. El tratamiento y la prevención pueden ser completos (niveles indetectables de agente infeccioso o células neoplásicas) o parciales, de manera que se encuentren en un paciente menos agentes infecciosos o células neoplásicas de las que se habrían producido sin los agentes biológicos inmunogénicos descritos actualmente. El efecto del tratamiento se puede comparar con un individuo o grupo de individuos que no reciben el tratamiento, o con el mismo paciente antes del tratamiento o en un momento diferente durante el tratamiento. En algunos aspectos, la intensidad de la infección o enfermedad se reduce en al menos un 10 %, en comparación, por ejemplo, con el individuo antes de la administración o con un individuo de control que no se somete al tratamiento. En algunos aspectos, la intensidad de la infección o enfermedad se reduce al menos en un 25 %, 50 %, 75 %, 80 %, o 90 %, o en algunos casos, ya no es detectable utilizando técnicas de diagnóstico estándar.

"Sujeto", "paciente", "individuo" y términos similares se utilizan indistintamente y se refieren a, excepto cuando se indique, mamíferos tales como seres humanos y primates no humanos, así como conejos, ratas, ratones, cabras, cerdos y otras especies de mamíferos. El término no indica necesariamente que el sujeto haya sido diagnosticado con una enfermedad en particular, pero normalmente se refiere a un individuo bajo supervisión médica. Un paciente puede ser un individuo que busca tratamiento, control, ajuste o modificación de un régimen terapéutico existente, etc.

II. Agentes biológicos inmunogénicos

Un agente biológico inmunogénico es cualquier agente biológico que provoca una respuesta inmunitaria en el hospedador, por ejemplo, un hospedador humano. Por tanto, el agente biológico inmunogénico puede ser un polipéptido (por ejemplo, glucoproteína, fosfoproteína u otra forma modificada), hidrato de carbono, lípido, polinucleótido (por ejemplo, cromatina, polinucleótido metilado u otra forma modificada). En algunas realizaciones, el agente biológico inmunogénico provoca directamente una respuesta inmunitaria, por ejemplo, es en sí mismo un inmunógeno (antígeno) diana. En algunas realizaciones, el agente biológico inmunogénico es un polinucleótido que codifica el inmunógeno diana. Por ejemplo, cuando un polinucleótido que codifica un antígeno diana se expresa en una célula presentadora de antígeno (APC), se monta una respuesta inmunitaria contra el antígeno expresado. El agente biológico inmunogénico se puede administrar solo, en combinación con un segundo, tercer y/o cuarto agente biológico inmunogénico (por ejemplo, en el caso de una vacuna preventiva de múltiples dianas) y/o en combinación con un adyuvante para aumentar la respuesta inmunitaria.

A. Vectores de expresión

Los vectores de expresión para usar como se describe en el presente documento pueden incluir vectores procedentes de virus, por ejemplo, vectores de virus adenoasociados (VAA) recombinantes, vectores retrovíricos, vectores adenovíricos, vectores modificados de vacuna Ankara (MVA) y vectores lentivíricos (por ejemplo, procedentes de HSV-1) (véase, por ejemplo, Brouardet al.(2009) British J. Pharm. 157:153). Los vectores procedentes de virus para uso terapéutico normalmente se vuelven incompetentes o atenuados para la replicación. Por ejemplo, en el caso de un vector adenovírico, el genoma adenovírico se puede modificar para eliminar los genes E1 y E3. Para la producción, el vector de replicación deficiente se puede administrar a una célula que expresa el gen E1 de manera que la célula produzca adenovirus recombinante (rAd, por sus siglas en inglés). Este rAd se puede recolectar y usar para una única ronda de infección para administrar la composición transgénica a otra célula dentro de un mamífero con el fin de provocar respuestas inmunitarias a un antígeno polipeptídico codificado.

Ejemplos de vectores víricos adecuados incluyen adenovirus 5, incluyendo, por ejemplo, Ad5 con eliminaciones de las regiones E1/E3 y Ad5 con una eliminación de la región E4. Otros vectores adenovíricos adecuados incluyen las cepas 2, las cepas 4 y 7 probadas por vía oral, adenovirus entéricos 40 y 41, y otras cepas (por ejemplo, Ad34, Ad26 o Ad35) que son suficientes para administrar un antígeno y provocar una respuesta inmunitaria adaptativa al antígeno transgénico [Lubecket al.,Proc Natl Acad Sci USA, 86(17), 6763-6767 (1989); Shenet al.,J Virol, 75(9), 4297-4307 (2001); Baileyet al.,Virology, 202(2), 695-706 (1994)]. El vector vírico no necesita haber sido aislado de seres humanos, pero puede provenir de un no humano tal como el adenovirus 3 del chimpancé (ChAd3, por sus siglas en inglés) (véase, por ejemplo, Collocaet al.(2012) Sci. Transl. Med. 4:115; Stanleyet al.(2014) Nat. Med. doi:10.1038/nm.3702). En algunas realizaciones, el vector adenovírico es un vector adenovírico vivo incompetente para la replicación (tal como Ad5r con E1 y E3 eliminados), un vector adenovírico vivo y atenuado (tal como el virus con eliminación de E1B55K) o un vector adenovírico vivo con replicación de tipo silvestre.

Las secuencias de control de la transcripción y la traducción en vectores de expresión para usar como se describe en el presente documento se pueden proporcionar mediante fuentes víricas. Por ejemplo, promotores y potenciadores de uso común proceden, por ejemplo, de beta actina, adenovirus, virus de simio (SV40) y citomegalovirus humano (CMV). Por ejemplo, son adecuados vectores que permiten la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor CMV, promotor temprano de SV40, promotor posterior SV40, promotor de metalotioneína, promotor del virus del tumor mamario murino, promotor del virus del sarcoma de Rous, promotor transductor u otros promotores que se hayan mostrado eficaces para la expresión en células de mamífero. Se pueden usar secuencias de señal, control y/o promotoras víricas o no víricas adicionales, siempre que dichas secuencias de control sean compatibles con las células hospedadoras que se van a transfectar.

B. Inmunógenos

Los inmunógenos para usar como se describe en el presente documento pueden proceder de antígenos, tales como, por ejemplo, antígenos víricos, antígenos bacterianos, antígenos de cáncer, antígenos de hongos o antígenos de parásitos (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 8.222.224 para una lista de antígenos que pueden usarse como se describe en el presente documento).

Ejemplos particulares de antígenos que se pueden utilizar como se describe en el presente documento son los procedentes del virus de la gripe (por ejemplo, HA, NA, M1, NP), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH, por ejemplo, gag, pol, env, etc.), virus del papiloma humano (VPH, por ejemplo, proteínas de la cápside tales como L1), virus de la encefalomielitis equina venezolana (EEV), virus de Epstein Barr, virus del herpes simple (VHS), virus del herpes humano, rinovirus, virus de Coxsackie, enterovirus, hepatitis A, B, C, E y G (VHA, VHB, VHC, VHE, HGV, por ejemplo, antígeno de superficie), virus de las paperas, virus de la rubeola, virus del sarampión, poliovirus, virus de la viruela, virus de la rabia y virus de la varicela-zóster.

Los antígenos víricos adecuados también incluyen proteínas víricas no estructurales, por ejemplo, proteínas codificadas por ácido nucleico vírico que no codifican polipéptidos estructurales, en contraste con los que producen la cápside o la proteína que rodea a un virus. Proteínas no estructurales incluyen aquellas proteínas que promueven la replicación del ácido nucleico vírico, expresión genética vírica, o procesamiento postraduccional, tales como, por ejemplo, proteínas no estructurales 1, 2, 3 y 4 (NS1, NS2, NS3 y NS4, respectivamente) de encefalitis equina venezolana (EEV), de encefalitis equina del este (EEE), o del bosque Semliki.

