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ES2978570T3 - Anticuerpos anti-MERTK de alta afinidad y sus usos - Google Patents

Anticuerpos anti-MERTK de alta afinidad y sus usos Download PDF

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ES2978570T3
ES2978570T3 ES20714383T ES20714383T ES2978570T3 ES 2978570 T3 ES2978570 T3 ES 2978570T3 ES 20714383 T ES20714383 T ES 20714383T ES 20714383 T ES20714383 T ES 20714383T ES 2978570 T3 ES2978570 T3 ES 2978570T3
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Isabel Kurth
Shugaku Takeda
Celia Andreu-Agullo
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Abstract

La presente divulgación proporciona anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanizados) que se unen específicamente a la tirosina quinasa Mer (MERTK; por ejemplo, MERTK humana) y composiciones que comprenden dichos anticuerpos. La presente divulgación también proporciona conjugados anticuerpo-fármaco que comprenden (i) un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en el presente documento que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humana), y (ii) agentes citotóxicos conjugados directamente con los anticuerpos o conjugados con los anticuerpos a través de enlaces, y composiciones que comprenden dichos conjugados anticuerpo-fármaco. La presente divulgación también proporciona métodos para tratar el cáncer, que comprenden administrar a un sujeto humano que lo necesite (a) un anticuerpo anti-MERTK que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humano) o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en este documento, o (b) un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende (i) un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a MERTK (por ejemplo, MERTK humano), y (ii) un agente citotóxico conjugado directamente con el anticuerpo o conjugado con el anticuerpo a través de un conector. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-MERTK de alta afinidad y sus usos
1. Campo
La presente divulgación divulga anticuerpos (p. ej., anticuerpos humanizados) que se unen específicamente a Mer Tirosina Quinasa (MERTK; p. ej., MERTK humana) y composiciones que comprenden tales anticuerpos. La presente divulgación también divulga productos conjugados de anticuerpo-fármaco que comprenden (i) un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), y (ii) agentes citotóxicos conjugados directamente con los anticuerpos o conjugados con los anticuerpos a través de conectores, y composiciones que comprenden tales productos conjugados de anticuerpo-fármaco. La presente divulgación también divulga métodos para tratar el cáncer, que comprenden administrar a un sujeto humano que lo necesite (a) un anticuerpo anti-MERTK que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, o (b) un producto conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende (i) un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), y (ii) un agente citotóxico conjugado directamente con el anticuerpo o conjugado con el anticuerpo a través de un conector.
2. Antecedentes
La Mer Tirosina Quinasa (MERTK), también conocida como c-mer, MER, Protooncogén c-Mer, Receptor Tirosina Quinasa MerTK, Tirosina-proteína Quinasa Mer, STK Quinasa, RP38 o MGC 133349, es miembro de la familia TAM de tirosina quinasas receptoras, que también incluye las quinasas AXL y TYRO3. MERTK transduce señales del espacio extracelular a través de activación mediante la unión de ligandos, sobre todo Gas-6, una proteína soluble. La unión del Gas-6 a MERTK induce la autofosforilación de MERTK en su dominio intracelular, lo que da como resultado la activación de la señal aguas abajo. Cummings CTet al.,(2013) Clin Cancer Res 19: 5275-5280; Verma Aet al.,(2011) Mol Cancer Ther 10: 1763-1773).
MERTK existe tanto en forma soluble como unida a membrana. El dominio extracelular se puede escindir para generar un dominio extracelular soluble, que se supone que actúa como un receptor señuelo para regular negativamente la activación del receptor MERTK en las células al reducir la capacidad y/o disponibilidad del ligando Gas-6 soluble para unirse a MERTK unida a la membrana (Sather S etal.,(2007) Blood 109: 1026-1033). Como resultado, MERTK tiene funciones duales relacionadas con la progresión del cáncer, la angiogénesis y la metástasis. Por un lado, la activación de MERTK por Gas-6 en células endoteliales da como resultado la inhibición del reclutamiento de células endoteliales por parte de las células cancerosas en un sistema de cocultivo. El reclutamiento endotelial es una característica clave de las células cancerosas que permite la angiogénesis tumoral, el crecimiento tumoral y la metástasis. También se demostró que la regulación por disminución de MERTK en células de cáncer de mama metastásico inhibe el reclutamiento endotelial (Png K<j>etal.,(2012) Nature 481: 190-194). Sin embargo, por otro lado, MERTK desempeña un papel opuesto en las células cancerosas, donde su expresión en exceso conduce a un aumento de la metástasis, probablemente al liberar MERTK escindida para generar una proteína soluble del dominio extracelular de MERTK como receptor señuelo. Además, la activación de MERTK dependiente de ligando en células cancerosas estimula vías oncogénicas, incluida la vía AKT (Linger RM, Cohen RA, Cummings CT, Sather S, Migdall-Wilson J, Middleton DH, Lu X, Barón AE, Franklin WA, Merrick DT, Jedlicka P, DeRyckere D, Heasley LE, Graham DK. La inhibición de la tirosina quinasa del receptor Mer o Axl promueve la apoptosis, bloquea el crecimiento y mejora la quimiosensibilidad del cáncer de pulmón de células no pequeñas humano (Oncogene. 18 de julio de 2013; 32 (29): 3420-31). Por tanto, las células tumorales expresan en exceso MERTK para promover la señalización oncogénica. Además, las células tumorales secretan una forma soluble del receptor extracelular MERTK que actúa como receptor señuelo para reducir la capacidad (y/o disponibilidad) del ligando soluble Gas-6 para activar MERTK en las células endoteliales, lo que en última instancia conduce a reclutamiento endotelial, angiogénesis, y progresión del cáncer (Png KJ etal.,(2012) Nature 481: 190-194).
MERTK también participa en la modulación de la homeostasis de los macrófagos y el mantenimiento de condiciones antiinflamatorias. En los macrófagos, MERTK media en el aclaramiento fagocítico de células apoptóticas y la liberación de IL-10 y citocinas inflamatorias agudas, cuya expresión es estimulada por la unión dependiente de Gas6 a MERTK. Zizzo etal.,(2012) J. Immunology 1 de octubre;189(7):3508-20; Cook etal.,J Clin Invest. 2013;123(8):3231-3242).
Históricamente, ha habido esfuerzos para generar inhibidores de MERTK para el tratamiento del cáncer (p. ej., compuesto UNC1062, un potente inhibidor de MERTK de molécula pequeña desarrollado como un compuesto anticanceroso), ya que se pensaba que MERTK funcionaba únicamente como un oncogén (Liu J etal.,(2013) Eur J Med Chem 65: 83-93; Cummings CT etal.,(2013) Clin Cancer Res 19: 5275-5280; Verma A etal.,(2011) Mol Cancer Ther 10: 1763-1773). En los últimos años, los productos conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) se han convertido en una de las clases de terapias contra el cáncer de más rápido crecimiento. Beck A etal.,(2017) Nat Rev Drug Discov 16: 315-337; Peters C y Brown S, (2015) Biosci Rep 35: art:e00225).
El documento WO 2019005756 se refiere a productos conjugados de anticuerpo-fármaco que comprenden (i) anticuerpos que se unen específicamente a Mer Tirosina Quinasa (MERTK) y (ii) agentes citotóxicos conjugados directamente con los anticuerpos o conjugados con los anticuerpos a través de conectores, composiciones que comprenden tales productos conjugados de anticuerpo-fármaco y usos terapéuticos de los mismos.
La cita de una referencia en el presente documento no se interpretará como una admisión de que tal referencia es anterior a la presente divulgación.
3. Compendio
En el presente documento se divulgan anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) con alta afinidad.
La presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a Mer Tirosina Quinasa (MERTK) humana, en donde el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106.
En algunas realizaciones, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende regiones constantes de cadena pesada y ligera de origen humano; o el anticuerpo comprende una porción de regiones constantes de cadena pesada y ligera de origen humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo es una IgG.
La presente invención también proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes, en donde una región de unión a antígeno comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención, y en donde la otra región de unión a antígeno se une a un antígeno de interés, opcionalmente en donde el antígeno de interés es un receptor de células inmunitarias o un antígeno asociado a tumor.
La presente invención también proporciona un producto conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende: (a) un radical de anticuerpo que es el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención; (b) uno o más radicales de fármaco, siendo cada radical de fármaco un agente citotóxico; y (c) opcionalmente un conector, en donde el agente citotóxico está conjugado directamente con el radical de anticuerpo o está conjugado con el radical de anticuerpo a través del conector.
En algunas realizaciones, el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en una auristatina, un maitansinoide, una pirrolobenzodiazepina, una indolinobenzodiazepina, una caliqueamicina, un análogo de camptotecina, una duocarmicina, un inhibidor de tubulina, una tubulisina o análogo de tubulisina, amberstatina269, doxorrubicina, SN-38, un antibiótico, una antraciclina, un inhibidor de microtúbulos, una espliceostatina, una thailanstatina, monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F (MMAF), DM1, DM4 y monometil auristatina E.
En algunas realizaciones, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco comprende el conector, y el conector es un conector escindible o un conector no escindible; opcionalmente en donde el conector es maleimidocaproil-valinacitrulina-p-aminobenciloxicarbonilo, CL2 o CL2A. En algunas realizaciones, el radical de anticuerpo se conjuga con MMAE a través de un conector mc-vc-PABC. En algunas realizaciones, el radical de anticuerpo se conjuga con SN-38 a través de un conector CL2A.
La presente invención también proporciona uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención.
La presente invención también proporciona una célulaex-vivoque contiene uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención.
La presente invención también proporciona un método para producir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende cultivar la célula de la presente invención en condiciones tales que dichos uno o más polinucleótidos sean expresados por la célula para producir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno codificados por los polinucleótidos.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención, el anticuerpo biespecífico de la presente invención o el producto conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención, y un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica de la presente invención para su uso en un método para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesite, opcionalmente en donde el sujeto es un ser humano.
En algunas realizaciones, dicho cáncer es un cáncer de cabeza y cuello, pulmón, mama, hueso, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado, parótida, tracto biliar, colon, recto, cuello uterino, útero, endometrio. riñón, vejiga, próstata o tiroides; o el cáncer es un melanoma, sarcoma, leucemia, carcinoma de células escamosas, melanoma, glioma, glioblastoma, neuroblastoma, sarcoma de Kaposi, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer de cabeza y cuello, mieloma múltiple o linfoma, o es una leucemia mielógena aguda o una leucemia linfocítica aguda.
En algunas realizaciones, dicho cáncer es cáncer de mama, opcionalmente cáncer de mama triple negativo. En algunas realizaciones, las células cancerosas de dicho cáncer expresan en exceso MERTK, opcionalmente expresan en exceso MERTK fosforilada; o MERTK es constitutivamente activa sobre células cancerosas de dicho cáncer; o dicho cáncer está asociado con la expresión en exceso de MERTK; o dicho cáncer está asociado con MERTK constitutivamente activa.
En una realización específica de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, el anticuerpo reconoce específicamente el dominio extracelular de MERTK humana, y el dominio extracelular comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132.
En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo se unen específicamente a MERTK humana y conducen a la internalización de MERTK desde la superficie celular. En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo bloquean la fosforilación de AKT inducida por Gas-6. En otra realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo previenen la activación de MERTk . En otra realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo reconocen específicamente la porción extracelular de MERTK humana. En otra realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo reducen la formación de colonias por parte de las células cancerosas. En una realización particular, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno descritos en el presente documento son monoclonales. En otra realización particular, un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo son una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK es un anticuerpo humanizado.
El anticuerpo anti-MERTK o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, que se unen específicamente a MERTK humana, comprenden una región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105.
Un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), pueden comprender una región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107.
Un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), pueden comprender una región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de<s>E<q>ID NO: 108.
Un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) pueden comprender una región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de S<e>Q ID NO: 109.
Un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), pueden comprender una región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 110.
El anticuerpo anti-MERTK o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, que se unen específicamente a MERTK humana, comprenden una región variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), pueden comprender una región variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111.
El anticuerpo anti-MERTK o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, que se unen específicamente a MERTK humana, comprenden (a) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y (b) una VL que comprende el aminoácido secuencia de SEQ ID NO: 106. Un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), pueden comprender (a) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y (b) una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Un anticuerpo anti-MERTK o el fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), pueden comprender (a) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108 y (b) una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK (p. ej. MERTK humana), pueden comprender (a) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 y (b) una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), pueden comprender (a) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110 y (b) una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento, que se une específicamente a MERTK humana, comprende regiones constantes de cadena pesada, o regiones constantes de cadena ligera, o ambas. En algunas realizaciones, la región constante de la cadena pesada se selecciona del grupo de inmunoglobulinas humanas que consiste en IgG<1>, IgG<2>, IgG3, IgG4, IgA<1>y IgA<2>. En ciertas realizaciones, la región constante de cadena ligera se selecciona del grupo de inmunoglobulinas humanas que consiste en IgGK e IgGA. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante que tiene una mayor afinidad de unión a uno o más receptores Fc gamma humanos.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una región constante que tiene una menor afinidad de unión a uno o más receptores Fc gamma humanos.
En una realización específica de la realización en donde el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas pesadas comprende una región variable (VH), que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID: 105. En una realización adicional de tal realización específica, cada una de las cadenas ligeras comprende una región variable (VL), que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 106.
En un ejemplo en donde el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas pesadas comprende una región variable (VH) que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 107. En un ejemplo adicional de tal ejemplo específico, cada una de las cadenas ligeras comprende una región variable (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106.
En un ejemplo en donde el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas pesadas comprende una región variable (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108. En un ejemplo adicional de tal ejemplo específico, cada una de las cadenas ligeras comprende una región variable (VL), que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106.
En un ejemplo en donde el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas pesadas comprende una región variable (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110. En una realización adicional de tal realización específica, cada una de las cadenas ligeras comprende una región variable (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID: 111.
En un ejemplo en donde el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, cada una de las cadenas pesadas comprende una región variable (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109. En un ejemplo adicional de tal ejemplo específico, cada una de las cadenas ligeras comprende una región variable (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID: 106.
En una realización específica de la realización en donde el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, la cadena ligera comprende una región variable (VL), que comprende SEQ ID NO: 106.
En un ejemplo en donde el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, la cadena ligera comprende una región variable (VL) que comprende SEQ ID NO: 111.
En una realización específica de la realización en donde el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, la cadena pesada comprende una región variable (VH), que comprende SEQ ID NO: 105.
En un ejemplo en donde el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, la cadena pesada comprende una región variable (VH), que comprende SEQ ID NO: 107.
En un ejemplo en donde el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, la cadena pesada comprende una región variable (VH), que comprende SEQ ID NO: 108.
En un ejemplo en donde el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, la cadena pesada comprende una región variable (VH) que comprende SEQ ID NO: 109.
En un ejemplo en donde el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, la cadena pesada comprende una región variable (VH), que comprende SEQ ID NO: 110.
En una realización específica de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en el presente documento, en donde el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región constante de origen humano. En una realización adicional de tal realización específica, la región constante de la cadena pesada tiene un isotipo seleccionado del grupo que consiste en gamma1, gamma2, gamma3 y gamma4.
En una realización específica de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en el presente documento, el anticuerpo se une a MERTK humana en células con una CE50 en el rango de aproximadamente 1 nM a 15 nM (p. ej., 6,5 nM a 8 nM.)
En una realización específica de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno disminuyen el nivel de expresión de MERTK en células cancerosas. (p. ej. la línea celular de melanoma SKMEL5). En otra realización específica de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno disminuyen el nivel de expresión de MERTK en macrófagos M2 humanos. En otra realización específica de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno disminuyen el nivel de<m>E<r>T<k>en macrófagos M2 humanos diferenciados in vitro.
En una realización específica de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región constante de origen humano. En una realización adicional de tal realización específica, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo son una inmunoglobulina humanizada.
En una realización específica de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en el presente documento, en donde el anticuerpo no es un anticuerpo monoclonal o una inmunoglobulina que comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo son un anticuerpo biespecífico.
La presente invención proporciona una inmunoglobulina que se une específicamente a MERTK humana, que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106.
En el presente documento se divulga una inmunoglobulina que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106.
En el presente documento se divulga una inmunoglobulina que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 106.
En el presente documento se divulga una inmunoglobulina que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106.
En una realización, la presente invención proporciona una inmunoglobulina humanizada que se une específicamente a MERTK humana, que comprende
(i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. En el presente documento se divulga una inmunoglobulina humanizada que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), que comprende:
(A) (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, o
(B) (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, o
(C) (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106.
En algunas realizaciones, el anticuerpo proporcionado en el presente documento es una IgG. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno proporcionado en el presente documento es un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv.
En el presente documento se divulgan un anticuerpo quimérico o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen a MERTK (p. ej., MERTK humana). El anticuerpo quimérico puede comprender una región variable de cadena pesada (VH) que comprende un aminoácido de SEQ ID NO: 110. El anticuerpo quimérico puede comprender una región variable de cadena ligera (VL) que comprende un aminoácido de SEQ ID NO: 111. El anticuerpo puede comprender una VH de SEQ ID NO: 110 y una VL de SEQ ID NO: 111.
En otra realización específica, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112. En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 114, 115, 116 o 117. En otra realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, comprenden una cadena ligera que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 113. En el presente documento se divulga un anticuerpo que comprende una cadena ligera que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 118. En otra realización específica, un anticuerpo anti-MERTK comprende una cadena pesada que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 112 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113. En el presente documento se divulga un anticuerpo anti-MERTK que comprende:
(A) una cadena pesada que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 114 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113; o
(B) una cadena pesada que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 115 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113; o
(C) una cadena pesada que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 116 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113; o
(D) una cadena pesada que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 117 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK es un anticuerpo biespecífico, que comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes, en donde una región de unión se une específicamente a MERTK humana y la otra región de unión se une a un antígeno de interés. (p. ej., un receptor de células inmunitarias, un receptor de punto de control o un antígeno asociado a tumores).
En realizaciones específicas, la región de unión que se une a MERTK comprende las regiones variables del anticuerpo z10 proporcionado en el presente documento (p. ej. las expuestas en la Tabla 11, más abajo). Se divulga una región de unión que se une a MERTK que comprende las regiones variables del anticuerpo z11 o z13 (p. ej., las expuestas en las Tablas 12 y 13 más abajo). En algunas realizaciones específicas, la otra región de unión del anticuerpo biespecífico se une a CD3. En otras realizaciones específicas, la otra región de unión del anticuerpo biespecífico se une a PD-L1. En otras realizaciones específicas, la otra región de unión del anticuerpo biespecífico se une a LRP1. En otras realizaciones específicas, la otra región de unión del anticuerpo biespecífico se une a LPR8. En otras realizaciones específicas, la otra región de unión del anticuerpo biespecífico se une a TGF-p. En otras realizaciones específicas, la otra región de unión del anticuerpo biespecífico se une a ICOS. En otras realizaciones específicas, la otra región de unión del anticuerpo biespecífico se une a CD40. En otras realizaciones específicas, la otra región de unión del anticuerpo biespecífico se une a NKGD2. En otras realizaciones específicas, la otra región de unión del anticuerpo biespecífico se une a TIGIT. En una realización particular, la región de unión que se une a CD40 es un anticuerpo agonista. En otra realización particular, la región de unión que se une a ICOS es un anticuerpo agonista. En otra realización particular, la región de unión que se une a PD-L1 es un anticuerpo bloqueador.
En el presente documento se divulgan un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo (p. ej., un anticuerpo humanizado o humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo) que se unen al mismo epítopo de MERTK (p. ej., MERTK humana) como un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento. En el presente documento se divulgan un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo (p. ej., un anticuerpo humanizado o humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo) que compiten con un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, para unirse a MERT<k>(p. ej., MERTK humana). En el presente documento se divulgan un primer anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que compiten con un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento para unirse a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde la competición se muestra como una reducción de la unión del primer anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo a MERTK. (p. ej., MERTK humana) en más de 80% (p. ej., 85%, 90%, 95% o 98%, o entre 80% y 85%, 80% y 90%, 85% y 90% o 85% y 95%) en presencia del anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento. En un ejemplo específico, el anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen al mismo epítopo que MERTK (o compiten por la unión a un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo) no son un anticuerpo murino o fragmento de unión a antígeno del mismo.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK proporcionado en el presente documento, que se une específicamente a MERTK humana con una CE<50>en el rango de aproximadamente 1 nM a 10 nM en un ensayo tal como se describe en el presente documento. En una realización específica, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionados en el presente documento no se unen o no se unen apreciablemente a Axl humana, Tyro3 humana o MERTK murina según se evalúa mediante un ensayo descrito en el mismo o conocido por un experto en la técnica. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo se unen a MERTK humana y MERTK de mono cinomolgo. En realizaciones específicas, se aísla un anticuerpo proporcionado en el presente documento. En realizaciones específicas, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo monoclonal. En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionados en el presente documento son bivalentes y son capaces de unirse a dos moléculas de MERTK humana.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan secuencias de polinucleótidos que codifican un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención. En una realización específica, se proporciona en el presente documento una secuencia de polinucleótidos que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada, en donde la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 119. Se divulga en el presente documento una secuencia de polinucleótidos que comprende una molécula de ácido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122 o SEQ ID NO: 123. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una secuencia de polinucleótidos que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera, en donde la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 120. En el presente documento se divulga una secuencia de polinucleótidos que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 124. En realizaciones específicas, se aíslan la molécula de ácido nucleico o la secuencia de polinucleótidos.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan vectores que comprenden una secuencia de polinucleótidos que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de la presente invención. En ciertas realizaciones, un vector (p. ej., un vector aislado) comprende un polinucleótido que codifica una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera, o una cadena pesada y/o una cadena ligera de un anticuerpo anti-MERTK. En ciertas realizaciones, una célula anfitriona comprende el polinucleótido o vector. Los ejemplos de células anfitrionas incluyen células deE. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces,levadura, 293F, CHO, YB/20, NS0, PER-C6, HEK-293, HEK-293T, NIH-3T3, HeLa, BHK, Hep G2, SP2/0, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10, células vegetales, células de insectos y células humanas en cultivo de tejidos. En una realización específica, se proporciona en el presente documento un método para producir un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención que se unen específicamente a MERTK humana que comprende cultivar una célula anfitriona de modo que se exprese el polinucleótido y se produzca el anticuerpo.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento una célulaex-vivoque contiene uno o más polinucleótidos que codifican cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención, o cualquiera de las inmunoglobulinas de la presente invención. En una realización específica, una célulaex-vivocontiene uno o más polinucleótidos que codifican una inmunoglobulina que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Una célula ex vivo divulgada en el presente documento puede contener uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo seleccionado entre:
(a) una primera inmunoglobulina que comprende (i) una cadena región variable de pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106; y
(b) una segunda inmunoglobulina que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106;
(c) una tercera inmunoglobulina que comprende (i) una región de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106; y
(d) una cuarta inmunoglobulina que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111.
En el presente documento se divulga una célulaex-vivoque contiene un polinucleótido que codifica cualquiera de las cadenas pesadas de anticuerpos descritas en el presente documento.
En el presente documento se divulga una célulaex-vivoque contiene un polinucleótido que codifica cualquiera de las cadenas ligeras de anticuerpos descritas en el presente documento. En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un método para producir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende cultivar una célulaex-vivoque contiene uno o más polinucleótidos que codifican cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención, en condiciones tales que uno o más polinucleótidos sean expresados por la célula para producir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo codificado por los polinucleótidos.
En una realización específica, un método para producir un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención comprende cultivar una célulaex-vivoque contiene uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en una inmunoglobulina que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Un método para producir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo divulgado en el presente documento puede comprender cultivar una célula ex vivo que contiene uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo seleccionado entre:
(a) una primera inmunoglobulina que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106;
(b) una segunda inmunoglobulina que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106;
(c) una tercera inmunoglobulina que comprende (i) una región de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106; y
(d) una cuarta inmunoglobulina que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111,
en condiciones tales que los uno o más polinucleótidos sean expresados por la célula para producir el anticuerpo codificado por el polinucleótido.
En el presente documento se divulga un método para producir una cadena pesada de anticuerpo, que comprende cultivar una célulaex-vivoque contiene un polinucleótido que codifica cualquiera de las cadenas pesadas de anticuerpo descritas en el presente documento en condiciones tales que la célula exprese el polinucleótido para producir la cadena pesada de anticuerpo codificada por el polinucleótido.
En el presente documento se divulga un método para producir una cadena ligera de anticuerpo, que comprende cultivar una célulaex-vivoque contiene un polinucleótido que codifica cualquiera de las cadenas ligeras de anticuerpo descritas en el presente documento en condiciones tales que la célula exprese el polinucleótido para producir la cadena ligera de anticuerpo codificada por el polinucleótido.
En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento productos conjugados de anticuerpo-fármaco que comprenden: (a) un radical de anticuerpo que es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención que se unen específicamente a MERTK humana; (b) uno o más radicales de fármaco, siendo cada radical de fármaco un agente citotóxico; y (c) opcionalmente un conector; en donde el agente citotóxico se conjuga directamente con el radical de anticuerpo o se conjuga con el radical de anticuerpo a través del conector.
En una realización específica, la razón molar del radical de anticuerpo con respecto al radical de fármaco está entre 1:1 y 1:12.
En una realización específica, la razón molar del radical de anticuerpo con respecto al radical de fármaco está entre 1:1 y 1:8.
En otra realización específica, la razón molar del radical de anticuerpo con respecto al radical de fármaco está entre 1:3 y 1:5.
En otra realización específica, la razón molar del radical de anticuerpo con respecto al radical de fármaco está entre 1:9.
En una realización específica, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco comprende el conector y el conector es un conector escindible.
En otra realización específica, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco comprende el conector y el conector es un conector no escindible.
En otra realización específica, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco comprende el conector y el conector es maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonilo (también conocido como "mc-vc-PABC") (para la estructura de mc-vc-PABC; véase la Figura 13A). En otra realización específica, el producto conjugado de anticuerpofármaco comprende el conector y el conector es CL2 (para la estructura de CL2, véanse la Figura 13B y Cardilloet al.
2011, Clín Cancer Res; 17(10); 3157-69. En otra realización específica, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco comprende el conector y el conector es CL2A (para la estructura de CL2A, véanse la Figura 13B y Goldberg et al.
2018, Oncotarget; 9(48); 28989-29006, y Cardillo et al. 2011, Clín Cancer Res; 17(10); 3157-69).
En realizaciones específicas, el agente citotóxico es una molécula pequeña, un nucleótido, un péptido o una proteína que no es un anticuerpo. En una realización adicional de tal realización específica, el agente citotóxico es una molécula pequeña.
En otra realización específica, el agente citotóxico es una auristatina, un maitansinoide, una pirrolobenzodiazepina, una indolinobenzodiazepina, una caliqueamicina, un análogo de camptotecina, una duocarmicina, un inhibidor de tubulina, una tubulisina o análogo de tubulisina, amberstatina269, doxorrubicina, un antibiótico, una antraciclina, un inhibidor de microtúbulos, una espliceostatina o una thailanstatina. En una realización adicional de tal realización específica, el agente citotóxico es monometil auristatina E (MMAE) o monometil auristatina F (MMAF). En otra realización adicional de tal realización específica, el agente citotóxico es DM1 o DM4. En otra realización adicional de tal realización específica, el agente citotóxico es SN-38.
En el presente documento se describe un método para producir un producto conjugado de anticuerpo-fármaco descrito en el presente documento en donde el conector no está presente, comprendiendo el método: (a) conjugar el agente citotóxico directamente con el radical de anticuerpo para producir el producto conjugado de anticuerpo-fármaco; y (b) purificar el producto conjugado de anticuerpo-fármaco.
En el presente documento se divulga un método para producir un producto conjugado de anticuerpo-fármaco descrito en el presente documento en donde el producto conjugado de anticuerpo-fármaco comprende el conector, comprendiendo el método las siguientes etapas en el orden indicado: (a) conjugar el conector directamente con el radical de anticuerpo para producir un conector-radical de anticuerpo; (b) conjugar el conector del conector-radical de anticuerpo directamente con el agente citotóxico para producir el producto conjugado de anticuerpo-fármaco; y (c) purificar el producto conjugado de anticuerpo-fármaco.
En el presente documento se divulga un método para producir un producto conjugado de anticuerpo-fármaco descrito en el presente documento, en donde el producto conjugado de anticuerpo-fármaco comprende el conector, comprendiendo el método las siguientes etapas en el orden indicado: (a) conjugar el conector directamente con el agente citotóxico para producir un conector-radical de agente citotóxico; (b) conjugar el conector del conector-radical de agente citotóxico directamente con el radical de anticuerpo para producir el producto conjugado de anticuerpofármaco; y (c) purificar el producto conjugado de anticuerpo-fármaco.
En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, o un producto conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención. En una realización específica, se proporciona en el presente documento una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno o cualquiera de los productos conjugados de anticuerpo-fármaco. En una realización específica, una composición farmacéutica comprende una inmunoglobulina que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Una composición farmacéutica divulgada en el presente documento puede comprender:
(a) una primera inmunoglobulina que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106;
(b) una segunda inmunoglobulina que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106,
(c) una tercera inmunoglobulina que comprende (i) una región de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106; o
(d) una cuarta inmunoglobulina que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110, y (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111,
y un portador farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica comprende una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención.
En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un producto conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención para su uso en métodos de tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite. En una realización específica, el método para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesite comprende administrar a dicho sujeto cualquiera de las composiciones farmacéuticas de la presente invención.
En algunas realizaciones, se evalúa una muestra de tumor del sujeto para determinar la expresión en exceso de MERTK fosforilada antes del tratamiento de acuerdo con los métodos. En ciertas realizaciones, el sujeto se trata si la muestra de tumor expresa en exceso MERTK fosforilada.
En una realización específica, el cáncer es un cáncer de cabeza y cuello, pulmón, mama, hueso, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado, parótida, tracto biliar, colon, recto, cuello uterino, útero, endometrio, riñón, vejiga, próstata o tiroides. En una realización determinada de tal realización específica, el cáncer es cáncer de mama. En una realización adicional de tal realización determinada, el cáncer es cáncer de mama triple negativo.
En una realización específica, el cáncer es un sarcoma, carcinoma de células escamosas, melanoma, glioma, glioblastoma, neuroblastoma, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, carcinoma de pulmón de células no pequeñas o sarcomas de Kaposi. En una realización específica, el cáncer es una leucemia o un linfoma. En otra realización específica, el cáncer es leucemia mielógena aguda. En otra realización específica adicional, el cáncer es leucemia linfocítica aguda. En otra realización adicional, el cáncer es mieloma múltiple.
En una realización específica, un cáncer tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento expresa en exceso MERTK, está asociado con MERTK humana constitutivamente activa, o ambos. En otra realización específica, las células cancerosas del cáncer expresan en exceso MERTK fosforilada.
En una realización específica, el método comprende adicionalmente administrar al sujeto un agente terapéutico adicional.
En una realización específica, el método comprende adicionalmente administrar al sujeto un agente terapéutico adicional, en donde el agente terapéutico adicional es para tratar el cáncer. El agente terapéutico adicional se puede administrar en la misma composición farmacéutica o en una composición farmacéutica diferente que el anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un producto conjugado de anticuerpo-fármaco.
En una realización específica, el agente terapéutico adicional es un agente utilizado para tratar el cáncer de mama, un agente utilizado para tratar el melanoma, una inmunoterapia o un inhibidor de la angiogénesis. En una realización adicional de tal realización específica, el agente terapéutico adicional es un agente utilizado para tratar el cáncer de mama que se selecciona del grupo que consiste en Tamoxifeno, Raloxifeno, Paclitaxel, Ciclofosfamida, Docetaxel, Vinblastina, Fluorouracilo, Everolimus, Trastuzumab, Trastuzumab-Emtansina, Pertuzumab y Ditosilato de Lapatinib. En otra realización adicional de tal realización específica, el agente terapéutico adicional es un agente utilizado para tratar el melanoma que se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de BRAF, un inhibidor de m Ek y Dacarbazina. En otra realización adicional de tal realización específica, el agente terapéutico adicional es un agente que bloquea la señalización del punto de control inmunológico. En otra realización adicional, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-L1. En otra realización adicional de tal realización específica, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la angiogénesis que se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de VEGF, un inhibidor de VEGFR2, Sunitinib y Sorafenib.
En una realización específica, el sujeto es un ser humano. En una realización específica, se proporciona en el presente documento un producto conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende un radical de anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO: 105 y la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, en donde el radical de anticuerpo está conectado a MMAE a través del conector mc-vc-PABC. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un producto conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende un radical de anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO: 105 y la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, en donde el radical de anticuerpo está conectado a SN-38 a través del conector CL2A.
En ciertas realizaciones, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un radical de anticuerpo que es una inmunoglobulina. En algunas realizaciones, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un radical de anticuerpo en donde el radical de anticuerpo es una inmunoglobulina y la inmunoglobulina comprende una región constante humana.
4. Breves descripciones de las figuras
Fig. 1.Determinación de las velocidades de disociación (K<d>) para anticuerpos anti-MERTK humanizados y un anticuerpo anti-MERTK quimérico mediante mediciones de resonancia de plasmón de superficie (SPR).
Fig. 2.Resumen de purificación de proteínas para tres anticuerpos anti-MERTK humanizados (z10, z11 y z13) y un anticuerpo anti-MERTK quimérico (xAb).
Fig. 3A - Fig. 3B.Fig. 3A. Análisis de citometría de flujo de la afinidad de unión del anticuerpo z10 por MERTK humana expresada por células de melanoma. Fig. 3B. Mediciones SPR de la unión del anticuerpo z10 a MERTK extracelular humana.
Fig. 4A-4D.El anticuerpo z10 se une específicamente a MERTK humana (Fig. 4A), según se mide en un ensayo de unión por afinidad utilizando ELISA. Sin embargo, el anticuerpo z10 no se une al dominio extracelular de Axl humana (Fig. 4B), Tyro 3 humana (Fig. 4C) o MERTK murina (Fig. 4D), como se evaluó en un ensayo de unión por afinidad utilizando ELISA. Los dominios extracelulares de MERTK humana, Axl humana y MERTK murina se conjugaron con un dominio Fc de IgG y se utilizaron en el ELISA.
Fig. 5A-5B.El anticuerpo z10 induce la degradación de MERTK humana en células cancerosas (específicamente células SKMEL5). Las células SKMEL5 se incubaron con anticuerpo z10 a diversas concentraciones durante 24 horas (Fig. 5A) o con 0,3 pg/mL del anticuerpo durante varios períodos de tiempo (Fig. 5B) antes de evaluar el nivel de MERTK humana mediante análisis de Transferencia Western.
Fig. 6A-6B.El anticuerpo z10 degrada MERTK humana en macrófagos M2 humanos diferenciadosin vitro.Los macrófagos M2in vitrose trataron con 0,3 pg/mL del anticuerpo z10 o IgG de control, y las células se incubaron durante varios períodos de tiempo antes de evaluar el nivel de MERTK humana mediante análisis de Transferencia Western. La Fig. 6a proporciona los resultados de la Transferencia Western y la Fig. 6B proporciona la cuantificación relativa de MERTK humana con respecto a tubulina.
Fig. 7A-7B.La degradación de MERTK humana está mediada por la internalización de MERTK humana de células SKMEL5. Las células SKMEL5 se incubaron con IgG de control o el anticuerpo z10, ambos marcados con pHrodo, que solo se puede medir en condiciones de pH bajo. p. ej. al ser absorbido por los lisosomas. La MERTK humana de superficie se midió utilizando un anticuerpo contra MERTK disponible comercialmente. La Fig. 7A muestra la fluorescencia a lo largo del tiempo y la Fig. 7B son imágenes representativas.
Fig. 8A-8C.El anticuerpo z10 bloquea la fosforilación de AKT inducida por Gas6 en células cancerosas humanas. Las células SKMEL5 se incubaron con 0,3 pl/mL del anticuerpo z10 o IgG de control durante 2 horas antes de incubarse con Gas6200 nM durante 10 minutos. La Fig. 8A muestra un resultado de Transferencia Western, la Fig. 8B muestra la cantidad de MERTK humana con respecto a tubulina y la Fig. 8C muestra la cantidad de AKT fosforilada con respecto a tubulina.
Fig. 9A-9D.El anticuerpo z10 inhibe la formación de colonias de células cancerosas humanas. La figura muestra la reducción en el número de colonias observada después de que se cultivaran 500 células SKMEL5 durante 12 días en presencia de 0,3 pg/mL o 1 pg/mL del anticuerpo z10 con respecto al número de colonias observadas cuando se cultivaron 500 células SKMEL5 durante 12 días con IgG de control. La Fig. 9A muestra la formación de colonias de células cancerosas después de 12 días de incubación con 0,3 pg/mL del anticuerpo z10 o del anticuerpo IgG de control. La Fig. 9B muestra la formación de colonias de células cancerosas después de 12 días de incubación con 1 pg/mL del anticuerpo z10 o del anticuerpo IgG de control. La Fig. 9C muestra el número de colonias formadas después de 12 días de incubación con 0,3 pg/mL del anticuerpo z10 o del anticuerpo IgG de control. La Fig. 9D muestra el número de colonias formadas después de 12 días de incubación con 1 pg/mL del anticuerpo z10 o del anticuerpo IgG de control.
Fig. 10.El anticuerpo z10 induce respuestas de citocinas en macrófagos M2 y monocitos CD14+.
Fig. 11A y 11B.z10 inhibe la supervivencia de las células cancerosas invitro.Se cultivaron 1.000 células de mieloma múltiple RPMI8226 (Fig. 11A) o 200 células de melanoma SKMEL5 (Fig. 11B) en presencia de control de IgG o z10. El día 6 (RPMI8226) o el día 4 (SKMel5), se evaluó la viabilidad utilizando el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo 2.0.
Fig. 12A y 12B.MDA-MB-231 - LM2: Eficacia Antitumoral de Anticuerpo Desnudo z10. Se inyectaron 50.000 células de TNBC MDA-MB-231-LM2 en la vena de la cola de ratones NSG. El tratamiento comenzó el día de la inoculación de las células tumorales, dos veces por semana i.p. durante la duración del estudio. La Fig. 12A muestra la colonización pulmonar de células de cáncer de mama triple negativo MDA-MB-231 LM2 utilizando imágenes IVIS. La Fig. 12B cuantifica la colonización pulmonar de células de cáncer de mama triple negativo MDA-MB-231 LM2. * designa un valor p inferior a 0,05.
Fig. 13A y 13B.La Fig. 13A muestra la estructura de maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonilmonometil auristatina E (mc-vc-PABC-MMAE) conjugada con un anticuerpo (Ab). La Fig. 13B muestra la estructura de SN-38 conjugada con un anticuerpo (Ab) a través de un conector CL2 o CL2A. "Ab" representa un anticuerpo, que, a modo de ejemplo, pero no de limitación puede ser z10 o una IgG de control. El conector CL2 tiene un sitio de escisión de Catepsina B (véase Fig. 13B donde AA es fenilalanina-lisina), mientras que el conector CL2A no tiene un sitio de escisión de Catepsina B (véase la Fig. 13B donde AA es lisina).