Los antígenos bacterianos pueden proceder de, por ejemplo,Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Helicobacter pylori, Streptococcus bovis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Corynebacterium diphtheriae, Borrelia burgdorferi, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Salmonella typhi, Vibrio chloerae, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Yersinia pestis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, Mycoplasm sp., Legionella pneumophila, Rickettsia typhi, Chlamydia trachomatisyShigella dysenteriae, Vibrio cholera(por ejemplo, subunidad B de la toxina del cólera, pilus corregulado por la toxina del cólera (PCT));Helicobacter pylorii(por ejemplo, VacA, CagA, NAP, Hsp, catalasa, ureasa);E. coli(por ejemplo, enterotoxina termolábil, antígenos fimbriales).

Los antígenos parásitos pueden proceder de, por ejemplo,Giardia lamblia, Leishmaniasp.,Trypanosomasp.,Trichomonassp.,Plasmodiumsp. (por ejemplo, antígenos proteicos de superficie deP. falciparum,tal como pfs25, pfs28, pfs45, pfs84, pfs 48/45, pfs 230, Pvs25 y Pvs28);Schistosomasp.;Mycobacterium tuberculosis(por ejemplo, Ag85, MPT64, ESAT-6, CFP10, R8307, MTB-32 MTB-39, CSP, LSA-1, LSA-3, EXP1, SSP-2, SALSA, STARP, GLURP, MSP-1, MSP-2, MSP-3, MSP-4, MSP-5, MSP-8, MSP-9, AMA-1, proteína de membrana integral tipo 1, RESA, EBA-175 y DBA).

Los antígenos fúngicos pueden proceder de, por ejemplo,Tinea pedis, Tinea corporus, Tinea cruris, Tinea unguium, Cladosporium carionii, Coccidioides immitis, Candidasp.,Aspergillus fumigatusyPneumocystis carinii.

Antígenos del cáncer incluyen, por ejemplo, antígenos expresados o sobreexpresados en el cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de piel (por ejemplo, melanoma), leucemia o linfoma. Antígenos de cáncer de ejemplo incluyen, por ejemplo, VPH L1, VPH L2, VPH E1, VPH E2, fosfatasa alcalina placentaria, AFP, BRCA1, Her2/neu, CA 15-3, CA 19-9, CA-125, CEA, Hcg, activador de plasminógeno de tipo urocinasa (Upa), inhibidor activador del plasminógeno, CD53, CD30, CD25, C5, CD11a, CD33, CD20, ErbB2, CTLA-4. Véase Sliwkowski y Mellman (2013) Science 341: 6151 para conocer dianas adicionales del cáncer.

C. Adyuvantes

En algunas realizaciones, las composiciones comprenden además al menos un adyuvante. Los adyuvantes adecuados incluyen, por ejemplo, los compuestos lipídicos y no lipídicos, toxina del cólera (TC), TC subunidad B, derivado CTK63 de la TC, enterotoxina termolábil (TL) deE. coli,derivado LTK63 de TL, Al(OH)3 y ácidos orgánicos poliiónicos como se describe en, por ejemplo, el documento WO2004/020592, Anderson y Crowle, Infect. Immun. 31(1 ):413-418 (1981), Rotermanet al.,J. Physiol. Pharmacol., 44(3):213-32 (1993), Arora y Crowle, J. Reticuloendothel. 24(3):271-86 (1978), y Crowle y May, Infect. Immun. 38(3):932-7 (1982)). Los ácidos orgánicos poliiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, ácido 6,6'-[3,3'-demitil[1,1'-bifenil]-4,4'-diil]bis(azo)bis[4-amino-5-hidroxy-1,3-naftaleno-disulfónico] (Azul de Evans) y ácido 3,3'-[1,1'bifenil]-4,4'-diilbis(azo)bis[4-amino-1-naftalen sulfónico] (Rojo Congo). Los expertos en la materia apreciarán que los ácidos orgánicos poliiónicos pueden usarse para cualquier método de vacunación basado en ácidos nucleicos junto con cualquier tipo de administración.

También se pueden utilizar agonistas de TLR-3 (por ejemplo, ARNbc y miméticos del mismo, tales como poliI:C, poli A:U y poliI:poliC). Los agonistas de TLR-3 incluyen, por ejemplo, ARN de horquilla corto, ARN de origen vírico, segmentos cortos de ARN que pueden formar ARN bicatenario o de horquilla corta y ARN de interferencia pequeño (ARNip). En algunas realizaciones, el agonista de TLR-3 es ARNbc procedente de virus, por ejemplo, ARNbc procedente de un virus Sindbis o intermedios víricos de ARNbc (Alexopoulouet al.(2001) Nature 413:732). En algunas realizaciones, el agonista de TLR-3 es un ARN de horquilla corto. Las secuencias de ARN de horquilla corto normalmente comprenden dos secuencias complementarias unidas mediante una secuencia enlazadora. La secuencia enlazadora particular no es un aspecto crítico de la invención. Se puede usar cualquier secuencia enlazadora apropiada siempre que no interfiera con la unión de las dos secuencias complementarias para formar un ARNbc. Los agonistas de TLR-3 pueden dar como resultado la liberación de citocinas proinflamatorias (por ejemplo, IL-6, IL-8, TNF-alfa, IFN-alfa, IFN-beta) cuando se ponen en contacto con una célula respondedora (por ejemplo, una célula dendrítica, una célula mononuclear de sangre periférica o un macrófago)in vitrooin vivo.

Otros adyuvantes adecuados incluyen inmunomoduladores tópicos tales como, miembros de la familia de las imidazoquinolinas tales como, por ejemplo, imiquimod y resiquimod (véase, por ejemplo, Henggeet al.,Lancet Infect. Dis. 1(3):189-98 (2001).

Adyuvantes adecuados adicionales están disponibles comercialmente como, por ejemplo, adyuvantes adicionales a base de alumbre (por ejemplo, Alhydrogel, Rehydragel, fosfato de aluminio, Algamulina); adyuvantes a base de aceite (adyuvante incompleto y adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Mich.), Specol, RIBI, TiterMax, Montanide ISA50 o Seppic MONTANIDE ISA 720); adyuvantes a base de copolímeros de bloqueo no iónicos, citocinas (por ejemplo, GM-CSF o ligando Flat3); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.); AS-2 (SmithKline Beecham, Filadelfia, Pa.); sales de calcio, hierro o zinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos derivatizados catiónica o aniónicamente; polifosfacenos; microesferas biodegradables; monofosforil lípido A y Quil A. Citocinas, tales como GM-CSF o interleucina-2, -7 o -12, también son adyuvantes adecuados. También se pueden utilizar como adyuvantes hemocianinas (por ejemplo, hemocianina de lapa californiana) y hemoeritrinas. Adyuvantes de polisacáridos tales como, por ejemplo, quitina, quitosano y quitina desacetilada también son adecuados como adyuvantes. Otros adyuvantes adecuados incluyen peptidoglucanos bacterianos de dipéptido muramil (MDP, N acetilmuramil L alanil D isoglutamina) y sus derivados (por ejemplo, treonil-MDP y MTPPE). El esqueleto de la pared celular (EPC) de BCG y BCG se pueden usar como adyuvantes, con o sin dimicolato de trehalosa. El dimicolato de trehalosa se puede utilizar solo (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 4.579.945). Las endotoxinas destoxificadas también son útiles como adyuvantes solos o en combinación con otros adyuvantes (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 4.866.034. 4.435.386, 4.505.899, 4.436.727, 4.436.728 y 4.505.900; y 4.520.0l9). Las saponinas QS21, QS17, QS7 también son útiles como adyuvantes (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.057.540; los documentos EP 0362 279; WO 96/33739; y W o 96/11711). otros adyuvantes adecuados incluyen Montanide ISA 720 (Seppic, Francia), SAF (Chiron, Calif., Estados Unidos), ISCOMS (c Sl ), MF-59 (Chiron), la serie SBAS de adyuvantes (por ejemplo, SBAS-2, SBAS-4 o SBAS-6 o variantes de los mismos, disponibles en SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica), Detox (Corixa, Hamilton, Mont.) y RC-529 (Corixa, Hamilton, Mont.).

También se contempla el uso de superantígenos como adyuvantes en la presente invención. Los superantígenos incluyen exoproteínas deStaphylococcus,tales como las enterotoxinas alfa, beta, gamma y delta de S.aureusy S.epidermidis,y las exotoxinas alfa, beta, gamma y delta deE. coli.Las enterotoxinas deStaphylococcuscomunes se conocen como enterotoxina A estafilocócica (EAE) y enterotoxina B estafilocócica (EBE), y se describen enterotoxinas hasta E (EEE) (Rottet al.,1992). También se pueden utilizarStreptococcus pyogenes B(SEB), la enterotoxina deClostridium perfringens(Bownesset al.,1992), la proteína asociada a la membrana citoplasmática (CAP) de S.pyogenes(Satoet al.,1994) y la toxina 1 del síndrome de shock tóxico (TSST 1) de S.aureus(Schwabet al.,1993).

Para las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento, los adyuvantes pueden diseñarse para inducir, por ejemplo, una respuesta inmunitaria predominantemente del tipo Th1 o Th2. Altos niveles de citocinas de tipo Th1 (por ejemplo, IFN-gamma, TNF-alfa, IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias mediadas por células a un antígeno administrado. En cambio, altos niveles de citocinas de tipo Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias humorales. Después de la administración oral de una composición que comprende un polipéptido inmunogénico como se proporciona en el presente documento, normalmente se provocará una respuesta inmunitaria que incluye respuestas de tipo Th1 y Th2.

III. Sistemas de administración dirigidos

Las composiciones y métodos descritos actualmente para la administración ileal pueden depender de recubrimientos, matrices y dispositivos apropiados tales como los que se describen a continuación.

A. Recubrimientos entéricos, matrices y dispositivos

Los recubrimientos entéricos se utilizan para proteger sustancias del entorno de pH bajo del estómago y retrasar la liberación de la sustancia encerrada hasta que alcanza una diana deseada más adelante en el tracto digestivo. Los recubrimientos entéricos son conocidos y están disponibles comercialmente. Los ejemplos incluyen polímeros sensibles al pH, polímeros biodegradables, hidrogeles, sistemas de liberación prolongada y sistemas de administración osmótica (véase, por ejemplo, Chourasia y Jain (2003) J. Pharm. Pharmaceutical Sci. 6:33).

El pH del tracto gastrointestinal (TGI) progresa desde muy ácido en el estómago (pH ~ 2) a más neutro en el íleon (pH ~ 5,8-7,0). Se pueden usar recubrimientos sensibles al pH que se disuelven en el íleon o justo antes del íleon. Los ejemplos incluyen los polímeros L y S de Eudragit® (valores de pH liminar que varían de 5,5 a 7,0); ftalato de acetato de polivinilo (pH 5,0), ftalato de hidroxipropil metilcelulosa 50 y 55 (pH 5,2 y 5,4, respectivamente) y ftalato de acetato de celulosa (pH 5,0). Thakralet al.(2013) Expert Opin. Drug Deliv. 10:131 revisan formulaciones de Eudragit® para la administración ileal, en particular, combinaciones de L y S que aseguran la administración a pH <7,0. Crottset al.(2001) Eur. J Pharm. Biol. 51:71 describen formulaciones de Eudragit® con propiedades de desintegración adecuadas. Vijayet al.(2010) J. Mater. Sci. Mater. Med. 21:2583 revisan los copolímeros a base de ácido acrílico (AA)-metil metacrilato (MMA) para la administración ileal a pH 6,8.

Para la administración ileal, el recubrimiento de polímero normalmente se disuelve a aproximadamente pH 6,8 y permite la liberación completa en aproximadamente 40 minutos (véase, por ejemplo, Huyghebaertet al.(2005) Int. J. Pharm. 298:26). Para conseguir esto, una sustancia terapéutica se puede cubrir con capas de diferentes recubrimientos, por ejemplo, de modo que la capa más externa protege la sustancia a través de condiciones de pH bajo y se disuelve cuando el comprimido sale del estómago, y al menos una capa interna que se disuelve cuando el comprimido pasa a un pH creciente. Se describen ejemplos de recubrimientos en capas para la administración al íleon distal, por ejemplo, en el documento WO2013148258.

Los polímeros biodegradables (por ejemplo, pectina, polímeros azoicos) se basan normalmente en la actividad enzimática de la microflora que vive en el TGI. El íleon alberga una mayor cantidad de bacterias que las etapas anteriores, incluyendo lactobacilos y enterobacterias.

Los sistemas de administración oral de liberación controlada por osmótica (OROS®; Alza) es un ejemplo de un sistema osmótico que se degrada con el tiempo en condiciones acuosas. Dichos materiales pueden manipularse con otros recubrimientos o en diferentes espesores, para administrar específicamente al íleon (véase, por ejemplo, Conleyet al.(2006) Curr. Med. Res. Opin. 22:1879).

Polímeros combinados para la administración al íleon se describen en el documento WO2000062820. Los ejemplos incluyen Eudragit® L100-55 (25 mg/cápsula) con citrato de trietilo (2,4 mg/cápsula) y Povidona K-25 (20 mg/comprimido) seguido de Eudragit® FS30D (30 mg/comprimido). Se pueden aplicar polímeros sensibles al pH para efectuar la administración al íleon, como se describe arriba y, por ejemplo, copolímeros de ácido metacrílico (por ejemplo, poli(ácido metacrílico-co-metacrilato de metilo) 1:1), ftalato de acetato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato succinato de hidroxipropil metilcelulosa, ftalato de acetato de polivinilo, trimelitato de acetato de celulosa, carboximetil etilcelulosa, goma laca u otros polímeros adecuados. La capa de recubrimiento también puede estar compuesta por polímeros formadores de película que son sensibles a otros componentes luminales además del pH, tales como la degradación bacteriana o un componente que tiene dicha sensibilidad cuando se mezcla con otro polímero formador de película. Ejemplos de dichos componentes que proporcionan liberación retardada al íleon son polímeros que comprenden enlace(s) azo, polisacáridos tales como la pectina y sus sales, galactomananos, amilosa y condroitina, polímeros disulfuro y glucósidos.

Componentes con pH variable, agua y sensibilidades enzimáticas se pueden usar en combinación para dirigir una composición terapéutica al íleon. El espesor del recubrimiento también se puede utilizar para controlar la liberación. Los componentes también se pueden utilizar para formar una matriz, en el que está integrada la composición terapéutica. Véase, en general, Frontiers in Drug Design & Discovery (Bentham Science Pub. (2009), vol. 4.

B. Cápsulas de frecuencia o radiocontroladas

Como alternativa a la disolución de recubrimientos y matrices, la administración en un sitio específico puede ser a través de cápsulas que se liberan con una señal generada externamente. Los primeros modelos se liberaban para una señal de alta frecuencia (AF), como se divulga en Digeniset al.(1998)Pharm. Sci. Tech. Today1:160. Desde entonces, el concepto de cápsula de AF original se ha actualizado y el resultado se comercializa como InteliSite®. La cápsula actualizada es un sistema de administración que no se desintegra y se activa por radiofrecuencia. El radiomarcaje de la cápsula permite determinar la ubicación de la cápsula dentro de una región específica del tracto GI mediante gammagrafía gamma. Cuando la cápsula llega a la ubicación deseada en el tracto GI, la activación externa abre una serie de ventanas del depósito de la cápsula del fármaco.