LasFig. 14A y 14Bmuestran los resultados de la cromatografía líquida de alta presión con exclusión por tamaño, midiendo la pureza de z10 conjugado con MMAE a través un conector mc-vc-PABC (z10-MMAE, véase la Fig. 13A donde Ab es z10) (Fig. 14A) y z10 conjugado con SN-38 a través de un conector CL2A (z10-SN-38, véase la Fig. 13B donde Ab es z10 y a A es lisina) (Fig. 14B).
Fig. 15:Los z10-ADC se unen a MERTK con una Kd similar a z10. La Fig. 15 proporciona datos de afinidad de unión de z10-ADC. La proteína recombinante hMER (producto conjugado de Mer-Fc) (50 nM-0,05 nM) se equilibró con z10, z10-MMAE o z10-SN-38 0,3 nM, respectivamente, antes de la adición a placas de ELISA previamente recubiertas con proteína recombinante hMER. La unión del anticuerpo se detectó utilizando un anticuerpo secundario anti-IgG humana conjugado con AP y se reveló utilizando un lector de microplacas GloMax.
Fig. 16A y 16B.Las Fig. 16A y 16B muestran que después de la incubación con z10, z10-MMAE o z10-SN-38, las células SKMel5 internalizan MERTK (Fig. 16A) y MERTK se degrada (Fig. 16B). z10, z10-MMAE y z10-SN-38 degradan MERTK en un grado similar. Las células SKMel5 se incubaron con 6,7 nM de z10, z10-MMAE o z10-SN-38 marcados con pHrodo. La señal de pHrodo solo se puede medir en condiciones de pH bajo. p. ej. al ser absorbido por los lisosomas. La MERTK de superficie se tiñó con un anticuerpo contra MERTK conjugado con BV421. La unión se midió mediante citometría de flujo.
Fig. 17A-17E.z10-MMAE y z10-SN-38 destruyen las células cancerosas que expresan MERTK. Se incubaron células SKMel5 (Fig. 17A) o RPMI8226 (Fig. 17B) con control de IgG, control de IgG conjugada con MMAE a través de un conector mc-mv-PABC (IgG-MMAE, véase la Fig. 13A donde Ab es IgG) o z10-MMAE durante 7 días. La viabilidad celular se midió utilizando CellTiterGlo. Se incubaron células -SKMel5 (Fig. 17C) o RPMI8226 (Fig. 17D) con control de IgG, control de IgG conjugada con SN-38 a través de un conector CL2A (IgG-SN-38, véase la Fig. 13B donde Ab es IgG y AA es lisina) o z10-SN-38 a las concentraciones indicadas durante 7 días. La viabilidad celular se midió utilizando CellTiterGlo. La Fig. 17E muestra el análisis de Transferencia Western de productos lisados de células completas preparados a partir de células SKMel5 o RPMI8226.
Fig. 18A y 18B.z10-MMAE inhibe la colonización pulmonar de células de TNBC MDA-MB-231-LM2. La Fig. 18A muestra la colonización pulmonar de células de cáncer de mama triple negativo MDA-MB-231-LM2 utilizando imágenes IVIS. La Fig. 18B cuantifica la colonización pulmonar de células de cáncer de mama triple negativo MDA-MB-231-LM2. Se inyectaron 50.000 células de<t>N<b>C MDA-MB-231-LM2 en la vena de la cola de ratones NSG. El tratamiento comenzó el día de la inoculación de células tumorales y la colonización metastásica pulmonar se controló mediante imágenes de bioluminiscencia. Las flechas en la Fig. 18B indican los días de dosificación. ** indica un valor p inferior a 0,01.
Fig. 19A y 19B.Los z10/z10-ADC no afectan a la viabilidad de macrófagos M1 (Fig. 19A) o macrófagos M2 (Fig. 19B) que expresan MERTK. Los macrófagos M2 se diferenciaron cultivando 8 * 104 monocitos en medio PBMC con M-CSF (50 ng/mL) durante 8 días. Los macrófagos M1 se diferenciaron cultivando 8 * 104 monocitos en medio PBMC con GM-CSF (20 ng/mL) durante 5 días, cultivando después con GM-CSF (20 ng/mL), IFNg (20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL), y LPS (10 pg/mL) durante 3 días adicionales. Los macrófagos M2 y M1 se trataron con los anticuerpos o ADC indicados durante 4 días en medio de diferenciación y la viabilidad se evaluó mediante el Ensayo de Viabilidad Celular CellTiter-Glo 2.0.
5. Descripción detallada
En el presente documento se proporcionan anticuerpos anti-MERTK (p. ej., anticuerpos monoclonales), y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a MERTK humana como se define en las reivindicaciones.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o fragmento de unión a antígeno del mismo reconocen específicamente el dominio extracelular de MERTK humana. En una realización particular, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o fragmento de unión a antígeno del mismo no se unen a Axl humana, Tyro 3 humana o MERTK murina según se detecta mediante un mecanismo conocido por un experto en la técnica, o descrito en el presente documento. En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o fragmento de unión a antígeno del mismo no se unen a Axl humana, Tyro3 humana o MERTK murina según se evalúa con un ensayo de unión por afinidad utilizando ELISA tal como se describe en la Sección 6.2, más abajo.
En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo se unen específicamente a la proteína MERTK humana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131. En otra realización específica, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o fragmento de unión a antígeno del mismo se unen específicamente a la región extracelular de MERTK humana, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 132. En otra realización específica, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o fragmento de unión a antígeno del mismo se unen específicamente a SEQ ID NO: 132. En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o fragmento de unión a antígeno del mismo son bivalentes. En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden dos sitios de unión a antígeno que se unen a MERTK humana. En una realización particular, los dos sitios de unión a antígeno se unen al mismo epítopo en MERTK humana. En una realización particular, los dos sitios de unión a antígeno comprenden CDR idénticas.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o fragmento de unión a antígeno del mismo se unen a una quimera MERTK-Fc recombinante (p. ej., una quimera MERTK-Fc humana recombinante) con una K<d>de aproximadamente 1 pM a 10 nM según se determina utilizando un mecanismo conocido por un experto en la técnica o descrito en el presente documento. En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo se unen a una quimera MERTK-Fc recombinante (p. ej., una quimérica MERTK-Fc humana recombinante) con una K<d>de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 6 pM según se determina utilizando resonancia de plasmón de superficie (SPR), tal como se describe en la Sección 6, más abajo. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo se unen a MERTK humana con una CE<50>de aproximadamente 1 nM a 20 nM utilizando un ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica. En una determinada realización específica, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo se unen a MERTK humana en un ensayo descrito en la Sección 6, más abajo, con una k<D>de aproximadamente 1 nM a 10 nM.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o un fragmento de anticuerpo del mismo se unen a células que expresan MERTK humana (p. ej., células cancerosas o macrófagos M2 con MERTk humana) con una CE<50>de aproximadamente 1 nM a 20 nM según se evalúa mediante citometría de flujo tal como se describe en el presente documento o como es conocido por un experto en la técnica. En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo se unen a células que expresan MERTK humana (p. ej., células cancerosas o macrófagos M2 con MERTK humana) con una CE<50>de 1 nM a 10 nM según se evalúa mediante citometría de flujo tal como se describe en la Sección 6.2, más abajo.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o fragmento de unión a antígeno del mismo disminuyen el nivel de expresión de MERTK humana en células cancerosas según se evalúa mediante un ensayo descrito en el presente documento (p. ej., en la Sección 6.2, más abajo) o un ensayo conocido por un experto en la técnica. En una realización particular, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o fragmento de unión a antígeno del mismo disminuyen el nivel de expresión de MERTK humana en la línea celular de melanoma SKMEL5 según se evalúa mediante un ensayo descrito en el presente documento (p. ej., en la Sección 6.2, más abajo) o un ensayo conocido por un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o fragmento de unión a antígeno del mismo disminuyen el nivel de expresión de MERTK humana en macrófagos M2 humanos según se evalúa mediante un ensayo descrito en el presente documento (p. ej., en la Sección 6.2, más abajo) o un ensayo conocido por un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o fragmento de unión a antígeno del mismo disminuyen el nivel de expresión de MERTK humana mediante la internalización de MERTK según se evalúa mediante un ensayo descrito en el presente documento. (p. ej., en la Sección 6.2, más abajo) o un ensayo conocido por un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo disminuyen el nivel de expresión de MERTK humana mediante internalización en lisosomas, según se evalúa mediante un ensayo descrito en el presente documento (p. ej., en la Sección 6.2, más abajo) o un ensayo conocido por un experto en la técnica.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo reducen la fosforilación de AKT inducida por Gas 6 en células que expresan MERTK humana (p. ej., células cancerosas) según se evalúa mediante un ensayo descrito en el presente documento (p. ej., Sección 6.2, más abajo) o un ensayo conocido por un experto en la técnica. En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo previenen la fosforilación de AKT inducida por Gas-6 en células cancerosas que expresan MERTK humana, tales como p. ej., células SKMEL5 de melanoma, según se evalúa mediante un ensayo descrito en el presente documento (p. ej., Sección 6.2, más abajo) o un ensayo conocido por un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo reducen la fosforilación inducida por Gas-6 de MERTK humana en células que expresan MERTK humana según se evalúa mediante un ensayo conocido por un experto en la técnica. En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo bloquean la activación de MERTK inducida por Gas-6 en células cancerosas que expresan MERTK humana (p. ej., células de melanoma, tales como, p. ej., SKMEL5) según se evalúa mediante un ensayo conocido por un experto en la técnica.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, reducen la capacidad de formación de colonias de las células cancerosas según se evalúa mediante un ensayo descrito en el presente documento (p. ej., en la Sección 6.2, más abajo) o un ensayo conocido por un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o fragmento de unión a antígeno del mismo inhiben la formación de colonias de células cancerosas (p. ej. células de melanoma tales como SKMEL5).
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo inducen respuestas de citocinas en macrófagos M2, monocitos CD14+ o ambos, tal como se proporciona en la Fig. 10, según se evalúa utilizando un ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica.
En realizaciones específicas, se aíslan un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden incluir anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales. En una realización específica, un anticuerpo puede ser una inmunoglobulina, un anticuerpo tetramérico que comprende dos moléculas de cadena pesada y dos de cadena ligera, un monómero de cadena ligera de anticuerpo, un monómero de cadena pesada de anticuerpo, un dímero de cadena ligera de anticuerpo, un dímero de cadena pesada de anticuerpo, un par de cadena ligera de anticuerpo-cadena pesada de anticuerpo, un anticuerpo de dominio único, anticuerpos monovalentes, un anticuerpo de cadena sencilla, un Fv de cadena sencilla (scFv), un Fv conectado por puentes disulfuro (scFv) y un anticuerpo antiidiotípico (anti-Id) (incluyendo, p. ej., anti-anticuerpo anti Id).
En ciertas realizaciones, un anticuerpo puede ser multiespecífico o biespecífico. En ciertas realizaciones, un anticuerpo es un anticuerpo monoclonal biespecífico. En ciertas realizaciones, un anticuerpo es monovalente. En una realización específica, un anticuerpo es bivalente. El anticuerpo de la presente invención se une a una MERTK humana en las células. En algunas realizaciones, un anticuerpo es monoespecífico. En ciertas realizaciones, un anticuerpo se produce de forma recombinante. En algunas realizaciones, un anticuerpo es un anticuerpo sintético. En una realización específica, un anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En otras realizaciones, un anticuerpo puede ser un anticuerpo humano.
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser de cualquier tipo (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA o IgY), cualquier clase (p. ej., IgG<1>, IgG<2>, IgG<3>, IgG<4>, IgA<1>o IgA<2>), o cualquier subclase (p. ej., IgG<2a>o IgG<2b>) de moléculas de inmunoglobulina. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG, o una clase o subclase del mismo. En una realización específica, un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo humanizado) es un anticuerpo monoclonal. En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK es un anticuerpo IgG.
Como se emplean en el presente documento, los términos "fragmento de unión a antígeno", "región de unión a antígeno" y términos similares se refieren a una porción de una molécula de anticuerpo que comprende los restos de aminoácidos que confieren a la molécula de anticuerpo su especificidad por el antígeno (p. ej., las regiones determinantes de la complementariedad (CDR)). La región de unión al antígeno puede derivar de cualquier especie animal, tal como roedores (p. ej., ratón, rata o hámster) y seres humanos. A modo de ejemplo, los fragmentos de unión a antígeno incluyen fragmentos Fab, fragmentos F(ab')<2>y fragmentos de unión a antígeno de cualquiera de los anticuerpos de la presente invención. En una realización específica, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo humanizado comprende una región de cadena pesada variable y una región de cadena ligera variable del anticuerpo z10. En el presente documento se divulga un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo humanizado que comprende una región de cadena pesada variable, una región de cadena ligera variable, o ambas, del anticuerpo z11 o z13.
Como se emplean en el presente documento, los términos "región variable" o "dominio variable" se utilizan indistintamente y son comunes en la técnica. La región variable típicamente se refiere a una porción de un anticuerpo, generalmente, una porción de una cadena ligera o pesada, que difiere ampliamente en secuencia entre anticuerpos y se utiliza en la unión a un antígeno particular, y la especificidad de un anticuerpo particular para su antígeno particular. La variabilidad en la secuencia se concentra en aquellas regiones denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), mientras que las regiones más altamente conservadas en el dominio variable se denominan regiones marco (FR). Sin desear vincularse a ningún mecanismo o teoría particular, se cree que las CDR de las cadenas ligera y pesada son las principales responsables de la interacción y especificidad del anticuerpo con el antígeno.
Las CDR se definen de diversas maneras en la técnica, incluidas las definiciones de Kabat, Chothia, AbM, Contact, IMGT y Exemplary. La definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia y es la definición más comúnmente utilizada para predecir regiones CDR (Kabat, Elvin A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda: Institutos Nacionales de Salud, 1983). La definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones bucle estructurales (Chothia etal.,(1987) J Mol Biol 196: 901-917). La definición de AbM, un compromiso entre las definiciones de Kabat y Chothia, es un conjunto integral de programas para el modelado de estructuras de anticuerpos producido por el Oxford Molecular Group (bioinf.org.uk/abs) (Martín ACR etal.,(1989) PNAS 86: 9268-9272). La definición de Contact se basa en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles (bioinf.org.uk/abs) (véase MacCallum RM etal.,(1996) J Mol Biol 5: 732-745). La definición de<i>M<g>T proviene del IMGT ("IMGT<®>, el sistema de información internacional ImMunoGeneTics<®>sitio web imgt.org, fundadora y directora: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, Francia). La definición de Exemplary es una combinación de AbM y Kabat (Presta etal.,(1997) Cancer Res 57: 4593-4599).
En una realización específica, un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable y una región de cadena ligera variable, en donde la región de cadena pesada variable y la región de cadena ligera variable son la región de cadena pesada variable y la región de cadena pesada variable n, del anticuerpo z10, que se proporcionan en la Tabla 11. La región de cadena pesada variable, o la región de cadena ligera variable, o ambas, del anticuerpo z11 o z13 se divulgan en las Tablas 12 y 13, respectivamente. También se divulgan un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión a antígeno descritos en el presente documento que comprenden una región de cadena pesada variable, una región de cadena ligera variable, o ambas, en donde la cadena pesada variable comprende la secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada variable de la Tabla 14, y la región de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácidos de la región de cadena ligera variable de la Tabla 11, 12 o 13, más abajo. En realizaciones específicas, el anticuerpo humanizado es monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina, un anticuerpo tetramérico que comprende dos moléculas de cadena pesada y dos de cadena ligera, un monómero de cadena ligera de anticuerpo, un monómero de cadena pesada de anticuerpo, un dímero de cadena ligera de anticuerpo y un dímero de cadena pesada de anticuerpo, un par de cadena ligera de anticuerpo-cadena pesada de anticuerpo, un anticuerpo de dominio único, un anticuerpo de cadena sencilla, Fv de cadena sencilla, un Fv conectado por puentes disulfuro o un anticuerpo antiidotípico. El anticuerpo humanizado puede ser de cualquier tipo (p. ej. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA o IgY), cualquier clase (IgG<1>, IgG<2>, IgG3, IgG4, IgA o IgA<2>), o cualquier subclase (p. ej. IgG<2>a o IgG<2>b) de moléculas de inmunoglobulina. En una realización específica, un anticuerpo humanizado descrito en el presente documento es una IgG, o una clase o subclase de la misma.
La solicitud no solo contempla anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden las secuencias divulgadas en el presente documento (p. ej., CDR, regiones marco, regiones variables) sino también anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que consisten o consisten esencialmente en las secuencias divulgadas en el presente documento. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente invención puede consistir en las secuencias de cadenas ligeras y pesadas de z10. Se divulga un anticuerpo que consiste en las secuencias de cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo z11 o z13.
En el presente documento se divulgan un anticuerpo anti-MERTK quimérico o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprenden una región de cadena pesada variable, una región de cadena ligera variable o ambas, en donde la cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácidos de la región de cadena ligera variable de la Tabla 15, más abajo, y la cadena pesada variable comprende la secuencia de aminoácidos de la región de la cadena pesada variable de la Tabla 15, más abajo.
En el presente documento se divulgan anticuerpos multiespecíficos y anticuerpos heteroconjugados. En una realización específica, se proporciona en el presente documento un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes, en donde una de las regiones de unión se une a MERTK (p. ej., MERTK humana), y comprende una región de cadena pesada variable y una región de cadena ligera variable del anticuerpo z10, y la otra región de unión se une a un antígeno de interés. En el presente documento se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende una región de cadena pesada variable, una región de cadena ligera variable, o ambas, del anticuerpo z11, z13 o xAb. En algunas realizaciones, un anticuerpo biespecífico comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes, en donde una de las regiones de unión se une específicamente a MERTK humana y la otra región de unión se une a un antígeno de interés, y en donde la región de unión que se une específicamente a MERTK humana comprende una región de cadena pesada variable y una región de cadena ligera variable del anticuerpo z10 descrito en el presente documento. En una realización específica, el antígeno de interés es un receptor de células inmunitarias o un antígeno asociado a tumores. Véase sección 5.1.3, más abajo, referente a los anticuerpos biespecíficos.
También se proporcionan en el presente documento anticuerpos heteroconjugados de la presente invención. En una realización específica, un anticuerpo heteroconjugado comprende dos anticuerpos monoclonales con especificidades por dos antígenos diferentes, en donde uno de los anticuerpos monoclonales comprende una región de cadena pesada variable y una región de cadena ligera variable del anticuerpo z10. En el presente documento se divulga un anticuerpo heteroconjugado que comprende una región de cadena pesada variable y una región de cadena ligera variable del anticuerpo z11, z13 o xAb.
También se proporcionan ácidos nucleicos aislados (polinucleótidos), tales como ADN complementario (ADNc), que codifican los anticuerpos anti-MERTK, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención. En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento polinucleótidos que comprenden la secuencia de ácido nucleico que codifica la VH y la VL del anticuerpo z10 expuesta en la Tabla 21. En algunas realizaciones, se proporcionan en el presente documento polinucleótidos que comprenden la secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo z10 como se expone en la Tabla 25. Los polinucleótidos que comprenden la secuencia de ácido nucleico que codifica VH, VL o ambas del anticuerpo z11, z13 y xAb se divulgan en el presente documento en las Tablas 22, 23 o 24, respectivamente. Los polinucleótidos que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo z11, z13 o xAb son los divulgados en el presente documento en las Tablas 26, 27 o 28, respectivamente.
Además, se proporcionan vectores (p. ej., vectores de expresión) y células (p. ej., células anfitrionas) que comprenden ácidos nucleicos (polinucleótidos) que codifican los anticuerpos anti-MERTK o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención. También se proporcionan métodos para producir tales anticuerpos.
En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento productos conjugados de anticuerpo-fármaco que comprenden: (a) un radical de anticuerpo que es un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que se unen específicamente a MERTK humana de la presente invención; (b) uno o más radicales de fármaco, siendo cada radical de fármaco un agente citotóxico; y (c) opcionalmente un conector; en donde el agente citotóxico se conjuga directamente con el radical de anticuerpo o se conjuga con el radical de anticuerpo a través del conector. El término "conjugado" como se emplea en esta divulgación significará unido covalentemente, directamente, o a través de una estructura unida covalentemente intermedia.
En el caso en el que el agente citotóxico sea un péptido o una proteína, o en el que el agente citotóxico y el conector (si lo hay) sean péptidos o proteínas, también se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los productos conjugados de anticuerpo-fármaco. En el presente documento se divulgan métodos para producir productos conjugados de anticuerpo-fármaco que comprenden (i) los anticuerpos anti-MERTK o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y (ii) agentes citotóxicos conjugados directamente con los anticuerpos anti-MERTK o fragmentos de unión a antígeno, o conjugados con los anticuerpos anti-MERTK o fragmentos de unión a antígeno a través de conectores.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan composiciones (p. ej. composiciones farmacéuticas) que comprenden un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención. En una realización específica, una composición farmacéutica comprende un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, uno o más portadores, excipientes o ambos farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente uno o más agentes terapéuticos diferentes.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan composiciones (p. ej. composiciones farmacéuticas) que comprenden un producto conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención. En una realización específica, una composición farmacéutica comprende un producto conjugado de anticuerpo-fármaco, uno o más portadores, excipientes o ambos farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente uno o más agentes terapéuticos diferentes.
En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención o una composición de los mismos para su uso en métodos de tratamiento del cáncer en un sujeto. En una realización específica, el anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo son un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión a antígeno. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo son un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo heteroconjugado. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo son un anticuerpo quimérico o fragmento de unión a antígeno del mismo.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un producto conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención para su uso en un método para tratar el cáncer en un sujeto. En una realización específica, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco comprende (i) un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, y (ii) agentes citotóxicos conjugados directamente con el anticuerpo anti-MERTK o fragmentos de unión a antígeno del mismo, o conjugados con el anticuerpo anti-MERTK o fragmentos de unión al antígeno del mismo a través de conectores.
5.1. Anticuerpos
La presente invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a anticuerpo del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno comprenden una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. El anticuerpo z10 es un anticuerpo de la presente invención. Los anticuerpos z11, z13 y xAb se divulgan, pero no se reivindican.
5.1.1. Secuencias y variantes
Las Tablas 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 26, 27, 28, 29 y 30 se divulgan, pero no se reivindican.
En las Tablas 1 y 7, más abajo, se proporcionan CDR de VH y CDR de VL, respectivamente, de un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se definen utilizando diferentes sistemas. La Tabla 2, más abajo, proporciona regiones marco de VH como se definen utilizando diferentes sistemas que pueden combinarse con las CDR en la Tabla 1. En una realización específica, las CDR de la Tabla 1 se combinan con la región marco 3 de VH de la secuencia consenso, utilizando un sistema de numeración, a lo largo de la región marco 1, 2 y 4 de VH, utilizando el mismo sistema de numeración, que se proporciona en la Tabla 2. La Tabla 9, más abajo, proporciona regiones marco de VL como se definen utilizando diferentes sistemas que pueden combinarse con las CDR de la Tabla 7. La Tabla 11 proporciona las secuencias de aminoácidos de VH y VL de anticuerpos particulares. La Tabla 14 divulga la secuencia de aminoácidos de una VH que puede combinarse con la VL proporcionada en las Tablas 11, 12, 13 o 15. La Tabla 16 proporciona las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpos particulares. La Tabla 19 divulga una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se puede combinar con la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de las Tablas 16, 17 o 18. La Tabla 21 proporciona las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de anticuerpos particulares. La Tabla 25 proporciona las secuencias de ácido nucleico que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de anticuerpos particulares. Las Tablas 29 y 30 divulgan secuencias de aminoácidos de MERTK humana ilustrativas a las que se puede unir un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento.
En realizaciones específicas, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionados en el presente documento comprenden la CDR1 de VH del anticuerpo de la Tabla 1 como definen Kabat, Chothia, AbM, Contact, IMGT o Exemplary. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionados en el presente documento comprenden la CDR2 de VH del anticuerpo en la Tabla 1 como definen Kabat, Chothia, AbM, Contact, IMGT o Exemplary. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionados en el presente documento comprenden la CDR3 de VH del anticuerpo en la Tabla 1 como definen Kabat, Chothia, AbM, Contact, IMGT o Exemplary. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionados en el presente documento comprenden una, dos o las tres CDR de VH de un anticuerpo de la Tabla 1, según se determina mediante un sistema de numeración.
En realizaciones específicas, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionados en el presente documento comprenden la CDR1 de VL del anticuerpo de la Tabla 7 como definen Kabat, Chothia, AbM, Contact, IMGT o Exemplary. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionados en el presente documento comprenden la CDR2 de VL del anticuerpo de la Tabla 7 como definen Kabat, Chothia, AbM, Contact, IMGT o Exemplary. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionados en el presente documento comprenden la CDR3 de VL del anticuerpo de la Tabla 7 como definen Kabat, Chothia, AbM, Contact, IMGT o Exemplary. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo proporcionados en el presente documento comprenden una, dos o las tres CDR de VL de un anticuerpo de la Tabla 7, según se determina mediante un sistema de numeración.
Tabla 1. Secuencias de Aminoácidos de CDR de VH del Anticuerpo z10/z11/z13/xAb
Tabla 2. Secuencias de Aminoácidos de la Región Marco de VH del Anticuerpo z10
Tabla 3. Secuencias de Aminoácidos de la Región Marco de VH del Anticuerpo z11
Tabla 4. Secuencias de Aminoácidos de la Región Marco de VH del Anticuerpo z13
Tabla 5. Secuencias de Aminoácidos Consenso de FR3 de VH del Anticuerpo (Xi es F o M; X2 es T o L)
Tabla 6. Secuencias de Aminoácidos de la Región Marco de VH del Anticuerpo xAb
Tabla 7. Secuencias de Aminoácidos de CDR de VL del Anticuerpo z10/z11/z13
Tabla 8. Secuencias de Aminoácidos de CDR de VL del anticuerpo xAb
Tabla 9. Secuencias de Aminoácidos de la Región Marco de VL del Anticuerpo z10/z11/z13
Tabla 10. Secuencias de aminoácidos de la región marco de VL del anticuerpo xAb
Tabla 11. Secuencias de aminoácidos de la región variable del anticuerpo z10
Tabla 12. Secuencias de aminoácidos de la región variable del anticuerpo z11
Tabla 13. Secuencias de aminoácidos de la región variable del anticuerpo z13
Tabla 14. Secuencia de aminoácidos consenso de región variable de cadena pesada de anticuerpo (X<1>es F o M; X<2>es T o L)
Tabla 15. Secuencias de aminoácidos de la región variable del anticuerpo xAb
Tabla 16. Secuencias de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo z10
Tabla 17. Secuencias de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo z11
Tabla 18. Secuencias de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo z13
Tabla 19. Secuencias de aminoácidos consenso de cadena pesada de anticuerpo (Xi es F o M; X<2>es T o L)
Tabla 20. Secuencias de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo xAb
Tabla 21. Secuencias de ADN de la región variable del anticuerpo z10
Tabla 22. Secuencias de ADN de la región variable del anticuerpo z11
Tabla 23. Secuencias de ADN de la región variable del anticuerpo z13
Tabla 24. Secuencias de ADN de la región variable del anticuerpo xAb
gacattgtgctgacccagtctcacaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcatcacctgcaaggccagtcagga tgtgggtgatgctgtaacctggtgtcaacagaaaccaggtcaacctcctaaactactgatttactgggcatccacccggcacac tggagtccctgatcgcttcacaggcagtgggtctgggacagatttcactctcaccattaacaatgtgcagtctgaggacttggca gattatttctgtcagcaatatcgcagctatcctctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa
(SEQ ID NO: 124)
Tabla 25. Secuencias de ADN de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo z10
Tabla 26. Secuencias de ADN de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo z11
Tabla 27. Secuencias de ADN de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo z13
Tabla 28. Secuencias de ADN de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo xAb
Tabla 29. Secuencias de proteínas MERTK
En una realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región marco (FR) 1, una CDR1 de región de cadena pesada variable (VH), una FR2, una CDR2 de VH, una FR3, una CDR3 de VH y una FR4, y en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, C<d>R3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos CDR1 de VH,<c>D<r>2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando el sistema de numeración Exemplary, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 2 utilizando el sistema de numeración Exemplary. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región marco (FR) 1, una CDR1 de región de cadena pesada variable (VH), una FR2, una CDR2 de VH, una FR3, una CDR3 de VH y una FR4, y en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando el sistema de numeración de Kabat, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 2 utilizando el sistema de numeración de Kabat. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región marco (FR) 1, una CDR1 de región de cadena pesada variable (VH), una FR2, una CDR2 de VH, una FR3, una CDR3 de VH y una FR4, y en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando el sistema de numeración de Chothia, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 2 utilizando el sistema de numeración de Chothia. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región marco (FR) 1, una CDR1 de región de cadena pesada variable (VH), una FR2, una CDR2 de VH, una FR3, una CDR3 de VH y una FR4, y en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando el sistema de numeración AbM, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 2 utilizando el sistema de numeración AbM. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región marco (FR) 1, una CDR1 de región de cadena pesada variable (VH), una FR2, una CDR2 de VH, una FR3, una CDR3 de VH y una FR4, y en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, Cd R3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando el sistema de numeración Contact, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 2 utilizando el sistema de numeración Contact. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región marco (FR) 1, una CDR1 de región de cadena pesada variable (VH), una FR2, una CDR2 de VH, una FR3, una CDR3 de VH y una FR4, y en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, Cd r 3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando el sistema de numeración IMGT, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 2 utilizando el sistema de numeración IMGT.
En el presente documento se divulgan un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región marco (FR) 1, una CDR1 de región de cadena pesada variable (VH), una FR2, una CDR2 de VH, una FR3, una CDR3 de VH y una FR4, y en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, C<d>R3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando un sistema de numeración, y FR1, FR2 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2 y FR4 expuestas en las Tablas 2, 3 o 4 utilizando el mismo sistema de numeración, y FR3 comprende la secuencia de aminoácidos del FR3 expuesta en la Tabla 5 utilizando el mismo sistema de numeración.
En una realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH), en donde la VH comprende una región marco (FR) 1, una CDR1 de VH, una FR2, una CDR2 de VH, una FR3, una CDR3 de VH y una FR4, y en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando el sistema de numeración Exemplary, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 2 utilizando el sistema de numeración Exemplary. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH), en donde la VH comprende una región marco (FR) 1, una CDR1 de VH, una FR2, una CDR2 de VH, una FR3, una CDR3 de VH y una FR4, y en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando el sistema de numeración de Kabat, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 2 utilizando el sistema de numeración de Kabat. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH), en donde la VH comprende una región marco (FR) 1, una CDR1 de VH, una FR2, una CDR2 de VH, una FR3, una CDR3 de VH y una FR4, y en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando el sistema de numeración de Chothia, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 2 utilizando el sistema de numeración de Chothia. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH), en donde la VH comprende una región marco (FR) 1, una CDR1 de VH, una FR2, una CDR2 de VH, una FR3, una CDR3 de VH y una FR4, y en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando el sistema de numeración AbM, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 2 utilizando el sistema de numeración AbM. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH), en donde la VH comprende una región marco (FR) 1, una CDR1 de VH, una FR2, una CDR2 de VH, una FR3, una CDR3 de VH y una FR4, y en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando el sistema de numeración Contact, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 2 utilizando el sistema de numeración Contact. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH), en donde la VH comprende una región marco (FR) 1, una CDR1 de VH, una FR2, una CDR2 de VH, una FR3, una CDR3 de VH y una FR4, y en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando el sistema de numeración IMGT, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 2 utilizando el sistema de numeración IMGT.
En el presente documento se divulgan un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH), en donde la VH comprende una región marco (FR) 1, una CDR1 de VH, una FR2, una CDR2 de VH, una FR3, una CDR3 de VH y una F<r>4, y en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando un sistema de numeración, y FR1, FR2, y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2 y FR4 expuestas en la Tabla 2, 3 o 4 utilizando el mismo sistema de numeración, y FR3 comprende la secuencia de aminoácidos de FR3 expuesta en la Tabla 5 utilizando el mismo sistema de numeración.
En una realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región marco (FR) 1, una CDR1 de región de cadena ligera variable (VL), una FR2, una CDR2 de VL, una FR3, una CDR3 de VL y una FR4, y en donde la CDR1 de VL, CDR2 de VL, CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL como se muestra en la Tabla 7 utilizando el sistema de numeración Exemplary, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 9 utilizando el sistema de numeración Exemplary. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región marco (FR) 1, una CDR1 de región de cadena ligera variable (VL), una FR2, una CDR2 de VL, una FR3, una CDR3 de VL y una FR4, y en donde la CDR1 de VL, CDR2 de VL, CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL como se muestra en la Tabla 7 utilizando el sistema de numeración de Kabat, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 9 utilizando el sistema de numeración de Kabat. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región marco (FR) 1, una CDR1 de región de cadena ligera variable (VL), una FR2, una CDR2 de VL, una FR3, una CDR3 de VL y una FR4, y en donde la CDR1 de VL, CDR2 de VL, CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL como se muestra en la Tabla 7 utilizando el sistema de numeración de Chothia, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 9 utilizando el sistema de numeración de Chothia. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región marco (FR) 1, una CDR1 de región de cadena ligera variable (VL), una FR2, una CDR2 de VL, una FR3, una CDR3 de VL y una FR4, y en donde la CDR1 de VL, CDR2 de VL, CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL expuestas en la Tabla 7 utilizando el sistema de numeración AbM, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 9 utilizando el sistema de numeración AbM. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región marco (FR) 1, una CDR1 de región de cadena ligera variable (VL), una FR2, una CDR2 de VL, una FR3, una CDR3 de VL y una FR4, y en donde la CDR1 de VL, CDR2 de VL, CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL expuestas en la Tabla 7 utilizando el sistema de numeración Contact, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 9 utilizando el sistema de numeración Contact. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región marco (FR) 1, una CDR1 de región de cadena ligera variable (VL), una FR2, una CDR2 de VL, una FR3, una CDR3 de VL y una F<r>4, y en donde la CDR1 de VL, CDR2 de VL, CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL expuestas en la Tabla 7 utilizando el sistema de numeración IMGT, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 9 utilizando el sistema de numeración IMGT.
En una realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena ligera variable (VL), en donde la VL comprende una región marco (FR) 1, una CDR1 de región de cadena ligera variable (VL), una FR2, una CDR2 de VL, una FR3, una CDR3 de VL y una FR4, y en donde la CDR1 de VL, CDR2 de VL, CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL expuestas en la Tabla 7 utilizando el sistema de numeración Exemplary, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 9 utilizando el sistema de numeración Exemplary. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena ligera variable (VL), en donde la VL comprende una región marco (FR) 1, una CDR1 de región de cadena ligera variable (VL), una FR2, una CDR2 de VL, una FR3, una CDR3 de VL y una FR4, y en donde la CDR1 de VL, CDR2 de VL, CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL expuestas en la Tabla 7 utilizando el sistema de numeración de Kabat, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 9 utilizando el sistema de numeración de Kabat. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena ligera variable (VL), en donde la VL comprende una región marco (FR) 1, una CDR1 de región de cadena ligera variable (VL), una FR2, una CDR2 de VL, una FR3, una CDR3 de VL y una FR4, y en donde la CDR1 de VL, CDR2 de VL, CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL expuestas en la Tabla 7 utilizando el sistema de numeración de Chothia, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 9 utilizando el sistema de numeración Chothia. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena ligera variable (VL), en donde la VL comprende una región marco (FR) 1, una CDR1 de región de cadena ligera variable (VL), una FR2, una CDR2 de VL, una FR3, una CDR3 de VL y una FR4, y en donde la CDR1 de VL, CDR2 de VL, CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL expuestas en la Tabla 7 utilizando el sistema de numeración AbM, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 9 utilizando el sistema de numeración AbM. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena ligera variable (VL), en donde la VL comprende una región marco (FR) 1, una CDR1 de región de cadena ligera variable (VL), una FR2, una CDR2 de VL, una FR3, una CDR3 de VL y una FR4, y en donde la CDR1 de VL, CDR2 de VL, CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de Vl , CDR2 de VL y CDR3 de VL expuestas en la Tabla 7 utilizando el sistema de numeración Contact, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 9 utilizando el sistema de numeración Contact. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena ligera variable (VL), en donde la VL comprende una región marco (FR) 1, una CDR1 de región de cadena ligera variable (VL), una FR2, una CDR2 de VL, una FR3, una CDR3 de VL y una FR4, y en donde la CDR1 de VL, CDR2 de VL, CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL expuestas en la Tabla 7 utilizando el sistema de numeración IMGT, y FR1, FR2, FR3 y FR4 comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1, FR2, FR3 y FR4 expuestas en la Tabla 9 utilizando el sistema de numeración IGMT.
En una realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH) y una región de cadena ligera variable (VL), en donde la VH comprende una región marco de VH (FR) 1, una CDR1 de VH, una FR2 de VH, una CDR2 de<v>H, una FR3 de VH, una CDR3 de VH y una FR4 de VH, en donde la VL comprende una FR1 de VL, una CDR1 de VL, una FR2 de VL, una CDR2 de VL, una FR3 de VL, una CDR3 de VL y una f R4 de VL, en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando el sistema de numeración Exemplary, en donde la FR1 de VH, FR2 de VH, FR3 de VH y FR4 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1 de VH, FR2 de VH, FR3 de VH y FR4 de VH expuestas en la Tabla 2 utilizando el sistema de numeración Exemplary, en donde la CDR1 de VL, CDR2 de VL y Cd R3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la c Dr 1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL expuestas en la Tabla 7 utilizando el sistema de numeración Exemplary, y en donde la FR1 de VL, FR2 de VL, FR3 de VL y FR4 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la f R1 de VL, FR2 de VL, FR3 de VL y FR4 de VL expuestas en la Tabla 9 utilizando el sistema de numeración Exemplary. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH) y una región de cadena ligera variable (VL), en donde la VH comprende una región marco de VH (FR) 1, una CDR1 de VH, una FR2 de VH, una CDR2 de VH, una FR3 de VH, una CDR3 de VH y una FR4 de VH, en donde la VL comprende una FR1 de VL, una CDR1 de VL, una FR2 de VL, una CDR2 de VL, una FR3 de VL, una CDR3 de VL y una FR4 de VL, en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando el sistema de numeración de Kabat, en donde la FR1 de VH, FR2 de VH, FR3 de VH y FR4 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1 de VH, FR2 de VH, FR3 de VH y FR4 de VH expuestas en la Tabla 2 utilizando el sistema de numeración de Kabat, en donde la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL expuestas en la Tabla 7 utilizando el sistema de numeración de Kabat, y en donde la FR1 de VL, FR2 de VL, FR3 de VL y FR4 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1 de VL, FR2 de VL, FR3 de VL y FR4 de VL expuestas en la Tabla 9 utilizando el sistema de numeración de Kabat. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH) y una región de cadena ligera variable (VL), en donde la VH comprende una región marco de VH (FR) 1, una CDR1 de VH, una FR2 de VH, una CDR2 de VH, una FR3 de VH, una CDR3 de VH y una FR4 de VH, en donde la VL comprende una FR1 de VL, una CDR1 de VL, una FR2 de VL, una CDR2 de VL, una FR3 de VL, una CDR3 de VL y una FR4 de VL, en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando el sistema de numeración Chothia, en donde la FR1 de VH, FR2 de VH, FR3 de VH y FR4 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1 de VH, FR2 de VH, FR3 de VH y FR4 de VH expuestas en la Tabla 2 utilizando el sistema de numeración de Chothia, en donde la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL expuestas en la Tabla 7 utilizando el sistema de numeración de Chothia, y en donde la FR1 de VL, FR2 de VL, FR3 de VL y FR4 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1 de VL, FR2 de VL, FR3 de VL y FR4 de VL expuestas en la Tabla 9 utilizando el sistema de numeración de Chothia. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH) y una región de cadena ligera variable (VL), en donde la VH comprende una región marco de VH (FR) 1, una CDR1 de VH, una FR2 de VH, una CDR2 de VH, una FR3 de VH, una C<d>R3 de VH y una FR4 de VH, en donde la VL comprende una FR1 de VL, una CDR1 de VL, una FR2 de VL, una CDR2 de VL, una FR3 de VL, una CDR3 de VL y una Fr 4 de VL, en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando el sistema de numeración AbM, en donde la FR1 de VH, FR2 de v H, FR3 de VH y f R4 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1 de VH, FR2 de VH, FR3 de VH y FR4 de VH expuestas en la Tabla 2 utilizando el sistema de numeración AbM, en donde la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL expuestas en la Tabla 7 utilizando el sistema de numeración AbM, y en donde la FR1 de VL, FR2 de VL, FR3 de VL y f R4 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1 de VL, FR2 de VL, FR3 de VL y FR4 de VL expuestas en la Tabla 9 utilizando el sistema de numeración AbM. En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH) y una región de cadena ligera variable (VL), en donde la VH comprende una región marco de VH (FR) 1, una CDR1 de VH, una FR2, una CDR2 de VH, una FR3 de VH, una CDR3 de VH y una FR4 de VH, en donde la V<l>comprende una FR1 de VL, una CDR1 de VL, una FR2 de VL, una CDR2 de VL, una FR3 de VL, una CDR3 de VL y una FR4 de VL, en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando el sistema de numeración Contact, en donde la FR1 de VH, FR2 de VH, FR3 de VH y FR4 de VH comprende las secuencias de aminoácidos de FR1 de VH, FR2 de VH, FR3 de VH y FR4 de VH expuestas en la Tabla 2 utilizando el sistema de numeración Contact, en donde la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de VL. CDR1, CDR2 de VL y CDR3 de VL expuestas en la Tabla 7 utilizando el sistema de numeración Contact, y en donde la FR1 de VL, FR2 de VL, FR3 de VL y FR4 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1 de VL, FR2 de VL, FR3 de VL, y FR4 de VL expuestas en la Tabla 9 utilizando el sistema de numeración Contact. En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH) y una región de cadena ligera variable (VL), en donde la VH comprende una región marco de VH (FR) 1, una CDR1 de VH, una FR2 de VH, una CDR2 de VH, una FR3 de VH, una CDR3 de VH y una FR4 de VH, en donde la VL comprende una FR1 de VL, una CDR1 de VL, una FR2 de VL, una CDR2 de VL, una FR3 de VL, una CDR3 de VL y una FR4 de VL, en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando el sistema de numeración IMGT, en donde la FR1 de VH, FR2 de VH, FR3 de VH y FR4 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1 de VH, FR2 de VH, FR3 de VH y FR4 de VH expuestas en la Tabla 2 utilizando el sistema de numeración IMGT, en donde la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL expuestas en la Tabla 7 utilizando el sistema de numeración IMGT, y en donde la FR1 de VL, FR2 de Vl , FR3 de VL y FR4 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1 de VL, FR2 de VL, FR3 de VL y FR4 de VL expuestas en la Tabla 9 utilizando el sistema de numeración IMGT.
En el presente documento se divulgan un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH) y una región de cadena ligera variable (VL), en donde la VH comprende una región marco de V<h>(FR) 1, una CDR1 de VH, una FR2 de VH, una CDR2 de VH, una FR3 de VH, una C<d>R3 de VH y una FR4 de VH, en donde la VL comprende una FR1 de VL, una CDR1 de VL, una FR2 de VL, una CDR2 de VL, una FR3 de VL, una CDR3 de VL, y una FR4 de VL, en donde la CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR1 de VH, CDR2 de VH y CDR3 de VH expuestas en la Tabla 1 utilizando un sistema de numeración, en donde la FR1 de VH, FR2 de VH,<f>R3 de VH y FR4 de VH comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1 de VH, FR2 de VH y FR4 de VH expuestas en las Tablas 2, 3 o 4 utilizando el mismo sistema de numeración, en donde FR3 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de FR3 de VH expuesta en la Tabla 5, en donde la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL expuestas en la Tabla 7 utilizando el mismo sistema de numeración, y en donde la FR1 de VL, f R2 de VL, FR3 de VL y FR4 de VL comprenden las secuencias de aminoácidos de la FR1 de VL, FR2 de VL, FR3 de VL y FR4 de VL expuestas en la Tabla 9 utilizando el mismo sistema de numeración.
En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH) y una región de cadena ligera variable (VL), en donde la CDR1 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, CDR2 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, CDR3 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, la CDR1 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68, la CDR2 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 y la CDR3 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70.
En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH) y una región de cadena ligera variable (VL), en donde la CDR1 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, CDR2 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, CDR3 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, la CDR1 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, la CDR2 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72 y la CDR3 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73.
En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH) y una región de cadena ligera variable (VL), en donde la CDR1 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, CDR2 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, CDR3 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, la CDR1 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68, la CDR2 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 y la CDR3 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70.
En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH) y una región de cadena ligera variable (VL), en donde la CDR1 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, CDR2 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, CDR3 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, la CDR1 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, la CDR2 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 y la CDR3 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76.
En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH) y una región de cadena ligera variable (VL), en donde la CDR1 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, CDR2 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, CDR3 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, la CDR1 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77, la CDR2 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72 y la CDR3 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70.
En otra realización específica, se proporcionan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región de cadena pesada variable (VH) y una región de cadena ligera variable (VL), en donde la CDR1 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, CDR2 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, CDR3 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, la CDR1 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68, la CDR2 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 y la CDR3 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70.
El anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, que se unen específicamente a MERTK humana, comprenden una región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105. Como se divulga, un anticuerpo anti-Anticuerpo MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), pueden comprender una región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107. Como se divulga, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), pueden comprender una región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID: 108. Como se divulga, un anti-MERTK humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), pueden comprender una región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109.
Como se divulga, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), pueden comprender una región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID: 110.
El anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, que se unen específicamente a MERTK humana, comprenden una región variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), pueden comprender una región de cadena ligera variable (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111.
Según la presente invención, un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, comprenden una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, y la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Como se divulga, un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) pueden comprender una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107, y la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Como se divulga, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) pueden comprender una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108, y la VL puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Como se divulga, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTk humana) pueden comprender una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110, y la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111.
Como se divulga, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), pueden comprender una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109, y la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 o 111.
Según la presente invención, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, comprenden una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de la VH expuesta en la Tabla 11 y la VL comprende la secuencia de aminoácidos de la VL expuesta en la Tabla 11. En el presente documento se divulgan un anticuerpo anti-MERTK humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), pueden comprender una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de la VH expuesta en la Tabla 12 y la VL comprende la secuencia de aminoácidos de la VL expuesta en la Tabla 12. En el presente documento se divulgan un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), pueden comprender una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de la VH expuesta en la Tabla 13 y la VL comprende la secuencia de aminoácidos de la VL expuesta en la Tabla 13. En el presente documento se divulgan un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), pueden comprender una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de la VH expuesta en la Tabla 14 y la VL comprende la secuencia de aminoácidos del VL expuesta en las Tablas 11, 12 o 13.
Como se divulga, un anticuerpo descrito en el presente documento puede describirse por su dominio VH solo o por su dominio VL solo. Véase, por ejemplo, Rader Cet al.,(1998) PNAS 95: 8910-8915 que describen la humanización del anticuerpo anti-avp3 de ratón mediante la identificación de una cadena ligera o una cadena pesada complementaria, respectivamente, de una biblioteca de cadenas ligeras o cadenas pesadas humanas, lo que da como resultado variantes de anticuerpos humanizados que tienen afinidades tan altas como, o superiores a la afinidad del anticuerpo original. Véase también, Clackson T etal.,(1991) Nature 352: 624-628, que describen métodos para producir anticuerpos que se unen a un antígeno específico mediante el uso de un dominio VH (o dominio VL) específico y el escrutinio de una biblioteca para determinar los dominios variables complementarios. Véase también, Kim SJ y Hong HJ, (2007) J Microbiol 45: 572-577, que describen métodos para producir anticuerpos que se unen a un antígeno específico mediante el uso de un dominio VH específico y el escrutinio de una biblioteca (p. ej., biblioteca de VL humanas) para determinar los dominios VL complementarios; los dominios VL seleccionados a su vez podrían utilizarse para guiar la selección de dominios VH complementarios adicionales (p. ej., humanos).
Como se emplean en el presente documento, los términos "se une inmunoespecíficamente", "reconoce inmunoespecíficamente", "se une específicamente" y "reconoce específicamente" son términos análogos en el contexto de los anticuerpos y se refieren a anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a un antígeno (p. ej., epítopo o complejo inmunitario) a través de los sitios de unión al antígeno como lo entiende un experto en la técnica, y no excluyen la reactividad cruzada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno con otros antígenos. Se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para determinar si se mantiene la unión inmunoespecífica a MERTK (p. ej., MERTK humana).
En el presente documento se divulgan un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprenden una cadena pesada y/o una cadena ligera de anticuerpo, p. ej., una cadena pesada sola, una cadena ligera sola, o tanto una cadena pesada como una cadena ligera. Con respecto a la cadena ligera, en un ejemplo específico, la cadena ligera de un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento es una cadena ligera kappa. En otro ejemplo específico, la cadena ligera de un anticuerpo antiMERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento es una cadena ligera lambda. La cadena ligera de un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención puede ser una cadena ligera kappa humana o una cadena ligera lambda humana.
En otra realización particular, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, comprenden una cadena ligera, en donde la cadena ligera comprende una región de cadena ligera variable (VL) y la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena ligera kappa, en donde la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Como se emplea en el presente documento, el término "región constante" o "dominio constante" son intercambiables y tienen su significado común en la técnica. La región constante es una porción de anticuerpo, p. ej., una porción carboxilo terminal de una cadena ligera y/o pesada que no está directamente implicada en la unión de un anticuerpo al antígeno pero que puede exhibir diversas funciones efectoras, tales como la interacción con el receptor de Fc. La región constante de una molécula de inmunoglobulina generalmente tiene una secuencia de aminoácidos más conservada con relación a un dominio variable de inmunoglobulina.
En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, comprenden una cadena ligera, en donde la cadena ligera comprende una región de cadena ligera variable (VL) y una región constante de cadena ligera kappa o lambda humana, en donde la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. En la técnica se han descrito ejemplos no limitantes de secuencias de región constante humana, p. ej., véase Kabat EAet a l,(1991).
En otra realización particular, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, comprenden una cadena ligera, en donde la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113.
Con respecto a la cadena pesada, en una realización específica, la cadena pesada de un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento puede ser una cadena pesada humana alfa (a), delta (8), épsilon (e), gamma. (y) o mu (|j). En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, comprenden una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende la región constante o una porción de la misma (p. ej. C<h>1, C<h>2 o C<h>3 o una combinación de las mismas) descritas en el presente documento o conocidas en la técnica, y una región de cadena pesada variable (VH) de SEQ ID NO: 105.
En una realización particular, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, comprenden una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende una región de cadena pesada variable (VH) de SEQ ID NO: 105 y la región constante o porción de la misma (p. ej. C<h>1, C<h>2 o C<h>3 o una combinación de las mismas) de la región variable de la región constante de la cadena pesada gamma humana. En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112. Se han descrito ejemplos no limitantes de secuencias de región constante humana en la técnica, p. ej., véase Kabat EA et al., (1991) más arriba.
En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK de la presente invención, que se une específicamente a MERTK humana, comprende (i) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112 y (ii) una cadena ligera que comprende el aminoácido ácido de SEQ ID NO: 113. Como se divulga, un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), puede comprender (i) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 114 y (ii) una cadena ligera que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 113. Como se divulga, un anti-MERTK anticuerpo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), puede comprender (i) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y (ii) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113. Como se divulga, un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana, puede comprender (i) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de<s>E<q>ID NO: 116 y (ii) una cadena ligera que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 113. Como se divulga, un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), puede comprender (i) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 y (ii) una cadena ligera que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 118.
Como se divulga, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que se unen inmunoespecíficamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) pueden comprender una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL) que comprenden cualquier secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento, y en donde las regiones constantes comprenden las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes de una molécula de inmunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgD, IgA o IgY humana. En otra realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen inmunoespecíficamente a MERTK humana, comprenden una VH y una VL que comprenden cualquier secuencia de aminoácidos según se reivindica, y en donde las regiones constantes comprenden las secuencias de aminoácidos de la regiones constante expuestas en la Tabla 11 de una molécula de inmunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgD, IgA o IgY humana, de cualquier clase (p. ej., IgGi, IgG<2>, IgG3, IgG4, IgAi e IgA<2>), o cualquier subclase (p. ej., IgG<2>a e IgG<2>b) de molécula de inmunoglobulina.
En ciertas realizaciones, se introducen una, dos o más mutaciones (p. ej., sustituciones de aminoácidos) en la región Fc de un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo.
En algunas realizaciones, se introducen una, dos o más mutaciones (p. ej., sustituciones de aminoácidos) en la región Fc de un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo (p. ej., dominio C<h>2 (restos 231-340 de IgG<1>humana) y/o dominio C<h>3 (restos 341-447 de IgG<1>humana) y/o la región bisagra, con numeración según el sistema de numeración de Kabat (p. ej., índice EU de Kabat)) para aumentar o disminuir la afinidad del anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo por un receptor de Fc (p. ej., un receptor de Fc activado) en la superficie de una célula efectora. Un experto conoce las mutaciones en la región Fc de un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que disminuyen o aumentan la afinidad de un anticuerpo por un receptor de Fc, y los mecanismos para introducir tales mutaciones en el receptor de Fc o fragmento del mismo son conocidos por un experto en la técnica. Los ejemplos de mutaciones en el receptor de Fc de un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que se pueden realizar para alterar la afinidad del anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo por un receptor de Fc son descritos, p. ej., por Smith Pet al.,(2012) en PNAS 109: 6181-6186, la Patente de Estados Unidos Núm. 6.737.056 y las Publicaciones Internacionales Núm. WO 02/060919; WO 98/23289; y WO 97/34631.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región constante glicosilada. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región constante no glicosilada. Se ha informado de que los anticuerpos con menor contenido de fucosa tienen una mayor afinidad por los receptores de Fc, tales como, p. ej., FcyRIIIa. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos tienen un menor contenido de fucosa o no tienen fucosa. Tales anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se pueden producir utilizando mecanismos conocidas por un experto en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden expresarse en células con dificiencia o carencia de capacidad de fucosilación. En un ejemplo específico, se pueden utilizar líneas celulares con una inactivación génica de ambos alelos de a1,6-fucosiltransferasa para producir anticuerpos con menor contenido de fucosa. El sistema Potelligent® (Lonza) es un ejemplo de tal sistema que puede utilizarse para producir anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos con menor contenido de fucosa. Alternativamente, se pueden producir anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno con menor contenido de fucosa o sin contenido de fucosa mediante, p. ej.: (i) cultivo de células en condiciones que impidan o reduzcan la fucosilación; (ii) eliminación postraduccional de fucosa (p. ej., con una enzima fucosidasa); (iii) adición postraduccional del carbohidrato deseado, p. ej., después de la expresión recombinante de una glicoproteína no glicosilada; o (iv) purificación de la glicoproteína para seleccionar anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que no estén fucosilados. Véanse, p. ej., Longmore GD y Schachter H (1982) Carbohidr Res 100: 365-92 e Imai-Nishiya H etal.,(2007) BMC Biotechnol. 7: 84 para métodos para producir anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos sin contenido de fucosa o con menor contenido de fucosa.
En otra realización particular, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, comprenden una cadena pesada o una cadena ligera, en donde (i) la cadena pesada comprende (a) una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y (b) un dominio de cadena pesada constante que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio constante de una IgG humana; o (ii) la cadena ligera comprende (a) una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 y (b) un dominio de cadena ligera constante que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio constante de una cadena ligera humana.
En otra realización particular, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, comprenden una cadena pesada y una cadena ligera, en donde (i) la cadena pesada comprende (a) una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y (b) un dominio de cadena pesada constante que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio constante de una IgG humana; y (ii) la cadena ligera comprende una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, y (b) un dominio de cadena ligera constante que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio constante de una cadena ligera kappa humana.
Como se divulga, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), pueden comprender una cadena pesada o una cadena ligera, en donde (i) la cadena pesada comprende (a) una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110 y (b) un dominio de cadena pesada constante que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio constante de una IgG humana; o (ii) la cadena pesada comprende (a) una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 y (b) un dominio de cadena ligera constante que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio constante de una cadena ligera kappa humana. Como se divulga, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), pueden comprender una cadena pesada y una cadena ligera, en donde (i) la cadena pesada comprende (a) una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110 y (b) un dominio de cadena pesada constante que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio constante de una IgG humana; y (ii) la cadena ligera comprende (a) una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 y (b) un dominio de cadena ligera constante que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio constante de una cadena ligera kappa humana.
La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias (p. ej., secuencias de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos) también se puede lograr utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo específico, no limitante, de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin S y Altschul SF (1990) PNAS 87: 2264-2268, modificado como en Karlin S y Altschul SF (1993) PNAS 90: 5873-5877. Tal algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul SFet al.,(1990) J Mol Biol 215: 403. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con los parámetros del programa de nucleótidos NBLAST establecidos, p. ej., para puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con los parámetros del programa XBLAS<t>configurados, p. ej., para obtener una puntuación de 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una molécula de proteína descrita en el presente documento. Para obtener alineamientos con espacios con fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como describen Altschul SF etal.,(1997) en Nuc Acids Res 25: 33893402. Alternativamente, se puede utilizar PSI BLAST para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas(Ídem).Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI Blast, se pueden utilizar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (p. ej., de XBLAST y NBLAST) (véase, p. ej., Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) en la web mundial, ncbi.nlm.nih.gov). Otro ejemplo específico, no limitante, de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, 1988, CABIOS 4:11 17. Tal algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), que forma parte del paquete de soporte lógico de alineamiento de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede utilizar una tabla de restos de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar utilizando técnicas similares a las descritas anteriormente, permitiendo o no espacios. Al calcular el porcentaje de identidad, típicamente sólo se cuentan las coincidencias exactas.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, comprenden una VH que tiene al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la VH de SEQ ID NO: 105. Como se divulga, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una VH que tiene al menos 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la VH de SEQ ID NO: 110.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen inmunoespecíficamente a MERTK humana, comprenden una VL que tiene al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la VL de SEQ ID NO: 106. Como se divulga, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una VL que tiene al menos 99% de identidad de secuencia con la VH de SEQ ID NO: 111.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, comprenden: (i) un dominio VH que tiene al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del dominio VH de SEQ ID NO: 105; y (ii) un dominio VL que tiene al menos 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del dominio VL de SEQ ID NO: 106.
Como se divulga, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), pueden comprender (i) un dominio VH que tiene al menos 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con el dominio VH de SEQ ID NO: 110, y (ii) un dominio VL que tiene al menos 99% de identidad de secuencia con el dominio VL de SEQ ID NO: 111.
También se divulgan en el presente documento anticuerpos que se unen al mismo epítopo o a uno solapante de MERTK (p. ej., MERTK humana) como un anticuerpo descrito en el presente documento. Como se emplea en el presente documento, un "epítopo" es un término de la técnica y se refiere a una región localizada de un antígeno a la que se puede unir específicamente un anticuerpo. Un epítopo puede consistir, por ejemplo, en aminoácidos contiguos de un polipéptido (epítopo lineal o contiguo) o un epítopo puede, por ejemplo, proceder de dos o más regiones no contiguas de uno o varios polipéptidos (epítopo conformacional, no lineal, discontinuo o no contiguo). En ciertos ejemplos, el epítopo de un anticuerpo puede determinarse mediante, p. ej., espectroscopia de RMN, estudios de cristalografía por difracción de rayos X, ensayos ELISA, intercambio de hidrógeno/deuterio acoplado con espectrometría de masas (p. ej., espectrometría de masas MALDI), ensayos de exploración de oligopéptidos basados en matrices y/o mapeo de mutagénesis (p. ej., mapeo de mutagénesis dirigida al sitio). Para la cristalografía de rayos X, la cristalización se puede lograr utilizando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica (p. ej., Giegé Ret al.,(1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50 (Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayén NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Los cristales de anticuerpo:antígeno se pueden estudiar utilizando técnicas de difracción de rayos X bien conocidas y pueden refinarse utilizando soporte lógico informático tal como X-PLOR (Yale University, 1992, distribuido por Molecular Simulators, Inc.; véase p. ej. Meth Enzymol (1985) volúmenes 114 y 115, eds Wyckoff HW et al.,; Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2004/0014194) y BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49 (Parte 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P etal.,(2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56 (Pt 10): 1316-1323). Los estudios de mapeo de mutagénesis se pueden realizar utilizando cualquier método conocido por un experto en la técnica. Véanse, p. ej., Champé M et al., (1995) y Cunningham BC & Wells JA (1989) para una descripción de técnicas de mutagénesis, incluidas técnicas de mutagénesis por exploración de alanina. Además, los anticuerpos que reconocen y se unen a los mismos epítopos o epítopos solapantes de MERTK (p. ej., MERTK humana) se pueden identificar utilizando técnicas de rutina tales como un inmunoensayo, por ejemplo, mostrando la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana, es decir, un ensayo de unión competitiva. También se pueden utilizar ensayos de unión competitiva para determinar si dos anticuerpos tienen una especificidad de unión similar para un epítopo. La unión competitiva se puede determinar en un ensayo en el que la inmunoglobulina sometida a prueba inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común, tal como MERTK. Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto (RIA) en fase sólida, inmunoensayo enzimático directo o indirecto en fase sólida (EIA), ensayo de competición tipo sándwich (véase Stahli C etal.,(1983) Methods Enzymol 9: 242-253); EIA de biotinaavidina directo en fase sólida (véase Kirkland TN etal.,(1986) J Immunol 137: 3614-9); ensayo de marcaje directo en fase sólida, ensayo sándwich de marcaje directo en fase sólida (véase Harlow E y Lane D, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA de marcaje directo en fase sólida utilizando la marca I-125 (véase Morel GA etal.,(1988) Mol Immunol 25(1): 7-15); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (Cheung RC etal.,(1990) Virology 176: 546-52); y RIA de marcaje directo (Moldenhauer G etal.,(1990) Scand J Immunol 32: 77-82). Típicamente, tal ensayo implica el uso de antígeno purificado (p. ej., MERTK (p. ej., MERTK humana)) unido a una superficie sólida o células que portan cualquiera de estos, una inmunoglobulina de prueba no marcada y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se puede medir determinando la cantidad de marca unid a la superficie sólida o a las células en presencia de la inmunoglobulina de prueba. Normalmente la inmunoglobulina de prueba está presente en exceso. Por lo general, cuando un anticuerpo competidor está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% o más. Un ensayo de unión competitiva se puede configurar en una gran cantidad de formatos diferentes utilizando antígeno marcado o anticuerpo marcado. En una versión común de este ensayo, el antígeno se inmoviliza sobre una placa de 96 pocillos. A continuación, se mide la capacidad de los anticuerpos no marcados para bloquear la unión de los anticuerpos marcados al antígeno mediante marcas radiactivas o enzimáticas. Para más detalles véanse, por ejemplo, Wagener C etal.,(1983) J Immunol 130: 2308-2315; Wagener C etal.,(1984) J Immunol Methods 68: 269-274; Kuroki M etal.,(1990) Cancer Res 50: 4872-4879; Kuroki M etal.,(1992) Immunol Invest 21: 523-538; Kuroki M etal.,(1992) Hybridoma 11: 391-407 y Antibodies: A Laboratory Manual, editores Harlow E y Lane D más arriba, pág. 386-389.
Como se divulga, se pueden utilizar ensayos de unión competitiva para determinar si un anticuerpo está bloqueado competitivamente, p. ej., de una manera dependiente de la dosis, mediante otro anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo se une esencialmente al mismo epítopo, o epítopos solapantes, como un anticuerpo de referencia, cuando los dos anticuerpos reconocen epítopos idénticos o estéricamente solapantes en ensayos de unión competitiva tales como ensayos ELISA competitivos, que se pueden configurar en varios formatos diferentes, utilizando antígeno marcado o anticuerpo marcado. En un ejemplo particular, se puede probar un anticuerpo en ensayos de unión competitiva con un anticuerpo descrito en el presente documento (p. ej., anticuerpo z10, z11 o z13).
En el presente documento se divulgan anticuerpos que compiten (p. ej., de una manera dependiente de la dosis) por la unión a MERTK (p. ej., MERTK humana) con un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento (p. ej., z10, z11, z13 o xAb) según se determina utilizando ensayos conocidos por un experto en la técnica o descritos en el presente documento (p. ej., ensayos competitivos ELISA o resonancia de plasmón de superficie). También se divulgan en el presente documento anticuerpos que inhiben competitivamente (p. ej., de una manera dependiente de la dosis) que un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento (p. ej., z10, z11, z13 o xAb) se una a MERTK (p. ej., MERTK humana), según se determina utilizando ensayos conocidos por un experto en la técnica o descritos en el presente documento (p. ej., ensayos competitivos ELISA, o matriz de suspensión o resonancia de plasmón de superficie).
En el presente documento se divulga un anticuerpo anti-MERTK que compite con un anticuerpo descrito en el presente documento por la unión a MERTK (p. ej., MERTK humana) en la misma medida que el anticuerpo descrito en el presente documento autocompite por la unión a MERTK (p. ej., MERTK humana). En el presente documento se divulga un primer anticuerpo que compite con un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento para unirse a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde la competición se muestra como una reducción de la unión del primer anticuerpo a M<e>RTK (p. ej., MERTK humana) en más de 80% (p. ej., 85%, 90%, 95% o 98%, o entre 80% y 85%, 80% y 90%, 85% y 90% o 85% y 95%).
En el presente documento se divulga un anticuerpo anti-MERTK que compite (p. ej., de una manera dependiente de la dosis) por la unión específica a MERTK (p. ej., MERTK humana), con un anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, Se Q ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 o SEQ ID NO: 110, y un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 o SEQ ID NO: 111
En un ejemplo específico, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano) o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente al mismo epítopo o a un epítopo solapante de un anticuerpo que comprende un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. En otro ejemplo específico, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento se unen inmunoespecíficamente al mismo epítopo o a un epítopo solapante de un anticuerpo que comprende un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107, y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. En otro ejemplo específico, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento se unen inmunoespecíficamente al mismo epítopo o a un epítopo solapante de un anticuerpo que comprende un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108, y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. En otro ejemplo específico, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento se unen inmunoespecíficamente al mismo epítopo o a un epítopo solapante de un anticuerpo que comprende un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110, y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111. Se pueden utilizar ensayos conocidos por un experto en la técnica o descrito en el presente documento (p. ej., cristalografía de rayos X, ensayos ELISA, etc.) para determinar si dos anticuerpos se unen al mismo epítopo. En ejemplos específicos, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que compiten con un anticuerpo descrito en el presente documento por la unión a MERTK (p. ej., MERTK humana) no son un anticuerpo murino. En ejemplos específicos, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen al mismo epítopo o a un epítopo solapante de un anticuerpo descrito en el presente documento (p. ej., MERTK humana) no son un anticuerpo murino.
La afinidad se puede medir y/o expresar de varias formas conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, la constante de disociación de equilibrio (K<d>), y constante de asociación de equilibrio (K<a>). La K<d>se puede determinar mediante mecanismos conocidos por un experto normal en la técnica, tales como interferometría de biocapa o resonancia de plasmón de superficie.
En ciertos ejemplos, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej. un anticuerpo humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que compiten con un anticuerpo descrito en el presente documento por la unión a MERTK (p. ej., MERTK humana), o un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen al mismo epítopo o a un epítopo solapante de un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento, se unen a MERTK (p. ej. MERTK humana) con una K<d>de aproximadamente 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4,5 nM, 4 nM, 3,5 nM, 3 nM, 2,5 nM, 2 nM, 1,5 nM, 1 nM, 0,75 nM, 0,5 nM, 0,25 nM o 0,1 nM. En algunos ejemplos, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que compiten con un anticuerpo descrito en el presente documento por la unión a MERTK (p. ej., MERTK humana), o un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen al mismo epítopo o a un epítopo solapante de un anticuerpo descrito en el presente documento, se unen a MERTK (p. ej., MERTK humana) con una K<d>de 0,1 nM a 10 nM, 0,5 nM a 10 nM, 1 nM a 10 nM, 2 nM a 10 nM, 2 nM a 5 nM, 4 nM a 10 nM en un ensayo tal como se describe en el presente documento o conocido por un experto en la técnica. En algunos ejemplos, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento que compiten con un anticuerpo descrito en el presente documento por la unión a MERTK (p. ej., MERTK humana), o un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen al mismo epítopo o a un epítopo solapante de un anticuerpo descrito en el presente documento, se unen a MERTK (p. ej., MERTK humana) con una avidez en K<d>de aproximadamente 2 pM a 8 pM utilizando un ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica.
En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo se unen a MERTK humana con una K<d>de aproximadamente 3 nM en un ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo se unen a MERTK humana con una avidez en K<d>de aproximadamente 1 pM a 15 pM en un ensayo descrito en el presente documento o conocido en la técnica. En otra realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo se unen a MERTK humana con una avidez en K<d>de aproximadamente 1,46 nM en un ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica. En otra realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo se unen a MERTK humana con una avidez en K<d>de aproximadamente 5,74 pM en un ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica. En otra realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo se unen a MERTK (p. ej., MERT<k>humana con una avidez en K<d>de aproximadamente 3,68 pM en un ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica. En otra realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo se unen a MERTK humana) con una avidez en K<d>de aproximadamente 2,99 pM en el ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica. Como se emplea en el presente documento, el término "aproximadamente" cuando se utiliza para modificar un valor numérico o rango numérico, indica que las desviaciones de 5% a 10% por encima y de 5% a 10% por debajo del valor o rango permanecen dentro del significado previsto del valor o rango citados.
En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo se unen a MERTK humana con una CE50 de 1 nM a 20 nM según se evalúa mediante un ensayo descrito en el presente documento o conocido en la técnica. En otra realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo se unen a MERTK humana con una CE50 de 1 nM a 10 nM según se evalúa mediante un ensayo descrito en el presente documento o conocido en la técnica. En otra realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo se unen a MERTK humana con una CE50 de aproximadamente 1 nM, aproximadamente 2 nM, aproximadamente 3 nM, aproximadamente 4 NM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 6 nM, aproximadamente 7 nM, aproximadamente 8 nM, aproximadamente 9 nM o aproximadamente 10 nM según se evalúa mediante un ensayo descrito en el presente documento o conocido en la técnica.
En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo es uno de la presente invención proporcionado en la sección 6 más abajo.
5.1.2. Características funcionales
En algunos aspectos, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, disminuyen los niveles de expresión de MERTK humana en células cancerosas (p. ej. células de melanoma SKMEL5) en más de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% u 85% según se evalúa mediante un ensayo conocido por un experto en la técnica o descrito en el presente documento. En algunos aspectos, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, disminuyen los niveles de expresión de MERTK humana en macrófagos M2 humanos en más de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% u 85% según se evalúa mediante un ensayo conocido por un experto en la técnica o descrito en el presente documento. En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo se unen a MERTK humana, pero no a Axl humana, Tyro3 humana o MERTK murina, según se evalúa mediante métodos descritos en el presente documento o conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo se unen a MERTK humana y MERTK de mono cinomolgo.
En algunos aspectos, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, inducen respuestas de secreción de citocinas por macrófagos m 2, monocitos CD14+ o ambos, tal como se expone en la Fig. 10. En ciertos aspectos, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo alteran la expresión de ciertas citocinas (p. ej. el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo aumentan la expresión de ciertas citocinas), tal como se expone en la Fig. 10, por macrófagos M2, monocitos CD14+, o ambos en más de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%., 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% u 85% según se evalúa mediante un ensayo conocido por un experto en la técnica o descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, bloquean (p. ej., parcial o completamente) el nivel de fosforilación de MERTK inducida por Gas-6 en células que expresan MERTK humana, tales como, p. ej., células cancerosas (p. ej., células de melanoma), macrófagos M2 o ambos, en un ensayo conocido por un experto en la técnica. En realizaciones específicas, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, reducen el nivel de fosforilación de MERTK humana inducida por Gas-6 en células que expresan MERTK humana, tales como, p. ej., células cancerosas (p. ej., células de melanoma), macrófagos M2 o ambos, en al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% u 85% en un ensayo conocido por un experto en la técnica.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, inducen la degradación de MERTK humana en células que expresan MERTK humana, tales como, p. ej., células cancerosas (p. ej., células de melanoma), macrófagos M2 o ambos. En realizaciones específicas, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, reducen el nivel de MERTK humana en la superficie de células que expresan MERTK humana, tales como, p. ej., células cancerosas (p. ej., células de melanoma), macrófagos M2 o ambos, en al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% u 85% en un ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, inducen la internalización de MERTK humana en células que expresan MERTK humana, tales como, p. ej., células cancerosas (p. ej., células de melanoma), macrófagos M2 o ambos. En realizaciones específicas, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, aumentan la internalización de MERTK humana por células que expresan MERTK humana, tales como, p. ej., células cancerosas (p. ej., células de melanoma), macrófagos M2 o ambos, en al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% u 85% en un ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, inhiben (p. ej., parcial o completamente) la formación de colonias por células cancerosas (p. ej., células de melanoma) en un ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica. En realizaciones específicas, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, reducen el nivel de formación de colonias por células cancerosas (p. ej., células de melanoma) en al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% u 85% en un ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica. En algunos aspectos, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen inmunoespecíficamente a MERTK humana, reducen la capacidad de formación de colonias de las células cancerosas. (p. ej., células de melanoma SKMEL5) en más de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% u 85% según se evalúa mediante un ensayo conocido por un experto en la técnica o descrito en el presente documento.
En algunos aspectos, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, previenen la fosforilación de AKT inducida por Gas6 en un ensayo descrito en el presente documento o conocido en la técnica. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, compiten con Gas-6 (p. ej., Gas-6 humana) por la unión a MERTK humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo inhiben (p. ej., inhiben completamente o solo inhiben parcialmente) la unión de Gas-6 a MERTK humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que se unen específicamente a MERTK humana, inhiben la unión de Gas-6 (p. ej., Gas-6 humana o de ratón) a MERTK humana en más de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% u 85% según se evalúa mediante un ensayo conocido por un experto en la técnica o descrito en el presente documento. En una realización específica, el ensayo que se utiliza para evaluar la inhibición de la unión de Gas-6 (p. ej., Gas-6 humana) a MERTK humana en presencia de un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, es un ELISA con anticuerpo de captura conocido por un experto en la técnica, tal como se describe en la Publicación Internacional Núm. WO2016/106221 (p. ej., Ejemplo 1 de Publicación Internacional Núm. WO2016/106221).
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, reducen el nivel de fosforilación de AKT inducida por Gas-6 en células cancerosas que expresan MERTK humana (p. ej., células de melanoma) en al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% u 85% en un ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica.
En realizaciones específicas, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que se unen específicamente a MERTK humana, inhiben la angiogénesis dentro de los tumores. En algunas realizaciones, la inhibición de la angiogénesis es de al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% u 85%. En una realización específica, la inhibición de la angiogénesis es de al menos 50%, 55%, 60%, 65% o 70%. La inhibición de la angiogénesis se puede evaluar mediante métodos descritos en el presente documento y/o conocidos por un experto en la técnica. La inhibición puede ser relativa al nivel de la angiogénesis sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (p. ej., un anticuerpo que no se une inmunoespecíficamente a MERTK).
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que se unen específicamente a MERTK humana, inhiben la progresión tumoral. La inhibición de la progresión tumoral es de al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%. o 85%. La progresión tumoral se puede evaluar mediante métodos conocidos por un experto en la técnica. La progresión tumoral puede ser relativa al estado del cáncer sin ningún anticuerpo o con un anticuerpo no relacionado (p. ej., un anticuerpo que no se une específicamente a MERTK humana). En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o una región de unión a antígeno del mismo tiene una, dos, tres o más de las características de un anticuerpo de la presente invención proporcionado en la Sección 6 más abajo.