En algunas realizaciones, el agente biológico inmunogénico se puede encerrar en una cápsula radiocontrolada, de modo que la cápsula sea rastreada y señalada una vez llega al íleon. En algunas realizaciones, la cápsula se señala en un momento dado después de la administración que corresponde al momento en que se espera que llegue al íleon, con o sin detección.

C. Formulaciones

Las composiciones farmacéuticas se pueden usar con fines profilácticos y terapéuticos como se describe en el presente documento. Tal como se ha explicado anteriormente, se pueden preparar composiciones farmacéuticas para proteger contra la degradación del estómago de manera que el agente biológico inmunogénico administrado alcance la ubicación deseada. Se describen métodos de microencapsulación de ADN y fármacos para administración oral, por ejemplo, en el documento US2004043952.

Una composición farmacéutica inmunogénica puede contener sales farmacéuticamente aceptables del agente biológico inmunogénico (por ejemplo, polipéptido inmunogénico o polinucleótido que codifica un polipéptido inmunogénico). Se pueden preparar dichas sales a partir de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables, incluyendo bases orgánicas (por ejemplo, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias y aminoácidos básicos) y bases inorgánicas (por ejemplo, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio). Algunos ejemplos particulares de sales incluyen solución salina tamponada con fosfato y solución salina (por ejemplo, por ingestión, administración nasal o inyección).

Un recubrimiento de liberación retardada o un recubrimiento adicional de la formulación puede contener otros polímeros formadores de película que no son sensibles a las condiciones luminales por razones técnicas o control cronográfico de la liberación del fármaco. Los materiales que se utilizarán para dicho fin incluyen, aunque no de forma limitativa; azúcar, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, acetato de polivinilo, hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y otros, utilizados solo o en mezclas.

Aditivos tales como dispersantes, colorantes, pigmentos, polímeros adicionales, por ejemplo, poli(etilacrilato, metilmetacrilato), agentes antiadherentes y antiespumantes se pueden incluir en una capa de recubrimiento. Se pueden añadir otros compuestos para aumentar el espesor de la película y disminuir la difusión de jugos gástricos ácidos en el material del núcleo. Las capas de recubrimiento también pueden contener plastificantes farmacéuticamente aceptables para obtener propiedades mecánicas deseadas. Dichos plastificantes son, por ejemplo, aunque sin limitación, triacetina, ésteres de ácido cítrico, ésteres de ácido Itálico, sebacato de dibutilo, alcohol cetílico, polietilenglicoles, monoésteres de glicerol, polisorbatos u otros plastificantes y mezclas de los mismos. La cantidad de plastificante se puede optimizar para cada fórmula, y en relación con el polímero(s) seleccionado(s), plastificante(s) seleccionado(s) y la cantidad aplicada de dicho(s) polímero(s).

En las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden emplear otros ingredientes farmacéuticos adecuados conocidos en la materia. Los vehículos adecuados incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera, un tampón, un vehículo sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio o microesferas biodegradables (por ejemplo, poliglicolato de polilactato). Microesferas biodegradables adecuadas se divulgan, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.° 4.897.268; 5.075.109; 5.928.647; 5.811.128 y 5.820.883. El polipéptido inmunogénico y/o vector de expresión transportador pueden encapsularse dentro de la microesfera biodegradable o asociarse con la superficie de la microesfera.

Dichas composiciones también pueden comprender tampones no inmunogénicos (por ejemplo, solución salina tamponada neutra o solución salina tamponada con fosfato), hidratos de carbono (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, bacteriostáticos, agentes quelantes tales como EDTA o glutatión, adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio), agentes de suspensión, agentes espesantes y/o conservantes. Como alternativa, las composiciones de la presente invención se pueden formular como liofilato. Los compuestos también pueden encapsularse dentro de liposomas usando tecnología bien conocida.

IV. Respuestas inmunitarias y vacunas

Las composiciones farmacéuticas para administración al íleon como se describen en el presente documento están diseñadas para provocar una respuesta inmunitaria de un individuo que es específica para un agente biológico inmunogénico incluido en la composición farmacéutica. La composición farmacéutica se puede utilizar de forma profiláctica o terapéutica como vacuna para evitar o reducir una infección vírica, infección bacteriana, infección parasitaria, infección por hongos o cáncer. Las composiciones farmacéuticas se pueden utilizar para tratar en cualquier etapa, por ejemplo, en las etapas precancerosa, cancerosa o metastásica, o para prevenir una enfermedad o infección.

Por ejemplo, las composiciones descritas en el presente documento pueden usarse para prevenir o tratar infecciones, tales como la gripe, hepatitis o VIH, o para la prevención o el tratamiento del cáncer. Dentro de dichos métodos, las composiciones farmacéuticas se administran normalmente a un individuo que puede o no estar afectado por la enfermedad, trastorno o infección. En algunas realizaciones, una enfermedad, trastorno o infección se diagnostica antes de la administración, por ejemplo, utilizando criterios generalmente aceptados en la materia. Por ejemplo, una infección vírica puede diagnosticarse mediante la medición del valor vírico en una muestra del paciente, una infección bacteriana puede diagnosticarse mediante la detección de las bacterias en una muestra del paciente, y el cáncer puede diagnosticarse mediante la detección de la presencia de un tumor maligno. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar antes o después de la extirpación quirúrgica de tumores primarios y/o tratamientos tales como la administración de radioterapia o fármacos quimioterapéuticos convencionales.

La inmunoterapia es normalmente inmunoterapia activa, en la que el tratamiento se basa en la estimulaciónin vivodel sistema inmunitario endógeno del hospedador para reaccionar contra, por ejemplo, tumores o células infectadas por bacterias o virus, con la administración de agentes modificadores de la respuesta inmunitaria (por ejemplo, agentes biológicos inmunogénicos).

La frecuencia de administración de las composiciones profilácticas o terapéuticas descritas en el presente documento, así como la dosificación, variará de un individuo a otro y se puede establecer fácilmente utilizando técnicas estándar. Normalmente, se pueden administrar entre 1 y 52 dosis durante un periodo de 52 semanas. En algunas realizaciones, se administran 3 dosis, a intervalos de 1 mes, o se administran 2-3 dosis cada 2-3 meses. En algunas realizaciones, se puede administrar una combinación de más de un antígeno simultánea o secuencialmente, por ejemplo, una vacuna anual contra la gripe que contiene componentes individuales dirigidos a cada subtipo de gripe o múltiples clados dentro de un subtipo. En algunas realizaciones, los intervalos son más como una vez al año, por ejemplo, una vacuna anual contra la gripe basada en la cepa actual en particular. Las vacunas de refuerzo se pueden administrar periódicamente a partir de entonces. Los protocolos alternativos pueden ser apropiados para pacientes individuales y enfermedades y trastornos particulares.

Una dosis adecuada es una cantidad de un agente biológico inmunogénico que, cuando se administra como se ha descrito anteriormente, es capaz de promover, por ejemplo, una respuesta inmunitaria antitumoral, antivírica o antibacteriana, y está al menos un 15-50 % por encima del nivel basal (sin tratar), o al menos un 5-50 % (por ejemplo, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 1,5 veces, 2 veces o más) por encima del nivel del tratamiento no dirigido al íleon. Dicha respuesta se puede controlar mediante la medición de los anticuerpos antitumorales en un paciente o mediante la generación dependiente de la vacuna de linfocitos T citolíticos capaces de destruir, por ejemplo, las células tumorales del paciente, las células infectadas por virus del paciente o las células infectadas por bacterias del pacientein vitro.Dichas vacunas también pueden generar una respuesta inmunitaria que conduzca a un mejor resultado clínico (por ejemplo, supervivencia libre de enfermedad completa o parcial o más prolongada, valores víricos reducidos) en pacientes vacunados en comparación con pacientes no vacunados, o pacientes que reciben tratamiento no dirigido al íleon.