5.1.3. Anticuerpos biespecíficos
En un aspecto específico, se proporciona en el presente documento un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes, en donde una de las regiones de unión se une específicamente a MERTK humana y la otra región de unión se une a otro antígeno de interés, y en donde la región de unión que se une específicamente a MERTK humana es un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención. En una realización específica, se proporciona en el presente documento un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes, en donde una de las regiones de unión se une específicamente a MERTK humana y la otra región de unión se une a otro antígeno de interés, y en donde la región de unión que se une específicamente a MERTK humana comprende la región de cadena pesada variable de un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes, en donde una de las regiones de unión se une específicamente a MERTK humana y la otra región de unión se une a otro antígeno de interés, y en donde la región de unión que se une específicamente a MERTK humana comprende la secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada variable del anticuerpo z10 expuesta en la Tabla 11. Como se divulga en el presente documento, es un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión diferentes, en donde una de las regiones de unión se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y la otra región de unión se une a otro antígeno de interés, y en donde la región de unión que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) comprende la secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada variable del anticuerpo z11 expuesta en la Tabla 12. En el presente documento se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes, en donde una de las regiones de unión se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y la otra región de unión se une a otro antígeno de interés, y en donde la región de unión que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) comprende la secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada variable del anticuerpo z13 expuesta en la Tabla 13. En el presente documento se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión diferentes, en donde una de las regiones de unión se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y la otra región de unión se une a otro antígeno de interés, y en donde la región de unión que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) comprende una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la Tabla 14.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes, en donde una de las regiones de unión se une específicamente a MERTK humana y la otra región de unión se une a otro antígeno de interés, y en donde la región de unión que se une específicamente a MERTK humana comprende la región de cadena ligera variable de un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes, en donde una de las regiones de unión se une específicamente a MERTK humana y la otra región de unión se une a otro antígeno de interés, y en donde la región de unión que se une específicamente a MERTK humana comprende la secuencia de aminoácidos de la región de cadena ligera variable del anticuerpo z10 expuesta en la Tabla 11. En el presente documento se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes, en donde una de las regiones de unión se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y la otra región de unión se une a otro antígeno de interés, y en donde la región de unión que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) comprende la secuencia de aminoácidos de la región de cadena ligera variable del anticuerpo z11 expuesta en la Tabla 12. En el presente documento se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes, en donde una de las regiones de unión se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y la otra región de unión se une a otro antígeno de interés, y en donde la región de unión que se une específicamente a MERTK (p. ej., humana MERTK) comprende la secuencia de aminoácidos de la región de cadena ligera variable del anticuerpo z13 expuesta en la Tabla 13. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión diferentes, en donde una de las regiones de unión se une específicamente a MERTK humana y la otra región de unión se une a otro antígeno de interés, y en donde la región de unión que se une específicamente a MERTK humana comprende una región de cadena ligera variable, en donde la región de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácidos de la VL expuesta en la Tabla 11.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes, en donde una de las regiones de unión se une específicamente a MERTK humana y la otra región de unión se une a otro antígeno de interés, y en donde la región de unión que se une específicamente a MERTK humana comprende la región de cadena ligera variable y la región de cadena pesada variable de un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes, en donde una de las regiones de unión se une específicamente a MERTK humana y la otra región de unión se une a otro antígeno de interés, y en donde la región de unión que se une específicamente a MERTK humana comprende las secuencias de aminoácidos de la región de cadena ligera variable y de la región de cadena pesada variable del anticuerpo z10 expuestas en la Tabla 11. En el presente documento se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes, en donde una de las regiones de unión se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y la otra región de unión se une a otro antígeno de interés, y en donde la región de unión que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) comprende las secuencias de aminoácidos de la región de cadena ligera variable y de la región de cadena pesada variable del anticuerpo z11 expuestas en la Tabla 12. En el presente documento se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes, en donde una de las regiones de unión se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y la otra región de unión se une a otro antígeno de interés, y en donde la región de unión que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) comprende las secuencias de aminoácidos de la región de cadena ligera variable y de la región de cadena pesada variable del anticuerpo z13 expuestas en la Tabla 13. En el presente documento se divulga un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes., en donde una de las regiones de unión se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y la otra región de unión se une a otro antígeno de interés, y en donde la región de unión que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) comprende una región de cadena ligera variable y una región de cadena pesada variable, en donde la región de cadena pesada variable comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la Tabla 14 y la región de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácidos de VL expuesta en las Tablas 11, 12 o 13.
En ciertas realizaciones, el antígeno de interés al que se une la otra región de unión de un anticuerpo biespecífico es un antígeno presente en una célula inmunitaria. (p. ej., una célula T, una célula NK o una célula dendrítica). En algunas realizaciones, el antígeno de interés al que se une la otra región de unión de un anticuerpo biespecífico es un receptor de punto de control inmunológico (p. ej., PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, Tim3, ICOS, CD40, G<i>TR u OX40). En una realización específica, la otra región de unión de un anticuerpo biespecífico comprende un anticuerpo agonista anti-GITR, un anticuerpo agonista anti-OX40 o un anticuerpo agonista anti-CD40. En realizaciones específicas, la otra región de unión de un anticuerpo biespecífico comprende un anticuerpo bloqueador o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen a PD-1, PD-L1, CTLA-4 o LAG3. En ciertas realizaciones, el antígeno de interés al que se une la otra región de unión de un anticuerpo biespecífico descrito en el presente documento es un receptor de células T. En una realización específica, el antígeno de interés al que se une la otra región de unión de un anticuerpo biespecífico descrito en el presente documento es CD3, PD-L1, Lr P1, LRP8, TGF-p, NKGD2 o TIGIT. En algunas realizaciones, el antígeno de interés es un antígeno asociado a tumores.
En una realización específica, la otra región de unión de un anticuerpo biespecífico es nivolumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En otra realización específica, la otra región de unión de un anticuerpo biespecífico es lambrolizumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En otra realización específica, la otra región de unión de un anticuerpo biespecífico es MEDI-4736 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En otra realización específica, la otra región de unión de un anticuerpo biespecífico descrito en el presente documento es ipilimumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En otra realización específica, la otra región de unión de un anticuerpo biespecífico es MPDL-3280A o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En otra realización específica, la otra región de unión de un anticuerpo biespecífico es pidilizumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En otra realización específica, la otra región de unión de un anticuerpo biespecífico es avelumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En otra realización específica, la otra región de unión de un anticuerpo biespecífico es pembrolizumab o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
5.2. Productos conjugados de anticuerpo-fármaco.
En el presente documento se proporcionan productos conjugados de anticuerpo-fármaco que comprenden: (a) un radical de anticuerpo que es un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, que se unen específicamente a MERTK humana; (b) uno o más radicales de fármaco, siendo cada radical de fármaco un agente citotóxico; y (c) opcionalmente un conector; en donde el agente citotóxico se conjuga directamente con el radical de anticuerpo o se conjuga con el radical de anticuerpo a través del conector. El término "conjugado" como se emplea en esta divulgación significará unido covalentemente, directamente, o a través de una estructura unida covalentemente intermedia. El radical de anticuerpo de un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento puede ser un anticuerpo de la presente invención descrito en la sección 5.1 o la sección 6. Un producto conjugado de anticuerpo-fármaco puede ser un producto conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención descrito en la sección 6.
En ciertas realizaciones, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento tiene una razón molar del radical de anticuerpo con respecto al radical de fármaco que está entre 1:1 y 1:20. En realizaciones específicas, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento tiene una razón molar del radical de anticuerpo con respecto al radical de fármaco que está entre 1:1 y 1:15. En realizaciones específicas, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento tiene una razón molar del radical de anticuerpo con respecto al radical de fármaco que está entre 1:1 y 1:12. En realizaciones específicas, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento tiene una razón molar del radical de anticuerpo con respecto al radical de fármaco que está entre 1:1 y 1:8. En realizaciones preferidas, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento tiene una razón molar del radical de anticuerpo con respecto al radical de fármaco que está entre 1:3 y 1:5. En una realización específica, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento tiene una razón molar del radical de anticuerpo con respecto al radical de fármaco que es de 1:3. En otra realización específica, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento tiene una razón molar del radical de anticuerpo con respecto al radical de fármaco que es de 1:4. En otra realización específica, el producto conjugado de anticuerpofármaco proporcionado en el presente documento tiene una razón molar del radical de anticuerpo con respecto al radical de fármaco que es de 1:5. En otra realización específica, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento tiene una razón molar del radical de anticuerpo con respecto al radical de fármaco que es de 1:9.
El radical de fármaco se conjuga con una o más cadenas del radical de anticuerpo. En algunas realizaciones, el radical de fármaco se conjuga con una cadena del radical de anticuerpo (por ejemplo, cuando el radical de anticuerpo es un scFv, o cuando el radical de anticuerpo es un anticuerpo multicadena, tal como una inmunoglobulina (que es un tetrámero), o fragmento de unión a antígeno del mismo). En otras realizaciones, el radical de fármaco se conjuga con dos o más cadenas del radical de anticuerpo (cuando el radical de anticuerpo es un anticuerpo multicadena, tal como una inmunoglobulina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo). En una realización específica, el radical de fármaco se conjuga con dos cadenas idénticas de una inmunoglobulina, p. ej., las cadenas pesadas o las cadenas ligeras. En otras realizaciones, el radical de fármaco se conjuga con todas las cadenas del radical de anticuerpo (cuando el radical de anticuerpo es un anticuerpo multicadena, tal como una inmunoglobulina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo). En algunas realizaciones, el radical de fármaco se conjuga con el anticuerpo mediante un método descrito en la sección 6.4 más abajo.
En una realización específica, el radical de fármaco se conjuga con uno o más sitios en la región constante de un anticuerpo. En una realización específica, el radical de fármaco se conjuga con uno o más sitios en la región variable de un anticuerpo. En una realización específica, el radical de fármaco se conjuga con uno o más restos de lisina en el anticuerpo. En una realización específica, el radical de fármaco se conjuga con uno o más restos de cisteína en el anticuerpo, p. ej., cuando MMAE o SN-38 es el radical de fármaco. En una realización particular, el radical de fármaco se conjuga con la región Fc de un anticuerpo que es una inmunoglobulina. En realizaciones específicas, el radical de fármaco es un péptido o proteína fusionados al extremo N-terminal o al extremo C-terminal de una o más cadenas del radical de anticuerpo (directamente o a través de un conector que es un péptido o proteína).
Por ejemplo, cuando el radical de anticuerpo es un scFv, el radical de fármaco se puede fusionar en el extremo N- o C-terminal del scFv (directamente o a través de un conector que es un péptido o proteína). En una realización específica, cuando el radical de anticuerpo es un anticuerpo multicadena o un fragmento de unión a antígeno del mismo, el radical de fármaco se puede fusionar a una de las cadenas del radical de anticuerpo (directamente o a través de un conector que es un péptido o proteína). En el caso de un anticuerpo que es una inmunoglobulina, en una realización específica, ambas cadenas pesadas pueden fusionarse con el radical de fármaco (directamente o a través de un conector que es un péptido o proteína), y/o ambas cadenas ligeras pueden fusionarse con el radical de fármaco (directamente o a través de un conector que es un péptido o proteína). En tales realizaciones específicas, se proporcionan en el presente documento vectores (p. ej., vectores de expresión) que comprenden polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión compuesta por el radical de fármaco y el radical de anticuerpo o una cadena del mismo, y el conector (si lo hubiera) entre el radical de fármaco y el radical de anticuerpo, para la expresión recombinante en células anfitrionas, preferiblemente en células de mamífero. T ambién se proporcionan en el presente documento células anfitrionasex-vivoque comprenden tales vectores para expresar recombinantemente la proteína de fusión compuesta por el radical de fármaco y el radical de anticuerpo o una cadena del mismo, y el conector (si lo hubiera) entre el radical de fármaco y el radical de anticuerpo. Las características y métodos para generar tales vectores y células anfitrionas ex-vivo pueden ser los mismos que se describen a continuación para los anticuerpos anti-MERTK. También se proporcionan en el presente documento métodos para producir la proteína de fusión compuesta por el radical de fármaco y el radical de anticuerpo o una cadena del mismo, y el conector (si lo hubiera) entre el radical de fármaco y el radical de anticuerpo, que comprenden cultivar tal célula anfitrionaex-vivoen condiciones tales que el polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión sea expresada por la célula anfitrionaex-vivopara producir la proteína de fusión. Los productos conjugados de anticuerpo-fármaco descritos en el presente documento pueden producirse mediante un método conocido en la técnica o como se describe en la Sección 6 más abajo.
En algunas realizaciones, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco tiene la estructura que se muestra en la Fig. 13A o Fig. 13B, y particularmente en la Fig. 13A. La Fig. 13A muestra la estructura de MMAE conectada a un anticuerpo (Ab) a través del conector mc-vc-PABC. La Fig. 13B muestra la estructura de SN-38 conectada a un anticuerpo (Ab) mediante el conector CL2 o CL2A. Si "AA" en la Fig. 13B es fenilalanina-lisina, la Fig. 13B muestra un anticuerpo conectado a SN-38 a través del conector CL2 (que comprende un sitio escindible por catepsina B). Si "AA" en la Fig. 13B es lisina, la Fig. 13B muestra un anticuerpo conectado a SN-38 mediante el conector CL2A (que no comprende un sitio escindible por catepsina B).
Según la presente invención, la porción de anticuerpo del producto conjugado de anticuerpo-fármaco comprende las regiones variables del anticuerpo z10. En una realización específica, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende un radical de anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO: 105 y la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, en donde el radical de anticuerpo se conjuga con MMAE a través del conector mc-vc-PABC. En otra realización específica, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende un radical de anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO: 105 y la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, en donde el radical de anticuerpo está conjugado con SN-38 a través del conector CL2A.
En una realización alternativa de los productos conjugados de anticuerpo-fármaco descritos a lo largo de esta divulgación, el radical de fármaco no es necesariamente un agente citotóxico. Por ejemplo, el radical de fármaco puede ser cualquier fármaco conocido en la técnica adecuado para su uso, y puede incluir, pero sin limitarse a, los descritos en la sección 5.2.3 más adelante o, p. ej., para fines de diagnóstico o seguimiento de enfermedades, puede ser un agente de generación de imágenes.
En una realización preferida de los productos conjugados de anticuerpo-fármaco de la presente invención, el radical de fármaco se conjuga con el anticuerpo (también denominado en el presente documento "radical de anticuerpo") a través de un conector.
5.2.1. Características funcionales de los productos conjugados de anticuerpo-fármaco
En ciertas realizaciones, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento se une a MERTK humana con una K<d>de aproximadamente 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4,5 nM, 4 nM, 3,5 nM, 3 nM, 2,5 nM, 2 nM, 1,5 nM, 1 nM, 0,75 nM, 0,5 nM, 0,25 nM, 0,17 nM, 0,1 nM, 0,081 nM o 0,021 nM. En algunos aspectos, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento disminuye los niveles de expresión de MERTK humana en células cancerosas (p. ej., células de melanoma SKMEL5) en más de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% u 85% según se evalúa mediante un ensayo conocido por un experto en la técnica o descrito en el presente documento, p. ej., como se describe en la sección 6 más abajo. En realizaciones específicas, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento se une a MERTK humana pero no a Axl humana, Tyro3 humana o MERTK murina según se evalúa mediante los métodos descritos en el presente documento o conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende un radical de anticuerpo en donde el producto conjugado de anticuerpo-fármaco se une a MERTK con mayor afinidad que el radical de anticuerpo no conjugado.
En ciertas realizaciones, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento provoca la muerte celular de células que expresan MERTK humana (p. ej., Macrófagos M2, células cancerosas o ambos)in vitro.En algunas realizaciones específicas, al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, u 85% de las células que expresan MERTK cultivadas durante un período de tiempo en presencia de un producto conjugado de anticuerpo-fármaco descrito en el presente documento están muertas al final del período de tiempo, según se evalúa mediante métodos conocidos por un experto en la técnica. para medir la muerte celular invitro.En otras realizaciones específicas, el porcentaje de células que expresan MERTK (p. ej., macrófagos M2, células cancerosas o ambos) que sufre muerte celular es al menos 50%, 100%, 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces o 1000 veces mayor cuando se cultivan durante un período de tiempo en presencia de un producto conjugado de anticuerpo-fármaco, en comparación con cuando se cultivan sin el producto conjugado de anticuerpo-fármaco (p. ej., cultivados sin ningún producto conjugado de anticuerpo-fármaco o cultivados con un producto conjugado de anticuerpo-fármaco que comprenda un anticuerpo no relacionado (p. ej., un anticuerpo que no se una inmunoespecíficamente a MERTK (p. ej., MERTK humana)) o cultivados con un anticuerpo anti-MERTK no conjugado o un fragmento de unión a antígeno anti-MERTK no conjugado descritos en el presente documento). El período de tiempo puede ser, por ejemplo, aproximadamente 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o una semana.
En algunas realizaciones, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento no afecta a la viabilidad de los macrófagos que expresan MERTK según se evalúa mediante métodos conocidos por un experto en la técnica para medir la muerte celularin vitroo un método descrito en el presente documento, p. ej., en la sección 6 más abajo. En algunas realizaciones, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento no afecta a la viabilidad de los macrófagos M1 según se evalúa mediante métodos conocidos por un experto en la técnica para medir la muerte celularin vitroo un método descrito en el presente documento, p. ej., en la sección 6 más abajo. En algunas realizaciones, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento no afecta a la viabilidad de los macrófagos M2 según se evalúa mediante métodos conocidos por un experto en la técnica para medir la muerte celularin vitroo un método descrito en el presente documento, p. ej., en la sección 6 más abajo.
En ciertas realizaciones, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento induce la degradación de MERTK en células que expresan MERTK, tales como, p. ej., células cancerosas (p. ej., células de melanoma). En realizaciones específicas, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento reduce el nivel de MERTK humana en la superficie de células que expresan MERTK humana, tales como, p. ej., células cancerosas (p. ej., células de melanoma) en al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% u 85% en un ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento induce una mayor degradación de MERTK en células que expresan MERTK que el radical de anticuerpo no conjugado, como se evalúa en un ensayo descrito en el presente documento o conocido en la técnica.
En ciertas realizaciones, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento induce la internalización de MERTK en células que expresan MERTK, tales como, p. ej., células cancerosas (p. ej., células de melanoma). En realizaciones específicas, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento aumenta la internalización de MERTK humana por células que expresan MERTK humana, tales como, p. ej., células cancerosas (p. ej., células de melanoma), en al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% u 85% en un ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende un radical de anticuerpo y el anticuerpo-fármaco induce una mayor internalización de las células que expresan MERTK que el radical de anticuerpo no conjugado según se evalúa mediante un ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica.
En ciertas realizaciones, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento inhibe la progresión tumoral. La inhibición de la progresión tumoral es de al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% u 85%. La progresión tumoral se puede evaluar mediante métodos conocidos por un experto en la técnica. La progresión tumoral puede ser relativa al estado del cáncer sin tratamiento con ningún anticuerpo, tratado con un anticuerpo no relacionado (p. ej., un anticuerpo que no se una específicamente a MERTK humana), tratado con SN-38, tratado con MMAE, tratado con el radical de anticuerpo no conjugado del producto conjugado de anticuerpo-fármaco. En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o una región de unión a antígeno del mismo tienen una, dos, tres o más de las características de un anticuerpo descrito en la Sección 6 más abajo.
En realizaciones específicas, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco descrito en el presente documento inhibe la angiogénesis dentro de los tumores. En algunas realizaciones, la inhibición de la angiogénesis es de al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% u 85%. En una realización específica, la inhibición de la angiogénesis es de al menos 50%, 55%, 60%, 65% o 70%. La inhibición de la angiogénesis se puede evaluar mediante métodos descritos en el presente documento y/o conocidos por un experto en la técnica. La inhibición puede ser relativa al nivel de angiogénesis sin el producto conjugado de anticuerpo-fármaco (p. ej., cultivado sin ningún producto conjugado de anticuerpo-fármaco o cultivado con un producto conjugado de anticuerpo-fármaco que comprenda un anticuerpo no relacionado (p. ej., un anticuerpo que no se una específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana)) o cultivado con un anticuerpo anti-MERTK no conjugado o un fragmento de unión a antígeno anti-MERTK no conjugado descritos en el presente documento).
En ciertas realizaciones, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco inhibe la progresión tumoral (p. ej., tumor de cáncer de mama humano). La inhibición de la progresión tumoral es de al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% u 85%. La progresión tumoral se puede evaluar mediante métodos conocidos por un experto en la técnica. La progresión tumoral puede ser relativa al estado del cáncer sin el producto conjugado de anticuerpo-fármaco (p. ej., cultivado sin ningún producto conjugado de anticuerpo-fármaco o cultivado con un producto conjugado de anticuerpo-fármaco que comprenda un anticuerpo no relacionado (p. ej., un anticuerpo que no se una específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana)) o cultivado con un anticuerpo anti-MERTK no conjugado o un fragmento de unión a antígeno anti-MERTK no conjugado descritos en el presente documento). En una realización específica, el ensayo que se utiliza para evaluar la progresión tumoral es un modelo de trasplante de tumor murino.
5.2.2. El radical de anticuerpo
Un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende cualquier anticuerpo anti-MERTK proporcionado en el presente documento. Véase, p. ej., la Sección 5.1.1 para ejemplos de radicales de anticuerpos de la presente invención de los productos conjugados de anticuerpo-fármaco proporcionados en el presente documento. En una realización específica, el radical de anticuerpo es una inmunoglobulina, p. ej., una inmunoglobulina que comprende un dominio constante humano o una inmunoglobulina humanizada. En otra realización específica, el radical de anticuerpo es un scFv, que comprende, p. ej., los dominios VH y VL de un anticuerpo proporcionado en el presente documento en la Sección 5.1.1
En algunas realizaciones, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende un radical de fármaco conjugado opcionalmente a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una VH como se reivindica. En algunas realizaciones, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende un radical de fármaco conjugado opcionalmente a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una VL como se reivindica. En algunas realizaciones, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende un radical de fármaco conjugado opcionalmente a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una VH y una VL de un anticuerpo como se reivindica.
En algunas realizaciones, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende un radical de fármaco conjugado opcionalmente a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105. En algunas realizaciones, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende un radical de fármaco conjugado opcionalmente a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. En algunas realizaciones, el producto conjugado de anticuerpofármaco proporcionado en el presente documento comprende un radical de fármaco conjugado opcionalmente a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende (i) una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y (ii) una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106.
En algunas realizaciones, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende MMAE conjugada a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una VH, en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105. En algunas realizaciones, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende MMAE conjugada a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una VL, en donde la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. En algunas realizaciones, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende SN-38 conjugada a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una VH, en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105. En algunas realizaciones, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende SN-38 conjugada a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una VL, en donde la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106.
En una realización específica, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende MMAE conjugada a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una VH y una VL, en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, y la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. En otra realización específica, un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende SN-38 conjugada a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una VH y una VL, en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, y la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106.
Como se divulga, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco puede comprender un radical de fármaco conjugado a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una cadena pesada divulgada en el presente documento, p. ej., una cadena pesada descrita en la Sección 5.1.1. Como se divulga, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco puede comprender MMAE conjugada a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una cadena pesada divulgada en el presente documento, p. ej., una cadena pesada descrita en la Sección 5.1.1. Como se divulga, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende SN-38 conjugada a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una cadena pesada divulgada en el presente documento, p. ej., una cadena pesada descrita en la Sección 5.1.1. Como se divulga, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco puede comprender un radical de fármaco conjugado a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una cadena ligera divulgada en el presente documento, p. ej., una cadena ligera descrita en la Sección 5.1.1. Como se divulga, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco puede comprender MMAE conjugada a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una cadena ligera divulgada en el presente documento, p. ej., una cadena ligera descrita en la Sección 5.1.1. Como se divulga, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco puede comprender SN-38 conjugada a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una cadena ligera divulgada en el presente documento, p. ej., una cadena ligera descrita en la Sección 5.1.1. Como se divulga, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco puede comprender un radical de fármaco conjugado a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende (i) una cadena pesada divulgada en el presente documento y (ii) una cadena ligera divulgada en el presente documento, p. ej., una cadena pesada y una cadena ligera descritas en la Sección 5.1.1. Como se divulga, el producto conjugado de anticuerpofármaco puede comprender MMAE conjugada a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende (i) una cadena pesada divulgada en el presente documento y (ii) una cadena ligera divulgada en el presente documento, p. ej., una cadena pesada y una cadena ligera descritas en la Sección 5.1.1. Como se divulga, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco puede comprender SN-38 conjugada a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende (i) una cadena pesada divulgada en el presente documento y (ii) una cadena ligera divulgada en el presente documento, p. ej., una cadena pesada y una cadena ligera descritas en la Sección 5.1.1.
En algunas realizaciones, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende un radical de fármaco conjugado a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112. En algunas realizaciones específicas, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende un radical de fármaco conjugado a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112. En algunas realizaciones específicas, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende SN-38 conjugada a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112. En algunas realizaciones, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende un radical de fármaco conjugado a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende una cadena ligera que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 113. En algunas realizaciones específicas, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende MMA<e>conjugada a través de un conector con una cadena ligera que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 113. En algunas realizaciones específicas, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende SN-38 conjugada a través de un conector a una cadena ligera que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 113. En algunas realizaciones, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende un radical de fármaco conjugado a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende (i) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112 y (ii) una cadena ligera que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 113. En una realización específica, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende MMAE conjugada a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende (i) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112 y (ii) una cadena ligera que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 113. En otra realización específica, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionado en el presente documento comprende SN-38 conjugada a través de un conector con un radical de anticuerpo que comprende (i) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112 y (ii) una cadena ligera que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 113.
5.2.3. El radical de fármaco y el conector
El agente citotóxico utilizado en los productos conjugados de anticuerpo-fármaco también suele denominarse carga útil o cabeza activa. La mayoría de los agentes citotóxicos utilizados en los productos conjugados de anticuerpofármaco se dirigen al ADN o a los microtúbulos y tienen una alta potencia de citotoxicidad (con un rango de CI<50>de aproximadamente 10-10-10-12 M) (véase Beck aet al.,(2017) Nat Rev Drug Discov 16: 315-337). Sin embargo, también se pueden utilizar agentes citotóxicos que no son tan potentes. El agente citotóxico puede ser una molécula pequeña, un nucleótido, un péptido o una proteína que no es un anticuerpo. En una realización específica, el agente citotóxico es una molécula pequeña. En otra realización específica, el agente citotóxico es una proteína que no es un anticuerpo. Los agentes citotóxicos ilustrativos no limitantes que se pueden utilizar en los productos conjugados de anticuerpofármaco según la invención son descritos por Beck A etal.,(2017) en Nat Rev Drug Discov 16: 315-337; Peters C y Brown S, (2015) Biosci Rep 35: art:e00225; McCombs JR y Owen S<c>(2015) The AAPS Journal 17: 339-351; Jackson DY (2016) Org Process Res Dev 20: 852-866; y Olivier KJ y Hurvitz sA ed., (2016) Antibody-Drug Conjugates: Fundamentals, Drug Development, and Clinical, Wiley.
En ciertas realizaciones, el agente citotóxico es uno de los agentes enumerados en la Tabla 30 o 31. En realizaciones específicas, el agente citotóxico utilizado en el producto conjugado de anticuerpo-fármaco es una auristatina (tal como monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F (MmAF), Aur0101, PF06380101, Auristatina W o auristatina F) o sus derivados, un maitansinoide (tal como DM1 o DM4), una pirrolobenzodiazepina (PBD) (tal como SGD1882 o SG3199), una indolinobenzodiazepina (tal como DGN462 o DGN549), una caliqueamicina (ozogamicina) (tal como CM1), un análogo de camptotecina (tal como SN-38, DX-8951f o derivado de DX-8951f), una duocarmicina (tal como seco-duocarmicina-hidroxi-benzamido-azaindol (seco-DUBA), agente alquilante de unión al surco menor (MGBA) o MED-2460), un inhibidor de tubulina (tal como criptoficina), una tubulisina o un análogo de tubulisina (tal como AZ13599185), amberstatina269, doxorrubicina, un antibiótico (tal como rifalogue), una antraciclina (tal como PNU-159682), un inhibidor de microtúbulos (tal como rizoxina), una espliceostatina o una thailanstatina. En una realización específica, el agente citotóxico utilizado en el producto conjugado de anticuerpo-fármaco es MMAE o MMAF. En una realización específica, el agente citotóxico utilizado en el producto conjugado de anticuerpo-fármaco es MMAE (véase, p. ej., la Figura 13A). En otra realización específica, el agente citotóxico utilizado en el producto conjugado de anticuerpo-fármaco es DM1 o DM4. En otra realización específica, el agente citotóxico utilizado en el producto conjugado de anticuerpo-fármaco es SN-38. En otra realización específica, el agente citotóxico utilizado en el producto conjugado de anticuerpo-fármaco es SN-38 como se muestra en la Fig. 13B.
Tabla 30: Ejemplos de Radicales de Fármaco
6-tioguanina decitabina (SuperGen)
Citarabina clofarabina (Bioenvision)
2-fluorodeso irofulven (MGI Pharma) Metotrexato DMDC (Hoffmann-La Roche) tomudex etinilcitidina (Taiho) Fludarabina Gemcitabina
Raltitrexed Capecitabina
Inhibidores de topoisomera Amsacrina mesilato de exatecán (Daiichi) Epirrubicina quinamed (ChemGenex) Etopósido gimatecán (Sigma-Tau) teniposido o diflomotecán (Beaufour-Ipsen) 7-etil-10-hid TAS-103 (Taiho)
dexrazoxan elsamitrucina (Spectrum) pixantrona ( J-107088 (Merck & Co) análogo de rebecamicina (Exelixis) BNP-1350 (BioNumerik)
BBR-3576 ( CKD-602 (Chong Kun Dang) rubitecán (S KW-2170 (Kyowa Hakko) irinotecán (C hidroxicamptotecina (SN-38) Topotecán
Antibióticos antitumorales Valrubicina Azonafida
Terarrubicin Antrapirazol
Idarrubicina Oxantrazol
Rubidazona Losoxantrona
Plicamicina MEN-10755 (Menarini) Porfiromicina GPX-100 (Gem Pharmaceuticals)
mitoxantrona Epirrubicina
Amonafida Mitoxantrona
Doxorrubicina
Agentes antimitóticos Colchicina E7010 (Abbott)
Vinblastina PG-TXL (Cell Theraperutics) Vindesina IDN 5109 (Bayer)
dolastatina 1 A 105972 (Abbott)
rizoxina (Fuji A 204197 (Abbott)
Mivobulina (Warner-Lambert) LU 223651 (BASF) cemadotina (BASF) D 24851 (ASTAMedica)
RPR 109881A (Ave ER-86526 (Eisai)
TXD 258 (Aventis) combretastatina A4 (BMS) epotilona B (Novarti isohomohalicondrina-B (PharmaMar) T 900607 (Tularik) ZD 6126 (AstraZeneca)
T 138067 (Tularik) AZ 10992 (Asahi)
criptoficina 52 (Eli Li IDN-5109 (Indena)
vinflunina (Fabre) AVLB (Prescient Neuropharma)
auristatina PE (Hormona Teikoku) azaepotilona B (BMS)
BMS 24755 BNP-7787 (BioNumerik)
BMS 18447 Profármaco CA-4 (OXiGENE) BMS 18879 dolastatina-10 (NIH)
taxoprexina CA-4 (OXiGENE)
SB 408075 Docetaxel
Vinorelbina Vincristina
Tricostatina Paclitaxel
Inhibidores de aromata aminogluteti YM-511 (Yamanouchi)
atamestano Formestano
Letrozol Exemestano
Anastrazol
Inhibidores de timidilat pemetrexed nolatrexed (Eximias)
ZD-9331 (B CoFactor™ (BioKeys) Antagonistas de ADN trabectedina edotreotida (Novartis)
glufosfamida (Baxter Internacional) mafosfamida (Baxter Internacional) albúmina 32P (Soluciones apaziquona (Spectrum Pharmaceuticals) Isotópicas)
timectacina (NewBiotic O6 bencilguanina (Paligent) Inhibidores de farnesiltransferasa arglabina (NuOncology tipifarnib (Johnson & Johnson)
lonafarnib (Schering-Pl alcohol perilílico (DOR BioPharma) BAY-43-9006 (Bayer)
Inhibidores de bombas CBT-1 (CBA Pharma) T rihidrocloruro de zosuquidar (Eli Lilly) tariquidar (Xenova) dicitrato de biricodar (Vertex)
MS-209 (Schering AG)
Inhibidores de histona tacedinalina (Pfizer) butirato de pivaloiloximetilo (Titan) acetiltransferasa
SAHA (Aton Pharma) depsipéptido (Fujisawa)
MS-275 (Schering AG)
Inhibidores de Metalopr Neovastato (Aeterna Laboratories) CMT-3 (CollaGenex)
marimastat (British Bi BMS-275291 (Celltech) Inhibidores de ribonucle maltolato de galio (Tit tezacitabina (Aventis)
reductasa
triapina (Vion) didox (Moleculas for Health) Agonistas/antagonistas de TNF alfa virulizina (Lorus Ther revimid (Celgene)
CDC-394 (Celgene) YM-598 (Yamanouchi) Antagonista del receptor de atrasentano (Abbott) alitretinoína (Ligand)
endotelina A
ZD-4054 (AstraZenec ISF-154 (Tragen)
Agonistas del receptor de ácido fenretinida (Johnson p-aletina (Dove Tail)
retinoico
LGD-1550 (Ligand) Terapia de LLC (Vasogen) Inmunomoduladores Interferón MAGE-A3 (GSK)
IRX-2 (Inmuno-Rx) CM-10 (cCam Biotherapeutics)
PEP-005 (Peplin Biotech) AMP-224 (GSK)
Tabla 31: Ejemplos adicionales de radicales de fármacos.
Como se emplea en el presente documento, el término "molécula pequeña" se refiere a un compuesto orgánico o inorgánico (que puede ser, por ejemplo, un compuesto heteroorgánico u organometálico) que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 10.000 gramos por mol. En realizaciones específicas, la molécula pequeña tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 5000 gramos por mol, o menos de aproximadamente 2000 gramos por mol, o menos de aproximadamente 1000 gramos por mol, o menos de aproximadamente 500 gramos por mol, o menos de aproximadamente 100 gramos por mol.
En algunas realizaciones, el agente citotóxico se conjuga directamente con el radical de anticuerpo. En otras realizaciones, el agente citotóxico se conjuga con el radical de anticuerpo a través de un conector. Los conectores apropiados que se van a utilizar según la invención son preferiblemente estables en el torrente sanguíneo para limitar la toxicidad inespecífica y lábiles en el sitio del cáncer para permitir la liberación del agente citotóxico (véase Peters C y Brown S, (2015) Biosci Rep 35: art:e00225). Los conectores ilustrativos no limitantes que se pueden utilizar según la invención son descritos por Beck Aet al.,(2017) Nat Rev Drug Discov 16: 315-337; Peters C y Brown S, (2015) Biosci Rep 35: art:e00225; McCombs JR y Owen SC (2015) The AAPS Journal 17: 339-351; Jackson DY (2016) Org Process Res Dev 20: 852-866; y Olivier KJ y Hurvitz Sa ed., (2016) Antibody-Drug Conjugates: Fundamentals, Drug Development, and Clinical, Wiley. En algunas realizaciones, el conector es un conector escindible, por ejemplo, que tiene un motivo sensible a una proteasa lisosomal (por ejemplo, catepsina B), un motivo sensible a un pH ácido (por ejemplo, hidrazona), o un motivo que contiene un puente disulfuro que puede ser reducido por el glutatión. En otras realizaciones, el conector es un conector no escindible. A modo de ejemplo, pero sin limitación, el conector puede ser una molécula pequeña, un nucleótido, un péptido o una proteína que no es un anticuerpo. En una realización específica, el conector es una molécula pequeña. En una realización específica, el conector utilizado en el producto conjugado de anticuerpo-fármaco es catepsina B, hidrazona, succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), ácido maleimidocaproico (mc), valina-citrulina (vc), 4-(2-piridilditio)-2-sulfobutanoato de N-hidroxisuccinimidilo (sulfo-SPDB), 4-(2-pirididitio)butanoato de N-hidroxisuccinimidilo (SPDB), 4-(2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP), valina-alanina (va), polietilenglicol 8-valina-citrulina (PEG8-va), mbvc, CL2A, conector escindible basado en vc o conector de polímero flexímero. En una realización específica, un conector seleccionado para su uso en un producto conjugado de fármaco-anticuerpo no interfiere en la unión del radical de anticuerpo a su antígeno, al agente citotóxico o a ambos. En realizaciones específicas, un conector seleccionado para su uso en un producto conjugado de anticuerpo-fármaco es maleimidocaproil-valina-citrulina-paminobenciloxicarbonilo (mc-vc-PABC). En otras realizaciones específicas, un conector seleccionado para su uso en un producto conjugado de anticuerpo-fármaco es CL2. En otras realizaciones específicas, un conector seleccionado para su uso en un producto conjugado de anticuerpo-fármaco es CL2A. En algunas realizaciones específicas, un conector seleccionado para su uso en un producto conjugado de anticuerpo-fármaco es el conector que se muestra en la Fig. 13A. En otras realizaciones específicas, un conector seleccionado para su uso en un producto conjugado de anticuerpo-fármaco descrito en el presente documento es el conector que se muestra en la Fig. 13B donde AA es lisina. En otras realizaciones específicas, un conector seleccionado para su uso en un producto conjugado de anticuerpo-fármaco es el conector que se muestra en la Fig. 13B donde AA es fenilalanina-lisina. En una realización específica, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un conector y el conector es maleimidocaproilvalina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonilo (también conocido como "mc-vc-PABC") (para la estructura de mc-vc-PABC; véase la Figura 13A). En otra realización específica, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un conector y el conector es CL2 (para la estructura de CL2, véase la Figura 13B y Cardilloet al.2011, Clin Cancer Res; 17(10); 3157-69). En otra realización específica, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco comprende el conector y el conector es CL2A (para la estructura de CL2A, véanse la Figura 13B y Goldberg et al. 2018, Oncotarget; 9(48); 28989-29006, y Cardillo et al. 2011, Clin Cancer Res; 17(10); 3157-69).
En algunas realizaciones, un conector seleccionado para su uso en un producto conjugado de anticuerpo-fármaco comprende uno o más sitios de escisión. En realizaciones específicas, un conector seleccionado para su uso en un producto conjugado de anticuerpo-fármaco contiene un sitio de proteasa catepsina B. En otras realizaciones específicas, un conector seleccionado para su uso en un producto conjugado de anticuerpo-fármaco descrito en el presente documento contiene un sitio de proteasa catepsina B y un sitio de escisión dependiente del pH.
Los pares de radicales de conector-fármaco ilustrativos no limitantes que se pueden utilizar en los productos conjugados de anticuerpo-fármaco descritos en el presente documento son descritos por Beck A etal.,(2017) Nat Rev Drug Discov 16: 315-337; Peters C y Brown S, (2015) Biosci Rep 35: art:e00225; McCombs JR y Owen SC (2015) The AAPS Journal 17: 339-351; Jackson DY (2016) Org Process Res Dev 20: 852-866; y Olivier KJ y Hurvitz SA ed, (2016) Antibody-Drug Conjugates: Fundamentals, Drug Development, and Clinical, Wiley. En realizaciones específicas, el par conector-radical de fármaco en el producto conjugado de anticuerpo-fármaco es vc-MMAE, mc-MMAF, SMCC-DM1, sulfo-SPDB-DM4, SPDB-DM4, SPP-DM1, va-SGD1882, polietilenglicol 8 (PEG8)-va-SG3199, sulfo-SPDB-DGN462, hidrazona-CM1, vc-seco-DUBA, mb-vc-MGBA, CL2A-SN-38, conector peptídico con derivado DX-8951, hidrazonadoxorrubicina, conector escindible basado en vc con Aur0101, vc-PF06380101, conector de polímero flexímero con auristatina F, conector escindible-inhibidor de tubulina o vc-rifalogue. En realizaciones específicas, el par conectorradical de fármaco en el producto conjugado de anticuerpo-fármaco es mc-vc-PABC-MMAE (como se muestra en la Fig. 13A). En otras realizaciones específicas, el par conector-radical de fármaco en el producto conjugado de anticuerpo-fármaco es CL2-SN-38 (como se muestra en la Fig. 13B donde AA es fenilalanina-lisina). En otras realizaciones específicas, el par conector-radical de fármaco en el producto conjugado de anticuerpo-fármaco es CL2A-SN-38 (como se muestra en la Fig. 13B donde AA es lisina).
En una realización específica, el radical de fármaco de un producto conjugado de anticuerpo-fármaco no interfiere en la unión del radical de anticuerpo a MERTK humana.
5.3. Producción de anticuerpos
5.3.1. Producción y escrutinio de anticuerpos.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan métodos para producir anticuerpos anti-MERTK o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención, que se unen específicamente a MERTK humana.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente documento se pueden producir mediante cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante técnicas de expresión recombinantes. Los métodos descritos en el presente documento emplean, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales en biología molecular, microbiología, análisis genético, ADN recombinante, química orgánica, bioquímica, PCR, síntesis y modificación de oligonucleótidos, hibridación de ácidos nucleicos y campos relacionados dentro del conocimiento práctico de la técnica. Estas técnicas se describen, por ejemplo, en las referencias citadas en el presente documento y se explican completamente en la bibliografía. Veánse, p. ej., Maniatis T etal.,(1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J etal.,(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J etal.,(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York.; Ausubel FM etal.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 y actualizaciones anuales); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 y actualizaciones anuales) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Appro,<i>R<l>Press; Birren B etal.,(eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
En una realización específica, un anticuerpo es un anticuerpo (p. ej., anticuerpo recombinante) preparado, expresado, creado o aislado por cualquier medio que implique creación, p. ej., vía síntesis, ingeniería genética de secuencias de ADN. En ciertas realizaciones, tal anticuerpo comprende secuencias que están codificadas por secuencias de ADN que no existen naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal del anticuerpo de un animal o mamífero (p. ej., humano)in vivo.En una realización específica, un anticuerpo descrito en el presente documento se elabora mediante un método que comprende utilizar MERTK humana (SEQ ID NO: 131 o su dominio extracelular (SEQ ID NO: 132) como inmunógeno.
En un cierto aspecto, se proporciona en el presente documento un método para producir un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, que se unen específicamente a MERTK humana, que comprende cultivar una célula o célula anfitriona descritas en el presente documento. En un cierto aspecto, se proporciona en el presente documento un método para preparar un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, que se unen específicamente a MERTK humana que comprende expresar (p. ej., expresar recombinantemente) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo utilizando una célula o célula anfitriona descritas en el presente documento (p. ej., una célula o una célula anfitriona que comprenden polinucleótidos que codifican un anticuerpo descrito en el presente documento). En una realización particular, la célula es una célula aislada. En una realización particular, los polinucleótidos exógenos se han introducido en la célula. En una realización particular, el método comprende adicionalmente la etapa de purificar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo obtenidos de la célula o célula anfitriona.
Los métodos para producir anticuerpos policlonales se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, el Capítulo 11 en: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5a ed., Ausubel FMet al.,eds., John Wiley and Sons, Nueva York).
El término "anticuerpo monoclonal" como se emplea en el presente documento no se limita a anticuerpos producidos mediante tecnología de hibridoma. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando una amplia variedad de mecanismos conocidos en la técnica, incluido el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes y de presentación en fagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos monoclonales de forma recombinante a partir de células anfitrionas que expresan exógenamente un anticuerpo descrito en el presente documento o un fragmento del mismo, por ejemplo, una cadena ligera y/o una cadena pesada de tal anticuerpo. Los métodos para la preparación de líneas celulares clonales y de anticuerpos monoclonales expresados por las mismas son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, el Capítulo 11 en Short Protocols in Molecular Biology, (2002)<5>a edición, Ausubel FM etal.,más arriba). Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos monoclonales utilizando mecanismos de hibridoma que incluyen aquellos conocidos en la técnica e ilustrados, por ejemplo, por Harlow E y Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling GJ etal.,en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563681 (Elsevier, N.Y., 1981); y Kohler G y Milstein C (1975) Nature 256: 495. Los métodos para producir y escrutar anticuerpos específicos utilizando tecnología de hibridoma son rutinarios y bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, se pueden inmunizar ratones (u otros animales, tales como ratas, monos, burros, cerdos, ovejas, hámsteres o perros) con un antígeno (p. ej., humano) y una vez que se detecta una respuesta inmunitaria, p. ej., se detectan anticuerpos específicos para el antígeno en el suero del ratón, se recoge el bazo del ratón y se aíslan los esplenocitos. A continuación, los esplenocitos se fusionan mediante técnicas bien conocidas con cualquier célula de mieloma adecuada, por ejemplo, células de la línea celular SP2/0 disponible en la American Type Culture Collection (ATCC®) (Manassas, VA), para formar hibridomas. Los hibridomas se seleccionan y clonan mediante dilución limitante.
Las células de hibridoma así preparadas se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas. Se analiza el medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra MERT<k>(p. ej., MERTK humana). Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse, desarrollarse y separarse del medio de cultivo mediante métodos convencionales. Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, más arriba). La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, inmunoprecipitación o mediante un ensayo de uniónin vitro,tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
En realizaciones específicas, los anticuerpos monoclonales son producidos por una sola célula (p. ej., hibridoma o célula anfitriona que produce un anticuerpo recombinante), en donde el anticuerpo se une inmunoespecíficamente a MERTK humana según se determina, p. ej., mediante ELISA u otro ensayo de unión a antígeno o de unión competitiva conocido en la técnica o como se describe en la Sección 6 del presente documento. En ciertas realizaciones, un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monovalente o multivalente (p. ej., anticuerpo bivalente). En realizaciones particulares, un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoespecífico o multiespecífico (p. ej., anticuerpo biespecífico).
Se pueden generar fragmentos de anticuerpo que reconocen MERTK (p. ej., MERTK humana) mediante cualquier mecanismo conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden producir fragmentos Fab y F(ab')<2>descritos en el presente documento mediante escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')<2>). Un fragmento Fab corresponde a uno de los dos brazos idénticos de una molécula de anticuerpo y contiene la cadena ligera completa emparejada con los dominios VH y CH1 de la cadena pesada. Un fragmento F(ab')<2>contiene los dos brazos de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo conectados por enlaces disulfuro en la región bisagra.
Adicionalmente, también se pueden generar un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento utilizando diversos métodos de presentación en fagos conocidos en la técnica. En los métodos de presentación en fagos, los dominios de anticuerpos funcionales se presentan sobre la superficie de partículas de fagos que portan las secuencias de polinucleótidos que los codifican. En particular, las secuencias de ADN que codifican los dominios VH y VL se amplifican a partir de bibliotecas de ADNc de animales (p. ej., bibliotecas de ADNc humano o murino de tejidos afectados). El ADN que codifica los dominios VH y VL se recombina junto con un conector scFv mediante PCR y se clona en un vector fagémido. El vector se somete a electroporación en células deE. coliy laE. colise infecta con un fago auxiliar. Los fagos utilizados en estos métodos son típicamente fagos filamentosos que incluyen fd y M13, y los dominios VH y VL generalmente se fusionan de manera recombinante con el gen III o el gen VIII del fago. El fago que expresa un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno particular puede seleccionarse o identificarse con antígeno, p. ej., utilizando antígeno marcado o antígeno unido o capturado en una superficie o cuenta sólida. Los ejemplos de métodos de presentación en fagos que se pueden utilizar para producir los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen los divulgados por Brinkman Uet al.,(1995) J Immunol Methods 182: 41-50; Ames RS etal,(1995) J Immunol Methods 184: 177-186; Kettleborough CA etal.,(1994) Eur J Immunol 24: 952-958; Persic L etal.,(1997) Gene 187: 9-18; Burton DR y Barbas CF (1994) Advan Immunol 57: 191 280; Solicitud PCT Núm. PCT/GB91/001134; Publicaciones internacionales Núm. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401, y WO 97/13844; y Patentes de Estados Unidos Núm. 5.698.426, 5.223.409, 5.403.484, 5.580.717, 5.427.908, 5.750.753, 5.821.047, 5.571.698, 5.427.908, 5.516.637, 5.780.225, 5.658.727, 5.733.743 y 5.969.108.
Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección de fagos, las regiones codificantes de anticuerpos del fago pueden aislarse y utilizarse para generar anticuerpos completos, incluidos anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresarse en cualquier anfitrión deseado, incluidas células de mamíferos, células de insectos, células vegetales, levaduras y bacterias, p. ej., como se describe abajo. Los mecanismos para producir de forma recombinante fragmentos de anticuerpos tal como fragmentos Fab, Fab' y F(ab')<2>también se pueden emplear utilizando métodos conocidos en la técnica, tales como los divulgados en la Publicación PCT Núm. WO 92/22324; Mullinax RL etal.,(1992) BioTechniques 12(6): 864-9; Sawai Het al.,(1995) Am J Reprod Immunol 34: 26-34; y Better Met a l,(1988) Science 240: 1041-1043.
En un aspecto, para generar anticuerpos completos, se pueden utilizar cebadores de PCR que incluyen secuencias de nucleótidos de VH o VL, un sitio de restricción y una secuencia flanqueante para proteger el sitio de restricción para amplificar las secuencias de VH o VL a partir de un molde, por ejemplo, clones de scFv. Utilizando mecanismos de clonación conocidos por los expertos en la técnica, los dominios VH amplificados por PCR se pueden clonar en vectores que expresan una región constante de VH, y los dominios VL amplificados por PCR se pueden clonar en vectores que expresan una región constante de VL, p. ej., regiones constantes kappa o lambda humanas. Los dominios VH y VL también se pueden clonar en un vector que exprese las regiones constantes necesarias. Los vectores de conversión de cadena pesada y los vectores de conversión de cadena ligera se cotransfectan después en líneas celulares para generar líneas celulares estables o transitorias que expresan anticuerpos de longitud completa, p. ej., IgG, utilizando mecanismos conocidos por los expertos en la técnica.
Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones del anticuerpo derivan de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede contener una región variable de un anticuerpo monoclonal de ratón o rata fusionada con una región constante de un anticuerpo humano. Se conocen en la técnica métodos para producir anticuerpos quiméricos. Véanse, p. ej., Morrison SL (1985) Science 229: 1202-7; Oi VT & Morrison SL (1986) BioTechniques 4: 214-221; Gillies SDet al.,(1989) J Immunol Methods 125: 191-202; y Patentes de Estados Unidos Núm. 5.807.715, 4.816.567, 4.816.397, y 6.331.415. Como se divulga, un anticuerpo quimérico comprende una región de cadena pesada variable (VH) y una región de cadena ligera variable (VL), en donde VH y VL comprenden cada una las secuencias de aminoácidos de VH y VL, respectivamente, expuestas en la Tabla 13.
Un anticuerpo humanizado es capaz de unirse a un antígeno predeterminado y que comprende una región marco que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y CDR que tienen sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana (p. ej., una inmunoglobulina murina). En realizaciones particulares, un anticuerpo humanizado también comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. Un anticuerpo humanizado puede seleccionarse entre cualquier clase de inmunoglobulinas, incluidas IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluida IgG<1>, IgG<2>, IgG3 e IgG4. Los anticuerpos humanizados se pueden producir utilizando una variedad de mecanismos conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, el injerto de CDR (Patente Europea Núm. EP 239400; Publicación internacional Núm. WO 91/09967; y Patentes de Estados Unidos Núm. 5.225.539, 5.530.101, y 5.585.089), técnicas de remodelación o reconstrucción de la superficie (Patentes Europeas Núm. EP 592106 y EP 519596; Padlan EA (1991) Mol Immunol 28(4/5): 489-498; Studnicka GMet al.,(1994) Prot Engineering 7(6): 805-814; y Roguska MAet al.,(1994) PNAS 91: 969-973), barajado de cadenas (Patente de Estados Unidos Núm. 5.565.332), y técnicas divulgadas, p. ej., en la Patente de Estados Unidos Núm. 6.407.213, la Patente de Estados Unidos Núm. 5.766.886, la Publicación Internacional Núm. WO 93/17105; Tan Pet al.,(2002) J Immunol 169: 1119-25; Caldas Cet al.,(2000) Protein Eng. 13(5): 353-60; Morea V etal.,(2000) Methods 20(3): 267-79; Baca M etal.,(1997) J Biol Chem 272(16): 10678-84; Roguska MA etal.,(1996) Protein Eng 9(10): 895 904; Couto JR etal.,(1995) Cancer Res. 55 (Sup 23): 5973s-5977s; Couto JR etal.,(1995) Cancer Res 55(8): 1717-22; Sandhu JS (1994) Gen 150(2): 409-10 y Pedersen JT etal.,(1994) J Mol Biol 235(3): 959-73. Véase también la Publicación de Solicitud de EE.UU. Núm. US 2005/0042664 A1 (24 Feb., 2005).
En una realización específica, un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a m Er TK humana, comprenden la VH y la VL del anticuerpo z10 (véase la Tabla 11). Se divulgan un anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprenden la VH y la VL del anticuerpo z11 (véase la Tabla 12), o la VH y VL del anticuerpo z13 (véase la Tabla 13). Se han descrito los métodos para preparar anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos), véanse, por ejemplo, en Patentes de Estados Unidos Núm. 7.951.917; 7.183.076; 8.227.577; 5.837.242; 5.989.830; 5.869.620; 6.132.992 y 8.586.713.
Los anticuerpos de dominio único, por ejemplo, anticuerpos que carecen de cadenas ligeras, pueden producirse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Véanse Riechmann L y Muyldermans S (1999) J Immunol 231: 25 38; Nuttall SD etal.,(2000) Curr Pharm Biotechnol 1(3): 253-263; Muyldermans S, (2001) J Biotechnol 74(4): 277-302; Patente de Estados Unidos Núm. 6.005.079; y Publicaciones Internacionales Núm. WO 94/04678, WO 94/25591 y WO 01/44301.
Adicionalmente, los anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno MERTK (p. ej., MERTK humana) se pueden utilizar a su vez para generar anticuerpos antiidiotipo que "imiten" un antígeno utilizando mecanismos bien conocidos por los expertos en la técnica. (Véase, p. ej., Greenspan NS y Bona CA (1989) FASEB J 7(5): 437-444; y Nissinoff A (1991) J Immunol 147(8): 2429-2438).
Como se divulga, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento se pueden unir al mismo epítopo o a un epítopo solapante de MERTK (p. ej., MERTK humana) como un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento. Como se divulga, un anticuerpo descrito en el presente documento, que bloquea competitivamente (p. ej., de manera dependiente de la dosis) uno cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento, (p. ej., z10, z11, o z13, o xAb) la unión a MERTK (p. ej., MERTK humana), es un anticuerpo anti-MERTK humana o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos humanos se pueden producir utilizando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulinas humanas. En particular, los complejos de genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera humanas se pueden introducir aleatoriamente o mediante recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón. Alternativamente, la región variable, la región constante y la región de diversidad humana se pueden introducir en células madre embrionarias de ratón además de los genes de las cadenas pesada y ligera humanas. Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera de ratón pueden hacerse no funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de loci de inmunoglobulina humana mediante recombinación homóloga. En particular, la deleción homocigótica de la región J<h>previene la producción de anticuerpos endógenos. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos. Después, los ratones quiméricos se crían para producir descendencia homocigótica que expresa anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de forma normal con un antígeno seleccionado, p. ej., todo o una parte de un antígeno (p. ej., MERTK). Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno se pueden obtener a partir de ratones transgénicos inmunizados utilizando tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se reorganizan durante la diferenciación de las células B y posteriormente sufren un cambio de clase y mutación somática. Por tanto, utilizando dicha técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para obtener una descripción general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase, p. ej., Lonberg N y Huszar D (1995) Int. Rev Immunol 13:65-93. Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos, véanse, p. ej., las Publicaciones Internacionales Núm. WO 98/24893, WO 96/34096 y WO 96/33735; y las Patentes de Estados Unidos Núm. 5.413.923, 5.625.126, 5.633.425, 5.569.825, 5.661.016, 5.545.806, 5.814.318 y 5.939.598. Los ejemplos de ratones capaces de producir anticuerpos humanos incluyen Xenomouse™ (Abgenix, Inc.; Patentes de Estados Unidos Núm. 6.075.181 y 6.150.184), HuAb-Mouse™ (Mederex, Inc./Gen Pharm; Patentes de Estados Unidos Núm. 5.545.806 y 5.569.825), Trans Chromo Mouse™ (Kirin) y KM Mouse™ (Medarex/Kirin).
Los anticuerpos humanos que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) se puede preparar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluidos los métodos de presentación en fagos descritos anteriormente utilizando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Véanse también las Patentes de Estados Unidos Núm. 4.444.887, 4.716.111, y 5.885.793; y las Publicaciones Internacionales Núm. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741.
En algunas realizaciones, se pueden producir anticuerpos humanos utilizando hibridomas de ratón-humano. Por ejemplo, los linfocitos de sangre periférica humana transformados con el virus de Epstein-Barr (EBV) pueden fusionarse con células de mieloma de ratón para producir hibridomas de ratón-humano que secretan anticuerpos monoclonales humanos, y estos hibridomas de ratón-humano pueden escrutarse para determinar cuáles secretan anticuerpos monoclonales humanos que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno diana (p. ej., MERTK humana). Tales métodos son conocidos y se describen en la técnica, véase, p. ej., Shinmoto Het al.,(2004) Citotechnology 46: 19-23; Naganawa Y etal.,(2005) Human Antibodies 14: 27-31.
Los métodos de escrutinio y selección de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente documento, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) son los descritos en el Ejemplo 1, más abajo.
Una vez que se ha producido un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, se pueden purificar mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (p. ej., intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad por el antígeno específico posterior a la cromatografía en columna con Proteína A y por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Adicionalmente, los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden fusionar con secuencias polipeptídicas heterólogas descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la técnica para facilitar la purificación.
En realizaciones específicas, se aísla o purifica un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Generalmente, un anticuerpo aislado es aquel que está sustancialmente libre de otros anticuerpos con especificidades antigénicas diferentes a las del anticuerpo aislado. Por ejemplo, en una realización particular, una preparación de un anticuerpo descrito en el presente documento está sustancialmente libre de material celular y/o precursores químicos. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de un anticuerpo en las que el anticuerpo se separa de los componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce de forma recombinante. Así, un anticuerpo que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de anticuerpo que tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% o 0,1% (en peso seco) de proteína heteróloga (también denominada en el presente documento "proteína contaminante") y/o variantes de un anticuerpo, por ejemplo, diferentes formas modificadas postraduccionalmente de un anticuerpo u otras versiones diferentes de un anticuerpo (p. ej., fragmentos de anticuerpos). Cuando el anticuerpo se produce de forma recombinante, generalmente también está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, 10%, 2%, 1%, 0,5% o 0,1% del volumen de la preparación proteica. Cuando el anticuerpo se produce mediante síntesis química, generalmente está sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas, es decir., se separa de precursores químicos u otras sustancias químicas que intervienen en la síntesis de la proteína. Por consiguiente, tales preparaciones del anticuerpo tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de precursores químicos o compuestos distintos del anticuerpo de interés. En una realización específica, los anticuerpos se aíslan o purifican.
5.3.2. Polinucleótidos
En ciertos aspectos, se proporcionan en el presente documento polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención que se unen específicamente a un antígeno MERTK humana, y vectores, p. ej., vectores que comprenden tales polinucleótidos para su expresión eficiente en células anfitrionas ex vivo (p. ej., células de E.coliy de mamífero). En algunas realizaciones, se aísla o purifica un polinucleótido.
Como se emplea en el presente documento, un polinucleótido o molécula de ácido nucleico "aislados" son aquellos que están separados de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural (p. ej., en un ratón o un ser humano) de la molécula de ácido nucleico. Por otra parte, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. Por ejemplo, la expresión "sustancialmente libre" incluye preparaciones de polinucleótidos o moléculas de ácido nucleico que tienen menos de aproximadamente 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% o 0,1% de otro material, p. ej., material celular, medio de cultivo, otras moléculas de ácido nucleico, precursores químicos y/u otras sustancias químicas.
En aspectos particulares, se proporcionan en el presente documento polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, que se unen específicamente a un polipéptido de MERTK humana y comprende una secuencia de aminoácidos como se reivindica. Se divulgan, pero no se reivindican polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos que compiten con tales anticuerpos por la unión a un polipéptido de MERTK (p. ej., MERTK humana) (p. ej., de una manera dependiente de la dosis), o que se unen al mismo epítopo, o a uno solapante, que el de tales anticuerpos.
En ciertos aspectos, en el presente documento se proporcionan polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera o la cadena pesada de un anticuerpo de la presente invención.
En ciertas realizaciones, un polinucleótido descrito en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región variable de cadena pesada que comprende s Eq ID NO: 105. Se divulga un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica<s>E<q>ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 o SEQ ID NO: 109. En ciertas realizaciones, un polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde el anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 106. Se divulga un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO: 111. En ciertas realizaciones, un polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Como se divulga, un polinucleótido descrito en el presente documento puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Como se divulga, un polinucleótido descrito en el presente documento puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Como se divulga, un polinucleótido descrito en el presente documento puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región variable de cadena pesada que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 110 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111. Como se divulga, un polinucleótido descrito en el presente documento puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden una región variable de cadena pesada que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 109 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106.
En ciertas realizaciones, un polinucleótido codifica una VH, en donde el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 119. Se divulga un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122 o SEQ ID NO: 123. En ciertas realizaciones, un polinucleótido codifica una VL, en donde el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 120. Se divulga un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 124. En una realización específica, un polinucleótido codifica una VH y una VL, en donde el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 119, y en donde el polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 120. Como se divulga, un polinucleótido descrito en el presente documento puede codificar una VH y una VL, en donde el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 121, y en donde el polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 120. Como se divulga, un polinucleótido descrito en el presente documento puede codificar una VH y una VL, en donde el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 122, y en donde el polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 120. Como se divulga, un polinucleótido descrito en el presente documento puede codificar una VH y una VL, en donde el polinucleótido comprende un ácido nucleico de SEQ ID NO: 123 y en donde el polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 124.
En aspectos específicos, en el presente documento se proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de la presente invención que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, p. ej., una cadena ligera y una cadena pesada separadas. Con respecto a la cadena ligera, en una realización específica, un polinucleótido proporcionado en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo que comprende una cadena ligera kappa humana o una cadena ligera lambda humana.
En aspectos específicos, un polinucleótido proporcionado en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera de un anticuerpo, en donde la secuencia de nucleótidos comprende una región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 106, y una secuencia de nucleótidos de la región constante de cadena ligera humana de la cadena ligera kappa o lambda humana. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera de un anticuerpo, en donde la cadena ligera comprende una región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 111, y una región constante de cadena ligera humana de la cadena ligera kappa o lambda humana.
En una realización particular, un polinucleótido proporcionado en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, que se une específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera, y en donde la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, y en donde la región constante de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de una región constante de la cadena ligera kappa humana. En otra realización particular, un polinucleótido proporcionado en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, que se une específicamente a MERTK humana y comprende una cadena ligera, en donde la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, y en donde la región constante de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de una región constante de la cadena ligera lambda humana. En otro aspecto, un polinucleótido proporcionado en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera de un anticuerpo de la presente invención, en donde la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113. En otro aspecto, un polinucleótido proporcionado en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera de un anticuerpo de la presente invención, que se une específicamente a MERTK humana, en donde la secuencia de nucleótidos comprende SEQ ID NO: 126.
En una realización particular, un polinucleótido proporcionado en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo que se une específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, y una región constante pesada. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y comprende una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107, y una región constante pesada. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y comprende una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108, y una región constante pesada. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y comprende una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109, y una región constante pesada. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y comprende una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110, y una región constante pesada.
En una realización particular, un polinucleótido proporcionado en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo que se une específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de<s>E<q>ID NO: 114. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117.
En un aspecto específico, el polinucleótido proporcionado en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada de un anticuerpo de la presente invención, que se une específicamente a MERTK humana, en donde la secuencia de nucleótidos comprende SEQ ID NO: 119 y una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada humana. En otro aspecto, un polinucleótido proporcionado en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada de un anticuerpo de la presente invención, que se une específicamente a MERTK humana, en donde la secuencia de nucleótidos comprende SEQ ID NO: 125.
Como se divulga, el polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada de un anticuerpo, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde la secuencia de nucleótidos comprende SEQ ID NO: 121 y una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada humana. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a MERTK, en donde el nucleótido comprende SEQ ID NO: 127.
Como se divulga, el polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada de un anticuerpo, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde la secuencia de nucleótidos comprende SEQ ID NO: 122 y una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada humana. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde la secuencia de nucleótidos comprende SEQ ID NO: 128.
Como se divulga, el polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada de un anticuerpo, que se une específicamente a MERTK (p. ej. MERTK humana), en donde la secuencia de nucleótidos comprende<s>E<q>ID NO: 123 y una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada humana. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a MERTK (p. ej. MERTK humana), en donde el nucleótido comprende SEQ ID NO: 129.
En un aspecto específico, un polinucleótido proporcionado en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo de la presente invención que se une específicamente a MERTK humana y una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada del anticuerpo, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 119 y una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada humana, y en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 120, y una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada humana. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada del anticuerpo, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 120, y una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena ligera humana, y en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 121 y una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada humana. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento que se une específicamente a MERT<k>(p. ej., MERTK humana) y una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada del anticuerpo, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 120 y una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena ligera humana, y en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 122 y una secuencia de nucleótidos de región constante de cadena pesada humana. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada del anticuerpo, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 124 y una secuencia de nucleótidos de la región constante de la cadena ligera humana, y en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 123 y una secuencia de nucleótidos de la región constante de la cadena pesada humana.
En un aspecto específico, un polinucleótido proporcionado en el presente documento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de la presente invención, que se une específicamente a MERTK humana, en donde el anticuerpo comprende: (1) una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y una región constante de cadena pesada humana; y (2) una región de cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, y una región constante de cadena ligera humana. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde el anticuerpo comprende: (1) una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y una región constante de cadena pesada humana; y (2) una región de cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, y una región constante de cadena ligera humana. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde el anticuerpo comprende: (1) una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108 y una región constante de cadena pesada humana; y (2) una región de cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, y una región constante de cadena ligera humana. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde el anticuerpo comprende: (1) una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110, y una región constante de cadena pesada humana; y (2) una región de cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 y una región constante de cadena ligera humana.
Como se divulga, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde el anticuerpo comprende: (1) una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109, y una región constante de cadena pesada humana; y (2) una región de cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 y una región constante de cadena ligera humana.
En otra realización específica, un polinucleótido proporcionado en el presente documento comprende secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo anti-MERTK, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, en donde una secuencia de nucleótidos codifica una cadena pesada del anticuerpo y la otra secuencia de nucleótidos codifica una cadena ligera del anticuerpo, y en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 125 y la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera comprende la ID NO: 126. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo anti-MERTK, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde una secuencia de nucleótidos codifica una cadena pesada del anticuerpo y la otra secuencia de nucleótidos codifica una cadena ligera del anticuerpo, y en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 127 y la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 126. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo anti-MERTK, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde una secuencia de nucleótidos codifica una cadena pesada del anticuerpo y la otra secuencia de nucleótidos codifica una cadena ligera del anticuerpo, y en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 128 y la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 126. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo anti-MERTK, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde una secuencia de nucleótidos codifica una cadena pesada del anticuerpo y la otra secuencia de nucleótidos codifica una cadena ligera del anticuerpo, y en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 129 y la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 130.
En otra realización específica, un polinucleótido proporcionado en el presente documento comprende secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK humana, en donde una secuencia de nucleótidos codifica una cadena pesada del anticuerpo y la otra codifica la cadena ligera del anticuerpo, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 112 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde una secuencia de nucleótidos codifica una cadena pesada del anticuerpo y la otra codifica la cadena ligera del anticuerpo, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde una secuencia de nucleótidos codifica una cadena pesada del anticuerpo y la otra codifica la cadena ligera del anticuerpo, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde una secuencia de nucleótidos codifica una cadena pesada del anticuerpo y la otra codifica la cadena ligera del anticuerpo, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 116 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113. Como se divulga, un polinucleótido puede comprender secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se unen específicamente a MERTK (p. ej., MERTk humana), en donde una secuencia de nucleótidos codifica una cadena pesada del anticuerpo y la otra codifica la cadena ligera del anticuerpo, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118.
En ciertas realizaciones, uno o varios polinucleótidos, uno o varios ácidos nucleicos o uno o varios nucleótidos incluyen ácidos desoxirribonucleicos, ácidos ribonucleicos, ribonucleótidos y formas poliméricas de los mismos. En algunas realizaciones, los uno o varios polinucleótidos, uno o varios ácidos nucleicos o uno o varios nucleótidos son de hebra sencilla o de doble hebra. En una realización específica, un polinucleótido, un ácido nucleico o una secuencia de nucleótidos son una secuencia de ADNc.
En algunas realizaciones, una secuencia de polinucleótidos (p. ej., una secuencia de ácido nucleico) que codifica un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo se somete a optimización de codones utilizando una metodología conocida por un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, una secuencia de polinucleótidos optimizada que codifica un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo (p. ej., dominio VH y/o dominio VL) pueden hibridarse con un polinucleótido antisentido (p. ej., complementario) de una secuencia de polinucleótidos no optimizada que codifica un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo (p. ej., dominio VH y/o dominio VL). En realizaciones específicas, una secuencia de nucleótidos optimizada que codifica un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo hibrida en condiciones de alta rigurosidad con un polinucleótido antisentido de una secuencia de polinucleótidos no optimizada que codifica un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En una realización específica, una secuencia de nucleótidos optimizada que codifica un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo hibrida en condiciones de hibridación de alta rigurosidad, rigurosidad intermedia o más baja rigurosidad con un polinucleótido antisentido de una secuencia de nucleótidos no optimizada que codifica un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Se ha descrito información sobre las condiciones de hibridación, véase, p. ej., la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. US 2005/0048549 (p. ej., párrafos 72 y 73).
Se pueden obtener los polinucleótidos y se puede determinar la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos mediante cualquier método conocido en la técnica. Las secuencias de nucleótidos que codifican los anticuerpos descritos en el presente documento y las versiones modificadas de estos anticuerpos se pueden determinar utilizando métodos bien conocidos en la técnica, es decir, codones de nucleótidos que se sabe que codifican aminoácidos particulares se ensamblan de tal manera que generen una secuencia de ácido nucleico que codifique el anticuerpo. Tal polinucleótido que codifica el anticuerpo se puede ensamblar a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (p. ej., como describen Kutmeier Get al.,(1994), en BioTechniques 17: 242-6), lo que, brevemente, implica la síntesis de oligonucleótidos solapantes que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, la reasociación y la ligación de esos oligonucleótidos y a continuación, la amplificación de los oligonucleótidos ligados mediante PCR.
Alternativamente, un polinucleótido que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento se puede generar a partir de ácido nucleico de una fuente adecuada (p. ej., un hibridoma) utilizando métodos bien conocidos en la técnica (p. ej., PCR y otros métodos de clonación molecular). Por ejemplo, se puede realizar la amplificación por PCR utilizando cebadores sintéticos hibridables con los extremos 3' y 5' de una secuencia conocida utilizando ADN genómico obtenido de células de hibridoma que producen el anticuerpo de interés. Tales métodos de amplificación por PCR se pueden utilizar para obtener ácidos nucleicos que comprenden la secuencia que codifica la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo. Tales métodos de amplificación por PCR se pueden utilizar para obtener ácidos nucleicos que comprenden la secuencia que codifica la región de cadena ligera variable y/o la región de cadena pesada variable de un anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados se pueden clonar en vectores para su expresión en células anfitrionas y para su clonación adicional, por ejemplo, para generar anticuerpos humanizados.
Si no está disponible un clon que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo particular, pero se conoce la secuencia de la molécula de anticuerpo, se puede sintetizar químicamente u obtener un ácido nucleico que codifique la inmunoglobulina a partir de una fuente adecuada (p. ej., una biblioteca de ADNc de anticuerpo o una biblioteca de ADNc generada a partir de, o ácido nucleico, preferiblemente ARN poli A+, aislado de, cualquier tejido o células que expresen el anticuerpo, tales como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo descrito en el presente documento) mediante amplificación por PCR utilizando cebadores sintéticos hibridables con los extremos 3' y 5' de la secuencia o mediante clonación utilizando una sonda oligonucleotídica específica para la secuencia génica particular a identificar, p. ej., un clon de ADNc de una biblioteca de ADNc que codifica el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR se pueden clonar a continuación en vectores de clonación replicables utilizando cualquier método bien conocido en la técnica.
El ADN que codifica los anticuerpos anti-MERTK descritos en el presente documento se puede aislar y secuenciar fácilmente utilizando procedimientos convencionales (p. ej., mediante el uso de sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos anti-MERTK). Las células de hibridoma pueden servir como fuente de tal ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que después se transfectan en células anfitrionas tales como células de E.coli,células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) (p. ej., células CHO del CHO GS System™ (Lonza)), células 293F, células HEK293 o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos agonistas de MERTK en las células anfitrionas recombinantes.
Para generar anticuerpos completos, se pueden utilizar cebadores de PCR que incluyen secuencias de nucleótidos de VH o VL, un sitio de restricción y una secuencia flanqueante para proteger el sitio de restricción para amplificar las secuencias de VH o VL en clones de scFv. Utilizando mecanismos de clonación conocidos por los expertos en la técnica, los dominios VH amplificados por PCR se pueden clonar en vectores que expresan una región constante de cadena pesada, p. ej., la región constante gamma 4 humana y los dominios VL amplificados por PCR se pueden clonar en vectores que expresan una región constante de cadena ligera, p. ej., regiones constantes kappa o lambda humanas. En ciertas realizaciones, los vectores para expresar los dominios VH o VL comprenden un promotor, una señal de secreción, un sitio de clonación para el dominio variable, dominios constantes y un marcador de selección. Los dominios VH y VL también pueden clonarse en un vector que exprese las regiones constantes necesarias. Los vectores de conversión de cadena pesada y los vectores de conversión de cadena ligera se cotransfectan después en líneas celulares para generar líneas celulares estables o transitorias que expresan anticuerpos de longitud completa, p. ej., IgG, utilizando mecanismos conocidos por los expertos en la técnica.
El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias murinas, o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido distinto de inmunoglobulina.
También se proporcionan polinucleótidos que hibridan en condiciones de hibridación de alta rigurosidad, rigurosidad intermedia o más baja rigurosidad con polinucleótidos que codifican un anticuerpo descrito en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En realizaciones específicas, los polinucleótidos hibridan en condiciones de hibridación de alta rigurosidad, rigurosidad intermedia o más baja rigurosidad con polinucleótidos que codifican una VH (SEQ ID NO: 119) y/o VL (SEQ ID NO: 120) proporcionadas en el presente documento.
Las condiciones de hibridación se han descrito en la técnica y son conocidas por un experto en la técnica. Por ejemplo, la hibridación en condiciones rigurosas puede implicar la hibridación con ADN unido al filtro en 6x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido de uno o más lavados en 0,2xSSC/SDS al 0,1% a aproximadamente 50-65°C; la hibridación en condiciones muy rigurosas puede implicar la hibridación con ácido nucleico unido al filtro en 6xSSC a aproximadamente 45°C seguido de uno o más lavados en 0,1xSSC/SDS al 0,2% a aproximadamente 68°C. La hibridación en otras condiciones de hibridación rigurosas es conocida por los expertos en la técnica y se han descrito, véase, por ejemplo, Ausubel FMet al.,eds., (1989) Current Protocols in Molecular Biology, vol. I, Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York en las páginas 6.3.1-6.3.6 y 2.10.3.
5.3.3. Células y vectores
En ciertos aspectos, en el presente documento se proporcionan vectores (p. ej., vectores de expresión) que comprenden polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención para la expresión recombinante en células anfitrionas, preferiblemente en células de mamífero. Los vectores de expresión pueden ser, p. ej., plásmidos o vectores virales (tales como virus de la enfermedad de Newcastle, adenovirus, virus adenoasociados, vaccinia, etc.). También se proporcionan en el presente documento células anfitrionas que comprenden tales vectores para expresar de forma recombinante anticuerpos anti-MERTK o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención.
La expresión recombinante de un anticuerpo descrito en el presente documento (p. ej., un anticuerpo de longitud completa, cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo, o un anticuerpo de cadena sencilla descritos en el presente documento) que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) implica la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo. Una vez que un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo, una cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo (p. ej., regiones variables de cadena pesada y/o ligera) descritos en el presente documento, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo se puede producir mediante tecnología de ADN recombinante utilizando mecanismos bien conocidos en la técnica. Por tanto, los métodos para preparar una proteína expresando un polinucleótido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (p. ej., cadena ligera o cadena pesada, o ambas) se describen en el presente documento. Se pueden utilizar métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen secuencias codificantes anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (p. ej., cadena ligera o cadena pesada, o ambas) y señales de control transcripcional y traduccional apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinantein vitro,técnicas de síntesis y recombinación genéticain vivo.También se proporcionan vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuerpo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o un dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, conectada operablemente a un promotor. Tales vectores pueden incluir, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véanse, p. ej., Publicaciones Internacionales Núm. WO 86/05807 y WO 89/01036; y Patente de Estados Unidos Núm. 5.122.464) y se pueden clonar dominios variables del anticuerpo en tal vector para la expresión de la cadena pesada completa, de la cadena ligera completa o de ambas cadenas, pesada y ligera completas.
Un vector de expresión se puede transferir a una célula (p. ej., célula anfitriona) mediante técnicas convencionales y las células resultantes pueden cultivarse después mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Por lo tanto, en el presente documento se proporcionan células anfitrionas que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o una cadena pesada o ligera del mismo, o un fragmento del mismo, o un anticuerpo de cadena sencilla descrito en el presente documento, conectados operablemente a un promotor para la expresión de tales secuencias en la célula anfitriona. Como se emplea en el presente documento, el término "célula anfitriona" puede ser cualquier tipo de célula, p. ej., una célula primaria, una célula en cultivo o una célula de una línea celular. En realizaciones específicas, el término "célula anfitriona" se refiere a una célula transfectada con una molécula de ácido nucleico y la progenie o progenie potencial de tal célula. La progenie de tal célula puede no ser idéntica a la célula parental transfectada con la molécula de ácido nucleico, p. ej., debido a mutaciones o influencias ambientales que pueden ocurrir en generaciones sucesivas o a la integración de la molécula de ácido nucleico en el genoma de la célula anfitriona.
Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión en anfitriones para expresar las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento. Tales sistemas de expresión en anfitriones representan vehículos mediante los cuales se pueden producir y posteriormente purificar las secuencias codificantes de interés, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, expresar una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento insitu.Estos incluyen, pero sin limitarse a, microorganismos tales como bacterias (p. ej.,E. co liy B.subtilis)transformados con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o ADN de cósmido que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; levadura (p. ej.,Saccharomyces, Pichia)transformados con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., baculovirus) que contiene secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células vegetales (p. ej., algas verdes tales comoChlamydomonas reinhardtii)infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (p. ej., plásmido Ti) que contiene secuencias codificantes de anticuerpos; o sistemas de células de mamíferos (p. ej., células COS (p. ej., COS1 o COS), CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NS0, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa y NIH 3T3, HEK-293T, 293F, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20 y BMT10) que albergan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (p. ej., promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (p. ej., el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7,5K del virus vaccinia). En una realización específica, las células para expresar anticuerpos o un fragmento de unión a antígeno de los mismos son células CHO, por ejemplo, células CHO de CHO GS System™ (Lonza). En una realización particular, las células para expresar anticuerpos descritos en el presente documento son células humanas, p. ej., líneas celulares humanas. En una realización específica, un vector de expresión de mamífero es pOptiVEC™ o pcDNA3.3. En una realización particular, se utilizan células bacterianas tales comoEscherichia coli,o células eucariotas (p. ej., células de mamífero), especialmente para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante completa, para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, las células de mamíferos tales como las células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector tal como el elemento promotor del gen temprano intermedio principal del citomegalovirus humano, son un sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking MK y Hofstetter H (1986) Gene 45: 101-5; y Cockett MIet al.,(1990) Biotechnology 8(7): 662-7). En ciertas realizaciones, los anticuerpos son producidos por células CHO o células NS0. En una realización específica, la expresión de secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a MERTK humana está regulada por un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor específico de tejido.