En general, un régimen de dosificación y tratamiento adecuado proporciona el compuesto(s) activo(s) en una cantidad suficiente para proporcionar beneficio terapéutico y/o profiláctico. Dicha respuesta se puede controlar mediante el establecimiento de un resultado clínico mejorado (por ejemplo, valor vírico reducido o negativo, remisiones más frecuentes, supervivencia libre de enfermedad completa o parcial o más prolongada) en pacientes tratados en comparación con pacientes tratados con tratamiento no dirigido al íleon o pacientes no tratados. Dichas respuestas inmunitarias generalmente se pueden evaluar usando ensayos estándar de proliferación, citotoxicidad o citocinas descritos anteriormente, que se pueden realizar usando muestras obtenidas de un paciente antes y después del tratamiento.

Por ejemplo, la detección de inmunocomplejos formados entre un polipéptido inmunogénico y anticuerpos en el líquido corporal, que son específicos para el polipéptido inmunogénico, puede usarse para controlar la eficacia de la terapia, por ejemplo, para una enfermedad o trastorno en el que está asociado el polipéptido inmunogénico. Se pueden analizar muestras de líquido corporal tomadas de un individuo antes y después del inicio de la terapia (por ejemplo, terapia dirigida al íleon) para determinar los inmunocomplejos mediante métodos conocidos. En resumen, se compara el número de inmunocomplejos detectados en ambas muestras. Un cambio significativo en el número de inmunocomplejos en la segunda muestra (terapia post-dirigida) en relación con la primera muestra (terapia pre-dirigida) refleja una terapia exitosa.

V. Ejemplos

Se conocen métodos farmacéuticos para administrar moléculas pequeñas al intestino, pero la capacidad de administrar un producto biológico grande al intestino para reconocimiento inmunológico adecuado es poco conocida. Los ratones no son capaces de tragar pastillas, por lo que es difícil realizar estudios con comprimidos en modelos animales. Adicionalmente, la ubicación del mejor lugar para administrar el vector de vacuna a fin de provocar una respuesta al antígeno transgénico no se ha caracterizado en seres humanos. En ovejas, se demostró que el yeyuno es la diana más eficaz para provocar una respuesta inmunitaria a un antígeno transgénico codificado por adenovirus (Mutwariet al.(1999)Immunology97:455). Aquí se muestra el resultado de varios estudios en primates humanos o no humanos con formas farmacéuticas orales humanas mejoradas para la administración de agentes biológicos.

Ejemplo 1

Para determinar qué región del intestino delgado es más activa para inducir una respuesta inmunitaria al antígeno, se realizaron pruebas en seres humanos. Se administraron cápsulas radiocontroladas a voluntarios sanos normales, con la vacuna liberada de manera temprana en el intestino delgado (yeyuno) o más tarde en el intestino delgado (íleon). Se ha descrito el uso de cápsulas radiocontroladas para la administración de fármacos de molécula pequeña, pero no para la administración de vacunas (Digeniset al.(1991) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 7:309).

La vacuna estaba compuesta por adenovirus recombinantes que expresaban el antígeno HA de la gripe de A/CA/04/2009 (rAd-HA-ARNbc) (véase, por ejemplo, el documento US2012/0244185). Se administraron un total de 1011 unidades infecciosas (UI) a cada sujeto el día 0. El número de linfocitos B preplasmáticos circulantes en sangre periférica se midió mediante el ensayo de células secretoras de anticuerpos (ASC) los días 0 y 7 después de la administración de la vacuna. Los resultados solo miden el número de ASC que reconocen el antígeno HA.

Los resultados muestran que las ASC se pudieron medir 7 días después de la inmunización en cada uno de los grupos tratados (Figura 1). Las respuestas promedio fueron más altas en el grupo dosificado al íleon que en el grupo dosificado al yeyuno. Las ASC de fondo en el día 0 fueron insignificantes. Para el íleon, se observó un promedio de 340 /- 111 (error estándar) ASC IgG y 74 /- 18 IgA en el día 7. Para el yeyuno, las respuestas promedio y de error estándar fueron 118 /- 30 ASC IgG y 28 /- 8 IgA. El grupo de íleon fue significativamente diferente del placebo (P = 0,03 el día 7 para ASC IgA, y tuvo una tendencia más alta para ASC IgG p = 0,07). Al contrario de los resultados en ovejas, los resultados en seres humanos indican que la administración en el íleon es más potente para provocar una respuesta de anticuerpos IgG o IgA que la administración en el yeyuno.

Las respuestas de linfocitos T también se determinaron mediante la detección de la liberación de interferón-Y (IFN-<y>) usando el ensayo ELISPOT®. La Figura 2 muestra que 12/12 del grupo con dosis en el íleon tenían niveles aumentados de IFN-y, en comparación con 8/12 del grupo con dosis en el yeyuno 7 días después de la administración. Asimismo, los niveles de IFN-<y>fueron significativamente más altos en el grupo con dosis en el íleon que en el grupo con dosis en el yeyuno.

Se midieron los valores de anticuerpos microneutralizantes (MN) de la gripe A/CA/07/2009. Los niveles aumentados de anticuerpos MN son indicativos de una respuesta de anticuerpos neutralizantes. Después de excluir a los sujetos que tenían una respuesta inicial de anticuerpos neutralizantes superior a 40 (Faixet al.(2012)PloS One 7:e34581),se representaron gráficamente los aumentos en los valores de MN para sujetos individuales. El número de sujetos con un aumento positivo fue de 9 de 10 para la vacuna administrada en el íleon frente a 6 de 10 para la vacuna administrada en el yeyuno (Figura 3). Los valores de la media geométrica (GMT) fueron similares entre los dos grupos, con GMT en el íleon que aumentaron de 22 a 92 frente a GMT en el yeyuno que aumentaron de 18 a 90. Los resultados indican que la liberación en el íleon es más fiable para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes a la gripe, lo que conduce posiblemente a un mayor porcentaje de sujetos protegidos contra la gripe.

Ejemplo 2

Se fabricaron a mano comprimidos utilizando celulosa microcristalina (PH-101, FMC) y almidón (Starch 1500, Colorcon) que incorporan sulfato de bario al 10 % como material radiopaco que contenía sílice ahumada como auxiliar de flujo y estearato de magnesio como lubricante de comprimidos. Los comprimidos de 7,14 mm de diámetro y 150 mg de peso se recubrieron con Eudragit® L-100 en una bandeja de recubrimiento usando un aumento de peso sólido del 10 % de recubrimiento como guía para saber si se añadió el recubrimiento entérico; los sólidos de recubrimiento contenían 4 partes de polímero Eudragit® por una parte de citrato de trietilo y 1 parte de talco. Como prueba inicial de rendimiento del recubrimiento entérico, a cuatro macacos cangrejeros se les administraron comprimidos mediante una sonda gástrica oral. La sonda gástrica oral es sólida y rígida, pero ahuecada en el medio para instilar líquidos. Tiene un tubo de silicona flexible en el extremo delantero de la sonda rígida que puede sostener un comprimido pequeño en su lugar. El tubo y el aparato de la pastilla se deslizaron por el esófago de los monos inmovilizados hasta que el extremo anterior pasó a través del esfínter cardíaco y llegó al estómago. Se utilizó un chorro de zumo de naranja para desalojar la pastilla en el estómago. Se tomaron radiografías en puntos temporales establecidos y se examinaron para determinar la ubicación y disolución del comprimido. La Tabla 1 resume los resultados.