En sistemas bacterianos, se pueden seleccionar ventajosamente varios vectores de expresión dependiendo del uso previsto para la molécula de anticuerpo que se expresa. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de tal anticuerpo, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos de proteínas de fusión que se purifiquen fácilmente. Tales vectores incluyen, pero sin limitarse a, el vector de expresión deE. colipUR278 (Ruether U y Mueller-Hill B (1983) EMBO J 2: 1791-1794), en el que la secuencia codificante del anticuerpo se puede ligar individualmente en el vector en marco con la región codificante lac Z de modo que se produzca una proteína de fusión; vectores pin (Inouye S e Inouye M (1985) Nuc Acids Res 13: 3101-3109; Van Heeke G y Schuster SM (1989) J Biol Chem 24: 5503 5509); y similares. Por ejemplo, también se pueden utilizar vectores pGEX para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutatión 5-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción y unión a cuentas de matriz de glutatión y agarosa seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir sitios de escisión de trombina o proteasa del factor Xa de modo que el producto del gen diana clonado pueda liberarse del radical GST.
En un sistema de insectos, se puede utilizar el virus de la poliedrosis nuclear deAutographa californica(AcNPV), por ejemplo, como vector para expresar genes foráneos. El virus crece en células deSpodoptera frugiperda.La secuencia codificante del anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (p. ej., el gen de la polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor de AcNPV (p. ej., el promotor de polihedrina).
En células anfitrionas de mamíferos, se pueden utilizar varios sistemas de expresión basados en virus. En los casos en los que se utiliza un adenovirus como vector de expresión, la secuencia codificante del anticuerpo de interés puede ligarse a un complejo de control de transcripción/traducción de adenovirus, p. ej., el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede insertarse a continuación en el genoma del adenovirus mediante recombinaciónin vitrooin vivo.La inserción en una región no esencial del genoma viral (p. ej., región El o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de anticuerpo en anfitriones infectados (p. ej., véase Logan J y Shenk T (1984) p Na S 81(12): 3655-9). También pueden ser necesarias señales de iniciación específicas para la traducción eficaz de secuencias insertadas codificantes de anticuerpos. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para garantizar la traducción de todo el inserto. Estas señales de control de la traducción y codones de iniciación exógenos pueden tener diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede mejorarse mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción apropiados, etc. (véase, p. ej., Bitter Get al.,(1987) Methods Enzymol.
153: 516-544).
Además, se puede elegir una cepa de células anfitrionas que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico de la forma específica deseada. Tales modificaciones (p. ej., glicosilación) y procesamiento (p. ej., escisión) de productos proteicos puede ser importante para la función de la proteína. Diferentes células anfitrionas tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y modificación postraduccionales de proteínas y productos genéticos. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas anfitriones apropiados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína foránea expresada. Para este fin, se pueden utilizar células anfitrionas eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento adecuado del transcrito primario, la glicosilación y la fosforilación del producto génico. Tales células anfitrionas de mamífero incluyen, pero sin limitarse a, CHO, VERO, BHK, Hela, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, 293F, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O y T47D, NS0 (una línea celular de mieloma murino que no producir endógenamente ninguna cadena de inmunoglobulina), CRL7O3O, COS (p. ej., COS1 o COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HEK293, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20, BMT10 y HsS78Bst. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-MERTK se producen en células de mamíferos, tales como células CHO.
En una realización específica, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos tienen un contenido de fucosa reducido o no tienen contenido de fucosa. Tales anticuerpos se pueden producir utilizando mecanismos conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden expresarse en células con deficiencia o carencia de capacidad para fucosilarse. En un ejemplo específico, se pueden utilizar líneas celulares con una inactivación génica de ambos alelos de a1,6-fucosiltransferasa para producir anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos con contenido reducido de fucosa. El sistema Potelligent® (Lonza) es un ejemplo de tal sistema que se puede utilizar para producir anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos con contenido reducido de fucosa.
Para la producción de proteínas recombinantes a largo plazo y de alto rendimiento, se pueden generar células de expresión estable. Por ejemplo, se pueden diseñar líneas celulares que expresen de manera estable un anticuerpo anti-MERTK descrito en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un anticuerpo anti-MERTK quimérico o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en este documento. En realizaciones específicas, una célula proporcionada en el presente documento expresa de manera estable una cadena ligera/dominio variable de cadena ligera y una cadena pesada/dominio variable de cadena pesada que se asocian para formar un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
En ciertos aspectos, en lugar de utilizar vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, las células anfitrionas pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (p. ej., promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN/polinucleótido foráneo, se puede dejar que las células modificadas genéticamente crezcan durante 1 a 2 días en un medio enriquecido y después se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de manera estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este método se puede utilizar ventajosamente para modificar genéticamente líneas celulares que expresen un anticuerpo anti-MERTK humanizado descrito en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un anticuerpo quimérico anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en este documento. Tales líneas celulares modificadas genéticamente pueden ser particularmente útiles en el escrutinio y evaluación de composiciones que interactúan directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.
Se pueden utilizar varios sistemas de selección, incluidos, pero sin limitarse a, los genes de timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler Met al.,(1977) Cell 11(1): 223-32), hipoxantinaguanina fosforribosiltransferasa (Szybalska EH y Szybalski W (1962) PNAS 48(12): 2026-2034) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy I etal.,(1980) Cell 22(3): 817-23) en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Además, la resistencia a antimetabolitos se puede utilizar como base de selección para los siguientes genes:dhfr,que confiere resistencia al metotrexato (Wigler M etal.,(1980) PNAS 77(6): 3567-70; O'Hare K etal.,(1981) PNAS 78: 1527-31);gpt,que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan RC y Berg P (1981) PNAS 78(4): 2072-6); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Wu GY y Wu CH (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev P (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol 32: 573-596; Mulligan R<c>(1993) Science 260: 926-932; y Morgan RA y Anderson WF (1993) Ann Rev Biochem 62: 191-217; Nabel GJ y Felgner p L (1993) Trends Biotechnol 11(5): 211-5); ehygro,que confiere resistencia a la higromicina (Santerre RF etal.,(1984) Gene 30(1-3): 147-56). Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología del ADN recombinante se pueden aplicar de forma rutinaria para seleccionar el clon recombinante deseado y tales métodos son descritos, por ejemplo, por Ausubel FM etal.,(eds.), en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York (1993); Kriegler M, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, Nueva York (1990); y en los Capítulos 12 y 13, Dracopoli NC etal.,(eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colbére-Garapin F etal.,(1981) J Mol Biol 150: 1-14.
Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo se pueden aumentar mediante la amplificación del vector (para una revisión, véase Bebbington CR y Hentschel CCG, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, vol. 3 (Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa anticuerpo es amplificable, el aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula anfitriona aumentará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará (Crouse GFet al.,(1983) Mol Cell Biol 3: 257-66).
La célula anfitriona puede cotransfectarse con dos o más vectores de expresión descritos en el presente documento, codificando el primer vector un polipéptido derivado de cadena pesada y codificando el segundo vector un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten la expresión igual de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Las células anfitrionas pueden cotransfectarse con diferentes cantidades de los dos o más vectores de expresión. Por ejemplo, las células anfitrionas pueden transfectarse con una cualquiera de las siguientes proporciones de un primer vector de expresión y un segundo vector de expresión: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6. 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45 o 1:50.
En un aspecto específico, una célula anfitriona proporcionada en el presente documento comprende un vector, en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región de cadena ligera variable (VL) de un anticuerpo descrito en el presente documento que se une específicamente a MERTK humana y una secuencia de nucleótidos que codifica una región de cadena pesada variable (VH) del anticuerpo, en donde la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, y en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105. En otro aspecto específico, una célula anfitriona proporcionada en el presente documento comprende un vector, en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento que se une específicamente a MERTK humana y una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada del anticuerpo, en donde la cadena ligera comprende una región de cadena ligera variable que comprende el aminoácido de s Eq ID NO: 106, y una región constante de cadena ligera humana, y en donde la cadena pesada comprende una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, y una región constante de cadena pesada humana.
Como se divulga, una célula anfitriona puede comprender un vector, en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región de cadena ligera variable (VL) de un anticuerpo descrito en el presente documento que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y una secuencia de nucleótidos que codifica una región de cadena pesada variable (VH) del anticuerpo, en donde la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, y en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109. Como se divulga, una célula anfitriona puede comprender un vector, en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada del anticuerpo, en donde la cadena ligera comprende una región de cadena ligera variable que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 106, y una región constante de cadena ligera humana, y en donde la cadena pesada comprende una región de cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109, y una región constante de cadena pesada humana.
Como se divulga, una célula anfitriona puede comprender un vector, en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica VL de un anticuerpo descrito en el presente documento que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y una secuencia de nucleótidos que codifica una VH del anticuerpo, en donde la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, y en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107. Como se divulga, una célula anfitriona puede comprender un vector, en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada del anticuerpo, en donde la cadena ligera comprende una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 y una región constante ligera humana, y en donde la cadena pesada comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y una región constante pesada humana.
Como se divulga, una célula anfitriona puede comprender un vector, en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una VL de un anticuerpo descrito en el presente documento que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y una secuencia de nucleótidos que codifica una VH del anticuerpo, en donde la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106, y en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108. Como se divulga, una célula anfitriona puede comprender un vector, en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada del anticuerpo, en donde la cadena ligera comprende una región de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 108, y una región constante de cadena ligera humana, y en donde la cadena pesada comprende una secuencia de nucleótidos de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 105, y una región constante de cadena pesada humana.
Como se divulga, una célula anfitriona puede comprender un vector, en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una VL de un anticuerpo descrito en el presente documento que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y una secuencia de nucleótidos que codifica una VH del anticuerpo, en donde la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111, y en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110.
En otro aspecto específico, una célula anfitriona proporcionada en el presente documento comprende un vector, en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo que se une específicamente a MERTK humana y una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada del anticuerpo, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 120 y una secuencia de nucleótidos de la región constante de la cadena ligera humana, y en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 119 y una secuencia de nucleótidos de la región constante de la cadena pesada humana.
Como se divulga, una célula anfitriona puede comprender un vector, en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada del anticuerpo, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 120, y una secuencia de nucleótidos de la región constante de la cadena ligera humana, y en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 121 y una secuencia de nucleótidos de la región constante de la cadena pesada humana. Como se divulga, una célula anfitriona puede comprender un vector, en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada del anticuerpo, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 120, y una secuencia de nucleótidos de la región constante de la cadena ligera humana, y en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 122 y una secuencia de nucleótidos de la región constante de la cadena pesada humana. Como se divulga, una célula anfitriona puede comprender un vector, en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana) y una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada del anticuerpo, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera comprende SEQ ID NO: 124, y una secuencia de nucleótidos de la región constante de la cadena ligera humana, y en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada comprende SEQ ID NO: 123 y una secuencia de nucleótidos de la región constante de la cadena pesada humana.
En un aspecto específico, una célula anfitriona proporcionada en el presente documento comprende un primer vector y un segundo vector, en donde el primer vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región de cadena pesada variable de un anticuerpo que se une específicamente a MERTK humana, en donde el segundo vector comprende una región de cadena ligera variable del anticuerpo, en donde la región de cadena pesada variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, y en donde la región de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Como se divulga, una célula anfitriona puede comprender un primer vector y un segundo vector, en donde el primer vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región de cadena pesada variable de un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde el segundo vector comprende una región de cadena ligera variable del anticuerpo, en donde la región de cadena pesada variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107, y en donde la región de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Como se divulga, una célula anfitriona puede comprender un primer vector y un segundo vector, en donde el primer vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región de cadena pesada variable de un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde el segundo vector comprende una región de cadena ligera variable del anticuerpo, en donde la región de cadena pesada variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108, y en donde la región de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Como se divulga, una célula anfitriona puede comprender un primer vector y un segundo vector, en donde el primer vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región de cadena pesada variable de un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde el segundo vector comprende una región de cadena ligera variable del anticuerpo, en donde la región de cadena pesada variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109, y en donde la región de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Como se divulga, una célula anfitriona puede comprender un primer vector y un segundo vector, en donde el primer vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región de cadena pesada variable de un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), en donde el segundo vector comprende una región de cadena ligera variable del anticuerpo, en donde la región de cadena pesada variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110 y en donde la región de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111. En algunas realizaciones, el primer vector comprende una región constante de cadena pesada y/o el segundo vector comprende una región constante de cadena ligera.
Alternativamente, se puede utilizar un único vector que codifique y sea capaz de expresar polipéptidos de cadena tanto pesada como ligera. En tal vector de expresión, la transcripción de ambos genes puede ser impulsada por un promotor común, mientras que la traducción del ARNm del primer gen puede realizarse mediante un mecanismo de exploración dependiente de cap y la traducción del ARNm del segundo gen puede realizarse mediante un mecanismo independiente de cap, p. ej., mediante un IRES.
En un aspecto específico, una célula anfitriona proporcionada en el presente documento comprende un vector, en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región de cadena pesada variable de un anticuerpo que se une específicamente a MERTK humana, y un nucleótido que codifica una región de cadena ligera variable del anticuerpo, en donde la región de cadena pesada variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, y en donde la región de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Como se divulga, una célula anfitriona puede comprender un vector, en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región de cadena pesada variable de un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), y un nucleótido que codifica una región de cadena ligera variable del anticuerpo, en donde la región de cadena pesada variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107, y en donde la región de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Como se divulga, una célula anfitriona puede comprender un vector, en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región de cadena pesada variable de un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), y un nucleótido que codifica una región de cadena ligera variable del anticuerpo, en donde la región de cadena pesada variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108, y en donde la región de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Como se divulga, una célula anfitriona puede comprender un vector, en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región de cadena pesada variable de un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), y un nucleótido que codifica una región de cadena ligera variable del anticuerpo, en donde la región de cadena pesada variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109, y en donde la región de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106. Como se divulga, una célula anfitriona puede comprender un vector, en donde el vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región de cadena pesada variable de un anticuerpo descrito en el presente documento, que se une específicamente a MERTK (p. ej., MERTK humana), y un nucleótido que codifica una región de cadena ligera variable del anticuerpo, en donde la región de cadena pesada variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110, y en donde la región de cadena ligera variable comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111. En algunas realizaciones, el vector comprende una región constante de cadena pesada y/o una región constante de cadena ligera.
En una realización específica, una célula anfitriona (p. ej., una célula anfitrionaex-vivo)descrita en el presente documento se cultiva en condiciones para producir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo codificados por la secuencia de polinucleótidos contenida en la célula anfitriona utilizando un mecanismo conocido en la técnica. En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se aíslan o purifican de la célula anfitriona utilizando un mecanismo conocido en la técnica.
5.4. Producción de productos conjugados de anticuerpo-fármaco
En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento métodos para producir un producto conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención en donde no está presente un conector, comprendiendo el método: (a) conjugar el agente citotóxico directamente con el radical de anticuerpo para producir el producto conjugado de anticuerpo-fármaco; y (b) purificar el producto conjugado de anticuerpo-fármaco. En la sección 6 se describen ejemplos de métodos para producir productos conjugados de anticuerpo-fármaco. (p. ej., en el Ejemplo 4).
En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento métodos para producir un producto conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención en donde el producto conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un conector, comprendiendo el método las siguientes etapas en el orden indicado: (a) conjugar el conector directamente con el radical de anticuerpo para producir un conector-radical de anticuerpo; (b) conjugar el conector del conectorradical de anticuerpo directamente con el agente citotóxico para producir el producto conjugado de anticuerpo-fármaco; y (c) purificar el producto conjugado de anticuerpo-fármaco.
En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento métodos para producir un producto conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención en donde el producto conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un conector, comprendiendo el método las siguientes etapas en el orden indicado: (a) conjugar el conector directamente con el agente citotóxico para producir un conector-radical de agente citotóxico; (b) conjugar el conector del conectorradical de agente citotóxico directamente con el radical de anticuerpo para producir el producto conjugado de anticuerpo-fármaco; y (c) purificar el producto conjugado de anticuerpo-fármaco.
Las etapas de conjugación y purificación se pueden realizar mediante métodos conocidos en la técnica utilizados para producir productos conjugados de anticuerpo-fármaco, tales como los métodos descritos por Beck Aet al.,(2017) en Nat Rev Drug Discov 16: 315-337; Peters C y Brown S, (2015) en Biosci Rep 35: arte:e00225; McCombs j R y Owen SC (2015) en The AAPS Journal 17: 339-351; Jackson Dy (2016) en Org Process Res Dev 20: 852-866; o Olivier KJ y Hurvitz SA ed, (2016) en Antibody-Drug Conjugates: Fundamentals, Drug Development, and Clinical, Wiley. En algunas realizaciones, el radical de fármaco se conjuga con una cadena del radical de anticuerpo (por ejemplo, cuando el radical de anticuerpo es un scFv, o cuando el radical de anticuerpo es un anticuerpo multicadena, tal como una inmunoglobulina (que es un tetrámero), o fragmento de unión a antígeno del mismo). En otras realizaciones, el radical de fármaco se conjuga con dos o más cadenas del radical de anticuerpo (cuando el radical de anticuerpo es un anticuerpo multicadena, tal como una inmunoglobulina, o un fragmento de unión a antígeno del mismo). En una realización específica, el radical de fármaco se conjuga con dos cadenas idénticas de una inmunoglobulina, p. ej., las cadenas pesadas o las cadenas ligeras. En otras realizaciones, el radical de fármaco se conjuga con todas las cadenas del radical de anticuerpo (cuando el radical de anticuerpo es un anticuerpo multicadena, tal como una inmunoglobulina o un fragmento de unión a antígeno del mismo). En una realización específica, el producto conjugado de anticuerpofármaco se purifica mediante cromatografía. En otra realización específica, el producto conjugado de anticuerpofármaco se purifica mediante centrifugación. A modo de ejemplo, pero sin limitación, la química de conjugación que se puede utilizar para generar el producto conjugado de anticuerpo-fármaco puede ser tiol más maleimida, tiol más maleimida autohidrolizante, tiol más feniloxadiazol sulfona, ligación de oxima, reacción de grupo alcoxiamina a ceto, cicloadición de azida-alquino promovida por cepa (SPAAC), química clic sin cobre, cisteína oxidada a formilglicina, ligación de hidrazino-iso-Pictet-Spengler (HIPS), ligación del grupo Y-carboxiamida de restos de glutamina más aminas primarias, ligación LPETG más amina primaria con motivo de poliglicina, maleimida más 6-tiofucosa, conjugación de hidrazida específica de fucosa, oxidación de peryodato (aldehido) más carga útil de aminooxi, cicloadición de alquinoazida promovida por cepa, oximación de C2-ceto-gal, oxidación de aldehído selectiva de sitio más ligación de oxima, ligación de oxima NH2 más derivados de 5-difluoro-2,4-dinitrobenceno basada en indol, tiol más bissulfona, tiol más dibromomaleimida, tiol más maleimida seguido de un tratamiento a pH 9,2 (45°C, 48 horas), o tiol más arilpropionitrilo (véase Beck Aet al.,(2017) Nat Rev Drug Discov 16: 315-337).
El anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento se pueden generar como se describe en 5.3 más abajo. En realizaciones específicas, el anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo se modifican genéticamente o se modifican mediante un método conocido en la técnica para facilitar la conjugación con el radical o radicales de fármaco, en particular para facilitar la conjugación específica de sitio con el radical o radicales de fármaco, por ejemplo, mediante un método descrito por Beck A etal.,(2017) en Nat Rev Drug Discov 16: 315-337; Peters C y Brown S, (2015) Biosci Rep 35: art:e00225; McCombs JR y Owen SC (2015) The AAPS Journal 17: 339-351; Jackson DY (2016) Org Process Res Dev 20: 852-866; o Olivier kJ y Hurvitz SA ed, (2016) Antibody-Drug Conjugates: Fundamentals, Drug Development, and Clinical, Wiley. Los métodos ilustrativos no limitantes que se pueden utilizar (véase Beck A etal.,(2017) Nat Rev Drug Discov 16: 315 337) para modificar genéticamente o modificar un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo para facilitar la conjugación con el radical o los radicales de fármaco incluyen la adición de una o más cisteínas o selenocisteínas adicionales, la modificación genética con aminoácidos no naturales, la adición de una o más etiquetas de aminoácidos reconocibles por ciertas enzimas que pueden ayudar con la conjugación, la remodelación de glucanos, la adición de una serina amino-terminal y la unión de cisteína nativa.
El conector y el agente citotóxico se pueden generar mediante cualquier método conocido en la técnica para producir el conector y el agente citotóxico, respectivamente.
5.5. Composiciones farmacéuticas
En el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden (a) un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención y (b) un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se purifican. En una realización específica, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo están presentes en la composición farmacéutica en una cantidad terapéuticamente eficaz. La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprenden una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 (p. ej., anticuerpo z10). Como se divulga, la composición farmacéutica puede comprender un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprenden una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 (p. ej. anticuerpo z11). Como se divulga, la composición farmacéutica puede comprender un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprenden una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 (p. ej., anticuerpo z13). Como se divulga, la composición farmacéutica puede comprender un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106.
También se divulgan en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden (a) un anticuerpo quimérico anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento y (b) un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se purifican. En una realización específica, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo están presentes en la composición farmacéutica en una cantidad terapéuticamente eficaz. Como se divulga, la composición farmacéutica puede comprender un anticuerpo quimérico o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprenden una VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 (p. ej., anticuerpo xAb). También se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden un polinucleótido o uno o varios vectores de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
También se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden (a) un producto conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención y (b) un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco está presente en la composición farmacéutica en una cantidad terapéuticamente eficaz.
También se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden (a) un anticuerpo biespecífico que se une a MERTK humana y otro antígeno de interés (p. ej., como se describe en el presente documento) y (b) un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, el anticuerpo biespecífico se purifica. En una realización específica, el anticuerpo biespecífico está presente en la composición farmacéutica en una cantidad terapéuticamente eficaz.
En una realización específica, una población de productos conjugados de anticuerpo-fármaco contenida en la composición farmacéutica tiene una razón fármaco-anticuerpo (DAR) entre 1 y 20. DAR es el número promedio de agentes citotóxicos conjugados con los anticuerpos. En otra realización específica, una población de productos conjugados de anticuerpo-fármaco contenida en la composición farmacéutica tiene un DAR entre 1 y 15. En otra realización específica, una población de productos conjugados de anticuerpo-fármaco contenida en la composición farmacéutica tiene un DAR entre 1 y 12. En otra realización específica, una población de conjugados de anticuerpofármaco contenida en la composición farmacéutica tiene un DAR entre 1 y 8. En otra realización específica, una población de conjugados de anticuerpo-fármaco contenida en la composición farmacéutica tiene un DAR entre 3 y 5. En otra realización específica, una población de conjugados de anticuerpo-fármaco contenida en la composición farmacéutica tiene un DAR entre 3,5 y 4.
Los portadores aceptables, que pueden ser excipientes o estabilizadores, no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen, pero sin limitarse a, tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil- o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparragina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluidos glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (p. ej., complejos de Znproteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (P<e>G).
En una realización específica, las composiciones farmacéuticas comprenden un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo y opcionalmente uno o más agentes profilácticos o terapéuticos adicionales, en un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo y opcionalmente uno o más agentes profilácticos o terapéuticos adicionales, en un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas y/o anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se pueden combinar con una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los agentes terapéuticos adicionales descritos en el presente documento (véase la Sección 5.4.2, más abajo).
En una realización específica, las composiciones farmacéuticas comprenden un producto conjugado de anticuerpofármaco y opcionalmente uno o más agentes profilácticos o terapéuticos adicionales, en un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad eficaz de un producto conjugado de anticuerpo-fármaco y opcionalmente uno o más agentes profilácticos o terapéuticos adicionales, en un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas y/o el producto conjugado de anticuerpo-fármaco se pueden combinar con una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los agentes terapéuticos adicionales descritos en el presente documento (véase la Sección 5.4.2, más abajo).
En algunas realizaciones, el producto conjugado de anticuerpo-fármaco es el único ingrediente activo incluido en la composición farmacéutica.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK es el único ingrediente activo incluido en la composición farmacéutica. En una realización específica, un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo son el único ingrediente activo incluido en la composición farmacéutica. En otra realización, uno o varios polinucleótidos o uno o varios vectores que codifican un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo son el único ingrediente activo en la composición farmacéutica.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden utilizar para tratar el cáncer. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para cualquier vía de administración (p. ej., parenteral, tópica, intratumoral, etc.).
Los portadores farmacéuticamente aceptables utilizados en preparaciones parenterales incluyen vehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos, tampones, antioxidantes, anestésicos locales, agentes de suspensión y dispersión, agentes emulsionantes, agentes secuestrantes o quelantes y otras sustancias farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de vehículos acuosos incluyen Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Dextrosa Isotónica, Inyección de Agua Estéril, e Inyección de Dextrosa y Ringer con Lactato Añadido. Los vehículos parenterales no acuosos incluyen aceites fijados de origen vegetal, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo y aceite de cacahuete. Se pueden añadir agentes antimicrobianos a concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas a preparaciones parenterales envasadas en recipientes de dosis múltiples que incluyen fenoles o cresoles, mercuriales, alcohol bencílico, clorobutanol, ésteres de ácido metil- y propil p-hidroxibenzoico, timerosal, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio. Los agentes isotónicos incluyen cloruro de sodio y dextrosa. Los tampones incluyen fosfato y citrato. Los antioxidantes incluyen bisulfato de sodio. Los anestésicos locales incluyen hidrocloruro de procaína. Los agentes de suspensión y dispersión incluyen carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropilmetilcelulosa y polivinilpirrolidona. Los agentes emulsionantes incluyen polisorbato 80 (TWEEN® 80). Un agente secuestrante o quelante de iones metálicos incluye EDTA. Los portadores farmacéuticos también incluyen alcohol etílico, polietilenglicol y propilenglicol para vehículos miscibles con agua; e hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido láctico para ajustar el pH.
Se puede formular una composición farmacéutica para cualquier vía de administración a un sujeto. Los ejemplos específicos de vías de administración incluyen intranasal, oral, pulmonar, transdérmica, intradérmica y parenteral. También se contempla en el presente documento la administración parenteral, caracterizada por inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa. Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección o como emulsiones. Los inyectables, soluciones y emulsiones también contienen uno o más excipientes. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol o etanol. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas que se van a administrar también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH, estabilizadores, potenciadores de la solubilidad y otros agentes similares, tales como, por ejemplo, acetato sodio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina y ciclodextrinas.
Las preparaciones para la administración parenteral de un anticuerpo incluyen soluciones estériles listas para inyección, productos solubles secos estériles, tales como polvos liofilizados, listos para combinarse con un disolvente justo antes de su uso, incluidos comprimidos hipodérmicos, suspensiones estériles listas para inyección, productos insolubles secos estériles listos para ser combinados con un vehículo justo antes de su uso y emulsiones estériles. Las soluciones pueden ser acuosas o no acuosas.
Si se administran por vía intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato (PBS) y soluciones que contienen agentes espesantes y solubilizantes, tales como glucosa, polietilenglicol y polipropilenglicol y mezclas de los mismos.
Las mezclas tópicas que comprenden un anticuerpo se preparan como se describe para la administración local y sistémica. La mezcla resultante puede ser una solución, suspensión, emulsiones o similares y puede formularse como cremas, geles, ungüentos, emulsiones, soluciones, elixires, lociones, suspensiones, tinturas, pastas, espumas, aerosoles, irrigaciones, pulverizaciones, supositorios, vendajes, parches dérmicos o cualquier otra formulación adecuada para administración tópica.
Un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un producto conjugado de anticuerpofármaco descritos en el presente documento se pueden formular como un aerosol para aplicación tópica, tal como mediante inhalación (véanse, p. ej., las Patentes de Estados Unidos Núm. 4.044.126, 4.414.209 y 4.364.923, que describen aerosoles para el suministro de un esteroide útil para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, particularmente asma). Estas formulaciones para administración al tracto respiratorio pueden estar en forma de aerosol o solución para nebulizador, o como polvo microfino para insuflación, solas o combinadas con un portador inerte como la lactosa. En tal caso, las partículas de la formulación tendrán, en una realización, diámetros de menos de 50 micrómetros, en una realización de menos de 10 micrómetros.
Un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un producto conjugado de anticuerpofármaco descritos en el presente documento se pueden formular para aplicación local o tópica, tal como para aplicación tópica en la piel y membranas mucosas, tal como en el ojo, en forma de geles, cremas y lociones y para aplicación al ojo o para aplicación intracisternal o intraespinal. Se contempla la administración tópica para el suministro transdérmico y también para administración a los ojos o mucosas, o para terapias de inhalación. También se pueden administrar soluciones nasales del anticuerpo solo o combinado con otros excipientes farmacéuticamente aceptables.
Los parches transdérmicos, incluidos los dispositivos iontoforéticos y electroforéticos, son bien conocidos por los expertos en la técnica y se pueden utilizar para administrar un anticuerpo. Por ejemplo, tales parches se describen en las Patentes de Estados Unidos Núm. 6.267.983, 6.261.595, 6.256.533, 6.167.301, 6.024.975, 6.010715, 5.985.317, 5.983.134, 5.948.433, y 5.860.957.
En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un producto conjugado de anticuerpo-fármaco es un polvo liofilizado, que puede reconstituirse para administración en forma de soluciones, emulsiones y otras mezclas. También se puede reconstituir y formular en forma de sólidos o geles. El polvo liofilizado se prepara disolviendo un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un producto conjugado de anticuerpo-fármaco o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, en un disolvente adecuado. En algunas realizaciones, el polvo liofilizado es estéril. El disolvente puede contener un excipiente que mejore la estabilidad u otro componente farmacológico del polvo o solución reconstituida, preparada a partir del polvo. Los excipientes que se pueden utilizar incluyen, pero sin limitarse a, dextrosa, sorbitol, fructosa, jarabe de maíz, xilitol, glicerina, glucosa, sacarosa u otro agente adecuado. El disolvente también puede contener un tampón, tal como citrato, fosfato de sodio o potasio u otro tampón conocido por los expertos en la técnica, en una realización, a aproximadamente un pH neutro. La posterior filtración en condiciones estériles de la solución seguida de liofilización en condiciones convencionales conocidas por los expertos en la técnica proporciona la formulación deseada. En una realización, la solución resultante se distribuirá en viales para liofilización. Cada vial contendrá una dosis única o dosis múltiples del compuesto. El polvo liofilizado se puede almacenar en condiciones apropiadas, por ejemplo, entre aproximadamente 4°C y temperatura ambiente.
La reconstitución de este polvo liofilizado con agua para inyección proporciona una formulación para uso en administración parenteral. Para la reconstitución, el polvo liofilizado se añade a agua esterilizada u otro portador adecuado. La cantidad precisa depende del compuesto seleccionado. Esta cantidad puede determinarse empíricamente.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un producto conjugado de anticuerpo-fármaco se suministran en forma líquida sin necesidad de reconstitución.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente documento, o los productos conjugados de anticuerpo-fármaco descritos en el presente documento y otras composiciones proporcionadas en el presente documento también pueden formularse para dirigirse a un tejido, receptor u otra zona particular del organismo del sujeto que se vaya a tratar. Muchos de estos métodos de direccionamiento son bien conocidos por los expertos en la técnica. Todos estos métodos de direccionamiento se contemplan en el presente documento para su uso en las presentes composiciones. Para ejemplos no limitantes de métodos de direccionamiento, véanse, p. ej., las Patentes de Estados Unidos Núm. 6.316.652, 6.274.552, 6.271.359, 6.253.872, 6.139.865, 6.131.570, 6.120.751, 6.071.495, 6.060.082, 6.048.736, 6.039.975, 6.004.534, 5.985.307, 5.972.366, 5.900.252, 5.840.674, 5.759.542 y 5.709.874. En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un producto conjugado de anticuerpo-fármaco se dirigen a un tumor.
Las composiciones que se van a utilizar para la administraciónin vivopueden ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de, p. ej., membranas de filtración estériles.
5.6 Usos en métodos
5.6.1 Usos terapéuticos en métodos.
5.6.1.1 Cáncer
En un aspecto, se presentan en el presente documento un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención o una composición farmacéutica de los mismos para su uso en métodos para tratar el cáncer en un sujeto Según la invención, el método para tratar el cáncer comprende administrar a un sujeto que lo necesite un anticuerpo anti-MERTK que comprende una VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y una VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 (p. ej., anticuerpo z10). Divulgado en el presente documento, el método para tratar el cáncer puede comprender administrar a un sujeto que lo necesite un anticuerpo anti-MERTK que comprende una VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 y una VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 (p. ej., anticuerpo z11). Divulgado en el presente documento, el método para tratar el cáncer puede comprender administrar a un sujeto que lo necesite un anticuerpo anti-MERTK que comprende una VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108 y una VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 (p. ej., anticuerpo z13). Divulgado en el presente documento, el método para tratar el cáncer puede comprender administrar a un sujeto que lo necesite un anticuerpo anti-MERTK que comprende una VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 109 y una VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 (p. ej., anticuerpo z13).
También se divulgan en el presente documento métodos para tratar el cáncer en un sujeto, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite un anticuerpo quimérico anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo quimérico anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento. Divulgado en el presente documento, el método para tratar el cáncer puede comprender administrar a un sujeto que lo necesite un anticuerpo quimérico que comprende una VH que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 110 y una VL que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 111 (p. ej., anticuerpo xAb).
En otro aspecto, se presenta en el presente documento un producto conjugado de anticuerpo-fármaco o una composición farmacéutica del mismo de la presente invención para su uso en métodos para tratar el cáncer en un sujeto. En otro aspecto, se presenta en el presente documento un anticuerpo biespecífico o una composición farmacéutica del mismo de la presente invención para su uso utilizar en métodos para tratar el cáncer en un sujeto. En otro aspecto, en el presente documento se presenta un polinucleótido o un vector que codifican un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención o una composición farmacéutica de los mismos para utilizar en métodos para tratar el cáncer en un sujeto.
En una realización específica, en el presente documento se presenta una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un producto conjugado de anticuerpofármaco de la presente invención para su uso en métodos para tratar el cáncer en un sujeto.
En ciertas realizaciones, los métodos para tratar el cáncer descritos en el presente documento incluyen obtener una biopsia de tumor, una muestra de tumor o una muestra de células cancerosas de un sujeto y evaluar el nivel de expresión de MERTK (p. ej., MERTK humana) utilizando un ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica. En algunas realizaciones, el nivel de fosforilación de MERTK (p. ej., MERTK humana) por células cancerosas, una muestra de tumor o una biopsia de tumor obtenidas de un sujeto se evalúa utilizando un ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica. En algunas realizaciones, los métodos para tratar el cáncer descritos en el presente documento incluyen obtener una biopsia de tumor, una muestra de tumor o una muestra de células cancerosas de un sujeto y evaluar el nivel de MERTk mutada (p. ej., MERTK humana mutante) utilizando un ensayo descrito en el presente documento o conocido en la técnica. Se pueden utilizar mecanismos conocidos por un experto en la técnica para obtener una biopsia de tumor o una muestra de células cancerosas. En algunas realizaciones, se utiliza una Transferencia Western, un ELISA o citometría de flujo para evaluar los niveles de expresión de MERTK (p. ej., MERTK humana). En ciertas realizaciones, se utiliza una Transferencia Western o un ELISA para evaluar el nivel de fosforilación de MERTK (p. ej., MERTK humana). En algunas realizaciones, se utilizan un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, o un anticuerpo anti-MERTK conocido por un experto en la técnica (p. ej., un anticuerpo anti-MERTK descrito en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional Núm. WO 2016106221) para medir los niveles de MERTK (p. ej., MERTK humanas). En algunas realizaciones, un sujeto tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento tiene células cancerosas que expresan en exceso MERTK, células cancerosas que expresan MERTK constitutivamente activada o ambas.
En ciertas realizaciones, los métodos para tratar el cáncer descritos en el presente documento incluyen obtener PMBC de un sujeto, aislar macrófagos y evaluar el nivel de expresión de MERTK (p. ej., MERTK humana) utilizando un ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica. En algunas realizaciones, se obtienen PMBC de un sujeto, se aíslan macrófagos y se evalúan el nivel de fosforilación de la expresión de MERTK (p. ej., MERTK humana), o el nivel de MERTK mutada (p. ej., MERTK humana mutada), o ambos por los macrófagos utilizando un ensayo descrito en el presente documento o conocido por un experto en la técnica. Se pueden utilizar mecanismos conocidos por un experto en la técnica para obtener PMBC y aislar macrófagos. En algunas realizaciones, se utiliza una Transferencia Western, un ELISA o citometría de flujo para evaluar los niveles de expresión de MERTK (p. ej., MERTK humana). En ciertas realizaciones, se utiliza una Transferencia Western o un ELISA para evaluar el nivel de fosforilación de MERTK (p. ej., MERTK humana). En algunas realizaciones, se utiliza un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, o un anticuerpo anti-MERTK conocido por un experto en la técnica (p. ej., un anticuerpo anti-MERTK descrito en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional Núm. WO 2016106221) para medir los niveles de MERTK (p. ej., MERTK humana). En algunas realizaciones, un sujeto tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento tiene células cancerosas que expresan en exceso MERTK, células cancerosas que expresan MERTK constitutivamente activada o ambas.
En ciertas realizaciones, el nivel de expresión de MERTK (p. ej., MERTK humana) en células cancerosas, macrófagos o ambos se evalúa antes de tratar a un sujeto de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones, el nivel de MERTK mutada (p. ej. MERTK humana mutada) en células cancerosas se evalúa antes de tratar a un sujeto de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, se evalúan el nivel de MERTK fosforilada (p. ej., MERTK humana), así como el nivel de MERTK mutada (p. ej., MERTK humana mutada) expresadas por células cancerosas, macrófagos o ambos antes de tratar a un sujeto de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones, el nivel de expresión y fosforilación de MERTK (p. ej., MERTK humana) en células cancerosas, macrófagos o ambos se evalúa antes de tratar a un sujeto de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento.
En ciertas realizaciones, el nivel de expresión de MERTK (p. ej., MERTK humana) en células cancerosas, macrófagos o ambos se evalúa mientras se trata a un sujeto de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento para evaluar la eficacia del tratamiento. En algunas realizaciones, se evalúa el nivel de MERTK fosforilada (p. ej., MERTK humana) expresada por células cancerosas, macrófagos o ambos mientras se trata a un sujeto de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento para evaluar la eficacia del tratamiento. En algunas realizaciones, el nivel de MERTK mutada (p. ej., MERTK humana mutada) se evalúa mientras se trata a un sujeto de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento para evaluar la eficacia del tratamiento. En ciertas realizaciones, se evalúan el nivel de expresión y fosforilación de MERTK (p. ej., MERTK humana) así como el nivel de MERTK mutada (p. ej., MERTK humana mutada) en células cancerosas, macrófagos o ambos mientras se trata a un sujeto de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento para evaluar la eficacia del tratamiento.
En realizaciones específicas, la administración de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, o el producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionados en el presente documento, o una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento a un sujeto con cáncer logra al menos uno, dos, tres, cuatro o más de los siguientes efectos: (i) la reducción o mejora de la gravedad de uno o más síntomas de cáncer; (ii) la reducción de la duración de uno o más síntomas asociados con el cáncer; (iii) la prevención en la recurrencia de un síntoma asociado con el cáncer; (iv) la reducción de la hospitalización de un sujeto; (v) una reducción de la duración de la hospitalización; (vi) el aumento de la supervivencia de un sujeto; (vii) la potenciación o mejora del efecto terapéutico de otra terapia; (viii) la inhibición del desarrollo o aparición de uno o más síntomas asociados con el cáncer; (ix) la reducción del número de síntomas asociados al cáncer; (x) la mejora de la calidad de vida evaluada mediante métodos bien conocidos en la técnica; (x) la inhibición de la recurrencia de un tumor; (xi) la regresión de tumores y/o uno o más síntomas asociados a los mismos; (xii) la inhibición de la progresión de tumores y/o uno o más síntomas asociados a los mismos; (xiii) una reducción del crecimiento de un tumor; (xiv) una disminución en el tamaño del tumor (p. ej., volumen o diámetro); (xv) una reducción en la formación de un tumor recién formado; (xvi) prevención, erradicación, extirpación o control de tumores primarios, regionales y/o metastásicos; (xvii) una disminución del número o tamaño de las metástasis; (xviii) una reducción de la mortalidad; (xix) un aumento de la supervivencia libre de recaídas; (xx) el tamaño del tumor se mantiene y no aumenta o aumenta menos que el aumento de un tumor después de la administración de una terapia convencional medida por métodos convencionales disponibles para un experto en la técnica, tales como generación de imágenes por resonancia magnética (MRI), MRI dinámica con contraste (DCE-MRI), rayos X y tomografía computarizada (CT), o una tomografía por emisión de positrones (PET); y/o (xxi) un aumento de la duración de la remisión en los pacientes.
En algunas realizaciones, un método para tratar el cáncer como se describe en el presente documento da como resultado uno, dos, tres o más de los siguientes efectos: respuesta completa, respuesta parcial, respuesta objetiva, aumento de la supervivencia general, aumento de la supervivencia libre de enfermedad, aumento de la tasa de respuesta objetiva, aumento del tiempo hasta la progresión, enfermedad estable, aumento de la supervivencia libre de progresión, aumento del tiempo hasta el fracaso del tratamiento y mejora o eliminación de uno o más síntomas de cáncer. En una realización específica, un método para tratar el cáncer como se describe en el presente documento da como resultado un aumento de la supervivencia general. En otra realización específica, un método para tratar el cáncer como se describe en el presente documento da como resultado un aumento de la supervivencia libre de progresión. En otra realización específica, un método para tratar el cáncer como se describe en el presente documento da como resultado un aumento de la supervivencia general y un aumento de la supervivencia libre de progresión.
En una realización específica, respuesta completa tiene el significado que entiende un experto en la técnica. En una realización específica, respuesta completa se refiere a la desaparición de todos los signos de cáncer en respuesta al tratamiento. Una respuesta completa puede no significar que el cáncer se haya curado, sino que el paciente esté en remisión. En una realización específica, el cáncer colorrectal está en remisión completa si la enfermedad clínicamente detectable no se detecta mediante técnicas conocidas tales como estudios radiográficos, médula ósea y biopsia o mediciones de proteínas.
En una realización específica, respuesta parcial tiene el significado entendido por un experto en la técnica. Por ejemplo, una respuesta parcial puede referirse a una disminución del tamaño del cáncer colorrectal en el cuerpo humano en respuesta al tratamiento. En una realización específica, una respuesta parcial se refiere a al menos aproximadamente una disminución de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% en toda la carga tumoral medible (p. ej., el número de células malignas presentes en el sujeto, o el volumen medido de masas tumorales o la cantidad de proteína monoclonal anormal) en ausencia de nuevas lesiones.
En una realización específica, supervivencia global tiene el significado que entiende un experto en la técnica. En una realización específica, la supervivencia global se refiere al período de tiempo desde la fecha del diagnóstico o el inicio del tratamiento para el cáncer colorrectal, en el que el sujeto humano diagnosticado de cáncer colorrectal todavía está vivo. La demostración de una mejora estadísticamente significativa en la supervivencia general puede considerarse clínicamente significativa si el perfil de toxicidad es aceptable y, a menudo, ha respaldado la aprobación de nuevos medicamentos.
Varios criterios de valoración suelen basarse en evaluaciones de tumores. Estos criterios de valoración incluyen supervivencia libre de enfermedad (SLE), tasa de respuesta objetiva (RO), tiempo hasta la progresión (TP), supervivencia libre de progresión (SLP) y tiempo hasta el fracaso del tratamiento (TF). La recopilación y el análisis de datos sobre estos criterios de valoración dependientes del tiempo a menudo se basan en evaluaciones, cálculos y estimaciones indirectas (p. ej., mediciones del tumor).
En una realización específica, supervivencia libre de enfermedad (SLE) tiene el significado entendido por un experto en la técnica. En una realización específica, la supervivencia libre de enfermedad puede referirse al período de tiempo después de finalizar el tratamiento primario para el cáncer colorrectal en el que el sujeto humano sobrevive sin ningún signo o síntoma de cáncer. La SLE puede ser un criterio de valoración importante en situaciones en las que la supervivencia puede prolongarse, lo que hace que un criterio de valoración de supervivencia no sea práctico. La SLE puede ser un sustituto del beneficio clínico o puede proporcionar evidencia directa de beneficio clínico. Esta determinación generalmente se basa en la magnitud del efecto, su relación riesgo-beneficio y el entorno de la enfermedad. La definición de SLE puede ser complicada, particularmente cuando las muertes se registran sin documentación previa de la progresión tumoral. Estos eventos pueden calificarse como recurrencias de la enfermedad o como eventos censurados. Aunque todos los métodos de análisis estadístico de muertes tienen algunas limitaciones, considerar todas las muertes (muertes por todas las causas) como recurrencias puede minimizar el sesgo. La SLE puede sobreestimarse utilizando esta definición, especialmente en pacientes que mueren después de un largo período sin observación. Se puede introducir sesgo si la frecuencia de las visitas de seguimiento a largo plazo es diferente entre los brazos del estudio o si los abandonos no son aleatorios debido a la toxicidad.
En una realización específica, tasa de respuesta objetiva tiene el significado que entiende un experto en la técnica. En una realización, una tasa de respuesta objetiva se define como la proporción de pacientes con una reducción del tamaño del tumor de una cantidad predefinida y durante un período de tiempo mínimo. La duración de la respuesta puede medirse desde el momento de la respuesta inicial hasta la progresión tumoral documentada. Generalmente, la FDA ha definido la RO como la suma de respuestas parciales más respuestas completas. Cuando se define de esta manera, la RO es una medida directa de la actividad antitumoral del fármaco, que puede evaluarse en un estudio de un solo brazo. Si están disponibles, se deben utilizar criterios normalizados para determinar la respuesta. Se ha considerado apropiado una variedad de criterios de respuesta (p. ej., criterios RECIST1.1) (Véase p. ej., Eisenhoweret al.,2009, European J. of Cancer, 45: 228-247)). La importancia de la RO se evalúa por su magnitud y duración, y el porcentaje de respuestas completas (sin evidencia detectable de tumor).
En una realización específica, tiempo hasta la progresión (TP) tiene el significado que entiende un experto en la técnica. En una realización específica, el tiempo hasta la progresión se refiere al período de tiempo desde la fecha del diagnóstico o el inicio del tratamiento para el cáncer colorrectal hasta que el cáncer empeora o se propaga a otras partes del organismo humano.
En una realización específica, el TP es el tiempo desde la aleatorización hasta la progresión objetiva del tumor; el TP no incluye muertes.
En una realización específica, supervivencia libre de progresión (SLP) tiene el significado entendido por un experto en la técnica. En una realización específica, la SLP se refiere al período de tiempo durante y después del tratamiento del cáncer colorrectal que el paciente humano vive con el cáncer, pero no empeora. En una realización específica, la SLP se define como el tiempo desde la aleatorización hasta la progresión objetiva del tumor o la muerte. La SLP puede incluir muertes y, por lo tanto, puede correlacionarse mejor con la supervivencia general.
En una realización específica, tiempo hasta el fracaso del tratamiento (TF) tiene el significado que entiende un experto en la técnica. En una realización específica, TF es un criterio de valoración compuesto que mide el tiempo desde la aleatorización hasta la interrupción del tratamiento por cualquier motivo, incluida la progresión de la enfermedad, la toxicidad del tratamiento y la muerte.
En una realización específica, enfermedad estable se refiere a cáncer colorrectal que no disminuye ni aumenta en extensión o gravedad.
En una realización específica, los criterios RECIST 1.1 se utilizan para medir qué tan bien responde un sujeto humano a los métodos de tratamiento descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones, el cáncer tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento es un cáncer de cabeza y cuello, pulmón, mama, hueso, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado, gástrico, parótida, tracto biliar, colon, recto, cuello uterino, útero, endometrio, riñón, vejiga, próstata o tiroides. En algunas realizaciones, el cáncer es un sarcoma, carcinoma de células escamosas, melanoma, glioma, glioblastoma, neuroblastoma, carcinoma de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal o sarcomas de Kaposi. En algunas realizaciones, el cáncer es una leucemia o un linfoma. En algunas realizaciones, el cáncer es mieloma múltiple. En algunas realizaciones, el cáncer tratado según los métodos es metastásico.
En una realización específica, el cáncer tratado según los métodos descritos en el presente documento es cáncer de mama. En una realización particular, el cáncer tratado según los métodos descritos en el presente documento es cáncer de mama triple negativo. El cáncer de mama triple negativo se refiere a cualquier tumor o célula derivada o que crece en el tejido mamario que no expresa los genes Her2 (también conocido como Neu), el Receptor de Estrógeno (también conocido como RE) o el Receptor de Progesterona (también conocido como RP).
En otra realización específica, el cáncer tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento es leucemia mielógena aguda. En otra realización específica más, el cáncer tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento es leucemia linfocítica aguda.
En ciertas realizaciones, las células cancerosas del cáncer tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento expresan en exceso MERTK. En una realización específica, MERTK es constitutivamente activa en las células cancerosas del cáncer tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento.
En ciertas realizaciones, el cáncer tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento está asociado con MERTK constitutivamente activa. En otra realización específica, el cáncer tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento está asociado con la expresión en exceso de MERTK. En otra realización específica, el cáncer tratado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento está asociado con la expresión en exceso de MERTK que es constitutivamente activa.
Como se empelan en el presente documento, los términos "sujeto" y "paciente" se utilizan indistintamente. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero tal como un primate (p. ej., mono o ser humano), lo más preferiblemente un ser humano.
En una realización específica, un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a MERTK humana, p. ej., anticuerpo z10, o un producto conjugado de anticuerpo-fármaco se administran a un sujeto. En ciertas realizaciones, se administran a un sujeto dos o más anticuerpos diferentes o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a MERTK humana, descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK o fragmentos de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento que se unen específicamente a MERTK humana, descritos en el presente documento, se administran a un sujeto combinados con una o más terapias diferentes (véase la Sección 5.4.2, más abajo).
En ciertas realizaciones, se administran a un sujeto dos o más productos conjugados de anticuerpo-fármaco diferentes. En algunas realizaciones, se administra un producto conjugado de anticuerpo-fármaco a un sujeto combinado con una o más terapias diferentes. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-MERTK (p. ej., un anticuerpo humanizado) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un producto conjugado de anticuerpo-fármaco se administran a un sujeto combinados con una o más terapias diferentes (véase la Sección 5.4.2, más abajo). En realizaciones específicas, las una o más terapias diferentes son terapias anticancerosas.
5.6.1.2 Vías de administración y dosificación
Un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo quimérico anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un producto conjugado de anticuerpo-fármaco descritos en el presente documento, o una composición farmacéutica descrita en el presente documento, se pueden suministrar a un sujeto mediante una variedad de vías. Estas incluyen, pero sin limitarse a, las vías parenteral, intranasal, intratraqueal, oral, intradérmica, tópica, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, intravenosa, intratumoral, conjuntiva, intratumoral y subcutánea. También se puede emplear la administración pulmonar, p. ej., mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente aerosolizante para uso como aerosol. En una realización, se administra por vía parenteral a un sujeto un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un producto conjugado de anticuerpo-fármaco, o una composición farmacéutica. En una realización específica, dicha administración parenteral es intravenosa, intramuscular o subcutánea.
La cantidad de un anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo, o un producto conjugado de anticuerpo-fármaco, o composición farmacéutica que será eficaz en el tratamiento y/o prevención de una afección dependerá de la naturaleza de la enfermedad, y se puede determinar mediante técnicas clínicas convencionales.
La dosis precisa de un anticuerpo anti-MERTK o de un fragmento de unión a antígeno del mismo, o del producto conjugado de anticuerpo-fármaco que se empleará en una composición farmacéutica, también dependerá de la vía de administración y del tipo de cáncer, y deberá decidirse según el juicio del facultativo y las circunstancias de cada sujeto. Por ejemplo, las dosis efectivas también pueden variar dependiendo del medio de administración, el sitio objetivo, el estado fisiológico del paciente (incluyendo edad, peso corporal y salud), si el paciente es humano o animal, otros medicamentos administrados o si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Las dosificaciones del tratamiento se ajustan de manera óptima para optimizar la seguridad y la eficacia.
En ciertas realizaciones, se emplea un ensayoin vitropara ayudar a identificar los rangos de dosificación óptimos. Las dosis efectivas se pueden extrapolar a partir de curvas dosis-respuesta obtenidas a partir de sistemas de pruebain vitroo de modelos animales.
Para un anticuerpo (o un fragmento de unión a antígeno del mismo) o productos conjugados de anticuerpo-fármaco, la dosificación oscila entre aproximadamente 0,0001 y 100 mg/kg, y más habitualmente entre 0,01 y 15 mg/kg, del peso corporal del paciente. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal, 10 mg/kg de peso corporal, o dentro del rango de 1-10 mg/kg o, en otras palabras, 70 mg o 700 mg o dentro del rango de 70-700 mg., respectivamente, para un paciente de 70 kg. En algunas realizaciones, la dosificación administrada al paciente es de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg del peso corporal del paciente.
Un régimen de tratamiento ilustrativo implica la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses durante un período de un año o durante varios años, o durante intervalos de varios de años. En algunos métodos, se administran simultáneamente a un sujeto dos o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos con diferentes especificidades de unión. Generalmente se administra en múltiples ocasiones un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un producto conjugado de anticuerpofármaco. Los intervalos entre dosificaciones únicas pueden ser semanales, mensuales, cada 3 meses, cada 6 meses o anualmente.
5. 6. 1. 3 Terapias combinadas
En un aspecto específico, los métodos para tratar el cáncer descritos en el presente documento comprenden adicionalmente administrar una o más terapias diferentes, tales como terapias anticancerosas (p. ej., cirugía, radiación, quimioterapia o un agente terapéutico adicional). En una realización específica, los métodos para tratar el cáncer en un sujeto, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un producto conjugado de anticuerpofármaco proporcionado en el presente documento, comprenden adicionalmente administrar al sujeto uno o más agentes terapéuticos adicionales. En una realización específica, el agente terapéutico adicional es para tratar el cáncer. En una realización específica, el agente terapéutico adicional es para tratar cualquier efecto secundario del tratamiento con un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un producto conjugado de anticuerpo-fármaco proporcionados en el presente documento.
En realizaciones específicas, el agente adicional es un agente utilizado para tratar el cáncer de mama, un agente utilizado para tratar el melanoma, una inmunoterapia o un inhibidor de la angiogénesis.
En una realización específica, el agente terapéutico adicional es un agente utilizado para tratar el cáncer de mama que se selecciona del grupo que consiste en Tamoxifeno, Raloxifeno, Paclitaxel (TAXOL®), Ciclofosfamida, Docetaxel, Vinblastina, Fluorouracilo, Everolimus, Trastuzumab, Trastuzumab-Emtansina, Pertuzumab y Ditosilato de Lapatinib. En una realización específica, el agente terapéutico adicional es un agente utilizado para tratar el melanoma que se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de BRAF, un inhibidor de MEK y Dacarbazina.
En una realización específica, el agente terapéutico adicional es un agente que bloquea la señalización de puntos de control inmunológico. En realizaciones específicas, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo bloqueador anti-CTLA-4, un anticuerpo bloqueador anti-PD-1 o un anticuerpo bloqueador anti-PD-L1.
En una realización específica, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la angiogénesis que se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de VEGF, un inhibidor de VEGFR2, Sunitinib y Sorafenib.
En otras realizaciones, el agente terapéutico adicional es un agente enumerado en la Tabla 32.
Tabla 32: Agentes terapéuticos adicionales para uso en terapia combinada con anticuerpos contra MERTK o fragmentos de unión a antígeno de los mismos
albúmina 32P (Isotope Solutions) apaziquona (Spectrum
A
In
A
En una realización específica, un método para tratar el cáncer que comprende administrar un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo a un sujeto, puede comprender adicionalmente administrar un anticuerpo anti-PD1 (p. ej., pembrolizumab, cemiplimab, pidilizumab o nivolumab), un anticuerpo anti-PD-L1 (p. ej., atezolizumab avelumab, durvaniab, BMS-936552 o CK-301), un anticuerpo anti-LAG3, un anticuerpo agonista anti-GITR, un anticuerpo anti-TGF-beta, un anticuerpo agonista anti-OX 40, una terapia CAR-T (p. ej., Kymriah, JCar017 o Yescarta), RGX-104 o RGX-202.
Un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un producto conjugado de anticuerpofármaco descritos en el presente documento se pueden administrar con un agente terapéutico adicional de forma concurrente o secuencial (antes y/o después). El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y el agente terapéutico adicional, o el producto conjugado de anticuerpo-fármaco y el agente terapéutico adicional se pueden administrar en la misma o diferentes composiciones, y por las mismas o diferentes vías de administración. Se puede administrar una primera terapia (que es un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un producto conjugado de anticuerpo-fármaco descritos en el presente documento, o el agente terapéutico adicional) antes de (p. ej., 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), concomitantemente o después de (p. ej., 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas después) de la administración de la segunda terapia (el anticuerpo anti-MERTK o fragmento de unión a antígeno del mismo o el producto conjugado de anticuerpo-fármaco descritos en el presente documento, o el agente terapéutico adicional) a un sujeto con cáncer. En ciertas realizaciones, un agente terapéutico adicional administrado a un sujeto combinado con un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un producto conjugado de anticuerpo-fármaco se administran en la misma composición (composición farmacéutica). En otras realizaciones, un agente terapéutico adicional administrado combinado con un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un producto conjugado de anticuerpo-fármaco se administran a un sujeto en una composición diferente que el anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo o el producto conjugado de anticuerpo-fármaco (p. ej., se utilizan dos o más composiciones farmacéuticas).
5.7 Kits
También se divulgan en el presente documento kits que comprenden uno o más anticuerpos o productos conjugados de anticuerpo-fármaco descritos en el presente documento, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En un ejemplo específico, se proporciona en el presente documento un paquete o kit farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes cargados con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento, tales como uno o más anticuerpos o un fragmento de unión a antígeno de los mismos o uno o más productos conjugados de anticuerpo-fármaco descritos en el presente documento. En algunos ejemplos, los kits contienen una composición farmacéutica descrita en el presente documento y un agente profiláctico o terapéutico.
Opcionalmente asociado con tales recipientes puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, una forma de dosificación y/o instrucciones para su uso. En ciertos ejemplos, las instrucciones incluidas con el kit proporcionan orientación con respecto a las cantidades de dosificación y/o regímenes de dosificación para la administración de la composición o composiciones farmacéuticas.
Los ejemplos de materiales de envasado farmacéutico incluyen, pero sin limitarse a, blísteres, frascos, paquetes, bolsitas, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, viales, recipientes, jeringas y cualquier material de envasado adecuado para una composición farmacéutica seleccionada y modo de administración y tratamiento previsto.
Los kits divulgados en el presente documento pueden incluir adicionalmente dispositivos que se utilizan para administrar los ingredientes activos. Los ejemplos de tales dispositivos incluyen, pero sin limitarse a, jeringas, inyectores sin aguja, bolsas de goteo, parches e inhaladores.
Los kits divulgados en el presente documento pueden incluir adicionalmente vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden utilizarse para administrar los ingredientes. Por ejemplo, si un ingrediente se proporciona en una forma sólida que debe reconstituirse para administración parenteral, el kit puede comprender un recipiente sellado de un vehículo adecuado en el que el ingrediente puede disolverse para formar una solución estéril libre de partículas que sea adecuada para administración parenteral o puede reconstituirse como una suspensión para administración oral. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitarse a: vehículos acuosos que incluyen, pero sin limitarse a, Agua para Inyectables USP, Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Dextrosa, Inyección de Dextrosa y Cloruro de sodio e Inyección de Ringer con lactato añadido; vehículos miscibles con agua que incluyen, pero sin limitarse a, alcohol etílico, polietilenglicol y polipropilenglicol; y vehículos no acuosos que incluyen, pero sin limitarse a, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, oleato de etilo, miristato de isopropilo y benzoato de bencilo.
En algunos ejemplos, un kit descrito en el presente documento incluye un reactivo (p. ej., un anticuerpo anti-MERTK o un fragmento de unión a antígeno del mismo descritos en el presente documento, o un anticuerpo anti-MERTK conocido por un experto en la técnica (p. ej., un anticuerpo anti-MERTK descrito en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional Núm. WO 2016106221)) para medir los niveles de MERTK (p. ej., MERTK humana) en las células (p. ej., células cancerosas, macrófagos o ambos) de un sujeto antes y/o durante el tratamiento del sujeto de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. En ciertos ejemplos, un kit descrito en el presente documento incluye uno o más reactivos para medir el nivel de MERTK fosforilada (p. ej., MERTK humana) por células (p. ej., células cancerosas, macrófagos o ambos) de un sujeto que se vaya a tratar de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. En ciertos ejemplos, un kit descrito en el presente documento incluye uno o más reactivos para medir el nivel de MERTK mutada (p. ej., MERTK humana) por células (p. ej., células cancerosas, macrófagos o ambos) de un sujeto que se vaya a tratar de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. En algunos ejemplos, un kit incluye información que guía a un médico especialista/médico de cabecera con respecto a la lectura de uno, dos o todos los siguientes: nivel de expresión de MERTK (p. ej., MERTK humana), nivel de MERTK fosforilada (p. ej., MERTK humana), niveles de MERTK mutada (p. ej., MERTK humana).
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
6. Ejemplos
6.1. Ejemplo 1: Generación de un anticuerpo específico humanizado, de alta afinidad, específico para MERTK humana
Este ejemplo describe un anticuerpo monoclonal que conduce a la degradación de MERTK de la superficie celular mediante internalización.
6.1.1. Humanización, expresión y purificación de anticuerpos candidatos.
Para generar anti-MERTK humanizado, las regiones marco de cadena pesada y cadena ligera de un subclón del anticuerpo M6, se utiliza un anticuerpo anti-MERTK murina divulgado en la Patente de Estados Unidos Núm.
10.221.248 fueron reemplazadas por regiones marco de cadena pesada y cadena ligera humanas, respectivamente, opcionalmente con una o más retromutaciones. Las combinaciones de cadenas pesadas (S24, S25, S26, S27, S28, S29, S30, S31) y cadenas ligeras (S32, S33) produjeron 16 anticuerpos humanizados en total. Los anticuerpos humanizados candidatos se expresaron en células HEK-293 o células 293 F y la expresión se confirmó mediante electroforesis en gel (datos no mostrados). Estaba presente una banda con el tamaño esperado de aproximadamente 150 kD para los anticuerpos humanizados z1 a z16, así como para xAb (un anticuerpo quimérico, calle 17) y dos líneas de hibridoma (HyAb 1 y HyAb2, calles 18 y 19). La afinidad de unión de los anticuerpos candidatos contra MERTK humana se midió mediante SPR. Los resultados de SPR se resumen en la Fig.1. Los valores de la constante de disociación (Kd) inferiores a 1*10'6 en la Fig. 1 indican que la Kd está por debajo del límite de detección del aparato. Con respecto a la región de cadena ligera variable, se encontró que la retromutación del cuarto resto (serina, S) en la región marco 3 (según la definición de Exemplary) de la región de cadena ligera variable a ácido aspártico (D) estaba asociada con un aumento de la afinidad de unión de los anticuerpos humanizados a MERTK humana. Con respecto a la región variable de la cadena pesada, se encontró que la retromutación del resto 27o (tirosina, T, penúltimo resto) estaba asociada con una menor afinidad de unión de los anticuerpos humanizados a MERTK humana. Como se muestra en la Fig. 2, la combinación de la región variable de la cadena pesada con las regiones marco para z10, z11 y z13 y la región variable de la cadena ligera con la región marco para z10, z11 y z13, que son idénticas, dio como resultado anticuerpos humanizados con una mayor afinidad que cuando se combinaron la cadena pesada de la región variable con la región marco para z10, z11 y z13 con una cadena ligera de la región variable con las regiones marco en la Tabla 33 más abajo.
La Tabla 34, más abajo, proporciona la avidez de los anticuerpos z10, z11 y z13 mediante SPR. La Tabla 34, más abajo, proporciona la afinidad del anticuerpo z10 utilizando SPR y los ensayos basados en células ELISA. Con respecto a las mediciones de avidez y afinidad utilizando SPR, se utilizaron los protocolos siguientes. El anticuerpo z10 utilizado en este estudio comprende las cadenas pesadas y ligeras expuestas en las Tablas 16. El anticuerpo z11 utilizado en este estudio comprende las cadenas pesadas y ligeras expuestas en las Tablas 17. El anticuerpo z13 utilizado en este estudio comprende las cadenas pesadas y ligeras expuestas en las Tablas 18.
Medición de afinidad de z10 por MERTK humana utilizando SPR
Se activó un chip sensor CM5 durante 420 s con una mezcla de EDC 400 mM y NHS 100 mM. A continuación, se inyectaron 30 ^g/mL de anticuerpo IgG anti-Fc humano (Jackson, 109-005-098) en NaAc 10 mM (pH 4,5) durante 420 s a un caudal de 10 ^l/min. El chip se desactivó con etanolamina-HCl 1 M. Se inyectaron 5 ^g/mL de anticuerpo z10 en tampón de migración (1 x HBS-EP+) a un caudal de 10 ^l/min durante 15 s. Se inyectaron 6 concentraciones (2,78, 5,56, 11,11,22,22, 44,44 y 88,88 nM) del dominio MERTK extracelular (W3725-hPro1, Sino Biological, 10298-HCCH) y tampón de migración a un caudal de 30 ^L/min para una fase de asociación de 180 s, seguida de 600 s de disociación. Se inyectó glicina 10 mM pH 1,5 como tampón de regeneración después de cada fase de disociación. El chip se regeneró con glicina 10 mM, pH 1,5. Se utilizó un canal de superficie (sin ligando capturado) como superficie de control para la resta de referencia. Los datos finales de cada interacción se dedujeron de los datos del canal de referencia y del canal de tampón. Los datos experimentales de la unión del anticuerpo z10 a W3725-hPro1 se ajustaron mediante el modo de unión 1:1. Se utilizó un peso molecular de 54 kDa para calcular la concentración molar del analito.
Medición de la avidez de z10, z11 y z13 por MERTK humana utilizando SPR
El activador se preparó con una mezcla de EDC 400 mM y NHS 100 mM inmediatamente antes de la inyección. El chip sensor CM5 se activó durante 420 s con la mezcla. A continuación, se inyectaron 5 ^g/mL de quimera rhMer/Fc (R&D Systems, 8910MR) en NaAc 10 mM (pH 4,5) durante 30 s a un caudal de 10 ^l/min. El chip se desactivó con etanolamina-HCl 1 M. Los anticuerpos Z10, z11 y z13 se diluyeron con tampón de migración (1 x HBS-EP+). Se inyectaron 8 concentraciones (0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 y 40 nM) de los anticuerpos y el tampón de migración a un caudal de 30 ^L/min durante una fase de asociación de 240 s, seguida de 4800 s de disociación. Se inyectó glicina 10 mM pH 1,5 como tampón de regeneración después de cada fase de disociación. El chip se regeneró con glicina 10 mM, pH 1,5. Se utilizó un canal de superficie sin ligando de captura como superficie de control para la resta de referencia. Los datos finales de cada interacción se dedujeron de los datos del canal de referencia y del canal de tampón. Los datos experimentales de los anticuerpos que se unen a la quimera rhMer/Fc se ajustaron mediante el modo de unión 1:1. Se eliminaron las curvas de anticuerpos de 40 nM y 0,3125 nM para permitir un mejor ajuste. Se utilizó un peso molecular de 150 kDa para calcular la concentración molar de los anticuerpos.
Tabla 33: Regiones marco de cadena pesada de S32
Tabla 34: Avidez y afinidad de los anticuerpos z10, z11 y z13 utilizando SPR
Debido a su alta afinidad por MERTK, se seleccionaron z10, z11 y z13 para estudios adicionales. Los anticuerpos se purificaron utilizando proteína A y se analizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución con exclusión por tamaño (SEC HPLC). La Fig. 2 muestra un resumen del análisis de pureza de los cuatro anticuerpos. Se utilizó SDS-PAGE para caracterizar los cuatro anticuerpos. Como se esperaba, fueron visibles bandas de 150 kDa, 50 kDa y 25 kDa en el gel, lo que sugiere que los anticuerpos son normales.
6.2. Ejemplo 2: Actividad de un Anticuerpo anti-MERTK humanizado
Este ejemplo demuestra que un anticuerpo humanizado particular se une específicamente a MERTK humana y no se une al dominio extracelular de Axl humana, Tyro3 humana o MERTK murina. Este ejemplo también demuestra que un anticuerpo humanizado que se une específicamente a MERTK humana bloquea la activación inducida por Gas6 e inhibe la formación de colonias de células cancerosasin vitro.Adicionalmente, el ejemplo demuestra que un anticuerpo humanizado que se une específicamente a MERTK humana reduce la expresión de MERTK humana en la superficie de células cancerosas y macrófagos al inducir la internalización y degradación de MERTK humana.
6.2.1. Materiales y métodos
Líneas celulares, anticuerpos y reactivos
Las células SKMEL5 se obtuvieron de ATCC (atcc, HTB-70) y se cultivaron en Medio Esencial Mínimo de Eagle (EMEM) complementado con FBS al 10%, penicilina y estreptomicina a 37°C con CO<2>al 5%. Los anticuerpos para citometría de flujo se obtuvieron de las siguientes fuentes: anti-MERTK (Biolegend, 367603), anti-CD86 (ThermoFisher, 12-0869-41) y anti-CD163 (ThermoFisher, 17-1639-41). El Colorante de Viabilidad Fijable (eFluor 780) se obtuvo de Thermofisher. Los anticuerpos para transferencias Western se obtuvieron de las siguientes fuentes: anti-MERTK (abcam, ab52968), anti-AKT (abcam, ab32505), anti-AKT1 fosfo S473 (abcam, ab81283), anti-p-Actina (Sigma, A5316), y anti-a-Tubulina (Sigma, T5168).
Ensayo de unión a la superficie celular
Z10 y el control de IgG humana (R&D Systems, 1-001-A) se marcaron con el Kit de Marcaje de IgG Humana Zenon Allophycocyanin (APC) (ThermoFisher, Z25451) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se recogieron células SKMEL5 con tripsina, se lavaron dos veces con PBS y se filtraron a través de un filtro de 70 pm. Se resuspendieron 50.000 células en 60 pl de tampón FACS (BSA al 2%, EDTA 10 mM, HEPES 25 mM, azida sódica al 0,1% en PBS sin Ca/Mg) que contenía suero AB humano al 10% (Sigma, H4522). Las células se tiñeron con DAPI (500 ng/mL) y Z10 o control de IgG marcados con APC a concentraciones que oscilaban entre 0,002 y 13,5 pg/mL (0,13 a 90 nM) durante 20 minutos sobre hielo, después se lavaron dos veces con tampón FACS y se sometieron a análisis mediante un citómetro de flujo (BD LSR Fortessa). Las señales de APC de células individuales vivas se analizaron en FlowJo y las IMF se trazaron con GraphPad Prism. Se utilizaron muestras de control de un solo color para crear una matriz de compensación.
Ensayo de internalización
Z10 y el control de IgG humana (R&D Systems) se marcaron con pHrodo Red, un colorante sensible al pH, utilizando el Kit de Marcaje a Microescala pHrodo Red (ThermoFisher, Núm. Cat.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La internalización del anticuerpo se determinó mediante citometría de flujo que detecta la fluorescencia de pHrodo, que es mínima a pH neutro y máxima en ambientes ácidos, tales como los lisosomas. Se sembraron un millón de SKMEL5 en placas de 6 pocillos y se incubaron con 1 pg/mL de anticuerpos Z10 o control IgG marcados con pHrodo durante 1, 3, 6 o 24 horas. Las células se recogieron con Tampón de Disociación Celular (ThermoFisher), se lavaron dos veces, se filtraron a través de un filtro de 70 pm y se resuspendieron en 200 pl de tampón FACS (BSA al 2%, EDTA 10 mM, HEPES 25 mM, azida sódica al 0,1% en PBS libre de Ca/Mg) que contenía suero AB humano al 10%. Las células se tiñeron secuencialmente con anticuerpos conjugados con BV421 contra MERTK durante 20 minutos sobre hielo y después se tiñeron con Colorante de Viabilidad Fijable (eFluor 780) durante 20 minutos sobre hielo. Se adquirieron 5000 imágenes multiespectrales de eventos para cada muestra mediante el Citómetro de Flujo de Imágenes ImageStream (Aminis). Se utilizaron muestras de control de un solo color para crear una matriz de compensación y los datos compensados resultantes se analizaron mediante el soporte lógico IDEA (Amnis) y GraphPad Prism.
Cultivo celular derivado de PBMC y diferenciación de macrófagos.
Se prepararon células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de capas leucocitarias de donantes sanos mediante centrifugación en gradiente de densidad Histopaque-1077 (Sigma, 10771) a 250 * g a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se recogió la capa intermedia que contenía PBMC y las células se lavaron con PBS con EDTA 2 mM tres veces. Se aislaron monocitos humanos a partir de PBMC mediante separación magnética utilizando el Kit de Aislamiento de Monocitos Clásicos humanos (Miltenyi, 130-117-337) según las instrucciones del fabricante. Se cultivaron 2,5*105 monocitos en placas de 24 pocillos en medio RPMI 1640 (Gibco, 11875093) que contenía suero AB humano al 10%, FBS al 10%, L-glutamina, penicilina y estreptomicina a 37°C con CO<2>al 5%. Los monocitos se trataron durante 24 horas con 1 pg/mL de Z10 o control de IgG y se recogió el sobrenadante para el análisis de citocinas. Para diferenciar los macrófagos M1 o M2, los monocitos se incubaron con GM-CSF (100 ng/mL; Miltenyi, 130-093-864) o M-CSF (50 ng/mL; Miltenyi, 130-096-485) durante 7 días, respectivamente, y se evaluó el efecto de Z10 sobre la diferenciación mediante cultivo en presencia de 0,3 a 1 pg/mL de Z10 o IgG durante todo el tiempo de diferenciación. Para determinar el efecto sobre la producción de citocinas de los macrófagos M2, el medio de cultivo se reemplazó por medio X-Vivo15 sin suero (Lonza, 04-418Q) con M-CSF (50 ng/mL) el Día 5 de diferenciación y se trató con 1 pg/mL de Z10 o IgG durante 48 horas, como se indica. Para medir las citocinas, se recolectaron sobrenadantes de cultivos celulares y se enviaron a Eve Technologies, Canadá, para el análisis en matrices de Citocinas/Quimiocinas Humanas (HD42).
Análisis de moléculas de superficie en macrófagos.
Los macrófagos polarizados se recogieron con Tampón de Disociación Celular (ThermoFisher), se lavaron dos veces, se filtraron a través de un filtro de 70 pm y se resuspendieron en tampón FACS (BSA al 2%,<e>D<t>A 10 mM, HEPES 25 mM, azida sódica al 0,1% en PBS libre de Ca/Mg) que contenía suero AB humano al 10%. Las células se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluoróforo contra ME<r>T<k>(BV421), CD86 (PE) y CD163 (APC) durante 20 minutos sobre hielo, y después con Colorante de Viabilidad Fijable (eFluor 780) durante 20 minutos sobre hielo. Las señales de fluorescencia se adquirieron con un citómetro de flujo (BD LSR Fortessa) y se analizaron con FlowJo y GraphPad Prism. Se utilizaron muestras de control de un solo color para crear una matriz de compensación.
Ensayo de proliferación
Se sembraron células SKMEL5 a razón de 2.000 células/pocillo en una placa de ensayo de 96 pocillos con Z10 o control de IgG a concentraciones de 0,1, 0,3, 0,9, 2,7, 8,1 y 24,3 pg/mL. Después de 72 horas de cultivo, la proliferación celular se determinó mediante el Kit de Ensayo de Proliferación Celular WST-8 (Cayman Chemical, 10010199). Las células se incubaron con la mezcla WST-8 durante 1 hora y la densidad óptica se leyó a 450 nm utilizando el Lector de Placas de Detección Múltiple GloMax (Promega). Se restaron los valores de fondo de los pocillos de control sin células y se representaron gráficamente las medias de los pocillos por triplicado utilizando GraphPad Prism.
Ensayo de formación de colonias.
Se cultivaron en placa células SKMEL5 a razón de 500 células/pocillo en placas de 6 pocillos. Las células se trataron con 0,3 o 1 pg/mL de control de IgG o Z10 por triplicado. Después de 7 días de cultivo, los medios se cambiaron por medios de nueva aportación que contenían los artículos a la misma concentración. Las células se tiñeron el día 12. Los pocillos se lavaron primero una vez con PBS y después se tiñeron con 2 mL de glutaraldehído al 6% (v/v), cristal violeta al 0,5% (p/v) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las placas se enjuagaron dos veces sumergiéndolas en un recipiente lleno de agua del grifo. A continuación, se dejaron secar a temperatura ambiente. Una vez que las placas estuvieron completamente secas, se contó mediante observación microscópica el número de colonias de más de 50 células. Los resultados se trazaron como un gráfico de barras utilizando GraphPad Prism.