La Figura 4 muestra que los comprimidos estaban completamente inalterados en el entorno de pH bajo del estómago; no hubo evidencia de disolución prematura de los comprimidos. Aunque grande para un mono, los comprimidos fueron capaces de pasar inalterados a través del estómago al intestino. En el intestino, se disolvieron a una velocidad razonable y se disolvieron completamente en 3 de cada 4 monos. En el 4o mono, la pastilla salió del estómago después de 3 horas y la pastilla no se había disuelto en el momento de la última radiografía. En general, los comprimidos funcionaron de manera aceptable y se seleccionó el recubrimiento Eudragit® L-100 para futuros estudios en seres humanos.

Ejemplo 3

Se completó un estudio clínico de fase 1 con inscripción secuencial, con una cohorte aleatorizada y controlada con placebo para evaluar la seguridad y la inmunogenicidad de una vacuna oral basada en Ad serotipo 5 recombinante (rAd5) contra la gripe estacional H1. El vector rAd5 (rAd-HA-ARNbc con HA de A/CA/04/2009) se describió en el ejemplo 1. El estudio tuvo una fase activa de aproximadamente 3 meses y se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de Good Clinical Practice aplicables, el United States Code of Federal Regulations, y las directrices del International Conference on Harmonization. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos después de discutir los riesgos. Se otorgó la aprobación del IRB antes de la dosificación de los sujetos.

Se produjo rAd-HA-ARNbc de grado de buenas prácticas de fabricación (GMP, por sus siglas en inglés) en bolsas Wave® (G<e>Healthcare, Waukesha, Wl) en Lonza Biologicals (Houston, TX). La purificación se realizó mediante cromatografía de intercambio iónico, seguido de intercambio de tampón. El vector purificado se mezcló con excipientes, liofilizados y luego se formaron comprimidos en Lonza utilizando celulosa microcristalina y almidón como volumen de comprimidos. Los comprimidos se recubrieron entéricamente con Eudragit® L 100 (Evonik Industries, Darmstadt, Alemania) utilizando un recubrimiento Vector HiCoater® LDCS-5 (Vector Freund, Cedar Rapids, lA). El producto final se liberó en un lote y se valoró mediante un ensayo de Ul estándar. El placebo se preparó como comprimidos de tamaño y forma similares que contenían 150 mg de celulosa microcristalina, sin recubrimiento entérico. El estudio comparó sujetos tratados con 109 UI, 1010 UI y placebo para la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria al transgén. Los sujetos recibieron comprimidos los días 0 y 28.

El número de linfocitos B preplasmáticos circulantes en sangre periférica se midió mediante ensayos de ASC los días 0 y 7 después de la dosis inicial, y los días 28 y 35 después de la segunda dosis (la segunda dosis se administró el día 28). Los resultados muestran que los recuentos de ASC se pudieron medir 7 días después de cada inmunización en los grupos tratados, pero no en el grupo placebo (Figura 5). Las respuestas promedio fueron más altas en el día 7 y más altas en el grupo de dosis alta que en el grupo de dosis baja. Las ASC de fondo en los días 0 y 28 fueron insignificantes e insignificantes para el grupo de placebo en todos los puntos temporales. Para el grupo de dosis alta, se encontró un promedio de 105 /- 33 y 27 /- 12 ASC para los días 7 y 35 respectivamente. Para el grupo de dosis baja, las ASC promedio fueron 41 /- 32 y 14 /- 8 para los días 7 y 35 respectivamente. El grupo placebo tuvo un promedio de 0,3 /- 0,3 y 0, para los días 7 y 35 respectivamente. El grupo de dosis alta fue significativamente más alto que el placebo (P = 0,01 y 0,05 para los días 7 y 35 respectivamente).

Las respuestas de anticuerpos neutralizantes a la gripe se midieron mediante ensayo de MN. Los resultados muestran un aumento dependiente de la dosis en los valores de MN en los grupos tratados frente al control con placebo (Figura 6). La frecuencia de pacientes que responden al tratamiento de MN con al menos un aumento de 2 veces en el grupo de dosis alta fue significativamente diferente a la del grupo de placebo (P = 0,003 según la prueba exacta de Fisher), mientras que la dosis baja tendió a aumentar, pero no fue significativamente mayor que el placebo (P = 0,2). Después de eliminar a los sujetos que tenían valores de MN superiores a 40, los valores de la media geométrica (GMT) se calcularon en los sujetos restantes (Tabla 2). También se calculó la respuesta del valor de veces de la media geométrica (GMFR, por sus siglas en inglés) del día 56 (Tabla 2). Estos resultados muestran que la inmunización oral genera valores de anticuerpos neutralizantes contra la gripe, con un aumento de más de 3 veces en el GMT después de la inmunización en el grupo de dosis alta. Estos resultados muestran que los comprimidos recubiertos con L 100 se pueden utilizar para la administración de vacunas al intestino.

Ejemplo 4

Se probaron parámetros para recubrimientos entéricosin vitropara determinar los tiempos de disolución con pH variable y porcentaje de recubrimiento. Los datos proporcionan pautas para la administración ileal después de la exposición gástrica a pH bajo (como en el estómago) y el tránsito posterior a través de un gradiente de pH creciente (como se encuentra en el duodeno y yeyuno) antes de llegar al íleon.

La desintegración del comprimido se probó con comprimidos de 150 mg preparados como se describe anteriormente, y recubiertos con un aumento de peso sólido total del 8, 10 o 12 %, utilizando Eudragit® L100, Eudragit® L100-55, o mezcla 1:1 (p/p) de polímeros L100 y L100-55, aplicado como una suspensión de disolvente orgánico. Por duplicado, los comprimidos preparados con cada polímero de recubrimiento, y en cada nivel de aplicación de recubrimiento, se expusieron previamente a líquido gástrico simulado USP (SGF, pH 1,6, sin pepsina) durante 120 minutos en un aparato de prueba de disolución de cilindro alternativo VanKel Bio-Dis III a 37 °C a una velocidad de movimiento alternativo de 10 inmersiones por minuto (IPM). Luego, los comprimidos se transfirieron a líquido intestinal simulado USP (SIF, pH 6,8, sin pancreatina). Se observó la desintegración de los comprimidos y se registró el tiempo hasta la desintegración completa de ambos comprimidos con una precisión de 5 minutos. Los datos indican que el tiempo de desintegración está influenciado tanto por la composición del polímero como por el espesor y proporcionan una guía con respecto a la selección adecuada de la composición de recubrimiento para influir en el comportamiento de los recubrimientos después de que los comprimidos salen del estómago.

El efecto del pH en el tiempo de desintegración se probó con comprimidos de 150 mg, recubiertos con un aumento de peso total de sólidos del 10 % con Eudragit® L100 o Eudragit® L100-55. Se preparó una serie de tampones ajustando el pH de USP SIF (sin pancreatina) a valores que abarcan la especificación USP de 6,8. Los comprimidos se expusieron previamente a USP SGF (sin pepsina) durante 120 minutos a 37 °C y 10 IPM, luego se transfirieron a las soluciones USP SIF de pH modificado. Se observó la desintegración de los comprimidos y se registró el tiempo hasta la desintegración completa con una precisión de 5 minutos. Los datos indican que la velocidad de desintegración está influenciada por el pH ambiental y difiere entre los dos polímeros. De nuevo, los resultados se pueden usar para la selección adecuada de una composición de recubrimiento para lograr la retención del fármaco a través del estómago y la parte superior del intestino delgado.

Ejemplo 5

Se llevó a cabo un estudio de fase 1, con reclutamiento secuencial, con una cohorte aleatorizada y controlada con placebo para evaluar la seguridad y la inmunogenicidad de una vacuna oral basada en Ad serotipo 5 recombinante (rAd5) contra la gripe estacional H1. Los comprimidos que contienen la vacuna se recubrieron como se describe en el presente documento para disolverse en el íleon. Los datos muestran que una vacuna oral en comprimidos sería competitiva con las vacunas existentes en términos de provocar respuestas de anticuerpos neutralizantes a la gripe.