Transferencias Western
Las células SKMEL5 se cultivaron a 3x105 células/pocillo en placas de 6 pocillos durante la noche y se trataron con Z10 a 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 y 10 pg/mL durante 24 h, o a 0,3 pg/mL durante 10 min, 30 min, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h y 72 h. Para los estudios de estimulación por GAS6, las células SKMEL5 se cultivaron a 1 * 105 células/pocillo en una placa de 24 pocillos durante la noche, se trataron con 0,3 pg/mL de Z10 o control de IgG durante 2 horas, después se estimularon con GAS6200 nM (R&D Systems, 885-GSB-050) durante 10 minutos.
Se prepararon productos lisados de células completas en tampón RIPA (Sigma, 20-188) que contenía inhibidor de proteasa (Sigma, 4693159001) e inhibidor de fosfatasa (Sigma, P2850 y P5726). Las concentraciones de proteínas se midieron utilizando el Kit de Ensayo de Proteínas BCA (ThermoFisher, 23225). Se cargaron cantidades iguales de proteína en gel de Tris-Glicina al 4-20% (Bio-Rad, 4561094) y después se transfirieron a membranas de PVDF (Bio-Rad, 1620177). Después de bloquear con BSA al 5%, las membranas se sondearon con anticuerpos primarios durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos unidos se detectaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Sigma, AP187P y AP181P) y se visualizaron mediante Sustrato de Transferencia Western ECL (ThermoFisher, 32106), utilizando Sistemas de Generación de Imágenes ChemiDoc (Bio-Rad).
Mediciones de afinidad mediante ELISA competitivo de hMER, mMER, hAxl y hTyro3
Se recubrieron placas de fondo plano Nunc MaxiSorp (ThermoFisher, 44-2404-21) de noventa y seis pocilios con 0,01 ug/mL de proteína recombinante hMER (RnD Systems, 891-MR-100) durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron tres veces con Tween al 0,1% en PBS y se bloquearon con leche descremada en polvo baja en grasa al 3% en PBS durante 2 h.
Durante la etapa de saturación, se prepararon diluciones del antígeno hAxl (RnD Systems, 154-AL-100), hTyro3 (RnD Systems, 859-DK-100) o mMER (RnD Systems, 591-MR-100)] a 50 nM como la concentración más alta, y se diluyeron en serie 1:1 a 0,098 nM en PBS. Cada dilución del antígeno se incubó con 150 uL de 6 nM del anticuerpo contra MERTK (z10) a temperatura ambiente durante 1 h. A continuación, la placa saturada se lavó tres veces con Tween al 0,1% en PBS y la mezcla de antígeno-anticuerpo se añadió a los pocillos por duplicado y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, la placa se lavó tres veces con Tween al 0,1% en PBS y se incubó con anticuerpo anti-Fosfatasa Alcalina humana (Sigma, SAB 3701248) a una dilución de 1:3000 en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con Tween al 0,1% en PBS, se añadieron 100 uL de sistema de sustrato líquido de Fosfatasa Alcalina Amarilla (pNPP) (Sigma, P7998) a cada pocillo y se incubaron durante 70 minutos a temperatura ambiente. Las placas se leyeron a 405 nm y a 570 nm, para corregir las inconsistencias de las placas, utilizando el sistema Glomax Discover de Promega. La absorbancia se representó en función de la concentración de antígeno y la Kd se calculó utilizando GraphPad Prism 7.0c.
6.2.2. Resultados
Se incubaron células de melanoma que expresaban MERTK (SKMEL5) con concentraciones crecientes (0,002 - 13,5 |jg/mL, (0,013 - 90 nM)) de anticuerpo z10 marcado con APC y después se evaluaron mediante citometría de flujo IMF para APC. Como se muestra en la Fig. 3A, el anticuerpo z10 se une a células de melanoma que expresan MERTK humana con alta afinidad (CE<50>= 6,7 nM). Las mediciones de SPR también demuestran que el anticuerpo z10 tiene una alta afinidad por MERTK humana (K<d>= 3 nM).
El anticuerpo z10 se une específicamente a MERTK humana y no se une al dominio extracelular de Axl humana, Tyro3 humana o MERTK murina, como se muestra en las Fig. 4A-4D. Se estableció un equilibrio entre el anticuerpo z10 (0,6 nM) y los dominios extracelulares de MERTK humana, Axl humana, Tyro3 humana y MERTK murina (50 nM - 0,1 nM) antes de la unión al antígeno en fase sólida (MERTK humana). El anticuerpo z10 unido se marcó con anticuerpo secundario para fosfatasa alcalina (AP) y se desarrolló para ELISA.
Se demostró que el anticuerpo z10 induce la degradación de células cancerosas por MERTK humana (véanse las Fig. 5A - 5B). En particular, se observó una degradación sustancial de MERTK humana en células SKMEL5 después de 24 horas utilizando concentraciones de 0, 0,03, 0,1, 0,3 y 1 jg/mL del anticuerpo z10. Adicionalmente, se observó una degradación sustancial de MERTK humana en células SKMEL5 después de 4 horas utilizando 0,3 jg/m L del anticuerpo z10.
Además, se demostró que el anticuerpo z10 induce la degradación de MERTK humana de macrófagos M2 diferenciadosin vitro(véanse las Fig. 6<a>- 6B). Aproximadamente 4 horas después de que los macrófagos M2 diferenciadosin vitrose trataran con 0,3 jg/m L del anticuerpo z10, se detectó una disminución en más de 50% de la MERTK humana mediante análisis de T ransferencia Western (véanse las Fig. 6A - 6B). Se detectaron disminuciones aún mayores de MERTK humana en macrófagos M2 diferenciadosin vitrodespués de 8 horas de tratamiento con 0,3 jg/m L del anticuerpo z10 (véanse las Fig. 6A - 6B).
El anticuerpo z10 parece degradar la MERTK humana en células cancerosas humanas SKMEL5 mediante la internalización de la MERTK humana y su posterior tráfico al lisosoma. Como se muestra en las Fig. 7A - 7B, después de 24 h de incubación de células SKMEL5 con anticuerpo z10, la mayor parte de la señal de MERTK se encuentra en el lisosoma y sólo se detecta una señal mínima (<20%) en la superficie celular.
El anticuerpo z10 previene la fosforilación de AKT inducida por Gas6 en células SKMEL5 humanas que expresan MERTK (véanse las Fig. 8A - 8C). En particular, la fosforilación de AKT inducida por Gas6 se bloquea tratando las células con el anticuerpo z10. Las células SKMEL5 se incubaron con 0,3 jg/m L del anticuerpo z10 o control de IgG durante 2 horas, seguido de tratamiento con Gas6 a 200 nM durante 10 minutos o tampón. Como se muestra en las Fig. 8A - 8C, la incubación de células SKMEL5 con el anticuerpo z10 antes de la incubación con Gas6 reduce el nivel de fosforilación de AKT inducida por Gas6. La Fig. 8B muestra que los niveles de MERTK humana en el producto lisado total disminuyeron después del tratamiento con el anticuerpo z10.
Como se muestra en las Fig. 9A - 9D, el anticuerpo z10 inhibe la formación de colonias de células cancerosas. Se cultivaron 500 células SKMEL5 en placas de 6 pocillos durante 12 días en presencia de IgG de control o el anticuerpo z10 (0,3 y 1 jg/mL). Se contaron colonias de más de 50 células. El número de colonias contadas cuando las células SKMEL5 se incubaron con el anticuerpo z10 se redujo significativamente con respecto a las colonias contadas cuando las células se incubaron con IgG de control.
El anticuerpo z10 indujo respuestas de citocinas en macrófagos M2 y monocitos CD14+ (véase la Fig. 10). En particular, se incubaron macrófagos M2 con 1 pg/mL del anticuerpo z10 o IgG de control durante 48 horas y se evaluó la expresión de determinadas citocinas. Se incubaron monocitos CD14+ con 1 pg/mL del anticuerpo z10 o IgG de control durante 24 horas y se evaluó la expresión de determinadas citocinas. Con relación a la IgG de control, el anticuerpo z10 induce aumentos de la expresión de ciertas citocinas por macrófagos M2 y monocitos CD14+ (véase la Fig. 10). Se ha demostrado que los macrófagos M2 suprimen las respuestas antitumorales (véase J. Inmunol. Cancer 5(1):53 (2017) y la expresión de MERTK humana está restringida principalmente a macrófagos M2 (Crittendenet al.Oncotarget. 2016; 7:78653-78666). Por tanto, el anticuerpo z10 puede tener un efecto anticanceroso indirectamente en células cancerosas y hace que el anticuerpo z10 sea útil para el suministro de agentes tóxicos a las células cancerosas. Además, se ha descubierto que la MERTK humana se expresa en varias líneas celulares cancerosas (véase la entrada de MERTK en The Human Protein Atlas, disponible en www.proteinatlas.org [consultado el 26 de febrero de 2019]). Por lo tanto, el anticuerpo z10, que tiene alta afinidad y especificidad por MERTK humana, induce respuestas de citocinas por parte de las células inmunitarias e inhibe la formación de colonias por parte de las células cancerosas, y tiene potencial terapéutico para tratar una variedad de cánceres.
Además, las CE<50>de los anticuerpos z11 y z13 se determinaron utilizando un ensayo basado en células similar al descrito en la Sección 6.2 anterior para z10. El anticuerpo z11 tiene una CE50 de 7,9 nM para MERTK humana, mientras que el anticuerpo z13 tiene una CE<50>de 7,6 nM para MERTK humana.
6.3. Ejemplo 3: Efecto de z10 sobre la viabilidad y supervivencia de las células cancerosas
6.3.1. Materiales y métodos
Ensayo de viabilidad
Se cultivaron en placa mil células SKMEL5 y células RPMI8226 en pocillos de placas de 96 pocillos y se cultivaron en 100 pl de medio RPMI-1640 (ATCC) complementado con FBS al 10% y Penicilina/Estreptomicina que contenía control de IgG (BioXCell, BE0092) o z10 a 3 y 30 pg/mL. El día 4 (SKMEL5) o el día 6 (RPMI8226), se añadieron a cada pocillo 100 pL de reactivo de Ensayo de Viabilidad Celular CellTiter-Glo 2.0 (Promega, G9241), se incubaron durante 10 minutos y se detectó la señal de luminiscencia con un Lector de Microplacas GloMax Discover (Promega). Las unidades luminométricas relativas medias (URL) de pocillos duplicados se trazaron con GraphPad Prism.
Ensayos de metástasis
Se cultivaron células de cáncer de mama triple negativo MDA-MB-231 LM2 TR (recibidas del Prof. Sohail Tavazoie, Universidad Rockefeller, Nueva York) que albergan un gen indicador de luciferasa (Minn etal.,Nature. 28 de julio de 2005; 436(7050): 518-524) en medio de cultivo D10F (DMEM Life Technologies, 11965-092), FBS al 10% (Sigma, F4135-500mL), NEAA al 1% (Fisher, 11140-050), piruvato de sodio al 1% (Fisher, 11360-070), Hepes al 1% (Fisher, 15630-080) y Pen/Strep al 1% (Fisher, 15140-122). El día de la inyección, las células se lavaron con DPBS (Fisher, 14190-144) y se desprendieron utilizando 3 mL de tripsina-EDTA al 0,25% (Fisher, 25200-056) por placa de cultivo celular de 15 cm durante 5 minutos en una incubadora de cultivos celulares a 37°C. Las células desprendidas se resuspendieron en 5 mL de D10F, se contaron utilizando un hemocitómetro y se centrifugaron a 220 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sedimento se resuspendió en DPBS a una concentración de 500.000 células/mL. Se expusieron ratones hembra NSG de 8 semanas de edad (Jackson, 005557) a una lámpara de calor para animales pequeños (Morganville Scientific, HL0100) durante 2-3 minutos. Se inyectaron 100 pl de la suspensión celular (50.000 células) en la vena lateral dilatada de la cola de ratones NSG hembra de 8 semanas de edad. Se prepararon control de isotipo IgG (BioXCell, BE0092) o z10 en solución estéril de NaCl al 0,9% y se administraron i.p. cada 3,5 días, a partir del día de la inyección de células MDA-MB-231 LM2. El control de isotipo de IgG se dosificó a 10 mg/kg y z10 se dosificó a 1, 3, 10 y 30 mg/kg. La colonización pulmonar se controló mediante generación de imágenes IVIS mediante inyección i.p. de 150 mg/kg de D-luciferina (Thermofisher Scientific, Waltham, MA). Los datos luminiscentes para cada punto temporal se normalizaron al día 0, o el día de la inyección del tumor, y se representaron utilizando Prism (Graphpad Software, La Jolla, CA). Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney, de una cola, para evaluar la importancia de la metástasis medida mediante generación de imágenes de bioluminiscencia.
6.3.2. Resultados:
Se cultivaron células de mieloma múltiple RPMI8226 o melanoma SKMEL5 en presencia de control de IgG o z10, respectivamente. El día 6 (RPMI8226) o el día 4 (SKMel5), se evaluó la viabilidad utilizando el Ensayo de Viabilidad Celular CellTiter-Glo 2.0. Las Fig. 11A y 11B muestran que z10 inhibe la supervivencia celular en células RPMi8226 y SKMEL5, respectivamente.
Se inyectaron 50.000 células de TNBC MDA-MB-231-LM2 en la vena de la cola de ratones NSG. El tratamiento comenzó el día de la inoculación de las células tumorales, dos veces por semana i.p. durante la duración del estudio. La Fig. 12A muestra la reducción de tumores en ratones tratados con z10. Los datos se cuantifican en la Fig. 12B.
6.4. Ejemplo 4: Actividad de productos conjugados de anticuerpo-fármaco que comprenden un anticuerpo anti-MERTK humanizado
Este ejemplo demuestra que los productos conjugados de anticuerpo-fármaco que comprenden un anticuerpo anti-MERTK humanizado conducen a la internalización y degradación de MERTK e inhiben el crecimiento de células cancerosasin vitroein vivo.
6.4.1. Materiales y métodos
Síntesis de IgG1-mc-vc-PABC-MMAE (también denominado en el presente documento "IgG-MMAE")
mc-vc-PABC-MMAE: Se incubaron 6317,7 pL de control de isotipo de IgG1 (11,08 mg/mL, WuXi, 562) con 432,6 pL de Tris (2-carboxietil)fosfina (TCEP) (2,5 mM, Sigma, 1002068588) en solución de PB 40 mM de pH 7,0 (Sigma, 101943380 y 101900512) en un volumen final de 12,6 mL durante 3 h a 37°C con rotación suave. A continuación, se añadieron 830,5 pL de Dimetilacetamida (DMA) (Sigma, ARK2190) y 569,5 pL de mc-vc-PABC-MMAE (10 mg/mL, Levena Biopharma, LN101-006) en DMA para obtener un contenido final de DMA de 10% v/v y una razón de maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonil-monometil auristatina E (mc-vc-PABC-MMAE)/mAb de 9. La mezcla de reacción se incubó a 22°C durante 1 h con rotación suave.
Durante la reacción, se equilibró una columna de desalinización por rotación de 40 KD con PBS, pH 7,2. Esta columna de desalinización se utilizó para el intercambio de tampón y la purificación del producto final. El producto se almacenó en histidina 20 mM, pH 5,5. La concentración de proteína de este producto se determinó mediante absorbancia a 280 nm con una CE280 de 1,61. La pureza y el nivel de agregación del producto se determinaron mediante cromatografía líquida de alta resolución con exclusión por tamaño (SEC-HPLC) con las condiciones que se muestran en la T abla 35 a continuación. El nivel de agregación de este producto fue de 0,57% y la pureza monomérica del producto fue de 99,43%. La razón fármaco-anticuerpo (DAR) del producto se midió con HlC-HPLC como 4,06.
Síntesis de z10-mc-vc-PABC-MMAE (también denominado en el presente documento "z10-MMAE")
Se incubaron 9002,8 pl de z10 (7,22 mg/mL) con 410,535 pl de TCEP (2,5 mM) en solución de PB 40 mM, pH 7,0, en un volumen final de 11,7 mL durante 3 h a 37°C con rotación suave. A continuación, se añadieron 771,2 pl de DMA y 528,76 pl de mc-vc-PABC-MMAE (10 mg/mL) en DMA para obtener un contenido final de DMA de 10% v/v y una razón mc-vc-PABC-MMAE/mAb de 9. La mezcla de reacción se incubó a 4°C durante 22 h con rotación suave. Durante la reacción, se equilibró una columna de desalinización por rotación de 40 KD con PBS, pH 7,2. Esta columna de desalinización se utilizó para el intercambio de tampón y la purificación. El producto se almacenó en histidina 20 mM, pH 5,5. La concentración de proteína de este producto se determinó mediante absorbancia a 280 nm con una CE280 de 1,53. La pureza y el nivel de agregación del producto se determinaron mediante cromatografía líquida de alta resolución con exclusión por tamaño (SEC-HPLC) con las condiciones que se muestran en la Tabla 35 a continuación. La pureza monomérica del producto fue de 100%. La DAR del producto se determinó con HIC-HPLC como 3,88.
Síntesis de IgG1-CL2A-SN-38 (también denominado en el presente documento "IgG-SN-38")
Se incubaron 6272 pl de control de isotipo de IgG1 (11,16 mg/mL, WuXi, 562) con 8 eq de TCEP (769 pl, 5 mM) en solución de PB de pH 7,0 en un volumen total de 12,6 mL. La reacción se incubó a 37°C durante 3 h con rotación suave. Después de eso, la mezcla de reacción se enfrió a 4°C sobre un baño de hielo seguido de la adición de 327 pl de DMA y 1073 pl de CL2A-SN-38 (10 mg/mL, Levena Biopharma, LN291-60) en DMA. La mezcla se mantuvo a 4°C durante 1 h. Durante la reacción, se equilibró una columna de desalinización por rotación de 40 KD con ácido acético a pH 6,0. Esta columna de desalinización se utilizó para el intercambio de tampón y la purificación del producto final. El producto se almacenó en ácido acético 20 mM, pH 6,0. La concentración de proteína de este producto se determinó mediante la absorbancia a 280 nm con una CE280 de 1,88 y una longitud de onda de referencia a 700 nm. La agregación y la pureza del producto se determinaron con SEC-HPLC con las condiciones que se muestran en la Tabla 36 a continuación. El nivel de agregación de este producto fue de 1,14% y la pureza de 99,14%. La DAR del producto se determinó con LC-MS como 7,78.
Síntesis de z10-CL2A-SN-38 (también denominado en el presente documento "z10-SN-38")
Se incubaron 9002 pl de z10 (7,22 mg/mL) con 8 eq de TCEP (714 pl, 5 mM) en solución de PB de pH 7,0 en un volumen total de 11,7 mL. La mezcla de reacción se incubó a 37°C durante 3 h con rotación suave. Después de eso, la mezcla de reacción se enfrió a 4°C sobre un baño de hielo seguido de la adición de 90 pl de DMA y 1210 pl de CL2A-SN-38 (10 mg/mL, Levena Biopharma, LN291-60) en DMA. La mezcla se mantuvo a 4°C durante 1 h. Durante la reacción, se equilibró una columna de desalinización por rotación de 40 KD con ácido acético a pH 6,0. Esta columna de desalinización se utilizó para el intercambio de tampón y la purificación del producto final. El producto se almacenó en ácido acético 20 mM, pH 6,0. La concentración de proteína de este producto se determinó mediante la absorbancia a 280 nm con una CE280 de 1,82. La pureza monomérica del producto se determinó con SEC-HPLC con las condiciones que se muestran en la Tabla 36 a continuación. Por tanto, el nivel de agregación de este producto es de 1,14% y la pureza monomérica del producto es de 98,86%. La DAR del producto se determinó con LC-MS como 7,49.
Determinación de pureza y niveles de agregación
Las Tablas 35 y 36 presentan los parámetros SEC-HPLC mediante los cuales se determinaron la purificación y agregación de los productos conjugados de anticuerpo-fármaco.
Tabla 35: SEC-HPLC para pureza y nivel de agregación del producto Ab-mc-vc-PABC-MMAE
Tabla 36: SEC-HPLC para pureza y nivel de agregación de Ab-CL2A-SN-38
Ensayo de internalización
El control de IgG (R&D 1-001-A), z10, z10-MMAE y z10-SN-38 se marcaron con pHrodo iFL Red, un colorante sensible al pH, utilizando el Kit de Marcaje de Proteínas a Microescala pHrodo iFL Red (ThermoFisher, P36014) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La internalización del anticuerpo se determinó mediante citometría de flujo que detecta la fluorescencia de pHrodo, que es mínima a pH neutro y máxima en ambientes ácidos, tales como el lisosoma.
Se cultivaron en placa cien mil células SKMEL5 por pocillo en placas de 24 pocillos en 1 mL de medio RPMI-1640 (ATCC) complementado con FBS al 10% y Penicilina/Estreptomicina y se incubaron con IgG, z10, z10-MMAE o z10-SN-38 marcados con pHrodo 10 nM, respectivamente, durante 3 o 6 hr. Las células se tripsinizaron, se filtraron a través de un filtro de 70 pm y se resuspendieron en tampón FACS (BSA al 2%, EDTA 10 mM, HEPES 25 mM, azida sódica al 0,1% en PBS sin Ca/Mg) que contenía reactivo bloqueante Human TruStain FcX (Biolegend, 422301). Las células se tiñeron secuencialmente con anticuerpos conjugados con BV421 contra MERTK para detectar niveles de MERTK en la superficie (Biolegend, 367603) durante 20 minutos sobre hielo y después se tiñeron con Colorante de Viabilidad Fijable (eFluor 780) (Thermofisher, 65-0865-14) durante 20 minutos sobre hielo.
Las intensidades medias de fluorescencia (IMF) de pHrodo y BV-421 se analizaron con el citómetro de flujo LSRFortessa (BD Biosciences) y los datos compensados se representaron con GraphPad Prism. La IMF de pHrodo se normalizó con el Grado de Marcaje (GDM) de IgG, z10, z10-MMAE y z10-SN-38 marcados con pHrodo. El GDM se calculó a partir de la absorbancia A280 y A560 de la proteína después del marcaje, según la fórmula proporcionada por el fabricante.
Ensayo de viabilidad de líneas celulares cancerosas
Se cultivaron en placa doscientas células SKMEL5 o mil células RPMI8226 por pocillo en pocillos de placas de 96 pocillos y se cultivaron en 100 pl de medio RPMI-1640 (ATCC) complementado con FBS al 10% y Penicilina/Estreptomicina que contenía cualquier control de IgG (BioXCell, BE0092), IgG1-MMAE, z10-MMAE, IgG1-SN-38 o z10-SN-38, respectivamente, a 0,015, 0,046, 0,137, 0,412, 1,24, 3,70, 11,1, 33,3 y 100 nM. El día 7, se añadieron a cada pocillo 100 pl de reactivo del Ensayo de Viabilidad Celular CellTiter-Glo 2.0 (Promega, G9241), se incubaron durante 10 minutos y la señal de luminiscencia se detectó con un Lector de Microplacas GloMax Discover (Promega). Las unidades luminométricas relativas medias (URL) de pocillos duplicados se trazaron con GraphPad Prism.
Ensayo de viabilidad de macrófagos
Se prepararon células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de capas leucocitarias de donantes sanos mediante centrifugación en gradiente de densidad Histopaque-1077 (Sigma, 10771) a 250 * g a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se recogió la capa intermedia que contenía PBMC y las células se lavaron tres veces con PBS/EDTA 2 mM. Se aislaron monocitos humanos a partir de PBMC mediante separación magnética utilizando el Kit de Aislamiento de Monocitos Clásicos humanos (Miltenyi, 130-117-337) según las instrucciones del fabricante. Se cultivaron ochenta mil monocitos por pocillo en placas de 96 pocillos en 150 pl de medio PBMC (medio RPMI 1640 (Gibco, 11875093) que contenía suero AB humano al 10%, FBS al 10%, L-glutamina, penicilina y estreptomicina) a 37°C con CO<2>al 5%. Los monocitos se trataron con GM-CSF (20 ng/mL; Biolegend, 766102) o M-Cs F (50 ng/mL; Biolegend, 574804) durante 8 días para diferenciarse en macrófagos M1 o M2, respectivamente. A continuación, se trataron macrófagos diferenciados con control de IgG (2 o 20 nM; BioXCell, BE0092), z10 (2 o 20 nM), IgG1-MMAE (1 o 10 nM), z10-MMAE (1 o 10 nM), IgG1-SN-38 (0,03 o 0,3 nM), z10-SN-38 (0,03 o 0,3 nM) o 1 pM del inhibidor de MERTK de molécula pequeña UNC-1062 (Aobious, AOB4488), en 100 pl de medio de diferenciación que contenía GM-CSF o M-CSF. El día 4, se añadieron a cada pocillo 100 pl de reactivo del Ensayo de Viabilidad Celular CellTiter-Glo 2.0 (Promega, G9241), se incubaron durante 10 minutos y la señal de luminiscencia se detectó con un Lector de Microplacas GloMax Discover (Promega). Las unidades luminométricas relativas medias (URL) de pocillos duplicados se trazaron con GraphPad Prism.
Transferencia Western
Las células SKMEL5 y las células RPMI8226 se cultivaron y mantuvieron en medio RPMI-1640 (ATCC) complementado con FBS al 10% y Penicilina/Estreptomicina. Se prepararon productos lisados de células completas en tampón RIPA (Sigma, 20-188) que contenía inhibidor de proteasa (Sigma, 4693159001) e inhibidor de fosfatasa (Sigma, P2850 y P5726). Las concentraciones de proteínas se midieron utilizando el Kit de Ensayo de Proteínas BCA (ThermoFisher, 23225). Se cargaron cantidades iguales de proteína (30 pg) en gel de Tris-Glicina al 4-20% (Bio-Rad, 4561094) y después se transfirieron a membranas de PVDF (Bio-Rad, 1620177). Después de bloquear con BSA al 5%, las membranas se sondearon con anticuerpos primarios durante 1 hora a temperatura ambiente en PBST (Tween20 al 0,1% en PBS) con BSA al 1%. Después de 3 etapas de lavado en PBST con BSA al 1%, se añadieron anticuerpos secundarios conjugados con HRP en PBST con B<s>A al 1% y se incubaron durante 1 h (Sigma, AP187P y AP181P). La transferencia se lavó con PBST y se reveló utilizando Sustrato de Transferencia Western ECL (ThermoFisher, 32106), utilizando Sistemas de Generación de Imágenes ChemiDoc (Bio-Rad). La señal se normalizó a tubulina, utilizada como control interno. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios en ensayos de T ransferencia Western; MERTK (abcam, ab52968), fosfo MERTK (abcam, ab14921), AXL (CST, 8661), Tyro3 (CST, 5585), AKT (abcam, ab32505), fosfo AKT (abcam, ab81283), tubulina (Sigma, T5168).
Ensayos de metástasis
Se cultivaron células de cáncer de mama triple negativo MDA-MB-231 LM2 TR (recibidas del Prof. Sohail Tavazoie, Universidad Rockefeller, Nueva York) que albergaban un gen informador de luciferasa (Minnet al.,Nature. 28 de julio de 2005; 436(7050): 518-524) en medio de cultivo D10F (DMEM Life Technologies, 11965-092, FBS al 10% Sigma, F4135-500 mL, NEAA al 1% Fisher, 11140-050, piruvato de sodio al 1% Fisher, 11360-070, Hepes al 1% Fisher, 15630-080 y Pen/Strep al 1% Fisher, 15140-122. El día de la inyección, las células se lavaron con DPBS (Fisher, 14190-144) y se desprendieron utilizando 3 mL de Tripsina-EDTA al 0,25% (Fisher, 25200-056) por placa de cultivo celular de 15 cm durante 5 minutos en una incubadora de cultivo celular a 37°C. Las células desprendidas se resuspendieron en 5 mL de D10F, se contaron utilizando un hemocitómetro y se centrifugaron a 220 x g durante 5 minutos a RT. El sedimento se resuspendió en DPBS a una concentración de 500.000 células/Ml. Se expusieron ratones hembra NSG de 8 semanas de edad (Jackson, 005557) a una lámpara de calor para animales pequeños (Morganville Scientific, HL0100) durante 2-3 minutos. Se inyectaron 100 pL de la suspensión celular (50000 células) en la vena lateral dilatada de la cola de ratones NSG hembra de 8 semanas de edad. Se prepararon el control de isotipo IgG-MMAE y z10-MMAE en PBS estéril y se administraron ip los Días 0, 3, 10, 18, 33 y 41 después de la inyección de células MDA-MB-231 LM2. La dosis inicial de IgG-MMAE y z10-MMAE fue de 3 mg/kg y se redujo a 2 mg/kg el Día 18 y a 1 mg/kg el Día 33.
La colonización pulmonar se controló mediante imágenes IVIS tras la administración i.p. de 150 mg/kg de D-luciferina (Thermofisher Scientific, Waltham, MA). Los datos luminiscentes para cada punto temporal se normalizaron al día 0, o el día de la inyección del tumor, y se representaron utilizando Prism (Graphpad Software, La Jolla, CA). Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney, de una cola, para evaluar la importancia de la metástasis medida mediante generación de imágenes de bioluminiscencia.
Mediciones de afinidad mediante ELISA competitivo.
Se recubrieron placas de fondo plano de noventa y seis pocillos Nunc MaxiSorp (ThermoFisher, 44-2404-21) con 0,01 pg/mL de proteína recombinante hMER (R&D Systems, 891-MR-100) durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron tres veces con Tween al 0,1% en PBS y se bloquearon con leche desnatada en polvo baja en grasa al 3% en PBS durante 2 h. Durante la preincubación de la placa, la proteína recombinante hMER en PBS a diversas concentraciones (50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56, 0,78, 0,39, 0,20, 0,10, 0,05 y 0 nM) se equilibraron con z10, z10-MMAE o z10-SN-38 0,3 nM, respectivamente, a temperatura ambiente durante 1 h. A continuación, la placa recubierta con hMER se lavó tres veces con PBST (Tween-20 al 0,1% en PBS) y la mezcla de antígeno-anticuerpo se añadió a los pocillos por duplicado y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó tres veces con PBST y se incubó con anticuerpo anti-IgG humana conjugado con Fosfatasa Alcalina (Sigma, SAB3701248) a una dilución de 1:3000 en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con PBST, se añadieron a cada pocillo 100 pl de Sustrato Líquido de Fosfatasa Alcalina Amarilla (pNPP) (Sigma, P7998) y se incubaron durante 70 minutos a temperatura ambiente. Se midió la absorbancia de las placas a 405 nm y 560 nm utilizando en Lector de Microplacas GloMax® Discover (Promega). La absorbancia a 405 nm se normalizó con la absorbancia a 560 nm. Los valores medios de los pocillos duplicados se representaron en función de la concentración de antígeno y la Kd se determinó mediante análisis de regresión no lineal con GraphPad Prism 7.0c.
6.4.2. Resultados
Se sintetizaron z10-mc-vc-PABC-MMAE (z10-MMAE) e IgG1-mc-vc-PABC-MMAE (IgG-MMAE), mostrándose sus estructuras en la Fig. 13A donde el Ab (porción de anticuerpo) era z10 e IgG de control, respectivamente. Se sintetizaron z10-CL2A-SN-38 (z10-SN-38) e IgG1-CL2A-SN-38 (IgG-SN-38), mostrándose sus estructuras en la Fig. 13B donde el Ab (porción de anticuerpo) era z10 e IgG de control, respectivamente.
La pureza de los productos conjugados de anticuerpo-fármaco se evaluó mediante SEC-HPLC. Las Figs. 14A y 14B muestran los resultados de s EC-HPLC para z10-MMAE y z10-SN-38, respectivamente. Para ambos productos conjugados, se midió una agregación mínima o nula, lo que indica una alta pureza de los productos conjugados.
Para evaluar la afinidad de unión de los productos conjugados de anticuerpo-fármaco y z10, se equilibró la proteína recombinante hMER (50 nM-0,05 nM) con z10, z10-MMAE o z10-SN-380,3 nM, respectivamente, antes de la adición a las placas de ELISA recubiertas previamente con proteína recombinante hMER. La unión del anticuerpo se detectó utilizando un anticuerpo secundario anti-IgG humana conjugado con AP y se reveló utilizando un lector de microplacas GloMax. La Fig. 15 muestra que z10, z10-MMAE y z10-SN-38 se unen a MER humana con valores de Kd de 0,17 nM, 0,081 nM y 0,021 nM, respectivamente.
Las células SKMel5 se incubaron con 6,7 nM de z10, z10-MMAE, z10-SN-38 o control de IgG marcados con pHrodo. La MERTK de superficie se tiñó con un anticuerpo contra MERTK conjugado con BV421. La unión se midió mediante citometría de flujo. Los datos mostrados en la Fig. 16A demuestran que z10, así como los productos conjugados de z10-MMAE y z10-SN-38 inducen la internalización de MERTK. Los datos mostrados en la Fig. 16B demuestran que z10, así como los productos conjugados de z10-MMAE y z10-SN-38 inducen la degradación de MERTK.
Se incubaron células SKMel5 o RPMI8226 con control de IgG, IgG-MMAE, z10-MMAE, IgG-SN-38 o z10-SN-38 durante 7 días. La viabilidad celular se midió utilizando CellTiterGlo. Los datos mostrados en las Fig. 17A y 17B demuestran que z10-MMAE disminuyó la viabilidad de las células de melanoma SKMel5 y de mieloma múltiple RPMI8226, respectivamente, en comparación con la viabilidad de estas células después de la incubación con IgG-MMAE o control de IgG. Los datos mostrados en las Fig. 17C y 17D demuestran que z10-SN-38 disminuyó la viabilidad de las células de melanoma SKMel5 y de mieloma múltiple RPMI8226, respectivamente, en comparación con la viabilidad de aquellas células incubadas con IgG-SN-38 o control de IgG. La Fig. 17E muestra la expresión de MERTK, fosfo MERTK, AXL, Tyro3, AKT, fosfo AKT y tubulina en productos lisados de células completas preparados a partir de células SKMel5 y RPMI8226.
Se inyectaron 50.000 células de TNBC MDA-MB-231-LM2 en la vena de la cola de ratones NSG. El tratamiento comenzó el día de la inoculación de células tumorales y la colonización metastásica pulmonar se controló mediante generación de imágenes de bioluminiscencia. La Fig. 18A muestra que z10-MMAE inhibe la colonización pulmonar de células de cáncer de mama triple negativo MDA-MB-231 en comparación con IgG-MMAEin vivo.Los datos se cuantifican en la Fig.18B.
Los macrófagos M2 se diferenciaron mediante cultivo de 8 * 104 monocitos en medio PBMC con M-CSF (50 ng/mL) durante 8 días. Los macrófagos M1 se diferenciaron mediante cultivo de 8 * 104 monocitos en medio PBMC con GM-CSF (20 ng/mL) durante 5 días, después se cultivaron con GM-CSF (20 ng/mL), IFNg (20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL) y LPS (10 pg/mL) durante 3 días adicionales. Los macrófagos M2 y M1 se trataron con los anticuerpos o ADC indicados durante 4 días en medio de diferenciación y la viabilidad se evaluó mediante el Ensayo de Viabilidad Celular CellTiter Glo 2.0. Los datos mostrados en la Fig. 19A demuestran que ni z10 ni z10-MMAE ni z10-SN-38 ni el inhibidor de MERTK UNC1062 afectan a la viabilidad de los macrófagos M i que expresan MERTK. Los datos mostrados en la Fig. 19B demuestran que ni z10 ni z10-MMAE ni z10-SN-38 ni el inhibidor de MERTK UNC1062 afectan a la viabilidad de los macrófagos M2 que expresan MERTK.

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a Mer Tirosina Quinasa (MERTK) humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprenden una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 y la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106.
2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo es una inmunoglobulina que comprende dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas.
4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo comprende regiones constantes de cadena pesada y ligera de origen humano; o en donde el anticuerpo comprende una porción de regiones constantes de cadena ligera y pesada de origen humano.
5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo es una IgG.
6. Un anticuerpo biespecífico que comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes, en donde una región de unión a antígeno comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, y en donde la otra región de unión a antígeno se une a un antígeno de interés; opcionalmente en donde el antígeno de interés es un receptor de células inmunitarias o un antígeno asociado a tumores.
7. Un producto conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende: (a) un radical de anticuerpo que es el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; (b) uno o más radicales de fármaco, siendo cada radical de fármaco un agente citotóxico; y (c) opcionalmente un conector, en donde el agente citotóxico se conjuga directamente con el radical de anticuerpo o se conjuga con el radical de anticuerpo a través del conector.
8. El producto conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 7, en donde el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en una auristatina, un maitansinoide, una pirrolobenzodiazepina, una indolinobenzodiazepina, una caliqueamicina, un análogo de camptotecina, una duocarmicina, un inhibidor de tubulina, una tubulisina o análogo tubulisina, amberstatina269, doxorrubicina, SN-38, un antibiótico, una antraciclina, un inhibidor de microtúbulos, una espliceostatina, una thailanstatina, monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F (MMAF), DM1, DM4 y monometil auristatina E.
9. El producto conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 7 u 8, en donde el producto conjugado de anticuerpo-fármaco comprende el conector, y el conector es un conector escindible o un conector no escindible; opcionalmente en donde el conector es maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonilo, CL2 o CL2A.
10. El producto conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 8, en donde el radical de anticuerpo está conjugado con MMAE a través de un conector mc-vc-PABC.
11. El producto conjugado de anticuerpo-fármaco de la reivindicación 8, en donde el radical de anticuerpo está conjugado con SN-38 através deun conector CL2A.
12. Uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
13. Una célulaex-vivoque contiene uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
14. Un método para producir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende cultivar la célula de la reivindicación 13 en condiciones tales que dichos uno o más polinucleótidos son expresados por la célula para producir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno codificados por los polinucleótidos.
15. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el anticuerpo biespecífico de la reivindicación 6, o el producto conjugado de anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, y un portador farmacéuticamente aceptable.
16. Una composición farmacéutica como se define en la reivindicación 15 para su uso en un método para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesite, opcionalmente en donde el sujeto es un ser humano.
17. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 16, en donde dicho cáncer es un cáncer de cabeza y cuello, pulmón, mama, hueso, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado, parótida, tracto biliar, colon, recto, cuello uterino, útero, endometrio, riñón, vejiga, próstata o tiroides; o en donde el cáncer es un melanoma, sarcoma, leucemia, carcinoma de células escamosas, melanoma, glioma, glioblastoma, neuroblastoma, sarcoma de Kaposi, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer de cabeza y cuello, mieloma múltiple o linfoma, o es una leucemia mielógena aguda o una leucemia linfocítica aguda.
18. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 17, en donde dicho cáncer es cáncer de mama, opcionalmente cáncer de mama triple negativo.
19. La composición farmacéutica para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en donde las células cancerosas de dicho cáncer expresan en exceso MERTK, opcionalmente expresan en exceso MERTK fosforilada; o en donde MERTK es constitutivamente activa sobre células cancerosas de dicho cáncer; o
en donde dicho cáncer está asociado con la expresión en exceso de MERTK; o
dicho cáncer está asociado con MERTK constitutivamente activa.
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