Las respuestas de inhibición de la hemaglutinación (HAI) se midieron los días 0 y 28 (Figura 7A). Ningún sujeto tratado con placebo seroconvirtió, pero un sujeto con placebo pasó por alto la selección y tuvo un valor alto en el día 0. Ninguno de los sujetos vacunados tenía un valor de HAI inicial > 20. Después de la inmunización, nueve sujetos en el grupo de vacuna alcanzaron niveles seroprotectores (HAI >40) (Figura 7A). El valor de la media geométrica (GMT) para el grupo fue 611 (IC del 95 %: 30 - 124), un aumento de 7,7 veces la media geométrica (GMFR) sobre el GMT inicial de 79 (IC del 95 %: 6 - 11). De los once que aumentaron 4 veces (92 %), nueve seroconvertidos (SC) y los otros 2 sujetos mostraron un aumento de 4 veces en el valor de HAI de 5 a 20. El grupo de vacuna tuvo un aumento estadísticamente significativo en el número de los que respondieron 4 veces frente al placebo (11 frente a 0, con P < 0 0000 según la prueba exacta de Fisher). Los sujetos que recibieron placebo tuvieron un GMT de 11,9 (IC del 95 %: 6 - 25) el día 28 frente a un GMT de 11,0 el día 0 (IC del 95 %: 5 - 23).

La durabilidad de la respuesta de anticuerpos se midió mediante el examen de las respuestas de HAI 180 días después de la inmunización. En el grupo inmunizado con vacuna, un 75 % (9 de 12) de los sujetos estaban seroprotegidos el día 28 y un 75 % (9 de 12) todavía estaban seroprotegidos el día 180. Se representaron gráficamente los GMT de la HAI (Figura 7B), y se encontró que la disminución del GMT era de un 28 % entre los días 28 y 180 después de la inmunización.

Las respuestas de anticuerpos neutralizantes a la gripe se midieron mediante ensayo de MN. Se observaron aumentos significativos en los valores de MN en el grupo tratado frente al control con placebo (Figura 7C). La frecuencia de los que responden 4 veces de MN en el grupo tratado con la vacuna fue significativamente diferente a la del grupo placebo, con 11 sujetos que respondieron en el grupo tratado con la vacuna frente a 0 en el grupo de placebo (P < 00000 según la prueba exacta de Fisher).

Después de eliminar a los sujetos que tenían valores de MN iniciales (y valores de HAI) superiores a 40, los valores de la media geométrica (GMT) se calcularon en los sujetos restantes los días 0 y 28 como se muestra en la siguiente tabla. El GMT para el grupo de vacuna aumentó a 247 (IC 95: 89-685) frente a ningún aumento en el grupo de placebo durante un g Mt el día 28 de 9-6 (IC 95: 5-18). Estos cálculos no tuvieron ningún impacto en el grupo de vacuna, ya que ninguno de los sujetos tenía valores iniciales altos de MN o HAI. Estos resultados muestran que los valores de anticuerpos neutralizantes de la gripe se generan mediante inmunización oral, con un aumento de más de 20 veces en el GMT después de la inmunización en el grupo tratado con la vacuna.

Para medir las respuestas totales de anticuerpos a HA, el número de linfocitos B preplasmáticos circulantes en sangre periférica se midió mediante ensayo de ASC los días 0 y 7 después de la inmunización. Los resultados muestran que las ASC se pudieron medir de forma fiable el día 7 en el grupo tratado con la vacuna (Figura 7D). Las ASC de fondo fueron generalmente insignificantes el día 0. Para el grupo tratado con la vacuna, un promedio de 992 (+/- error est.

209, IC del 95 %: 532-1452) ASC IgG y 337 ASC IgA (+/- error est. 104, IC del 95 %: 117-580) cada uno por 1 * 106 PBMC se encontraron para el día 7, con solo un sujeto de 12 que no tiene respuesta de ASC detectable. El grupo de placebo no tenía manchas de IgA el día 7, pero un sujeto tenía un frotis de fondo alto y una respuesta de ASC IgG medible con manchas más pequeñas que las observadas normalmente. El grupo tratado fue significativamente diferente del placebo en términos de la capacidad de provocar una respuesta de ASC IgG o IgA en el día 7 (P = 00007 y P = 0,008 respectivamente mediante la prueba T).

Se midió retrospectivamente a los sujetos sus valores de antivector antes y después de la inmunización. Después de la inmunización oral, algunos sujetos tratados con la vacuna tuvieron un aumento en las respuestas de anticuerpos neutralizantes a Ad5, lo que llevó a un aumento de 26 veces en los valores de la GM de anticuerpos neutralizantes, en comparación con el aumento de veces de la GM de 10 veces en los sujetos tratados con placebo. En el grupo de vacuna, las respuestas de HAI y MN mostraron una tendencia similar para los sujetos individuales. Ocho sujetos fueron negativos para Ad5 antes de la inmunización y cuatro fueron positivos para Ad5 antes de la inmunización. Un sujeto que fue positivo para Ad5 no seroconvirtió HAI, sin embargo, un sujeto que fue positivo para Ad5 tuvo el mayor aumento en los valores de HAI (64 veces) de cualquiera de los sujetos del estudio. Este mismo sujeto tuvo una ganancia en los valores de MN de 362 veces sin ningún aumento en los valores de anticuerpos neutralizantes de Ad5 antes y después de la inmunización. No se observó una correlación entre los valores de Ad5 iniciales frente al número de veces de respuesta MN (o respuesta HAI) para los sujetos inmunizados con la vacuna en comprimidos.

Además, la vacuna en comprimidos descrita actualmente es estable a temperatura ambiente durante más de 270 días y puede tolerar excursiones a corto plazo a temperaturas más altas, lo que hace que este enfoque sea técnicamente viable.

Ejemplo 5 Discusión

El ejército de Estados Unidos realizó un estudio independiente para medir los efectos de sus campañas de vacunación estacional sobre las respuestas de anticuerpos neutralizantes en el personal militar, e informó un GMFR de valores de MN de 5,6 después de la inyección de vacuna trivalente inactivada (TIV, por sus siglas en inglés) y un GMFR de 2,2 después de la administración intranasal de vacuna gripe viva y atenuada (LAIV, por sus siglas en inglés), después de considerar los sujetos que tenían valores de MN superiores a 40 al inicio (Faixet al.(2012) PloS one 7: e34581). En otro estudio, se encontró que la tasa de SC para H1N1 era del 45 % para una inyección de 45 pg de proteína HA (sin adyuvante) (Gordonet al.(2012) Vaccine 30:5407), mientras que en otro, la vacuna H1N1 fue altamente inmunogénica con una tasa de SC del 78 % observada después de 1 dosis de una vacuna dividida (Greenberget al.(2009) 361:2405).

En contraste con los resultados variables observados con vacunas inyectadas, en el presente estudio, el GMFR de MN se calculó en 29 para los 12 sujetos tratados con la vacuna y un 92 % de los sujetos mostró un aumento de más de 4 veces en los valores de MN. En el presente estudio de comprimidos, la tasa de SC HAI entre los sujetos tratados con vacuna fue del 75 % y más de un 92 % de los sujetos tuvieron un aumento de 4 veces en los valores de HAI (Figura 7A). Los valores de MN fueron más altos que los valores de HAI. Es posible que el ensayo de MN sea más sensible o que la vacuna oral basada en rAd provoque respuestas neutralizantes más fuertes fuera de la región de la cabeza que las vacunas inyectadas con proteínas.

Las respuestas de HAI se provocan con vacunas comerciales inyectadas, pero se sabe que los valores de HAI disminuyen. Por ejemplo, los voluntarios no infectados por VIH tuvieron una caída del 67 % en los valores GMT de HAI entre 1 y 6 meses después de la inmunización (Crum-Cianfloneet al.(2011) Vaccine 29:3183). De forma similar, el porcentaje de sujetos seroprotegidos se redujo del 75 % al 56 % para los sujetos VIH negativos que se inscribieron con valores de hA i seronegativos (<1:10). Los estudios con vacunas contra la gripe pandémica también han demostrado una disminución en la durabilidad. En el estudio de la vacuna contra la gripe aviar AS03, el GMT alcanzó 563 después de 2 dosis de vacuna, pero a los 6 meses después de la inmunización, el GMT había bajado a 18, una disminución del 96 % (Leroux-Roelset al.(2010) Vaccine 28:849). En el presente estudio de vacuna en comprimidos, el porcentaje de sujetos seroprotegidos permaneció constante a un 75 % 1 y 6 meses después de la inmunización, y la caída del valor GMT de HAI fue menos dramática mostrando solo una disminución de un 28 % (Figura 7B). Una posibilidad es que la durabilidad sea mejor para las vacunas basadas en vectores debido a las respuestas mejoradas de linfocitos T.

Ejemplo 5 Materiales y métodos

Protocolo clínico e inscripción.Los sujetos se evaluaron previamente para valores de inhibición de hemaglutinación (HAI) dentro de los 45 días posteriores a la inscripción. Para poder participar en el estudio, los sujetos tenían que tener un título de HAI inicial de < 1:20, tener entre 18 y 49 años y gozar de buena salud. La fase activa del ensayo fue hasta el día 28, con la fase de seguimiento para el control de la seguridad para continuar durante 1 año.

Se inscribieron 24 sujetos. Todos los sujetos que se inscribieron completaron evaluaciones de seguridad e inmunogenicidad durante la fase activa y hasta el día 180 de la fase de control.

Aleatorización y enmascaramiento.El estudio fue diseñado para evaluar la vacuna (VXA-A11) en 12 sujetos a una dosis única de 1 * 1011 unidades infecciosas (UI) con 12 sujetos que recibieron un control de placebo. Hubo 3 sujetos tratados con vacuna centinela inscritos secuencialmente, con cada sujeto dosificado con una frecuencia no mayor a una cada 24 h. Después de una semana de control de las toxicidades relacionadas con la vacuna, los sujetos restantes en la cohorte tratada (9) fueron asignados al azar junto con 12 controles de placebo. La aleatorización se realizó mediante asignación generada por computadora, y el farmacéutico no ciego distribuyó el fármaco del estudio con identidad oculta al personal ciego. Todo el personal del centro de investigación, así como las personas directamente implicadas con los ensayos inmunológicos o la evaluación de la seguridad clínica, permanecieron ciegos a las asignaciones de tratamiento. Todos los sujetos estaban ciegos en el estudio.

Vacuna.El vector rAd (Ad5 no replicante) transporta ADN que codifica el transgén HA (A/CA/04/2009) cuya expresión está dirigida por un promotor de CMV y una horquilla de ARNbc molecular dirigida por un promotor separado. La sustancia farmacéutica de GMP se produjo en bolsas Wave (GE Healthcare, Waukesha, WI) en Lonza Biologicals (Houston, TX). La purificación se realizó mediante cromatografía de intercambio iónico, seguido de intercambio de tampón. El vector purificado se mezcló con excipientes, liofilizados y luego se formaron comprimidos en Lonza utilizando celulosa microcristalina y almidón como volumen de comprimidos. Los comprimidos se recubrieron entéricamente con Eudragit L100® (Evonik Industries, Darmstadt, Alemania) utilizando un sistema Vector Hi-Coater (Vector Freund, Cedar Rapids, IA). El producto final se liberó en un lote y se valoró mediante un ensayo estándar de UI en Lonza. El placebo se preparó como comprimidos de tamaño y forma similares que contenían 150 mg de celulosa microcristalina, sin recubrimiento entérico.

Criterios de valoración.El criterio de valoración principal de este estudio es la seguridad y el criterio de valoración secundario es la inmunogenicidad a través de la fase activa, principalmente mediante valores de HAI y seroconversiones de HAI. Los criterios de valoración inmunológicos adicionales incluyen valores de MN y ASC. Hubo 5 acontecimientos adversos en el grupo de placebo y 4 en el grupo de vacuna, todos los cuales fueron de grado 1 en intensidad. No se informaron acontecimientos adversos graves en el estudio.

Aislamiento y crioconservación de PBMC.Se recogió sangre en tubos K<3>EDTA Vacutainer® (BD, Franklin Lakes, NJ) y se aislaron PBMC el mismo día usando tubos Lymphoprep™ (Axis-Shield, Noruega). Las PBMC se congelaron y descongelaron utilizando reactivos sin suero de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Cellular Technology Ltd [CTL], Shaker Heights, OH).

Células secretoras de anticuerpos (ASC).Los kits de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISpot) para linfocitos B secretores de IgG e IgA se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Mabtech, Mariemont, OH). Se cultivaron células (entre 15 * 104 y 5 *105 células por pocillo) en pocillos triplicados, en medio CTL-Test para optimizar las manchas. La proteína HA (Protein Sciences Corp, Meriden, CT) se biotiniló y cuantificó usando un kit de biotinilación (Pierce, Rockford, IL).

Ensayos de anticuerpos.Se realizaron valores de HAI y microneutralización (MN) y se midieron frente a A/CA/07/2009 procedente de MDCK y A/CA/07/2009 procedente de huevo, respectivamente. Los valores de HAI y MN inferiores a 10 se marcaron como 5 según lo sugerido por el asesoramiento reglamentario.

Análisis estadístico.Se realizaron pruebas "t" de Students no apareado para comprobar las diferencias significativas entre grupos. Se utilizó una prueba exacta de Fisher bilateral para determinar si las frecuencias observadas eran diferentes para algunos análisis, como se indica en el texto. Para ambas pruebas, se consideraron significativos valores dep <0,05.Se proporcionaron intervalos de confianza del 95 por ciento (IC 95) para valores medidos.

Se entiende que los ejemplos y las realizaciones descritos en el presente documento son únicamente con fines ilustrativos y que los expertos en la materia podrán sugerir diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos y se han de incluir dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica para provocar una respuesta inmunitaria en un ser humano que comprende: (i) un vector adenovírico, que codifica un polipéptido inmunogénico abarcado por (ii) un agente que dirige la administración del vector adenovírico al íleon del ser humano, en donde el agente (ii) es un recubrimiento entérico que tiene un pH liminar de 5,8, 5,9, 6 o 6,1.

2. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en donde el recubrimiento entérico tiene un pH liminar de 6,0.

3. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 o 2, en donde el recubrimiento entérico se desintegra al menos un 75 % en comparación con su espesor original en 110 minutos a pH 5,8-6,8.

4. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el recubrimiento entérico comprende poli(metilmetacrilato-co-ácido metacrílico) 1:1.

5. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el recubrimiento entérico comprende Eudragit® L-100.

6. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el recubrimiento entérico comprende Eudragit® L-100, citrato de trietilo y talco.

7. La composición inmunogénica de la reivindicación 6, en donde el recubrimiento entérico comprende de 1-4 partes de Eudragit® L-100, 1-2 partes de citrato de trietilo y 1-2 partes de talco.

8. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el vector adenovírico codifica además ARNbc.

9. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición está en forma de comprimido.

10. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para usar en un método para administrar la composición al íleon de un ser humano que comprende la administración oral de la composición al ser humano.

11. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para usar en un método para provocar una respuesta inmunitaria en un ser humano que comprende administrar la composición al ser humano, en donde la respuesta inmunitaria es específica para el polipéptido inmunogénico.

12. La composición inmunogénica para usar de la reivindicación 11, en donde la administración da como resultado la producción de anticuerpos neutralizantes por parte del ser humano.